FI90086C - Foerfarande foer isolering av en terapeutiskt anvaendbar lactobacillus acidophilus -stam - Google Patents

Description

1 90086

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen Lactobacillus acidophilus -kannan eristämiseksi

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisen Lactobacillus acidophilus -kannan ATCC 53103 eristämiseksi näytteestä, joka sisältää paljon bakteeri-kanto j a.

L. acidophilus esiintyy useimpien terveiden ihmisten normaalissa suolistofloorassa. Lactobacillus-suku on 10 laajalti levinnyt luonnossa. Monia lajeja, kuten esimerkiksi L. bulgaricus ja L. casei esiintyy meijerituotteissa sekä hedelmissä ja vihanneksissa. Muita Lactobacillus-la-jeja löytyy nisäkkäiden ja hyönteisten suolistoalueelta. Monien vuosisatojen ajan on monia Lactobacillus-lajeja 15 käytetty maidossa ja meijerituotteissa käymisorganismeina, jogurtin ja erityyppisten, käytettyjen ja hapatettujen maitojen, juustomassojen ja kermojen valmistuksessa. Meijeriteollisuudessa käytetty Lactobacillus-laji on tavallisesti L. bulgaricus, vaikka L. acidophilus -kantoja on 20 myös käytetty erittäin laajalti.

Viime vuosina on suoritettu monia tutkimuksia käyttämällä L. acidophilus -kantoja, jotka on eristetty North Carolina State Universityssä ("NSCU"). Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että NSCU-kannoilla ihmisten tai eläin-.···. 25 ten nauttimina on edullisia vaikutuksia maha-suolistoalueen erilaisiin toimintoihin, mukaanluettuna kemiallisten karsinogeenien aktivoitumisen tukahtuminen paksusuolessa, kolesterolin erittymisen väheneminen (joka kytkeytyy paksusuolen syövän vähentyneeseen vaaraan) sekä anti--'30 bioottihoidon maha-suolisto-alueeseen kohdistuvien vaiku tusten väheneminen.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota uutta L. acidophilus -kantaa, jolla on joukko ominaisuuksia, jotka tekevät ne ihmisen terveydelle hyödyllisiksi ja tekevät 35 sen käyttökelpoiseksi hoidettaessa antibioottihoidon sivu- 2 90086 vaikutuksia, haavaista paksusuolentulehdusta ja ummetusta, muodostaessa vastustuskykyä patogeenisten mikro-organismien kolonisaatiolle maha-suolisto-alueelle, vähennettäessä kolesterolin ja estrogeenin erittymistä ulosteissa.

5 Keksinnön mukaisesti saatavalle L. acidophilus -kannalle on ominaista, että keskimäärin vähintään 50, mieluummin ainakin 100 bakteeria voi kiinnittyä Ihmisen ohutsuolen limakalvon soluun, sen jälkeen kun bakteereita on inkuboitu viiden minuutin ajan solujen kanssa. Edulli-10 sesti bakteereille on edelleen tunnusomaista, että ne valmistavat ainakin 3,5 milliekvivalenttia (mekv) maitohappoa 1010 CFU:a (pesäkkeitä muodostavaa yksikköä) kohti ravinto-alustassa, 37 eC:ssa vuorokauden aikana; ne pystyvät jakautumaan 37 °C:ssa ravintoalustassa pH-arvossa 3,0; ne 15 pystyvät jakautumaan ravintoalustassa, joka sisältää 0,1 % härän sappirakon sappea; niiden solunjakutumisaika on yksi tunti ravintoalustassa 37 °C;ssa. "Ravintoalusta" tarkoittaa mitä tahansa viljelyvällainetta, joka sisältää L. acidophilus -bakteereiden jakautumiseen tarvittavat ravinto-20 aineet.

Keksintö antaa käyttöön menetelmän Lactobacillus acidophilus -kannan ATCC 53103 eristämiseksi näytteestä, joka sisältää monia bakteerikantoja. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että näyte seulotaan Lac-.25 tobacillus-bakteerien suhteen, jotka (a) pystyvät lujasti kiinnittymään maha-suolistoalueen soluihin, (b) pystyvät lisääntymään ravintoalustassa, jonka pH on alle 5,5, ja • 30 (c) pystyvät lisääntymään ravintoalustassa, joka sisältää ainakin 0,1 % sappea.

