JP2012189615A - マイクロ流体デバイス - Google Patents
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- G—PHYSICS
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Abstract
【解決手段】開示したテクノロジーは、DNAシーケンシングおよびゲノタイピング、プロテオミクス、病原体検出、診断ならびに生物兵器防衛などの様々な用途のためのサンプル調製および分析システムとして使用できる。本発明は、標的分析物を捕捉および精製するための手段および該標的分析物をマイクロ流体デバイス内へ導入するための手段を備える第1モジュールと、該マイクロ流体デバイスを備える第2モジュールと、を備え、ここで該マイクロ流体デバイスは該標的分析物を検出もしくは分析するために適合する、モジュラーシステムを提供する。
【選択図】なし
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づいて、2004年9月15日に提出された米国仮特許出願第60/609,970号の利益を主張する。この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
本発明の態様は、国防総省によって授与されたプロジェクト番号W911SR−04−P−0047、NIHによって授与された助成金番号5R01HG003583−01、HSARPAによって授与された契約番号NBCHC050133、HSARPAによって授与された受付番号TTA−1−0014(協定番号W81XWH−04−9−0012)のうちの1つまたは複数の下で政府の資金提供を受けて実施された。連邦政府は、本発明に所定の権利を有する。
本発明は、当技術分野におけるこれらやその他の必要を解決する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
標的分析物を捕捉および精製するための手段および該標的分析物をマイクロ流体デバイス内へ導入するための手段を備える第1モジュールと、
該マイクロ流体デバイスを備える第2モジュールと、
を備え、ここで該マイクロ流体デバイスは該標的分析物を検出もしくは分析するために適合する、モジュラーシステム。
(項目2)
前記標的分析物が、細菌、ウイルス、胞子、真核細胞、または核酸からなる群から選択される、項目1に記載のシステム。
(項目3)
前記細菌が炭疽菌(Bacillus anthracis)である、項目2に記載のシステム。
(項目4)
前記胞子が炭疽菌胞子である、項目2に記載のシステム。
(項目5)
前記細胞が癌細胞である、項目2に記載のシステム。
(項目6)
前記核酸がDNAである、項目2に記載のシステム。
(項目7)
前記分析が、前記DNAシーケンシングを含む、項目6に記載のシステム。
(項目8)
前記分析が、前記DNAの増幅を含む、項目6に記載のシステム。
(項目9)
前記マイクロ流体デバイスが、項目32に記載のマイクロ流体デバイスである、項目1に記載のシステム。
(項目10)
回転式磁極片と、
フロースルーチューブと、
固定磁極片と、
を備え、
ここで、該回転式磁極片、該チューブおよび該固定磁極片は、該磁極片が回転すると該フロースルーチューブ内で磁気進行波を生じる様式で配列されており、そのために適合する材料を含む、磁気進行波フロースルー式デバイス。
(項目11)
前記磁極片の回転が少なくとも約100Hzである、項目10に記載のデバイス。
(項目13)
前記チューブのルーメン内に配置されたビーズをさらに備える、項目10に記載のデバイス。
(項目14)
前記ビーズが磁性ビーズである、項目10に記載のデバイス。
(項目15)
標的分析物が前記磁性ビーズに付着する、項目14に記載のデバイス。
(項目16)
前記標的分析物が前記磁性ビーズへ親和性捕捉される、項目15に記載のデバイス。
(項目17)
前記標的分析物が、細菌、胞子、ウイルス、真核細胞、および核酸からなる群から選択される、項目16に記載のデバイス。
(項目18)
前記フロースルーチューブがマイクロ流体デバイス内へ供給される、項目10に記載のデバイス。
(項目19)
標的分析物を溶解もしくは破壊する方法であって、該方法は、以下:
a)標的分析物および磁性ビーズを項目10に記載の磁気進行波デバイスのフロースルーチューブ内へ導入する工程、ならびに
b)該チューブ内で1つまたは複数の方向に該磁性ビーズを加速させるために適合する周波数で該デバイスの磁極片を回転させる工程、
を包含し、
それにより該ビーズが該標的分析物を溶解または破壊させる、方法。
(項目20)
前記標的分析物が、細菌、胞子、ウイルス、真核細胞、および核酸からなる群から選択される、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記回転させる工程が、少なくとも約100Hzである、項目19に記載の方法。
