ES2643571T3 - Gen de fusión FGFR3 y fármaco que se dirige al mismo - Google Patents

Gen de fusión FGFR3 y fármaco que se dirige al mismo Download PDF

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ES2643571T3 ES13842962.6T ES13842962T ES2643571T3 ES 2643571 T3 ES2643571 T3 ES 2643571T3 ES 13842962 T ES13842962 T ES 13842962T ES 2643571 T3 ES2643571 T3 ES 2643571T3
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alkyl
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fusion polypeptide
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Yoshito Nakanishi
Nukinori AKIYAMA
Yukari NISHITO
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Description

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7
imagen7
[2] Otra realización de la presente invención se relaciona con:
un método para seleccionar un paciente, en particular un paciente que tiene cáncer de vejiga, tumor cerebral,
5 carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, melanoma de piel, cáncer de esófago, cáncer gástrico o cáncer de hígado, al que puede aplicársele un agente anticancerígeno que comprende un compuesto que tiene una actividad inhibitoria de FGFR o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende las etapas de:
(a) determinar la presencia o ausencia de un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido FGFR3 y un
10 polipéptido BAIAP2L1 o un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido FGFR3 y un polipéptido BAIAP2L1 en una muestra aislada de un sujeto;
en donde el polipéptido FGFR3 es la totalidad o una parte de un polipéptido de tipo salvaje que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 7; y
en donde el polipéptido BAIAP2L1 es la totalidad o una parte de un polipéptido de tipo salvaje que consiste en la 15 secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y
(b) seleccionar un paciente que se confirma que tiene el polipéptido de fusión o el polinucleótido como un paciente al que se le puede aplicar el agente anticancerígeno,
en donde el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es capaz de inhibir el crecimiento de un cáncer que expresa el polipéptido de fusión o que tiene un nucleótido que codifica el polipéptido de fusión, en 20 particular donde dicho compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable se representa mediante:
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en donde R1, R2, R3 y R4 representan, cada uno, independientemente el grupo enumerado a continuación:
R1 representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C1-4, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6,
25 cicloalquilo C3-7, arilo C6-10 alquilo C1-4, OR5, -NR6R7, -(CR8R9)nZ1, -C(O)NR12R13, -SR14, -SOR15, -SO2R16, -NR17SO2R18, COOH, arilo C6-10 que es opcionalmente sustituido por uno o más grupos independientemente seleccionados del grupo P, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que se encuentra sustituido opcionalmente por uno o más grupos independientemente seleccionados del grupo Q, -COR19, -COOR20
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para transformar las células normales y la contribución de BAIAP2L1 a la capacidad de transformación, mediante la realización de pruebas a través del uso de proliferación celular independiente del andamiaje como un indicador.
La Figura 12 muestra los resultados de examinación de la capacidad tumorigénica in vivo del polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 al llevar a cabo evaluaciones utilizando ratones lampiños.
En el orden desde la izquierda, se muestran los 15 días establecidos luego de la inoculación simultánea en la región inguinal de ratones lampiños, células que expresan FGFR3 de tipo salvaje, células que expresan BAIAP2L1 de tipo salvaje, células que expresan el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 y células que expresan un polipéptido de fusión de FGFR3 y un BAIAP2L1 deficiente de dominio BAR, respectivamente.
La Figura 13 muestra un resultado de la examinación del efecto de la inhibición del crecimiento tumoral del inhibidor de FGFR en la formación del tumor in vivo mediante un polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 mediante el uso de ratones lampiños para evaluación.
Modo de llevar a cabo la invención
La presente invención es como se ilustra en [1] a [5] descritos anteriormente.
En la presente invención, "FGFR" hace referencia a cualquier FGFR que pertenece a la familia de FGFR que comprende FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4, que son receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que pertenecen a la familia del receptor de tirosina cinasa (Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005, 16: 139-149). Los FGFR pueden tener cualquier origen y son preferiblemente FGFR derivados de mamíferos (humanos, ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, ovejas, monos, cabras, burros, bovinos, caballos, cerdos, etc.), más preferiblemente, FGFR humanos, y aún más preferiblemente FGFR3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 7 (secuencias ADNc, SEQ ID NO: 10 y 11, respectivamente / n.º de acceso GenBank: NM_001163213.1 y NM_000142.4, respectivamente). El locus del gen FGFR3 humano es 4p16.3.
En la presente invención "FGFR3 humano" hace referencia a un polipéptido FGFR3 humano de tipo salvaje que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 7. Se describe también un polipéptido mutante con una sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos (preferiblemente uno a diez aminoácidos, y más preferiblemente, uno a cinco aminoácidos) en el polipéptido de tipo salvaje.
El polipéptido mutante también incluye polipéptidos que tienen una homología de 70 % o más, preferiblemente una homología de 80 % o más, más preferiblemente, una homología de 90 % o más y, aun más preferiblemente, una homología de 95 % o más con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de tipo salvaje.
En la presente invención, "BAIAP2L1" hace referencia a una proteína 1 similar a la proteína 2 asociada al inhibidor 1 de angiogénesis específica del cerebro (BAIAP2L1; también designada como "sustrato del receptor de tirosina cinasa de insulina" (IRTKS, por sus siglas en inglés)) (Journal of Cell Science, 2007, 120: 1663-1672). BAIAP2L1 puede ser de cualquier origen y es preferiblemente un BAIAP2L1 de mamífero, más preferiblemente un BAIAP2L1 humano, y, aun más preferiblemente, un BAIAP2L1 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (secuencia de ADNc, SEQ ID NO: 12 / n.º de acceso GenBank NM_018842.4). El locus del gen BAIAP2L1 humano es 7q22.1 y se ubica en un cromosoma diferente del que contiene el gen FGFR3.
En la presente invención "BAIAP2L1 humano" hace referencia a un polipéptido BAIAP2L1 humano de tipo salvaje que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Se describe también un polipéptido mutante con una sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos (preferiblemente uno a diez aminoácidos, y, más preferiblemente, uno a cinco aminoácidos) en el polipéptido de tipo salvaje.
El polipéptido mutante también incluye polipéptidos que tienen una homología de 70 % o más, preferiblemente una homología de 80 % o más, más preferiblemente, una homología de 90 % o más y, aun más preferiblemente, una homología de 95 % o más con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de tipo salvaje.
Se describe también "TACC3" que se refiere a la proteína de hélice superenrollada ácida transformante 3 (TACC3) (Genomics. 1.º de junio 1999; 58(2): 165-70). TACC3 es preferiblemente una TACC3 de mamífero, más preferiblemente una TACC3 humana, y, aun más preferiblemente, una TACC3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (secuencia de ADNc, SEQ ID NO: 13 / n.º de acceso GenBank NM_006342.2). El locus del gen TACC3 humano es 4p16.3 y se ubica corriente arriba del gen FGFR3 en el mismo cromosoma.
En general, "TACC3 humana" hace referencia a un polipéptido TACC3 humano de tipo salvaje que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o un polipéptido mutante con una sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos (preferiblemente uno a diez aminoácidos, y, más preferiblemente, uno a cinco aminoácidos) en el polipéptido de tipo salvaje.
El polipéptido mutante también incluye polipéptidos que tiene una homología 70 % o más, preferiblemente una homología de 80 % o más, más preferiblemente, una homología de 90 % o más y, aun más preferiblemente, una homología de 95 % o más con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de tipo salvaje.
