ES2965306T3 - Composición probiótica que comprende cepas de Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus paracasei - Google Patents
Composición probiótica que comprende cepas de Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus paracasei Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición que comprende una cepa de Lactobacillus rhamnosus determinada y una cepa de Lactobacillus paracasei determinada en la que la relación entre dicha cepa de Lactobacillus rhamnosus determinada y dicha cepa de Lactobacillus paracasei determinada (LRα:LPα) es mayor o igual a 8:1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición probiótica que comprende cepas deLactobacillus rhamnosusyLactobacillus paracasei
Campo de la invención:
La presente invención se refiere al campo de los probióticos. En particular, la presente invención se refiere a una composición probiótica que comprende una determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy una determinada cepa deLactobacillus paracaseien una proporción específica según las reivindicaciones. La presente invención también se refiere al uso de esta composición en un método de prevención o tratamiento del cuerpo humano o animal y al proceso para preparar esta composición.
Antecedentes de la invención:
Durante mucho tiempo se han asignado beneficios para la salud a algunos productos alimenticios fermentados, tales como el yogur, que varían desde una mejor absorción/disponibilidad de nutrientes debido a la fermentación hasta efectos específicos asignados a las propias cepas de bacterias.
Estos microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud en el hospedador, generalmente se denominan probióticos. La mayoría de los microorganismos usados como probióticos son bacterias del ácido láctico, en particular cepas de los génerosLactobacillusyBifidobacteria.
Se han realizado muchos estudios para investigar clínicamente los beneficios para la salud de las cepas lácticas.
Al principio, se pensaba que las cepas lácticas afectaban beneficiosamente al hospedador principalmente mejorando su equilibrio microbiano intestinal, a través de competencia con patógenos y bacterias productoras de toxinas.
En particular, se demostró que los probióticos previenen o tratan las infecciones intestinales (Fosteret al.,2011; Pamer, 2014). Dichas estrategias también están asociadas con una mayor eliminación de infecciones intestinales resistentes a los antibióticos en ratones (Vidalet al.,2010).
Ahora, también se ha demostrado que los beneficios para la salud de los probióticos van más allá del equilibrio microbiano intestinal. También incluyen el alivio de enfermedades inflamatorias intestinales crónicas, la prevención y el tratamiento de diarreas inducidas por patógenos, infecciones urogenitales, enfermedades atópicas, etc. Se ha demostrado queEscherichia coli Nissle 1917, Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)yLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 evitan el aumento de la permeabilidad intestinalin vivo(Ukenaet al.,2007, Donatoet al.2010 y Laval Let al.,2015).
Dado que los beneficios para la salud de los probióticos difieren de una cepa a otra, están surgiendo investigaciones sobre composiciones que comprenden múltiples especies de probióticos. Sin embargo, el comportamiento de una cepa puede verse influido por la presencia de otra cepa. De hecho, debido a la competencia y/o a las interacciones entre algunas de estas bacterias o los metabolitos que producen, no siempre es posible proporcionar una composición que comprenda varios probióticos.
De hecho, la mayoría de los estudios sobre probióticos usan cepas individuales. Hay menos estudios sobre la eficacia de mezclas de cepas probióticas (documentos WO 2012/136830 A1, KR2013/0002545 A, Comanet al.,Functional foods as carriers for SYNBIO®, a probiotic bacteria combination, International Journal of food microbiology, vol. 157, 2 de junio de 2012, Verdenelliet al.,Influence of a combination of two potential probiotic strains, Lactobacillus rhamnosus IMC 501 ® and Lactobacillus paracasei IMC 502 ® on bowel habits of healthy adults, Letters in apply microbiology, vol. 52, n.° 6, junio de 2011 páginas 596-602, Lin Wen-Hsinet al.,Induced apoptosis of Th2 lymphocytes and inhibition of airway hyper-responsiveness and inflammation by combined lactic acid bacteria treatment, International Immuno-pharmacology, vol. 15, n.° 4, 8 de noviembre de 2012, páginas 703-711). Y cuando se han llevado a cabo dichos estudios, la evidencia de que las mezclas son más eficaces que las cepas que las componen es limitada (Chapmanet al.,2011).
Descripción detallada de la invención:
Sorprendentemente, los autores de la invención han encontrado una composición de múltiples cepas muy eficaz que comprende una proporción apropiada de una determinada cepa deLactobacillus rhamnosuscon respecto a una determinada cepa deLactobacillus paracasei.Esta composición de múltiples cepas evita notablemente el aumento de la permeabilidad intestinal.
