JP2008538924A - モナチン及びその前駆体の生成のためのポリペプチド及び生合成経路 - Google Patents

モナチン及びその前駆体の生成のためのポリペプチド及び生合成経路 Download PDF

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Abstract

グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルベート、及び２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸からのモナチンの生成に用いることのできる方法及び組成物が提供される。インドール−３−ピルベート及び２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸中間体の製造方法も開示される。提供される組成物には、核酸分子、ポリペプチド、化学構造物、及び細胞が含まれる。方法には、生体外及び生体内での工程が含まれ、該生体外での方法には、化学反応が含まれる。

Description

発明の分野
本開示は、インドール−３−ピルベート、２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）及び／又はモナチンの生成に有用なポリペプチド及び生合成経路を提供する。
インドールピルベート
インドール−３−ピルベートは、高酸素濃度下の組織中で酸化的ストレスを中和すると考えられている強力な抗酸化剤である（Ｐｏｌｉｔｉら．「トリプトファン研究の最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、Ｇ．Ａ．Ｆｉｌｉｐｐｉｎｉら編集．プレナム出版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９６年、２９１−８頁）。インドールピルベートは、インドール−酢酸（ＩＡＡ）、主な植物増殖ホルモンであるオーキシン（拡散性増殖促進因子）を生成する経路の中間体でもある。ＩＡＡは、頂芽優性、屈性、芽の伸長、形成層細胞分裂の誘導、及び発根開始を含む生理学的過程の範囲において、１マイクログラム未満の量で活性を有する。合成オーキシンは、園芸で用いられ、発根を誘導し、果実の挿し木及び発達を促進する。高濃度では、合成オーキシンは広葉植物に対する効果的な除草剤となる。発酵により作られる天然のオーキシンは、化学的に作られた除草剤よりも環境に優しいと考えられる。発生調節剤は、１９９９年の全世界における売り上げが、４億ポンド（１４億米国ドル）であった。
インドール酢酸及びその誘導体についての特許の例としては、以下のものが含まれる：米国特許第５，８４３，７８２号オーキシンを培養培地中に用いたバラ科植物のマイクロプロパゲーション及び米国特許第５，９５２，２３１号バラ科植物のマイクロプロパゲーション。
植物関連の有用性に加え、インドール酢酸は医薬的用途にも有用である。例えば、米国特許第５，１７３，４９７号「α−オキソピロロ［２，３−Ｂ］インドール酢酸及びその誘導体の調製方法」には、アルツハイマー病や老年性痴呆に伴う記憶障害の治療におけるこれらの化合物の使用が提案されている。米国特許第５，１７３，４９７に提案される機構は、これらの化合物がアセチルコリンエステラーゼポリペプチドを阻害し、脳内のアセチルコリン濃度を上昇させるというものである。
インドール−３−カルビノールは、ペルオキシダーゼにより触媒される酸化によりインドール−３−酢酸から生成され、容易にジインドリルメタンに変更することが可能である。両化合物は、毒素を除去し、女性の健康に有益なホルモンの産生を促進することが報告されている。
トリプトファン誘導体
塩素化されたＤ−トリプトファンは非栄養性甘味料として同定され、他の誘導体の探求への関心も高まっている。モナチンは、その組成においてアミノ酸のトリプトファンに類似する天然甘味料である。モナチンは、南米の低木、スクレロチトン・イリシフォリウス（Ｓｃｌｅｒｏｃｈｉｔｏｎ ｉｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ）の根の樹皮から抽出でき、飲食料品業界において強力な甘味料として期待されている。モナチンに関する特許の例には、以下のものが含まれる：米国特許第５９９４５５９号 強力な天然甘味料モナチン−Ａの合成、米国特許第４９７５２９８号 ３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブト−４−イル）−インドール化合物、米国特許第５１２８１６４号 ３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブト−４−イル）−インドール化合物を含む食用組成物；及び米国特許第５１２８４８２号 ３−１（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブト−４−イル）−インドールの製造方法。
ここに記載されるモナチン前駆体のいくつかについても、合成甘味料又はモナチン誘導体の合成中間体として有用であろう。
発明の簡単な説明
本開示は、グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸から、及び／又はインドール−３−ピルベート及び２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸といったモナチン前駆体を通じてモナチンを作り出す種々の生合成経路を提供する。モナチン、インドール−３−ピルベート、及び２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の作製に使用可能なペプチド及び核酸配列も開示されている。簡潔化のため、明細書及び請求の範囲において中間体／生成物（例えば、モナチン又はモナチン前駆体）が形成されたと記載された場合、「及び／又はその塩」という用語は適用可能な場合には包含されているものと解釈されるべきである。換言するならば、例えば、「インドール−３−ピルベートはモナチン前駆体に変換される」という表現は、「インドール−３−ピルビン酸はモナチン前駆体並びに及び／又はその塩に変換される」であると解釈されるべきである。実際、当業者であれば、示された反応条件下において中間体／生成物の塩が実際に存在しているか又は共に存在するかを理解するであろう。
モナチンは、１種類以上の適切な基質及び１種類以上の選択されたポリペプチドを含む反応混合物を反応させて生成することができる。適切な基質には、グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸、モナチン前駆体（インドール−３−ピルベート及び２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸のような）、並びにその混合物が含まれるが、これに限定されることはない。前記反応混合物に存在するモナチン生成に適切な基質は、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は反応混合物中でその場所で（ｉｎ ｓｉｔｕ）生成されてもよい。前記選択されたポリペプチドは、反応混合物に添加されてもよく、更に／又は前記反応混合物中に存在する微生物により生成されてもよい（例えば、前記反応混合物を、前記選択されたポリペプチドを発現する微生物で発酵させることにより）。
モナチンは、インドール−３−ピルベート、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（モナチン前駆体、ＭＰ、モナチンのα−ケト型）、インドール−３−乳酸、トリプトファン、及び／又はグルコースを通じて生成することができる（図１）。図１−３及び１１−１３に示される、基質を第一の生成物に変換し、その後に該第一の生成物を第二の生成物に変換し、所望の最終生成物が造られるまでこれを続けることを必要とするモナチン又はその中間体の生成又は製造方法が開示されている。
図１−３及び１１−１３には、可能性のある中間生成物と最終生成物が枠内に示されている。例えば、グルコースからトリプトファン、トリプトファンからインドール−３−ピルベート、インドール−３−ピルベートからＭＰ、ＭＰからモナチン、又はインドール−３−乳酸（インドール−ラクテート）からインドール−３−ピルベートへといった、１つの生成物の別のものへの変換は、これらの方法を用いて行なうことができる。これらの変換は、化学的又は生物学的に促進することができる。「変換」という用語は、化学的方法又は第一の中間体を第二の中間体へと変化させる反応中のポリペプチドのいずれかを用いることを意味する。「化学変換」という用語は、ポリペプチドにより能動的に促進されない反応を意味する。「生物学的変換」という用語は、ポリペプチド（例えば、酵素）により能動的に促進される反応を意味する。変換は、生体外又は生体内で起こることが可能である（例えば、適切な微生物により栄養ブロスを発酵させることによる）。生物学的変換が用いられる場合には、ポリペプチド及び又は細胞は、ポリマーの支持体上に化学的に結合させるなどにより支持体に固定することができる。前記変換は、当業者に公知のあらゆる反応器を用いることで、例えば、バッチ又は連続反応器中にて達成することができる。
第一のペプチドを基質と接触させて第一の生成物を作り、次に造られた該第一の生成物を第二のポリペプチドと接触させて第二の生成物を造り、次に造られた該第二の生成物を第三のポリペプチドと接触させて例えばモナチンなどの第三の生成物を造ることを含む方法も提供される。使用されるポリペプチド及び生成される生成物は、図１−３及び１１−１３に示されている。
図１−３及び１１−１３に示す変換の実施に使用できるポリペプチドとそのコーディング配列が開示されている。いくつかの例においては、基質特異性及び／又はポリペプチドの活性を変化させることが可能な１以上の点変異を有するポリペプチドを用いてモナチンを作っている。
モナチンを生成する単離された組換え細胞が開示されている。これらの細胞は、植物、動物、菌類、酵母、藻類、古草菌、又は真菌細胞のようないかなる細胞でもよい。これらの細胞を用いて、該細胞を含む栄養培地を発酵させることによりモナチンを合成することができる。該栄養培地には、グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸、及び／又はインドール−３−ピルベート及び２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸といったモナチン前駆体を含むモナチンの合成に適したあらゆる分子が含まれていてもよいが、これに限定されるものではない。
特定の例では、開示される細胞は以下の活性を１種類以上、例えば、以下の活性を２種類以上又は３種類以上含む：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．５）、複数基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．２８）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２）、トリプトファンオキシダーゼ（ＥＣ番号無し、Ｈａｄａｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ １２５：１０９６−１１０４、１９７６及びＦｕｒｕｙａら、Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６４：１４８６−９３、２０００）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３）、Ｄアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）又は４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）といったシンターゼ／リアーゼ（ＥＣ４．１．３．−）、シンターゼ／リアーゼ（４．１．２．−）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（Ｋｏｈｉｂａ及びＭｉｔｏ、第８回ビタミンＢ６及びカルボニル触媒に関する国際シンポジウムの議事録、大阪、日本１９９０年）、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ、ＥＣ２．６．１．４２）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）及びロイシン（分枝鎖）デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）。
別の例では、細胞は以下の活性を１種類以上、例えば、以下の活性を２種類以上又は３種類以上含む：インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２３７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−ｎ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１１）、乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．−）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）又は４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）といったシンターゼ／リアーゼ（４．１．３．−）、シンターゼ／リアーゼ（４．１．２．−）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．２８）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．５）、複数基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ、ＥＣ２．６．１．４２）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）、ロイシン（分枝鎖）デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．９９．１）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、及び／又はＤアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）。
更に、開示される細胞は以下の活性を１種類以上、例えば、以下の活性を２種類以上又は３種類以上含む：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．５）、複数基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．２８）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２）、トリプトファンオキシダーゼ（ＥＣ番号無し）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）、インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２３７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１１）、乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．−）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）又は４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）といったシンターゼ／リアーゼ（４．１．３．−）、シンターゼ／リアーゼ（４．１．２．−）、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ、ＥＣ２．６．１．４２）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）、ロイシン（分枝鎖）デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）及び／又はＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ。
モナチンは、トリプトファン及び／又はインドール−３−乳酸を、トリプトファン及び／又はインドール−３−乳酸をインドール−３−ピルベートに変換する第一のポリペプチドと接触させ（Ｄ又はＬ型のトリプトファン又はインドール−３−乳酸をインドール−３−ピルベートへ変換される基質として用いることができる；当業者であれば、本工程のために選択されたポリペプチドが理想的に適切な特異性を示すことを理解するであろう）、生じたインドール−３−ピルベートを、インドール−３−ピルベートを２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）へと変換する第二のポリペプチドと接触させ、該ＭＰを、ＭＰをモナチンへと変換する第三のポリペプチドと接触させることを含む方法により生成することができる。上記変換に用いることのできる典型的なポリペプチドを図２及び３に示す。
本発明の別の局面からは、ＭＰのような組成物、並びに、少なくとも１種類の外来性核酸配列にコードされる少なくとも２種類のポリペプチド、又は時として少なくとも３種類又は少なくとも４種類のポリペプチドを含む細胞が提供される。
本開示の上記及び他の局面は、以下の詳細な説明及び例示から明らかである。
配列表
添付される配列表に列挙される核酸及びアミノ酸の配列が、ヌクレオチド塩基については標準文字の略号を用い、アミノ酸については３文字コードを用いて示されている。各核酸配列のうち１本鎖のみが示されているが、しかし、表示される全ての鎖についての言及において相補鎖も含まれているものと理解すべきである。
配列番号１及び２は、それぞれシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）由来のアミノトランスフェラーゼの核酸及びアミノ酸配列を示す（文字通り、チロシン又は芳香族アミノトランスフェラーゼと呼ばれるｔａｔＡ遺伝子）。
配列番号３及び４は、それぞれロドバクテル・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（２．４．１）由来のチロシンアミノトランスフェラーゼの核酸及びアミノ酸配列を示す（ｔａｔＡ（配列番号１及び２）との相同性から、ゲノミクス用ソフトウェアにより「アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ」であると予想された）。
配列番号５及び６は、それぞれロドバクテル・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（３５０５３）由来のアミノトランスフェラーゼの核酸及びアミノ酸配列を示す（配列番号３及び４の２．４．１の配列に基いてクローニングされた新規な配列）。
配列番号７及び８は、それぞれ大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）由来の広範囲の基質に対するアミノトランスフェラーゼ（ｂｓａｔ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。
配列番号９及び１０は、それぞれバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。
配列番号１１及び１２は、それぞれラクトバシラス・アミロヴォラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）由来の芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ）の新規な核酸及びアミノ酸配列を示す（相同性により芳香族アミノトランスフェラーゼと同定された）。
配列番号１３及び１４は、それぞれＲ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（３５０５３）由来の複数基質アミノトランスフェラーゼ（ｍｓａ）の核酸及びアミノ酸配列を示す（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡＥＯ１００００９３．１，ｂｐ１４７４３−１６１５５及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＺＰ００００５０８２．１に対する相同性により複数基質アミノトランスフェラーゼと同定された）。
配列番号１５−１６は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）配列のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号１７−１８は、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｔａｔＡ配列のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号１９−２０は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｒａＴアミノトランスフェラーゼ配列のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号２１−２２は、ロドバクテル・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（２．４．１及び３５０５３）の複数基質アミノトランスフェラーゼ配列のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号２３−２４は、大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）のｂｓａｔ配列のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号２５−２６は、ラクトバシラス・アミロヴォラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のａｒａＴ配列のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号２７−２８は、Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のｔａｔＡ配列（２．４．１及び３５０５３の両方）のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号２９−３０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｓｐＣ配列（遺伝子配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＥＯＯＯ１９５．１、タンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＣ７４０１４．１）のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号３１及び３２は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の芳香族アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。
配列番号３３−３４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｙＢ配列のクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号３５−４０は、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＫＨＧ）（ＥＣ４．１．３．１６）活性を有するポリペプチドのクローニングに使用されたプライマーを示す。
配列番号４１及び４２は、Ｐ００９１３（ＧＩ：４０１１９５）及びＰ３１０１３（ＧＩ：４０１２０１）のタンパク質をコードする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のトリプトファナーゼ（ｔｎａ）及びシトロバクテル・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）由来のチロシンフェノール−リアーゼ（ｔｐｌ）の核酸配列を示す。
配列番号４３−４６は、トリプトファナーゼポリペプチド及びβ−チロシナーゼ（チロシンフェノールリアーゼ）ポリペプチドのクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号４７−５４は、トリプトファナーゼポリペプチド及びβ−チロシナーゼポリペプチドの変異に用いたプライマーを示す。
配列番号５５−６４は、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）活性を有するポリペプチドのクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号６５及び６６は、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来の４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ｐｒｏＡ）の核酸及びアミノ酸の配列をそれぞれ示す。
配列番号６７−６８は、ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣ中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｓｐＣを有するオペロン内へのＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ｐｒｏＡ）のクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号６９−７２は、ｐＥＳＣ−ｈｉｓ内への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｓｐＣ及びＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ｐｒｏＡのクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号７３−７４は、ここに開示する遺伝子のクローニングに用いたプライマーの５’末端に付加された配列を示す。
配列番号７５−７６は、ＨＥＸ遺伝子及び遺伝子産物の核酸及びアミノ酸の配列（ＮＣＢＩ 受託番号１ ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）（ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼアミノ酸配列）をそれぞれ示す。
配列番号７７−７８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）又は変異ａｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＨＥＸ）の遺伝子配列のクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号７９−８０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒｂ）のクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号８１−８２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ ２９１９１）のｋｈｇ遺伝子のクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号８３及び８４は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のｋｈｇ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：．ＡＥ００８６９２．１ ＧＩ：５６５４２４７０）及び遺伝子産物（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）の核酸及びアミノ酸の配列をそれぞれ示す。
配列番号８５−８６は、タンパク質ＧＩ：１７８８７２２（タンパク質同定番号ＡＡＣ７５４３８．１）をコードする２４９６３１７−２４９５０７９番目の塩基のＧＩ：４８９９４８７３としてＮＣＢＩに寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｆｄＺ遺伝子配列のクローニングに用いたプライマーを示す。
配列番号８７及び８８は、リゾビウム・レグミノサラム・ビオヴァル・ヴィシエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ ｖｉｃｉａｅ）ｒｈｉｚ２３ｇ０２−ｐ１ｋ １００９ ３４１（サンガー研究所）由来のアルドラーゼの核酸及びアミノ酸の配列をそれぞれ示す。
複数の実施態様の詳細な説明
省略形及び用語
以下の用語及び方法の説明の提供により、よりよく本開示内容を説明し、当業者を本開示内容の実施へと導く。ここで用いられる「包含する」は「含む」ことを意味する。加えて、文脈から他に明確に示されない限りは、単数形には複数形での意味も含まれる。例えば、「タンパク質を含む」という言及には、１つ又は複数のそのようなタンパク質が含まれており、また、「前記細胞を含む」という言及には、１つ又はそれよりも多くの細胞、及び当業者に公知なそれに相当するもの等についての言及が含まれる。「約」という用語には、いずれかの測定において生じる実験誤差の範囲が含まれる。他に記載がない限り、全ての測定数値は、「約」という単語が明確に使用されていない場合であっても、該単語「約」をその数値の前に有しているものと仮定する。
他に説明のない限り、ここで用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、本開示内容が属する技術分野の当業者に一般的に理解される意味と同様の意味を有する。ここに記載される方法及び原料と類似する方法及び原料又は同一の方法及び原料を本開示内容の実施又は試験に用いることは可能であるが、適切な方法及び原料は下記に説明される。該原料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、制限を設けることを意味するものではない。本開示内容のその他の特徴及び優位性は、以下の詳細な説明及び請求の範囲から明らかである。
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部の非コーディングセグメント（イントロン）及び転写を決定する制御配列を含まないＤＮＡの断片。ｃＤＮＡは、細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡから逆転写することにより実験室で合成することが可能である。
保存的置換：ポリペプチド内にける１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換であり、該ポリペプチドの活性に対して微細ないし皆無の影響を有するもの。該置換は、変換されたアミノ酸が構造的又は機能的に類似することが判明するかどうかに関わらず、保存的であるものと考えられる。例えば、理論上、１又はそれ以上の保存的置換を含むトリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を維持する。ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ又は当該技術分野で公知の他の方法のような標準的な方法を用いて、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することにより１又はそれより多くの保存的置換を含むように生成することが可能である。
タンパク質内の本来のアミノ酸を置換でき、該ポリペプチドの活性に対しての影響が微細ないし皆無である場合に保存的置換とみなすことができるアミノ酸の非限定的な例には、以下のものが含まれる：Ｓｅｒ又はＴｈｒで置換されたＡｌａ；Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓで置換されたＡｒｇ；Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐで置換されたＡｓｎ；Ａｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎで置換されたＡｓｐ；Ｓｅｒ又はＡｌａで置換されたＣｙｓ；Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇで置換されたＧｌｎ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐで置換されたＧｌｕ；Ｐｒｏで置換されたＧｌｙ；Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｙｒで置換されたＨｉｓ；Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅで置換されたＩｌｅ；Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅで置換されたＬｅｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇで置換されたＬｙｓ；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅで置換されたＭｅｔ；Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕで置換されたＰｈｅ；Ｔｈｒ、Ａｌａで置換されたＳｅｒ；Ｓｅｒ又はＡｌａで置換されたＴｈｒ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒで置換されたＴｒｐ；Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐで置換されたＴｙｒ；並びにＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕで置換されたＶａｌ。
とりわけ他の部位における、保存的置換についての更なる情報は、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら、（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７，１９８７）、Ｏ’Ｒｅｇａｎら、（Ｇｅｎｅ ７７：２３７−５１，１９８９）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈら、（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．３：２４０−７，１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１３２１−５，１９８８）、ＷＯ００／６７７９６（Ｃｕｒｄら．）並びに遺伝学及び分子生物学の標準的教科書において見つけることができる。
由来する：本明細書と請求項の目的のため、以下の１以上のものが当てはまる場合には、その物質は生物又は供給源に「由来する」：１）該物質が、該生物／供給源に存在する；２）該物質が天然の宿主から取り出されている；又は、３）該物質が、天然の宿主から取り出され、例えば変異誘発等により進化している。
酵素的に生成する：「酵素的に生成する」というフレーズ、又は「酵素的に生成された」若しくは「酵素的に合成された」等の類似するフレーズは、少なくとも１種類のポリペプチドを生体外（例えば、試験管又は反応器で１種類以上のポリペプチドを用いる）、又は生体内（例えば、細胞全体内又は発酵反応）のいずれかで用いた生成物（モナチン等）の製造を意味する。生成物を「酵素的に生成する」ことは、化学的な試薬又は反応の使用を除外するものではない一方で、該生成物の製造において少なくとも１つの反応を促進する少なくとも１種類のポリペプチドの使用を包含する。
外来性：ここで核酸及び特定の細胞との関係において用いられる「外来性」という用語は、自然界に見出される状態にある該特定の細胞に由来しない全ての核酸を意味する。従って、非天然の核酸は、細胞に導入されれば該細胞にとって外来性のものとして考慮される。天然の核酸についても、特定の細胞にとっては外来性と成りうる。例えば、個人Ｘの細胞から単離された全染色体は、個人Ｙの細胞に関しては、該染色体がＹの細胞に導入されれば外来性の核酸である。
機能的に同等：同等な機能を有すること。酵素に関しては、機能的に同等な分子には、該酵素の機能を保持する異なる分子が含まれる。例えば、機能的同等物は、酵素の配列において、１以上の配列変異が、変異を伴わないペプチドの酵素活性のような機能を保持する配列変異により提供できる。特定の例では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼの機能的同等物は、トリプトファンをインドール−３−ピルベートに変換する能力を保持する。
配列変異の例としては、保存的置換、欠失、変異、フレームシフト及び挿入が挙げられるが、これに限定されるものではない。１つの例で、任意のポリペプチドがある抗体に結合し、機能的同等物は同じ抗体に結合するポリペプチドである。従って、機能的同等物には、あるポリペプチドと同じ結合特異性を有し、該ポリペプチドの代わりの試薬として使用可能なペプチドが含まれる。１つの例では、ある機能的同等物が、結合配列が非連続的であるが、抗体がその直線エピトープに結合するポリペプチドを含む。従って、ペプチドの配列がＭＰＥＬＡＮＤＬＧＬ（配列番号１２のアミノ酸１−１０）の場合には、機能的同等物には、以下のように表わすことが可能な非連続的エピトープが含まれる（＊＊＝介在するアミノ酸の全ての数値）：ＮＨ２−＊＊−Ｍ＊＊Ｐ＊＊Ｅ＊＊Ｌ＊＊Ａ＊＊Ｎ＊＊Ｄ＊＊Ｌ＊＊Ｇ＊＊Ｌ−ＣＯＯＨ。この例において、前記ポリペプチドは、該ポリペプチドの３次元構造が配列番号１２のアミノ酸１−１０に結合するモノクローナル抗体に結合可能である場合には、配列番号１２のアミノ酸１−１０と機能的に同等である。
ハイブリダイゼーション：ここで用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの核酸分子のヌクレオチド配列の相補性についての、相補的な１本鎖ＤＮＡ及び／又はＲＮＡが２重分子を形成する能力に基く試験方法を意味する。核酸のハイブリダイゼーション技術を用いて本開示内容の範囲内にある単離された核酸を得ることが可能である。簡潔には、配列番号１１に記載される配列と一定の相同性を有するいかなる核酸をプローブとして用いて、中程度から非常にストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにより類似する核酸を同定することが可能である。同定された後には、該核酸は、精製し、シーケンスし、解析することで本開示内容の範囲に含まれるかどうかを決定することができる。
ハイブリダイゼーションは、サザン又はノーザン解析により行なわれ、プローブにハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡ配列をそれぞれ同定することが可能である。前記プローブは、ビオチン、ジゴキシゲニン、ポリペプチド、又は３２Ｐといった放射性同位体により標識できる。前記ＤＮＡ又はＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「（１９８９）分子クローニング法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、プレインヴュー、ニューヨーク州」の第７．３９−７．５２章に記載される方法のような当業者にとって周知の標準的手法を用いて、アガロース又はポリアクリルアミドのゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロール、ナイロン又はその他の適切なメンブランに移し、プローブとハイブリダイズさせることが可能である。典型的には、プローブは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さにある。例えば、配列番号１１に記載される隣接する２０ヌクレオチドの配列に対応するプローブを用いて同一又は類似の核酸を同定することが可能である。更に、２０ヌクレオチドよりも長い又は短いプローブを用いることもできる。
また、本開示内容は、少なくとも約１２塩基の長さにあり（例えば、少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、又は５０００塩基の長さ）、ハイブリダイゼーション条件下において、配列番号１１に示される配列を有する核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖にハイブリダイズする単離された核酸の配列を提供する。該ハイブリダイゼーション条件は、中程度に又は非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であってもよい。
本開示内容の目的として、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、ハイブリダイゼーションが、２５ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０μｇ／ｍＬの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、及び１−１５ｎｇ／ｍＬのプローブ（約５ｘ１０7ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリダイゼーション溶液中で約４２℃にて行なわれる一方で、洗浄が２×ＳＳＣ及び０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む洗浄用溶液で約５０℃にて行なわれることを意味する。
非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、ハイブリダイゼーションが、２５ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０μｇ／ｍＬの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、及び１−１５ｎｇ／ｍＬのプローブ（約５ｘ１０7ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリダイゼーション溶液中で約４２℃にて行なわれる一方で、洗浄が０．２×ＳＳＣ及び０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む洗浄用溶液で約６５℃にて行なわれることを意味する。
単離された：ここで用いられる「単離された」という用語は、その天然宿主から取り出された全ての物質について言及される；該物質は生成される必要はない。例えば、「単離された核酸」は、該核酸が由来する生物の天然のゲノムでは該核酸が隣接する両隣の配列（１つは５’末端で１つは３’末端）に隣接してない天然の核酸を意味する。例えば、単離された核酸は、これに制限されることはないが、天然のゲノムにおいて通常その組換えＤＮＡ分子に隣接して見付かる核酸配列の１つが取り除かれている又は欠如している場合には、いかなる長さの組換えＤＮＡであってもよい。従って、単離された核酸には、ベクター、自然に複製されるプラスミド、ウィルス（例えばレトロウィルス、アデノウィルス、又はヘルペスウィルス）又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに挿入された組換えＤＮＡと共に、他の配列とは独立した分離された分子（例えば、ｃＤＮＡ又はＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処理により作られたゲノムＤＮＡの断片）として存在する組換えＤＮＡが含まれるが、これに限定されることはない。これに加え、単離された核酸には、ハイブリッド又は融合核酸配列の部分である組換えＤＮＡ分子が含まれていてもよい。
非天然の核酸配列は自然界に見出されず、天然のゲノムにおいても隣接する配列を有しないのであるから、ここで核酸との関連で用いられる「単離された」という用語には、あらゆる非天然の核酸も含まれる。例えば、操作された核酸等の非天然の核酸は、単離された核酸であるものと考慮される。操作された核酸は、通常の分子クローニング又は化学的核酸合成の手法により作り出すことが可能である。単離された非天然の核酸は、他の配列から独立しているか、又はベクター、自然に複製するプラスミド、ウィルス（例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、又はヘルペスウィルス）、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに挿入されていてもよい。更に、非天然の核酸には、ハイブリッド又は融合核酸配列の部分である核酸分子が含まれていてもよい。
例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリー、又はゲノムＤＮＡの制限酵素消化物を含むゲル切片に含まれる数１００ないし数１００万個の他の核酸分子の中に混在する核酸は、単離された核酸としては考慮されない。
核酸：ここで用いられる「核酸」という用語には、ＲＮＡ、並びに、これらに制限されないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成（例えば化学的に合成された）ＤＮＡを含むＤＮＡの両方が包含される。該核酸は、二本鎖又は一本鎖でもよい。一本鎖の場合には、該核酸は、センス鎖又はアンチセンス鎖であってもよい。更に、核酸は環状又は直線状であってもよい。
機能的に連結している：第一の核酸配列が、第二の核酸配列と機能的に関連して配置された場合であれば、該第一の核酸配列は、該第二の核酸配列と「機能的に連結している」。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写に作用するならば、該プロモーターは該コーディング配列と機能的に連結している。一般的に、機能的に連結されたＤＮＡ配列は、隣接しており、二つのポリペプチドコーディング領域を結合させる必要がある場合には、同一のリーディングフレーム内にある。
ペプチド修飾：本開示には、酵素及びその合成の実施形態が含まれる。更に、所望の酵素活性を有する類似体（非ペプチドの有機分子）、誘導体（開示されるペプチド配列から開始して得られる化学的に機能化されたペプチド分子）及び変異体（ホモログ）を、ここに記載される方法で用いることができる。ここに開示されるペプチドには、Ｌ−及び／又はＤ−アミノ酸、天然及びその他でもよいアミノ酸の配列が含まれる。
ペプチドを種々の化学的手法により修飾して、該非修飾ペプチドと本質的に同じ活性を有し、これに付随的してその他の所望の特性を有する誘導体を生成することができる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシル末端又は側鎖であれ、医薬的に許容可能なカチオンの塩として提供されるか、又はエステル化されてＣ１−Ｃ１６のエステルを形成するか、又はＲ１及びＲ２が別個独立してＨ又はＣ１−Ｃ１６のアルキルである一般式ＮＲ１Ｒ２のアミドに変換されるか、又は結合されて５員環若しくは６員環等の複素環を形成することができる。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端又は側鎖であれ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸、安息香酸、硫酸トルエン、マレイン酸、酒石酸及びその他の有機塩のような医薬的に許容可能な酸付加塩の形態にあってもよく、又はＣ１−Ｃ１６のアルキル若しくはジアルキルアミノへと変換されてもよく、若しくは更にアミドまで変換されてもよい。
ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、周知の手法によりＣ１−Ｃ１６のアルコキシ又はＣ１−Ｃ１６のエステルへと変換することができる。ペプチド側鎖のフェニル環及びフェノール環は、１以上のＦ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩのようなハロゲン原子、又はＣ１−Ｃ１６のアルキル、Ｃ１−Ｃ１６のアルコキシ、カルボン酸及びそのエステル、若しくはこのようなカルボン酸のアミドにより置換することができる。ペプチド側鎖のメチレン基は、同族のＣ２−Ｃ４アルキレンに伸長することができる。チオールは、アセトアミド基のような数多くの周知の保護基のうち、いずれか１種類により保護することができる。また、当業者であれば、本開示に係るペプチドに環状構造を導入して、該ペプチドの構造に増大した安定性を生じる構造的条件を選択して提供する方法も理解するであろう。例えば、ペプチドが酸化された場合にジスルフィド結合を含むように該ペプチドにＣ末端又はＮ末端のシステインを付加して、環状ペプチドを作り出すことができる。その他のペプチドを環化する方法には、チオエーテル並びにカルボキシル末端及びアミノ末端のアミド及びエステルの形成が含まれる。
ペプチド模倣薬及び生物模倣薬（ｏｒｇａｎｏｍｉｍｅｔｉｃ）の化学的成分の三次元的配置は、ペプチドのバックボーン及びその成分のアミノ酸側鎖の三次元的配置を模倣するものであり、結果として本開示に係るタンパク質のこのようなペプチド模倣薬及び生物模倣薬が検出可能な酵素活性を有することになることから、このようなペプチド模倣薬及び生物模倣薬の実施形態も本開示の範囲内にある。コンピューターモデリングの適用については、ファルマコフォアが、生物学的活性に対する構造上の要件の三次元的な決定をするのに理想的である。ペプチド模倣薬及び生物模倣薬は、最新のコンピューターモデリング用ソフトウェアを用いて（コンピューター援用薬品設計（ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ）又はＣＡＤＤを用いる）、各ファルマコフォアに適合するように設計することができる。ＣＡＤＤにおいて使用される技術の記載に関しては、Ｋｌｅｇｅｒｍａｎ及びＧｒｏｖｅｓ（編集）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９３、インターファーム出版に掲載される、Ｗａｌｔｅｒｓ、「コンピューターによる薬品のモデリング（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ）」：Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬの第１６５−７４ページ、並びにＭｕｎｓｏｎ（編集）、「薬理学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、１９９５、Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌの第１０２章を参照。また、これらの手法を用いて調製された模倣薬についても本開示の範囲内に含まれる。一例としては、酵素、又はその変異体、断片、若しくは融合体により作り出される酵素活性を模倣する模倣薬がある。
ＰｒｏＡアルドラーゼ：「ＰｒｏＡ」及び／又は「ＰｒｏＡアルドラーゼ」は、歴史的にコマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来の４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼのみを同定するものとして用いられてきたが、他に記載のない限り、ここでは「ＰｒｏＡ」及び／又は「ＰｒｏＡアルドラーゼ」という用語は、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ活性を有するあらゆるポリペプチドを意味するものとして用いる。ＰｒｏＡ又はＰｒｏＡアルドラーゼの適切な例としては、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡ （配列番号６６）及びシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＣＡＣ４６３４４）、又はＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡ（配列番号６６）及び／又はシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＣＡＣ４６３４４）に対する相同性を示す酵素が挙げられる。例えば、安定な酵素であれば、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡ（配列番号６６）及び／又はシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＣＡＣ４６３４４）に対して少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、及び／又は９９％の配列同一性を有するであろう。
プローブ及びプライマー：核酸のプローブ及びプライマーは、ここに提示されるアミノ酸配列及び核酸配列に基き直ちに調製することが可能である。「プローブ」には、検出可能な標識又はレポーター分子を含む単離された核酸が含まれる。典型的な標識には、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、及びポリペプチドが含まれるが、これに限定されるものではない。標識方法及び種々の目的に適した標識の選択の手引きについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（編集）、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、第１−３巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９、及びＡｕｓｕｂｅｌら．（編集）「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーネ出版及びウィリーインターサイエンス社（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク州（定期的更新を伴う）、１９８７、において議論されている。
「プライマー」とは、典型的には１０個以上のヌクレオチドを有する核酸分子である（例えば、約１０個から約１００個の間のヌクレオチドを有する核酸分子である）。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションにより、相補的な標的の核酸鎖にアニーリングして、該プライマー及び該標的核酸鎖との間にハイブリッドを形成し、その後に、例えばＤＮＡポリメラーゼポリペプチドにより該標的核酸鎖に沿って伸長することが可能である。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当該技術分野にて公知のその他の核酸増幅法による核酸配列の増幅に用いることも可能である。
