CN117042780A - 用于mRNA治疗剂的T细胞的体内靶向 - Google Patents

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德鲁·韦斯曼
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Abstract

本发明涉及包含缀合至T细胞靶向结构域的递送媒介物的组合物，其中递送媒介物包含至少一种试剂，并且其中靶向结构域特异性结合至T细胞抗原。本发明还涉及使用所描述的组合物治疗或预防疾病和病症，包括癌症、传染性疾病和免疫学病症的方法。

Description

用于mRNA治疗剂的T细胞的体内靶向
相关申请
本发明申请主张2020年10月13日提交的美国临时专利申请号63/090,985的优先权，以上专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
有关联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院提供的经费AI045008的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
通过激活、抑制或修饰调节免疫细胞以改变它们的性质已成为一类被称为免疫治疗的流行且高需求的疗法。目前，离体产生CAR T细胞，这是昂贵且费时的。另外，它不是患有高度恶性癌症或具有极低T细胞计数的患者的治疗选择。仍非常需要开发体内T细胞靶向的mRNA递送系统以用于稳健且快速产生CAR T细胞及其他治疗剂。基于mRNA的CAR T细胞治疗剂还可以通过降低由于它们的瞬时性质所造成的CAR T细胞诱导的毒性风险以及避免基因组整合风险来提供安全的平台。CAR T细胞的瞬时存在还将适用于需要短期减少特定致病细胞的多种疾病，如用于治疗心肌纤维化、自体免疫疾病和多种其他疾病。
基于mRNA的治疗剂开发中的重要障碍在于有效的体内递送。因此，本领域需要有效、安全且免疫细胞特异的mRNA递送系统以用于引入和大规模使用当前稳健的基于mRNA的免疫治疗以及产生新的类型的稳健的基于mRNA的免疫治疗。本发明满足了这种未满足的需要。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施方式的以下详细说明。应理解本发明不局限于附图中所示的实施方式的确切方案和工具。
图1A显示了证实靶向的mRNA-LNP表达的体内生物分布的实例实验的结果。在得自注射了靶向和非靶向的荧光素酶mRNA-LNP的小鼠脾脏的CD3+细胞制剂中，荧光素酶mRNA作为LU/mg蛋白值的定量表达。
图2A和图2B显示了证实不同T细胞的亚型对Cre mRNA-LNP的体内吸收的实例实验的结果。图2A显示了其中在用10μg Cre mRNA-LNP处理后24小时收获脾脏的实验中的数据，并且使用流式细胞术确定T细胞亚群中ZsGreen1+细胞的％。每个符号代表一只动物并且水平线显示具有SEM的平均值。图2B显示了用于标识不同T细胞的亚型中ZsGreen1阳性细胞的设门策略。
图3显示了FAP CAR T的CD5靶向递送和体内产生的示意图。
图4A至图4D显示了CD5靶向的脂质纳米颗粒体外产生了功能性基于mRNA的FAPCART细胞。图4A和图4B显示了在与IgG/LNP-FAPCAR、CD5/LNP-GFP或者CD5/LNP-FAPCAR培育后48小时，鼠科T细胞中(图4A)GFP和(图4B)FAPCAR的表达的代表性流式细胞术分析。图4C显示了来自生物学独立的重复(n＝4)的对于FAPCAR染色阳性的鼠科T细胞的定量(百分比)。图4D显示将FAPCAR T细胞与表达FAP的靶标HEK293T细胞混合过夜并在生物学独立的重复(n＝3)中测定杀伤效率。数据为平均值+/-s.e.m.。
图5A至图5C显示了CD5/LNP-FAPCAR体外产生了功能性基于mRNA的FAPCAR T细胞。图5A显示了用于流式细胞术的代表性设门策略。图5B显示了证实通过来自两个生物学独立的重复的FAP CAR T细胞数目的提高，观察到靶标表达FAP的HEK293T细胞测定的杀伤提高的数据。数据为平均值+/-s.e.m.。图5C显示了在与CD5/LNP-GFP体外混合后24小时，证实人ACH2永生化T细胞表达GFP的数据。
图6A至图6D显示了CD5靶向的脂质纳米颗粒体内产生了基于mRNA的FAPCAR T细胞。图6A显示了在静脉内注射8μg对照IgG/LNP-Luc或者CD5/LNP-Luc后24小时，证实CD3+脾细胞中荧光素酶活性的数据。柱状图代表两个生物学独立的重复。图6B显示了证实用30μg非靶向的/LNP-Cre(NT)、IgG/LNP-Cre或者CD5/LNP-Cre注射Ai6小鼠(RosaCAG-LSLZsGreen)的数据。在24小时后，在(81.1％)CD4+和(75.6％)CD8+中观察到ZsGreen表达，但是在多种(15.0％)CD3-脾细胞中不能。柱状图代表两个生物学独立的重复。图6C显示了在注射10μg LNP后48小时，证实从AngII/PE损伤小鼠脾脏分离T细胞的数据。代表性流式细胞术分析显示了用CD5/LNP-FAPCAR注射的动物中的FAPCAR表达，但是在对照盐水、IgG/LNP-FAPCAR或者CD5/LNP-GFP动物中无表达。图6D显示了证实在C中对于FAPCAR染色阳性的鼠科T细胞定量的数据。在两个单独群组中，n＝2个生物学独立的小鼠/组。数据为平均值+/-s.e.m.。
图7显示了证实CD5靶向的脂质纳米颗粒体内产生了基于mRNA的FAPCAR T细胞的数据。来自在LNP施用后48小时，从用AngII/PE损伤1周的动物分离的脾脏T细胞的流式细胞术散点图显示仅CD5/LNP-FAPCAR注射对FAPCAR染色，而在盐水、非靶向(IgG/LNP-FAPCAR)或者CD5靶向、含有不相关的mRNA(CD5/LNP GFP)的LNP对照中未染色。
图8A至图8E显示了证实FAPCAR T细胞胞啃(trogocytose)来自激活的心脏成纤维细胞的FAP并仅在AngII/PE损伤的FAPCAR处理的动物中将FAP返回脾脏的示例性实验数据。图8A显示了表达FAPCAR的T细胞胞啃来自激活的成纤维细胞的FAP的示意图。图8B显示了两种FAPCAR T细胞的共聚焦时间推移显微照片，所述T细胞首先在40min(箭形)和85min(箭头)形成免疫学突触，然后胞啃来自HEK293T细胞的RFP-FAP(深红色)(在FAPCAR T细胞内，在85min，箭形和150min，箭头观察到斑点)。图8C显示了在107个MigR1-对照T细胞继承性转移后24小时未损伤的动物、在107个FAPCAR-GFP T细胞继承性转移后24小时未损伤的动物、在107个MigR1-对照T细胞继承性转移后48时AngII/PE-损伤(7天)的动物和在107个FAPCAR-GFP T细胞继承性转移后48小时AngII/PE-损伤(7天)的动物的FAP染色的脾脏(通过短划线突出显示白髓区)的广视野图像。比例尺：100μm。图8D显示了在107个FAPCAR-GFPT细胞继承性转移后48小时AngII/PE-损伤(7天)的动物的脾脏的白髓区中的FAP(深红色)和FAPCAR-GFP(黄色)的共聚焦显微照片。代表性FAPCAR+ T细胞的最大-Z投影(左下子图版)和单一Z切片(右下子图版)。比例尺：10μm。图8E显示了来自用10μg IgG/LNP-FAPCAR或CD5/LNP-FAPCAR注射48小时的AngII/PE-损伤(7天)的动物的FAP-染色脾脏的白髓区(短划线轮廓)的共聚焦显微照片。在CD5/LNP-FAPCAR处理条件下，FAP(灰色和深红色)和CD3(黄色)特异性重叠。比例尺：100μm(顶行；灰度)或10μm(底行；合并的伪彩色)。
图9显示了证实FAPCAR T细胞胞啃来自激活的心脏成纤维细胞的FAP并仅在AngII/PE损伤的FAPCAR处理的动物中将FAP返回脾脏的数据。胞啃的证据被限制在107个FAPCAR-GFP T细胞继承性转移后1、2和28天的AngII/PE-损伤(7天)的动物的脾脏白髓(未注射相等数目的MigR1-对照T细胞)。继承性转移后12周，脾脏中FAP+ T细胞的数目显著降低，然而可以观察到稀有的细胞。
图10A至图10H显示了证实体内产生的瞬时FAPCAR T细胞改善损伤后心脏功能的示例性实验数据。经由植入的28-天微型渗透泵，对野生型成年C57BL/6小鼠连续剂量施用盐水或AngII/PE。在压力-过载损伤1周后，注射靶向LNP。在另外两周后，分析小鼠。图10A显示了实验时间线的示意图。超声心动描记仪测量显示在单次注射10μg CD5/LNP-FAPCAR后，左心室(LV)容积、舒张和收缩功能的改善。(图10B)舒张末期和(图10C)收缩末期容积(μL)的测量。图10D显示了体重-归一化的LV质量(mg/g)的M-模式估计值。舒张功能(图10E)(E/e'，LV填充压力的估计值)(图10E)射血分数(％)和(图10G)整体纵向应变。图10H显示了代表性的m-模式超声心动描记仪图像。数据代表了分布在整个3个群组中，n＝7、7、8个生物学独立的小鼠/组。数据为平均值+/-s.e.m.。显示了单因素方差分析后的Tukey事后检验的p-值，p<0.05。
图11A至图11B显示了证实体内产生的瞬时FAPCAR T细胞改善损伤后心脏功能的示例性实验数据。图11A显示了小鼠体重和(图11B)阿佛丁麻醉下所测量的心率。图11C显示了证实仅在CD5/LNP-FAPCAR处理动物中有收缩改善，而在对照动物中没有的缩短分数(％)。
图12A至图12B显示了证实体内产生的FAPCAR T细胞改变损伤后心脏纤维化的示例性实验数据。对AngII/PE损伤动物单次注射10μgCD5/LNP-FAPCAR后两周的天狼猩红组织学分析。参见来自图10A的实验时间线。图12A显示天狼猩红(PSR)染色突出显示了空的未损伤动物(盐水泵植入+第1周盐水注射后3周)、损伤的对照动物(AngII/PE+盐水)、同种型非靶向的LNP对照(AngII/PE+IgG/LNP-FAPCAR)和处理的动物(AngII/PE+CD5/LNP-FAPCAR)的冠状心脏部分中的胶原蛋白(粉红色)。插图显示了左心室心肌的放大图。比例尺：100μm。图12B显示了图12A中所观察到的心室纤维化百分比的定量。分布在整个5个群组中，n＝8、11、12个生物学独立的小鼠/组。数据为平均值+/-s.e.m.。显示了单因素方差分析后的Tukey事后检验的p-值，p<0.05。
图13A至图13C显示了证实体内产生的FAPCAR T细胞改变损伤后心脏纤维化的示例性实验数据。图13A显示了来自图12中所述的所有剂量施用的动物的代表性的天狼猩红染色的(PSR)心脏。图13B显示了AngII/PE损伤时，心脏重量与体重之比(HW/BW，mg/g)升高，并且在CD5/LNP-FAPCAR治疗后，它得到了部分解决。图13C显示了证实图13A中所观察到的心室纤维化百分比的定量证实了纤维化仅在CD5/LNP-FAPCAR治疗动物中消退的数据。分布在整个5个群组中，n＝8、11、12、12个生物学独立的小鼠/组。数据为平均值+/-s.e.m.。显示了单因素方差分析后的Tukey事后检验的p值，p<0.05。
图14显示了证实在盐水或AngII/PE压力过载损伤3周后和在所指明的注射(盐水或CD5/LNP-FAPCAR)后2周的多个器官的H&E染色的示例性实验数据。
具体实施方式
本发明公开提供了通过使用免疫疗法方法治疗或预防受试者中疾病(例如，癌症)的组合物和方法，所述免疫疗法方法包括对受试者的免疫细胞体内基因编程以靶向和破坏靶细胞(例如，癌细胞)，借此治疗或预防疾病(例如，癌症)。在多个实施方式中，本发明公开提供了工程化以特异性靶向受试者免疫细胞的递送媒介物(例如，脂质体或脂质纳米颗粒(LNP))，所述免疫细胞如(但不限于)任何种类的骨髓细胞(例如，嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和单核细胞)或者任何种类的淋巴细胞(例如，T细胞(例如，细胞毒性T细胞、辅助性T细胞或者记忆T细胞)、B细胞(例如，浆细胞和记忆B细胞)和自然杀伤细胞)。在多个实施方式中，所述递送媒介物包含一个或多个细胞靶向部分，如蛋白、肽、抗体、抗体片段、抗原结合域、免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、小分子、适体、维生素、核酸分子等，它能够结合所述递送媒介物以靶向要编程或修饰的靶标免疫细胞。在多个实施方式中，所述递送媒介物包含一个或多个核酸分子(例如，mRNA、表达载体或基因组编辑载体)载物。如本文所使用的，术语“基因组编辑载体”是指编码基因组编辑系统的组分的核酸分子，如(但不限于)CRISPR/Cas9蛋白、碱基编辑器或引物编辑器，和任何相关所需要的组分，如适合的向导RNA(gRNA)。参见Kantor等人,“CRISPR-Cas9 DNA Base-Editing and PrimeEditing,”Int J Mol Sci,2020；21；第6240页，以上文献的内容作为参考并入。
在靶标免疫细胞(例如，通过胞吞)细胞吸收所述递送媒介物后，载物核酸从内涵体中释放。一旦释放，所述载物核酸修饰受试者的靶标免疫细胞，例如，通过对靶细胞(例如，癌细胞)特异的一个或多个合成表面受体的基于mRNA的、基于载体的或者基于基因组编辑的表达来修饰。一个或多个表面受体可以包括嵌合抗原受体(CAR)，其包含对靶细胞(例如，癌细胞)特异的抗原结合结构域。一个或多个表面受体还可以包括对靶细胞(例如，癌细胞)特异的T细胞受体(TCR)。一旦结合至靶细胞(例如，癌细胞)，编程或修饰的免疫细胞有助于破坏靶细胞(例如，通过T细胞介导的细胞毒性)，借此治疗或预防受试者中的疾病。
在多个实施方式中，本发明涉及具有缀合至T细胞靶向结构域的递送媒介物的组合物，其中所述递送媒介物包含至少一种试剂。在一个实施方式中，所述T细胞靶向结构域结合至CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6或CCR7。
在一个实施方式中，T细胞靶向结构域结合至泛T抗原。在一个实施方式中，泛T抗原是CD2、CD3、CD5或CD7。在一个实施方式中，泛T抗原是CD5。
在一个实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含缀合至用于靶向多个T细胞的亚型的T细胞靶向结构域的递送媒介物的组合。在一个实施方式中，所述组合包含两种或更多种T细胞靶向的递送媒介物，其靶向两种或更多种T细胞抗原。在一个实施方式中，两种或更多种T细胞抗原选自CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6和CCR7。在一个实施方式中，组合包含两种或更多种T细胞靶向的递送媒介物，其靶向CD4+ T细胞的表面抗原和CD8+ T细胞的表面抗原。在一个实施方式中，组合包含两种或更多种T细胞靶向的递送媒介物，其靶向CD4和CD8。
在某些实施方式中，递送媒介物是包含缀合至靶向结构域的PEG-脂质的脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，至少一种试剂是核酸。在一个实施方式中，核酸是核苷修饰的核酸分子。在一些实施方式中，至少一种试剂是mRNA治疗剂。在一个实施方式中，核酸是核苷修饰的mRNA治疗剂。本发明还涉及使用本文所描述的组合物治疗疾病或病症的方法。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所使用的，以下术语中的每一个具有在该部分中与之有关的含义。
冠词“一个”在本文中用于表示一个或大于一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”表示一个元素或大于一个元素。
当表示可测值，如量、时距等时，如本文所使用的“约”意味着涵盖了所指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，照此这些变化对于实施所公开的方法是适合的。
如本文所使用的术语“抗体”是指特异性结合抗原或表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来源于重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，其包括(例如)多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”是指全抗体的一部分并且是指全抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多重特异性抗体。
如本文所使用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的多肽链。
如本文所使用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的多肽链。k和l轻链表示两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所使用的术语“合成抗体”表示使用DNA重组技术所产生的抗体，如(例如)通过噬菌体所表达的抗体。还应将该术语视为表示已通过编码所述抗体的DNA分子的合成产生并且所述DNA分子表达指明所述抗体的抗体蛋白质或氨基酸序列的抗体，其中已使用在本领域中可用的并且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得了所述DNA或氨基酸序列。该术语还应被理解为表示通过编码所述抗体的RNA分子的合成产生的抗体。所述RNA分子表达抗体蛋白质，或者表示所述抗体的氨基酸序列，其中已通过在本领域中可用且熟知的转录DNA(合成或克隆)或其他技术获得RNA。
“疾病”是动物的健康状态，其中所述动物不可以维持体内平衡，并且其中如果所述疾病未得到改善，则所述动物的健康持续变差。相反，动物中的“病症”是其中所述动物能够维持体内平衡，但是其中所述动物的健康状态不如不存在所述病症的情况下的状态良好的健康状态。如果保持不治疗，则病症不必需导致所述动物的健康状态进一步降低。
如本文所使用的“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列，如基因、cDNA或mRNA用作生物过程中用于具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或者具有从中所获得的限定的氨基酸序列和生物学性质的其他聚合物和大分子的合成的模板的固有性质。因此，如果对应于所述基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生了蛋白，则所述基因编码所述蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链两者可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作性地连接至要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含对于表达来说足够的顺式作用元件；其他用于表达的元件可以通过宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域中已知的所有那些载体，如粘粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中的质粒)、RNA和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)，所述载体引入了重组多核苷酸。
“同源的”是指两个多肽之间或者两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两条所比较的序列的两者中的位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在该位置是同源的。两条序列之间的同源性百分比是两条序列共有的匹配或同源位置数目除以所比较的位置数目再×100。例如，如果两条序列的10个位置中有6个匹配或同源，则所述两条序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性。一般地，当两条序列比对时进行比较以提供最大同源性。
“分离的”表示相对于天然状态改变或从天然状态中除去。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其自然状态中共存的材料部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以处于基本纯化的形式，或者可以存在于非天然环境中，如(例如)宿主细胞。
在本发明的背景中，使用了常见核酸(通过N-糖苷键结合至核糖或脱氧核糖的核碱基)的下列缩写。“A”是指腺嘌呤核苷，“C”是指胞嘧啶核苷，“G”是指鸟嘌呤核苷，“T”是指胸腺嘧啶核苷并且“U”是指尿嘧啶核苷。
除非另作说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，从而在一些形式中，编码所述蛋白的核苷酸序列可以含有内含子。
如本文所使用的，术语“调节”表示与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比和/或与相同但未治疗的受试者中的反应水平相比，调节受试者中的反应水平的可检测的升高或降低。该术语涵盖了干扰和/或影响受试者，优选地人中的天然信号或反应，借此调节有益治疗反应。
除非另作说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。另外，所述核苷酸序列可以含有能够通过细胞中的翻译机器翻译的修饰的核苷。例如，在一些方面，所述核苷酸序列包含mRNA，其中一些或全部尿嘧啶核苷已被假尿嘧啶核苷、1-甲基假尿嘧啶核苷或者另一种修饰的核苷替代。
术语“可操作性地连接的”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致后者表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作性地连接。例如，如果所述启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作性地连接至编码序列。一般地，在相同阅读框中，可操作性地连接的DNA或RNA序列是邻接的，并且必要时，连接两个蛋白编码区。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中是可互换使用的并且表示无论体外还是原位，对本文所描述的方法起反应的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方式中，所述患者、受试者或个体是人。
如本文所使用的术语“多核苷酸”的定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有以下常识：核酸是多核苷酸，其可以水解为单体“核苷酸”。所述单体核苷酸可以水解为核苷。如本文所使用的多核苷酸包括(但不限于)通过本领域中可用的任何方式获得的所有核酸序列，所述方式无限制地包括重组方式，即使用常规克隆技术和PCRTM等从重组文库或细胞基因组中对核酸序列的克隆，和通过合成方式。
在某些情况下，本发明的多核苷酸或核酸是“核苷修饰的核酸”，其是指包含至少一个修饰的核苷的核酸。“修饰的核苷”是指具有修饰的核苷。例如，已在RNA中识别了超过100种不同的核苷修饰(Rozenski等人,1999,The RNA Modification Database:1999update.Nucl Acids Res 27:196-197)。
在某些实施方式中，“假尿嘧啶核苷”是指，在另一个实施方式中，m1acp3Y(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m1Y(1-甲基假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，该术语是指Ym(2'-O-甲基假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m5D(5-甲基二氢尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m3Y(3-甲基假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，该术语是指未进一步修饰的假尿嘧啶核苷部分。在另一个实施方式中，该术语是指任何以上假尿嘧啶核苷的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。在另一个实施方式中，该术语是指本领域中已知的任何其他假尿嘧啶核苷。每种可能性代表了本发明的单独的实施方式。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是可互换使用的并且表示由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且不限制可以组成蛋白或肽序列的最大氨基酸数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何的肽或蛋白。如本文所使用的，该术语是指短链和长链两者，所述短链在本领域中通常也被称为肽、寡肽和寡聚物，并且长链在本领域中通常被称为蛋白，其存在多种类型。“多肽”包括(例如)生物学活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同型二聚体、杂二聚物、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类拟物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