Menetelmä käsittää L. acidophilus -lajin eristettävien bakteereiden tutkimusvaiheiden suorittamisen missä järjestyksessä tahansa, bakteereiden yhdistämisen maha-35 suolisto-alueen solujen kanssa sekä bakteerien valinnan, 3 90086 jotka pystyvät kiinnittymään soluihin keskimääräisellä nopeudella ainakin 50, ja mieluummin ainakin 100 bakteeri-solua maha-suolisto-alueen solua kohti viiden minuutin mittaisen esi-inkuboinnin aikana. Valintamenetelmään liit-5 tyy myös edullisesti näytteen bakteereiden inkubointivaiheet ravintoalustassa pH-arvossa alle 5,5 (mieluummin alle 3,5), sekä bakteerien valinta, jotka jakautuvat tässä ravintoalustassa; näytteen bakteerien inkubointi ravinto-alustassa, joka sisältää ainakin 0,1 % sappea ja baktee-10 rien valinta, jotka jakautuvat tässä ravintoalustassa; ja näytteen bakteerien inkubointi ravintoalustan kanssa sekä bakteerien valinta, joiden jakautumisaika on vähemmän kuin yksi tunti noin 37 °C:ssa.

Keksinnön muut piirteet ja edut käyvät ilmi seuraa-15 vasta keksinnön edullisten suoritusmuotojen kuvauksesta sekä patenttivaatimuksesta.

Kannan eristäminen

Terveillä ihmisillä on L. acidophilus -lajien bakteereita osana normaaliflooraansa, yleensä konsentraatio-20 na noin 109 Lactobacillus-bakteeria grammaa kohti suolensisältöä; täten on terveillä ihmisillä suolistonsa alueella 10u ylimäärä lactobacillusta. Menetelmän ensimmäisenä vaiheena on tutkia ihmisiltä saadut ulostenäytteet ja valita ne, joissa on korkeat Lactobacillus-konsentraatiot.

. 25 Seuraavaksi tutkitaan nämä näytteet käyttämällä me netelmää, joka on laadittu kantojen eritämiseksi, joilla on ne ominaisuudet, joita on esitetty edellä keksinnön yhteenvedossa ja jotka voidaan mainita lyhyesti seuraavalla tavalla: 30 (1) haponkestävyys (2) sapenkestävyys (ominaisuus, jonka the Department of Food Science, North Carolina State University, on todennut toivottavaksi ominaisuudeksi) (3) kyky tarttua herkästi ihmisen suolistoalueen 35 limakalvon soluihin 4 90086 (4) maitohapon valmistus (5) kestävä in vitro kasvu.

Hapon- ja sapen kestävyys

Seulonta sapenkestävyyden sekä stabilisuuden suh-5 teen jokseenkin happämessa ympäristössä suoritetaan seu-raavalla tavalla. Valmistetaan LBS-agar (kuvattu julkaisussa J. Bacteriol. 62 (1951) 132), jolla on seuraava koostumus litraa kohti:

Tryptikoosia ja peptonia 10,0 g 10 Hiivauutetta 5,9 g

Ammoniumsitraattia 2,0 g

Monokaliumfosfaattia 6,0 g

Dekstroosia 20,0 g

Polysorbaatti-P04 1,0 g 15 Natriumasetaattihydraattia 25,0 g

Magnesiumsulfaattia 0,575 g

Mangaanisulfaattia 0,12 g

Ferrosulfaattia 0,034 g

Agaria 15,0 g 20 84 g:aan edellä esitetyn koostumuksen mukaista jau hetta, josta vesi on poistettu, lisätään 30 ml tomaatti-mehua sekä 800 ml tislattua vettä ja sen jälkeen, sekoittaen, 1,32 ml etikkahappoa. Sitten lisätään 1,5 g härän sappirakon sappea ja pH säädetään 5,5:ksi käyttämällä 1 N 25 HCla. Levyjä säilytetään anaerobisessa kammiossa 1-3 vrk. ennen käyttöä ja sitten niitä käytetään ilman autoklaavilla suoritettua käsittelyä. Terveiltä henkilöiltä saadut ulostenäytteet homogenoidaan vedessä anaerobisissa olosuhteissa ja sarjalaimennuksia inkuboidaan levyillä 48 30 tunnin ajan anaerobisessa kammiossa. Valitaan bakteerit, jotka jakautuvat levyillä ja niitä seulotaan edelleen. Tämä vaihe poistaa monia näytteeseen sisältyvistä mikro-organismeista.

Seulonta kestävyyden suhteen happamimmissa olosuh-35 teissä suoritetaan käyttämällä MRS-lihalientä (Difco, ku- 5 90086 vattu julkaisussa J. Applied Bacteriol. 23 (1960) 130), jolla on seuraava koostumus:

Bacto-proteaasi-peptoni # 3 10,0 g

Bacto-lihauute 10,0 g 5 Bacto-hiivauute 5,0 g

Dekstroosi 20,0 g

Tween 20 1,0 g

Ammoniumsitraatti 2,0 g

Natriumasetaatti 5,0 g 10 Magnesiumsulfaatti 0,1 g

Mangaanisulfaatti 0,05 g

Dinatriumfosfaatti 2,0 g 55 g edellä esitettyä koostumusta, vedettömänä, sekoitetaan 1000 ml:n kanssa tislattua vettä ja steriloi-15 daan autoklaavikäsittelyllä 15 minuutin ajan 6,89 kPa:n paineessa. Alustan lopullinen pH on 6,5 25 °C:ssa. Sitten pH säädetään käyttämällä 1,0 N HCl:a ja, jos tarpeellista, 1,0 N NaOH:a, ja alusta steriloidaan suodattamalla. Bakteereita inkuboidaan ravintoalustassa 48 tunnin ajan an-20 aerobisessa kammiossa. Valitut bakteerit voivat edullisesti jakautua pH:ssa, joka on alle 3,5 mieluummin pH:ssa 3,0.