プローブ及びプライマーの調製方法及び使用方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（編集）、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、第１−３巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら．（編集）「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーネ出版及びウィリーインターサイエンス社（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク州（定期的更新を伴う）、１９８７；及びＩｎｎｉｓら．（編集）、「ＰＣＲ法プロトコル（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：方法と応用へのガイダンス（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、アカデミック出版：サンディエゴ、１９９０、のような文献中に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、プライマー（０．５版、著作権１９９１、ホワイトヘッド生物医学研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）等の、その目的のために意図されたコンピュータープログラムを用いることにより、公知の配列から得ることが可能である。当業者であれば、特定のプローブ又はプライマーの特異性は、その長さに伴って増加するが、プローブ又はプライマーは完全長配列から短くても５つの連続するヌクレオチドの配列までの長さの範囲内で変動可能なことを理解するであろう。従って、例えば、２０個の連続するヌクレオチドからなるプライマーは、これに対応する１５個のヌクレオチドのみからなるプライマーよりも高い特異性をもって標的にアニーリングすることが可能である。従って、より高い特異性を得るためには、プローブ及びプライマーは、例えば、１０、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、３０００、３０５０，３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４５０、３５００、３５５０、３６００、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８５０、３９００、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０、４７００、４７５０、４８００、４８５０、４９００、５０００、５０５０、５１００、５１５０、５２００、５２５０、５３００、５３５０、５４００、５４５０、又はこれよりも多くの連続するヌクレオチドを含むものから選択することができる。
プロモーター：核酸の転写を支配する核酸制御配列が配列したものである。プロモーターは、転写開始部位付近に必要な核酸配列を含み、例えば、ポリメラーゼＩＩ型のプロモーターであれば、ＴＡＴＡ因子を含む。プロモーターには、遠位のエンハンサー又はリプレッサー因子が含まれていてもよく、これらは、転写開始部位から数１０００塩基対もの位置にあってもよい。
精製された：ここで用いられる「精製された」という用語は、完全な純粋さを要するものではなく、むしろ相対的な用語として意図されている。従って、例えば、精製されたポリペプチド又は核酸試料とは、該対象のポリペプチド若しくは核酸が生物内の自然環境にあるポリペプチド若しくは核酸よりも高い濃度にあるか、又はこれらが取り出されてきた環境中よりも高い濃度にあるものでよい。
組換え：「組換え」核酸とは、（１）該核酸が発現される生物において天然に存在しない配列、又は（２）組換え核酸よりも短く、別々であった２つの配列を人工的に連結させることにより作られた配列を有するものである。この人工的な連結は、場合により、化学合成、又は、より一般的に、例えば遺伝子操作技術等による単離された核酸断片の人工操作により行なうことができる。「組換え」は、人工的に操作されてはいるが、その核酸が単離された生物に見られるものと同一の制御配列及びコーディング領域を有する核酸分子の表現にも用いられる。
配列の同一性：アミノ酸配列間の同一性は、他において配列の同一性と呼ばれてはいるものの、配列間の類似性に関して表現されている。配列の同一性は、多くの場合百分率による同一性（又は類似性又は相同性）により測定される；パーセンテージが高い程に、２つの配列はより類似する。配列番号１２のようなペプチドのホモログ又は変異体は、標準的方法を用いてアラインメントした場合に、比較的高い配列同一性を有する。
比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムが下記に記載されている：Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４−８，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７−４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１−９０，１９８８；並びにＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９−２９，１９９４。
ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ（商標））（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘの配列解析プログラムと組み合わせて使用するために、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ、ベセスダ、メリーランド州）及びインターネットを含む複数の供給源から利用可能である。
ペプチドの変異体は、典型的に、ｂｌａｓｔｐのギャップがデフォルトのパラメータとして設定されているＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ２．０を用いてアミノ酸配列との完全長アラインメントについて計算して、少なくとも５０％の配列同一性を有することにより特徴づけられる。約３０個のアミノ酸よりも大きなアミノ酸配列の比較には、デフォルトのパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（１１のギャップ存在コスト、そして１の残基ギャップコスト毎）を用いたＢｌａｓｔ２配列機能が利用される。短いペプチド（約３０個のアミノ酸よりも少ない）のアラインメントの場合には、該アラインメントは、デフォルトのパラメータに設定されたＰＡＭ３０マトリックス（開いたギャップ９で、伸長ギャップ１のペナルティー）を利用したＢｌａｓｔ２配列機能を用いて行なわれる。対象の配列と更に高い類似性を有するタンパク質は、この方法により評価された場合には、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％までもの配列同一性といった、増大した百分率の同一性を示すであろう。全配列よりも小さな部分が配列同一性について比較される場合には、ホモログ及び変異体は、典型的には、１０−２０個のアミノ酸の短い領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するであろうし、該対象の配列に対する類似性に依存して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９８％の配列同一性を有してもよい。このような短い領域における配列同一性の決定方法は、米国メリーランド州ベセスタの米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により維持されるウェブサイトに記載されている。当業者であれば、これらの配列同一性の範囲は、単に指針として提示されているに過ぎないことを理解するであろう；提示される範囲に該当しない非常に重要なホモログが得られることは十分に可能性のあることである。
類似する方法を用いて、核酸配列の配列同一性パーセントを測定することができる。特定の例においては、相同的な配列は天然の配列とアラインメントされ、そして両配列中の同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が存在する位置の数を計算することによりマッチングの数が求められる。配列同一性パーセントは、同定された配列（例えば配列番号１１）に示される配列の長さ、又は統合された長さ（例えば、同定された配列に示される配列からの１００個の連続するヌクレオチド又はアミノ酸残基）のいずれかにより前記マッチングの数を割って、続いて生じた値に１００を掛けることにより求められる。例えば、配列番号１１に示される配列とアラインメントした場合に１１６６のマッチングを有するアミノ酸配列は、該配列番号１１に示される配列と７５．０パーセント同一である（即ち、１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。配列同一性パーセント値は、最も近い１０分の１の値へと切り捨て（切り上げ）られる。ことに注意すべきである。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、及び７５．１４は７５．１へと切り捨てられ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、及び７５．１９は、７５．２へと切り上げられる。また、長さの値は必ず整数であることにも注意すべきである。別の例では、以下の同定された配列からの２０個の連続するヌクレオチドとアラインメントされる２０−ヌクレオチド領域を含む標的配列は、該同定された配列と７５パーセントの配列同一性を共有する領域を含む（即ち、１５÷２０＊１００＝７５）。
Figure 2008538924
特異的結合剤：ここに記載されるポリペプチドのいずれかに特異的に結合可能な薬剤。例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒト化モノクローナル抗体を含む）、及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメントのようなモノクローナル抗体の断片、並びにこのようなポリペプチドのエピトープに特異的に結合可能なその他の薬剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ここに提示されるポリペプチド（又はその断片、変異体又は融合体）に対する抗体を用いてこのようなポリペプチドを精製又は同定することが可能である。ここに提示されるアミノ酸及び核酸の配列により、ここに記載されるポリペプチドを認識する特異的抗体ベースの結合剤を生産することが可能となる。
ポリペプチド、該ポリペプチドの部分、又はその変異体に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体は作成することができる。ポリペプチド抗原上の１以上のエピトープに対して誘起された抗体は、該ポリペプチドを特異的に検出するであろう。即ち、１種類の特定のポリペプチドに対して誘起された抗体は、該特定のポリペプチドを認識して結合するであろうが、その他のポリペプチドを実質的に認識して結合することはないであろう。特定のポリペプチドに対して抗体が特異的に結合することの判定は、数多くの標準的イムノアッセイ法の一つにより行なうことができる；例えば、ウェスタンブロッティング法がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（編集）、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、第１−３巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９を参照）。
ウェスタンブロッティング法により、任意の抗体試料（配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対してマウス内で生成された試料のような）が適当なポリペプチド（例えば、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）を特異的に検出することを判定するため、総細胞タンパク質を細胞から抽出してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離することが可能である。
前記分離された総細胞タンパク質は、その後、メンブラン（例えばニトロセルロース）に移すことができ、そして前記抗体試料は該メンブランと共にインキュベートされる。前記メンブランを洗浄して非特異的に結合した抗体を除去した後、アルカリホスファターゼのようなポリペプチドに結合した適切な二次抗体（例えば、抗マウス抗体）を用いると、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムの適用が結果として免疫局在性のアルカリホスファターゼにより濃い青色の化合物を生じるので、特異的に結合した抗体の存在を検出することが可能である。
免疫原としての使用に適した実質的に純粋なポリペプチドは、形質移入された細胞、形質転換された細胞、又は野生型の細胞から得ることができる。最終試料中のポリペプチド濃度は、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）フィルター装置上での濃縮により、１ミリリットル毎に数マイクログラムの濃度まで調整することができる。更に、完全長のポリペプチドから９アミノ酸残基しか有しないポリペプチドの大きさの範囲内にあるポリペプチドを免疫原として利用することができる。このようなポリペプチドは、細胞培養中で精製可能であり、標準的方法を用いて化学的に合成可能であり、又は巨大なポリペプチドを生成可能なより小さなポリペプチドに切断することにより得ることもできる。９アミノ酸残基の長さしか有しないポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子のような主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子との関連における免疫系に晒された場合には、免疫原性と成りうる。従って、ここに開示されるいずれかのアミノ酸配列の連続したアミノ算残基を少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０個、又はこれよりも多く有するポリペプチドは、抗体の生産のための免疫原として用いることができる。
ここに開示されるポリペプチドのいずれもに対するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−７，１９７５）の古典的な方法又はそれから派生した方法に従って、マウスハイブリドーマから調製することが可能である。
ここに開示されるあらゆるポリペプチドの雑多なエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、修飾されていないか若しくは免疫原性を高めるために修飾された該ポリペプチド（又はその断片）で適切な動物を免疫することにより調製することが可能である。ウサギの効果的な免疫プロトコルは、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓら．（Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３３：９８８−９１，１９７１）に見出すことができる。
全体抗体に代わって抗体の断片を用いることも可能であり、容易に原核生物宿主細胞内で発現することができる。「抗体断片」とも呼ばれるモノクローナル抗体の免疫学的に有効な部分の作製及び使用の方法は、周知であり、Ｂｅｔｔｅｒ及びＨｏｒｏｗｉｔｚ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−９６，１９８９）、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１３６２−７，１９９０）、米国特許第５，６４８，２３７号（「機能的抗体断片の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」）、米国特許第４，９４６，７７８号（「一本鎖ポリペプチド結合性分子（Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」）、米国特許第５，４５５，０３０号（「一本鎖ポリペプチド結合性分子を用いた免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」）、及びこれらに引用される参考文献に記載される方法も含まれる。
立体反転アミノトランスフェラーゼ：「立体反転アミノトランスフェラーゼ」とは、反対のキラリティーの基質をアミノドナーとして用いることで、優先的に又は選択的にキラルアミノ酸生成物（モナチンのような）を生成可能なポリペプチドである。例として、立体反転アミノトランスフェラーゼは、優先的に又は選択的にＬ−グルタメートを基質として用いてＲ，Ｒモナチンを生成するＤ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ（又はＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）でもよい。これに限定されない立体反転アミノトランスフェラーゼの例としては、Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４１）及びＤ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ活性又はＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素が挙げられる。
形質転換された：「形質転換された」細胞とは、例えば分子生物学的手法により核酸分子が導入された細胞である。形質転換は、このような細胞に核酸分子が導入されうる全ての技術を包含し、これに限定されるものではないが、ウィルスベクターを用いた形質移入、接合、プラスミドベクターを用いた形質転換、及びエレクトロポレーション、リポフェクション、及びパーティクルガン加速による裸のＤＮＡの導入が含まれる。
変異体、断片又は融合タンパク質：開示されるタンパク質には、その変異体、断片及び融合体が含まれる。タンパク質（例えば配列番号１２）、融合タンパク質、又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードするＤＮＡ配列（例えば配列番号１１）は、真核生物細胞、バクテリア、昆虫、及び／又は植物中で該タンパク質を発現できるように操作することが可能である。発現を得るため、該ＤＮＡ配列は、変更したり他の制御配列と機能的に連結したりすることが可能である。前記制御配列及び前記タンパク質を含む最終産物がベクターと呼ばれる。このベクターは、真核生物、バクテリア、昆虫、及び／又は植物の細胞に導入することができる。細胞内に入ったら、前記ベクターにより前記タンパク質の生成が可能となる。
例えば配列番号１２のトリプトファンアミノトランスフェラーゼ（又はその変異体、多型、突然変異体、若しくは断片）のようなタンパク質で、例えばトリプトファンをインドール−３−ピルベートへと変換する能力などの、該タンパク質の所望の活性を阻害しない他のアミノ酸配列と連結されているタンパク質を含む融合タンパク質。１つの例においては、前記他のアミノ酸配列は、その長さが約１０、１２、１５、２０、２５、３０、又は５０個のアミノ酸以下である。
当業者であれば、ＤＮＡ配列は、そのコードするタンパク質の生物学的活性に影響することなく数多くの方向に変更することが可能であることを理解するであろう。例えば、ＰＣＲを用いてタンパク質をコードするＤＮＡ配列に変異を作り出すことが可能である。このような変異体は、前記タンパク質の発現に用いられる宿主内のコドン選択について最適化された変異、又は発現を促進する他の配列変化であってもよい。
ベクター：細胞に導入されることにより形質転換された細胞を作り出す核酸分子。ベクターには、複製開始点のような該ベクターを細胞内で複製させる核酸配列が含まれていてもよい。また、ベクターには、１以上の選択可能なマーカー遺伝子及び当該分野で公知の他の遺伝因子も含まれていてもよい。
生合成経路の概要
図１−３及び１１−１３に示すように、種々の生合成経路を用いてモナチン又はインドール−３−ピルベート若しくはＭＰのようなモナチンの中間体を生成することが可能である。各基質（グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルベート、及びＭＰ）の各生成物（トリプトファン、インドール−３−ピルベート、ＭＰ及びモナチン）への変換には、複数の異なるポリペプチドを用いることができる。更に、これらの反応は、生体内、生体外、又は生体内反応と非酵素的化学反応を含む生体外反応のような生体外反応との組み合わせを通じて行なうことができる。従って、図１−３及び１１−１３は、例示的なものであり、所望の生成物を得るために用いることのできる複数の異なる経路を示している。
グルコースからトリプトファンへ
種々の生物は、グルコースからトリプトファンを生成することができる。このような生物に、グルコース及び／又はトリプトファンからモナチン、ＭＰ、及び／又はインドール−３−ピルベートを生成するために要する遺伝子を含む構築物をクローニングすることができる。ここでは、トリプトファンをモナチンへ変換可能なことを示す。
他の例においては、生物は、公知のポリペプチドを用いてトリプトファンを生成するよう、又はトリプトファンを過剰生成するように操作される。例えば、米国特許第４，３７１，６１４号（ここに参考文献として組み入れられている）には、野生型トリプトファンオペロンを含むプラスミドにより形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が記載されている。
米国特許第４，３７１，６１４号に開示されるトリプトファンの最大力価は、約２３０ｐｐｍである。同様に、国際特許出願公開公報ＷＯ８７０１１３０号（ここに参考文献として組み入れられている）には、トリプトファンを生成するように遺伝子操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が記載され、Ｌ−トリプトファンの発酵生産の増加について議論がなされている。当業者であれば、グルコースからトリプトファンを生成可能な生物が、グルコース又はフルクトース−６−ホスフェートに変換可能な他の炭素及びエネルギーの供給源を利用して同様の結果を得ることも可能なことを理解するであろう。典型的な炭素及びエネルギーの供給源には、これに限定されるものではないが、スクロース、フルクトース、デンプン、セルロース又はグリセロールが含まれる。
トリプトファンからインドール−３−ピルベートへ
複数のポリペプチドを用いてトリプトファンをインドール−３−ピルベートに変換することが可能である。典型的にポリペプチドには、酵素クラス（ＥＣ）２．６．１．２７、１．４．１．１９、１．４．９９．１、２．６．１．２８、１．４．３．２、１．４．３．３、２．６．１．５、２．６．１．−、２．６．１．１及び２．６．１．２１の構成要素が含まれる。これらのクラスには、Ｌ−トリプトファン及び２−オキソグルタレートをインドール−３−ピルベート及びＬ−グルタメートへと変換するトリプトファンアミノトランスフェラーゼ（Ｌ−フェニルアラニン−２−オキソグルタレートアミノトランスフェラーゼ、トリプトファントランスアミナーゼ、５−ヒドロキシトリプトファン−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、ヒドロキシトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファントランスアミナーゼ、及びＬ−トリプトファン：２−オキソグルタレートアミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）；Ｄ−トリプトファン及び２−オキソ酸をインドール−３−ピルベート及びアミノ酸へと変換するＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ；Ｌ−トリプトファン及びＮＡＤ（Ｐ）をインドール−３−ピルベート及びＮＨ3及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈへと変換するトリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）−Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−Ｔｒｐ−デヒドロゲナーゼ、ＴＤＨ及びＬ−トリプトファン：ＮＡＤ（Ｐ）オキシドレダクターゼ（脱アミノ化する））；Ｄ−アミノ酸及びＦＡＤをインドール−３−ピルベート及びＮＨ3及びＦＡＤＨ２に変換するＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ；Ｌ−トリプトファン及びフェニルピルベートをインドール−３−ピルベート及びＬ−フェニルアラニンへと変換するトリプトファン−フェニルピルベートトランスアミナーゼ（Ｌ−トリプトファン−α−ケトイソカプロエートアミノトランスフェラーゼ及びＬ−トリプトファン：フェニルピルベートアミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）；Ｌ−アミノ酸及びＨ2Ｏ及びＯ2を２−オキソ酸及びＮＨ3及びＨ2Ｏ2へと変換するＬ−アミノ酸オキシダーゼ（ヘビアミノ酸オキシダーゼ及びＬ−アミノ酸：酸素オキシドレダクターゼ（脱アミノ化する）とも呼ばれる）；Ｄ−アミノ酸及びＨ2Ｏ及びＯ2を２−オキソ酸及びＮＨ3及びＨ2Ｏ2へと変換するＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ヘビアミノ酸オキシダーゼ及びＤ−アミノ酸：酸素オキシドレダクターゼ（脱アミノ化する））；並びにＬ−トリプトファン及びＨ2Ｏ及びＯ2をインドール−３−ピルベート及びＮＨ3及びＨ2Ｏ2へと変換するトリプトファンオキシダーゼ、と呼ばれるポリペプチドが含まれる。これらのクラスには、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸（又はＤ−アラニン）アミノトランスフェラーゼ、及び複数のアミノトランスフェラーゼ活性を有する広範囲な（複数の基質）アミノトランスフェラーゼも含まれ、これらのうちいくつかは、トリプトファン及び２−オキソ酸をインドール−３−ピルベート及びアミノ酸に変換することができる。
配列番号１１及び１２に示される新規なアミノトランスフェラーゼを含む、このような活性を有するアミノトランスフェラーゼクラスの１１種類の構成要素が、下記実施例１に記載されている。従って、本開示は、配列番号１１及び１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％もの配列同一性を有する単離された核酸及びタンパク質の配列を提供する。また、本開示に包含されるものとしては、アミノトランスフェラーゼ活性を維持するか、又はアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１１及び１２の断片並びに融合体がある。典型的な断片としては、これに限定されるものではないが、配列番号１１の少なくとも１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、又は１０００個の連続するヌクレオチド、又は配列番号１２の少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００又は３５０個の連続するアミノ酸が挙げられる。開示される配列（及びその変異体、断片、及び融合体）は、ベクターの一部分であってもよい。該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することが可能であり、それによって、トリプトファンからインドール−３−ピルベートを生成可能な組換え細胞を作り出すことができ、いくつかの例ではこれらは更にＭＰ及び／又はモナチンを生成することが可能である。
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（１．４．３．２）は公知であり、配列は、ヴィペラ・レベティネ（Ｖｉｐｅｒａ ｌｅｂｅｔｉｎｅ）（Ｐ８１３７５種）、オフィオファガス・ハナア（Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ ｈａｎｎａｈ）（Ｐ８１３８３種）、アグキストロドン・ロドストマ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）（Ｐ８１３８２種）、クロタラス・アトロクス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ）（Ｐ５６７４２種）、ブルコルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、シロイヌナズナ、カウロバクテル・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｅｎｔｕｓ）、クラミドモナス・レインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ハツカネズミ、シュードモナス−シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、及びロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）株のような複数の異なる供給源から単離することが可能である。更に、トリプトファンオキシダーゼは前記文献に記載されており、例えば、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）種ＳＦ−Ｉ、根こぶ病を有する白菜、シロイヌナズナ、及び哺乳動物の肝臓から単離することが可能である。トリプトファンをインドール−３−ピルベートに変換可能なＬ−アミノ酸オキシダーゼクラスの１つの構成要素が、別の分子クローニング用供給源と共に、下記実施例５で議論されている。種々のＤ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子は、分子クローニング用のデータベースで利用可能である。
トリプトファンデヒドロゲナーゼは公知であり、例えば、ホウレン草、ピサム・サティヴァム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、プロソピス・ジュリフローラ（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｊｕｌｉｆｌｏｒａ）、豆、メスキート、小麦、トウモロコシ、トマト、タバコ、クロモバクテリウム・ヴィオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、及びラクトバシリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）から単離することができる。種々のＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列が公知となっている。
米国特許第５，７２８，５５５号には、水の存在下においてトリプトファンをインドール−３−ピルベート及びアンモニウムに変換できるフェニルアラニンデアミナーゼ（ＥＣ３．５．１．−）が開示されている。このような広い特異性を有する酵素は、プロテウス・ミキソファシエンス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ヴルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）及びプロテウス・モルガニイ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｏｒｇａｎｉｉ）のようなプロテウス微生物から単離でき、対応する遺伝子はクローニングされ、シーケンスされている。例えば、プロテウス・ヴルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）デアミナーゼ（タンパク質受託番号：ＢＡＡ９０８６４．１ ＧＩ：７００７４１２；遺伝子受託番号：ＡＢ０３０００３．１ ＧＩ：７００７４１１）；プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）デアミナーゼ（タンパク質受託番号：ＡＡＡ８６７５２．１ ＧＩ：１０１５４２６；遺伝子受託番号：Ｕ３５３８３．１ ＧＩ：１０１５４２５）を参照。トリプトファンをインドール−３−ピルベートに変換可能なＬ−デアミナーゼは、プロヴィデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）及びモルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）にも含まれている。Ｈ．Ｄｒｅｃｈｓｅｌ，Ａ．Ｔｈｉｅｋｅｎ，Ｒ．Ｒｅｉｓｓｂｒｏｄｔ，Ｇ．Ｊｕｎｇ，及びＧ．Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：２７２７−２７３３（１９９３）を参照。
図１１−１３に示されるように、トリプトファンオキシダーゼのようなアミノ酸オキシダーゼを用いてトリプトファンをインドール−３−ピルベートに変換する場合には、カタラーゼを添加して過酸化水素を還元し、又はその存在を排除することまでも可能である。
インドール−３−ラクテートからインドール−３−ピルベート
インドール−３−ラクテートをインドール−３−ピルベートへと変換する反応は、ポリペプチドの１．１．１．１１０、１．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３、１．１．１．２２２、１．１．１．２３７、１．１．３．−、又は１．１．１．１１１クラスの構成要素のような種々のポリペプチドにより触媒されることが可能である。前記ポリペプチドの１．１．１．１１０クラスには、インドールラクテートデヒドロゲナーゼ（インドール乳酸：ＮＡＤ+オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれる。前記１．１．１．２７、１．１．１．２８、及び１．１．２．３クラスには、ラクテートデヒドロゲナーゼ（乳酸ヒドロゲナーゼ、ラクテート：ＮＡＤ+オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれる。前記１．１．１．２２２クラスには、（Ｒ）−４−ヒドロキシフェニルラクテートデヒドロゲナーゼ（Ｄ−芳香族ラクテートデヒドロゲナーゼ、Ｒ−芳香族ラクテートデヒドロゲナーゼ、及びＲ−３−（４−ヒドロキシフェニル）ラクテート：ＮＡＤ（Ｐ）+２−オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれ、そして前記１．１．１．２３７クラスには、３−（４−ヒドロキシフェニルピルベート）レダクターゼ（ヒドロキシフェニルピルベートレダクターゼ及びＡ−ヒドロキシフェニルラクテート：ＮＡＤ+オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれる。前記１．１．３．−クラスには、ラクテートオキシダーゼが含まれ、前記１．１．１．１１１クラスには、（３−イミダゾール−５−イル）ラクテートデヒドロゲナーゼ（（Ｓ）−３−（イミダゾール−５−イル）ラクテート：ＮＡＤ（Ｐ）+オキシドレダクターゼとも呼ばれる）が含まれる。恐らく、これらのクラス中の複数のポリペプチドが、インドール−３−乳酸からのインドール−３−ピルベートの生成を可能とする。この変換の例は、実施例４に提示される。
化学反応を用いてインドール−３−乳酸をインドール−３−ピルベートに変換することも可能である。このような化学反応には、例えば、以下のような、複数の方法を用いて達成可能な酸化工程が含まれる：Ｂ２触媒（Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，ｖ １３，ｎ ２８，ｐ １８（１），２００２）、希釈過マンガン酸（ｐｅｒｍａｎｇａｎａｔｅ）及び過塩素酸（ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）、又は金属触媒の存在下で過酸化水素を用いた空気酸化。
インドール−３−ピルベートから２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）へ
複数の公知のポリペプチドを用いてインドール−３−ピルベートをＭＰへ変換することが可能である。典型的なポリペプチドクラスには、４．１．３．−、４．１．３．１６、４．１．３．１７、及び４．１．２．−が含まれる。これらのクラスには、２つのカルボン酸基質の縮合を触媒するアルドラーゼのような、炭素−炭素シンターゼ／リアーゼが含まれる。ペプチドクラスＥＣ４．１．３．−は、オキソ酸基質（インドール−３−ピルベートのような）を求電子体として用いて炭素−炭素結合を形成するシンターゼ／リアーゼであり、一方、ＥＣ４．１．２．−は、アルデヒド基質（ベンズアルデヒドのような）を求電子体として用いて炭素−炭素結合を形成するシンターゼ／リアーゼである。
例えば、欧州特許第１０４５−０２９号に記載されるポリペプチド（ＥＣ４．１．３．１６，４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートグリオキシレート−リアーゼであり、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートアルドラーゼ、２−オキソ−４−ヒドロキシグルタレートアルドラーゼ又はＫＨＧアルドラーゼとも呼ばれる）は、グリオキシル酸及びピルベートを４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸、及び４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼのポリペプチド（ＥＣ４．１．３．１７、また、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタレートピルベート−リアーゼ又はＰｒｏＡアルドラーゼとも呼ばれる）へと変換し、２個のピルベート等の２つのケト酸を４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタレートへと縮合する。これらのリアーゼを用いた反応は、ここに記載されている。
図１−２及び１１−１３には、３炭素（Ｃ３）分子が、インドール−３−ピルベートと結合するこれらの反応の概略図が示されている。ＥＣ４．１．２．−及び４．１．３．−の多くの構成要素、特にＰＬＰを利用するポリペプチドは、セリン、システイン、及びアラニンのようなアミノ酸、又はこれらの誘導体であるＣ３分子を利用することができる。ＥＣ４．１．２．−及び４．１．３．−の典型に触媒されるアルドール縮合では、この経路の三炭素分子（即ち、Ｃ３炭素供給源）がピルベート又はピルベートの誘導体であることが要求される。しかしながら、他の化合物もＣ３炭素供給源として機能してピルベートに変換されることが可能である。アラニンは、上記で指摘された多くを含む種々のＰＬＰを利用するトランスアミナーゼによりアミノ基転移され、ピルベートを生み出すことが可能である。ピルベート及びアンモニアは、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、及び、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｓ−アルキル−Ｌ−システイン、０−アシル−Ｌ−セリン、及び３−クロロ−Ｌ−アラニンのような十分な脱離基を有するセリン及びシステインの誘導体のβ脱離反応（トリプトファナーゼ又はβ−チロシナーゼに触媒されるような）により得ることが可能である。アスパルテートは、トリプトファナーゼ（ＥＣ４．１．９９．１）及び／又はβ−チロシナーゼ（ＥＣ４．１．９９．２、又はチロシン−フェノールリアーゼとも呼ばれる）により触媒される反応等の、ＰＬＰ媒介性のβ−リアーゼ反応において、ピルベートの供給源として機能することができる。β−リアーゼ反応の速度は、Ｍｏｕｒａｔｏｕら．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ ２７４：１３２０−５，１９９９）及び実施例１８に記載されるように、前記（４．１．９９．１−２）ポリペプチドに部位特異的変異誘発を行なうことにより増加させることが可能である。これらの修飾により、前記ポリペプチドがジカルボキシルアミノ酸基質を許容可能となる。ラクテートもピルベートの供給源として機能することが可能であり、ラクテートデヒドロゲナーゼ及び酸化された補因子、又はラクテートオキシダーゼ及び酸素の添加によりピルベートへと酸化される。これらの反応の例を下記に記載する。例えば、図２及び図１１−１３に示されるように、ピルベートをＣ３分子として用いた場合に、ＰｒｏＡアルドラーゼをインドール−３−ピルベートと接触させることができる。
ＭＰも、実施例８に提示されるアルドール縮合のような化学反応を用いて作り出すことが可能である。
ＭＰからモナチンへ
ＭＰからモナチンへの変換は、以下の１以上により触媒可能である：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２７）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（１．４．１．１９）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（１．４．９９．１）、グルタメートデヒドゲナーゼ（１．４．１．２−４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）、ロイシン（分枝鎖）デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）、トリプトファン−フェニルピルベートトランスアミナーゼ（２．６．１．２８）、又はより一般的にアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（２．６．１．５）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２１）（図２）及び分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ、ＥＣ２．６．１．４２）のようなアミノトランスフェラーゼファミリー（２．６．１．−）の構成要素。配列番号１１及び１２に示されるアミノトランスフェラーゼクラスの新規な構成要素を含む、該アミノトランスフェラーゼクラスの１１個の構成要素が下記（実施例１）に記載されており、アミノトランスフェラーゼ及びデヒドロゲナーゼ酵素の活性を示す反応が、実施例１５に提示されている。
上記反応は、化学反応を用いても行なうことができる。ケト酸（ＭＰ）のアミノ化は、アンモニア及びナトリウムシアノボロヒドリドを用いた還元的アミノ化により行なわれる。
図１１−１３は、インドール−３−ピルベート又はトリプトファンからの増加したモナチンの収量を提供すると共に、ＭＰのモナチンへの変換に使用可能な更なるポリペプチドを示す。例えば、アスパルテートがアミノドナーとして用いられる場合には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いてアスパルテートをオキサロアセテートへと変換できる（図１１）。該オキサロアセテートは、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（図１１）及び２−オキソグルタレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７１）のようなデカルボキシラーゼによりピルベート及び二酸化炭素へと変換される。これに加え、リジンがアミノドナーとして用いられる場合には、リジンεアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．３６）を用いてリジンをアリシンへと変換することが可能である（図１２）。該アリシンは、自動的に１−ピペリデイン６−カルボキシレートへと変換される（図１２）。図１２に示す工程に類似する工程では、リジンεアミノトランスフェラーゼの代わりにオルニチンδ−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１３）が用いられ、オルニチンはアミノドナーとして機能する。還元的アミノ化反応を触媒可能なポリペプチド（例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ）を用いてＭＰをモナチンへと変換する場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再利用すること及び／又は揮発性生成物を生成することが可能なギ酸デヒドロゲナーゼのようなポリペプチド（図１３）を用いることができる。
生合成経路の設計における更なる検討
いずれのポリペプチドを用いてインドール−３−ピルベートを作り出すかに依存して、ＭＰ及び／又はモナチン、補因子、基質、及び／又は追加的なポリペプチドが産生細胞に提供されて生成物の形成を促進することが可能である。
過酸化水素の除去
過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）は、生産された場合には、産生細胞にとって有毒となり、生成されるポリペプチド又は中間体を損傷する可能性がある。上記のＬ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｈ2Ｏ2を生成物として作り出す。従って、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いた場合には、生じるＨ2Ｏ2は除去可能であるか、又はその濃度が低下して前記細胞又は生成物に対する潜在的な損傷を低下させる。
カタラーゼを用いて細胞中のＨ2Ｏ2濃度を減少させることが可能である（図１１−１３）。前記産生細胞は、過酸化水素の水及び酸素ガスへの分解を触媒するカタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）をコードする遺伝子又はｃＤＮＡ配列を発現することができる。例えば、カタラーゼは、前記産生細胞に形質移入されたベクターから発現されることが可能である。使用可能なカタラーゼの例としては、これに限定されるものではないが、下記のものが挙げられる：ｔｒ｜Ｑ９ＥＶ５０（スタフィロコッカス・キシロサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ））、ｔｒ｜Ｑ９ＫＢＥ８（バシラス・ハロジュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））、ｔｒ｜Ｑ９ＵＲＪ７（カンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、ｔｒ｜Ｐ７７９４８（ストレプトミセス・コエリコロール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ））、ｔｒ｜Ｑ９ＲＢＪ５（キサントモナス・カペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．）。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、又はトリプトファンオキシダーゼを利用した生触媒反応も、カタラーゼポリペプチドを含んでいてもよい。
ＰＬＰ（ピリドキサル−５’−ホスフェート）利用可能性の調節
図１に示されるように、ＰＬＰは、ここに記載される１以上の生合成工程において利用することができる。ＰＬＰ濃度は、補充することが可能であるので、ＰＬＰは、該反応全体の効率に対する制限となるものではない。
ビタミンＢ６（ＰＬＰの前駆体）の生合成経路については、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において徹底的に研究が行なわれ、そのタンパク質のいくつかは結晶化されている（Ｌａｂｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４９：４５−８，１９９９）。他の代謝経路では、前記遺伝子のうち２つ（ｅｐｄ又はｇａｐＢ及びｓｅｒＣ）が要求されるが、ピリドキサルホスフェートの生合成には３つの遺伝子（ｐｄｘＡ、ｐｄｘＢ、及びｐｄｘＪ）が固有のものとなる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の経路における開始材料の１つとして、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェート（ＤＸＰ）がある。通常の２及び３炭素の中心的な代謝物からのこの前駆体の合成は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートシンターゼ（ＤＳＸ）というポリペプチドにより触媒される。他の前駆体は、４炭糖であるＤ−エリスロース４−ホスフェートから形成されるスレオニン誘導体である。ホスホ−４−ヒドロキシル−Ｌスレオニン（ＨＴＰ）への変換に必要な遺伝子は、ｅｐｄ、ｐｄｘＢ、及びｓｅｒＣである。ＰＬＰ形成における最終反応は、ｐｄｘＡ及びｐｄｘＪの遺伝子産物により触媒される、ＤＸＰ及びＨＴＰ間での複雑な分子内縮合及び閉環反応である。
モナチンを生成する発酵の間、ＰＬＰが限られた栄養分となるならば、産生宿主細胞内の１以上の前記経路の遺伝子の増大した発現を用いてモナチンの収量を増加させることが可能である。宿主生物は、その天然経路の遺伝子の複数コピーを含むことができ、又は非天然経路の遺伝子のコピーを該生物のゲノムに導入することもできる。更に、サルベージ経路遺伝子の複数のコピーを前記宿主生物にクローニングすることもできる。
全ての生物において保存される１つのサルベージ経路では、種々のビタミンＢ６誘導体を活性ＰＬＰ型へと再利用する。この経路において必要とされるポリペプチドは、ｐｄｘＫキナーゼ、ｐｄｘＨオキシダーゼ、及びｐｄｘＹキナーゼである。これらの遺伝子の１種類以上の過剰発現によりＰＬＰ利用可能性を増大させることができる。
ビタミンＢ６濃度は、宿主生物内の天然生合成経路の遺伝子の代謝制御の除去又は抑制により上昇させることが可能である。ＰＬＰは、バクテリアのフラヴォバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種２３８−７株における、前駆体であるスレオニン誘導体の生合成に必要なポリペプチドを抑制する。この代謝制御を有しない細菌株は、ピリドキサル誘導体を過剰生成し、２０ｍｇ／ＬまでものＰＬＰを排出できる。モナチンを生成する宿主生物の同様の方法での遺伝子操作により、生合成経路の遺伝子を過剰発現することなくＰＬＰの生産量を増加させることができる。
アンモニウムの利用
トリプトファナーゼ反応は、アンモニアをより多く利用可能にするか、又は水を取り除くことにより合成方向（インドールからのトリプトファンの生成）へ促進することが可能である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応のような還元的アミノ化反応についても、過剰量のアンモニウムにより正方向に傾けることができる。
アンモニアは、炭酸又はリン酸緩衝系において炭酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム塩として利用可能にできる。また、アンモニアは、ピルビン酸アンモニウム又はギ酸アンモニウムとしても提供可能である。これに代わり、アンモニアは、前記反応がグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、トリプトファンデヒドロゲナーゼ又は分枝鎖デヒドロゲナーゼのようなアンモニアを生産する反応と連結された場合にも供給可能である。アンモニアは、フェノール、又はインドール、ピルベート及びＮＨ3へと加水分解される天然基質のＥＣ４．１．９９．−（チロシン又はトリプトファン）の添加により作り出すことが可能である。これにより、酵素にその好ましい基質を加水分解させることで通常の平衡量に亘って合成産物の収量を増加させること可能となる。
生成物及び副生成物の除去
トリプトファンアミノトランスフェラーゼを介したトリプトファンのインドール−３−ピルベートへの変換は、該反応がグルタメートを生成し、補基質である２−オキソグルタレート（α−ケトグルタレート）を必要とするので、インドール−３−ピルベートの生成速度に対して不利に作用する可能性がある。グルタメートは、前記アミノトランスフェラーゼの阻害を生ずる可能性があり、該反応は大量の前記補基質を消費するであろう。更に、高グルタメート濃度は、下流の分離工程に対して有害なものとなる。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）のポリペプチドはグルタメートを２−オキソグルタレートへと変換し、それによってトリプトファンアミノトランスフェラーゼにより触媒される前記反応中の前記補基質を再利用する。また、ＧＬＤＨは、好気的条件下での細胞のエネルギー（ＡＴＰ）生産に用いられる還元性同等物（ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）をも生産する。ＧＬＤＨによるグルタメートの利用は、副生成物の形成を低下させる。これに加え、前記反応では、細胞への窒素供給源として、又は図１に示す最終工程の還元的アミノ化における基質として機能可能なアンモニアが生産される。従って、ＧＬＤＨポリペプチドを過剰発現する産生細胞を用いて収量を増加させ、培地及び／又は分離工程のコストを低下させることができる。
トリプトファンからモナチンへの経路において、適切な酵素クラスからのアミノトランスフェラーゼが用いられた場合には、工程３のアミノドナー（例えば、グルタメート又はアスパルテート）は、変換されて工程１で必要とされるアミノアクセプターへ戻ることが可能である。この経路において、１のトランスアミナーゼの基質が他方のトランスアミナーゼの活性を競合的に阻害しない２種類の個別のトランスアミナーゼを利用することにより、この経路の効率を増加させることができる。
記載された経路における多くの反応は可逆的であり、従って、基質と生成物との間で平衡に達する。該経路の収量は、前記ポリペプチドからの生成物を継続的に取り除くことにより増加させることができる。例えば、パーミアーゼ又は他の輸送タンパク質を用いた発酵ブロスへのモナチンの分泌、又は基質の再利用を伴う生触媒反応の流れからのモナチンの選択的結晶化は、反応収量を増加させるであろう。
更なる酵素反応又はアミノドナー基の置換による副生成物の除去は、反応収量を増大させるもう１つの方法である。複数の例が実施例２１で議論され、図１１−１３に示されている。理想的には、副生成物は、相転移（蒸発）又は二酸化炭素のような非反応性最終産物への自発的変換のいずれによっても、逆方向において反応に利用することができないように生成される。
基質プールの調整
インドールプールは、トリプトファン前駆体生産量の増加並びに／又はインドール−３−ピルベート及び／若しくはトリプトファンを伴う異化経路の変更により調整することができる。例えば、インドール−３−ピルベートからのインドール−３−酢酸の生成は、宿主細胞内のＥＣ４．１．１．７４をコードする遺伝子の機能的欠失により減少又は排除することができる。トリプトファンからのインドールの生成は、宿主細胞内のＥＣ４．１．９９．１をコードする遺伝子の機能的欠失により減少又は排除することができる。また、これに代わり、過剰量のインドールを、生体外又は生体内での製造方法においてＥＣ４．１．９９．１をコードする遺伝子の増加量との組み合わせで基質として利用することも可能である（Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．，８２：６０４−６，１９９６）。遺伝子操作を行なってＤ−エリスロース−４−ホスフェート及びコリスメートのような中間体の濃度を上昇させることも可能である。