(項目22)
前記標的分析物が前記磁性ビーズへ付着させられる、項目19に記載の方法。
(項目23)
前記標的分析物が前記磁性ビーズへ親和性捕捉される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記フロースルーチューブがマイクロ流体デバイスと流体連絡している、項目19に記載の方法。
(項目25)
前記標的分析物が核酸であり、前記マイクロ流体デバイスが前記核酸の配列を増幅させるために適合している、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記標的分析物が核酸であり、前記マイクロ流体デバイスが前記核酸をシーケンシングするために適合している、項目24に記載の方法。
(項目27)
エアロゾルを含有するために適合するチャンバと、
超音波処理装置プローブと、
を備え、
該チャンバがサンプル注入口およびサンプル排出口を備え、該プローブが、該サンプル注入口とサンプル排出口との間に配置されたサンプルを超音波処理するために適合する方法で前記チャンバ内に配置されている、フロースルー式超音波処理装置。
(項目28)
流体サンプルをさらに含み、前記サンプルが前記チャンバを通って流れる項目27に記載の超音波処理装置。
(項目29)
前記サンプル出口がマイクロ流体デバイスと流体連絡している、項目27に記載の超音波処理装置。
(項目30)
標的分析物を含むサンプルが前記超音波処理装置のチャンバ内に存在する間に項目27に記載のフロースルー式超音波処理装置のプローブを作動させるステップを含み、
これにより前記標的分析物が超音波処理される、標的分析物を溶解もしくは破壊させる方法。
(項目31)
前記標的分析物が、細菌、胞子、ウイルス、真核細胞、および核酸からなる群から選択される、項目30に記載の方法。
(項目32)
マイクロ流体デバイスであって、
2つの親和性捕捉チャンバと流体連絡している装填リザーバであって、前記捕捉チャンバが各々分離チャネルと流体連絡している装填リザーバと、
順方向および逆方向核酸シーケンシング産物を含むサンプルを該リザーバから該親和性捕捉チャンバへ電気泳動するために適合する電極であって、該捕捉チャンバが該順方向および逆方向核酸シーケンシング産物のどちらかを捕捉するために適合する親和性捕捉マトリックスを含む電極と、
該親和性捕捉チャンバの温度制御のための手段と、
を備える、マイクロ流体デバイス。
図面を含む上記の一般的な説明、および以下の詳細な説明は、どちらも例示かつ説明することだけを目的としており、本開示を制限するものではないことを理解されたい。本開示では、単数形の使用は、特別に記載しない限り、複数形を含んでいる。同様に「または」の使用は、他に特別に記載しない限り「および/または」を意味している。同様に、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「包含する(include)」、「包含する(includes)」、および「包含している(including)」は、限定することは意図されていない。「要素」もしくは「構成要素」などの用語は、他に特別に記載しない限り、1つのユニットを含む要素および構成要素ならびに2つ以上のユニットを含む要素もしくは構成要素の両方を包含している。本明細書で使用した章毎の見出しは構成上だけのためであり、本明細書に記載した主題を限定すると解釈してはならない。特許、特許出願、論文、書籍および専門書を含むがそれらに限定されない本明細書で言及した参考文献の全体および参考文献の部分は、これにより明示的にあらゆる目的のために全体として参照して本明細書に組み込まれる。万一1つまたは複数の組み込まれた参考文献が本開示と矛盾する場合は、本開示が優先される。
一部の実施形態では、サンプル中の標的分析物は、その後の処理もしくは分析のためにマイクロ流体デバイス内へ導入する前に濃縮することができる。一部の実施形態では、1つまたは複数の標的分析物は、マクロスケール容量(例、ミリリットルからリットル容量)を保持して1つまたは複数の標的分析物を小さな表面(例、マイクロビーズ)上へ濃縮できる、1つまたは複数のオフチップ・フロースルー式デバイスを用いて濃縮することができる。一部の実施形態では、1つまたは複数の標的分析物は、マクロスケール容量を保持するオフチップ・リザーバによって供給できるオンチップ・フロースルー式デバイスを用いて濃縮できる。一部の実施形態では、オンチップおよびオフチップ・デバイスを組み合わせて使用できる。一部の実施形態では、捕捉された標的分析物は、下流での処理もしくは分析のために適合する容量へ選択的に溶離させることができる。図1に示したように、SCPM1は免疫捕捉2、溶解3、核酸精製4のためのモジュールを含むことができ、ナノバイオプロセッサ(nanobioprocessor)5と集積化することができる。一部の実施形態では、毒素などの分子を免疫捕捉して、ナノバイオプロセッサ5へ直接的に供給することができる(図2)。
