具体实施方式
作为本发明的抗肥胖剂和抗肥胖食品(以下有时称为“抗肥胖剂等”)的有效成分的微生物,属于乳酸菌的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri),是可以产生由上述(1)~(3)的氨基酸序列(分别对应于序列表的1、3、5)或在该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的脂肪酶(以下称为“本发明脂肪酶类”)的乳酸菌(以下称为“本发明乳酸菌”)。
该本发明的脂肪酶类将存在于肠道粘膜细胞附近的脂质(三酰甘油)分解为脂肪酸和甘油,摄入到本发明乳酸菌中。而且,如图1所示,所摄入的脂肪酸作为菌体构成要素被利用,甘油经过各种代谢途径成为二氧化碳、丙酮、乙醇、乳酸盐或罗伊氏素(reuterin)。
本发明乳酸菌除了具有产生上述脂肪酶类的能力,即具有编码上述脂肪酶的核苷酸序列(基因)之外,优选具有以下(4)所示的核苷酸序列(对应于序列表的8)作为编码运载蛋白的基因。另外,本发明还包括与下述(4)所示核苷酸序列的同源性为80%以上、且能在严格条件下与编码具有甘油转运活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(4)所示核苷酸序列杂交、且编码具有甘油转运活性的蛋白质的核苷酸序列。
(4)ATGCATGGATTTATTGGCGAATTTTTTGGCACCATGGTTTTAATCCTATTAGGAGCAGGA
TGTTGTGCTGGTAATAGTTTGAATAAAACATATGGGAAACAAAGTGGCTGGTGGTTTATC
TGTATTTCATGGGGCTTAGCAGTTACAATGGGAGTTTATGTTGCAGGATTTCTGGGTTCA
TTAGGGCACTTAAATCCCGCTGTAACAATTCCTTTTGCTATTTTTGGCTTATTCCCATGG
AGTAACGTTATACCTTACTTACTTGGTCAATTTCTTGGTGCGTTTGTTGGTGCAGTATTA
GTAATTATTCAATTCTATCCACAATTTAAAGCAACCCCAAATGAAGAAGAAGGAAATAAT
GTTGGTATTTTTGCTACTCGTCCAGCGATAAATAGTCCAATTTTTAACTTTTTCTCAGAA
GTGATTGCGACCTTTGCATTTATTTTCATCTTATTAAATCTTGGCAACTTTACACAGGGA
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ACTGGCTTTGCATTAAACCCAGCTCGTGATTGGTCACCACGTTTAGCATATACTATTTTG
CCAATTCCTAATAAGGGTGTTTCAGAATGGTGGTATGCATGGGTTCCAATGTGTGGCCCA
ATTGTTGGGGGCCTTCTTGCTTGTGCTTTACAAACGGCACTAGTTTAG
该基因编码将甘油摄入到本发明乳酸菌的细胞内的运载蛋白,如图1所示,所摄入的甘油通过乳酸菌内的酶代谢。
进而,本发明乳酸菌优选具有由上述式(5)~(7)所示的氨基酸序列(分别对应于序列表的序列号9、11、13)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的亚基所构成的甘油分解酶。该亚基(5)~(7)所构成的甘油分解酶为在pdu(propanediol utilization)操纵子中发挥作用的甘油脱水酶(glycerol dehydratase),可以高效地代谢通过本发明脂肪酶的作用所产生的甘油。
另外,可通过基因工程学方法将编码该亚基(5)~(7)的核苷酸序列(9)~(11)(分别对应于序列表的序列号10、12、14)整合到其它乳酸菌等中,由此获得甘油分解性高的乳酸菌。本发明还包括与下述(9)~(11)所示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且在严格条件下与编码具有甘油分解活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(9)~(11)所示的核苷酸序列杂交、且编码具有甘油分解活性的蛋白质的核苷酸序列。
(9)ATGAAACGTCAAAAACGATTTGAAGAACTAGAAAAACGGCCAATTCATCAAGATACATTT
GTTAAAGAATGGCCAGAAGAAGGTTTCGTTGCAATGATGGGGCCTAATGACCCTAAGCCT
AGTGTAAAAGTTGAAAATGGCAAGATCGTAGAGATGGATGGTAAAAAGCTCGAAGATTTT
GATTTGATTGACTTGTACATTGCTAAGTATGGAATCAATATTGACAACGTTGAAAAAGTT
ATGAATATGGATTCTACCAAGATTGCACGGATGCTTGTTGATCCTAATGTTTCTCGTGAT
GAAATTATTGAAATTACATCAGCTTTGACTCCTGCTAAGGCTGAAGAGATCATCAGTAAG
CTTGATTTTGGTGAAATGATTATGGCTGTCAAGAAGATGCGCCCACGTCGTAAGCCTGAC
AACCAGTGTCACGTTACCAATACTGTTGATAACCCAGTTCAAATTGCTGCTGATGCTGCT
GATGCCGCTCTTCGTGGATTTCCAGAACAAGAAACCACGACAGCTGTGGCACGTTATGCA
CCATTCAATGCTATTTCAATTTTAATTGGTGCACAAACAGGTCGCCCTGGTGTATTGACA
CAATGTTCTGTTGAAGAAGCTACTGAATTGCAATTAGGTATGCGTGGTTTTACCGCATAT
GCTGAAACCATTTCAGTTTACGGTACTGATCGTGTATTTACCGATGGTGATGATACTCCA
TGGTCTAAAGGCTTCTTGGCATCTTGTTATGCATCACGTGGTTTGAAGATGCGATTTACT
TCAGGTGCCGGTTCAGAAGTTTTGATGGGTTATCCAGAAGGTAAGTCAATGCTTTACCTT
GAAGCGCGTTGTATTTTACTTACTAAGGCTTCAGGTGTTCAAGGACTTCAAAATGGTGCC
GTAAGTTGTATTGAAATTCCTGGTGCTGTTCCTAATGGTATTCGTGAAGTTCTCGGTGAA
AACTTGTTATGTATGATGTGTGACATCGAATGTGCTTCTGGTTGTGACCAAGCATACTCA
CACTCCGATATGCGGCGGACTGAACGGTTTATTGGTCAATTTATTGCCGGTACTGATTAT
ATTAACTCTGGTTACTCATCAACTCCTAACTACGATAATACCTTCGCTGGTTCAAACACT
GATGCTATGGACTACGATGATATGTATGTTATGGAACGTGACTTGGGTCAATATTATGGT
ATTCACCCTGTTAAGGAAGAAACCATTATTAAGGCACGTAATAAGGCCGCTAAAGCCCTT
CAAGCAGTATTTGAAGATCTTGGATTACCAAAGATTACTGATGAAGAGGTCGAAGCAGCA
ACGTATGCTAACACCCATGATGACATGCCAAAGCGGGATATGGTTGCAGATATGAAGGCT
GCTCAAGATATGATGGATCGTGGAATTACTGCTATTGATATTATCAAGGCATTGTACAAC
CACGGATTTAAAGATGTCGCTGAAGCAATTTTGAACCTTCAAAAACAAAAAGTTGTTGGT
GATTACCTTCAAACATCTTCTATTTTTGATAAAGATTGGAACGTCACTTCTGCTGTTAAC
GACGGAAATGATTATCAAGGACCAGGTACTGGATACCGTCTATATGAAGACAAGGAAGAA
TGGGATCGGATTAAAGACTTACCATTCGCCCTTGATCCAGAACATTTGGAACTGTAG
(10)ATGGCTGATATTGATGAAAACTTATTACGTAAAATCGTTAAAGAAGTTTTAAGCGAAACT
AATCAAATCGATACTAAGATTGACTTTGATAAAAGTAATGATAGTACTGCAACAGCAACT
CAAGAGGTGCAACAACCAAATAGTAAAGCTGTTCCAGAAAAGAAACTTGACTGGTTCCAA
CCAGTTGGAGAAGCAAAACCTGGATATTCTAAGGATGAAGTTGTAATTGCAGTCGGTCCT
GCATTCGCAACTGTTCTTGATAAGACAGAAACTGGTATTCCTCATAAAGAAGTGCTTCGT
CAAGTTATTGCTGGTATTGAAGAAGAAGGGCTTAAGGCGCGGGTAGTTAAAGTTTACCGG
AGTTCAGATGTAGCATTCTGTGCTGTCCAAGGTGATCACCTTTCTGGTTCAGGAATTGCT
ATTGGTATCCAATCAAAAGGGACGACAGTTATTCACCAAAAGGATCAAGACCCTCTTGGT
AACCTTGAGTTATTCCCACAAGCGCCAGTACTTACTCCCGAAACTTATCGTGCAATTGGT
AAGAATGCCGCTATGTATGCTAAGGGTGAATCTCCAGAACCAGTTCCAGCTAAAAACGAT
CAACTTGCTCGTATTCACTATCAAGCTATTTCAGCAATTATGCATATTCGTGAAACTCAC
CAAGTTGTTGTTGGTAAGCCTGAAGAAGAAATTAAGGTTACGTTTGATTAA
(11)ATGAGTGAAGTTGATGATTTAGTAGCAAAGATCATGGCTCAGATGGGAAACAGTTCATCT
GCTAATAGCTCTACAGGTACTTCAACTGCAAGTACTAGTAAGGAAATGACAGCAGATGAT
TACCCACTTTATCAAAAGCACCGTGATTTAGTAAAAACACCAAAAGGACACAATCTTGAT
GACATCAATTTACAAAAAGTAGTAAATAATCAAGTTGATCCTAAGGAATTACGGATTACA
CCAGAAGCATTGAAACTTCAAGGTGAAATTGCAGCTAATGCTGGCCGTCCAGCTATTCAA
AAGAATCTTCAACGAGCTGCAGAATTAACACGAGTACCTGACGAACGGGTTCTTGAAATG
TATGATGCATTGCGTCCTTTCCGTTCAACTAAGCAAGAATTATTGAACATTGCAAAGGAA
TTACGGGACAAGTATGACGCTAATGTTTGCGCAGCATGGTTTGAAGAAGCTGCTGATTAT
TATGAAAGTCGTAAGAAGCTAAAGGGCGATAACTAA
本发明乳酸菌优选进一步还保有下述(8)的氨基酸序列(对应于序列表的序列号15)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的肠道黏附性蛋白质。