将如本文所使用的术语“启动子”定义为被细胞的合成机器，或引入的合成机器识别的DNA序列，它是起始多核苷酸序列的特异性转录所需的。例如，通过噬菌体RNA聚合酶识别启动子并且将其用于通过体外转录产生mRNA。
对于亲和配体，具体地，抗体来说，如本文所使用的术语“特异性结合”表示识别特异性抗原，但是基本不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的抗原的抗体还可以结合至来自一个或多个其他物种的抗原。但是，这种物种间的反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合至抗原的抗体还可以结合至所述抗原不同的等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”可以与抗体、蛋白或肽与第二化学物质的相互作用结合用于表示所述相互作用取决于所述化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，通常，抗体识别并结合至特异性蛋白结构，而不是蛋白。如果抗体对表位“A”特异，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，含有表位A的分子(或者游离的未标记的A)的存在将降低结合至所述抗体的标记的A的量。
如本文所使用的术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。通过抑制、减少、缓解或消除疾病或病症的至少一种病征或症状获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医师所探寻的组织、系统或受试者的生物或医学反应的受试化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时，足以预防正在治疗的疾病或病症的一种或多种病征和/或症状的发展或者在某种程度上减轻所述一种或多种病征和/或症状的化合物的量。治疗有效量将基于化合物、疾病及其严重程度、要治疗的受试者的年龄、体重等而改变。
作为本文中所使用的术语，“治疗”疾病表示降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。
如本文所使用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的一个细胞。细胞包括原代受试者细胞及其子代。
如本文所使用的短语“受转录控制”或者“可操作性连接的”表示启动子相对于多核苷酸处于正确位置和取向以控制通过RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
“载体”是包含分离的核酸并且可以用于向细胞内部递送分离的核酸的物质组合物。多种载体在本领域中是已知的，其包括(但不限于)线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应被视为包括有利于核酸向细胞递送的非质粒和非病毒化合物，如(例如)聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括(但不限于)腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，它是饱和或不饱和的(即含有一个或多个双键和/或三键)，具有1至24个碳原子(C1-C24烷基)、1至12个碳原子(C1-C12烷基)、1至8个碳原子(C1-C8烷基)或者1至6个碳原子(C1-C6烷基)并且通过单键连接至所述分子的其余部分，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1二甲基乙基(叔丁基)、3甲基己基、2甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非另外具体指明，否则烷基是可选地取代的。
“亚烷基”或“亚烷基链”是指将所述分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成，它是饱和或不饱和的(即含有一个或多个双键(亚烯基)和/或三键(亚炔基))并且具有(例如)1至24个碳原子(C1-C24亚烷基)、1至15个碳原子(C1-C15亚烷基)、1至12个碳原子(C1-C12亚烷基)、1至8个碳原子(C1-C8亚烷基)、1至6个碳原子(C1-C6亚烷基)、2至4个碳原子(C2-C4亚烷基)、1至2个碳原子(C1-C2亚烷基)，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。亚烷基链通过单键或双键连接至所述分子的其余部分并且通过单键或双键连接至基团。亚烷基链与所述分子的其余部分以及与基团的连结点可以通过所述链内的一个碳或任何两个碳。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烷基链可以是可选地取代的。
“环烷基”或“碳环”是指仅由碳和氢原子组成的稳定非芳香族单环或多环烃基，其可以包括稠合或桥接的环系统，所述系统具有3至15个碳原子，优选地具有3至10个碳原子，并且它是饱和或不饱和的并且通过单键连接至所述分子的其余部分。单环基团包括(例如)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环基团包括(例如)金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7,7二甲基双环[2.2.1]庚基等。除非另外具体指明，否则环烷基基团是可选地取代的。
“环亚烷基”是二价环烷基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则环亚烷基基团可以是可选地取代的。
“杂环基”或“杂环”是指由2至12个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子所组成的稳定3-至18-元非芳香族环基团。除非在说明书中另有具体说明，否则杂环基基团可以是单环、双环、三环或四环系统，其可以包括稠合或桥连的环系统；并且杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以可选地被氧化；所述氮原子可以可选地季铵化；并且所述杂环基基团可以是部分或完全饱和的。这些杂环基基团的实例包括(但不限于)二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异恶唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧哌嗪基、2-氧哌啶基、2-氧吡咯烷基、恶唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫吗啉基、1-氧-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非另外具体指明，否则杂环基基团可以是可选地取代的。
本文所使用的术语“取代的”表示任何上述基团(例如，烷基、环烷基或杂环基)，其中至少一个氢原子被与非氢原子的键替换，如(但不限于)：卤素原子，如F、Cl、Br和I；桥氧基(＝O)；羟基(-OH)；烷氧基(ORa，其中Ra是C1-C12烷基或环烷基)；羧基(OC(＝O)Ra或者-C(＝O)ORa，其中Ra为H、C1-C12烷基或环烷基)；胺基(NRaRb，其中Ra和Rb分别独立地为H、C1-C12烷基或环烷基)；C1-C12烷基；和环烷基基团。在一些实施方式中，取代基是C1-C12烷基。在其他实施方式中，取代基是环烷基基团。在其他实施方式中，取代基是卤代基团，如氟代。在其他实施方式中，取代基是桥氧基。在其他实施方式中，取代基是羟基。在其他实施方式中，取代基是烷氧基。在其他实施方式中，取代基是羧基。在其他实施方式中，取代基是胺基。
“可选的”或“可选地”(例如，可选地取代的)表示随后所述的事件或状况可以或可以不发生，并且描述包括其中所述事件或状况发生的情况和其中它不发生的情况。例如，“可选地取代的烷基”表示所述烷基可以或可以不被取代，并且该描述包括取代的烷基和未取代的烷基两者。
范围：在整个发明公开中，本发明的多个方面可以以范围格式存在。应理解以范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应将其视为对本发明范围的刻板限制。因此，对范围的描述应认为具有具体公开的所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围，如1至6的描述应认为具有具体公开的子范围，如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这是适用的，而无需考虑范围的宽度。
描述
本发明部分涉及用于递送媒介物的靶向递送的组合物和方法。在一个方面，本发明涉及包含缀合至靶向结构域的递送媒介物的组合物。在一个实施方式中，递送媒介物包含至少一种试剂，如治疗剂。在一个实施方式中，递送媒介物包含RNA分子，其包括(但不限于)mRNA、核苷修饰的RNA、siRNA、miRNA、shRNA或者反义RNA。在一个实施方式中，递送媒介物包含治疗剂。在一个实施方式中，治疗剂是核苷修饰的RNA。
在一个实施方式中，组合物包含缀合至靶向结构域的递送媒介物，靶向结构域结合T细胞表面抗原，借此将组合物导向至T细胞。
在多个实施方式中，靶向结构域结合至在T细胞(例如，泛T抗原)的多种亚型上表达的T细胞的细胞表面分子。可以靶向的泛T抗原包括(但不限于)CD2、CD3、CD5和CD7。
在多个实施方式中，本发明涉及包含靶向的递送媒介物的组合的组合物，其中组合包含靶向第一T细胞抗原的第一递送媒介物和靶向至少一种其他T细胞抗原的至少一种其他递送媒介物，从而靶向的递送媒介物的组合靶向多种T细胞的亚型。可以靶向的T细胞抗原包括(但不限于)CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6和CCR7。
在一个实施方式中，本发明的组合物包含靶向CD4的第一递送媒介物和靶向CD8的第二递送媒介物，从而靶向的递送媒介物的组合靶向细胞毒CD8+ T细胞和CD4+辅助性T细胞的组合。
在一个实施方式中，递送媒介物包含或包封了用于调节T细胞的试剂。在一些实施方式中，试剂是基于mRNA的免疫治疗。在一个实施方式中，递送媒介物包含或包封了编码嵌合抗原受体(CAR)分子的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子是编码CAR的mRNA分子。
本发明还部分涉及治疗对其有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括施用包含含有缀合至结合T细胞表面抗原的靶向结构域的试剂的至少一种递送媒介物的组合物。
可以使用本发明的T细胞靶向的治疗性组合物治疗的示例性疾病和病症包括(但不限于)癌症、传染性疾病和免疫学病症。
递送媒介物载物(cargo)
在多个实施方式中，递送媒介物包含一个或多个基因修饰免疫细胞的核酸分子(例如，mRNA、表达载体或基因组编辑载体)的载物。在靶标免疫细胞(例如，通过胞吞)细胞吸收递送媒介物后，所述载物核酸从内涵体中释放。一旦释放，所述载物核酸修饰受试者的靶标免疫细胞以表达一个或多个表面部分(例如，细胞受体)。一个或多个表面部分可以包括嵌合抗原受体(CAR)，其包含对靶细胞的一个或多个标志物特异的抗原结合结构域。一个或多个表面部分还可以包括对靶细胞的一个或多个标志物特异的T细胞受体(TCR)。一旦结合至靶细胞，编程或修饰的免疫细胞有助于破坏靶细胞(例如，通过T细胞介导的细胞毒性)，借此治疗或预防受试者中的疾病或病症(例如，癌症)。
在一个实施方式中，本发明公开考虑本文所公开的递送媒介物包含至少一种试剂。在一些实施方式中，试剂是治疗剂、成像剂、诊断剂、造影剂、标记剂、检测剂或消毒剂。试剂还可以包括通常不认为是活性成分的具有生物学活性的物质，如香料、甜味剂、调味剂和风味增强剂、pH调节剂、泡腾剂、润肤剂、膨胀剂、可溶性有机盐、渗透剂、抗氧化剂、着色剂或染色剂等。
在一个实施方式中，递送媒介物包含至少一种治疗剂。本发明不局限于任何具体治疗剂，而是涵盖可以包括在递送媒介物内的任何适合的治疗剂。示例性治疗剂包括(但不限于)抗病毒剂、抗菌剂、抗氧化剂、血栓溶解剂、化疗剂、抗炎剂、免疫原性剂、抗菌剂、麻醉剂、止痛剂、药物试剂、小分子、肽、核酸等。在一个实施方式中，试剂是如在本文其他地方所描述的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)。
核酸试剂
在一个方面，本发明公开提供了包含用于抑制、失活和/或破坏激活的成纤维细胞的核酸载物(例如，DNA或RNA)的递送媒介物，核酸载物包括(但不限于)mRNA、表达载体、基因组编辑载体、siRNA、shRNA、miRNA。在多个实施方式中，核酸载物可以是核苷修饰的核酸分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)。在多个实施方式中，试剂是分离的核酸。在某些实施方式中，分离的核酸分子是DNA分子或RNA分子之一。在一些实施方式中，分离的核酸分子是cDNA、mRNA、siRNA、shRNA或者miRNA分子。在一些实施方式中，试剂是分离的核酸分子，分离的核酸分子是核苷修饰的RNA分子。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA分子、siRNA、miRNA、shRNA或者反义分子。
在多个实施方式中，递送媒介物包含基因修饰免疫细胞以靶向细胞(例如，癌细胞)的一个或多个核酸分子(例如，mRNA、表达载体或基因组编辑载体、DNA或RNA)的载物。在靶标免疫细胞(例如，通过胞吞)细胞吸收递送媒介物后，所述载物核酸从内涵体中释放。一旦释放，所述载物核酸修饰受试者的靶标免疫细胞以表达对于所关心的靶细胞(例如，癌细胞)特异的一种或多种表面部分(例如，细胞受体)。一个或多个表面部分可以包括嵌合抗原受体(CAR)，其包含对靶细胞的一个或多个标志物(例如，癌症标志物)特异的抗原结合结构域。一个或多个表面部分还可以包括T细胞受体(TCR)，其对靶细胞的一个或多个标志物(例如，癌症标志物)特异。一旦结合至靶细胞(例如，癌细胞)，编程或修饰的免疫细胞有助于破坏靶细胞(例如，通过T细胞介导的细胞毒性)，借此治疗或预防受试者中的疾病(例如，癌症)。
在一个实施方式中，核酸包括启动子/调控序列，从而核酸能够指导核酸的表达。因此，本发明涵盖了用于将外源核酸引入细胞，并伴随着所述外源核酸在所述细胞中的表达的表达载体和方法，如(例如)Sambrook等人(2012,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和Ausubel等人(1997,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York)以及如在本文其他地方所描述的那些。
核苷修饰的RNA
在一个实施方式中，本发明的组合物包含核苷修饰的核酸(例如，核苷修饰的mRNA分子)。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码蛋白，如治疗性蛋白的核苷修饰的RNA。
例如，在一个实施方式中，组合物包含核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，组合物包含核苷修饰的mRNA。核苷修饰的mRNA相比于未修饰的mRNA具有特别的优势，包括(例如)提高的稳定性、低或不存在的先天免疫原性和增强的翻译。在本发明中有用的核苷修饰的mRNA进一步描述于美国专利号8,278,036、8,691,966和8,835,108，以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，核苷修饰的mRNA不激活任何病理生理途径，转化非常有效并且几乎在递送后立即转化，并且用作持续几天的体内连续蛋白质生产的模板(Kariko等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840；Kariko等人,2012,Mol Ther 20:948-953)。发挥生理作用所需的mRNA的量较小而且这使其适用于人疗法。
在某些情况下，与使用蛋白、质粒DNA或病毒载体的方法相比，通过递送编码mRNA表达蛋白具有多种益处。在mRNA转染期间，所期望的蛋白的编码序列是递送至细胞的唯一物质，因此避免了与质粒主链、病毒基因和病毒蛋白质有关的所有副作用。更重要地，不同于基于DNA的和基于病毒的载体，mRNA不具有引入基因组的风险并且在mRNA递送后立即开始蛋白质生产。例如，已在体内注射编码mRNA 15至30分钟内测量到高水平的循环蛋白。在某些实施方式中，使用mRNA而不是蛋白也具有多种优势。蛋白在循环中的半衰期通常较短，因此蛋白处理将需要频繁的剂量施用，同时mRNA提供了几天的连续蛋白质生产的模板。蛋白纯化是成问题的并且它们可以含有引起副作用的聚集物及其他杂质(Kromminga andSchellekens,2005,Ann NY Acad Sci 1050:257-265)。
在某些实施方式中，核苷修饰的RNA包含天然存在的修饰的-核苷假尿嘧啶核苷。在某些实施方式中，假尿嘧啶核苷的包含使得mRNA更稳定、非免疫原性且高度可翻译(Kariko等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840；Anderson等人,2010,Nucleic Acids Res38:5884-5892；Anderson等人,2011,Nucleic Acids Research 39:9329-9338；Kariko等人,2011,Nucleic Acids Research 39:e142；Kariko等人,2012,Mol Ther 20:948-953；Kariko等人,2005,Immunity 23:165-175)。
已证实修饰的核苷，包括假尿嘧啶核苷在RNA中的存在抑制它们先天免疫原性(Kariko等人,2005,Immunity 23:165-175)。此外，可以比不含或含有其他修饰的核苷的RNA更有效地转化蛋白-编码、体外-转录的含有假尿嘧啶核苷的RNA(Kariko等人,2008,MolTher 16:1833-1840)。随后，已表明假尿嘧啶核苷的存在改善了RNA的稳定性(Anderson等人,2011,Nucleic Acids Research 39:9329-9338)并且降低了PKR的激活和翻译的抑制两者(Anderson等人,2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892)。对于含有1-甲基-假尿嘧啶核苷的RNA也观察到了如对于假尿嘧啶核苷所述的类似作用。
在一些实施方式中，核苷修饰的核酸分子是纯化的核苷修饰的核酸分子。例如，在一些实施方式中，纯化组合物以除去双链污染物。在一些情况下，将制备型HPLC纯化程序用于获得具有优良翻译潜力且无先天免疫原性的含有假尿嘧啶核苷的RNA(Kariko等人,2011,Nucleic Acids Research 39:e142)。将编码促红细胞生成素的HPLC-纯化的含假尿嘧啶核苷的RNA施用于小鼠和猕猴导致血清EPO水平显著升高(Kariko等人,2012,Mol Ther20:948-953)，因此确认含假尿嘧啶核苷的mRNA适合于体内蛋白疗法。
在一些实施方式中，使用非HPLC方法纯化核苷修饰的核酸分子。在一些情况下，使用色谱方法纯化核苷修饰的核酸分子，所述方法包括(但不限于)HPLC和快速蛋白液相色谱(FPLC)。示例性FPLC-基纯化程序描述于Weissman等人,2013,Methods Mol Biol,969:43-54。在美国专利申请公开号US2016/0032316中也描述了示例性纯化程序，该专利申请公开以其全部内容作为参考并入本文。
本发明涵盖了包含假尿嘧啶核苷或修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子。在某些实施方式中，组合物包含分离的核酸，其中核酸包含假尿嘧啶核苷或修饰的核苷。在某些实施方式中，组合物包含载体，所述载体包含分离的核酸，其中核酸包含假尿嘧啶核苷或修饰的核苷。
在一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA是IVT RNA，如在本文其他地方所描述的。例如，在某些实施方式中，通过T7噬菌体RNA聚合酶合成了核苷修饰的RNA。在另一个实施方式中，通过SP6噬菌体mRNA聚合酶合成了核苷修饰的mRNA。在另一个实施方式中，通过T3噬菌体mRNA聚合酶合成了核苷修饰的RNA。
在一个实施方式中，修饰的核苷是m1acp3Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m1Ψ(1-甲基假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Ψm(2'-O-甲基假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m5D(5-甲基二氢尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m3Ψ(3-甲基假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是未进一步修饰的假尿嘧啶核苷部分。在另一个实施方式中，修饰的核苷是任何以上假尿嘧啶核苷的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。在另一个实施方式中，修饰的核苷是本领域中已知的任何其他假尿嘧啶核苷样核苷。
在另一个实施方式中，在本发明的核苷修饰的RNA中修饰的核苷是尿嘧啶核苷(U)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是胞苷(C)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是腺苷酸(A)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是鸟苷(G)。
在另一个实施方式中，本发明的修饰的核苷是m5C(5-甲基胞苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m5U(5-甲基尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m6A(N6-甲基腺苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是s2U(2-硫尿核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Ψ(假尿嘧啶核苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Um(2'-O-甲基尿嘧啶核苷)。