L. acidophiluksen seulonta

Seuraava seulontavaihe on L. acidophilus -lajin 25 bakteereiden eristäminen bakteereista, jotka pystyvät jakautumaan hapossa ja sapessa. Tämä vaihe suoritetaan käyttämällä normaaleja mikrobiologisia menetelmiä.

Tarttuvuus

Seuraavassa vaiheessa tutkitaan hapon ja sapen suh-30 teen kestävien L. acidophilus -bakteereiden kykyä pysyä kiinni maha-suolisto-alueen soluissa. Ensin eristetään ihmisen maha-suolisto-alueen solut millä tahansa sopivalla menetelmällä. Erääseen tekniikkaan sisältyy ulos virtaa-van nesteen kokoaminen potilaalta, jolla on hyvin toimiva . 35 sykkyräsuolen avaus, jota huuhdotaan keittosuolalla.

6 90085

Ulos virtaava keittosuolaliuos kootaan kylmään puskuri I:een (0,1 % gelatiinia, 1 % glukoosia, 500 mM nat-riumfosfaattia, pH 7,4) 1/10 tilavuudessa. Sitten tämä liuos suodatetaan # 25 silkin lävitse solurykelmien ja 5 -jäänteiden poistamiseksi, ja sykkyräsuolen limakalvon so lut kootaan sentrifugoimalla 100 x g 10 minuutin ajan. Sitten solut pestään puskuri II:ssa (0,45 % NaCl, 0,1 % glukoosia, 0,01 % gelatiinia, 50 mM natriumfosfaattia, pH

7.4) käyttämällä samoja sentrifugointiolosuhteita. Lopuksi 10 solut lietetään uudelleen puskuriin II, lisätään 1/3 tilavuutta kudosviljelmäravintoalustaa NCTC 135, ja soluja säilytetään 4 °C:ssa käyttöön saakka. Sykkyräsuolen solujen lukumäärä ja elinkykyisyys määritetään Tryptan Blue -värjäyksen avulla. Ihmisen sykkyräsuolen solut voidaan 15 jäähdyttää nestemäisessä typessä, sen jälkeen kun on lisätty 10 % (tilav./tilav.) glyserolia.

Bakteereita kasvatetaan 18 tunnin ajan 37 *C:ssa, MRS-ravintoalustassa, 6 pCi:n kanssa lisättyä 3H-alaniinia ja 3H-leusiinia. Sitten bakteerit pestään 5 tilavuudella 20 fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta, lietetään uudelleen puskuriin II ja suodatetaan 2,0 μ:η polykarbonaat-tisuodattimien läpi solurykelmien poistamiseksi. Sitten bakteerit sekoitetaan ihmisen ohutsuolen solujen kanssa, inkuboidaan 37 °C:ssa ja näytteet otetaan 5 minuuttia myö-. 25 hemmin. Näytteet pannaan 2,0 μ:n polykarbonaattisuodatti-mille, ja ylimäärä liuosta poistetaan imemällä varovaisesti. Sitten suodattimet huuhdotaan, ensin 2 ml:11a, sitten 5 ml:11a fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta (pH

7.4) . Näitä suodattimia käyttämällä ohutsuolen solut ja 30 kiinni pysyvät bakteerit säilyvät, mutta vapaat bakteerit menevät lävitse. Kontrolleihin sisältyy reaktioseos ilman ihmisen ohutsuolen soluja. Säilynyt radioaktiivisuus määritetään nestetuikelaskimella. Bakteeriperäinen spesifinen aktiivisuus määritetään pesäkkeitä muodostavista yksiköis-35 tä optisesta tiheydestä 550 nm:ssä sekä 0,2 μ:η suodatti- 7 90085 millä säilyneestä radioaktiivisuudesta. Bakteeriperäistä spesifistä aktiivisuutta käytetään sidottujen bakteereiden lukumäärän laskemiseen.

Bakteerit, jotka sitoutuvat yllä esitetyn menetel-5 män mukaisesti vähintään nopeudella 50 ja mieluummin 100 bakteeria maha-suolistoalueen solua kohti (edustaen noin 10 % bakteereista, jotka ovat kosketuksessa solujen kanssa), ovat halutut bakteerit.