La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Un objeto de la presente invención es una composición que comprende:
- una cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y
- una cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689
en donde la proporción de dicha cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 con respecto a dicha cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 (LRa:LPa) está entre 9:1 y 15:1.
En una realización, la composición comprende al menos 106 unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml) de dicha cepa deLactobacillus rhamnosus.
En una realización, la composición comprende al menos una cepa adicional deLactobacillus paracasei.La al menos una cepa adicional deLactobacillus paracaseipuede serLactobacillus paracaseiCNCM I-1518.
En una realización, la composición es una composición alimenticia.
En una realización, la composición es un producto lácteo.
La presente invención también se refiere a una composición según la invención para su uso en un método para la prevención o el tratamiento del cuerpo humano o animal.
En una realización, la composición es para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno gastrointestinal, diabetes de tipo 1 y obesidad. El trastorno gastrointestinal puede ser una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y/o síndrome del intestino irritable (SII).
Un objeto de la invención es también un proceso para preparar una composición que comprende las etapas de: - añadir a un medio que sea un producto fermentado una cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y una cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 para obtener una composición con una proporción de LRa:LPa entre 9:1 y 15:1
o
- inocular un medio de fermentación, que es leche, con dicha cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y dicha cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 y
- fermentar el medio inoculado incubándolo a una temperatura adecuada para el crecimiento de dichas cepas, que está entre 25 °C y 44 °C durante 3 a 16 horas, hasta que la proporción de LRa:LPa esté entre 9:1 y 15:1.
La proporción de LRa:LPa puede determinarse de diferente manera. Por ejemplo, se puede determinar en función de las unidades formadoras de colonias de la determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy las unidades formadoras de colonias de la determinada cepa deLactobacillus paracaseien la composición. También puede ser en función de las UFC de cada una de las cepas dadas por gramo de peso seco de la composición o en función de las UFC de cada una de las cepas dadas por volumen de composición.
La proporción de LRa:LPa puede ser mayor o igual a 9:1, mayor o igual a 10:1 o mayor o igual a 11:1.
En una realización, la proporción de LRa:LPa es estrictamente mayor de 10:1. Preferiblemente, la proporción de LRa:LPa es igual a 10:1.
La proporción de LRa:LPa está entre 9:1 y 15:1, más preferiblemente entre 10:1 y 12:1.
En una realización preferida, la composición comprende al menos 106 unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml) de dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosus,preferiblemente entre 108 UFC/ml y 1010 UFC/ml, más preferiblemente 109 UFC/ml.
Dado que la proporción de LRa:LPa es conocida, es fácil determinar la concentración de dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseien función de la concentración de dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosus.Por ejemplo, si la determinada cepa deLactobacillus rhamnosusestá en 109 UFC/ml en la composición y la proporción de LRa:LPa es 10:1. Entonces, la determinada cepa deLactobacillus paracaseiestá en 108 UFC/ml en la composición. En una realización preferida, la composición comprende al menos 105 UFC/ml de dicha determinada cepa deLactobacillus paracasei,preferiblemente entre 107 UFC/ml y 109 UFC/ml, más preferiblemente 108 UFC/ml.
Normalmente, dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosuses una cepa probiótica que regula la función de barrera intestinal.
Se describe, pero no se reivindica una cepa deLactobacillus rhamnosusque seaLactobacillus rhamnosusGG (ATCC 53103).
LaLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 se describió en los documentos WO2009/130423 y US2013/02738 A1 y se depositó, según el Tratado de Budapest, en CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, París, Francia) el 19 de noviembre de 2006 con el número I-3690.
LaLactobacillus rhamnosusGG (ATCC 53103) (LGG®) se describe en el documento US4839281 y se depositó, según el Tratado de Budapest, en ATCC (American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd. Manassas, Virginia 20110-2209 Estados Unidos de América) con el número 53103.
Las cepas deLactobacillus rhamnosusque pueden obtenerse por mutagénesis o por transformación genética de la cepa deLactobacillus rhamnosusmencionada anteriormente y que mantienen sus propiedades probióticas también están incluidas en la presente invención. Preferiblemente, la cepa deLactobacillus rhamnosusesLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690.
Normalmente, dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseies una cepa probiótica con propiedades inmunomoduladoras. En una realización preferida, dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseise selecciona del grupo que consiste enLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 yLactobacillus paracaseiCNCM 1 -1518.
LaLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 se describe en los documentos WO2009122042 y US2013/02738 A1 y se depositó, según el Tratado de Budapest, en CNCM el 9 de noviembre de 2006 con la referencia CNCM I-3689.
LaLactobacillus paracaseiCNCM I-1518 se describe en los documentos EP0794707 y US2013/02738 A1 y se depositó, según el Tratado de Budapest, en CNCM el 28 de septiembre de 1994 con la referencia CNCM 1-1518.
LaLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 y laLactobacillus paracaseiCNCM I-1518 ambas tienen propiedades inmunomoduladoras (véase en particular el documento WO2009/130423).
En cuanto a la determinada cepa deLactobacillus rhamnosus,las cepas deLactobacillus paracaseique pueden obtenerse por mutagénesis o por transformación genética de la cepaLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 yLactobacillus paracaseiCNCM 1-1518 que mantiene sus propiedades probióticas también están incluidas en la presente invención.
En una realización más preferida, la composición comprende una determinada cepa deLactobacillus rhamnosusque esLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y una determinada cepa deLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseiCNCM I-3689. La proporción de la determinada cepa deLactobacillus rhamnosusque esLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 con respecto a la determinada cepa deLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 (LRa:LPa) es como se menciona anteriormente en la presente memoria, por ejemplo, mayor o igual a 9:1, mayor o igual a 10:1 o mayor o igual a 11:1.
En aún otra realización, la composición comprende una determinada cepa deLactobacillus rhamnosusque esLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690, una primera determinada cepa deLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 y una segunda determinada cepa deLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseiCNCM I-1518. La proporción de la determinada cepa deLactobacillus rhamnosusque esLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 con respecto a la primera determinada cepa deLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 (LRa:LPa<1>) es como se menciona anteriormente en la presente memoria, por ejemplo, mayor o igual a 9:1, mayor o igual a 10:1 o mayor o igual a 11:1.
Y la proporción de la determinada cepa deLactobacillus rhamnosusque esLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 con respecto a la segunda determinada cepa deLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseiCNCM I-1518 (LRa:LPa<2>) es también como se menciona anteriormente en la presente memoria, por ejemplo, mayor o igual a 8:1, mayor o igual a 9:1, mayor o igual a 10:1 o mayor o igual a 11:1.
La composición puede comprender además otras cepas deLactobacillusy/u otras cepas de bacterias además de la determinada deLactobacillus rhamnosuso la determinada deLactobacillus paracasei.
Por ejemplo, la composición puede comprender diversos fermentos que pueden usarse para realizar la fermentación del producto lácteo y, en particular, un cultivo de bacterias del ácido láctico tales como:
-Lactobacillus sp.(por ejemplo,Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bifidusy combinaciones de las mismas),
-Lactococcus sp.(por ejemplo,Lactococcus lactis),
- Bifidobacterium sp.(por ejemplo,Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium animalis,especialmenteBifidobacteria animalissubesp.lactis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longumy combinaciones de las mismas), y/o
-Streptococcus sp.(por ejemplo,Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis, Streptococcus cremorisy combinaciones de las mismas). Las bacterias del ácido láctico preferidas para usarse en la presente invención, en particular, para obtener una composición láctea fermentada se seleccionan deLactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Bifidobacterium animalissubesp.lactis,y combinaciones de las mismas.
En una realización, la composición comprende al menos una cepa adicional deLactobacillus paracasei.La cepa adicional deLactobacillus paracaseidifiere de dicha determinada cepa deLactobacillus paracasei.Dicha al menos una cepa adicional deLactobacillus paracaseipuede ser, por ejemplo, laLactobacillus paracaseiCNCM I-1518 (con la condición de que la determinada cepa deLactobacillus paracaseino seaLactobacillus paracaseiCNCM I-1518). Cuando la composición comprende dicha cepa adicional deLactobacillus paracasei,la cepa adicional deLactobacillus paracaseino se tiene en cuenta en la proporción de LRa:LPa. Por ejemplo, si la composición comprende una determinada cepa deLactobacillus rhamnosusque esLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690, una determinada cepa deLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 y una cepa adicional deLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseique esLactobacillus paracaseiCNCM I-1518, la proporción de LRa:LPa es la proporción deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 con respecto aLactobacillus paracaseiCNCM I-3689. LaLactobacillus paracaseiCNCM 1-1518 no se tiene en cuenta en esta proporción. La proporción deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 con respecto aLactobacillus paracaseiCNCM I-1518 (LRalPp) puede ser diferente de la proporción de LRa:LPa. Por ejemplo, la proporción de LRa:LPa puede ser 10:1 y la proporción de LRa:LPp puede ser 1:1. Según la presente invención, la composición puede estar en una forma adecuada para administración oral. Esto incluye, por ejemplo, sólidos, semisólidos, líquidos y polvos. Se prefieren composiciones semisólidas, tales como yogures, y composiciones líquidas, tales como bebidas.
