JP2003532411A - 高純度のｘ染色体保有精子集団およびｙ染色体保有精子集団 - Google Patents
高純度のｘ染色体保有精子集団およびｙ染色体保有精子集団Info
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Abstract
(57)【要約】
高い純度を有する、天然には存在しない精子の単離された集団（１５）、ならびに質量、容量、配向または発光される光のような特徴に基づいて、精子（２８）を区別する技術であって、分析の方法ならびにビーム形成光学要素（３０）および検出器（３２）のような装置を含む。本発明の幅広い目的は、単離された高純度のＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団の精子を提供することであり得る。高純度を有する、単離された非天然の集団の精子は、高純度集団の精子に対する適用のほんの数例として述べる、哺乳動物からの子孫の性選択、卵の授精のための種々のインビトロプロトコル、人工授精のような種々のインボプロトコル、受賞動物または食肉動物の産生を含むビジネス方法、あるいは希少なまたは絶滅の危機にある動物の保存を含む多くの適用を有する。
Description
【０００１】
（Ｉ．技術分野）
単離された高純度のＸ染色体保有精子集団またはＹ染色体保有精子集団および
精子、粒子、または区別的特徴（例えば、重量、容量、ＤＮＡ含有量など）に基
づく事象を単離する技術。
精子、粒子、または区別的特徴（例えば、重量、容量、ＤＮＡ含有量など）に基
づく事象を単離する技術。
【０００２】
（ＩＩ．背景）
単離された高純度のＸ染色体保有精子集団またはＹ染色体保有精子集団は、多
くの哺乳動物（例えば、ウシ（ｂｏｖｉｄ）、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ
、ネコ、ラクダ、ゾウ、ウシ（ｏｘｅｎ）、バッファローなど）の卵子または卵
母細胞のインビトロまたはインビボでの人工的な授精または受精を達成するため
に使用され得る。本明細書中で参考として援用する、米国特許第５，１３５，７
５９号もまた参照のこと。
くの哺乳動物（例えば、ウシ（ｂｏｖｉｄ）、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ
、ネコ、ラクダ、ゾウ、ウシ（ｏｘｅｎ）、バッファローなど）の卵子または卵
母細胞のインビトロまたはインビボでの人工的な授精または受精を達成するため
に使用され得る。本明細書中で参考として援用する、米国特許第５，１３５，７
５９号もまた参照のこと。
【０００３】
しかし、精子をＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団に分離するための従
来技術は、低純度の精子集団を生じ得る。分離方法に関わらず、慣用的に精子は
、高純度（例えば、９０％、９５％、または９５％以上）のＸ染色体保有精子サ
ンプルおよびＹ染色体保有精子サンプルに分離されなかった。
来技術は、低純度の精子集団を生じ得る。分離方法に関わらず、慣用的に精子は
、高純度（例えば、９０％、９５％、または９５％以上）のＸ染色体保有精子サ
ンプルおよびＹ染色体保有精子サンプルに分離されなかった。
【０００４】
大きさ、重量、または密度の差異に直接的にかまたは間接的に基づく多くの技
術が、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子を分離することに関して開示されて
いる。米国特許第４，４７４，８７５号により開示されるように、全ての精子細
胞に同時に浮力が適用され、次いでＸ染色体保有精子およびＹ染色体保有精子が
、分離培体中の異なる位置で単離され得る。米国特許第５，５１４，５３７号は
、精子が２種の大きさのビーズで充填されたカラムを通過する技術を開示する。
より大きなＸ染色体保有精子は、より大きなビーズを含む層において単離され、
一方、より小さなＹ染色体保有精子は、より小さなビーズを含む層において単離
される。米国特許第４，６０５，５５８号は、精子が密度勾配に対して示差的に
応答し得ることを開示し、そして米国特許第４，００９，２６０号は、遅延培体
（ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）のカラムを通る移動速度、または泳動速
度におけるＹ染色体保有精子とＸ染色体保有精子との間の差異を利用する。
術が、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子を分離することに関して開示されて
いる。米国特許第４，４７４，８７５号により開示されるように、全ての精子細
胞に同時に浮力が適用され、次いでＸ染色体保有精子およびＹ染色体保有精子が
、分離培体中の異なる位置で単離され得る。米国特許第５，５１４，５３７号は
、精子が２種の大きさのビーズで充填されたカラムを通過する技術を開示する。
より大きなＸ染色体保有精子は、より大きなビーズを含む層において単離され、
一方、より小さなＹ染色体保有精子は、より小さなビーズを含む層において単離
される。米国特許第４，６０５，５５８号は、精子が密度勾配に対して示差的に
応答し得ることを開示し、そして米国特許第４，００９，２６０号は、遅延培体
（ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）のカラムを通る移動速度、または泳動速
度におけるＹ染色体保有精子とＸ染色体保有精子との間の差異を利用する。
【０００５】
上述のそれぞれの技術に共通する問題は、それら各々が、「バルク様式（ｂｕ
ｌｋ−ｍａｔｔｅｒ）」で全ての精子に作用すること（これは、全ての精子が同
時に同一の処理を受けることを意味する）、およびＹ染色体保有精子細胞が、Ｘ
染色体保有精子細胞よりも速く、早く、または異なる位置で現れることであり得
る。結果として、個々の精子細胞は評価され得ず、そして容量、重量、密度、ま
たは他の精子細胞の性質の実際の「測定」は存在し得ない。精子細胞の１つ１つ
の評価は、実際の分離プロセスがモニターされ得、そして対象の量的データは分
離プロセスの間でさえも生成され得、そして分離パラメータは所望のように変更
され得るという点で利点を提供し得る。さらに、これらの技術は、流動細胞分類
装置（ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）と組み合わせられ
得ない。
ｌｋ−ｍａｔｔｅｒ）」で全ての精子に作用すること（これは、全ての精子が同
時に同一の処理を受けることを意味する）、およびＹ染色体保有精子細胞が、Ｘ
染色体保有精子細胞よりも速く、早く、または異なる位置で現れることであり得
る。結果として、個々の精子細胞は評価され得ず、そして容量、重量、密度、ま
たは他の精子細胞の性質の実際の「測定」は存在し得ない。精子細胞の１つ１つ
の評価は、実際の分離プロセスがモニターされ得、そして対象の量的データは分
離プロセスの間でさえも生成され得、そして分離パラメータは所望のように変更
され得るという点で利点を提供し得る。さらに、これらの技術は、流動細胞分類
装置（ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）と組み合わせられ
得ない。
【０００６】
精子の分離のためのフローサイトメーター技術もまた、開示されている。これ
らの技術を用いて、精子を蛍光色素で染色し得、そして励起源または照射源（例
えば、レーザービーム）により通過する狭い流れまたはバンドの中を流動させ得
る。染色された粒子または細胞は、励起源または照射源を通過し、蛍光色素は蛍
光の光を発する。この蛍光の光は、光学レンズアセンブリにより収集され得、検
出器（例えば、電気信号を生成および増幅する光電子増倍管）に集束され得、次
いで、分析器により分析され得る。次いで、このデータは、複数のパラメータま
たは単一のパラメータのクロマトグラムまたはヒストグラムとして表示され得る
。細胞の数および細胞あたりの蛍光は座標として使用され得る。本明細書中で参
考として援用する、米国特許第５，１３５，７５９号を参照のこと。しかし、こ
の型の技術に関して、種々の問題が未解決のまま残っており、そしてＸ染色体保
有精子細胞またはＹ染色体保有精子細胞の高純度の集団を単離することが困難で
ある。
らの技術を用いて、精子を蛍光色素で染色し得、そして励起源または照射源（例
えば、レーザービーム）により通過する狭い流れまたはバンドの中を流動させ得
る。染色された粒子または細胞は、励起源または照射源を通過し、蛍光色素は蛍
光の光を発する。この蛍光の光は、光学レンズアセンブリにより収集され得、検
出器（例えば、電気信号を生成および増幅する光電子増倍管）に集束され得、次
いで、分析器により分析され得る。次いで、このデータは、複数のパラメータま
たは単一のパラメータのクロマトグラムまたはヒストグラムとして表示され得る
。細胞の数および細胞あたりの蛍光は座標として使用され得る。本明細書中で参
考として援用する、米国特許第５，１３５，７５９号を参照のこと。しかし、こ
の型の技術に関して、種々の問題が未解決のまま残っており、そしてＸ染色体保
有精子細胞またはＹ染色体保有精子細胞の高純度の集団を単離することが困難で
ある。
【０００７】
従来のフローサイトメーター技術に伴う大きな問題は、シース液体流（ｓｈｅ
ａｔｈ ｆｌｕｉｄ ｓｔｒｅａｍ）における対象、粒子、または細胞の方向で
あり得る。これは、対象または細胞が１つより多い軸に関して、形状において不
規則である場合（例えば、精子）、特に問題であり得る。この問題の１つの局面
は、シース液体流中で対象の最初の方向が確立されることであり得る。この問題
の第２の局面は、対象から発せられる光が測定される期間内に、検出器（光電子
増倍管またはそれ以外）に対して対象のその方向が維持されることであり得る。
ａｔｈ ｆｌｕｉｄ ｓｔｒｅａｍ）における対象、粒子、または細胞の方向で
あり得る。これは、対象または細胞が１つより多い軸に関して、形状において不
規則である場合（例えば、精子）、特に問題であり得る。この問題の１つの局面
は、シース液体流中で対象の最初の方向が確立されることであり得る。この問題
の第２の局面は、対象から発せられる光が測定される期間内に、検出器（光電子
増倍管またはそれ以外）に対して対象のその方向が維持されることであり得る。
【０００８】
従来のフローサイトメーター技術に伴う別の大きな問題は、液滴中に対象また
は細胞をカプセル化できないことであり得る。特に、液滴が不規則な形状の対象
の周囲に形成される場合、液滴は、対象または細胞の全ての性質を完全に囲むの
に十分な大きさであり得ない。例えば、上述のようなフローサイトメトリー操作
の間、液滴は、非常に高速（１秒間あたり１０，０００〜９０，０００滴でさえ
も、およびいくつかの適用においては、１秒間あたり８０，０００滴でさえも）
で形成され得る。特にこれらの高速の速度において精子が液滴中にカプセル化さ
れる場合、尾部または頸部の一部は、液滴中にカプセル化され得ない。次いで、
液滴中にカプセル化されない尾部または頸部のその部分は、その後の液滴形成ま
たは液滴の適切な偏向を妨害する様式で、ノズルと反応性であり得るか、または
その液滴を囲む環境に反応性であり得る。結果として、いくつかの精子は、全く
分析されず、手順の有効性を減少させ得るか、または集団に割り当てられるのに
十分に分離され得ないか、または誤った軌道に偏向され得るか、もしくはその全
ての組み合わせが生じ得る。
は細胞をカプセル化できないことであり得る。特に、液滴が不規則な形状の対象
の周囲に形成される場合、液滴は、対象または細胞の全ての性質を完全に囲むの
に十分な大きさであり得ない。例えば、上述のようなフローサイトメトリー操作
の間、液滴は、非常に高速（１秒間あたり１０，０００〜９０，０００滴でさえ
も、およびいくつかの適用においては、１秒間あたり８０，０００滴でさえも）
で形成され得る。特にこれらの高速の速度において精子が液滴中にカプセル化さ
れる場合、尾部または頸部の一部は、液滴中にカプセル化され得ない。次いで、
液滴中にカプセル化されない尾部または頸部のその部分は、その後の液滴形成ま
たは液滴の適切な偏向を妨害する様式で、ノズルと反応性であり得るか、または
その液滴を囲む環境に反応性であり得る。結果として、いくつかの精子は、全く
分析されず、手順の有効性を減少させ得るか、または集団に割り当てられるのに
十分に分離され得ないか、または誤った軌道に偏向され得るか、もしくはその全
ての組み合わせが生じ得る。
【０００９】
従来のフローサイトメーター技術および他の技術に伴う別の大きな問題は、測
定可能な事象の同時発生であり得る。この問題の１つの局面は、第１の事象から
の入射光のフラックスが、第２の事象からの入射光のフラックスが信号を生成し
始めた後も信号を生成し続けることであり得る。結果として、２つの事象は、少
なくとも部分的にお互いに分離されないまま残る。この問題の別の局面は、２つ
以上の事象が同時に開始され、そして入射光のフラックスが全ての事象の寄与を
含むことであり得る。結果として、これらの多くの事象は、全く分離され得ず、
そしてこれらの多くの事象に対応する対象は、集団に不正確に割り当てられるか
、または集団に全く割り当てられないか、もしくはその両方であり得る。特に、
フローサイトメトリーに関して、懸濁液中の個々の粒子、対象、細胞、または精
子は、光のビームを通って流れ、それらが相互作用して測定可能な反応（例えば
、蛍光の発光）を提供する。従来のフローサイトメトリーにおいて、ヘキスト（
Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色した精子は、蛍光の光の発光を生じるレーザービームをト
ラバースする。ＤＮＡに結合した励起された蛍光色素からの蛍光の光の発光は、
実際の発光事象が終了した後の一定期間、従来の光電子増倍管において電子流を
生成するのに十分な明るさであり得る。さらに、従来のフローサイトメーターに
おいて、レーザービームは、３０μｍの高度を有するパターンを生成し得、その
幅はおよそ８０μｍであり得る。蛍光色素結合ＤＮＡを含むウシ精子の核は、約
９μｍ長であり、レーザービームの高度はその核よりも３倍程度大きくあり得る
。この相違は、一度のレーザービームのパターンでの１つより多い精子における
結合した蛍光色素のレーザー励起を可能にし得る。これらの従来のフローサイト
メトリーの問題の各々は、個々の事象を互いに分離する能力を減少させる。
定可能な事象の同時発生であり得る。この問題の１つの局面は、第１の事象から
の入射光のフラックスが、第２の事象からの入射光のフラックスが信号を生成し
始めた後も信号を生成し続けることであり得る。結果として、２つの事象は、少
なくとも部分的にお互いに分離されないまま残る。この問題の別の局面は、２つ
以上の事象が同時に開始され、そして入射光のフラックスが全ての事象の寄与を
含むことであり得る。結果として、これらの多くの事象は、全く分離され得ず、
そしてこれらの多くの事象に対応する対象は、集団に不正確に割り当てられるか
、または集団に全く割り当てられないか、もしくはその両方であり得る。特に、
フローサイトメトリーに関して、懸濁液中の個々の粒子、対象、細胞、または精
子は、光のビームを通って流れ、それらが相互作用して測定可能な反応（例えば
、蛍光の発光）を提供する。従来のフローサイトメトリーにおいて、ヘキスト（
Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色した精子は、蛍光の光の発光を生じるレーザービームをト
ラバースする。ＤＮＡに結合した励起された蛍光色素からの蛍光の光の発光は、
実際の発光事象が終了した後の一定期間、従来の光電子増倍管において電子流を
生成するのに十分な明るさであり得る。さらに、従来のフローサイトメーターに
おいて、レーザービームは、３０μｍの高度を有するパターンを生成し得、その
幅はおよそ８０μｍであり得る。蛍光色素結合ＤＮＡを含むウシ精子の核は、約
９μｍ長であり、レーザービームの高度はその核よりも３倍程度大きくあり得る
。この相違は、一度のレーザービームのパターンでの１つより多い精子における
結合した蛍光色素のレーザー励起を可能にし得る。これらの従来のフローサイト
メトリーの問題の各々は、個々の事象を互いに分離する能力を減少させる。
【００１０】
従来のフローサイトメーター技術および他の技術に伴う別の大きな問題は、不
規則な形状の対象（例えば、精子）がそれらの励起／検出経路内での方向に基づ
き異なる信号（形状、持続時間、または量）を生成することであり得る。結果と
して、同種集団内での個体は、別の同種集団由来の個体の発光特性と重複し得る
広範なスペクトルの発光特性を生成し、２つの集団の個体を分離する能力を除去
または減少させ得る。
規則な形状の対象（例えば、精子）がそれらの励起／検出経路内での方向に基づ
き異なる信号（形状、持続時間、または量）を生成することであり得る。結果と
して、同種集団内での個体は、別の同種集団由来の個体の発光特性と重複し得る
広範なスペクトルの発光特性を生成し、２つの集団の個体を分離する能力を除去
または減少させ得る。
【００１１】
従来のフローサイトメーター技術および他の技術に伴う別の大きな問題は、対
象が、励起源に対して均一に曝露されないことであり得る。従来のビーム形成光
学要素は、対象がビームの周辺に近い場合、レーザー光に対する均一な曝露を提
供し得ない。
象が、励起源に対して均一に曝露されないことであり得る。従来のビーム形成光
学要素は、対象がビームの周辺に近い場合、レーザー光に対する均一な曝露を提
供し得ない。
【００１２】
従来のフローサイトメーター技術に伴う別の大きな問題は、対象（例えば、精
子）が、不必要に長い期間、励起源に曝露され得ることであり得る。レーザー光
による細胞（例えば、精子）の照射は、細胞またはそれらに含まれるＤＮＡに対
する損傷を生じ得る。
子）が、不必要に長い期間、励起源に曝露され得ることであり得る。レーザー光
による細胞（例えば、精子）の照射は、細胞またはそれらに含まれるＤＮＡに対
する損傷を生じ得る。
【００１３】
従来のフローサイトメーター技術に伴う別の大きな問題は、注入管によるノズ
ル内での層流の崩壊が存在し得ることであり得る。層流の崩壊は、流動中の不規
則な形状の対象の方向を変更し、そして分類の速度および分類されるＸ染色体保
有精子またはＹ染色体保有精子の集団の純度を低下させ得る。
ル内での層流の崩壊が存在し得ることであり得る。層流の崩壊は、流動中の不規
則な形状の対象の方向を変更し、そして分類の速度および分類されるＸ染色体保
有精子またはＹ染色体保有精子の集団の純度を低下させ得る。
【００１４】
精子細胞の核ＤＮＡに結合した染料を利用する技術に伴うさらなる問題が存在
し得る。第１に、核内のＤＮＡは高度に凝縮され、そして形状において平面的で
あるので、ＤＮＡの化学量論的な染色は困難であるか、または不可能であり得る
。第２に、染色された核は、高い屈折率を有し得る。第３に、ＤＮＡ−染料複合
体を形成するためにＤＮＡに結合される染料は、受精率またはその後の胚の生存
性を減少させ得る。第４に、ＤＮＡ−染料複合体は、代表的に、染料を蛍光発光
させるために紫外光を用いて照射される。この照射は、精子の生存性に影響を及
ぼし得る。これらの種々の問題に起因して、より少ない染料を必要とするかまた
は全く必要としない、もしくはより少ない紫外線照射を必要とするかまたは全く
必要としない、あるいはより少ないその両方を必要とするかまたは全く必要とし
ない方法を使用することが好ましくあり得る。
し得る。第１に、核内のＤＮＡは高度に凝縮され、そして形状において平面的で
あるので、ＤＮＡの化学量論的な染色は困難であるか、または不可能であり得る
。第２に、染色された核は、高い屈折率を有し得る。第３に、ＤＮＡ−染料複合
体を形成するためにＤＮＡに結合される染料は、受精率またはその後の胚の生存
性を減少させ得る。第４に、ＤＮＡ−染料複合体は、代表的に、染料を蛍光発光
させるために紫外光を用いて照射される。この照射は、精子の生存性に影響を及
ぼし得る。これらの種々の問題に起因して、より少ない染料を必要とするかまた
は全く必要としない、もしくはより少ない紫外線照射を必要とするかまたは全く
必要としない、あるいはより少ないその両方を必要とするかまたは全く必要とし
ない方法を使用することが好ましくあり得る。
【００１５】
Ｘ染色体保有精子細胞集団またはＹ染色体保有精子細胞集団の高純度サンプル
（生きているか、固定されているか、生存可能か、生存不可能か、インタクトか
、尾部がないか、または核としてのいずれか）を作製することに関して、あるい
は、一般的に、比較的高い入射光フラックスを有する連続的な事象間の発光信号
における小さな差異を検出することに関して、あるいは流体流れ中の不規則な形
状の物体を配向させることに関して、あるいは光路内における同時の事象を除く
ことに関して、あるいは望ましくなく配向した物体を分析から除くことに関して
、本発明は、現実的な様式で、上記問題のすべてに取り組む。
（生きているか、固定されているか、生存可能か、生存不可能か、インタクトか
、尾部がないか、または核としてのいずれか）を作製することに関して、あるい
は、一般的に、比較的高い入射光フラックスを有する連続的な事象間の発光信号
における小さな差異を検出することに関して、あるいは流体流れ中の不規則な形
状の物体を配向させることに関して、あるいは光路内における同時の事象を除く
ことに関して、あるいは望ましくなく配向した物体を分析から除くことに関して
、本発明は、現実的な様式で、上記問題のすべてに取り組む。
【００１６】
（ＩＩＩ．発明の開示）
本発明の幅広い目的は、単離された高純度のＸ染色体保有集団およびＹ染色体
保有集団の精子を提供することであり得る。高純度を有する、単離された非天然
の集団の精子は、高純度集団の精子に対する適用のほんの数例として述べる、哺