(8)M F G H D G R I V T K V Y Q W A G T Y Y Y F D P N T Y L R V
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该肠道黏附性蛋白质具有使乳酸菌黏附在肠道粘膜细胞附近的作用,具有该蛋白质的本发明乳酸菌在肠道粘膜附近存在一定期间,可以稳定地摄入脂质。另外,可通过公知的方法将编码该蛋白质的下述(12)所示的基因(对应于序列表的序列号16)整合到其它乳酸菌中,由此获得在肠道内滞留时间长的乳酸菌。另外,本发明还包括与下述(12)所示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且在严格条件下与编码具有使乳酸菌黏附在肠道粘膜细胞附近的活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(12)所示的核苷酸序列杂交、且编码具有使乳酸菌黏附在肠道粘膜细胞附近的活性的蛋白质的核苷酸序列。
(12)ATGTTCGGTCACGATGGCCGCATTGTTACTAAAGTTTACCAATGGGCTGGCACGTATTAC
TACTTTGATCCGAATACTTATTTGCGAGTAGATAATGATTACCGTCAATCTCAGTGGGGC
GATTGGTATATGTTTGGCCCAGATGGTCGTATCGTTACAGGGTTAAAGGAATGGTACGGT
AGTTATTATTACTTTGATCCGACGACTTACTTAAAAGTAACTAATAAGTGGATAGATAAT
AAGTACTTTGGTCCAGCTGGTCAGCAAGCTATTTCACGCTTTGAGAGACTTGATAATAAG
TATTACTATTTCGATGCTAATGGGGCAGTTCTTAATATCCATGATCAATTTAAGAATATT
GATAACCACACTTATTACTTTGGAGCTGATGGTGCTTGTTATACCAGTCAATTCTTAAAT
AAGGATGGTAAACAGTATTATTTCGATAATGATGGAATTATGCTCACTGATCAAGAGAAG
ATCATTGACGGTAAATTCTATCATTTCAATGTTAATGGTGAAGCAATCCAAGTAAATGAT
CCTTCTGAAATTTGA
另外,本发明乳酸菌优选具有由下述式(16)~(20)任一个所示的氨基酸序列(分别对应于序列表的序列号17、19、21、23、25)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的甘油分解酶。该甘油分解酶为醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,图1中的ADH(8)),可以高效地代谢由本发明脂肪酶的作用所产生的甘油。这里所说的1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列是指与这些原本的序列等价的序列,依然保持甘油分解活性的序列。作为这种氨基酸序列,可以举出显示80%以上同源性的序列。
(16)M K A A V I N D P V D G F V T V K D V Q L R D L K P G E A L
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另外,还可以通过基因工程学的方法将编码该甘油分解酶(16)~(20)的下述核苷酸序列(32)~(36)(分别对应于序列表的序列号18、20、22、24、26)整合到其它乳酸菌等,由此获得甘油分解性高的乳酸菌。另外,本发明还包括与下述(32)~(36)任一个所示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且在严格条件下与编码具有甘油分解活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(32)~(36)任一个所示的核苷酸序列杂交、且编码具有甘油分解活性的蛋白质的核苷酸序列。
(32)ATGAAAGCTGCTGTTATTAATGATCCAGTAGACGGTTTTGTTACTGTTAAAGATGTTCAA
CTTCGGGATTTGAAGCCCGGTGAAGCTTTAGTTGACATGGAATATTGTGGTCTTTGTCAC
ACTGATCTACACGTTGCTGCTGGGGACTTTGGTAAGAAGCCCGGTCGTATTATCGGTCAC
GAAGGGGTTGGTCGTGTATCTAAGGTTGCCCCTGGCGTTACTTCCTTGAAAGTTGGCGAC
CGTGTATCAATTGCATGGTTCTTCAAGGGCTGTGGACACTGTGAATATTGTTTAACTGGT
CGTGAAACTCTTTGTCGGAACGTTCTTAATGCGGGTTACACTGCTGACGGTGCAATGGCT
GAACAATGTATCGTACCAGCTGACTACGCTGTTAAGGTTCCAGAAGGTCTTGATCCTGTT
GAAGCTACTTCATTAACTTGTGCTGGTGTTACGATGTACAAGGCATTAAAGGTTGCTGAC
ATCAAGCCAGGTCAATGGGTATCAATCGTTGGTGCTGGTGGTTTAGGTAACTTGGGTATT
CAACTTGCTCACAACGTATTTGGTGCTCATGTTATCGCTGTTGATGGTAATCCTGATAAG
CTTGAAGCCGCTAAGAAGAATGGTGCTGAAATTTTAATTAACCGTCATGACGGTGATGTT
GATAAGCAAATTCAAGAAAAGGTTGGCGGTGTTCACGCTGCTGTAGTAACAGCTGTTTCT
GCCTCTGCATTCGACCAAGCAGTTGATTCACTTCGCCCAGATGGTAAGCTTGTTGCCGTT
GCGCTTCCACAAGGTGACATGAAGCTTAACATTGCTAAGACTGTTCTTGATGGTATCATT
GTTGCTGGTTCATTAGTTGGTACCCGTCAAGACTTAGCTGAATGTTTCCAATTTGGTGCA
GAAGGTAAGGTTCACCCAATTGTTAAGACTCGTAAGTTAAGCGAAATTAATGATATGATC
CAAGAACTTAAGGATAACAAGGTTGTTGGTCGGAATGTTGTTGATTTTGTTCACAACGAT
AACGACTAA
(33)ATGGAAAAACGCGAAAATGCTATTCCGAAAACAATGAAGGCTTGGGCAGTCACAACTCCT
GGGCCGATTGATGGTAAGGAATCACCAATCGAATTTACCGAAAAGCCTGTGCCGACTCCT
AAACGGGGAGAAGTCCTTGTTAAGGTAATAACGTGTGGAGTATGTCATACGGACTTGCAC
GTGACTGAAGGAGACTTGCCGGTTCACCACGAACACGTTACTCCTGGTCATGAAATTGTT
GGTAAAGTTGTCGGCTTTGGACCAGAGACACAACGATTTAAGTTTGGTGAGCGAATTGGG
ATTCCATGGTTTCGGCATGCTTGTGGTGTATGCAAGTTTTGCCGATCAGGTCATGAGAAT
CTCTGTCCTCATTCACTTTATACCGGTTGGGATCATGATGGCGGTTATGCAGAATATGTC
ACAGTTCCAGAAGGATTTGCATATCGGCTTCCAGAAAAGTTTGATTCCCTAGAGGCAGCT
CCGTTATTATGTGCAGGGATTATTGGTTATCGGGCCTTTGAACGTGCCAATGTTCCGGCT
GGCGGTCGCCTAGGATTATATGGCTTCGGTGGTTCAGCTCATATTACAGCTCAAATTGCA
CTTGCTCAGGGAATTGAAGTGCATGTCTTTACGCGTGGTGAGGATGCCAAGAAATTCGCC
CTAGAATTAGGTTGTGCTTCTGTTCAGGGCTCCTATGACCCAGCACCAGTTCCTTTGGAT
TCATCAATCATTTTTGCGCCGGTTGGTGATATGGTCTTGCCGGCTTTAGCTAGTTTAGTT
CCAGGGGGGACATTAGCATTAGCCGGTATTCATATGACTGATATTCCAACAATGAATTAC
CAAAAAGAAATATTCCACGAAAAGACATTAACGAGTGTTGAGAGTAATACTCGTCGTGAT
GGGGAAGAATTCTTAACATTAGCTGATCGTCTTAATATCCATCCTGAAGTCCACGAATAT
CCCCTAGCAAAGGCTGACGAAGCATTACGCTATGTTAAGCACGGTGATATTAAGGGAGCT
TGTGTATTACGTGTTAGTGAGGACTAA
(34)ATGCAAATTAAAGCTGCTCTTGCAACCAAACCTAACGCTGATTTAGAGATTCAAACCGTC
GAATTGGATGAACCAAAAGAAAATGAAGTATTAATAAAAATTGCTTCAACAGGTTTTTGT
CATACAGATATTGTTGGTCGAAGCGGTGCCACTACCCCTCTCCCCGTTGTCCTCGGGCAT
GAAGGTGCGGGCGTCGTCCAAAAAGTAGGAGCTAACGTTACGGACGTTAAACCCGGCGAC
CATGTTGTTCTATCATTTAGCTACTGTGGCCATTGCTATAACTGTACTCATAATCATCAA
GGCTTATGCGAAAACTTCAATCAGCTAAACTTTGAAGGAAAAACCTATGATGGTACTCAC
CGCCTGCACTTAGATGATGGCACGCCAGTCAGTGTCTTTTTTGGTCAGTCTTCCTTTGCG
ACCTATGTAACAGCCAATGTCCATAATATTGTTAAAGTTGATCAAGATGTTGATCTTAAC
TTATTAGGGCCACTCGGTTGTGGAATGCAAACAGGTGCTGGAACCGTTCTAAATTATATT
AAACCTGCTCCTGAAGATGCAATTGCCGTTTTCGGTGCTGGTGCTGTTGGCTTAGCCGCA
ATTATGGCTGCTAAAATTGCTGGAGTTAAACATATTATTGCGATTAATCGTAACGGTAAC
CACCTTGACCTGGCGAAGGAATTGGGCGCTACTGAAACGATTAATAATACGGCTGAAGAT
CCCGTCAAAGCAATTAAAGAAATCGTTCCGCGTGGTGTAACTTATGCAATCGATACTACC
GGAAACACCGGTGTAATTAAATCAGCAATTGATAGTCTTGCCACCGCTGGAGAATGTGTC
CTCTTAGGAGTTGGCGGCGATATTACCTTAGACTTAATGAATGATATCTTATCAGAATCT