一部の実施形態では、標的分析物は、マクロスケールのサンプル容量を濃縮マトリックス140に通して流すオフチップ・フロースルー式デバイス130を用いて濃縮できる(図4)。一部の実施形態では、濃縮マトリックスが標的分析物を保持し、他方バルク溶液および干渉化合物はデバイスを通過する。一部の実施形態では、干渉化合物もしくは望ましくない化合物がマトリックス140上に保持され、標的分析物はデバイスを通過する。サンプルの形状(表面、水、土壌、エアロゾル、生体物質)に依存して、粗濾過(約、20μm)は、かさの高い不純物および微粒子を除去するために役立つことがある。一部の実施形態では、オフチップ・フロースルー式デバイスは、その中にマトリックスが装填されている底部にフリット製開口部150を含むことができ、溶出のための孔(≦1mm)ポートを含むことができる(図4)。濃縮マトリックスは、本明細書に記載するように、非親和性培地もしくは親和性捕捉培地を使用できる。BPMマイクロ流体デバイスと集積化されたオフチップ・フロースルー式デバイスの実施例は、図3に示されている。
本明細書で使用する「非親和性捕捉」は、疎水性、親水性、もしくはイオン性相互作用による培地上での標的分析物の非特異的捕捉を意味する。
Technologies社)またはBig Beadを使用できる。所望の物質の濃縮もしくは精製を提供するためには、標準もしくは特殊クロマトグラフィ用培地もまた使用できる。任意の選択された培地に対して、床容量、相違する培地処方、洗浄、および溶出条件は、当業者であれば感受性を増強する目的で最大保持のために最大化できる。
本明細書で使用する「親和性捕捉」は、標的分析物に対して実質的に特異的である分子(例、抗体、リガンド、受容体、レクチン、ハプテン、エピトープ、オリゴヌクレオチドなど)を含む培地を用いる標的分析物の捕捉を意味する。一部の実施形態では、標的分析物(例、細胞、微生物、胞子、または毒素)の表面エピトープに対するモノクローナル抗体を用いて修飾された磁性ビーズをサンプルへ添加することができる。一部の実施形態では、特異的微生物、細胞タイプ、サブタイプ、種、核酸、タンパク質などに対する抗体でコーティングされたビーズの混合物もしくは数セットのビーズを、サンプルへ連続的に、または当業者の裁量で選択された様々な組み合わせで適用できる。抗体がコーティングされたビーズは、標的分析物へ結合するのでそれにより溶液から標的分析物を捕捉できる。ビーズは、磁石によって収集でき、不純物および潜在的阻害剤は洗浄によって除去できる。
一部の実施形態では、BPMマイクロ流体デバイスは、標的分析物を濃縮するために使用できる。一部の実施形態では、標的分析物のオンチップ濃縮は、モジュール集積化、超微細加工テクノロジーの使用、および同一チャンバ内でPCRなどの様々な方法を実行する能力を促進できる。一部の実施形態では、これは適切な流量を産生するために相当に大きな径のチャネルの使用を必要とすることがある。一部の実施形態では、免疫親和性捕捉は、病原性微生物もしくはウイルス、タンパク質、または他の標的分析物をサンプルから濃縮および精製するための迅速かつ特異的方法を提供する。例えば、標的分析物を濃縮するために、ビーズに基づくサンプル調製は、バッチプロセスからオンチッププロセスへ適応させることができる。例えば、抗体がコーティングされたビーズは、導電学的ビーズ床充填および堰式ビーズ捕獲法を用いて集積化かつ超微細加工された捕捉チャンバ内へ配置することができる(Oleschuk et al. 2000. Analytical Chemistry 72:585−5909)。
一部の実施形態では、標的分析物は、オンチップもしくはオフチップで破壊および溶解することができる。破壊または溶解することができる標的分析物の非限定的例は、(例、原核細胞、真核細胞、古細菌)、胞子(例、細菌性(例、炭疽菌(B. anthracis)、クロストリジウム(Clostridium))もしくは真菌性(例、C.イミチス(C. immitis)))、細胞小器官(例、ミトコンドリア、核など)、核酸、染色体、プラスミド、リボソーム、プロテオソーム、ウイルス(疱瘡、インフルエンザ、ウエストナイル、ポリオ、肝炎、およびレトロウイルスなど)である。一部の実施形態では、標的分析物は超音波処理によって破壊または溶解することができる。一部の実施形態では、ビーズ上に捕捉された標的分析物は、マイクロチップ上に導入する前に超音波処理することができる。
3. 核酸精製モジュール
一部の実施形態では、本発明のシステムは、核酸精製モジュール(NAPM)を含むことができる。NAPMは、溶液または1つもしくは複数のビーズ、コロイド、多相(不均質もしくは均質)溶液、または他の組成物などの他の物理的形態にあるサンプルを受け入れるように設計できる。一部の実施形態では、NAPは、溶解モジュールからの流入を受け入れるように設計できる。NAPMによって受け入れられる容量の範囲は、ミリリットルからピコリットル未満の容量に及ぶ可能性がある。一部の実施形態では、NPAからの排出は、その後の処理もしくは分析のためにBPMマイクロチップまたは他のマイクロ流体デバイスへ送達することができる。