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invención mediante la expresión de un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión de la presente invención. Los vectores de expresión no se ven particularmente limitados siempre y cuando tengan la función de producir polipéptidos de fusión de la presente invención mediante la expresión de polinucleótidos que codifican los polipéptidos en diversas células procariotas y/o eucariotas como un hospedador.
Dichos vectores de expresión incluyen, por ejemplo, pMAL C2, pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol.18, 1990, p. 5322) y pME18S (Jikken Igaku Bessatsu (Experimental Medicine: SUPPLEMENT), "Idenshi Kougaku Handbook (Handbook of Genetic Engineering)" (1992)).
Alternativamente, los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden ser producidos como proteínas de fusión con otras proteínas. Por ejemplo, cuando se prepara como una proteína de fusión con glutatión S-transferasa (GST), ADNc que codifica un polipéptido de fusión de la presente invención puede subclonarse en, por ejemplo, el plásmido pGEX4T1 (Pharmacia). E. coli DH5α se transforma con el plásmido resultante y los transformantes se cultivan para preparar la proteína de fusión.
Alternativamente, los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden producirse como fusiones con hemaglutinina (HA) de influenza, región constante de inmunoglobulina, β-galactosidasa, proteína de unión a maltosa (MBP, por sus siglas en inglés) o similares. Adicionalmente, los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden producirse como fusiones con péptidos conocidos, por ejemplo, FLAG (Hopp, T. P. et ál., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6x His que consiste en 6 residuos de histidina (His), 10x His, hemaglutinina (HA) de influenza, fragmentos de c-myc humano, fragmentos de VSV-GP, fragmentos de p18HIV, etiqueta T7, etiqueta HSV, etiqueta E, fragmentos de antígeno SV40T, etiqueta Ick, fragmentos de α-tubulina, etiqueta B, fragmentos de proteína C, Stag, StrepTag y HaloTag.
Cuando se utilizan bacterias, en particular E. coli, como una célula hospedadora, los vectores de la presente invención contienen preferiblemente al menos una región operadora del promotor, un codón de inicio, un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión de la presente invención, un codón de detención, una región de terminación y un replicón.
Cuando se utiliza levadura, células animales o células de insectos como un hospedador, los vectores de expresión contienen preferiblemente un promotor, un codón de inicio, un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión de la presente invención y un codón de terminación.
Los vectores también pueden contener ADN que codifica un péptido de señal, una secuencia amplificadora, regiones no traducidas 5' y 3' del gen que codifica una proteína de la presente invención, uniones de corte y empalme, sitios de poliadenilación, una región de marcador de selección, un replicón y similares.
Adicionalmente, de ser necesario, los vectores pueden contener genes marcadores (genes para la amplificación génica, genes de resistencia a fármacos, etc.) que permiten la selección de hospedadores transformados u hospedadores con amplificación génica.
Los genes marcadores incluyen, por ejemplo, el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), gen de cinasa timidina, gen de resistencia a la neomicina, gen de glutamato sintasa, gen de adenosina deaminasa, gen de ornitina decarboxilasa, gen de higromicina-B fosfotransferasa y gen de aspartato transcarbamilasa.
Una región operadora del promotor para expresar el polipéptido de fusión de la presente invención en bacterias comprende un promotor, un operador y una secuencia Shine-Dalgarno (SD) (por ejemplo, AAGG).
Por ejemplo, cuando el hospedador es el género Escherichia, comprende, por ejemplo, el promotor Trp, promotor Iac, promotor recA, promotor APL, promotor lpp, promotor tac o similares.
Los ejemplos de un promotor para expresar el polipéptido de fusión de la presente invención en levadura son el promotor PH05, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH y similares.
Cuando el hospedador es Bacillus, los ejemplos son el promotor SL01, promotor SP02, promotor penP, y similares.
Cuando el hospedador es una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, los ejemplos son un promotor derivado de SV40, promotor de retrovirus, promotor de choque térmico, y similares; y se prefieren el SV40 y retrovirus. No obstante, el promotor no se ve limitado a los ejemplos anteriores. Además, el uso de un potenciador es eficaz para la expresión.
Un codón de inicio preferible es, por ejemplo, un codón metionina (ATG). Un codón de terminación comúnmente utilizado (por ejemplo, TAG, TAA, TGA) se ejemplifica como un codón de terminación. Se utilizan comúnmente los terminadores naturales o sintéticos como una región de terminación.
Un replicón hace referencia a un ADN capaz de replicar la secuencia de ADN total en células hospedadoras e incluye un plásmido natural, un plásmido modificado artificialmente (fragmento de ADN preparado a partir de un plásmido natural), un plásmido sintético y similares. Los ejemplos de plásmidos preferibles para E. coli son pBR322
o sus derivados artificiales (fragmentos de ADN obtenidos por el tratamiento de pBR322 con enzimas de restricción
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adecuadas), para la levadura son el plásmido de levadura 2 μ o ADN cromosómico de levadura y pRSVneo ATCC 37198, y para células de mamíferos son los plásmidos pSV2dhfr ATCC 37145, plásmido pdBPV-MMTneo ATCC 37224, plásmido pSV2neo ATCC 37149 y similares.
También pueden utilizarse una secuencia potenciadora, el sitio de poliadenilación, y una unión de corte y empalme que se utilizan usualmente en la técnica, tal como los derivados de SV40.
El vector de expresión de la presente invención puede prepararse mediante el enlace continuo y circular de al menos el promotor mencionado anteriormente, codón de inicio, polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión de la presente invención, el codón de terminación y región de terminación, a un replicón adecuado. Si así se desea, pueden usarse fragmentos de ADN adecuados (por ejemplo, enlazadores, sitios de restricción y similares) mediante un método común tal como una digestión con enzimas de restricción o enlace mediante ADN ligasa de T4.
La presente invención también se relaciona con células recombinantes transformadas con los vectores mencionados anteriormente de la presente invención y las células recombinantes de la presente invención pueden prepararse mediante la introducción del vector de expresión mencionado anteriormente en las células hospedadoras.
Las células hospedadoras en la presente invención no están particularmente limitadas siempre y cuando sean compatibles con un vector de expresión mencionado anteriormente y puedan transformarse. Los ejemplos de los mismos incluyen varias células tales como células de tipo salvaje o células recombinantes establecidas artificialmente utilizadas comúnmente en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacterias (los géneros Escherichia y Bacillus), levadura (el género Saccharomyces, el género Pichia, y similares) células animales,
o células de insectos).
Se prefieren células de E. coli o animales. Los ejemplos específicos de E. coli (DH5α, TB1, HB101 y similares), células derivadas de ratones (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH3T3 y similares), células derivadas de ratas (PC12, PC12h), células derivadas de hámsteres (BHK, CHO y similares), células derivadas de monos (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo y similares) y células derivadas de humanos (Hela, células derivadas de fibroblastos diploides, células de mieloma y HepG2 y similares).
Puede introducirse un vector de expresión (transformado (transfectado)) en células hospedadoras de acuerdo con métodos de rutina.
[cuando el hospedador es E. coli, Bacillus subtilis, o similares: Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., Vol.69, p.2110 (1972); Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111 (1979); J. Mol. Biol., Vol.56, p.209 (1971);
[cuando el hospedador es Saccharomyces cerevisiae]: Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., Vol.75, p.1927 (1978); J. Bacteriol., Vol.153, p.163 (1983);
[cuando el hospedador es una célula animal]: Virology, Vol.52, p.456 (1973);
[cuando el hospedador es una célula de insecto]: Mol. Cell. Biol., Vol.3, pp.2156-2165 (1983).