AAGAAAATCTCTGGGGTTGTCGAAGGAGATAGCAATCCCCAAGAGTTTATTCCTCAACTA
GTTAAGTACTACAAGCAAAGCAAGTTCCCCCTTGATAAGCTTGTTAAGTACTACGATTTT
GCTGATATTAACCAAGTTATCGCTGACTCAACAAACGGAAAGGTTATTAAGCCAATCATC
AAAATTGATCCTGAATTAGCTAAATAATTGCCGCTCACCAATGACGGAAGCAATGTTCAA
AAAATGGTTGCAGAAGCTGGCCTTGCTGATCAAATTACTATTGATTCAGCCGGAACAAGT
AACATTGCAGAAGGTTCACCTGCTGATAGTCGAACAAAAGCCATTCTCGATAAATATCAC
ATTAAAGACGACGGAATGATTGCCCGTCAATTGCAGGACAGGGATTATTATGATGCCGAT
TATATTATCGCAATGGATCAGATGAATGTCCGGGACGCAAAAGATATGGCACCAGCTGGG
TTAGAAAATAAGGTTCATGGAATCTTTGAAGCTACCCCAGGAAAAGAAAATTGCTATATC
GTTGACCCCTGGATCACTCACTGA
(35)ATGAAAAAAGCTATTTTTGAAAAGGCGGGTCAAATGAAGATTGTTGATGTTGACCGTCCA
ACAATTGAAAAGCCTGATGACGTAATTATTAAGGTAGTGCGGACCTGTGTTTGTGGTTCT
GACCTATGGAACTTCCGAGGAATTAATCCGGTTGAAAAAGATTCTGAAAACTCTGGCCAT
GAAGCAATTGGAATTGTTGAAGAAGTTGGTGAAGATATCACTACTGTCAAACCTGGGGAC
TTTGTGATTGCTCCATTTACTCATGGATGTGGGCACTGTGCTGCTTGTCGCGCGGGCTTC
GATGGTTCTTGCCAAAGTCACAACGATAACTTTAGCTCTGGTGTGCAAGCTCAATACGTT
CGGTTCCAACACGGTCAATGGGCGCTTGTTAAAGTTCCGGGCAAGCCAAGTGACTACAGT
GAAGGAATGCTTAAGTCCCTCTTAACCCTTGCTGATGTTATGGCTACTGGTTACCACGCT
GCACGAGTTGCTAACGTTAGTGATGGTGATACAGTTGTTGTAATGGGTGACGGTGCTGTT
GGCCTTTGTGCGATTATTGCTGCTAAGATGCGGGGCGCTAAGAAGATCATTTCTACTAGT
CGCCATGCTGACCGTCAAGCCCTTGCTAAGGAATTTGGTGCTACTGACAATGTTGCTGAA
CGTAGTGACGAAGCGGTTCAAAAGATCATGGAACTCACTAACGGTGCCGGTGCTGATGCT
GTCCTTGAATGCGTTGGTACTGAACAATCAACTGATACTGCCATGAAAGTTGGCCGTCCA
GGTACCATCGTTGGTCGGGTTGGCTTACCTCATACCCCAAAGATGGACATGACGGTGCTA
TTCTACAACAACACTATTGTCGGCGGTGGTCCAGCATCAGTAACCACTTACGACAAGGAC
GTATTGTTGAAGGCTGTTCTTGATGGTGACATTAACCCTGGTAAGGTCTTTACTAAGAGC
TTCGACCTTGACCAAATTCAAGAAGCTTATGAAGCAATGGATAAGCGTGAAGCAATCAAG
TCTTACATTATTATGGATGGCTTTGAACGCGATTAA
(36)ATGGGTCGTTTAGATAATAAAGTTGCAATTATTACTGGTGGTTCTAAAGGAATTGGAGCT
GCTGTCGCAAAAAAGTTTATCGAAGAAGGCGCAAAGGTTGTTTTAACCGCTCGGAAGATG
GATGAGGGACAAAAAGTCGCTGACCAACTAGGTGACAATGCGATCTTTATCCAACAAGAC
GTTGCTCGGAAAGGAGACTGGGACCGGGTAATCCGCCAAACTGTCCAAGTCTTTGGGAAG
CTCAATATTGTGGTTAACAATGCGGGAATTGCCGAATACGCCGATGTTGAGAAGACGGAC
GCTGAAATTTGGGATAAAACAATTGCCGTTAACCTTACCGGTACGATGTGGGGAACTAAG
CTCGGTATTGAAGCAATGAAGAACAACGGGGAAAAGAATTCAATCATCAATATGTCATCC
ATTGAAGGACTAATTGGTGATCCTGATCTCTTTGCATACAATGCTTCTAAGGGTGGTGTC
CGCCTCTTAACTAAGTCCGCTGCGCTTGATTGTGCCCGGAAAGGCTATGACATCCGTGTA
AATACAATTCATCCTGGTTATATCTCAACTCCACTAGTTGATAATTTGGTCAAGGATGAT
CCAAAAGCAGAAGGACACCTAGAAAGCCTTCATCCCCTTGGCCGTCTTGGAAAGCCAGAA
GAGATTGCTAACCTCGCTTTATACCTTGCTTCAGATGAATCAAGCTTTAGTACTGGTTCG
GAATTTGTCGCTGATGGTGGCTATACGGCTCAATAA
本发明乳酸菌优选具有由下述式(21)或(22)所示的氨基酸序列(分别对应于序列表的序列号27、29)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的甘油分解酶。该甘油分解酶为醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,图1中的ADH(8)),可以高效地代谢由本发明的脂肪酶作用所产生的甘油。这里所说的1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列是指与这些原本的序列等价的序列,依然保持甘油分解活性的序列。作为这种氨基酸序列,可以举出显示80%以上同源性的序列。
(21)M T N V P T V K L N N G V E M P T L G F E V F Q V P D L S Q
A E Q A V T D A L E V G Y R L I D T A A A Y Q N E E A V G K
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另外,还可以通过基因工程学的方法将编码该甘油分解酶(21)或(22)的下述核苷酸序列(37)或(38)(分别对应于序列表的序列号28、30)整合到其它乳酸菌等,由此获得甘油分解性高的乳酸菌。另外,本发明还包括与下述(37)或(38)所示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且在严格条件下与编码具有甘油分解活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(37)或(38)所示的核苷酸序列杂交、且编码具有甘油分解活性的蛋白质的核苷酸序列。
(37)ATGACAAATGTACCAACAGTAAAATTAAATAACGGAGTAGAAATGCCAACCCTTGGATTT
GAAGTATTCCAAGTTCCAGACTTAAGCCAAGCTGAACAAGCAGTTACCGATGCTCTTGAA
GTCGGCTATCGTTTAATCGATACTGCTGCTGCTTACCAAAATGAAGAAGCAGTTGGAAAG
GCAATTAAGAATAGTAGTGTAAACCGTGAAGATGTCTTTGTAACTTCTAAGTTATGGGTG
TCTGATTTTAACTATAAGCGGGCTAAAGCAGGGATTGACGCTTCACTGCAAAAACTTGGC
CTTGATTACATGGATCTTTACCTTCTCCATCAACCATATGGCGATACAATGGGGGCTTGG
CGAGCATTACAAGAAGCACAGAAAGAAGGTAAGATTCGCGCAATCGGTGTATCGAACTTC
TACGCTGATCAACTAAAGGATCTTGAATTAACAATGCCTGTTAAGCCAGCGGTCAACCAA
ATTGAAGTTAACCCTTGGTACCAGCAAGATCAAGAGGTTAAGTTTGCGCAAAGTGAAGAT
ATTCGTGTTGAAGCATGGGCACCATTTGCGGAAGGTAAGCATGATATTTTTACCAACGAA
ATAATTGCGGAAATTGCTGCCAAGTATGGCAAGAGCAATGGTCAAGTAATTCTTCGCTGG
CTTTTACAACGGGGTATTACTGTCATTCCAAAGTCAGTCCACAAGAACCGGATGGAAGAA
AATATCGATGTCTTTGATTTTGAACTTTCCAATGATGATATGAAAAAGATAGCTAGTCTT
AACAAGAAGGAAAGCCAATTCTTTGACCACCGTGATCCGGTTACGATTGAACAAATCTTT
GGCTCCAGCTTAAAGATGGTTCAAGATGACGAAAAATAA
(38)ATGATTTTAGATGAGACAATTACTCTTAATAGTGGTGTGAAAATTCCAAAGTTTGCATTA
GGAACCTGGATGATTGATGATGACCAAGCAGCCGAAGCAGTTCGGAATGCGATTAAGATG
GGATATCGGCACATCGATACAGCTCAGGCTTATGATAATGAGCGGGGAGTCGGTGAAGGT
GTACGAACAGCCGGTATTGATCGGGATAAAATCTTTGTTACTTCAAAGATCGCTGCTGAA
CACAAAGATTATGATGTAACTAAAAAGTCGATTGACGAGACTCTTGAAAAGATGGGTCTT
GATTATATCGACATGATGCTTATTCATAGTCCTCAACCATGGAAAGAAGTAAATCAATCT
GATAATCGTTACCTTGAAGGAAATCTCGCTGCTTGGCGAGCCATGGAAGATGCCGTTAAC
GAAGGTAAGATTCGAACAATTGGCGTTTCTAATTTCAAAAAAGCCGATCTTGAAAATATT
ATTAAGAATAGCGATACCGTTCCCGCTGTTGATCAAGTTTTAGCTCATATTGGTCATACT
CCATTCAATCTTTTATCATTTACTCATGAACATGACATTGCGGTTGAAGCATATTCACCA
GTTGCTCACGGCGCTGCTTTAGACAACCCCGTAATTGAAAAGATGGCTAAAAAGTACAAC
GTTTCAGTCCCACAATTGTGCATTCGGTATGATTGGCAAATAGGAATGATCGTCTTACCA
