CN101374954A - 用于生产莫纳甜和其前体的多肽和生物合成途径 - Google Patents

Abstract

本文提供了可用于由葡萄糖、色氨酸、吲哚－3－乳酸、吲哚－3－丙酮酸和2－羟基2－(吲哚－3－基甲基)－4－酮戊二酸制备莫纳甜的方法和组合物。也公开了生产吲哚－3－丙酮酸和2－羟基2－(吲哚－3－基甲基)－4－酮戊二酸中间体的方法。所提供的组合物含有核酸分子、多肽、化学结构和细胞。方法包括体外和体内方法，体外方法包括化学反应。

Description

用于生产莫纳甜和其前体的多肽和生物合成途径

发明背景

发明领域

本发明提供了可用于生产吲哚-3-丙酮酸、2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(MP)和/或莫纳甜的多肽和生物合成途径。

背景技术

吲哚丙酮酸

吲哚-3-丙酮酸是一种强效抗氧化剂，相信它抵消了氧气浓度高的组织中的氧化应激(Politi等，“色氨酸研究的最近进展”(Recent advances in Tryptophan research)，G.A.Filippini等编，普利诺出版社(Plenum Press)，纽约，1996，第291-8页)。吲哚丙酮酸也是作为主要的植物生长激素生长素(可扩散的生长促进因子)的吲哚-乙酸(IAA)的产生途径中的中间物。在生理过程包括顶端优势、向性、纸条伸长、诱导形成层细胞分裂和生根中，亚微克量的IAA是有活性的。园艺中用合成生长素诱导生根并促进果实形成和发育。在高浓度时，合成生长素是有效的阔叶植物除草剂。可认为，通过发酵生产的天然生长素比化学生产的除草剂对环境更友好。1999年生长调节剂的全球销售额为4亿英镑(14亿美元)。

关于吲哚乙酸和其衍生物的专利的一些例子包括：美国专利5,843,782“蔷薇科植物的微体繁殖，用于培养基的生长素(Micropropagation of rose plants，auxin used inculture medium)”和美国专利5,952,231“蔷薇科植物的微体繁殖(Micropropagation ofrose plants)”。

除了植物相关用途以外，吲哚乙酸还用于药物应用。例如，美国专利号5,173,497“α-氧代吡咯并[2，3-B]吲哚乙酸和衍生物的制备方法(Method of preparingalpha-oxopyrrolo[2，3-B]indole acetic acids and derivatives)”提出，用这些化合物治疗记忆损伤，如伴随阿尔茨海默病和老年性痴呆的记忆损伤。美国专利号5,173,497中提出的机制是这些化合物抑制乙酰胆碱酯酶并提高大脑中的乙酰胆碱水平。

通过过氧化物酶催化的氧化作用由吲哚-3-乙酸产生吲哚-3-甲醇，且可容易地转化成二吲哚甲烷。据报道，两种化合物能够消除毒素并促进产生有益于女性健康的激素。

色氨酸衍生物

氯化D-色氨酸被鉴定为非营养性甜味剂，对探索其它衍生物的兴趣持续增加。

莫纳甜是组成类似于氨基酸色氨酸的天然甜味剂。它可提取自南非灌木似冬青叶硬木朔(Sclerochiton ilicifolius)的根皮，作为高强度甜味剂在食品和饮料工业中有前途。关于莫纳甜的专利的一些例子包括：美国专利号5,994,559“合成莫纳甜-高强度天然甜味剂”(Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener)；美国专利号4,975,298“3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)-吲哚化合物”(3-(1-amino-1，3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds)；美国专利号5,128,164“含有3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)-吲哚化合物的供人类消费的组合物”(Compositionfor human consumption containing 3-(1-amino-1，3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indolecompounds)和美国专利号5,128,482“生产3-1(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)吲哚的方法”(Process for the production of 3-1(1-amino-1，3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)indole)。

本文所述的一些莫纳甜前体也可用作合成甜味剂或合成莫纳甜衍生物的中间体。

发明概述

本发明提供了由葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或通过莫纳甜前体如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸制备莫纳甜的几种生物合成途径。公开了可用于制备莫纳甜、吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的多肽和核酸序列。为了简明，无论在说明书和权利要求书中的什么地方提到形成的中间体/产物(如莫纳甜或莫纳甜前体)，只要合理均可包含术语“和/或其盐”。换言之，例如，术语“将吲哚-3-丙酮酸转变为莫纳甜前体”应理解为“将吲哚-3-丙酮酸转变为莫纳甜前体和和/或其盐”。实际上，本领域普通技术人员应理解，在所示的反应条件下，实际上存在或也存在中间体/产物的盐。

可通过包含一种或多种合适底物和一种或多种所选多肽的反应混合物发生反应来生产莫纳甜。合适底物可包括但不限于：葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、莫纳甜前体(如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸)和其混合物。可将用于生产莫纳甜的反应混合物中存在的合适底物加入反应混合物和/或可以在反应混合物中原位生产所述合适底物。可将所选多肽加入反应混合物中和/或可以由反应混合物中存在的微生物生产(例如用表达所选多肽的微生物发酵该反应混合物)。

可通过吲哚-3-丙酮酸、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(莫纳甜前体，MP，莫纳甜的α酮形式)、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖来产生莫纳甜(图1)。产生或制造莫纳甜或其中间体的方法见图1-3和11-13，包括将底物转化为第一种产物，然后将第一种产物转化为第二种产物，等等，直到产生所需终产物。

图1-3和11-13在方框中显示了可能的中间产物和终产物。例如，可用这些方法进行一种产物到另一种产物的转化，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到MP、MP到莫纳甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。可用化学方法或生物学方法促进这些转化。术语“转化”指在将第一种中间体转变成第二种中间体的反应中使用化学方法或多肽。术语“化学转化”指不由多肽主动促进的反应。术语“生物转化”指由多肽(如酶)主动促进的反应。转化可在体内或体外发生(如用合适微生物发酵营养肉汤)。当使用生物转化时，多肽和/或细胞能固定于支持物如化学附着于聚合物支持物上。可用本领域普通技术人员已知的任何反应器，例如在分批或连续反应器中完成转化。

也提供了方法，包括使第一种多肽接触底物，制造第一种产物，然后使产生的第一种产物接触第二种多肽，产生第二种产物，然后使产生的第二种产物接触第三种多肽，产生第三种产物，例如莫纳甜。所用多肽和所产生的产物见图1-3和11-13。

公开了可用于进行图1-3和11-13中所示转化的多肽及其编码序列。在一些实施例中，具有一个或多个改变多肽的底物特异性和/或活性的点突变的多肽可用来制造莫纳甜。

公开了产生莫纳甜的分离和重组细胞。这些细胞可以是任何细胞，如植物、动物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。这些细胞可用于通过发酵含有该细胞的营养培养基合成莫纳甜。所述营养培养基可包含用于合成莫纳甜的任何合适分子，包括但不限于：葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或莫纳甜前体如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-yl甲基)-4-酮戊二酸。

在具体实施例中，公开的细胞包括一种或多种以下活性，例如两种或多种或者三种或多种以下活性：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶(EC2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号，Hadar等，J.Bacteriol 125：1096-1104，1976和Furuya等，BiosciBiotechnol Biochem 64：1486-93，2000)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》(Proceedings of 8^th International Symposium on Vitamin B₆ andCarbonyl Catalysis)，日本大阪，1990)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)和亮氨酸(支链)脱氢酶(EC 1.4.1.9)。

在另一实施例中，细胞包括一种或多种，例如两种或多种、三种或多种以下活性：吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)、3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、支链转氨酶(BCAT，EC2.6.1.42)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、亮氨酸(支链)脱氢酶(EC 1.4.1.9)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-色氨酸转氨酶和/或D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。

此外，公开的细胞可包括一种或多种以下活性，如两种或多种或者三种或多种以下活性：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC编号)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、支链转氨酶(BCAT，EC 2.6.1.42)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、，亮氨酸(支链)脱氢酶(EC 1.4.1.9)和/或D-色氨酸转氨酶。

能生产莫纳甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接触第一种多肽，其中第一种多肽将色氨酸和/或吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸都可用作底物转化成吲哚-3-丙酮酸；本领域技术人员理解选择用于此步骤的多肽理想地表现出适当特异性)，所得吲哚-3-丙酮酸接触第2种多肽，其中第2种多肽将吲哚-3-丙酮酸转化成2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，MP接触第3种多肽，其中第3种多肽将MP转化成莫纳甜。能用于这些转化的示范多肽示于图2和3。

本发明另一方面提供了组合物如MP，含有在至少一种外源核酸序列上编码的至少两种多肽、或有时至少三种或至少四种多肽的细胞。

通过以下详述和说明性实施例将明白本发明的这些和其它方面。

附图简要说明

图1显示用于生成莫纳甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径。一种途径通过色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一种通过吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。随后通过2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(MP)中间体生成莫纳甜。

框中所示化合物是底物和生物合成途径中生成的产物。

与箭头相邻的组合物是辅因子或可在底物转化成产物期间使用的反应物。所用辅因子或反应物取决于生物合成途径的特定步骤使用的多肽。辅因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)能催化不依赖于多肽的反应，因此仅提供PLP可从底物进行到产物。

图2是使用MP中间体的生物合成途径的更详细图。框中显示了途径中各步骤的底物。允许在底物之间发生转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其常用名称和酶分类(EC)号描述。

图3显示将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径的更详细图。框中显示了底物，而允许在底物之间发生转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其常用名称和酶分类(EC)号描述。

图4显示一种经化学方法产生MP的可能反应。

图5A和5B是色谱图，显示酶法生成的莫纳甜的LC/MS鉴定。

图6是酶法合成的莫纳甜的电喷射质谱。

图7A和7B显示了酶混合物中生成的莫纳甜的LC/MS/MS子离子分析色谱图。

图8是色谱图，显示酶法生成莫纳甜的高分辨质谱测量。

图9A-9C是色谱图，显示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成莫纳甜的手性分离。

图10是柱状图，显示IPTG诱导后细菌细胞中生成的莫纳甜的相对量。(-)表示不加入底物(不加入色氨酸或丙酮酸)。

图11-12是示意图，显示用于增加莫纳甜产量的途径，莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。

图13是示意图，显示能用于增加莫纳甜产量的途径，莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。

序列表

所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是用标准字母缩写(核酸碱基)和三字母编码(氨基酸)表示的。只显示各核酸序列的一条链，但参照所示链应理解包括互补链。

SEQ ID NO：1和2分别显示来自苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的转氨酶(tatA基因，在文献中称为酪氨酸转氨酶或芳族氨基酸转氨酶)的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：3和4分别显示来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的酪氨酸转氨酶(2.4.1)(与基因组软件预测为“天冬氨酸转氨酶”的tatA(SEQ ID NO：1和2)同源)的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：5和6分别显示来自类球红细菌(35053)(新颖，根据2.4.1序列SEQID NO：3和4克隆)的转氨酶的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：7和8分别显示来自硕大利什曼原虫(Leishmania major)的广谱底物转氨酶(bsat)的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：9和10分别显示来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的芳族氨基酸转氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：11和12分别显示来自食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)的芳族氨基酸转氨酶(araT)(通过同源性鉴定为芳族氨基酸转氨酶)的新核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：13和14分别显示来自类球红细菌(35053)的多底物转氨酶(msa)(通过与登录号AAAE01000093.1，bp 14743-16155和登录号ZP00005082.1同源鉴定为多底物转氨酶)的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：15和16显示用于克隆枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat)序列的引物。

SEQ ID NO：17和18显示用于克隆苜蓿根瘤菌tatA序列的引物。

SEQ ID NO：19和20显示用于克隆枯草芽孢杆菌araT转氨酶序列的引物。

SEQ ID NO：21和22显示用于克隆类球红细菌(2.4.1和35053)多底物转氨酶序列的引物。

SEQ ID NO：23和24显示用于克隆硕大利什曼原虫bsat序列的引物。

SEQ ID NO：25和26显示用于克隆食淀粉乳杆菌araT序列的引物。

SEQ ID NO：27和28显示用于克隆类球红细菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物。

SEQ ID NO：29和30显示用于克隆大肠杆菌aspC序列(基因序列Genbank登录号：AE000195.1，蛋白质序列Genbank登录号：AAC74014.1)的引物。

SEQ ID NO：31和32分别显示来自大肠杆菌的芳族氨基酸转氨酶(tyrB)的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：33和34显示用于克隆大肠杆菌tyrB序列的引物。

SEQ ID NO：35-40显示用于克隆具有4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(KHG)(EC4.1.3.16)活性的多肽的引物。

SEQ ID NO：41和42显示来自大肠杆菌的色氨酸酶(tna)基因和来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的酪氨酸-酚裂合酶(tpl)基因的核酸序列，它们分别编码蛋白质P00913(GI：401195)和P31013(GI：401201)。

SEQ ID NO：43-46显示用于克隆色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶(酪氨酸酚-裂合酶)多肽的引物。

SEQ ID NO：47-54显示用于使色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶多肽突变的引物。

SEQ ID NO：55-64显示用于克隆具有4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)活性的多肽的引物。

SEQ ID NO：65和66显示来自睾丸酮丛毛单胞菌的4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(proA)的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：67-68显示用于在pET30Xa/LIC中具有大肠杆菌aspC的操纵子中克隆睾丸酮丛毛单胞菌4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(proA)的引物。

SEQ ID NO：69-72显示用于在pESC-his中克隆大肠杆菌aspC和睾丸酮丛毛单胞菌proA的引物。

SEQ ID NO：73-74显示加到用于克隆本文所公开基因的引物5’端的序列。

SEQ ID NO：75和76分别显示HEX基因和基因产物的核酸和氨基酸序列(NCBI登录号1AHF_A GI：1127190)(HEXAspC氨基转移酶氨基酸序列)。

SEQ ID NO：77和78显示用于克隆大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(aspC)或突变的aspC转氨酶(HEX)基因序列的引物。

SEQ ID NO：79和80显示用于克隆大肠杆菌酪氨酸转氨酶(tyrb)的引物。

SEQ ID NO：81和82显示用于克隆运动发酵单胞菌(Z.mobilis)的khg基因的引物。

SEQ ID NO：83和84分别显示了运动发酵单胞菌khg基因(登录号：AE008692.1GI：56542470)和基因产物(登录号：AAV89621.1 GI：56543467)的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：85-86显示用于克隆以GI：48994873碱基2496317-2495079保藏于NCBI的大肠杆菌yfdZ基因序列的引物，该基因序列编码蛋白GI：1788722(蛋白质IDAAC75438.1)。

SEQ ID NO：87和88分别显示来自豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)蚕豆生物型rhiz23g02-plk_1009_341(桑格研究所(Sanger Institute))的醛缩酶的核酸和氨基酸序列。

具体实施方式的详述

缩写和术语

提供下列术语和方法的解释以更好地描述本说明书并指导本领域普通技术人员实践本发明。如本文所用，“含有”指“包括”。此外，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”或“一种”或“这种”也包括复数。例如，提到“含有一种蛋白质”包括一种或多种这样的蛋白质，提到“含有这种细胞”包括一种或多种细胞以及本领域技术人员已知的它的等价物，等等。术语“约”包括发生于任何测定中的实验误差的范围。除非另有说明，假定所有的测定数字前面都有“约”字，即使没有明显地使用“约”字。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所属方法和材料和方法和材料可用于实施或测试本发明，但下面描述了合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅为说明性，不应为限制性。通过以下详述和权利要求书可看出本发明的其它特征和优点。

cDNA(互补DNA)：缺少内部非编码节段(内含子)和决定转录的调节序列的一段DNA。可在实验室中通过提取自细胞的信使RNA逆转录合成cDNA。

保守取代：用一种氨基酸取代多肽中的另一种氨基酸，该取代对多肽活性影响很小或无影响。如果交换的氨基酸似乎在结构或功能上相似，则认为该取代是保守取代。例如，包含一个或多个保守取代的色氨酸转氨酶多肽理想地保持色氨酸转氨酶活性。可通过用，例如标准方法如定位诱变或PCR或本领域已知的其它方法来操作编码该多肽的核苷酸序列来产生含有一个或多个保守取代的多肽。

可用来取代蛋白质中原始氨基酸、并且如果对多肽活性影响很小或无影响被认为是保守取代的氨基酸的非限制性例子包括：用丝氨酸或苏氨酸取代丙氨酸；用谷氨酰胺、组氨酸或赖氨酸取代精氨酸；用谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸取代天冬酰胺；用天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺取代天冬氨酸；用丝氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸；用天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷氨酰胺；用天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸取代谷氨酸；用脯氨酸取代甘氨酸；用天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、酪氨酸取代组氨酸；用亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代异亮氨酸；用异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸；用天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸取代赖氨酸；用异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸；用色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸；用苏氨酸、丙氨酸取代丝氨酸；用丝氨酸或丙氨酸取代苏氨酸；用苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸；用组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸；用甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸取代缬氨酸。

关于保守取代的其它信息可参见Ben-Bassat等(J.Bacteriol.169：751-7，1987)、O′Regan等(Gene 77：237-51，1989)、Sahin-Toth等(Protein Sci.3：240-7，1994)、Hochuli等(Bio/Technology 6：1321-5，1988)、WO 00/67796(Curd等)和遗传学和分子生物学的标准教科书。

衍生：出于说明书和权利要求书的目的，如果发生以下一种或多种事件则称一种物质“衍生”自生物体或来源：1)该物质存在于该生物体/来源中；2)从天然宿主中取出该物质；或者，3)从天然宿主中取出或者(例如)通过诱变产生该物质。

酶学生产：术语“酶学生产”或类似术语如“用酶学方法生产”或“酶学合成”指用至少一种多肽体外(如用一种或多种多肽在试管或反应器中)或体内(如在完整细胞或发酵反应中)生产产物(如莫纳甜)。尽管“酶学生产”产物不排除采用化学试剂或反应，但它包括在生产该产物时采用促进至少一种反应的至少一种多肽。

外源性：在提到核酸和特定细胞时本文所用术语“外源性”指在天然情况下不是源自该特定细胞的任何核酸。因此，认为在引入细胞时，非天然存在的核酸对细胞来说是外源性的。对于特定细胞而言，天然存在的核酸也可以是外源性的。例如，当将分离自人X的细胞的整个染色体引入人Y的细胞时，它对Y的细胞来说是外源性核酸。

功能等效：具有等效功能。在酶中，功能等效的分子包括保持酶功能的不同分子。例如，可通过酶序列中的序列改变来提供功能等效物，其中具有一个或多个序列改变的肽保持了未改变肽的功能，以使其保持酶活性。在具体实施例中，色氨酸转氨酶功能等效物保持了将色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的能力。

序列改变的例子包括但不限于：保守取代、缺失、突变、移码和插入。在一个实施例中，给定多肽与抗体结合，功能等效物是与相同抗体结合的多肽。因此，功能等效物所包括的肽具有与多肽相同的结合特异性并可用作代替该多肽的试剂。在一个实施例中，功能等效物包括结合序列不连续、抗体与线性表位结合的多肽。因此，如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO：12的氨基酸1-10)，功能等效物包括不连续的表位，可以是(^**＝任何数量的间插氨基酸)：NH2-^**-M^**P^**E^**L^**A^**N^**D^**L^**G^**L-COOH。在这个例子中，如果该多肽的三维结构使其可以结合能结合SEQ ID NO：12的氨基酸1-10的单克隆抗体，那么该多肽与SEQ ID NO：12的氨基酸1-10功能等效。

杂交：本文所用术语“杂交”指根据互补的单链DNA和/或RNA形成双链体分子的能力来测试两个核酸分子的核苷酸序列的互补性的方法。在本发明范围内，核酸杂交技术可用于获得分离的核酸。简要说，与SEQ ID NO：11所列序列有一些同源性的任何核酸可用作在中等至高度严谨条件下杂交鉴定相似核酸的探针。鉴定后，可纯化、测序并分析该核酸，以确定它是否在本发明范围内。

可通过Southern或Northern分析进行杂交来分别鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。可用生物素、洋地黄毒苷、多肽或放射性同位素如³²P来标记探针。可以在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离待分析的DNA或RNA，转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其它合适的膜上，用本领域熟知的标准技术用探针杂交，如Sambrook等(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning)，第二版，纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)的第7.39-7.52节所述。探针的长度一般至少约20个核苷酸。例如，对应于SEQ ID NO：11所列20个毗连核苷酸序列的探针可用于鉴定相同或相似的核酸。此外，可采用长于或短于20个核苷酸的探针。

本公开也提供了长度至少约为12个碱基(如，长度至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基)并且在杂交条件下与具有SEQ ID NO：11所列核酸序列的正义或反义链杂交的分离核酸序列。杂交条件可以是中等或高度严谨的杂交条件。

就本公开目的而言，中等严谨的杂交条件意味着在约42℃下在含有25mMKPO₄(pH7.4)、5X SSC、5X邓氏溶液(Denhart solution)、50μg/mL经超声处理的变性鲑精DNA、50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/mL探针(约5x10⁷cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交，而在约50℃下用含有2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行洗涤。

高度严谨的杂交条件意味着在约42℃下在含有25mM KPO₄(pH7.4)、5X SSC、5X邓氏溶液、50μg/mL经超声处理的变性鲑精DNA、50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/mL探针(约5x10⁷cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交，而在约65℃下用含有0.2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行洗涤。

分离：本文所用术语“分离”指由其天然宿主中取出的任何物质；该物质不一定经过纯化。例如，“分离核酸”指不与来源于天然存在的生物体基因组中直接毗连(一个在5’端，一个在3’端)的序列直接毗连的天然存在的核酸。例如，分离的核酸可以是，但不限于：在天然存在的基因组中，通常发现重组DNA分子侧翼的一个核酸序列被去除或不存在的任何长度的重组DNA分子。因此，分离的核酸包括但不限于：以独立于其它序列的分离分子(如用PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA以及掺入载体、自主复制的质粒、病毒(如逆转录病毒载体、腺病毒或疱疹病毒)或原核生物或真核生物的基因组DNA的重组DNA。此外，分离的核酸可包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。

当提及核酸时，本文所用术语“分离”也包括任何非天然存在的核酸，因为在自然中未发现非天然存在的核酸序列，且在天然存在的基因组中非天然存在的核酸序列不具有直接毗连的序列。例如，非天然存在的核酸如工程改造的核酸被认为是分离核酸。可用普通的分子克隆技术或化学核酸合成技术来制造工程改造的核酸。分离的非天然存在的核酸可以独立于其它序列，或掺入载体、自主复制的质粒、病毒(如逆转录病毒载体、腺病毒或疱疹病毒)或原核生物或真核生物的基因组DNA。此外，非天然存在的核酸可包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。

再例如，认为cDNA或基因组文库、或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片中中数百至数百万其它核酸分子中存在的核酸不是分离核酸。

核酸：本文所用术语“核酸”包括RNA和DNA，DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA和合成(如化学合成)DNA。核酸可以是双链或单链核酸。其中单链核酸可以是正义链或反义链。此外，核酸可以是环形或线状。

操作性连接：当第一核酸序列与第二核酸序列发生功能性关系时，第一核酸序列“操作性连接”于第二核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录，将启动子操作性连接于编码序列。通常，操作性连接的DNA序列是毗连的，当需要时可将两个多肽编码区连接在相同的阅读框中。

多肽修饰：本公开包括酶，及其合成实施方式。此外，本文所述方法可采用具有所需酶活性的类似物(非肽有机分子)、衍生物(用所公开的肽序列为起点获得的化学功能化的肽分子)和变体(同源物)。本文所公开的肽包括可以是L-氨基酸和/或D-氨基酸，天然存在或非天然存在的氨基酸序列。

可通过各种化学技术修饰肽，产生活性与未修饰肽基本相同，并任选地具有其它所需特性的衍生物。例如，可以药学上可接受的阳离子盐，或酯化形成C1-C16酯，或转化成式NR₁R₂的酰胺的形式提供肽的羧酸基团(羧基端或侧链)，其中R₁和R₂各自独立地为H或C1-C16烷基或者结合形成杂环如5-元环或6-元环。肽的氨基(氨基端或侧链)可以是药学上可接受的酸加成盐如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、顺丁烯二酸盐、酒石酸盐和其它有机盐形式，或可被修饰为C1-C16烷基或二烷基氨基或进一步转化为酰胺的形式。

可用熟知技术将肽侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或转化为C1-C16酯。可用一个或多个卤原子如F、Cl、Br或I，或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯或这种羧酸的酰胺来取代肽侧链的苯基或酚环。肽侧链的亚甲基可以延伸到同源的C2-C4亚烷基中。可用许多良好公认的保护基团中的任何一个，如乙酰胺基团来保护硫醇。本领域技术人员也将认识到将环结构引入本公开肽中以选择和提供对结构的构象约束，导致稳定性提高。例如，可以向肽加入C-末端或N-末端半胱氨酸，以致当氧化时，该肽将含有二硫键，产生环状肽。其它肽环化方法包括形成硫醚以及羧基和氨基末端酰胺和酯。

肽模拟物和有机模拟物实施方式也是在本公开范围之内，这种肽模拟物和有机模拟物的化学组成的三维排列模拟肽骨架和成分氨基酸侧链的三维排列，导致此公开蛋白的肽模拟物和有机模拟物具有可检测的酶活性。对于计算机建模应用而言，使药效团理想化，生物活性的结构要求的三维定义。用当前的计算机建模软件(采用计算机辅助药物设计或CADD)，可设计适合各药效团的肽模拟物和有机模拟物。为了解用于CADD的技术的说明，可参见例如Walters，《药物的计算机辅助建模》(Computer-Assisted Modeling of Drugs)，刊于Klegerman和Groves(编)，《制药生物技术》(Pharmaceutical Biotechnology)，1993，伊利诺斯州布法罗沟的国际药物出版社(Interpharm Press，Buffalo Grove，IL)，第165-74页和第102章，Munson(编)，《药理学原理》(Principles of Pharmacology)，1995，Chapman和Hall。用这些技术制备的模拟物也包括在本发明范围内。在一个实施例中，模拟物模拟酶或其变体、片段或融合所产生的酶活性。

ProA醛缩酶：虽然在历史上“ProA”和/或“ProA醛缩酶”仅用于鉴定获自睾丸酮丛毛单胞菌的4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶，但本文所用术语“ProA”和/或“ProA醛缩酶”指具有4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶活性的任何多肽，除非另有说明。ProA或ProA醛缩酶的合适例子包括睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)和苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)，或显示与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)和/或苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)同源的酶。例如，合适酶与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)和/或苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)的序列相同性可能至少约为40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％和/或99％。

探针和引物：可根据本文提供的氨基酸序列和核酸序列容易地制备核酸探针和引物。“探针”包括含有可检测标记或报道分子的分离核酸。示范性标记包括但不限于：放射性同位素、配体、化学发光剂和多肽。例如，Sambrook等(编)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)第2版，第1-3卷，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)，1989，和Ausubel等(编)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，格林出版社和威利国际科学出版社(Greene Publishing andWiley-Interscience)，纽约(定期更新)，1987中讨论了标记方法和适合各种目的的标记的选择指南。

“引物”一般是具有10个或更多个核苷酸的核酸分子(如具有约10-100个核苷酸的核酸分子)。引物可通过核酸杂交退火到互补靶核酸链上，在引物和靶核酸链之间形成杂交体，然后通过例如，DNA聚合酶多肽沿靶核酸链延伸。可通过例如，聚合酶链反应(PCR)或本领域已知的其它核酸扩增方法将引物对用于扩增核酸序列。

例如，在参考文献如Sambrook等(编)，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)第2版，第1-3卷，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，纽约冷泉港，1989；Ausubel等(编)，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版社和威利国际科学出版社(Greene Publishing and Wiley-Interscience)，纽约(定期更新)，1987；和Innis等(编)，《PCR方法：方法和应用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)，学术出版社(Academic Press)：圣地亚哥，1990中描述了探针和引物的制备和使用方法。例如，可通过用于此目的的计算机程序如Primer(0.5版，

1991，怀特黑德生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)，马萨诸塞州剑桥(Cambridge，Mass.))从已知序列获得PCR引物对。本领域技术人员将理解，具体的探针或引物的特异性随长度而提高，但探针或引物的尺寸范围是序列全长到短至五个连续核苷酸的序列。因此，例如，20个连续核苷酸的引物可退火到具有特异性高于仅15个核苷酸的相应引物的靶上。因此，为了获得更大的特异性，探针和引物可选自例如：10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050，3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450或更多个连续核苷酸。