サンプル中の全核酸は、核酸を溶液から表面上へ推し進めるためにカオトロピック剤を使用する非特異的捕捉法を用いて精製できる。例えば、米国特許第6,489,112号は、シリカキャピラリの表面上へ核酸を推し進めるためにチオシアン酸塩もしくはグアニジニウムなどのカオトロピック剤を用いる定量的ナノスケール「テンプレート捕捉」法について記載している。洗浄後、濃縮かつ精製された核酸は、サイクルシーケンシングなどのナノスケールのサンプル処理もしくは分析のためにバッファ中へ溶出させることができる。本方法は、溶解液から核酸を精製するためにも使用できる。
一部の実施形態では、標的核酸は、オリゴヌクレオチド捕捉配列へのオフチップ・ハイブリダイゼーションを用いて選択的に精製できる。
サンプルは、様々なマイクロ流体デバイスもしくは他の流体システム内へ直接的に、または例えば本明細書に記載したように捕捉および核酸精製による処理後に導入できる。一部の実施形態では、親和性捕捉ステップからのビーズは、マイクロリットルもしくはナノリットル容量などの小さな容量でマイクロチップ内へ導入することができる。ビーズは、シリンジポンプもしくはピペッティングデバイスを用いるなどでマイクロチップ上のリザーバ内へポンプで送り込むことができ、そしてオンマイクロチップポンプを使用してそこにビーズを捕獲もしくは保持できるマイクロチップの部分へビーズを移動させることができる。
BPMは、典型的には以下で記載するように機器およびプログラマブルソフトウエアによって任意に作動できる1つまたは複数のマイクロ流体デバイスを含んでいる。一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、SCPMからサンプルを投入し、流体回路と反応チャンバ間に液体を送り、試薬を添加し、核酸および毒素などの様々な標的分析物についてのアッセイを実行する、カートリッジ内に保持されたマイクロチップ、ナノチップ、もしくはピコチップであってよい。一部の実施形態では、様々なタイプのチップは、それにより反応時間および順序を制御するためのシステム制御要素としてのMOVバルブ、ポンプおよびルータを用いて、個別バイオプロセッサモジュール内でサンプルを処理できる。一部の実施形態では、本明細書に開示したチップはSCPMと集積化できる。
MOVマイクロバルブ、マイクロポンプ、およびマイクロルータは、2つのガラス製マイクロ流体層を、バルブを開閉するポリジメチルシロキサン(PDMS)などの変形可能な膜層、および膜を変形させてバルブを作動させるための空気層と結合する。上部ガラス層(図9)内にエッチングされた流体チャネルは、不連続性で、バルブシートとして機能するバイアへ通じている。PDMS膜40はバルブシートに接して置かれており、通常は2つのバイア間の流体路を閉鎖する。PDMS膜40の反対側には、エッチングによって形成された空気置換チャンバがフルスケール真空源もしくは圧力源へ接続されている。超小型オフチップ・ソレノイドを制御することによって、真空もしくは圧力(ほぼ1/2気圧)をPDMS膜40へ適用すると、柔軟性膜の単純な変形によってバルブを開放したり(50)閉鎖したり(60)できる。
図31は、核酸分析のために使用できる単一バイオプロセッサモジュールの実施例を示している。このデザインでは、IMSおよび核酸精製からの結合した精製核酸を備える捕捉されたビーズを下方チャネル350内へ投入できる。オンチップMOVポンプ351は、ビーズを堰352へ移動させ、そこではリアルタイムPCR試薬および内部標準物質を試薬注入口から添加できるので、熱の局所的適用によって核酸を遊離させてμRT−PCRチャンバ353内へポンプで送り込むことができる。チャンバを取り囲んでいるバルブは、サーマルサイクリングのために閉鎖する。
一部の実施形態では、マイクロチップは、真空チャック上の固定位置で保持することができる。マイクロチップ・インターフェースデバイスは、外部空気源、サーマルサイクリング温度制御要素、温度制御、および試薬導入ラインを含む外部制御要素を提供するためにマイクロチップと連結することができる。
208とB 209との間を往復させることができる。消化が望ましい場合は、チャンバA 208内の消化されたアリコートは、本明細書に記載するようにDNAプローブを用いたハイブリダイゼーションによってDNA分析のために標識できる。