AAGACTACTAATCCAGAACACATGAAGGAAAACACTGAAATTGATTTTGAAATTTCTGAA
GCTGATATGGACCTATTGCGGCGAGTAAAGCCATTAGACTATGGCGATTTTGATATCTAC
CCTGTTTACGGTGGAAAAATGTAA
另外,本发明乳酸菌优选具有由下述式(23)~(2 5)任一个所示的氨基酸序列(分别对应于序列表的序列号31、33、35)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)。该醛脱氢酶为图1中所示的aldehyde dehydrogenase(9),可以高效地代谢由本发明脂肪酶的作用而产生的甘油。这里所说的1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列是指与这些原本的序列等价的序列,依然保持醛脱氢酶活性的序列。作为这种氨基酸序列可以举出显示80%以上同源性的序列。
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另外,还可以通过基因工程学的方法将编码该醛脱氢酶(23)~(25)的下述核苷酸序列(39)~(41)(分别对应于序列表的序列号32、34、36)整合到其它乳酸菌等,由此获得甘油分解性高的乳酸菌。另外,本发明还包括与下述(39)~(41)任一个所示的核苷酸序列的同源性为8 0%以上、且在严格条件下与编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(39)~(41)任一个所示的核苷酸序列杂交、且编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
(39)ATGCCTGCTAACAACAAGAAACAAGTTGAAAAGAAAGAATTAACTGCTGAAGAAAAAAAG
CAAAACGCCCAAAAGCTAGTTGACGATTTAATGACTAAGAGTCAAGCTGCTTTTGAAAAG
TTACGTTACTATTCACAAGAACAAGTTGACAAGATTTGTCAGGCAATGGCTCTCGCTGCC
GAAGAACACCACATGGACTTAGCTGTTGATGCTGCTAACGAAACTGGTCGTGGGGTTGCT
GAAGATAAGGCTATCAAGAACATCTACGCAAGTGAATACATTTGGAACAACATCCGTCAC
GATAAGACTGTTGGTATTATCGAAGACAATGATGAAGACCAAACTATCAAAATTGCTGAT
CCACTTGGTGTCATTGCCGGAATTGTTCCAGTTACTAACCCTACTTCAACAACGATCTTC
AAATCAATCATTAGTGCTAAGACACGGAATACAATCATCTTTTCTTTCCACCGTCAAGCA
ATGAAGTCATCTATCAAGACTGCAAAGATTCTCCAAGAAGCTGCTGAAAAAGCCGGTGCG
CCAAAGAACATGATTCAATGGCTCCCTGAAAGTACCCGCGAAAACACTACCGCATTACTC
CAACACCCTAATACTGCTACTATTTTAGCAACCGGTGGTCCTTCATTAGTTAAGGCTGCC
TACAGTTCTGGTAACCCTGCTCTTGGTGTTGGTCCTGGTAACGGTCCTGCTTACATCGAA
AAAACTGCCAACATCGAACGTTCTGTTTACGACATCGTTCTTTCTAAGACATTCGATAAC
GGTATGATTTGTGCCACTGAAAACTCAGTTGTTGTTGATGAAGAAATCTACGACAAGGTT
AAAGAAGAATTCCAAAAGTGGAACTGTTACTTCTTGAAGCCAAACGAAATTGATAAATTT
ACTGATGGCTTTATTGACCCAGATCGTCATCAAGTTCGTGGTCCAATCGCTGGTCGTTCA
GCTAATGCTATTGCTGACATGTGTGGTATTAAAGTACCTGACAACACTAAGGTTATCATT
GCTGAATACGAAGGTGTTGGTGACAAGTACCCACTTTCAGCTGAAAAGCTTTCACCAGTA
TTAACAATGTACAAGGCAACCTCTCACGAAAATGCCTTTGATATCTGTGCTCAATTATTA
CACTACGGTGGTGAAGGTCACACTGCTGCTATTCACACCCTTGATGATGATTTAGCTACT
AAGTACGGTCTTGAAATGCGTGCTTCACGGATCATTGTTAACTCCCCATCTGGTATTGGT
GGTATTGGTAACATCTACAACAACATGACTCCATCCCTTACTTTAGGTACTGGTTCATAC
GGTAGTAACTCAATTTCTCACAACGTTACTGATTGGGACCTCTTAAACATCAAAACAATT
GCAAAGCGGCGTGAAAACCGTCAATGGGTTAAGATTCCCCCAAAAGTATACTTTCAACGC
AACTCACTAAAAGAATTGCAAGATATTCCAAACATTAACCGGGCATTCATCGTTACTGGT
CCTGGAATGAGCAAGCGTGGTTACGTTCAACGTGTTATCGATCAATTGCGTCAACGCCAA
AACAACACTGCTTTCTTAGTATTTGATGACGTTGAAGAAGATCCATCAACAAACACTGTT
GAAAAAGGTGTTGCCATGATGAATGACTTCAAACCTGATACAATTATTGCTCTTGGTGGT
GGTTCACCAATGGATGCTGCTAAGGCTATGTGGATGTTCTATGAGCACCCAGAAACTTCA
TGGTATGGGGTTATGCAAAAGTACCTTGATATTCGGAAGCGTGCTTACCAAATCAAGAAG
CCTACTAAGTCTCAACTTATTGGTATCCCTACTACATCAGGTACTGGTTCAGAAGTTACT
CCATTTGCGGTTATTACCGATTCAAAAACTCATGTTAAGTACCCACTTGCTGACTACGCC
TTAACACCAAACATTGCAATCGTTGACTCACAATTCGTTGAAACTGTTCCAGCAAAAACT
ACTGCTTGGACTGGACTAGATGTTTTATGTCACGCTACTGAATCATATGTTTCTGTTATG
GCAACTGACTACACTCGTGGTTGGTCACTACAAACCATCAAGGGTGTTATGGAAAACCTT
CCTAAGTCAGTTCAAGGTGATAAGTTAGCTCGTCGTAAGATGCACGACTTCTCAACAATG
GCCGGGATGGCATTTGGTCAAGCCTTCTTAGGAATTAACCACTCCCTTGCCCACAAGATG
GGTGGAGCATTCGGTCTTCCTCACGGTTTGCTTATCGCTATTGCAATGCCACAAGTAATT
CGCTTTAACGCAAAACGTCCACAAAAGCTTGCTCTCTGGCCTCACTATGAGACTTACCAT
GCAACTAAGGACTACGCTGACATTGCACGGTTCATTGGTTTGAAAGGCAACACTGATGAA
GAATTAGCTGAAGCATATGCTAAGAAAGTTATCGAACTTGCTCACGAATGTGGTGTTAAG
CTTAGTCTTAAGGACAATGGTGTTACACGTGAAGAATTTGATAAGGCGGTTGACGATCTT
GCTCGCTTAGCTTACGAAGATCAATGTACTACTACTAACCCAGTTGAACCACTTGTTAGC
CAACTCAAGGAATTACTTGAACGTTGCTACGATGGTACTGGCGTTGAAGAAAAATAA
(40)ATGGCATATCAAAGTATCAATCCATTTACGAACCAAGTAGAAAAAACGTTTGAAAATACA
ACTGATGAAGAATTAGAACAAACATTAACTACGGCGCATCAATTATATTTAGATTGGCGG
AAGTATAATGACCTTGAAGAACGGAAACGGCAAATTTTAAAGTTAGGTCAAATATTACGT
GAACGGCGTGTTGAATATGCGACAGTTATGAGTAAGGAAATGGGAAAATTAATTAGCGAA
GCAGAAGGCGAGGTTGACCTTTGTGCTTCTTTCTGTGATTATTATGCAGCCCATGCAGAT
GAATTTCTGCAACCAAAAATTATTGCGACAACGAGTGGACGCGCCAAAGTTTTGAAGCAA
TCATTAGGAATTTTAGTTGCAGTTGAACCTTGGAATTTCCCATTCTATCAAATTGCCCGG
GTATTTATTCCCAACTTTATTGCAGGAAACCCCATGATCTTGAAGGATGCGTCGAATTGT
CCAGCATCCGCCCAAGCATTTAACGATGCCGTTAAGGAAGCTGGTGCGCCAGCCGGCAGT
TTAACTAATTTATTCCTTTCATATGACCAAGTAAATAAGGCAATTGCTGATAAGCGGGTA
GCCGGCGTTTGTCTTACTGGTTCTGAACGTGGTGGTGCAACCGTTGCTAAAGAGGCTGGT
GCTAATTTGAAGAAGAGCACTTTGGAACTTGGTGGTAATGATGCCTTTATTATCTTAGAC
GATGCAGATTGGGATCTTGTCGAAAAAGTTGCCCCGGCAGCCCGTCTGTATAATGCTGGA
CAAGTATGTACATCATCAAAACGTTTTATTGTCCTTGAAAAGGATTATGATCGTTTCTTA
AAGATGATGAAAGATGCGTTCTCGAAAGTTAAAATGGGTGATCCCCTTGATCCATTAACA
ACTCTGGCACCATTATCATCTAAGAAAGCAAAAGAAAAGCTCCAACAGCAAGTCGCAACA
GCAGTAGAAAATGGGGCCAAAGTTTACTATGGTAATAAGCCGGTTGACATGGAAGGTCAA
TTCTTTATGCCAACGATCTTAACTGATATCACTCCAGATAACCCAATATTTGATACGGAA
ATGTTTGGGCCAGTGGCTTCGGTTTATAAGGTTAGTTCCGAAGAGGAAGCAATCGAACTG
GCTAATAATTCAAGCTATGGGTTAGGAAACACTATCTTTAGCAATGATTCCGAACATGCG
GAACGAGTAGCAGCGAAGATCGAAACTGGAATGAGTTGGATTAATGCCGGCTGGGCTTCA
TTACCAGAATTACCATTTGGTGGTGTTAAGAATTCAGGTTACGGTCGTGAACTCAGCAGT
TACGGAATTGATGAATTTACTAACAAACATCTAATTTACGAAGCACGACAATAA
(41)ATGCAGATTAATGATATTGAAAGTGCTGTACGCAAAATTCTTGCCGAAGAACTAGATAAT