トリプトファン生成は、殆どの生物において制御されている。その１つの機構として、該経路中の特定の酵素のフィードバック阻害によるものがある；トリプトファン濃度が上昇するにつれ、トリプトファン生成速度が低下する。従って、トリプトファン中間体を通じてモナチンを生成するよう操作された宿主細胞を用いた場合、トリプトファン濃度に対する感受性を有しない生物を用いることが可能である。例えば、種々のトリプトファン類似体による増殖阻害に耐性を有するカサランサス・ロセウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）の菌株が、高濃度の５−メチルトリプトファンに繰返し晒すことにより選択されている（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇ及びＢｅｒｌｉｎ，Ｚ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ３４：５４１−５，１９７９）。前記菌株に生じるトリプトファンシンターゼ活性は、恐らく前記遺伝子の変異のために、生成阻害による比較的低度の影響を受けていた。同様にして、モナチン生成に用いる宿主細胞についても最適化することが可能である。
トリプトファン生成は、定向進化を用いて生成阻害に対する感受性が低いポリペプチドへと進化させることを通じて最適化することが可能である。例えば、スクリーニングは培地中にトリプトファンは含まないが、高濃度の非代謝性トリプトファン異性体を含むプレート上で行なうことが可能である。米国特許第５，７５６，３４５号；同第４，７４２，００７号；及び同第４，３７１，６１４号には、発酵生物中のトリプトファン生産性の増大に用いる方法が記載されている。トリプトファン生合成の最終ステップは、インドールへのセリンの付加である；従って、セリンの利用性を高めることでトリプトファン生成量を増加させることができる。
発酵生物により生成されたモナチンの量は、宿主生物により生成されるピルベート量を増加させることにより増加させることが可能である。トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）（Ｗａｎｇら，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３３８−４２，２００２）及びトルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）（Ｌｉら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７：４５１−９，２００１）のような特定の酵母は、ピルベートを過剰生成しており、ここに開示される方法の実施に用いることができる。更に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ１４８５ｌｉｐ２株（Ｋａｗａｓａｋｉら．，Ｊ．Ｆｅｒｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．８２：６０４−６，１９９６）と同様に、生物に遺伝子操作を行なってピルビン酸生産を促進させることも可能である。
キラリティーの制御
モナチンの風味の性質は、該分子の立体化学（キラリティー）を制御することにより変更できる。例えば、別の食品系のための異なる濃度の混合においては、別のモナチン異性体が望まれるであろう。キラリティーは、ｐＨ及びポリペプチドの組み合わせにより制御することが可能である。
Figure 2008538924
モナチンのＣ−４部位におけるラセミ化（上記の番号付けがされた分子を参照）は、ｐＨのシフト又は補因子であるＰＬＰとの反応により生じることが可能なα炭素の脱プロトン化及び再プロトン化により生じることが可能となる。微生物においては、ラセミ化を起こす程十分にｐＨがシフトすることはあり得ないが、ＰＬＰは豊富にある。ポリペプチドを用いてキラリティーをコントロールする方法は、モナチン生成に利用する生合成経路に依存する。
モナチンが図２に示す経路を用いて形成される場合、以下を考えることができる。生触媒反応においては、炭素−２のキラリティーは、インドール−３−ピルベートをＭＰへと変換する酵素により決定される。複数の酵素（例えば、ＥＣ４．１．２．−、４．１．３．−から）がインドール−３−ピルベートをＭＰへと変換できるので、従って、所望の異性体を形成する酵素を選択することが可能である。また、これとは別に、インドール−３−ピルベートをＭＰへと変換する酵素のエナンチオ特異性を定向進化により変更することが可能であり、又は触媒抗体を操作して所望の反応を触媒させることも可能である。ＭＰが生成されたならば（酵素又は化学縮合のいずれかにより）、ここに記載されるようなトランスアミナーゼを用いて立体特異的にアミノ基を付加することが可能である。炭素−４のＲ又はＳ配位のいずれも、Ｄ−又はＬ−芳香族酸アミノトランスフェラーゼが使用されるのかに依存して作り出すことが可能である。殆どのアミノトランスフェラーゼはＬ−異性体に特異的であるが、しかし、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼも特定の植物内に存在している（Ｋｏｈｉｂａ及びＭｉｔｏ、第８回ビタミンＢ６及びカルボニル触媒に関する国際シンポジウムの議事録、大阪、日本１９９０年）。更に、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２１）、Ｄ−メチオニン−ピルベートアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．４１）並びに（Ｒ）−３−アミノ−２−メチルプロパノエートアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．６１）及び（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロパノエートアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２２）の両方が同定されている。特定のアミノトランスフェラーゼについては、Ｃ２炭素において特定の配位を有する上記反応用の基質のみを許容するであろう。従って、ＭＰへの変換が立体特異的でない場合であっても、トランスアミナーゼの適切な選択を通じて最終生成物の立体化学を制御することが可能である。前記反応は可逆的であるので、未反応のＭＰ（所望でない同位体）は、再利用してその構成要素に戻すことが可能であり、ＭＰのラセミ混合物を再形成することができる。
基質の活性化
ここに開示される反応において、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）のようなリン酸化された基質を使用することができる。リン酸化された基質はエネルギー的により好ましい場合があり、従って、反応速度及び／又は収量の増加に用いることができる。アルドール縮合では、リン酸基の付加により求核基質のエノール互変異性体が安定化され、より反応性が高められる。他の反応においては、リン酸化された基質は時としてより良好な脱離基を提供する。同様にして、基質はＣｏＡ誘導体又はピロリン酸誘導体への変換により活性化できる。
例証的な態様
１つの態様において、モナチン又はその塩は、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：１ ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）のようなアミノトランスフェラーゼの使用を含む方法により生成することができる。例えば、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼを用いて、トリプトファン、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸、及びそれらの組み合わせから選択される基質を含む少なくとも１つの反応を促進することが可能である。
別の態様において、モナチン又はその塩は、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ）（ＥＣ２．６．１．４２）及び／又は分枝鎖デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）の使用を含む方法により生成することができる。例えば、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ及び／又は分枝鎖デヒドロゲナーゼを用いて２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の反応を促進することができる。適切な分枝鎖アミノトランスフェーゼ（ＢＣＡＴ）（ＥＣ２．６．１．４２）には、ＡＴ−１０２又はＡＴ−１０４が含まれていてもよい。適切な分枝鎖デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）には、ＡＡＤＨ−１１０が含まれていてもよい。
別の態様において、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸又はその塩は、ＫＨＧアルドラーゼのようなアルドラーゼの使用を含む方法により生成することができる。適切なＫＨＧアルドラーゼには、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．： ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）及び／又はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ活性を有するポリペプチドが含まれていてもよい。ある態様では、適切なアルドラーゼには、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）と少なくとも約９５％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含み、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ活性を有するポリペプチドが含まれていてもよい。前記選択されたアルドラーゼを用いてインドール−３−ピルベートのような、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の合成のための基質を必要とする反応を促進することが可能である。
他の態様において、モナチン又はその塩は、アルドラーゼを用いて、モナチンの生成のための基質を必要とし、生成されるモナチンの６０％より多くがモナチンのＲ，Ｒ立体異性体となる反応を促進することを含む方法により生成することができる。前記反応に適切なアルドラーゼには、ＫＨＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）が含まれ、前記反応に適切な基質には、インドール−３−ピルベートが含まれていてもよい。
他の態様において、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸は、以下のものを含む適切な反応混合物を反応させることを含む方法により生成することができる：（ａ）トリプトファンのような適切な基質；（ｂ）ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：１ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）、ＹｆｄＺ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７５４３８．１）及びこれらの組み合わせから選択される第一のポリペプチド；並びに（ｃ）ＫＨＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）、ＰｒｏＡアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）、及びこれらの組合せから選択される第二のポリペプチド。前記基質にトリプトファンが含まれる場合には、該トリプトファンにはＤ−トリプトファン、Ｌ−トリプトファン、及びこれらの混合物が含まれていてもよい。前記トリプトファンは前記反応混合物に添加してもよく、更に／又は適切な基質（例えば、グルコース及びセリン）を反応させることによりその場所で生成することができる。ある態様では、前記トリプトファンにはＤ−トリプトファンが含まれる。前記ＫＨＧアルドラーゼには、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）及び／又はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ活性を有するポリペプチドが含まれていてもよい。ある態様では、適切なアルドラーゼには、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）と少なくとも約９５％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含み、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ活性を有するポリペプチドが含まれていてもよい。また、ある態様では、前記ＰｒｏＡアルドラーゼには、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ、及びこれらの組み合わせが含まれていてもよい。前記選択されたポリペプチドは、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は該反応混合物中に存在する微生物により発現されてもよい。例えば、前記反応混合物には、前記選択されたポリペプチドが、該ポリペプチドを発現する適切な微生物で栄養培地を発酵することにより生成されるような栄養培地が含まれていてもよい。
他の態様において、モナチン又はその塩は、以下のものを含む反応混合物を反応させることにより生成することができる：（ａ）２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸のような適切な基質；並びに（ｂ）ＹｆｄＺ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７５４３８．１）、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：１ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ）（ＥＣ２．６．１．４２）、分枝鎖デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）、及びその組み合わせから選択されるポリペプチド。２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸は、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又はその場所で合成されてもよい。例えば、前記反応混合物には、更に（ｃ）インドール−３−ピルベート；並びに（ｄ）インドール−３−ピルベート及びＣ３炭素供給源を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸へと変換可能な第二のポリペプチドが含まれていてもよい。前記インドール−３−ピルベートは、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は適切な基質からその場所で合成されてもよい。前記選択されたポリペプチドは、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は該反応混合物中に存在する微生物により発現されてもよい。例えば、前記反応混合物には、前記選択されたポリペプチドの１種類以上を発現する微生物で発酵された栄養培地が含まれていてもよい。ある態様では、前記反応混合物には、ＹｆｄＺ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７５４３８．１）、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：１ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）、又はこれらの組み合わせを含む細胞抽出物のような未精製の細胞抽出物が含まれていてもよい。
また、ある態様では、モナチン又はその塩は、以下のものを含む反応混合物を反応させることにより生成することができる：（ａ）２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸のような適切な基質；並びに（ｂ）ＡＴ−１０１、ＡＴ−１０２、ＡＴ−１０３、ＡＴ−１０４、ＡＡＤＨ−１０２、ＡＡＤＨ−１１０、ＡＡＤＨ−１１２、ＡＡＤＨ−１１３、及びこれらの組み合わせから選択されるポリペプチド。ある態様では、前記選択されるポリペプチドは、ＡＴ−１０３でもよい。前記方法により生成されるモナチン又はその塩は、その大部分がモナチンのＲ，Ｒ立体異性体であってもよい。例えば、ある態様では、前記方法において生成されるモナチンの少なくとも約６５％が、モナチンのＲ，Ｒ立体異性体であってもよい。
他の態様において、モナチン又はその塩は、モナチン組成物中に存在するモナチン又はその塩の少なくとも約８０％がモナチンのＲ，Ｒ立体異性体であるようなモナチン組成物を酵素的に生成することにより、基質（トリプトファン及び／又はインドール−３−ピルベートのような）から生成することができる。前記方法の適切な態様では、前期モナチン組成物中に存在するモナチン又はその塩の少なくとも約８４％が、モナチンのＲ，Ｒ立体異性体である。適切な基質には、トリプトファンが含まれていてもよく、これにはＤ−トリプトファン、Ｌ−トリプトファン又はこれらの混合物が含まれていてもよい。ある態様では、前記選択された基質はＤ−トリプトファンである。前記方法には、ＰｒｏＡアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）を提供することが含まれていてもよい。例えば、ＰｒｏＡアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）を提供してインドール−３−ピルベートから２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸への変換を促進することができる。ある態様では、前記方法には、ＡＴ−１０３（Ｄ−トランスアミナーゼ）のようなトランスアミナーゼを提供することが含まれていてもよい。例えば、ＡＴ−１０３（Ｄ−トランスアミナーゼ）を提供して、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸からモナチンへの変換を促進することができる。
他の態様において、モナチン又はその塩は、以下のものを含む反応混合物を反応させることを含む方法により生成することができる：（ａ）トリプトファン、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸、及びこれらの組み合わせから選択される基質；並びに（ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣポリペプチド（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７４０１４．１）。前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣポリペプチド（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７４０１４．１）には、ブタ細胞質ゾルのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの番号付け方式に基いて番号付けされた、第３９、４１、４７、６９、１０９、２９７番目、及びこれらの組み合わせから選択されるアミノ酸部位における少なくとも１つの置換を含んでいてもよい。適切な態様では、前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣポリペプチドは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有してもよい。前記前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣポリペプチドには、以下の置換の少なくとも１つが含まれていてもよい：第３９番目のバリンからロイシンへの置換；第４１番目のリジンからチロシンへの置換；第４７番目のスレオニンからイソロイシンへの置換；第６９番目のアスパラギンからロイシンへの置換；第１０９番目のスレオニンからセリンへの置換；第２９７番目のアスパラギンからセリンへの置換；及びこれらの組み合わせ。前記基質は、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は適切な基質からその場所で生成されてもよい。前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣポリペプチドは、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は該反応混合物中に存在する微生物により発現されてもよい（例えば、前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣポリペプチドを発現する微生物で、栄養培地が含まれていてもよい反応混合物を発酵させることによる）。
更なる態様においては、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸又はその塩は、以下のものを含む反応混合物を反応させることにより生成することができる：（ａ）インドール−３−ピルベートのような基質；及び（ｂ）適切なアルドラーゼ。例えば、前記アルドラーゼは、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ １１０株（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２７３７８９５３）；スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）（シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））パウシモビリス（ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：１９９１８９６３）；イエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）ＫＩＭ （ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ： ＧＩ：２１９５６７１５）；ラルストニア・メタリジュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）ＣＨ３４（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：４８７６７３８６）；イエルシニア・シュードチュベルキュロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＩＰ ３２９５３（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：５１５９４４３６）；リゾビウム・レグミノサラム・ビオヴァルヴィシエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ ｖｉｃｉａｅ）ｒｈｉｚ２３ｇ０２−ｐ１ｋ １００９ ３４１（配列番号８８）；ノヴォスフィンゴビウム・アロマティシヴォランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ １２４４４（スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）Ｆ１９９）（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：４８８４９０２６）；シュードモナスプティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２４９８４０８１）；マグネトスピリラム・マグネトタクティカム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ）ＭＳ−１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：４６２００８９０）；ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＣＧＡ００９（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：３９９３７７５６）；キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ−３３９１３（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２１１１５２９７）；キサントモナス・アキソノポディス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｃｉｔｒｉ）３０６（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２１１１０５８１）；ストレプトマイシス・アヴェルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２９８２８１５９）；及びこれらの組み合わせから選択されてもよい。前記基質（例えば、インドール−３−ピルベート）は、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は適切な基質からその場所で生成されてもよい。前記アルドラーゼは、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は該反応混合物中に存在する微生物により発現されてもよい（例えば、選択されるアルドラーゼを発現する微生物で、栄養培地が含まれていてもよい反応混合物を発酵させることによる）。
更なる態様では、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸又はその塩は、以下のものを含む反応混合物を反応させることにより生成できる：（ａ） インドール−３−ピルベートのような基質；及び（ｂ）適切なアルドラーゼ。例えば、適切なアルドラーゼには、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸リアーゼ活性を有しており、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡ（配列番号６６）と少なくとも約４９％同一なアミノ酸配列、又はシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＣＡＣ４６３４４）と少なくとも約５６％同一なアミノ酸配列を含んでいてもよい。ある適切な態様では、前記アルドラーゼは、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸リアーゼ活性を有しており、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡ（配列番号６６）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、及び／若しくは９９％同一なアミノ酸配列、並びに／又はシノリゾビウムメリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＣＡＣ４６３４４）と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、及び／若しくは９９％同一なアミノ酸配列を含むであろう。また、ある態様では、前記アルドラーゼは、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡ（配列番号６６）と少なくとも約６０％同一なアミノ酸配列を含む。他の態様では、前記アルドラーゼは、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡ（配列番号６６）と少なくとも約７０％同一なアミノ酸配列を含む。前記基質（例えば、インドール−３−ピルベート）は、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は該反応混合物中の適切な基質からその場所で生成されてもよい。前記アルドラーゼは、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は該反応混合物中に存在する微生物により発現されてもよい（例えば、選択されるアルドラーゼを発現する微生物で、栄養培地が含まれていてもよい反応混合物を発酵させることによる）。
更なる態様において、モナチン又はその塩は、以下のものを含む反応混合物を反応させることを含む方法により生成することができる：（ａ）トリプトファンのような基質；及び適切なデアミナーゼ（ＥＣ３．５．１．−）。ある態様では、前記デミナーゼは、以下のものから選択される微生物から得られる：プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）種、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）種、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）種、又はこれらの組み合わせ。適切なデアミナーゼには、プロテウス・ミキソファシエンス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ヴルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・モルガニイ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、及びこれらの組み合わせを含むが、これに限定されることのないプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）種から得られるデアミナーゼが含まれていてもよい。前記トリプトファンは、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は適切な基質からその場所で生成されてもよい。前記デアミナーゼは、前記反応混合物に添加されてもよく、更に／又は該反応混合物中に存在する微生物により発現されてもよい（例えば、選択されるデアミナーゼを発現する微生物で、栄養培地が含まれていてもよい反応混合物を発酵させることによる）。
実施例１
トリプトファンアミノトランスフェラーゼのクローニング及び発現
本実施例は、トリプトファンのインドール−３−ピルベートへの変換に使用可能なトリプトファンアミノトランスフェラーゼのクローニングに用いた方法を記載する。該遺伝子は、ｐＥＴ ３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターにクローニングされ、切断可能なＮ末端ＨＩＳ6−Ｔａｇ／Ｔ７タグを有する複合タンパクが産生された。生じたタンパク質は固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製された。
実験の概要
アミノトランスフェラーゼをコードする１１種類の遺伝子が、大腸菌にクローニングされた。これらの遺伝子は、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｙ１４０８２．１ ｂｐ２８６２２−２９４７０及びＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ ３８８８４８．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（又はリゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｈｉｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ともいう）のチロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔａｔＡ、配列番号１及び２、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、ロドバクテル・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）２．４．１株のチロシンアミノトランスフェラーゼ（ホモロジーによりアサートされたｔａｔＡ、配列番号３及び４、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）３５０５３のチロシンアミノトランスフェラーゼ（ホモロジーによりアサートされた、配列番号５及び６、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）の広範囲な基質に対するアミノトランスフェラーゼ（ｂｓａｔ、メキシコリーシュマニア（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）からのペプチド断片に対するホモロジーによりアサートされた、配列番号７及び８、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ、ホモロジーによりアサートされた、配列番号９及び１０、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、ラクトバシラス・アミロヴォラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）の芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ、ホモロジーによりアサートされた、配列番号１１及び１２、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）３５０５３の複数基質に対するアミノトランスフェラーゼ（ホモロジーによりアサートされた、配列番号１３及び１４、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、ロドバクテル・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）２．４．１株の複数基質に対するアミノトランスフェラーゼ（ｍｓａ、ホモロジーによりアサートされた、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡＥＯ １００００９３．１， ｂｐ１４７４３−１６１５５及びＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＺＰ００００５０８２．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０００１９５．１ ｂｐ２７５５−１５６５及びＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７４０１４．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、及び大腸菌のチロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ、 配列番号３１及び３２、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）。
これらの遺伝子は、クローニングされ、発現されて、市販の酵素と共にトリプトファンをインドール−３−ピルベートに変換する活性について試験された。１１種類全てのクローンが活性を有していた。
所望の活性を持つポリペプチドを収容可能な菌種の同定
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースには、トリプトファンアミノトランスフェラーゼとして称される遺伝子が無かった。しかしながら、この酵素の活性を有する生物が同定された。以下の供給源からの細胞抽出物又は精製されたタンパク質には、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）活性が測定された：フェスカ・オクトフロラ（Ｆｅｓｔｕｃａ ｏｃｔｏｆｌｏｒａ）からの根瘤菌単離物、エンドウマメのミトコンドリア及び細胞質ゾル、ヒマワリの根頭癌腫細胞、リゾビウム・レグミノサラム・ビオヴァル・トリフォリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ ｔｒｉｆｏｌｉ）、エルウィニア・ヘルビコラｐｖ．ギプソフィレ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ ｐｖ．ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａｅ）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．サヴァスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アゾスピリラム・リプフェラム及びブラジレンス（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｆｅｒｕｍ ＆ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）、エンテロバクテル・クロアケ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクテル・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、ブラジリゾビウム・エルカニイ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｌｋａｎｉｉ）、カンジダ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、アゾトバクテル・ヴィネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、ラットの脳、ラットの肝臓、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、シュードモナス・フルオレセンスＣＨＡＯ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＣＨＡＯ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ヘルヴェティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、小麦の幼苗、大麦、ファセオラス・アウレウス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（リョクトウ）、サッカロミセス・ウヴァラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）（カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）），リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、トウモロコシ、トマトの苗条、エンドウマメの木、タバコ、ブタ、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、及びストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）。
クローニングのためのゲノムＤＮＡの単離
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（ＡＴＣＣ受託番号９９３０）を、ｐＨ７．２、２５℃において、ＴＹ培地中で増殖した。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）が１．８５になるまで細胞を増殖させ、ゲノムＤＮＡの調製には２％の種菌を用いた。ゲノムＤＮＡの単離には、キアゲンジェノミックチップ（Ｑｉａｇｅｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｔｉｐ）２０／Ｇキット（バレンシア、カリフォルニア州）が用いられた。
バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）６０５１（ＡＴＣＣ）を３０℃にてべレト・ニュートリエント・ブロス（Ｂｅｒｅｔｏ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）中で増殖した（Ｄｉｆｃｏ；デトロイト、ミシガン州）。キアゲンジェノミックチップ２０／Ｇのプロトコルに以下の変更を加えたものを用いてゲノムＤＮＡを単離した：プロテナーゼＫ及びリゾチームの濃度を２倍にし、インキュベーション時間を２−３倍に増やした。
大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＡＴＣＣ５０１２２のゲノムＤＮＡは、ＩＤＩ社（ケベック州、 ａｎａｄａ）からｐＨ８．０のＴＥバッファー中に１７ｎｇ／μＬの濃度で提供された。
ロドバクテル・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）２．４．１株（テキサス大学（ヒューストン）Ｓａｍ Ｋａｐｌａｎ教授からの提供）、Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）３５０５３（ＡＴＣＣ受託番号）、及びＬ．アミロヴォラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のゲノムＤＮＡを標準的なフェノール抽出により調製した。細胞は、対数期の後期に回収し、ＴＥＮバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、細胞懸濁液１ｍＬに対して０．０２４ｍＬのラウリルサルコシンナトリウムを添加することで溶解した。該ＤＮＡ溶液については、ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で飽和したフェノールを等量用いて少なくとも３回抽出した後、クロロホルム／オクタノール９：１溶液で１回抽出し、クロロホルムで３回抽出した。０．１倍体積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．８及び２倍体積のエタノールの添加により、該ＤＮＡを沈殿した。該沈殿物は、遠心により回収され、７０％エタノールで１回洗浄された。最後に、該ＤＮＡは０．１０ｍＬの蒸留水に溶解された。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡを、ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社）から単離し、キアゲンジェノミックチップ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐTM）（５００／Ｇ）キットを用いて調製した。ＬＢでＯＤ650が１．８７になるまで増殖した上記株の３０ｍＬから、０．３ｍｇの精製ＤＮＡが得られた。該精製ＤＮＡはキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）流出バッファー（ＥＢ）に、０．３７μｇ／μＬの濃度で溶解された。
ポリメラーゼ連鎖反応法プロトコル
ｐＥＴ ３０ Ｘａ／ＬＩＣベクター（ノバジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）に適合する突出部を有するプライマーを設計した。該ｐＥＴベクターは、Ｘａ／ＬＩＣ部位の５’側に１２塩基の一本差突出部を有し、該Ｘａ／ＬＩＣ部位の３’側に１５塩基の一本差突出部を有する。該プラスミドは、非クローニング依存性ライゲーション用に設計され、Ｎ末端にＨｉｓ及びＳタグを、Ｃ末端には任意でＨｉｓタグを有する。Ｘａプロテアーゼ認識部位（ＩＥＧＲ）は、目的遺伝子の開始コドンの直前に位置しているので、融合タンパク質のタグを除去することが可能である。
プライマー設計時に、生物種特異的な配列の５’末端に、以下の配列が付加された：フォーワードプライマー、５’ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣ（配列番号７３）；リバースプライマー：５’ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣ（配列番号７４）。
バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｔ用プライマー：
Ｎ末端：ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＧＧ−３’及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴ−３’（配列番号１５及び１６）。
シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｔａｔＡ用プライマー：
Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＣＧ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ（配列番号１７及び１８）。
バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｒａＴ用プライマー：
Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＴＣＣ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＡＡＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧ（配列番号１９及び２０）。
ロドバクテル・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のｍｓａ（２．４．１株及び３５０５３の両方）：
Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＴ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＧＧＧ（配列番号２１及び２２）。
大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）のｂｓａｔ：
Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＡＴ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＧＣ（配列番号２３及び２４）。
ラクトバシラス・アミロヴォラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のａｒａＴ：
Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＴＴＡＧＣＴＡＡＴＧＡ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＡ（配列番号２５及び２６）。
ロドバクテル・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のｔａｔＡ：（２．４．１株及び３５０５３の両方）：
Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＣＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧ（配列番号２７及び２８）。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のａｓｐＣ：
Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧＣ−３’及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧ−３’（配列番号２９及び３０）。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｔｙｒＢ：
Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＣ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧ−３’（配列番号３３及び３４）。
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）から得た遺伝子（ｔａｔＡ）は、以下のＰＣＲプロトコルを用いて増幅された。５０μＬの反応量において、０．１−０．５μｇの鋳型、１．５μＭの各プライマー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕのエキスパンドハイファイデリティーポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ロッシュ社、インディアナポリス、インディアナ州）、及びＭｇ含有の１×エキスパンド（商標）（１×ＥｘｐａｎｄTM）バッファーを用いた。使用したサーマルサイクラーのプログラムには、９６℃で５分間のホットスタート、及びこれに続く以下のステップの２９回の繰返し：９４℃で３０秒、５５℃で２分間、及び７２℃で２．５分間、が含まれた。前記２９回の繰返しの後、サンプルは７２℃にて１０分間維持され、その後、４℃にて保存された。このＰＣＲプロトコルにより、１１９９ｂｐの生成物が得られた。
Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から得た遺伝子の配列（ｍｓａ及びｔａｔＡ）、Ｌ．アミロヴォラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のａｒａＴ、及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のａｒａＴから得た遺伝子の配列は、以下のＰＣＲプロトコルを用いて増幅された。５０μＬの反応量において、０．１−０．５μｇの鋳型、１．５μＭの各プライマー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕのエキスパンドハイファイデリティー（商標）ポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙTM Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、及びＭｇ含有の１×エキスパンド（商標）（１×ＥｘｐａｎｄTM）バッファーを加えた。使用したサーマルサイクラーのプログラムには、９６℃で５分間のホットスタート、及びこれに続く以下のステップの２９回の繰返し：９４℃で３０秒、４０−６０℃で１分間、４５秒間（温度勾配機能付きサーマルサイクラー）及び７２℃で２分間、１５秒間が含まれた。前記２９回の繰返しの後、サンプルは７２℃にて１０分間維持され、その後、４℃にて保存された。
各Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のｍｓａ遺伝子については、４２℃及び４８℃のアニーリング温度において、複数の生成物が得られたが、明確なバンドは約１４６４ｂｐにあった。Ｌ．アミロヴォラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のａｒａＴについては、４２℃、４８℃、及び５６℃のアニーリング温度で、１１７３ｂｐに強いバンドとして単一の生成物を得た。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｒａＴについては、４０℃、４５℃、５０℃、及び５５℃のアニーリング温度で、ゲノムＤＮＡ及びコロニーの両方から単一の強い生成物を得た（１１７３ｂｐ）。大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）のｂｓａｔについては、５５℃のアニーリング温度で最も明るい生成物が得られた（１２６０ｂｐ）。ロドバクテル（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）のｔａｔＡ遺伝子については、５０−５５℃のアニーリング温度で、適切なサイズに明るい産物を得た（１２３９ｂｐ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｔ遺伝子については、５５−６０℃のアニーリング温度が用いられ、アニーリング時間は４５秒間へ短縮された。適切なサイズの明るい産物が得られた（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子については約１．３ｋｂ、ｄａｔ遺伝子については約８５０ｂｐ）。
クローニング
前記ＰＣＲ産物は、キアゲンゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（バレンシア、カリフォルニア州）を用いて、０．８％又は１％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製された。前記ＰＣＲ産物は、アガロースゲルでの標準物との対比により定量され、その後、ライゲーションインディペンデントクローニング（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）用の製造元推奨プロトコルに従ってＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理された。
簡潔には、約０．２ｐｍｏｌの精製されたＰＣＲ産物を、ｄＧＴＰの存在下で、２２℃にて３０分間１ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと処理した。前記ポリメラーゼは、前記ＰＣＲ産物の３’末端から連続する塩基を取り除く。前記ポリメラーゼはグアニン残基と遭遇すると、該酵素の５’から３’方向へのポリメラーゼ活性が前記エキソヌクレアーゼ活性を妨害し、これ以上の切除を効果的に防止する。これにより、ｐＥＴ Ｘａ／ＬＩＣベクターと適合する一本鎖の突出部が作り出される。前記ポリメラーゼは、７５℃で２０分間インキュベートすることで不活性化される。
前記ベクター及び処理済みインサートは、ノバジェン社の推奨通りにアニールされた。約０．０２ｐｍｏｌの処理済みインサート及び０．０１ｐｍｏｌのベクターは、２２℃にて５分間インキュベートされ、６．２５ｍＭのＥＤＴＡ（終濃度）が添加され、前記２２℃のインキュベーションが繰り返された。前記アニーリング反応物（１μＬ）は、ノバブルー（商標）（ＮｏｖａＢｌｕｅTM）シングルスコンピテントセル（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）へ添加され、氷上にて５分間インキュベートされた。混合の後、前記細胞は、４２℃にて３０秒間のヒートショック法により形質転換された。前記細胞は２分間氷上に置かれ、常温の２５０μＬのＳＯＣで回収され、３７℃にて３０分間、２２５ｒｐｍで振とう培養された。細胞は、カナマイシンを含有（２５−５０μｇ／ｍＬ）するＬＢプレートに播種された。
プラスミドＤＮＡは、キアゲンスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて精製され、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩを用いた制限酵素処理により、適正なインサートがスクリーニングされた。適正なインサートを有すると思われるプラスミドの配列は、ジデオキシ鎖停止ＤＮＡシーケンス法により確かめられた。