Los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden producirse mediante células recombinantes transformadas mediante cultivo (en adelante, el término también hace referencia a cuerpos de inclusión) que comprende un vector de expresión preparados como se describen anteriormente en un medio nutritivo de acuerdo con métodos de rutina.
Los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden producirse mediante el cultivo de las células recombinantes descritas anteriormente, en particular, células animales, y les permite secretarse en sobrenadantes del cultivo.
El cultivo resultante se filtra o se centrifuga para obtener un filtrado del cultivo (sobrenadante). Los polipéptidos de fusión de la presente invención se purifican y se aíslan a partir del filtrado del cultivo mediante métodos de rutina utilizados comúnmente para purificar y aislar las proteínas naturales o sintéticas. Los ejemplos de un método de aislamiento y purificación son métodos que utilizan solubilidad tal como métodos de precipitación salina y precipitación por solventes; métodos que utilizan diferencias en el peso molecular tal como diálisis, ultrafiltración, filtración en gel y electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida; métodos que utilizan una carga tal como una cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de hidroxilapatita; un método que utiliza una afinidad específica tal como cromatografía en columna por afinidad; métodos que utilizan diferencias en hidrofobicidad tal como cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa; y métodos que utilizan diferencias en el punto isoeléctrico tal como isoelectroenfoque.
Mientras tanto, cuando un polipéptido de fusión de la presente invención se encuentra en el periplasma o citoplasma de las células recombinantes cultivadas (tal como E. coli), las células se recolectaron mediante métodos de rutina tal como filtración y centrifugado del cultivo, y luego se suspendieron en un amortiguador adecuado. Luego de que la pared celular y/o la membrana celular de las células se rompe mediante métodos tales como la sonificación, lisozima y criólisis, una parte de la membrana que contiene la proteína de la presente invención se obtiene mediante métodos
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tales como centrifugación y filtración. La parte de la membrana se solubiliza con un detergente tal como Triton-X100 para obtener la solución en bruto. Luego, la proteína de la presente invención puede aislarse y purificarse a partir de la solución en bruto mediante métodos de rutina tales como los ejemplificados anteriormente.
La presente descripción también se relaciona con los oligonucleótidos arbitrarios que se hibridan a polinucleótidos (ADNc y ADN genómicos) que codifican los polipéptidos de fusión descritos anteriormente de la presente invención.
Los oligonucleótidos tienen secuencias de nucleótidos que son complementarias a secuencias de nucleótidos parciales arbitrarias de los ADNc y ADN genómico y que son útiles como un par de cebadores oligonucleótidos que consisten en cebadores sentido y antisentido en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La totalidad de la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión de la presente invención o una parte arbitraria de la secuencia de nucleótidos puede amplificarse mediante PCR a través del uso del par de cebadores oligonucleótidos.
Los cebadores oligonucleótidos incluyen oligonucleótidos de cualquier longitud que son complementarios a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de la presente invención. Los cebadores oligonucleótidos incluyen preferiblemente los que tienen una secuencia de al menos 12 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 12 a 50 nucleótidos y aún más preferiblemente 12 a 20 nucleótidos.
Los oligonucleótidos también son útiles como una sonda cuando se manipula la hibridación de ADN o ARN. Cuando se utiliza como una sonda, los ADN incluyen una secuencia de nucleótidos parcial de 20 o más nucleótidos más consecutivos, preferiblemente una secuencia de nucleótidos parcial de 50 o más nucleótidos parciales, más preferiblemente una secuencia de nucleótidos parcial de 100 o más nucleótidos consecutivos, incluso más preferiblemente una secuencia de nucleótidos parcial de 200 o más nucleótidos consecutivos y aun más preferiblemente una secuencia de nucleótidos parcial de 300 o más nucleótidos consecutivos, que se hibridan a un polinucleótido de la presente invención.
La presente descripción también se relaciona con oligonucleótidos que se unen a polinucleótidos de ARNm que codifican polipéptidos de fusión de la presente invención y tienen una actividad de inhibición de la traducción de los ARN en proteínas. Es particularmente preferible que los oligonucleótidos incluyan ARNip que escinden los ARNm mediante unión a los polinucleótidos de ARNm que codifican los polipéptidos de fusión de la presente invención.
Los oligonucleótidos hacen referencia a aquellos que se unen a los polipéptidos de fusión que codifican los ARNip de la presente invención y, mediante esto, inhiben su expresión e incluyen, por ejemplo, oligonucléotidos antisentido, ribozimas y ARN de interferencia pequeño (ARNip). Se unen a las ARNm y luego inhiben su traducción a proteínas.
Un oligonucleótido antisentido hace referencia a un oligonucleótido que se hibrida específicamente al ADN genómico y/o ARNm, e inhibe su expresión de proteínas mediante la inhibición de la transcripción y/o traducción.
La unión a un polinucleótido objetivo (ARNm, etc.) puede ser el resultado de complementariedad de pares de bases comunes. Alternativamente, cuando un oligonucleótido antisentido se une a, por ejemplo, un dúplex de ADN la unión puede ser el resultado de la interacción específica en la ranura mayor de la hélice doble. Los sitios objetivo para un oligonucleótido antisentido incluyen el extremo 5' de un ARNm, por ejemplo, secuencias no traducidas 5' hasta o inclusive el codón de inicio AUG, y secuencias no traducidas 3' de un ARNm, así como también las secuencias de región de codificación.
Cuando se utilizan como un oligonucleótido antisentido, los oligonucleótidos antisentido incluyen secuencias de nucleótidos parciales de 5 a 100 nucleótidos consecutivos, preferiblemente secuencias de nucleótidos parciales de 5 a 70 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente secuencias de nucleótidos parciales de 5 a 50 nucleótidos consecutivos y aun más preferiblemente secuencias de nucleótidos parciales de 5 a 30 nucleótidos consecutivos.
Adicionalmente, los oligonucleótidos antisentido pueden ser parcialmente modificados mediante la modificación química para alargar su semivida en la sangre (para estabilizarlos) o aumentar la permeabilidad de su membrana intracelular cuando se los administra a los pacientes, o para potenciar su resistencia a la degradación o absorción en los órganos digestivos en la administración oral. Dicha modificación química incluye, por ejemplo, modificación química de un enlace de fosfato, ribosa, nucleobases, restos de azúcar en oligonucleótidos y extremos 3' y 5' de oligonucleótidos.
La modificación de enlaces de fosfato incluye, por ejemplo, la conversión de uno o más enlaces a enlaces de fosfodiéster (D-oligo), enlaces fosforotioato, enlaces fosforoditioato (S-oligo), metil fosfonato (MP-oligo), enlaces de fosforoamidato, enlaces no fosfato y enlaces de metil fosfonotioato y combinaciones de los mismos. La modificación de ribosa incluye, por ejemplo, la conversión a 2'-fluorribosa o 2'-0-metilribosa. La modificación de la base de nucleótidos incluye, por ejemplo, la conversión a 5-propiniluracilo o 2-aminoadenina.
La ribozima hace referencia a oligonucleótidos que tienen una actividad catalítica de escindir el ARNm. En general, las ribozimas tienen actividad de endonucleasa, ligasa o polimerasa. Las ribozimas incluyen varios tipos de ribozimas reguladoras en tras, por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo y ribozimas horquillas.
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El ARNip hace referencia a oligonucleótidos de doble cadena capaces de llevar a cabo la interferencia de ARN (por ejemplo, Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir etál., 2001, Nature, 411, 494-498).