GCCAGCTCTTCAAGTGCAAACGTTGCAGCTACTACTGATAATGGTCATCGCGGAATTTTC
ACTAATGTCAATGATGCAATTGCTGCTGCAAAAGCTGCTCAAGAAATATATCGGGATAAG
CCAATTGCTGTTCGCCAACAAGTGATTGATGCCATTAAGGAAGGATTCCGCCCATATATT
GAAAAAATGGCTAAAGATATCAAAGAAGAAACAGGAATGGGAACAGTAGAGGCCAAAATT
GCTAAGTTAAACAATGCCTTGTACAACACTCCTGGTCCCGAGATTCTTGAACCAGTTGTA
GAAAACGGTGACGGTGGGATGGTTATGTATGAACGGTTACCATATGGTGTTATTGGTGCG
GTTGGCCCAAGTACAAACCCTTCAGAAACTGTAATTGCTAATGCGATCATGATGCTTGCC
GGTGGTAATACTCTTTACTTTGGTGCTCACCCTGGCGCAAAGAATGTTACTCGCTGGACA
ATTGAAAAGATGAACGATTTTATTGCAGATGCAACAGGCCTTCATAATTTAGTTGTAAGT
ATTGAAACACCAACAATTGAATCAGTTCAACAAATGATGAAGCACCCCGACATTGCAATG
TTAGCAGTAACTGGTGGCCCAGCTGTTGTTCACCAAGCAATGACCAGTGGTAAGAAAGCG
GTTGGTGCTGGTCCTGGTAATCCTCCTGCAATGGTTGATGCTACTGCTGATATTGATTTA
GCTGCTCATAATATCATTACATCTGCTTCATTTGATAATGATATTTTATGTACTGCTGAA
AAGGAAGTAGTTGCAGAAAGTAGCATTAAAGATGAATTAATTCGTAAGATGCAAGATGAA
GGTGCCTTTGTAGTTAACCGTGAACAAGCCGATAAATTAGCTGATATGTGTATCCAAGAA
AATGGTGCTCCTGATCGTAAATTTGTTGGTAAGGATGCAACTTATATCTTAGACCAAGCT
AATATTCCTTACACAGGCCACCCAGTTGAAATTATTTGTGAACTTCCTAAGGAACATCCA
TTAGTAATGACTGAAATGTTAATGCCAATTTTACCAGTTGTTTCTTGTCCAACATTTGAT
GATGTTTTGAAGACTGCTGTTGAAGTTGAAAAAGGTAACCATCACACAGCTACTATTCAT
TCCAATAACCTTAAGCATATTAATAATGCTGCTCACCGGATGCAATGTTCAATCTTTGTT
GTTAATGGCCCATCCTATGTTGGTACAGGTGTTGCAGATAATGGAGCTCACTCAGGTGCT
TCAGCATTAACAATTGCTACGCCAACTGGTGAAGGAACATGTACTGCACGAACATTTACT
CGTCGGGTTCGTTTGAACTCACCACAAGGATTCTCAGTACGTAACTGGTATTAA
本发明乳酸菌优选具有由下述式(26)所示的氨基酸序列(对应于序列表的序列号37)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的甘油酸激酶(glycerate kinase)。该甘油酸激酶为图1中所示的glyceratekinase(10),可以高效地代谢由本发明脂肪酶的作用而产生的甘油。这里所说的1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列是指与这些原本的序列等价的序列,依然保持甘油酸激酶活性的序列。作为这种氨基酸序列可以举出显示80%以上同源性的序列。
(26)M K F V I A P D S F K G G L T A K E A A N V M A E G I K R V
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另外,还可以通过基因工程学的方法将编码该甘油酸激酶(26)的下述核苷酸序列(42)(对应于序列表的序列号38)整合到其它乳酸菌等,由此获得甘油分解性高的乳酸菌。另外,本发明还包括与下述(42)所示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且在严格条件下与编码具有甘油酸激酶活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(42)所示的核苷酸序列杂交、且编码具有甘油酸激酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
(42)ATGAAATTTGTAATTGCTCCAGATTCATTTAAAGGCGGATTAACAGCAAAAGAAGCAGCA
AATGTGATGGCAGAAGGAATCAAAAGAGTGTTTCCGAATGCCGAGTATGCTTTAGTTCCA
ATGGCTGATGGAGGAGAGGGGACTGTTCAATCCTTAGTTGATGCGACTAACGGTCAAAAA
ATGATTGCTAAAGTCCACAACCCATTAAATAAATTAGTTAATGCTGAGTACGGAATATTA
GGTGATGGGGAAACGGCAGTGATTGAGATGGCGGCGGCAAGTGGCCTTCAATTTGTTAAT
AAGGAGACTGCGAACCCGCTTATTACAACTACATATGGTACCGGCGAGTTAATTAAGGAT
GCTCTTGACCATAACATTAAAAAAATAATTATTGGAATTGGTGGAAGTGCAACCGTTGAT
GGCGGAGCGGGGATGGCCCAAGCACTTGGAGCACGTTTATTGGATGCTGATAATCATGAA
ATTGGTTTAGGCGGTGGTGAGTTAGCAAGTTTAGAGCAAGTAGATTTTGGAGGATTAGAT
CCTCGCTTAAAAAATGTAGATATTCAGATTGCATCAGACGTAACCAACCCATTAACAGGA
AAAAATGGGGCAGCCCCAGTATTTGGCCCGCAAAAAGGAGCTGATGAAGAAATGGTGAAC
ATCTTGGACAAAAATCTTCATCATTATGCCCGAAAAATAGTTGCAGCTGGTGGGCCAGAC
GTTGAACAAACGGCAGGTGCAGGGGCAGCCGGTGGTTTAGGAGCCGGGTTGATAGCATTT
ACCGGTGCGACAATGAAGCGAGGAGTAGAATTAGTGATTGAAGCAACTCAACTACAAAAA
AAGGCAGTTGGCGCTGATTATGTTTTTACTGGTGAAGGAGGAATTGATTTCCAGACTAAA
TTTGGTAAAACGCCATATGGAGTCGCTAAGGCAACTAAAGAGGTGGCTCCAACTGCTCCG
GTAATTGTGTTGGCTGGAAATATTGGTAAAGGCGTAAATGATCTATATTCATCCACGGCC
ATTGATGCAATTTTTGCAACTCCTGAAGGGGCTAAACCATTAAAAACAGCATTAGCAGAT
GCACCTATTGATATTGCTCAAACAGCGGAAAACGTTGCACGTTTAATTAAAGTGAGTCAT
GTTAGTAATTAA
本发明乳酸菌优选具有由下述式(27)所示的氨基酸序列(对应于序列表的序列号39)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的甘油激酶(glycerolkinase)。该甘油激酶为图1中所示的GK(5),可以高效地代谢由本发明脂肪酶的作用而产生的甘油。这里所说的1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列是指与这些原本的序列等价的序列,依然保持甘油激酶活性的序列。作为这种氨基酸序列可以举出显示80%以上同源性的序列。
(27)L S E Q Q Y I M A I D Q G T T S S R A I I F D H D G N K V A
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另外,还可以通过基因工程学的方法将编码该甘油激酶(27)的下述核苷酸序列(43)(对应于序列表的序列号40)整合到其它乳酸菌等,由此获得甘油分解性高的乳酸菌。另外,本发明还包括与下述(43)所示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且在严格条件下与编码具有甘油激酶活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(43)所示的核苷酸序列杂交、且编码具有甘油激酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
(43)TTGAGTGAACAACAATATATCATGGCGATTGACCAGGGAACGACGAGCTCACGGGCGATT
ATCTTTGACCATGACGGAAATAAGGTTGCGATCAGTCAGCAGGAATTTCCCCAATACTTC
CCGCAGCCGGGGTGGGTTGAACATGATCCTCTAGAGATTTGGGATAGCGTTCAATCAGTG
ATTTCAAATGTAATGATTAAGTCCCAGATCAAGCCCTATAAGATTGCGGCAATTGGGATT
ACTAACCAACGGGAGACGACGGTTATTTGGGATCGCCATACCGGTAAGCCGATTTATAAC
GCAATTGTCTGGCAATCGAAGCAAACGAGCGACATCGCCGAACAATTGATTAAAGATGGT
TATAAGGATATGATCCACCAGAAGACTGGCTTGGTGATTGATTCGTATTTCGCGGCCACT
AAGATCAAGTGGATCCTTGACCATGTTCCTGGTGCCCGGGAAAAAGCAGCAAAGGGAGAC
TTGATGTTTGGGACTATCGATACTTGGTTACTATGGAATTTATCGGGACGGCGGGTCCAC
GCAACGGATGTGACCAATGCCAGCCGGACGATGCTTTTTAATATCCATACCCTCGACTGG
GATCAAGATATCCTTGACCTGCTTGATATTCCCCAGTCGCTTTTGCCAGTAGTAAAGCCA
AGTTCAGCCATTTACGGTTATACTGGCGACTACCACTTCTATGGGGTGCAGATTCCAATT
GCCGGGATTGCAGGTGACCAACAAGCAGCCCTCTTTGGTCAAGCAGCCTATGATAAAGGT
TCAATCAAGAACACCTATGGGACTGGAGCCTTCATCGTCATGAATACGGGACTAAAACCC