配列番号１−１４及び３１−３２は、前記組換えアミノトランスフェラーゼのヌクレオチド配列及びそれに対応するアミノ酸配列を示しており、Ｇｅｎｂａｎｋの配列からのいかなる変異も、サイレント置換であるか、又はタンパク質配列に保存的置換を作り出していた。配列番号１１及び１２は新規な配列である。
遺伝子発現及びアッセイ
配列解析により確かめられたプラスミドＤＮＡは、大腸菌発現宿主であるＢＬＲ（ＤＥ３）又はＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）にサブクローニングされた。該培養は増殖され、前記プラスミドはキアゲンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて単離され、制限酵素処理により解析されて同一性が確認された。
初めに、ＢＬＲ（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）の両細胞中のＬ．アミロヴォラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のａｒａＴ、Ｂ． サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｒａＴ、及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｔａｔＡに誘導がなされた。カナマイシン含有（３０ｍｇ／Ｌ）のＬＢで０．５−０．８のＯＤ600まで増殖した培養を用いて経時的実験が行なわれ、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）で誘導され、該誘導後の０、１、２、及び４時間目にサンプリングが行なわれた。２．０ｍＬからの細胞が、１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％ ２−メルカプトエタノール、及び２０％グリセロールを含む０．１０ｍＬの１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ６．８に再懸濁され、９５℃にて１０分間加熱されて冷却され、０．１０ｍＬのＨ2Ｏに希釈された。これら細胞総タンパク質のサンプルは、４−１５％の勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。２時間及び４時間の誘導、ＢＬＲ（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の間に発現されたタンパク質量に有意な差は無かった。
２ｍＬの培養からの細胞ペレットを０．２５μＬのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む０．２５ｍＬのノバジェンバグバスター（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ ＢｕｇＢｕｓｔｅｒTM）試薬液に懸濁し、低速の振とうと共に常温で２０分間インキュベートし、１６，０００×ｇで遠心して細胞片を除去することにより、４時間目のサンプルから細胞抽出物をもまた調製した。上澄（細胞抽出物）は、４−１５％の勾配ゲルにローディングされ、細胞の可溶性タンパク質について分析された。
（Ｌ．アミロヴォラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のａｒａＴ（配列番号１１及び１２）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｒａＴ（配列番号９及び１０）、及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｔａｔＡ（配列番号１及び２）の３種類のクローンでは、適正なサイズ（約４５ｋＤａ）に相当する可溶性タンパク質が示された。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｒａＴ遺伝子産物は、最も高い過剰発現レベルにあり、及び／又は、他の２種の遺伝子産物よりも可溶性が高かった。
その次の発現方法では、陽性クローンからのプラスミドＤＮＡは、その宿主の優れた増殖能のためＢＬ２１（ＤＥ３）にサブクローニングされた。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢで増殖された培養で、ＯＤ600が約０．８に達した時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて再度誘導が行なわれた。細胞は、３７℃で４時間増殖させた後に回収され、３０００ｒｐｍで１０分間（４℃）遠心され、ＴＥＧＧＰバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍｇ／Ｌグルタチオン、５％グリセロール、ロッシュ社のコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を含む）で洗浄され、−８０℃のエタノール中で瞬間冷凍された。
サンプルは、５μＬ／ｍＬのプロテアーゼ阻害剤カクテルセット＃３（カルバイオケム−ノババイオケム社、サンディエゴ、カリフォルニア州）及び１μＬ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼを含むバグバスター（商標）（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒTM）（ノバジェン社）試薬に、５ｍＬ／ｇ湿細胞重量で再懸濁された。サンプルは、軌道振とう器上で、常温にて２０分間インキュベートされた。不溶性の細胞片は、１６，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心することにより除去された。
細胞抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、以下のプロトコルを用いた以下のインドール−ピルビン酸の生産によりトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性についてアッセイが行なわれた。５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭヒ酸ナトリウム、５０μＭピリドキサールホスフェート、５ｍＭ α−ケトグルタレート、及び５ｍＭ Ｌ−トリプトファン中で１ｍＬの反応が行なわれた。前記反応は、細胞無しの抽出物又は精製された酵素を添加することで開始され、３０℃にて３０分間インキュベートされた。２０％のＴＣＡ（２００μＬ）を添加して反応を停止し、沈殿したタンパク質は遠心により除去された。３２７ｎｍの吸光度が測定され、アッセイバッファー中の新たに調製されたインドール−３−ピルベートの検量線と比較された。トリプトファン基質無し、又はｐＥＴ３０ａのみを形質転換したクローンの無細胞抽出物を用いたコントロール反応も行なわれた。
細胞抽出物中の天然の大腸菌性アミノトランスフェラーゼによるバックグランドのため、ぞれぞれｐＥＴ３０のアミノ末端ＨＩＳ6−タグ／Ｓ−タグに融合したアミノトランスフェラーゼタンパク質を含む前記組換え融合タンパク質は、Ｈｉｓ−結合性カートリッジを備えた固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて、製造元のプロトコル（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）に従って精製された。前記複合タンパク質のＨＩＳ6−タグ配列は、ＩＤＡベースのＨｉｓ結合性樹脂に固定化された２価のＮｉ2+カチオンに結合する。溶離液フラクションは、ＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）カラムで脱塩され、ｐＨ７．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓで溶離された。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、アミノトランスフェラーゼ活性についてアッセイされた。
１ｍＭ ＩＰＴＧ（４時間）による３７℃での誘導からの結果は、大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）のｂｓａｔ、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｔａｔＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｓｐＣ、及び両Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のｔａｔＡクローンは、有意なレベルのトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を有することを示している。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｒａＴタンパク質は、過剰発現されており、可溶性であるが、酵素活性は殆ど示さなかった。Ｌ．アミロヴォラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のａｒａＴ遺伝子産物は、細胞抽出物中で可溶性であることが分かったが、Ｈｉｓ−結合性カートリッジを用いた精製では、適正な分子量を持つタンパク質が少量生じただけであった。ｍｓａ遺伝子産物は不溶性であり、２４℃にて更なる発現実験を行ない封入体の形成を最小化した。１０μＭないし１ｍＭにある種々のＩＰＴＧ濃度を用いて可性タンパク質量を最大化した。
表１は、ミリグラム量のタンパク質から１分間に形成されたマイクログラム量のインドール−３−ピルベート（Ｉ３Ｐ）の測定された特異的活性を列挙している。いくつかのケースにおいて、非常に微量な組換えタンパク質が該アッセイの有効な直線範囲を上回る高レベルの活性を示した。これらのケースでは、「＞」が具体的な活性値の前に記載されている。
Figure 2008538924
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クローニングされた全ての組換えタンパク質を比較するアライメントから、ａｒａＴ、ｔａｔＡ、ｂｓａｔ、及びｍｓａの配列間にはあまり多くの保存領域が存在しないことが示される。最も活性の高い組換えタンパク質のアライメント：ロドバクテル（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）のｔａｔＡ遺伝子産物のホモログ、大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）の広範囲基質アミノトランスフェラーゼ、及びシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のチロシンアミノトランスフェラーゼは、種々の保存領域を示したが、しかし、タンパク質レベルにおいて３０−４３％程度の同一性しか有していない。広範囲の利用性、Ｄ−特異的（Ｄ−アラニン）アミノトランスフェラーゼは、モナチンの他の立体異性体の作製に有用であろう（実施例９−１５参照）。
実施例２
本実施例は、ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターにクローニングされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｓｐＣ遺伝子の変異種、ＨＥＸのサブクローニング及び解析に用いられた方法について記載する。この遺伝子の産物は、その活性部位に６箇所の変異を有し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴｙｒＢ芳香族（チロシン）アミノトランスフェラーゼに対する相同性に基づいた芳香族アミノ酸のアミノトランスフェラーゼ活性が増大されるように合理的に設計された。これらの箇所のうち、２箇所（Ｔｈｒ１０９及びＡｓｎ２９７；ブタ細胞質のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）の番号付け方式）は、全ての公知のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素において不変であるが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴｙｒＢ配列（Ｓｅｒ１０９及びＳｅｒ２９７）を模倣するように改変された。他の４箇所（ＶａＩ３９、Ｌｙｓ４１、Ｔｈｒ４７、及びＡｓｎ６９）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣの活性部位の窪みに一列に並んでおり、ＴｙｒＢ内に存在するより疎水性の高い側鎖を有するアミノ酸（Ｌｅｕ３９、Ｔｙｒ４１、Ｉｌｅ４７、及びＬｅｕ６９）で置換されている。
クローニング
ｐＵＣ１９にクローニングされたＨＥＸ遺伝子は、ＪＦ Ｋｉｒｓｃｈ教授（分子細胞生物学科、カリフォルニア大学バークレイ校、バークレイ、カリフォルニア州９４７２０−３２０６）より提供され、該遺伝子のｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣへのクローニング用鋳型として使用された。Ｊａｍｅｓ Ｊ．Ｏｎｕｆｆｅｒ及びＪａｃｋ Ｆ．Ｋｉｒｓｃｈ、「ホモロジーモデリング及び部位特異的変異誘発による大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの基質特異性の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）チロシンアミノトランスフェラーゼの基質特異性への再設計（Ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４：１７５０−１７５７（１９９５）を参照。
実施例１に記載されるｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣベクターに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｓｐＣ遺伝子（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）をクローニングするために設計されたプライマー（配列番号２９及び３０）を用いて同ベクターにＨＥＸ遺伝子がサブクローニングされた。以下のＰＣＲプロトコルを用いて遺伝子増幅を行なった：５０μＬの反応量中に、５０ｎｇのＤＮＡの鋳型、１．０μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１ＵのｐｆｕＵｌｔｒａ ＨＦポリメラーゼ（ストラタジーン社）、２．１Ｕのエキスパンドハイファイデリティー（商標）ポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙTM Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社、インディアナポリス、インディアナ州）、及びＭｇ含有の１Ｘエキスパンド（商標）（１×ＥｘｐａｎｄTM）バッファーが添加された。サーマルサイクラーのプログラムには、９４℃で５分間のホットスタート；これに続く９４℃（３０秒）の変性ステップ、５０℃（１分間）のアニーリングステップ、及び７２℃（１分３０秒間）の伸長ステップの１０サイクル；９４℃（３０秒）の変性ステップ、５５℃（１分間）のアニーリングステップ、及び各サイクル毎に５秒ずつ延長される７２℃（１分３０秒間）の伸長ステップの１５サイクル；９４℃（３０秒）の変性ステップ、５５℃（１分間）のアニーリングステップ、及び７２℃（２分４５秒間）の伸長ステップの１０サイクル；及び最後に７２℃（７分間）の終了ステップ、が用いられた。該増幅されたＤＮＡは、キアゲンキアクイックゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（バレンシア、カリフォルニア州）を用いて１％アガロースゲルから精製された。前記ＰＣＲ産物は、２６０ｎｍの吸光度測定により定量され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理され、ライゲーションインディペンデントクローニング（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ）用の製造元推奨プロトコル（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）及び上記実施例１の記載に従って前記ベクターにアニーリングされた。
アニーリング反応物のエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂへの形質転換は、バイオラッド社のエレクトロポレーションマニュアルに記載されるように、０．１ｃｍキュベット及びバイオラッドジーンパルサーＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ）を用いて、標準的な条件の下で行なわれた。ＨＥＸ遺伝子を含むクローンは制限酵素処理解析により同定され、ＤＮＡシーケンスにより確認された。配列番号７５及び７６は、ＨＥＸ遺伝子及び遺伝子産物（ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ、又はＨＥＸタンパク質とも呼ばれる）のヌクレオチド配列及びこれに相当するアミノ酸配列を示す。ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ １ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０（アミノ酸配列）を参照。
遺伝子発現及びアッセイ
プラスミドＤＮＡ（シーケンス解析により確認）は、発現宿主であるＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）にサブクローニングされた。該培養は、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ倍地中で増殖され、前記プラスミドはキアゲンスピンプラスミドミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ｓｐｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて単離され、続いて制限酵素処理により解析されて同一性が確認された。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃にて増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）構築物を用いて誘導実験が行なわれた。ＯＤ600が約０．６に達した後に、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現が誘導された。細胞は３０℃で４時間増殖され、遠心により回収された。細胞は、その後、１μＬ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ、５μＬ／ｍＬのカルバイオケムプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｅｔ ＩＩＩ）及び０．３３μＬ／１０ｍＬのｒ−リゾチームを含むバグバスター（商標）（ＢｕｇｂｕｓｔｅｒTM）試薬液（ノバジェン社）を用いて、ノバジェン社推奨プロトコルに従って溶解された。低速振とうと共に２５℃で１５分間インキュベーションされた後、細胞片は、４℃にて２１，０００×ｇで２０分間遠心してペレット化された。上澄（無細胞抽出物）は、４−１５％の勾配ゲル（バイオラッド社）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、前記組換え融合タンパク質の可溶性タンパク質濃度が検出された。発現量は高く（可溶性タンパク質の約３０−４０％）、ａｓｐＣアミノトランスフェラーゼタンパク質で観察された場合と同様であった。
ＨＩＳ6−ＨＥＸタンパク質が、Ｈｉｓ−結合性９００カートリッジを有する固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて、製造元推奨プロトコル（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）に従って細胞抽出物（上記の通り調整された）から精製された。（ＨＩＳ６−ＨＥＸタンパク質のＨＩＳ6−タグ配列は、ＩＤＡベースのＨｉｓ−結合性樹脂に固定化された２価のＮｉ2+カチオンに結合する）。溶離液フラクションは、ＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）カラムで脱塩され、ｐＨ７．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで溶離された。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度が分析され、ウシ血清アルブミンを標準物としてピアスＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ａｓｓａｙ）を用いて精製フラクション中のタンパク質の量が測定された。
精製されたＨＩＳ6−ＨＥＸタンパク質及び精製されていない細胞抽出物は、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性について以下のプロトコルを用いて解析された：１．０ｍＬの反応混合物には、５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５、５ｍＭ α−ケトグルタレート、０．０５ｍＭピリドキサールホスフェート、０．５ｍＭ ヒ酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び酵素が含まれた。前記酵素以外の全ての組成物が一緒に混合され、該酵素を添加して反応を開始させ、該反応溶液は３０℃で３０分間インキュベートされた。前記反応は、０．２ｍＬの２０％トリクロロ酢酸の添加により停止され、前記混合物は、２１，０００ｒｐｍで遠心され、透明な上澄が慎重に除去された。前記上澄の吸光度を３２７ｎｍにて測定した（インドール−３−ピルベートに最大の吸光度）。全ての反応は、２つの系にて行なわれた。実施例１に記載されるＨＩＳ6−ｔｙｒｂ及びＨＩＳ6−ａｓｐＣのアミノトランスフェラーゼの比較については、同様のプロトコルを用いて解析された。結果を表２に示す。３２７での吸光度は、インドール−３−ピルベート濃度に比例しており、特定の実験における種々の酵素の相対活性の測定に用いることが可能である。
Figure 2008538924
表２に列挙される結果は、精製された酵素をアッセイで用いた場合には、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼが、ＡｓｐＣタンパク質よりも、トリプトファンに対して約４０％高い活性を有することを示している。細胞抽出物が前記酵素の供給源である場合には、活性の向上は、有意に低下している。このことは、宿主である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の天然タンパク質による干渉的な活性に起因するものであろう。ＴｙｒＢ遺伝子産物は、ＡｓｐＣタンパク質よりも不安定であり、この安定性の欠如は、この酵素について観察される程度の低い活性に反映されているであろう。更に、前記Ｈｉｓ複合タグは、タンパク質の適正な高次構造に干渉し、その活性に不利に影響しているかもしれない。下記データを参照。トリプトファンに対するＡｓｐＣのＨＥＸ変異体の増大した活性は、この酵素を下記実施例９−１０（表６及び７）に記載されるように使用した場合のモナチン形成量の向上を説明できるであろう。ＡｓｐＣのＨＥＸ変異体は、Ｃ．テストステロニ（Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼを含む反応におけるＳ，Ｓモナチン作製に最適な酵素である。
実施例３
本実施例は、ａｓｐＣ、ｔｙｒＢ、及びＨＥＸアミノトランスフェラーゼ遺伝子、及びアミノ末端のＨＩＳ6タグ無しで構築された該遺伝子産物のサブクローニング、発現及び解析に用いられた方法について記載する。アミノトランスフェラーゼ活性は、実施例１８に記載されるように、反応の副産物であるグルタメートの形成をＨＰＬＣで追跡することにより測定された。
クローニング
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｓｐＣ、ｔｙｒＢ及びＨＥＸ遺伝子のｐＥＴ３０ａベクター（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）へのクローニング用に、下記のプライマーが設計された（同じプライマーがａｓｐＣ及びＨＥＸにも用いられた）：
ａｓｐＣ／ＨＥＸプライマー：
Ｎ末端：５’−ＧＣＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣ−３’（配列番号７７）；
Ｃ末端：５’−ＡＴＡＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧ−３’（配列番号７８）；
ｔｙｒＢプライマー：
Ｎ末端：５’−ＧＣＧＧＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＣ−３’（配列番号７９）；
Ｃ末端：５’−ＣＣＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧ−３’（配列番号８０）。
制限酵素との適合性及びより高発現レベルのため、ｔｙｒＢのコーディング配列の５’側にＡＴＧ開始コドンが付加された。以下のＰＣＲプロトコルを用いて遺伝子増幅を行なった：１００μＬの反応量中に、５０ｎｇのＤＮＡの鋳型、１．０μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１ＵのＰｆｕターボ（Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ）ポリメラーゼ（ストラタジーン社；ラホヤ、カリフォルニア州）、及び１ＸクローンドＰｆｕ（Ｃｌｏｎｅｄ Ｐｆｕ）バッファーが添加された。サーマルサイクラーのプログラムには、９４℃で５分間のホットスタート；これに続く９４℃（３０秒）の変性ステップ、５５℃（１分間）のアニーリングステップ、及び７２℃（２分間）の伸長ステップの２５サイクル、及び最後に７２℃（７分間）の終了ステップ、が用いられた。該増幅されたＤＮＡは、キアゲンキアクイック（登録商標）ＰＣＲピュリフィケーションキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（バレンシア、カリフォルニア州）を用いて精製された。前記精製されたＤＮＡ及び精製されたプラスミドＤＮＡ（キアゲンキアプレップ（登録商標）スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を用いて精製されたｐＥＴ３０）は、製造元の指示書（ＮＥＢ；バーリー、マサチューセッツ州）に従って、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化された。ＮｄｅＩによるｐＥＴ３０ａベクターの消化により、アミノ末端のＨＩＳ6−タグ領域が除去される。消化されたＤＮＡは、キアゲンキアクイック（登録商標）ゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（バレンシア、カリフォルニア州）を用いて１％アガロースゲルから精製された。前記ＤＮＡ精製物は、２６０ｎｍの吸光度測定により定量され、クイックライゲーションキット（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ＮＥＢ）を用いてライゲーションされた。前記ライゲーションされたＤＮＡは、化学的コンピテント細胞トップ１０Ｆ’（ＴＯＰ１０Ｆ’）（インビトロジェン；カールスバド、カリフォルニア州）に形質転換された。インサートを有するクローンは、精製されたプラスミドＤＮＡを１％アガロースゲルで泳動することにより同定された。インサートを有するクローンは、ＤＮＡシーケンスにより確認された。
遺伝子発現及びアッセイ
プラスミドＤＮＡ（シークエンス解析により確認）は、発現宿主であるＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）にサブクローニングされた。該培養は、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で増殖された。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃にて増殖されたＢＬ２１（ＤＥ３）構築物を用いて誘導実験が行なわれた。ＯＤ600が約０．５に達した後に、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現が誘導された。細胞は３０℃で４時間増殖され、遠心により回収された。細胞は、その後、１μＬ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ、５μＬ／ｍＬのカルバイオケムプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｅｔ ＩＩＩ）及び０．３３μＬ／１０ｍＬのｒ−リゾチームを含むバグバスター（商標）（ＢｕｇｂｕｓｔｅｒTM）試薬液（ノバジェン社）を用いて、ノバジェン社推奨プロトコルに従って溶解された。緩やかな振とうと共に２５℃で１５分間インキュベーションされた後、細胞片は、４℃にて２１，０００×ｇで２０分間遠心してペレット化された。上澄（無細胞抽出物）は、４−１５％の勾配ゲル（バイオラッド社）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、前記組換え融合タンパク質の可溶性タンパク質濃度が検出された。３種類の全てのタンパク質で発現量は高く（全可溶性タンパク質の約２５−４０％）、対応するｐＥＴ３０ ＨＩＳ6−タグ付き構築物で観察された場合と同様であった。
以下のプロトコルを用いて、タグ無しのＡｓｐＣ及びＴｙｒＢタンパク質のトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性のアッセイが行なわれた。実施例１に記載されるようにインドール−３−ピルベートの形成を測定するのではなく、実施例１８に記載するＨＰＬＣ蛍光検出法を用いて反応の副産物であるグルタメートの形成を測定した。この反応において、トリプトファンは、化学量論的にα−ケトグルタレートと反応してインドール−３−ピルベート及びグルタメートを作り出す。グルタメートは、インドール−３−ピルベートよりも水性溶液中で安定であり、これを測定することで、より正確な酵素活性の測定が可能となる。１．０ｍＬの前記反応混合物中には、ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのα−ケトグルタレート、０．０５ｍＭのピリドキサールホスフェート、５ｍＭのトリプトファン及び酵素が含まれた。前記酵素以外の全ての組成物が一緒に混合され、該酵素を添加して反応を開始させ、該反応溶液は３０℃で６０分間インキュベートされた。前記反応は、０．１５ｍＬの２０％トリクロロ酢酸の添加により停止され、前記混合物は、２１，０００ｒｐｍで遠心され、透明な上澄が慎重に除去された。結果を表３（グルタメート濃度のバックグランド及びタンパク質沈殿のためのトリクロロ酢酸添加による希釈について補正された）に示す。
Figure 2008538924
他の研究者により、ＴｙｒＢアミノトランスフェラーゼは、その基質としてＡｓｐＣよりもトリプトファンに対してより高活性を示すことが観察されていることから（Ｈａｙａｓｈｉら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１２２２９−１２３９）、上記結果は驚くべきものであった。前記予期せぬ低レベルな活性は、タンパク質の不安定性によるものかもしれない。しかしながら、タグ無しのＴｙｒＢタンパク質に見られる活性レベルは、上記タグ付きの変種に観察された活性（表１参照）よりも相当に高いものである。アミノトランスフェラーゼ反応において、トリプトファンは、化学量論的にα−ケトグルタレートと反応してインドール−３−ピルベート及びグルタメートを作り出すので、形成されたインドール−３−ピルベート濃度（表１に示すように）及び形成されたグルタメート濃度（表３に示すように）は同一の活性を表している。グルタメートは、インドール−３−ピルベートよりも水性溶液中で安定であり、従って、これを測定することで、より正確な酵素活性の測定が可能となる。どちらの検出法を用いてもＡｓｐＣに対するＴｙｒＢの相対活性（又は比率）は、同じ数字を生み出すはずであり、タグ付きのＴｙｒＢ変種が、タグ付きＡｓｐＣとの比較してトリプトファンに対して低い活性を有する一方で、タグ無しのＴｙｒＢは、タグ無しＡｓｐＣとほぼ同様の活性を有することは明らかである。
実施例４
インドール−３−ラクテートのインドール−３−ピルベートへの変換
図１及び３に示すように、インドール−３−乳酸を用いてインドール−３−ピルベートを作り出すことが可能である。乳酸とピルベートの変換は、インドール−３−ラクテートとインドール−３−ピルベートの変換と同様に可逆的反応である。インドール−３−ピルベートからの３４０ｎｍにおける高いバックグランド量により、インドール−ラクテートの酸化がこれに続いた。
アッセイ用の標準混合物０．１ｍＬには、ｐＨ８．０で１００ｍＭのリン酸カリウム、０．３ｍＭのＮＡＤ＋、７単位の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（シグマ社、Ｌ２３９５、セントルイス、ミズーリ州）、及び２ｍＭの基質が含まれていた。該アッセイは、モレキュラーディバイススペクトラマックスプラスプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）を用いてＵＶ透過性マイクロタイタープレート中で２つの系で重複して行なわれた。ポリペプチドとバッファーは混合され、インドール−３−乳酸及びＮＡＤ＋を含むウェルにピペッティングされ、短時間の混合の後、９秒間の間隔を空けて各ウェルについて３４０ｎｍの吸光度が測定された。反応は、２５℃で５分間継続した。ＮＡＤ＋からのＮＡＤＨの生成に続いて、３４０ｎｍにおける吸光度の増大が生じた。ＮＡＤ＋無し及び基質無しで個別のネガティブコントロールが行なわれた。リューコノストク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＤ−ＬＤＨ（シグマ社カタログ番号Ｌ２３９５）は、インドール−誘導体基質に対して、バシラス・ステアロテルモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＬ−ＬＤＨ（シグマ社カタログ番号Ｌ５２７５）よりも高い活性を示すことが判明した。
同様の方法が、Ｄ−乳酸及びＮＡＤ＋又はＮＡＤＨ、及び、Ｄ−ＬＤＨポリペプチドの天然の基質であるピルベートについても用いられた。ピルベートの還元のＶmaxは、ラクテートの酸化のＶmaxよりも１００−１０００倍高かった。インドール−３−ラクティックのＤ−ＬＤＨとの酸化反応のＶmaxは、乳酸との酸化反応のＶmaxの約５分の１であった。インドール−３−ピルベートの存在は、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５ｍＭのヒ酸ナトリウムを含む５０ｍＭのホウ酸ナトリウムバッファーを用いて３２７（エノール−ボレート誘導体）の吸光度の変化を追跡することにより測定された。Ｌ−ＬＤＨ及びＤ−ＬＤＨの両ペプチドによるネガティブコントロールと比較して、微量な、しかし、繰返し可能な吸光度の変化が観測された。
更に、広い特異性を有する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７、ＥＣ１．１．１．２８、及び／又はＥＣ１．１．２．３と関連する活性を有する酵素）がクローニング可能であり、また、これを用いてインドール−３−乳酸からインドール−３−ピルベートを作り出すことが可能である。広い特異性を有するデヒドロゲナーゼの供給源として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が挙げられる。
もう１つの方法として、インドール−３−ラクテートを、インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１０）を含むクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）の細胞抽出物；又は、インドール−３−ピルベートに対する活性を有することが知られているｐ−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２２）を含むクルーズ・トリパノソーマ・エピマスチゴテス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｅｐｉｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ）の細胞抽出物；又は、イミダゾール−５−イル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１１）を含シュードモナスアシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞抽出物；又は、ヒドロキシフェニルピルベートレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２３７）を含むコレウスブルメイ；又は、Ｄ−芳香族乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２２）を含むカンジダ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）と接触させることによりインドール−３−ピルベートを作り出すことが可能である。このような活性について記載された参照として、Ｎｏｗｉｃｋｉら．（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ７１：１１９−２４，１９９２）、Ｊｅａｎ及びＤｅＭｏｓｓ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４ １９６８、Ｃｏｏｔｅ及びＨａｓｓａｌｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．Ｉｌｌ：２３７−９，１９６９）、Ｃｏｒｔｅｓｅら（ＣＲ．Ｓｅａｎｃｅｓ Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．ＦｉＩ．１６２ ３９０−５，１９６８）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ及びＡｌｆｅｒｍａｎｎ（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．Ｃ：Ｂｉｏｓｃｉ．４３ ５０１−４，１９８８）、及びＢｈａｔｎａｇａｒら．（Ｊ．Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３５：３５３−６０，１９８９）が挙げられる。加えて、シュードモナス種由来等の乳酸オキシダーゼ（Ｇｕら．Ｊ．ＭｏＩ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ：１８：２９９−３０５，２００２）を用いてインドール−３−ラクティックを酸化してインドール−３−ピルベートにできる。
実施例５
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いたＬ−トリプトファンのインドール−３−ピルベートへの変換
本実施例は、実施例１に記載されるようなトリプトファンアミノトランスフェラーゼを用いる代わりとしての、オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２）を介したトリプトファンのインドール−３−ピルベートへの変換に用いる方法について記載する。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、カスカベルガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ）（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号Ａ−２８０５）から精製された。分子クローニング用のＬ−アミノ酸オキシダーゼの受託番号としては以下の番号が挙げられる；ＣＡＤ２１３２５．１、ＡＡＬ１４８３１、ＮＰ ４９０２７５、ＢＡＢ７８２５３、Ａ３８３１４、ＣＡＢ７１１３６、ＪＥ０２６６、Ｔ０８２０２、Ｓ４８６４４、ＣＡＣ００４９９、Ｐ５６７４２、Ｐ８１３８３、Ｏ９３３６４、Ｐ８１３８２、Ｐ８１３７５、Ｓ６２６９２、Ｐ２３６２３、ＡＡＤ４５２００、ＡＡＣ３２２６７、ＣＡＡ８８４５２、ＡＰ００３６００、及びＺ４８５６５。
反応は、総体積１ｍＬにて微小遠心管内で行なわれ、振とうと共に３７℃で１０分間インキュベートされた。反応混合物には、５ｍＭのＬ−トリプトファン、ｐＨ６．６で１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、０．５ｍＭヒ酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、０．０１６ｍｇのカタラーゼ（８３Ｕ、シグマ社、Ｃ−３５１５）、０．００８ｍｇのＦＡＤ（シグマ社）、及び０．００５−０．１２５単位のＬ−アミノ酸オキシダーゼが含まれていた。ネガティブコントロールにはトリプトファンを除く全ての成分が含まれ、ブランクにはオキシダーゼを除く全ての成分が含まれていた。カタラーゼを用いて酸化的脱アミノ化中に形成された過酸化水素が取り除かれた。四ホウ酸ナトリウム及びヒ酸ナトリウムを用いて、３２７ｎｍに最大吸光度を示すエノール−ボレート型のインドール−３−ピルベートを安定化した。前記反応混合物中にて、０．１−１ｍＭの濃度でインドール−３−ピルベート標準液が調製された。
前記購入したＬ−アミノ酸オキシダーゼは、１ｍｇのタンパク質から毎分５４０μｇのインドール−３−ピルベートを形成する特異的活性を有していた。これは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ酵素の特異的活性と同じオーダーの量である。
実施例６
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いたＤ−トリプトファンのインドール−３−ピルベートへの変換
本実施例は、反応の開始基質としてＬ−トリプトファンを用いる代わりとしての、オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３）を介したＤ−トリプトファンのインドール−３−ピルベートへの変換に用いる方法について記載する。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼはバイオカタリティックス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）（パサデナ、カリフォルニア州、カタログＡＯＤ−１０１）から購入された。
反応は、総体積１ｍＬにて微小遠心管内で行なわれ、振とうと共に３０℃で２０分間インキュベートされた。反応混合物には、５ｍＭのＬ−トリプトファン、ｐＨ８で５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウムバッファー、０．５ｍＭヒ酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２５．５μＬの工業グレードのカタラーゼ（１０００Ｕ、バイオカタリティックス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）、ＣＡＴ−１０１）、０．００８ｍｇのＦＡＤ（シグマ社）、及び約１０ｍｇの粗調製Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが含まれていた。前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ調剤は、大量の不溶性原料を含んでいた。ネガティブコントロールには、オキシダーゼ以外の全ての成分が含まれていた。サンプルは２つの系で重複して測定された。
前記サンプルは、遠心されてデブリが取り除かれ、上澄は、３２７ｎｍ吸光度測定前に１０倍に希釈された。該希釈サンプルは０．７８９−０．９２６の範囲内の吸光度を有し、一方で、ネガティブコントロール（非希釈）は、０．４１８及び０．４１６のＯＤを有していた。予想される通り、広い特異性を有するＤ−オキシダーゼを用いてＤ−トリプトファンをインドール−３−ピルベートに効率的に変換することが可能である。
実施例７
アルドラーゼを用いたインドール−３−ピルベートの２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸への変換
本実施例は、アルドラーゼ（リアーゼ）を用いたインドール−３−ピルベートの２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸モナチン前駆体（ＭＰ）への変換に使用可能な方法を記載する（図２）。アルドール縮合は、アルデヒド又はケトンのβ−炭素と別のアルデヒド又はケトンのカルボニル炭素との間に炭素−炭素結合を形成する反応である。カルバニオンは、ある基質のカルボニル基の隣の炭素上に形成され、第二の基質のカルボニル炭素（求電子炭素）に対する求核攻撃としての役割をする。通常、前記求電子基質はアルデヒドであるから、殆どのアルドラーゼはＥＣ４．１．２．の範疇に属する。多くの場合、前記求核基質はピルベートである。一般的に、アルドラーゼが、２個のケト酸又は２個のアルデヒド間の縮合を触媒することはあまりない。
しかしながら、２個のカルボン酸の縮合を触媒するアルドラーゼが同定された。例えば、欧州特許ＥＰ１０４５−０２９には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）培養（ＥＣ４．１．３．１６）を用いてグリオキシル酸及びピルベートからＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する方法が記載されている。加えて、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）は、２個のケト酸の縮合を触媒可能である。従って、同様のアルドラーゼペプチドを用いてインドール−３−ピルベートとピルベートの縮合を触媒した。これら酵素の活性又はエナンチオ特異性は、モナチンの特定の立体異性体の製造のため改変することが可能である。
クローニング
４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ（例、ＰｒｏＡアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）及び４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシル酸−リアーゼ（例、ＫＨＧアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１６）は、図２のアルドラーゼ反応によく類似する反応を触媒する。ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣベクター（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）に適合する突出部を有するプライマーが設計された。これらのプライマーの設計は、上記実施例１に記載されている。
ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣ へのクローニング用に以下のプライマーが設計された：
１． シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ） （シュードモナス・オクラセアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｃｈｒａｃｅａｅ） ＮＧＪＩ）ｐｒｏＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．： １２９６４６６３ Ｖｅｒｓｉｏｎ：１２９６４６６３）及びコマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ｐｒｏＡ遺伝子（配列番号６５−６６、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）
フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＡＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧＴ−３’及び
リバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣ−３’
（配列番号５５及び５６）。
２．シノリゾビウムメリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１ ＳＭｃ００５０２遺伝子（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｐｒｏＡ，Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：１５０７４５７９及びＣＡＣ４６３４４、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）
フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡ−３’及び
リバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＴＣＧＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣ−３’
（配列番号６１及び６２）。
３．スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種ＬＢ １２６ ｆｌｄＺ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：７５７３２４７ Ｖｅｒｓｉｏｎ：７５７３２４７、推定上のアシルトランスフェラーゼをコードする）
フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＴＣＣＡ−３’及び
リバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣＡ−３’
（配列番号５７及び５８）。
４．アルトロバクテルケイセリ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｅｙｓｅｒｉ）ｐｃｍＥ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＦ３３１０４３ Ｖｅｒｓｉｏｎ：ＡＦ３３１０４３．１、オキサロシトラマレートアルドラーゼをコードする）
フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧ−３’及び
リバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＡＴＴＣＣＡ−３’
（配列番号５９及び６０）。
５．イエルシニアぺスティ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）ＣＯ９２株ＹＰＯ００８２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：１５９７８１１５ Ｖｅｒｓｉｏｎ：１５９７８１１５、恐らくトランスフェラーゼをコードする）
フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＧＡＡ−３’及び
リバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＧＡ−３’
（配列番号６３及び６４）。
６．バシラスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｋｈｇ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｚ９９１１５．１ ＧＩ：２６３４４７８、１２６７１ｌ−１２７３０１及びＣＡＢ１４１２７．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）
フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＣＧＴＴＧＡ−３’及び
リバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＴ−３’
（配列番号３５及び３６）。
７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋｈｇ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０００２７９．１ １３３１−１９７２及びＡＡＣ７４９２０．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）
フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧ−３’及び
リバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡ−３’
（配列番号３７及び３８）。
８．Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ｋｈｇ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ５９１７９２．１ ＧＩ：１５０７５８５０、６５３５３−６４６７３及びＣＡＣ４７４６３．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）
フォワード５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＡＧＧＧＧＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡ−３’及び
リバース５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＧＣＧＡＡＧ−３’
（配列番号３９及び４０）。
上記１−２及び６−８に記載される生物のゲノムＤＮＡは、キアゲンジェノミック−チップＤ（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐＤ）（バレンシア、カリフォルニア州）のプロトコルを用いて精製された。３−５に記載される生物のゲノムＤＮＡについても、類似する手法を用いて精製可能である。
シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ）（ＡＴＣＣ ３３６３６）は、３０℃でニュートリエントブロス（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）及びヒドロキシベンゾエート培地中にて増殖された。コマモナステス・トステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（ＡＴＣＣ４９２４９）は、２６℃でニュートリエントブロス（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）及びヒドロキシベンゾエート培地中にて増殖された。スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種ＬＢ１２６（フレミッシュ工科研究大学（Ｆｌｅｍｉｓｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＶＩＴＯ、Ｂ−２４００ ＭｏＩ、ベルギー）は、Ｗａｔｔｉａｕら．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：８６１−７２，２００１）に記載される方法に従って増殖された。アルトロバクテルケイセリ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｅｙｓｅｒｉ）（湾岸生態部（Ｇｕｌｆ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、国立衛生環境影響研究所、米国環境保護局、ガルフブリーズ、ＦＬ ３２５６１、アメリカ合衆国）は、Ｅａｔｏｎ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：３６８９−３７０３，２００１）に記載されるプロトコルに従って増殖された。シノリゾビウムメリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１（ＡＴＣＣ５１１２４）は、２６℃にてＡＴＣＣ ＴＹ培地及びヒドロキシベンゾエート培地中にて増殖された。イエルシニアぺスティ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）ＣＯ９２株（ＡＴＣＣ）は、２６℃にて、ＡＴＣＣ培地７３９ウマ血液寒天で増殖された。バシラスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）６０５１（ＡＴＣＣ）は、３０℃にてベレトニュートリエントブロス（Ｂｅｒｅｔｏ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ） （ディフコ社；デトロイト、ミズーリ州）で増殖された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡは、実施例１に記載するようにＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社）から単離された。
実施例１に記載されるＰＣＲ、クローニング、及びスクリーニングのプロトコルは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｋｈｇ配列と同様に、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｐｒｏＡ配列のクローニングにも用いられた。同方法は、上記の他の配列のクローニングにも用いることが可能である。Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のｐｒｏＡ遺伝子については、ＰＣＲのアニーリング及び伸長の条件は、４０−６０℃で１分間、４５秒間（温度勾配機能付きサーマルサイクラー）及び７２℃で２分間、１５秒間であった。
陽性クローンは、Ｓ−タグ及びＴ７終止プライマー（ノバジェン社）、及びインテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（コラルヴィル、アイオワ州）からの内部プライマーを用いたジデオキシ鎖停止ＤＮＡシーケンス法（シークライト社、ヒューストン、テキサス州）を用いてシーケンスされた。
発現及び活性のアッセイ
プラスミドＤＮＡ（シーケンス解析により確認）は、発現宿主であるＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）にサブクローニングされた。該培養は、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ倍地中で増殖され、前記プラスミドはキアゲンスピンプラスミドミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ｓｐｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて単離され、続いて制限酵素処理により解析されて同一性が確認された。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃にて増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）構築物を用いて誘導実験が行なわれた。ＯＤ６００が約０．６に達した後に、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現が誘導された。細胞は３０℃で４時間増殖され、遠心により回収された。細胞は、その後、バグバスター（商標）（ＢｕｇｂｕｓｔｅｒTM）試薬液（ノバジェン社）を用いて溶解され、前記Ｈｉｓ−タグ付組換えタンパク質は、上記（実施例１）のようにＨｉｓ−結合性カートリッジを用いて精製された。精製されたタンパク質は、ＰＤ−１０ディスポーザブルカラム上で脱塩され、２ｍＭのＭｇＣｌ２を有するｐＨ７．３、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで溶離された。
前記タンパク質は、４−１５％の勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、前記組換え融合タンパク質の予想分子量における可溶性タンパク質濃度が検出された。
前記タンパク質について、インドール−３−ピルベート及びピルビン酸ナトリウムを基質として活性のアッセイを行なった。前記アッセイの混合物１ｍＬには、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７−ｐＨ８．９）、０−８ｍＭのＭｇＣｌ2、３ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ８）、及び６ｍＭの各基質が含まれていた。反応は、異なる量のペプチド（例えば、１０ないし１００μｇ）の添加により開始され、２５℃−３７℃で３０分間インキュベートされ、フィルター濾過された後に−８０℃で凍結された。
ｐｒｏＡ遺伝子産物の活性の結果
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のｐｒｏＡ及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＳＭｃＯＯ ５０２の遺伝子構築物は、ＩＰＴＧで誘導された際に高い発現性を有していた。総タンパク質及び細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により測定されたとおり、前記組換えタンパク質は高い可溶性を呈した。Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）の遺伝子産物は、９５％よりも高純度で精製された。Ｈｉｓ−結合性カートリッジを用いたアフィニティー精製後においてＳ．メリロティ（Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の遺伝子産物の収量は非常に少量であったため、細胞抽出物を用いて酵素アッセイを行なった。
両組換えアルドラーゼは、インドール−３−ピルベート及びピルベートからのＭＰの形成を触媒した。酵素活性には、２価のマグネシウム及びリン酸カリウムの両方の存在が必要であった。インドール−３−ピルベート、ピルベート、又はリン酸カリウムが存在しない場合には生成物が見られなかった。酵素が存在しない場合でも少量の生成物が形成された（典型的に、酵素が存在する場合よりも量が１オーダー少なかった）。
実施例１８に記載されるＬＣ／ＭＳ法を用いて、インドール−３−ピルベート標準よりも僅かに遅れて逆相のＣ１８カラムから前記産物のピークが流出し、該ピークの質量スペクトルは、前記ＭＰ産物として予測される親イオンである、２９２．１の衝突誘導性親イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）を示した。前記質量スペクトルに存在する主な娘断片には、ｍ／ｚ＝１５８（１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドカルボニウムイオン）、１６８（３−ブタ−１，３−ジエニル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、２７４（２９２−Ｈ2Ｏ）、２５６（２９２−２Ｈ2Ｏ）、２３８（２９２−３Ｈ2Ｏ）、２２８（２９２−ＣＨ4Ｏ3）、及び２０４（ピルベートの喪失）のものが含まれていた。また、前記産物は、λmaxが２７９−２８０にあり、２９０ｎｍ付近に小さな肩のあるトリプトファンのような他のインドール含有化合物に特徴的なＵＶスペクトルを示した。
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）アルドラーゼにより生産されるＭＰ量は、反応温度の常温から３７℃への上昇、基質の量、及びマグネシウム量の増加に伴って増加した。前記酵素の合成活性は、ｐＨの上昇と共に減少し、ｐＨ７において最大生産量がみられた。トリプトファン標準に基けば、２０μｇの精製タンパク質を用いた標準アッセイにおけるＭＰ生産量は、１ｍＬの反応量毎に約１０−４０μｇであった。
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡアルドラーゼのコーディング配列と上記の他の遺伝子との高い相同性に基き、前記組換え遺伝子産物の全てが上記反応を触媒可能であることが予想される。更に、５９及び８７番目の位置にスレオニン（Ｔ）を、１１９番目にアルギニン（Ｒ）を、１２０番目にアスパラギン酸（Ｄ）及び３１及び７１番目にヒスチジン（Ｈ）（Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）の番号付け方式に基く）を有するアルドラーゼは、類似する活性を有するであろうことが予想される。更なるホモログがシークエンスされ、ＮＣＢＩに寄託された。それらの遺伝子はクローニングが可能であり、対応する遺伝子産物は類似する活性を有することが予想される。類似するアルドラーゼ活性を有すると予想される遺伝子及びタンパク質の例について、そのＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡタンパク質との同一性パーセント及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡタンパク質との同一性パーセント、並びにその照合番号を下記に提示する：
アルドラーゼ供給源：ブラディリゾビウムジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｓｔｒ．）ＵＳＤＡ １１０株（タンパク質ｂｌｒ３８４２）
遺伝子：ＮＣ ００４４６３．１：４２６０８１５．．４２６１４９８
タンパク質：ＧＩ：２７３７８９５３（ＮＰ ７７０４８２．１）
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６３
Ｓ．メリロティ（Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６３
アルドラーゼ供給源：スフィンゴモナス（シュードモナス）パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）
遺伝子：ＧＩ：１９９１８９５９（ＡＢ０７３２２７．１：３７３８．．４４２４）
タンパク質：ＧＩ：１９９１８９６３（ＢＡＢ８８７３８．１）
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６５
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６４
アルドラーゼ供給源：イエルシニア・ぺスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）ＫＩＭ
遺伝子：ＡＥ０１３６０６．１ ＧＩ：２１９５６７０５
タンパク質：ＡＡＭ８３６５０．１ ＧＩ：２１９５６７１５
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５６
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５７
アルドラーゼ供給源：ラルストニア・メタリジュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）ＣＨ３４
遺伝子：ＮＺ ＡＡＡＩ０２００００１６．１ ＧＩ：４８７６７３３４
タンパク質：ＺＰ ００２７１７４３．１ ＧＩ：４８７６７３８６
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６０
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５７
アルドラーゼ供給源：イエルシニア・シュードチュベルクロ（登録商標）シス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＩＰ ３２９５３
遺伝子：ＮＣ ００６１５５．１ ＧＩ：５１５９４３５９
タンパク質：ＹＰ ０６８６２７．１ ＧＩ：５１５９４４３６
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５６
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５７
アルドラーゼ供給源：リゾビウムレグミノサラム・ビオヴァルヴィシアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ ｖｉｃｉａｅ）ｒｈｉｚ２３ｇ０２−ｐｌｋ １００９ ３４１
（サンガー研究所（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））
遺伝子：
ＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＡＣＡＴＡＣＣＡＣＧＧＧＣＧＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＧＣＣＡＡＡＴＣＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＡＣＧＧＴＣＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＧＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＡＴＣＴＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＣＴＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＴＧＡＴＡＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＴＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＡＡＣＧＧＴＴＡＴＴＴＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＧＴＴＧＣＣＧＣＧＧＣＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＡＣＧＣＣＧＧＴＧＴＣＣＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＡＡＡＣＧＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＴＴＣＡＴＣＧＡＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＴＣＧＧＧＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＴＧＣＧＧＴＣＧＡＡＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＡ（配列番号８７）
タンパク質：
ＭＧＩＶＶＱＮＩＰＲＡＥＡＤＶＩＤＲＬＡＫＳＧＶＡＴＶＨＥＡＱＧＲＫＧＭＬＡＳＨＭＲＰＩＹＳＧＡＱＩＡＧＳＡＩＴＩＳＡＰＰＧＤＮＷＭＩＨＶＡＩＥＱＩＱＡＧＤＩＬＶＬＳＰＴＳＰＣＤＮＧＹＦＧＤＬＬＡＴＳＡＲＡＲＧＣＲＧＬＶＩＤＡＧＶＲＤＩＲＤＬＴＱＭＱＦＰＶＷＳＫＡＶＳＡＱＧＴＶＫＥＴＬＧＳＶＮＶＰＩＶＣＡＧＡＦＩＥＡＧＤＩＩＶＡＤＤＤＧＶＣＶＶＫＬＮＡＡＥＥＶＬＴＡＡＥＮＲＶＡＮＥＥＡＫＲＱＲＬＡ
ＡＧＥＬＧＬＤＩＹＤＭＲＳＫＬＲＥＫＧＬＫＹＶＷ （配列番号８８）
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５８
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６１
アルドラーゼ供給源：ノボスフィンゴビウムアロマティシヴォランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ １２４４４（スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス（ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）Ｆ１９９は同じ遺伝子を有する）
遺伝子：ＮＺ ＡＡＡＶ０２０００００３．１ ＧＩ：４８８４８８４３
タンパク質：ＺＰ ００３０３２７０．１ ＧＩ：４８８４９０２６
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６８
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６３
アルドラーゼ供給源：シュードモナス・プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０
遺伝子：ＡＥ０１６７８３．１ ＧＩ：２６５５７０２７
タンパク質：ＡＡＮ６８１２６．１ ＧＩ：２４９８４０８１
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５７
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６０
アルドラーゼ供給源：マグネトスピリラム・マグネトタクティクム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ）ＭＳ−１
遺伝子：ＮＺ ＡＡＡＰ０１００３８７７．１ ＧＩ：２３０１６４６５
タンパク質：ＺＰ０００５６３０１．２ ＧＩ：４６２００８９０
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：７３
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５９
アルドラーゼ供給源：ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＣＧＡ００９
遺伝子：ＮＣ ００５２９６．１ ＧＩ：３９９３３０８０
タンパク質：ＮＰ ９５００３２．１ ＧＩ：３９９３７７５６
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：７４
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５８
アルドラーゼ供給源：キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ−３３９１３
遺伝子：ＡＥＯ１２５２４．１ ＧＩ：２１１１５２９２
タンパク質：ＡＡＭ４３２５１．１ ＧＩ：２１１１５２９７
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６３
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６４
アルドラーゼ供給源：キサントモナス・アキソノポディスシトリ３０６（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓｃｉｔｒｉ ３０６）
遺伝子：ＡＥ０１２０６６．１ ＧＩ：２１１１０５８０
タンパク質：ＡＡＭ３８９９０．１ ＧＩ：２１１１０５８１
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６１
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：６２
アルドラーゼ供給源：ストレプトミセス・アヴェルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０
遺伝子：ＮＣ ００３１５５．３ ＧＩ：５７８３３８４６
タンパク質：ＮＰ ８２２７９３．１ ＧＩ：２９８２８１５９
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：４９
Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｒｏＡとの同一性パーセント：５６
ｋｈｇ遺伝子産物の活性の結果
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｋｈｇ遺伝子構築物は、ＩＰＴＧで誘導された際に高いタンパク質発現レベルを有していたが、一方でＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｋｈｇは、比較的低い発現レベルを有していた。前記組換えタンパク質は、総タンパク質及び細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析から判断されるように、高い可溶性を示した。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｋｈｇ遺伝子産物は９５％よりも高純度で精製された；Ｈｉｓ−結合性カートリッジを用いたアフィニティー精製後においてＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の遺伝子産物の収量はこれら程には多くなかった。
上記酵素の活性にマグネシウム及びホスフェートが必要であるという証拠はない。しかしながら、リン酸ナトリウムバッファー中でアッセイを行なったことが文献により報告され、前記酵素は、二機能性であり、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコネート（ＫＤＰＧ）のようなリン酸化された基質に対する活性を有することが報告されている。酵素アッセイは、上記の通りに行なわれ、そのいくつかの場合においてホスフェートは除外された。結果は、前記組換えＫＨＧアルドラーゼはＭＰを生産したが、前記ＰｒｏＡアルドラーゼほどの活性を有していなかったことを示す。いくつかの場合において、ＫＨＧにより生産されたＭＰの濃度は、殆どマグネシウム及びホスフェート単独で生産された量と同じであった。ホスフェートによるＫＨＧ活性の増加は見られなかった。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）酵素が最も高い活性を有しており、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（実施例１８を参照）による測定では、前記マグネシウム及びホスフェート単独による場合よりも約２０−２５％も高い活性を有していた。前記シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）酵素が最も低い活性量を有しており、これは発現に示されるフォールディング及び溶解性の障害に関連している可能性がある。３種類の全ての酵素は、グルタメート活性部位（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の番号付け方式で４３番目の位置）及びピルベート（１３０番目の位置）とのシッフ塩基形成に必要なリジンを有する；しかしながら、前記Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の酵素は、活性部位の残基である４７番目にアルギニンではなくスレオニンを含んでいる。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＫＨＧは、比較的小さく、スレオニン活性部位を有する他の酵素と共に、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）及び大腸菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の酵素とは異なるクラスターにあることが判明した。前記活性部位における差異が、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の酵素の増大した活性の理由であろう。
アルドラーゼ活性の向上
触媒抗体は、天然のアルドラーゼと同程度に有効であり、広い範囲の基質を許容可能であり、これを用いて図２に示す反応を触媒することが可能である。
また、アルドラーゼは定向進化法により改良可能であり、例えばＤＮＡシャッフリング法及びエラープローンＰＣＲ法によりホスフェートの必要性を除去してエナンチオ選択性を逆転することで進化したＫＤＰＧアルドラーゼ（上記ＫＨＧと非常にホモロジーが高い）が先に記載されている。ＫＤＰＧアルドラーゼポリペプチドは、ドナー基質（ここではピルベート）に対して高い特異性を有するが、アクセプター基質（即ち、インドール−３−ピルベート）については比較的適応性があるので、生化学反応において有用である（Ｋｏｅｌｌｅｒ及びＷｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：２３２−２３９，２００１）。ＫＨＧアルドラーゼは、多数のカルボン酸及びアルデヒドとピルベートの縮合に対する活性を有する。ＫＨＧアルドラーゼの哺乳動物性変種は、バクテリア性変種に対して、４−ヒドロキシ４−メチル２−オキソグルタレートに対する高い活性及び４−ヒドロキシ−２−ケトグルタレートの両方の立体異性体に対する許容性を含むより広いエナンチオ特異性を有すると考えられている。殆どのバクテリア性供給源は、前記融合産物の特定の構造に対して１０倍の嗜好性を有することが明らかとなっている。この例外は、ラット肝臓などの哺乳動物性供給源から単離された酵素に類似したジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）バクテリア由来の酵素であり、これは基質に対する緩やかな立体化学的要件と共に低い基質選択性（広範囲の基質を許容する）を示す（参照：Ｓｈｅｌｔｏｎら（１９９６）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１１８（９）：２１１７−２１２５。ゲノムデータベースでは１００種類近くのＫＨＧホモログが利用可能であり、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）プロヴィデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び哺乳類の組織内における活性が実証されている。これらの酵素は、モナチン生産に望ましいエナンチオ特異性の調整の開始点として使用可能である。
ピルベート並びにケト酸であり、及び／又はインドール等のかさ高い疎水性基を有する他の基質を用いるアルドラーゼは、「進化する」ことで前記ペプチドの特異性、速度、及び選択性を調整することが可能である。ここで示されるＫＨＧ及びＰｒｏＡアルドラーゼに加え、これら酵素の例には以下のものが含まれるが、これらに限定されることはない：ＫＤＰＧアルドラーゼ及びこれに関連するポリペプチド（ＫＤＰＨ）；ノカルジオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）株由来トランスカルボキシベンザルピルビン酸ヒドラターゼ−アルドラーゼ；ピルベートと２−カルボキシベンズアルデヒド（芳香環含有基質）を縮合させる４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブト−３−エノエートアルドラーゼ（２’−カルボキシベンザルピルビン酸アルドラーゼ）；ピルベート及び芳香環含有アルデヒドを基質として用いる、シュードモナス・プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）及びスフィンゴモナス・アロマティシヴォランス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）由来のトランス−０−ヒドロキシベンジリデンピルビン酸ヒドラターゼ−アルドラーゼ；２−オキソ酸を基質として用い、マクロコッカス・デニトリフルカンス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｌｃａｎｓ）という生物に存在すると考えられる（３−ヒドロキシアスパラギン酸アルドラーゼ（エリスロ−３−ヒドロキシ−Ｌ−アスパラギン酸グリオキシル酸リアーゼ）；ベンジル基を含む基質を用いるベンゾインアルドラーゼ（ベンズアルデヒドリアーゼ）；ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ；グリシンとベンズアルデヒドを縮合させるＬ−トレオ−３−フェニルセリンベンズアルデヒド−リアーゼ（フェニルセリンアルドラーゼ）；４−ヒドロキシ−２オキソバレレートアルドラーゼ；１，２−ジヒドロキシベンジルピルビン酸アルドラーゼ；及び２−ヒドロキシベンザルピルビン酸アルドラーゼ。
イソクエン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミニン酸シンセターゼ、クエン酸リアーゼ、トリプトファナーゼ及びその特定の変異体、β−チロシナーゼ及びその特定の変異体、ＰＬＰ、触媒アルドラーゼ抗体、トリプトファンシンセターゼは、試験された条件下においては、上記に類似するアッセイ、及び実施例１８に記載する検出法を用いて検出可能なレベルでインドール−３−ピルベートをＭＰに変換していなかったようである。
望ましい活性を有するポリペプチドは、以下の方法を用いて目的のクローンをスクリーニングすることにより選択可能である。トリプトファン栄養要求菌株は、発現カセットに目的のクローンを載せたベクターにより形質転換され、少量のモナチン又はＭＰを含む培地で増殖された。アミノトランスフェラーゼ及びアルドラーゼの反応は可逆性であるから、前記細胞はモナチンのラセミ混合物からトリプトファンを生産することが可能である。同様にして、生物（組換え型及び野生型の両方）は、ＭＰ又はモナチンを炭素及びエネルギー源として利用する能力によりスクリーニング可能である。目的のアルドラーゼの一供給源は、種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びリゾバクテリア（ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）株の発現ライブラリーである。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）は、芳香族分子の分解のための種々の独特の異化経路を有しており、また、種々のアルドラーゼも含んでいる；植物の根圏で増殖することが知られるリゾバクテリア（ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ）はアルドラーゼを含み、モナチンの生合成経路の構築に関して記載された種々の遺伝子を有する。
実施例８
モナチン前駆体の化学合成
実施例７には、アルドラーゼを用いてインドール−３−ピルベートを２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸モナチン前駆体（ＭＰ）に変換する方法が記載されている。本実施例では、ＭＰを化学的に合成する別の方法について記載する。
ＭＰは典型的なアルドール型縮合を用いて形成可能である（図４）。簡潔に、典型的なアルドール型反応は、ＬＤＡ（リチウムジイソプロピルアミド）、リチウムヘキサメチルジシラザン又はブチルリチウムといった強塩基を用いたピルビン酸エステルのカルバニオン生成を必要とする。前記生成されたカルバニオンは、インドール−ピルベートと反応して結合産物を形成する。
インドール窒素の保護に用いることのできる保護基としては、以下のものが挙げられるが、これに限定されるものではない：ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、及びベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）。カルボン酸のブロック基には、アルキルエステル（例えば、メチル、エチル、ベンジルエステル）が含まれるが、これに限定されるものではない。このような保護基が用いられる場合には、形成される生成物の立体化学を制御することは不可能である。しかしながら、Ｒ２及び／又はＲ３が、（Ｓ）−２−ブタノール、メタノール、又はキラルアミンといったキラル保護基（図４）であった場合には、一方のみのＭＰのエナンチオマーの形成に有利に働くことになる。
実施例９
トリプトファン又はインドール−３−ピルベートのモナチンへの変換
アミノトランスフェラーゼ及びアルドラーゼの２種の酵素を用いた細胞外での製法では、トリプトファン及びピルベートからモナチンが形成された。第一の工程では、α−ケトグルタレートは、インドール−３−ピルベート及びグルタメートを生成するアミノ基移転反応のトリプトファン由来のアミノ基のアクセプターであった。アルドラーゼは、Ｍｇ2+及びホスフェートの存在下でピルベートがインドール−３−ピルベートと反応してモナチンのα−ケト誘導体（ＭＰ）である２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸を生じる第二の反応を触媒した。前記第一の反応で形成された前記グルタメート由来のアミノ基の移転で、所望の生成物であるモナチンが生成された。前記生成物の精製及び特性指摘により、形成された異性体がＳ，Ｓ−モナチンであることが確認された。上記製法に対して行なわれた改良と共に、代わりとなる基質、酵素及び条件について記載する。
酵素
コマモナステス・トステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来のアルドラーゼである４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ（ＰｒｏＡアルドラーゼ、ｐｒｏＡ遺伝子）（ＥＣ４．１．３．１７）が、実施例７に記載される通りにクローニングされ、発現され、精製された。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）由来の４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシル酸リアーゼ（ＫＨＧアルドラーゼ）（ＥＣ４．１．３．１６）が、実施例７に記載される通りにクローニングされ、発現され、精製された。
モナチンの生成にアルドラーゼと共に用いられたアミノトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｓｐＣ遺伝子にコードされるＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｙｒＢ遺伝子にコードされるチロシンアミノトランスフェラーゼ、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＴａｔＡ酵素、大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）ｂｓａｔ遺伝子にコードされる広範囲の基質に対するアミノトランスフェラーゼ、又はブタ心臓由来のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＩＩａ型）であった。非哺乳類タンパク質のクローニング、発現及び精製については、実施例１に記載されている。ブタ心臓由来のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＩＩａ型）は、シグマ社（＃Ｇ７００５）から入手した。
ＰｒｏＡアルドラーゼ及びＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの使用方法
前記反応混合物１リットル中には、５０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ８．０、４ｍＭのＭｇＣｌ2、３ｍＭリン酸カリウム、０．０５ｍＭピリドキサールホスフェート、１００ｍＭのピルビン酸アンモニウム、５０ｍＭのトリプトファン、１０ｍＭのα−ケトグルタレート、１６０ｍｇの組換え体Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ（非精製細胞抽出物中、〜３０％がアルドラーゼ）、２３３ｍｇの組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（非精製細胞抽出物中、〜４０％がアミノトランスフェラーゼ）、が含まれていた。前記酵素以外の全ての成分が一緒に混合され、トリプトファンが溶解するまで３０℃でインキュベートされた。その後、前記酵素が添加され、前記反応溶液は、緩やかな振とう（１００ｒｐｍ）と共に３０℃で３．５時間インキュベートされた。前記酵素を添加して０．５時間及び１時間後に、一定分量の固体のトリプトファン（各５０ｍｍｏｌ）が前記反応系に添加された。添加されたトリプトファンの全てが溶解したわけではないが、濃度は５０ｍＭ又はこれを超える濃度で維持された。３．５時間後に、前記固体のトリプトファンは、フィルター除去された。一定量のトリプトファンを標準として用いたＬＣ／ＭＳによる前記反応混合物の解析により、該溶液中のトリプトファン濃度が６０．５ｍＭであり、モナチン濃度が５．８１ｍＭ（１．０５ｇ）であることが示された。
以下の方法を用いて最終生成物を精製した。前記透明な溶液の９０％が、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂（２２５ｍＬ；結合容量１．７ｍｅｑ／ｍＬ）に注がれた。前記カラムは水で洗浄され、２８０ｎｍの吸光度が最初の貫流フラクションの５％未満になるまで３００ｍＬのクラクションが採取された。その後、前記カラムは１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．４で溶離され、３００ｍＬフラクションが４フラクション分採取された。４フラクションは、全てモナチンを含んでおり、微温のウォーターバスと共に回転式エバポレーターを用いて１０５ｍＬまで蒸発された。体積の減少に伴って沈殿が形成され、該沈殿は該蒸発工程を通してフィルター除去された。
ＬＣ／ＭＳによる前記カラムフラクションの解析により、９９％のトリプトファン及びモナチンが前記カラムに結合していることが示された。前記蒸発工程中に形成された沈殿には、９７％よりも多くのトリプトファン及び２％未満のモナチンが含まれていた。上澄中の生成物に対するトリプトファンの比率は、約２：１であった。
前記上澄（７ｍｌ）は、事前に、０．５Ｌの１Ｍ ＮａＯＨ、０．２Ｌの水、１．０Ｌの１．０Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８．４、及び０．５Ｌの水で洗浄してアセテート型に変換されていた１００ｍＬのファストフローＤＥＡＥセファロース（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（アマシャムバイオサイエンス社）カラムに注がれた。前記上澄は、２ｍＬ／分未満でロードされ、前記カラムは２８０ｎｍの吸光度が０になるまで水で３−４ｍＬ／分で洗浄された。モナチンは、１００ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ ８．４で溶離され、１００ｍＬのフラクションを４フラクション分回収した。
前記フラクションの解析により、貫流フラクション中におけるトリプトファンとモナチンの比率は８５：１５であり、溶離フラクション中における比率は７：９３であることが示された。２８０ｎｍにおけるモナチンの吸光係数がトリプトファンと同じであったと仮定すると、溶離フラクションには、０．１４６ｍｍｏｌの生成物が含まれていたことになる。総量が１Ｌの反応系について推定すると、〜２．４ｍｍｏｌ（〜７１０ｍｇ）のモナチンが生成され、６８％の回収率となる。
ＤＥＡＥセファローズカラムからの溶離フラクションは２０ｍＬ未満まで蒸発された。生成物の一定分量は、更に、モナチンの解析スケールでの特性指摘のため、実施例１８に記載するのと同様のクロマトグラフィー条件を用いたＣ8調製用逆相カラムに通すことにより精製された。ウォーターズフラクションリンクス（商標）（Ｗａｔｅｒｓ ＦｒａｃｔｉｏｎｌｙｎｘTM）ソフトウェアを用いて、ｍ／ｚ＝２９３イオンの検出に基いたモナチンフラクションの自動回収を起動させた。モナチンに対応するプロトン付加分子イオンを含むＣ8カラムからのフラクションが回収され、蒸発乾燥され、その後、少量の水に溶解された。このフラクションを用いて、生成物の特性指摘を行なった。
生じた生成物は以下の方法により特性指摘が行なわれた。
ＵＶ／可視分光法。酵素的に生成されたモナチンのＵＶ／可視分光測定は、キャリー１００バイオ（Ｃａｒｙ １００ Ｂｉｏ）ＵＶ／可視分光光度計を用いて行なわれた。水に溶解された前記精製産物は、インドール含有化合物に特徴的な、２８８ｎｍに肩のある２８０ｎｍでの最大吸光を示した。
ＬＣ／ＭＳ解析。前記生体外での生化学反応から得られたモナチンの混合物の解析は、実施例１８に記載されたように行なわれた。図５には、生体外の酵素的生成混合物中のモナチンの典型的なＬＣ／ＭＳ解析が示されている。図５の下のグラフには、ｍ／ｚ＝２９３におけるモナチンのプロトン付加分子イオンの選択イオンのクロマトグラムが示されている。混合物中のモナチンの同定は、図６に示される質量スペクトルにより実証された。ＬＣ／ＭＳによる前記精製産物の解析は、２９３の分子イオン及び２８０ｎｍでの吸光度を持つ単一のピークを示した。質量スペクトルは、図６に示されるものと同一であった。
ＭＳ／ＭＳ解析。実施例１８に記載するように、モナチンについてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオンの実験も行なわれた。図７にモナチンの娘イオンの質量スペクトルが示されている。図７でラベルした全てのフラグメントイオンの暫定的な構造決定が行なわれた。これらには、ｍ／ｚ＝２７５（２９３−Ｈ2Ｏ）、２５７（２９３−（２×Ｈ2Ｏ））、２３０（２７５−ＣＯＯＨ）、２１２（２５７−ＣＯＯＨ）、１６８（３−ブタ−１，３−ジエニル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１５８（１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドカルボニウムイオン）、１４４（３−エチル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１３０（３−メチレン−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、及び１１８（インドールカルボニウムイオン）のフラグメントイオンが含まれる。分子のインドール部分から得られた場合には、予想されるとおり、これらの多くはＭＰのために得られたもの（実施例７）と同一であった。いくつかのものについては、ケトンの代わりにアミノ基が存在することにより、ＭＰに見られたものよりも１質量単位高いものであった。
モナチンの精密質量測定。図８には、精製モナチンについてアプライドバイオシステムズ−パーキンエルマーＱ−スター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｑ−Ｓｔａｒ）四重極／飛行時間複合型質量分析計を用いて得られた質量スペクトルが示されている。トリプトファンを内部質量校正標準として用いて測定したプロトン付加モナチンの質量は、２９３．１１４４であった。元素組成Ｃｉ4Ｈ17Ｎ2Ｏ5に基いて計算されたプロトン付加モナチンの質量は、２９３．１１３７である。これは百万分率（ｐｐｍ）で２未満の質量測定エラーであり、酵素的に生成されたモナチンの元素組成の確定的証拠を提供するものである。
ＮＭＲ分光法。ＮＭＲ実験は、ヴァリアンイノーヴァ（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ）５００ＭＨｚ装置を用いて行なわれた。モナチンのサンプル（〜３ｍｇ）は０．５ｍｌのＤ2Ｏに溶解された。最初に、溶媒（Ｄ2Ｏ）は、４．７８ｐｐｍにおける内部基準として用いられた。水のピークが大きかったことから、1Ｈ−ＮＭＲは水のピークを抑制して測定された。続いて、水のピークの広さから、モナチンのＣ−２プロトンを基準ピークとして使用し、７．１９２ｐｐｍの公表値に定めた。
13Ｃ−ＮＭＲについては、最初の数百回の走査による測定から、サンプルが希釈されすぎており配分時間内に十分な13Ｃスペクトルを得られないことが示された。従って、結合する水素と炭素を相互に関連付けて炭素の化学シフトの情報を提供すること可能な、異核種間多量子コヒーレンス（ａ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）（ＨＭＱＣ）実験が行なわれた。
1Ｈ及びＨＭＱＣデータの要約を表４及び５に示す。公表値との比較から、前記ＮＭＲデータは、酵素的に生成されたモナチンは、（Ｓ，Ｓ）、（Ｒ，Ｒ）のいずれか、又はこれら両者の混合物であることを示した。
キラルＬＣ／ＭＳ解析。生体外で生成されたモナチンは、１種類の異性体であり、（Ｓ，Ｓ）及び（Ｒ，Ｒ）エナンチオマーの混合物ではないことを実証するため、実施例１８に記載する装置を用いて鏡像異性ＬＣ／ＭＳ解析が行なわれた。
キラルＬＣ分離は、常温でキロバイオティックＴ（Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｔ）（アドヴァンストセパレーションズテクノロジー社）キラルクロマトグラフィーカラムを用いて行なわれた。分離法及び検出法は、前記販売会社から公表されたプロトコルを基に、トリプトファンのＲ−（Ｄ）及びＳ−（Ｌ）異性体に対して最適化された。ＬＣの移動相は、Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸含有水； Ｂ）メタノールを含有する０．０５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸から構成された。溶離は、７０％のＡ及び３０％のＢで定組成であった。流速は１．０ｍＬ／分で、ＰＤＡの吸光度は２００ｎｍから４００ｎｍまでモニターされた。トリプトファン及びモナチンのキラルＬＣ／ＭＳ解析に用いた機器パラメータは、実施例１８でＬＣ／ＭＳ解析について記載されたものと同一である。ｍ／ｚ１５０−４００の領域の一群の質量スペクトルが用いられた。プロトン付加分子イオンの選択イオンクロマトグラム（Ｒ−及びＳ−の両トリプトファンについて［Ｍ＋Ｈ］+＝２０５、モナチンについて［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３）は、混合物中のこれら被検体の直接的な同定を可能とした。
図９に、キラルクロマトグラフィーで分離され、ＭＳでモニターされたＲ−及びＳ−トリプトファン及びモナチンのクロマトグラフを示す。モナチンのクロマトグラムにおける単一のピークは、該化合物が、Ｓ−トリプトファンと殆ど同じ保持時間を持つ１種類の異性体であることを示す。
表４
1Ｈ ＮＭＲのデータ
Figure 2008538924
Figure 2008538924
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旋光分析。旋光度は、ルドルフオートポルＩＩＩ（Ｒｕｄｏｌｐｈ Ａｕｔｏｐｏｌ ＩＩＩ）旋光計で測定された。モナチンは、水中１４．６ｍｇ／ｍＬの溶液として調製された。Ｓ，Ｓモナチン（塩の状態）について予想される比旋光度（［α］D 20）は、水中１ｇ／ｍＬの溶液で−４９．６である（Ｖｌｅｇｇａａｒら）。酵素的に生成された精製モナチンで測定された［α］D 20は、−２８．１であり、Ｓ，Ｓ異性体であったことを示している。
改良
試薬及び酵素の濃度を含む反応条件は最適化され、以下の試薬配合を用いて５−１０ｍｇ／ｍＬの収率が得られた：５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ８．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００ｍＭピルベート（ナトリウム又はアンモニウム塩）、５ｍＭα−ケトグルタレート（ナトリウム塩）、０．０５ｍＭピリドキサールホスフェート、酵素添加後に終量を１ｍＬとするための脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、５０μｇ／ｍＬの組換えＰｒｏＡアルドラーゼ（細胞抽出物；１６７μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｓｐＣ遺伝子によりコードされるＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ１０００μｇ／ｍＬ（細胞抽出物；２５００μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度）、及び６０ｍＭを超える濃度にするための固体トリプトファン（飽和；反応を通じて部分的に溶解しない）。前記混合物は、緩やかな攪拌又はミキシングと共に３０℃で４時間インキュベートされた。
置換
α−ケトグルタレートの濃度は、１ｍＭまで減少させることが可能であり、９ｍＭのアスパルテートを補充して同じ量のモナチンが得られる。第一の工程に置いて、オキサロアセテートといった別のアミノ酸アクセプターを用いることもできる。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの代わりに、組換え大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）の広範囲の基質に対するアミノトランスフェラーゼが用いられた場合でも、同様のモナチン収量が達成された。しかしながら、分子質量が２９２の第二の未確認の生成物（主生成物の３−１０％）もＬＣ／ＭＳ解析により検出された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｙｒＢにコードされる酵素、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ｔａｔ Ａにコードされる酵素又はブタ心臓由来のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＩＩａ型）がアミノトランスフェラーゼとして添加去れた場合には、０．１−０．５ｍｇ／ｍＬのモナチン濃度が得られた。インドール−３−ピルベートから前記反応を開始させた場合、最終工程でグルタメートデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＨを用いた還元的アミノ化を行なうことが可能である（実施例１５のように）。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと共にＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＳ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）由来のＫＨＧアルドラーゼも用いて酵素的にモナチンを生成した。以下の反応条件が用いられた：５０ｍＭのＮＨ4−ＯＡｃ ｐＨ８．３、２ｍＭのＭｇＣｌ2、２００ｍＭのピルベート、５ｍＭのグルタメート、０．０５ｍＭピリドキサールホスフェート、酵素添加後に終量を０．５ｍＬとするための脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、２０μｇ／ｍＬの組換えＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（精製）、細胞抽出物から未精製の約４００μｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、及び１２ｍＭインドール−３−ピルベート。反応系は、振とうと共に３０℃で３０分間インキュベートされた。Ｂ。サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の酵素を用いて生成されたモナチン量は、８０ｎｇ／ｍＬであったが、アルドラーゼ量の増加に伴って増加した。インドール−３−ピルベート及びグルタメートを飽和量のトリプトファン及び５ｍＭのα−ケトグルタレートに代えた場合、モナチンの生成は３６０ｎｇ／ｍＬにまで増加した。反応は、飽和量のトリプトファンと共に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３中に３０μｇ／ｍＬの各３種類のＫＨＧ酵素を用いて繰り返され、検出量を増加させるため１時間反応が進められた。実施例７と同様に、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の酵素が最も高い活性を有し、約４０００ｎｇ／ｍＬのモナチンを生成した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫＨＧは３０００ｎｇ／ｍＬのモナチンを生成し、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の酵素は２３００ｎｇ／ｍＬを生成した。
実施例１０
ＰｒｏＡアルドラーゼ及びＡｓｐＣ、ＴｙｒＢ、又はＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼをアミノ末端ＨＩＳ6タグ有り及び無しで用いたトリプトファンのモナチンへの変換
実施例９に記載される２種類の酵素を用いてトリプトファンからモナチンを生成する生体外の製法について、アミノ末端ＨＩＳ6タグ有り及び無しで構築された３種類のアミノトランスフェラーゼを用いて更なる試験を行なった。
酵素
コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来のｐｒｏＡアルドラーゼ遺伝子が、実施例７に記載されるようにクローニングされて発現された。この遺伝子構築物の遺伝子産物は、ｐＥＴ３０系のアミノ末端ＨＩＳ6タグを有する。
ｐＥＴ３０のアミノ末端ＨＩＳ6タグ系と共に構築されたａｓｐＣ及びｔｙｒＢアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、実施例１に記載されるようにクローニングされ発現された。ｐＥＴ３０のアミノ末端ＨＩＳ6タグ系と共に構築されたＨＥＸ遺伝子は、実施例２に記載されるようにクローニングされ発現された。上記３種類のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のタグ無しの変種は、実施例３に記載されるようにクローニングされ発現された。
アミノトランスフェラーゼタンパク質を含む細胞抽出物を用いたモナチン生成物の遺伝子発現及びアッセイ
ｐｒｏＡ、ａｓｐＣ、ｔｙｒＢ、及びＨＥＸの遺伝子産物を含む細胞抽出物が、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で増殖された培養から調製された。ＯＤ600が約０．５に達した後に、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを添加してタンパク質が誘導された。細胞は誘導後に３０℃で４時間増殖され、遠心により回収された。洗浄された細胞は、１μＬ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ、５μＬ／ｍＬのカルバイオケムプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｅｔ ＩＩＩ）及び０．３３μＬ／１０ｍＬのｒ−リゾチームを含むバグバスター（商標）（ＢｕｇｂｕｓｔｅｒTM）試薬液（ノバジェン社）を用いて、ノバジェン社推奨プロトコルに従って溶解された。緩やかな振とうと共に２５℃で１５分間インキュベーションされた後、細胞片は、４℃にて２１，０００×ｇで２０分間遠心してペレット化され、上澄が慎重に除去された（細胞抽出物）。