在其他实施方式中，修饰的核苷是m1A(1-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2’-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲基硫代-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲基硫代-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲基硫代-N6-(顺羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；Ar(p)(2’-O-核糖基腺苷(磷酸酯))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m1Im(1,2’-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2’-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫代胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；m5Cm(5,2’-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2’-O-甲基胞苷)；k2C(赖胞苷)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2’-O-甲基鸟苷)；m2 2G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2’-O-二甲基鸟苷)；m2 2Gm(N2,N2,2’-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2’-O-核糖基鸟苷(磷酸酯))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不完全的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基怀俄苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧基辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQ0(7-氰基-7-去氮鸟苷)；preQ1(7-氨基甲基-7-去氮鸟苷)；G+(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2’-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫代尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)；s2Um(2-硫代-2’-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-羟乙酸)；mcmo5U(尿苷5-羟乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷)；mchm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2’-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；cmnm5Um(5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；m6 2A(N6,N6-二甲基腺苷)；Im(2’-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2’-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟基甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧基甲基尿苷)；m6Am(N6,2’-O-二甲基腺苷)；m6 2Am(N6,N6,O-2’-三甲基腺苷)；m2,7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2,2,7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2’-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2’-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2’-O-二甲基鸟苷)；m1Am(1,2’-O-二甲基腺苷)；τm5U(5-牛磺酸甲基尿苷)；τm5s2U(5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷)；imG-14(4-去甲基怀俄苷)；imG2(异怀俄苷)；或者ac6A(N6-乙酰基腺苷)。
在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA包含2个或更多个上述修饰的组合。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA包含3个或更多个上述修饰的组合。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA包含大于3个上述修饰的组合。
在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA中0.1％至100％的残基是修饰的(例如，通过假尿嘧啶核苷或者修饰的核苷碱基的存在)。在另一个实施方式中，0.1％的残基是修饰。在另一个实施方式中，修饰的残基的分数是0.2％。在另一个实施方式中，分数是0.3％。在另一个实施方式中，分数是0.4％。在另一个实施方式中，分数是0.5％。在另一个实施方式中，分数是0.6％。在另一个实施方式中，分数是0.8％。在另一个实施方式中，分数是1％。在另一个实施方式中，分数是1.5％。在另一个实施方式中，分数是2％。在另一个实施方式中，分数是2.5％。在另一个实施方式中，分数是3％。在另一个实施方式中，分数是4％。在另一个实施方式中，分数是5％。在另一个实施方式中，分数是6％。在另一个实施方式中，分数是8％。在另一个实施方式中，分数是10％。在另一个实施方式中，分数是12％。在另一个实施方式中，分数是14％。在另一个实施方式中，分数是16％。在另一个实施方式中，分数是18％。在另一个实施方式中，分数是20％。在另一个实施方式中，分数是25％。在另一个实施方式中，分数是30％。在另一个实施方式中，分数是35％。在另一个实施方式中，分数是40％。在另一个实施方式中，分数是45％。在另一个实施方式中，分数是50％。在另一个实施方式中，分数是60％。在另一个实施方式中，分数是70％。在另一个实施方式中，分数是80％。在另一个实施方式中，分数是90％。在另一个实施方式中，分数是100％。
在另一个实施方式中，分数小于5％。在另一个实施方式中，分数小于3％。在另一个实施方式中，分数小于1％。在另一个实施方式中，分数小于2％。在另一个实施方式中，分数小于4％。在另一个实施方式中，分数小于6％。在另一个实施方式中，分数小于8％。在另一个实施方式中，分数小于10％。在另一个实施方式中，分数小于12％。在另一个实施方式中，分数小于15％。在另一个实施方式中，分数小于20％。在另一个实施方式中，分数小于30％。在另一个实施方式中，分数小于40％。在另一个实施方式中，分数小于50％。在另一个实施方式中，分数小于60％。在另一个实施方式中，分数小于70％。
在一些实施方式中，组合物包含单链核苷修饰的RNA的纯化制剂。例如，在一些实施方式中，单链核苷修饰的RNA的纯化制剂基本不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方式中，相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，所述纯化制剂是至少90％，或者至少91％，或者至少92％，或者至少93％，或者至少94％，或者至少95％，或者至少96％，或者至少97％，或者至少98％，或者至少99％，或者至少99.5％，或者至少99.9％的单链核苷修饰的RNA。
在另一个实施方式中，给定核苷(即尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷或腺嘌呤核苷)的0.1％的残基是修饰的。在另一个实施方式中，修饰的给定核苷酸的分数是0.2％。在另一个实施方式中，分数是0.3％。在另一个实施方式中，分数是0.4％。在另一个实施方式中，分数是0.5％。在另一个实施方式中，分数是0.6％。在另一个实施方式中，分数是0.8％。在另一个实施方式中，分数是1％。在另一个实施方式中，分数是1.5％。在另一个实施方式中，分数是2％。在另一个实施方式中，分数是2.5％。在另一个实施方式中，分数是3％。在另一个实施方式中，分数是4％。在另一个实施方式中，分数是5％。在另一个实施方式中，分数是6％。在另一个实施方式中，分数是8％。在另一个实施方式中，分数是10％。在另一个实施方式中，分数是12％。在另一个实施方式中，分数是14％。在另一个实施方式中，分数是16％。在另一个实施方式中，分数是18％。在另一个实施方式中，分数是20％。在另一个实施方式中，分数是25％。在另一个实施方式中，分数是30％。在另一个实施方式中，分数是35％。在另一个实施方式中，分数是40％。在另一个实施方式中，分数是45％。在另一个实施方式中，分数是50％。在另一个实施方式中，分数是60％。在另一个实施方式中，分数是70％。在另一个实施方式中，分数是80％。在另一个实施方式中，分数是90％。在另一个实施方式中，分数是100％。
在另一个实施方式中，修饰的给定核苷酸的分数小于8％。在另一个实施方式中，分数小于10％。在另一个实施方式中，分数小于5％。在另一个实施方式中，分数小于3％。在另一个实施方式中，分数小于1％。在另一个实施方式中，分数小于2％。在另一个实施方式中，分数小于4％。在另一个实施方式中，分数小于6％。在另一个实施方式中，分数小于12％。在另一个实施方式中，分数小于15％。在另一个实施方式中，分数小于20％。在另一个实施方式中，分数小于30％。在另一个实施方式中，分数小于40％。在另一个实施方式中，分数小于50％。在另一个实施方式中，分数小于60％。在另一个实施方式中，分数小于70％。
在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA在细胞中的翻译比具有相同序列的未修饰的RNA分子更有效。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA显示出增强的被靶细胞翻译的能力。在另一个实施方式中，相对于其未修饰的对应物，翻译增强2倍。在另一个实施方式中，翻译增强3倍。在另一个实施方式中，翻译增强5倍。在另一个实施方式中，翻译增强7倍。在另一个实施方式中，翻译增强10倍。在另一个实施方式中，翻译增强15倍。在另一个实施方式中，翻译增强20倍。在另一个实施方式中，翻译增强50倍。在另一个实施方式中，翻译增强100倍。在另一个实施方式中，翻译增强200倍。在另一个实施方式中，翻译增强500倍。在另一个实施方式中，翻译增强1000倍。在另一个实施方式中，翻译增强2000倍。在另一个实施方式中，倍数是10至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是10至100倍。在另一个实施方式中，倍数是10至200倍。在另一个实施方式中，倍数是10至300倍。在另一个实施方式中，倍数是10至500倍。在另一个实施方式中，倍数是20至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是30至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是50至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是100至1000倍。在另一个实施方式中，倍数是200至1000倍。在另一个实施方式中，翻译增强任何其他显著的量或量的范围。
在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA显示出比具有相同序列的未修饰的体外合成的RNA分子显著较低的先天免疫原性。在另一个实施方式中，修饰的RNA分子显示出比其未修饰的对应物小2倍的先天性免疫应答。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了3倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了4倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了5倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了6倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了7倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了8倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了9倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了10倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了15倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了20倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了50倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了100倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了200倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了500倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了1000倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了2000倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低另一倍数差异。
在另一个实施方式中，“显示出显著较低的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测降低。在另一个实施方式中，该术语是指先天免疫原性的成倍降低(例如，以上列举的降低倍数之一)。在另一个实施方式中，该术语是指使得可以施用有效量的核苷修饰的RNA但不会引发可检测的先天性免疫应答的降低。在另一个实施方式中，该术语是指使得可以反复施用核苷修饰的RNA，但不会引起足以可检测地降低修饰的RNA所编码的蛋白的产生的先天性免疫应答的降低。在另一个实施方式中，所述降低使得可以反复施用核苷修饰的RNA，但不会引起足以消除修饰的RNA所编码的蛋白的可检测的产生的先天性免疫应答的降低。
RNA干扰剂
在一个实施方式中，将siRNA用于降低靶标蛋白的水平。RNA干扰(RNAi)是其中双链RNA(dsRNA)向广泛的生物和细胞类型中的引入导致互补mRNA降解的现象。在细胞中，通过被称为Dicer的核糖核酸酶将长dsRNA切割成短的21-25个核苷酸的小干扰RNA或siRNA。随后，将siRNA与蛋白组分组装成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，其在该过程中解旋。然后，将激活的RISC通过siRNA反义链和mRNA之间的碱基配对相互作用结合至互补转录本。将结合的mRNA切割，并且mRNA的序列特异性降解导致了基因沉默。参见，例如，美国专利号6,506,559；Fire等人,1998,Nature 391(19):306-311；Timmons等人,1998,Nature 395:854；Montgomery等人,1998,TIG 14(7):255-258；David R.Engelke主编,RNAInterference(RNAi)Nuts&Bolts of RNAi Technology,DNA Press,Eagleville,PA(2003)；和GregoryJ.Hannon主编,RNAi AGuide to Gene Silencing,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY(2003)。Soutschek等人(2004,Nature 432:173-178)描述了对辅助静脉内全身递送的siRNA的化学修饰。siRNA的优化包括对整体G/C含量、末端C/T含量、Tm和3'悬突的核苷酸含量的考虑。参见，例如，Schwartz等人,2003,Cell,115:199-208和Khvorova等人,2003,Cell115:209-216。因此，本发明还包括使用RNAi技术降低PTPN22水平的方法。
在一个方面，本发明包括包含siRNA或反义多核苷酸的载体。优选地，siRNA或反义多核苷酸能够抑制靶标多肽的表达。所期望的多核苷酸向载体的掺入以及载体的选择在本领域中是熟知的，如(例如)Sambrook等人(2012)和Ausubel等人(1997)以及本文其他处。
在某些实施方式中，本文所描述的表达载体编码短发夹RNA(shRNA)试剂。shRNA分子在本领域中是熟知的并且针对靶标的mRNA，借此降低了所述靶标的表达。在某些实施方式中，通过细胞表达所编码的shRNA，然后加工成siRNA。例如，在某些情况下，细胞具有切割shRNA以形成siRNA的天然酶(例如，dicer)。
为了评价siRNA、shRNA或反义多核苷酸的表达，要引入到细胞中的表达载体还可以含有可选择标志物基因或报告基因或两者，以有利于从试图使用本发明的递送媒介物转染或感染的细胞群体中鉴定表达细胞。在其他实施方式中，所述可选择标志物可以在单独的DNA片上携带并且还可以包含在递送媒介物内。可选择标志物和报告基因两者均可以侧接适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标志物在本领域中是已知的并且包括(例如)抗生素抗性基因，如新霉素抗性等。
因此，在一个方面，递送媒介物可以含有载体，所述载体包含要递送的核苷酸序列或构建体。载体的选择将取决于其中它随后将引入的宿主细胞。在具体的实施方式中，本发明的载体为表达载体。适合的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞。在具体的实施方式中，所述表达载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物细胞载体。基于原核生物载体的和/或基于真核生物载体的系统可以用于和本发明一起使用以产生多核苷酸或者它们的同源多肽。众多这类系统是可商购的和广泛可用的。
通过说明，其中引入核酸序列的载体可以是质粒，当引入细胞时，它整合或未整合到宿主细胞的基因组中。其中可以插入本发明的核苷酸序列或者本发明的基因构建体的载体的说明性的非限制性实例包括用于在真核生物细胞中表达的tet-on诱导型载体。
可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得载体(Sambrook等人,2012)。在具体的实施方式中，载体是用于转化动物细胞的载体。
在一个实施方式中，重组表达载体还可以含有核酸分子，核酸分子编码肽或拟肽。
启动子可以是与基因或多核苷酸序列天然结合的一个启动子，如可以通过分离位于所述编码段和/或外显子上游的5'非编码序列获得。这种启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与多核苷酸序列天然结合的增强子，其位于该序列的下游或上游。作为另外一种选择，通过将编码多核苷酸段置于重组或异源启动子的控制之下将获得某些优势，所述启动子是指在其天然环境中通常不与所述多核苷酸序列结合的启动子。重组或异源增强子还表示在其天然环境中通常不与所述多核苷酸序列结合的增强子。这些启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，和分离自任何其他原核、病毒或真核细胞的启动子或增强子，和非“天然存在的”启动子或增强子，即含有不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变的启动子或增强子。除通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以结合本文所公开的组合物，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCRTM产生序列(美国专利4,683,202、美国专利5,928,906)。此外，考虑还可以使用在非核细胞器，如线粒体、叶绿体等内指导序列的转录和/或表达的控制序列。
天然地，使用在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物中有效指导DNA段的表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员通常已知如何使用启动子、增强子和细胞类型的组合来用于蛋白表达，例如，参见Sambrook等人(2012)。所使用的启动子可以是组成型的，组织特异的、诱导型的和/或在适当条件下有用的以指导所引入的DNA段的高水平表达，如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。所述启动子可以是异源的或内源的。
重组表达载体还可以含有可选择标志物基因，其有利于宿主细胞的选择。适合的可选择标志物基因是编码蛋白，如赋予对某些药物的抗性的G418和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光虫荧光素酶或免疫球蛋白或其部分，如免疫球蛋白的Fc部分，优选地IgG的基因。可以在来自所关心的核酸的单独的载体上引入可选择标志物。
在siRNA多核苷酸产生后，技术人员将理解siRNA多核苷酸将具有可以修饰以改善作为治疗化合物的siRNA的某些特征。因此，还可以通过对其进行修饰以包括硫代磷酯或其他键、膦酸甲酯、砜、硫酸酯、羰游基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等来设计siRNA多核苷酸以耐受降解(参见，例如，Agrawal等人,1987,Tetrahedron Lett.28:3539-3542；Stec等人,1985Tetrahedron Lett.26:2191-2194；Moody等人,1989Nucleic AcidsRes.12:4769-4782；Eckstein,1989Trends Biol.Sci.14:97-100；Stein,In:Oligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of Gene Expression,Cohen主编,Macmillan Press,London,第97-117页(1989))。
还可以修饰任何多核苷酸以提高其体内稳定性。可能的修饰包括(但不限于)在5'和/或3'端添加侧接序列；在主链中使用硫代磷酯或2'O-甲基，而不是磷酸二酯键；和/或包含非常规碱基，如肌苷、Q核苷(queuosine)和怀丁苷等以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基-、甲基-、硫代-和其他修饰形式。
在本发明的一个实施方式中，将通过质粒载体表达的反义核酸序列用作抑制靶标蛋白表达的试剂。将反义表达载体用于转染哺乳动物细胞或哺乳动物本身，借此导致所述靶标蛋白的内源表达降低。
反义分子和它们用于抑制基因表达的使用在本领域中是熟知的(参见，例如，Cohen,1989,In:Oligodeoxyribonucleotides,Antisense Inhibitors of GeneExpression,CRC Press)。如在本文其他处定义的术语，反义核酸是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub,1990,Scientific American 262:40)。在细胞中，反义核酸杂交至相应mRNA，从而形成双链分子，借此抑制基因的翻译。
反义方法抑制基因翻译的使用在本领域中是已知的，并且描述于(例如)Marcus-Sakura(1988,Anal.Biochem.172:289)。可以使用编码反义分子的DNA，通过基因表达向细胞提供这些反义分子，如Inoue,1993,美国专利号5,190,931所教导的。
作为另外一种选择，可以通过合成制备本发明的反义分子，然后向细胞提供。约10至约30，并且更优选地约15个核苷酸的反义寡聚物是优选的，因为它们易于合成和引入靶细胞。通过本发明所考虑的合成反义分子包括本领域中已知的寡核苷酸衍生物，与未修饰的寡核苷酸相比，其具有改善的生物活性(参见美国专利号5,023,243)。
在本发明的一个实施方式中，将核糖酶用作抑制靶标蛋白表达的试剂。可以通过将靶标序列引入基本的核糖酶结构中来设计用于抑制靶标分子表达的核糖酶，所述靶标序列(例如)与编码所述靶标分子的mRNA序列互补。可以使用可商购的试剂(AppliedBiosystems,Inc.,Foster City,CA)合成靶向所述靶标分子的核糖酶，或者可以从编码它们的DNA通过基因表达它们。
在一个实施方式中，试剂可以包含CRISPR-Cas系统的一种或多种组分，其中靶向编码靶标分子的基因的向导RNA(gRNA)和CRISPR相关(Cas)肽形成复合物以诱导所述靶标基因内的突变。在一个实施方式中，试剂包括gRNA或者编码gRNA的核酸分子。在一个实施方式中，试剂包括Cas肽或者编码Cas肽的核酸分子。
微小RNA试剂
在一个实施方式中，试剂包含miRNA或miRNA的模拟物。在一个实施方式中，试剂包含编码miRNA或miRNA的模拟物的核酸分子。