ACGCTTTCGGATAACGGCTTGTTGACGACGATTGCGTATGGCCTGGACGGGCAAACTCAT
TACGCGCTTGAAGGAAGTATCTTTGTGGCCGGTTCTGCCGTTCAATGGTTGCGGGATGGT
CTCAAGATGTTTGATAAGGCAAGCGAGTCCGAACAAATGGCTGTCGATGCCAAGACAACT
GGCGGCGTTTATGTCGTCCCCGCCTTTACAGGATTAGGCGCACCGTACTGGGATCAAGAA
GTGCGGGGCGCAATGTTTGGCCTTACCCGTGGAACTGAACGGGGACATATCATCCGTGCA
ACTTTGGAAGCCATTGCCTACCAGACCAAAGATGTTGTCGATACGATGGTCAAGGACACC
CAATTACCACTAACAGCACTAACGGTTAACGGGGGCGCTTCACGGAACAACTTCATGATG
CAGTTCCAGGCCGATATCTTACAAACGCCAATCAAGCGGGCAGCAATGGAAGAGACAACC
GCGCTGGGAGCAGCCTTTCTCGCTGGATTGGCCGTTGATTTCTGGGAAGACCAGGATGAG
TTACGGAAGCTATCACGGATTGGCGACCAGTTTGATCCACAAATGGATCCGCAAAAGGCA
GCTGACTTGTATCGGGGATGGCAACGGGCCATTGCAGCTGCGCAGTTTTATGGCAAAGAT
TAA
本发明乳酸菌优选具有由下述式(28)所示的氨基酸序列(对应于序列表的序列号41)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)。该甘油-3-磷酸脱氢酶为图1中所示的GPD(6),可以高效地代谢由本发明脂肪酶的作用而产生的甘油。这里所说的1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列是指与这些原本的序列等价的序列,依然保持甘油-3-磷酸脱氢酶活性的序列。作为这种氨基酸序列可以举出显示80%以上同源性的序列。
(28)M A E K I A V L G A G S W G S V L A N M L T E N G H D V T L
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另外,还可以通过基因工程学的方法将编码该甘油-3-磷酸脱氢酶(28)的下述核苷酸序列(44)(对应于序列表的序列号42)整合到其它乳酸菌等,由此获得甘油分解性高的乳酸菌。另外,本发明还包括与下述(44)所示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且在严格条件下与编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(44)所示的核苷酸序列杂交、且编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
(44)ATGGCAGAAAAAATTGCTGTTTTAGGTGCTGGTTCGTGGGGCAGTGTTTTAGCAAACATG
CTTACAGAAAATGGCCACGATGTAACATTATGGTCTCGTAATGAGGAACAAGTTAAGCAA
TTAAATACTGAACATACAAATCCTCGCTATATGAAAGATTTTGTTTATTCTACTAACTTA
ACAGCAACAACGGACATGAAAAAAGCTGTTAAGGGTGCCAGTGTGGTCCTGATTGTAATT
CCAACAAAGGGTCTTCGTGAAGTTGCTAAGCAATTAAATGCAATTTTGACTGAATTACAT
CAAAAACCGCTAGTTATTCACGCAACGAAAGGCTTAGAACAAAATACTTATAAGCGGCCA
TCGGAAATGCTTAGCGAAGATATTTCTCCTGAAAACCGTCAGGCAATTGTTGTTTTATCA
GGTCCGAGTCATGCTGAAGATGTGGCGATTAAAGATATGACAGCTGTAACCGCAGCTTGT
GAGGACCTGGCCAGTGCTAAAAAGGCGCAGAAGTTATTTAGTAATTCTTATTTCCGTGTG
TACACTAATGACGATGTAATTGGTGCCGAATTTGGCGCAGCCTTAAAGAACATTATTGCA
ATTGGTGCTGGAGCTATTCAGGGACTTGGTTATCATGATAATGCTCGGGCAGCGTTAATT
ACTCGTGGACTTGCAGAAATTCGCCGATTGGGAGTTGCTTTTGGTGCCAACCCGATGACT
TTTATTGGTCTTTCTGGGGTTGGTGACCTTGTTGTTACTGCTACCAGTAAAAATTCTCGA
AATTGGCGTGCTGGCTATCAATTGGGGCAAGGAAAAAAGCTTCAAGATGTAATTGATAAT
ATGGGAATGGTTATCGAAGGTGTCTATACTACCAAAGCCGCTTATGAATTAAGTCGTAAA
CGACAAGTACAGATGCCAATTACCGAAGCTCTTTACCGTGTTTTGTATGAAGGCGAAGAT
ATTAAAACTGCAATTTCTCAATTAATGGACCGAGATCTTACTTCAGAAAACGAATAA
本发明乳酸菌优选具有由下述式(29)~(31)任一个所示的氨基酸序列(对应于序列表的序列号43、45、47)或该氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列所表示的磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase)。该磷酸丙糖异构酶为图1中所示的triosephosphate isomerase(15),可以高效地代谢由本发明脂肪酶的作用而产生的甘油。这里所说的1个或多个氨基酸缺失、置换或增加的氨基酸序列是指与这些原本的序列等价的序列,依然保持磷酸丙糖异构酶活性的序列。作为这种氨基酸序列可以举出显示80%以上同源性的序列。
(29)M R K P F I A A N W K M H K N V Q E S V E F V D A I K G K L
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(30)M R K P F I I A N W K M N K N V H E S V A F V K A I K E K L
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(31)M R V P I I A G N W K M H K D V Q E A V S F I E K V K N Q L
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另外,还可以通过基因工程学的方法将编码该磷酸丙糖异构酶(29)~(31)的下述核苷酸序列(45)~(47)(对应于序列表的序列号44、46、48)整合到其它乳酸菌等,由此获得甘油分解性高的乳酸菌。另外,本发明还包括与下述(45)~(47)任一个所示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且在严格条件下与编码具有磷酸丙糖异构酶活性的蛋白质的核苷酸序列和下述(45)~(47)任一个所示的核苷酸序列杂交、且编码具有磷酸丙糖异构酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
(45)ATGCGCAAACCCTTTATTGCTGCTAATTGGAAGATGCATAAGAATGTCCAAGAATCGGTT
GAATTTGTGGATGCAATTAAAGGAAAGCTACCAGATCCGCAAGAAGTTGAAGTCGGAATT
GCAGCCCAAGCTTTTGCATTACCCAGTATGGTTCAAGCCGCTGATGATTCAGGATTAAAG
ATAATCGCGCAAAACGCGGCGGCTGAATATTCGGGAGCTTTCACTGGTGAAATTAGCTTA
CGAGGTTTAGCTGACGCCGGTGTTTCATATGTAATGTTAGGACATATTGAACGGCGCCAT
TTATTCCACGAGGATAATGAGTTGGTTAATCGGAAAGTGTTGGCAGCCCTTCAAATGGGA
GTTACCCCGATAATTTGTACGGATGAAACGATGGTCCAGAAAGAAGTTAATGGTGAAATT
CACTACGTTTTCCAGCAATTGATGAGCGTATTGAGGGGCGTTTCTCTTGATCAAATTAAA
AATGTAGTTGTTTCCTATGAACCAAGTTGGGCAGTTGGATATGGTCAGCATGCTAATCCA
GTTCTTGCTGAAGAAGGATGCCGTCAAATTCGGCGAACGATTGCTGATAACTACACTTAT
GAGATTGCTGATAAGATCAGGATTCTTTATGGGGGCAGTGTCAATCCAGATAATATCGGA
ATGATTATGAACAAGCCAGATGTAGATGGGGTATTAATCGGTCGGGCAAGTTTAGATGTT
GATAATTTTTTGCGAATGGTCAATTATTTAAAAAATGATCAAGAAAAATAA
(46)ATGCGCAAACCGTTTATTATTGCGAACTGGAAAATGAATAAAAACGTTCATGAATCTGTT
GCGTTTGTTAAAGCAATTAAAGAAAAGCTCCCGGCAGATAAAGAAATTGGGATCGCCGCG
CAAGCAGTTTCGCTATATAACATGAAAAAAGTGGCGAGCTCTTCCAACTTACAAATTATT
GCTCAAAATGCATCTGCTGAGTTAGAGGGACCATATACTGGAGAAATTAGCATGCGAAGT
TTAGCAGATGCGGGCGTGACATACGTGATGCTAGGCCATTTAGAGCGCCGACGCCTTTTT
AACGAGAGTAATGATTCAATTAATCAAAAAGTTTTAGCAGCCCTCAATGCTGGTATTATT
CCAATCATTTGTACGGATGAAGAGATGGTCCAAACAGAAGTTAACGGACAAATTCATTAT
GTATTTCGCCAACTAAAAAGCGTCCTTAAAGGGGTACCAGCTAATAAACTATCACAGATT
GTTATTTCGTATGAACCAAGTTGGGCCGTTGGGAGCACGCATCAAGCAAATCCAGACATT
GCGGAAGAGGGATGTCAGGCAATTCGTCAAAGCCTGGTTGAAATGTATGGTAATGAGATT
GGCGAGCAAGTCCGAATACTCTATGGTGGCAGCGTTAATCCCGAGAACATTGGTCAAATT
ATGAGTAAACCAAATGTTGATGGGGCGCTAATCGGTCGCGCAAGTCTCGAGATTGAAAGT