乳動物からの子孫の性選択、卵の授精のための種々のインビトロプロトコル、人
工授精のような種々のインボプロトコル、受賞動物または食肉動物の産生を含む
ビジネス方法、あるいは希少なまたは絶滅の危機にある動物の保存を含む多くの
適用を有する。
保有集団の精子を提供することであり得る。高純度を有する、単離された非天然
の集団の精子は、高純度集団の精子に対する適用のほんの数例として述べる、哺
乳動物からの子孫の性選択、卵の授精のための種々のインビトロプロトコル、人
工授精のような種々のインボプロトコル、受賞動物または食肉動物の産生を含む
ビジネス方法、あるいは希少なまたは絶滅の危機にある動物の保存を含む多くの
適用を有する。
【００１７】
本発明の別の幅広い目的は、高純度のＸ染色体保有精子サンプルおよびＹ染色
体保有精子サンプルを作製するためのデバイスと方法との両方を含む。
体保有精子サンプルを作製するためのデバイスと方法との両方を含む。
【００１８】
本発明の特定の実施形態が記載され、これは、上記の多くの適用において使用
され得る。これは、全ての光のフラックスにおいて小さな測定可能な差異を有す
る明るい光電子放出事象間を区別すること、流体流れにおいて不規則な形状の物
体を配向させること、光路内の同時の事象を最小化させること、光路内の望まし
くない配向していない物体によって与えられる信号の除去（物体自体の除去を含
む）、および液滴内の不規則な形状の物体のカプセル化という特定の目的を達成
するために使用され得る。このように、本発明の特定の目的は、非常に種々であ
り得る。
され得る。これは、全ての光のフラックスにおいて小さな測定可能な差異を有す
る明るい光電子放出事象間を区別すること、流体流れにおいて不規則な形状の物
体を配向させること、光路内の同時の事象を最小化させること、光路内の望まし
くない配向していない物体によって与えられる信号の除去（物体自体の除去を含
む）、および液滴内の不規則な形状の物体のカプセル化という特定の目的を達成
するために使用され得る。このように、本発明の特定の目的は、非常に種々であ
り得る。
【００１９】
本発明の別の幅広い目的は、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％
よりさらに上の範囲の段階的レベルの高純度を有する、Ｘ染色体保有精子サンプ
ルまたはＹ染色体保有精子サンプル（生きているか、固定されているか、生存可
能か、生存不可能か、インタクトか、尾部がないか、または精子核）を提供する
ことであり得る。
よりさらに上の範囲の段階的レベルの高純度を有する、Ｘ染色体保有精子サンプ
ルまたはＹ染色体保有精子サンプル（生きているか、固定されているか、生存可
能か、生存不可能か、インタクトか、尾部がないか、または精子核）を提供する
ことであり得る。
【００２０】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、精子を、高い分離速度において
さえ、高純度を有するＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団に選別すること
であり得る。高速度の分離は、１秒当たり約５００個、１０００個、２０００個
、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８，０００
個、９，０００個または１０，０００個の速度あるいはそれ以上の速度で、それ
ぞれの性の生きた精子を作製し得る。
さえ、高純度を有するＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団に選別すること
であり得る。高速度の分離は、１秒当たり約５００個、１０００個、２０００個
、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８，０００
個、９，０００個または１０，０００個の速度あるいはそれ以上の速度で、それ
ぞれの性の生きた精子を作製し得る。
【００２１】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、フローサイトメーターの流路の
励起／検出部分において望ましくない配向を有する精子（生きているか、固定さ
れているか、生存可能か、生存不可能か、インタクトか、尾部がないか、または
精子核）を実質的に除去する（ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｏｒ ｒｅｍｏｖｅ）こと
であり得る。
励起／検出部分において望ましくない配向を有する精子（生きているか、固定さ
れているか、生存可能か、生存不可能か、インタクトか、尾部がないか、または
精子核）を実質的に除去する（ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｏｒ ｒｅｍｏｖｅ）こと
であり得る。
【００２２】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、高いレベルの純度を有するＸ染
色体保有精子またはＹ染色体保有精子の人工授精サンプルを提供することであり
得る。
色体保有精子またはＹ染色体保有精子の人工授精サンプルを提供することであり
得る。
【００２３】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、高いレベルの純度を有するＸ染
色体保有精子またはＹ染色体保有精子のインビトロ授精サンプルを提供すること
であり得る。
色体保有精子またはＹ染色体保有精子のインビトロ授精サンプルを提供すること
であり得る。
【００２４】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、高純度の人工授精サンプルを用
いて授精された雌の子孫の性、高純度の人工授精サンプルを用いて授精された卵
の子孫の性を、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％より高い選択成
功率で予め選択することであり得る。
いて授精された雌の子孫の性、高純度の人工授精サンプルを用いて授精された卵
の子孫の性を、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％より高い選択成
功率で予め選択することであり得る。
【００２５】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、全ての発光フラックスにおいて
小さな差異を有する発光事象間を区別することであり得る。
小さな差異を有する発光事象間を区別することであり得る。
【００２６】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、高い入射光フラックスに曝露さ
れた後の期間の間、光のない場合でさえ、光電子増倍管によって生成されるバッ
クグラウンドノイズの量を実質的に除去するかまたは減少させることであり得る
。
れた後の期間の間、光のない場合でさえ、光電子増倍管によって生成されるバッ
クグラウンドノイズの量を実質的に除去するかまたは減少させることであり得る
。
【００２７】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、フローサイトメトリーまたはそ
れ以外と組み合わせて使用される光電子増倍管の光電陰極の飽和を実質的に除去
することであり得る。
れ以外と組み合わせて使用される光電子増倍管の光電陰極の飽和を実質的に除去
することであり得る。
【００２８】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、光電子増倍管の光電陰極から第
１のダイノードに移動する電子の数を減少させることであり得る。
１のダイノードに移動する電子の数を減少させることであり得る。
【００２９】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、光電子増倍管のＮ電極への電子
の合計の流れを減少させることであり得る。
の合計の流れを減少させることであり得る。
【００３０】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、光電子増倍管により生成される
バックグラウンド信号の量を比率的に増加させることなく、光電子増倍管の光電
陰極への光のフラックスを増加させ得ることであり得る。
バックグラウンド信号の量を比率的に増加させることなく、光電子増倍管の光電
陰極への光のフラックスを増加させ得ることであり得る。
【００３１】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、測定される発光事象から、バッ
クグラウンド信号に対する信号の比を増加させることであり得る。
クグラウンド信号に対する信号の比を増加させることであり得る。
【００３２】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、光電子増倍管の光電陰極を飽和
させることなく、高い入射光フラックス事象または連続した高い入射光フラック
ス事象の間、光電子増倍管から生成される信号の増加した増幅を可能にすること
であり得る。
させることなく、高い入射光フラックス事象または連続した高い入射光フラック
ス事象の間、光電子増倍管から生成される信号の増加した増幅を可能にすること
であり得る。
【００３３】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、結合した蛍光色素の励起の際に
発せられた光のフラックスにおいて小さな差異を有する、蛍光色素染色精子、ま
たは他の細胞、または他の物体を選別することから生じるクロマトグラムまたは
ヒストグラムの見かけの分解能を増加することであり得る。
発せられた光のフラックスにおいて小さな差異を有する、蛍光色素染色精子、ま
たは他の細胞、または他の物体を選別することから生じるクロマトグラムまたは
ヒストグラムの見かけの分解能を増加することであり得る。
【００３４】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、精子を選別するために使用され
る場合、選別するフローサイトメーター機器の較正を改善することであり得る。
る場合、選別するフローサイトメーター機器の較正を改善することであり得る。
【００３５】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、フローサイトメーターシステム
の精子選別速度を増加することであり得る。
の精子選別速度を増加することであり得る。
【００３６】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、フローサイトメトリーによって
選別される精子サンプルの純度を増加させることであり得る。
選別される精子サンプルの純度を増加させることであり得る。
【００３７】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、核ＤＮＡの合計量と比較して、
Ｘ染色体ＤＮＡの量に対するＹ染色体ＤＮＡの量における差異が小さいときに、
Ｙ染色体保有精子からＸ染色体保有精子を選別するための技術を提供することで
あり得る。
Ｘ染色体ＤＮＡの量に対するＹ染色体ＤＮＡの量における差異が小さいときに、
Ｙ染色体保有精子からＸ染色体保有精子を選別するための技術を提供することで
あり得る。
【００３８】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、フローサイトメーターを用いて
Ｙ染色体保有精子からＸ染色体保有精子を選別するプロセスの間に生成されるヒ
ストグラムの見かけの分解能を改善する技術を提供することであり得る。
Ｙ染色体保有精子からＸ染色体保有精子を選別するプロセスの間に生成されるヒ
ストグラムの見かけの分解能を改善する技術を提供することであり得る。
【００３９】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、励起／検出経路内の物体の同時
発生を最小化するビーム成形光学要素（ｂｅａｍ ｓｈａｐｉｎｇ ｏｐｔｉｃ
ｓ）を提供することであり得る。
発生を最小化するビーム成形光学要素（ｂｅａｍ ｓｈａｐｉｎｇ ｏｐｔｉｃ
ｓ）を提供することであり得る。
【００４０】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、トラバースする励起ビームに物
体が曝露される合計のルーメンを最小化するビーム成形光学要素を提供すること
であり得る。この目定の１つの局面は、物体が曝露される合計のルーメンを減少
させることであり得る。この目的の第２の局面は、物体が曝露される合計のルー
メンを増加させることなく、光源の出力を増加させることであり得る。
体が曝露される合計のルーメンを最小化するビーム成形光学要素を提供すること
であり得る。この目定の１つの局面は、物体が曝露される合計のルーメンを減少
させることであり得る。この目的の第２の局面は、物体が曝露される合計のルー
メンを増加させることなく、光源の出力を増加させることであり得る。
【００４１】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、光路を通過する物体の均一な曝
露を可能にするビーム成形光学要素を提供することであり得る。
露を可能にするビーム成形光学要素を提供することであり得る。
【００４２】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、流体流れにおける不規則な形状
の物体を配向させるノズルを提供することであり得る。この目的の１つの局面は
、細長い物体を同じ方向に配向させることであり得る。この目的の第２の局面は
、側背が平坦な物体を同じ方向に配向させることであり得る。
の物体を配向させるノズルを提供することであり得る。この目的の１つの局面は
、細長い物体を同じ方向に配向させることであり得る。この目的の第２の局面は
、側背が平坦な物体を同じ方向に配向させることであり得る。
【００４３】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、流体の液滴内の不規則な形状の
物体を完全にカプセル化することであり得る。
物体を完全にカプセル化することであり得る。
【００４４】
本発明の特定の実施形態の別の有意な目的は、流体流れ内の望ましく配向され
た物体から望ましくなく配向された物体を区別することであり得る。
た物体から望ましくなく配向された物体を区別することであり得る。
【００４５】
本発明の特定の実施形態の別の目的は、差示的干渉コントラスト技術を提供す
ることであり得、これによって、物体平面が、目的の物体を有する流体流れから
なり、そして像平面が通過する物体からの信号を測定するために使用され得る。
ることであり得、これによって、物体平面が、目的の物体を有する流体流れから
なり、そして像平面が通過する物体からの信号を測定するために使用され得る。
【００４６】
本発明の実施形態の別の目的は、正確な容量を測定するため、および配向を決
定するために使用され得るような方法で、各物体から２つの側方向に分離された
画像を形成する光を提供することであり得る。このように、容量の正確な測定が
可能となるように適切に配向されていない物体は、捨てられ得る。このことは、
これらの２つの画像から得られる光パルスが、２つのピンホールを使用すること
で、像平面において独立して検出され得るような改善によって達成され得る。物
体が測定される場合、第１の画像が、この物体の体積に対して比例的な光パルス
を生じさせ、そして第２の画像が、配向に依存した光パルスを生じさせ得るよう
に、光が回転される。
定するために使用され得るような方法で、各物体から２つの側方向に分離された
画像を形成する光を提供することであり得る。このように、容量の正確な測定が
可能となるように適切に配向されていない物体は、捨てられ得る。このことは、
これらの２つの画像から得られる光パルスが、２つのピンホールを使用すること
で、像平面において独立して検出され得るような改善によって達成され得る。物
体が測定される場合、第１の画像が、この物体の体積に対して比例的な光パルス
を生じさせ、そして第２の画像が、配向に依存した光パルスを生じさせ得るよう
に、光が回転される。
【００４７】
本発明の実施形態の別の目的は、物体が流体流内に含まれるという事実を補償
する様式を提供し得る。流体流は、水のシリンダー（例えば、このシリンダーは
、円柱レンズとして作用する）であり得、従って、物体の画像を歪曲させる。光
学的に、このことは、周囲（空気）よりも高い屈折率のシリンダー（水）に対応
する。本発明において開示される補償は、例えば、周囲よりも低い屈折率を有す
るシリンダーからなり得るが、種々の形状および屈折率の他の補償エレメントが
また、必要がある場合に設計され得る。光がこの補償エレメントを通過すること
を確実にすることによって、流体流の光学的効果が、補償エレメントの完全に反
対の挙動によって補償され得る。
する様式を提供し得る。流体流は、水のシリンダー（例えば、このシリンダーは
、円柱レンズとして作用する）であり得、従って、物体の画像を歪曲させる。光
学的に、このことは、周囲（空気）よりも高い屈折率のシリンダー（水）に対応
する。本発明において開示される補償は、例えば、周囲よりも低い屈折率を有す
るシリンダーからなり得るが、種々の形状および屈折率の他の補償エレメントが
また、必要がある場合に設計され得る。光がこの補償エレメントを通過すること
を確実にすることによって、流体流の光学的効果が、補償エレメントの完全に反
対の挙動によって補償され得る。
【００４８】
本発明の本来のさらなる目的は、本明細書および特許請求の範囲の他の領域全
体にわたって開示されている。
体にわたって開示されている。
【００４９】
（Ｖ．本発明を実施するための形態）
本発明は、高い純度の、Ｘ染色体を保有する精子または精子細胞の集団および
Ｙ染色体を保有する精子または精子細胞の集団に関する。高い純度の、Ｘ染色体
を保有する精子の集団およびＹ染色体を保有する精子の集団は、インタクトな生
存精子の集団を含み得、そしてまた、尾部のない精子（精子核）の集団、または
所望され得る場合、精子の他の生存可能形態もしくは生存不能形態の集団を含み
得る。精子細胞の頭部、頚部、および尾部を有するインタクトな生存精子細胞を
各々分離する文脈において、本発明を記述する特定の例が提供されるが、記載さ
れる技術は、同様に、精子核に関する種々の用途を有し得ることが理解されるべ
きである。Ｘ染色体を保有する精子の集団およびＹ染色体を保有する精子の集団
は、以下に挙げられるが、これらに限定されない哺乳動物の種の任意の雄性由来
の精子を含むことがさらに理解されるべきである：ヒトの精子ならびに一般的に
公知な動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヤギ、もしくはブタ）
およびあまり一般的でない動物（例えば、ゾウ、シマウマ、ラクダ、もしくはク
ドゥ（ｋｕｄｕ））の精子。この動物の列挙は、９０％以上の純度で慣用的にソ
ーティングされ得る、より多くの種の動物の例であることを意図し、そして哺乳
動物の任意の特定の種由来の精子に本発明の記載を限定することを意図しない。
Ｙ染色体を保有する精子または精子細胞の集団に関する。高い純度の、Ｘ染色体
を保有する精子の集団およびＹ染色体を保有する精子の集団は、インタクトな生
存精子の集団を含み得、そしてまた、尾部のない精子（精子核）の集団、または
所望され得る場合、精子の他の生存可能形態もしくは生存不能形態の集団を含み
得る。精子細胞の頭部、頚部、および尾部を有するインタクトな生存精子細胞を
各々分離する文脈において、本発明を記述する特定の例が提供されるが、記載さ
れる技術は、同様に、精子核に関する種々の用途を有し得ることが理解されるべ
きである。Ｘ染色体を保有する精子の集団およびＹ染色体を保有する精子の集団
は、以下に挙げられるが、これらに限定されない哺乳動物の種の任意の雄性由来
の精子を含むことがさらに理解されるべきである：ヒトの精子ならびに一般的に
公知な動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヤギ、もしくはブタ）
およびあまり一般的でない動物（例えば、ゾウ、シマウマ、ラクダ、もしくはク
ドゥ（ｋｕｄｕ））の精子。この動物の列挙は、９０％以上の純度で慣用的にソ
ーティングされ得る、より多くの種の動物の例であることを意図し、そして哺乳
動物の任意の特定の種由来の精子に本発明の記載を限定することを意図しない。
【００５０】
哺乳動物の種々の種からの高度に分離された精子は、以下の産物に取り込まれ
得る：人工受精プロトコルを用いてか、または米国特許出願第６０／２１１，０
９３号、同第６０／２２４，０５０号、もしくは特許協力条約出願ＵＳ９９／１
７１６５号において使用されるような営利事業の方法の一部として使用され得る
産物、あるいは特許協力条約出願ＵＳ９８／２７９０９号に記載されるような低
用量の受精プロトコルを用いて使用され得る産物、あるいは米国特許出願６０／
２５３，７８５号に記載されるようなヒトを含む動物由来の卵母細胞のインビト
ロ受精に使用され得る産物（上記の参考文献の各々は、本明細書において参考と
して援用される）。
得る：人工受精プロトコルを用いてか、または米国特許出願第６０／２１１，０
９３号、同第６０／２２４，０５０号、もしくは特許協力条約出願ＵＳ９９／１
７１６５号において使用されるような営利事業の方法の一部として使用され得る
産物、あるいは特許協力条約出願ＵＳ９８／２７９０９号に記載されるような低
用量の受精プロトコルを用いて使用され得る産物、あるいは米国特許出願６０／
２５３，７８５号に記載されるようなヒトを含む動物由来の卵母細胞のインビト