一部の実施形態では、MINDSシステムは、Sangerサンプルの無人自動化調製および分析を用いて超低消費コストでシーケンシングサンプルを調製および分析することができる。シーケンシングテンプレートは、単独DNAフラグメントから誘導された各々がDNAを運んでいるビーズとのバルクエマルジョンPCR反応において剪断された染色体もしくはBAC DNAから出発してビーズ上で調製できる。フラグメントを備えていないビーズを排除するための分類後、個別ビーズは、クリーンアップおよびμCAE分析と一緒に400チャネルマイクロチップ上に集積化された低容量(例、25nL)のサイクルシーケンシング反応チャンバへ送達できる。一部の実施形態では、ビーズは堰によって捕捉でき、サイクルシーケンシングは順方向および逆方向両方の対合末端(paired−end)読み込みのために実行でき、生成物は、順方向もしくは逆方向読み込みのどちらかのための親和性ゲル捕捉マトリックスを含有するデュアルサンプルクリーンアップチャンバ内へ電気泳動させることができる。親和性ゲルは、イオンおよび組み込まれていないヌクレオチドを除去するために洗浄できる。精製されたサイクルシーケンシングフラグメントは、温度を上昇させることによって親和性マトリックスから溶出させ、電気泳動法分析のために折り返しCEチャネル内へ注入できる。このアプローチは、一部には分子の数によって決定される基本的限度に近い規模でシーケンシングを実施できるので、試薬容量および費用を数桁分も減少させることができる。
マイクロ流体サイクルシーケンシングモジュール(CSM)は、スタンドアロン機能として、およびMINDSシステムのためのマイクロチップに基づくサンプル調製におけるモジュールとして使用できる。CSMは、1)流れを制御するためのオンチップバルブおよびポンプを備えるサンプル調製マイクロ流体デバイスを含有するマイクロチップ、および2)オンチップバルブおよびポンプを通してマイクロチップを作動させるための外部インターフェースを含むことができる。サンプル調製CSMは、キャピラリ(CAE)およびマイクロチップ(μCAE)によるオフチップ分析を行なう200nLサイクルシーケンシング容量を備える16チャネルスケールであってよい。一部の実施形態では、外部流体インターフェース、加熱、および空気作動装置を備えるマイクロチップインターフェースデバイス(MID)は、400チャネル以上へ拡張できる。
CSMを作動させるための機器の特徴は、1)CSMマイクロチップに基づくカートリッジ内の液体移動を制御するオンチップミニロボットの自動化外部作動、2)サーマルサイクリングのための外部加熱および冷却の制御、3)チップへサイクルシーケンシング試薬を送達するためのシリンジポンプの駆動、および4)サンプルをマイクロタイタープレートから注入口内へ移動させ、マイクロチップ排出口からマイクロタイタープレート内へ調製されたサイクルシーケンシングサンプルを取り出すためのTecan MiniPrepロボットの制御、を含むことができる。全4つの要素は、LabRATソフトウエアを通して制御できる。
一部の実施形態では、完全MINDSシステムは、3つのモジュールであるビーズライブライリーモジュール、サイクルシーケンシングモジュール、およびDNA分析モジュールを含むことができる。一部の実施形態では、完全MINDSシステムは、25nLの対合末端読み込みサイクルシーケンシング、対の親和性捕捉クリーンアップ、およびハイパーターンを備える折り返しマイクロチャネル上のμCAE分離を集積化している400チャネルのMINDSマイクロチップ上でビーズに基づくライブラリーを分析できる。MINDSシステムは、ビーズライブラリーの構造に依存して、ショットガンシーケンシングまたは再シーケンシングのための完全自動化システムであってよい。一部の実施形態では、サイクルシーケンシングモジュールおよびDNA分析モジュールは集積化することができ、PCRもしくは精製プラスミドなどの調製されたサンプルは投入サンプルとして使用できる。一部の実施形態では、PCRもしくは他の増幅反応は、マイクロチップ上で実施できる。
DNA分析モジュールは、各対合末端読み込みから標識されたDNAフラグメントを分離および検出するために対合末端読み込みおよびμCAEのサンプルクリーンアップを実行できる。サイクルシーケンシングは、各々が、ベクター内に挿入された固有の親和性捕捉シーケンスを有している順方向および逆方向両方向にプライマを使用できる。フル容量、ナノスケール調製、またはCSMからの対のサイクルシーケンシングサンプルは、放射状デザインを備える分析用マイクロチップのリザーバ内へ装填できる。サンプルは、順方向もしくは逆方向読み込みのどちらかのための親和性捕捉オリゴヌクレオチドを含有する2つのサンプルクリーンアップチャンバ内へ導電学的に移動させることができる。サイクルシーケンシングサンプルは約20nLの容量へ濃縮できるが、他方イオン、組み込まれていない色素、テンプレート、ヌクレオチド、および酵素は廃棄物中へ通過する。濃縮およびクリーンアップされたサンプルは、温度を上昇させることによって遊離させ、分離マトリックスが充填されたマイクロチャネル内で分離のためにTwin Tインジェクタ内へ注入できる。放射状チャネルは環状検出領域に集束するので、そこでマイクロチャネルをスキャンして検出することができる。