TTCTTACAAATGATTAATTATATCGAATTAGCGAGCAAGCAGAAGTTACAGGTAATTTAG
(47)ATGAGAGTACCGATTATTGCTGGTAATTGGAAAATGCATAAGGATGTACAAGAAGCTGTC
TCTTTTATCGAAAAAGTAAAAAATCAGCTTCCGCCTGCCGACCAACTTGAAACAGCAATT
GCTGCTCCTACTCTTTGTTTAGTACCAATGGTTAAAGCAGCTGAAGAATCCCCGTTAAAA
ATAATGGCAGAAAACTGCTACTATAAGAATGAGGGAGCTTATACTGGTGAAACAAGTCCA
TATGCTTTATACCAAGCAGGAATCCATCATGTGATTTTAGGCCATTCTGAACGCCGAACT
TACTTTAATGAAACTGATGAATTAATTAATAAAAAAGTGAAGGCAGCATTAGTAAATGGG
TTATGTCCGATTGTTTGTTGTGATGATACTATGCGTCGACGAGTTGCTGGAAAGAAAGTT
CATTGGGTGGTGAGCCGAATTCTCGCTGACCTTCATGGATTGACCAATGACGAAATTTGT
CATGTTACGGTTGCTTATGAACCAAGTTGGGCGATTGGAACAGGCGAGAGTGCTGATCCA
GAACAAGCGGCGGAAGGTTGTTACCTTATTCGGCAAACGATTAGTGATATGTATGGCGAT
GAAGTTGCAAATAACGTTCGAATTCTCTATGGCGGAAGTGTGACAACTTCTAATATCAAT
GCACTAATGGCAAAAAATGATATTGATGGTGTTTTAGTCGGAGCGGCGAGCTTAAATCCA
GAAACATTTTTACAATTAGTTCACCATTAG
以上说明的本发明乳酸菌可以根据常规方法对属于罗伊氏乳杆菌的微生物进行基因分析而获得。例如,通过对多个属于罗伊氏乳杆菌的微生物,研究是否存在与编码脂肪酶(1)~(3)的下述基因(13)~(15)(分别对应于序列表的序列号2、4、6)同源性高的核苷酸序列,从而可以获得目标的本发明乳酸菌。
(13)ATGGTGAAATTGATGACAATACACGAATTAGCAAATAACCCAACGTTAAGGGGCCAAGTA
CGCTTGATTGAAAATATTGTTTATGGTGCGATGGATGGTGAGGCATTACATATGTCGATC
TTAGCACCGTGGACGCAACGTTTCCCGAAACAATATCAAACTGAACCTCGACCATTGATT
GTCTTTGTTCAAGGAAGCTCGTGGCGAACACCAAAAATGGGAGAAGAAATTCCACAACTG
GTTCAATTTGTTCGGGCCGGTTATATTGTAGCGACTGTTCAACACCGTAGTTCAATTGAT
AGCCACCCATTTCCTGCCTTTTTGCAAGATGTTAAGACTGCCATTCGTTTCTTACGGGCC
AATGCGCAAAAATATGCAATTGATCCGCAACAGGTTGCAATTTGGGGGACTTCCTCTGGA
GCCAATGCGGCAATGCTAGTCGGCTTAACGGGTGATGATCCGCGCTATAAAGTTGACCTT
TATCAAGACGAATCGGATGCAGTAGATGCTGTGGTTAGTTGTTTTGCCCCAATGGACGTG
GAGAAGACGTTTGAGTATGATGCTAATGTTCCAGGAAATAAGTTACTGCAATATTGCTTA
TTAGGGCCTGATGTATCAAAGTGGCCAGAAATTGAAAAGCAAATGAGTCCCTTATATCAA
GTCAAAGATGGGCAAAACTACCCACCATTCTTATTGTTCCACGGAGATGCTGATAAAGTT
GTTCCATATGAACAGATGGAAAAAATGTATATGCGGTTGAAGGATAATGGAAATTCTGTT
GAAGCGTAGCGGGTTAAGGGTGCGAACCATGAACGAGATTTCTGGAGTCCAACAATTTAT
AATATTGTGCAGAAGTTTCTTGGCGATCAATTTAAATAA
(14)TTGATTTATGTTTTAAAAGATTTATGTAATACTATTGCTGAAGTCTATGGCAAAAGTATT
TTAAAAGGAGTTTTTATCATGAAACATACGCTTAAAGTTGATCAAGTACGTGACGGTTTA
TGGCTAGATTCAGATATTACGTATACGCAAGTTCCTGGATGGCTTGGTAATACAACGCGA
GATTTGAAGCTTTCAGTCATTCGACATTTTCAAACTAATGATGATACACGTTATCCAGTA
ATTTTTTGGTTTGCTGGTGGCGGCTGGATGGATACTGACCACAATGTTCATCTGCCGAAT
TTGGTTGATTTTGCTCGGGATGGTTACATTGTTGTCGGCGTCGAATATCGTGATAGCAAC
AAAGTTCAGTTTCCTGGGCAATTAGAAGATGCTAAGGCTGCTATTCGTTATATGAGAGCT
AATGCCAAGCGCTTCCAAGCTGATCCTAATCGGTTTATTGTGATGGGAGAATCGGCCGGT
GGACATATGGCAAGTATGCTAGGTGTTACTAACGGCCTTAACCAATTTGACAAAGGTGCT
AATTTAGATTACTCCAGTGATGTTCAAGTAGCAGTTCCTTTTTATGGTGTGGTTGATCCC
TTAACCGCTAAAACAGGAAGTGCATCAAACGATTTTGATTTTGTTTACCGTAACTTGCTT
GGTGCTGAGCCTGAAAACGCTCCTGAGCTTGATTCTGCCGCAAATCCCCTCACCTATGTA
AATTCTAATTCTACGCCCTTTCTTATCTTTCATGGGACAGAAGATGTCGTTGTTCCAATT
AAAGATAGTGAAAAGCTTTATGATGCATTAGTTGAAAACAACGTTCCTGCTGAATTATAC
GAAATCGAAGGCGCAAGTCACATGGATGTGAAATTCCTTCAACCACAGGTATTTAAGATT
GTGATGGACTTTTTAGATAAGTATTTAACTCGGTCATAG
(15)ATGGAAATTAAAAGTGTTAACTTAGATCAACCATATTCGTCTCTAGATATTTATCATAGT
AATACTGATAAAGCTTTGCCCGGTCTTGTTATTTTACCAGGAGGCAGTTATAACCAGATC
ATGGAGCGAGATTCTGAACGGGTGGCATTAACGTTTGCAACCCATGCATGGCAAACATTT
GTTGTACGATATCCGGTAGTTGAGCATAAGAATTATGAAGAAGCCAAAATAGCGGTTCAC
CAAGCATTTGAATATATCGTCAACCATGCAGCTGAATTAGATGTTGACGCTGATCGGTTG
GGGATTATTGGCTTTTCTGCAGGAGGCCAAATTGCCGCTGCATATAGTAATGAAAAACTA
ACACACGCTAGATTCGCCGCATTAGGATATCCTGTTATTCAACCCTTGATTGATGAACGT
ATGGGGGTTACAACAGAGAATGTAGCGAAATTAGTAAATCCGCAAACACCACCAACCTTT
ATGTGGGGATCGGCAAAAGATGAACTGACTCCCTTTGTTGATCACCTTCAAGTATATGCA
GATGCGTTAATTAAGAATGATATTCCATATGAATTACATGAGTTTGGCACTGGGGGACAT
GGAATCGCGTTAGCTAACGAATATACTGGTATTGTTAATAATGATCGGGTAGATAATCAT
ATGGGAAAGTGGTTCCCGCTATTTCTTGAGTGGTTAACTGAACTGAATTTAATTTAG
本发明中,所谓的“严格条件”可以列举如下条件:例如在含有6×SSC(1×SSC的组成:0.15MNaCl、0.015M的柠檬酸钠、pH7.0)、0.5%SDS、5×Denhardt、100μg/mL的热变性鲑鱼精子DNA的溶液中,与探针一起在50~65℃的温度下保存一晚使其杂交。
进而,具有运载蛋白基因(4)的本发明乳酸菌,具有编码甘油分解酶亚基的基因(9)~(11)、编码甘油分解酶的基因(32)~(38)、编码醛脱氢酶的基因(39)~(41)、编码甘油酸激酶的基因(42)、编码甘油激酶的基因(43)、编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(44)、编码磷酸丙糖异构酶的基因(45)~(47)或编码肠道黏附性蛋白质的基因(12)的本发明乳酸菌,也可以与上述同样地获得。
作为上述本发明乳酸菌的代表性菌,可以举出罗伊氏乳杆菌JCM1112T,其为理化学研究所的标准株。
本发明的抗肥胖剂可以通过将上述本发明乳酸菌制成可以口服且以活的状态到达肠道的活菌剂而调制。对于其剂型并无特别限定,例如可以为粉末剂、颗粒、片剂、胶囊剂等固体,凝胶、糊剂等半固体状,悬浮液,糖浆等液体状。这些各剂型可以通过制药领域中公知的方法制得。
配合在上述抗肥胖剂中的本发明乳酸菌可以应用公知的乳酸菌培养方法进行培养。作为该培养方法,可以根据常规方法将本发明乳酸菌进行液体培养,直接利用所得的培养物,或者通过离心分离等方法从该培养物中收集菌体后使用,还可以将培养物冷冻干燥制成粉末状后使用。
作为固体状的本发明抗肥胖剂的通常的制造方法,可以举出将本发明乳酸菌与水、淀粉、微晶纤维素、面粉、砂糖等载体一起配合,制成所需形态的方法。上述载体也是公知的,可以根据使用形态进行适当选择后使用。更具体地说,可以将通过常规方法培养获得的本发明乳酸菌的菌体制成冷冻干燥粉末,将其与砂糖混合,从而调制粉末剂。另外,还可以将本发明乳酸菌的菌体与适当的片剂用载体混合,根据常规方法进行压片,获得片剂。而且,还可以将本发明乳酸菌的湿菌体悬浮在糖浆中制成糖浆剂。调制本发明的抗肥胖剂时,还可以根据需要含有其它成分,例如其它微生物或有效成分、或者甜味料、香料、着色剂等。
如此获得的抗肥胖剂的给予量可以考虑对象的身体状况、例如健康状态、体重、年龄、病史、所使用的其它成分等适当地决定,一般来说,作为本发明乳酸菌的菌数,一个成人大致为108~109CFU/天左右。
使用本发明乳酸菌调制抗肥胖饮食品时,可以利用目前公知的乳酸菌的培养方法制成可以口服摄取的发酵食品。具体地说,可以制成酸奶等发酵乳、乳酸菌饮料、发酵香肠等食品,这些食品的制造可以通过使部分或全部所用乳酸菌采用本发明乳酸菌来进行。另外,还可以形成较多地含有本发明乳酸菌的形态,制成健康食品和功能性食品。在调制该抗肥胖食品时,当然并非仅含有本发明乳酸菌,还可以含有其它的乳酸菌,另外,还可以添加食品添加剂或调味品等。
本发明乳酸菌如后述实施例所示,具有显著的体重增加抑制效果(瘦身效果),认为其理由如下所示。