启动子：指导核酸转录的一系列核酸控制序列。启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下的TATA元件。启动子可包括可位于距转录起始位点多达几千碱基对的远端增强子或阻抑元件。

纯化的：本文所用术语“纯化的”不要求绝对纯净；而打算作为相对术语。因此，例如，纯化的多肽或核酸制剂可以是主题多肽或核酸的浓度高于它们在生物体天然环境中的浓度或高于取出它们的环境中的浓度的制剂。

重组：“重组”核酸是一种具有以下序列的核酸：(1)在表达它的生物体中不天然存在的序列或(2)由两种分离的、较短的序列人工组合而成的序列。常常用化学合成，更常见的是如用遗传工程技术人工操作核酸的分离节段来完成此人工组合。“重组”也用于描述已人工操作的，但含有与发现于分离出该核酸的生物体的调节序列和编码区相同的核酸分子。

序列相同性：用序列之间的相似性，或称为序列相同性来表示氨基酸序列之间的相似性。常常通过相同性百分数(或相似性或同源性)来量度序列相同性；此百分数越高，两个序列越相似。当用标准方法比对时，多肽的同源物或变体，如SEQ ID NO：12具有相对较高的序列相同性。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法见：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-53，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444-8，1988；Higgins和Sharp，Gene 73：237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-3，1989；Corpet等，NucleicAcids Research 16：10881-90，1988；和Altschul等，Nature Genet.6：119-29，1994。

可从几种来源获得NCBI局部序列比对基本检索工具(BLAST^TM)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-10，1990)，包括国家生物技术信息中心(NCBI，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD))和因特网，与序列分析软件blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。

肽变体一般的特征是经缺口blastp设置为默认参数的NCBI Blast 2.0进行氨基酸序列全长比对计算具有至少50％序列相同性。对于比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列而言，采用Blast 2序列函数，用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵，(存在缺口损失11，每残基缺口损失1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，用Blast 2序列函数，用设置为默认参数的PAM30矩阵(开放缺口9，延伸缺口罚分1)进行比对。当用此方法评价时，与参比序列相似性更大的蛋白显示出相同性百分数提高，如序列相同性为至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，甚至至少99％。当比较少于完整序列的序列相同性时，在10-20个氨基酸的短窗口中同源物和变体的序列相同性一般至少为80％，且序列相同性可以为至少85％、至少90％、至少95％或98％，这取决于它们与参比序列的相似性。在此短窗口中确定序列相同性的方法见位于马里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中心维护的网站。本领域技术人员将理解，提供这些序列相同性的范围仅是为了指导；完全可能获得在所提供范围之外的非常有效的同源物。

类似的方法可用于确定核酸序列的序列相同性百分数。在具体实施例中，比对同源序列与天然序列，通过计算两个序列中存在的相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量来确定匹配数量。通过将匹配数量除以鉴定序列(如SEQ ID NO：11)中所列序列长度，或除以分节长度(如来自鉴定序列中所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将得到的值乘以100来确定序列相同性百分数。例如，与SEQ ID NO：11所列序列比对时具有1166个匹配的核酸序列与SEQ ID NO：11所列序列的相同性为75.0％(即(1166÷1554)*100＝75.0)。应注意，序列相同性百分数值四舍五入到最接近的十分之一。例如，75.11、75.12、75.13和75.14四舍五入到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19四舍五入到75.2。也应注意，长度值总是整数。在另一个实施例中，含有与如下所述鉴定序列的20个连续核苷酸比对的20-核苷酸区域的靶序列含有与该鉴定序列的序列相同性为75％(即15÷20*100＝75)的区域。

        1                 20

靶序列：  AGGTCGTGTACTGTCAGTCA

          | || ||| |||| |||| |

鉴定序列：ACGTGGTGAACTGCCAGTGA

特异性结合物：能够特异性结合于本文所述任何多肽的物质。例子包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体(包括人源单克隆抗体)和单克隆抗体的片段如Fab、F(ab′)₂和Fv片段以及能够特异性结合于这种多肽的表位的任何其它物质。

本文所提供的多肽(或其片段、变体或融合物)的抗体可用于纯化或鉴定这种多肽。本文所提供的氨基酸和核酸序列可用于生产识别本文所述多肽的基于特异性抗体的结合物。

可生产多肽、部分多肽或其变体的单克隆或多克隆抗体。多肽抗原上产生抗一个或多个表位的抗体宜特异性检测该多肽。即，产生抗特定多肽的抗体将识别和结合该特定多肽，基本不会识别和结合其它多肽。通过许多标准免疫测定方法中的任何一种，如Western印迹(参见例如，Sambrook等(编)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)第2版，第1-3卷，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港，1989)来确定抗体与特定多肽特异性结合。

为通过Western印迹测定给定抗体制剂(如在小鼠中产生的抗具有SEQ ID NO：12所列氨基酸序列的多肽的制剂)特异性检测合适的多肽(如具有SEQ ID NO：12所列氨基酸序列的多肽)，从细胞中抽提细胞总蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

然后，可将分离的细胞总蛋白转移到膜(如硝酸纤维素)上，用抗体制剂孵育该膜。洗涤膜去除非特异性结合的抗体后，可用合适的偶联于多肽如碱性磷酸酶的第二抗体(如抗鼠抗体)检测存在的特异性结合的抗体，因为通过免疫定位的碱性磷酸酶应用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四唑鎓导致产生深蓝色化合物。

适合用作免疫原的基本纯的多肽可获自转染细胞、转化细胞或野生型细胞。通过，例如Amicon过滤装置浓缩将最终制剂中多肽浓度调整到几微克/微升的水平。此外，大小范围是全长多肽至少达9个氨基酸残基的多肽可用作免疫原。这种多肽可在细胞培养物中产生、可用标准方法化学合成或可通过将大多肽切割成可纯化的较小多肽而获得。在主要组织相容性复合体(MHC)分子如I型MHC分子或II型MHC分子的情况下，当呈递给免疫系统时，长度少达9个氨基酸残基的多肽可具有免疫原性。因此，具有本文所公开的任何氨基酸序列的至少9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多个连续氨基酸残基可用作生产抗体的免疫原。

可根据Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256：495-7，1975)或其衍生方法从鼠杂交瘤制备本文所公开的任何多肽的单克隆抗体。

可通过用多肽(或其片段)免疫合适的动物来制备含有本文所公开任何多肽的异源表位的抗体的多克隆抗血清，该多肽可以是未修饰或经修饰提高免疫原性的多肽。免疫兔的有效方法可参见Vaitukaitis等(J.Clin.Endocrinol.Metab.33：988-91，1971)。

可用抗体片段代替整个抗体，并可在原核宿主细胞中容易地表达抗体片段。制造和使用单克隆抗体的免疫有效部分，也称为“抗体片段”的方法是熟知的，包括Better和Horowitz(Methods Enzymol.178：476-96，1989)、Glockshuber等(Biochemistry29：1362-7，1990)、美国专利号5,648,237(“功能性抗体片段的表达”(Expression ofFunctional Antibody Fragments))、美国专利号4,946,778(“单多肽链结合分子”(SinglePolypeptide Chain Binding Molecules))、美国专利号5,455,030(“采用单链多肽结合分子的免疫疗法”(Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules))和其中引用的参考文献中描述的方法。

立体反转性转氨酶：“立体反转性转氨酶”采用手性相反的底物作为氨基供体时能够优选或选择性产生手性氨基酸产物(如莫纳甜)的多肽。例如，立体反转性转氨酶可以是优选或选择性采用L-谷氨酸作为底物来产生R，R莫纳甜的D-苯基甘氨酸转氨酶(也称为D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶)。立体反转性转氨酶的非限制性例子包括D-甲硫氨酸转氨酶(EC 2.6.1.41)和具有D-苯基甘氨酸转氨酶活性或D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶活性的酶。

转化的：“转化的”细胞是通过例如分子生物学技术引入了核酸分子的细胞。转化包括可将核酸分子引入细胞的所有技术，包括但不限于：用病毒载体转染、接合、用质粒载体转化和通过电穿孔引入裸DNA、脂质转染和基因枪加速。

变体、片段或融合蛋白：所公开的蛋白包括其变体、片段和融合物。经工程改造，编码蛋白质(例如SEQ ID NO：12)、融合蛋白或蛋白片段或变体的DNA序列(例如SEQ ID NO：11)可在真核细胞、细菌、昆虫和/或植物中表达该蛋白。为了获得表达，可改变DNA序列，且操作性连接于其它调节序列。将含有调节序列和蛋白的最终产物称为载体。可将该载体引入真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞和/或植物细胞。引入细胞后，该载体可产生所述蛋白。

融合蛋白可包括连接于不抑制所需蛋白活性，例如将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的能力的其它氨基酸序列的蛋白，如色氨酸转氨酶(或其变体、多态形式、突变体或片段)如SEQ ID NO：12。在一个实施例中，所述其它氨基酸序列的长度不超过约10、12、15、20、25、30或50个氨基酸。

本领域普通技术人员将理解，可用不影响编码蛋白生物活性的许多方式改变DNA序列。例如，可用PCR在编码蛋白的DNA序列中产生变异。这种变体可以是用于表达该蛋白的宿主细胞中密码子偏好优化的变体，或促进表达的其它序列改变。

载体：将核酸分子引入细胞，产生转化细胞。载体可包括允许它在细胞中复制，如含有复制起点的核酸序列。载体也可包括一个或多个可选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件。

生物合成途径概述

如图1-3和11-13所示，可用许多生物合成途径产生莫纳甜或其中间体如吲哚-3-丙酮酸或MP。对于各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)向各产物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫纳甜)的转化，可采用几种不同多肽。而且，可在体内、体外、或通过体内反应和体外反应的组合，如包括无酶化学反应的体外反应来进行这些反应。因此，图1-3和11-13是示范，显示可用于获得所需产物的多种不同途径。

葡萄糖到色氨酸

许多生物体能从葡萄糖合成色氨酸。含从葡萄糖和/或色氨酸生成莫纳甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的构建物可克隆入这种生物体中。本文显示色氨酸可转化成莫纳甜。

在其它例子中，用已知多肽改造生物体可产生色氨酸或过量产生色氨酸。例如，美国专利号4,371,614(纳入本文作参考)描述了用含野生型色氨酸操纵子的质粒转化大肠杆菌菌株。

美国专利号4,371,614所述色氨酸的最大效价约为230ppm。类似地，WO8701130(纳入本文作参考)描述了经遗传改造以生成色氨酸的大肠杆菌菌株并讨论了增加发酵生产的L-色氨酸。本领域技术人员认识到能从葡萄糖生成色氨酸的生物体也能利用其它可转化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，结果类似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纤维素或甘油。

色氨酸到吲哚-3-丙酮酸

可用一些多肽将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括酶种类(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21。这些种类包括称为色氨酸转氨酶的多肽(也称为L-苯丙氨酸-2-酮戊二酸转氨酶、色氨酸转氨酶、5-羟基色氨酸-酮戊二酸转氨酶、羟基色氨酸转氨酶、L-色氨酸氨基转移酶、L-色氨酸转氨酶、和L-色氨酸：2-酮戊二酸转氨酶)，它将L-色氨酸和2-酮戊二酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酰胺；D-色氨酸转氨酶，它将D-色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶(也称为NAD(P)-L-色氨酸脱氢酶、L-色氨酸脱氢酶、L-Trp-脱氢酶、TDH和L-色氨酸：NAD(P)氧化还原酶(脱氨))，它将L-色氨酸和NAD(P)转化成吲哚-3-丙酮酸和NH₃和NAD(P)H；D-氨基酸脱氢酶，它使D-氨基酸和FAD转化成吲哚-3-丙酮酸和NH₃和FADH₂；色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(也称为L-色氨酸-α-酮异己酸转氨酶和L-色氨酸：苯基丙酮酸转氨酶)，它将L-色氨酸和苯基丙酮酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨))，它使L-氨基酸和H₂O和O₂转化成2-含氧酸和NH₃以及H₂O₂；D-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨))，它将D-氨基酸和H₂O和O₂转化成2-含氧酸和NH₃以及H₂O₂；色氨酸氧化酶，它使L-色氨酸和H₂O和O₂转化成吲哚-3-丙酮酸和NH₃以及H₂O₂。这些种类也含有酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和有多种转氨酶活性的广(多底物)转氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。

转氨酶种类中有这种活性的11个成员描述于下面的实施例1，包括SEQ IDNO：11和12所示的新转氨酶。因此，本发明提供分离的核酸和蛋白序列，与SEQ IDNO：11和12有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列相同性。本发明也涵盖SEQ ID NO：11和12的片段和融合体，它们保持转氨酶活性或编码具有转氨酶活性的蛋白。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000个SEQ ID NO：11的毗连核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350个SEQ ID NO：12的毗连氨基酸。所示序列(和其变体、片段和融合体)可以是载体的一部分。载体能用于转化宿主细胞，从而生成重组细胞，重组细胞可从色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能进一步产生MP和/或莫纳甜。

L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)是已知的，其序列可分离自一些不同来源，如地中海蝰(Vipera lebetine)(sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah)(sp P81383)、红口蝮(Agkistrodon rhodostonma)(sp P81382)、西部菱斑响尾蛇(Crotalus atrox)(sp P56742)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepaica)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄杆菌(Caulobacter cresentus)、莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Musmusculus)、丁香假单胞菌(P.Syringae)和红球菌属(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文献且可分离自例如鬼伞属(Coprinus)SF-1、有根肿病的大白菜、拟南芥和哺乳动物的肝。下面在实施例5中讨论可将色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸的L-氨基酸氧化酶分类的一个成员，以及其它分子克隆来源。在用于分子克隆的数据库中可获得许多D-氨基酸氧化酶基因。

色氨酸脱氢酶是已知的，并可分离自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黄花牧豆树(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆树、小麦、玉米、番茄、烟草、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和乳杆菌(Lactobacilli)。许多D-氨基酸脱氢酶基因序列已知。

美国5,728,555公开了苯丙氨酸脱氨酶(EC 3.5.1.-)，它也可在水存在下将色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸和铵。这些广泛特异性酶可从变形菌属(Proteus)微生物分离，如产粘变形菌(Proteus myxofaciens)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、普通变形菌(Proteusvulgaris)和摩氏变形菌(Proteus morganii)，对相应基因进行克隆和测序。参见例如普通变形菌脱氨酶(蛋白质登录号：BAA90864.1 GI：7007412；基因登录号：AB030003.1GI：7007411)；奇异变形菌脱氨酶(蛋白质登录号：AAA86752.1 GI：1015426；基因登录号：U35383.1 GI：1015425)。普罗威登斯菌(Providencia)和摩根菌(Morganella)也含有可将色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸的L-脱氨酶。参见H.Drechsel，A.Thieken，R.Reissbrodt，G.Jung和G.Winlcelmann，J.Bacterid.，175：2727-2733(1993)。

如图11-13所示，如果用氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸，能加入过氧化氢酶以减少或甚至去除过氧化氢的存在。

吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸

将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的反应可通过各种多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽类的成员。1.1.1.110多肽类包括吲哚乳酸脱氢酶(也称为吲哚乳酸：NAD⁺氧化还原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3类包括乳酸脱氢酶(也称为乳酸脱氢酶、乳酸：NAD⁺氧化还原酶)。1.1.1.222类包括(R)-4-羟苯基乳酸脱氢酶(也称为D-芳族乳酸脱氢酶、R-芳族乳酸脱氢酶和R-3-(4-羟苯基)乳酸：NAD(P)⁺2-氧化还原酶)且1.1.1.237类包括3-(4-羟苯基丙酮酸)还原酶(也称为羟苯基丙酮酸还原酶和4-羟苯基乳酸：NAD⁺氧化还原酶)。1.1.3.-类包括乳酸氧化酶，1.1.1.111类包括(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(也称为(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸：NAD(P)⁺氧化还原酶)。可能这些种类中的一些多肽能从吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。实施例4提供了这种转变的例子。

化学反应也可用于将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸。这种化学反应包括能用一些方法完成的氧化步骤，例如：使用B2催化剂的空气氧化(China ChemicalReporter，13卷，28期，18页(1)，2002)，金属催化剂存在时稀释高锰酸盐和高氯酸盐或过氧化氢。

吲哚-3-丙酮酸到2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(MP)

一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸转化成MP。示范多肽种类包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。这些种类包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2种羧酸底物缩合的醛缩酶。肽类EC4.1.3.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电体，而EC 4.1.2.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作为亲电体。

例如，EP 1045-029中所述多肽(EC 4.1.3.16、4-羟基-2-酮戊二酸乙醛酸-裂合酶，也称为4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶、2-氧-4-羟基戊二酸醛缩酶或KHG醛缩酶)将乙醛酸和丙酮酸转化成4-羟基-2-酮戊二酸，多肽4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17，也称为4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛缩酶)缩合2种酮酸如2个丙酮酸到4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸。本文描述利用这些裂合酶的反应。

图1-2和11-13显示这些反应的示意图，其中3-碳(C3)分子结合吲哚-3-丙酮酸。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的许多成员，特别是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇缩合需要此途径的3个碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作为C3碳源且可转化成丙酮酸。可通过许多利用PLP的转氨酶来转氨以产生丙酮酸，包括许多上述的转氨酶。可通过β消除反应(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)获得丙酮酸和氨，反应用于L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有足够离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介导的β-裂合酶反应中用作丙酮酸的来源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC4.1.99.2，也称为酪氨酸-酚裂合酶)催化的反应。通过在(4.1.99.1-2)多肽上进行定点诱变可增加β-裂合酶反应速率，如Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)和实施例5所述。这些修饰使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸盐也能用作丙酮酸的来源，且通过加入乳酸脱氢酶和氧化辅因子或乳酸氧化酶和氧来氧化成丙酮酸。这些反应的例子在下文描述。例如，如图2和图11-13所示，当丙酮酸用作C3分子时，ProA醛缩酶能接触吲哚-3-丙酮酸。

也可采用化学反应，如实施例8所述的醇醛缩合产生MP。

MP到莫纳甜

MP到莫纳甜的转化可由下列1个或多个催化：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)或更多转氨酶家族(2.6.1.-)的一般成员如天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(图2)。转氨酶类的11个成员在下文描述(实施例1)，包括SEQ ID NO：11和12所示新的种类成员，实施例15提供证明转氨酶和脱氢酶活性的反应。

此反应也能用化学反应进行。通过还原性氨基化用氨和氰基硼氢化钠进行酮酸(MP)氨基化。

图11-13显示其它多肽，它们能用于使MP转化成莫纳甜，以及提供增加来自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫纳甜产量的方法。例如，如果天冬氨酸用作氨基供体，天冬氨酸转氨酶能用于使天冬氨酸转化成草酰乙酸(图11)。草酰乙酸通过脱羧酶(如草酰乙酸脱羧酶)转化成丙酮酸和二氧化碳(图11)。此外，如果赖氨酸用作氨基供体，赖氨酸ε转氨酶(EC 2.6.1.36)可用于使赖氨酸转化成ε-醛基赖氨酸(图12)。ε-醛基赖氨酸自发转化成1-哌啶6-羧酸盐(图12)。类似于图12的类似方法采用鸟氨酸δ-转氨酶(EC 2.6.1.13)代替赖氨酸ε转氨酶，鸟氨酸用作氨基供体。如果能催化还原性氨基化反应的多肽(如谷氨酸脱氢酶)用于将MP转化成莫纳甜，可使用能再循环NAD(P)H和/或产生挥发性产物的多肽，如甲酸脱氢酶。

设计生物合成途径中的其它考虑

根据采用哪种多肽产生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜，给生产细胞提供辅因子、底物和/或其它多肽以增加产物形成。

去除过氧化氢

过氧化氢(H₂O₂)是一种产物，如果产生，可对生产细胞有毒、并可损害多肽或产生的中间体。上述L-氨基酸氧化酶产生H₂O₂作为产物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H₂O₂或其水平减少以降低对细胞或产物的潜在损伤。

过氧化氢酶能用于降低细胞中的H2O2水平(图11-13)。生产细胞可表达编码过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化过氧化氢分解成水和氧气。例如，过氧化氢酶可从转染入生产细胞的载体中表达。能使用的过氧化氢酶例子包括但不限于：tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、tr|Q9URJ7(白假丝酵母(Candida albicans))、tr|P77948(天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor))、tr|Q9RBJ5(野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris))(SwissProt登录号)。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反应器也能包含过氧化氢酶多肽。

PLP(吡哆醛-5’-磷酸)有效性的调节

如图1所示，PLP可用于本文所述1个或多个生物合成步骤。能补充PLP浓度，从而PLP不成为对反应总效率的限制。

已充分研究大肠杆菌中维生素B₆(PLP的前体)的生物合成途径且已结晶一些蛋白质(Laber等，FEBS Letters，449：45-8，1999)。其它代谢途径中需要2个基因(epd或gapB和serC)，而3个基因(pdxA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成独有的。大肠杆菌途径中的起始物质之一是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。从共同的2和3碳中心代谢物合成此前体是由多肽1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前体是从4-碳糖，D-赤藓糖4-磷酸形成的苏氨酸衍生物。转化到磷酸-4-羟基-L苏氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一个反应是DXP与HTP间的复杂分子内缩合和闭环反应，由pdxA和pdxJ的基因产物催化。

如果PLP成为发酵生产莫纳甜期间的限制营养物，可增加1个或多个途径中的基因在生产宿主细胞中的表达来提高莫纳甜产量。宿主生物体可包含多拷贝的天然途径基因，或非天然途径基因的拷贝可掺入生物体的基因组中。另外，可在宿主生物体内克隆入多拷贝的拯救途径基因中。

在所有生物体中保守的1个拯救途径使各种维生素B6的衍生物再循环成活性PLP形式。参与此途径的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。过量表达1个或多个这些基因可增加PLP有效性。

可通过去除或阻抑宿主生物体中天然生物合成途径基因的代谢调节提高维生素B₆水平。PLP阻抑参与黄杆菌属(Flavobacterium)菌株238-7中前体苏氨酸衍生物的生物合成的多肽。此细菌菌株无代谢控制，过量产生吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以类似方式遗传操作产生莫纳甜的宿主生物体可增加PLP生成而不过度表达生物合成途径基因。

铵利用

通过制备更能利用的氨或去除水能驱动色氨酸酶反应趋向合成方向(从吲哚生成色氨酸)。还原性氨基化反应如由谷氨酸氢化酶催化的反应，也能通过铵过量来驱动。

氨可作为碳酸或磷酸缓冲系统中的碳酸铵或磷酸铵盐而得到。氨也能作为丙酮酸铵或甲酸铵提供。另外，如果反应偶联于产生氨的反应如谷氨酸脱氢酶、色氨酸脱氢酶或支链脱氢酶，可提供氨。加入EC 4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能产生氨，底物会水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH₃。通过酶水解其优选底物也能使增加的合成产物的产量超过正常平衡量。

除去产物和副产物

色氨酸经色氨酸转氨酶转化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影响吲哚-3-丙酮酸的产率，因为反应生成谷氨酰胺并需要共底物2-酮戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酰胺可引起转氨酶的抑制，反应会消耗大量共底物。此外，高谷氨酸浓度对下游分离过程有害。

多肽谷氨酸脱氢酶(GLDH)将谷氨酸转化成2-酮戊二酸，从而在反应中再循环共底物，反应由色氨酸转氨酶催化。GLDH也产生还原性等效物(NADH或NADPH)，能用于在需氧条件下产生细胞所用能量(ATP)。通过GLDH利用谷氨酸也减少副产物形成。另外，反应产生氨，它能用作细胞的氮源或作为图1所示最后步骤中还原性氨基化的底物。因此，过度表达GLDH多肽的生产细胞能用于增加产量和降低培养基和/或分离方法的成本。

在色氨酸到莫纳甜的途径中，如果使用来自适当酶类的转氨酶，步骤3的氨基供体(如谷氨酸或天冬氨酸)可反转化成步骤1所需的氨基受体(如2-酮戊二酸或草酰乙酸)。使用此途径的2种独立的转氨酶能提高此途径的效率，其中1种转氨酶的底物非竞争性抑制其它转氨酶的活性。

所述途径中的许多反应是可逆的，因此可达到底物和产物间的平衡。可通过从多肽中连续取出产物来增加途径的产量。例如，用通透酶或其它转运蛋白使莫纳甜分泌入发酵液，或者从生物催化反应器流中选择性结晶莫纳甜并伴随底物再循环会提高反应产量。

另一种增加反应产量的方法是通过另外的酶反应或通过氨基供体基团的取代来去除副产物。实施例21和图11-13显示了几个例子。理想的是，通过相变(蒸发)或自发转变为无反应性的终产物如二氧化碳使产生的副产物不能以反方向反应。

底物库的调节

可通过增加色氨酸前体生成和/或改变包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代谢途径调节吲哚库。例如，可通过宿主细胞中编码EC 4.1.1.74的基因功能性缺失来减少或去除从吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸。可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC4.1.99.1的基因减少或去除从色氨酸生成吲哚。另外，过量吲哚能用作体外或体内过程中的底物，结合增加量的编码EC 4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.，82：604-6，1996)。可进行遗传修饰以增加中间体，如D-赤藓糖-4-磷酸和分支酸的水平。

在大多数生物体中调节了色氨酸产量。一种机制是通过反馈抑制该途径中的某些酶；随着色氨酸水平提高，色氨酸的生产速率降低。因此，采用经工程改造通过色氨酸中间体生产莫纳甜的宿主细胞时，可采用对色氨酸浓度不敏感的生物体。例如，通过重复接触高浓度的5-甲基色氨酸选择对多种色氨酸类似物的生长抑制作用有抗性的长春花(Catharanthus roseus)品系(Schallenberg和Berlin，Z Naturforsch 34：541-5，1979)。得到的该品系的色氨酸合酶活性受产物抑制作用的影响较小，可能是由于基因突变的缘故。相似地，可优化用于生产莫纳甜的宿主细胞。

可通过采用定向演化以产生对产物抑制作用敏感性较低的多态，以优化色氨酸生产。例如，可在培养基中不含色氨酸、但含有高水平不可代谢的色氨酸类似物的的平板上进行筛选。美国专利5,756,345；4,742,007；和4,371,614描述了用于提高发酵生物的色氨酸产量的方法。色氨酸生物合成的最后一个步骤是将丝氨酸加入吲哚；因此可提高丝氨酸的有效性，以提高色氨酸产量。

可通过提高宿主生物产生的丙酮酸产量提高发酵生物产生的莫纳甜产量。某些酵母，如皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.35：338-42，2002)和光滑球拟酵母菌(Torulopsis glabrata)(Li等，Appl Microbiol.Biotechnol.57：451-9，2001)过量产生丙酮酸，并可用于实施本文所述的方法。此外，可对生物体，如大肠杆菌菌株W1485lip 2进行遗传修饰，以促进丙酮酸生产(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.82：604-6，1996)。

控制手性

通过控制分子的立体化学(手性)能改变莫纳甜的味觉特性。例如，不同食物系统的浓度不同的混合物中需要不同的莫纳甜异构体。通过pH和多肽的组合控制手性可。

通过α碳的去质子化和再质子化可在莫纳甜的C-4位置(见上面编号的分子)外消旋，这能通过pH变化或辅因子PLP反应来发生。在微生物中，pH不太可能变化到足以引起外消旋，但PLP是充足的。控制多肽手性的方法取决于用于生成莫纳甜的生物合成途径。

当用图2所示途径形成莫纳甜时，可考虑下列各项。在生物催化反应中，碳-2的手性由酶确定，该酶将吲哚-3-丙酮酸转化成MP。多种酶(如来自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸转化成MP，因此可选择形成所需立体异构体的酶。另外，可用定向进化改变将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶的对映特异性，或能改造催化抗体以催化所需反应。一旦生成MP(通过酶法或化学缩合)，可用转氨酶立体特异性加入氨基，如本文所述的转氨酶。能产生碳-4的R或S构象，这取决于使用D-还是L-芳族酸转氨酶。大部分转氨酶对L-异构体有特异性，然而，在某些植物中存在D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B₆和羰基催化讨论会会议录》，日本大阪，1990)。此外，鉴定了D-丙氨酸转氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.22)。某些转氨酶可能仅接受在C2碳具有特定构象的反应底物。因此，即使转化成MP不是立体有择的，可通过适当选择转氨酶控制终产物的立体化学。由于反应是可逆的，未反应MP(不需要的异构体)可再循环回到其组分且可再形成MP的外消旋混合物。