3101)によって制御できる。以下に記載するマイクロチップ再生は、使用されたマトリックスのフラッシングおよび再充填を提供するために中央に位置する「へその緒」を用いて適所で実施できるが、リザーバの清掃および再補充は、アウターチューブがバッファもしくは他の溶液を流れさせる間に物質を除去するインナーチューブを備えるチューブ・イン・チューブデザインから行なうことができる。
Nucleic Acids Res. 28:e60に記載されているとおりであってよい。一般に、Borofloatガラス製ウエハ(Schott社、ニューヨーク州ヨンカーズ)は、濃HFで予備エッチングし、次にCVDもしくはスパッタリングによってアモルファスシリコンマスクを沈着させることができる。一部の実施形態では、アモルファスシリコンの代わりにクロム−金を使用できる。HMDSの接着層をアモルファスシリコンの上部にコーティングし、ウエハにフォトレジスト(Shipley社、カリフォルニア州サンタクララ)の薄層をスピンコーティングし、ソフトベークすることができる。フォトレジストは、所望のチャネルパターンを有するマスクを通してUV光線を用いてパターン化できる。フォトレジストが現像された後、露出したアモルファスシリコンは除去し、チャネルパターンは濃塩酸を用いて、流体用ウエハ上のチャネルについては約40μmおよびマニホールドウエハについては約70μmの深さへガラスに化学エッチングすることができる。しかし、様々な構成成分の深さを決定することは、当業者の能力の範囲内に含まれる。残留しているフォトレジストおよびアモルファスシリコンは剥ぎ取ることができる。250μm以下のアクセスホールは、ダイアモンド製ドリルを備えるCNCミニミルを用いてBorofloatバイアウエハ内に穿孔できる。一部の実施形態では、より小さなホールは特注レーザを用いて穿孔できる。製造するために、超音波穿孔は全ホールを同時に穿孔できる。H2SO4/H2O2中での最終洗浄後、流体ウエハおよびバイアウエハは、バイアホールがチャネルギャップと適正にポジショニングされるようにアラインメントし、その後2層μCAEチップを製造するために約570℃の真空炉内でバイアウエハと加熱結合させることができる。5層マイクロチップについては、3枚のガラス製ウエハをアラインメントして最初に組み立てることができる;ガラス層のうちの2枚は薄いウエハであってよい。マニホールドウエハおよび厚さ254μmのPDMSメンブレン(Bisco Silicones社、イリノイ州エルクグローブ)は、UVオゾンクリーナ中で洗浄し、4もしくは5層のマイクロチップを組み立てることができる。UVオゾン処理は、不可逆性ガラス−PDMS結合を作り出すことができる。最終マイクロチップは、個別CSMマイクロチップを製造するためにダイスカットできる、またはMINDSマイクロチップのためにそのままで使用できる。
CSMの機能をDNA分析モジュールと結合すると、コアMINDSシステムを作り出すことができる。上述および図14のCSMマイクロチップの基本ユニットデザインは、8” DNA分析モジュールマイクロチップへ移植することができる。これは100の対合末端読み込み親和性サンプルクリーンアップチャンバおよび分離マイクロチャネルと集積化された対合末端読み込みのための50個の100nLサイクルシーケンシングサンプル調製チャンバを備えたマイクロチップを作製することができる。本システムのサービスは、マイクロチップを作動および再生させるためにマイクロ流体およびミニロボット型オンチップ機能を使用できる。サンプルを装填するために外部オートメーションを含む実施形態では、コアMINDSシステムは、現行方法に比較して実質的に減少したコストで1日当たり7M塩基の高品質シーケンスを生成できる。
磁性ビーズに結合したモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を含む希釈溶液からのモデル標的微生物の捕捉を使用すると、BPMマイクロデバイス内へ導入するための濃縮精製物質を提供できる。ここでは、本発明者らは、大腸菌のO157菌株に対する抗体と結合したDYNAL(登録商標)ビーズの使用について記載する。本発明者らは、3シリーズの実験を実施した:(1)希釈ストックから大腸菌を捕捉する、(2)高度に過剰のバシラス菌の存在下で大腸菌を捕捉する、および(3)Baltimoreエアサンプラからのエアロゾルサンプルから大腸菌を捕捉する。
捕捉化学は、最初はチューブ内で250μLの容量で試験し、バッファ中に分散させたモデル微生物を用いて捕捉および洗浄を最適化した。図36は、DYNAL(登録商標)ビーズに結合したモノクローナル抗体を用いた大腸菌の代表的な捕捉を示している。大腸菌O157は、250μLのPBS/Tween中の様々な濃度で含まれる抗大腸菌O157抗体と結合した5μLのビーズへ添加した。この混合物を回転式ミキサで10分間混合した。ビーズは、強力磁石を用いてチューブの側面に引き寄せ、上清を除去した。ビーズは、250μL PBS/Tween(PBST)を用いて3回洗浄した。洗浄したビー酢を250μLのPBST中に再懸濁させ、捕捉した大腸菌をTSA上で計数した。