前記タンパク質の濃度は、９６ウェルプレート型でピアスＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）を用いて測定された。各ウェルあたりの総アッセイ体積は、２００μＬであった。各ウェルにおいて、２００μＬのワーキング試薬が１０μＬのタンパク質溶液に添加された。ウシ血清アルブミン（ピアス社、カタログ＃２３２０９）が検量線決定に用いられた（０ないし１．０ｍｇ／ｍＬ）。アッセイのサンプルと標準物質の吸光度が５６２ｎｍで測定された。
未精製酵素を用いてトリプトファンからのモナチン生成を試みた。前記２種類のタンパク質の発現レベルは、以下の例において高かった（可溶性タンパク質総量の３０ないし４０％）。しかしながら、例えば可溶性タンパク質総量の５ないし３０％といった発現レベルの低い、又は、例えば可溶性タンパク質総量の４０％を超える発現レベルの高い他の細胞抽出物を用いることも可能であった。反応混合物１ｍＬには、１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ８．０、４ｍＭのＭｇＣｌ2、３ｍＭのリン酸カリウム、０．０５ｍＭのピリドキサールホスフェート、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０ｍＭのトリプトファン、１０ｍＭのα−ケトグルタレート、１１２μｇの組換えＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ（〜３０％のアルドラーゼを含有する未精製細胞抽出物（可溶性タンパク質総量の百分率として計算））及び１０００μｇ又は１０μｇいずれかの組換えアミノトランスフェラーゼ（〜４０％のアミノトランスフェラーゼを含有する未精製細胞抽出物（可溶性タンパク質総量の百分率として計算））が含まれていた。トリプトファンは固体のまま添加された。酵素以外の全ての成分が一緒に混合され、前記トリプトファンが溶解するまで３０℃にてインキュベートされた。その後、酵素が添加され、反応溶液は、緩やかな攪拌と共に３０℃で１時間インキュベートされた。反応混合物は、実施例１８に記載されるようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭによりモナチン形成について解析された。表６に、酵素活性を前記１時間のインキュベーション中に生じた生成物の濃度として列挙する。これらの結果から、ＡｓｐＣ又はＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼがｐＥＴ３０アミノ末端ＨＩＳ6タグと融合した場合、又はこれらが天然タンパク質のまま発現された場合において、トリプトファンから形成されたモナチンの量に有意差が無いことが示されている。対照的に、タグ付きのＴｙｒＢタンパク質は、タグ無しのＴｙｒＢタンパク質と比べて、少量の産物を生成している。タグ無しのＴｙｒＢタンパク質は、添加されたアミノトランスフェラーゼ酵素の総量に依存するが、ＡｓｐＣ又はＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ反応混合液で測定された生成物濃度の約２５−７５％を生成している。
Figure 2008538924
最適化されていない培地、誘導濃度、又は誘導時間を用いた場合、ＡｓｐＣ又はＰｒｏＡの発現レベルは低下した（例えば、総可溶性タンパク質の約１０−２０％まで）。これらの場合には、更なる量の細胞抽出物を用いて対等な結果を得た。
精製アミノトランスフェラーゼタンパク質の使用
アミノトランスフェラーゼは、タグ付きのｐＥＴ３０構築物の細胞抽出物（上記同様に生成）からＨｉｓ−結合性カートリッジ付きの固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて、製造元のプロトコル（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）に従って精製された。融合タンパク質のＨＩＳ6−タグ配列は、ＩＤＡベースのＨｉｓ−結合性樹脂に固定化された２価のＮｉ2+カチオンに結合する。溶離液フラクションは、ＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）カラムで脱塩され、ｐＨ７．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで溶離された。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度が分析され、ウシ血清アルブミンを標準物としてピアスＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ａｓｓａｙ）を用いてフラクション中のタンパク質の量が測定された。
精製されたＡｓｐＣ、ＨＥＸＡｓｐＣ、又はＴｙｒＢアミノトランスフェラーゼ及び未精製のＰｒｏＡアルドラーゼを用いてトリプトファンからのモナチン形成を試みた。反応混合物０．５ｍＬには、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４ｍＭのＭｇＣｌ2、３ｍＭのリン酸カリウム、０．０５ｍＭピリドキサールホスフェート、２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、〜５０ｍＭのトリプトファン、５ｍＭのα−ケトグルタレート、１６５μｇの組換えＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ（〜３０％のアルドラーゼを含有する未精製細胞抽出物（可溶性タンパク質の総量の百分率として計算））及び６４μｇ又は１０μｇいずれかの精製組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アミノトランスフェラーゼが含まれていた。トリプトファンは固体のまま添加された。酵素以外の全ての成分が一緒に混合され、前記トリプトファンが溶解するまで３０℃にてインキュベートされた。その後、酵素が添加され、反応溶液は、緩やかな振とうと共に３０℃で２時間インキュベートされた。反応混合物は、１０倍に希釈され、実施例１８に記載されるようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭによりモナチン形成について解析された。表７に、酵素活性を前記２時間のインキュベーション中に生じた生成物の濃度として列挙する。
Figure 2008538924
表７の結果は、限定された量の精製アミノトランスフェラーゼ及び過剰のアルドラーゼ（未精製）により、ＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼの反応よりも、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼの反応では７倍多いモナチン（殆ど検出不能 対 ０．０８７９ｇ／Ｌ）が生成されることを示している。より高濃度のアミノトランスフェラーゼでは、前記増加率は約２０％となる。しかしながら、同様にして、未精製酵素ではあまり著しい差異は観察されなかった（表６参照）。
コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来のｐｒｏＡアルドラーゼ遺伝子及びＨＩＳ6タグ無しのＨＥＸアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子もｐＥＴ２３ａ（ノバジェン社）誘導体のマルチプルクローニング配列のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングされた。これら構築物の細胞抽出物が、ＩＰＴＧ又はラクトースのいずれかにより誘導された培養から調製され、モナチンの酵素的生成のための酵素の供給源として使用された。反応は、５０ｍＬにおいてｐＨの範囲が７．５ないし８．９にある３種類のスルホン酸緩衝液（ＭＯＰＳ、３−（Ｎ−モルフォリオ）プロパンスルホン酸；ＨＥＰＥＳ、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−スルホン酸；ＴＡＰＳ、２−ヒドロキシ−１、１−ビス（ヒドロキシメチル）メチル）アミノ）−１−プロパンスルホン酸）のいずれか１種類を用いて行なわれた。反応系には、５０ｍＭの緩衝液、２ｍＭのＭｇＣｌ2、２００ｍＭのピルベート、５ｍＭのグルタメート、０．０５ｍＭのピリドキサールホスフェート、酵素添加後に終量を５０ｍＬとするための脱気水、３ｍＭのリン酸カリウム、１９４μｇ／ｍＬのＰｒｏＡアルドラーゼ細胞抽出物（〜５０μｇ／ｍＬのアルドラーゼを含む）及び２８１μｇ／ｍＬ又は２８１０μｇ／ｍＬのＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ細胞抽出物（〜５０μｇ／ｍＬ又は〜５００μｇ／ｍＬのアミノトランスフェラーゼを含む）が含まれていた。酵素添加の直前であり、かつ反応が開始してから一定時間間隔後に固体のトリプトファン（０．５ｇ）が反応混合物に加えられた。反応系は常温で攪拌され、一定分量が上記同様にＬＣ−ＭＳによる解析用に取り分けられた。これらの条件下において、モナチン生成に最適なｐＨは、８．２から８．５の間にあった。前記酵素は、反応開始後から数日間モナチンを生成し続け、６ｇ／Ｌ以下の生成物を生成した。
実施例１１
本実施例は、ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ２９１９１）からＫＨＧアルドラーゼをクローニングし、解析する方法について記載する。この酵素をアミノトランスフェラーゼと組み合わせて用いてトリプトファンからモナチンを生成した。
クローニング
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ２９１９１）由来のｋｈｇ遺伝子は、実施例２に記載されるのと同様の方法によりクローニングされた。Ｍｅｋａｌａｎｏｓ ＪＪ，「ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）の毒素遺伝子の複製及び増幅（Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）」，Ｃｅｌｌ ３５：２５３−２６３（１９８３）の方法を用いてゲノムＤＮＡを単離した。
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のｋｈｇ遺伝子のｐＥＴ３０ａ及びｐＥＴ２８ベクター（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）へのクローニング用に以下のプライマーが設計された。
Ｎ末端：５’−ＧＧＣＣＧＧＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＴＡＴＣＧＡＴＴＣＣＧＴＡＡＴ−３’（配列番号８１）；
Ｃ末端：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧ−３’（配列番号８２）。
以下のＰＣＲプロトコルを用いて遺伝子増幅を行なった：５０μＬの反応量中に、２００ｎｇのＤＮＡの鋳型、１．６μＭの各プライマー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５ＵのｐｆｕＵｌｔｒａ ＨＦポリメラーゼ（ストラタジーン社）、２．８Ｕのエキスパンドハイファイデリティー（商標）ポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙTM Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社、インディアナポリス、インディアナ州）、及びＭｇＣｌ2含有の１Ｘエキスパンド（商標）バッファー（１×ＥｘｐａｎｄTM）が添加された。サーマルサイクラーのプログラムには、９４℃で３分間のホットスタート；これに続く９４℃（３０秒間）の変性ステップ、５３℃（３０秒間）のアニーリングステップ、及び７２℃（１分３０秒間）の伸長ステップの８サイクル；９４℃（３０秒）の変性ステップ、５９℃（３０秒間）のアニーリングステップ、及び７２℃（１分３０秒間）の伸長ステップの２０サイクル；及び最後に７２℃（７分間）の終了ステップ、が用いられた。該増幅されたＤＮＡは、キアゲンキアクイック（登録商標）ゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（バレンシア、カリフォルニア州）を用いて１％アガロースゲルから精製された。精製ＤＮＡ及び精製プラスミドＤＮＡ（キアゲンキアプレップ（登録商標）スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を用いて精製）は、製造元の指示（ＮＥＢ； ビヴァリー、マサチューセッツ州）に従い、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにより消化された。ＮｄｅＩによるｐＥＴ３０ａベクターの消化により、アミノ末端のＨＩＳ6−タグ領域が除去される。消化されたＤＮＡは、キアゲンキアクイック（登録商標）ゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（バレンシア、カリフォルニア州）を用いて１％アガロースゲルから精製された。精製されたＤＮＡ産物は、２６０ｎｍでの吸光度の測定により定量され、ラピッドＤＮＡライゲーションキット（Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ロッシュ社）を用いてライゲーションされた。ライゲーション反応物のエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂへの形質転換は、バイオラッド社のエレクトロポレーションマニュアルに記載されるように、０．２ｃｍキュベット及びバイオラッドジーンパルサーＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ）装置を用いて、標準的な条件の下で行なわれた。ｋｈｇ遺伝子を含むクローンは、制限酵素処理解析により同定され、ＤＮＡシーケンスにより確認された。配列番号８３及び８４には、ｋｈｇ遺伝子とその遺伝子産物のヌクレオチド配列及びこれに対応するアミノ酸配列が示されている。
遺伝子発現及びアッセイ
プラスミドＤＮＡ（シーケンス解析により確認）は、製造元のプロトコル（ノバジェン社）に従って、発現宿主であるＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）に形質転換された。該培養は、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ倍地中で増殖された。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃にて増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）構築物を用いて誘導実験が行なわれた。ＯＤ600が約０．６に達した後に、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現が誘導された。細胞は３０℃で４時間増殖され、遠心により回収された。細胞は、その後、１μＬ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ、５μＬ／ｍＬのカルバイオケムプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｅｔ ＩＩＩ）を含むバグバスター（商標）（ＢｕｇｂｕｓｔｅｒTM）試薬液（ノバジェン社）を用いて、ノバジェン社推奨プロトコルに従って溶解された。上澄（無細胞抽出物）は、４−１５％の勾配ゲル（バイオラッド社）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、前記組換え融合タンパク質の可溶性タンパク質濃度が検出された。Ｚ．モボリス（Ｚ．ｍｏｂｏｌｉｓ）アルドラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で効率よく発現され、可溶性タンパク質の約３０％を占めることがＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で判断された。
未精製の酵素を用いて、トリプトファンからのモナチンの形成を試みた。前記反応混合物１ｍＬ中には、１００ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ８．０、４ｍＭのＭｇＣｌ2、３ｍＭのリン酸カリウム、０．０５ｍＭのピリドキサールホスフェート、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０ｍＭのトリプトファン、１０ｍＭのα−ケトグルタレート、２３９μｇの組換えＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（〜３０−４０％のアルドラーゼを含む非精製細胞抽出物（可溶性タンパク質総量の百分率として計算））及び組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ｋｈｇアルドラーゼ（〜３０％のアルドラーゼを含む１０又は１００μｇの非精製細胞抽出物（可溶性タンパク質総量の百分率として計算））又はＰｒｏＡアルドラーゼ（３０％のアルドラーゼを含む１１．２又は１１２μｇの非精製細胞抽出物（可溶性タンパク質総量の百分率として計算））が含まれていた。トリプトファンは固体で添加された。前記酵素以外の全ての成分が一緒に混合され、トリプトファンが溶解するまで３０℃でインキュベートされた。その後、前記酵素が添加され、前記反応溶液は、緩やかな振とうと共に３０℃で１時間又は２２時間インキュベートされた。反応混合物は、１０倍に希釈され、実施例１８に記載されるようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭによりモナチン形成について解析された。表８に、酵素活性を前記インキュベーション中に形成された生成物の濃度として列挙する。
Figure 2008538924
表８に列挙される結果は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼが、ＰｒｏＡアルドラーゼが存在する反応との比較においては低濃度ではあるが、モナチン形成を触媒していることを示している。第２列目及び４列目の結果の比較から分かるように、反応系により高濃度のＫＨＧアルドラーゼが添加された場合には、より多くのモナチンが形成されていた。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼが存在する反応系からのＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラフにモナチンのＭＳ／ＭＳの特徴を有する２本のピークが観察され、この酵素により複数種のモナチン異性体が形成されたことが示された。表８に示される結果は、これら２本のピークの和を表している。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のアッセイの２４時間サンプルをキラル手法を用いて解析した場合、該サンプルの大体数はＳ，Ｓ−モナチンであることが示された。しかしながら、少量のＲ，Ｓ−モナチンも存在しており、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）アルドラーゼがＲ−モナチン前駆体（Ｒ−ＭＰ）立体異性体を生成可能であることが示された。
前記Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧについて、ＰｒｏＡアルドラーゼと共に、実施例７に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のホモログとの比較により更なる特性指摘が行なわれた。１ｍＬの反応混合物に対し、以下のものが加えられた：約６０μｇアルドラーゼ（細胞抽出物中に供給される）、４ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＤ−トリプトファン、０．５ｍｇのバイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ−１０３）、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーｐＨ７．５又は１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ８、０．０５ｍＭのＰＬＰ、３ｍＭのリン酸カリウム（酢酸反応のみに添加）、及び１０ｍＭのα−ケトグルタレート。実験は、アルドラーゼが添加されていないネガティブコントロールを用いて２つの系で重複して行なわれた。サンプルは、緩やかな振とうと共に３０℃にて一晩（２０時間）インキュベートされ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析及びＦＤＡＡ誘導体化の前に濾過された。酢酸ナトリウムサンプルの実際のｐＨは約５であり、ホスフェートにより緩衝されたサンプルの最終ｐＨは約７であった。いずれのアルドラーゼもｐＨ５では有意な活性を有しておらず、ＰｒｏＡアルドラーゼを含むサンプルではネガティブコントロールよりも若干高かったが、恐らく実験誤差よりも高いものではなかったであろう。リン酸カリウムにおいては、ＰｒｏＡアルドラーゼは、Ｒ，Ｒ：Ｓ，Ｒが１．７：１となる比率で７３．４ｐｐｍのモナチンを生成した。ＫＨＧアルドラーゼは、およそＲ，Ｒ：Ｓ，Ｒが２：１−４：１となる比率で、０．０３−０．６ｐｐｍのモナチンを生成した。
実施例１２
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の別のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いたＳ，Ｓモナチンの生成
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと芳香族アミノトランスフェラーゼの両方に相同性を有する推定上ＰＬＰ依存性のアミノトランスフェラーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５からクローニングされ、その組換えタンパク質のＳ，Ｓ−モナチンを生成する活性について試験を行なった。ＮＣＢＩにＧＩ：４８９９４８７３として寄託されたｙｆｄＺ遺伝子配列の、タンパク質ＧＩ：１７８８７２２（タンパク質ＩＤ ＡＡＣ７５４３８．１）をコードする２４９６３１７−２４９５０７９塩基に基づいてプライマーが設計された。
５’プライマー：
ＴＧＡ ＣＣＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＡＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＣ ＡＣＴ ＣＧＣ ＣＣＴＧＡＡＣ（配列番号８５）
３’プライマー：
ＴＴＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＣＣ ＧＣＧ ＴＴＴ ＴＣＧ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＧＴ ＴＴＧ（配列番号８６）
ＭＧ１６５５由来のゲノムＤＮＡが標準的手法を用いて調製され、１００ｎｇが１×ｒＴｔｈバッファー、１ｍＭの酢酸マグネシウム塩、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．７５μＭの各プライマー、０．５μＬのＰｆｕポリメラーゼ（Ｐｆｕ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ストラタジーン社）、及び４単位のｒＴｔｈポリメラーゼ（ｒＴｔｈ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（アプライドバイオシステムズ社）をも含む１００μＬのＰＣＲ反応に用いられた。ＰＣＲ８ラウンドにおいて５６℃のアニーリング温度を用い、これに６０℃のアニーリング温度を用いる２２ラウンドのＰＣＲが続いた。伸張ステップは、６８℃にて２分１５秒間行なわれた。ＰＣＲ産物は、キアゲンキアクイックゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（バレンシア、カリフォルニア州）を用いてゲル精製され、ＥＢバッファー５０μＬ中に溶出された。精製されたＰＣＲ産物及びｐＴＲＣ９９ａベクター（ファルマシアバイオテック社）は、ＢＳＡ入りの１×ＮＥＢバッファー中で３７℃にてＸｂａ及びＨｉｎｄＩＩＩで一晩消化された。消化産物は、キアゲンキアクイック（登録商標）ＰＣＲピュリフィケーションキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製され、３２μＬの０．５ＸＥＢ中に溶出された。ライゲーションは、インサート：ベクターを６：１の比率で、クイックライゲーションキット（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＮＥＢ）を用いて行なわれた。ライゲーション反応物は、ＰＣＲピュリフィケーションキット（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製され、ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞にエレクトロポレーションされた。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレートに２μＬが播種された。コロニーは、ｐＴＲＣ９９ａベクターから得られたプライマーを用いてＰＣＲによりスクリーニングされた。ミニプレップＤＮＡはシーケンスされ、ベクターへの正確な挿入が確認された。
細胞は、アンピシリン含有ＬＢ培地にて０．４のＯＤまで増殖され、１ｍＭのＩＰＴＧにて３７℃で３時間誘導された。バグバスター（商標）（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒTM）（ノバジェン社）を用いて、製造元のプロトコルに従って細胞抽出物が作られ、タンパク質濃度が０−２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ標準を用いたピアスＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ａｓｓａｙ）の使用により測定された。発現は、可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認され、推定上のアミノトランスフェラーゼ（ＹｆｄＺ）は、可溶性タンパク質の約１０％を構成することが測定された。
モナチン生成について、ｙｆｄＺ遺伝子産物は１００ｍＭ酢酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）の両方においてアッセイされ、実施例２に記載されるように調製されたＨＥＸＡｓｐＣタンパク質と比較された。５０μｇの未精製アミノトランスフェラーゼが、２０ｍＭのＬ−トリプトファン、４ｍＭのＭｇＣｌ2、３ｍＭのリン酸カリウム（酢酸バッファー専用）、０．０５ｍＭのＰＬＰ、１０ｍＭのα−ケトグルタレート、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び細胞抽出物として提供された５０μｇのＰｒｏＡアルドラーゼ（実施例７に記載）を含む各バッファー中にてアッセイされた。酵素の添加前に、酢酸サンプルのｐＨを６ないし７．５に調整する必要があった。１ｍＬのサンプル（２つの系で重複して測定）は、緩やかな振とうと共に３０℃にて１時間インキュベートされた。各バッファーにてネガティブコントロールも行なわれ、ＰｒｏＡアルドラーゼの細胞抽出物に存在するもの以外全くアミノトランスフェラーゼを含むものではなかった。サンプルは濾過され、実施例１８に記載されるようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）により解析された。生成されたモナチンのバックグラウンド量（４１０−４６９ｎｇ／ｍＬのモナチン）を差し引いた後、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼは、ホスフェートバッファー中で１２８５ｎｇ／ｍＬのモナチンを生成することが判明し、ＹｆｄＺタンパク質は４２６ｎｇ／ｍＬのモナチンを生成することが判明した。酢酸ナトリウムバッファー中においては、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼが８１５ｎｇ／ｍＬのモナチンを生成する一方で、前記推定上のアミノトランスフェラーゼは４４６ｎｇ／ｍＬを生成した。結果から、ｙｆｄＺ遺伝子産物は、実際に、実施例１に記載されるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと類似する振る舞いを見せるアミノトランスフェラーゼであり、その活性はトリプトファン及びモナチンの両方に対するものであることが確認された。
実施例１３
市販のトランスアミナーゼライブラリーを用いたインドール−３−ピルベートからのモナチンの生成の比較
トランスアミナーゼライブラリーがバイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）（パサディナ、カリフォルニア州）から購入され、該酵素はＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来のＰｒｏＡアルドラーゼを用いた関連反応におけるモナチンの生成について試験された。前記ライブラリーは以下のものから構成されていた：ＡＴ−１０１、広範囲Ｌ−アミノトランスフェラーゼ；ＡＴ−１０２、分枝鎖Ｌ−トランスアミナーゼ（即ち、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ、ＥＣ２．６．１．４２））；ＡＴ−１０３、広範囲Ｄ−トランスアミナーゼ；ＡＴ−１０４、分枝鎖Ｌ−トランスアミナーゼ（即ち、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ、ＥＣ２．６．１．４２））；ＡＴ−１０５、リジン６−アミノトランスフェラーゼ；及びＡＴ−１０６、広範囲Ｌ−トランスアミナーゼ。ＡＴ−１０３を含む反応では、Ｄ−グルタメートがアミノ酸ドナーとして用いられた。ＡＴ−１０５を含む反応では、Ｌ−リジンがアミノドナーとして用いられた。他の全ての反応では、Ｌ−グルタメートが補基質として用いられた。酵素及び追加の組成物／基質は、前記キットに提供され、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーｐＨ７．５、１００ｍＭのアミノドナー、及び０．１ｍＭのＰＬＰを含む反応バッファーに直接添加された。１ｍＬの反応バッファーに対し、以下のものが添加された：４ｍｇのインドール−３−ピルベート、２０ｍｇのピルベート、細胞抽出物中に提供される約５０μｇのＰｒｏＡ、１μＬの２ＭのＭｇＣｌ2、及び２ｍｇの試験されるアミノトランスフェラーゼ酵素。全ての反応は２つの系で重複して行なわれ、追加のアミノトランスフェラーゼを添加していないネガティブコントロール反応も行なわれた。モナチンのバックグラウンド生成は、組換えＰｒｏＡ酵素の細胞抽出物中に存在する天然の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アミノトランスフェラーゼに起因する。反応は、緩やかな振とう（１００ｒｐｍ）と共に３０℃で一晩インキュベートされた。サンプルは濾過され、実施例１８に記載される逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析に処された。結果を以下に示す：
Figure 2008538924
ＡＴ−１０１、ＡＴ−１０２、ＡＴ−１０３、及びＡＴ−１０４アミノトランスフェラーゼは、明らかにネガティブコントロールよりも多くのモナチンを生成した。ＡＴ−１０５は、ネガティブコントロールよりも少ないモナチンを生成しているが、これは恐らく、細胞抽出物中の天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アミノトランスフェラーゼに適していないリジンをアミノドナーとして用いたことが理由であろう。同様にして、Ｄ−グルタメートが与えられたＡＴ−１０３を含む反応ではバックグラウンドが低くなることが予想されるであろう。上記結果は更に解析され、クロマトグラフ分離中に分解する２種類の立体異性体プールのピーク領域に基づいてモナチンのＳ、Ｒ／Ｒ、Ｓ対Ｒ、Ｒ／Ｓ、Ｓ比が測定された。生成された総モナチン量のうち、ネガティブコントロールに約９９．７％のＲ、Ｒ／Ｓ、Ｓモナチンが含まれていた。ＡＴ−１０２が次に最も高い特異性を示し（８９％のＲＲ／ＳＳピーク）、ＡＴ−１０１及びＡＴ−１０４がこれに続いた（〜８０％）。広い特異性を有するＤ−アミノトランスフェラーゼであるＡＴ−１０３を用いた反応では、混合異性体との比較で６９％のＲ、Ｒ／Ｓ、Ｓモナチンが生成された。この酵素は、Ｄ−アミノ酸に呈する広い特異性を有することが知られており、実施例１においてもＤ−トリプトファンを基質として許容することが示された、実施例１に記載されたバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＤＡＴ酵素と相同的である。実施例１８に記載する方法を用いてキラル解析が行なわれ、予想通り、前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼはＲ，Ｒモナチンを生成していたことが確かめられた。Ｓ，Ｓモナチン又はＲ，Ｒモナチンを基質として用いた更なる実験により、予想通り、バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）の酵素はＤ−配位に対する選択性が非常に高いことが確認された（実施例１５に結果を記載する）。
ＡＴ−１０３（前記広範囲Ｄ−トランスアミナーゼ）及びＰｒｏＡアルドラーゼを含む関連反応中の副生成物として生成するＳ，Ｓモナチン又はＲ，Ｓモナチンの量を減少させるため、該アルドラーゼは、実施例１に記載するようにＨｉｓ−結合性カートリッジを用いて精製された。精製された酵素には、細胞抽出物中に存在する可能性のある野生型アミノトランスフェラーゼ活性は含まれないはずであった。Ｈｉｓ−結合性溶離物は脱塩され、ＰＤ−１０カラム（Ｇ２５セファデックス（Ｇ２５Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、アマルシャムファルマシア社）を用いてイミダゾールが除去され、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７に溶出された。実験は、２つの系で重複して行なわれ、１ｍＬの体積中には、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＣｌバッファーｐＨ７．８、５０μｇＰｒｏＡアルドラーゼ、４ｍｇのインドール−３−ピルベート、１又は２ｍｇのＤ−アミノトランスフェラーゼ、２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ2、３ｍＭのリン酸カリウム、０．１ｍＭのＰＬＰ、及び１４．７ｍｇのＤ−グルタメートが含まれていた。チューブは緩やかな振とうと共に３０℃でインキュベートされた。２時間のタイムポイントが取られ、−２０℃にて即座に凍結された。２時間目においてＮａＯＨを用いてｐＨが５から７−８の間に調整され、アッセイ系は一晩インキュベートされた。サンプルは濾過され、実施例１８に記載するようにモナチンについて解析された。恐らく低いｐＨのせいで、前記２時間目のサンプルは、検出可能な量のモナチンを有していなかった。一晩のサンプルは、１ｍｇのＤ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合に約１９０ｎｇ／ｍＬのモナチンを含有し、約８４％がＲ，Ｒモナチンで１６％がＳ，Ｒモナチンであった。２ｍｇのＤ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合には、５４０ｎｇ／ｍＬのモナチンが生成され、約７１％がＲ，Ｒモナチンであった。
同様の実験が、１００ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．５、０．１ｍＭのＰＬＰ、及び１００ｍＭのグルタメートを含むバイオカタリティクスアミノトランスフェラーゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）バッファーを用いて行なわれた。上記のように固体インドール−ピルベート及びＤ−アミノトランスフェラーゼが添加された。ストック溶液からＰｒｏ Ａ アルドラーゼ（５０μｇ）、ＭｇＣｌ2、及び５０ｍＭのピルベートが添加された。アッセイ系は上記と同様に処理されたが、この場合においてはｐＨ調整は必要なかった。バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）により供給される酵素及びバッファーのみを用いてネガティブコントロールが行なわれたが、モナチンは全く生成されなかった。実験結果を表９に示す。
Figure 2008538924
ホスフェートバッファー中でのモナチン生成量は、明らかにＴｒｉｓバッファー系よりも高い。
実施例１からのクローニングされたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＡＴの活性とバイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）の酵素を比較するため、更なるアッセイが行なわれた。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｔ遺伝子は、実施例１にＡｓｐＣ及びＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼについて記載されるのと同様にサブクローニングされ、Ｈｉｓ−６タグが取り除かれた。実施例１に記載されるように、タグ無し及びタグ付きの酵素がＢＬ２１（ＤＥ３）で生成された。細胞抽出物が作られ、前述のように総タンパク質のアッセイが行なわれ、タンパク質濃度が測定された。以下を含む１ｍＬの反応が２つの系で重複して行なわれた：５００μｇのＤ−アミノトランスフェラーゼ、５０μｇのＰｒｏＡアルドラーゼ、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、３ｍＭのＭｇＣｌ2、４ｍｇのインドール−３−ピルベート、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、７．３５ｍｇ（５０ｍＭ）のＤ−グルタメート、及び０．１ｍＭのＰＬＰ。サンプルは３０℃で１時間、２時間、及び一晩インキュベートされ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析用に濾過された。実施例１８に記載されるＦＤＡＡ誘導体化プロトコルにより、サンプルにはモナチンのＳ，Ｒ及びＲ，Ｒ立体異性体のみが含まれることが分かった。結果は、下記表１０にまとめられている。％ＲＲは、逆相クロマトグラフィーにより分離されるピーク領域により決定され、更に前記一晩のサンプルの組成がＦＤＡＡ誘導体化技術により確かめられた。
Figure 2008538924
ＨＩＳ−６タグの除去によりＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＤ−アミノトランスフェラーゼの活性が向上されたことが分かった；しかしながら、バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）Ｄ−アミノトランスフェラーゼのホモログが明かに最も高い活性を有していた。また、バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、Ｒ−ＭＰに対してより高い基質特異性を示した。インキュベーション時間の増加は、形成されるＲ，Ｒモナチンの鏡像異性的余剰を減少させることが分かった。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来の他の相同的なＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼについても特性指摘が行なわれた。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＹＭ−Ｉ由来の酵素は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の酵素と類似した基質特異性を有することが判明し、従って、この酵素がモナチンの生成のために機能することが予想される。更に、Ｂ．ＹＭ−Ｉ及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、特異性が高い酵素であり、Ｂ．スフェリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）及び他の種に由来するホモログのように広い基質特異性を有しないことが示された。従って、全てのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のホモログはモナチンに至る酵素経路において活性を有することが予想される。Ｋ．Ｙｏｎａｈａ、Ｈ．Ｍｉｓｏｎｏ、Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ、及びＫ．Ｓｏｄａ、ＪＢＣ、２５０：６９８３−６９８９（１９７５）；Ｋ．Ｔａｎｉｚａｗａ、Ｙ．Ｍａｓｕ、Ｓ．Ａｓａｎｏ、Ｈ．Ｔａｎａｋａ、及びＫ．Ｓｏｄａ、ＪＢＱ２６４：２４４５−２４４９（１９８９）を参照。試験された（上記）相同的酵素であるＡＴ−１０３については、モナチンの生成を触媒することが示された。Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．ハロジュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．リチェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．スフェリクス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．スリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ＹＭ−ｌ／ＹＭ−２、ゲオバシラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、テルモフィリック（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ）種、及びオセアノバシラス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含むバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種内において、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする多くの遺伝子が知られている。
実施例１４
市販のデヒドロゲナーゼ酵素を用いたモナチンの生成
Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼと共にバイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）アミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素を用いたインドール−３−ピルベート及びピルベートからのモナチンの生成について、以下の条件でアッセイを行なった：６−７ｍｇ／ｍｌのデヒドロゲナーゼ酵素、５ｍｇのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、５０μｇアルドラーゼ（未精製、実施例７を参照）、３ｍＭリン酸カリウムバッファー、２ｍＭのＭｇＣｌ2、４ｍｇのインドール−３−ピルベート、及び２０ｍｇのピルベートが１ｍＬのＡＡＤＨ反応バッファー（１００ｍＭの炭酸水素塩ｐＨ９．５、２００ｍＭのＮＨ4Ｃｌ）に添加された。ネガティブコントロールには、アミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素は含まれていなかった。サンプルは３０℃にて１００ｒｐｍで一晩インキュベートされた。実験は２つの系で重複して行なわれた。前記試験されたデヒドロゲナーゼは、ＡＡＤＨ−１１０、ＡＡＤＨ−１１１、ＡＡＤＨ−１１２、及びＡＡＤＨ−１１３であった。ＡＡＤＨ−１１０及び１１１は、広い特異性を有する酵素として規定され、一方で１１２及び１１３はグルタミン酸デヒドロゲナーゼである。ＡＡＤＨ−１１０は、ネガティブコントロールとの比較において、約０．３６μｇ／ｍＬの最も多くのモナチンを生成した（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定）。ＮＡＤＨを用いるグルタミン酸デヒドロゲナーゼであるＡＡＤＨ−１１２は、ＮＡＤＰＨを用いるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤＨ−１１３）よりも高い活性を示した。ＡＡＤＨ−１１１については、アッセイされた条件下ではネガティブコントロールよりも多くのモナチンを生成しなかった。
実施例１５
ＭＰ及びモナチン間での相互変換
ＭＰのアミノ化によるモナチンの形成は、アミノトランスフェラーゼにより、又はＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨといった補因子を要するデヒドロゲナーゼにより触媒可能である。実施例１及び９、１０、１２−１４を参照。これらの反応は可逆的であり、いずれの方向においても測定することができる。デヒドロゲナーゼ酵素を用いた場合の方向性は、主にアンモニウム塩の濃度により制御されている。
デヒドロゲナーゼ活性。モナチンの酸化的脱アミノ化は、ＮＡＤ（Ｐ）+がより単色のＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換することに伴う３４０ｎｍ吸光度の増加を追跡することによりモニターされた。モナチンは、実施例９に記載されるように、酵素的に生成されて精製された。
典型的なアッセイ用混合物０．２ｍＬには、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０ないし８．９、０．３３ｍＭのＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+、２ないし２２単位のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（シグマ社）、及び１０−１５ｍＭの基質が含まれていた。アッセイは、ＵＶ透過性のマイクロタイタープレートにて、モレキュラーデバイススペクトラマックスプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ）プレートリーダーを用いて２つの系で重複して行なわれた。酵素、バッファー、及びＮＡＤ（Ｐ）+の混合物は、基質を含むウェルにピペッティングにより移され、短時間の混合の後１０秒間の間隔を設けて３４０ｎｍ吸光度の増加がモニターされた。反応系は２５℃で１０分間インキュベートされた。基質を添加していないネガティブコントロールが行なわれ、ポジティブコントロールとしてはグルタメートが用いられた。ウシ肝臓由来のＩＩＩ型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（シグマ社＃Ｇ−７８８２）は、グルタメートのα−ケトグルタレートへの変換速度の約１００分の１の変換速度でモナチンのＭＰへの変換を触媒した。グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いてインドール−３−ピルベートからモナチンを生成する試みでは、結果として検出可能量のトリプトファンが生成され、前記経路における本工程においては、オキシダーゼ又はアミノトランスフェラーゼを用いるよりもむしろ潜在的にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はその変異体を、トリプトファンの脱アミノ化に用いることが可能であることが示された。
アミノ基移転活性。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＨＩＳ6−ＡｓｐＣ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＨＩＳ6−ＴｙｒＢ）、大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）由来の広範囲の基質に対するアミノトランスフェラーゼ（ＨＩＳ6−ＢＳＡＴ）、及び実施例１に記載される２つの市販のブタグルタミン酸−オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼを用いてモナチンアミノトランスフェラーゼのアッセイが行なわれた。オキサロアセテート及びα−ケトグルタレートの両方は、アミノアクセプターとして試験された。アッセイ用混合物（０．５ｍＬ中）には、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．０５ｍＭのＰＬＰ、５ｍＭのアミノアクセプター、５ｍＭのモナチン、及び２５μｇのアミノトランスフェラーゼが含まれていた。アッセイ系は３０℃にて３０分間インキュベートされ、０．５ｍＬのイソプロパノールの添加により反応が停止された。モナチンの喪失量は、ＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（実施例１８）によりモニターされた。オキサロアセテートをアミノアクセプターとした大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）ＨＩＳ6−ＢＳＡＴにおいて最も高い活性が認められ、α−ケトグルタレートをアミノアクセプターとした同一酵素がこれに続いた。オキサロアセテートを用いた相対的な活性は以下の通りであった：ＨＩＳ6−ＢＳＡＴ＞ＨＩＳ6−ＡｓｐＣ＞ブタＩＩａ型＞ブタＩ型＝ＨＩＳ6−ＴｙｒＢ。α−ケトグルタレートを用いた相対的な活性は以下の通りであった：ＨＩＳ6−ＢＳＡＴ＞ＨＩＳ6−ＡｓｐＣ＞ブタＩ型＞ブタＩＩａ型＞ＨＩＳ6−ＴｙｒＢ。
上記に類似するアッセイ法、及び実施例１８に記載される検出方法を用いてが、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＴａｔＡ及びＲ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＴａｔＡの２種類の酵素は、試験された条件下では検出可能な程にモナチンをＭＰに変換することはなかった。しかしながら、上記検出可能な活性の欠如は、ＭＰが水性溶液中で不安定であることから時として検出が困難であるという事実に起因しているかもしれない。精製ＰｒｏＡアルドラーゼ及び精製Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｔｏｔｉ）アミノトランスフェラーゼのそれぞれを約５０μｇ用いた反応（実施例９同様の条件下）では、トリプトファンとピルベートは２時間では６ｐｐｍ、一晩の反応では４０ｐｐｍのモナチンへと変換された。Ｒ．セファロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のトリプトファンアミノトランスフェラーゼからは、約１０倍も多くのモナチンが生成され、ＭＰからモナチンへの変換におけるより高い活性が示された。
タグ無しのＴｙｒＢ及びＡｓｐＣタンパク質のアミノトランスフェラーゼ活性及び基質特異性についても、トリプトファンの変わりにＳ，Ｓ−モナチン（５ｍＭ）が基質として添加された実施例３に記載するプロトコルを用いて副産物であるグルタメートの形成を追跡することにより測定された。上記アミノトランスフェラーゼ反応において、Ｓ，Ｓ−モナチンは、化学量論的にアミノアクセプターであるα−ケトグルタレートと反応してＭＰ及びグルタメートを形成する。従って、１μｍｏｌのグルタメートが形成された場合には、１μｍｏｌのＭＰも形成されているはずである。結果を表１１に列挙する。
Figure 2008538924
これらの結果と実施例３に記載される結果との比較から、ＡｓｐＣがＳ，Ｓ−モナチンよりも６倍も高くトリプトファンに対する基質選択性を有する（３２８．２μｇ／ｍＬ／５４．３μｇ／ｍＬ）ことが示された。一方で、ＴｙｒＢは、トリプトファンに対して１．５倍の嗜好性を示すのみであり（３１０．１μｇ／ｍＬ／２１１．８μｇ／ｍＬ）、モナチンが基質である場合にＡｓｐＣタンパク質よりも相当に高い活性を示す。
市販のデヒドロゲナーゼを用いたモナチンからＭＰへの変換
モナチンからＭＰへの変換について、バイオカタリティクス（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）の種々のアミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤＨ−１０１−１１０）がアッセイされた。アッセイは、１００ｍＭの炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ１０．０、１０−２０ｍＭのＮＡＤ+、実施例９に記載されるように調製された２０−２００ｍＭのモナチン、及び２０ｍｇ／ｍｌの酵素中にて行なわれた。反応系は３０−４５℃で２時間インキュベートされ、その後３０℃で１６時間インキュベートされた。反応の過程は、ＮＡＤＨの生成による３４０ｎｍでの吸光度変化の追跡によりモニターされた。ネガティブコントロールは、酵素が存在しない又はＡＡＤＨ−１０１が存在する中で、ＮＡＤ+又はモナチンのいずれかが取り除かれて行なわれた。ポジティブコントロールは、ＡＡＤＨ−１０１を基質としてのバリンと共に用いて行なわれた。ポジティブコントロールとの比較では低度であるが（〜１−４％）、ＡＡＤＨ−１０２（芳香族Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ）及びＡＡＤＨ−１１０（広い特異性の分枝鎖Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ；ＥＣ１．４．１．９）は、Ｓ，Ｓモナチンに対する多少の活性を有し、進化して生体触媒による過程における活性を向上させることが可能であることが分かった。ＭＰからのモナチンの生成に必要な還元的アミノ化反応は、概して本実施例で測定された酸化的脱アミノ化反応よりも十分に速い反応である。ＭＰはＬＣ／ＭＳによって検出できなかった；しかしながら、不安定でありアッセイが困難であることが判明した。
市販のアミノトランスフェラーゼを用いたモナチン及びα−ＫＧのＭＰ及びグルタミン酸への変換