底物的激活

磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)可用于本文所示反应。磷酸化底物可在能量上更有利，因此可用于增加反应速度和/或产量。在醛醇缩合中，加入磷酸基团稳定亲核底物的烯醇互变异构体，使它更具反应性。在其它反应中，磷酸化底物常常提供更好的离去基团。类似地，可通过转化成CoA衍生物或焦磷酸盐衍生物激活底物。

说明性实施方式

在一个实施方式中，可通过包括采用转氨酶如HEXAspC转氨酶(NCBI登录号：1AHF_A GI：1127190)的方法生产莫纳甜或其盐。例如，HEXAspC转氨酶可用于促进至少一种反应，该反应的底物选自色氨酸、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其组合。

在另一实施方式中，可通过包括采用支链转氨酶(BCAT)(EC 2.6.1.42)和/或支链脱氢酶(EC 1.4.1.9)的方法生产莫纳甜或其盐。例如，支链转氨酶和/或支链脱氢酶可用于促进2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的反应。合适的支链转氨酶(BCAT)(EC 2.6.1.42)可包括AT-102或AT-104。合适的支链脱氢酶(EC 1.4.1.9)可包括AADH-110。

在另一实施方式中，可通过包括采用醛缩酶如KHG醛缩酶的方法生产2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐。合适的KHG醛缩酶可包括运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV89621.1 GI：56543467)和/或包含与运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV89621.1 GI：56543467)至少约90％相同的氨基酸序列并且具有运动发酵单胞菌KHG醛缩酶活性的多肽。在一些实施方式中，合适的醛缩酶可包括包含与运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV89621.1 GI：56543467)至少约95％相同或至少约99％相同的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有运动发酵单胞菌KHG醛缩酶活性。所选醛缩酶可用于促进包括用于合成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的底物如吲哚-3-丙酮酸的反应。

在其它实施方式中，通过以下方法生产莫纳甜或其盐，该方法包括采用醛缩酶促进包括用于合成莫纳甜的底物的反应，其中反应中产生的60％以上莫纳甜是莫纳甜的R，R立体异构体。适用于该反应的醛缩酶可包括KHG醛缩酶(EC 4.1.3.16)，适用于该反应的底物可包括吲哚-3-丙酮酸。

在其它实施方式中，可通过包括使合适的反应混合物发生反应的方法生产2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸，所述混合物包含：(a)合适底物如色氨酸；(b)第一种多肽，选自HEXAspC转氨酶(NCBI登录号：1AHF_A GI：1127190)、YfdZ(NCBI登录号AAC75438.1)或其组合；和(c)第二种多肽，选自KHG醛缩酶(EC 4.1.3.16)、ProA醛缩酶(EC 4.1.3.17)或其组合。底物包含色氨酸时，色氨酸可包括D-色氨酸、L-色氨酸和其混合物。色氨酸可以加入反应混合物和/或通过合适底物(如葡萄糖和丝氨酸)的反应原位生产。在一些实施方式中，色氨酸包括D-色氨酸。KHG醛缩酶可包括运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV8621.1 GI：56543467)和/或包含与运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV89621.1 GI：56543467)至少约90％相同的氨基酸序列并且具有运动发酵单胞菌KHG醛缩酶活性的多肽。在一些实施方式中，合适的醛缩酶可包括包含与运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV89621.1GI：56543467)至少约95％相同或至少约99％相同的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有运动发酵单胞菌KHG醛缩酶活性。在一些实施方式中，ProA醛缩酶可包括睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶、苜蓿根瘤菌ProA醛缩酶和其组合。所选多肽可以加入反应混合物和/或由反应混合物中存在的微生物表达。例如，反应混合物可包含营养培养基，从而通过用表达该多肽的合适微生物发酵营养培养基生产所选多肽。

在其它实施方式中，可通过反应混合物的反应生产莫纳甜或其盐，所述反应混合物包含：(a)合适底物如2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸；和(b)一种多肽，选自YfdZ(NCBI登录号AAC75438.1)、HEXAspC转氨酶(NCBI登录号：1AHF_AGI：1127190)、支链转氨酶(BCAT)(EC 2.6.1.42)、支链脱氢酶(EC 1.4.1.9)或其组合。2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸可以加入该反应混合物和/或可原位合成。例如，该反应混合物还可含有(c)吲哚-3-丙酮酸；和(d)能够将吲哚-3-丙酮酸和C3碳源转变为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的第二种多肽。吲哚-3-丙酮酸可加入该反应混合物和/或可由合适底物原位合成。所选多肽可加入该反应混合物和/或可由该反应混合物中存在的微生物表达。例如，该反应混合物可包含用表达一种或多种所选多肽的微生物发酵的营养培养基。在一些实施方式中，该反应混合物可含有未纯化细胞提取物，如含有YfdZ(NCBI登录号AAC75438.1)、HEXAspC转氨酶(NCBI登录号：1AHF_A GI：1127190)或其组合的细胞提取物。

在一些实施方式中，可通过以下反应混合物的反应生产莫纳甜或其盐，所述反应混合物包含：(a)合适底物如2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸；和(b)一种多肽，选自AT-101、AT-102、AT-103、AT-104、AADH-102、AADH-110、AADH-112、AADH-113或其组合。在一些实施方式中，所选多肽可以是AT-103。该方法生产的莫纳甜或其盐可能主要是莫纳甜的R，R立体异构体。例如，在一些实施方式中，该方法生产的至少约65％莫纳甜可能是莫纳甜的R，R立体异构体。

在其它实施方式中，可通过酶学生产莫纳甜组合物，以由底物(如色氨酸和/或吲哚-3-丙酮酸)生产莫纳甜或其盐，其中该莫纳甜组合物中存在的至少约80％的莫纳甜或其盐是莫纳甜的R，R立体异构体。在该方法的合适实施方式中，该莫纳甜组合物中存在的至少约84％的莫纳甜或其盐是莫纳甜的R，R立体异构体。合适的底物可包含色氨酸，其包括D-色氨酸、L-色氨酸和其混合物。在一些实施方式中，所选底物是D-色氨酸。该方法可包括提供ProA醛缩酶(EC 4.1.3.17)。例如，可提供ProA醛缩酶(EC 4.1.3.17)以促进吲哚-3-丙酮酸转变为2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸。在一些实施方式中，该方法可包括提供转氨酶如AT-103(D-转氨酶)。例如，可提供AT-103(D-转氨酶)以促进2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸转变为莫纳甜。

在其它实施方式中，可通过包括使以下反应混合物发生反应的方法生产莫纳甜或其盐，所述混合物包含：(a)一种底物，选自色氨酸、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其组合；和(b)大肠杆菌AspC多肽(NCBI登录号AAC74014.1)。大肠杆菌AspC多肽(NCBI登录号AAC74014.1)可在选自位置39、41、47、69、109、297或其组合的氨基酸位置上含有至少一个取代，其中氨基酸位置的编号基于猪胞浆天冬氨酸转氨酶编号系统。在合适的实施方式中，大肠杆菌AspC多肽可具有天冬氨酸转氨酶活性。大肠杆菌AspC多肽可包含至少一种以下取代：Val 39→Leu取代；Lys 41→Tyr取代；Thr 47→Ile取代；Asn 69→Leu取代；Thr 109→Ser取代；Asn 297→Ser取代；和其组合。该底物可以加入该反应混合物和/或由合适底物原位生产。大肠杆菌AspC多肽可加入该反应混合物和/或由反应混合物中存在的微生物表达(如通过用表达大肠杆菌AspC多肽的微生物发酵包含营养培养基的反应混合物)。

在其它实施方式中，可通过使以下反应混合物发生反应生产2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐，所述混合物包含：(a)一种底物，如吲哚-3-丙酮酸；和(b)合适的醛缩酶。例如，所述醛缩酶可选自大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)菌株USDA110(NCBI登录号：GI：27378953)；少动鞘胺醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)(假单胞菌)(NCBI登录号：GI：19918963)；鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)KIM(NCBI登录号：GI：21956715)；Ralstonia metallidurans CH34(NCBI登录号：GI：48767386)；假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)IP32953(NCBI登录号：GI：51594436)；豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)蚕豆生物型rhiz23g02-plk_1009_341(SEQ ID NO：88)；溶芳烃新鞘氨醇单胞菌(Novosphingobiumaromaticivorans)DSM 12444(溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)F199))(NCBI登录号：GI：48849026)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440(NCBI登录号：GI：24984081)；趋磁螺菌(Magnetospirillum magnetotacticum)MS-I(NCBI登录号：GI：46200890)；沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009(NCBI登录号：GI：39937756)；野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC-33913(NCBI登录号：GI：21115297)；地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)柑桔变种306(NCBI登录号：GI：21110581)；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)MA-4680(NCBI登录号：GI：29828159)；或其组合。底物(如吲哚-3-丙酮酸)可加入该反应混合物和/或可由合适底物原位产生。醛缩酶可加入该反应混合物和/或可由反应混合物中存在的微生物表达(如通过用表达所选醛缩酶的微生物发酵包含营养培养基的反应混合物)。

在其它实施方式中，可通过使以下反应混合物发生反应生产2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐，所述混合物包含：(a)底物，如吲哚-3-丙酮酸；和(b)合适醛缩酶。例如，合适醛缩酶可包含与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)至少约49％相同的氨基酸序列或与苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)至少约56％相同的氨基酸序列，其中该醛缩酶具有4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸裂合酶活性。在一些合适的实施方式中，醛缩酶可包含与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)至少约60％、70％、80％、90％、95％和/或99％相同的氨基酸序列和/或与苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)至少约60％、70％、80％、90％、95％和/或99％相同的氨基酸序列，其中该醛缩酶具有4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸裂合酶活性。在一些实施方式中，该醛缩酶包含与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)至少约60％相同的氨基酸序列。在其它实施方式中，该醛缩酶包含与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)至少约70％相同的氨基酸序列。底物(如吲哚-3-丙酮酸)可以加入该反应混合物和/或由反应混合物中的合适底物原位产生。该醛缩酶可以加入该反应混合物和/或可由反应混合物中存在的微生物表达(如通过用表达所选醛缩酶的微生物发酵包含营养培养基的反应混合物)。

在其它实施方式中，可通过包括使以下反应混合物发生反应的方法生产莫纳甜或其盐，所述混合物包含：(a)一种底物如色氨酸；和合适的脱氨酶(EC 3.5.1.-)。在一些实施方式中，该脱氨酶衍生自选自下组的微生物：变形菌、普罗威登斯菌、摩根菌或其组合。合适的脱氨酶可包括衍生自变形菌属的脱氨酶，变形菌属包括但不限于：产粘变形菌、奇异变形菌、普通变形菌、摩氏变形菌和其组合。色氨酸可加入该反应混合物和/或可由合适底物原位生产。该脱氨酶可加入该反应混合物和/或可由该反应混合物中存在的微生物表达(如通过用表达所选脱氨酶的微生物发酵包含营养培养基的反应混合物)。

实施例

实施例1

色氨酸转氨酶的克隆和表达

该实施例描述用于克隆色氨酸转氨酶的方法，它可用于使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。将基因克隆入pET 30 Xa/LIC载体中以产生具有可切割的N末端HIS₆-标记/T7-标记的融合蛋白。用固定金属亲和层析纯化得到的蛋白。

实验概述

11个编码转氨酶的基因克隆入大肠杆菌中。这些基因是枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat，Genbank登录号Y14082.1 bp 28622-29470和Genbank登录号NP_388848.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿中华根瘤菌(也称为苜蓿根瘤菌)酪氨酸转氨酶(tatA，SEQ ID NO：1和2，分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1酪氨酸转氨酶(tatA通过同源性确定，SEQ ID NO：3和4，分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球细红菌35053酪氨酸转氨酶(通过同源性确定，SEQ ID NO：5和6，分别为核酸序列和氨基酸序列)，硕大利什曼原虫广底物转氨酶(bsat，通过与来自墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)的肽片段的同源性确定，SEQ ID NO：7和8，分别为核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NO：9和10，分别为核酸序列和氨基酸序列)、食淀粉乳杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NO：11和12，分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌35053多底物转氨酶(通过同源性确定，SEQ ID NO：13和14，分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1多底物转氨酶(msa，通过同源性确定，Genbank登录号NZ_AAAE01000093.1，bp 14743-16155和Genbank登录号ZP-00005082.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(aspC，Genbank登录号AE000195.1bp2755-1565和Genbank登录号AAC74014.1，分别为核酸序列和氨基酸序列)和大肠杆菌酪氨酸转氨酶(tyrB，SEQ ID NO：31和32，分别为核酸序列和氨基酸序列)。

将这些基因克隆、表达并测试其将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的活性，同时检测市售酶的活性。所有十一个克隆都有活性。

鉴定可包含具有所需活性的多肽的细菌菌株

NCBI(全国生物技术信息中心)数据库中没有基因命名为色氨酸转氨酶。然而，鉴定了有此酶活性的生物体。在细胞提取物或从纯化蛋白中测量到L-色氨酸转氨酶(TAT)活性，来源如下：八花羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌分离物、豌豆线粒体和细胞溶质、向日葵冠瘿细胞、豌豆根瘤菌三叶草生物变种(Rhizobium leguminosarumbiovartrifoli)、草生欧文氏菌石头花致病变种(Erwinia herbicola pv.gypsophilae)、丁香假单胞菌萨氏致病变种(Pseudomonas syringae pv.savastanio)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、麦芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、大鼠脑、大鼠肝、苜蓿中华根瘤菌、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CHA0、乳酸乳杆菌(Lactococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、小麦苗、大麦、金色菜豆(Phaseolus aureus)(绿豆)、葡萄状酵母(卡尔斯伯根糖酵母)、利什曼原虫属、玉米、番茄茎、豌豆植物、烟草、猪、生孢梭菌(C.Sporogenes)和灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)。

分离基因组DNA用于克隆

在TY培养基中，25℃、pH 7.2下培养苜蓿中华根瘤菌(ATCC号9930)。细胞生长至600nm处的光密度(OD₆₀₀)为1.85，用2％接种物制备基因组DNA。用凯杰genomic tip 20/G试剂盒(加州巴伦西亚(Valencia，CA))分离基因组DNA。

在Bereto营养肉汤(戴福科公司(Difco)；密歇根州底特律)中，30℃下培养枯草芽孢杆菌6051(ATCC)。用凯杰genomic tip 20/G法分离基因组DNA，作出以下改变：蛋白酶K和溶菌酶的浓度加倍，孵育时间增加2-3倍。

由加拿大魁北克IDI公司(IDI，Inc.，Quebec，Canada)提供溶于TE缓冲液(pH8.0)的硕大利什曼原虫ATCC 50122基因组DNA，17ng/μL。

用标准酚抽提制备类球红细菌2.4.1(由休斯敦得克萨斯大学的Sam Kaplan教授提供)、类球红细菌35053(ATCC号)和食淀粉乳杆菌基因组DNA。在对数生长晚期收获细胞，重悬于TEN缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，100mM NaCl)，向每毫升细胞悬液中加入0.024mL月桂酰肌氨酸钠来裂解细胞。用等体积的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)饱和酚抽提至少三次后，用氯仿:辛醇9:1抽提DNA溶液一次，用氯仿抽提三次。通过加入0.1倍体积的3M乙酸钠(pH6.8)和2倍体积的乙醇来沉淀DNA。离心收集沉淀物，用70％乙醇洗涤一次。最后，将DNA溶解于0.10mL蒸馏水中。

从菌株DH10B(英杰公司(Invitrogen))中分离大肠杆菌基因组DNA并用凯杰Genomic-tip^TM(500/G)试剂盒制备。从LB中生长到OD₆₅₀为1.87的30mL该菌株中获得0.3mg纯化的DNA。将纯化的DNA溶于凯杰洗脱缓冲液(EB)，浓度为0.37。

基因银行基因银行基因银行基因银行基因银行基因银行加州巴伦西亚密歇根州底特律起始密码子

聚合酶链反应流程

为pET 30 Xa/LIC载体(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)设计具有相容突出端的引物。pET载体在Xa/LIC位点的5’侧具有12个碱基的单链突出端，在Xa/LIC位点的3’侧具有15个碱基的单链突出端。该质粒设计用于不依赖连接的克隆，具有N末端His和S标记以及任选的C末端His标记。Xa蛋白酶识别位点(IEGR)正好在感兴趣基因的起始密码子的前方，以致可去除融合蛋白标记。

当设计引物时，将以下序列加入生物特异性序列的5’端：正向引物：5’GGTATTGAGGGTCGC(SEQ ID NO：73)；反向引物：5’AGAGGAGAGTTAGAGCC(SEQ ID NO：74)。

枯草芽孢杆菌dat引物：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3’和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3’(SEQ IDNO：15和16)。

苜蓿中华根瘤菌tatA引物：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC(SEQ IDNO：17和18)。

枯草芽孢杆菌araT引物：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG(SEQ IDNO：19和20)。

类球红细菌msa(2.4.1.和35053)：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG(SEQ IDNO：21和22)。

硕大利什曼原虫bsat：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC(SEQ IDNO：23和24)。

食淀粉乳杆菌araT：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTTGTAAAA(SEQ IDNO：25和26)。

类球红细菌tatA(2.4.1和35053菌株)：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG(SEQ IDNO：27和28)。

大肠杆菌aspC：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3’和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQID NO：29和30)。

大肠杆菌tyrB：

N末端：5’-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC和

C末端：5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3’(SEQID NO：33和34)。

用以下PCR流程扩增获自苜蓿中华根瘤菌(tatA)的基因。在50μL反应体系中采用0.1-0.5μg模板、1.5μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U Expand High Fidelity聚合酶(罗氏(Roche)，印第安纳州印第安纳波利斯)和含有Mg的1X Expand^TM缓冲液。所用热循环程序包括在96℃热启动5分钟，然后29个以下步骤的循环：94℃ 30秒，55℃ 2分钟，72℃ 2.5分钟。29个循环后，将样品在72℃保持10分钟，然后储存于4℃。此PCR流程产生1199bp的产物。

用以下PCR流程扩增获自类球红细菌(msa和tatA)、食淀粉乳杆菌araT和芽孢杆菌araT的基因序列。在50μL反应中，加入0.1-0.5μg模板，1.5μM各引物，0.4mM各dNTP，3.5U Expand High Fidelity^TM聚合酶和含有Mg的1X Expand^TM缓冲液。所用热循环程序包括在96℃热启动5分钟，然后是29个以下步骤的循环：94℃ 30秒，40-60℃ 1分钟45秒(梯度热循环仪)和72℃ 2分钟15秒。29个循环后，将样品在72℃保持10分钟，然后储存于4℃。

对于类球红细菌msa基因而言，42℃和48℃的退火温度产生多种产物，但产生一条约1464bp的独特条带。对于食淀粉乳杆菌araT而言，42℃、48℃和56℃的退火温度产生单一产物，在1173bp处产生一条浓条带。对于枯草芽孢杆菌araT而言，40℃、45℃、50℃、55℃的退火温度从基因组DNA和菌落中产生单一产物(1173bp)。对于硕大利什曼原虫bsat而言，55℃的退火温度产生最洁净的产物(1239bp)。对于红细菌tatA基因而言，50-55℃的退火温度产生正确大小(1260bp)的洁净产物。对于大肠杆菌基因和枯草芽孢杆菌dat基因而言，采用55-60℃的退火温度，退火温度时间缩短到45秒。获得正确大小的洁净产物(大肠杆菌基因约1.3kb，dat基因850bp)。

克隆

用Qiagen凝胶抽提试剂盒(加州巴伦西亚)从0.8或1％ TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。通过与琼脂糖凝胶上的标准品比较来定量PCR产物，然后按照生产商推荐的不依赖于连接的克隆(Ligation Independent Cloning)方案(诺华基公司)用T4DNA聚合酶处理。

简要说，在dGTP存在下，用1U T4 DNA聚合酶在22℃处理约0.2pmol纯化的PCR产物30分钟。聚合酶从PCR产物的3’端去除连续的碱基。当聚合酶碰到鸟嘌呤残基时，该酶的5’至3’聚合酶活性抵消外切核酸酶活性，以有效防止进一步切除。这样建立的单链突出端与pET Xa/LIC载体相容。在75℃孵育20分钟使该聚合酶失活。

如诺华基公司所推荐地使该载体和处理的插入物退火。在22℃下将约0.02pmol处理的插入物和0.01pmol载体孵育5分钟，加入6.25mM EDTA(终浓度)，重复上述22℃的孵育步骤。将退火反应(1μL)加入NovaBlue^TM单个感受态细胞(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)，冰上孵育5分钟。混合后，通过42℃热激30秒转化该细胞。将细胞在冰上放置2分钟，用250μL室温SOC回收，在37℃振荡(225rpm)30分钟。将细胞接种于含有卡那霉素(25-50μg/mL)的LB平板上。

用Qiagen离心小量制备试剂盒纯化质粒DNA，通过XhoI和XbaI限制性消化筛选正确的插入物。通过双脱氧链终止DNA测序法确证似乎具有正确插入物的质粒序列。

SEQ ID NO：1-14和31-32显示重组转氨酶的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，来自Genbank序列的任何改变是沉默的，或者在蛋白序列中产生保守取代。SEQ IDNO：11和12是新序列。

基因表达和测定

将序列分析确证的质粒DNA亚克隆入大肠杆菌表达宿主BLR(DE3)或BL21(DE3)(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)中。培养培养物，用Qiagen小量制备试剂盒分离质粒，用限制性消化分析来确认相同性。

用BLR(DE3)和BL21(DE3)细胞中的食淀粉乳杆菌araT、枯草芽孢杆菌araT和苜蓿中华根瘤菌tatA开始进行诱导。当培养物在含有卡那霉素(30mg/L)的LB中生长到OD₆₀₀为0.5-0.8时进行时程研究，用1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，在诱导后0、1、2和4小时取样。将来自2.0mL培养物的细胞重悬于0.10mL含有10％十二烷基硫酸钠、10％2-巯基乙醇和20％甘油的120mM Tris-HCl(pH6.8)中，在95℃加热10分钟，冷却，用0.10mL H₂O稀释。将这些细胞总蛋白样品分成等份，用4-15％梯度凝胶进行SDS-PAGE分析。诱导2小时和4小时，以及BLR(DE3)和BL21(DE3)细胞间表达的蛋白量没有显著差异。

也通过将来自2mL培养物的细胞沉淀重悬于0.25mL含有0.25μL Benzonase核酸酶的Novagen BugBuster^TM试剂从4小时样品中制备细胞提取物，在室温下温和振荡孵育20分钟，16,000×g离心去除细胞碎片。将上清(细胞提取物)上样于4-15％梯度凝胶上，以分析细胞的可溶性蛋白质。

这3个克隆(食淀粉乳杆菌araT(SEQ ID NO：11和12)、枯草芽孢杆菌araT(SEQID NO：9和10)和苜蓿中华根瘤菌tatA(SEQ ID NO：1和2)显示出对应于正确大小(约45kDa)的可溶性蛋白质。枯草芽孢杆菌araT基因产物以最高水平过度表达和/或该基因产物比其它两种基因产物更可溶解。

在随后的表达方法中，将来自阳性克隆的质粒DNA亚克隆入BL21(DE3)中，由于此宿主的生长特性更佳。当培养物在含有50mg/L卡那霉素的LB中生长时，当OD₆₀₀达到约0.8诱导时，用1mM IPTG重复诱导。在37℃生长4小时后收获细胞，3000rpm离心10分钟(4℃)，用TEGGP缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.0)，0.5mMEDTA，100mg/L谷胱甘肽，5％甘油，含有罗氏(Roche)完全蛋白酶抑制剂混合物)洗涤，在-80℃乙醇中快速冷冻。

将样品重悬于5mL/g湿细胞重的BugBuster^TM(诺华基公司)试剂中，其中含有5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物组#3(开尔生化-诺伐生化公司(Calbiochem-NovabiochemCorp.)，加州圣地亚哥)和1μL/mL Benzonase核酸酶。在室温下，在定轨摇床上孵育样品20分钟。通过在4℃下16,000×g离心20分钟去除不溶性细胞碎片。

用SDS-PAGE分析细胞提取物，用以下方法通过随后产生的吲哚-丙酮酸来测定色氨酸转氨酶活性。1mL反应在50mM四硼酸钠(pH8.5)、0.5mM EDTA、0.5mM砷酸钠、50μM吡哆醛磷酸盐、5mM α-酮戊二酸和5mM L-色氨酸中进行。通过加入无细胞提取物或纯化酶开始反应，在30℃孵育30分钟。加入20％TCA(200μL)终止反应，离心去除沉淀的蛋白质。测量327nm处的吸光度并与测定缓冲液中新鲜制备的吲哚-3-丙酮酸的标准曲线比较。也进行无底物色氨酸或用得自只用pET30a转化的克隆的无细胞提取物的对照反应。

由于在细胞提取物中天然大肠杆菌转氨酶有背景，按照生产商的方案(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)，用具有His-结合柱体的固定金属亲和层析纯化各自含有与pET30氨基末端HIS₆-标记/S-标记融合的转氨酶蛋白的重组融合蛋白。融合蛋白的HIS₆-标记序列与固定在IDA基His结合树脂上的Ni²⁺二价阳离子结合。洗脱馏分在PD-10(安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)，新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))柱上脱盐，用50mM Tris，pH7.0洗脱。SDS-PAGE分析纯化的蛋白质，测定转氨酶活性。

用1mM IPTG在37℃诱导(4小时)得到的结果证明，硕大利什曼原虫bsat、苜蓿中华根瘤菌tatA、大肠杆菌aspC和类球红细菌tatA克隆都具有显著水平的色氨酸转氨酶活性。来自枯草芽孢杆菌的araT蛋白过度表达并可溶，但酶活性小。食淀粉乳杆菌araT基因产物似乎可溶解于细胞提取物，但用His结合柱体纯化仅产生少量分子量正确的蛋白。msa基因产物不可溶，又在24℃进行表达试验，以使包含体形成减至最低程度。用10μM和1mM之间几种浓度的IPTG使可溶性蛋白量增加至最大程度。

表1列出了比活，以每毫克蛋白每分钟形成的吲哚-3-丙酮酸(I3P)微克数表示。在一些情况下，很少量的重组蛋白就显示出该测定有效线性范围之上的高水平活性。在这些情况下，在比活数之前加上“>”。

表1

细胞提取物(CE)和纯化(P)以及市售酶中克隆的比活

 

酶	比活(μg I3P/mg蛋白/分钟)	备注
			硕大利什曼原虫bsat CE	>49.3
硕大利什曼原虫bsat P	>4280
			苜蓿中华根瘤菌tatA CE	>28.6
苜蓿中华根瘤菌tatA P	>931
			类球红细菌2.4.1 tatA CE	>41.2
类球红细菌2.4.1 tatA P	1086
			类球红细菌35053 tatA CE	>62.3
类球红细菌35053 tatA P	>486
			食淀粉乳杆菌araT CE	1.26
食淀粉乳杆菌araT P	0	His-结合柱体后蛋白质少
			枯草芽孢杆菌araT CE	0	检测不到
枯草芽孢杆菌araT P	1.5-4.5
			类球红细菌2.4.1 msa CE	2.05	非常少的可溶性蛋白质
类球红细菌2.4.1 msa P	0	His结合柱体后没有蛋白质
			类球红细菌35053 msa CE	3.97	非常少的可溶性蛋白质
类球红细菌35053 msa P	0	His结合柱体后没有蛋白质
			大肠杆菌aspC(P)	800
大肠杆菌tyrB(P)	1	不很可溶
			枯草芽孢杆菌D-转氨酶(P)	2.7	用D-色氨酸作为底物
广范转氨酶	22	西格马公司目录号T7684
			猪II-A型	1.5	西格马公司G7005
猪I型	1	西格马公司G2751

比较所有克隆的重组蛋白的比对说明，在araT、tatA、bsat和msa序列之间没有许多高度保守区域。活性最高的重组蛋白：红细菌tatA基因产物同源物、硕大利什曼原虫宽底物转氨酶和苜蓿中华根瘤菌酪氨酸转氨酶的比对显示有几个保守区域，但它们在蛋白质水平仅约30-43％相同。广范围的D-特异性(D-丙氨酸)转氨酶的有效性在生产其它莫纳甜立体异构体中有用(参见实施例9-15)。