El ARNip escinde el ARNm en una forma específica de la secuencia y, como resultado, inhibe la traducción del ARNm en la proteína. El ARNip incluye los ARN de doble cadena que tienen 20 a 25 pares de base de largo y comprenden una complementariedad de secuencia con respecto a la secuencia de polinucleótido objetivo. Los ARNip también incluyen oligonucleótidos que comprenden nucleótidos y no nucleótidos modificados químicamente.
La presente descripción también se relaciona con anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión descrito anterior de la presente invención y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos.
Los anticuerpos no se ven limitados por su origen, forma, función, etc. Los anticuerpos pueden ser cualquier anticuerpo, anticuerpos monoclonales o policlonales. Sin embargo, los anticuerpos preferidos son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden derivarse de cualquier animal, tal como anticuerpos humanos, anticuerpos de ratones y anticuerpos de rata. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos recombinantes tal como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. La región variable de un anticuerpo se compone típicamente de tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), entre cuatro marcos (FR). Los CDR prácticamente determinan la especificidad de unión de un anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de CDR son ampliamente diversas. Por otro lado, las secuencias de aminoácidos que constituyen FR exhiben frecuentemente una homología alta entre anticuerpos que tienen diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, se dice que en general la especificidad de unión de un anticuerpo puede trasplantarse a un anticuerpo diferente mediante injertos de CDR.
Los anticuerpos humanizados también se designan como anticuerpos reformados humanos y se preparan mediante la transferencia de las CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano tal como un ratón, a las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo humano. También se conocen las técnicas de recombinación genética generales para su preparación (ver publicación de solicitud de patente europea n.º 125023 y WO 96/02576).
Específicamente, por ejemplo, cuando la CDR derivan de un anticuerpo de ratón, una secuencia de ADN se diseñan de forma tal que las CDR del anticuerpo de ratón se unen con las regiones de marco (FR) de un anticuerpo humano y se sintetizan mediante PCR a través de, como cebadores, varios oligonucleótidos que tienen partes que se superponen a los extremos de los CDR y FR (ver el método descrito en WO 98/13388). El ADN resultante se une luego a un ADN que codifica una región constante del anticuerpo humano, insertado en un vector de expresión y se introduce en un hospedador para producir el anticuerpo (ver publicación de solicitud de patente europea n.º EP 239400 y publicación de solicitud de patente internacional n.º WO 96/02576).
Las regiones de marco de anticuerpo humano a ser unidas con CDR se seleccionan de forma tal que las regiones determinantes de la complementariedad forman un sitio de unión al antígeno favorable. De ser necesario, los aminoácidos de la región de marco en una región variable de anticuerpo puede sustituirse, eliminarse, agregarse y/o insertarse de forma tal que las regiones determinantes de complementariedad forman un sitio de unión al antígeno adecuado. Por ejemplo, las mutaciones pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos de la FR mediante la aplicación del método de PCR utilizado para injertar CDR de ratón a FR humanas. Específicamente, pueden introducirse mutaciones en una parte de las secuencias de nucleótidos de cebadores que se hibridan a las FR. Las mutaciones se introducen en FR sintetizadas mediante el uso de dichos cebadores. Las secuencias de FR mutante que tienen propiedades deseadas pueden seleccionarse mediante la evaluación y determinación de la actividad de unión al antígeno de anticuerpos mutantes sustituidos con aminoácidos mediante el método descrito anteriormente (Sato, K. etál., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
En general, se utilizan las regiones constantes de anticuerpos humanos para las de los anticuerpos humanizados.
No existen limitaciones particulares de las regiones constantes de anticuerpos humanos a ser utilizadas en la presente invención; y por ejemplo, cuando se utiliza una región constante de cadena pesada, puede ser una región constante de IgG1 humana, una región constante de IgG2 humana, una región constante de IgG3 humana, una región constante de IgG4 humana o una región constante de IgM, IgA, IgE o IgD. Alternativamente, cuando se utiliza una región constante de cadena ligera, puede ser una región constante de cadena κ o región constante de cadena λ humana. Adicionalmente, las regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano pueden tener una secuencia de origen natural o pueden ser una región constante que tiene una secuencia con una modificación (sustitución, eliminación, adición y/o inserción) de uno o más aminoácidos en la secuencia de origen natural.
Además, luego de que se preparó un anticuerpo humanizado, los aminoácidos en la región variable (por ejemplo, CDR y FR) y la región constante del anticuerpo humanizado pueden ser eliminados, agregados, insertos y/o sustituidos con otros aminoácidos. Los anticuerpos humanizados también incluyen tales anticuerpos humanizados con sustituciones de aminoácidos y similares.
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El origen de las CDR de un anticuerpo humanizado no se ve particularmente limitado y puede ser cualquier animal. Por ejemplo, es posible utilizar secuencias de anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de camello, y similares. Se prefieren secuencias de CDR de anticuerpos de ratones.
Cuando se administran a humanos para fines terapéuticos, los anticuerpos humanizados son útiles porque se reduce su inmunogenicidad en el cuerpo humano.
Los anticuerpos quiméricos comprenden, por ejemplo, regiones constantes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano, y regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de un mamífero no humano, tal como un ratón. Los anticuerpos quiméricos pueden prepararse mediante métodos conocidos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse mediante la clonación de un gen de anticuerpo de hibridomas, la inserción de este en un vector adecuado y la introducción de la construcción en hospedadores (ver, por ejemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Específicamente, los ADN de las regiones variables del anticuerpo (regiones V) se sintetizan a partir de ARNm de hibridomas mediante transcriptasa inversa. Una vez que se obtienen los ADN que codifican las regiones V de un anticuerpo de interés, se unen con ADN que codifican las regiones constantes (regiones C) de un anticuerpo humano deseado. Las construcciones resultantes se insertan en los vectores de expresión. Alternativamente, los ADN que codifican las regiones V del anticuerpo pueden insertarse en un vector de expresión que comprenden ADN que codifican las regiones C de un anticuerpo humano. Los ADN se insertan en un vector de expresión de forma tal que se expresan bajo la regulación de regiones regulatorias de la expresión, por ejemplo, amplificadores y promotores. En la siguiente etapa, las células hospedadoras pueden transformarse con el vector de expresión para permitir la expresión de anticuerpos quiméricos.
Los anticuerpos humanos pueden obtenerse mediante el uso de métodos de los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos humanos deseados con actividad de unión al antígeno pueden obtenerse mediante la sensibilización de linfocitos humanos con un antígeno de interés o células que expresan un antígeno de interés in vitro; y fusionar los linfocitos sensibilizados con células de mieloma humano tales como U266 (ver publicación de solicitud de patente japonesa Kokoku n.º (JP-B) H01-59878 (solicitud de patente japonesa aprobada, examinada para oposición). Alternativamente, el anticuerpo humano deseado también puede obtenerse mediante la inmunización de un animal transgénico que tiene un repertorio total de genes de anticuerpo humano con un antígeno deseado (ver publicaciones de solicitud de patente internacional n.º WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, y WO 96/33735).
Alternativamente, los linfocitos B que expresan anticuerpos que tienen actividad de unión al antígeno se aíslan a partir de un grupo de linfocitos humanos mediante citometría de flujo, matriz celular o similar. Los genes de anticuerpo de linfocitos B seleccionados pueden analizarse y las secuencias de ADN de los anticuerpos humanos que se unen al antígeno pueden determinarse (Jin, A. etál., Nature Medicine (2009) 15, 1088-92; Scheid, J.F.
etál., Nature (2009) 458, 636-640; Wrammert, J. etál., Nature (2008) 453, 667-672; Tiller, T. etál., Journal of Immunological Methods (2008) 329, 112-124). Cuando las secuencias de ADN de los anticuerpos de unión al antígeno se revelan, los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la construcción de vectores de expresión adecuados que portan las secuencias. Dichos métodos son conocidos y WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388 pueden usarse como referencias.