ＡＴ−１０１、ＡＴ−１０２、ＡＴ−１０３、及びＡＴ−１０４が、バイオカタリティクス社（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）（パサディナ、カリフォルニア）から購入された。ＡＴ−１０１は、広範囲Ｌ−トランスアミナーゼであり、ＡＴ−１０２は、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４２）であり、ＡＴ−１０３は、広範囲Ｄ−アミノトランスフェラーゼであり、ＡＴ−１０４は、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４２）である。これらの酵素は全て、アルドラーゼ酵素と共に用いた場合、インドール−ピルベート及びピルベートからのモナチン生成における活性を有していた（実施例１３参照）。前記酵素は、化学的に生成されたＳ，Ｓ及びＲ，Ｒモナチンに対する活性について試験された。反応は、０．５ｍＬの総体積にて行なわれ、２つの系で重複して測定された。アッセイ系には、ｐＨ７．８で５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．０８ｍＭのＰＬＰ、１０ｍＭのα−ケトグルタレート（α−ＫＧ）、５ｍＭのモナチン、及び１ｍｇ／ｍｌのアミノトランスフェラーゼ酵素が含まれていた。ネガティブコントロールにはアミノトランスフェラーゼ酵素は含まれていなかった。サンプルは、３０℃にて１００ｒｐｍの振とうで２時間インキュベートされた。サンプルは濾過され、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析が行なわれてグルタメート濃度が確認された（実施例１８に記載する通り）。グルタメート濃度は、ＭＰ生成量と化学量論的に相関するはずである。ネガティブコントロールには、天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アミノトランスフェラーゼによるグルタメート生成と共に、アルドラーゼの細胞抽出物からのグルタメート濃度による多少のバックグラウンドが含まれる。Ｒ，Ｒを反応基質として用いた場合、ネガティブコントロールと比較して唯一有意に生成されたグルタメートは、Ｄ−トランスアミナーゼ（ＡＴ−１０３）によるものであり、約１．１μｇ／ｍｌが検出された。ＡＴ−１０１及びＡＴ−１０４は、ネガティブコントロールよりも僅かに多くグルタメートを生成した。Ｄ−トランスアミナーゼ酵素は、Ｓ，Ｓ−モナチンに対して検出可能な活性を示さなかった。予想されたように、前記アミノトランスフェラーゼは、アミノ部分を含むキラル炭素についてエナンチオ選択的であった。全てのＬ−アミノトランスフェラーゼがＳ，Ｓ−モナチンに対する活性を示した。ＡＴ−１０１は、７５μｇ／ｍｌのグルタメートを生成し、ＡＴ−１０２は、１０２μｇ／ｍｌのグルタメートを生成し、ＡＴ−１０４は６４μｇ／ｍｌのグルタメートを生成した。
２５ｍＭのＲ，Ｒ−ｍｏｎａｔｉｎ、１００ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．５、０．０８ｍＭのＰＬＰ、５０ｍＭのα−ケトグルタレート及び４ｍｇ／ｍＬのＡＴ−１０３酵素を用いての同様の反応では、３０℃で１、２、３、及び１９時間のインキュベーションで、０．１４５、０．２６８、０．３９１、及び０．５９３ｍＭのグルタメートが生成された（実施例１８に記載するＬＣ−ポストカラム蛍光法により測定）。Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファーと比較した場合に、ホスフェートではＤ−アミノトランスフェラーゼ活性が増加することが分かった。１ｍｇ／ｍＬのＡｓｐＣ及び基質としてのＳ，Ｓ−モナチンを用いた並行実験では、インキュベーション時間中に０．１１−０．１８ｍＭのグルタメートが形成された。ＡｓｐＣ濃度の２ｍｇ／ｍｌへの増加により、４時間の反応においてグルタメート濃度は１．２ｍＭに増加した。
実施例１６
トリプトファン及びピルベート以外のＣ３供給源からのモナチンの生成
上記実施例９に記載されるように、インドール−３−ピルベート又はトリプトファンについては、ピルベートをＣ３分子として用いることでモナチンに変換可能である。しかしながら、一定の状況においては、ピルベートは適切な原料となり得ない。例えば、ピルベートは他のＣ３炭素供給源よりも高価であり、又は培地に添加された場合に発酵に対して有害な作用を及ぼすであろう。多くのＰＬＰ−酵素によりアラニンをアミノ基転移させてピルベートを生成することが可能である。
トリプトファナーゼ様酵素は、アミノトランスフェラーゼ等の他のＰＬＰ酵素よりも速い速度でβ脱離反応を行なった。このクラス（４．１．９９．−）からの酵素は、Ｌ−セリン、Ｌ−システインといったアミノ酸、及びＯ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｓ−アルキル−Ｌ−システイン、Ｏ−アシル−Ｌ−セリン、３−クロロ−Ｌ−アラニンといった良好な脱離基を有するセリン及びシステインの誘導体からアンモニアとピルベートを生成することができる。
ＥＣ４．１．９９．−ペプチドを用いたモナチンの生成方法は、Ｍｏｕｒａｔｏｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：１３２０−５，１９９９）の方法に従ってβ−チロシナーゼ（ＴＰＬ）又はトリプトファナーゼを突然変異させることにより改善することができる。Ｍｏｕｒａｔｏｕらには、自然界での存在が報告がなされていない、β−チロシナーゼをジカルボキシルアミノ酸β−リアーゼに変換する能力が記載されている。２８３番目のバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）へ、１００番目のアルギニン（Ｒ）をスレオニン（Ｔ）に変換することにより特異性の変化が達成された。これらのアミノ酸の変化により、リアーゼが加水分解的脱アミノ化反応のためのジカルボキシルアミノ酸（アスパラギン酸等）を許容することが可能となる。従って、アスパルテートは、その後のアルドール縮合反応のためのピルベート供給源として用いることも可能である。
更に、細胞又は酵素リアクターはラクテート及びラクテートをピルベートに変換する酵素と共に供給される。上記反応を触媒可能な酵素の例として、乳酸デヒドロゲナーゼ及び乳酸オキシダーゼが上げられる。
ゲノムＤＮＡの単離
トリプトファナーゼペプチドについては、例えばＭｏｕｒａｔｏｕら（ＪＢＣ ２７４：１３２０−５，１９９９）のように先に報告がなされている。トリプトファナーゼペプチドをコードする遺伝子を単離するため、実施例１に記載されるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０ＢからのゲノムＤＮＡが、ＰＣＲの鋳型として用いられた。
チロシン−フェノールリアーゼの遺伝子はＣ． フロインディイ（Ｃ．ｆｅｕｎｄｉｉ）（ＡＴＣＣカタログ番号８０９０、指定番号 ＡＴＣＣ １３３１６；ＮＣＴＣ ９７５０）から単離され、栄養アガー（ディフコ社０００１）及び栄養ブロス（ディフコ社０００３）にて３７℃でＯＤが０．２になるまで増殖された。ゲノムＤＮＡは、キアゲンジェノミックチップ（商標）１００／Ｇキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐTM１００／Ｇ ｋｉｔ）を用いて精製された。
コーディング配列のＰＣＲ増幅
上記実施例１に記載するように、ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣベクター（ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州）に適合する突出部を有するプライマーが設計された。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｎａ（配列番号４１）。ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣへのクローニング用Ｎ−末端プライマー：５’−ＧＧＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＣＧＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＡＴ ＣＴ−３’（配列番号４３）。
ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣへのクローニング用Ｃ−末端プライマー：５’−ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＡＧ ＴＴＡ ＧＡＧ ＣＣＴ ＴＡＡ ＡＣＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＡＧＴ ＴＴＴ Ｇ−３’（配列番号４４）。
Ｃ．フロインディイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｔｐｌ（配列番号４２）。ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣへのクローニング用Ｎ−末端プライマー：５’−ＧＧＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＣＧＣ ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号４５）。ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣへのクローニング用Ｃ−末端プライマー：５’−ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＡＧ ＴＴＡ ＧＡＧ ＣＣＴＴＡＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号４６）。
全てのＰＣＲ反応においてエッペンドルフマスターサイクラー（商標）グラディエント５３３１サーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒTM Ｇｒａｄｉｅｎｔ ５３３１ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）が用いられた。５０μＬ中に、０．５μｇの鋳型（ゲノムＤＮＡ）、１．０μＭの各プライマー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕのエキスパンドハイファイデリティーポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ロッシュ社）、及びＭｇ含有の１Ｘエキスパンド（Ｅｘｐａｎｄ）バッファー、及び５％のＤＭＳＯ（終濃度）が添加された。使用されたサーマルサイクラー用ＰＣＲプログラムは以下の通りであった：９６℃でホットスタート（５分間）、９４℃−３０秒間、４０−６０℃−１分４５秒間、７２℃−２分１５秒間；３０回の繰返し。最終重合ステップは７分間であり、その後サンプルは４℃で保存された。
クローニング
上記実施例１に詳述されるクローニング及び陽性クローンの同定方法を用いて適切なクローンを同定した。
遺伝子発現及び活性アッセイ
プラスミドＤＮＡ（シーケンス解析により確認）は、発現宿主であるＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）にサブクローニングされた。該培養は、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ倍地中で増殖され、前記プラスミドはキアゲンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて単離され、制限酵素処理により解析されて同一性が確認された。
発現宿主であるＢＬ２１（ＤＥ３）を用いて誘導実験が行なわれ、該構築物は５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で増殖された。前記培養のＯＤ600値が約０．６に達した後に０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現が誘導された。細胞は３０℃で４時間増殖され、遠心により回収された。細胞は、その後、５μＬ／ｍＬのプロテアーゼ阻害剤カクテルセット＃ＩＩＩ（カルバイオケム社）及び１μＬ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ（ノバジェン社）を含む５ｍＬ／ｇ湿潤細胞重量のバグバスター（商標）（ＢｕｇｂｕｓｔｅｒTM）試薬液（ノバジェン社）に溶解され、Ｈｉｓ−タグ付組換えタンパク質が上記実施例１に記載されるようにＨｉｓ−結合性カートリッジを用いて精製された。精製されたタンパク質はＰＤ−１０（Ｇ２５ セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、アマルシャムバイオサイエンス社）カラムで脱塩され、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＣｌバッファーｐＨ８．０に溶離された。タンパク質は４−１５％の勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析され、前記組換え融合タンパク質の予想分子量での可溶性タンパク質濃度が確認された。
変異誘発
ペプチドクラス４．１．９９．−（トリプトファナーゼ及びβ−チロシナーゼ）のいくつかの構成要素は、アスパルテート又はこれに類似する何らの改変もされていないアミノ酸と共にβ−リアーゼ反応を起こす。しかしながら、前記クラスのいくつかの構成要素については、基質としての使用及び／又は生成物の創造を可能とするために変異誘発を必要とするであろう。更に、場合によっては変換を可能とするペプチドについても変異誘発により最適化することが可能である。
ＰＬＰ−結合性ペプチドの三次元構造解析に基き、部位特異的変異誘発が行なわれた。ポリペプチドの基質特異性を変化させた２つの例を下記に示す。
トリプトファナーゼの変異誘発：実施例１６Ａ
下記に示す変異誘発プロトコルにより、アミノ酸配列に２点の変異が導入された。第一の点変異により１０３番目の部位のアルギニン（Ｒ）がスレオニン（Ｔ）へと変換され、第二の点変異により２９９番目の部位のバリン（Ｖ）がアルギニン（Ｒ）へと変換された（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）成熟タンパク質の番号付け方式）。変異誘発実験はＡＴＧラボラトリーズ社（エデンプレーリー、ミネソタ州）により行なわれた。変異は、遺伝子断片のＰＣＲにより順に導入され、該断片の再構築もＰＣＲにより完成された。１０３番目のアルギニン（Ｒ）をスレオニン（Ｔ）に変換するためのプライマー：５’−ＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴＴ−３’（配列番号４７）及び
５’−ＴＧＣＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＣＧＧＡＡＴＧＧＴ−３’（配列番号４８）。
２９９番目のバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）に変換するためのプライマー：
５’−ＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＣＧＧＴ−３’（配列番号４９）及び
５’−ＣＴＴＴＧＣＣＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＧＡＣＡ−３’（配列番号５０）。
変異体はＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩを用いた制限酵素処理によりスクリーニングされ、シーケンスにより確認された。
チロシンフェノールリアーゼ（β−チロシナーゼ）の変異誘発：実施例１６Ｂ
チロシンフェノールリアーゼアミノ酸配列に２点の変異がなされた。これらの変異により、１００番目の部位にあるアルギニン（Ｒ）がスレオニン（Ｔ）へ、２８３番目の部位にあるバリン（Ｖ）がアルギニン（Ｒ）へと変換された（Ｃ．フロインディイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）成熟タンパク質配列において）。
Ｒ１００Ｔ変換用プライマーは以下の通り：
５’−ＡＧＧＧＧＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＡＴＣＧ−５’（配列番号５１）及び
５’−ＡＧＧＧＧＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＡＴＣＧ−３’（配列番号５２）。
Ｖ２８３Ｒ変換用プライマーは以下の通り：
５’−ＧＴＴＡＧＴＣＣＧＣＧＴＣＴＡＣＧＡＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡＴ−３’（配列番号５３）及び
５’−ＧＴＡＧＡＣＧＣＧＧＡＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５４）。
上記の方法が用いられ、クローンはＫｐｎＩ／ＳａｃＩ消化、及びＢｓｔＸＩ消化によりスクリーニングされた。配列は、ジデオキシ鎖停止シークエンス法により確認された。組換えタンパク質は、上記の野生型酵素用に記載された通りに生成された。
反応混合物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．３、２ｍＭのＭｇＣｌ2、２００ｍＭのＣ３炭素供給源、５ｍＭのα−ケトグルタレート、ナトリウム塩、０．０５ｍＭのピリドキサールホスフェート、酵素添加後に終体積を０．５ｍＬとするための脱気水、３ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．５、実施例７で調製された粗組換えＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ２５μｇ、実施例１で調製された粗Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）５００μｇ、及び６０ｍＭを超える濃度を可能とするための固体トリプトファン（飽和；反応中全てが溶解するわけではない）により構成された。反応系は、３０℃で攪拌と共に３０分間インキュベートされた。セリン、アラニン、及びアスパルテートが３−炭素供給源として供給された。アッセイは、β−脱離反応及びβ−リアーゼ反応を可能とする二次的ＰＬＰ酵素（精製済）（トリプトファナーゼ（ＴＮＡ）、トリプトファナーゼ二重変異体、β−チロシナーゼ（ＴＰＬ））を含む又は含まない状態で行なわれた。前記反応混合物のＬＣ／ＭＳ解析の結果を表１２に示す：
Figure 2008538924
アラニン及びセリンを３−炭素供給源として生成されたモナチンはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘走査解析により確認され、実施例９で生成されたモナチンの特性指摘と同一であった。試験された中でアラニンは最良の代替物であり、ＡｓｐＣ酵素によりアミノ基転移された。モナチンの生成量は、アミノ基転移二次活性を有するトリプトファナーゼの添加により増加した。セリンを炭素供給源として用いたモナチンの生成量については、添加されたトリプトファナーゼの量はアミノトランスフェラーゼと比較して５分の１の量に過ぎなかったが、トリプトファナーゼの添加により約２倍に増加した。ＡｓｐＣは単独で多少のβ−脱離作用が可能である。アスパルテートを用いた結果から、アスパルテートに対するトリプトファナーゼ活性は、従来β−チロシナーゼについて指摘されてきたように、同一の部位特異的変異誘発により増加しないことが示された。β−チロシナーゼ変異体は、モナチンの生成についてより高い活性を有するであろうことが予想される。
実施例１７
モナチンの化学合成
インドール−３−ピルビン酸へのアラニンの添加によりモナチンが生成されるが、この反応はグリニャール試薬又は有機リチウム試薬を用いて合成的に行なうことが可能である。
例えば、無水条件下において、カルボキシル基及びアミノ基が適切にブロックされた３−クロロ−アラニン又は３−ブロモ−アラニンにマグネシウムが添加される。次にインドール−３−ピルベート（適切にブロックされた）が添加され、結合した生成物が形成され、次に保護基の除去が起こってモナチンが形成される。特に有用な保護基としては、簡単に付加及び除去が可能なＴＨＰ（テトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。
実施例１８
モナチン、ＭＰ、トリプトファン及びグルタミン酸の検出
本実施例では、トリプトファン及びグルタミン酸と共に、モナチン、又はその前駆体である２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の存在の検出に用いる方法について記載する。また、モナチンの４種類の立体異性体の分離及び検出の方法についても記載する。
モナチン、ＭＰ、及びトリプトファンのＬＣ／ＭＳ解析
ウォーターズ９９６フォト−ダイオードアレイ（Ｗａｔｅｒｓ ９９６ Ｐｈｏｔｏ−Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ）（ＰＤＡ）吸光モニターを備えたウォーターズ２７９５液体クロマトグラフが該クロマトグラフとマイクロマスクアトロウルティマ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａ）三連四重極質量分析計を含むウォーターズ／マイクロマス（Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）装置を用いて生体外又は生体内の生化学的反応から得られたモナチン、ＭＰ、及び／又はトリプトファンの混合物の解析が行なわれた。エクステラ（Ｘｔｅｒｒａ）ＭＳ Ｃ8逆相クロマトグラフィーカラム、２．１ｍｍ×２５０ｍｍ、又はスペルコディスカヴァリー（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）Ｃ18逆相クロマトグラフィーカラム、２．１ｍｍ×１５０ｍｍを用いて室温又は４０℃にてＬＣ分離が行なわれた。前記ＬＣの移動相は、Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸含有水、及びＢ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸含有メタノールから構成された。
勾配溶離は、測定間に５分間の再平衡化時間を設け、５％Ｂから３５％Ｂ、０−４分で直線、３５％Ｂから６０％Ｂ、４−６．５分で直線、６０％Ｂから９０％Ｂ、６．５−７分で直線、９０％Ｂ、７−１１分でアイソクラチック、９０％Ｂから９５％Ｂ、１１−１２分で直線、９５％Ｂから５％Ｂ、１２−１３分で直線であった。流速は０．２５ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸光度は２００ｎｍから４００ｎｍでモニターされた。ＥＳＩ−ＭＳの全ての指標は、被検体のプロトン付加分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）の生成及び特徴的なフラグメントイオンの生産に基いて最適化され、選択された。
以下の機器パラメータがモナチンのＬＳ／ＭＳ解析に用いられた：キャピラリー：３．５ｋＶ；コーン：４０Ｖ；ヘックス（Ｈｅｘ）１：２０Ｖ；開口部：０Ｖ；ヘックス（Ｈｅｘ）２：０Ｖ；イオン源温度：１００℃；脱溶媒温度：３５Ｏ℃；脱溶媒ガス：５００Ｌ／ｈ；コーンガス：５０Ｌ／ｈ；低質量分解能（Ｑ１）：１５．０；高質量分解能（Ｑ１）：１５．０；イオンエネルギー：０．２；入口：５０Ｖ；衝突エネルギー：２；出口：５０Ｖ；低質量分解能（Ｑ２）：１５；高質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．５；増倍管：６５０。報告された質量／電荷比（ｍ／ｚ）及び分子量の不確定性は±０．０１％である。混合物中のα−ケトグルタレート型のモナチン（ＭＰ）及びモナチンの初期検出は、ｍ／ｚ １５０−４００の領域におけるＬＣ／ＭＳモニタリングで質量スペクトルの収集を行なうことにより行なわれた。プロトン付加された分子イオン用に選択されたイオンクロマトグラム（ＭＰ用に［Ｍ＋Ｈ］+＝２９２，モナチン用に［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３，トリプトファン用に［Ｍ＋Ｈ］+＝２０５）により、混合物中にあるこれら被検体の直接的な同定が可能となった。次なるモナチン及びＭＰの検出方法には、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法（下記参照）が用いられた。
モナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析
モナチンについて、以下の通りにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン実験を行なった。娘イオン解析には、質量分析計の第一の質量分析部（Ｑ１）から、アルゴンが導入されて該親イオンをフラグメント（娘）イオンへと化学的に解離する衝突室への目的の親イオンのトランスミッションを必要とする（例えば、モナチンについてｍ／ｚ＝２９３）。その後、これらのフラグメントイオンは第二の質量分析部（Ｑ２）で検出され、前記親イオンの構造決定を実証するのに用いることができる。トリプトファンは、ｍ／ｚ＝２０５のトランスミッション及びフラグメンテーションを介する同様の方法にて特性指摘され定量された。
以下の機器パラメータがモナチンのＬＳ／ＭＳ／ＭＳ解析に用いられた：
キャピラリー：３．５ｋＶ；コーン：４０Ｖ；ヘックス（Ｈｅｘ）１：２０Ｖ；開口部：０Ｖ；ヘックス（Ｈｅｘ）２：０Ｖ；イオン源温度：１００℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス：５００Ｌ／ｈ；コーンガス：５０Ｌ／ｈ； 低質量分解能（Ｑ１）：１３．０；高質量分解能（Ｑ１）：１３．０；イオンエネルギー：０．２；入口：−５Ｖ；衝突エネルギー：１４；出口：１Ｖ；低質量分解能（Ｑ２）：１５；高質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．５；増倍管：６５０。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳマルチプルリアクションモニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
モナチン検出の感度及び選択性の向上のため、ＭＲＭ測定法を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法が開発された。ＬＣ分離は、先の部分に記載される通りに行なわれた。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの機器パラメータは、Ｑ１及びＱ２の低及び高質量分解能を１２．０に設定して選択性を最大にした点を除いては、先の部分に記載され通りに設定された。５種類のモナチン特異的な親から娘へのトランジションを用いて、生体外及び生体内反応中のモナチンを特異的に検出した。前記トランジションは、２９３．１から１５８．３、２９３．１から１６８．２、２９３．１から２１１．２、２９３．１から２３０．２、及び２９３．１から２５７．２であった。
モナチン、トリプトファン、及びグルタミン酸（グルタメート）のハイスループット測定
上記に記載する装置及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳマルチプルリアクションモニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）用に記載されたＭＳパラメータを用いて、生体外又は生体内の反応から得られたモナチン、トリプトファン、及び／又はグルタミン酸の混合物のハイスループット分析（５分未満／サンプル）が行なわれた。ＬＣ分離は、０．２５％酢酸を含む４．６ｍｍ×５０ｍｍアドバンストセパレーションテクノロジーズキロバイオティック（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ）Ｔカラムを用いて常温で行なわれた。アイソクラチック溶離は５０％Ｂで０−５分であった。流速は０．６ｍＬ／分であった。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ装置用の全てのパラメータについては、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）実験用の被検体特異的フラグメントイオンの衝突誘導性生成と共に、トリプトファン及びモナチン及び内部基準である2Ｈ5−トリプトファン又は2Ｈ3−グルタミン酸のプロトン付加分子イオンの最適インソース生成に基いて最適化されて選択された（トリプトファンで２０４．７から１４６．４、2Ｈ5−トリプトファンで２０９．７から１５１．４、グルタミン酸で１４７．６から１０２．４、2Ｈ3−グルタミン酸で１５０．６から１０５．４、モナチン特異的なトランジションについては先の部分に列挙している）。
モナチンの正確な質量測定
アプライドバイオシステムズ−パーキンエルマーＱ−スター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｑ−Ｓｔａｒ）四重極／飛行時間複合型質量分析計を用いた高分解能ＭＳ分析が行なわれた。プロトン付加されたモナチンの測定質量は、内部質量較正標準としてトリプトファンを用いた。基本組成物Ｃ14Ｈ17Ｎ2Ｏ5に基いて計算されたプロトン付加されたモナチンの質量は２９３．１１３７である。実施例９に記載する生触媒性製法を用いて生成されたモナチンは、２９３．１１４４の測定質量を示した。これは１００万分の２（２ｐｐｍ）未満の質量測定誤差であり、酵素的に生成されたモナチンの基本組成についての決定的な証拠を提供するものである。
モナチンのキラルＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）測定
生体外及び生体内反応中のモナチンの立体異性体分布の決定は、１−フルオロ−２−４−ジニトロフェニル−５−Ｌ−アラニンアミド（ＦＤＡＡ）の誘導体化及びこれに続く逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭ測定により行なわれた。
ＦＤＡＡによるモナチンの誘導体化
５０μＬのサンプル又はスタンダードに、２００μＬの１％ＦＤＡＡアセトン溶液が添加された。４０μＬの１．０Ｍ炭酸水素ナトリウムが添加され、該混合物は、時折の攪拌と共に４０℃で１時間インキュベートされた。該サンプルは、取り除かれ、冷却され、そして２０μＬの２．０ＭのＨＣｌで中和された（緩衝化された生物学的混合物を効果的に中和するには、より多くのＨＣｌを要するであろう）。脱気完了後、サンプルはＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる解析のための準備が整った。
生体外及び生体内反応中のモナチンの立体異性体分布の決定のためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳマルチプルリアクションモニタリング
先の部分に記載したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置を用いた解析を行なった。モナチンの４種類の立体異性体全て（特にＦＤＡＡ−モナチン）を分離可能なＬＣ分離が、フェノメネックスルナ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ）（５μｍ）Ｃ１８逆相クロマトグラフィーカラムを用いて４０℃にて行なわれた。ＬＣ移動相は、Ａ）０．０５％（質量／体積）酢酸アンモニウム含有水及びＢ）アセトニトリルから構成された。勾配溶離は、測定間に１６分間の再平衡化時間を設け、２％Ｂから３４％Ｂ、０−３３分で直線、３４％Ｂから９０％Ｂ、３３−３４分で直線、９０％Ｂ、３４−４４分でアイソクラチック、９０％Ｂから２％Ｂ、４４−４６分で直線であった。流速は０．２５ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸光度は２００ｎｍから４００ｎｍでモニターされた。ＥＳＩ−ＭＳの全ての指標は、ＦＤＡＡ−モナチンのプロトン付加分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）の生成及び特徴的なフラグメントイオンの生産に基いて最適化され、選択された。
モナチンの陰イオンＥＳＩ／ＭＳモードでのＬＣ／ＭＳ解析には、以下の機器パラメータが用いられた：キャピラリー：２．０ｋＶ；コーン：２５Ｖ；ヘックス（Ｈｅｘ）１：１０Ｖ；開口部：０Ｖ；ヘックス（Ｈｅｘ）２：０Ｖ；イオン源温度：１００℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス：５００Ｌ／ｈ；コーンガス：５０Ｌ／ｈ；低質量分解能（Ｑ１）：１２．０；高質量分解能（Ｑ１）：１２．０；イオンエネルギー：０．２；入口：−５Ｖ；衝突エネルギー：２０；出口：１Ｖ；低質量分解能（Ｑ２）：１２；高質量分解能（Ｑ２）：１２；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．０；増倍管：６５０。３種類のＦＤＡＡ−モナチン特異的な親から娘へのトランジションを用いて生体外及び生体内反応中のＦＤＡＡ−モナチンが特異的に検出された。該トランジションは、５４３．６から２６８．２、５４３．６から４９９．２、及び５４３．６から５２５．２である。ＦＤＡＡ−モナチン立体異性体の同定は、精製モナチン立体異性体に対するクロマトグラフィーの保持時間及び質量スペクトルデータに基く。
グルタメートを含むアミノ酸の液体クロマトグラフィー−ポストカラム蛍光検出
ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２６９０ ＬＣ装置又はウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４７４走査性蛍光検出計を備えた同等物、及びウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ポストカラム反応モジュールにて、生体外及び生体内反応中のグルタミン酸測定のためにポストカラム蛍光検出を備えた液体クロマトグラフィーが行なわれた。ＬＣ分離は、６０℃にて、相互作用−ナトリウム（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−Ｓｏｄｉｕｍ）が注入されたイオン交換カラムにて行なわれた。移動相Ａは、ピッカリングＮａ ３２８（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ Ｎａ ３２８）バッファー（ピッカリングラボラトリー社； マウンテンビュー、カリフォルニア州）であった。移動相ＢはピッカリングＮａ ７４０（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ Ｎａ ７４０）バッファーであった。勾配溶離は、測定間に２０分間の再平衡化時間を設け、０％Ｂから１００％Ｂ、０−２分、１００％Ｂ、２０−３０分でアイソクラチック、１００％Ｂから０％Ｂ、３０−３１分で直線であった。前記移動相の流速は、０．５ｍＬ／分であった。前記ＯＰＡポストカラム誘導体化溶液の流速は、０．５ｍＬ／分であった。蛍光検出計の設定は励起波長が３３８ｎｍで放出波長が４２５ｎｍであった。該分析の内部標準としてノルロイシンが用いられた。アミノ酸の同定は、精製された標準物についてのクロマトグラフィーの保持時間に基づいた。
実施例１９
細菌中におけるモナチンの生成
本実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内におけるモナチンの生成に用いた方法について記載する。当業者であれば、同様の方法を用いて他の細菌細胞内でモナチンを生成できることを把握するであろう。加えて、モナチンの生成経路中の他の遺伝子を含むベクター（図２）も使用できる。
ｔｒｐ−１＋グルコース培地、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内でのトリプトファンの生成の増大に用いた最小培地（Ｚｅｍａｎら、Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：２００−４、１９９０）が以下のように調製された。７００ｍＬのナノ精製水に以下の試薬が添加された：２ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１３．６ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．２ｇのＭｇＳＯ4＊７Ｈ2０、０．０１ｇのＣａＣｌ2＊２Ｈ2０、及び０．５ｍｇのＦｅＳＯ4＊７Ｈ2０。ｐＨが７．０に調整され、体積が８５０ｍＬまで増加され、該培地はオートクレーブされた。個別に５０％グルコース溶液が調製され、フィルター滅菌された。前記基礎培地（８５０ｍＬ）に４０ｍＬが加えられ、終体積を１Ｌとした。
ｐＨ７の０．１Ｍのリン酸ナトリウムにて１０ｇ／ＬのＬ−トリプトファン溶液が調製され、フィルター滅菌された。以下に記載するように、培養には典型的に１０分の１の体積が加えられた。１０％ピルビン酸ナトリウム溶液も調製され、フィルター滅菌された。培養１Ｌに対し、典型的に１０ｍＬの分量が用いられた。アンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）、カナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）及びＩＰＴＧ（８４０ｍＭ）のストックが調製され、フィルター滅菌され、使用前まで−２０℃で保存された。ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）（ポリオキシエチレン２０−ソルビタンモノラウレート）が終濃度０．２％（体積／体積）で使用された。アンピシリンは、非致死的濃度で、典型的には終濃度１−１０μｇ／ｍＬで用いられた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）：：Ｃテストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ｐｒｏＡ／ｐＥＴ ３０ Ｘａ／ＬＩＣ（実施例７に記載）の新鮮なプレートが５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地中、３０℃にて増殖された。一晩の培養（５ｍＬ）は、単一コロニーから播種され、カナマイシンを含むＬＢ培地中で３０℃で増殖された。Ｔｒｐ−１＋グルコース倍地中での誘導には、典型的に１ないし５０個の種菌が用いられた。新鮮な抗生物質が終濃度５０ｍｇ／Ｌで添加された。振とうフラスコの系は誘導前まで３７℃にて増殖された。
細胞は、０．３５−０．８のＯＤ600が得られるまで１時間毎にサンプル採取された。その後、細胞は０．１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導され、温度が３４℃まで下げられた。サンプル（１ｍＬ）は、誘導（零時点）前に回収され５０００ｘｇにて遠心された。上澄は、ＬＣ／ＭＳ解析用に−２０℃で凍結された。誘導から４時間後、さらに１ｍＬのサンプルが回収され、遠心により細胞ペレットからブロスが分離された。上記の通り、トリプトファン、ピルビン酸ナトリウム、アンピシリン及びツイーンが添加された。
前記細胞は誘導後４８時間増殖され、更に１ｍＬがサンプル採取され上記の通りに調製された。４８時間時点にて、更なる一定分量のトリプトファン及びピルベートが添加された。全ての培養体積は約７０時間の増殖（誘導後）の後に、４℃にて３５００ｒｐｍで２０分間遠心された。上澄はデカントされてブロスと細胞の両方が−８０℃で凍結された。ブロスのフラクションが濾過され、ＬＣ／ＭＳにより分析された。［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３ピークの高さと領域が実施例１８に記載するとおりにモニターされた。該培地のバックグラウンドレベルは差し引かれた。データは、また、該培養の６００ｎｍにおける吸光度で割った［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３ピークの高さをプロットすることにより、細胞増殖について標準化された。
誘導時ではなく、むしろ誘導から４時間後にピルベート、アンピシリン、及びツイーンを添加した場合に、より高濃度のモナチンが生成された。ＰＬＰ、更なるホスフェート、又は更なるＭｇＣｌ2のような他の添加物はモナチンの生成量を増加しなかった。インドール−３−ピルベートの代わりにトリプトファンを用い、播種時又は誘導時ではなく誘導後にトリプトファンが添加された場合に、より高力価のモナチンが得られた。誘導前、及び誘導から４時間後（基質の添加時点）においては、発酵ブロス又は細胞抽出物中には概して検出可能な濃度のモナチンが存在していなかった。トリプトファン及びピルベートが添加されていない培養と共に、ｐＥＴ３０ａベクターのみを有する細胞を用いてネガティブコントロールが行なわれた。親ＭＳ走査により、（ｍ＋１）／ｚ＝２９３を有する化合物はより大きな分子に由来するものではなく、娘走査（実施例１８にて実施されたように）は、生体外で作られたモナチンに類似するものであったことが示された。
終濃度が０、０．２％（体積／体積）、及び０．６％のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ツイーンの効果が調べられた。０．２％ツイーンにおいて、振とうフラスコでのモナチン生成量が最大となった。アンピシリン濃度を０から１０μｇ／ｍＬの間で変化させた。細胞ブロス中のモナチン量は、０から１μｇ／ｍＬの間で急速に増加し（２．５倍）、アンピシリン濃度が１から１０μｇ／ｍＬに増加した場合に１．３倍に増加した。
典型的な結果を示す経時的実験を図１０に示す。細胞ブロスに分泌されたモナチン量は、数値を細胞の増殖について標準化した場合であっても増加していた。トリプトファンのモル吸光係数を用い、ブロス中のモナチン量は１０μｇ／ｍＬ未満であると評価された。同様の実験が、ｐｒｏＡインサートを有しないベクターを含む細胞を用いて繰り返された。多くの数値は負であり、これらの培養におけるｍ／ｚ＝２９３のピークの高さは培地単体におけるよりも低いことが示された（図１０）。トリプトファン及びピルベートがない場合には、数値は一貫して低く、モナチン生成がアルドール酵素により触媒される酵素反応の結果であることが示された。
細菌細胞中でのモナチンの生体内生成は、８００ｍＬ振とうフラスコ実験及び発酵槽にて繰り返された。２５０ｍＬのモナチン（無細胞ブロス中の）サンプルが陰イオン交換クロマトグラフィー及び調製用逆相液体クロマトグラフィーにより精製された。このサンプルは蒸発され、高分解能質量分析（実施例９に記載）に処された。該高分解能ＭＳにより、生成されている代謝物がモナチンであることが示された。
生体外でのアッセイにより、アミノトランスフェラーゼはアルドラーゼよりも高濃度で存在する必要があることが示され（実施例９参照）、従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼがアルドラーゼ遺伝子と組み合わせて過剰発現され、モナチン生成量が増加された。以下のように、ａｓｐＣ／ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣを有するオペロンにＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ｐｒｏＡを導入するプライマーが設計された：５’プライマー：ＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＴ（配列番号６７）及び３’プライマー：ＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣ（配列番号６８）。クローニング用に、５’プライマーにはＢａｍＨＩ部位が含まれ、３’プライマーにはＳａｌＩ部位が含まれる。実施例７に記載するようにＰＣＲが行なわれ、ゲル精製された。ＰＣＲ産物と同様に、ａｓｐＣ／ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣ構築物はＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化された。消化物は、キアゲンス・ピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて精製された。前記ｐｒｏＡのＰＣＲ産物は、ロッシュラピッドＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（インディアナポリス、インディアナ州）を用いて製造元の指示に従って前記ベクターにライゲーションされた。実施例１に記載されるように、ノバブルー・シングルス（Ｎｏｖａｂｌｕｅｓ Ｓｉｎｇｌｅｓ）（ノバジェン社）を用いた化学的形質転換が行なわれた。コロニーは５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で増殖され、プラスミドＤＮＡがキアゲンスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて精製された。クローンは、制限酵素処理解析によりスクリーニングされ、配列がシークライト（Ｓｅｑｗｒｉｔｅ）（ヒューストン、テキサス州）により確認された。構築物は、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ノバジェン社）にサブクローニングされた。ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣ構築物もＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換された。
上記の標準条件下におけるＢＬＲ（ＤＥ３）振とうフラスコのサンプルの初期比較から、第二の遺伝子（ａｓｐＣ）の添加が７倍もモナチンの生成量を向上させることが示された。増殖を速めるため、ＢＬ２１（ＤＥ３）−由来の宿主株が用いられた。上記Ｔｒｐ−１培地中で前記ｐｒｏＡクローン及び前記２つの遺伝子のオペロンクローンが誘導され、ｐＬｙｓＳ宿主にも培地にクロラムフェニコール（３４ｍｇ／ｍＬ）が添加された。０．２％のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）及び１ｍｇ／Ｌのアンピシリンの添加有り又は無しで振とうフラスコ実験が行なわれた。生体外で生成され精製されたモナチンをスタンダードとして用いて、ブロス中のモナチン量が計算された。実施例１８に記載するようにＳＲＭ解析が行なわれた。細胞は、増殖の零時点、４時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目及び９６時間目にサンプル採取された。
培養ブロス中の最大生成量について、結果が表１３に示されている。殆どの例において、前記２つの遺伝子構築物が、ｐｒｏＡ構築物単体よりも高い数値を示している。漏出性の細胞外皮を有しているはずのｐＬｙｓＳ株では、これらの株は該して比較的遅い速度で増殖するにもかかわらず、最も高濃度のモナチンが分泌された。ツイーン及びアンピシリンの添加は有益であった。
Figure 2008538924
実施例２０
酵母内でのモナチンの生成
本実施例は、真核細胞内におけるモナチンの生成に用いる方法について記載する。当業者であれば、目的のいかなる細胞内においても類似の方法を用いてモナチンを生成できることを把握するであろう。更に、本実施例に記載される遺伝子に加えて、又は代えて他の遺伝子（例えば、図２に列挙される遺伝子）を用いることもできる。
ｐＥＳＣイーストエピトープタギングベクターシステム（ｐＥＳＣ Ｙｅａｓｔ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｓｐＣ及びＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ｐｒｏＡ遺伝子がサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へとクローニングされ発現された。ｐＥＳＣベクターには、逆鎖にＧＡＬ１及びＧＡＬ１０の両プロモーターが２つの個別のマルチプルクローニングサイトと共に含まれており、同時に２種類の遺伝子の発現を可能とする。ｐＥＳＣ−Ｈｉｓベクターには、宿主（ＹＰＨ５００）内でのヒスチジン栄養要求性の補完のためのＨｉｓ３遺伝子も含まれている。ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターは、グルコースにより抑制され、ガラクトースにより誘起される；酵母内での最適な発現のためにコザック配列を用いる。ｐＥＳＣプラスミドはシャトルベクターであり、初期の構築が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で行なわれることを可能とする（選択用にｂｌａ遺伝子を有する）；しかしながら、そのマルチプルクローニングサイトには細菌性リボソーム結合部位が存在しない。
ｐＥＳＣ−Ｈｉｓへのクローニング用に以下のプライマーが設計された（制限酵素部位に下線が引かれ、コザック配列は太字である）：ａｓｐＣ（ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ）、ＧＡＬ１；
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧ−３’（配列番号６９）及び
５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧ−３’（配列番号７０）。
ｐｒｏＡ（ＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔｌ）、ＧＡＬ１０：
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＧＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧＴ−３’（配列番号７１）及び
５’−ＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣＣ−３’（配列番号７２）。
コザック配列の導入により、両成熟タンパク質の第二コドンは芳香族アミノ酸からバリンへと変更された。目的の遺伝子は、実施例１及び７に記載されるクローンからのｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣミニプレップＤＮＡを鋳型として用いて増幅された。エッペンドルフマスターサイクラーグラディエントサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）及び５０μＬの反応量に以下のプロトコルを用いてＰＣＲが行なわれた：１．０μＬの鋳型、１．０μＭの各プライマー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕのエキスパンドハイファイデリティーポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ロッシュ社、インディアナポリス、インディアナ州）、及びＭｇ含有の１Ｘエキスパンド（商標）（ＥｘｐａｎｄTM）バッファー。使用されたサーマルサイクラープログラムは、９４℃で５分間のホットスタート、及びこれに続く以下のステップの２９回の繰返しから構成された：９４℃で３０秒間、５０℃で１分４５秒間、及び７２℃で２分１５秒間。前記２９回の繰返しの後、サンプルは７２℃で１０分間維持され、その後４℃にて保存された。ＰＣＲ産物は１％ＴＡＥ−アガロースゲルでの分離及びこれに続くキアクイックゲルエクストラクションキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いた回収により精製された。
前記ｐＥＳＣ−ＨｉｓベクターＤＮＡ（２．７μｇ）は、上記と同様にＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化され、ゲル精製された。前記ａｓｐＣのＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化され、キアクイックＰＣＲピュリフィケーションカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ）で精製された。ライゲーションは、ロッシュラピッドＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて製造元のプロトコルに従って行なわれた。脱塩されたライゲーション体は、０．２ｃｍバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）ディスポーザブルキュベット内で、パルスコントローラープラス（ｐｕｌｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ｐｌｕｓ）を備えたバイオラッドジーンパルサーＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ）を用いて、製造元の指示に従って、４０μｌのエレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（インビトロジェン社）にエレクトロポレーションされた。１ｍＬのＳＯＣ培地中で１時間回復させた後、形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地上に播種された。クローン用のプラスミドＤＮＡの調製は、キアプレップスピンミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を用いて行われた。プラスミドＤＮＡは制限酵素処理によりスクリーニングされ、ベクター用に設計されたプライマーを用いて確認のためにシーケンスされた（シークライト（Ｓｅｑｗｒｉｔｅ））。
前記ａｓｐＣ／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓクローンは、ｐｒｏＡのＰＣＲ産物と同様にＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化された。ＤＮＡは上記と同様に精製され、上記と同様にライゲーションされた。前記２種類の遺伝子構築物はＤＨ１０Ｂへ形質転換され、制限酵素処理及びＤＮＡシーケンシングによりスクリーニングされた。
前記構築物は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＰＨ５００株にＳ．ｃ．イージーコンプ（商標）トランスフォーメーションキット（Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐTM Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（インビトロジェン社）を用いて形質転換された。形質転換反応物は、２％のグルコースを含むＳＣ−Ｈｉｓ最小培地（インビトロジェン社ｐＹＥＳ２マニュアル）へ播種された。個々の酵母コロニーは、ｐｒｏＡ及びａｓｐＣ遺伝子の存在について、上記のＰＣＲプライマーを用いたコロニーＰＣＲ法によりスクリーニングされた。ペレット化された細胞（２μｌ）は、１μｌのザイモリアーゼを含む２０μＬのＹ−ライシスバッファー（Ｙ−Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（ザイモリサーチ社）に懸濁され、３７℃で１０分間加熱された。この懸濁液のうち４μＬが、続いて上記の反応混合物及びプログラムを用いる５０μＬのＰＣＲ反応に用いられた。
５ｍＬの培養が、ＳＣ−Ｈｉｓ＋グルコース上で３０℃で２２５ｒｐｍにて一晩増殖された。ガラクトースによる誘導前の遅延期を最短にするため、細胞は、徐々にラフィノース上での増殖に調整されていった。約１２時間の増殖の後、６００ｎｍでの吸光度が測定され、適切な体積の細胞が遠心により沈殿され、新鮮なＳＣ−Ｈｉｓ培地中で０．４のＯＤを示すように再懸濁された。以下の炭素供給源が順に用いられた：１％ラフィノース＋１％グルコース、０．５％グルコース＋１．５％ラフィノース、２％ラフィノース、及び最後に誘導用に１％ラフィノース＋２％ガラクトース。