La composición puede ser una composición farmacéutica o una composición nutritiva. Según una realización preferida, la composición es una composición nutritiva, tal como un producto alimenticio (incluyendo un alimento funcional) o un complemento alimenticio.
Un "complemento alimenticio" indica un producto elaborado a partir de compuestos habitualmente usados en los productos alimenticios, pero que se presenta en forma de comprimidos, polvo, cápsulas, bebedizos o cualquier otra forma no asociada habitualmente a los alimentos, y que tiene efectos beneficiosos para la salud. Un "alimento funcional" es un alimento que además tiene efectos beneficiosos para la salud. En particular, los complementos alimenticios y los alimentos funcionales pueden tener un efecto fisiológico (protector o curativo) contra una enfermedad, por ejemplo, contra una enfermedad crónica. Según la invención, la composición puede ser un producto lácteo, preferiblemente un producto lácteo fermentado.
En el contexto de la presente invención, "producto lácteo fermentado" indica más particularmente un producto lácteo fermentado listo para el consumo humano, tal como una leche fermentada, un yogur o un queso fresco tal como un queso blanco o un petit-suisse. También puede ser un producto lácteo fermentado colado, tal como un yogur colado, también denominado yogur concentrado o yogur de estilo griego.
A las expresiones "leche fermentada" y "yogur" se les da su significado habitual en el campo de la industria láctea, es decir, productos destinados al consumo humano y procedentes de la fermentación láctica acidificante de un sustrato lácteo. Estos productos pueden contener ingredientes secundarios tales como frutas, verduras y hortalizas, azúcar, etc.
La expresión "leche fermentada", por tanto, queda reservada en la presente solicitud a un producto lácteo elaborado con un sustrato lácteo que se ha sometido a un tratamiento al menos equivalente a la pasteurización, sembrado con microorganismos pertenecientes a la especie o especies características de cada producto.
El término "yogur" se reserva a la leche fermentada obtenida, según el uso local y constante, por el desarrollo de bacterias lácticas termófilas específicas conocidas comoLactobacillus delbrueckiisubesp.bulgaricusyStreptococcus thermophilus,que deben estar en estado vivo en el producto terminado, a una tasa mínima. En determinados países, la normativa exige la adición de otras bacterias lácticas a la producción de yogur y, en particular, el uso adicional de cepas deBifidobacteriumy/oLactobacillus acidophilusy/oLactobacillus casei.Estas cepas lácticas están destinadas a conferir diversas propiedades al producto acabado, tales como favorecer el equilibrio de la flora intestinal o modular el sistema inmunológico. El yogur puede ser yogur batido o cuajado.
Por lo tanto, en la práctica, la expresión "leche fermentada" se usa generalmente para indicar las leches fermentadas distintas de los yogures. También puede conocerse, según el país, con nombres tan diversos como, por ejemplo, "Kefir", "Kumtss", "Lassi", "Dahi", "Leben", "Filmjolk", "Villi", "Acidophilus milk".
Finalmente, la denominación "queso blanco" o "petit-suisse" está reservada, en la presente solicitud, para el queso sin refinar y no salado, que se ha sometido a fermentación únicamente por bacterias lácticas (y ninguna fermentación distinta de la fermentación láctica).
El producto lácteo fermentado se elabora a partir de leche entera y/o leche total o parcialmente desnatada, que se puede usar en forma de polvo que se puede reconstituir mediante la adición de agua. Se pueden añadir otros componentes de la leche tales como nata, caseína, caseinato (por ejemplo, caseinato de calcio o sodio), proteínas del lactosuero, en particular en forma de concentrado (WPC), proteínas de la leche, en particular en forma de concentrado (MPC), hidrolizados de proteínas de la leche y mezclas de los mismos.
La leche y los componentes de la leche normalmente tienen un origen animal, tal como origen de vaca, cabra, oveja, búfala, burra o camélido.