MiRNA是能够通过抑制翻译或者通过靶向的mRNA的降解导致细胞中特定基因的转录后沉默的小非编码RNA分子。miRNA可以是完全补充的或者可以与靶标核酸具有非互补区，因此在非互补区导致产生“凸起”。miRNA可以通过以下方式抑制基因表达：如果抑制翻译，如当miRNA不与靶标核酸完全互补时，或者通过导致靶标RNA降解，这被认为只有在miRNA以完全互补结合其靶标时发生。本发明公开还可以包括miRNA的双链前体。miRNA或pri-miRNA可以是18-100个核苷酸长，或者18-80个核苷酸长。成熟miRNA可以具有19-30个核苷酸，或者21-25个核苷酸，具体地21、22、23、24或25个核苷酸的长度。MiRNA前体通常具有约70-100个核苷酸的长度并且具有发夹构象。通过酶Dicer和Drosha从前体miRNA体内产生miRNA，所述酶将长前体miRNA特异性加工成功能性miRNA。可以通过基于细胞的系统体内合成或者通过化学合成体外合成本发明公开中所描述的发夹或成熟微小RNA或者pri-微小RNA试剂。
在多个实施方式中，试剂包含含有疾病相关miRNA的核苷酸序列的寡核苷酸。在某些实施方式中，所述寡核苷酸包含处于前体微小RNA、成熟或发夹形式的疾病相关miRNA的核苷酸序列。在其他实施方式中，设想了包含一种或多种疾病相关miRNA、任何前体miRNA、任何片段的序列或它们的任何组合的寡核苷酸的组合。
可以合成MiRNA以包括赋予所期望的特征的修饰。例如，修饰可以改善稳定性、与靶标核酸的杂交热力学、对特定组织或细胞类型的靶向或者细胞渗透性，例如，通过依赖或不依赖胞吞的机制。
修饰还可以提高序列特异性，并因此减少脱靶。以下更详细地描述了合成和化学修饰方法。如果需要，可以修饰miRNA分子以对于降解稳定miRNA、提高半衰期或另外改善效力。所期望的修饰描述于(例如)美国专利公开号20070213292、20060287260、20060035254、20060008822和2005028824，以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。对于提高的核酸酶抗性和/或对靶标的结合亲和力，本发明公开中所述的单链寡核苷酸试剂可以包括2'-O-甲基、2'-氟、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-氨基丙基、2'-氨基和/或硫代磷酸酯键。锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)，例如，2'-4'-乙烯-桥核酸的包含，和某些核苷酸修饰还可以提高与靶标的结合亲和力。吡喃糖在寡核苷酸主链中的包含还可以降低核酸内切切割。可以通过包含3'阳离子基团，或者通过用3-3'键在3'-末端逆转核苷来进一步修饰寡核苷酸。在另一种替代方案中，可以用氨烷基封闭3'-末端。其他3'缀合物可以抑制3'-5'核酸外切切割。尽管不受理论束缚，3'可能通过空间阻断核酸外切酶结合至寡核苷酸的3'端来抑制核酸外切切割。即使小的烷基链、芳基或杂环缀合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)可以阻断3'-5'-核酸外切酶。
在一个实施方式中，miRNA包括含有寡脱氧核苷酸缺口的2'修饰的寡核苷酸，其中将一些或全部核苷酸间键修饰成硫代磷酸酯以用于耐受核酸酶。膦酸甲酯修饰的存在提高了寡核苷酸对于其靶标RNA的亲和力并因此降低了IC5Q。这种修饰还提高了所修饰的寡核苷酸的核酸酶耐受性。应理解本发明公开的方法和试剂可以结合可以发展以增强抑制性核酸分子的稳定性或效力的任何技术使用。
miRNA分子包括含有修饰的主链或非天然核苷间键的核苷酸寡聚物。具有修饰的主链的寡聚物包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。出于本发明公开的目的，还将在它们的核苷间主链中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸认为是核苷酸寡聚物。具有修饰的寡核苷酸主链的核苷酸寡聚物包括(例如)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基磷酸酯，包括3'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯、硫羰磷酰胺酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。还包括多种盐、混合的盐和游离酸形式。
本文所描述的miRNA可以处于成熟或发夹形式，其可以作为裸寡核苷酸提供。在一些情况下，可以期望使用辅助miRNA或其他核苷酸寡聚物向细胞的递送的制剂(参见，例如，美国专利号5,656,611、5,753,613、5,785,992、6,120,798、6,221,959、6,346,613和6,353,055，以上专利中的每一个作为参考并入本文)。
在一些实例中，miRNA组合物是至少部分晶体、均一晶体和/或无水的(例如，小于80、50、30、20或10％的水)。在另一个实例中，miRNA组合物处于水相，例如，处于包括水的溶液中。可以将所述水相或晶体组合物引入递送媒介物，例如，脂质体(特别是对于水相)或颗粒(例如，如可以适合于晶体组合物的微粒)。通常，以与预期施用方法相容的方式配制所述miRNA组合物。可以与另一种试剂，例如，另一种治疗剂或稳定寡核苷酸试剂的试剂，例如，与寡核苷酸试剂复合的蛋白组合配制miRNA组合物。其他试剂包括螯合剂，例如，EDTA(例如，以除去二价阳离子，如Mg)、盐和RNA酶抑制剂(例如，宽特异性RNA酶抑制剂)。在一个实施方式中，miRNA组合物包括另一种miRNA，例如，第二miRNA组合物(例如，不同于所述第一组合物的微小RNA)。其他制剂仍可以包括至少3、5、10、20、50或100或更多种不同的寡核苷酸物质。
在某些实施方式中，组合物包含模拟miRNA活性的寡核苷酸组合物。在某些实施方式中，组合物包含与miRNA的核碱基序列具有核碱基同一性的寡核苷酸，并因此设计以模拟miRNA的活性。在某些实施方式中，模拟miRNA活性的寡核苷酸组合物包含模拟成熟miRNA发夹或处理的miRNA双螺旋的双链RNA分子。
在一个实施方式中，所述寡核苷酸与内源miRNA或miRNA前体核碱基序列共有同一性。选择在本发明的组合物中包含的寡核苷酸可以是一些长度之一。这种寡核苷酸的长度可以为7至100个连接的核苷。例如，与miRNA共有核碱基同一性的寡核苷酸的长度可以为7至30个连接的核苷。与miRNA前体共有同一性的寡核苷酸的长度可以长达100个连接的核苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含7至30个连接的核苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29或者30个连接的核苷酸。在某些实施方式中，寡核苷酸包含19至23个连接的核苷。在某些实施方式中，寡核苷酸长度为40多至50、60、70、80、90或100个连接的核苷。
在某些实施方式中，寡核苷酸具有与miRNA或其前体具有特定同一性的序列。本文所描述的成熟miRNA和它们相应的茎环序列的核碱基序列是miRBase(miRNA序列和注释的在线可搜索数据库)中存在的序列。miRBase序列数据库中的条目代表了miRNA转录本的预测发夹部分(茎环)，其具有有关成熟miRNA序列的位置和序列的信息。该数据库中的miRNA茎环序列不严格地为前体miRNA(pre-miRNA)，并且在一些情况下可以包括来自假定的一级转录本的前体miRNA和一些侧接序列。本文所描述的miRNA核碱基序列涵盖了miRNA的任何形式，包括miRBase序列数据库发布版10.0中所述的序列以及miRBase序列数据库的任何早期发布版中所述的序列。序列数据库发布版可以导致某些miRNA重命名。序列数据库发布版可以导致成熟miRNA序列变化。本发明的组合物涵盖了包含与本文所描述的miRNA的任何核碱基序列形式具有特定同一性的寡核苷酸的寡聚化合物。
在某些实施方式中，寡核苷酸具有在7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的区域内与miRNA具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的核碱基序列。因此，在某些实施方式中，寡核苷酸的核碱基序列可以相对于miRNA具有一个或多个不相同的核碱基。
在某些实施方式中，组合物包含编码miRNA、前体、模拟物或其片段的核酸分子。例如，组合物可以包含病毒载体、质粒、粘粒或者适合于在所期望的哺乳动物细胞或组织中表达miRNA、前体、模拟物或其片段的其他表达载体。
体外转录的RNA
在一个实施方式中，本发明的试剂包含体外转录的(IVT)RNA。在一个实施方式中，本发明的试剂包含编码治疗性蛋白的体外转录的(IVT)RNA。在一个实施方式中，本发明的试剂包含编码多种治疗性蛋白的IVT RNA。
在一个实施方式中，可以将IVT RNA作为瞬时转染形式引入细胞。使用合成产生的质粒DNA模板，通过体外转录产生RNA。可以使用适当引物和RNA聚合酶，通过PCR将来自任何来源的所关心的DNA直接转化为用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是(例如)基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或者任何其他适合的DNA来源。在一个实施方式中，体外转录所期望的模板是治疗性蛋白，如在本文其他地方所描述的。
在一个实施方式中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。所述DNA可以来自来源于生物基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方式中，DNA是所关心的全长基因或基因的一部分。基因可以包括5'和/或3'未翻译区(UTR)的一些或全部。基因可以包括外显子和内含子。在一个实施方式中，用于PCR的DNA是人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是来自致病或共生生物，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌的基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA来自致病或共生生物，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌，所述DNA包括5'和3'UTR。作为另外一种选择，所述DNA可以是在天然存在的生物中不正常表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因的一部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单一生物或来自不止一种生物。
可以用作用于PCR的DNA来源的基因包括编码诱导或增强生物中适应性免疫反应的多肽的基因。优选的基因是对于短期处理有用的基因，或者其中对剂量或要表达的基因存在安全性顾虑的基因。
在多个实施方式中，将质粒用于产生mRNA体外转录的模板，其将用于转染。
还可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。所述RNA优选地具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在0至3000个核苷酸之间。可以通过不同方法改变要添加至编码区的5'和3'UTR序列长度，方法包括(但不限于)设计用于与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用该方法，本领域的技术人员可以在转录的RNA转染后，改变实现最优翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是所关心的基因的天然存在的、内源的5'和3'UTR。作为另外一种选择，可以通过将UTR序列引入正向和反向引物或通过对模板的任何其他修饰，添加对所关心的基因非内源的UTR序列。对所关心的基因非内源的UTR序列的使用对于改变RNA的稳定性和/或翻译效率可以是有用的。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件可以降低RNA的稳定性。因此，基于在本领域中熟知的UTR的性质，可以选择或设计3'UTR以提高转录的RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可以含有内源基因的Kozak序列。作为另外一种选择，当如以上所描述的，通过PCR添加对所关心的基因非内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录本的翻译效率，但是似乎不是所有RNA能够有效翻译所需的。多种RNA对Kozak序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施方式中，5'UTR可以来源于其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其他实施方式中，多种核苷酸类似物可以用于3'或5'UTR中以阻碍RNA的核酸外切酶降解。
为了使得能够从DNA模板合成RNA而无需基因克隆，应将转录启动子连接至要转录的序列上游的DNA模板。当将起到RNA聚合酶启动子作用的序列加入至正向引物5'末端时，RNA聚合酶启动子被引入要转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方式中，启动子是T7 RNA聚合酶启动子，如在本文其他地方所描述的。其他有用的启动子包括(但不限于)T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列在本领域中是已知的。
在优选的实施方式中，RNA在5'端和3'多聚(A)尾具有帽，其决定了核糖体结合、翻译起始以及RNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板上，例如，质粒DNA，RNA聚合酶产生了长多联体产物，其不适合于在真核细胞中表达。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录导致产生了正常尺寸的RNA，当在转录后多聚腺苷酸化时，它在真核转染中有效。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录本的3'端延伸至模板最后一个碱基之外(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nachevaand Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。
多聚A/T段向DNA模板整合的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的多聚A/T序列可以引起质粒不稳定性，这可以通过对于质粒增殖的重组非感受态细菌细胞的使用进行改善。
可以在体外转录后，通过使用多聚(A)聚合酶，如大肠杆菌(E.coli)多聚A聚合酶(E-PAP)或酵母多聚A聚合酶进一步延伸RNA的多聚(A)尾。在一个实施方式中，将多聚(A)尾的长度从100个核苷酸提高至300至400个核苷酸之间导致RNA翻译效率提高约2倍。另外，不同化学基团与3'端的连接可以提高RNA稳定性。这种连接可以含有修饰/人工核苷酸、适体及其他化合物。例如，可以使用多聚(A)聚合酶将ATP类似物引入多聚(A)尾。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。
5'帽还对RNA分子提供了稳定性。在优选的实施方式中，通过方法产生RNA以包括5'帽1结构。可以使用牛痘封端酶和2'-O-甲基转移酶(CellScript,Madison,WI)产生这种帽1结构。作为另外一种选择，使用本领域中已知的和本文所描述的技术提供5'帽(Cougot等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
成像剂
在一个实施方式中，递送媒介物包含成像剂。成像剂是允许递送媒介物在对细胞或组织暴露后显像的材料。显像包括对于肉眼的成像，以及需要用仪器检测或者检测通常对眼睛不可见的信息的成像，并且包括需要检测光子、声音或其他能量子的成像。实例包括：染色剂、活体染料、荧光标志物、放射性标记物、酶或者编码标志物或酶的质粒构建体。可以在递送媒介物中使用的用于成像和靶向的多种材料和方法提供于Handbook ofTargeted delivery of Imaging Agents,Torchilin主编,(1995)CRC Press,Boca Raton,Fla。
基于分子成像的显像通常包括在组织、细胞或分子水平检测生物过程或生物分子。分子成像可以用于评价用于基因疗法、基于细胞的疗法的具体靶标，并且作为诊断或研究工具用于使病理学状况显像。能够胞内递送的成像剂是特别有用的，因为这些试剂可以用于评价胞内活性或状况。成像剂必须有效地达到它们的靶标；因此，在一些实施方式中，细胞的有效吸收是所期望的。快速吸收还可以是所期望的以避免RES，参见以下中的综述：Allport and Weissleder,Experimental Hematology1237-1246(2001)。
此外，成像剂优选地应提供高信噪比，从而可以以少量检测它们，无论是直接还是通过提高与特定靶标有关的信号的有效放大技术。放大策略综述于：Allport andWeissleder,Experimental Hematology 1237-1246(2001)并且包括(例如)抗生物素蛋白-生物素结合系统、转化配体捕捉、靶标结合后改变物理行为的探针和利用驰豫速度。成像技术的实例包括磁共振成象、放射性核素成像、计算机断层成像、超声波和光学成象。
如本文所描述的递送媒介物可以有利地用于多种成像技术或策略，例如，通过将成像剂引入递送媒介物。多种成像技术和策略是已知的，例如，参见，以下中的综述：Allport and Weissleder,Experimental Hematology 1237-1246(2001)；这些策略可以适合于与递送媒介物一起使用。适合的成像剂包括(例如)荧光分子、标记的抗体、标记的抗生物素蛋白：生物素结合剂、胶态金属(例如，金、银)、报告酶(例如，辣根过氧化物酶)、超顺磁转铁蛋白、第二报告分子系统(例如，酪氨酸酶)和顺磁螯合物。
在一些实施方式中，成像剂是磁共振成象造影剂。磁共振成象造影剂的实例包括(但不限于)1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”N”'-四乙酸(DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙基磷(DOTEP)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”-三乙酸(DOTA)及其衍生物(参见美国专利号5,188,816、5,219,553和5,358,704)。在一些实施方式中，成像剂是X射线造影剂。本领域中已知的X射线造影剂包括5-氨基-间苯二甲酸的一些卤化衍生物，特别是碘化衍生物。
小分子试剂
在多个实施方式中，试剂是小分子。当试剂是小分子时，可以使用技术人员已知的标准方法获得小分子。这些方法包括化学有机合成或生物方法。生物方法包括使用本领域中熟知的方法，从生物来源纯化、重组合成和体外翻译系统。在一个实施方式中，小分子试剂包含有机分子、无机分子、生物分子、合成分子等。
在治疗多种疾病和病况中潜在有用的分子多样性化合物的组合文库以及制备所述文库的方法在本领域中是熟知的。方法可以使用多种技术人员熟知的技术，其包括固相合成、溶液法、单个化合物的平行合成、化学混合物的合成、刚性核心结构、柔性线性序列、反卷积策略(deconvolution strategies)、标签技术和产生用于先导化合物发现的无偏分子图谱vs.用于先导化合物开发的偏差结构。在本发明的一些实施方式中，使用组合技术合成和/或标识试剂。
在小型文库合成的一般方法中，将激活的核心分子与一些构建块缩合，从而导致产生了共价连接的核心-构建块集合体的组合文库。所述核芯的形状和刚性决定了所述构建块在形状空间中的取向。可以通过改变核芯、键或构建块使文库偏倚以靶向特征化生物结构(“针对性文库(focused libraries)”)或者可以使用柔性核芯以较低的结构偏倚合成文库。在本发明的一些实施方式中，经由小文库合成来合成试剂。
即使未显示盐，本文所描述的小分子和小分子化合物可以作为盐存在，并且应理解本发明涵盖了本文所示的试剂的所有盐和溶剂化物以及试剂的非盐和非溶剂化物形式，如技术人员所熟知的。在一些实施方式中，本发明的试剂的盐是药物可用的盐。
当对于任何本文所描述的试剂可以存在互变异构形式时，每种互变异构形式旨在包含在本发明中，尽管可能仅明确显示了一种或一些互变异构形式。例如，当显示2-羟基吡啶基部分时，还预期显示了相应的2-吡啶酮互变异构体。
本发明还包括任何或全部立体化学形式，包括试剂的任何对映体或非对映体形式。在本文中对结构或名称的列举旨在涵盖所示试剂的全部可能的立体异构体。本发明还涵盖了试剂的所有形式，如试剂的晶体或非晶体形式。还预期了包含本发明的试剂的组合物，如包含其特定立体化学形式的基本纯的试剂的组合物，或者以任何比例包含本发明的试剂，包括两种或更多种立体化学形式的混合物，如外消旋或非外消旋混合物的组合物。
本发明还包括本文所描述的任何试剂的任何或所有活性类似物或衍生物，如前体药物。在一个实施方式中，试剂是前体药物。在一个实施方式中，本文所描述的小分子是用于衍生化的候选分子。照此，在某些情况下，本文包括了具有调节的效力、选择性和溶解度的本文所描述的小分子的类似物并且提供了用于药物发现和药物开发的有用的先导化合物。因此，在某些情况下，在优化期间，考虑药物递送、代谢、新颖性和安全性等问题，设计了新型类似物。
在一些情况下，如组合和药物化学领域中所熟知的，本文所描述的小分子试剂是已知试剂的衍生物或类似物。可以通过在不同位置上添加和/或取代官能团来制备类似物或衍生物。照此，可以使用熟知的化学合成程序将本文所描述的小分子转化为衍生物/类似物。例如，可以选择性修饰所有氢原子或取代基以产生新的类似物。另外，可以将连接原子或基团修饰成具有碳主链或杂原子的更长或更短的接头。另外，可以改变所述环基团以在所述环中具有不同个数的原子和/或以包含杂原子。此外，芳香族可以转化为环，并且反之亦然。例如，所述环可以为5-7个原子，并且可以是碳环的或杂环的。
如本文所使用的，术语“类似物”或“衍生物”意在表示通过一种或多种化学反应从母体化合物或分子所制备的化合物或分子。照此，类似物可以是具有与本文所描述的小分子试剂类似的结构的结构或者可以基于本文所描述的小分子试剂的骨架，但是相对于某些组件或结构组成而与之不同，其在代谢上可以具有类似或相反的作用。根据本发明的任何小分子抑制剂的类似物或衍生物可以用于治疗疾病或病症。
在一个实施方式中，可以通过将氢基彼此独立地修饰为其他取代基来使本文所描述的小分子试剂独立地衍生化，或由此制备类似物。也就是说，可以相对于相同分子上的其他原子来独立地修饰每个分子上的每个原子。可以使用用于产生衍生物/类似物的任何常规修饰。例如，所述原子和取代基可以独立地由氢、烷基、脂族、直链脂族、具有链杂原子的脂族、支链脂族、取代的脂族、环脂族、具有一个或多个杂原子的杂环脂族、芳族、杂芳族、多芳族、聚氨基酸、肽、多肽、其组合、卤素、卤代-取代的脂族等组成。另外，可以使化合物上的任何环基团衍生化以提高和/或降低环尺寸以及将主链原子改变为碳原子或杂原子。
多肽试剂
在其他相关方面，试剂包括调节靶标的分离的肽。例如，在一个实施方式中，本发明的肽直接通过结合至靶标抑制或激活靶标，借此调节所述靶标的正常功能活性。在一个实施方式中，本发明的肽通过与内源蛋白竞争调节靶标。在一个实施方式中，本发明的肽通过作为反式显性失活突变体起作用来调节靶标的活性。
所述多肽试剂的变体可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地，保守氨基酸残基)替换的变体，并且该替换的氨基酸残基可以或可以不是通过遗传密码编码的氨基酸残基，(ii)其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基，例如，通过取代基团的连接所修饰的残基的变体，(iii)其中所述多肽是本发明的多肽的可变剪接变体的变体，(iv)所述多肽的片段和/或(v)其中所述多肽与另一个多肽，如前导或分泌序列或者用于纯化(例如，His-标签)或者用于检测(例如，Sv5表位标签)的序列融合的变体。所述片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)所产生的多肽。变体可以翻译后修饰或者化学修饰。根据本文的教导内容，这些变体被认为在本领域技术人员的范围内。
抗体试剂
本发明还考虑了递送媒介物，其包含对靶标特异的抗体或抗体片段。也就是说，所述抗体可以抑制靶标以提供有益作用。