Maitohapon tuottaminen 10 Maitohapon tuottaminen mitataan inkuboimalla bak teeria MRS-ravintoalustassa tai Scott Peptone Yeast Broth -liemessä anaerobisissa olosuhteissa ja mittaamalla maitohappo 8 tai 24 tunnin kuluttua käyttämällä kaasu-neste-kromatografiaa. Seulotut bakteerit valmistavat ainakin 3,5 15 mekv. ja mieluummin 4 mekv. maitohappoa 1010 CFU:a kohti 37 eC:ssa 24 tunnin aikana.

Kestävä kasvu

Lopullinen seulontavaihe koskee bakteerien valintaa, joilla on kestävä kasvu in vitro, solunjakautumisai-20 kana mitattuna. 5 x 104 CFU:a bakteereja siirrostetaan ravintoalustaan, esimerkiksi MRS-lihaliemeen, ja CFU mitataan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 tunnin kuluttua maljäämällä 0,1 ml:n laimennokset LBS-agarllle ja inkuboimalla levyjä 48 tunnin ajan 37 °C:ssa anaerobisissa olosuhteissa. Vali-25 taan bakteerit joiden jakautumisaika 37 °C:ssa on vähemmän kuin yksi tunti tai mieluummin noin 45 minuuttia. Seulonnan periaatteet

Edellä esitetyn seulontamenetelmän kukin vaihe on suunniteltu L. acidophilus -kantojen eristämiseksi, joil-30 la kannoilla on ominaisuuksia, joiden perusteella ne pystyvät lisäämään ihmisen terveyttä.

Hapon- ja sapenkestävyys ovat tärkeitä, koska bakteerit nautitaan ja niiden pitää kulkea mahalaukun happamien olosuhteiden sekä sappea sisältävän ohutsuolen kaut-35 ta, ja niiden täytyy kyetä pysymään elossä ja jakautumaan 8 90085 näissä olosuhteissa, jos bakteereiden on annettava terveydellisiä etuja niitä nauttivalle henkilölle.

Kiinnipysyminen on tärkeää, koska tämä ominaisuus tekee mahdolliseksi L. acidophilus -bakteerien asettumisen 5 ja kiinnittymisen maha-suolisto-alueelle.

Maitohapon valmistaminen on tärkeää, koska uskotaan, että bakteerien valmistama maitohappo on osittain vastuussa edullisista vaikutuksista, jotka kyseessä olevan kannan asettuminen vatsa-suolisto-alueelle saa aikaan. 10 Maitohappo on mikrobienvastainen aine, ja sen muodostuminen kyseessä olevan keksinnön mukaisten bakteerien avulla voi auttaa niitä muodostamaan suojaava este patogeenejä vastaan maha-suolisto-alueella. Maitohappo saattaa myös auttaa karsinogeenien inaktivoinnissa maha-suolisto-15 alueella.

Kestävä kasvu in vitro on tärkeä ominaisuus, koska bakteereja täytyy valmistaa suuressa mittakaavassa; kestävä kasvu on myös indikaattori siitä, että bakteerit tulevat uskottavasti kasvamaan hyvin myös in vivo.

20 Kannan GG ominaisuudet

Keksinnön mukaisella kannalla, joka merkitään GG-:ksi, on seuraavat ominaisuudet.

Haponkestävyys

Kanta GG voi kasvaa pH-arvossa 3,0 aina konsentraa-25 tioon 1 x 107 CFU:a asti. Korkeammissa pH-arvoissa kasvu on vielä suurempi, saavuttaen 109 CFU:a pH 5,0:ssa.

Normaalissa ihmisen mahanesteessä GG-kanta, käyttäen siirrostuksena 10® CFU:n suuruista ympiä, voi elää, ympin koon vähentyessä vähemmän kuin 2 log ainakin 30 mi-.30 nuutin ajan pH-arvoss 2,5.

GG-kannan bakteereja (109 CFU:a) siirrostettiin Levine-putkea pitkin suoraan terveen vapaaehtoisen henkilön mahalaukkuun. Mahalaukunsisällön pH:n ollessa 1,0 - 2,0 ainakin 100 GG-organismia jäi eloon vähintään kahdeksi .35 tunniksi.

9 ') Ω O 8 β

Sapenkestävyys GG-kanta voi kasvaa härän sappirakon sapessa, 0,15 %:n konsentraatiossa, LBS-agarilla.

Kiinnittyminen suolen limakalvon soluihin 5 Alla esitetty taulukko ilmaisee GG-kannan sykkyrä- suolen limakalvon soluihin tapahtuvan kiinnittymisen laa- j uuden.