誘導培地中での約１６時間の増殖の後、５０ｍＬの培養は２つの２５ｍＬの培養に分けられ、該２つのうち一方だけに下記のものが添加された：（終濃度）１ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、ｐＨ７．１で５ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＭｇＣｌ2。非誘導培地から、及びモナチン経路の基質添加前の１６時間の培養からのブロスのサンプル及び細胞ペレットは、ネガティブコントロールとして保存された。更に、機能的ａｓｐＣ遺伝子（及び切断されたｐｒｏＡ遺伝子）のみを含む構築物が、別のネガティブコントロールとして用いられた。前記細胞は、誘導から合計で６９時間増殖させられた。時折、前記酵母細胞は比較的低いＯＤで誘導され、トリプトファン及びピルベートの添加前４時間のみ増殖された。しかしながら、これらモナチンの基質は、増殖を阻害することが分かり、比較的高いＯＤでの添加がより効果的であった。
前記培養からの細胞ペレットは、５ｍＬのイーストバスター（商標）（ＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒTM）＋１グラム（湿重量）の細胞中に５０μｌのＴＨＰ（ノバジェン社）を用い、並びに先の実施例に記載するようにプロテアーゼ阻害剤及びビンゾナーゼヌクレアーゼの添加と共に製造元プロトコルに従って溶解された。培養ブロス及び細胞抽出物は濾過され、実施例１８に記載されるようにＳＲＭにより分析された。この方法を用いて、前記ブロスサンプル中にはモナチンは検出されず、これらの条件下では細胞がモナチンを分泌できないことが示された。これらの条件下ではプロトン輸送力が不十分な可能性があり、又はアミノ酸トランスポーター全般がトリプトファンで飽和している可能性もある。タンパク質発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてその変化が検出可能なレベルにはなかった。
モナチンは、２種類の機能的遺伝子を持つ培養の細胞抽出物中で、培地にトリプトファン及びピルベートが添加された場合に一時的に検出可能であった（約６０ｎｇ／ｍＬ）。いずれのネガティブコントロールの細胞抽出物中にもモナチンは検出されなかった。実施例９に記載される最適化されたアッセイ法を用い、４．４ｍｇ／ｍＬの総タンパク質量（典型的に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞抽出物に用いられた量の約２倍）を用いたモナチンの生体外アッセイが２つの系で重複して行なわれた。その他のアッセイも、３２μｇ／ｍＬのＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ又は４００μｇ／ｍＬのＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼを添加して行なわれ、該細胞抽出物中でどの酵素が制限しているのかを測定した。ネガティブコントロールが、酵素の添加なし、又はＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼのみの添加により行なわれた（アルドール縮合は酵素無しでも一定の範囲内で起こりうる）。ポジティブコントロールは、１６μｇ／ｍＬのアルドラーゼ及び４００μｇ／ｍＬのアミノトランスフェラーゼを用いた部分的に純粋な酵素（３０−４０％）により行なわれた。
生体外での結果は、ＳＲＭにより分析された。細胞抽出物の分析から、トリプトファンは、誘導後に培地に添加された場合に効果的に細胞内に輸送されており、追加的にトリプトファンを添加しなかった場合よりも２桁高いトリプトファン濃度を生じていたことが示された。生体外でのモナチン分析の結果を表１４に示す（数値はｎｇ／ｍＬで示される）。
Figure 2008538924
増殖培地に基質が添加された又は添加されていない全長の２種類の遺伝子の細胞抽出物から肯定的な結果が得られた。ポジティブコントロールとの比較において、これらの結果からは、前記酵素は酵母の総タンパク質量の１％に近い濃度で発現されたことが示されている。ａｓｐＣ構築物（切断されたｐｒｏＡと共に）の細胞抽出物をアルドラーゼでアッセイした場合のモナチン生成量は、細胞抽出物を単体でアッセイした場合よりも有意に多く、組換えＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼは、酵母の総タンパク質量の約１−２％を占めることが示されている。誘導されなかった培養の細胞抽出物は、細胞中の天然アミノトランスフェラーゼの存在により、アルドラーゼでアッセイした場合には低い活性量を有していた。ＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼでアッセイした場合には、誘導されなかった細胞の抽出物の活性は、ＡｓｐＣを含むネガティブコントロールにより生成されたモナチンの量（約２００ｎｇ／ｍｌ）まで増加した。これに対し、前記２種類の遺伝子構築物の細胞抽出物をアッセイした場合に観測された活性は、アルドラーゼが添加された場合よりもアミノトランスフェラーゼが補充された場合により一層増加した。両遺伝子は同じレベルで発現しているはずであるから、上記は、アルドラーゼの濃度よりもアミノトランスフェラーゼの濃度が高い場合にモナチン生成量が最大となることを示しており、実施例９に示す結果と一致する。
ピルベートとトリプトファンの添加は、細胞増殖を阻害するだけでなく、明らかにタンパク質発現も阻害している。ｐＥＳＣ−Ｔｒｐプラスミドの添加により、ＹＰＨ５００宿主細胞のトリプトファン栄養要求を補正し、増殖、発現及び分泌へより少ない作用を有するトリプトファンの供給方法を提供することができる。
実施例２１
関連反応を用いた酵素的過程の改善
理論上は、副反応又は基質若しくは中間体の分解が生じない場合には、図１に例示される酵素反応から形成される生成物の最大量は、各反応の平衡定数並びにトリプトファン及びピルベートの濃度に正比例することになる。トリプトファンは可溶性の高い基質ではなく、２００ｍＭより高いピルベート濃度は収量にマイナスの効果を与えるものと思われる（実施例９参照）。
理想的には、分離のコストを下げるため、モナチンの濃度は基質に関して最大化される。モナチンが反応混合物から取り除かれ、逆反応が起こるのを防ぐような物理的分離法を行なうこともできる。原料及び触媒はその後再生することができる。モナチンの、種々の試薬及び中間体との、大きさ、電荷及び疎水性における類似性により、モナチンに対する高い親和性（アフィニティークロマトグラフィー技術のような）がない限り物理的分離は困難なものとなるであろう。しかしながら、モナチンの反応は、系の平衡がモナチン生成に傾くような他の反応と連結させることが可能である。以下は、トリプトファン又はインドール−３−ピルベートから得られるモナチンの収量を向上させる方法の例である。
オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３）を用いた関連反応
図１１は、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの添加でＭＰからモナチンへの変換中に形成される副生成物のオキサロアセテートが取り除かれるモナチンの形成経路の例示である。トリプトファンオキシダーゼ及びカタラーゼを用いて反応をインドール−３−ピルベート生成の方向へ至らしめる。カタラーゼは、過酸化水素が逆方向での反応、又は酵素若しくは中間体の損傷に利用されないように過剰に用いられる。酸素は、上記カタラーゼ反応中に再生される。これに代わり、インドール−３−ピルベートを初期の基質として用いることができる。
上記経路で、アスパルテートは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって触媒される反応におけるＭＰのアミノ化のためのアミノ基のドナーとして用いられる。理論上は、ＭＰ／モナチン反応と比較してトリプトファン／インドール−３−ピルベート反応に対して低い特異性を有するアミノトランスフェラーゼは、アスパルテートがアミノドナーとして作用せず、インドール−３−ピルベートを再アミノ化しないように用いられる。オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（シュードモナス種由来）を添加してオキサロアセテートをピルベート及び二酸化炭素に変換することができる。ＣＯ2は揮発性であるため、酵素を用いた反応に利用することができず、従って、逆反応を減少させる又は阻止するものである。上記工程で生成されるピルベートも、前記アルドール縮合反応において基質として機能してＭＰを形成することができる。その他のデカルボキシラーゼ酵素を用いることもできる；アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アキフェックス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アルケオグロバス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アゾトバクテル・ヴィネランディイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ボルデテッラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種の複数種類、カンピロバクテル・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クロロビウム・テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロロフレクサス・オーランチアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、フソバクテリウム・ヌレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、クレブジエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジョネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マグネトコッカスＭＣ−Ｉ（Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ＭＣ−Ｉ）、マンヘイミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、メチロバシラス・フラゲラタスＫＴ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ ＫＴ）、パストレラ・マルトシダＰｍ７０（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｐｍ７０）、ペトロトガ・ミオテルマ（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｉｏｔｈｅｒｍａ）、ポルフィロモナス・ギンギヴァリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種の複数種類、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の複数種類、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の複数種類、ステプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の複数種類、テルモクロマチウム・テピダム（Ｔｈｅｒｍｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種の複数種類にホモログが存在することが知られている。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＨＩＳ6−タグ付アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＨＩＳ6−タグ付チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）、大形リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）からのＨＩS6−タグ付広範囲の基質に対するアミノトランスフェラーゼ（ＢＳＡＴ）、及び実施例１に記載されるように２種類の市販のブタ由来グルタミン酸−オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼと共にトリプトファンアミノトランスフェラーゼのアッセイが行なわれた。オキサロアセテート及びα−ケトグルタレートの両方はアミノアクセプターとして試験された。トリプトファンを用いた場合の活性に対するモナチンを用いた場合の活性（実施例１５）の比率が比較され、どの酵素がモナチンアミノトランスフェラーゼ反応に対して最も高い特異性を有するのかが決定された。これらの結果から、トリプトファン反応に対するモナチン反応に最も高い特異性を有する酵素はブタＩＩ−Ａ型グルタミン酸−オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼ、ＧＯＡＴ（シグマ社＃Ｇ７００５）であることが示された。上記特異性は、いずれのアミノアクセプターを用いたかについて無関係であった。従って、上記酵素は、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを用いた関連反応で使用された。
インドール−３−ピルベートから開始する典型的な反応には、ｐＨ７．３で５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、６ｍＭのインドール−３−ピルベート、６ｍＭのピルビン酸ナトリウム、６ｍＭのアスパルテート、０．０５ｍＭのＰＬＰ、３ｍＭのリン酸カリウム、３ｍＭのＭｇＣｌ2、２５μｇ／ｍＬのアミノトランスフェラーゼ、５０μｇ／ｍＬのＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ、及び３単位／ｍＬのデカルボキシラーゼ（シグマ社＃Ｏ４８７８）が含まれていた（終濃度）。反応混合物は２６℃で１時間インキュベートされた。場合によっては、デカルボキシラーゼが除外されるか、又はアスパルテートがα−ケトグルタレートにより代替された（ネガティブコントロールとして）。上記のアミノトランスフェラーゼ酵素も、前記ＧＯＡＴの代わりに試験され初期の特異性の実験が確認された。サンプルは、実施例１８に記載されるように濾過されＬＣ／ＭＳにより分析された。結果から、ＧＯＡＴ酵素は、副生成物として最少量のトリプトファンを生成すると共に、タンパク質１ミリグラムについて最大量のモナチンを生成することが示された。更に、デカルボキシラーゼ酵素が添加された場合には、生成物の形成において２−３倍の増加が見られた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣ酵素も、他のアミノトランスフェラーゼと比較してより多くのモナチンを生成した。
モナチン生成量は以下により増大した：１）インドール−ピルベート、ピルベート、及びアスパルテートを定期的に２ｍＭ添加すること（３０分毎ないし１時間毎）、２）無酸素性の環境中、又は脱気したバッファーを用いて反応を行なうこと３）反応を数時間進めさせること、及び４）あまり多く凍結融解を行なっておらず、新たに調製されたデカルボキシラーゼを用いること。デカルボキシラーゼは１２ｍＭよりも高濃度のピルベートにより阻害された。４ｍＭより高濃度のインドール−３−ピルベートでは、インドール−３−ピルベートを用いた副反応が促進された。反応で使用されるインドール−３−ピルベートの量は、アルドラーゼの量も増加される場合には増加することができる。高濃度のホスフェート（５０ｍＭ）及びアスパルテート（５０ｍＭ）は、カルボキシラーゼ酵素反応に対して阻害的であった。添加されるデカルボキシラーゼ酵素の量は、１時間の反応におけるモナチンの生成量を減少せしめることなく０．５Ｕ／ｍＬまで低下させることができる。モナチンの生成量は、温度を２６℃から３０℃へ、３０℃から３７℃へ上昇させた場合に増加した。しかしながら、３７℃においては、インドール−３−ピルベートの副反応も促進された。モナチンの生成量は、ｐＨを７から７．３へ上昇させるに伴って増加し、ｐＨ７．３−８．３において比較的安定であった。
トリプトファンから開始される典型的な反応には、ｐＨ７．３で５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、２０ｍＭのトリプトファン、６ｍＭのアスパルテート、６ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭのＰＬＰ、３ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭのＭｇＣｌ2、２５μｇ／ｍＬのアミノトランスフェラーゼ、５０μｇ／ｍＬのＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ、４単位／ｍＬのデカルボキシラーゼ、５−２００ｍＵ／ｍＬのＬ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ社＃Ａ−２８０５）、１６８Ｕ／ｍＬのカタラーゼ（シグマ社＃Ｃ−３５１５）、及び０．００８ｍｇのＦＡＤが含まれていた（終濃度）。反応は３０℃で３０分間行なわれた。デカルボキシラーゼの添加により改善が観察された。５０ｍＵ／ｍＬのオキシダーゼが用いられた場合に最大量のモナチンが生成された。改善は、インドール−３−ピルベートが基質として用いられた場合に観察されたものと類似していた。更に、モナチンの生成量は、１）トリプトファン濃度が低い場合（即ち、トリプトファン濃度がアミノトランスフェラーゼ酵素のＫmより低く、従って、該アミノトランスフェラーゼの活性部位において比較的ＭＰとの競合性が低い）、及び２）アルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼに対するオキシダーゼの比率が、インドール−３−ピルベートが堆積できないようなレベルで維持されている場合に増加した。
インドール−３−ピルベート又はトリプトファンのいずれから開始する場合であっても、１−２時間のインキュベーション時間でのアッセイにおけるモナチンの生成量は、酵素の比率を同一に保ったまま、全ての酵素を２−４倍量使用した場合に増加した。いずれの基質を用いた場合であっても約１ｍｇ／ｍＬのモナチン濃度は達成された。インドール−ピルベートから開始された場合には、トリプトファンの生成量は、概して生成物量の２０％未満となり、関連反応の使用による有益性が示された。更なる最適化並びに中間体の濃度及び副反応の制御により、生産性及び収量は更に改善することができる。
オキサロアセテートの代わりにα−ケトグルタレートを２−オキソグルタレートデカルボキシラーゼ酵素と共にアミノアクセプターとして用いることができる（ＥＣ４．１．１．７１）。この場合、コハク酸セミアルデヒド及び二酸化炭素が作られる。この反応スキームからは、逆反応が生じることを防ぐことが予想されるが、副生成物としてピルベートが提供されるという利点があるわけではない。この酵素をコードする多数の遺伝子配列が発表されている。
リジンεアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．３６）を用いた関連反応
リジンεアミノトランスフェラーゼ（Ｌ−リジン６−トランスアミナーゼ）は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、フラヴォバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンディダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む種々の生物において発見されている。生物により、いくつかのβラクタム抗体の生成の第一工程として利用されている（Ｒｉｕｓ及びＤｅｍａｉｎ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７：９５−１００，１９９７）。この酵素は、α−ケトグルタレートがアミノアクセプターである場合にリジンのＣ−６のＰＬＰ−媒介性アミノ基転移によりリジンをＬ−２−アミノアジペート６−セミアルデヒド（アリシン）へと変換する。アリシンは不安定であり、自然に分子内脱水を起こし、環状分子である１−ピペリデイン６−カルボキシレートを形成する。これによりあらゆる逆反応の発生が効果的に阻害される。図１２に反応スキームが描かれている。これに代わり、リジンピルビン酸６−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．７１）を用いることも可能である。
１ｍＬの典型的な反応には、以下のものが含まれる：ｐＨ７．３で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭのインドール−３−ピルベート、０．０５ｍＭのＰＬＰ、ｐＨ８で６ｍＭのリン酸カリウム、２−５０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのリジン、１００μｇのアミノトランスフェラーゼ（リジンεアミノトランスフェラーゼＬＡＴ−１０１、バイオカタリティクス社、パサディナ、カリフォルニア州）、及び２００μｇのＣ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ。モナチンの生成量は、ピルベート濃度の上昇に伴って増加した。これらの反応条件（５０ｍＭのピルベートで）を用いての最大量は、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを用いた関連反応で観察された量の１０分の１未満であった（約０．１ｍｇ／ｍＬ）。
前記反応混合物のＬＣ／ＭＳ分析において、［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３のピークはモナチンとして予想される時点で溶出し、質量スペクトルには他の酵素的製法で観察されたのと同じフラグメントが複数含まれていた。適切な質量電荷比（２９３）を持つ第二のピークは、実施例９で生成されたＳ，Ｓ−モナチンで典型的に観察された場合よりも若干早く溶出しており、モナチンの別の異性体の存在が示唆された。この酵素では非常に微量のトリプトファンが生成された。しかしながら、この酵素はピルベートを基質として用いることも可能である（副生成物としてアラニンが生成される）。また、該酵素は不安定であることが知られている。定向進化実験を行なって安定性を増加させ、ピルベートに対する活性を減少させ、ＭＰに対する活性を増大させることで改善を行なうことが可能である。これらの反応は、上記のようにＬ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼと連関させることも可能である。
図１２に示される製法に類似する製法では、リジンεアミノトランスフェラーゼの代わりにオルニチンδ−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１３）を用い、この場合には、オルニチンはアミノドナーとして機能する。α−ケト産物であるＬ−グルタミン酸セミアルデヒドは、自然に環化してΔ1−ピロリン−Ｓ−カルボキシレートを形成する。上記種類の酵素を用いた別の反応スキームが、非タンパク質新生性アミノ酸製剤の生産のために記載されている（Ｔ．Ｌｉ，Ａ．Ｂ．Ｋｏｏｔｓｔｒａ，ＬＧ．Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：５３３−５３８（２００２））。これらのスキームでは、目的のアミノ酸に対して比較的高い活性を有する別のアミノトランスフェラーゼ（モナチンに対するＨＥＸＡｓｐＣのような）及びグルタメートの添加を要する。
その他の関連反応
トリプトファン又はインドール−ピルベートからのモナチンの収量を向上させることが可能な別の関連反応が図１３に示されている。ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．２又は１．２．１．４３）は一般的な酵素である。ギ酸ヒドロゲナーゼにはＮＡＤＨを必要とするものもあるが、それ以外はＮＡＤＰＨを利用することができる。アンモニウムベースのバッファーを用いることで、グルタミン酸デヒドロゲナーゼがＭＰおよびモナチンの相互変換を触媒することが先の実施例において証明された。ギ酸アンモニウム及びギ酸デヒドロゲナーゼの存在は、補因子の再生に有効な系であり、二酸化炭素の生成は逆反応の速度を低下させるのに有効な方法である（Ｂｏｍｍａｒｉｕｓら，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ １０：３７，１９９４及びＧａｌｋｉｎら．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４６５１−６，１９９７）。更に、大量のギ酸アンモニウムも反応バッファーに溶解可能である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ反応（又は同様の還元的アミノ化）により生成されるモナチンの収量は、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸アンモニウムの添加により向上させることが可能である。
同様の還元的アミノ化の触媒に適した酵素が実施例１４及び１５に示された。これらの酵素には、芳香族（フェニルアラニン）デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２０）と共に広い特異性を有する分枝鎖デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）が含まれていた。また、広い特異性を有するＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（１．４．９９．１）を用いてもこの反応を触媒できることが予想される。
他の製法を用いて平衡をモナチン生成に対して傾けさせることが可能である。例えば、アミノプロパンが、米国特許第５，３６０，７２４号及び同第５，３００，４３７号に記載されるようなω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１８）により触媒される反応中のＭＰのモナチンへの変換においてアミノ酸ドナーとして機能する場合には、生じる生成物の１つは、基質のアミノプロパンよりも揮発性の高い生成物であるアセトンとなるであろう。周期的に温度を短時間上昇させてアセトンを選択的に蒸発させ、これにより平衡を緩和させることも可能である。アセトンは４７℃の沸点を有しており、この温度を短時間用いても恐らく前記中間体が分解されることはないであろう。α−ケトグルタレートをアミノアクセプターとして利用できる殆どのアミノトランスフェラーゼもＭＰに対する活性を有する。同様にして、アミノドナーとしてのグリシンと共にグリオキシレート／芳香族酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．６０）が用いられた場合には、グリオキシレートが生成される。この生成物は不安定であり、グリシンよりも低い沸点を有する。
実施例２２
組換え発現
公的に入手可能な酵素のｃＤＮＡ及びアミノ酸の配列、並びに酵素及びここに開示される配列番号１１及び１２といった配列、及びその変異体、多型、突然変異体、断片及び融合体により、酵素等のいかなるタンパク質の発現及び精製も基本的な実験技術をもって実施することができる。当業者であれば、酵素及びその断片は、目的のいかなる細胞内又は生物内でも組換え技術により生成が可能であり、使用する前、例えば配列番号１２及びその誘導体の生成前に精製することが可能であることを理解するであろう。
組換えタンパク質の製造方法は、当該技術分野において周知である。従って、本開示の範囲には、酵素等のいかなるタンパク質又はその断片の組換え発現が包含される。例としてＪｏｈｎｓｏｎらに付与された米国特許第５，３４２，７６４号；Ｐａｕｓｃｈらに付与された米国特許第５，８４６，８１９号；Ｆｌｅｅｒらに付与された米国特許第５，８７６，９６９号並びにＳａｍｂｒｏｏｋら（分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９、第１７章）を参照。
簡潔に言うと、タンパク質又はペプチドをコードする部分的、完全長又は変異ｃＤＮＡ配列は、細菌由来又は真核生物由来の発現ベクター等の発現ベクターにライゲーションすることが可能である。該ｃＤＮＡ配列の上流にプロモーターを配置することでタンパク質及び／又はペプチドの生成が可能となる。プロモーターの例としては、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃ，ｔｒｃ，λファージの主なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、ポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス、バキュロウィルス、及びシミアンウィルス由来のプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ用のプロモーター、酵母の酸性ホスファターゼのプロモーター、酵母のα−交配因子のプロモーター及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれに限定されるものではない。
完全な天然タンパク質の生成に適したベクターとしては、ｐＫＣ３０（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）、ｐＫＫ１７７−３（Ａｍａｎｎ及びＢｒｏｓｉｕｓ，１９８５，Ｇｅｎｅ ４０：１８３）及びｐＥＴ−３（Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔｔ，１９８６，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３）が挙げられる。ＤＮＡ配列は、他のプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物ウィルス及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）（Ｂｕｒｋｅら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８０６−８１２）のような他のクローニング媒体に移すことができる。これらのベクターは、体細胞、及び細菌、真菌（Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ及びＭａｒｓｈａｌｌ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３１３−１３１７）、無脊椎動物、植物（Ｇａｓｓｅｒ及びＦｒａｌｅｙ，１９８９， ｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３）、及び哺乳動物（Ｐｕｒｓｅｌら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８１−１２８８）といった単純な又は複雑な生物を含む種々の宿主に導入することが可能であり、これらは異種ｃＤＮＡの導入によりトランスジェニックとなる。
例えば、哺乳動物細胞においては、ｃＤＮＡ配列は、ｐＳＶ２ベクター内のシミアンウィルスのＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２−６）のような異種プロモーターにライゲーションされ、サルのＣＯＳ−１細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５−８２）等の細胞に導入され、一過性又は長期の発現を達成することが可能である。該キメラ遺伝子構築物の安定な導入は、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅｒｇ，１９８２，Ｊ Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−４１）及びミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ ＵＳＡ ７８：２０７２−６）等の生化学的選択により哺乳動物細胞内で維持することができる。
ヒト又は他の哺乳動物細胞等の真核細胞へのＤＮＡの導入は従来技術である。ベクターは、例えば、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎｄｅｒ Ｅｂ，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４６６）リン酸ストロンチウム（Ｂｒａｓｈら，１９８７，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２０１３）による沈殿、エレクトロポレーション法（Ｎｅｕｍａｎｎら，１９８２，ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１）、リポフェクション法（Ｆｅｉｇｎｅｒら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３）、ＤＥＡＥデキストラン法（ＭｃＣｕｔｈａｎら，１９６８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．４１：３５１）、マイクロインジェクション法（Ｍｕｅｌｌｅｒら，１９７８，Ｃｅｌｌ １５：５７９）、プロトプラスト融合法（Ｓｃｈａｆｎｅｒ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１６３−７）、又はペレットガン（Ｋｌｅｉｎら，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０）により純粋なＤＮＡとしてレシピエントの細胞に導入される（トランスフェクション）。また、これに代わり、ｃＤＮＡは、例えばアデノティルス（Ａｈｍａｄら，１９８６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）又はヘルペス（Ｓｐａｅｔｅら，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０：２９５）といったレトロウィルス（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｇｅｎ．Ｅｎｇｒｇ．７：２３５）等のウィルスベクターの感染により導入することも可能である。
本開示内容の原理が応用できる多くの可能な実施形態を考慮し、例示される実施形態は本開示に係る特定の実施例に過ぎず、本開示の範囲を限定するものと受け取られるべきではないことが理解されるべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲に従うものである。従って、我々は、これらの各請求項の範囲及び趣旨に含まれる全てのものを我々の発明として主張する。
図１には、モナチン及び／又はインドール−３−ピルベートの生成に用いる生合成経路が示されている。１つの経路ではトリプトファンを通じてインドール−３−ピルベートが生成される一方で別の経路ではインドール−３−乳酸からインドール−３−ピルベートが生成されている。続いてモナチンが２−ヒドロキ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）中間体から生成されている。枠内に示される化合物は、該生合成経路で生成される基質及び生成物である。矢印の隣にある組成物は、補因子、又は基質を生成物に変換する際に用いられる反応物質である。使用される補因子又は反応物質は、該生合成経路の特定の工程で用いられるポリペプチドに依存する。補因子であるＰＬＰ（ピリドキサール５’ホスフェート）は、ポリペプチドに依存せずに反応を触媒することができ、従って、単にＰＬＰを提供するだけで基質から生成物への進行が可能となる。 図２は、ＭＰ中間体を用いた生合成経路のより詳細な図解である。該経路中の各工程の基質は、枠内に示されている。基質間の変換を可能とするポリペプチドについては、該基質間の矢印の隣に列挙されている。各ペプチドはその一般名及び酵素クラス（ＥＣ）番号により記載されている。 図３には、インドール−３−乳酸からインドール−３−ピルベートへの変換の生合成経路についてのより詳細な図解が示されている。基質は、枠内に示され、該基質間の変換を可能とするポリペプチドについては、該基質間の矢印の隣に列挙されている。各ペプチドはその一般名及び酵素クラス（ＥＣ）番号により記載されている。 図４には、化学的方法によりＭＰを作るための１つの可能な反応が示されている。 図５Ａ及び５Ｂは、酵素的に生成されたモナチンのＬＣ／ＭＳ同定を示すクロマトグラムである。 図６は、酵素的に合成されたモナチンのエレクトロスプレー質量スペクトルである。 図７Ａ及び７Ｂには、酵素の混合物中で生成されたモナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン解析のクロマトグラムが示されている。 図８は、酵素的に生成されたモナチンの高分解能質量測定を示すクロマトグラムである。 図９Ａ〜９Ｃは、（Ａ）Ｒ−トリプトファン、（Ｂ）Ｓ−トリプトファン、及び（Ｃ）酵素的に生成されたモナチンのキラル分離を示すクロマトグラムである。 図１０は、ＩＰＴＧ誘導後に細菌細胞内で生成されたモナチンの相対量を示す棒グラフである。（−）は、基質添加が無いことを示す（トリプトファン又はピルベートが添加されていない）。 図１１は、トリプトファン又はインドール−３−ピルベートから生成されるモナチンの収量を増加するために用いられた経路の概略図である。 図１２は、トリプトファン又はインドール−３−ピルベートから生成されるモナチンの収量を増加するために用いられた経路の概略図である。 図１３は、トリプトファン又はインドール−３−ピルベートから生成されるモナチンの収量を増加するために用いることのできる経路の概略図である。

Claims (35)

  1. ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：１ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）を用いて、トリプトファンを伴う反応、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸を伴う反応、及びその組み合わせから選択される少なくとも１つの反応を促進することを含むモナチン又はその塩の製造方法。
  2. 分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ）（ＥＣ２．６．１．４２）又は分枝鎖デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）を用いて、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の反応を促進することを含むモナチン又はその塩の製造方法。
  3. 前記分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ）（ＥＣ２．６．１．４２）が、ＡＴ−１０２又はＡＴ−１０４である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記分枝鎖デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）が、ＡＡＤＨ−１１０である、請求項２に記載の方法。
  5. Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）であるか、又はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ活性を有するポリペプチドであるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼを用いてインドール−３−ピルベートの反応を促進することを含む２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の製造方法。
  6. ＫＨＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）を用いてインドール−３−ピルベートの反応を促進することを含み、該反応において生成されるモナチンの６０％より多くが、モナチンのＲ，Ｒ立体異性体である、モナチン又はその塩の製造方法。
  7. （ａ）トリプトファン；
    （ｂ）ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：１ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）、ＹｆｄＺ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７５４３８．１）、及びこれらの組み合わせから選択される第一のポリペプチド、並びに
    （ｃ）ＫＨＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）、ＰｒｏＡアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）及びこれらの組み合わせから選択される第二のポリペプチド
    を含む反応混合物を反応させることを含む２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の製造方法。
  8. 前記トリプトファンが、Ｄ−トリプトファンを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＫＨＧアルドラーゼが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）であるか、又はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＡＶ８９６２１．１ ＧＩ：５６５４３４６７）と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＫＨＧアルドラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
  10. 前記ＰｒｏＡアルドラーゼが、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ、Ｓ．メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＰｒｏＡアルドラーゼ、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項９に記載の方法。
  11. （ａ）２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸；及び
    （ｂ）ＹｆｄＺ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７５４３８．１）、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：１ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ）（ＥＣ２．６．１．４２）、分枝鎖デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）、及びこれらの組み合わせから選択されるポリペプチド
    を含む反応混合物を反応させることを含むモナチンの製造方法。
  12. 前記反応混合物が、更に
    （ｃ）インドール−３−ピルベート；並びに
    （ｄ）インドール−３−ピルベート及びＣ３炭素供給源を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸へ変換することができる第二のポリペプチド
    を含む請求項１１に記載の方法。
  13. 前記混合物が、ＹｆｄＺ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７５４３８．１）、ＨＥＸＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：１ＡＨＦ Ａ ＧＩ：１１２７１９０）、又はこれらの組み合わせを含む未精製細胞抽出物を含む、請求項１１に記載の方法。
  14. （ａ）２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸；及び
    （ｂ）ＡＴ−１０１、ＡＴ−１０２、ＡＴ−１０３、ＡＴ−１０４、ＡＡＤＨ−１０２、ＡＡＤＨ−１１０、ＡＡＤＨ−１１２、ＡＡＤＨ−１１３、及びこれらの組み合わせから選択されるポリペプチド
    を含む反応混合物を反応させることを含むモナチン又はその塩の製造方法。
  15. 前記選択されるポリペプチドが、ＡＴ−１０３である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記方法において生成されるモナチンの６５％より多くが、モナチンのＲ，Ｒ立体異性体である、請求項１５に記載の方法。
  17. モナチン組成物を酵素的に生成することを含み、該モナチン組成物中に存在する少なくとも約８０％のモナチン又はその塩がモナチンのＲ，Ｒ立体異性体である、トリプトファン又はインドール−３−ピルベートからのモナチン又はその塩の製造方法。
  18. 前記トリプトファンが、Ｄ−トリプトファンを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記モナチン組成物中に存在する少なくとも約８４％のモナチン又はその塩がモナチンのＲ，Ｒ立体異性体である、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記方法が、更にＰｒｏＡアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）を提供してインドール−３−ピルベートの２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸への変換を促進することを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記方法が、更にＡＴ−１０３（Ｄ−トランスアミナーゼ）を提供して２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸のモナチンへの変換を促進することを含む、請求項１９に記載の方法。
  22. （ａ）トリプトファン、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸、又はこれらの組み合わせ；並びに
    （ｂ）第３９番目、第４１番目、第４７番目、第６９番目、第１０９番目、第２９７番目の位置、及びこれらの組み合わせから選択されるアミノ酸の位置において少なくとも１つの置換を有し、該アミノ酸の位置の番号付けがブタ細胞質ゾルのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの番号付け方式に基く、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣポリペプチド（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ７４０１４．１）
    を含む反応混合物を反応させることを含むモナチン又はその塩の製造方法。
  23. 前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｓｐＣポリペプチドが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＡｓｐＣポリペプチドが、第３９番目のバリン（Ｖａｌ）からロイシン（Ｌｅｕ）への置換を含む、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記ＡｓｐＣポリペプチドが、第４１番目のリジン（Ｌｙｓ）からチロシン（Ｔｙｒ）への置換を含む、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記ＡｓｐＣポリペプチドが、第４７番目のスレオニン（Ｔｈｒ）からイソロイシン（Ｉｌｅ）への置換を含む、請求項２２に記載の方法。
  27. 前記ＡｓｐＣポリペプチドが、第６９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）からロイシン（Ｌｅｕ）への置換を含む、請求項２２に記載の方法。
  28. 前記ＡｓｐＣポリペプチドが、第１０９番目のスレオニン（Ｔｈｒ）からセリン（Ｓｅｒ）への置換を含む、請求項２２に記載の方法。
  29. 前記ＡｓｐＣポリペプチドが、第２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）からセリン（Ｓｅｒ）への置換を含む、請求項２２に記載の方法。
  30. （ａ）インドール−３−ピルベート；並びに
    （ｂ）ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ １１０株（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２７３７８９５３）；スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）（シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））・パウシモビリス（ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：１９９１８９６３）；イエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）ＫＩＭ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２１９５６７１５）；ラルストニア・メタリジュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）ＣＨ３４（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：４８７６７３８６）；イエルシニア・シュードチュベルキュロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＩＰ３２９５３（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：５１５９４４３６）；リゾビウム・レグミノサラム・ビオヴァル・ヴィシエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ ｖｉｃｉａｅ）ｒｈｉｚ２３ｇ０２−ｐ１ｋ １００９ ３４１（配列番号８８）；ノヴォスフィンゴビウム・アロマティシヴォランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ１２４４４（スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）Ｆ１９９）（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：４８８４９０２６）；シュードモナス・プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２４９８４０８１）；マグネトスピリラム・マグネトタクティカム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ）ＭＳ−Ｉ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：４６２００８９０）；ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＣＧＡ００９（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：３９９３７７５６）；キサントモナスカンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ−３３９１３（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２１１１５２９７）；キサントモナス・アキソノポディス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｃｉｔｒｉ）３０６（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２１１１０５８１）；ストレプトマイシス・アヴェルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＧＩ：２９８２８１５９）；及びこれらの組み合わせから選択されるアルドラーゼ
    を含む反応混合物を反応させることを含む２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の製造方法。
  31. （ａ）インドール−３−ピルベート；及び
    （ｂ）Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡ（配列番号６６）と少なくとも約４９％同一なアミノ酸配列又はシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＣＡＣ４６３４４）と少なくとも約５６％同一なアミノ酸配列を含み、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸リアーゼ活性を有するアルドラーゼ
    を含む反応混合物を反応させることを含む２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の製造方法。
  32. 前記アミノ酸配列が、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡ（配列番号６６）と少なくとも約６０％同一である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記アミノ酸配列が、Ｃ．テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）ＰｒｏＡ（配列番号６６）と少なくとも約７０％同一である、請求項３１に記載の方法。
  34. トリプトファン、及びプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）種、プロヴィデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）種、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）種、又はこれらの組み合わせから選択される微生物から得られるデアミナーゼ（ＥＣ３．５．１．−）、を含む反応混合物を反応させることを含むモナチン又はその塩の製造方法。
  35. 前記プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）種が、プロテウス・ミキソファシエンス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ヴルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、及びプロテウス・モルガニイ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｏｒｇａｎｉｉ）を含む、請求項３４に記載の方法。
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