所述抗体可以是完整单克隆或多克隆抗体，和免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、人源化抗体、基因工程单链FV分子(Ladner等人，美国专利号4,946,778)或嵌合抗体，例如，含有鼠科抗体的结合特异性，但是其中剩余部分是人源的抗体。可以使用本领域技术人员已知的方法制备抗体，包括单克隆和多克隆抗体、片段和嵌合体。
可以使用完整多肽或含有所关心的免疫性抗原的片段制备抗体。用于使动物免疫的多肽或寡肽可以得自RNA的翻译或化学合成，并且如果需要，可以缀合至载体蛋白。可以化学偶联至肽的适合的载体包括牛血清白蛋白和甲状球蛋白、钥孔血蓝素。然后，偶联的多肽可以用于使动物(例如，小鼠、大鼠或兔)免疫。
CAR试剂
在一个实施方式中，试剂包含编码嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸序列。在一个实施方式中，试剂包含编码CAR的mRNA分子。在一个实施方式中，试剂包含编码CAR的修饰的核苷mRNA分子。
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程化以在免疫效应细胞上表达且特异性结合抗原的人工T细胞受体。CAR可以用作使用继承性细胞转移的疗法。从患者除去T细胞并修饰，从而它们表达对抗原的特定形式特异的受体。在一些实施方式中，CAR对所选的靶标，例如，成纤维细胞表面受体具有特异性。CAR还可以包含胞内激活域、跨膜结构域和包含特异性结合至所选靶标，例如，细胞表面受体的抗原结合区的胞外结构域。
在一个实施方式中，本发明涉及包含试剂的递送媒介物，其中试剂包含编码嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸序列(例如，mRNA)。在一个实施方式中，试剂包含编码嵌合抗原受体(CAR)的mRNA分子(例如，修饰的核苷mRNA分子)。在一个实施方式中，试剂包含编码CAR的mRNA分子。在一个实施方式中，试剂包含编码CAR的核苷修饰的mRNA分子。
在多个实施方式中，本文所考虑的CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内域。所述胞外结构域包含靶标特异性结合元件，其另外被称为抗原结合结构域。在一些实施方式中，所述胞外结构域还包含铰链域。在某些实施方式中，所述胞内域或另外所述胞质结构域包含共刺激信号区和ξ链部分。所述共刺激信号区是指包含共刺激分子的胞内域的CAR部分。共刺激分子是除淋巴细胞对抗原有效应答所需的抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间或者在CAR的胞质结构域和跨膜结构域之间，存在引入的间隔臂结构域。如本文所使用的，术语“间隔臂结构域”通常表示起作用以将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域或胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔臂结构域可以包含多至5个氨基酸、或10个氨基酸、或20个氨基酸、或30个氨基酸、或40个氨基酸、或50个氨基酸、或60个氨基酸、或70个氨基酸、或80个氨基酸、或90个氨基酸、或100个氨基酸、或110个氨基酸、或120个氨基酸、或130个氨基酸、或140个氨基酸、或150个氨基酸、或160个氨基酸、或170个氨基酸、或180个氨基酸、或190个氨基酸、或200个氨基酸、或210个氨基酸、或220个氨基酸、或230个氨基酸、或240个氨基酸、或250个氨基酸、或260个氨基酸、或270个氨基酸、或280个氨基酸、或290个氨基酸、或300个氨基酸。
所述胞外结构域、跨膜结构域和胞内域可以来源于这些结构域的任何所期望的来源。
CAR抗原结合结构域
所述抗原结合结构域可以得自任何广泛多种与配体结合和/或信号转导有关的胞外结构域或分泌的蛋白。在一个实施方式中，抗原结合结构域可以由反过来可以借助于CHI和铰链区的存在共价结合Ig轻链的Ig重链组成，或者可以借助于铰链、CH2和CH3结构域的存在与其他Ig重链/轻链复合物变得共价结合。在后一种情况下，变得连接至嵌合构建体的重链/轻链复合物可以构成其特异性不同于所述嵌合构建体的抗体特异性的抗体。根据抗体功能、所期望的结构和信号转导，可以使用整条链或者可以使用截短的链，其中可以除去CHI、CH2或CH3结构域的全部或一部分或者可以除去铰链区的全部或一部分。
在多个实施方式中，所述CAR抗原结合结构域可以是人源化的或者包含完全人序列。
CAR跨膜结构域
相对于跨膜结构域，可以将本发明公开的CAR设计成包含融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用了与所述CAR中的结构域之一天然结合的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择并通过氨基酸替换修饰跨膜结构域以避免这些结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合以最大程度降低与所述受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。当来源是天然来源时，结构域可以来源于任何膜结合或跨膜蛋白。在本发明中具有具体用途的跨膜区可以来源于T细胞受体的α、β或ξ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD 154(即包含至少它们的跨膜区)。作为另外一种选择，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个实施方式中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可以存在于合成跨膜结构域的每个末端。可选地，例如，但不限于，长度在2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域和胞质信号转导结构域之间形成连接。在另一个实施方式中，接头包含甘氨酸-丝氨酸双联体。
CAR胞内结构域
在多个实施方式中，CAR的胞质结构域或另外胞内结构域可以负责其中表达CAR的免疫细胞的正常效应因子功能中的至少一种的激活。术语“效应因子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应因子功能可以是溶胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。术语“胞内信号转导域”是指转导效应因子功能信号并且指导细胞实施特化功能的蛋白部分。尽管通常可以使用整个胞内结构域，但是在多数情况下，不必需使用整条链。在使用胞内结构域的截短部分的程度上，可以使用该截短部分来代替完整链，只要它转导效应因子功能信号。因此，术语胞内结构域表示包括足以转导效应因子功能信号的胞内结构域的任何截短部分。
用于在本发明公开的CAR中使用的胞内结构域的优选实例包括在抗原受体接合后一致作用以起始信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
已知单独提供TCR产生的信号不足以完全激活T细胞并且还需要第二或共刺激信号。因此，据称可以通过两种类型的胞内信号序列介导T细胞激活：通过TCR引起抗原依赖性初始激活的那些(初始胞质信号序列)，和以独立于抗原的方式起作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号序列)。
初始胞内信号序列以刺激性方式或者以抑制性方式调节TCR复合物的初始激活。以刺激性方式起作用的初始胞内信号序列可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号转导基序。
含有在本发明中特别有用的初始胞内信号序列的ITAM的实例包括来源于TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞内信号分子包含来源于CD3ξ的胞内信号序列。
在另一个实施方式中，可以设计CAR的胞内结构域以包含CD3-ξ信号转导结构域本身或者与在本发明的CAR的背景中有用的任何其他所期望的胞质结构域组合。例如，CAR的胞内结构域可以包含CD3ξ链部分和共刺激信号区。所述共刺激信号区是指包含共刺激分子的胞内域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子，它是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。这些分子的实例包括CD2、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。
本发明的CAR的胞内结构域内的胞内信号序列可以以随机或所指明的顺序彼此连接。可选地，短寡或多肽接头，例如，2至10个氨基酸长的接头可以形成键。在一些实施方式中，甘氨酸-丝氨酸二联体提供了适合的接头。
在一个实施方式中，设计所述胞内结构域以包含CD3-ξ的信号转导结构域和CD28的信号转导结构域。在另一个实施方式中，设计所述胞内结构域以包含CD3-ξ的信号转导结构域和4-IBB的信号转导结构域。
在多个实施方式中，所述CAR可以是“第一代”、“第二代”、“第三代”、“第四代”或“第五代”CAR(参见，例如，Sadelain等人,Cancer Discov.3(4):388-398(2013)；Jensen等人,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe等人,Dis.Model Mech.8(4):337-350(2015)；Brentjens等人,Clin.Cancer Res.13:5426-5435(2007)；Gade等人,CancerRes.65:9080-9088(2005)；Maher等人,Nat.Biotechnol.20:70-75(2002)；Kershaw等人,J.Immunol.173:2143-2150(2004)；Sadelain等人,Curr.Opin.Immunol.(2009)；Hollyman等人,J.Immunother.32:169-180(2009))，每篇文献以其全部作为参考并入)。
用于在本发明中使用的“第一代”CAR包含融合至跨膜结构域的抗原结合结构域，例如，单链可变片段(scFv)，其融合至T细胞受体链的细胞质/胞内结构域。“第一代”CAR通常具有来自CD3ζ链的胞内结构域，它是来自内源T细胞受体(TCR)的初始信号发射器。“第一代”CAR可以提供从头抗原识别并独立于HLA介导的抗原递呈，通过单一融合分子中的它们的CD3ζ链信号转导结构域引起CD4+和CD8+ T细胞的激活。
用于在本发明中使用的“第二代”CAR包含抗原结合结构域，例如，单链可变片段(scFv)，其融合至能够激活T细胞的胞内信号转导域和设计以放大T细胞效力和持久性的共刺激结构域(Sadelain等人,Cancer Discov.3:388-398(2013))。因此，CAR设计可以将抗原识别与信号转导组合，这两种功能是两种不同复合物(TCR异源二聚体和CD3复合物)生理学所具有的。“第二代”CAR在CAR的胞质尾中包括来自多种共刺激分子，例如，CD28、4-1BB、ICOS、OX40等的胞内结构域，从而为所述细胞提供额外的信号。
“第二代”CAR(例如)通过CD28或4-1BB结构域提供了共刺激，并且(例如)通过CD3ζ信号转导结构域提供了激活。临床前研究已表明“第二代”CAR可以改善T细胞的抗肿瘤活性。例如，在靶向慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和急性淋巴母细胞性白血病(ALL)患者中的CD19分子的临床试验中，证实了“第二代”CAR修饰的T细胞的稳健效力(Davila等人,Oncoimmunol.1(9):1577-1583(2012))。
“第三代”CAR(例如)通过包含CD28或4-1BB结构域两者提供了多个共刺激，并且(例如)通过包含CD3ζ激活域提供了激活。
“第四代”CAR，除组成型或诱导型趋化因子组分之外，(例如)通过CD28或4-1BB结构域提供了共刺激，并且(例如)通过CD3ζ信号转导结构域提供了激活。
“第五代”CAR(例如)通过CD28或4-1BB结构域提供了共刺激，并且(例如)通过CD3ζ信号转导结构域、组成型或诱导型趋化因子组分和细胞因子受体的胞内结构域，例如，IL-2Rβ提供了激活。
在多个实施方式中，CAR可以包括于多价CAR系统中，例如，DualCAR或“TandemCAR”系统。多价CAR系统包括包含多个CAR的系统或细胞和包含靶向不止一种抗原的二价/双重特异性CAR的系统或细胞。
在本文所公开的实施方式中，CAR通常包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，如以上所描述的。在具体的非限制性实施方式中，所述抗原结合结构域是scFv。
在一个实施方式中，所述抗原结合结构域是靶向结构域，其中靶向结构域将表达CAR的T细胞导向至所关心的特定细胞或组织。例如，在一个实施方式中，靶向结构域包含抗体、抗体片段或者特异性结合至抗原(例如，salef-抗原或外源抗原)的肽，借此将表达CAR的T细胞重定向至表达所述抗原的细胞或组织。
可以产生对任何所期望的所关心的抗原具有反应性的本发明的CAR分子的抗原结合结构域，所述抗原包括(但不限于)肿瘤抗原、外源抗原(例如，细菌抗原或病毒抗原)或自体抗原。
肿瘤抗原是通过引起免疫应答的肿瘤细胞所产生的蛋白。本发明的含有VM-结构域的融合分子的抗原结合结构域的选择将取决于要治疗的具体癌症类型。肿瘤抗原在本领域中是熟知的并且包括，例如，神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素-反应性AFP、甲状球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、小肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺特异性蛋白、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌瘤肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性白细胞弹性酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。另一种示例性肿瘤抗原是硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)(也称为黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)或者神经元-神经胶质抗原2(NG2))。
在一个实施方式中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤有关的一种或多种抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达可以用作用于免疫攻击的靶标抗原的一些蛋白。这些分子包括(但不限于)黑素瘤中的组织特异性抗原，如MART-1、酪氨酸酶和GP 100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶标分子属于转化相关分子组，如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶标抗原是肿瘤-胚胎抗原(onco-fetal antigens)，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤独特的真正地肿瘤特异性的免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原，如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶标抗原的其他候选。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)已用作单克隆抗体被动免疫疗法的靶标，但成效有限。
本发明中所提及的肿瘤抗原类型也可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或者肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对肿瘤细胞是独特的并且不发生在体内其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的，并且相反在无法诱导对抗原免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是当免疫系统不成熟并且不能应答时在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者其可以是在正常细胞上通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA的非限制性实例包括下列：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2以及肿瘤特异性多谱系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原，如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位造成的独特的肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大型基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎儿球蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
外源抗原可以是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或其片段，或其变体。在本文其他处讨论了可以使用本发明的组合物和方法靶向的示例性病毒、细菌、真菌和寄生虫。
双重特异性T细胞衔接体(例如，BiTE)试剂
在另一个实施方式中，本发明公开的核酸载物分子(例如，mRNA、表达载体、CRISPR、基因组编辑系统或者核苷修饰的mRNA分子)可以编码特异性结合至免疫细胞(例如，细胞毒性T细胞)上的抗原和所关心的细胞，例如，癌细胞上的抗原两者的双重特异性T细胞衔接体。
双重特异性T细胞衔接体是通过将两种抗体的靶向区(即抗原结合域)连接成单一分子所产生的双重特异性分子。将所述分子的一个臂工程化以结合细胞毒性T细胞表面上存在的蛋白，并且将另一个臂设计以结合主要在靶细胞(例如，激活的成纤维细胞)上存在的特异性蛋白质。当两个靶标结合时，双重特异性T细胞衔接体(即BiTE分子)在细胞毒性T细胞和靶细胞之间形成桥，其使得T细胞能够识别靶细胞并对靶细胞实现细胞毒性T细胞应答，借此导致其破坏。可以改变相互作用并结合至靶细胞的分子的结合臂以产生基于所存在的细胞特异性标志物靶向不同类型细胞的不同的抗原结合域。还可以参考DiegoEllerman,“Bispecific T-cell engagers:Towards understanding variableinfluencing the in vitro potency and tumor selectivity and their modulationto enhance their efficacy and safety,”Methods,第154卷,Feb.2019,第102-117页，该文献作为参考并入本文。
术语“双重特异性”是指双重特异性分子(例如，双重特异性T细胞衔接体)能够特异性结合至至少两种不同的抗原决定簇(例如，一种来自T细胞并且另一种来自靶细胞，如激活的成纤维细胞)。通常，双重特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，它们中的每一个对于不同的抗原决定簇特异。在某些实施方式中，双重特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原决定簇。
本发明公开不局限于BiTE形式，但是考虑使用适合于T细胞重定向的任何适合的双重特异性形式，包括双链抗体(Holliger等人,Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，如串联双链抗体(Kipriyanov等人,J Mol Biol 293,41-66(1999))、DART(双重亲和力重靶向)分子，其基于双链抗体形式，但是具有用于另外稳定的C末端二硫桥键(Moore等人,Blood 117,4542-51(2011))和三功能抗体(triomab)，它是完整杂交小鼠/大鼠IgG分子，并且目前正在临床试验中进行评价，代表了较大尺寸的形式(在Seimetz等人,Cancer TreatRev 36,458-467(2010)中综述)。以上参考文献中的每一篇作为参考并入本文。
用于制备双重特异性抗体的方法在本领域是已知的(参见，例如，Millstein等人,Nature,305:537-539(1983)；Traunecker等人,EMBOJ.,10:3655-3659(1991)；Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986)；Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)；Hollinger等人,PNAS USA,90:6444-6448(1993)；Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,81；95,731,168；4,676,980；和4,676,980、WO 94/04690；WO 91/00360；WO 92/200373；WO 93/17715；WO92/08802；和EP 03089)。这些与制备双重特异性抗体，包括BiTE有关的上述参考文献中的每一篇作为参考并入本文。
在实践本文所描述的方法中有用的示例性双重特异性抗体分子包含(i)两种抗体，第一抗体对靶细胞(例如，激活的成纤维细胞)表面上表达的抗原具有结合特异性并且第二抗体对于在免疫细胞(例如，细胞毒性T细胞)表面上表达的抗原具有结合特异性，(ii)单一抗体，其具有对靶细胞(例如激活的成纤维细胞)表面上表达的抗原具有结合特异性的一条链或臂，和对免疫细胞(例如，细胞毒性T细胞)具有结合特异性的第二链或臂，(iii)单链抗体，其具有对靶细胞(例如，成纤维细胞)表面上表达的抗原具有结合特异性并且还对免疫细胞(例如，细胞毒性T细胞)具有结合特异性，例如，经由通过额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iv)双可变区-域抗体(DVD-Ig)，其中每条轻链和重链含有通过短肽键串联的两个可变域；(v)化学-连接的双重特异性(Fab')2片段；(vi)Tandab，它是两个单链双链抗体的融合蛋白，其导致产生了对靶标抗原中的每一个具有两个结合位点的四价双重特异性抗体；(vii)柔性抗体(具有双链抗体的scFv的组合，其导致产生了多价分子)；(viii)所谓的“对接锁定”分子(蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”的改进，其可以应用于Fab以产生含有连接至不同Fab片段的两个相同的Fab片段的三价双重特异性结合蛋白；(ix)所谓的“蝎形“分子，其含有(例如)融合至人Fc-区的两个末端的两个scFv；(x)双链抗体；和(xi)所谓的“ImmTAC”分子(对癌症的免疫动员mTCR；参见，例如，Liddy等人,Nat.Med.18:980-987(2012))。
递送媒介物
在一些实施方式中，本发明涉及包含用于递送一种或多种试剂的递送媒介物的组合物。在一些实施方式中，试剂包含本发明的核苷修饰的mRNA。
在一些实施方式中，递送媒介物是胶体分散体系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和脂质基系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介的示例性胶体体系是脂质体(例如，人工膜囊)。
脂质制剂的使用旨在用于将至少一种试剂(体外、离体或体内)引入宿主细胞。在另一个方面，至少一种试剂可以与脂质结合。可以将与脂质结合的至少一种试剂被包封在脂质体的水性内部、分散在脂质体的脂质双分子层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子连接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为混悬液包含在脂质中、包含或与胶束复合或另外与脂质结合。脂质、脂质/核酸或脂质/表达载体相关组合物不局限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双分子层结构、作为胶束或通过“塌缩”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能地形成尺寸或形状不均一的聚集体。脂质是可以天然存在的脂肪物质或者合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃和它们的衍生物的化合物种类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