实施例2

本实施例描述了用于亚克隆和分析克隆到载体pET30 Xa/LIC中的突变的大肠杆菌aspC基因HEX的方法。此基因产物的活性位点上携带6个突变，根据与来自大肠杆菌的TyrB芳族氨基酸(酪氨酸)转氨酶的同源性进行合理设计能提高对芳族氨基酸的转氨酶活性。在所有已知的天冬氨酸转氨酶中两个这类位置(Thr109和Asn297；猪胞浆天冬氨酸转氨酶(AAT)编号系统)不发生改变，但经修饰模拟了大肠杆菌TyrB序列(Ser109和Ser297)。另外四个位置(Val 39、Lys 41、Thr 47和Asn 69)在大肠杆菌AspC的活性位点口袋上排成一线，被TyrB中发现的疏水性侧链更多的氨基酸(Leu 39、Tyr 41、Ile 47和Leu 69)取代。

克隆

克隆到pUC19中的HEX基因由J.F.Kirsch教授(分子和细胞生物学系，加州大学伯克利分校，Berkeley，CA 94720-3206)提供，并用作将该基因克隆到pET23aXa/LIC中的模板。参见James J.Onuffer和Jack F.Kirsch，＂Redesign of the substratespecificity of Escherichia coli aspartate aminotransferase to that of Escherichia colityrosine aminotransferase by homology modeling and site-directed mutagenesis＂(通过同源性建模和定位诱变将大肠杆菌天冬氨酸转氨酶的底物特异性重新设计为大肠杆菌酪氨酸转氨酶的底物特异性)，Protein Science 4：1750-1757(1995)。

用设计用于将大肠杆菌aspC基因克隆到实施例1所述的pET30 Xa/LIC载体(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)中的引物(SEQ ID NO：29和30)将HEX基因亚克隆到相同载体中。用以下PCR方案进行基因扩增：在50μL反应中，加入50ng DNA模板，1.0μM各引物，0.2mM各dNTP，1 U PfuUltra HF聚合酶(司查塔基公司(Stratagene))、2.1 U Expand High Fidelity^TM聚合酶(罗氏分子生物化学公司(RocheMolecular Biochemicals)，印第安纳州印第安纳波利斯)和含有Mg的1X Expand^TM缓冲液。热循环程序采用94℃热启动5分钟；接着是10个下述步骤的循环：94℃的变性步骤(30秒)、50℃的退火步骤(1分钟)、72℃的延伸步骤(1分钟30秒)；15个下述步骤的循环：94℃的变性步骤(30秒)、55℃的退火步骤(1分钟)、每个循环延长5秒的72℃的延伸步骤(1分钟30秒)；10个下述步骤的循环：94℃的变性步骤(30秒)、55℃的退火步骤(1分钟)、72℃的延伸步骤(2分钟45秒)；最后是72℃的结束步骤(7分钟)。用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒(加州巴伦西亚)从1％琼脂糖凝胶中纯化扩增的DNA。通过测定260nm处的吸光度定量PCR产物，用T4 DNA聚合酶处理，按照生产商推荐的不依赖于连接的克隆方案(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)和之前在实施例1中所述的方案用载体退火。

如伯乐(Bio-Rad)电穿孔手册所述，用0.1cm试管和伯乐基因脉冲器II系统将退火反应物转化到电感受态DH10B中。通过限制性分析鉴定含有HEX基因的克隆，并进行DNA测序验证。SEQ ID NO 75和76显示了HEX基因和基因产物(HEXAspC转氨酶，也称为HEX蛋白)的核苷酸和相应氨基酸序列。也参见NCBI登录号1AHF_AGI：1127190(氨基酸序列)。

基因表达和测定

将质粒DNA(经序列分析验证)亚克隆入表达载体BL21(DE3)(诺华基公司)。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养该培养物，用Qiagen离心质粒小量制备试剂盒分离质粒，然后用限制性消化分析以确认其身份。用含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃培养的BL21(DE3)构建物进行诱导实验。OD₆₀₀达到约0.6后用0.2mM IPTG诱导蛋白表达。30℃培养细胞4小时，离心收获细胞。然后按照诺华基公司推荐的方案用含有1μL/mL Benzonase核酸酶、5μL/mL Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物组III和0.33μL/10mL r-溶菌酶的Bugbuster^TM试剂(诺华基公司)裂解。25℃温和振荡培育15分钟后，通过21,000 x g、4℃离心20分钟沉淀细胞碎片。通过SDS-PAGE在4-15％梯度凝胶(伯乐)上分析上清液(无细胞提取物)，以检测重组融合蛋白的可溶性蛋白水平。表达水平高(约占可溶性蛋白的30-40％)，并且类似于aspC转氨酶蛋白的观察结果。

按照生产商方案(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)用装有His-Bind 900柱的固定金属亲和色谱由细胞提取物(如上所述制备)纯化HIS₆-HEX蛋白。(HIS₆-HEX蛋白的HIS₆-标签序列结合于固定在FDA基His-Bind树脂上的二价Ni²⁺阳离子)。洗脱组分在PD-10(安玛西亚生物科学公司，新泽西州皮斯卡塔韦)柱上脱盐，用50mMTris-HCl，pH7.0洗脱。用SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度，用Pierce BCA测定试剂盒以牛血清白蛋白为标准品测定纯化组分中的蛋白质含量。

用以下方案分析纯化的HIS₆-HEX蛋白和未纯化细胞提取物的色氨酸转氨酶活性：1.0mL该反应混合物含有50mM四硼酸钠，pH8.5，5mM α-酮戊二酸，0.05mM吡哆醛磷酸，0.5mM砷酸钠，0.5mM EDTA和酶。将除酶以外的所有组分混合在一起，加入该酶以启动该反应，30℃培育该反应溶液30分钟。通过加入0.2mL 20％三氯乙酸终止该反应，21,000rpm离心该混合物，小心去除澄清的上清液。在327nm测定上清液的吸光度(吲哚-3-丙酮酸的最大吸光度)。一式两份地进行所有反应。出于比较目的，也用相同的方案分析实施例1所述的HIS₆-tyrb和HIS₆-asρC转氨酶。结果见表2。327处的吸光度与吲哚-3-丙酮酸浓度成正比例，并可用于测定不同酶在具体实验中的相对活性。

表2

 

转氨酶基因	反应中的转氨酶μg	327nm吸光度
			HIS6-HEX，纯化	9.1	1.171
HIS6-HEX，细胞提取物	22.8	1.683
			HIS6-aspC，纯化	9.1	0.834
HIS6-aspC，细胞提取物	22.8	1.42
			HIS6-tyrB，纯化	9.1	0.008
HIS6-tyrB，细胞提取物	22.8	0.346

表2所列结果证明，纯化酶用于测定时，HEXAspC转氨酶对色氨酸的活性比AspC蛋白高约40％。细胞提取物是酶来源时，活性的提高程度显然较低。这可能是由宿主大肠杆菌菌株的天然蛋白的干扰活性引起的。tyrB基因产物的稳定性低于AspC蛋白，观察到此酶的活性水平低反应了它的稳定性不足。而且，His融合标签可能干扰该蛋白的正确构象，并且对其活性造成不良影响，参见以下数据。AspC的HEX突变体对色氨酸活性升高可以解释如以下实施例9-10(表6和7)所述使用此酶时形成的莫纳甜的产量增加。AspC的HEX突变体是在与睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶的反应中生产S，S莫纳甜的最优酶。

实施例3

本实施例描述了用于亚克隆、表达和分析经构建不含氨基端HIS₆标签的aspC、tyrB和HEX转氨酶基因和基因产物的方法。该反应的副产物(谷氨酸)形成后用HPLC测定转氨酶活性，如实施例18所述。

克隆

设计以下引物，以将大肠杆菌aspC、tyrB和HEX基因克隆到pET30a载体(诺华基，威斯康星州麦迪逊)中(将相同的引物用于aspC和HEX)：

aspC/HEX引物：

N末端：

5′-GCGGAACATATGTTTGAGAACATTACCGCC-3′(SEQ ID NO：77)；

C末端：

5′-ATAACCGGATCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3′(SEQ ID NO：78)；

tyrB引物：

N末端：

5′-GCGGCGCATATGGTGTTTCAAAAAGTTGACGC-3′(SEQ ID NO：79)；

C末端：

5′-CCAATAGGATCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3′(SEQ ID NO：80)。

将ATG起始密码子加到tyrB编码序列的5′端，以便与限制性酶相容并获得较高的表达水平。用以下PCR方案进行基因扩增：在100μL反应中，加入50ng DNA模板，1.0μM各引物，0.2mM各dNTP，1 U Pfu Turbo聚合酶(司查塔基公司；加利福尼亚州拉霍亚)和1X克隆Pfu缓冲液。热循环程序采用94℃热启动5分钟；接着是25个下述步骤的循环：94℃的变性步骤(30秒)、55℃的退火步骤(1分钟)、72℃的延伸步骤(2分钟)，最后是72℃的结束步骤(7分钟)。用凯杰

PCR纯化试剂盒(加州巴伦西亚)纯化扩增的DNA。用NdeI和BamHI按照生产商说明书(NEB公司(NEB)；马萨诸塞州贝弗利(Beverly，MA))消化纯化的DNA和纯化的质粒DNA(用凯杰

离心小量制备试剂盒纯化的pET30)。用NdeI消化pET30a载体能去除氨基端HIS₆-标签区。用凯杰凝胶提取试剂盒(加州巴伦西亚)由1％琼脂糖凝胶纯化消化的DNA。通过测定260nm处的吸光度定量纯化的DNA产物，用Quick连接试剂盒(NEB公司)连接。将连接的DNA转化到化学感受态TOP10F′细胞(英杰公司；加利福尼亚州卡尔斯巴德)中。通过在1％琼脂糖凝胶上运行纯化质粒DNA鉴定含有插入物的克隆。通过DNA测序验证含有插入物的克隆。

基因表达和测定

将质粒DNA(经序列分析验证)亚克隆到表达宿主BL21(DE3)(诺华基公司)中。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养该培养物。用含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃培养的BL21(DE3)构建物进行诱导实验。OD₆₀₀达到约0.5后用0.1mM IPTG诱导蛋白表达。30℃培养细胞4小时，离心收获细胞。然后按照诺华基公司推荐的方案用含有1μL/mL Benzonase核酸酶、5μL/mL Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物组III和0.33μL/10mLr-溶菌酶的Bugbuster^TM试剂(诺华基公司)裂解。25℃温和振荡培育15分钟后，通过21,000 x g、4℃离心20分钟沉淀细胞碎片。通过SDS-PAGE在4-15％梯度凝胶(伯乐)上分析上清液(无细胞提取物)，以检测重组融合蛋白的可溶性蛋白水平。所有3种蛋白的表达水平高(约占全部可溶性蛋白的25-40％)，并且类似于相应pET30 HIS₆-标记构建物的观察结果。

用以下方案检测未标记的AspC和TyrB蛋白的色氨酸转氨酶活性。用实施例18所述的HPLC荧光检测法测定反应副产物(谷氨酸)的形成，而不如实施例1所述测定吲哚-3-丙酮酸的形成。在此反应中，色氨酸与α-酮戊二酸发生化学计量性反应，产生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。在水溶液中，谷氨酸比吲哚-3-丙酮酸更稳定，因此测定谷氨酸可更准确地测定酶活性。1.0mL反应混合物含有50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mMα-酮戊二酸、0.05mM吡哆醛磷酸、5mM色氨酸和酶。将除酶以外的所有组分混合在一起，加入该酶以启动该反应，30℃培育该反应溶液60分钟。通过加入0.15mL 20％三氯乙酸终止该反应，21,000rpm离心该混合物，小心去除澄清的上清液。结果(根据谷氨酸的背景水平和加入三氯乙酸以沉淀蛋白质的稀释度校正)见表3。

表3

 

转氨酶基因	转氨酶μg	[谷氨酸]；μg/mL
			TyrB	50	310
AspC	50	328

此结果令人惊讶，因为其它研究人员已观察到TyrB转氨酶对色氨酸作为底物的活性高于AspC(Hayashi等(1993)Biochemistry 32：12229-1239)。出乎意料的低活性水平可能是由于蛋白的稳定性。然而，用未标记TyrB蛋白发现的活性水平显然高于标记的该蛋白(见表1)。因为在转氨酶反应中色氨酸与α-酮戊二酸发生化学计量性反应，所以形成的吲哚-3-丙酮酸浓度(如表1所示)和形成的谷氨酸浓度(如表3所示)反映了相同的活性。然而，在水溶液中谷氨酸比吲哚-3-丙酮酸更稳定，所以测定谷氨酸可更准确地测定酶活性。采用这两种检测方法获得的TyrB与AspC的相对活性(或比值)应产生相同结果，很明显标记TyrB对色氨酸的活性低于标记AspC，而未标记TyrB与未标记AspC的活性基本相同。

实施例4

吲哚-3-乳酸转变为吲哚-3-丙酮酸

如图1和3所示，吲哚-3-乳酸能用于生成吲哚-3-丙酮酸。乳酸和丙酮酸间的转化是可逆反应，正如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸间的转化也是这样。由于在340nm来自吲哚-3-丙酮酸的高背景量，通常可跟踪吲哚-乳酸的氧化。

0.1mL标准测定混合物含有100mM磷酸钾，pH8.0、0.3mM NAD⁺、7单位乳酸脱氢酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，使用Molecular Devices SpectraMax Plus平板阅读器。混合多肽和缓冲液并移吸到含吲哚-3-乳酸和NAD⁺的孔中，短暂混合后，以9秒间隔读取各孔在340nm的吸光度。反应在25℃保持5分钟。从NAD⁺生成NADH后，在340nm的吸光度增加。不用NAD⁺以及不用底物进行单独的阴性对照。来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)的D-LDH(Sigma目录号L2395)似乎显示与吲哚衍生物底物的活性大于来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Baccilus stearothermophilus)的L-LDH(Sigma目录号L5275)的活性。

用类似方法，使用D-乳酸和NAD+或NADH以及D-LDH多肽的天然底物丙酮酸。丙酮酸还原的V_max比乳酸氧化的V_max高100-1000倍。吲哚-3-乳酸与D-LDH氧化反应的V_max约为乳酸的五分之一。也通过使用含0.5mM EDTA和0.5mM砷酸钠的50mM硼酸钠缓冲液，跟踪在327(烯醇-硼酸盐衍生物)的吸光度变化测量吲哚-3-丙酮酸的存在。与用于L和D-LDH多肽的阴性对照相比，观察到小但可重复的吸光度变化。

此外，可克隆广特异性乳酸脱氢酶(酶活性与EC 1.1.1.27、EC 1.1.1.28和/或EC1.1.2.3相关)并用于从吲哚-3-乳酸产生吲哚-3-丙酮酸。广特异性脱氢酶的来源包括大肠杆菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

另外，可通过吲哚-3-乳酸接触来自生孢梭菌(Clostridium sporogenes)的细胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)；或接触克氏表鞭毛型锥虫(Trypanosoma cruzi epimastigotes)细胞提取物，提取物含有已知对吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)；或食酸假单胞菌(Pseudomonas Acidovorans)或大肠杆菌细胞提取物，提取物含有咪唑-5-基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)；或锦紫苏(Coleus blumei)，它含有羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)；或麦芽念珠菌(Candidamaltosa)，它含有D-芳族乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)来生成吲哚-3-丙酮酸。描述这种活性的参考文献包括Nowicki等(FEBS Microbiol Letters，71：119-24，1992)、Jean和DeMoss(Canadian J.Microbiol.141968)、Coote和Hassall(Biochem.J.111：237-9，1969)、Cortese等(C.R.SeancesSoc.Biol.Fil.162390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.C：Biosci.43501-4，1988)和Bhatnagar等(J.Gen Microbiol135：353-60，1989)。此外，乳酸氧化酶，如来自假单胞菌属(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mol.Catalysis B：Enzymatic：18：299-305，2002)可用于将吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。

实施例5

用L-氨基酸氧化酶将L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸

该实施例描述了经氧化酶(EC 1.4.3.2)将L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸的方法，作为实施例1所述使用色氨酸转氨酶的另一种选择。L-氨基酸氧化酶纯化自南美响尾蛇(Crotalus durissus)(西格马公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO)，目录号A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸氧化酶的登录号包括：CAD21325.1、AAL14831、NP_490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。

反应在微离心管中进行，总体积1mL，37℃振荡孵育10分钟。反应混合物含有5mM L-色氨酸、100mM磷酸钠缓冲液pH6.6、0.5mM砷酸钠、0.5mM EDTA、25mM四硼酸钠、0.016mg过氧化氢酶(83U，Sigma C-3515)、0.008mg FAD(西格马公司)和0.005-0.125单位的L-氨基酸氧化酶。阴性对照含有色氨酸之外的所有成分，空白含有氧化酶之外的所有成分。过氧化氢酶用于去除在氧化脱氨期间形成的过氧化氢。四硼酸钠和砷酸钠用于稳定吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸盐形式，吲哚-3-丙酮酸在327nm显示最大吸光度。在反应混合物中制备0.1-1mM浓度的吲哚-3-丙酮酸标准。

购得的L-氨基酸氧化酶具有每分钟每毫克蛋白形成540μg吲哚-3-丙酮酸的比活。这与色氨酸转氨酶的比活是相同的数量级。

实施例6

利用D-氨基酸氧化酶将D-色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸

该实施例描述了经氧化酶(EC 1.4.3.3)将D-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸的方法，作为用L-色氨酸作为反应原料的另一种选择。D-氨基酸氧化酶购自生物催化公司(BioCatalytics)(加利福尼亚州帕萨迪纳(Pasadena，CA)，目录号AOD-101)。

反应在微离心管中进行，总体积1mL，30℃振荡孵育20分钟。反应混合物含有5mM L-色氨酸、50mM四硼酸钠缓冲液pH8、0.5mM砷酸钠、0.5mM EDTA、25.5μL技术级催化酶(1000 U，生物催化公司CAT-101)、0.008mg FAD(西格马公司)和约10mg D-氨基酸氧化酶粗制剂。D-氨基酸氧化酶制剂含有大量不溶性物质。阴性对照含有氧化酶之外的所有成分。一式两份地进行实验。

离心样品以去除碎片，将上清液稀释10倍，然后在327nm测定吸光度。稀释样品的吸光度为0.789-0.926，而阴性对照(未稀释)的OD为0.418和0.416。正如所料，可采用广泛特异性D-氧化酶有效地将D-色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸。

实施例7

用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转化为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸

该实施例描述的方法可用于将吲哚-3-丙酮酸转化成2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，使用醛缩酶(裂合酶)(图2)。醛醇缩合是在一种醛的β-碳或酮与另一种醛或酮的羰基碳间形成碳-碳键的反应。在一个底物的羰基相邻碳上形成碳负离子，并用作亲核体攻击第2个底物的羰基碳(亲电碳)。最通常地，亲电底物是醛，因此大部分醛缩酶属于EC 4.1.2.-类别。亲核底物通常是丙酮酸。醛缩酶不常催化2个酮酸或2个醛间的缩合。

然而，鉴定了催化2个羧酸缩合的醛缩酶。例如，EP 1045-029描述从乙醛酸和丙酮酸使用假单胞菌培养物(EC 4.1.3.16)生成L-4-羟基-2-酮戊二酸。此外，4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸丙酮酸裂合酶，EC 4.1.3.17)能催化2个酮酸的缩合。因此，类似的醛缩酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸的缩合。可修饰这些酶的活性和对映异构体特异性以产生特定的莫纳甜立体异构体。

克隆

4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸丙酮酸裂合酶(如ProA醛缩酶，EC 4.1.3.17)和4-羟基-2-酮戊二酸乙醛酸裂合酶(如KHG醛缩酶，EC 4.1.3.16)催化与图2的醛缩酶反应非常相似的反应。设计引物的突出端与pET30 Xa/LIC载体(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)相容。上述实施例1中描述了这些引物的设计。

为pET30 Xa/LIC克隆设计了以下引物：

1.稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea、Pseudomonas ochraceae NGJI)proA基因(Genbank登录号：12964663版本：12964663)和睾丸酮丛毛单胞菌proA基因(SEQID NO：65-66，分别是核酸序列和氨基酸序列)

正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3’和

反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3’

(SEQ ID NO：55和56)。

2.苜蓿中华根瘤菌1021SMc00502基因(与proA同源，Genbank登录号：15074579或AL591788.1 GI：15074579和CAC46344.1，分别是核酸序列和氨基酸序列)

正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3’和

反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3’

(SEQ ID NO：61和62)。

3.鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)LB126 fldZ基因(Genbank登录号：7573247版本：7573247，编码推定的酰基转移酶)

正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3’和

反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3’

(SEQ ID NO：57和58)。

4.凯氏节杆菌(Arthrobacterkeyseri)pcmE基因(Genbank登录号：AF331043版本：AF331043.1，编码草酰柠苹酸(oxalocitramalate)醛缩酶)

正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCT CGG-3’和

反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3’

(SEQ ID NO：59和60)。

5.鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)菌株CO92YPO0082基因(Genbank登录号：15978115版本：15978115，编码可能的转移酶)

正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3’和

反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTG A-3’

(SEQ ID NO：63和64)。

6.枯草芽孢杆菌khg基因(Genbank登录号Z99115.1 GI：2634478，126711-127301和CAB14127.1，分别是核酸序列和氨基酸序列)

正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3’和

反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3’

(SEQ ID NO：35和36)。

7.大肠杆菌khg基因(Genbank登录号AE000279.11331-1972和AAC74920.1，分别是核酸序列和氨基酸序列)

正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3’和

反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3’

(SEQ ID NO：37和38)。

8.苜蓿中华根瘤菌khg或SMc03153基因(Genbank登录号AL591792.1GI：15075850，65353-64673和CAC47463.1，分别是核酸序列和氨基酸序列)

正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3’和

反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3’

(SEQ ID NO：39和40)。

用Qiagen Genomic-tip^TM(加州巴伦西亚)方法纯化来自以上1-2和6-8所述生物的基因组DNA。采用类似技术，可纯化来自3-5中所述生物的基因组DNA。

在营养肉汤和羟基苯甲酸培养基中30℃下培养稻草假单胞菌(ATCC 33636)。在营养肉汤和羟基苯甲酸培养基中26℃下培养睾丸酮丛毛单胞菌(ATCC 49249)。根据Wattiau等(Research in Microbiol.152：861-72，2001)所述方法培养鞘氨醇单胞菌属LB126(佛兰德技术研究所(Flemish Institute for Technological Research)，VITO，B-2400Mol，比利时)。根据Eaton(J.Bacteriol.183：3689-3703，2001)所述的方法培养凯氏节杆菌(海湾生态学部(Gulf Ecology Division)，国立健康和环境影响研究实验室(National Health and Environmental Effects Research Laboratory)，美国环境保护局(U.S.Environmental Protection Agency)，GulfBreeze，FL32561，美国)。在ATCC TY培养基和羟基苯甲酸培养基中26℃下培养苜蓿中华根瘤菌1021(ATCC 51124)。在ATCC培养基739马血琼脂中26℃下培养鼠疫耶尔森氏菌菌株CO92(ATCC)。在Bereto营养肉汤(戴福科公司；密歇根州底特律)中30℃下培养枯草芽孢杆菌6051(ATCC)。大肠杆菌基因组DNA分离自DH10B菌株(英杰公司)，如实施例1所述。

将实施例1所述的PCR、克隆和筛选方法用于克隆睾丸酮丛毛单胞菌和苜蓿中华根瘤菌proA序列，以及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和苜蓿中华根瘤菌khg序列。相同方法可用于克隆上述其它序列。对于睾丸酮丛毛单胞菌proA基因而言，PCR的退火和延伸条件是40-60℃1分钟45秒(梯度热循环仪)和72℃ 2分钟15秒。

用双脱氧链终止测序法(序列建造者公司(Seqwright)，Houston，TX)与S-标记和T7终止子引物(诺华基公司)以及DNA综合技术公司(Integrated DNA Technologies，Inc.)(Coralville，爱荷华州)的内部引物对阳性克隆进行测序。

表达和活性测定

将质粒DNA(通过序列分析确证)亚克隆入表达宿主BL21(DE3)(诺华基公司)中。培养物在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中生长，用凯杰离心质粒小量制备试剂盒分离质粒，然后用限制性消化来分析以确认相同性。用在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃下生长的BL21(DE3)构建物进行诱导试验。在OD₆₀₀达到约0.6后用0.1mM IPTG诱导蛋白表达。在30℃下培养细胞4小时，离心收获细胞。然后用Bugbuster^TM试剂(诺华基公司)裂解细胞，用His-结合柱体纯化His-标记重组蛋白，如上所述(实施例1)。在PD-10一次性柱上使纯化蛋白脱盐，用含有2mM MgCl₂的50mM Tris-HCl，pH7.3缓冲液洗脱。

在4-15％梯度凝胶上用SDS-PAGE分析蛋白质，以检测在重组融合蛋白的预计分子量处的可溶性蛋白质水平。

用吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸钠作为底物测定蛋白活性。1mL测定混合物中含有100mM Tris-HCl(pH 7-pH 8.9)，0-8mM MgCl₂，3mM磷酸钾(pH8)和6mM各底物。通过加入不同量的多肽(例如10-100μg)启动反应，在25℃-37℃孵育30分钟，过滤，然后在-80℃冷冻。

proA基因产物的活性结果

当用IPTG诱导时，睾丸酮丛毛单胞菌proA和苜蓿中华根瘤菌SMc00502基因构建物有高水平表达。重组蛋白是高度可溶的，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品所确定的。睾丸酮丛毛单胞菌基因产物纯化至>95％纯度。由于用His-结合柱体亲和纯化后苜蓿中华根瘤菌基因产物的产量很低，细胞提取物用于酶测定。

两种重组醛缩酶都催化从吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二价镁和磷酸钾的存在。当缺少吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸钾时，没有明显产物。缺乏酶时也形成少量产物(通常比酶存在时少1个数量级)。

采用实施例6所述的LC/MS方法，从反相C18柱洗脱的产物峰稍迟于吲哚-3-丙酮酸标准，此峰的质谱显示碰撞诱导母离子([M+H]+)为292.1，产物MP预期的母离子。质谱中存在的主要子片段包括具有m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、274(292-H₂O)、256(292-2H₂O)、238(292-3H₂O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。产物也表现出其它含吲哚的化合物的UV光谱特征，如色氨酸，λ_max为279-280且在约290nm处有一小肩。

随着反应温度从室温增加到37℃、底物量和镁量的增加，睾丸酮丛毛单胞菌醛缩酶法生成的MP量增加。酶的合成活性随着pH增加而减少，在pH7观察到最多产物。在色氨酸标准基础上，用20μg纯化的蛋白在标准测定下生成的MP量约为每毫升反应物10-40μg。

由于苜蓿中华根瘤菌和睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶编码序列与上述其它基因的高度同源性，预期所有重组基因产物能催化此反应。此外，预期有类似活性的醛缩酶在59位和87位有苏氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有组氨酸(H)(以睾丸酮丛毛单胞菌的编号系统为基础)。已对其它同源物测序，并保藏于NCBI。可克隆其基因，预计相应的基因产物具有相似活性。下面提供了标识号码以及与睾丸酮丛毛单胞菌ProA蛋白的相同性百分数和与苜蓿根瘤菌ProA蛋白的相同性百分数，它们是预计具有相似醛缩酶活性的基因和蛋白质的例子：

醛缩酶来源：大豆根瘤菌菌株USDA110(蛋白blr3842)

基因：NC_004463.1：4260815..4261498

蛋白：GI：27378953(NP_770482.1)

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：63

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：63

醛缩酶来源：少动鞘胺醇单胞菌(假单胞菌)

基因：GI：19918959(AB073227.1:3738..4424)

蛋白：GI：19918963(BAB88738.1)

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：65

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：64

醛缩酶来源：鼠疫耶尔森菌KIM

基因：AE013606.1 GI：21956705

蛋白：AAM83650.1 GI：21956715

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：56

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：57

醛缩酶来源：Ralstoniametallidurans CH34

基因：NZ_AAAI02000016.1 GI：48767334

蛋白：ZP_00271743.1 GI：48767386

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：60

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：57

醛缩酶来源：假结核耶尔森菌IP 32953

基因：NC_006155.1 GI：51594359

蛋白：YP_068627.1 GI：51594436

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：56

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：57

醛缩酶来源：豌豆根瘤菌蚕豆生物型rhiz23g02-plk_1009_341(桑格研究所)