Adicionalmente, se conocen las técnicas para obtener anticuerpos humanos mediante el análisis con una biblioteca de fagos de anticuerpos humanos. Por ejemplo, la región variable de un anticuerpo humano se expresa como un anticuerpo de cadena simple (scFv) en la superficie de fagos mediante el uso de un método de expresión de fagos y fagos que se unen al antígeno pueden seleccionarse. Mediante el análisis de genes de fagos seleccionados, las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de anticuerpos humanos que se unen al antígeno pueden determinarse. Si las secuencias de ADN de scFv que se unen al antígeno se identifican, los vectores de expresión adecuados que comprenden estas secuencias pueden construcciones para obtener anticuerpos humanos. Tales métodos son conocidos en la técnica. Puede hacerse referencia a WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, y similares.
Los anticuerpos incluyen no solamente anticuerpos divalentes como se representa mediante la IgG, sino que también anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes como se representa mediante IgM. Además, los anticuerpos también incluyen anticuerpos biespecíficos capaces de unirse a diferentes antígenos.
Los anticuerpos incluyen no solamente moléculas de anticuerpos completas, sino que también cualquier fragmento de unión al antígeno tal como anticuerpo de peso molecular bajo.
Los anticuerpos también incluyen anticuerpos modificados que se unen a sustancias citotóxicas. Los anticuerpos también incluyen aquellos con cadenas de azúcar alteradas.
Los anticuerpos de peso molecular (minicuerpos) incluidos en fragmentos de unión al antígeno son anticuerpos que comprenden un fragmento de anticuerpo que no tienen una parte de un anticuerpo total (por ejemplo, la IgG total, etc.). Los minicuerpos no se ven particularmente limitados, siempre y cuando tengan la actividad de unión a un polipéptido de fusión de la presente invención.
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SerGlyGly;
Gly-Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 19);
Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 20);
GlyGly-GlyGlySer (SEQ ID NO: 21);
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 22);
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 23);
Ser-GlyGlyGlyGly-Gly (SEQ ID NO: 24);
GlyGly-Gly-Gly-Gly-GlySer (SEQ ID NO: 25);
Ser-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 26);
(GlyGly-GlyGlySer (SEQ ID NO: 21))n; y
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 22)),
donde n es un número entero de 1 o más.
La secuencia de aminoácidos de un enlazador peptídico puede seleccionarse adecuadamente por los expertos en la técnica de acuerdo con el fin. Por ejemplo, el "n" mencionado anteriormente, que determina la longitud del enlazador peptídico, es usualmente 1 a 5, preferiblemente 1 a 3 y más preferiblemente 1 o 2.
Los enlazadores sintéticos (agentes de reticulación química) incluyen agentes de reticulación que se utilizan normalmente para reticular péptidos, por ejemplo, N-hidroxi succinimida (NHS), suberato de disuccinimidilo (DSS), bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3), ditiobis(propionato de succinimidilo) (DSP), ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo) (DTSSP), etilenglicolbis(succinato de succinimidilo) (EGS), etilenglicolbis(succinato de sulfosuccinimidilo) (sulfo-EGS), tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST), bis[2(succinimido oxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) y bis[2-(sulfosuccinimido oxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo-BSOCOES). Estos agentes de reticulación se encuentran comercialmente disponibles.
Cuando se unen cuatro regiones variables del anticuerpo, se necesitan usualmente tres enlazadores. Dichos enlazadores múltiples pueden ser iguales o diferentes.
Los anticuerpos incluyen anticuerpos en los que se agregaron uno o más aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo. Adicionalmente, las proteínas de fusión que son el resultado de una fusión entre los anticuerpos anteriores y un segundo péptido o proteína se incluyen en la presente descripción. Las proteínas de fusión pueden prepararse mediante el enlace de un polinucleótido que codifica un anticuerpo con un polinucleótido que codifica un segundo péptido o polipéptido en marco, mediante la inserción de este en un vector de expresión y la expresión de la construcción de fusión en un hospedador. Algunas técnicas conocidas por los expertos en la técnica se encuentran disponibles para este fin. El péptido o polipéptido compañero a ser fusionado con un anticuerpo puede ser un péptido conocido, por ejemplo, FLAG (Hopp, T. P. etál., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His que consiste en seis residuos de His (histidina), 10x His, hemaglutinina (HA) de influenza, fragmento de c-myc humano, fragmento VSV-GP, fragmento p18VIH, etiqueta T7, etiqueta HSV, etiqueta E, fragmento de antígeno SV40 T, etiqueta Ick, fragmento de α-tubulina, etiqueta B, fragmento de proteína C, Stag, StrepTag, HaloTag. Otros polipéptidos compañeros a ser fusionados con los anticuerpos incluyen, por ejemplo, GST (glutationa-S-transferasa), HA (hemaglutinina de influenza), región constante de inmunoglobulina, β-galactosidasa y MBP (proteína de unión a maltosa). Un polinucleótido que codifica uno de estos péptidos o polipéptidos comercialmente disponibles pueden fusionarse con un polinucleótido que codifica un anticuerpo. El polipéptido de fusión puede prepararse mediante la expresión de la construcción de fusión.
Adicionalmente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos conjugados que se unen a cualquiera de las diversas moléculas que incluyen sustancias poliméricas tales como polietilenglicol (PEG) y ácido hialurónico, sustancias radioactivas, sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes, enzimas y toxinas. Dichos anticuerpos conjugados pueden obtenerse mediante la modificación química de los anticuerpos obtenidos. Los métodos para modificar los anticuerpos se establecen en el campo (por ejemplo, US 5057313 y US 5156840). Los "anticuerpos" también incluyen dichos anticuerpos conjugados.
Adicionalmente, los anticuerpos utilizados en la presente invención pueden ser anticuerpos biespecíficos. El anticuerpo biespecífico hace referencia a un anticuerpo que tiene regiones variables que reconocen epítopos diferentes en la misma molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos pueden reconocer diferentes epítopos en la molécula de polipéptido de fusión de la presente invención o reconocen el polipéptido de fusión de la presente invención con un sitio de unión al antígeno y una sustancia diferente con el otro sitio de unión al antígeno.
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pirrolidinilmetilo, grupo piperidinilmetilo, grupo piperazinilmetilo, grupo piperaziniletilo y grupo oxetanilmetilo.
En la presente memoria, "monohidroxialquilo" hace referencia a un grupo en el que un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente se encuentra sustituido con un grupo hidroxilo. El monohidroxialquilo preferiblemente incluye un monohidroxialquilo C1-6 y monohidroxialquilo C2-6. Específicamente, el monohidroxialquilo incluye, por ejemplo, un grupo hidroximetilo, grupo 1-hidroxietilo y un grupo 2-hidroxietilo.
En la presente memoria, "dihidroxialquilo" hace referencia a un grupo en el que dos átomos de hidrógeno arbitrarios en un "alquilo" definido anteriormente se encuentran sustituidos con dos grupos hidroxilo. El dihidoxialquilo preferiblemente incluye dihidroxialquilo C1-6 y dihidroxialquilo C2-6. Específicamente, el hidroxialquilo incluye, por ejemplo, un grupo 1,2-dihidroxietilo, un grupo 1,2-dihidroxipropilo y grupo 1,3-dihidroxipropilo.