即,如图1所示,本发明乳酸菌通过3个脂肪酶(脂肪酶(1)~(3))的作用,将消化道内的脂肪成分分解为甘油和脂肪酸。然后,所分解的甘油被本发明乳酸菌所具有的运载蛋白(PduF;(4)的核苷酸编码)摄入到菌体内,进而被菌体内的甘油分解酶基因(PduCDE;由亚基(5)~(7)构成)代谢,产生罗伊氏素或转变为本菌自身的能量源。
另一方面,脂肪酸作为本菌的菌体成分被利用,而不会被吸收入生物体内。而且,(8)的肽具有本发明乳酸菌固定在人或哺乳动物肠道的功能,使本发明乳酸菌可以稳定地在肠道内存在一定期间。
如上所述,本发明乳酸菌由于稳定地存在于肠道内、积极地分解脂肪、且利用或进一步分解其代谢物,因此可以抑制脂质从肠道被吸收入体内、即便摄取通常的饮食也可以预防肥胖、维持及提高瘦身效果。
另外,本发明的一个方式包括本发明乳酸菌用于预防或治疗肥胖症的应用,还包括本发明乳酸菌用于制造抗肥胖剂的应用。
进而,本发明的又一个方式包括以向肥胖症患者给予本发明乳酸菌为特征的肥胖症治疗方法,还包括以给予本发明抗肥胖剂为特征的肥胖症治疗方法。
实施例
以下举出实施例,更加详细地说明本发明,但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
罗伊氏乳杆菌JCM1112T的抗肥胖效果试验:
通过下述材料和方法研究罗伊氏乳杆菌JCM1112T的抗肥胖效果。
使用材料和试验方法:
(1)使用的实验动物
使用体重约180~200g的SPF级Wistar系大鼠(8周龄-雄;日本SLC株式会社),从放入实验室开始设置7天的驯化期,开始实验。饲养环境设定为温度22±1℃、湿度55±5%、照明时间12小时(8点~20点),大鼠为1只/笼,利用给水瓶使其自由摄取灭菌蒸馏水、使用给饵器使其自由摄取大鼠用放射线灭菌固体样品*(CE-2,CLEA Japan Inc.)。所使用的饲养器具均使用通过高压蒸汽灭菌器灭菌的器具。
*饲养繁殖用(粗脂肪4.6%)
(2)待测菌液的调制
作为待测菌,使用罗伊氏乳杆菌JCM1112T(理化学研究所的标准菌、从该所购买)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)ATCC53103(GG株)。这些待测菌接种于MRS液体培养基(Oxid),在37℃下培养一晚,制成预培养液。将该预培养液添加到新鲜的MRS液体培养基中达到1%量,在37℃下培养18小时,将其作为待测菌液。
(3)待测菌液的给予
将上述实验动物分为各待测菌给予组和对照组(1组各5只),对待测菌给予组,将上述待测菌液通过口服给予。待测菌的给予使用探针强制进行。给予菌液在使用时调制,给予菌量为每只大鼠109CFU。另外,对对照组给予相同容量的PBS。
(4)体重测定和一般症状的观察
使用体重计每天测定实验动物的体重。每天均观察一般症状。对每个个体记录症状,用表现个体数来表示观察到显著变化的症状项目。
(5)结果
图2示意出分别给予上述乳杆菌属细菌的大鼠组和未给予的大鼠组的体重随时间增加的状况。由该图可知,与未给予组相比,罗伊氏乳杆菌JCM1112T给予组显著抑制了体重的增加,其程度大于鼠李糖乳杆菌ATCC53103给予组。
另外,实验动物的健康状态良好是由良好的体重增加的进展来显示的同时,由各组大鼠的诊察来确认的。
实施例2
罗伊氏乳杆菌JCM1112T的基因组解析:
使用下述药品,通过以下方法从罗伊氏乳杆菌JCM1112T中获取DNA,进行基因组解析。
DNA获取方法:
(药品)
核裂解液(Wizard基因组DNA纯化试剂盒;Promega公司生产)
生理盐水
50mMEDTA(pH7.0)
50mg/ml溶菌酶溶液(在使用当日,用TE缓冲液、0.25MTris-HCl(pH8.0)或10mMTris-HCl(pH8.0)/10mMEDTA/0.5%SDS溶解规定量的溶菌酶进行调制)
2mg/mlEDTA
苯酚·氯仿·异戊醇(25∶24∶1)混合液(以下简称为“PCI”)
氯仿·异戊醇(24∶1)混合液(以下简称为“CIA”)
99%乙醇
70%乙醇
TE缓冲液
(方法)
1.在静置条件、37℃下培养罗伊氏乳杆菌JCM1112T24小时,在3500rpm下离心分离所得培养液(50ml)15分钟后,利用生理盐水悬浮。
2.在3500rpm下离心分离上述1所得的悬浮液15分钟,舍去上清,利用5ml50mMEDTA悬浮。
3.在上述2所得的悬浮液中加入200μl50mg/ml溶菌酶溶液,在37℃下培养60分钟。(此时使用空气培养箱时,培养时间为2~3小时)
4.培养后,在3500rpm下离心分离15分钟,舍去上清。
5.在4所得的沉淀物中加入核裂解液5ml,在80℃下培养10分钟。
6.加入1μl2mg/mlRNaseA,在37℃下培养45分钟。
7.加入10mlPCI并混合,在3500rpm下离心分离15分钟。
8.将上清移至新的试管中,再加入10mlPCI并混合。
9.共增加3次同样的操作。(直至变得不能识别蛋白质层)
10.加入10mlCIA,缓缓混合后,在3500rpm下离心分离15分钟。(除去苯酚)
11.将上清移至新的试管中,进行乙醇沉淀。
12.将11所得的沉淀物溶解在1mlTE缓冲液中,获得乳酸菌DNA。
基因组解析方法:
对于如上获得的DNA进行结构基因预测和解析。联合使用GENOMEGAMBLER(Sakiyama,T.,Takami,H.,Ogasawara,N.,Kuhara.S.,Kozuki,T.,Doga,K.,Ohyama,A.,Horikoshi,K.,Anauromated system for genome analysis to support microbial whole-genome shotgun sequencing.,Biosci.Biotechnol.Bichem.,64:670-673.2000.)、GLIMMER 2.0(Salzberg,SL.,Delcher,AL.,Kasif,S.,and White,O.,Microbial gene identification usinginterpolated Markov models.,Nucleic.Acid.Res.,26:544-548.1998.)和BLAST program blastp(Altschul,SF.Gish,W.,Miller,W.,Myers,EW.,and Lipman,DJ.,Basic local alignment searchtool.,J.Mol.Biol.,215:403-410.1990)的结果来进行该结构基因预测等。
另外,域结构的解析使用INTERPRO(Mulder,NJ.,Apweiler,R.,Attwood,TK.,Bairoch,A.,Barrell,D.,Bateman,A.,Binns,D.,Biswas,M.,Bradley,P.,Bork,P.,Bucher,P.,Copley,PR.,Courcelle,E.,Das,U.,Durbin,R.,Falquet,L.,Fleischmann,W.,Griffiths-Johns,S.,Haft,D.,Harte,N.,Hulo,N.,Kahn,D.,Silventoinen,V.,Orchard,SE.,Pagni,M.,Peyruc,D,,Ponting,CP.,Selengut,JD.,Servant,F.,Sigrist,CJ.,Vaughan,R.,andZdobnov,EM.,The InterPro Database,2003 brings increasedcoverage and new features.,Nucleic.Acids.Res.,31:315-318.2003,;http://www.ebj.ac.uk/interpro)进行;分子系统树的制作中使用了CLUSTALW(Thompson,JD.,Higgins,DG.,and Gibson,TJ.,CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice.,Nucleic.Acids.Res.,22:4673-4680.1994.;http://clustalw.Genome.ad.jp/)。
进而,所使用的DNA和氨基酸序列由National Center ofBiological Information(NCBI,http://www.ncibi.nlm.nih.gov)和KEGG database(Ogata,H.,Goto,S.,Sato,K.,Fujibuchi,W.,Bono,H.,and Kanehisa,M.,KEGG:Kyoto Encuclopedia ofGenes and Genomes.,Nucleic,Acids.Res.,27:29-34.,1999.;http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg2.html)获得,乳杆菌属细菌的序列草图由DOE JOINT GENOME INS TITUTE(JGI;http://www.jgi.doe.gov/JGI_microbial/html/index.html)获得。
根据以上信息可知,(13)~(15)所示的基因分别为编码脂肪酶的基因、(4)所示的基因为编码运载蛋白的基因、(9)、(10)和(11)所示的基因为编码甘油分解酶的基因、(12)所示的基因为黏附性基因。另外可知,(32)~(38)所示的基因为编码甘油分解酶的基因、(39)~(41)所示的基因为编码醛脱氢酶的基因、基因(42)所示的基因为编码甘油酸激酶的基因、(43)所示的基因为编码甘油激酶的基因、(44)所示的基因为编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因、(45)~(47)所示基因为编码磷酸丙糖异构酶的基因。
实施例3
甘油分解基因的扩增:
将实施例2中精制的DNA作为模板,将以下核苷酸序列作为引物,使用下述反应液进行PCR。PCR条件也示于下。
(使用的引物)
pduCDE(F):
CACCATGAAACGTCAAAAACGATTT
pduCDE(R):
AAAAGCTTAGTTATCGCCCTTTAGC
(PCR反应液)
模板DNA:1μl
KOD-plus:1μl
10×KOD-plus缓冲液:5μl
dNTP(各2mM):5μl
引物(20mm):各1μl
MgSO4(25mm):2μl
去离子水(D.W.):34μl
(PCR条件)
(1)在94℃下保持3分钟。
(2)在94℃下保持15秒钟。
(3)在56℃(Tm)下保持30秒钟。
(4)在68℃下保持3分30秒钟。
(5)将(2)~(4)进行30个循环。
(6)在4℃下保存
实施例4
罗伊氏乳杆菌来源的脂肪酶基因和黏附性基因的扩增:
除了将引物换成下述引物之外,与实施例3同样地进行PCR,扩增脂肪酶基因和黏附性基因。
(使用的引物)
脂肪酶(1)
5’-ATGGTGAAATTGATGACAAT
5’-TTATTTAAATTGATCGCCAA
脂肪酶(2)
5’-TTGATTTATGTTTTAAAAGA
5’-CTATGACCGAGTTAAATACT
脂肪酶(3)
5’-ATGGAAATTAAAAGTGTTAA
5’-CTAAATTAAATTCAGTTCAG
黏附性基因
5’-ATGTTCGGTCACGATGGCCG
5’-TCAAATTTCAGAAGGATCAT