El producto lácteo fermentado contiene un agente texturizante, es decir, un agente usado para modificar la textura general o la sensación en boca de un producto alimenticio, tal como agentes gelificantes (por ejemplo, gelatina, agar, carragenina, pectina, gomas naturales), estabilizantes (por ejemplo, almidón, agar, pectina, goma, gelatina arábiga), espesantes (por ejemplo, goma guar, goma xantana, pectina, almidón, agar, carragenina, ácido algínico). Puede ser más particularmente un agente gelificante tal como gelatina, agar, carragenina o pectina, en particular gelatina, agar o carragenina.
Además del agente texturizante, pueden estar presentes otros aditivos alimenticios, elegidos en particular entre: - azúcares y edulcorantes:
los azúcares y edulcorantes son agentes edulcorantes de carbohidratos aceptables para los alimentos que pueden ser edulcorantes naturales o artificiales, sin calorías o bajos en calorías; ejemplos preferidos de azúcares apropiados son sacarosa, fructosa, lactosa, glucosa y maltosa. Dichos azúcares pueden incorporarse en forma de azúcar de remolacha, azúcar de caña, azúcar de arce, melaza, jarabe de maíz, jarabe de malta, jarabe de arce, néctar de agave o también miel;
ejemplos preferidos de edulcorantes sin calorías o bajos en calorías apropiados son aspartamo, sucralosa, acesulfamo de potasio, sacarina, ciclamato de sodio, taumatina, tagatosa, neohesperidina dihidrocalcona, isomaltulosa, rebaudiósido A o también un extracto de Stevia (que contiene rebaudiósido A).
- vitaminas (por ejemplo, vitamina A, B1, B2, B6, B12, C, D, E o K, ácido fólico, etc.),
- antioxidantes,
- agentes modificadores del pH (por ejemplo, agentes tamponantes o agentes acidificantes tales como ácido cítrico y sus sales, por ejemplo, citrato de sodio, potasio o calcio),
- lubricantes (por ejemplo, aceites vegetales),
- conservantes (por ejemplo, ácido sórbico y sus sales tales como sales de sodio, potasio y calcio, dióxido de azufre, ácido benzoico y sus sales tales como sales de sodio, potasio y calcio, p-hidroxibenzoato de etilo, metilo o propilo, etc.),
- agotadores del sabor (por ejemplo, ácido glutámico y sus sales tales como sales de sodio, potasio, calcio, magnesio o amonio),
- agentes aromáticos aromatizantes de origen sintético o natural (por ejemplo, aromas de frutas), y
- agentes colorantes (pigmentos, tintes, etc.).
Si es necesario, el experto podrá elegir los aditivos alimenticios apropiados entre todos los aditivos alimenticios y excipientes bien conocidos disponibles en el mercado.
La composición de la invención también puede ser un producto fermentado que sea vegetal fermentado, tal como soja, cereales y/o frutas fermentadas en forma cuajada, agitada o bebible. El producto fermentado puede estar en forma de líquido o en forma de polvo seco obtenido al secar el líquido fermentado. Las composiciones nutritivas que pueden usarse según la invención también incluyen alimentos para bebés, fórmulas lácteas para lactantes y fórmulas lácteas de continuación para lactantes. En una realización preferida, el producto fermentado es un producto fresco. Un producto fresco, que no se ha sometido a etapas de tratamiento térmico intenso, tiene la ventaja de que las cepas bacterianas presentes están en forma viva.
La presente invención también se refiere a una composición de la invención para su uso en un método para la prevención o el tratamiento del cuerpo humano o animal.
En una realización preferida, la composición de la invención es para su uso en la mejora de la integridad de la barrera epitelial intestinal. De hecho, como se menciona previamente, dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosuses normalmente una cepa probiótica que regula la función de barrera intestinal.
La disfunción de la barrera intestinal es un factor importante en la manifestación clínica de un amplio número de trastornos y enfermedades, tal como el síndrome del intestino irritable (SII), alergias alimentarias, diabetes de tipo 1, obesidad (Camilleri M LKetal.,2012, Perrier C CB.etal.2011, Vaarala O., 2012) y precede a procesos de inflamación crónica, tal como enfermedades inflamatorias intestinales (EII) (Vetrano S.et al.,2011).