ロ受精に使用され得る産物（上記の参考文献の各々は、本明細書において参考と
して援用される）。
【００５１】
用語（純度または高い純度）の使用は、特定の識別特性または所望の特性の組
み合わせを有する、単離された精子の集団の割合であることが理解されるべきで
ある。例えば、精子の集団がＹ染色体に対してＸ染色体を含むこと基づいて分離
される場合、９０％の純度を有する集団を含むＸ染色体は、個々の精子の９０％
がＸ染色体である一方で、このような精子の集団の１０％がＹ染色体を有し得る
、精子の集団を含む。このように、Ｘ染色体含有集団またはＹ染色体含有集団に
関して高い純度とは、９０％と約１００％との間、約９１％と約１００％との間
、約９２％と約１００％との間、約９３％と約１００％との間、約９４％と約１
００％との間、約９５％と約１００％との間、約９６％と約１００％との間、約
９７％と約１００％との間、約９８％と約１００％との間、約９９％と約１００
％との間からなる群から選択される純度を含み得る。
み合わせを有する、単離された精子の集団の割合であることが理解されるべきで
ある。例えば、精子の集団がＹ染色体に対してＸ染色体を含むこと基づいて分離
される場合、９０％の純度を有する集団を含むＸ染色体は、個々の精子の９０％
がＸ染色体である一方で、このような精子の集団の１０％がＹ染色体を有し得る
、精子の集団を含む。このように、Ｘ染色体含有集団またはＹ染色体含有集団に
関して高い純度とは、９０％と約１００％との間、約９１％と約１００％との間
、約９２％と約１００％との間、約９３％と約１００％との間、約９４％と約１
００％との間、約９５％と約１００％との間、約９６％と約１００％との間、約
９７％と約１００％との間、約９８％と約１００％との間、約９９％と約１００
％との間からなる群から選択される純度を含み得る。
【００５２】
重要なことに、本発明の多数の実施形態は、単離された高純度の精子のＸ染色
体保有集団およびＹ染色体保有集団を記載し、そしてこの記載は高純度精子分離
デバイス、ならびに精子の集団を単離するための方法および単離された高純度の
精子の集団を使用するための方法を開示するが、本発明の基本的な概念は、他の
タイプの粒子、または粒子分別特性を有する事象もしくは分別特性を有する事象
に適用可能であることが理解されるべきである。本発明は、当業者に容易に理解
されるように、光生成信号における小さな差異の分離が必要であり得る様々な場
合（例えば、製品の欠陥検出、フィールドフロー分別（ｆｉｅｌｄ ｆｌｏｗ
ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、液体クロマトグラフィー、電気泳動、コンピュ
ーター断層撮影、γ線カメラ、飛行計器の時間など）に適用可能であり得ること
が理解されるべきである。
体保有集団およびＹ染色体保有集団を記載し、そしてこの記載は高純度精子分離
デバイス、ならびに精子の集団を単離するための方法および単離された高純度の
精子の集団を使用するための方法を開示するが、本発明の基本的な概念は、他の
タイプの粒子、または粒子分別特性を有する事象もしくは分別特性を有する事象
に適用可能であることが理解されるべきである。本発明は、当業者に容易に理解
されるように、光生成信号における小さな差異の分離が必要であり得る様々な場
合（例えば、製品の欠陥検出、フィールドフロー分別（ｆｉｅｌｄ ｆｌｏｗ
ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、液体クロマトグラフィー、電気泳動、コンピュ
ーター断層撮影、γ線カメラ、飛行計器の時間など）に適用可能であり得ること
が理解されるべきである。
【００５３】
さらに、本開示は、Ｙ染色体保有精子からＸ染色体保有精子をフロー分離する
ための装置および方法の実施形態の説明を提供し、本発明のこれらの実施形態の
説明は、精子のフロー分離にも高純度フローサイトメーター精子分離システムに
も本発明の範囲を縮小することは意味せず、むしろこれらの例は、本発明が多種
多様の用途に適用され得るように実際的な様式で、本発明の基本概念を例示する
ことを意図する。
ための装置および方法の実施形態の説明を提供し、本発明のこれらの実施形態の
説明は、精子のフロー分離にも高純度フローサイトメーター精子分離システムに
も本発明の範囲を縮小することは意味せず、むしろこれらの例は、本発明が多種
多様の用途に適用され得るように実際的な様式で、本発明の基本概念を例示する
ことを意図する。
【００５４】
ここで図１および２を参照すると、本発明のフローサイトメーターの実施形態
が示され、これは、分析のために少なくとも１種の蛍光色素で染色された粒子ま
たは細胞を確立または供給するように働く、粒子源または細胞源（１）を備える
。この粒子または細胞は、この粒子または細胞が流体流またはシース流体（３）
内に導入されるような様式で、ノズル（２）内に堆積される。このシース流体（
３）は、通常、あるシース流体源（４）から供給され、その結果、この粒子源ま
たは細胞源（１）が粒子または細胞をシース流体（４）に供給する場合、これら
はノズル（２）を通して同時に供給される。
が示され、これは、分析のために少なくとも１種の蛍光色素で染色された粒子ま
たは細胞を確立または供給するように働く、粒子源または細胞源（１）を備える
。この粒子または細胞は、この粒子または細胞が流体流またはシース流体（３）
内に導入されるような様式で、ノズル（２）内に堆積される。このシース流体（
３）は、通常、あるシース流体源（４）から供給され、その結果、この粒子源ま
たは細胞源（１）が粒子または細胞をシース流体（４）に供給する場合、これら
はノズル（２）を通して同時に供給される。
【００５５】
このように、シース流体（３）が粒子または細胞のためのシース流体環境をど
のように形成するかが容易に理解され得る。様々な流体はある圧力でフローサイ
トメーターに提供されるため、これらの流体はノズル（２）から流れ、そしてノ
ズルオリフィス（５）において流れ出る。発振器制御機器（７）により非常に正
確に制御され得るタイプの発振器（６）を設けることによって、圧縮波はノズル
（２）内で確立され得、ノズルオリフィス（５）でノズル（２）を出る流体に伝
達される。発振器（６）はシース流体（３）に作用するため、ノズルオリフィス
（５）を出る流れ（８）は、最終的に正確に液滴（９）を形成する。粒子または
細胞は、流体流またはシース流体環境に取り囲まれるため、この液滴（９）は、
この環境内で別個に単離された粒子または細胞を巻き込み得、そして本発明のい
くつかの実施形態について、精子細胞であり得る。
のように形成するかが容易に理解され得る。様々な流体はある圧力でフローサイ
トメーターに提供されるため、これらの流体はノズル（２）から流れ、そしてノ
ズルオリフィス（５）において流れ出る。発振器制御機器（７）により非常に正
確に制御され得るタイプの発振器（６）を設けることによって、圧縮波はノズル
（２）内で確立され得、ノズルオリフィス（５）でノズル（２）を出る流体に伝
達される。発振器（６）はシース流体（３）に作用するため、ノズルオリフィス
（５）を出る流れ（８）は、最終的に正確に液滴（９）を形成する。粒子または
細胞は、流体流またはシース流体環境に取り囲まれるため、この液滴（９）は、
この環境内で別個に単離された粒子または細胞を巻き込み得、そして本発明のい
くつかの実施形態について、精子細胞であり得る。
【００５６】
液滴（９）は、粒子または細胞を巻き込み得るため、フローサイトメーターは
、粒子または細胞の特性に基づいて、粒子、細胞、精子細胞などを分離するため
に使用され得る。これは、粒子検出システムまたは細胞検出システム（１０）に
よって達成される。この粒子検出システムまたは細胞検出システムは、流体流（
８）内に含まれる粒子または細胞に応答する少なくともいくつかのタイプの検出
器またはセンサ（１１）を備える。この粒子検出システムまたは細胞検出システ
ム（１０）は、特性の相対的な存在または相対的な非存在（例えば、粒子が応答
性であり得る照射ビームを生成するレーザー励振器（１２）のような照射源によ
り励起され得る、粒子もしくは細胞、またはこの細胞内のＤＮＡに結合した蛍光
色素）に依存して作用を引き起こし得る。各タイプの粒子、細胞または精子細胞
の核ＤＮＡは、少なくとも１つのタイプの蛍光色素で染色され得るが、異なる量
の蛍光色素は、使用される特定のタイプの蛍光色素に利用可能な結合部位の数に
依存して、各別個の粒子または細胞に結合する。精子に関して、Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２染色の結合部位のアベイラビリティは、各精子内に含まれるＤＮＡの
量に依存する。Ｘ染色体保有精子は、Ｙ染色体保有精子より多くのＤＮＡを含む
ため、Ｘ染色体保有精子は、Ｙ染色体保有精子より多くの量の蛍光色素に結合し
得る。従って、励起の際に結合した蛍光色素によって放射される蛍光を測定する
ことによって、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子とを区別することが可能で
ある。
、粒子または細胞の特性に基づいて、粒子、細胞、精子細胞などを分離するため
に使用され得る。これは、粒子検出システムまたは細胞検出システム（１０）に
よって達成される。この粒子検出システムまたは細胞検出システムは、流体流（
８）内に含まれる粒子または細胞に応答する少なくともいくつかのタイプの検出
器またはセンサ（１１）を備える。この粒子検出システムまたは細胞検出システ
ム（１０）は、特性の相対的な存在または相対的な非存在（例えば、粒子が応答
性であり得る照射ビームを生成するレーザー励振器（１２）のような照射源によ
り励起され得る、粒子もしくは細胞、またはこの細胞内のＤＮＡに結合した蛍光
色素）に依存して作用を引き起こし得る。各タイプの粒子、細胞または精子細胞
の核ＤＮＡは、少なくとも１つのタイプの蛍光色素で染色され得るが、異なる量
の蛍光色素は、使用される特定のタイプの蛍光色素に利用可能な結合部位の数に
依存して、各別個の粒子または細胞に結合する。精子に関して、Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２染色の結合部位のアベイラビリティは、各精子内に含まれるＤＮＡの
量に依存する。Ｘ染色体保有精子は、Ｙ染色体保有精子より多くのＤＮＡを含む
ため、Ｘ染色体保有精子は、Ｙ染色体保有精子より多くの量の蛍光色素に結合し
得る。従って、励起の際に結合した蛍光色素によって放射される蛍光を測定する
ことによって、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子とを区別することが可能で
ある。
【００５７】
粒子または細胞の特性に基づいて分離および単離を達成するために、放射光が
センサ（１１）で受信され得、そして液滴（９）内に含まれる粒子または細胞の
特性に基づいて各液滴（９）を差示的に荷電する液滴荷電器（ｃｈａｒｇｅｒ）
に連結したあるタイプの分離区別システムまたは分析器（１３）に供給され得る
。このように、この分離区別システムまたは分析器（１３）は、液滴（９）が適
切な粒子または細胞を含むか否かに基づいて、静電偏向プレート（１４）が液滴
（９）を偏向させ得るように作用する。
センサ（１１）で受信され得、そして液滴（９）内に含まれる粒子または細胞の
特性に基づいて各液滴（９）を差示的に荷電する液滴荷電器（ｃｈａｒｇｅｒ）
に連結したあるタイプの分離区別システムまたは分析器（１３）に供給され得る
。このように、この分離区別システムまたは分析器（１３）は、液滴（９）が適
切な粒子または細胞を含むか否かに基づいて、静電偏向プレート（１４）が液滴
（９）を偏向させ得るように作用する。
【００５８】
結果として、フローサイトメーターは、粒子または細胞（１６）を１つ以上の
収集容器（１５）に方向付けることによって、この粒子または細胞（１６）を分
離するように作用する。例えば、分析器が精子細胞の特性に基づいて精子細胞を
区別する場合、Ｘ染色体保有精子と巻き込んでいる液滴は、正に荷電され得、従
って、一方向で偏向され、一方、Ｙ染色体保有精子を巻き込んでいる液滴は、負
に荷電され、従って他の方向に偏向され、そして廃液の流れ（ｗａｓｔｅｄ ｓ
ｔｒｅａｍ）（これは粒子または細胞を巻き込まないか、または所望でもなく選
別もされていない細胞と巻き込む液滴である）は、米国特許出願０９／００１，
３９４（本明細書中で参考として援用される）において考察されるように、無電
荷のままであり得、従って、偏向されていない流れで、吸引チューブ内などに収
集される。通常は、多数の偏向技術が確立され得、同時に収集され得る。
収集容器（１５）に方向付けることによって、この粒子または細胞（１６）を分
離するように作用する。例えば、分析器が精子細胞の特性に基づいて精子細胞を
区別する場合、Ｘ染色体保有精子と巻き込んでいる液滴は、正に荷電され得、従
って、一方向で偏向され、一方、Ｙ染色体保有精子を巻き込んでいる液滴は、負
に荷電され、従って他の方向に偏向され、そして廃液の流れ（ｗａｓｔｅｄ ｓ
ｔｒｅａｍ）（これは粒子または細胞を巻き込まないか、または所望でもなく選
別もされていない細胞と巻き込む液滴である）は、米国特許出願０９／００１，
３９４（本明細書中で参考として援用される）において考察されるように、無電
荷のままであり得、従って、偏向されていない流れで、吸引チューブ内などに収
集される。通常は、多数の偏向技術が確立され得、同時に収集され得る。
【００５９】
粒子、細胞、精子細胞または精子（インタクトな精子、生きた精子、固定され
た精子、可視の精子、非可視の精子、または核）を、高純度のＸ染色体保有集団
およびＹ染色体保有集団に慣用的に分離するために、使用される粒子分別装置ま
たは方法は、分析および分離の基準として使用される高分解能の分別特性を提供
しなければならない。
た精子、可視の精子、非可視の精子、または核）を、高純度のＸ染色体保有集団
およびＹ染色体保有集団に慣用的に分離するために、使用される粒子分別装置ま
たは方法は、分析および分離の基準として使用される高分解能の分別特性を提供
しなければならない。
【００６０】
精子に関して、Ｘ染色体保有精子細胞の核ＤＮＡに結合した蛍光色素により放
射される光と、Ｙ染色体保有精子細胞の核ＤＮＡに結合した蛍光色素により放射
される光との区別は上記のように困難であり得る。
射される光と、Ｙ染色体保有精子細胞の核ＤＮＡに結合した蛍光色素により放射
される光との区別は上記のように困難であり得る。
【００６１】
多くの用途において、検出器（これは、増倍型光電管であり得る）に投射する
光放射事象から放出される光の全ては多く、一方、区別される各光放射事象の放
射光の間の差異は小さい。この問題は、光放射事象が連続的に高速度で生じ、そ
して光放射事象の間の時間が短い場合（例えば、フローサイトメーターを使用す
る高速細胞選別の場合）に悪化し得る。結合した蛍光色素の差異に基づいて粒子
、細胞または精子細胞を分離する場合、細胞は励起源を通過して流れ、そして毎
秒多数の放射事象が確立され得る。結果として、粒子、細胞または精子細胞の流
れの中で生成される放射光の量は、非常に大量であり得る。この流れの速度が増
加するにつれて、励起源の遮断点は非常に明るくなる。増倍型光電管の光電陰極
にあたるこの高レベルの入射光は、非常に低い信号対バックグラウンド信号の比
を生じ得る。バックグラウンド信号の量は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２のような
蛍光色素が精子細胞の核ＤＮＡを標識するために使用され得る場合、さらに悪化
し得る。
光放射事象から放出される光の全ては多く、一方、区別される各光放射事象の放
射光の間の差異は小さい。この問題は、光放射事象が連続的に高速度で生じ、そ
して光放射事象の間の時間が短い場合（例えば、フローサイトメーターを使用す
る高速細胞選別の場合）に悪化し得る。結合した蛍光色素の差異に基づいて粒子
、細胞または精子細胞を分離する場合、細胞は励起源を通過して流れ、そして毎
秒多数の放射事象が確立され得る。結果として、粒子、細胞または精子細胞の流
れの中で生成される放射光の量は、非常に大量であり得る。この流れの速度が増
加するにつれて、励起源の遮断点は非常に明るくなる。増倍型光電管の光電陰極
にあたるこの高レベルの入射光は、非常に低い信号対バックグラウンド信号の比
を生じ得る。バックグラウンド信号の量は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２のような
蛍光色素が精子細胞の核ＤＮＡを標識するために使用され得る場合、さらに悪化
し得る。
【００６２】
この問題に対する最良の解決策は、増倍型光電管の前に光学フィルタを配置す
ることによって、光電陰極管にあたる光束の総量を減少することに集中してきた
。このアプローチは、信号対バックグラウンド信号の割合を変えず、そして倍増
型光電管の感度を上げるための引き続く試みは、この倍増型光電管がバックグラ
ウンド信号の量から飽和する場合に、さらなるバックグラウンド信号を生成する
。
ることによって、光電陰極管にあたる光束の総量を減少することに集中してきた
。このアプローチは、信号対バックグラウンド信号の割合を変えず、そして倍増
型光電管の感度を上げるための引き続く試みは、この倍増型光電管がバックグラ
ウンド信号の量から飽和する場合に、さらなるバックグラウンド信号を生成する
。
【００６３】
代表的に、倍増型光電管は、約４００ボルト〜約９００ボルトの範囲の作動電
圧を有する。標準的な倍増型光電管（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎから入手可能なＲ９２８およびＲ１４７７倍増型光電管）の線形作
動の下限は、約３００ボルトであり得る。このように、倍増型光電管を用いる装
置または機器は、このような倍増型光電管を４００ボルト以上で作動するように
構成される。アノードにおける電子の数を減少することが所望される場合でさえ
、米国特許第４，５０１，３６６号および同第５，８８０，４５７号に開示され
るように、光電陰極と第１のダイノードとの間の電圧は、高電圧に維持され、そ
してアノードにおける電子の減少は、残りのダイノードに対する電圧を下げるこ
とによって達成されるか、または固有のダークノイズまたはショットノイズが電
子的に濾光されるかのいずれかである。
圧を有する。標準的な倍増型光電管（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎから入手可能なＲ９２８およびＲ１４７７倍増型光電管）の線形作
動の下限は、約３００ボルトであり得る。このように、倍増型光電管を用いる装
置または機器は、このような倍増型光電管を４００ボルト以上で作動するように
構成される。アノードにおける電子の数を減少することが所望される場合でさえ
、米国特許第４，５０１，３６６号および同第５，８８０，４５７号に開示され
るように、光電陰極と第１のダイノードとの間の電圧は、高電圧に維持され、そ
してアノードにおける電子の減少は、残りのダイノードに対する電圧を下げるこ
とによって達成されるか、または固有のダークノイズまたはショットノイズが電
子的に濾光されるかのいずれかである。
【００６４】
予想外に、倍増型光電管に対する電圧の量を４００ボルト〜約２８０ボルトよ
り下、または約２５０ボルト、またはさらに０ボルトまで下げることにより、各
光放射事象により放射される全光が多い場合でさえ、または毎秒多数の明るい連
続的な事象が存在する場合でさえ、光放射光における小さな差異が区別され得る
。精子の核ＤＮＡに結合した蛍光色素の照射により生成する光放射事象の速度に
関して、本発明は、Ｘ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団への精子の分離の
間に達成され得る光放射事象の速度を、少なくとも５０００分離可能事象／秒、
少なくとも６０００分離可能事象／秒、少なくとも７０００分離可能事象／秒、
少なくとも８０００分離可能事象／秒、少なくとも９０００分離可能事象／秒、
少なくとも１０，０００分離可能事象／秒、少なくとも１１，０００分離可能事
象／秒、少なくとも１２，０００分離可能事象／秒、少なくとも１３，０００分
離可能事象／秒、少なくとも１４，０００分離可能事象／秒、少なくとも１５，
０００分離可能事象／秒、少なくとも１６，０００分離可能事象／秒、少なくと
も１７，０００分離可能事象／秒、少なくとも１８，０００分離可能事象／秒、
少なくとも１９，０００分離可能事象／秒、少なくとも２０，０００分離可能事
象／秒、少なくとも２５，０００分離可能事象／秒、少なくとも３０，０００分
離可能事象／秒、および少なくとも３５，０００分離可能事象／秒、またはそれ
を越えるの分離可能事象速度まで増加させ得る。
り下、または約２５０ボルト、またはさらに０ボルトまで下げることにより、各
光放射事象により放射される全光が多い場合でさえ、または毎秒多数の明るい連
続的な事象が存在する場合でさえ、光放射光における小さな差異が区別され得る
。精子の核ＤＮＡに結合した蛍光色素の照射により生成する光放射事象の速度に
関して、本発明は、Ｘ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団への精子の分離の
間に達成され得る光放射事象の速度を、少なくとも５０００分離可能事象／秒、
少なくとも６０００分離可能事象／秒、少なくとも７０００分離可能事象／秒、
少なくとも８０００分離可能事象／秒、少なくとも９０００分離可能事象／秒、
少なくとも１０，０００分離可能事象／秒、少なくとも１１，０００分離可能事
象／秒、少なくとも１２，０００分離可能事象／秒、少なくとも１３，０００分
離可能事象／秒、少なくとも１４，０００分離可能事象／秒、少なくとも１５，
０００分離可能事象／秒、少なくとも１６，０００分離可能事象／秒、少なくと