ビーズに基づく捕捉法の特異性を決定するために、本発明者らは、添加されたBacillus cereus(ATCC 11778)細胞が、抗体のコーティングされたビーズへの大腸菌の結合に及ぼす影響を標準アッセイ条件下で試験した。約104 E. coli/mLの懸濁液を様々な力価のB. cereusと混合し、上述したようにIMSを実施したが、ただし回収は選択的にB. cereusを阻害するレベルで添加されたテトラゾリウムを備えるTSA培地上で実施した。これは細胞混合物の直接平板培養を許容したが、複製してコロニー形成単位(CFU)として定量できたのは大腸菌だけであった。
本発明者らは細菌細胞を効率的に捕捉、精製、および回収できることを証明したので、Spector Industries社の御厚意により90%(v/v)のBaltimoreエアサンプラ由来液体(BASL)サンプルを含有する溶液から大腸菌O157を回収することに拡大したいと考えた。BASLは、潜在的に抗体媒介性結合および回収を妨害する可能性がある、極めて多種多様な競合する微生物、花粉、ならびにその他の化学物質および生物学的物質を含有している。
本発明者らは、干渉化合物が貫流するのを許容しながら小さな表面上に分析物を結合させる、リットル量のサンプル容量まで処理できるオフチップ型のディスポーザブル式フロースルーデバイスについてSPEを評価した。最終的に、標的分析物は、マイクロチップに基づくバイオプロセッサによる下流処理のために濃縮形で回収できる、またはSPE物質自体をマイクロチップのためのフィードストックとすることができる。
図40は、25,000もしくは45,000CFU/mLの相当に高濃度の細菌を含むサンプルを用いて、装填したサンプル中、ならびにSPE後上清(未結合)および溶出液中の細菌濃度の関数としての細菌アッセイの結果を示している。この範囲内では、80〜90%の大腸菌がSPEマトリックス中に保持されるが(図41)、少量の細菌は通過し、極めて少量(1%)は逆流洗浄によって回収される。そこで、シリカ上では強力な結合が示され、生育細胞の溶出は極めて少ない。125および250CFU/mLの極めて低い力価では、比例してより多くの細胞がカラムを通過し、約20%しか保持されない(データは示していない)。
一部の実施形態は、生体材料を捕捉または精製するためにアガロースに基づく「Big
Bead」を使用する。市販で入手できるβ−ガラクトシダーゼ(Sigma社)を0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)、1mMのMgCl2中に100および10ng/mLの2種の濃度で溶解させた。これらの2種の溶液は、50Åの孔径を備える100mgの50μmシリカ粒子を含有する「Extract−Clean」 SPEカートリッジ(Alltech社)、または500μmの硬化アガロースビーズを含む5mLの「Big Bead」カラムに通過させた。アガロースおよびシリカ由来培地の両方に対して、酵素溶液(20mL)に約5mL/分の流量でそれらの各SPE床を貫流させ、上清を収集し、カートリッジを2mLのバッファで約1mL/秒の流量でバックフラッシュした。上清および溶出液は、基質としてo−ニトロフェニル−β−ガラクトシド(ONPG)を用いて酵素活性について分析した。
本発明者らは、アガロースBig Beadカートリッジが大腸菌のDH5α菌株に選択的に結合して濃縮する能力を評価した。図43は、2,000または4,700CFU/mLの初期細胞濃度で実施されたBig Bead捕捉実験から入手した分画中の大腸菌DH5αの分布を示している。これらの実験は、104または103CFU/mLで20mLの細菌懸濁液を用いて、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)、1mMのMgCl2中で実施した。このアッセイは、TSAプレート上の増殖であった。低力価(2,000CFU/mL)では、>70%の細菌がフロースルー分画中で、バックフラッシュした溶出液中では1%未満が回収された。高力価(4,730CFU/mL)では、>80%の細菌がフロースルー分画中で、溶出液中では5%未満が回収された。したがって、Big Beadマトリックスに結合したままなのは25〜10%の細菌だけであった。