Por tanto, la composición de la invención puede ser para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno gastrointestinal, diabetes de tipo 1 y obesidad. En particular, el trastorno gastrointestinal puede ser una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y/o síndrome del intestino irritable (SII).
Debido a las propiedades inmunomoduladoras de dicha determinada cepa deLactobacillus paracasei,la composición también puede usarse como composición inmunomoduladora. Preferiblemente, la composición de la invención es para su uso tanto como composición inmunomoduladora como en la prevención o el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno gastrointestinal, diabetes de tipo 1 y obesidad.
La presente invención también se refiere a un proceso para preparar una composición de la invención.
Las composiciones probióticas que comprenden múltiples cepas se obtienen clásicamente cultivando por separado cada cepa probiótica que se usará en la composición en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicha cepa, y añadiéndolas al producto final una vez completado su crecimiento.
Por tanto, en una realización, el proceso para preparar la composición de la invención comprende la etapa de añadir a un medio que es un producto fermentado una cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y una cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 para obtener una composición con una proporción de LRa:LPa entre 9:1 y 15:1. La determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy la determinada cepa deLactobacillus paracaseise cultivan por separado, cada una en condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa. Luego, una vez completado su crecimiento, dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseise añaden a un medio para obtener la proporción deseada de LRa:LPa, produciendo de ese modo la composición de la invención. Si el medio no comprende ya dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracasei,dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseise pueden añadir a un medio en la proporción deseada de LRalPa.
Otra forma de preparar composiciones probióticas de múltiples cepas es la cofermentación, también denominada cocultivo.
En esta realización, el proceso para preparar la composición de la invención comprende las etapas de:
- inocular un medio de fermentación, que es leche, con dicha cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y dicha cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 y
- fermentar el medio inoculado incubándolo a una temperatura adecuada para el crecimiento de dichas cepas, que está entre 25 °C y 44 °C durante 3 a 16 horas, hasta que la proporción de LRa:LPa está entre 9:1 y 15:1. La fermentación se detiene cuando se alcanza la proporción deseada de LRa:LPa.
La principal ventaja de la cofermentación es que los metabolitos liberados por las cepas durante la fermentación permanecen en el producto final, es decir, en la composición de la invención.
La presente invención también se refiere a un proceso para preparar una composición, que comprende las etapas de:
- añadir a un medio, que es un producto fermentado, una cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y una cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 para obtener una composición con una proporción de LRa:LPa entre 9:1 y 15:1
o
- inocular un medio de fermentación, que es leche, con dicha cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y dicha cepa deLactobacillus paracaseiCepa CNCM I-3689 y
- fermentar el medio inoculado incubándolo a una temperatura adecuada para el crecimiento de dichas cepas, que está entre 25 °C y 44 °C durante 3 a 16 horas, hasta que la proporción de LRa:LPa está entre 9:1 y 15:1.
En una realización preferida de este proceso para preparar una composición, la proporción de LRa:LPa es como se describe anteriormente en la presente memoria.
En una realización, cada determinada cepa se cultiva por separado cada una en condiciones adecuadas para su crecimiento, luego cada determinada cepa se añade a un medio en una cantidad adecuada.
En otra realización, el proceso para preparar una composición comprende las etapas de inocular un medio de fermentación con dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseiy fermentando el medio inoculado incubándolo a una temperatura adecuada para el crecimiento de dichas cepas, hasta que la proporción de LRa:LPa está entre 9:1 y 15:1. En esta realización, las cepas dadas se cofermentan y la fermentación se lleva a cabo para obtener una proporción adecuada de LRa:LPa en el medio de fermentación al final de la fermentación.
Preferiblemente, el medio de fermentación es leche.
La presente invención también se refiere al uso de una composición de la invención en la fabricación de una composición para el tratamiento del cuerpo humano o animal.
En una realización preferida, la composición de la invención es un producto fermentado, preferiblemente un producto lácteo fermentado.
Existen varios procesos para preparar el producto fermentado de la invención.