も１７，０００分離可能事象／秒、少なくとも１８，０００分離可能事象／秒、
少なくとも１９，０００分離可能事象／秒、少なくとも２０，０００分離可能事
象／秒、少なくとも２５，０００分離可能事象／秒、少なくとも３０，０００分
離可能事象／秒、および少なくとも３５，０００分離可能事象／秒、またはそれ
を越えるの分離可能事象速度まで増加させ得る。
【００６５】
特定の例として、既存のＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標
）ソーティングフローサイトメーターは、最低４００ボルトで、光電子増倍管を
操作するように構成される。利得は、低電圧ではなく、高電圧で光電子増倍管を
操作するように調節され得る。ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメー
ターは、光電子増倍制御装置を再構成することによって変換され得る。チャネル
スリー上のＲ１６Ｃレジスタ（２．４９キロオーム）は、２．０Ｋレジスタによ
って交換され、光電子増倍管を制御する増幅器の利得を変更する。この変換は、
光電子増倍管が約２８０ボルトで操作されるのを可能にした。並列の２つの３．
７５キロオームレジスタまたは１．３キロオームレジスタを有するＳＸ ＭｏＦ
ｌｏ（登録商標）フローサイトメーターの同様の変換は、光電子増倍管が、それ
ぞれ約２００ボルトの電圧または０ボルトのすぐ上で操作されることを可能にし
得る。また、この変換に関して、光電陰極の前の中性密度フィルターはまた、代
表的な操作電圧範囲外で、光電子増倍管を操作することの結果として除去され得
る。
）ソーティングフローサイトメーターは、最低４００ボルトで、光電子増倍管を
操作するように構成される。利得は、低電圧ではなく、高電圧で光電子増倍管を
操作するように調節され得る。ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメー
ターは、光電子増倍制御装置を再構成することによって変換され得る。チャネル
スリー上のＲ１６Ｃレジスタ（２．４９キロオーム）は、２．０Ｋレジスタによ
って交換され、光電子増倍管を制御する増幅器の利得を変更する。この変換は、
光電子増倍管が約２８０ボルトで操作されるのを可能にした。並列の２つの３．
７５キロオームレジスタまたは１．３キロオームレジスタを有するＳＸ ＭｏＦ
ｌｏ（登録商標）フローサイトメーターの同様の変換は、光電子増倍管が、それ
ぞれ約２００ボルトの電圧または０ボルトのすぐ上で操作されることを可能にし
得る。また、この変換に関して、光電陰極の前の中性密度フィルターはまた、代
表的な操作電圧範囲外で、光電子増倍管を操作することの結果として除去され得
る。
【００６６】
この変換は、光電子増倍管によって電子信号に変換されるので、予想外に光放
射性事象の信号対ノイズ比を増加する。次いで、よりきれいな信号は、分析器（
１３）のアナログ・デジタル変換器に対する利得増幅を、適切なレベルまで増加
することによって増幅され得、そして出力は、単変量または二変量のヒストグラ
ムとして作成され得る。
射性事象の信号対ノイズ比を増加する。次いで、よりきれいな信号は、分析器（
１３）のアナログ・デジタル変換器に対する利得増幅を、適切なレベルまで増加
することによって増幅され得、そして出力は、単変量または二変量のヒストグラ
ムとして作成され得る。
【００６７】
今ここで、図３を参照すると、本発明の使用の前に、３つの異なるＳＸ Ｍｏ
Ｆｌｏ（登録商標）フローサイトメーター（＃１、＃２、＃３）上で作成された
二変量ヒストグラムの比較（図１Ａ）、およびインタクトな生存射精ウシ精子の
分離に関して本発明を使用すること（図１Ｂ）が示される。単変量ヒストグラム
から理解され得るように、生存Ｙ染色体保有精子（１８）からのインタクトな生
存Ｘ染色体保有精子（１７）の分離能（ピーク間の谷によって示されるＹ染色体
保有集団からのＸ染色体保有集団の明らかな区別）は、本発明の使用によって実
質的に改善され得る。
Ｆｌｏ（登録商標）フローサイトメーター（＃１、＃２、＃３）上で作成された
二変量ヒストグラムの比較（図１Ａ）、およびインタクトな生存射精ウシ精子の
分離に関して本発明を使用すること（図１Ｂ）が示される。単変量ヒストグラム
から理解され得るように、生存Ｙ染色体保有精子（１８）からのインタクトな生
存Ｘ染色体保有精子（１７）の分離能（ピーク間の谷によって示されるＹ染色体
保有集団からのＸ染色体保有集団の明らかな区別）は、本発明の使用によって実
質的に改善され得る。
【００６８】
ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーターを用いる本発明のこの実
施形態の使用の前に、インタクトな生存精子の平均分離速度または選別速度は、
８４％〜９３％の純度の範囲を有し、約８７％の純度で、Ｘ染色体保有精子およ
びＹ染色体保有精子は共に約１７．９×１０６／４．５時間であった（すなわち
、２つの流れ（第１の流れのＸ染色体保有精子および第２の流れのＹ染色体保有
精子選別）の各々における１秒当り約１，１００個の分離または選別）。分離事
象の速度は、３回の選別について、それぞれ２２，０００、２３，０００、およ
び２０，０００であった。
施形態の使用の前に、インタクトな生存精子の平均分離速度または選別速度は、
８４％〜９３％の純度の範囲を有し、約８７％の純度で、Ｘ染色体保有精子およ
びＹ染色体保有精子は共に約１７．９×１０６／４．５時間であった（すなわち
、２つの流れ（第１の流れのＸ染色体保有精子および第２の流れのＹ染色体保有
精子選別）の各々における１秒当り約１，１００個の分離または選別）。分離事
象の速度は、３回の選別について、それぞれ２２，０００、２３，０００、およ
び２０，０００であった。
【００６９】
上記変換後の生存精子の平均選別速度は、８９％〜約９２％の純度の範囲を有
し、約９０．８％の純度で、約４０．３×１０６／４．５時間の選別（すなわち
、１つの流れ当り１秒当り約２，５００個の選別）であった。１秒当りの事象は
、３回の分離について、それぞれ１３，０００、１５，０００、および１９，５
００であった。
し、約９０．８％の純度で、約４０．３×１０６／４．５時間の選別（すなわち
、１つの流れ当り１秒当り約２，５００個の選別）であった。１秒当りの事象は
、３回の分離について、それぞれ１３，０００、１５，０００、および１９，５
００であった。
【００７０】
データから理解され得るように、本発明のこの実施形態は、分離された精子集
団の増加した純度を生じるだけでなく、分離速度または選別速度が２倍以上とな
ることを可能にしたが、分離可能事象の速度は、実際に減少した。
団の増加した純度を生じるだけでなく、分離速度または選別速度が２倍以上とな
ることを可能にしたが、分離可能事象の速度は、実際に減少した。
【００７１】
同様に、今ここで図４および５を参照し、これらは、本発明を使用する前（図
４）および上記変換後（図５）にＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメ
ーター＃１を用いてインタクトな雄性ウシ精子の選別の二変数のヒストグラムを
示す。本発明を使用する際に、最初に光電陰極で、１３５ＭＷに調整したレーザ
ーで、１×の利得でそして１．０（１０分の１の大きさ）の中性密度フィルター
を用いて、１秒当り約１０，０００事象で、ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フロ
ーサイトメーターを、４４０ボルトで操作した。本発明を使用する際に、光電陰
極で、約１００ｍＷに調整したレーザーで、４×の利得で、中性密度フィルター
を用いずに、１秒当り約１０，０００事象で、ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フ
ローサイトメーターを、２６２ボルトで操作した。このデータから理解され得る
ように、Ｘ染色体保有集団（１９）とＹ染色体保有集団（２０）との間の谷の増
加した深さによって示されるように、分離能における大きな増加が存在する。
４）および上記変換後（図５）にＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメ
ーター＃１を用いてインタクトな雄性ウシ精子の選別の二変数のヒストグラムを
示す。本発明を使用する際に、最初に光電陰極で、１３５ＭＷに調整したレーザ
ーで、１×の利得でそして１．０（１０分の１の大きさ）の中性密度フィルター
を用いて、１秒当り約１０，０００事象で、ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フロ
ーサイトメーターを、４４０ボルトで操作した。本発明を使用する際に、光電陰
極で、約１００ｍＷに調整したレーザーで、４×の利得で、中性密度フィルター
を用いずに、１秒当り約１０，０００事象で、ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フ
ローサイトメーターを、２６２ボルトで操作した。このデータから理解され得る
ように、Ｘ染色体保有集団（１９）とＹ染色体保有集団（２０）との間の谷の増
加した深さによって示されるように、分離能における大きな増加が存在する。
【００７２】
同様に、今ここで図６および７を参照し、これらは、本発明のこの実施形態を
使用する前（図６）および本発明のこの実施形態を使用する際（図７）に、それ
ぞれ図３および４において示される同じパラメータで操作されるＳＸ ＭｏＦｌ
ｏ（登録商標）フローサイトメーター＃２を用いてインタクトな雄性ウシ精子の
選別の二変数のヒストグラムを示す。再び、Ｘ染色体保有集団（２１）とＹ染色
体保有集団（２２）との間の谷の深さによって示されるように、分離能における
大きな増加が存在し得る。
使用する前（図６）および本発明のこの実施形態を使用する際（図７）に、それ
ぞれ図３および４において示される同じパラメータで操作されるＳＸ ＭｏＦｌ
ｏ（登録商標）フローサイトメーター＃２を用いてインタクトな雄性ウシ精子の
選別の二変数のヒストグラムを示す。再び、Ｘ染色体保有集団（２１）とＹ染色
体保有集団（２２）との間の谷の深さによって示されるように、分離能における
大きな増加が存在し得る。
【００７３】
今ここで図８および９を参照し、これらは、本発明のこの実施形態を使用する
前（図８）および本発明のこの実施形態を使用する際（図９）に、ＳＸ ＭｏＦ
ｌｏ（登録商標）フローサイトメーターを用いてインタクトなウマ精子の選別の
二変数のヒストグラムを示す。本発明のこの実施形態を使用する場合、生存ウマ
精子を、３００ボルト未満の光電子増倍管電圧で１００ｍＷのレーザー仕事率で
、分離または選別した。この分離速度または選別速度は、１秒当り１２，０００
事象で、１秒平均当り４，８００分類を超えた。増加した分離能のＸ染色体保有
集団（２３）およびＹ染色体保有集団（２４）が劇的である。データは、約８〜
約９チャネル分離が、本発明のこの実施形態を使用せず、ピーク間の５チャネル
の分離と比較される場合、本発明のこの実施形態を用いて達成される。選別され
たＸ染色体保有集団および選別されたＹ染色体保有集団の両方の純度は、約９３
％であった。
前（図８）および本発明のこの実施形態を使用する際（図９）に、ＳＸ ＭｏＦ
ｌｏ（登録商標）フローサイトメーターを用いてインタクトなウマ精子の選別の
二変数のヒストグラムを示す。本発明のこの実施形態を使用する場合、生存ウマ
精子を、３００ボルト未満の光電子増倍管電圧で１００ｍＷのレーザー仕事率で
、分離または選別した。この分離速度または選別速度は、１秒当り１２，０００
事象で、１秒平均当り４，８００分類を超えた。増加した分離能のＸ染色体保有
集団（２３）およびＹ染色体保有集団（２４）が劇的である。データは、約８〜
約９チャネル分離が、本発明のこの実施形態を使用せず、ピーク間の５チャネル
の分離と比較される場合、本発明のこの実施形態を用いて達成される。選別され
たＸ染色体保有集団および選別されたＹ染色体保有集団の両方の純度は、約９３
％であった。
【００７４】
今ここで、図１０を参照すると、これは、本発明のこの実施形態を使用して分
離されたＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色種馬核（Ｓ−０５４００）の選別の一変
数ヒストグラムおよび二変数ドットプロットを示す。核は、新しく射精された種
馬精子から分離した。精子は、遠心分離によって洗浄し、超音波処理し、そして
得られた頭部および尾部を、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を使用して分離し
た。単離された頭部を洗浄し、２％ホルマリンで固定し、次いでＨｏｅｃｈｓｔ
３３３４２で染色した。染色した核を、アジ化ナトリウム（０．５％）を使用し
て安定化した。サンプルを、１秒当り５０００事象で実行してヒストグラムを生
成する。次いで、染色した核を使用して、ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フロー
サイトメーターを校正し、これを、本発明の光電子増倍管の実施形態を組み込む
ために、上記のように変換した。２つの集団（Ｘ染色核およびＹ染色核）を合わ
せるために、二変数プロットにおいて補償を使用した。ウマ精子核の２つの集団
は、一変数プロットによって示されるように、基線に対してほぼ十分に分離され
る。
離されたＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色種馬核（Ｓ−０５４００）の選別の一変
数ヒストグラムおよび二変数ドットプロットを示す。核は、新しく射精された種
馬精子から分離した。精子は、遠心分離によって洗浄し、超音波処理し、そして
得られた頭部および尾部を、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を使用して分離し
た。単離された頭部を洗浄し、２％ホルマリンで固定し、次いでＨｏｅｃｈｓｔ
３３３４２で染色した。染色した核を、アジ化ナトリウム（０．５％）を使用し
て安定化した。サンプルを、１秒当り５０００事象で実行してヒストグラムを生
成する。次いで、染色した核を使用して、ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フロー
サイトメーターを校正し、これを、本発明の光電子増倍管の実施形態を組み込む
ために、上記のように変換した。２つの集団（Ｘ染色核およびＹ染色核）を合わ
せるために、二変数プロットにおいて補償を使用した。ウマ精子核の２つの集団
は、一変数プロットによって示されるように、基線に対してほぼ十分に分離され
る。
【００７５】
今ここで、図１１を参照すると、ＳＸ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイト
メーターについての特異的な改変は、１．８Ｋの正確な値を提供するように並列
の２つのレジスタの使用を含む。２つの３．５７Ｋレジスタ（２５）および（２
６）は、効果的である値の十分近くに存在し得る約１．７８５Ｋに等しい。次い
で、この改変を用いて、この特定の機器上の光電子増倍管は、約２００ボルトで
実行され得る。自然には、同様の改変が、他のフローサイトメーター機器、また
は特定の事象から放射される光の量を測定するために光電子増倍管を使用する他
の機器に対してなされ得る。図１２は、本発明のこの特定の実施形態についての
電気的回路図を提供する。
メーターについての特異的な改変は、１．８Ｋの正確な値を提供するように並列
の２つのレジスタの使用を含む。２つの３．５７Ｋレジスタ（２５）および（２
６）は、効果的である値の十分近くに存在し得る約１．７８５Ｋに等しい。次い
で、この改変を用いて、この特定の機器上の光電子増倍管は、約２００ボルトで
実行され得る。自然には、同様の改変が、他のフローサイトメーター機器、また
は特定の事象から放射される光の量を測定するために光電子増倍管を使用する他
の機器に対してなされ得る。図１２は、本発明のこの特定の実施形態についての
電気的回路図を提供する。
【００７６】
本発明の別の重要な実施形態は、減少した高さの照射ビームパターン光学要素
であり得る。図１３Ａによって示されるように、従来の照射ビーム形状光学要素
は、これを通過する精子細胞の頭部（２８）の高さよりもはるかに大きい高さを
有し得るビームパターン（２７）を生成する。結果として、蛍光色素結合ＤＮＡ
を含む１つより多い精子細胞の頭部は、同時に照射ビームパターンに侵入し得る
。この場合において、複数の精子頭部に含まれるＤＮＡに結合した蛍光色素は、
同時に励起され得、そして単一の放射事象内で蛍光を発する。このようなものと
して、先のかまたは引き続く放射事象は、ビームパターン（２７）中の他の精子
頭部に起因する同時発生的光フラックスを含み得る。これは、Ｘ染色体保有精子
とＹ染色体保有精子との間を区別する光放射事象間で、平均光フラックスにおい
て減少した差異を生じる。これはまた、Ｘ染色体保有精子またはＹ染色体保有精
子の光放射を比較する事象間で、平均光フラックスにおける差異を減少し得る。
重要なことには、多数のＤＮＡに結合された蛍光色素の同時発生的な励起が、よ
り小さい割合の放射された総光フラックス事象間でさえ、事象間の光フラックス
における測定可能な差異を作成する事象の平均輝度を増加する。これは、事象間
の差異の定量をより困難にする。
であり得る。図１３Ａによって示されるように、従来の照射ビーム形状光学要素
は、これを通過する精子細胞の頭部（２８）の高さよりもはるかに大きい高さを
有し得るビームパターン（２７）を生成する。結果として、蛍光色素結合ＤＮＡ
を含む１つより多い精子細胞の頭部は、同時に照射ビームパターンに侵入し得る
。この場合において、複数の精子頭部に含まれるＤＮＡに結合した蛍光色素は、
同時に励起され得、そして単一の放射事象内で蛍光を発する。このようなものと
して、先のかまたは引き続く放射事象は、ビームパターン（２７）中の他の精子
頭部に起因する同時発生的光フラックスを含み得る。これは、Ｘ染色体保有精子
とＹ染色体保有精子との間を区別する光放射事象間で、平均光フラックスにおい
て減少した差異を生じる。これはまた、Ｘ染色体保有精子またはＹ染色体保有精
子の光放射を比較する事象間で、平均光フラックスにおける差異を減少し得る。
重要なことには、多数のＤＮＡに結合された蛍光色素の同時発生的な励起が、よ
り小さい割合の放射された総光フラックス事象間でさえ、事象間の光フラックス
における測定可能な差異を作成する事象の平均輝度を増加する。これは、事象間
の差異の定量をより困難にする。
【００７７】
図１３Ｂによって示されるように、ビーム形状の高さを減少することによって
、同じ測定事象の間に減少した高さのビーム（２９）パターン内にある多数の精
子頭部の発生率は減少する。これは、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子との
間を区別する光放射事象間の増加した平均差異を生じる。これはまた、各測定放
射事象についての平均総光フラックスを減少し得る。約９μｍの核を有するウシ
精子を選別するために使用される本発明の特定の実施形態について、ビームの高
さは、約２０μｍであり得ることが見出されている。本願において、２０μｍ未
満の高さの垂直ビームは、分離能においてさらなる利得を提供しなかったことが
見出されている。
、同じ測定事象の間に減少した高さのビーム（２９）パターン内にある多数の精
子頭部の発生率は減少する。これは、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子との
間を区別する光放射事象間の増加した平均差異を生じる。これはまた、各測定放
射事象についての平均総光フラックスを減少し得る。約９μｍの核を有するウシ
精子を選別するために使用される本発明の特定の実施形態について、ビームの高
さは、約２０μｍであり得ることが見出されている。本願において、２０μｍ未
満の高さの垂直ビームは、分離能においてさらなる利得を提供しなかったことが
見出されている。
【００７８】
図１４を参照すると、減少した高さの照射ビームパターン光学要素は、Ｈｏｅ
ｃｈｓｔ３３３４２染色で染色した、Ｘ染色体保有ウシ精子の分類された集団（
図１４Ａ）とＹ染色体保有ウシ精子の分類された集団（図１４Ｂ）の純度を改善
し得る。これは、２５％および４０％の選別ゲートの単変量ピークの両方につい
てあてはまる。図１４からさらに理解され得るように、減少した高さのビームパ
ターン光学要素は、本発明の任意の他の局面（例えば、上記のような本発明の光
電子増倍管回路の実施形態の改変（新たなＰＭＴ）のような）に独立した分離さ
れた精子の純度を改善し得るか、またはなおさらに分離された精子サンプルの純
度を増加するために本発明の改変された光電子増倍管の実施形態と組み合わせて
使用され得る。
ｃｈｓｔ３３３４２染色で染色した、Ｘ染色体保有ウシ精子の分類された集団（
図１４Ａ）とＹ染色体保有ウシ精子の分類された集団（図１４Ｂ）の純度を改善
し得る。これは、２５％および４０％の選別ゲートの単変量ピークの両方につい
てあてはまる。図１４からさらに理解され得るように、減少した高さのビームパ
ターン光学要素は、本発明の任意の他の局面（例えば、上記のような本発明の光
電子増倍管回路の実施形態の改変（新たなＰＭＴ）のような）に独立した分離さ
れた精子の純度を改善し得るか、またはなおさらに分離された精子サンプルの純
度を増加するために本発明の改変された光電子増倍管の実施形態と組み合わせて
使用され得る。
【００７９】
減少した高さのビームパターン光学要素の別の利点は、励起レーザービームま
たは照射ビームにおける精子の通過時間が減少され得ることであり得る。励起レ
ーザービーム中の減少した量の照射時間は、精子に対してより少ないストレスま
たは損傷を生じる。