En la presente memoria, "trihidroxialquilo" hace referencia a un grupo en el que tres átomos de hidrógeno arbitrarios en un "alquilo" definido anteriormente se encuentran sustituidos con tres grupos hidroxilo. El trihidroxialquilo preferiblemente incluye trihidroxialquilo C1-6 y trihidroxialquilo C2-6.
En la presente memoria, "alcoxialquilo" hace referencia a un grupo en el que un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente se encuentra sustituido con un "alcoxi" definido anteriormente. El alcoxialquilo preferiblemente incluye alcoxi C1-3 alquilo C1-4 y alcoxi C1-3 y alquilo C2-4. Específicamente, el alcoxialquilo incluye, por ejemplo, metoxietilo.
En la presente memoria, "alcoxialcoxialquilo" hace referencia a un grupo en el que un átomo de hidrógeno arbitrario en el alquilo de extremo de un "alcoxialquilo" definido anteriormente se encuentra sustituido con un "alcoxi" definido anteriormente. El alcoxialcoxialquilo preferiblemente incluye alcoxi C1-3, alcoxi C1-4 alquilo C1-4 y alcoxi C1-3 alcoxi C24 alquilo C2-4.
En la presente memoria, "aminoalquilo" hace referencia a un grupo en el que un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente se encuentra sustituido con un grupo amino. El grupo aminoalquilo preferiblemente incluye aminoalquilo C1-4 y aminoalquilo C2-4.
En la presente memoria, "alquilamino" hace referencia a un grupo amino unido con un "alquilo" definido anteriormente. El alquilamino preferiblemente incluye alquilamino C1-4.
En la presente memoria, "dialquilamino" hace referencia a un grupo amino unido con dos "alquilos" definido anteriormente. Los dos grupos alquilo pueden ser iguales o diferentes. El dialquilamino preferiblemente incluye di(alquilo C1-4)amino.
En la presente memoria, "alquilaminoalquilo" hace referencia a un grupo en el que un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente se encuentra sustituido con un "alquilamino" definido anteriormente. El alquilaminoalquilo preferiblemente incluye alquilamino C1-4 alquilo C1-4 y alquilamino C1-4 alquilo C2-4.
En la presente memoria, "dialquilaminoalquilo" hace referencia a un grupo en el que un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente se encuentra sustituido con un "dialquilamino" definido anteriormente. El dialquilamino preferiblemente incluye di(alquilo C1-4)amino alquilo C1-4 y di(alquilo C1-4) alquilo C2-4.
En la presente memoria, "heterociclilamino" hace referencia a un grupo amino unido con un "heterociclilo" definido anteriormente. El heterociclilamino preferiblemente incluye un heterociclilamino de 3 a 10 miembros.
En la presente memoria, "cianoalquilo" hace referencia a un grupo en el que un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente se encuentra sustituido con un grupo ciano. El cianoalquilo preferiblemente incluye ciano(alquilo C1-3).
En la presente memoria, "alquilsulfonilo" hace referencia a un grupo amino unido con un "alquilo" definido anteriormente (es decir, alquil-SO2-). El alquilsulfonilo preferiblemente incluye alquilsulfonilo C1-3. Específicamente, el alquilsulfonilo incluye metilsulfonilo, etilsulfonilo, n-propilsulfonilo e i-propilsulfonilo.
En la presente memoria, "alquilsulfonilalquilo" hace referencia a un grupo en el que un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente se encuentra sustituido con un "alquilsulfonilo" definido anteriormente. El alquilsulfonilalquilo preferiblemente incluye alquilsulfonilo C1-3 alquilo C1-4 y alquilsulfonilo C1-3 alquilo C2-4.
Preferiblemente, los compuestos representados por la fórmula (I) mostrados anteriormente son la siguiente manera:
R1 mostrado anteriormente representa, preferiblemente, hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C1-4, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-7, arilo C6-10 alquilo C1-4, -OR5, -NR6R7, -(CR8R9)nZ1, C(O)NR12R13, -SR14, -SOR15, -SO2R16, -NR17SO2R18, COOH, arilo C6-10 que es opcionalmente sustituido con uno o más grupos independientemente seleccionados del grupo P, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que se encuentra sustituido opcionalmente por uno o más grupos independientemente seleccionados del grupo Q, -COR19, -COOR20 -OC(O)R21, -NR22C(O)R23, -NR24C(S)R25, -C(S)NR26R27, -SO2NR28R29, -OSO2R30, -SO3R31, o -Si(R32)3;
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TACC3 y las células de una línea celular derivada del cáncer de colon HCT116 que no expresa un polipéptido de fusión de FGFR3, se colocaron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante cuatro días en presencia de DMSO (utilizado como control) o cada uno de los compuestos enumerados en las Tablas 1-1 a 1-5 en diluciones seriales en 2 veces (18 etapas) a una concentración máxima de 50 μM. Cuatro días después, se determinó el nivel de
5 proliferación celular mediante el uso de WST-8 (DOJINDO LABORATORIES).
La actividad inhibitoria de cada compuesto en la proliferación celular de cada línea celular se calculó de acuerdo con:
(1-T/C)x 100 (%)
donde T representa la absorbancia a 450 nM en pocillos donde se incubaron las células en presencia de un
10 compuesto en varias concentraciones y C representa la absorbancia a 450 nM en pocillos donde se incubaron las células en presencia de DMSO. Se calculó la IC50 mediante el uso del método de mínimos cuadrados.
Tal como se muestran en las Tablas 1-1 a 1-5, el resultado mostró que la concentración inhibitoria del 50 % de la proliferación celular (IC50) para las células que expresan el polipéptido de fusión fue significativamente inferior que la de las células que no expresan el polipéptido de fusión.