Kosketusaika Suolen solua kohti sidot tujen bakteerien lukumäärä 10 - 5 minuuttia 119 10 minuuttia 235 15 minuuttia 333 15 Maitohapon tuottaminen

Maitohapon tuottaminen mitattiin kaasu-nestekro- matografisesti sen jälkeen kun GG-kantaa oli inkuboitu nestemäisessä ravintoalustassa. Seuraavat maitohappokon-sentraatiot mitattiin annettuina inkubointiaikoina.

20 Inkubointiaika Maitohapon tuotto

8 tuntia 1,53 mekv./108 CFU

24 tuntia 4,44 mekv./1010 CFU

25 Solunj akautumisaika GG-kanta osoitti kestävää kasvua in vitro. Käytettäessä alkuympplä 5 x 104 CFU:a MRS-lihaliemessä, kanta osoitti 40-kertaisen kasvun lisääntymisen nelituntisen jakson aikana, saavuttaen tiheyden 2 x 106 CFU:a. Täten 30 tänä nelituntisena ajanjaksona tapahtui 5,2 solunjakautumista, joten jakautumisajaksi tuli 45 minuuttia.

Käyttö

Kyseessä olevan keksinnön mukaisia kantoja voidaan viljellä suuressa mittakaavassa ja käyttää terapeuttises- 35 ti lyofilisoidussa muodossa tai yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen, ja ne voidaan li- ίο 9 0 0 86 sätä ruoka-aineisiin, erityisesti meijerituotteisiin, kuten esimerkiksi maitoon ja jogurttiin, kuten on tehty muiden L. acidophilus -kantojen suhteen monien vuosien ajan. Kyseessä olevan kannan bakteereita yksinään, ruoassa tai 5 muissa kantaja-aineissa, potilas voi nauttia suun kautta tehokkaan määrän (esimerkiksi 106 - 1910 bakteeria henkilöä kohti päivässä), monien sairauksien hoitamiseksi tai estämiseksi, jotka sairaudet on mainittu edellä ja joita seu-raavassa kuvataan yksityiskohtaisemmin. Viljelyolosuhteet 10 ovat seuraavat.

Varastoliuos käsittää steriiliä kuorittua maitoa, jossa on 1010 CFU:a elävää organismia. 1 ml tätä varasto-liuosta lisätään kahteen litraan MRS-lihalientä. Astia asetetaan anaerobiseen inkubointikammioon ja inkuboidaan 15 yön yli 14 tunnin ajan samalla sekoittaen 37 eC:ssa. Liha-liemi sentrlfugoidaan 10 000 x g:llä 20 minuutin ajan ja saostuma lietetään uudelleen 50 - 100 mitään steriiliä kuorittua maitoa sekä varastoidaan -80 ’Ctssa.

Eräässä erityisessä annostelutavassa lisätään 109 -20 1010 organismia maitoon, joko 10 - 20 ml tn tilavuudessa tai suuremmissa tilavuuksissa, esimerkiksi 250 - 500 mltssa. Maitoa annostellaan kerran päivittäin, siten että annetaan 109 - 1010 CFUta yhtenä annoksena. Eläimiä varten 0,21 - 1,0 ml varastomaitoliuosta sekoitetaan niiden ruokaan, 25 niin että ne saavat 109 - 1010 CFUta päivittäin. Antibioottihoidon sivuvaikutukset

Ripuli on antibioottihoidon pääasiallinen komplikaatio, joka esiintyy noin 10 %tlla antibiootteja, erityisesti ampisilliiniä, amoksasilliiniä, kefalosporiineja, 30 klindamysiiniä, erytromysiiniä ja tetrasykliiniä saavilla potilailla. Kyseessä olevan keksinnön mukaisia kantoja voidaan käyttää antibiootin aikaansaaman ripulin hoitoon, samalla tavalla kuin muita L. acidophilus -valmisteita on aiemmin käytetty. Lisäksi voidaan kantoja käyttää ennen 35 antibioottihoitoa tai sen kanssa samanaikaisesti, ennalta n 90086 ehkäisevänä hoitona. Sellaisen ennaltaehkäisevän annostelun tulisi tapahtua 24 tuntia ennen antibioottihoitoa. Haavainen paksusuolentulehdus

Varsinainen haavainen paksusuolentulehdus edustaa 5 vaikeaa terapeuttista ongelmaa. Sairaus on suhteellisen yleinen ja potilaat kärsivät toistuvista ripulikohtauksis-ta, joita voi esiintyä monissa tilanteissa, vuosia kestävän aktiivisen sairauden aikana. Tähän mennessä ainoat hoidot, jotka ovat osoittautuneet menestyksellisiksi, ovat 10 salisyyliatsosulfapyridiini (SAS) sekä kortikosteroidit. Monet potilaat sairastuvat uudelleen näistä hoidoista huolimatta. Lisäksi hoitoihin sinänsä liittyy sivuvaikutusten suuri esiintymistiheys.