脂质及其衍生物
在多个实施方式中，递送媒介物可以包含脂质或其衍生物。
脂质是可以天然存在的脂肪物质或者合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃和它们的衍生物的化合物种类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇、醛和聚合物(例如，PEG化的脂质)。
适合使用的脂质可以得自商品化来源。例如，二豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以得自Sigma,St.Louis,MO；联十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以得自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Chol”)可以得自Calbiochem-Behring；二豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)及其他脂质可以得自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储液可以储存在约-20℃。由于比甲醇更易于蒸发，因此将氯仿用作唯一的溶剂。
在一个实施方式中，LNP包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和PEG化脂质。
在一个实施方式中，LNP包含阳离子脂质。如本文所使用的，术语“阳离子脂质”是指当pH降低至脂质的可电离基团的pK以下时为阳离子或变为阳离子(质子化)，但在更高的pH值下逐渐更中性的脂质。在低于pK的pH值，脂质则能够与带负电荷的核酸结合。在某些实施方式中，所述阳离子脂质包括pH降低时带正电荷的两性离子脂质。
在一些实施方式中，阳离子脂质是优选的。在某些实施方式中，阳离子脂质包含在选择性pH，如生理学pH携带净正电荷的任何一些脂质物质。这类脂质包括(但不限于)N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化氨(DOTMA)；N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化氨(DOTAP)；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟醋酸铵(DOSPA)、双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰基氧基丙胺(DODMA)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧代丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。另外，可以在本发明中使用的一些阳离子脂质的商品化制剂是可获得的。这些包括(例如)(可商购的阳离子脂质体，其包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，来自GIBCO/BRL，Grand Island,N.Y.)；(可商购的阳离子脂质体，其包含N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟醋酸铵(DOSPA)和(DOPE)，来自GIBCO/BRL)；和/>(可商购的阳离子脂质，其包含处于乙醇中的双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)。以下脂质是阳离子的并且在低于生理学pH下具有正电荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油醇基氧代-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻烯基氧代-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。
在一个实施方式中，所述阳离子脂质是氨基脂质。在本发明中有用的适合的氨基脂质包括WO 2012/016184中所述的那些，该专利以其全部内容作为参考并入本文。代表性的氨基脂质包括(但不限于)1,2-二亚麻醇氧代-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚麻醇氧代-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚麻酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚麻醇硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚麻醇氧代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油醇基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚麻酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油醇基氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚麻醇氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油醇基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚麻醇氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油醇基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。
适合的氨基脂质包括具有化学式的那些：
其中R1和R2是相同或不同的并且独立地为可选地取代的C10-C24烷基、可选地取代的C10-C24烯基、可选地取代的C10-C24炔基或者可选地取代的C10-C24酰基；
R3和R4是相同或不同的并且独立地为可选地取代的C1-C6烷基、可选地取代的C2-C6烯基或可选地取代的C2-C6炔基，或者R3和R4可以连接以形成具有4至6个碳原子和选自氮和氧的1或2个杂原子的可选地取代的杂环；
R5是不存在或存在的，并且当存在时，是氢或C1-C6烷基；
m、n和p是相同或不同的，并且独立地为0或1，但条件是m、n和p不同时为0；
q是0、1、2、3或4；和
Y和Z是相同或不同的并且独立地为O、S或NH。
在一个实施方式中，R1和R2分别为亚油烯基，并且氨基脂质是二亚油醇基氨基脂质。在一个实施方式中，氨基脂质是二亚油醇基氨基脂质。
代表性的有用的二亚油醇基氨基脂质具有以下化学式：
其中n是0、1、2、3或4。
在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-K-DMA。在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA(以上的DLin-K-DMA，其中n是2)。
在一个实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有化学式(I)所示的结构：
(I)
或其药物可用的盐、互变异构体、前体药物或立体异构体，其中：
L1和L2分别独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或碳-碳双键；
R1a和R1b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或者(b)R1a为H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起和相邻的R1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起和相邻的R2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起和相邻的R3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R4a为H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起和相邻的R4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R5和R6分别独立地为甲基或环烷基；
R7在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；
R8和R9分别独立地为C1-C12烷基；或者R8和R9，与它们所连接的氮原子一起，形成包含一个氮原子的5、6或7-元杂环；
a和d分别独立地为0至24的整数；
b和c分别独立地为1至24的整数；和
e是1或2。
在化学式(I)的某些实施方式中，R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一个是C1-C12烷基或者L1或L2中的至少一个是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。在其他实施方式中，当a为6时，R1a和R1b不是异丙基，或者当a为8时，为正丁基。
在化学式(I)的其他实施方式中，R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一个是C1-C12烷基或者L1或L2中的至少一个是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；且
当a为6时，R1a和R1b不是异丙基，或者当a为8时，为正丁基。
在化学式(I)的其他实施方式中，R8和R9分别独立地为未取代的C1-C12烷基；或者R8和R9，与它们所连接的氮原子一起，形成包含一个氮原子的5、6或7-元杂环；
在化学式(I)的某些实施方式中，L1或L2中的任一个可以是-O(C＝O)-或碳-碳双键。L1和L2分别可以是-O(C＝O)-或者分别可以是碳-碳双键。
在化学式(I)的一些实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。在其他实施方式中，L1和L2两者为-O(C＝O)-。
在化学式(I)的一些实施方式中，L1或L2之一是-(C＝O)O-。在其他实施方式中，L1和L2两者为-(C＝O)O-。
在化学式(I)的一些其他实施方式中，L1或L2之一是碳-碳双键。在其他实施方式中，L1和L2两者为碳-碳双键。
在化学式(I)的其他实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-并且L1或L2中的另一个是-(C＝O)O-。在更多实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-并且L1或L2中的另一个是碳-碳双键。在更多实施方式中，L1或L2之一是-(C＝O)O-并且L1或L2中的另一个是碳-碳双键。
应理解如在整个说明书中所使用的，“碳-碳”双键是指以下结构之一：
其中Ra和Rb在每次出现时独立地为H或取代基。例如，在一些实施方式中，Ra和Rb在每次出现时独立地为H、C1-C12烷基或环烷基，例如，H或C1-C12烷基。
在其他实施方式中，化学式(I)所示的脂质化合物具有以下结构(Ia)：
在其他实施方式中，化学式(I)所示的脂质化合物具有以下结构(Ib)：
在其他实施方式中，化学式(I)所示的脂质化合物具有以下结构(Ic)：
在化学式(I)所示的脂质化合物的某些实施方式中，a、b、c和d分别独立地为2至12的整数或者4至12的整数。在其他实施方式中，a、b、c和d分别独立地为8至12或5至9的整数。在一些特定的实施方式中，a是0。在一些实施方式中，a是1。在其他实施方式中，a是2。在更多实施方式中，a是3。在其他实施方式中，a是4。在一些实施方式中，a是5。在其他实施方式中，a是6。在更多实施方式中，a是7。在其他实施方式中，a是8。在一些实施方式中，a是9。在其他实施方式中，a是10。在更多实施方式中，a是11。在其他实施方式中，a是12。在一些实施方式中，a是13。在其他实施方式中，a是14。在更多实施方式中，a是15。在其他实施方式中，a是16。
在化学式(I)的一些其他实施方式中，b是1。在其他实施方式中，b是2。在更多实施方式中，b是3。在其他实施方式中，b是4。在一些实施方式中，b是5。在其他实施方式中，b是6。在更多实施方式中，b是7。在其他实施方式中，b是8。在一些实施方式中，b是9。在其他实施方式中，b是10。在更多实施方式中，b是11。在其他实施方式中，b是12。在一些实施方式中，b是13。在其他实施方式中，b是14。在更多实施方式中，b是15。在其他实施方式中，b是16。
在化学式(I)的一些其他实施方式中，c为1。在其他实施方式中，c是2。在更多实施方式中，c是3。在其他实施方式中，c是4。在一些实施方式中，c是5。在其他实施方式中，c是6。在更多实施方式中，c是7。在其他实施方式中，c是8。在一些实施方式中，c是9。在其他实施方式中，c是10。在更多实施方式中，c是11。在其他实施方式中，c是12。在一些实施方式中，c是13。在其他实施方式中，c是14。在更多实施方式中，c是15。在其他实施方式中，c是16。
在化学式(I)的一些特定的其他实施方式中，d是0。在一些实施方式中，d是1。在其他实施方式中，d是2。在更多实施方式中，d是3。在其他实施方式中，d是4。在一些实施方式中，d是5。在其他实施方式中，d是6。在更多实施方式中，d是7。在其他实施方式中，d是8。在一些实施方式中，d是9。在其他实施方式中，d是10。在更多实施方式中，d是11。在其他实施方式中，d是12。在一些实施方式中，d是13。在其他实施方式中，d是14。在更多实施方式中，d是15。在其他实施方式中，d是16。
在化学式(I)的一些其他多个实施方式中，a和d相同。在一些其他实施方式中，b和c相同。在一些其他具体实施方式中，a和d相同且b和c相同。
化学式(I)中a和b之和以及c和d之和是可以改变以获得具有所期望的性质的化学式(I)所示的脂质的因素。在一个实施方式中，选择a和b，从而它们的和为14至24的整数。在其他实施方式中，选择c和d，从而它们的和为14至24的整数。在其他实施方式中，a和b之和与c和d之和相同。例如，在一些实施方式中，a和b之和以及c和d之和均为相同整数，其可以在14至24的范围内。在更多实施方式中，选择a、b、c和d，从而a和b之和以及c和d之和为12或以上。
在化学式(I)的一些实施方式中，e是1。在其他实施方式中，e是2。
未具体限制在化学式(I)的R1a、R2a、R3a和R4a处的取代基。在某些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时为H。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C12烷基。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C8烷基。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C6烷基。在以上实施方式中的一些中，所述C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在化学式(I)的某些实施方式中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时是C1-C12烷基。
在化学式(I)的其他实施方式中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一个是H，或者R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时为H。
在化学式(I)的某些实施方式中，R1b与它所结合的碳原子一起与相邻R1b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。在上述其他实施方式中，R4b与它所结合的碳原子一起与相邻R4b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在上述实施方式中未具体限制在化学式(I)的R5和R6处的取代基。在某些实施方式中，R5或R6之一或两者是甲基。在某些其他实施方式中，R5或R6之一或两者是环烷基，例如环己基。在这些实施方式中，所述环烷基可以被取代或未被取代。在某些其他实施方式中，所述环烷基被C1-C12烷基，例如叔丁基取代。
在化学式(I)的上述实施方式中未具体限制R7处的取代基。在某些实施方式中，至少一个R7为H。在一些其他实施方式中，R7在每次出现时为H。在某些其他实施方式中，R7是C1-C12烷基。
在化学式(I)的上述实施方式的某些其他实施方式中，R8或R9之一是甲基。在其他实施方式中，R8和R9两者是甲基。
在化学式(I)的一些不同实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7-元杂环。在上述的一些实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5元杂环，例如吡咯烷基环。
在多个不同的实施方式中，化学式(I)所示的示例性脂质可以包括
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在一些实施方式中，LNP包含化学式(I)所示的脂质、至少一个试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-5。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-6。
在一些其他实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有化学式(II)所示的结构：
或其药物可用的盐、互变异构体、前体药物或立体异构体，其中：
L1和L2分别独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、
-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、
-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-，或直接的键；
G1是C1-C2亚烷基、–(C＝O)-、-O(C＝O)-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-或直接的键；
G2是–C(＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)NRa或直接的键；
G3是C1-C6亚烷基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1a和R1b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或者(b)R1a为H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起和相邻R1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或者(b)R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起和相邻R2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或者(b)R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起和相邻R3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或者(b)R4a为H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起和相邻R4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R5和R6分别独立地为H或甲基；
R7是C4-C20烷基；
R8和R9分别独立地为C1-C12烷基；或者R8和R9，与它们所连接的氮原子一起，形成5、6或7-元杂环；
a、b、c和d分别独立地为1至24的整数；和
x为0、1或2。
在化学式(II)的一些实施方式中，L1和L2分别独立地为
–O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接的键。在其他实施方式中，G1和G2分别独立地为-(C＝O)-或直接的键。在一些不同的实施方式中，L1和L2分别独立地为–O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接的键；并且G1和G2分别独立地为–(C＝O)-或直接的键。
在化学式(II)的一些不同的实施方式中，L1和L2分别独立地为-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRa-、-NRaC(＝O)-、
-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-NRaS(O)xNRa-、
-NRaS(O)x-或-S(O)xNRa-。
在化学式(II)的上述实施方式的其他实施方式中，所述脂质化合物具有(IIA)或(IIB)所示的下列结构之一：
在化学式(II)的一些实施方式中，所述脂质化合物具有结构(IIA)。在其他实施方式中，所述脂质化合物具有结构(IIB)。
在化学式(II)的任何上述实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个为-O(C＝O)-。
在化学式(II)的一些不同的实施方式中，L1或L2之一是-(C＝O)O-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个为-(C＝O)O-。
在化学式(II)的不同实施方式中，L1或L2之一是直接的键。如本文所使用的，“直接的键”表示基团(例如，L1或L2)不存在。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个是直接的键。
在化学式(II)的其他不同实施方式中，对于R1a和R1b的至少一次出现，R1a为H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起和相邻的R1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在化学式(II)的其他不同实施方式中，对于R4a和R4b的至少一次出现，R4a为H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起和相邻的R4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在化学式(II)的其他实施方式中，对于R2a和R2b的至少一次出现，R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起和相邻的R2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在化学式(II)的其他不同实施方式中，对于R3a和R3b的至少一次出现，R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起和相邻的R3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在化学式(II)的多种其他实施方式中，所述脂质化合物具有(IIC)或(IID)所示的下列结构之一：
其中e、f、g和h分别独立地为1至12的整数。
在化学式(II)的一些实施方式中，所述脂质化合物具有结构(IIC)。在其他实施方式中，所述脂质化合物具有结构(IID)。
在结构(IIC)或(IID)的多个实施方式中，e、f、g和h分别独立地为4至10的整数。
在化学式(II)的某些实施方式中，a、b、c和d分别独立地为2至12的整数或者4至12的整数。在其他实施方式中，a、b、c和d分别独立地为8至12或5至9的整数。。在一些特定实施方式中，a是0。在一些实施方式中，a是1。在其他实施方式中，a是2。在更多实施方式中，a是3。在其他实施方式中，a是4。在一些实施方式中，a是5。在其他实施方式中，a是6。在更多实施方式中，a是7。在其他实施方式中，a是8。在一些实施方式中，a是9。在其他实施方式中，a是10。在更多实施方式中，a是11。在其他实施方式中，a是12。在一些实施方式中，a是13。在其他实施方式中，a是14。在更多实施方式中，a是15。在其他实施方式中，a是16。