基因：

ATGGGCATCGTCGTACAGAACATACCACGGGCGGAAGCTGATGTGATCGACAGGCTC

GCCAAATCAGGCGTCGCGACGGTCCACGAAGCCCAGGGGCGCAAAGGCATGCTCGCC

AGCCATATGAGACCAATCTATTCAGGTGCGCAGATCGCCGGCTCCGCCATTACGATCT

CCGCACCGCCCGGTGATAACTGGATGATCCATGTGGCGATCGAGCAGATCCAGGCCG

GCGACATCCTGGTGCTTTCGCCGACCTCGCCCTGTGACAACGGTTATTTCGGCGACCT

GCTTGCCACCTCGGCGCGGGCGCGAGGTTGCCGCGGCCTTGTCATCGACGCCGGTGTC

CGCGATATCAGGGATCTGACCCAGATGCAGTTCCCCGTGTGGTCCAAGGCCGTGTCCG

CGCAGGGGACCGTCAAGGAAACGCTCGGTTCGGTCAACGTTCCGATCGTCTGCGCTGG

CGCCTTCATCGAAGCCGGCGACATCATCGTCGCCGACGACGACGGGGTGTGCGTGGT

GAAGCTCAACGCGGCCGAGGAGGTTCTGACTGCTGCCGAGAACCGTGTGGCGAACGA

GGAGGCCAAGCGGCAACGCCTCGCCGCCGGCGAACTCGGGCTCGATATCTATGACAT

GCGGTCGAAGCTCCGGGAAAAGGGGCTTAAATATGTATGA(SEQ ID NO：87)

蛋白质：

MGIVVQNIPRAEADVIDRLAKSGVATVHEAQGRKGMLASHMRPIYSGAQI

AGSAITISAPPGDNWMIHVAIEQIQAGDILVLSPTSPCDNGYFGDLLATSAR

ARGCRGLVIDAGVRDIRDLTQMQFPVWSKAVSAQGTVKETLGSVNVPIV

CAGAFIEAGDIIVADDDGVCVVKLNAAEEVLTAAENRVANEEAKRQRLA

AGELGLDIYDMRSKLREKGLKYVW(SEQ ID NO：88)

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：58

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：61

醛缩酶来源：溶芳烃新鞘氨醇单胞菌DSM12444(溶芳烃鞘氨醇单胞菌F199含有同一基因)

基因：NZ_AAAV02000003.1 GI：48848843

蛋白：ZP_00303270.1 GI：48849026

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：68

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：63醛缩酶来源：恶臭假单胞菌KT2440

基因：AE016783.1 GI：26557027

蛋白：AAN68126.1 GI：24984081

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：57

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：60

醛缩酶来源：趋磁螺菌MS-1

基因：NZ_AAAP01003877.1 GI：23016465

蛋白：ZP_00056301.2 GI：46200890

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：73

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：59

醛缩酶来源：沼泽红假单胞菌CGA009

基因：NC_005296.1 GI：39933080

蛋白：NP950032.1 GI：39937756

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：74

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：58

醛缩酶来源：野油菜黄单胞菌ATCC-33913

基因：AEO12524.1 GI：21115292

蛋白：AAM43251.1 GI：21115297

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：63

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：64

醛缩酶来源：地毯草黄单胞菌柑桔变种306

基因：AE012066.1 GI：21110580

蛋白：AAM38990.1 GI：21110581

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：61

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：62

醛缩酶来源：阿维链霉菌MA-4680

基因：NC_003155.3 GI：57833846

蛋白：NP822793.1 GI：29828159

与睾丸酮丛毛单胞菌ProA的相同性百分数：49

与苜蓿根瘤菌ProA的相同性百分数：56

khg基因产物的活性结果

当用IPTG诱导时，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因构建物有高水平表达，而苜蓿中华根瘤菌khg的表达水平较低。重组蛋白高度可溶，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品判断的。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因产物纯化到>95％纯度；用His-结合柱体亲和纯化后，苜蓿中华根瘤菌基因产物的产量不高。

没有证据说明此酶活性需要镁和磷酸盐。然而，文献报导在磷酸钠缓冲液中进行测定，报导的酶是双功能并对磷酸化底物如2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶测定如上所述进行，在一些情况中省略磷酸盐。结果表明重组KHG醛缩酶产生MP，但活性不如ProA醛缩酶。在一些情况中，KHG产生的MP水平几乎与镁和磷酸盐单独产生的量相同。磷酸盐似乎不增加KHG活性。杆菌酶活性最高，比单独镁和磷酸盐的活性约高20-25％，如LC/MS/MS所确定(见实施例18)。中华根瘤菌酶活性量最低，这可能与表达中注意到的折叠和溶解度问题相关。所有3种酶有活性位点谷氨酰胺(枯草芽孢杆菌编号系统中的43位)以及与丙酮酸形成Shiff碱基所需的赖氨酸(130位)；然而，枯草芽孢杆菌酶在47位含有活性位点残基苏氨酸，而不是精氨酸。枯草芽孢杆菌KHG较小且似乎在簇中不同于苜蓿中华根瘤菌和大肠杆菌酶，其它酶有活性位点苏氨酸。活性位点的差异可能是枯草芽孢杆菌酶活性增加的原因。

提高醛缩酶活性

催化抗体可与天然醛缩酶一样有效，接受广范围的底物，并能用于催化图2所示反应。

通过定向进化也能改进醛缩酶，例如上述用于KDPG醛缩酶的例子(与上述KHG高度同源)，KDPG醛缩酶通过DNA改组和易错PCR去除对磷酸盐的需求和反转对映选择性。KDPG醛缩酶多肽用于生化反应，因为它们高度特异于供体底物(本文是丙酮酸)，但对于受体底物(即吲哚-3-丙酮酸)相对灵活(Koeller和Wong，Nature 409：232-239，2001)。KHG醛缩酶有缩合丙酮酸与许多羧酸和醛的活性。认为KHG醛缩酶的哺乳动物形式的对映特异性比许多细菌形式更广，包括对4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸活性较高和接受4-羟基-2-酮戊二酸的2种立体异构体。细菌来源似乎对该融合产物的特定构型有10倍偏好。例外是来自运动发酵单胞菌的酶，该酶的底物选择性较低(接受广泛底物)，对底物立体化学要求也不严格，类似于分离自哺乳动物来源如大鼠肝的酶(参见：Shelton等(1996)J Am Chem Soc，118(9)：2117-2125。基因组数据库中存在将近100个KHG同系物，在假单胞菌、副球菌、普罗威登斯菌、中华根瘤菌、摩根氏菌、大肠杆菌和哺乳动物组织中证明活性。这些酶能用作修改对映特异性的起始点，这是莫纳甜生成需要的。

可“演化出”利用丙酮酸和另一底物的醛缩酶以修改该多肽的特异性、速度和选择性，所述另一底物是酮酸和/或含有体积大的疏水基团如吲哚。除了本文证明的KHG和ProA醛缩酶之外，这些酶的例子包括但不限于：KDPG醛缩酶和相关多肽(KDPH)；来自类诺卡氏菌属(Nocardioides sp)的转羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶；4-(2-羧苯基苯基)-2-氧丁-3-烯醇盐醛缩酶(2’-羧基亚苄基丙酮酸醛缩酶)，它缩合丙酮酸与2-羧基苯甲醛(一种含芳环的底物)；来自恶臭假单胞菌(P.Putida)和食芳香物鞘氨醇单胞菌的反式-O-羟基苯亚甲基丙酮酸水合酶-醛缩酶，它也利用丙酮酸和含芳族的醛作为底物；3-羟基天冬氨酸醛缩酶(赤-3-羟基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶)，它使用2-含氧酸作为底物且被认为在生物体脱氮微球菌(Micrococcus denitrificans)中；苯偶姻醛缩酶(苯甲醛裂合酶)，它利用含苄基的底物；二氢新蝶呤醛缩酶；L-苏-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基丝氨酸醛缩酶)，它缩合甘氨酸与苯甲醛；4-羟基-2-氧戊酸醛缩酶；1，2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶和2-羟基亚苄基丙酮酸醛缩酶。

采用与上述类似的测定，和实施例18所述的检测方法，异柠檬酸裂合酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、柠檬酸裂合酶、色氨酸酶和某些突变体、β-酪氨酸酶和某些突变体、PLP、催化醛缩酶抗体、色氨酸合酶在测试条件下似乎没有将吲哚-3-丙酮酸可检测地转化为MP。

通过筛选感兴趣的克隆可选择有所需活性的多肽，使用下列方法。用表达盒上携带感兴趣克隆的载体转化色氨酸营养缺陷型且生长于含少量莫纳甜或MP的培养基。由于转氨酶和醛缩酶反应是可逆的，细胞能从莫纳甜的外消旋混合物生成色氨酸。类似地，通过利用MP或莫纳甜作为碳源和能源的能力可筛选生物体(重组和野生型)。靶醛缩酶的一个来源是多种假单胞菌和根瘤菌菌株的表达文库。假单胞菌有许多不寻常的分解代谢途径用于降解芳族分子，它们也含有许多醛缩酶；而根瘤菌含有醛缩酶，已知在植物根瘤中生长，有许多描述用于构建莫纳甜生物合成途径的基因。

实施例8

莫纳甜前体的化学合成

实施例7描述了采用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转变为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸莫纳甜前体(MP)的方法。本实施例描述了化学合成MP的另一种方法。

采用典型的醇醛缩合反应形成MP(图4)。简要说，典型的醇醛型反应包括用强碱如LDA(二异丙基氨基锂)、六甲基二硅氮烷锂或丁基锂产生丙酮酸酯的碳负离子。产生的碳负离子与吲哚-丙酮酸反应形成偶联产物。

可用于保护吲哚氮的保护剂包括但不限于：叔丁氧基羰基(Boc)和苄氧基羰基(Cbz)。羧酸的封端基团包括但不限于：烷基酯(如甲酯、乙酯、苄酯)。采用这种保护基时，不可能控制所形成产物的立体化学。然而，如果R2和/或R3是手性保护基(图4)，如(S)-2-丁醇、薄荷醇或手性胺时，这会有利于一种MP对映异构体的形成(相对于另一种异构体)。

实施例9

将色氨酸或吲哚-3-丙酮酸转变为莫纳甜

体外方法使用2种酶转氨酶和醛缩酶，从色氨酸和丙酮酸生成莫纳甜。在第1步中，α-酮戊二酸是转氨反应中来自色氨酸氨基的受体，反应产生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。醛缩酶催化第2个反应，其中丙酮酸在Mg²⁺和磷酸盐存在下与吲哚-3-丙酮酸反应，产生莫纳甜(MP)的α-酮衍生物，2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。转移第1个反应中形成的谷氨酸的氨基生成所需产物莫纳甜。纯化和表征产物确定形成的异构体是S，S-莫纳甜。描述另外的底物、酶和条件以及对此方法所作的改进。

酶

如实施例7所述克隆、表达和纯化来自睾丸酮丛毛单胞菌的醛缩酶、4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，proA基因)(EC 4.1.3.17)。如实施例7所述克隆、表达和纯化来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿中华根瘤菌的4-羟基-2-酮戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶)(EC 4.1.3.16)。

用于结合醛缩酶以生成莫纳甜的转氨酶是大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶、大肠杆菌tyrB基因编码的酪氨酸转氨酶、苜蓿中华根瘤菌TatA酶、硕大利什曼原虫bsat基因编码的宽底物转氨酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)。如实施例1描述克隆、表达和纯化非哺乳动物蛋白。来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)获得自西格马公司(#G7005)。

使用ProA醛缩酶和L-天冬氨酸转氨酶的方法

1升反应混合物中含有50mM醋酸铵，pH8.0、0.4mM MgCl₂、3mM磷酸钾、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸铵、50mM色氨酸、10mM α-酮戊二酸、160mg重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(未纯化细胞提取物，～30％醛缩酶)、233mg重组大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(未纯化细胞提取物，～40％醛缩酶)。除了酶，所有成分混合一起并在30℃孵育直到色氨酸溶解。然后加入酶，反应溶液30℃孵育并温和振荡(100rpm)3.5小时。酶加入后0.5和1小时，在反应中加入固体色氨酸的等分试样(各50微摩尔)。所有加入的色氨酸不溶解，但浓度维持于50mM或更高。3.5小时后，滤去固体色氨酸。使用确定量的色氨酸作为标准，通过LC/MS分析反应混合物显示溶液中的色氨酸浓度为60.5mM且莫纳甜浓度为5.81mM(1.05g)。

下列方法用于纯化终产物。90％的澄清溶液加到伯乐AG50W-X8树脂柱(225mL；结合力为1.7meq/mL)上。用水洗柱，收集300mL部分，直到280nm处的吸光度<5％首先流过部分。然后柱用1M醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个300-mL部分。所有4个部分含有莫纳甜并用装有温水浴的旋转蒸发器蒸发到105mL。随着体积减小形成沉淀且在蒸发过程中滤去。

通过LC/MS分析柱部分显示99％色氨酸和莫纳甜结合于柱。蒸发过程中形成的沉淀含有>97％色氨酸和<2％莫纳甜。上清中色氨酸与产物的比例约为2:1。

上清(7ml)应用于100mL Fast Flow DEAE琼脂糖(安玛西亚生物科学公司)柱，柱预先用0.5L 1M NaOH、0.2L水、1.0L 1.0M醋酸铵，pH8.4和0.5L水洗转化成醋酸盐形式。上清以<2mL/分钟上样，柱用3-4mL/分钟的水洗直到280nm处的吸光度约为0。莫纳甜用100mM醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个100-mL部分。

部分的分析显示流过部分的色氨酸与莫纳甜比例为85:15且洗脱部分的比例为7:93。假定莫纳甜在280nm处的消光系数与色氨酸相同，洗脱部分含有0.146毫摩尔产物。对于68％的回收，推断总共1L的反应会生成约2.4毫摩尔(约710mg)莫纳甜。

来自DEAE琼脂糖柱的洗脱部分蒸发到<20mL。通过用C₈制备型反相柱进一步纯化产物的等分部分，所用色谱条件与实施例18所述用于分析-规模莫纳甜特征的条件相同。Waters Fractionlynx^TM软件用于在检测m/z＝293离子基础上触发自动分部收集莫纳甜。收集来自莫纳甜的相应质子化分子离子的C₈柱的部分，蒸发到干燥，随后溶于小体积水。此部分用于产物的鉴定。

所得产物用下列方法表征。

UV/可见光谱学.用Cary 100 Bio UV/可见光分光光度计完成UV/可见光谱测量酶法生成的莫纳甜。溶于水的纯化产物显示280nm的最大吸收，在288nm处有一肩，是含吲哚的化合物的典型特征。

LC/MS分析.如实施例18所述完成莫纳甜混合物的分析，莫纳甜获得自体外生化反应。图5说明体外酶合成混合物中莫纳甜的典型LC/MS分析。图5的下面一组阐明莫纳甜的质子化分子离子在m/z＝293的所选离子色谱。混合物中的此莫纳甜鉴定通过图6所述质谱确证。LC/MS分析纯化产物显示293的分子离子单峰和280nm处的吸光度。质谱与图6所示相同。

MS/MS分析.如实施例18所述，也对莫纳甜进行LC/MS/MS子离子实验。图7说明莫纳甜的子离子质谱。对图7中标记的所有片段离子进行了试验性结构分配。这些包括m/z＝275(293-H₂O)、257(293-(2xH₂O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳离子)、130(3-亚甲基-1H-吲哚-正碳离子)和118(吲哚正碳离子)的片段离子。如预料的，如果获得自分子的吲哚部分，这些中的许多与MP获得的(实施例7)相同。由于存在氨基而不是酮，一些比MP所见高1个质量单位。

莫纳甜的精确质量测量.图8阐明使用应用生物系统公司(AppliedBiosystems)-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪获得的纯化莫纳甜的质谱。使用色氨酸作为内部质量校准标准，质子化莫纳甜的测量质量是293.1144。在C₁₄H₁₇N₂O₅元素组成的基础上，质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。此质量测量误差小于百万分之二(2ppm)，提供酶法生成莫纳甜的元素组成的确证。

NMR光谱学.NMR实验在Varian Inova500MHz仪器上进行。莫纳甜样品(～3mg)溶于0.5ml D₂O。溶剂(D₂O)起初用作4.78ppm的内部参考。由于水的峰大，运行¹H-NMR，同时抑制水的峰。随后，由于水的峰宽，莫纳甜的C-2质子用作参考峰，设在7.192ppm的发表值。

对于¹³C-NMR，几百次扫描的初始运行表明样品太稀释不能在规定时间获得适当¹³C谱。因此，进行异核多级量子相干(HMQC)实验，它能使其附着的氢和碳相关，也提供碳化学位移的信息。

表4和5显示¹H和HMQC数据的概括。通过与发表值比较，NMR数据表明酶法生成的莫纳甜是(S，S)、(R，R)或两者的混合物。

手性LC/MS分析.为确定体外生成的莫纳甜是一种异构体而不是(R，R)和(S，S)对映异构体的混合物，用实施例18所述仪器完成手性LC/MS分析。

用Chirobiotic T(高级分离技术)手性色谱柱在室温进行手性LC分离。在供应商发表的方案基础上，对色氨酸的R-(D)和S-(L)异构体优化分离和检测。LC流动相包括A)含0.05％(v/v)三氟乙酸的水；B)含0.05％(v/v)三氟乙酸的甲醇。洗脱在70％A和30％b为等度。流速为1.0mL/分钟，从200nm到400nm监控PDA吸光度。用于手性LC/MS分析色氨酸和莫纳甜的仪器参数与实施例18所述用于LC/MS分析的相同。收集使用m/z 150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于R-和S-色氨酸的[M+H]⁺＝205且用于莫纳甜的[M+H]⁺＝293)可直接鉴定混合物中的这些分析物。

图9显示R-和S-色氨酸和莫纳甜的色谱，它们由手性色谱分离并通过MS监控。莫纳甜色谱中的单峰表明该化合物是一种异构体，保留时间几乎与S-色氨酸相同。

表4

¹H NMR数据

¹Vleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992)。

²Takeshi和Shusuke(JP2002060382，2002-02-26)。

表5

¹³C NMR数据(来自HMQC谱)

 

	嘉吉公司	Vleggaar等1
			原子	δC	δC
2	126.1	126.03
			3	*	110.31
4	120.4	120.46
			5	120.2	120.25
6	122.8	122.74
			7	112.8	112.79
8	*	137.06
			9	*	129.23
10a	36.4	36.53
			12	39.5	39.31
13	54.9	54.89
			14	*	175.30
15	*	181.18

¹Vleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992)。

旋光测定.在Rudolph Autopol III旋光仪上测量旋光性。莫纳甜制备为14.6mg/mL的水溶液。对于1g/mL水溶液，S，S莫纳甜(盐形式)的预期比旋光([α]_D ²⁰)是-49.6(Veleggaar等)。观察到纯化、酶法生成莫纳甜的[α]_D ²⁰为-28.1，表明它是S，S异构体。

改进

优化包括试剂和酶浓度的反应条件，5-10mg/mL的产量用下列试剂混合物产生：50mM醋酸铵，pH8.3、2mM MgCl₂、200mM丙酮酸(钠或铵盐)、5mM α-酮戊二酸(钠盐)、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到1mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、50μg/mL重组ProA醛缩酶(细胞提取物；总蛋白浓度为167μg/mL)、1000μg/mL大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶(细胞提取物；总蛋白浓度为2500μg/mL)和使浓度>60mM的固体色氨酸(饱和；一些在整个反应中未溶解)。混合物在30℃孵育4小时并温和搅拌或混合。

取代

α-酮戊二酸的浓度可减少到1mM并补充9mM天冬氨酸，莫纳甜的产量相等。另外的氨基酸受体可用于第1个步骤，如草酰乙酸。

当用重组硕大利什曼原虫宽底物转氨酶代替大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶时，获得类似的莫纳甜产量。然而，分子量为292的第2种未鉴定产物(主要产物的3-10％)也通过LC-MS分析检测。当大肠杆菌tyrB编码的酶、苜蓿中华根瘤菌tatA编码的酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)作为转氨酶加入时，产生0.1-0.5mg/mL的莫纳甜浓度。当反应从吲哚-3-丙酮酸开始时，还原性氨基化可用于最后步骤，此步有谷氨酸脱氢酶和NADH(如实施例15)。

来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿中华根瘤菌的KHG醛缩酶也与大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶一起使用以酶法生成莫纳甜。使用下列反应条件：50mM NH₄-OAcpH8.3、2mM MgCl₂、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到0.5mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、20μg/mL重组枯草芽孢杆菌KHG醛缩酶(纯化的)、大约400μg/mL来自细胞提取物的未纯化大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反应在30℃振荡孵育30分钟。用枯草芽孢杆菌酶生成的莫纳甜量为80ng/mL，随着醛缩酶量增加而提高。如果用饱和量的色氨酸和5mM α-酮戊二酸代替吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸，莫纳甜产量增加到360ng/mL。用50mM Tris pH8.3中的3种30μg/mL KHG酶和饱和量的色氨酸重复反应，进行1小时以增加检测。如实施例7所述，杆菌酶活性最高，产生约4000ng/mL莫纳甜。大肠杆菌KHG产生3000ng/mL莫纳甜，苜蓿中华根瘤菌酶产生2300ng/mL。

实施例10

用含有或不含氨基端HIS₆标签的ProA醛缩酶和AspC、TyrB或HEXAspC转氨酶将色氨酸转变为莫纳甜

采用经构建含有或不含氨基端HIS₆标签的三种转氨酶进一步检测如实施例9所述利用两种酶由色氨酸生产莫纳甜的体外方法。

酶

如实施例7所述克隆和表达睾丸酮丛毛单胞菌的ProA醛缩酶基因。该基因构建物的基因产物携带了pET30系统的氨基端HIS₆标签。

如实施例1所述克隆和表达用pET30氨基端HIS₆标签系统构建的aspC和tyrB转氨酶基因。如实施例2所述克隆和表达用pET30氨基端HIS₆标签系统构建的HEX基因。如实施例3所述克隆和表达未标记的三种转氨酶基因。

基因表达和莫纳甜产量测定

采用含有转氨酶蛋白质的细胞提取物

由在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养的培养物制备含有proA、aspC、tyrB和HEX基因产物的细胞提取物。OD₆₀₀达到约0.5后，通过加入0.2mM IPTG诱导蛋白。诱导后30℃培养细胞4小时，离心收获细胞。按照诺华基公司推荐方案用含有1μL/mL Benzonase核酸酶、5μL/mL Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物组III和0.33μL/10mL r-溶菌酶的Bugbuster^TM试剂(诺华基公司)裂解洗涤过的细胞。25℃温和振荡培育15分钟后，21,000xg、4℃离心20分钟以沉淀细胞碎片，小心去除上清液(细胞提取物)。

用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒在96孔板中评估蛋白质浓度。每孔的总测定体积为200μL。将200μL工作试剂加入各孔的10μL蛋白质溶液中。用牛血清白蛋白(Pierce目录号23209)用于测定标准曲线(0-1.0mg/mL)。在562nm测定试验样品和标准品的吸光度。

用未纯化酶检测由色氨酸形成的莫纳甜。在以下例子中这两种蛋白的表达水平高(占总可溶性蛋白质的30-40％)。然而，也可采用其表达水平低(例如)5-30％总可溶性蛋白质，或高(例如)40％以上总可溶性蛋白质的其它细胞提取物。1mL反应混合物含有100mM乙酸钠，pH8.0，4mM MgCl₂，3mM磷酸钾，0.05mM吡哆醛磷酸，200mM丙酮酸钠，50mM色氨酸，10mM α-酮戊二酸，112μg重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(含有～30％醛缩酶(以总可溶性蛋白质的百分数计算)的未纯化细胞提取物)和1000μg或10μg重组转氨酶(含有～40％转氨酶(以总可溶性蛋白质的百分数计算)的未纯化细胞提取物)。加入固体形式的色氨酸。将除酶以外的所有组分混合在一起，30℃培育直到色氨酸溶解。然后加入酶，30℃温和振荡培育该反应溶液1小时。如实施例18所述，用LC/MS/MS MRM分析反应混合物中形成的莫纳甜。表6以1小时培育中形成的产物浓度说明了酶活性。这些结果显示，AspC或HEXAspC转氨酶与pET30氨基端HIS₆标签融合时或它们表达为天然蛋白质时由色氨酸形成的莫纳甜的产量无显著性差异。相反，与未标记TyrB蛋白相比，标记的TyrB蛋白产生的产物较少。未标记TyrB产生的产物水平约为AspC或HEXAspC转氨酶反应混合物中观察到的产物水平的25-75％，这取决于所加入的转氨酶总量。

表6

 

转氨酶基因	[转氨酶]；μg/mL	[莫纳甜]；g/L
			aspC	300	1.085
aspC	30	0.186
			tyrB	300	0.751
tyrB	30	0.087
			HEX	300	1.514
HEX	30	0.411
			HIS6-aspC	300	1.101
HIS6-aspC	30	0.213
			HIS6-tyrB	300	0.002
HIS6-tyrB	30	0.001
			HIS6-HEX	300	1.581
HIS6-HEX	30	0.487
					ND*

^*低于检测水平

采用非最优培养基、诱导物浓度或诱导时间时，AspC或ProA的表达水平降低(如降低至总可溶性蛋白质的约10-20％)。在这些情况下，采用额外量的细胞提取物获得相同结果。

采用纯化的转氨酶蛋白

用装有His-Bind柱的固定金属亲和色谱按照生产商说明书(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)由标记pET30构建物的细胞提取物(如上所述制备)纯化转氨酶。融合蛋白的HIS₆-Tag序列结合于固定在IDA基His-Bind树脂的二价Ni²⁺阳离子。洗脱组分在PD-10(安玛西亚生物科学公司，新泽西州皮斯卡塔韦)柱上脱盐，用50mMTris-HCl，pH7.0洗脱。用SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度，用Pierce BCA测定试剂盒以牛血清白蛋白为标准品测定该组分中的蛋白质含量。

用纯化的AspC、HEXAspC或TyrB转氨酶和未纯化的ProA醛缩酶检测由色氨酸形成的莫纳甜。0.5mL该反应混合物含有50mM Tris-HCl，pH8.0，4mM MgCl₂，3mM磷酸钾，0.05mM吡哆醛磷酸，200mM丙酮酸钠，～50mM色氨酸，5mMα-酮戊二酸，165μg重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(未纯化的细胞提取物含有～30％醛缩酶(以总可溶性蛋白质的百分数计算))以及64μg或10μg纯化的重组大肠杆菌转氨酶。加入固体形式的色氨酸。将除酶以外的所有组分混合在一起，30℃孵育直到色氨酸溶解。然后加入酶，反应溶液30℃孵育并温和振荡2小时。将该反应混合物稀释10倍，如实施例18所述用LC-MS/MS MRM分析莫纳甜形成。表7以2小时培育形成的产物浓度说明了酶活性。

表7

 

转氨酶基因	[转氨酶]；μg/mL	[莫纳甜]；g/L
			HIS6-aspC	64	0.380
HIS6-aspC	10	0.0015
			HIS6-tyrB	10	0.0019
HIS6-HEX	64	0.457
			HIS6-HEX	10	0.0879
-	-	0.0032

表7的结果显示，采用有限量的纯化转氨酶和大量过量的醛缩酶(未纯化)，HEXAspC转氨酶反应比AspC转氨酶反应产生的莫纳甜多几倍(几乎检测不到与0.0879g/L)。采用较高的转氨酶浓度时，提高约20％。但相似地，用未纯化酶观察到的差异显然较小(见表6)。

也将不含HIS₆标签系统的睾丸酮丛毛单胞菌的ProA醛缩酶基因和HEX天冬氨酸转氨酶基因克隆到pET23a(诺华基公司)衍生物的多克隆序列的NdeI和XhoI位点上。由IPTG或乳糖诱导的培养物制备这些构建物的细胞提取物并用作酶学生产莫纳甜中的酶来源。用三种磺酸盐缓冲液(MOPS、3-(N-吗啉代)丙磺酸；HEPES，4-(2-羟乙基)哌嗪(poperazine)-1-磺酸；TAPS，2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基)-1-丙磺酸)之一在pH为7.5-8.9的50mL体系中进行该反应。该反应含有50mM缓冲液、2mMMgCl2、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.005mM吡哆醛磷酸、脱气水，加入酶、3mM磷酸钾、194μg/mL ProA醛缩酶细胞提取物(含有～50μg/mL醛缩酶)和281μg/mL或2810μg/mL HEXAspC转氨酶细胞提取物(含有～50μg/mL或～500μg/mL转氨酶)后，最终体积为50mL。恰好在加入酶之前和反应开始后的时间间隔点上将固体色氨酸(0.5g)加入反应混合物中。室温搅拌该反应，取出等份用LC-MS进行分析，如上所述。在这些条件下，生产莫纳甜的最优pH为8.2-8.5。反应开始后，该酶继续产生莫纳甜数天，并产生多达6g/L产物。