Useat todisteet antavat aiheen olettaa, että suo-15 liston mikrofloora kytkeytyy tähän sairaustapahtumaan, joko alkuunpanijana tai oireiden määräävänä tekijänä.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisten L. acidophilus -kantojen bakteereja voidaan antaa, kuten edellä on kuvattu, antibioottien sivuvaikutuksiin, haavaisen paksusuolen-20 tulehduksen hoitoon tai estämiseen.

Ummetus

Suolen hidas toiminta j a krooninen ummetus ovat pääongelmia vanhemmilla henkilöillä. Ummetus johtaa vatsan pullistumiseen, kouristuksiin ja yleiseen pahanolon-25 tunteeseen. Yleisön mielenkiinnon kohdistuminen suolen hyvän aktiivisuuden edistämiseen heijastuu tuotevalikoimaan, joka on saatavissa apteekeista tämän tilan helpottamiseen. Nämä tuotteet vaihtelevat raaoista ulostusai-neista lyhytketjuisiin rasvahappoihin, erilaisiin luonnon-. 30 kuitutuotteisiin, kuten esimerkiksi pektiineihin, lignii- neihin, kumeihin ja kasvilimoihin.

Viljeltyjä meijerituotteita, jogurtteja ja hapatettuja maitoja on käytetty jo kauan kroonisen ummetuksen helpottamiseen.

35 Kyseessä olevan keksinnön mukaisten L. acidophilus 12 9 O 0 85 -kantojen bakteereita voidaan käyttää yksinään, kuten edellä on kuvattu, tai niitä voidaan antaa sekoitettuna laktuloosin, ummetuksen hoitoon käytetyn synteettisen di-sakkaridin ei-terapeuttisen annoksen kanssa. Bakteerit me-5 taboloivat laktuloosia, mikä lisää niiden edullisia vaikutuksia ilman sivuvaikutuksia, jotka joskus kytkeytyvät laktuloosin terapeuttisiin annoksiin.

Resistenssi kolonisaatiota vastaan

Viime vuosina on tullut ilmeiseksi, että bakteerien 10 asettautuminen ihmisen maha-suolisto-alueelle tarjoaa varaston patogeenisten mikro-organismien levittämistä varten, erityisesti isännissä, joiden immuunivaste on heikentynyt. Terveiden yksilöiden suoliston mikrofloora voi vastustaa ei toivottujen mikro-organismien kiinnittymistä mo-15 nien sisäisten kontrollimekanismien avulla. Vaikka nämä kontrollimokanismit ovat huonosti ymmärrettyjä, kokonaistulos on ihmisen suolistoflooran suhteellinen stabilisuus, siten että samat bakteerityypit ja samat konsentraatiot säilyvät pitkiä aikoja.

20 Antibioottihoidon vaikutuksen kautta ei toivottavat mikro-organismit pystyvät asettautumaan maha-suolistoalueelle. Bakteerien joukossa näihin ei toivottuihin bakteereihin kuuluvat Pseudomonas, Enterobacter, Serratia, Klebsiella, Citrobacter sekä Proteus-Providensia. Sienet 25 voivat myös asettautua asumaan suoleen, erityisesti hiivat, kuten esimerkiksi Candida.

Vaikka terveet yksilöt voivat vastustaa bakteerien asettautumista suolistoon vieläpä antibioottihoidon aikana, isännillä, joiden immuunivastus on heikentynyt, on .30 näissä olosuhteissa edessään vakava vaara. Nämä ei toivotut mikro-organismit voivat tunkeutua limakalvoon, aiheuttaen verenmyrkytyksen sekä hengenvaarallisen sairauden.

Kliinisiin puitteisiin, joissa ei toivottujen bak-35 teerien asettautuminen suolistoon tulee tärkeäksi, kuuluu 13 ) O 08 5 syöpä, erityisesti potilailla, joita on käsitelty tehokkaalla kemoterapialla; perinnöllinen tai hankittu immuuni-puutosoireisto; potilaat, joita on hoidettu kortikosteroi-deilla erilaisten tilojen vuoksi; elinsiirtojen, kuten 5 esimerkiksi munuaisten, luuytimen, sydämen ja maksan vastaanottajat. Näitä ovat myös vanhemmat, heikentyneet potilaat, joihin ei toivottavat bakteerit ovat siirtyneet ja joita nämä bakteerit ovat infektoineet. Pikkulasten osalta päätyminen tehohoitoyksiköihin kytkeytyy usein antibioot-10 tihoitoon, huonoon ravintotilanteeseen sekä heikentyneeseen immuunivasteeseen liittyviin olosuhteisiin. Tähän suureen vaararyhmään kuuluvia lapsia uhkaavat myös ongelmat, jotka kytkeytyvät mahdolliseen patologisten baktee-reiden ja hiivojen kolonisaatioon.