在化学式(II)的一些实施方式中，b是1。在其他实施方式中，b是2。在更多实施方式中，b是3。在其他实施方式中，b是4。在一些实施方式中，b是5。在其他实施方式中，b是6。在更多实施方式中，b是7。在其他实施方式中，b是8。在一些实施方式中，b是9。在其他实施方式中，b是10。在更多实施方式中，b是11。在其他实施方式中，b是12。在一些实施方式中，b是13。在其他实施方式中，b是14。在更多实施方式中，b是15。在其他实施方式中，b是16。
在化学式(II)的一些实施方式中，c是1。在其他实施方式中，c是2。在更多实施方式中，c是3。在其他实施方式中，c是4。在一些实施方式中，c是5。在其他实施方式中，c是6。在更多实施方式中，c是7。在其他实施方式中，c是8。在一些实施方式中，c是9。在其他实施方式中，c是10。在更多实施方式中，c是11。在其他实施方式中，c是12。在一些实施方式中，c是13。在其他实施方式中，c是14。在更多实施方式中，c是15。在其他实施方式中，c是16。
在化学式(II)的一些某些实施方式中，d是0。在一些实施方式中，d是1。在其他实施方式中，d是2。在更多实施方式中，d是3。在其他实施方式中，d是4。在一些实施方式中，d是5。在其他实施方式中，d是6。在更多实施方式中，d是7。在其他实施方式中，d是8。在一些实施方式中，d是9。在其他实施方式中，d是10。在更多实施方式中，d是11。在其他实施方式中，d是12。在一些实施方式中，d是13。在其他实施方式中，d是14。在更多实施方式中，d是15。在其他实施方式中，d是16。
在化学式(II)的一些实施方式中，e是1。在其他实施方式中，e是2。在更多实施方式中，e是3。在其他实施方式中，e是4。在一些实施方式中，e是5。在其他实施方式中，e是6。在更多实施方式中，e是7。在其他实施方式中，e是8。在一些实施方式中，e是9。在其他实施方式中，e是10。在更多实施方式中，e是11。在其他实施方式中，e是12。
在化学式(II)的一些实施方式中，f是1。在其他实施方式中，f是2。在更多实施方式中，f是3。在其他实施方式中，f是4。在一些实施方式中，f是5。在其他实施方式中，f是6。在更多实施方式中，f是7。在其他实施方式中，f是8。在一些实施方式中，f是9。在其他实施方式中，f是10。在更多实施方式中，f是11。在其他实施方式中，f是12。
在化学式(II)的一些实施方式中，g是1。在其他实施方式中，g是2。在更多实施方式中，g是3。在其他实施方式中，g是4。在一些实施方式中，g是5。在其他实施方式中，g是6。在更多实施方式中，g是7。在其他实施方式中，g是8。在一些实施方式中，g是9。在其他实施方式中，g是10。在更多实施方式中，g是11。在其他实施方式中，g是12。
在化学式(II)的一些实施方式中，h是1。在其他实施方式中，e是2。在更多实施方式中，h是3。在其他实施方式中，h是4。在一些实施方式中，e是5。在其他实施方式中，h是6。在更多实施方式中，h是7。在其他实施方式中，h是8。在一些实施方式中，h是9。在其他实施方式中，h是10。在更多实施方式中，h是11。在其他实施方式中，h是12。
在化学式(II)的一些其他多个实施方式中，a和d相同。在一些其他实施方式中，b和c相同。在一些其他具体实施方式中，a和d相同且b和c相同。
化学式(II)中a和b之和以及c和d之和是可以改变以获得具有所期望的性质的脂质的因素。在一个实施方式中，选择a和b，从而它们的和为14至24的整数。在其他实施方式中，选择c和d，从而它们的和为14至24的整数。在其他实施方式中，a和b之和与c和d之和相同。例如，在一些实施方式中，a和b之和以及c和d之和均为相同整数，其可以在14至24的范围内。在更多实施方式中，选择a、b、c和d，从而a和b之和以及c和d之和为12或以上。
未具体限制化学式(II)的R1a、R2a、R3a和R4a处的取代基。在一些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个为H。在某些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时为H。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C12烷基。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C8烷基。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C6烷基。在以上实施方式中的一些中，所述C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在化学式(II)的某些实施方式中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时是C1-C12烷基。
在化学式(II)的其他实施方式中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一个是H，或者R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时为H。
在化学式(II)的某些实施方式中，R1b与它所结合的碳原子一起与相邻R1b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。在上述其他实施方式中，R4b与它所结合的碳原子一起与相邻R4b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在上述实施方式中未具体限制在化学式(II)的R5和R6处的取代基。在某些实施方式中，R5或R6之一是甲基。在其他实施方式中，R5或R6中的每一个是甲基。
在上述实施方式中未具体限制在化学式(II)的R7处的取代基。在某些实施方式中，R7是C6-C16烷基。在一些其他实施方式中，R7是C6-C9烷基。在这些实施方式的一些中，R7被下列取代基取代：-(C＝O)ORb、–O(C＝O)Rb、-C(＝O)Rb、-ORb、-S(O)xRb、-S-SRb、-C(＝O)SRb、
-SC(＝O)Rb、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-C(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)NRaRb、
-OC(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)ORb、-NRaS(O)xNRaRb、-NRaS(O)xRb或-S(O)xNRaRb，其中：Ra是H或C1-C12烷基；Rb是C1-C15烷基；并且x为0、1或2。例如，在一些实施方式中，R7被-(C＝O)ORb或–O(C＝O)Rb取代。
在化学式(II)的上述实施方式的多种实施方式中，Rb是支链C1-C15烷基。例如，在一些实施方式中，Rb具有以下结构之一：
在化学式(II)的上述实施方式的某些其他实施方式中，R8或R9之一是甲基。在其他实施方式中，R8和R9两者是甲基。
在化学式(II)的一些不同实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7-元杂环。在上述的一些实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5元杂环，例如吡咯烷基环。在上述的一些不同的实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成6元杂环，例如哌嗪基环。
在化学式(II)所示的上述脂质的其他实施方式中，G3是C2-C4亚烷基，例如C3亚烷基。
在多个不同的实施方式中，所述脂质化合物具有以下结构之一：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
在一些实施方式中，LNP包含化学式(II)所示的脂质、至少一个试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。
在一些其他实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有化学式(III)所示的结构：
或其药物可用的盐、互变异构体、前体药物或立体异构体，其中：
L1或L2之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、
-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或
-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、
-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接的键；
G1和G2分别独立地为未取代的C1-C12亚烷基或者C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2分别独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5为H或C1-C6烷基；且
x为0、1或2。
在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，所述脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：
或者/>
/>
其中：
A是3至8-元环烷基或环亚烷基环；
R6在每次出现时独立地为H、OH或C1-C24烷基；
n为1至15的整数。
在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，所述脂质具有结构(IIIA)，并且在其他实施方式中，所述脂质具有结构(IIIB)。
在化学式(III)的其他实施方式中，所述脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：
或者/>
其中y和z分别独立地为1至12的整数。
在化学式(III)的任何上述实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个是-O(C＝O)-。在任何上述的一些不同的实施方式中，L1和L2分别独立地为-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个为-(C＝O)O-。
在化学式(III)的一些不同的实施方式中，所述脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：
在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，所述脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或者(IIIJ)之一：
在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，n是2至12，例如，2至8或2至4的整数。例如，在一些实施方式中，n是3、4、5或6。在一些实施方式中，n是3。在一些实施方式中，n是4。在一些实施方式中，n是5。在一些实施方式中，n是6。
在化学式(III)的上述实施方式中的一些其他实施方式中，y和z分别独立地为2至10的整数。例如，在一些实施方式中，y和z分别独立地为4至9或4至6的整数。
在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R6是H。在上述实施方式中的其他实施方式中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方式中，R6是OH。
在化学式(III)的一些实施方式中，G3是未取代的。在其他实施方式中，G3是取代的。在多种不同实施方式中，G3是直链C1-C24亚烷基或者直链C1-C24亚烯基。
在化学式(III)的一些其他以上实施方式中，R1或R2或两者为C6-C24烯基。例如，在一些实施方式中，R1和R2分别独立地具有以下结构：
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；且
a是2至12的整数，
其中分别选择R7a、R7b和a，从而R1和R2分别独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方式中，a是5至9或8至12的整数。
在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R7a的至少一次出现为H。例如，在一些实施方式中，R7a在每次出现时为H。在上述实施方式的其他不同的实施方式中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方式中，所述C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在化学式(III)的不同的实施方式中，R1或R2或两者具有以下结构之一：
在化学式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NHC(＝O)R4。在一些实施方式中，R4是甲基或乙基。
在多个不同的实施方式中，化学式(III)所示的阳离子脂质具有以下结构之一：
/>
/>
/>
/>
/>
在一些实施方式中，LNP包含化学式(III)所示的脂质、至少一个试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，化学式(III)所示的脂质是化合物III-3。在一些实施方式中，化学式(III)所示的脂质是化合物III-7。
在某些实施方式中，阳离子脂质以约30至约95摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约30至约70摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约40至约60摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，LNP仅包含阳离子脂质。
在某些实施方式中，所述LNP包含一种或多种其他脂质，其在它们形成期间稳定颗粒形成。
适合的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。
术语“中性脂质”是指在生理学pH，以不带电或中性两性离子形式存在的一些脂质物质中的任一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
示例性中性脂质包括(例如)二硬脂酰磷脂酰胆喊(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酸氧基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE(transDOPE))。在一个实施方式中，所述中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在一些实施方式中，所述LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在多个实施方式中，阳离子脂质(例如，化学式(I)所示的脂质)与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。
在多个实施方式中，所述LNP还包含类固醇或类固醇类似物。“类固醇”是包含以下碳骨架的化合物：
在某些实施方式中，所述类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式的一些中，阳离子脂质(例如，化学式(I)所示的脂质)与胆固醇的摩尔比在约2:1至1:1的范围内。
术语“阴离子脂质”是指在生理学pH带负电荷的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)和结合至中性脂质的其他阴离子修饰基团。
在某些实施方式中，LNP包含糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM1)。在某些实施方式中，LNP包含甾醇类，如胆固醇。
在一些实施方式中，LNP包含聚合物缀合的脂质。术语“聚合物缀合的脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分两者的分子。聚合物缀合的脂质的实例是PEG化的脂质。术语“PEG化的脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分两者的分子。PEG化的脂质在本领域中是已知的并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)等。
在某些实施方式中，LNP包含其他稳定-脂质，它是聚乙二醇-脂质(PEG化的脂质)。适合的聚乙二醇-脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的甘油二酯、PEG修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施方式中，所述聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG。在其他实施方式中，LNP包含PEG化的甘油二酯(PEG-DAG)，如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸甘油二酯(PEG-S-DAG)，如4-O-(2',3'-二(十四酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、PEG化的神经酰胺(PEG-cer)或者PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四酰氧基)丙基)氨基甲酸酯或者2,3-二(十四酰氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。在多个实施方式中，阳离子脂质与所述PEG化的脂质的摩尔比在约100:1至约25:1的范围内。
在一些实施方式中，LNP包含具有以下结构(IV)的PEG化脂质：
或其药物可用的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R10和R11分别独立地为直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，其含有10至30个碳原子，其中所述烷基链可选地被一个或多个酯键中断；和
z具有30至60的平均值。
在PEG化的脂质(IV)的以上实施方式的一些实施方式中，当z为42时，R10和R11不均为n-十八基。在一些其他实施方式中，R10和R11分别独立地为含有10至18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11分别独立地为含有12至16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11分别独立地为含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11分别独立地为含有14个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方式中，R10和R11分别独立地为含有16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方式中，R10和R11分别独立地为含有18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方式中，R10是含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，并且R11是含有14个碳原子的直链或支链，饱和或不饱和的烷基链。
在多个实施方式中，z覆盖选择以使得(II)的PEG部分具有约400至约6000g/mol的平均分子量的范围。在一些实施方式中，平均值z为约45。
在其他实施方式中，PEG化的脂质具有以下结构之一：
其中n是选择以使得PEG化的脂质的平均分子量为约2500g/mol的整数。
在某些实施方式中，其他脂质以约1至约10摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，其他脂质以约1至约5摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，其他脂质以约1摩尔百分比或者约1.5摩尔百分比存在于LNP中。
在一些实施方式中，LNP包含化学式(I)所示的脂质、核苷修饰的RNA、中性脂质、类固醇和PEG化脂质。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-6。在不同的实施方式中，所述中性脂质是DSPC。在其他实施方式中，所述类固醇是胆固醇。在其他不同的实施方式中，PEG化脂质是化合物IVa。
在某些实施方式中，LNP包含一个或多个靶向部分，其将LNP靶向至细胞或细胞群体。例如，在一个实施方式中，靶向结构域是配体，其将LNP导向存在于细胞表面上的受体。
在某些实施方式中，LNP包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方式中，LNP包含一个或多个结构域，其结合至细胞以诱导LNP的内化。例如，在一个实施方式中，一个或多个内化结构域结合至存在于细胞表面上的受体以诱导受体介导的LNP的吸收。在某些实施方式中，LNP能够体内结合生物分子，其中LNP结合的生物分子然后可以被细胞-表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP结合全身性ApoE，其导致LNP和结合的载物的吸收。
本领域描述了其他示例性LNP和它们的生产，例如，在美国专利申请公开号US20120276209、Semple等人,2010,Nat Biotechnol.,28(2):172-176；Akinc等人,2010,Mol Ther.,18(7):1357-1364；Basha等人,2011,Mol Ther,19(12):2186-2200；Leung等人,2012,J Phys Chem C Nanomater Interfaces,116(34):18440-18450；Lee等人,2012,IntJ Cancer.,131(5):E781-90；Belliveau等人,2012,Mol Ther nucleic Acids,1:e37；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl.,51(34):8529-8533；Mui等人,2013,MolTher Nucleic Acids.2,e139；Maier等人,2013,Mol Ther.,21(8):1570-1578；和Tam等人,2013,Nanomedicine,9(5):665-74中，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入。
以下反应流程显示了制备化学式(I)、(II)或(III)所示的脂质的方法。
一般反应流程1
可以根据一般反应流程1(“方法A”)制备化学式(I)所示的脂质的实施方式(例如，化合物A-5)，其中R是饱和或不饱和的C1-C24烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。参考一般反应流程1，具有结构A-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。将A-1、A-2和DMAP的混合物用DCC处理以提供溴化物A-3。在任何必需的清理和/或纯化步骤之后，在足以产生A-5的温度和时间下加热溴化物A-3、碱(例如，N,N-二异丙基乙胺)和N,N-二甲基二胺A-4的混合物。
一般反应流程2
可以根据一般反应流程2(“方法B”)制备化学式(I)所示的化合物的其他实施方式(例如，化合物B-5)，其中R是饱和或不饱和的C1-C24烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。如一般反应流程2所示，具有结构B-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。用酸性氯化物B-2(1当量)和碱(例如，三乙胺)处理B-1(1当量)的溶液。用氧化剂(例如，氯铬酸吡啶)处理粗产物，并回收中间产物B-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用还原剂(例如，三乙酰氧基氢硼化钠)处理粗B-3、酸(例如，乙酸)和N,N-二甲基氨基胺B-4的溶液以获得B-5。