15 Tabla 1-1
COMPUESTO
FGFR1 IC50 (μmol/L) FGFR2 IC50 (μmol/L) FGFR3 IC50 (μmol/L ) HCT116 (CRC) IC50 (μmol/L) RT-4 (Vejiga) IC50 (μmol/L)
1
0,0014 0,0034 0,0035 4,1 0,02
2
0,0069 0,0084 0,018 2,7 0,016
3
imagen49 0,0027 0,0043 0,0054 2,9 0,018
4
0,00067 0,0085 0,030 9,5 0,018
5
0,00032 0,012 0,012 11 0,021
6
0,00081 0,012 0,0037 12 0,024
57
7
0,0029 0,0094 0,13 3,2 0,024
8
imagen50 0,0096 0,023 0,034 11 0,029
9
0,010 0,015 0,046 6,3 0,030
10
0,009 0,0062 0,032 >50 0,039
11
imagen51 0,011 0,017 0,065 5,7 0,052
12
imagen52 0,045 0,021 0,082 7,2 0,058
13
0,036 0,010 0,35 0,39 0,065
14
imagen53 0,038 0,0076 0,10 3,1 0,075
58
15
imagen54 0,035 0,016 0,36 19 0,076
5
10
[Tabla 1 -2]
COMPUESTO
FGFR1 IC50 (μmol/L) FGFR2 IC50 (μmol/L) FGFR3 IC50 (μmol/L) HCT116 (CRC) IC50 (μmol/L) RT-4 (Vejiga) IC50 (μmol/L)
16
imagen55 0,23 0,20 0,40 17 0,076
17
imagen56 0,011 0,012 0,041 3,8 0,077
18
0,048 0,021 0,079 11 0,082
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19
imagen57 0,017 0,017 0,070 2,5 0,084
20
imagen58 0,029 0,025 0,082 >50 0,088
21
imagen59 0,021 0,020 0,090 21 0,088
22
imagen60 0,016 0,0086 0,21 1,2 0,089
23
0,087 0,11 0,13 10 0,09
24
0,023 0,016 0,060 >50 0,092
25
imagen61 0,018 0,012 0,045 >100 0,098
26
imagen62 0,022 0,0055 0,094 11 0,13
27
imagen63 0,015 0,023 0,077 25 0,15
60
28
0,048 0,039 0,16 21 0,2
29
imagen64 0,03 0,015 0,14 8,5 0,16
30
imagen65 0,033 0,020 0,077 13 0,16
[Tabla 1 -3]
COMPUESTO
FGFR1 IC50 (μmol/L) FGFR2 IC50 (μmol/L) FGFR3 IC50 (μmol/L) HCT116 (CRC) IC50 (μmol/L) RT-4 (Vejiga) IC50 (μmol/L)
31
imagen66 0,039 0,018 0,077 2 0,17
32
imagen67 0,043 0,039 0,015 8,7 0,18
33
imagen68 0,15 0,056 0,95 4,4 0,18
34
imagen69 0,050 0,026 0,23 3,8 0,19
61 62
35
imagen70 0,043 0,022 0,086 7,8 0,19
36
imagen71 0,075 0,040 0,38 4,8 0,19
37
imagen72 0,040 0,015 0,080 8,9 0,19
38
imagen73 0,022 0,012 0,16 6,1 0,21
39
imagen74 0,024 0,0083 0,37 11 0,21
40
imagen75 0,042 0,026 0,15 19 0,22
41
imagen76 0,053 0,017 0,21 >20 0,24
42
imagen77 0,043 0,021 0,15 15 0,25
43
imagen78 0,060 0,027 0,13 >50 0,25
44
imagen79 0,030 0,0089 0,11 10 0,26
45
imagen80 0,0027 0,0032 0,0054 9,4 0,29
[Tabla 1 -4]
COMPUESTO
FGFR1 IC50 (μmol/L) FGFR2 IC50 (μmol/L) FGFR3 IC50 (μmol/L) HCT116 (CRC) IC50 (μmol/L) RT-4 (Vejiga) IC50 (μmol/L)
46
imagen81 0,056 0,021 0,068 37 0,3
47
imagen82 0,0079 0,011 0,036 14 0,320
48
0,027 0,018 0,12 37 0,32
49
0,0050 0,023 0,018 13 0,350
63 64
50
imagen83 0,091 0,057 0,37 34 0,39
51
imagen84 0,076 0,036 0,80 5,1 0,41
52
imagen85 0,093 0,019 0,35 10 0,44
53
imagen86 0,057 0,014 0,67 >20 0,44
54
0,038 0,022 0,082 >20 0,46
55
imagen87 0,033 0,038 0,068 16 0,48
56
imagen88 0,091 0,026 1,3 19 0,49
57
imagen89 0,095 0,040 0,32 >20 0,51
58
imagen90 0,0055 0,0040 0,029 12 0,56
59
0,046 0,016 0,25 3,3 0,58
60
0,030 0,0054 0,0031 17 0,6
[Tabla 1 -5]
COMPUESTO
FGFR1 IC50 (μmol/L) FGFR2 IC50 (μmol/L) FGFR3 IC50 (μmol/L) HCT116 (CRC) IC50 (μmol/L) RT-4 (Vejiga) IC50 (μmol/L)
61
imagen91 0,14 0,078 0,37 9,1 0,62
62
imagen92 0,060 0,029 0,18 1,7 0,64
63
imagen93 0,077 0,022 0,32 13 0,67
64
imagen94 0,042 0,031 0,36 1,2 0,68
65
imagen95 0,031 0,020 0,11 23 0,68
65
66
imagen96 0,025 0,048 0,043 >50 0,74
67
imagen97 0,0030 0,0043 0,0067 7,3 0,75
68
imagen98 0,092 0,037 0,33 >2 0,91
69
imagen99 0,12 0,11 0,38 4,3 0,92
70
imagen100 0,031 0,0085 0,50 9 0,97
71
imagen101 0,051 0,034 0,18 3,8 0,99
[Ejemplo 3]
Análisis de inhibidores de FGFR sobre su actividad inhibitoria de proliferación celular contra diversas líneas celulares que expresan el polipéptido de fusión FGFR3-TACC3 o el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1
5 (1) Actividad inhibitoria de la proliferación celular de los inhibidores de FGFR contra diversas líneas celulares (in vitro)
Se evaluaron seis compuestos A a F (Tablas 2-1 y 2-2), que constituyen sustancias que eliminan la actividad cinasa de FGFR, para determinar sus efectos en la proliferación celular en un total de seis tipos de líneas celulares derivadas del cáncer de vejiga humanas: tres tipos de líneas celulares que expresan un polipéptido de fusión 10 FGFR3-TACC3 o FGFR3-BAIAP2L1: RT112/84 (disponible de ECACC; n.º de catálogo 85061106), RT4 (disponible de ATCC; n.º de catálogo HTB-2) y SW780 (disponible de ATCC; n.º de catálogo CRL-2169); línea celular BFTC-905 (disponible de DSMZ; n.º de catálogo ACC 361) que expresa el polipéptido FGFR de tipo salvaje, pero no expresa los polipéptidos de fusión; línea celular UM-UC-14 (disponible de ECACC; n.º de catálogo 08090509) que expresa el polipéptido FGFR de tipo mutado, pero no expresa los polipéptidos de fusión; y la línea celular HT-1376 (disponible
15 de ATCC: n.º de catálogo CRL-1472) que no expresa FGFR3.
Las células colocadas en placas de 96 pocillos (RT112/84, BFTC-905 y UM-UC-14: 3,0E+03 células/pocillo; SW780, RT4 y HT-1376: 5,0E+03 células/pocillo) se cultivaron durante cuatro días en presencia de DMSO (utilizado como un control) o cada compuesto en diluciones seriales en tres veces (9 etapas) a una concentración máxima de 20 μM. Cuatro días después, se determinó el nivel de proliferación celular mediante el uso de WST-8 (DOJINDO
20 LABORATORIES).
La actividad inhibitoria de la proliferación celular de cada compuesto contra cada línea celular se calculó según:
(1-T/C)x 100 (%)
en donde T representa la absorbancia a 450 nM en pocillos donde se incubaron las células en presencia de un compuesto en varias concentraciones y C representa la absorbancia a 450 nM en pocillos donde se incubaron las 25 células en presencia de DMSO. Se calculó la IC50 mediante el uso del método de mínimos cuadrados.
66
Tal como se muestran en la Tabla 3, el resultado mostró que la concentración inhibitoria del 50 % de la proliferación celular (IC50) contra las células que expresan los polipéptidos de fusión fue significativamente inferior que aquella con respecto a las células que no expresan los polipéptidos de fusión.