15 Luonnollisen vastustuskyvyn ylläpitäminen ei toi vottujen mikro-organismien ylikasvua vastaan tunnetaan uusimmassa tieteellisessä kirjallisuudessa terminä "colonization resistance" (CR), kolonisaatioresistenssi. On suoritettu erilaisia toimenpiteitä joko kolonisaatioresis-20 tenssin lisäämiseksi tai vaihtoehtoisesti suolistomikro-organismien liikakasvun estämiseksi. CR:n lisäys saavutetaan käyttämällä antibiootteja, jotka saavat aikaan ainoastaan vähimmäisvaikutuksia normaalisuolistoflooran koostumuksessa, erityisesti pitämällä yllä normaaleja anaero-25 bisia komponentteja, jotka näyttävät olevan vastuussa ei toivottujen mikro-organismien liikakasvun torjunnasta. Vaihtoehtoinen menetelmä on estää kolonisaatio antamalla suun kautta antibiootteja, jotka käytännöllisesti katsoen tappavat kaikki uudet mikroflooraan tulijat. Tämä menetel-.30 mä tuottaa "steriilin" mikroflooran, ainakin lyhyeksi aikaa .

Vaikka kullakin näistä kolonisaatiota estävistä menetelmistä on etunsa, ne eivät ole välttämättä tehokkaita. Suhteellisen harvat terapeuttiset antibiootit pysty-35 vät pitämään yllä CR:a, joten tämä menettely on usein me- 14 9 0 0 8 5 nestyksetön. Toinen suun kautta annettavien antibioottien antamiseen kytkeytyvä menetelmä saa aikaan monia omia si-vuvaikutuksiaan, ja se on usein tulokseton, koska erittäin resistentit mikro-organismit voivat asettua suolistoon 5 vieläpä mikrobilääkkeiden läsnäollessa. Täten ei toivottujen mikro-organismien kolonisaatio joko aikuis- tai lapsi-isäntiin, joiden immuunivaste on heikentynyt, jää uudenaikaisen lääketieteen pääongelmaksi.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisten L. acidophilus 10 -kantojen bakteereita voidaan antaa potilaille edellä kuvatulla tavalla, CR:n aikaansaamiseksi hyödyllisellä tavalla, koska bakteereilla ei ole luontaista patogeenisuut-ta. Tällaisen luonnollisen organismin kolonisaatio suolistoon voisi estää muiden patogeenisten muotojen pääsyn 15 flooraan, kun taas samanaikaisesti pidetään yllä suhteellisen terveellisiä suolisto-olosuhteita.

Kolesterolin erittyminen

Viime vuosina on huomattavaa mielenkiintoa kohdistettu sterolien, erityisesti kolesterolin erittymiseen 20 ulosteiden mukana, koska tämä saattaa olla yhteydessä paksusuolen syövän kanssa. Koe-eläimillä suoritetut kokeet, jotka on tehty vuosikymmen sitten, osoittivat, että kolesterolin lisääntynyt erittyminen ulosteisiin voi laajentaa kemiallisesti aiheutettua paksunsuolen syöpää.

25 On ollut jonkin aikaa tunnettua, että kolesteroli kulkee enterohepaattisen kierron kautta, jonka seurauksena jonkin verran kolesterolia absorboituu uudestaan suolessa, ja jäljelle jäävä osa erittyy ulosteiden mukana. Paksusuolessa kolesteroli hajoaa mikrobi toiminnan johdosta 30 koprostanoliksi ja koprostanoniksi. Useimmat yksilöt erittävät pääosan kolesterolia näinä pienentyneinä lopputuotteina, mutta noin 20 % ihmisistä erittää enimmäkseen puhdasta kolesterolia ja ainoastaan pieniä määriä pienenty-mistuotteita.

35 Vaikka nämä eläintutkimukset olivat mielenkiinto!- 15 9 0 086 siä, niiden merkityksellisyyttä ei pidetty suurena, kunnes oli julkaistu kolesterolia alentavia lääkkeitä koskevia tutkimuksia. Nämä tutkimukset osoittivat, että kolesterolia alentavilla lääkkeillä onnistuttiin alentamaan 5 seerumin kolesterolitasoja ja vähentämään sydänkohtauksia.

Seuraus oli kuitenkin paksusuolen syövän lisääntyminen, sillä seerumin kolesterolin lasku tapahtui ulosteiden lisääntyneen kolesterolin kustannuksella. Nämä kliiniset kokeet varmistivat eläimillä saadut tulokset, joissa ulos-10 teiden korkeammat kolesterolitasot kytkeytyivät paksusuo len syövän vaaraan.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisia L. acidophilus -kantojen bakteereja voidaan antaa potilaille yllä kuvatulla tavalla, potilaiden ulosteissa erittyvän kolestero-15 Iin määrän vähentämiseksi.