たは照射ビームにおける精子の通過時間が減少され得ることであり得る。励起レ
ーザービーム中の減少した量の照射時間は、精子に対してより少ないストレスま
たは損傷を生じる。
【００８０】
再度、図１４Ｂを参照すれば、低い高さのビームパターンが、従来用いられて
いるものより大きい面積を有する照射ビームパターンと組み合わせて用いられ得
ることが理解され得る。例えば、図１４Ａに示されるような、従来のビームパタ
ーン（２７）は、約３０μｍ×８０μｍの楕円形のパターンを有するが、本発明
は、ウシの精子を選別するために用いる場合、このビームが、２０μｍ×１６０
μｍのビームパターン（２９）を有するときに、Ｘ染色体保有集団とＹ染色体保
有集団との間に至適の解像度を生成する。２０μｍ×１６０μｍのビームパター
ンは、３０μｍ×８０μｍのビームパターンの面積の約１．３倍を有する。従っ
て、入射光点でのエネルギーの損失において反比例が存在し得る。これによって
、精子に対する照射ダメージを増大する懸念なしに励起レーザーパワーを増大す
ることが可能になる。例えば、装置が３０μｍ×８０μｍの照射ビームパターン
を生成する従来のビームシェイビング光学要素を有し、そして励起レーザーが１
５０ｍＷで従来的に出力されれば、２０μｍ×１６０μｍのビームパターンを有
する本発明の特定の実施形態は、入射光点でのパワーの総量を増大することなく
、３００ｍＷで出力された励起レーザーを有し得る。あるいは、この励起レーザ
ーを、１５０ｍＷで実行して、単位面積あたりのより低い照射エネルギー、照射
ダメージの減少、レーザー寿命の延長、などを利用し得る。
いるものより大きい面積を有する照射ビームパターンと組み合わせて用いられ得
ることが理解され得る。例えば、図１４Ａに示されるような、従来のビームパタ
ーン（２７）は、約３０μｍ×８０μｍの楕円形のパターンを有するが、本発明
は、ウシの精子を選別するために用いる場合、このビームが、２０μｍ×１６０
μｍのビームパターン（２９）を有するときに、Ｘ染色体保有集団とＹ染色体保
有集団との間に至適の解像度を生成する。２０μｍ×１６０μｍのビームパター
ンは、３０μｍ×８０μｍのビームパターンの面積の約１．３倍を有する。従っ
て、入射光点でのエネルギーの損失において反比例が存在し得る。これによって
、精子に対する照射ダメージを増大する懸念なしに励起レーザーパワーを増大す
ることが可能になる。例えば、装置が３０μｍ×８０μｍの照射ビームパターン
を生成する従来のビームシェイビング光学要素を有し、そして励起レーザーが１
５０ｍＷで従来的に出力されれば、２０μｍ×１６０μｍのビームパターンを有
する本発明の特定の実施形態は、入射光点でのパワーの総量を増大することなく
、３００ｍＷで出力された励起レーザーを有し得る。あるいは、この励起レーザ
ーを、１５０ｍＷで実行して、単位面積あたりのより低い照射エネルギー、照射
ダメージの減少、レーザー寿命の延長、などを利用し得る。
【００８１】
従来のビームシェイビング光学要素および従来の光電子増倍管増幅デバイスと
比べて、本発明の低い高さのビームパターン光学要素、および本発明の光電子増
倍管増幅は、約４％以上まで、精子のＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団
の純度を増大し得る。
比べて、本発明の低い高さのビームパターン光学要素、および本発明の光電子増
倍管増幅は、約４％以上まで、精子のＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団
の純度を増大し得る。
【００８２】
本発明のビームシェイビング光学要素（３０）は、図１５および１６に示され
るように、フローサイトメーターに組み込まれ得る。理解されるように、精子内
に含まれるＤＮＡに結合した蛍光色素のレーザー励起によって放出された光（３
１）は、励起レーザービームパターンを通じてフローするとき、精子頭部の平坦
表面（２８）に対して０度および９０度で位置された光電子増倍管（３２）によ
って検出され得る。
るように、フローサイトメーターに組み込まれ得る。理解されるように、精子内
に含まれるＤＮＡに結合した蛍光色素のレーザー励起によって放出された光（３
１）は、励起レーザービームパターンを通じてフローするとき、精子頭部の平坦
表面（２８）に対して０度および９０度で位置された光電子増倍管（３２）によ
って検出され得る。
【００８３】
理解されるように、染色された精子は、各精子の頭部が光電子増倍管（０度検
出器である）に向ったその精子頭部の平坦表面にそって配向されるように、正確
な様式で励起ビームまたは照射ビームによって操作されなければならない。精子
のＤＮＡ含量の正確な測定は、パドル形状の精子頭部（２８）の平坦表面からの
み測定され得る。従って、適切な方向で励起ビームを入れる精子の割合のみが、
正確に測定され、そしてＤＮＡ含量に基づいて選別され得る。
出器である）に向ったその精子頭部の平坦表面にそって配向されるように、正確
な様式で励起ビームまたは照射ビームによって操作されなければならない。精子
のＤＮＡ含量の正確な測定は、パドル形状の精子頭部（２８）の平坦表面からの
み測定され得る。従って、適切な方向で励起ビームを入れる精子の割合のみが、
正確に測定され、そしてＤＮＡ含量に基づいて選別され得る。
【００８４】
ここで、図１７、１８、および１９を参照すれば、本発明の特定の実施形態は
また、精子頭部が、光電子増倍管の前面を通過するとき、この平坦化された精子
頭部を適切な方向に水力学的に強制する、粒子または精子細胞配向ノズル（３３
）を有し得る。図１７に示されるように、この配向ノズルは、円錐様形状を形成
する内部表面（３４）を有する。内部円錐（コーン）は、円形（入り口末端（３
５））から、非常に楕円形の形状（流れが先端を出すオリフィス（３６）の近位
）まで徐々に変化する。このオリフィス（３６）は、楕円ではなくて円形であり
得る。従って配向ノズル（３４）の内部局面は、丸い入り口から、狭い長円へ、
オリフィス（３６）の直前の丸い出口へとなる。この内部形状は、図１８に示さ
れる配向ノズルの断面図によって、さらに明確にされる。
また、精子頭部が、光電子増倍管の前面を通過するとき、この平坦化された精子
頭部を適切な方向に水力学的に強制する、粒子または精子細胞配向ノズル（３３
）を有し得る。図１７に示されるように、この配向ノズルは、円錐様形状を形成
する内部表面（３４）を有する。内部円錐（コーン）は、円形（入り口末端（３
５））から、非常に楕円形の形状（流れが先端を出すオリフィス（３６）の近位
）まで徐々に変化する。このオリフィス（３６）は、楕円ではなくて円形であり
得る。従って配向ノズル（３４）の内部局面は、丸い入り口から、狭い長円へ、
オリフィス（３６）の直前の丸い出口へとなる。この内部形状は、図１８に示さ
れる配向ノズルの断面図によって、さらに明確にされる。
【００８５】
図１９および２１に示されるように、注入チューブ（３７）（直径約０．０６
１インチであり得る）は、チップ(先端）の近位に円味をつけられてブレード（
３８）を形成し得る配向ノズル（または従来のノズル）（３３）とともに用いら
れ得る。平坦化されたブレード（３８）は、配向ノズル（３３）における長円の
最大直径から９０度の角度で配向され得る。注入ニードル（針）の内径は、約０
．０１０インチであり得、平坦化されたニードルチューブブレード（３８）の中
心において丸くされたオリフィス（３９）を形成する。
１インチであり得る）は、チップ(先端）の近位に円味をつけられてブレード（
３８）を形成し得る配向ノズル（または従来のノズル）（３３）とともに用いら
れ得る。平坦化されたブレード（３８）は、配向ノズル（３３）における長円の
最大直径から９０度の角度で配向され得る。注入ニードル（針）の内径は、約０
．０１０インチであり得、平坦化されたニードルチューブブレード（３８）の中
心において丸くされたオリフィス（３９）を形成する。
【００８６】
円味をつけられた注入チューブの特定の実施形態において、この円味をつけら
れたブレードは、図２１に例示されるパドル形状に構成される。このパドル形状
の円味をつけられたブレードは、ノズル（従来のノズルでも配向ノズルでも）内
のシース流体の層流（ラミナーフロー）を維持するのを補助し得る。従って、パ
ドル形状の円味をつけられたブレードによって維持された流体の層流は、それに
注入された物体の破壊を少なくする。パドル形状の円味をつけられたブレードを
有する本発明の注入チューブの実施形態によって維持されたシース流体の層流に
導入された精子によって、従来の注入チューブの技術を上回って、精子選別速度
における２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより大きい増大が可能にな
る。１秒間あたり、各性の約４，０００〜約１０，０００選別という速度の高速
の精子選別が達成され得る。このような高速の選別でさえ、高純度（９０％以上
）のＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団が達成され得る。円味をつけられ
たパドル形状の先端を有する本発明の注入チューブは、本明細書に記載される他
の発明、または他の技術（例えば、それぞれが、本明細書において参考として援
用されている、米国特許出願第０９／４５４，４８８号、または国際特許出願番
号ＰＣＴ／ＵＳ００／４２３５０に記載の技術）とは独立して、または組み合わ
せて用いられ得る。
れたブレードは、図２１に例示されるパドル形状に構成される。このパドル形状
の円味をつけられたブレードは、ノズル（従来のノズルでも配向ノズルでも）内
のシース流体の層流（ラミナーフロー）を維持するのを補助し得る。従って、パ
ドル形状の円味をつけられたブレードによって維持された流体の層流は、それに
注入された物体の破壊を少なくする。パドル形状の円味をつけられたブレードを
有する本発明の注入チューブの実施形態によって維持されたシース流体の層流に
導入された精子によって、従来の注入チューブの技術を上回って、精子選別速度
における２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより大きい増大が可能にな
る。１秒間あたり、各性の約４，０００〜約１０，０００選別という速度の高速
の精子選別が達成され得る。このような高速の選別でさえ、高純度（９０％以上
）のＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団が達成され得る。円味をつけられ
たパドル形状の先端を有する本発明の注入チューブは、本明細書に記載される他
の発明、または他の技術（例えば、それぞれが、本明細書において参考として援
用されている、米国特許出願第０９／４５４，４８８号、または国際特許出願番
号ＰＣＴ／ＵＳ００／４２３５０に記載の技術）とは独立して、または組み合わ
せて用いられ得る。
【００８７】
図２１に示されるように、本発明の円味をつけられたブレード注入チューブ、
または本発明の円味をつけられたブレードパドル形状の特定の実施形態は、さら
に層流増強溝（グルーブ）（４０）を含み得る。この層流増強溝（４０）は、注
入チューブのオリフィスへ層流を維持することを補助する。再度、この増強され
た層流によって、さらに多くの精子がラミナーシース流体フロー中で正しい方向
を維持することが可能になり、さらに多数の選別可能事象速度を生じ、これが次
に、各性または精子について、さらに高速の選別をもたらす。
または本発明の円味をつけられたブレードパドル形状の特定の実施形態は、さら
に層流増強溝（グルーブ）（４０）を含み得る。この層流増強溝（４０）は、注
入チューブのオリフィスへ層流を維持することを補助する。再度、この増強され
た層流によって、さらに多くの精子がラミナーシース流体フロー中で正しい方向
を維持することが可能になり、さらに多数の選別可能事象速度を生じ、これが次
に、各性または精子について、さらに高速の選別をもたらす。
【００８８】
本発明の別の実施形態において、配向ノズルオリフィス（３９）または他の従
来のものを、サイズ決めして、精子がオリフィス（３９）を出る場合に、インタ
クトな生きた精子をカプセル化する液滴を形成し得る。精子細胞のカプセル化は
、従来の精子細胞巻き込み技術では生じない。精子細胞の尾部のかなりの部分が
液滴の外側に残る。例えば、ウシ精子細胞は、この流体流が１平方インチあたり
約５０ポンドの圧力を有する場合、約１３．５マイクロ秒の長さ（すなわち、１
平方インチあたり約５０ポンドの流体流圧力で、精子細胞の長さ全体が、この照
射ビームを通過する時間の長さ）を有する。ウシ精子細胞を運搬するための従来
の液滴形成技術は、約３５キロヘルツで操作されたオシレータに対して反応性と
なり得る、約７０マイクロメートルの直径を有するオリフィスを有するノズルか
ら１４マイクロ秒（すなわち、流体流中で単一の液滴波形を形成するのにかかる
時間）の液滴を確立する。このような精子細胞の尾部の一部は、液滴から容易に
突き出る。この液滴から精子細胞が突き出ることを防ぐために、本発明の液滴カ
プセル化の１つの実施形態は、約３０キロヘルツで、１平方インチあたり約５０
ポンドで、約２８マイクロ秒の液滴を形成し得る約１００マイクロメートルのオ
リフィスを提供する。尾部を含む、インタクトな生きた精子細胞を全体としてカ
プセル化することにより、この精子細胞は、この液滴の充填の際にノズルとの相
互作用が低下し、そして液滴の偏向がさらに正確になり得る。これによって、Ｘ
染色体保有精子とＹ染色体保有精子とに交差汚染が減り、そしてまた偏向した精
子をさらに均一に収集することが可能になる。均一に偏向している精子は、種々
の流体によって衝撃を和らげられる収集表面に指向され得る。分離した精子の衝
撃を和らげることは、本明細書において参考として援用されている米国特許出願
第０９／００１，３９４号に記載のように、ストレスを低下するのに重要であり
得る。他の種の哺乳動物由来の精子に関して、本発明は、種々の長さの精子細胞
をカプセル化する液滴サイズを生成するように変化され得る。精子の長さおよび
流体流の圧力に依存して、本発明の液滴カプセル化はなお、本発明の液滴カプセ
ル化のいくつかの実施形態において、１秒間あたり、少なくとも１０，０００液
滴、１秒間あたり少なくとも２０，０００液滴、１秒間あたり、少なくとも３０
，０００液滴、１秒間あたり少なくとも４０，０００液滴、１秒間あたり、少な
くとも５０，０００液滴、１秒間あたり少なくとも６０，０００液滴、１秒間あ
たり、少なくとも７０，０００液滴、１秒間あたり少なくとも８０，０００液滴
、１秒間あたり、少なくとも９０，０００液滴、１秒間あたり少なくとも１００
，０００液滴、および以下同様に１秒間あたり、少なくとも２００，０００液滴
の液滴形成速度を達成し得る。
来のものを、サイズ決めして、精子がオリフィス（３９）を出る場合に、インタ
クトな生きた精子をカプセル化する液滴を形成し得る。精子細胞のカプセル化は
、従来の精子細胞巻き込み技術では生じない。精子細胞の尾部のかなりの部分が
液滴の外側に残る。例えば、ウシ精子細胞は、この流体流が１平方インチあたり
約５０ポンドの圧力を有する場合、約１３．５マイクロ秒の長さ（すなわち、１
平方インチあたり約５０ポンドの流体流圧力で、精子細胞の長さ全体が、この照
射ビームを通過する時間の長さ）を有する。ウシ精子細胞を運搬するための従来
の液滴形成技術は、約３５キロヘルツで操作されたオシレータに対して反応性と
なり得る、約７０マイクロメートルの直径を有するオリフィスを有するノズルか
ら１４マイクロ秒（すなわち、流体流中で単一の液滴波形を形成するのにかかる
時間）の液滴を確立する。このような精子細胞の尾部の一部は、液滴から容易に
突き出る。この液滴から精子細胞が突き出ることを防ぐために、本発明の液滴カ
プセル化の１つの実施形態は、約３０キロヘルツで、１平方インチあたり約５０
ポンドで、約２８マイクロ秒の液滴を形成し得る約１００マイクロメートルのオ
リフィスを提供する。尾部を含む、インタクトな生きた精子細胞を全体としてカ
プセル化することにより、この精子細胞は、この液滴の充填の際にノズルとの相
互作用が低下し、そして液滴の偏向がさらに正確になり得る。これによって、Ｘ
染色体保有精子とＹ染色体保有精子とに交差汚染が減り、そしてまた偏向した精
子をさらに均一に収集することが可能になる。均一に偏向している精子は、種々
の流体によって衝撃を和らげられる収集表面に指向され得る。分離した精子の衝
撃を和らげることは、本明細書において参考として援用されている米国特許出願
第０９／００１，３９４号に記載のように、ストレスを低下するのに重要であり
得る。他の種の哺乳動物由来の精子に関して、本発明は、種々の長さの精子細胞
をカプセル化する液滴サイズを生成するように変化され得る。精子の長さおよび
流体流の圧力に依存して、本発明の液滴カプセル化はなお、本発明の液滴カプセ
ル化のいくつかの実施形態において、１秒間あたり、少なくとも１０，０００液
滴、１秒間あたり少なくとも２０，０００液滴、１秒間あたり、少なくとも３０
，０００液滴、１秒間あたり少なくとも４０，０００液滴、１秒間あたり、少な
くとも５０，０００液滴、１秒間あたり少なくとも６０，０００液滴、１秒間あ
たり、少なくとも７０，０００液滴、１秒間あたり少なくとも８０，０００液滴
、１秒間あたり、少なくとも９０，０００液滴、１秒間あたり少なくとも１００
，０００液滴、および以下同様に１秒間あたり、少なくとも２００，０００液滴
の液滴形成速度を達成し得る。
【００８９】
本発明の配向ノズルを用いてさえ、ビームパターンで適切に配向されていない
、特定の数の精子、または粒子が存在する。上記のように、精子頭部の方向が適
切でなければ、ＤＮＡ含量は、放射光に基づいて正確に測定され得ない。本発明
の特定の実施形態は、流体流中の所望されない配向されていない精子（ＲＵＵＳ
）または粒子の除去を提供する。
、特定の数の精子、または粒子が存在する。上記のように、精子頭部の方向が適
切でなければ、ＤＮＡ含量は、放射光に基づいて正確に測定され得ない。本発明
の特定の実施形態は、流体流中の所望されない配向されていない精子（ＲＵＵＳ
）または粒子の除去を提供する。
【００９０】
ここで、図１６および２０Ａを参照すれば、精子のＤＮＡ含量の正確な測定は
、検出器で適切に配向されているパドル形状の精子頭部（２８）の平坦表面に依
存することが理解され得る。従って、図１６および２０Ａに示されるように、適
切な方向で励起ビームに入る精子の割合のみが正確に測定され得、そしてＤＮＡ
含量に基づいてＮ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団に選別され得る。図２
０Ａおよび２０Ｂによって示されるように、適切な方向で励起ビームを通過する
精子は、配向された放射信号プロット（４０）を生成し、このプロットは、図２
０Ｄによって示される、配向されていない精子によって生成される配向されてい
ない放射信号プロット（４１）とは異なった形状であり得る。当然、配向されて
いない精子によって生成される配向されていない放射信号プロット（４１）の形
状は、励起ビームにおける不適切な方向の程度によって変化する。これらの不適
切な方向は、図２０Ｃに示される方向を含み得るが、また精子頭部を回転させる
全ての様式の方向（検出器による整列（図１６に適切な整列を示す）以外のパド
ル形状の頭部の表面を配向する回転の任意の部分、またはフローの方向にそった
整列以外の精子頭部（４２）の軸を配向する回転の任意の部分）を含み得る。当
然、適切な方向は、種間で異なって規定され得る。精子頭部がパドル形状でない
、いくつかの種については、励起ビーム内の（または検出器に対する）適切な方
向は、さもなければ、他の解剖学的特徴または信号特徴によって規定され得る。
それにもかかわらず、励起ウインドウ内の種々の種の適切に配向された精子につ
いての至適の信号は、連続する放射事象との引き続く比較のための標準的な放射
信号プロットとして生成され得る。
、検出器で適切に配向されているパドル形状の精子頭部（２８）の平坦表面に依
存することが理解され得る。従って、図１６および２０Ａに示されるように、適
切な方向で励起ビームに入る精子の割合のみが正確に測定され得、そしてＤＮＡ
含量に基づいてＮ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団に選別され得る。図２
０Ａおよび２０Ｂによって示されるように、適切な方向で励起ビームを通過する
精子は、配向された放射信号プロット（４０）を生成し、このプロットは、図２
０Ｄによって示される、配向されていない精子によって生成される配向されてい
ない放射信号プロット（４１）とは異なった形状であり得る。当然、配向されて
いない精子によって生成される配向されていない放射信号プロット（４１）の形
状は、励起ビームにおける不適切な方向の程度によって変化する。これらの不適
切な方向は、図２０Ｃに示される方向を含み得るが、また精子頭部を回転させる
全ての様式の方向（検出器による整列（図１６に適切な整列を示す）以外のパド
ル形状の頭部の表面を配向する回転の任意の部分、またはフローの方向にそった
整列以外の精子頭部（４２）の軸を配向する回転の任意の部分）を含み得る。当
然、適切な方向は、種間で異なって規定され得る。精子頭部がパドル形状でない
、いくつかの種については、励起ビーム内の（または検出器に対する）適切な方
向は、さもなければ、他の解剖学的特徴または信号特徴によって規定され得る。
それにもかかわらず、励起ウインドウ内の種々の種の適切に配向された精子につ
いての至適の信号は、連続する放射事象との引き続く比較のための標準的な放射
信号プロットとして生成され得る。
【００９１】
哺乳動物のうちの１種の配向された精子について確立された、各発光信号プロ
ットの形状（または積分された面積もしくはその両方）を標準発光信号プロット
（または積分された面積もしくはその両方）と比較することによって、配向され