Por ejemplo, una composición previa que comprende una proporción determinada de LRa':LPa' se puede añadir a un producto ya fermentado de tal manera que la proporción de LRa:LPa en el producto final sea como se describe anteriormente en la presente memoria. La composición previa se puede obtener añadiendo a un medio dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseio cofermentando dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracasei.Preferiblemente, el producto ya fermentado al que se le añade la composición previa no comprende dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracasei.En consecuencia, la proporción de LRa:LPa' en la composición previa puede ser la misma que la proporción de LRa:LPa en el producto fermentado final. Otra forma de preparar un producto fermentado según la invención puede ser cofermentar dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseicon las cepas usadas para obtener el producto fermentado. Por ejemplo, cuando el producto fermentado es un yogur, las cepas usadas para la fermentación láctica sonLactobacillus delbrueckiisubesp.bulgaricusyStreptococcus thermophilus.Por tanto,Lactobacillus delbrueckiisubesp.bulgaricus, Streptococcus thermophilus,dicha determinada cepa deLactobacillus rhamnosusy dicha determinada cepa deLactobacillus paracaseipueden cofermentarse para obtener un yogur según la invención.
Por lo general, la leche se pasteuriza en primer lugar antes de fermentarse.
La etapa de pasteurización es un tratamiento térmico a una temperatura comprendida entre 72 °C y 138 °C, preferiblemente durante 2 segundos a 30 minutos. Dicha etapa y sus condiciones son bien conocidas por el experto en la técnica.
La etapa de fermentación es preferiblemente una fermentación láctica usando técnicas que son conocidas por el experto.
Cuando se hace referencia a una "fermentación láctica", esta significa una fermentación láctica acidificante que da lugar a la coagulación y acidificación de la leche tras la producción de ácido láctico, que puede ir acompañada de la producción de otros ácidos, dióxido de carbono y diversas sustancias tales como exopolisacáridos (EPS) o sustancias aromáticas, por ejemplo, diacetilo y acetaldehído.
Para realizar dicha fermentación láctica, se añaden fermentos lácticos al producto lácteo no fermentado, en particular leche, que generalmente se ha pasteurizado previamente, y la temperatura se mantiene entre 25 °C y 44 °C, preferiblemente durante 3 a 16 horas.
La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.
Figuras
La figura 1 muestra el efecto de la administración de las siguientes composiciones sobre la protección de la integridad de la barrera intestinal en el modelo en ratones de inflamación de bajo grado inducida por DNBS. La leyenda es como sigue:
vehículo PBS: ratones no expuestos a DNBS y no tratados con cepas probióticas
DNBS+PBS: ratones expuestos a DNBS y no tratados con cepas
DNBS+CNCM-I3690: ratones expuestos a DNBS y tratados conL. rhamnosus(109 UFC/ml) DNBS+mezcla 1:1: ratones expuestos a DNBS y tratados con la misma concentración (109 UFC/ml) deL. rhamnosusyL. paracasei
DNBS+mezcla 1:10: ratones expuestos a DNBS y tratados con la proporción deL. rhamnosus.L. paracaseide 10:1 (109 UFC/ml:108 UFC/ml)
DNBS+CNCM-I3689: ratones expuestos a DNBS y tratados conL. paracasei(109 UFC/ml)
Ejemplos
Material y métodos:
Condiciones de crecimiento bacteriano y animales
Lactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 yLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 se cultivaron en medio MRS (Difco, EE. UU.) en condiciones anaeróbicas a 37 °C.
Se mantuvieron ratones macho C57BL/seis (de 6 a 8 semanas de edad; Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) en las instalaciones de cuidado de animales del Instituto Nacional de Investigación Agrícola (IERP, INRA, Jouy-en-Josas, Francia) en condiciones sin patógenos específicos (SPF). Los ratones se alojaron en condiciones convencionales durante un mínimo de 1 semana antes de la experimentación. Todos los experimentos se realizaron según las normas de la Comunidad Europea para el cuidado de animales y se aprobaron por el comité local correspondiente (Comethea) (número de protocolo 02550.0).
Diseño experimental
Se indujo inflamación como se describe previamente (Lavalet al., 2015). En resumen, los ratones se expusieron, con anestesia, a una primera dosis intrarrectal de 100 mg/kg de solución de ácido dinitrobencenosulfónico (DNBS) (ICN, Biomedical Inc.) en etanol al 30 % (EtOH). Los ratones de control (sin colitis) recibieron solamente EtOH al 30 %.
Trece días después de la primera inyección de DNBS, se administraron por vía intragástrica 109 UFC deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 viable en solitario, 109 UFC deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 viables y 109 UFC deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 viable o 109 UFC deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 viable y 108 UFC deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 viable en 200 gl de PBS o PBS en solitario, diariamente durante 10 días (periodo de alimentación forzada).
Finalmente, 21 días después de la primera exposición, los ratones se expusieron de nuevo a una segunda administración de 50 mg/kg de DNBS o EtOH.