实施例11

本实施例描述了用于克隆和分析运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(ATCC29191)的KHG醛缩酶的方法。将此酶与转氨酶联用以由色氨酸生产莫纳甜。

克隆

以类似方式将运动发酵单胞菌(ATCC 29191)的khg基因克隆到实施例2所述的基因中。用Mekalanos JJ，Duplication and amplification of toxin genes in Vibriocholerae(复制和扩增霍乱弧菌的毒素基因)，Cell 35：253-263(1983)所述方法分离基因组DNA。

设计以下引物，以将运动发酵单胞菌khg基因克隆到pET30a和pET28载体(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)中

N末端：

5′-GGCCGGCATATGCGTGATATCGATTCCGTAAT-3′(SEQ ID NO：81)；

C末端：

5′-GGAATTCTCGAGTTAGGCAACAGCAGCGCG-S′(SEQ ID NO：82)。

用以下PCR方案进行基因扩增：在50μL反应中，加入200ng DNA模板、1.6μM各引物、0.4mM各dNTP、0.5U pfuUltra HF聚合酶(司查塔基公司)、2.8 U Expand HighFidelity^TM聚合酶(罗氏分子生物化学公司，印第安纳州印第安纳波利斯)和含有MgCl₂的1X Expand^TM缓冲液。热循环程序采用94℃热启动3分钟；接着是8个下述步骤的循环：94℃的变性步骤(30秒)、53℃的退火步骤(30秒)、72℃的延伸步骤(1分钟30秒)；20个下述步骤的循环：94℃的变性步骤(30秒)、59℃的退火步骤(30秒)、72℃的延伸步骤(1分钟30秒)；最后是72℃的结束步骤(7分钟)。用凯杰

凝胶提取试剂盒(加州巴伦西亚)从1％琼脂糖凝胶中纯化扩增的DNA。用NdeI和XhoI按照生产商说明书(NEB公司；马萨诸塞州贝弗利)消化纯化的DNA和纯化的质粒DNA(用Qiagen

离心小量制备试剂盒纯化)。用NdeI消化pET30a载体能去除氨基端HIS₆-标签区。用凯杰凝胶提取试剂盒(加州巴伦西亚)由1％琼脂糖凝胶纯化消化的DNA。通过测定260nm处的吸光度定量纯化的DNA产物，用快速DNA连接试剂盒(罗氏)连接。如伯乐电穿孔手册所述，用0.2cm试管和伯乐基因脉冲器II系统在标准条件下将连接反应物转化到电感受态DH10B中。通过限制性分析鉴定含有khg基因的克隆，用DNA测序验证。SEQ ID NOS 83和84显示了khg基因和基因产物的核苷酸和相应氨基酸序列。

基因表达和测定

按照生产商方案(诺华基公司)将质粒DNA(经序列分析验证)转化到表达宿主BL21(DE3)中。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养培养物。用含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃培养的BL21(DE3)构建物进行诱导实验。OD₆₀₀达到约0.6后用0.2mM IPTG诱导蛋白表达。30℃培养细胞4小时，离心收获细胞。然后按照诺华基公司推荐方案采用含有1μL/mL Benzonase核酸酶和5μL/mL Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物组III的Bugbuster^TM试剂(诺华基公司)裂解细胞。通过SDS-PAGE在4-15％梯度凝胶(伯乐)上分析上清液(无细胞提取物)，以检测重组融合蛋白的可溶性蛋白水平。运动发酵单胞菌醛缩酶在大肠杆菌中有效表达，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶分析它约占可溶性蛋白质的30％。用未纯化酶检测由色氨酸形成的莫纳甜。1mL反应混合物中含有100mM乙酸钠、pH8.0、4mM MgCl₂、3mM磷酸钾、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸钠、50mM色氨酸、10mMα-酮戊二酸、239μg重组HEXAspC转氨酶(含有～30-40％醛缩酶的未纯化细胞提取物(以总可溶性蛋白质的百分数计算))和重组运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(10或100μg含有～30％醛缩酶的未纯化细胞提取物(以总可溶性蛋白质的百分数计算))或ProA醛缩酶(11.2或112μg含有30％醛缩酶的未纯化细胞提取物(以总可溶性蛋白质的百分数计算))。加入固体形式的色氨酸。将除酶以外的所有组分混合在一起，30℃培育直到色氨酸溶解。然后加入酶，30℃温和振荡培育该反应溶液1小时或22小时。将该反应混合物稀释10倍，如实施例18所述用LC-MS/MS MRM分析莫纳甜形成。表8以培育形成的产物浓度说明了酶活性。

表8

 

醛缩酶基因	醛缩酶μg	转氨酶μg	培育时间(小时)	[莫纳甜]；μg/mL
					运动发酵单胞菌khg	10	239	1	0.730
运动发酵单胞菌khg	10	239	24	18.150
					运动发酵单胞菌khg	100	239	1	0.800
运动发酵单胞菌khg	100	239	24	18.630
					运动发酵单胞菌khg	0	239	1	nd
运动发酵单胞菌khg	0	239	24	<0.2
					运动发酵单胞菌khg	0	0	1	0.980
运动发酵单胞菌khg	0	0	24	16.990
					睾丸酮丛毛单胞菌proA	11.2	239	1	214
睾丸酮丛毛单胞菌proA	11.2	239	24	1464
					睾丸酮丛毛单胞菌proA	112	239	1	746
睾丸酮丛毛单胞菌proA	112	239	24	1160
					睾丸酮丛毛单胞菌proA	0	239	1	<0.2
睾丸酮丛毛单胞菌proA	0	239	24	1.790
					睾丸酮丛毛单胞菌proA	0	0	1	0.990
睾丸酮丛毛单胞菌proA	0	0	24	17.470

表8所列结果显示，运动发酵单胞菌KHG醛缩酶能催化莫纳甜的形成，但与存在ProA醛缩酶的反应相比水平低。通过比较第2行和第4行的结果可以看出，将较高浓度的KHG醛缩酶加入该反应时，形成更多的莫纳甜。在存在运动发酵单胞菌KHG醛缩酶的反应的LC/MS/MS色谱图中观察到含有莫纳甜MS/MS特征的两个峰，这表明此酶形成了一种以上莫纳甜异构体。表8所示结果反映了这两个峰的总和。采用手性技术分析时，来自运动发酵单胞菌试验的24小时样品显示出，大多数样品是S，S-莫纳甜。然而，有少量R，S-莫纳甜，这表明运动发酵单胞菌醛缩酶能够产生R-莫纳甜前体(R-MP)立体异构体。

通过与实施例7所述的大肠杆菌同源物以及ProA醛缩酶比较进一步表征运动发酵单胞菌KHG。每1mL反应混合物加入：约60μg醛缩酶(在细胞提取物中提供)，4mM MgCl₂，50mM D-色氨酸，0.5mg生物催化公司的D-氨基转移酶(AT-103)，100mM丙酮酸钠，100mM磷酸钾缓冲液pH7.5或100mM乙酸钠缓冲液pH8，0.05mMPLP，3mM磷酸钾(仅用于乙酸反应)和10mMα-酮戊二酸。一式两份地进行实验，阴性对照不加醛缩酶。30℃温和振荡培育样品过夜(20小时)，过滤，然后进行LC/MS/MS分析和FDAA衍生化。乙酸钠样品的实际pH约为5，而磷酸盐缓冲样品的最终pH约为7。pH5时，醛缩酶都没有显示出显著活性，含有ProA醛缩酶的样品略高于阴性对照，但可能不高于实验误差。在磷酸钾中，ProA醛缩酶产生73.4ppm莫纳甜，R，R:S，R比率为1.7:1。KHG醛缩酶产生0.03-0.6ppm莫纳甜，R，R:S，R产物比率约为2:1-4:1。

实施例12

用另一种天冬氨酸转氨酶生产S，S莫纳甜

由大肠杆菌MG1655克隆与天冬氨酸和芳族氨基酸转氨酶有同源性的推定PLP依赖性转氨酶，检测重组蛋白生产S，S-莫纳甜的活性。根据以GI：48994873碱基2496317-2495079保藏于NCBI的yfdZ基因序列设计引物，该基因序列编码蛋白GI:1788722(蛋白质ID AAC75438.1)

5′引物：

TGA CCC TCT AGA TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG GCT GAC ACT CGCCCT GAA C(SEQ ID NO：85)

3′引物：

TTC TCA AGC TTT TAT TCC GCG TTT TCG TGA ATA TGT TTG(SEQ ID NO：86)

用标准技术制备MG1655的基因组DNA，将100ng用于100μLPCR反应，该反应还含有1×rTth缓冲液、1mM醋酸镁、0.3mM各dNTP、0.75μM各引物、0.5μLPfu聚合酶(司查塔基公司)和4单位rTth聚合酶(应用生物系统公司)。八轮采用56℃退火温度的PCR，后接22轮采用60℃退火温度的PCR。延伸步骤在68℃进行2分钟15秒。用凯杰QIAquick凝集提取试剂盒(加州巴伦西亚)凝胶纯化PCR产物，用50μLEB缓冲液洗脱。用Xba和HindIIIin在1X NEB缓冲液2加BSA中37℃消化纯化的PCR产物和pTRC99a(法玛西亚生物科技(Pharmacia Biotech))载体过夜。用凯杰QIAquick

 PCR纯化试剂盒纯化消化产物，用32μL0.5X EB洗脱。用快速连接试剂盒(NEB公司)进行连接，插入物:载体之比为6:1。用PCR纯化试剂盒纯化该连接反应，并电穿孔至DH10B感受态细胞中。将2μL接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。用获自pTRC99a载体的引物以PCR筛选菌落。对小量制备DNA进行测序，以确认插入物正确地插入载体中。

用含有氨苄青霉素的LB培养基培养细胞至OD 0.4，用1mM IPTG 37℃诱导3小时。按照生产商说明书用BugBuster^TM(诺华基公司)生产细胞提取物，用Pierce BCA测定试剂盒以0-2mg/mL BSA标准品测定蛋白质浓度。对可溶性蛋白质作SDS-PAGE分析，以验证表达，估计推定的转氨酶(YfdZ)含有约10％的可溶性蛋白质。

在100mM乙酸钠和50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中测定yfdZ基因产物生产的莫纳甜，并与如实施例2所述制备的HEXAspC蛋白作比较。在含有20mM L-色氨酸、4mM MgCl₂、3mM磷酸钾(仅用于乙酸盐缓冲液)、0.05mM PLP、10mMα-酮戊二酸、100mM丙酮酸钠和50μg以细胞提取物形式提供的ProA醛缩酶(如实施例7所述)的各缓冲液中测定50μg未纯化转氨酶。在加入酶之前，将乙酸盐样品的pH从6调整到7.5。30℃温和振荡培育1mL样品(一式两份)1小时。也在各缓冲液中进行阴性对照，除了ProA醛缩酶细胞提取物中存在的物质以外，阴性对照不含任何转氨酶。如实施例18所述过滤样品，并用LC/MS/MS(MRM)进行分析。减去产生的背景量莫纳甜(410-469ng/mL莫纳甜)后，发现HEXAspC转氨酶在磷酸盐缓冲液中能产生1285ng/mL莫纳甜，而YfdZ蛋白产生426ng/mL莫纳甜。在乙酸钠缓冲液中，HEXAspC转氨酶产生815ng/mL莫纳甜，而推定的转氨酶产生446ng/mL。结果确认，yfdZ基因产物实际上是与实施例1所述天冬氨酸转氨酶的作用类似并且对色氨酸和莫纳甜都有活性的转氨酶。

实施例13

用市售转氨酶文库由吲哚-3-丙酮酸生产莫纳甜的比较

转氨酶文库购自生物催化公司(加利福尼亚州帕萨迪纳)，在采用睾丸酮丛毛单胞菌的ProA醛缩酶的偶联反应中检测该酶在偶联反应中生产的莫纳甜。该文库由以下组分组成：AT-101，广泛L-转氨酶；AT-102，支链L-转氨酶(即支链转氨酶(BCAT，EC2.6.1.42))；AT-103，广泛D-转氨酶；AT-104，支链L-转氨酶(即支链转氨酶(BCAT，EC2.6.1.42))；AT-105，赖氨酸-6-转氨酶；和AT-106，广泛L-转氨酶。在与AT-103的反应中，D-谷氨酸用作氨基酸供体。在与AT-105的反应中，L-赖氨酸用作氨基酸供体。所有其它反应利用L-谷氨酸作为共同底物。将酶和其它组分/底物直接加入试剂盒提供的反应缓冲液中，其中含有100mM磷酸钾缓冲液pH7.5、100mM氨基供体和0.1mM PLP。向1mL反应缓冲液中加入：4mg吲哚-3-丙酮酸、20mg丙酮酸、约50μg以细胞提取物形式提供的ProA、1μL 2M MgCl₂和2mg待测转氨酶。一式两份地进行所有反应，阴性对照反应不加额外的转氨酶。莫纳甜的背景生产是由于重组ProA酶细胞提取物中存在天然大肠杆菌转氨酶。30℃温和振荡(100rpm)培育该反应过夜。过滤该样品，并进行反相LC/MS/MS分析(如实施例18所述)。结果见下：

 

酶	产生的莫纳甜μg/mL
		AT-101	173.05
AT-102	122.05
		AT-103	369.7
AT-104	133.05
		AT-105	15.2
AT-106	78.35
		阴性	73.25

AT-101、AT-102、AT-103和AT-104转氨酶产生的莫纳甜明显多于阴性对照。AT-105产生的莫纳甜少于阴性对照，大概是因为赖氨酸用作氨基供体，它不适合细胞提取物中的天然大肠杆菌转氨酶。相似地，预计与用于D-谷氨酸的AT-103发生反应的背景较低。进一步分析结果以确定S，R/R，S与R，R/S，S莫纳甜的比值(以色谱分离过程中分辨开的两种立体异构体库的峰面积计)。在所产生的总莫纳甜中，阴性对照含有约99.7％ R，R/S，S莫纳甜。AT-102的特异性(89％ RR/SS峰)次之，然后是AT-101和AT-104(～80％)。与混合异构体相比，利用广泛特异性D-转氨酶AT-103的反应产生69％ R，R/S，S莫纳甜。此酶与实施例1所述的枯草芽孢杆菌DAT酶同源，已知它对D-氨基酸具有广泛特异性，如实施例1所示它能接受D-色氨酸作为底物。用实施例18所述方法进行手性分析，验证了正如所料，该D-转氨酶产生R，R莫纳甜。以S，S莫纳甜或R，R莫纳甜作为底物的进一步实验验证，正如所料，生物催化公司的酶对D构型有高度选择性(实施例15所示结果)。

为了降低作为与AT-103(广泛性D-转氨酶)和ProA醛缩酶的偶联反应副产物产生的S，S莫纳甜或R，S莫纳甜的产量，用His-Bind柱纯化醛缩酶，如实施例1所述。纯化酶不应含有细胞提取物中可能存在的野生型转氨酶活性。His-Bind洗脱物用PD-10柱(G25 Sephadex，安法玛西亚公司(Amersham-Pharmacia))脱盐，以去除咪唑，用50mM Tris-Cl(pH7)洗脱。以1mL体积一式两份地进行实验，实验含有100mMTris-Cl缓冲液(pH7.8)、50μg ProA醛缩酶、4mg吲哚-3-丙酮酸、1或2mg D-转氨酶、200mM丙酮酸钠、2mM MgCl₂、3mM磷酸钾、0.1mM PLP和14.7mg D-谷氨酸。30℃温和振荡培育该试管。取2小时时间点，立即冷冻于-20℃。在2小时时用NaOH将pH由5调整至7-8，培育该试验过夜。过滤样品，如实施例18所述分析其中的莫纳甜。2小时样品中的莫纳甜含量无法检测到，可能是由于pH低。采用1mgD-转氨酶时，过夜样品含有约190ng/mL莫纳甜，约84％为R，R莫纳甜，16％为S，R莫纳甜。采用2mg D-转氨酶时，产生540ng/mL莫纳甜，约71％是R，R莫纳甜。

用生物催化公司转氨酶缓冲液进行相似试验，所述缓冲液含有100mM磷酸钾pH7.5，0.1mM PLP和100mM谷氨酸。如上所述加入固体吲哚-丙酮酸和D-转氨酶。加入ProA醛缩酶(50μg)、MgCl₂和50mM丙酮酸的母液。如上所述处理该试验，但在这种情况下不需要调节pH。阴性对照仅使用生物催化公司提供的酶和缓冲液，它不会产生任何莫纳甜。实验结果见表9。

表9

在磷酸盐缓冲液中由吲哚-3-丙酮酸产生莫纳甜

 

Mg D-转氨酶	时间(小时)	总莫纳甜(ng/mL)	％R，R
				0	2	0	n/a
1	2	6,780	未测定
				2	2	13,170	55％
0	16	0	n/a
				1	16	15,000	未测定
2	16	28,930	51％

磷酸盐缓冲液中的莫纳甜产量明显高于Tris缓冲体系中的莫纳甜产量。

为了比较来自实施例1的克隆的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)DAT与生物催化公司酶的活性，进行额外测定。也亚克隆枯草芽孢杆菌dat基因以去除His-6标签，如实施例1中关于AspC和HEXAspC转氨酶的描述。在BL21(DE3)中产生未标记和标记的酶，如实施例1所述。制备细胞提取物，进行总蛋白测定以评估蛋白质浓度，如前所述。进行一式两份的1mL反应，每份含有：500μg D-转氨酶、50μg ProA醛缩酶、100mM磷酸钾pH7.5、3mM MgCl₂、4mg吲哚-3-丙酮酸、200mM丙酮酸钠、7.35mg(50mM)D-谷氨酸和0.1mM PLP。30℃培育样品1小时、2小时和过夜，过滤后用于LC/MS/MS分析。经实施例18所述的FDAA衍生法测定，样品仅含莫纳甜的S，R和R，R立体异构体。结果见下表10。通过反相色谱分离的峰面积测定％RR，再用FDAA衍生技术验证过夜样品的组成。

表10

D-转氨酶的比较

 

酶	时间(小时)	莫纳甜(ppb)	％RR莫纳甜
				枯草芽孢杆菌DAT-HIS	1	512	未测定
未标记的枯草芽孢杆菌DAT	1	1056	未测定
				生物催化公司AT-103	1	2353	未测定
枯草芽孢杆菌DAT-HIS	2	894	～80-90％
				未标记的枯草芽孢杆菌DAT	2	1913	～80％
生物催化公司AT-103	2	6887	92.5％
				枯草芽孢杆菌DAT-HIS	16	3014	31
未标记的枯草芽孢杆菌DAT	16	5612	33
				生物催化公司AT-103	16	16131	66

去除HIS-6标签似乎能提高枯草芽孢杆菌D-转氨酶的活性；然而，生物催化公司D-转氨酶同源物的活性显然最高。它也显示对R-MP的底物特异性更高。延长培育时间似乎会减少产生的对映异构体过量的R，R莫纳甜。

已经鉴定了其它来自芽孢杆菌的同源性D-氨基酸转氨酶。发现来自芽孢杆菌YM-1的酶与枯草芽孢杆菌酶的底物特异性相似，因此预计此酶对莫纳甜的生产有作用。此外，芽孢杆菌YM-1和枯草芽孢杆菌酶是特异性更高的酶，但与球形芽孢杆菌和其它种类的同源物相比它不具有广泛的底物特异性。因此，预计所有芽孢杆菌同源物在产生莫纳甜的酶途径中都有活性。参见K.Yonaha，H.Misono，T.Yamamoto和K.Soda，JBC，250：6983-6989(1975)；K.Tanizawa，Y.Masu，S.Asano，H.Tanaka和K.Soda，JBC264：2445-2449(1989)。所测试的一种同源酶AT-103(如上)能催化莫纳甜的产生。已知许多基因编码芽孢杆菌中的D-氨基酸转氨酶，这些芽孢杆菌包括炭疽杆菌(B.anthracis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、嗜碱芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、芽孢杆菌YM-1/YM-2、地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)、嗜热菌属(thermophilic sp.)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus sp.)。

实施例14

用市售脱氢酶生产莫纳甜

在以下条件下测定用偶联于睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶的生物催化公司氨基酸脱氢酶由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸生产的莫纳甜：将6-7mg/ml脱氢酶、5mgNADH或NADPH、50μg醛缩酶(未纯化，参见实施例7)、3mM磷酸钾缓冲液、2mMMgCl₂、4mg吲哚-3-丙酮酸和20mg丙酮酸加入1mL AADH反应缓冲液(100mM碳酸氢盐，pH9.5，200mM NH₄Cl)中。阴性对照不含氨基酸脱氢酶。30℃、100rpm培育样品过夜。一式两份进行实验。检测的脱氢酶是AADH-110、AADH-111、AADH-112和AADH-113。AADH-110和111被确定为广泛特异性酶，而112和113是谷氨酸脱氢酶。与阴性对照相比，AADH-110产生的莫纳甜最多(经LC/MS/MS测定)，约为0.36μg/mL。利用NADH的谷氨酸脱氢酶AADH-112的活性高于利用NADPH的谷氨酸脱氢酶(AADH-113)。在测定条件下，AADH-111产生的莫纳甜似乎不比阴性对照多。

实施例15

MP和莫纳甜间的相互转化

可通过转氨酶，或通过需要还原辅因子如NADH或NADPH的脱氢酶催化MP氨基化形成莫纳甜。参见实施例1和9、10、12-14。这些反应是可逆的且能以任何一个方向测量。当使用脱氢酶时，方向性主要通过铵盐的浓度控制。

脱氢酶活性.随着NAD(P)+转化成更生色的NAD(P)H，通过跟踪340nm处吸光度增加来监控莫纳甜的氧化脱氨。如实施例9所述酶法生成和纯化莫纳甜。

典型的0.2mL测定混合物含有50mM Tris-HCl，pH8.0到8.9、0.33mM NAD⁺或NADP⁺、2到22单位的谷氨酸脱氢酶(西格马公司)和10-15mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，用Molecular Devices SpectraMax Plus平板阅读器读数。将酶、缓冲液和NAD(P)⁺的混合物移吸入含底物的孔，短暂混合后，以10秒间隔监控340nm处的吸光度增加。反应在25℃孵育10分钟。不加入底物作为阴性对照，谷氨酸用作阳性对照。来自牛肝的III型谷氨酸脱氢酶(西格马公司#G-7882)催化莫纳甜转化为MP，转化率约为谷氨酰胺转化为α-酮戊二酸的百分之一。尝试利用谷氨酸脱氢酶由吲哚-3-丙酮酸生产莫纳甜导致产生可检测量的色氨酸，这表明谷氨酸脱氢酶或其突变体可用于使色氨酸脱氨，而非将氧化酶或转氨酶用于该途径的这一步骤。

转氨活性。用来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶(HIS₆-AspC)、来自大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(HIS₆-TyrB)、来自硕大利什曼原虫广泛底物转氨酶(HIS₆-BSAT)和实施例1所述的两种市售猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行莫纳甜转氨酶实验。检测作为氨基接受体的草酰乙酸和α-酮戊二酸。测定混合物含有(0.5mL)50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.05mM PLP、5mM氨基接受体、5mM莫纳甜和25μg转氨酶。30℃培育该试验30分钟，通过加入0.5mL异丙醇终止该反应。用LC/MS或LC/MS/MS监测莫纳甜损失(实施例18)。用硕大利什曼原虫HIS₆-BSAT以草酰乙酸作为氨基接受体观察到最高活性，其次是同一酶以α-酮戊二酸作为氨基接受体。对草酰乙酸的相对活性为：HIS₆-BSAT>HIS₆-AspC>猪IIa型>猪I型＝HIS₆-TyrB。对α-酮戊二酸的相对活性为：HIS₆-BSAT>HIS₆-AspC>猪I型>猪IIa型＝HIS₆-TyrB。

采用与上述类似的测定，和实施例18所述的检测方法，苜蓿中华根瘤菌tatA和类球红细菌tatA这两种酶在测试条件下似乎没有将莫纳甜可检测地转化为MP。然而，这种缺乏可检测的活性可能归因于莫纳甜有时难以检测，因为它在水溶液中不稳定。在采用纯化ProA醛缩酶和纯化苜蓿根瘤菌转氨酶各约50μg的反应中(在类似于实施例9的条件下)，用2小时将色氨酸和丙酮酸转变为6ppm莫纳甜，过夜反应转变为40ppm莫纳甜。类球红细菌色氨酸转氨酶产生的莫纳甜多约10倍，这表明将MP转变为莫纳甜的活性较高。

通过跟踪用实施例3所述方法形成的副产物谷氨酸测定未标记TyrB和AspC蛋白的转氨酶活性和底物特异性，其中S，S-莫纳甜(5mM)代替色氨酸作为底物。在此转氨酶反应中，S，S-莫纳甜与氨基接受体α-酮戊二酸发生化学计量性反应，形成MP和谷氨酸。因此，如果形成1μmole谷氨酸，也应形成1μmole MP。结果见表11。

表11

 

转氨酶基因	蛋白质μg	[谷氨酸]；μg/mL
			tyrB	50	211.8
aspC	50	54.3

将这些结果与实施例3所述结果相比较可以看出，AspC对色氨酸的底物优选性比对S，S-莫纳甜的底物优选性高6倍(328.2μg/mL/54.3μg/mL)。另一方面，TyrB仅显示对色氨酸优选1.5倍(310.1μg/mL/211.8μg/mL)，以莫纳甜作底物时比AspC蛋白的活性高得多。

用市售脱氢酶将莫纳甜转变为MP

测定生物催化公司的几种氨基酸脱氢酶(AADH-101-110)将莫纳甜转变为MP的能力。在100mM碳酸氢钠缓冲液(pH10.0)、10-20mM NAD⁺、20-200mM莫纳甜(如实施例9所述制备)和20mg/ml酶中进行测定。30-45℃培育反应2小时，然后30℃培育16小时。通过跟踪由于NADH生成引起的340nm吸光度改变检测反应进程。阴性对照中没有酶，或者存在AADH-101但省去了NAD⁺或莫纳甜。用AADH-101以缬氨酸作底物进行阳性对照。虽然与阳性对照相比低(～1-4％)，但AADH-102(芳族L-氨基酸脱氢酶)和AADH-110(广泛特异性支链L-氨基酸脱氢酶；EC1.4.1.9)似乎对S，S-莫纳甜有些活性，可能经演化提高它在生物催化过程中的活性。由MP生产莫纳甜所需的还原性氨基化反应一般比此处测定的氧化性脱氨反应进行得快得多。可以用LC/MS检测到MP；然而，已发现它不稳定并且难于测定。

用市售转氨酶将莫纳甜和α-KG转变为MP和谷氨酸

AT-101、AT-102、AT-103和AT-104购自生物催化公司(加利福尼亚州帕萨迪纳)。AT-101是广泛L-转氨酶，AT-102是支链转氨酶(EC 2.6.1.42)，AT-103是广泛D-转氨酶，AT-104是支链转氨酶(EC 2.6.1.42)。与醛缩酶偶联时，这些酶都能由吲哚-丙酮酸和丙酮酸产生莫纳甜(参见实施例13)。检测这些酶对化学方法生产的S，S和R，R莫纳甜的活性。在0.5mL总体积中一式两份地进行反应。该试验含有50mM Tris pH7.8，0.08mM PLP，10mM α-酮戊二酸(α-KG)，5mM莫纳甜和1mg/ml转氨酶。阴性对照不含转氨酶。30℃、100rpm振荡培育该样品2小时。过滤样品，进行LC/MS/MS分析以确定谷氨酸水平(如实施例18所述)。谷氨酸水平应该与MP产量化学计量相关。阴性对照含有一些背景水平的谷氨酸，它们来自醛缩酶细胞提取物和天然大肠杆菌转氨酶。R，R用作反应底物时，与阴性对照相比唯一产生显著谷氨酸的是D-转氨酶(AT-03)，检测到约为1.1μg/ml。AT-101和AT-104产生的谷氨酸略多于阴性对照。D-转氨酶对S，S-莫纳甜的活性检测不到。正如所料，转氨酶对含有氨基部分的手性碳有对映异构选择性。所有L-转氨酶都对S，S-莫纳甜有活性。AT-101产生75μg/ml谷氨酸，AT-102产生102μg/ml谷氨酸，AT-104产生64μg/ml谷氨酸。