ていない精子が同定され得（単変量分布ヒストグラムまたは二変量分布ヒストグ
ラムから差し引かれた信号）、そして配向されていない精子が、肯定的に除去さ
れ得、その結果、所望される場合、配向されていない精子は、Ｘ染色体保有集団
もＹ染色体保有集団もいずれも収集されない。
ットの形状（または積分された面積もしくはその両方）を標準発光信号プロット
（または積分された面積もしくはその両方）と比較することによって、配向され
ていない精子が同定され得（単変量分布ヒストグラムまたは二変量分布ヒストグ
ラムから差し引かれた信号）、そして配向されていない精子が、肯定的に除去さ
れ得、その結果、所望される場合、配向されていない精子は、Ｘ染色体保有集団
もＹ染色体保有集団もいずれも収集されない。
【００９２】
重要なことに、本発明は、分離される２つの精子集団間の分解能（この分解能
は、これらの集団が互いに分離され得る速度を増加する）を改善し、そして分離
される集団の純度を改善したことである。従って、ここで、精子を非常に速い速
度で選別することが可能になった。選別可能事象速度または分離可能事象速度は
、約３５，０００／秒もの速さが可能であった（同時事象（同じ時間での励起／
検出ウィンドウ内における複数の精子）は含まない）。選別可能事象速度または
分離可能事象速度は、９０％、９２％、９３％、９５％、またはそれより高い純
度での、１秒当たり約５０００〜約１１，０００個の各性のインタクトな生存精
子であり得る高い分離速度または選別速度と相関する。上記の本発明はまた、さ
らにより高い純度のＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団が、選別速度また
は分離速度を１秒当たり約２０００個の各性の生存精子に低下させることによっ
て、約９７％〜約９８％またはより高い％で得られることを可能にする。
は、これらの集団が互いに分離され得る速度を増加する）を改善し、そして分離
される集団の純度を改善したことである。従って、ここで、精子を非常に速い速
度で選別することが可能になった。選別可能事象速度または分離可能事象速度は
、約３５，０００／秒もの速さが可能であった（同時事象（同じ時間での励起／
検出ウィンドウ内における複数の精子）は含まない）。選別可能事象速度または
分離可能事象速度は、９０％、９２％、９３％、９５％、またはそれより高い純
度での、１秒当たり約５０００〜約１１，０００個の各性のインタクトな生存精
子であり得る高い分離速度または選別速度と相関する。上記の本発明はまた、さ
らにより高い純度のＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団が、選別速度また
は分離速度を１秒当たり約２０００個の各性の生存精子に低下させることによっ
て、約９７％〜約９８％またはより高い％で得られることを可能にする。
【００９３】
理解され得るように、上記の本発明は、最も高い可能性のある選別可能事象速
度または最も高い可能性のある分離可能事象速度および最も高い可能性のある生
じる分離速度を達成する際に特に重要であり、この分離速度は、１秒当たり少な
くとも１，０００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも２，０００個の各性の
分離、１秒当たり少なくとも３，０００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも
４，０００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも５，０００個の各性の分離、
１秒当たり少なくとも６，０００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも７，０
００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも８，０００個の各性の分離、１秒当
たり少なくとも９，０００個の各性の分離、または１秒当たり少なくとも１０，
０００個の各性の分離であり得る。
度または最も高い可能性のある分離可能事象速度および最も高い可能性のある生
じる分離速度を達成する際に特に重要であり、この分離速度は、１秒当たり少な
くとも１，０００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも２，０００個の各性の
分離、１秒当たり少なくとも３，０００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも
４，０００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも５，０００個の各性の分離、
１秒当たり少なくとも６，０００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも７，０
００個の各性の分離、１秒当たり少なくとも８，０００個の各性の分離、１秒当
たり少なくとも９，０００個の各性の分離、または１秒当たり少なくとも１０，
０００個の各性の分離であり得る。
【００９４】
本発明は、上記に示されるように、精子を染色することが困難な場合でさえも
、他の解剖学的特徴もしくは化学特徴を有していても（これらは、Ｘ保有染色体
集団とＹ保有染色体集団との間の区別をより困難にする）、精子の高速選別を可
能にする。これら困難な場合でさえ、ウシ精子の高純度Ｘ染色体保有集団および
Ｙ染色体保有集団が、上記のように、１秒当たり約１５，０００〜２０，０００
個の選別可能事象またはより高い個数での選別可能事象の選別可能事象速度、な
らびに１秒当たり２０００個の各性のインタクトな生存精子での各性（Ｘ染色体
保有およびＹ染色体保有）のインタクトな生存精子の選別速度または分離速度を
達成することによって、９２％〜９３％の高純度で単離され得る。
、他の解剖学的特徴もしくは化学特徴を有していても（これらは、Ｘ保有染色体
集団とＹ保有染色体集団との間の区別をより困難にする）、精子の高速選別を可
能にする。これら困難な場合でさえ、ウシ精子の高純度Ｘ染色体保有集団および
Ｙ染色体保有集団が、上記のように、１秒当たり約１５，０００〜２０，０００
個の選別可能事象またはより高い個数での選別可能事象の選別可能事象速度、な
らびに１秒当たり２０００個の各性のインタクトな生存精子での各性（Ｘ染色体
保有およびＹ染色体保有）のインタクトな生存精子の選別速度または分離速度を
達成することによって、９２％〜９３％の高純度で単離され得る。
【００９５】
ここで、図２３および２４を参照して、本発明の実施形態は、差示的干渉コン
トラスト技術を利用して、粒子またはカプセルの容量を測定する。本発明の基本
的な実施形態は、異なる容量を有する粒子（例えば、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ
染色体保有精子細胞との間の容量において差異を有する精子細胞ヘッド（２８）
）を含み得る。電磁照射源（４３）は、粒子間または精子細胞ヘッド（２８）間
の容量における差異に差示的に反応性である初期波形特徴を有する、電磁照射ま
たは電磁照射のビーム（４４）を生成する。電磁照射は、レーザー光であり得る
が、多数の型の電磁照射（マイクロ波照射、紫外線照射などを含むが、これらに
限定されない）でもあり得る。位相シフト材料を含む粒子またはカプセルまたは
精子ヘッド容量をトラバースする際、電磁照射は、電磁照射の波形特徴に応答し
て検出器（４６）上の対物レンズ（４５）を通して焦点を当て得る。検出器は、
分析器（４７）に連結され得る。分析器は、粒子の容量をトラバースする前およ
び粒子の容量をトラバースした後に波形特徴における変化に基づいて粒子間を区
別し得、そして積分面積もしくは信号形状またはその両方に基づいて信号を分析
し得る。特定の実施形態において、波形特徴を分析する本発明は、粒子、カプセ
ル、または精子細胞ヘッドの容量をトラバースする際に、初期波形特徴を変更さ
れた波形特徴と重ねあわせる工程を包含し得る。初期波形特徴と位相シフトした
波形特徴の重ねあわせは、電磁照射がトラバースする位相シフト媒体の量と相関
する様式で、電磁照射のビームの強度を差示的に調節し得る。本発明はまた、さ
らなるフィルター（４８）（例えば、カラーフィルタ）を含み得る。
トラスト技術を利用して、粒子またはカプセルの容量を測定する。本発明の基本
的な実施形態は、異なる容量を有する粒子（例えば、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ
染色体保有精子細胞との間の容量において差異を有する精子細胞ヘッド（２８）
）を含み得る。電磁照射源（４３）は、粒子間または精子細胞ヘッド（２８）間
の容量における差異に差示的に反応性である初期波形特徴を有する、電磁照射ま
たは電磁照射のビーム（４４）を生成する。電磁照射は、レーザー光であり得る
が、多数の型の電磁照射（マイクロ波照射、紫外線照射などを含むが、これらに
限定されない）でもあり得る。位相シフト材料を含む粒子またはカプセルまたは
精子ヘッド容量をトラバースする際、電磁照射は、電磁照射の波形特徴に応答し
て検出器（４６）上の対物レンズ（４５）を通して焦点を当て得る。検出器は、
分析器（４７）に連結され得る。分析器は、粒子の容量をトラバースする前およ
び粒子の容量をトラバースした後に波形特徴における変化に基づいて粒子間を区
別し得、そして積分面積もしくは信号形状またはその両方に基づいて信号を分析
し得る。特定の実施形態において、波形特徴を分析する本発明は、粒子、カプセ
ル、または精子細胞ヘッドの容量をトラバースする際に、初期波形特徴を変更さ
れた波形特徴と重ねあわせる工程を包含し得る。初期波形特徴と位相シフトした
波形特徴の重ねあわせは、電磁照射がトラバースする位相シフト媒体の量と相関
する様式で、電磁照射のビームの強度を差示的に調節し得る。本発明はまた、さ
らなるフィルター（４８）（例えば、カラーフィルタ）を含み得る。
【００９６】
ここで、図２４を参照して、本光学発明の実施形態は、顕微鏡の分解限界に対
応する従来のＤＩＣ顕微鏡と比較して、光が分裂する実際の距離を増加する差示
的干渉コントラスト光学要素を使用することを含む。本発明のこの実施形態にお
いて、誘導された分裂は、物体のサイズよりも大きく、従って、１つの物体から
生じる側方に分離した２つの個々の画像が生じる。第２の改変は、複屈折材料の
プレート（例えば、Ｓａｖａｒｔプレート）を、対物レンズから離れた位置で使
用することを含む。本発明のこの実施形態は、構築がより簡単である。なぜなら
、複屈折材料は、対物ハウジングの内側に配置される必要が無いからである。従
来のＤＩＣ顕微鏡は、複屈折材料が、Ｗｏｌｌａｓｔｏｎプリズムと呼ばれる形
態で使用され、これは、対物ハウジングの内側に配置されるなければならず、こ
れによって、この目的のために特別に製造された高価な対物レンズを使用するこ
とが必要になっていた。
応する従来のＤＩＣ顕微鏡と比較して、光が分裂する実際の距離を増加する差示
的干渉コントラスト光学要素を使用することを含む。本発明のこの実施形態にお
いて、誘導された分裂は、物体のサイズよりも大きく、従って、１つの物体から
生じる側方に分離した２つの個々の画像が生じる。第２の改変は、複屈折材料の
プレート（例えば、Ｓａｖａｒｔプレート）を、対物レンズから離れた位置で使
用することを含む。本発明のこの実施形態は、構築がより簡単である。なぜなら
、複屈折材料は、対物ハウジングの内側に配置される必要が無いからである。従
来のＤＩＣ顕微鏡は、複屈折材料が、Ｗｏｌｌａｓｔｏｎプリズムと呼ばれる形
態で使用され、これは、対物ハウジングの内側に配置されるなければならず、こ
れによって、この目的のために特別に製造された高価な対物レンズを使用するこ
とが必要になっていた。
【００９７】
本発明の実施形態の構成要素は、互いに整列して配置され得、そして以下から
なる：電磁照射源（４３）、例えば、水銀アークランプ；スペクトル調整エレメ
ント、例えば、帯域フィルタ；偏光調整エレメント（４９）、例えば、回転可能
なマウントに応答したシートポーラライザー（５３）および波長板（５４）；光
が粒子または精子細胞上に集光することを可能にする光コンデンサ（５１）、例
えば、コンデンサレンズ、またはレンズセット、または顕微鏡対物レンズ；粒子
または精子細胞（２８）を含み得る流体流れ（８）、例えば、圧力下で排出され
る流体噴射；粒子または細胞からの光を収集する光収集器（４５）、例えば、５
０倍率の動作距離の顕微鏡対物レンズおよび管レンズ；ビームを２つ以上の成分
に分裂させるビームスプリッタ（５０）、例えば、その配向および位置が正確に
制御され得るような方法でマウントされた、Ｓａｖａｒｔプレートの形態での一
片の複屈折材料；粒子または精子細胞に対応する光のみを選択するための画像光
セレクター（５５）、例えば、ピンホールのセット、形成される画像の各々につ
いての１つのピンホール（５３）。
なる：電磁照射源（４３）、例えば、水銀アークランプ；スペクトル調整エレメ
ント、例えば、帯域フィルタ；偏光調整エレメント（４９）、例えば、回転可能
なマウントに応答したシートポーラライザー（５３）および波長板（５４）；光
が粒子または精子細胞上に集光することを可能にする光コンデンサ（５１）、例
えば、コンデンサレンズ、またはレンズセット、または顕微鏡対物レンズ；粒子
または精子細胞（２８）を含み得る流体流れ（８）、例えば、圧力下で排出され
る流体噴射；粒子または細胞からの光を収集する光収集器（４５）、例えば、５
０倍率の動作距離の顕微鏡対物レンズおよび管レンズ；ビームを２つ以上の成分
に分裂させるビームスプリッタ（５０）、例えば、その配向および位置が正確に
制御され得るような方法でマウントされた、Ｓａｖａｒｔプレートの形態での一
片の複屈折材料；粒子または精子細胞に対応する光のみを選択するための画像光
セレクター（５５）、例えば、ピンホールのセット、形成される画像の各々につ
いての１つのピンホール（５３）。
【００９８】
本発明の１つの実施形態において、構成要素は、光源（４３）またはその画像
が光コンデンサ（４５）（しばしば、ケーラー型イルミネーションと称される）
の後方焦平面に位置するように、配置され得る。物体平面の画像は、個々の粒子
または精子細胞からの光を捕獲するために、対物光セレクター（５５）またはピ
ンホール（５３）と最良に一致し得る。図２７および２８に示されるように、構
成要素は、マウンティング、ポスト、およびホルダーを用いて、頑丈な光学台ま
たはベンチ上にマウントされ得る。成分は、物体平面の焦点が正確になされ得る
ような様式で、マウントされ得る。これは、流れを焦点の中に入れるかまたは焦
点の外に出すために、流体流れに流れ位置制御装置（例えば、マイクロメーター
）をを備えることによってなされ得る。さらに、光コンデンサ（５１）に光コン
デンサ位置制御装置（６１）を備えて、光コンデンサが物体平面上に焦点を当て
ることを可能にすることが、必要であり得る。複屈折エレメントまたはビームス
プリッタ（５０）のマウンティングに関して特別の注意を払うことが必要であり
得、３軸回転エレメントが、好ましくあり得る。
が光コンデンサ（４５）（しばしば、ケーラー型イルミネーションと称される）
の後方焦平面に位置するように、配置され得る。物体平面の画像は、個々の粒子
または精子細胞からの光を捕獲するために、対物光セレクター（５５）またはピ
ンホール（５３）と最良に一致し得る。図２７および２８に示されるように、構
成要素は、マウンティング、ポスト、およびホルダーを用いて、頑丈な光学台ま
たはベンチ上にマウントされ得る。成分は、物体平面の焦点が正確になされ得る
ような様式で、マウントされ得る。これは、流れを焦点の中に入れるかまたは焦
点の外に出すために、流体流れに流れ位置制御装置（例えば、マイクロメーター
）をを備えることによってなされ得る。さらに、光コンデンサ（５１）に光コン
デンサ位置制御装置（６１）を備えて、光コンデンサが物体平面上に焦点を当て
ることを可能にすることが、必要であり得る。複屈折エレメントまたはビームス
プリッタ（５０）のマウンティングに関して特別の注意を払うことが必要であり
得、３軸回転エレメントが、好ましくあり得る。
【００９９】
ここで、図２５を参照して、本発明の実施形態はまた、流体流れ中の非対称粒
子（これには、ウシ精子細胞などの精子が挙げられるが、これらに限定されない
）の配向を決定するための、作製された両画像の使用を含み得る。本発明の配向
評価の実施形態は、独立して作製された両画像について光学系に入る偏光状態の
光の制御を可能にする光学系を含み得る。本干渉光学発明はさらに、この系に入
る偏光状態の光を制御する、偏光調整エレメント（５６）を提供し得る。本配向
検出発明に関して、偏光調整エレメント（５６）は、このエレメントが２つの部
分（これらは、本発明の１つの実施形態においてピンホール（５３）を含む画像
光セレクター（５５）上に、投影される）からなるような様式で選択され得る。
これは、画像平面の結合面（５５）中に偏光調整エレメント（５６）を配置する
か、または同じことを達成するための他の光学要素を用いることによって、達成
され得る。この成分の単純な例は、例えば、偏光材料（シートポーラライザー）
の２つの半環状部分（これらの配向角は、独立して選択され得る）からなる「ハ
ーフシェード」部分であり得る。像平面中の各ピンホールは、同じ半球体の半分
のうちの１つに入り得る。偏光角は、１つのピンホール（５３）の信号が容量に
対応し、そして通過する物体の配向角から相対的に独立し、そして他のピンホー
ル（５３）がこの配向角に大きな程度依存する信号を有するような様式で、選択
され得る。２つの信号は、従来のマルチチャンネルフローサイトメトリーと類似
の様式で分析器（４７）によって処理され得る（しかしこれは、１つの例である
）。この例に関して、二変量ドットプロットが作製され得、そしてまた、ユーザ
ーがこのプロット上のウィンドウを選択することを可能にする。
子（これには、ウシ精子細胞などの精子が挙げられるが、これらに限定されない
）の配向を決定するための、作製された両画像の使用を含み得る。本発明の配向
評価の実施形態は、独立して作製された両画像について光学系に入る偏光状態の
光の制御を可能にする光学系を含み得る。本干渉光学発明はさらに、この系に入
る偏光状態の光を制御する、偏光調整エレメント（５６）を提供し得る。本配向
検出発明に関して、偏光調整エレメント（５６）は、このエレメントが２つの部
分（これらは、本発明の１つの実施形態においてピンホール（５３）を含む画像
光セレクター（５５）上に、投影される）からなるような様式で選択され得る。
これは、画像平面の結合面（５５）中に偏光調整エレメント（５６）を配置する
か、または同じことを達成するための他の光学要素を用いることによって、達成
され得る。この成分の単純な例は、例えば、偏光材料（シートポーラライザー）
の２つの半環状部分（これらの配向角は、独立して選択され得る）からなる「ハ
ーフシェード」部分であり得る。像平面中の各ピンホールは、同じ半球体の半分
のうちの１つに入り得る。偏光角は、１つのピンホール（５３）の信号が容量に
対応し、そして通過する物体の配向角から相対的に独立し、そして他のピンホー
ル（５３）がこの配向角に大きな程度依存する信号を有するような様式で、選択
され得る。２つの信号は、従来のマルチチャンネルフローサイトメトリーと類似
の様式で分析器（４７）によって処理され得る（しかしこれは、１つの例である
）。この例に関して、二変量ドットプロットが作製され得、そしてまた、ユーザ
ーがこのプロット上のウィンドウを選択することを可能にする。
【０１００】
上記の「ハーフシェード」断片の改善は、図２５Ｄによって示される構築であ
り得る。同じこの２半球体部分は、像平面上に投影されるが、これらが作製され
る方法は、異なる。鏡（５７）は、光（４４）を半円形部分に分解し、そして背
中あわせに再結合する。半分の各々は、別々の手段をトラバースして、その偏光
状態を制御する。この実施形態の利点は、偏光角が連続的かつ独立して制御され
得ることであり得、従って、セットアップの調整を容易にする。本実施形態に使
用される材料は、標準的な光学供給会社によって供給され得、そして干渉計光学
について使用されるマウンティング材料と類似のマウンティング材料を用いて、
セットアップにおいてマウントされ得る。
り得る。同じこの２半球体部分は、像平面上に投影されるが、これらが作製され
る方法は、異なる。鏡（５７）は、光（４４）を半円形部分に分解し、そして背
中あわせに再結合する。半分の各々は、別々の手段をトラバースして、その偏光
状態を制御する。この実施形態の利点は、偏光角が連続的かつ独立して制御され
得ることであり得、従って、セットアップの調整を容易にする。本実施形態に使
用される材料は、標準的な光学供給会社によって供給され得、そして干渉計光学
について使用されるマウンティング材料と類似のマウンティング材料を用いて、
セットアップにおいてマウントされ得る。
【０１０１】
ここで、図２６を参照して、光を透明材料の非平面領域（例えば、実質的に円
筒状（しかし、他のジオメトリーもまた含む）の流体流れ）を通過させることに
よって導入されるアーティファクトを補正するために、本発明の実施形態は、形
は非平面領域に類似するが相対屈折率に関して正反対である構成要素の組み込み
を開示する。フローサイトメーターの特定の場合、この形状は、円筒状に近づく
。評価される物体が水の円筒状流れ内に配置される事実によって導入されるアー
ティファクトについて補正するために、透明な円筒状の形状であり得る光学成分
（５８）の組み込みを、より高い屈折率の透明材料（５９）内に配置する。流れ
の画像および補償エレメントの画像が、像平面において互いに頂部にあることが
好ましくあり得る。これは、対物レンズと像平面との間に補償エレメントを配置
することによって、および補助レンズを組み込むことによってなされ得る。
筒状（しかし、他のジオメトリーもまた含む）の流体流れ）を通過させることに