Estrogeenin erittyminen

Estrogeenien mittaustekniikassa tapahtuneet parannukset ovat laajentaneet näitä tärkeitä sukupuolihormoneja koskevia tietoja. Estrogeeneja muodostuu suureksi osak-20 si ovarloissa, vähemmässä määrin rasva- ja muissa kudoksissa. Estrogeenit erittyvät pääasiallisesti virtsassa.

Viime vuosina tapahtunut tärkeä kehitys koskee estrogeenien enterohepaattisen kierron ymmärtämistä. On osoitettu, että puolet kiertävästä estrogeenistä kiertää ta-25 kaisin sapen kautta suolistoalueelle, jossa ne absorboituvat uudelleen kehoon. Ainoastaan 5 % estrogeeneista erittyy ulosteissa.

Erittyäkseen sapessa, estrogeenit konjugoituvat, yleensä glukuronideina tai sulfonaatteina. Nämä konjugoi-30 dut estrogeenit kulkevat sapen kautta suolistoon, jossa ne dekonjugoituvat suoliston bakteereiden toiminnan ansiosta ja absorboituvat tämän jälkeen uudelleen.

Enterohepaattisen kierron tärkeys osoitettiin Adlercreutz et al.:n tutkimuksissa, joissa tutkittiin 35 ulosteiden ja virtsan estrogeenit naisilla, jotka saivat 16 ^ 0 0 8 6 ampisilliiniä pientä infektiota vastaan. Tämä suun kautta nautittu antibiootti aiheutti 30 %:n vähenemisen virtsan estrogeenien erittymisessä ja siihen liittyvän estrogeenin erittymisen lisääntymisen ulosteissa. Selityksenä on se, 5 että antibiootti tukahdutti suolessa bakteerit, jotka olivat vastuussa estrogeenien dekonjugaatiosta. Tämän seurauksena oli vähentynyt uudelleenabsorptio ohutsuolessa ja lisääntynyt estrogeenien erittyminen.

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että virtsan ja 10 plasman korkeahkot estrogeenitasot korreloivat rintasyövän lisääntyneen vaaran kanssa. Tämä näyttää sopivan yhteen havainnon kanssa, jonka mukaan naispuolisilla kasvissyöjillä, joilla on alhaisemmat virtsan ja plasman estrogeenitasot, on vähentynyt riski sairastua rintasyöpään.

15 Kyseessä olevan keksinnön mukaisten L. acidophilus -kantojen bakteereja voidaan antaa edellä kuvatulla tavalla naisille, joilla on kuukautiset, eritetyn estrogeeni-määrän alentamiseksi; L. acidophiluksen nauttiminen vaikuttaa samoihin dekonjugoiviin entsyymeihin, jotka vaikut-20 tavat estrogeenin uudelleenabsorptioon.

Talletukset L. acidophilus -kanta GG on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collection, Rockville, MA, ja sille on annettu talletusnumero ATCC 53103. New 25 England Medical Center Hospitals, Inc., myöntää vastuunsa kyseisten viljelmien korvaamisen suhteen, mikäli ne kuolisivat ennen patentin voimassaolon loppumista, sekä vastuunsa ilmoittaa ATCC patentin julkaisemisesta jolloin talletukset tulevat yleisön saataville. Tähän asti talle-30 tukset ovat US-patenttiviranomaisten (Commissioner of

Patents) saatavissa, lakipykälien 37 CFR § 1,14 ja 35 USC § 112 edellyttävällä tavalla.

Muut suoritusmuodot sisältyvät seuraavaan patenttivaatimukseen.

Claims (1)

17 9UU85 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen Lactobacillus acidophilus -kannan ATCC 53103 eristämiseksi näyt-5 teestä, joka sisältää paljon bakteerikantoja, tunnettu siitä, että näyte seulotaan Lactobacillus-bak-teerien suhteen, jotka (a) pystyvät lujasti kiinnittymään maha-suolistoalueen soluihin, 10 (b) pystyvät lisääntymään ravintoalustassa, jonka pH on alle 5,5, ja (c) pystyvät lisääntymään ravintoalustassa, joka sisältää ainakin 0,1 % sappea. 15 Förfarande för isolering av en terapeutiskt använd- 20 bar Lactobacillus acidophilus-stam, ATCC 53103, ur ett prov innehällande mänga bakteriestammar, känne-t e c k n a t därav, att provet selekteras med avseende pä Lactobacillus-bakterier, som (a) förmär fästa sig härt vid celler i mag-tarm- 25 omrädet, (b) förmär föröka sig i ett näringsunderlag vars pH är under 5,5, och (c) förmär föröka sig i ett näringsunderlag som innehäller ätminstone 0,1 % galla. 30