30℃培育1、2、3和19小时时，采用25mM R，R-莫纳甜、100mM磷酸钾(pH7.5)、0.08mM PLP、50mM α-酮戊二酸和4mg/mL AT-103酶的相似反应产生0.145、0.268、0.391和0.593mM谷氨酸(用实施例18所述的LC-柱后荧光法测定)。与Tris-Cl缓冲液相比，似乎磷酸盐缓冲液中的D-转氨酶活性较高。在采用1mg/mL AspC和S，S-莫纳甜作底物的平行实验中，培育期间形成0.11-0.18mM谷氨酸。在4小时反应中，将AspC浓度提高到2mg/ml能将谷氨酸浓度提高到1.2mM。

实施例16

从色氨酸和除丙酮酸外的C3来源生成莫纳甜

如上面实施例9所述，吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能转化成莫纳甜，使用丙酮酸作为C3分子。然而，在一些情况中，丙酮酸可能不是理想的原料。例如，丙酮酸可能比其它C3碳源更昂贵，或如果加入培养基对发酵有不利影响。丙氨酸可通过许多PLP-酶转氨以产生丙酮酸。

色氨酸酶样酶进行β-消除反应的速度快于其它PLP酶如转氨酶。来自此类别(4.1.99.-)的酶能从氨基酸如L-丝氨酸、L-半胱氨酸、具有良好离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物例如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸产生氨和丙酮酸。

可根据Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)的方法通过β-酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶突变，改进用EC 4.1.99.-多肽生成莫纳甜的方法。Mouratou等描述将β-酪氨酸酶转化成二羧氨基酸β-裂合酶的能力，此裂合酶没有报导在自然界中产生。通过使缬氨酸(V)283转化成精氨酸(R)和精氨酸(R)100变成苏氨酸(T)来完成特异性变化。这些氨基酸变化使裂合酶接受二羧氨基酸用于水解脱氨反应(如天冬氨酸)。因此，天冬氨酸也能用作丙氨酸的来源用于随后的醛醇缩合反应。

另外，能提供乳酸和将乳酸转化成丙酮酸的酶的细胞或酶反应器。能催化此反应的酶的例子包括乳酸脱氢酶和乳酸氧化酶。

分离基因组DNA

以前例如，Mouratou等(JBC 274：1320-5，1999)报道了色氨酸酶多肽。为分离编码色氨酸酶多肽的基因，将来自大肠杆菌DH10B的基因组DNA用作PCR模板，如实施例1所述。

酪氨酸-酚裂合酶基因分离自弗氏柠檬酸杆菌(ATCC目录号8090，指定ATCC13316；NCTC 9750)，在营养琼脂(Difco 0001)和营养肉汤(Difco 0003)中37℃下培养到OD为2.0。用Qiagen Genomic-tip^TM100/G试剂盒纯化基因组DNA。

PCR扩增编码序列

为pET 30Xa/LIC载体(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)设计具有相容性突出端的引物，如实施例1所述。

大肠杆菌tna(SEQ ID NO：41)。用于pET30Xa/LIC克隆的N-末端引物：5’-GGTATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3’(SEQ ID NO：43)。用于pET30Xa/LIC克隆的C-末端引物：5’-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACT TCTTTA AGT TTT G-3’(SEQ ID NO：44)。

弗氏柠檬酸杆菌tpl(SEQ ID NO：42)。用于pET30 Xa/LIC克隆的N-末端引物：5’-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3’(SEQ ID NO：45)。用于pET30 Xa/LIC克隆的C-末端引物：5’-AGA GGA GAG TTA GAGCCTTAGATGTAATCAAAGCGTG-3’(SEQ ID NO：46)。

所有PCR反应都使用Eppendorf Mastercycler^TM梯度5331热循环仪。在50μL中加入0.5μg模板(基因组DNA)，1.0μM各引物，0.4mM各dNTP，3.5U Expand HighFidelity聚合酶(Roche)，含有Mg的1X Expand缓冲液和5％ DMSO(终浓度)。所用的热循环仪PCR程序如下：96℃热启动(5分钟)，94℃-30秒，40-60℃-1分钟45秒，72℃-2分钟15秒；30个循环。最后聚合步骤为7分钟，然后将样品储存于4℃。

克隆

将上面实施例1中详述的克隆和阳性克隆鉴定程序用于鉴定合适的克隆。

基因表达和活性测定

将质粒DNA(通过序列分析确证)亚克隆入表达宿主BL21(DE3)(诺华基公司)中。在含有30mg/L卡那霉素的LB培养基中培养构建物，用凯杰小量制备试剂盒分离质粒，用限制性消化来分析以确认相同性。

用BL21(DE3)表达宿主进行诱导实验，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃下培养构建物。当培养物的OD₆₀₀达到约0.6后用0.1mM IPTG诱导蛋白表达。在30℃下培养细胞4小时，离心收获细胞。然后在5mL/g湿细胞重的BugBuster^TM(诺华基公司)试剂中裂解细胞，该试剂中含有5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物组#III(开尔生化公司)和1μL/mL Benzonase核酸酶(诺华基公司)，用His-结合柱体纯化His-标记的重组蛋白，如实施例1所述。纯化蛋白在PD-10(G25 Sephadex，安玛西亚生物科学公司)柱上脱盐，用100mM Tris-Cl缓冲液，pH8.0洗脱。在4-15％梯度凝胶上用SDS-PAGE分析蛋白，以检测在重组融合蛋白的预计分子量处的可溶性蛋白质水平。

诱变

多肽类4.1.99.-(色氨酸酶和β-酪氨酸酶)的一些成员将与天冬氨酸或类似氨基酸进行β-裂合酶反应，没有任何修改。然而，该类的一些成员可能需要被诱变才能使用这些底物和/或生成产物。而且，在一些情况下，通过诱变进一步优化可进行转化的多肽。

根据PLP-结合多肽的3D结构分析进行定位诱变。下面介绍改变多肽的底物特异性的两个例子。

色氨酸酶的诱变：实施例16A

以下提供的诱变方法将两个点突变引入氨基酸序列中。第一个点突变将103位上的精氨酸(R)改变成苏氨酸(T)，第二个点突变将299位上的缬氨酸(V)改变成精氨酸(R)(大肠杆菌成熟蛋白的编号系统)。由ATG实验室(明尼苏达州伊甸草原(EdenPrairie，MN))进行诱变实验。通过基因片段的PCR以及用PCR完成片段组装连续地引入突变。

用于将精氨酸(R)103转化为苏氨酸(T)的引物：

5’-CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3’(SEQ ID NO：47)和

5’-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3’(SEQ ID NO：48)。

用于将缬氨酸(V)299转化为精氨酸(R)的引物：

5’-TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3’(SEQ ID NO：49)和

5’-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3’(SEQ ID NO：50)。

用Xba I/HindIII和SphI进行限制性消化来筛选突变体，用测序确认。

酪氨酸酚裂合酶(β-酪氨酸酶)的诱变：实施例16B

在酪氨酸酚裂合酶氨基酸序列上产生两个点突变。这些突变将100位上的精氨酸(R)转变成苏氨酸(T)，将283位上的缬氨酸(V)转变成精氨酸(R)(在弗氏柠檬酸杆菌成熟蛋白质序列中)。

用于R100T转化的引物：

5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’(SEQ ID NO：51)和

5’-TCTGCGCCGGTCCCCTGGTGAGTCGGAACAAT-3’(SEQ ID NO：52)。

用于V283R转化的引物：

5’-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3’(SEQ ID NO：53)和

5’-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3’(SEQ ID NO：54)。

采用上述方法以及用KpnI/SacI消化和BstXI消化筛选克隆。用双脱氧链终止测序来确证序列。如上所述产生野生型酶的重组蛋白。

反应混合物包含50mM Tris-Cl pH 8.3、2mM MgCl₂、200mM C3碳源、5mM α-酮戊二酸、钠盐、0.05mM吡哆醛磷酸盐、脱气水，使得加入酶后最终体积为0.5mL、3mM磷酸钾pH7.5、25μg、如实施例2所制备的25μg粗重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶、如实施例1所制备的500μg粗L-天冬氨酸转氨酶(AspC)和浓度>60mM的固体色氨酸(饱和；一些色氨酸在整个反应中不溶解)。在30℃下边混合边孵育该反应混合物30分钟。丝氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作为3-碳源提供。用和不用能够进行β-消除和β-裂合酶反应的二级PLP酶(纯化)(色氨酸酶(TNA)、双突变色氨酸酶、β-酪氨酸酶(TPL))来进行测定。反应混合物的LC/MS分析结果见表12：

表12

利用替代C3-碳源生成莫纳甜

 

C3-碳源	其它PLP酶	相对活性
			无	无	0％
丙酮酸	无	100％
			丝氨酸	无	3％
丝氨酸	11μg野生型TNA(1U)	5.1％
			丝氨酸	80μg双突变TNA	4.6％
丙氨酸	无	32％
			丙氨酸	11μg野生型TNA	41.7％
丙氨酸	80μg突变TNA	43.9％
			天冬氨酸	110μg野生型TNA(10U)	7.7％
天冬氨酸	5U野生型TPL(粗)	5.1％
			天冬氨酸	80μg突变TNA	3.3％

从作为3-碳源的丙氨酸和丝氨酸产生的莫纳甜通过LC/MS/MS子扫描分析确认，与实施例9中产生的莫纳甜特征相同。丙氨酸是测试的最佳选择之一，通过AspC酶转氨。产生的莫纳甜量通过加入色氨酸酶而增加，色氨酸酶具有转氨二级活性。通过加入色氨酸酶，用丝氨酸作为碳源产生的莫纳甜量几乎加倍，即使与转氨酶相比仅加入五分之一的色氨酸酶量。AspC能有一些单独的β-消除活性的量。天冬氨酸的结果表明色氨酸酶对天冬氨酸的活性不随着定点诱变增加，定点诱变与前面β-酪氨酸酶提示的相同。预计突变β-酪氨酸酶产生莫纳甜的活性较高。

实施例17

莫纳甜的化学合成

将丙氨酸加入吲哚-3-丙酮酸产生莫纳甜，用格氏试剂或有机锂试剂进行此合成反应。

例如，在无水条件下将镁加入羧基和氨基端适当封端的3-氯-或3-溴-丙氨酸中。然后加入吲哚-3-丙酮酸(适当封端)，形成偶联产物，然后去除保护基形成莫纳甜。可以使用的具体保护基包括容易连接和去除的THP(四氢吡喃基醚)。

实施例18

检测莫纳甜、MP、色氨酸和谷氨酸

该实施例描述了用于检测莫纳甜或其前体2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸，以及色氨酸和谷氨酸的存在的方法。也描述了用于分离和检测莫纳甜的四种立体异构体的方法。

莫纳甜、MP和色氨酸的LC/MS分析

用Waters/Micromass液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)仪器进行来源于体外或体内生化反应的莫纳甜、MP和/或色氨酸的混合物分析，该仪器包括Waters 2795液相色谱，装有Waters 996光电二极管阵列(PDA)吸光度监控器，串联置于色谱与Micromass Quattro Ultima三重四极质谱仪间。用Xterra MS C₈反相色谱柱(2.1mm×250mm)或Supelco Discovery C₁₈反相色谱柱(2.1mm×150mm)在室温或40℃下进行LC分离。LC流动相包括A)含0.05％(v/v)三氟乙酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟乙酸的甲醇。

梯度洗脱是：从5％B到35％B线性，0-4分钟，从35％B到60％B线性，4-6.5分钟，从60％B到90％B线性，6.5-7分钟，在90％B等度，7-11分钟，从90％B到95％B线性，11-12分钟，从90％B到5％B线性，12-13分钟，运行间有5分钟再平衡阶段。流速是0.25mL/分钟，从200nm到400nm监控PDA吸光度。所有ESI-MS参数是基于产生感兴趣分析物的质子化分子离子([M+H]⁺)、生成特征性片段离子基础上优化和选择的。

下列仪器参数用于莫纳甜的LC/MS分析：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；六角形(Hex)1：20V；孔径：0V；六角形(Hex)2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：15.0；高质量分辨率(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：50V；碰撞能量：2；出口：50V；低质量分辨率(Q2)：15；高质量分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。报导的质量/电荷比(m/z)和分子量的不确定性为±0.01％。混合物中莫纳甜的α-酮酸形式(MP)和莫纳甜的初始检测用LC/MS监控完成，收集m/z 150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于MP的[M+H]⁺＝292，用于莫纳甜的[M+H]⁺＝293，用于色氨酸的[M+H]⁺＝205)可直接鉴定混合物中的这些分析物。检测莫纳甜和MP的后续方法采用多反应监测(MRM)的LC/MS/MS方法(见下文)。

莫纳甜的LC/MS/MS分析

对莫纳甜进行LC/MS/MS子离子实验如下。子离子分析包括将感兴趣的母离子(如对于莫纳甜，m/z＝293)从第1个质量分析器(Q1)传送到质谱仪的碰撞细胞，其中导入氩并使母离子化学解离成片段(子)离子。然后用第2个质量分析器(Q2)检测这些片段离子，它们可用于确证母离子的结构分配。

下列仪器参数用于LC/MS/MS分析莫纳甜：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；六角形1：20V；孔径：0V；六角形2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：15.0；高质量分辨率(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：14；出口：1V；低质量分辨率(Q2)：15；高质量分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。

LC/MS/MS多反应监测

为提高莫纳甜检测的灵敏度和选择性，开发了采用MRM测量的LC/MS/MS法。如前章节所述进行LC分离。如前章节所述设定ESI-MS/MS的仪器参数，除了将Q1和Q2的低质量分辨率和高质量分辨率设定为12.0，以使灵敏度最大化。用5种莫纳甜特异性母-子跃迁在体外和体内反应中特异性检测莫纳甜。所述跃迁是293.1至158.3、293.1至168.2、293.1至211.2、293.1至230.2和293.1至257.2。

高通量测定莫纳甜、色氨酸和谷氨酸

用上述仪器高通量分析(<5分钟/样品)来源于体外和体内反应的莫纳甜、色氨酸和/或谷氨酸的混合物，MS参数与LC/MS/MS多反应监测所述相同。LC分离用4.6mm×50mm的Advanced Separation Technologies Chirobiotic T柱在室温进行。LC流动相包括A)含0.25％乙酸的水；B)含0.25％乙酸的甲醇。用50％B等度洗脱0-5分钟。流速为0.6毫升/分钟。优化ESI-MS/MS系统的所有参数，并根据色氨酸和莫纳甜和内标²H₅-色氨酸或²H₃-谷氨酸的质子化分子离子的最佳来源产生、以及多反应监测(MRM)实验中碰撞诱导产生的分析物特异性片段离子进行选择(色氨酸：204.7至146.4，²H₅-色氨酸：209.7至151.4，谷氨酸：147.6至102.4，²H₃-谷氨酸：150.6至105.4，前一节中列出莫纳甜-特异性跃迁)。

莫纳甜的精确质量测量

使用应用生物系统公司-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪进行高分辨MS分子。使用色氨酸作为内部质量校准标准，测量质子化莫纳甜的质量。在C₁₄H₁₇N₂O₅元素组成的基础上，质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。用实施例3描述的生物催化法产生的莫纳甜显示的测量质量为293.1144。此质量测量误差小于百万分之二(2ppm)，提供酶法生成莫纳甜的元素组成的确证。

莫纳甜的手性LC/MS/MS(MRM)测定

用1-氟-2-4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺(FDAA)的衍生作用，然后是反相LC/MS/MS MRM测定完成测定体外和体内反应中莫纳甜的立体异构体分布。

用FDAA衍生莫纳甜

将200μL 1％FDAA的丙酮溶液加入50μL样品或标准品。加入40μL 1.0M碳酸氢钠，在40℃不时混合孵育该混合物1小时。取出样品，冷却，用20μL 2.0M HCl中和(可能需要更多HCl来有效中和缓冲的生物混合物)。完成脱气后，样品随时用于LC/MS/MS分析。

LC/MS/MS多反应监测用于测定体外和体内反应中莫纳甜的立体异构体分布。

用前一节所述的LC/MS/MS仪器进行分析。在Phenomenex Luna(5μm)C18反相层析柱上40℃下进行能够分离莫纳甜的所有四种立体异构体(尤其是FDAA-莫纳甜)的LC分离。LC流动相包括A)含0.05％(质量/体积)乙酸铵的水和B)乙腈。梯度洗脱是从2％B到34％B线性，0-33分钟，从34％B到90％B线性，33-34分钟，在90％B等度，34-44分钟，从90％B到2％B线性，44-46分钟，运行间有16分钟再平衡阶段。流速是0.25mL/分钟，从200nm到400nm监控PDA吸光度。优化ESI-MS的所有参数并基于产生FDAA-莫纳甜的质子化分子离子([M+H]⁺)、生成特征性片段离子进行选择。

下列仪器参数用于在阴离子ESI/MS模式中对莫纳甜进行LC/MS分析：毛细管：2.0kV；圆锥：25V；六角形1：10V；孔径：0V；六角形2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：12.0；高质量分辨率(Q1)：12.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：20；出口：1V；低质量分辨率(Q2)：12；高质量分辨率(Q2)：12；离子能量(Q2)：3.0；倍增器：650。用3种FDAA-莫纳甜特异性母-子跃迁在体外和体内反应中特异性检测FDAA-莫纳甜。所述跃迁是543.6至268.2、543.6至499.2和543.6至525.2。FDAA-莫纳甜立体异构体的鉴定是基于与纯化莫纳甜立体异构体相比的层析保留时间和质谱数据。

液相色谱-包括谷氨酸的氨基酸的后柱荧光检测

在Waters 2690 LC系统或装有Waters 474扫描荧光检测器的等效仪器，和Waters后柱反应模块上进行具有后柱荧光检测的液相色谱，以确定体外和体内反应中的谷氨酸。在装载有Interaction-Sodium的离子交换柱上60℃下进行LC分离。流动相A是Pickering Na 328缓冲液(皮克林制药公司(Pickering Laboratories，Inc.)；加利福尼亚州芒廷维尤(Mountain View，CA))。流动相B是Pickering Na 740缓冲液。梯度洗脱是从0％B至100％B，0-20分钟，在100％B等度，20-30分钟，在100％B至0％B线性，30-31分钟，运行间有20分钟再平衡阶段。流动相的流速是0.5mL/分钟。OPA支柱衍生溶液的流速是0.5mL/分钟。荧光检测器设置为EX338nm和Em 425nm。将正亮氨酸用作该分析的内标。氨基酸的鉴定基于纯化标准品的层析保留时间数据。

实施例19

在细菌中产生莫纳甜

该实施例描述的方法用于在大肠杆菌细胞中产生莫纳甜。本领域技术人员理解类似方法可用于在其它细菌细胞中产生莫纳甜。此外，可使用含莫纳甜合成途径中其它基因(图2)的载体。

极限培养基Trp-1+葡萄糖培养基用于增加大肠杆菌细胞中的色氨酸产量(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-4，1990)，此培养基制备如下。在700mL纳米纯水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄、13.6g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.01g CaCl₂·2H₂O和0.5mg FeSO₄·7H₂O。pH调至7.0，体积增加到850mL，培养基高压灭菌。单独制备50％葡萄糖溶液并无菌过滤。在基础培养基(850mL)中加入40ml，终体积1L。

在0.1M磷酸钠pH7中制备10g/L L-色氨酸溶液并无菌过滤。通常加入十分之一体积到下面特定的培养物中。还制备了10％丙酮酸钠溶液并无菌过滤。每升培养物通常使用10mL等分试样。制备氨苄青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)贮存液，无菌过滤，使用前-20℃贮存。吐温20(聚氧乙烯20-山梨聚糖单月桂酸酯)以0.2％(体积/体积)终浓度使用。氨苄青霉素以非致死浓度使用，通常为1-10μg/mL终浓度。

在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上制备大肠杆菌BL21(DE3)::睾丸酮丛毛单胞菌proA/pET30 Xa/LIC细胞(如实施例7所述)的新鲜平板。接种来自单菌落的过夜培养物(5mL)，在含卡那霉素的LB培养基中30℃下培养。一般将1-50个接种物用于trp-1+葡萄糖培养基中进行诱导。加入新鲜抗生素，使其终浓度为50mg/L。37℃培育摇瓶，然后进行诱导。

细胞每小时取样，直到OD₆₀₀为0.35-0.8。随后用0.1mM IPTG诱导细胞，温度降到34℃。诱导前(0时间点)收集样品(1ml)并5000 x g离心。上清在-20℃冷冻用于LC-MS分析。诱导后4小时，收集另外的1mL样品，离心以从细胞沉淀中分离培养液。如上所述加入色氨酸、丙酮酸钠、氨苄青霉素和吐温。

诱导后细胞生长48小时，另取1mL样品且如上制备。在48小时，加入另一等分的色氨酸和丙酮酸。生长约70小时后(诱导后)，3500rpm 4℃离心整个培养物体积20分钟。轻轻倒出上清，培养液和细胞都在-80℃冷冻。过滤培养液部分并通过LC/MS分析。如实施例18所述监控[M+H]⁺＝293峰的高度和面积。减去培养基的背景水平。数据也对于细胞生长标准化，这是通过绘出[M+H]⁺＝293峰的高度图，将峰高除以培养物在600nm处的光密度。

当丙酮酸、氨苄青霉素和吐温在诱导后4小时而不是诱导时加入时，产生较高水平的莫纳甜。其它添加物如PLP、另外的磷酸盐或MgCl₂不增加莫纳甜产量。当使用色氨酸而不是吲哚-3-丙酮酸时且当色氨酸在诱导后而不是接种或诱导时加入时，获得较高效价的莫纳甜。诱导前和诱导后4小时(底物加入时)，发酵液或细胞提取物中通常没有可检测水平的莫纳甜。阴性对照仅用有pET30a载体的细胞以及培养物进行，培养物中不加入色氨酸和丙酮酸。母体MS扫描证明具有(m+1)/z＝293的化合物不来源于较大分子，子扫描(如实施例18所述)类似于体外产生的莫纳甜。

利用0、0.2％(体积/体积)和0.6％终浓度的吐温-20研究吐温的作用。0.2％吐温摇瓶产生莫纳甜的产量最高。氨苄青霉素浓度在0-10μg/mL之间变化。细胞肉汤中的莫纳甜量在0-1μg/mL之间迅速增加(2.5倍)，当氨苄青霉素浓度从1增加到10μg/mL时增加1.3倍。

显示典型结果的时程实验示于图10。甚至当值对于细胞生长标准化时，分泌到细胞培养液的莫纳甜量增加。通过使用色氨酸的摩尔消光系数，培养液中的莫纳甜量估计小于10μg/mL。用不含pro A插入的载体的细胞重复相同实验。许多数字为负，表明这些培养物中m/z＝293的峰高度小于单独培养基中的峰高度(图10)。当色氨酸和丙酮酸缺乏时，数字一致较低，证明莫纳甜生成是醛缩酶催化酶反应的结果。

在800mL摇瓶实验和发酵罐中重复细菌细胞中的莫纳甜体内生成。通过阴离子交换层析和制备型反相液相色谱纯化250mL莫纳甜样品(在无细胞的培养液中)。蒸发此样品，交付高分辨质量分析(如实施例9所述)。高分辨MS表明生成的代谢物是莫纳甜。

体外试验表明，转氨酶需要以高于醛缩酶的水平存在(参见实施例9)，因此大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶与醛缩酶基因一起过度表达，以提高莫纳甜的产量。设计如下引物以用aspC/pET30 Xa/LIC将睾丸酮丛毛单胞菌proA引入操纵子，引物如下：5′引物：ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ IDNO：67)和3′引物：CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQ ID NO：68)。5′引物含有BamHI位点，3′引物含有用于克隆的SalI位点。如实施例7所述进行PCR，并进行凝胶纯化。用BamHI和SalI消化aspC/pET30Xa/LIC构建物，同样也对PCR产物进行相同操作。用Qiagen离心柱纯化消化产物。用罗氏快速DNA连接试剂盒(印第安纳州印第安纳波利斯)按照生产商说明书将proA PCR产物连接于载体。如实施例1所述用Novablues Singles(诺华基公司)进行化学转化。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养菌落，用凯杰离心小量制备试剂盒纯化质粒DNA。用限制性消化分析筛选克隆，由得克萨斯州休斯敦(Houston，TX)的序列建造者公司验证序列。将构建物亚克隆到BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(诺华基公司)中。也将proA/pET30 Xa/LIC构建物转化到BL21(DE3)pLysS中。

起初在上述标准条件下比较BLR(DE3)摇瓶样品证明，加入第二种基因(aspC)能使莫纳甜产量提高7倍。为了加速生长，采用BL21(DE3)-衍生宿主菌株。用上述Trp-1培养基诱导proA克隆和两种基因操纵子克隆，pLysS宿主的培养基中也加入了氯霉素(34mg/L)。在加入和不加0.2％吐温-20和1mg/L氨苄青霉素的情况下进行摇瓶实验。用体外产生的纯化莫纳甜作为标准品计算肉汤中的莫纳甜含量。如实施例18所述进行SRM分析。在生长0小时、4小时、24小时、48小时、72小时和96小时时对细胞采样。

结果见表13，显示培养肉汤中生成的最大量。在大多数情况下，；两种基因构建物比仅proA构建物得到的数值更高。细胞包膜更易渗漏的pLysS菌株分泌的莫纳甜水平较高，但是这些菌株的生长速率一般较慢。加入吐温和氨苄青霉素是有利的。

表13

大肠杆菌的莫纳甜产量

 

构建物	宿主	吐温+Amp	g/mL莫纳甜	时间
					proA	BL21(DE3)	-	0.41	72小时
proA	BL21(DE3)	+	1.58	48小时
					proA	BL21(DE3)pLysS	-	1.04	48小时
proA	BL21(DE3)pLysS	+	1.60	48小时
					aspC：proA	BL21(DE3)	-	0.09	48小时
aspC：proA	BL21(DE3)	+	0.58	48小时
					aspC：proA	BL21(DE3)pLysS	-	1.39	48小时
aspC：proA	BL21(DE3)pLysS	+	6.68	48小时

实施例20

在酵母中产生莫纳甜

该实施例描述用于在真核细胞中生成莫纳甜的方法。本领域技术人员理解类似方法可用于在任何感兴趣细胞中生成莫纳甜。此外，除了该实施例所述的那些基因，还可另外使用其它基因(例如图2所列)。

pESC酵母抗原表位标记载体系统(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)用于将大肠杆菌aspC和睾丸酮丛毛单胞菌proA基因克隆和表达入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中。pESC载体含有相反链上的GAL1和GAL10启动子，有2个不同多克隆位点，可同时表达2个基因。pESC-His载体也含有His3基因用于宿主(YPH500)中组氨酸营养缺陷型的互补。GAL1和GAL10启动子受葡萄糖阻抑且由半乳糖诱导；用Kozak序列在酵母中实现最佳表达。pESC载体是穿梭载体，能在大肠杆菌中产生初始构建物(具有bla基因用于选择)；然而，多克隆位点中没有细菌核糖体结合部位。

设计下列引物用于克隆入pESC-His(限制性位点加下划线，Kozak序列粗体显示)：aspC(BamHI/SalI)，GAL1：

5’-CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3’(SEQ ID NO：69)和

5’-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ ID NO：70)。

proA(EcoRI/NotI)，GAL10：

5’-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO：71)和

5’-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’(SEQ ID NO：72)。

由于引入Kozak序列，两种成熟蛋白的第二个密码子由芳族氨基酸改变为缬氨酸。用来自实施例1和实施例7所述的克隆的pET30 Xa/LIC小量制备DNA作模板，扩增感兴趣的基因。用Eppendorf Master循环梯度热循环器和以下方案在50μL反应中进行PCR：1.0μL模板、1.0μM各引物，0.4mM各dNTP，3.5 U Expand高保真聚合酶(罗氏，印第安纳州印第安纳波利斯)和含有Mg的1X Expand^TM缓冲液。所用热循环程序由以下步骤组成：94℃热启动5分钟，接着是29个下述步骤的循环：94℃30秒，50℃1分钟45秒，72℃2分钟15秒。29个循环后，将样品维持在72℃ 10分钟，然后储存于4℃。通过以下方法纯化PCR产物：在1％TAE-琼脂糖凝胶上分离，然后用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加州巴伦西亚)回收。