よって導入されるアーティファクトを補正するために、本発明の実施形態は、形
は非平面領域に類似するが相対屈折率に関して正反対である構成要素の組み込み
を開示する。フローサイトメーターの特定の場合、この形状は、円筒状に近づく
。評価される物体が水の円筒状流れ内に配置される事実によって導入されるアー
ティファクトについて補正するために、透明な円筒状の形状であり得る光学成分
（５８）の組み込みを、より高い屈折率の透明材料（５９）内に配置する。流れ
の画像および補償エレメントの画像が、像平面において互いに頂部にあることが
好ましくあり得る。これは、対物レンズと像平面との間に補償エレメントを配置
することによって、および補助レンズを組み込むことによってなされ得る。
【０１０２】
光学要素（５８）の実施形態は、それを横切って開けられた円柱状の穴を有す
る、より高い屈折率の透明な材料の薄いスライス（５９）（例えば、ガラスまた
はパースペクス）内に位置決めされ得る。パースペクスは、その中に円形のチャ
ネルを開けるのがより容易であり得るという利点を有する。この円柱状の穴は、
透明な材料で充填され得、その材料の屈折率は、周辺の材料の屈折率よりも低い
。物質と周辺材料との間の屈折率における差は、特定の適用について、流動中の
水と周辺空気との間の屈折率における差と同じであるが反対であり得る。使用す
るレンズの倍率が、画面中に生じる画像を同じサイズにする限り、シリンダを水
の流れと同じサイズにする必要はなくてよい。いくつかの適用において、屈折率
の差を調整してこの倍率を補正することが所望され得るかまたは必要であり得る
。このようなパースペクスの外側のエレメントの製造は、極めて単純であり得、
そしてパースペクスまたは選択された材料を機械加工した経験を有する多くの機
械工場でなされ得る。それは、光学部材への組み込みを容易にするために、それ
が標準的な光学マウンティングハードウェアに適合するような寸法になされ得る
。
る、より高い屈折率の透明な材料の薄いスライス（５９）（例えば、ガラスまた
はパースペクス）内に位置決めされ得る。パースペクスは、その中に円形のチャ
ネルを開けるのがより容易であり得るという利点を有する。この円柱状の穴は、
透明な材料で充填され得、その材料の屈折率は、周辺の材料の屈折率よりも低い
。物質と周辺材料との間の屈折率における差は、特定の適用について、流動中の
水と周辺空気との間の屈折率における差と同じであるが反対であり得る。使用す
るレンズの倍率が、画面中に生じる画像を同じサイズにする限り、シリンダを水
の流れと同じサイズにする必要はなくてよい。いくつかの適用において、屈折率
の差を調整してこの倍率を補正することが所望され得るかまたは必要であり得る
。このようなパースペクスの外側のエレメントの製造は、極めて単純であり得、
そしてパースペクスまたは選択された材料を機械加工した経験を有する多くの機
械工場でなされ得る。それは、光学部材への組み込みを容易にするために、それ
が標準的な光学マウンティングハードウェアに適合するような寸法になされ得る
。
【０１０３】
屈折率を正確に適合させることは、困難であり得る。調整を容易にする本発明
の１つの実施形態は、物質をパースペクスの内側の物質または他の選択された材
料を、透明な屈折率流体（５８）（１つの例として、有機油）、または所望の屈
折率に近い屈折率を有する油の混合物にすることであり得る。ほとんどの流体の
屈折率が、固体またはガラスよりもはるかに、温度と共に変化するという事実に
起因して、温度による屈折率における差を微調整することが可能であり得る。こ
れは、温度制御装置（６０）を組み込むことによってなされ得る。
の１つの実施形態は、物質をパースペクスの内側の物質または他の選択された材
料を、透明な屈折率流体（５８）（１つの例として、有機油）、または所望の屈
折率に近い屈折率を有する油の混合物にすることであり得る。ほとんどの流体の
屈折率が、固体またはガラスよりもはるかに、温度と共に変化するという事実に
起因して、温度による屈折率における差を微調整することが可能であり得る。こ
れは、温度制御装置（６０）を組み込むことによってなされ得る。
【０１０４】
透明な流体または屈折率流体の光学要素（５８）は、化学品供給会社によって
供給され得る。これらの会社は、しばしば、容易に入手可能な、それらの流体の
屈折率に関するデータを有する。いくつかの会社はさらに、屈折率流体として作
用するように特別に作製され、保証された安定な屈折率を有する流体を提供する
。温度制御装置およびサーモスタットは、多くの会社によって供給される。屈折
率流体に熱を適用するための実用的な方法は、熱伝導材料（１つの例として、金
属）から作製された、屈折率流体を含む、中空マウンティングを使用することで
あり得る。多くの実験室に見られる、従来の液浸サーモスタットサイクラーを使
用して、水は、マウンティングを通してポンプされ、従って、要素を一定かつ制
御可能な温度に維持し得る。
供給され得る。これらの会社は、しばしば、容易に入手可能な、それらの流体の
屈折率に関するデータを有する。いくつかの会社はさらに、屈折率流体として作
用するように特別に作製され、保証された安定な屈折率を有する流体を提供する
。温度制御装置およびサーモスタットは、多くの会社によって供給される。屈折
率流体に熱を適用するための実用的な方法は、熱伝導材料（１つの例として、金
属）から作製された、屈折率流体を含む、中空マウンティングを使用することで
あり得る。多くの実験室に見られる、従来の液浸サーモスタットサイクラーを使
用して、水は、マウンティングを通してポンプされ、従って、要素を一定かつ制
御可能な温度に維持し得る。
【０１０５】
このＰＣＴ出願に含まれる議論は、基本的な説明としての役割を果たすことが
意図される。読者は、この特定の議論が明らかに全ての可能な実施形態を記載し
なくともよく；多くの代替物が暗に示されていることを認識する。この議論はま
た、本発明の一般的な性質について十分に説明しなくともよいし、そして各特徴
または要素が、実際に、より広い機能またはより多くの種々の代替のエレメント
または等価なエレメントをどのように示し得るか明示しなくともよい。
意図される。読者は、この特定の議論が明らかに全ての可能な実施形態を記載し
なくともよく；多くの代替物が暗に示されていることを認識する。この議論はま
た、本発明の一般的な性質について十分に説明しなくともよいし、そして各特徴
または要素が、実際に、より広い機能またはより多くの種々の代替のエレメント
または等価なエレメントをどのように示し得るか明示しなくともよい。
【０１０６】
再度、これらは本明細書中に暗に含まれる。本発明は、機能的に方向付けられ
た専門用語で記載されており、この機能の各局面は、デバイス、サブルーチン、
またはプログラムにより達成される。装置に関する請求項は、記載されるデバイ
スについて含まれるだけでなく、本発明および各エレメントが発揮する機能を包
含する方法またはプロセスに関する請求項もまた含まれ得る。説明も専門用語も
ここに含まれる特許請求の範囲を限定することを意図しない。
た専門用語で記載されており、この機能の各局面は、デバイス、サブルーチン、
またはプログラムにより達成される。装置に関する請求項は、記載されるデバイ
スについて含まれるだけでなく、本発明および各エレメントが発揮する機能を包
含する方法またはプロセスに関する請求項もまた含まれ得る。説明も専門用語も
ここに含まれる特許請求の範囲を限定することを意図しない。
【０１０７】
さらに、本発明および特許請求の範囲の種々のエレメントの各々はまた、種々
の様式で達成され得る。この開示は、任意の装置の実施形態、方法またはプロセ
スの実施形態の実施形態のバリエーションであるようなバリエーションの各々、
またはこれらの任意のエレメントの単なるバリエーションでさえも含むように理
解されるべきである。特に、本発明のエレメントに関する開示に関して、各エレ
メントについての単語は、等価な装置用語または方法用語により表わされ得る（
たとえ、その機能または結果のみが同一であったとしても）ことを理解されるべ
きである。このような等価な用語、より広範な用語、またはより一般的な用語で
さえも、各エレメントまたは作用の説明に含まれるとみなされるべきである。こ
のような用語は、本発明に権利を与える暗に広い範囲を明確にすることが所望さ
れる場合、置換され得る。１つの例にすぎないが、全ての作用は、その作用を取
得するための手段としてか、またはその作用を生じる手段として表わされること
が理解されるべきである。同様に、開示される各々の物理的なエレメントは、そ
の物理的なエレメントが促進する作用の開示を含むように理解されるべきである
。この最後の局面に関して、１つの例にすぎないが、「液滴分離器」の開示は、
明確に議論されているか否かに関わらず、「液滴を分離」する作用の開示を含む
ことを理解されるべきであり、そして逆に、「液体−気体を変換」する作用の開
示のみが存在する場合、このような開示は、「液滴分離器」の開示および「液滴
を分離」するための手段の開示さえも含むことを理解されるべきである。このよ
うな変更および代替的な用語は、本明細書中に明確に含まれることを理解される
べきである。
の様式で達成され得る。この開示は、任意の装置の実施形態、方法またはプロセ
スの実施形態の実施形態のバリエーションであるようなバリエーションの各々、
またはこれらの任意のエレメントの単なるバリエーションでさえも含むように理
解されるべきである。特に、本発明のエレメントに関する開示に関して、各エレ
メントについての単語は、等価な装置用語または方法用語により表わされ得る（
たとえ、その機能または結果のみが同一であったとしても）ことを理解されるべ
きである。このような等価な用語、より広範な用語、またはより一般的な用語で
さえも、各エレメントまたは作用の説明に含まれるとみなされるべきである。こ
のような用語は、本発明に権利を与える暗に広い範囲を明確にすることが所望さ
れる場合、置換され得る。１つの例にすぎないが、全ての作用は、その作用を取
得するための手段としてか、またはその作用を生じる手段として表わされること
が理解されるべきである。同様に、開示される各々の物理的なエレメントは、そ
の物理的なエレメントが促進する作用の開示を含むように理解されるべきである
。この最後の局面に関して、１つの例にすぎないが、「液滴分離器」の開示は、
明確に議論されているか否かに関わらず、「液滴を分離」する作用の開示を含む
ことを理解されるべきであり、そして逆に、「液体−気体を変換」する作用の開
示のみが存在する場合、このような開示は、「液滴分離器」の開示および「液滴
を分離」するための手段の開示さえも含むことを理解されるべきである。このよ
うな変更および代替的な用語は、本明細書中に明確に含まれることを理解される
べきである。
【０１０８】
さらに、全てのエレメントまたは適用の種々の組み合わせおよび順列が、作成
および提示され得る。全ては、特定の適用における設計または性能を最適化する
ためになされ得る。
および提示され得る。全ては、特定の適用における設計または性能を最適化する
ためになされ得る。
【０１０９】
本特許出願において言及された法律、法令、規定または規則の任意の効果、ま
たは本特許出願において言及された特許、刊行物または他の引用文献は、参考と
して本明細書によって援用される。詳細には、米国特許出願第６０／２６７５７
１号、同第６０／２３９，７５２号、および同第６０／２０３，０８９号は、任
意の図または添付書類を含んで、各々、本明細書中に参考として本明細書によっ
て援用され、そして以下の参考文献の表中の各参考文献は、参考として本明細書
によって援用される。
たは本特許出願において言及された特許、刊行物または他の引用文献は、参考と
して本明細書によって援用される。詳細には、米国特許出願第６０／２６７５７
１号、同第６０／２３９，７５２号、および同第６０／２０３，０８９号は、任
意の図または添付書類を含んで、各々、本明細書中に参考として本明細書によっ
て援用され、そして以下の参考文献の表中の各参考文献は、参考として本明細書
によって援用される。
【０１１０】
【表１】
さらに、使用される各用語に関して、本出願におけるその利用が、このような
解釈と矛盾しない限り、一般的な辞書の定義が、各用語および全ての定義につい
て含まれるように理解され、ランダムハウスウェブスター大辞典（第２版）に含
まれるような代替的な用語および同義語が、参考として本明細書中に援用される
ことが、理解される。しかし、上記の各々に関して、このような参考として援用
される情報および記載が、この／これらの発明の特許化と矛盾するとみなされう
る程度にまで、このような記載が、本出願人によってなされたものとして明らか
にみなされるべきではない。
解釈と矛盾しない限り、一般的な辞書の定義が、各用語および全ての定義につい
て含まれるように理解され、ランダムハウスウェブスター大辞典（第２版）に含
まれるような代替的な用語および同義語が、参考として本明細書中に援用される
ことが、理解される。しかし、上記の各々に関して、このような参考として援用
される情報および記載が、この／これらの発明の特許化と矛盾するとみなされう
る程度にまで、このような記載が、本出願人によってなされたものとして明らか
にみなされるべきではない。
【０１１１】
さらに、その内容が必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ま
たは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」
のような変化形は、言及されたエレメントまたは工程あるいはエレメントまたは
工程のグループを包含することを意味するが、任意の他のエレメントまたは工程
あるいはエレメントまたは工程のグループを排除することを意味しないことが意
図される。このような用語は、オーストラリアなどの国々において法的に許可さ
れ得る最も広い範囲を本出願人に付与するように、その最も拡大した形態で解釈
されるべきである。
たは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」
のような変化形は、言及されたエレメントまたは工程あるいはエレメントまたは
工程のグループを包含することを意味するが、任意の他のエレメントまたは工程
あるいはエレメントまたは工程のグループを排除することを意味しないことが意
図される。このような用語は、オーストラリアなどの国々において法的に許可さ
れ得る最も広い範囲を本出願人に付与するように、その最も拡大した形態で解釈
されるべきである。
【０１１２】
従って、本出願人は、少なくとも以下を特許請求するための支持を有すること
が理解されるべきである：ｉ）本明細書中に記載の液体−気体変換デバイスの各
々；ｉｉ）開示および記載される関連する方法、ｉｉｉ）これらのデバイスおよ
び方法の各々の、類似のバリエーション、等価なバリエーション、およびさらに
は暗黙のバリエーション、ｉｖ）開示および記載されるその示された機能の各々
を達成する、それらの代替的な設計、ｖ）開示および記載される事を達成するこ
とが暗示されるような示された機能の各々を達成する、それらの代替的な設計お
よび方法、ｖｉ）別個のかつ独立した発明として示される、各々の特徴、要素、
および工程、ｖｉｉ）開示される種々のシステムまたは要素によって向上される
適用、ｖｉｉ）このようなシステムまたは要素によって生成される、得られた生
成物、ｉｘ）本明細書中上記に実質的に記載され、そして任意の添付の実施例に
関する、方法および装置、ならびにｘ）開示される各々のエレメントの種々の組
み合わせおよび順序。
が理解されるべきである：ｉ）本明細書中に記載の液体−気体変換デバイスの各
々；ｉｉ）開示および記載される関連する方法、ｉｉｉ）これらのデバイスおよ
び方法の各々の、類似のバリエーション、等価なバリエーション、およびさらに
は暗黙のバリエーション、ｉｖ）開示および記載されるその示された機能の各々
を達成する、それらの代替的な設計、ｖ）開示および記載される事を達成するこ
とが暗示されるような示された機能の各々を達成する、それらの代替的な設計お
よび方法、ｖｉ）別個のかつ独立した発明として示される、各々の特徴、要素、
および工程、ｖｉｉ）開示される種々のシステムまたは要素によって向上される
適用、ｖｉｉ）このようなシステムまたは要素によって生成される、得られた生
成物、ｉｘ）本明細書中上記に実質的に記載され、そして任意の添付の実施例に
関する、方法および装置、ならびにｘ）開示される各々のエレメントの種々の組
み合わせおよび順序。
【０１１３】
さらに、その内容が必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ま
たは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」
のような変化形は、言及されたエレメントまたは工程あるいはエレメントまたは
工程のグループを包含することを意味するが、任意の他のエレメントまたは工程
あるいはエレメントまたは工程のグループを排除することを意味しないことが意
図される。このような用語は、オーストラリアなどの国々において法的に許可さ
れ得る最も広い範囲を本出願人に付与するように、その最も拡大した形態で解釈
されるべきである。
たは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」
のような変化形は、言及されたエレメントまたは工程あるいはエレメントまたは
工程のグループを包含することを意味するが、任意の他のエレメントまたは工程
あるいはエレメントまたは工程のグループを排除することを意味しないことが意
図される。このような用語は、オーストラリアなどの国々において法的に許可さ
れ得る最も広い範囲を本出願人に付与するように、その最も拡大した形態で解釈
されるべきである。
【０１１４】
本明細書中に示される特許請求の範囲は、この本発明の説明の一部として、参
考として本明細書中によって援用され、本出願人は、このような請求項に含まれ
ているこのような内容の全てまたは一部を、任意または全ての請求項あるいはそ
の任意のエレメントまたは構成要素を指示するさらなる記載として使用する権利
を明確に保持し、そして本出願人はさらに、本出願あるいは任意のその後の継続
出願、分割出願または一部継続出願によって保護が求められる事項を定義するこ
とが必要な場合、あるいは、任意の国の特許法、規則または規定あるいは条約の
任意の利益を得ること、それらに遂行する料金を減少すること、またはそれらに
従うことが必要な場合、このような請求項に含まれる内容の任意の部分または全
てあるいはその任意のエレメントまたは構成要素を、その説明から特許請求の範
囲へ移動するか、あるいはその逆を行う権利を明らかに保持する。そして、この
ような参考文献によって援用される内容は、本出願（任意のその後の継続出願、
分割出願または一部継続出願、あるいは本願に対する任意の再発行または延長を
含む）の係属中に生かされる。
考として本明細書中によって援用され、本出願人は、このような請求項に含まれ
ているこのような内容の全てまたは一部を、任意または全ての請求項あるいはそ
の任意のエレメントまたは構成要素を指示するさらなる記載として使用する権利
を明確に保持し、そして本出願人はさらに、本出願あるいは任意のその後の継続
出願、分割出願または一部継続出願によって保護が求められる事項を定義するこ
とが必要な場合、あるいは、任意の国の特許法、規則または規定あるいは条約の
任意の利益を得ること、それらに遂行する料金を減少すること、またはそれらに
従うことが必要な場合、このような請求項に含まれる内容の任意の部分または全
てあるいはその任意のエレメントまたは構成要素を、その説明から特許請求の範
囲へ移動するか、あるいはその逆を行う権利を明らかに保持する。そして、この
ような参考文献によって援用される内容は、本出願（任意のその後の継続出願、
分割出願または一部継続出願、あるいは本願に対する任意の再発行または延長を
含む）の係属中に生かされる。
【図１】
図１は、概略化されたフローサイトメトリーを示す。
【図２】
図２は、概略化されたフローサイトメトリーの第２図を示す。
【図３】
図３は、本発明の増幅器を用いないフローサイトメーターからの単変量ヒスト
グラム（＃１、＃２および＃３）（図３Ａ）と、本発明の増幅器の特定の実施形
態を使用する同一のフローサイトメーターの単変量ヒストグラム（図３Ｂ）との
比較を示し、Ｘ染色体保有ウシ精子集団とＹ染色体保有ウシ精子集団との間の改
善された分解能を例示する。
グラム（＃１、＃２および＃３）（図３Ａ）と、本発明の増幅器の特定の実施形
態を使用する同一のフローサイトメーターの単変量ヒストグラム（図３Ｂ）との
比較を示し、Ｘ染色体保有ウシ精子集団とＹ染色体保有ウシ精子集団との間の改
善された分解能を例示する。
【図４】
図４は、Ｘ染色体保有ウシ精子集団とＹ染色体保有ウシ精子集団との間の従来
の分解能を例示する、単変量ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
の分解能を例示する、単変量ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
【図５】
図５は、本発明の増幅器の特定の実施形態を使用する、Ｘ染色体保有ウシ精子
集団とＹ染色体保有ウシ精子集団との間の改善された分解能を例示する、単変量
ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
集団とＹ染色体保有ウシ精子集団との間の改善された分解能を例示する、単変量
ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
【図６】
図６は、Ｘ染色体保有ウシ精子集団とＹ染色体保有ウシ精子集団との間の従来
の分解能を例示する、単変量ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムの第２の例