マイクロ流体デバイスの超微細加工は、本質的にはLiu et al. 2000.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10):5369−5374によって記載されたように実施した。手短には、Borofloatガラス製ウエハを洗浄し、アモルファスシリコン製マスクを沈着させ、その後にHMDS層およびフォトレジスト層を接着させた。フォトレジストは、マスクを通して紫外線を用いてパターニングし、チャネルパターンは濃HFを用いて、典型的には流体ウエハ上のチャネルについては40μm、およびマニホールドウエハについては70μmの深さへ化学エッチングした。フォトレジストおよびアモルファスシリコンは剥ぎ落とし、アクセスホールはダイアモンドドリルを備えるCNC−ミニミルを用いて穿孔した。これらの穴は、4層マイクロチップにおいて反応および検出チャンバとして使用できる。または、本発明者らは、全部の穴を同時に穿孔するためには超音波穿孔を使用するであろう。洗浄後、流体用ウエハおよびバイアウエアをアラインメントし、熱結合させた。4層マイクロチップを作製するために、マニホールドウエハおよびPDMSメンブレンを加えた。
このバイオプロセッサモジュールは、上流のエアサンプルコレクタもしくは他の投入デバイスからサンプルを受け入れ、保存および再検査のためのアリコートを作製し、サンプルを溶解し、サンプルを調製して標識し、さらにそれらを分析のために単分子蛍光相関検出器へ排出する。バイオプロセッサモジュールは、流体デバイスを含有するディスポーザブルのプラスチック製カートリッジおよびカートリッジを作動させる機器を含んでいる。
サンプル濃縮モジュール。マクロスケールで開始され、標的微生物の表面エピトープに対する抗体を用いて修飾された磁性ビーズが、チャンバ内のミリリットル容量のエアコレクタ210の排出物(または他のマトリックスから生成したスラリ)へ加えられる(図8)。ビーズは、個別微生物、サブタイプ、種などに特異的な抗体を用いてコーティングされた数セットのビーズの混合物である。インテロゲートされる微生物の範囲は、追加の試薬混合物を用いて拡張できる。ビーズは標的微生物を捕捉し、その間に不純物は洗浄によって除去される−第一次元の選択性および特異性が提供される。標的微生物を含有するビーズは、SCPM211内で磁石によって収集される。
EXPARは、オリゴヌクレオチド配列、熱安定性ポリメラーゼ、およびニッキング酵素を用いる、60℃でDNAの短いセグメントを特異的に増幅させるための高速等温法である。生成物は、蛍光またはMSによって検出される。EXPAR反応は、NanoBioProcessorで遺伝子検査、遺伝子発現測定、分子診断学、生物兵器防衛およびその他の用途のために実施できる。
RiboMaker検出システムは、人工プロモータ複合体(APC)およびRiboLog(商標)と呼ばれるヌクレオチドアナログを用いる、abscription(商標)と称するRNAポリメラーゼ(RNAP)転写の不稔開始に基づいている。APCは、50〜450個のトリヌクレオチド不稔生成物/分/部位を生成するためにRNAPポリメラーゼのための開始部位を提供する。検出は、MS分析、蛍光、化学発光、または当業者によく知られている他の方法によって行うことができる。DNAもしくはRNA分析のためには、APCは、標的部位プローブに対する特異性を提供するフランキング配列を有することができる。相違する質量単位を備えるRiboLogは、どの部位が結合しているかを同定できる。インテロゲートすべき配列の様々な部分へ複数のAPCを結合させることによって、RiboLogのフィンガープリントは、擬陽性および擬警報を排除するのに役立つ、生物兵器防衛のための追加の特異性情報を提供できる。タンパク質については、APCユニットは抗体に結合させることができる。RiboMaker検出は、高速で、線形であり、PCRに比較して阻害に対して低感受性であると主張されている。
16チャネルマイクロチップ270の実施形態は、図23に示されている。バルブおよびポンプのための作動ライン271は、垂直に走り、外部作動ラインを接続できるマイクロチップの底部上のバイアで終了するように図示されている。サイクルシーケンシング混合物は、シリンジポンプによって左側のチャネル272へ、そしてマイクロチップを再生させるための水もしくはバッファは右側のチャネル273に供給される。これらの「サービス」チャネルはどちらも、全16チャネルに供給するために多重化されており、流れを制御するために各々オンチップポンプもしくはバルブ274を有している。このマイクロチップは、ガラス製ウエハおよびPDMSメンブレンから4層デバイスとして構築されている。
完全MINDSシステムを作製するためには、コアMINDSシステムからの機器が修正される:1)ビーズサービスチャネルが加えられ、個々のビーズを送達するためのビーズ分類法とインターフェースされる;2)マイクロチップインターフェースデバイス上の抵抗加熱器デザインおよび電極リングがマイクロチップへ改造される;3)単独ビーズが繰り返し装填されたり取り除かれたりすることを保証するためのマイクロチップの修正。
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- 本願明細書に記載された発明。
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