用BamHI/SalI消化pESC-His载体DNA(2.7μg)，如上所述进行凝胶纯化。用BamHI/SalI消化aspC PCR产物，用QIAquick PCR纯化柱纯化。用罗氏(Roche)快速DNA连接试剂盒按照生产商方案进行连接。采用装有脉冲控制器的伯乐公司(Bio-Rad)基因脉冲器II在0.2cm伯乐一次性试管中按照生产商方案将脱盐的连接物电穿孔到40μl Electromax DH10B感受态细胞(英杰公司)中。在1mL SOC培养基中恢复1小时后，将转化子接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。用QIAprep离心小量制备试剂盒制备用于克隆的质粒DNA制剂。用限制性消化筛选质粒DNA，采用为该载体设计的引物进行测序(序列建造者公司)以验证。

用EcoRI和NotI消化aspC/pESC-His克隆，对proA PCR产物进行相同操作。如上所述纯化DNA，如上所述进行连接。将这两种基因构建物转化到DH10B细胞中，用限制性消化筛选，进行DNA测序。

用S.c.EasyComp^TM转化试剂盒(英杰公司)将该构建物转化到酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株YPH500中。将转化反应接种于含有2％葡萄糖的SC-His极限培养基(英杰pYES2手册)。采用上述PCR引物通过菌落PCR筛选单个酵母菌落中是否存在proA和aspC基因。将沉淀细胞(2μl)悬浮于含有1μl消解酶的20μLY-裂解缓冲液(载膜研发公司(Zymo Research))中，37℃加热10分钟。然后，将4μL此悬液用于50μLPCR反应体系中，该PCR反应采用上述PCR反应混合物和程序。

将5mL培养物于SC-His+葡萄糖上30℃、225rpm培养过夜。逐渐将细胞调整到在棉子糖上生长，目的是在用半乳糖诱导之前最大程度缩短停滞期。生长约12小时后，测定600nm处的吸光度，离心得到合适体积的细胞，用新鲜SC-His培养基重悬使OD为0.4。依次使用以下碳源：1％棉子糖+1％葡萄糖、0.5％葡萄糖+1.5％棉子糖、2％棉子糖，最后加入1％棉子糖+2％半乳糖进行诱导。

在诱导培养基中生长约16小时后，将50mL培养物分成两份25mL培养物，将以下物质加入其中一份培养物中：(终浓度)1g/L L-色氨酸、5mM磷酸钠pH7.1、1g/L丙酮酸钠、1mM MgCl₂。来自非诱导培养基和加入莫纳甜途径底物之前的16小时培养物的肉汤和细胞沉淀样品保存作阴性对照。此外，仅含功能性aspC基因(和截短的proA基因)的构建物用作另一阴性对照。诱导后，使细胞生长共计69小时。偶然地，以较低OD诱导酵母细胞，并且在加入色氨酸和丙酮酸之前仅培养4小时。然而，这些莫纳甜底物似乎能抑制生长，在较高OD时添加更有效。

按照生产商方案每克细胞(湿重)用5mL YeastBuster^TM+50μl THP(诺华基公司)裂解来自培养物的细胞沉淀，其中加入上一实施例所述的蛋白酶抑制剂和Benzonase核酸酶。过滤培养物肉汤和细胞提取物，然后如实施例18所述用SRM进行分析。采用这种方法，在肉汤样品中检测不到莫纳甜，这表明细胞在这些条件下无法分泌莫纳甜。在这些条件下质子原动力可能不足，或者普通的氨基酸转运蛋白已被色氨酸所饱和。蛋白质表达水平改变无法用SDS-PAGE检测到。

将色氨酸和丙酮酸加入培养基时，在含有两种功能基因的培养物的细胞提取物中可以瞬时检测到莫纳甜(约60ng/mL)。在阴性对照细胞提取物中无法检测到莫纳甜。使用实施例3所述的优化实验用含有4.4mg/mL总蛋白(约为通常用于大肠杆菌细胞提取物的两倍)的细胞提取物进行2次莫纳甜的体外测定。加入32μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶或400μg/mL AspC转氨酶进行其它测定，以确定哪个酶在酵母细胞提取物中是限制性的。不加入酶或仅加入AspC转氨酶(无酶时发生低水平的醛醇缩合)进行阴性对照。用部分纯化的酶(30-40％)进行阳性对照，使用16μg/mL醛缩酶和400μg/mL转氨酶。

用SRM分析体外结果。细胞提取物的分析显示出，在诱导后将色氨酸加入培养基时，可将色氨酸有效地转运到细胞内，导致其色氨酸水平比未加入色氨酸时高两个数量级。体外莫纳甜分析结果见表14(数值表示ng/mL)。

表14

用酵母细胞提取物产生莫纳甜

 

	aspC构建物	+醛缩酶	+AspC	双基因构建物	+醛缩酶	+AspC
							阻抑(葡萄糖培养基)	0	888.3	173.5	0	465.2	829
诱导24小时	0	2832.8	642.4	0	1375.6	9146.6
							诱导69小时	0	4937.3	340.3	71.9	1652.8	23693.5
诱导69小时+底物	0	556.9	659.1	21.9	755.6	16688.2
							阳性对照(纯化酶)	21853			21853
阴性对照(无酶)	0		254.3	0		254.3

生长培养基中加入或不加底物时，用全长双基因构建物细胞提取物获得阳性结果。这些结果与阳性对照相比，表明酶表达水平接近酵母中1％的总蛋白。当aspC构建物(具有截短的proA)的细胞提取物用醛缩酶测定时，产生的莫纳甜量显著大于单独细胞提取物测定，这表明重组AspC转氨酶包含约1-2％酵母总蛋白。由于细胞中存在天然转氨酶，用醛缩酶测定时未诱导培养物的细胞提取物有小量活性。用AspC转氨酶测定时，来自未诱导细胞的提取物活性增加到用AspC的阴性对照生成的莫纳甜量(大约200ng/ml)。相反，补充转氨酶时双基因构建物细胞提取物测定中观察到的活性增加大于加入醛缩酶时观察到的活性。由于2个基因都应以相同水平表达，表明当转氨酶水平高于醛缩酶水平时，产生的莫纳甜量最大，这与实施例9所示结果一致。

加入丙酮酸和色氨酸不仅抑制了细胞生长，而且也显著抑制了蛋白质表达。加入pESC-Trp质粒可用于校正YPH500宿主细胞的色氨酸营养缺陷型，以便在对生长、表达和分泌影响较小的情况下提供色氨酸。

实施例21

用偶联反应改进酶学方法

理论上，如果没有发生副反应或者底物或中间体的降解，由图1所示酶学反应形成的最大产物产量与各反应的平衡常数以及色氨酸和丙酮酸的浓度成正比。色氨酸不是高度可溶的底物，丙酮酸浓度大于200mM似乎对产率有负面影响(参见实施例9)。

理想地，莫纳甜浓度相对于底物最大化以降低分离成本。可进行物理分离，这样莫纳甜从反应混合物中取出，防止逆反应发生。原料和催化剂可随后再生。由于莫纳甜的大小、电荷和疏水性与一些试剂和中间体类似，物理分离困难，除非对莫纳甜的亲和性高(如亲和层析技术)。然而，莫纳甜反应可偶联其它反应，这样系统的平衡向莫纳甜生成移动。以下是改进莫纳甜产量的方法的例子，莫纳甜获得自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。

采用草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)的偶联反应

图11是生产莫纳甜的途径的说明，其中加入了草酰乙酸脱羧酶以去除MP转化成莫纳甜的过程中形成的副产物草酰乙酸。色氨酸氧化酶和过氧化氢酶用于在吲哚-3-丙酮酸生成的方向驱动反应。过氧化氢酶过量使用，因而过氧化氢不能在逆方向中起作用或者损害酶或中间体。氧在过氧化氢酶反应期间再生。另外，吲哚-3-丙酮酸可用作初始底物。

在这个途径中，天冬氨酸用作天冬氨酸转氨酶催化的反应中氨基化MP的氨基供体。理想地，采用与MP/莫纳甜反应相比，对色氨酸/吲哚-3-丙酮酸反应特异性较低的转氨酶，以使天冬氨酸无法用作氨基供体以再氨基化吲哚-3-丙酮酸。可加入草酰乙酸脱羧酶(来自假单胞菌)以将草酰乙酸转变为丙酮酸和二氧化碳。由于CO₂是挥发性物质，无法用它与酶反应，因此减少、甚至防止了副反应的发生。此步骤产生的丙酮酸也可用作醇醛缩合反应的底物，以形成MP。可采用其它脱羧酶；已知以下生物中存在同源物：伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、风产液菌(Aquifex aeolicus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、几种博德特菌(Bordetella)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、微温绿菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、磁球菌(Magnetocuccus)MC-1、溶血曼海米亚菌(Mannheimia haemolytica)、鞭毛甲基杆菌KT(Methylobacillus flagellatus KT)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella Multocida)Pm70、微热石袍菌(Petrotoga miotherma)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、几种假单胞菌、几种火球菌(Pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、几种沙门菌(Salmonella)、几种链球菌(Streptococcus)、微温热着色菌(Thermochromatium tepidum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)和几种弧菌(Vibrio)

用来自大肠杆菌的HIS₆-标记的天冬氨酸转氨酶(AspC)、来自大肠杆菌的HIS₆-标记的酪氨酸转氨酶(TyrB)、来自硕大利什曼原虫的HIS₆-标记的广泛底物转氨酶(BSAT)和实施例1所述的两种市售的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行色氨酸转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。比较用莫纳甜的活性(实施例15)相对用色氨酸的活性的比例，用于确定哪一个酶对莫纳甜转氨酶反应的特异性最高。这些结果表明莫纳甜反应相对于色氨酸反应特异性最高的酶是猪II-A型谷氨酸-草酰乙酸转氨酶GOAT(Sigma#G7005)。此特异性不取决于使用的氨基受体。因此，此酶用于具有草酰乙酸脱羧酶的偶联反应。

从吲哚-3-丙酮酸起始的典型反应包含(终浓度)：50mM Tris-Cl pH7.3、6mM吲哚-3-丙酮酸、6mM丙酮酸钠、6mM天冬氨酸、0.05mM PLP、3mM磷酸钾、3mM MgCl₂、25μg/mL转氨酶、50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和3单位/mL脱羧酶(西格马公司#O4878)。26℃培育该反应混合物1小时。在一些情况中，省略脱羧酶或用α-酮戊二酸取代天冬氨酸(作为阴性对照)。也测试上述取代GOAT的转氨酶以证实早期特异性实验。过滤样品并通过LC/MS分析，如实施例18所述。结果证明GOAT酶法生成最高量的莫纳甜每mg蛋白，而产生最少量的色氨酸作为副产物。此外，加入脱羧酶时，产物形成量增加了2-3倍。与其它转氨酶相比，大肠杆菌AspC酶也生成更多的莫纳甜。

通过以下方法提高莫纳甜产量：1)定期加入2mM吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和天冬氨酸(每半小时到1小时)，2)在厌氧环境中或用脱气缓冲液进行反应，3)允许反应进行数小时和4)使用没有多次冻融的新鲜制备的脱羧酶。丙酮酸浓度>12mM会抑制脱羧酶。吲哚-3-丙酮酸浓度高于4mM时，与吲哚-3-丙酮酸的副反应加速。如果也增加醛缩酶量，用于反应的吲哚-3-丙酮酸量可增加。高水平的磷酸盐(50mM)和天冬氨酸(50mM)能抑制脱羧酶反应。在1小时反应中，加入的脱羧酶量能减少到0.5U/mL，而莫纳甜产量没有降低。当温度从26℃提高到30℃和从30℃提高到37℃时，产生的莫纳甜量增加；然而，37℃时吲哚-3-丙酮酸的副反应也加速。生成的莫纳甜量随着pH从7增加到7.3而增大，且从pH7.3-7.8相对稳定。

从色氨酸起始的典型反应包含(终浓度)：50mM Tris-Cl pH7.3、20mM色氨酸、6mM天冬氨酸、6mM丙酮酸钠、0.05mM PLP、3mM磷酸钾、3mM MgCl₂、25μg/mL转氨酶、50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和4单位/mL脱羧酶、5-200mU/mLL-氨基酸氧化酶(西格马公司A-2805)、168U/mL过氧化氢酶(西格马公司C-3515)和0.008mg FAD。反应可在30℃进行30分钟。加入脱羧酶观察到改进。当使用50mU/mL氧化酶时，产生最大量的莫纳甜。改进类似于当吲哚-3-丙酮酸用作底物时观察到的。此外，当1)色氨酸水平低(即色氨酸浓度低于转氨酶的K_m，因此与MP相比对转氨酶活性位点的竞争力较低)和2)氧化酶与醛缩酶和转氨酶的比例维持在不能积聚吲哚-3-丙酮酸的水平时，产生的莫纳甜量增加。

无论从吲哚-3-丙酮酸还是色氨酸起始，当使用2-4倍的所有酶量且同时维持相同酶比例时，孵育时间为1-2小时的实验中产生的莫纳甜量增加。使用任一底物，都达到约1mg/mL莫纳甜浓度。如果从吲哚-3-丙酮酸起始，产生的色氨酸量通常低于20％的产物量，显示出使用偶联反应的益处。随着中间体浓度和副反应的进一步最优化和控制，产率和产量能大幅提高。

α-酮戊二酸可取代草酰乙酸，用作2-酮戊二酸脱羧酶(EC 4.1.1.71)的氨基接受体。在这种情况下，产生琥珀酸半醛和二氧化碳。预计这种反应方案也能防止副反应的发生，但没有以副产物的形式提供丙酮酸的好处。公开了编码此酶的许多基因序列。

采用赖氨酸ε转氨酶(EC 2.6.1.36)的偶联反应

在一些生物体中发现赖氨酸ε转氨酶(L-赖氨酸6-转氨酶)，包括红球菌、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(Streptomyces)、诺卡氏菌(Nocardia)、黄杆菌、产朊假丝酵母(Candida utilis)和链霉菌。生物体利用此酶作为生成一些β-内酰胺抗生素中的和一步骤(Rius和Demain，J.Microbiol.Biotech.，7：95-100，1997)。当α-酮戊二酸是氨基接受体时，此酶通过PLP-介导的赖氨酸的C-6转氨作用将赖氨酸转化成L-2-氨基己二酸6-半醛(ε-醛赖氨酸)。ε-醛赖氨酸不稳定且自发经历分子内脱水以形成环状分子1-哌啶6-羧酸盐。这有效抑制任何逆反应发生。图12描述反应流程。或者，也能使用赖氨酸-丙酮酸6-转氨酶(EC 2.6.1.71)。

1mL典型反应包含：50mM Tris-Cl pH7.3、20mM吲哚-3-丙酮酸、0.05mM PLP、6mM磷酸钾pH8、2-50mM丙酮酸钠、1.5mM MgCl₂、50mM赖氨酸、100μg转氨酶(赖氨酸ε转氨酶LAT-101，生物催化公司，加利福尼亚州帕萨迪纳)和200μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶。产生的莫纳甜量随着丙酮酸浓度增加而增加。用这些反应条件(50mM丙酮酸)的最大量比用草酰乙酸脱羧酶(约0.1mg/mL)的偶联反应观察到的低10倍。

在反应混合物的LC/MS分析中，[M+H]⁺＝293的峰在莫纳甜预期时间洗脱且质谱包含一些用其它酶方法观察到的相同片段。第2个有正确质量与电荷比(293)洗脱的峰稍早于实施例9中生成的S，S莫纳甜通常观察到的，这表明存在另一种莫纳甜异构体。此酶法生成的色氨酸很少。然而，此酶可能采用丙酮酸作底物(产生丙氨酸作为副产物)。同样，已知酶不稳定。可通过定向进化实验进行改进以增加稳定性，减少与丙酮酸的活性并提高与MP的活性。这些反应也能与上述L-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶偶联。

图12所示方法的类似方法利用鸟氨酸δ-转氨酶(EC 2.6.1.13)代替赖氨酸ε转氨酶，在这种情况下鸟氨酸用作氨基供体。α-酮产物、L-谷氨酸半醛自发地环化形成Δ1吡咯啉-S-羧酸。其它文献描述了采用这些类型酶的其它反应方案，用于生产非蛋白质性氨基酸制剂(T.Li，A.B.Kootstra，LG.Fotheringham，Organic Process Research &Development，6：533-538(2002))。这些方案需要加入对感兴趣氨基酸和谷氨酸活性较高的另一种转氨酶(如用于莫纳甜的HEXAspC)。

其它偶联反应

图13显示另一种能提高来自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸的莫纳甜产量的偶联反应。甲酸脱氢酶(EC 1.2.1.2或1.2.1.43)是普通酶。一些甲酸脱氢酶需要NADH而另一些能利用NADPH。在前述实施例中，谷氨酸脱氢酶能催化MP和莫纳甜间的相互转化，使用以铵为基础的缓冲液。甲酸铵和甲酸脱氢酶的存在是辅因子再生的有效系统，二氧化碳生成是降低逆反应速度的有效方法(Bommarius等，Biocatalysis 10：37，1994和Galkin等，Appl.Environ.Microbiol.63：4651-6，1997)。此外，大量甲酸铵能溶于反应缓冲液。加入甲酸脱氢酶和甲酸铵可改进谷氨酸脱氢酶反应(或类似的还原性氨基化)生成的莫纳甜产量。

实施例14和15中说明了能催化相似的还原性氨基化反应的合适酶。这些酶包括广泛特异性支链脱氢酶(EC 1.4.1.9)以及芳族氨基酸(苯丙氨酸)脱氢酶(EC1.4.1.20)。预计广泛特异性D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)也可用于催化此反应。

其它方法能用于驱动平衡趋向莫纳甜生成。例如，如果氨基丙烷用作ω-氨基酸转氨酶(EC 2.6.1.18)如美国专利5,360,724和5,300,437所述的转氨酶催化的反应中将MP转变为莫纳甜的氨基酸供体，得到的产物之一是丙酮，该产物的挥发性高于底物氨基丙烷的挥发性。可以周期性地短时间提高温度，以选择性挥发丙酮，从而减缓平衡。丙酮的沸点为47℃，如果采用较短时间该温度不大可能降解中间体。可利用α-酮戊二酸作为氨基接受体的大多数转氨酶也对MP有活性。相似地，如果采用乙醛酸/芳香酸转氨酶(EC 2.6.1.60)，以甘氨酸作氨基供体，那么会产生乙醛酸。该产物不稳定，沸点低于甘氨酸。

实施例22

重组表达

采用公众可得的酶cDNA和氨基酸序列以及本文所述的酶和序列如SEQ IDNO：11和12，以及它们的变体、多态形式、突变体、片段和融合物，能够用标准实验室技术表达和纯化任何蛋白，如酶。本领域技术人员能理解，可以在感兴趣的任何细胞或组织中重组生产酶和其片段，临用前纯化，例如在生产SEQ ID NO：12和其衍生物之前纯化。

本领域熟知生产重组蛋白的方法。因此，本发明的范围包括重组表达任何蛋白或其片段，如酶。参见例如Johnson等的美国专利5,342,764；Pausch等的美国专利5,846,819；Fleer等的美国专利5,876,969和Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，纽约冷泉港，1989，第17章)。

简要说，可将编码某种蛋白或肽的部分、全长或变体cDNA序列连接到表达载体，如细菌或真核表达载体中。可通过将启动子置于cDNA序列上游生产蛋白和/或肽。启动子的例子包括但不限于：lac，trp，tac，trc，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，fd外壳蛋白的控制区，SV40的早期和晚期启动子，衍生自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒和猴病毒的启动子，3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子，酵母α-交配因子的启动子和它们的组合。

适用于生产完整天然蛋白质的载体包括pKC30(Shimatake和Rosenberg，1981，Nature 292：128)、pKK177-3(Amann和Brosius，1985，Gene40：183)和pET-3(Studier和Moffatt，1986，J.Mol.Biol.189：113)。可将DNA序列转移到其它克隆载体如其它质粒、噬菌体、粘粒、动物病毒和酵母人工染色体(YAC)中(Burke等，1987，Science236：806-812)。可将这些载体引入各种宿主(包括体细胞)和简单或复杂生物体中，例如细菌、真菌(Timberlake和Marshall，1989，Science 244：1313-1317)、无脊椎动物、植物(Gasser和Fraley，1989，Science 244：1293)和哺乳动物(Pursel等，1989，Science244：1281-1288)，这些宿主通过引入异源cDNA获得了转基因。

为了在哺乳动物细胞中表达，可将cDNA序列连接于异源启动子，如猴病毒SV40、pSV2载体的启动子(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：2072-6)，并引入细胞如猴COS-1细胞(Gluzman，1981，Cell 23：115-82)中，实现瞬时或长期表达。可通过生化选择，如新霉素(Southern和Berg，1982，JMol.Appl.genet.1：321-41)和霉酚酸(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2012-6)维持哺乳动物细胞中稳定整合的嵌合基因构建物。

将DNA转移到真核细胞，如人或其它哺乳动物细胞中是常规技术。通过以下方法将载体作为纯DNA引入受体细胞中(转染)：(例如)磷酸钙沉淀(Graham和vanderEb，1973，Virology 52：466)、磷酸锶沉淀(Brash等，1987，Mol.Cell Biol.7：2013)、电穿孔(Neumann等，1982，EMBO J.1：841)、脂质转染法(Feigner等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：1413)、DEAE右旋糖苷(McCuthan等，1968，J.Natl.Cancer Inst.41：351)、显微注射(Mueller等，1978，Cell 15：519)、原生质体融合(Schafher，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2163-7)或粒丸枪(Klein等，1981，Nature 327：10)。或者，可通过病毒载体，例如逆转录病毒(Bernstein等，1985，Gen.Engrg.7：235)如腺病毒(Ahmad等，1986，J.Virol.57：267)或疱疹病毒(Spaete等，1982，Cell 30：295)的感染引入cDNA。

根据应用本发明原理的许多可能实施方式，应理解，所述实施方式只是本发明的具体例子，不应限制本发明的范围。但是，本发明范围与所附权利要求书一致。因此，本发明要求保护所附权利要求书的范围和构思内的所有内容。

序列表

Claims (35)

1.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括采用HEXAspC转氨酶(NCBI登录号：1AHF_A GI:1127190)以促进选自下组的至少一个反应：涉及色氨酸的反应、涉及2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的反应和它们的组合。

2.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括采用支链转氨酶(BCAT)(EC2.6.1.42)或支链脱氢酶(EC 1.4.1.9)以促进2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的反应。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述支链转氨酶(BCAT)(EC 2.6.1.42)是AT-102或AT-104。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述支链脱氢酶(EC 1.4.1.9)是AADH-110。

5.一种生产2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的方法，所述方法包括采用运动发酵单胞菌KHG醛缩酶以促进吲哚-3-丙酮酸的反应，其中，所述运动发酵单胞菌KHG醛缩酶是运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV89621.1 GI:56543467)或者包含与运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV89621.1 GI:56543467)至少约90％相同的氨基酸序列并且具有运动发酵单胞菌KHG醛缩酶活性的多肽。

6.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括采用KHG醛缩酶(EC 4.1.3.16)以促进吲哚-3-丙酮酸的反应，其中所述反应中产生的60％以上莫纳甜是莫纳甜的R，R立体异构体。

7.一种生产2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的方法，所述方法包括使反应混合物发生反应，所述混合物包含：

(a)色氨酸；

(b)第一种多肽，该多肽选自HEXAspC转氨酶(NCBI登录号：1AHF_AGI:1127190)、YfdZ(NCBI登录号AAC75438.1)或其组合，和

(c)第二种多肽，该多肽选自KHG醛缩酶(EC 4.1.3.16)、ProA醛缩酶(EC 4.1.3.17)或其组合。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述色氨酸包括D-色氨酸。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述KHG醛缩酶是运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV8621.1 GI:56543467)或包含与运动发酵单胞菌KHG醛缩酶(登录号：AAV89621.1 GI:56543467)至少90％相同的氨基酸序列并且具有运动发酵单胞菌KHG醛缩酶活性的多肽。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ProA醛缩酶选自睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶、苜蓿根瘤菌ProA醛缩酶或其组合。

11.一种生产莫纳甜的方法，所述方法包括使反应混合物发生反应，所述混合物包含：

(a)2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸；和

(b)一种多肽，该多肽选自YfdZ(NCBI登录号AAC75438.1)、HEXAspC转氨酶(NCBI登录号：1AHF_A GI:1127190)、支链转氨酶(BCAT)(EC 2.6.1.42)、支链脱氢酶(EC 1.4.1.9)或其组合。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述反应混合物还包含：

(c)吲哚-3-丙酮酸；和

(d)能够将吲哚-3-丙酮酸和C3碳源转变为2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸的第二种多肽。

13.如权利要求11所述的方法，所述混合物包含未纯化的细胞提取物，其含有YfdZ(NCBI登录号AAC75438.1)、HEXAspC转氨酶(NCBI登录号：1AHF_AGI:1127190)或其组合。

14.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括使反应混合物发生反应，所述混合物包含：

(a)2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸；和

(b)一种多肽，该多肽选自：AT-101、AT-102、AT-103、AT-104、AADH-102、AADH-110、AADH-112、AADH-113和它们的组合。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述所选多肽是AT-103。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法产生的65％以上莫纳甜是莫纳甜的R，R立体异构体。

17.一种由色氨酸或吲哚-3-丙酮酸生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括酶学生产莫纳甜组合物，其中所述莫纳甜组合物中存在的至少约80％的莫纳甜或其盐是莫纳甜的R，R立体异构体。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述色氨酸包含D-色氨酸。

19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述莫纳甜组合物中存在的至少约84％的莫纳甜或其盐是莫纳甜的R，R立体异构体。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提供ProA醛缩酶(EC 4.1.3.17)以促进吲哚-3-丙酮酸转变为2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提供AT-103(D-转氨酶)以促进2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸转变为莫纳甜。

22.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括使反应混合物发生反应，所述混合物包含：

(a)色氨酸、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其组合；和

(b)在选自位置39、41、47、69、109、297或其组合的氨基酸位置上含有至少一个取代的大肠杆菌AspC多肽(NCBI登录号AAC74014.1)，其中氨基酸位置的编号基于猪胞浆天冬氨酸转氨酶编号系统。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌AspC多肽具有天冬氨酸转氨酶活性。

24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述AspC多肽包含Val39→Leu取代。

25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述AspC多肽包含Lys41→Tyr取代。

26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述AspC多肽包含Thr47→Ile取代。

27.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述AspC多肽包含Asn69→Leu取代。

28.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述AspC多肽包含Thr109→Ser取代。

29.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述AspC多肽包含Asn297→Ser取代。

30.一种生产2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的方法，所述方法包括使反应混合物发生反应，所述混合物包含：

(a)吲哚-3-丙酮酸；和

(b)醛缩酶，选自大豆根瘤菌菌株USDA 110(NCBI登录号：GI:27378953)；少动鞘胺醇单胞菌(假单胞菌)(NCBI登录号：GI:19918963)；鼠疫耶尔森菌KM(NCBI登录号：GI:21956715)；Ralstonia metallidurans CH34(NCBI登录号：GI:48767386)；假结核耶尔森菌IP 32953(NCBI登录号：GI:51594436)；豌豆根瘤菌蚕豆生物型rhiz23g02-plk_1009_341(SEQ ID NO：88)；溶芳烃新鞘氨醇单胞菌DSM 12444、溶芳烃鞘氨醇单胞菌(F199)(NCBI登录号：GI:48849026)；恶臭假单胞菌KT2440(NCBI登录号：GI:24984081)；趋磁螺菌MS-I(NCBI登录号：GI:46200890)；沼泽红假单胞菌CGA009(NCBI登录号：GI:39937756)；野油菜黄单胞菌ATCC-33913(NCBI登录号：GI:21115297)；地毯草黄单胞菌柑桔变种306(NCBI登录号：GI:21110581)；阿维链霉菌MA-4680(NCBI登录号：GI:29828159)；或其组合。

31.一种生产2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的方法，所述方法包括使反应混合物发生反应，所述混合物含有：

(a)吲哚-3-丙酮酸；和

(b)一种醛缩酶，其含有与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)至少约49％相同的氨基酸序列或与苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)至少约56％相同的氨基酸序列，其中所述醛缩酶具有4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸裂合酶活性。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)至少约60％相同。

33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66)至少约70％相同。

34.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括使含有色氨酸和脱氨酶(EC3.5.1.-)的反应混合物发生反应，所述脱氨酶衍生自选自变形菌属、普罗威登斯菌属、摩根菌属或其组合的微生物。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述变形菌属包括产粘变形菌、奇异变形菌、普通变形菌和普通变形菌。

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