を示す。
の分解能を例示する、単変量ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムの第２の例
を示す。
【図７】
図７は、本発明の増幅器の特定の実施形態を使用する、Ｘ染色体保有ウシ精子
集団とＹ染色体保有ウシ精子集団との間の改善された分解能を例示する、単変量
ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムの第２の例を示す。
集団とＹ染色体保有ウシ精子集団との間の改善された分解能を例示する、単変量
ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムの第２の例を示す。
【図８】
図８は、Ｘ染色体保有ウマ精子集団とＹ染色体保有ウマ精子集団との間の従来
の分解能を例示する、単変量ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
の分解能を例示する、単変量ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
【図９】
図９は、本発明の増幅器の特定の実施形態を使用する、Ｘ染色体保有ウマ精子
集団とＹ染色体保有ウマ精子集団との間の改善された分解能を例示する、単変量
ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
集団とＹ染色体保有ウマ精子集団との間の改善された分解能を例示する、単変量
ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
【図１０】
図１０は、本発明の増幅器の特定の実施形態を使用する、ウマの精子の核の集
団を含むＸ染色体とウマの精子の集団を含むＹ染色体との間の改善された分解能
を例示する、単変量ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
団を含むＸ染色体とウマの精子の集団を含むＹ染色体との間の改善された分解能
を例示する、単変量ヒストグラムおよび二変量ヒストグラムを示す。
【図１１】
図１１は、ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーターに関する本発明の増
幅器を作製するための、回路基板の修正の特定の実施形態を示す。
幅器を作製するための、回路基板の修正の特定の実施形態を示す。
【図１２】
図１２は、ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーターに関する本発明の増
幅器の特定の実施形態の電気的概略図を示す。
幅器の特定の実施形態の電気的概略図を示す。
【図１３】
図１３は、従来のビーム形状光学（図１３Ａ）を使用するレーザービームパタ
ーンおよび低い高さのビーム形状光学（図１３Ｂ）を使用するレーザービームパ
ターンを示す。
ーンおよび低い高さのビーム形状光学（図１３Ｂ）を使用するレーザービームパ
ターンを示す。
【図１４】
図１４は、従来の技術を使用するか、または本発明の増幅器もしくは低い高さ
のビーム形状光学と連結された本発明の増幅器を使用する、分離されたＸ染色体
を含む精子（図１４Ａ）と分離されたＹ染色体を含む精子（図１４Ｂ）との純度
を比較する棒グラフを示す。
のビーム形状光学と連結された本発明の増幅器を使用する、分離されたＸ染色体
を含む精子（図１４Ａ）と分離されたＹ染色体を含む精子（図１４Ｂ）との純度
を比較する棒グラフを示す。
【図１５】
図１５は、低い高さのビーム形状光学の正面図である。
【図１６】
図１６は、低い高さのビーム形状光学の上面図である。
【図１７】
図１７は、本発明のオブジェクト配向ノズルの斜視図および２つの断面図を示
す。
す。
【図１８】
図１８は、本発明のオブジェクト配向ノズルの一連の段階的な断面図を示す。
【図１９】
図１９は、本発明の開先注入チューブの実施形態の正面図および端面図を示す
。
。
【図２０】
図２０は、配向された精子からの信号（図２０Ａおよび図２０Ｂ）と配向され
ていない精子からの信号（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）との比較により、本発明の
所望でない配向されていない精子の除去（ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｕｎｄｅｓｉ
ｒｅｄ ｕｎｏｒｉｅｎｔｅｄ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ（ＲＵＵＳ））を例示
する。
ていない精子からの信号（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）との比較により、本発明の
所望でない配向されていない精子の除去（ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｕｎｄｅｓｉ
ｒｅｄ ｕｎｏｒｉｅｎｔｅｄ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ（ＲＵＵＳ））を例示
する。
【図２１】
図２１は、パドル形状の開先ブレードを有する、本発明の開先注入チューブの
別の実施形態の斜視図を示す。
別の実施形態の斜視図を示す。
【図２２】
図２２は、フローサイトメーターに連結された従来の光学技術を示す。
【図２３】
図２３Ａは、典型的な精子の形状およびサイズを示し、そして図２３Ｂは、正
しく配向された精子と正しく配向されていない精子との差を示す。
しく配向された精子と正しく配向されていない精子との差を示す。
【図２４】
図２４は、例示的な容量および配向に関する２つの信号の測定を可能にする構
造を有する本発明の実施形態を示す。
造を有する本発明の実施形態を示す。
【図２５】
図２５ＡおよびＢは、各々半端に対してピンホールを備える２つの半端を有す
る、本発明の実施形態を示し、図２５Ｃは、本発明の実施形態の像平面を示し、
図２５Ｄは、独立して回転可能な２つの偏光子を有する本発明の実施形態を示す
。
る、本発明の実施形態を示し、図２５Ｃは、本発明の実施形態の像平面を示し、
図２５Ｄは、独立して回転可能な２つの偏光子を有する本発明の実施形態を示す
。
【図２６】
図２６Ａおよび２６Ｂは、本発明の実施形態に関する流体流の補償方法を例示
し、図２６Ｃは、補償エレメントの実施形態を示し、図２６Ｄは、流体流の画像
および補償エレメントの画像が像平面の頂部で互いにぶつかる、補償エレメント
の別の実施形態を示す。
し、図２６Ｃは、補償エレメントの実施形態を示し、図２６Ｄは、流体流の画像
および補償エレメントの画像が像平面の頂部で互いにぶつかる、補償エレメント
の別の実施形態を示す。
【図２７】
図２７は、本発明の干渉顕微鏡の実施形態を示す。
【図２８】
図２８は、本発明の干渉顕微鏡の第２図を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ６０／２６７，５７１
(32)優先日 平成13年２月10日(2001．2．10)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，
ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，
ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ
Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 2G045 AA27 CB14 FB12
4B063 QA01 QQ08 QQ42 QR66 QS39
4B065 AA90 AC20 BA30 BD50 CA60
Claims (31)
- 【請求項１】 Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精子細胞とを単離する
方法であって、以下の工程： ａ．哺乳動物の種の雄性から精子細胞を収集する工程； ｂ．該精子細胞の性区別特徴を決定する工程； ｃ．該精子細胞間を、該性区別特徴に基づいて区別する工程； ｄ．区別した精子細胞を、Ｘ染色体保有集団とＹ染色体保有集団とに分離する
工程；および ｅ．各々が９０％より高い純度を有する、別々のＸ染色体保有精子細胞集団お
よびＹ染色体保有精子細胞集団を生成する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精
子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記精子細胞間を、前記性区別特徴
に基づいて区別する前記工程が、該精子細胞の核内のＤＮＡの量を評価する工程
を包含する、方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精
子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記精子細胞間を、前記性区別特徴
に基づいて区別する前記工程が、前記量のＤＮＡを含むカプセルの容量を評価す
る工程を包含する、方法。 - 【請求項４】 請求項３に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精
子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記量のＤＮＡを含む前記カプセル
の前記容量を評価する前記工程が、前記精子細胞における核の容量を決定する工
程を包含する、方法。 - 【請求項５】 請求項３に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精
子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記ＤＮＡを含むカプセルの前記容
量を評価する前記工程が、精子細胞頭部の容量を決定する工程を包含する、方法
。 - 【請求項６】 請求項５に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精
子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記量のＤＮＡを含む前記カプセル
の前記容量を評価する前記工程が、さらに、以下の工程： ａ．初期波形特徴を有する電磁放射線のビームを発生させる工程； ｂ．前記量のＤＮＡを含む前記カプセルの前記容量を、該電磁放射線のビーム
でトラバースする工程； ｃ．該カプセルの該容量をトラバースすることによって、該初期波形特徴を変
化させる工程；および ｄ．変化した波形特徴を分析する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項７】 請求項６に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精
子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記カプセルの前記容量をトラバー
スすることによって、前記初期波形特徴を変化させる前記工程が、電磁放射線の
前記ビームの該初期波形の位相をシフトさせる工程を包含する、方法。 - 【請求項８】 請求項６に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精
子細胞とを単離する方法であって、シフトした位相を有する電磁放射線の前記ビ
ームを、前記初期波形特徴を有する前記電磁放射線のビームに重ねる工程をさら
に包含する、方法。 - 【請求項９】 請求項８に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精
子細胞とを単離する方法であって、電磁放射線の重ねたビームの電磁放射線強度
を、初期波形特徴を有する前記電磁放射線のビームの強度と比較する工程をさら
に包含する、方法。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有
精子細胞とを単離する方法であって、電磁放射線の前記重ねたビームと、初期波
形特徴を有する前記電磁放射線のビームとの間の光強度の差異に基づいて、前記
量のＤＮＡを含む前記カプセルの前記容量を決定する工程をさらに包含する、方
法。 - 【請求項１１】 請求項２に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有
精子細胞とを単離する方法であって、以下の工程： ａ．前記精子細胞を流体流に導入する工程； ｂ．該流体流中に巻き込まれた該精子細胞を分析する工程； ｃ．該巻き込まれた精子細胞の１つを有する液滴を複数形成する工程； ｄ．該液滴に巻き込まれた該精子細胞の前記性区別特徴に基づいて、該液滴の
各々を区別して荷電させる工程； ｅ．該液滴の各々を偏向する工程；および ｆ．該液滴に巻き込まれた該精子細胞の該性区別特徴に基づいて、該液滴の各
々を区別して収集する工程、 をさらに包含する、方法。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、前記精子細胞の核内のＤＮＡの量を、未
染色で維持する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項１３】 請求項１１に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、前記精子細胞の核内のＤＮＡの量を染色
する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、前記精子細胞の核内の染色されたＤＮＡ
を照射する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項１５】 請求項１４に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、前記精子細胞の核内の照射された染色Ｄ
ＮＡから放出される蛍光を検出する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記精子細胞の前記核内の照射
された染色ＤＮＡからの蛍光を検出する前記工程が、光電子増倍管を用いて信号
を発生させる工程を包含する、方法。 - 【請求項１７】 請求項１６に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、前記光電子増倍管を、代表的な作動電圧
範囲外で作動させる工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項１８】 請求項１４に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記精子細胞の前記核内の染色
ＤＮＡを照射する前記工程が、減少した高さを有する照射ビームパターンを発生
させる工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項１９】 請求項１８に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記減少した高さが、前記精子
細胞の長手方向軸に沿った長さにおおよそ等しい高さから、該精子細胞の該長手
方向軸に沿った長さの約３倍の高さを含む、方法。 - 【請求項２０】 請求項１９に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、ここで、前記精子細胞が、約９マイクロ
メートルの長さの長手方向軸を有し、そして前記照射ビームパターンの前記高さ
が、約２０マイクロメートルである、方法。 - 【請求項２１】 請求項１８に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、ここで、液滴を形成する前記工程が、前
記精子細胞をカプセル化するに十分な大きさを有する液滴を形成する工程を包含
する、方法。 - 【請求項２２】 オリフィスを有するノズルから前記流体流を射出する工程
をさらに包含する、請求項２１に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有
精子細胞とを単離する方法であって、ここで、該オリフィスが、７０マイクロメ
ートルの直径を有する、方法。 - 【請求項２３】 請求項２２に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、さらに、以下の工程： ａ．前記精子細胞を検出器に対して配向する工程； ｂ．該検出器に対する精子細胞配向に差示的に感受性の特徴を有する光を検出
する工程； ｃ．精子細胞配向に差示的に感受性の特徴を有する該光を、精子細胞配向情報
を含む少なくとも１つの信号に変換する工程；および ｄ．該検出器に対する該精子細胞の配向を決定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２４】 請求項２３に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保
有精子細胞とを単離する方法であって、前記検出器に対する前記精子細胞の決定
された配向に基づいて、前記液滴を区別して収集する工程をさらに包含する、方
法。 - 【請求項２５】 請求項１、６、１２、１３、１７、１８、２１、または
２３に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精子細胞とを単離する方法
であって、ここで、前記精子のＸ染色体保有集団およびＹ染色体保有集団の前記
純度が、９０％〜約１００％の間、約９１％〜約１００％の間、約９２％〜約１
００％の間、約９３％〜約１００％の間、約９４％〜約１００％の間、約９５％
〜約１００％の間、約９６％〜約１００％の間、約９７％〜約１００％の間、約
９８％〜約１００％の間、約９９％〜約１００％の間からなる群より選択される
、方法。 - 【請求項２６】 請求項１、６、１２、１３、１７、１８、２１、または２
３に記載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精子細胞とを単離する方法で
あって、１秒間あたり少なくとも５０００の分離可能事象、１秒間あたり少なく
とも６０００の分離可能事象、１秒間あたり少なくとも７０００の分離可能事象
、１秒間あたり少なくとも８０００の分離可能事象、１秒間あたり少なくとも９
０００の分離可能事象、１秒間あたり少なくとも１０，０００の分離可能事象、
１秒間あたり少なくとも１１，０００の分離可能事象、１秒間あたり少なくとも
１２，０００の分離可能事象、１秒間あたり少なくとも１３，０００の分離可能
事象、１秒間あたり少なくとも１４，０００の分離可能事象、１秒間あたり少な
くとも１５，０００の分離可能事象、１秒間あたり少なくとも１６，０００の分
離可能事象、１秒間あたり少なくとも１７，０００の分離可能事象、１秒間あた
り少なくとも１８，０００の分離可能事象、１秒間あたり少なくとも１９，００
０の分離可能事象、１秒間あたり少なくとも２０，０００の分離可能事象、１秒
間あたり少なくとも２１，０００の分離可能事象からなる群より選択される分離
可能事象速度を確立する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項２７】 請求項１、６、１２、１３、１８、２１、または２３に記
載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精子細胞とを単離する方法であって
、ここで、前記精子細胞を分離する前記工程が、１秒間あたり少なくとも５００
分離、１秒間あたり少なくとも１，０００分離、１秒間あたり少なくとも２，０
００分離、１秒間あたり少なくとも３，０００分離、１秒間あたり少なくとも４
，０００分離、１秒間あたり少なくとも５，０００分離、１秒間あたり少なくと
も６，０００分離、１秒間あたり少なくとも７，０００分離、１秒間あたり少な
くとも８，０００分離、１秒間あたり少なくとも９，０００分離、１秒間あたり
少なくとも１０，０００分離からなる群より選択される分離速度を含む、方法。 - 【請求項２８】 請求項１、６、１２、１３、１８、２１、または２３に記
載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精子細胞とを単離する方法であって
、ここで、前記巻き込まれた精子細胞の１つを各々有する液滴を形成する前記工
程が、１秒間あたり少なくとも１０，０００の液滴、１秒間あたり少なくとも２
０，０００の液滴、１秒間あたり少なくとも３０，０００の液滴、１秒間あたり
少なくとも４０，０００の液滴、１秒間あたり少なくとも５０，０００の液滴、
１秒間あたり少なくとも６０，０００の液滴、１秒間あたり少なくとも７０，０
００の液滴、１秒間あたり少なくとも８０，０００の液滴、１秒間あたり少なく
とも９０，０００の液滴、１秒間あたり少なくとも１００，０００の液滴からな
る群より選択される液滴形成速度を含む、方法。 - 【請求項２９】 前記哺乳動物の種がウシ哺乳動物を含む、請求項１に記載
の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精子細胞とを単離する方法。 - 【請求項３０】 前記哺乳動物の種がウマ哺乳動物を含む、請求項１に記載
の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精子細胞とを単離する方法。 - 【請求項３１】 前記哺乳動物の種がヒツジ哺乳動物を含む、請求項１に記
載の、Ｘ染色体保有精子細胞とＹ染色体保有精子細胞とを単離する方法。
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