Se supervisó la pérdida de peso durante los 3 días siguientes a la segunda inyección de DNBS para evaluar posibles signos clínicos de malestar. Para confirmar la ausencia de sobreinflamación, se determinaron las puntuaciones macroscópicas e histológicas del colon, así como la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) del colon (un marcador del grado de infiltración por neutrófilos polimorfonucleares) y los niveles séricos de lipocalina-2 (un marcador de inflamación inicial) como se describe previamente (Shashidharamurthyet al.,2013; Martinet al.,2014; Lavalet al.,2015).
Permeabilidad intestinalin vivo
La permeabilidadin vivose evaluó utilizando el indicador de dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano 3000-5000 Da, Sigma-Aldrich) como se describe previamente (Tambuwalaet al.,2010). En resumen, al final del periodo se administraron a los ratones 0,6 mg/g de peso corporal de FITC-dextrano disuelto en PBS mediante sonda oral. Para medir la presencia de FITC-dextrano en la sangre, 3,5 h después de administración forzada, se recuperaron muestras de sangre del plexo venoso retroorbitario y se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C hasta el análisis. Los ratones se alojaron en condiciones convencionales durante este periodo con acceso ilimitado a agua y comida. El suero se separó mediante centrifugación y los niveles de FITC en el plasma se determinaron usando un lector de microplacas de fluorescencia (excitación 485 nm y emisión 530 nm; Tecan, Lyon, Francia).
Análisis estadístico
Se usó el programa informático GraphPad (GraphPad Sofware, LaJolla, CA, EE. UU.) para el análisis estadístico. Los resultados se presentan como gráficos de barras o diagramas de puntos con las medias ± ETM. Las comparaciones implicaron la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de una prueba de comparación múltiple de Dunn. Se consideró significativo un valor depinferior a 0,05.
Resultados:
Las cepas deL. rhamnosusyL. paracaseise sometieron a prueba ambas en un modelo murino de inflamación crónica de bajo grado inducida por dos administraciones intrarrectales de ácido dinitrobencenosulfónico (DNBS) separadas por un periodo de recuperación. Este modelo se caracteriza por un aumento de la permeabilidad de la barrera del colon.
Como se muestra en la figura 1,L. rhamnosusCNCM-I-3690, pero noL. paracaseiCNCM-I-3689 puede restablecer la integridad de la barrera intestinal. Cuando las cepas deL. rhamnosusCNCM-I-3690 yL. paracaseiCNCM-I-3689 se mezclaron en una proporción 1:1,L. rhamnosusCNCM-I-3690 perdió su capacidad de proteger la barrera, pero cuando está en la mezcla en una proporción de 10:1 dondeL. paracaseiCNCM-I-3689 estaba presente 10 veces menos que L.rhamnosusCNCM-I-3690, el efecto beneficioso deL. rhamnosusCNCM-I-3690 todavía está presente.
Claims (10)
1. Una composición que comprende:
- una cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y
- una cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689
en donde la proporción de dicha cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 con respecto a dicha cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 (LRa:LPa) está entre 9:1 y 15:1.
2. La composición según la reivindicación 1, en donde la composición comprende al menos 106 unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml) de dicha cepa deLactobacillus rhamnosus.
3. La composición según la reivindicación 1 o 2, en donde la composición comprende al menos una cepa adicional deLactobacillus paracasei.
4. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la al menos una cepa adicional deLactobacillus paracaseiesLactobacillus paracaseiCNCM I-1518.
5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición es una composición alimenticia.
6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición es un producto lácteo.
7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un método de prevención o tratamiento del cuerpo humano o animal.
8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno gastrointestinal, diabetes de tipo 1 y obesidad.
9. La composición para su uso según la reivindicación 8, en donde el trastorno gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y/o síndrome del intestino irritable (SII).
10. Un proceso para preparar una composición, que comprende las etapas de:
- añadir a un medio, que es un producto fermentado, una cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y una cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 para obtener una composición con una proporción de LRa:LPa entre 9:1 y 15:1
o
- inocular un medio de fermentación, que es leche, con dicha cepa deLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 y dicha cepa deLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 y
- fermentar el medio inoculado incubándolo a una temperatura adecuada para el crecimiento de dichas cepas, que está entre 25 °C y 44 °C durante 3 a 16 horas, hasta que la proporción de LRa:LPa está entre 9:1 y 15:1.
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