[Tabla 2 -1]
CÓDIGO
FÓRMULA ESTRUCTURAL/NOMBRE QUÍMICO
A
imagen102
B
COMPUESTO REPRESENTADO POR [COMPUESTO 2]
C
COMPUESTO REPRESENTADO POR [COMPUESTO 3]
[Tabla 2 -2]
imagen103
67 [Tabla 3]
D
COMPUESTO REPRESENTADO POR [COMPUESTO 4]
E
COMPUESTO REPRESENTADO POR [COMPUESTO 5]
F
COMPUESTO REPRESENTADO POR [COMPUESTO 6]
NOMBRE DE LA CÉLULA
IC50 (μ mol/L)
COMPUESTO A A
COMPUESTO B B COMPUESTO C C COMPUESTO D D COMPUESTO E E COMPUESTO F F
UM-UC-14
0,11 0,010 0,016 0,017 0,066 0,075
RT112/84
0,018 0,014 0,017 0,018 0,15 0,13
SW780
0,12 0,069 0,16 1,1 0,53 0,57
RT4
0,35 0,18 0,25 0,23 0,24 0,25
BFTC-905
>10 14 11 >20 2,5 2,8
68
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imagen106
imagen107
imagen108
RAT-2 que expresan de forma estable el polipéptido BAIAP2L1 (igual que anteriormente) o el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 ΔBAR (igual que anteriormente) mediante el uso de lentivirus.
Las células RAT-2 sin tratamiento (células originales), las células RAT-2 que expresan de forma estable el polipéptido FGFR3, células RAT-2 que expresan de forma estable el polipéptido BAIAP2L1 o células RAT-2 que expresan de forma estable el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 o las células RAT-2 que expresan de forma estable el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 ΔBAR se colocaron en placas a 2,0 x 103 células/pocillos en una placa PrimeSurface™ 96U (Sumitomo Bakelite Co. Ltd.) y se cultivaron durante 14 días. El conteo celular luego de 14 días se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo™ (Promega). Tal como se muestra en la Figura 11, se observó que las células RAT-2, que expresan de forma estable el polipéptido BAIAP2L1, no tienen una capacidad de proliferación celular independiente del andamiaje y la capacidad de proliferación celular independiente del andamiaje, observada en células RAT-2 que expresan de forma estable el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 se perdió en las células RAT-2 que expresan de forma estable el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 ΔBAR.
Por consiguiente, se confirmó que la capacidad de transformación de un polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 en células normales es causada por la transautofosforilación potenciada del polipéptido FGFR3 debido al dominio que promueve la dimerización en el polipéptido BAIAP2L1.
(3) Evaluación de la capacidad tumorigénica de un polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 y la actividad de supresión de la ampliación tumoral de un inhibidor de FGFR
Las células RAT-2 que expresan, de forma estable, el polipéptido FGFR3, el polipéptido BAIAP2L1, el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 o el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 ΔBAR, establecidas en los experimentos mencionados anteriormente (1) y (2), se inocularon de forma subcutánea en la región inguinal de ratones lampiños BALB/c (Charles River Laboratories Japan) a 4,8 -5,4 x 106 células y los ratones fueron observados durante 15 días. Tal como se muestra en la Figura 12, se confirmó la ampliación del tumor solamente en ratones inoculados con células RAT-2 que expresan de forma estable el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1.
Adicionalmente, las células RAT-2 que expresan de forma estable FGFR3-BAIAP2L1 se inocularon en ratones lampiños a 5,04 x 106 células. A partir de siete días luego de colocar las células, se administró de forma oral un compuesto A inhibidor de FGFR (igual que anteriormente) suspendido en una solución que contiene DMSO al 10 %, Cremphor EL al 10 %, PEG400 al 15 % y HPCD al 15 % una vez al día a ratones a una concentración de 20 mL/kg. Tal como se muestra en la Figura 13, se observó que la ampliación del tumor potenciada por el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 fue significativamente suprimida por el inhibidor de FGFR en una forma dependiente de la concentración.
Se confirmó que el polipéptido de fusión FGFR3-BAIAP2L1 tiene una capacidad tumorigénica muy potente y esta capacidad tumorigénica se vio suprimida por el inhibidor de FGFR.
Aplicación industrial
Los polipéptidos de fusión que comprenden un polipéptido FGFR3 y otro polipéptido de la presente invención se expresan específicamente en varios tipos de células cancerosas que incluyen células del cáncer de vejiga. La proliferación de células que expresan dichos polipéptidos de fusión se ve significativamente inhibida mediante compuestos que tienen una actividad inhibitoria de FGFR. Por lo tanto, el uso de un polipéptido de fusión de la presente invención como un biomarcador para la terapia del cáncer en función del inhibidor de FGFR permite evaluar a cada paciente para determinar la aplicabilidad o modo de uso del inhibidor de FGFR y permite evitar los efectos secundarios y controlar el modo de terapia para producir el mejor efecto terapéutico en la terapia en función del inhibidor de FGFR. Por lo tanto, esto permite una medicina personalizada.
Además, el uso de polipéptidos de fusión de la presente invención como un objetivo en el desarrollo de agentes terapéuticos contra el cáncer que se dirijan a FGFR, es decir, agentes terapéuticos direccionados de forma molecular, permite proporcionar inhibidores de FGFR con altos niveles de especificidad y actividad antitumoral a células cancerosas objetivo, así como también agentes terapéuticos contra el cáncer que comprenden los inhibidores.
Los inhibidores de FGFR obtenidos como se describen anteriormente tienen una especificidad alta hacia las células cancerosas objetivo y, por lo tanto, es posible proporcionar agentes terapéuticos contra el cáncer con una gran actividad antitumoral, pero pocos efectos secundarios.
Adicionalmente, polipéptidos de fusión de la presente invención tiene una correlación estrecha con varios tipos de cáncer y, por lo tanto, puede evaluarse la susceptibilidad al cáncer (sensibilidad al cáncer) de los sujetos, si los sujetos se encuentran afectados por el cáncer o si el cáncer avanzó en los sujetos mediante la determinación de la presencia o ausencia del polipéptido de fusión de la presente invención o un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión en muestras de sujetos que incluyen no solamente pacientes con cáncer, sino también personas saludables.
74
imagen109

Claims (3)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    imagen6
    imagen7
    heteroarilo de 5 a 10 miembros;
    R30 representa alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; R31 representa alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo
    5 de 3 a 10 miembros; R32 representa alquilo C1-4 o arilo C6-10; <grupo P> halógeno, alquilo C1-4, haloalquilo C1-4, -OH, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, heterociclilamino de 3 a 10 miembros, -
    SO2R16, -CN, -NO2 y heterociclilo de 3 a 10 miembros; 10 <grupo Q> halógeno, alquilo C1-4, haloalquilo C1-4, -OH, alcoxi C1-3, monohidroxi alquilo C1-6, dihidroxi alquilo C1-6, trihidroxialquilo C1-6, heterociclil amina de 3 a 10 miembros, -SO2R16, -CN, -NO2, cicloalquilo C3-7, -COR19 y heterociclilo de 3 a 10 miembros que es opcionalmente sustituido por alquilo C1-4.
    imagen8
    167
    imagen9
  2. 9.
    Una célula recombinante que comprende el vector de la reivindicación 8.
  3. 10.
    Un método para la detección de
    (a) un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido FGFR3 y un polipéptido BAIAP2L1, que comprende la
    etapa de detección del polipéptido de fusión en una muestra aislada de un sujeto mediante el uso de un fragmento 5 de unión al anticuerpo o antígeno del mismo que se une al polipéptido de fusión de la reivindicación 7 o
    (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido FGFR3 y un polipéptido BAIAP2L1, que comprende la etapa de detección de un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión en una muestra aislada de un sujeto mediante el uso de un par de cebadores de oligonucleótido que consiste en cebadores sentido y antisentido que se hibridan cada uno en un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión la
    10 reivindicación 7 para le detección o amplificación del polinucleótido.
    169
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