应注意尽管以上将起始材料A-1和B-1显示在仅包括饱和亚甲基碳，但是包括碳-碳双键的起始材料也可以用于包括碳-碳双键的化合物的制备。
一般反应流程3：
可以根据一般反应流程3(“方法C”)制备化学式(I)所示的脂质的不同实施方式(例如，化合物C-7或C9)，其中R是饱和或不饱和的C1-C24烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。参考一般反应流程3，具有结构C-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。
一般反应流程4
可以根据一般反应流程4(“方法D”)制备化学式(II)所示的化合物的实施方式(例如，化合物D-5和D-7)，其中R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5、R6、R8、R9、L1、L2、G1、G2、G3、a、b、c和d是如本文所定义的并且R7'表示R7或C3-C19烷基。参考一般反应流程1，具有结构D-1和D-2的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。在任何必需的清理后，用还原剂(例如，三乙酰氧基氢硼化钠)处理D-1和D-2的溶液以获得D-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用酰基氯D-4(或羧酸和DCC)处理D-3和碱(例如，三甲胺、DMAP)的溶液以获得D-5。可以在任何必需的清理和/或纯化之后，用LiAlH4 D-6还原D-5以提供D-7。
一般反应流程5
可以根据一般反应流程5(“方法E”)制备化学式(II)所示的脂质的实施方式(例如，脂质E-5)，其中R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5、R6、R7、R8、R9、L1、L2、G3、a、b、c和d是如本文所定义的。参考一般反应流程2，具有结构E-1和E-2的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。在任何必需的清理后，加热E-1(过量)、E-2和碱(例如，碳酸钾)的混合物以获得E-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用酰基氯E-4(或羧酸和DCC)处理E-3和碱(例如，三甲胺、DMAP)的溶液以获得E-5。
一般反应流程6
一般反应流程6提供了制备化学式(III)所示的脂质的示例性方法(方法F)。一般反应流程6中的G1、G3、R1和R3是如本文对于化学式(III)所定义的，并且G1'是指G1短1个碳的同系物。具有结构F-1的化合物是购买的或者根据本领域中已知的方法制备的。F-1与二醇F-2在适当缩合条件(例如，DCC)下的反应获得了酯/醇F-3，其然后可以氧化(例如，PCC)为醛F-4。F-4与胺F-5在还原胺化条件下的反应获得了化学式(III)所示的脂质。
应注意用于制备化学式(III)所示的脂质的多种替代策略对于本领域那些技术人员是可用的。例如，可以使用适当起始材料，根据类似方法制备其中L1和L2是除酯以外的化学式(III)所示的其他脂质。此外，一般反应流程6显示了化学式(III)所示的脂质的制备，其中G1和G2是相同的；然而，这不是本发明所要求的方面并且对以上反应流程的改变对于获得其中G1和G2不同的化合物是可能的。
本领域技术人员将理解在本文所描述的方法中，中间体化合物的官能性基团可能需要适当保护基的保护。这些官能性基团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的适当保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔-丁基二甲基甲硅烷基、叔-丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。适合于氨基、脒基和胍基的保护基包括叔-丁氧羰基、苄氧羰基等。适合于巯基的保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、p-甲氧基苄基、三苯甲基等。适合于羧酸的保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据标准技术添加或除去保护基，这是本领域技术人员已知的并且是如本文所描述的。保护基的使用详细描述于Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups inOrganic Synthesis(1999),第3版,Wiley。如本领域中技术人员将理解的，所述保护基还可以是聚合物树脂，如Wang树脂、Rink树脂或2-氯代三苯甲基-氯树脂。
递送媒介物实施方式
考虑了任何适合的递送媒介物形式。
在一些实施方式中，递送媒介物是胶体分散体系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和脂质基系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、脂质体和脂质纳米颗粒。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体体系包括脂质体(例如，人工膜囊)和脂质纳米颗粒。
如以上所描述的，将所述脂质制剂的用途考虑用于将至少一种试剂引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，至少一种试剂可以与脂质结合。可以将与脂质结合的至少一种试剂被包封在脂质体的水性内部、分散在脂质体的脂质双分子层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子连接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为混悬液包含在脂质中、与脂质复合、包含或与胶束复合或另外与脂质结合。脂质、脂质/核酸或脂质/表达载体相关组合物不局限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双分子层结构、作为胶束或通过“塌缩”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能地形成尺寸或形状不均一的聚集体。
在一个实施方式中，至少一种试剂的递送包括任何适合的递送方法，包括本文其他处所述的示例性递送方法。在某些实施方式中，至少一种试剂向受试者的递送包括在接触步骤前至少一种试剂与转染试剂的混合。在另一个实施方式中，本发明的方法还包括与转染试剂一起施用至少一种试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是阳离子脂质试剂。
在另一个实施方式中，转染试剂是基于脂质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于蛋白的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于聚乙烯亚胺的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是磷酸钙。在另一个实施方式中，转染试剂是 或/>在另一个实施方式中，转染试剂是本领域中已知的任何其他转染试剂。
在一些实施方式中，至少一种试剂的递送包括脂质体。“脂质体”是涵盖多种通过封闭的脂质双分子层或聚集物的产生所形成的单层和多层脂质媒介物的一般术语。可以将脂质体表征为具有磷脂双分子层膜和内部水媒介的胞囊状结构。多层脂质体具有通过水媒介分隔的多个脂质层。当将磷脂在过量水溶液中混悬时，它们自发形成。脂质组分在封闭结构形成前经历自重排，并且在脂质双分子层之间包埋水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖了在溶液中具有不同于正常胞囊状结构的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或者仅作为脂质分子的非均一聚集物存在。
可以将与脂质结合的至少一种试剂包封在脂质体的水性内部、分散在脂质体的脂质双分子层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子连接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为混悬液包含在脂质中、包含或与胶束复合或另外与脂质结合。脂质、脂质/核酸或脂质/表达载体相关组合物不局限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双分子层结构、作为胶束或通过“塌缩”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能地形成尺寸或形状不均一的聚集体。
在另一个实施方式中，转染试剂形成脂质体。在另一个实施方式中，脂质体提高胞内稳定性，提高吸收效率并改善生物活性。在另一个实施方式中，脂质体是由以与组成细胞膜的那些脂质类似的方式排列的脂质所组成的中空球形囊泡。在一些实施方式中，脂质体包含用于包埋水溶性化合物的内部水性空间。在另一个实施方式中，脂质体可以将至少一种试剂以活性形式递送至细胞。
在一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)和至少一种试剂。
术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少纳米级(例如，1-1000nm)一维尺度的颗粒，其包括一个或多个脂质。在一些实施方式中，LNP包含在反脂质胶束内组织并且在脂质单层包膜内包覆或插入相邻脂质双分子层之间(例如，脂质双分子层-试剂-脂质双分子层)的至少一种试剂。在一些实施方式中，LNP的形态不像常规脂质体，其特征在于围绕水性核心的脂质双分子层，因为它们具有电子密集核心，其中阳离子/可电离脂质组织成围绕包封试剂(例如，mRNA分子)的反胶束(Cullis and Hope,2017；Guevara等人,2019b)。在多个实施方式中，颗粒包括化学式(I)、(II)或者(III)所示的脂质。在一些实施方式中，在包含如本文所描述的至少一种试剂的制剂中包括脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，这些脂质纳米颗粒包含阳离子脂质(例如，化学式(I)、(II)或(III)所示的脂质)和选自下列的一种或多种赋形剂：中性脂质、荷电脂质、类固醇和脂质-锚点的聚乙二醇(例如，PEG化脂质，如具有结构(IV)的PEG化脂质，如化合物IVa)。在一些实施方式中，至少一种试剂被包封在脂质纳米颗粒的脂质部分或者通过脂质纳米颗粒的一些或全部脂质部分包围的水性空间中，借此保护它避免被酶促降解或者避免通过宿主生物或细胞机制诱导的其他不期望的影响，例如，不利的免疫应答。
在多个实施方式中，脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一个实施方式中，脂质纳米颗粒具有约83nm的平均直径。在一个实施方式中，脂质纳米颗粒具有约102nm的平均直径。在一个实施方式中，脂质纳米颗粒具有约103nm的平均直径。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒是基本无毒的。在某些实施方式中，当存在于脂质纳米颗粒中时，至少一种试剂在水溶液中耐受胞内或细胞间酶的降解作用。
LNP可以包含能够形成至少一种试剂与之连接或者其中包封或复合了至少一种试剂的颗粒的任何脂质。术语“脂质”是指作为脂肪酸的衍生物(例如，酯)并且特征通常为不溶于水但可溶于多种有机溶剂的一组有机化合物。在本文其他处显示了示例性脂质。
在一个实施方式中，LNP包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质、阴离子脂质和PEG化的脂质。
在一个实施方式中，LNP包含阳离子脂质。如本文所使用的，术语“阳离子或可电离脂质”是指当pH降低至脂质的可电离基团的pKa以下时，处于阳离子或变为阳离子(质子化)，但在更高的pH值逐渐更中性的脂质。在低于pKa的pH值，脂质则能够与带负电荷的核酸结合。在某些实施方式中，阳离子脂质包括pH降低时带正电荷的两性离子脂质。
在多个实施方式中，LNP包含阳离子或可电离脂质、稳定脂质、甾醇和脂质-锚点的聚乙二醇(即PEG化的脂质)。
在一些实施方式中，LNP包含化学式(I)所示的离子脂质、至少一种试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-5。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-6。
在一些实施方式中，LNP包含化学式(II)所示的离子脂质、至少一种试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-9。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-10。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-11。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-12。在一些实施方式中，化学式(II)所示的脂质是化合物II-32。
在一些实施方式中，LNP包含化学式(III)所示的离子脂质、至少一种试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，化学式(III)所示的脂质是化合物III-3。在一些实施方式中，化学式(III)所示的脂质是化合物III-7。
在某些实施方式中，阳离子脂质以约30至约95摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约30至约70摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约40至约60摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，LNP仅包含阳离子脂质。
在某些实施方式中，LNP包含一种或多种稳定脂质(例如，中性或阴离子脂质)，其帮助包封载物并在它们的形成期间稳定颗粒形成。示例性中性脂质包括(例如)二硬脂酰磷脂酰胆喊(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酸氧基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE(transDOPE))。在一个实施方式中，所述中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。在多个实施方式中，阳离子脂质(例如，化学式(I)所示的脂质)与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。
在多个实施方式中，LNP还包含类固醇或类固醇类似物。在某些实施方式中，所述类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式的一些中，阳离子脂质(例如，化学式(I)所示的脂质)与胆固醇的摩尔比在约2:1至1:1的范围内。
在某些实施方式中，LNP包含糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM1)。
在某些实施方式中，LNP包含作为聚乙二醇-脂质(PEG化的脂质)的其他脂质以减少免疫系统识别和改善生物分布。在一个实施方式中，所述聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG。在其他实施方式中，LNP包含PEG化的甘油二酯(PEG-DAG)，如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸甘油二酯(PEG-S-DAG)，如4-O-(2',3'-二(十四酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、PEG化的神经酰胺(PEG-cer)或者PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四酰氧基)丙基)氨基甲酸酯或者2,3-二(十四酰氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。在多个实施方式中，阳离子脂质与PEG化的脂质的摩尔比在约100:1至约25:1的范围内。
在某些实施方式中，PEG化的脂质以约1至约10摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，PEG化的脂质以约1至约5摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，PEG化的脂质以约1摩尔百分比或者约1.5摩尔百分比存在于LNP中。
在一些实施方式中，LNP包含化学式(I)所示的脂质、核苷修饰的RNA、中性脂质、类固醇和PEG化脂质。在一些实施方式中，化学式(I)所示的脂质是化合物I-6。在不同的实施方式中，所述中性脂质是DSPC。在其他实施方式中，所述类固醇是胆固醇。在其他不同的实施方式中，PEG化脂质是化合物IVa。
在某些实施方式中，LNP包含一个或多个靶向部分，其将LNP靶向至细胞或细胞群体。例如，在一个实施方式中，靶向结构域是配体，其将LNP导向存在于细胞表面上的受体。示例性靶向结构域包括CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6和CCR7。
在某些实施方式中，LNP包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方式中，LNP包含一个或多个结构域，其结合至细胞以诱导LNP的内化。例如，在一个实施方式中，一个或多个内化结构域结合至存在于细胞表面上的受体以诱导受体介导的LNP的吸收。在某些实施方式中，LNP能够体内结合生物分子，其中LNP结合的生物分子然后可以被细胞-表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP结合全身性ApoE，其导致LNP和结合的载物的吸收。
本领域描述了其他示例性LNP和它们的生产，例如，在美国专利申请公开号US20120276209、Semple等人,2010,Nat Biotechnol.,28(2):172-176；Akinc等人,2010,Mol Ther.,18(7):1357-1364；Basha等人,2011,Mol Ther,19(12):2186-2200；Leung等人,2012,J Phys Chem C Nanomater Interfaces,116(34):18440-18450；Lee等人,2012,IntJ Cancer.,131(5):E781-90；Belliveau等人,2012,Mol Ther nucleic Acids,1:e37；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl.,51(34):8529-8533；Mui等人,2013,MolTher Nucleic Acids.2,e139；Maier等人,2013,Mol Ther.,21(8):1570-1578；和Tam等人,2013,Nanomedicine,9(5):665-74，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入。
靶向部分
如以上所教导的，本文所考虑的递送媒介物——其可以包括多种形式，如(但不限于)大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、脂质体和脂质纳米颗粒(LNP)——可以包含一个或多个靶向部分(或者等价地，“靶向结构域”或者“靶向配体”)，其起作用以将递送媒介物(例如，LNP)靶向至细胞或细胞群体。靶向部分可以包括能够与靶细胞或组织表面上的靶细胞配体特异性相互作用或结合的任何适合的结合剂。靶向部分可以是天然存在的或者工程化的。靶向部分可以包括(但不限于)蛋白、肽、抗体或抗体片段、免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、小分子、适体、维生素、核酸分子等。意在将本文所考虑的靶向部分认为是无限制的，只要任何特定靶向部分可以(a)偶联至递送媒介物(共价或非共价)和(b)能够通过递送媒介物上的靶向部分和靶细胞或组织上的靶细胞配体之间的结合或另外相互作用，导致或帮助将递送媒介物定位或靶向靶细胞或组织。
靶细胞配体可以包括细胞表面上或者细胞外的细胞间隙中存在的内源配体，如碳水化合物、脂质、多糖、蛋白、糖蛋白、糖脂、肽、细胞膜组分(例如，胆固醇)等。在某些实施方式中，靶细胞上的内源配体对靶细胞特异，即仅在靶细胞上表达和/或包含，或者至少最低限度地存在于不是靶细胞的细胞中。例如，靶细胞上的内源配体可以是疾病相关蛋白，例如，癌细胞蛋白，它是通常不在健康细胞中表达的细胞表面蛋白。在其他实施方式中，靶细胞上的靶标配体可以是工程化或另外非天然存在的配体，例如，表达非天然存在的表面细胞蛋白的基因修饰的靶细胞。可以选择适合的靶向配体，从而使用靶细胞的独特性质，因此允许组合物区分靶细胞和非靶细胞。
这方面可以被称为递送媒介物向所关心的靶细胞(例如，淋巴细胞，如T细胞)的“选择性递送”。术语“选择性递送”表示通过递送媒介物的靶向部分和所关心的靶细胞(例如，特定T细胞亚群)上的靶细胞配体之间的结合相互作用，通过共价或非共价结合至靶细胞(例如，特定T细胞亚群)，定位递送媒介物，但是其中递送媒介物不结合，或者最低限度结合至不表达靶细胞配体的细胞(即这些细胞可以被称为“非靶细胞”)。“最低限度结合”表示递送媒介物与非靶细胞的结合的范围在未检测到至相对于阴性对照(它可以是已知不结合至递送媒介物的细胞类型)的小于1％，或者小于2％，或者小于3％，或者小于4％，或者小于5％，或者小于6％，或者小于7％，或者小于8％，或者小于9％，或者小于10％的提高的结合。
因此，可以通过使用(共价或非共价)连接至递送媒介物的靶向部分将本发明公开的递送媒介物定位或靶向至特定类型的细胞(例如，特定类型的T细胞)。优选地，连接靶向部分，从而使靶向部分存在或另外暴露于递送媒介物的外表面，从而所述部分可以与靶细胞或组织(例如，T细胞，如CD3、CD4、CD5或CD8上的特定CD抗原)表面上的同源结合结构域或配体相互作用，借此促进或帮助递送媒介物与靶细胞或组织(如CD3+、CD4+、CD5+或CD8+ T细胞)结合，其中它将然后内化(例如，通过主动内化，如胞吞)并且一旦处于细胞内部，则伴随通过递送媒介物携带的试剂(例如，mRNA)的释放。
将理解靶向部分可以在制备期间或之后连接至递送媒介物表面。在一些实施方式中，靶向部分在所述媒介物已制备后连接至递送媒介物表面。在其他实施方式中，在所述媒介物已制备前，将靶向部分连接至未组装的递送媒介物的组分(例如，脂质)。可以通过本领域中任何已知的方式实施这种连接方式，包括在本领域中熟知的和在本文中所讨论的任何适合的缀合化学。
在一些其他实施方式中，递送媒介物或者包含递送媒介物的组合物还可以包括增强递送媒介物向靶细胞的定位的一种或多种其他试剂。这些其他试剂可以包括帮助递送媒介物向靶细胞的定位的其他肽、适体、寡核苷酸、维生素或其他分子，但是它不必然直接偶联至递送媒介物。
在一个实施方式中，本发明公开的递送媒介物包含能够将递送媒介物靶向白细胞的一个或多个靶向部分，其通常包括骨髓和淋巴类的免疫系统细胞。骨髓细胞可以包括(例如)嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和单核细胞。单核细胞还被分为树突状细胞和巨噬细胞。淋巴样细胞(或淋巴细胞)包括T细胞(再分成辅助性T细胞、记忆T细胞和细胞毒性T细胞)、B细胞(再分成浆细胞和记忆B细胞)和自然杀伤细胞。
本领域的常规技术人员将能够通过在递送媒介物上安装(共价或非共价)偶联(至递送媒介物)的正确匹配的靶向部分，例如，抗体、肽、蛋白、寡核苷酸、小分子、维生素或适体，从而使递送媒介物由于靶向部分和细胞靶标配体之间的特异性，并且优选地，选择性相互作用定位至靶细胞，来识别可以用作定位本文所描述的递送媒介物的方式的这些类型的白细胞中的每一种的适合的细胞靶标配体。
在多个实施方式中，本发明公开考虑了靶向和/或定位至白细胞，并且具体地，至特定淋巴细胞，如T细胞、B细胞或自然杀伤细胞的递送媒介物。在具体的实施方式中，递送媒介物包含能够将递送媒介物靶向至T细胞，包括辅助性T细胞、记忆T细胞和细胞毒性T细胞的一个或多个靶向部分。在具体的实施方式中，递送媒介物包含能够将递送媒介物靶向至细胞毒性T细胞的一个或多个靶向部分。
本领域的技术人员将理解白细胞包含被称为CD抗原的细胞表面抗原，所述CD抗原的特征在于不同类型的白细胞并且帮助定义了多种白细胞亚群。
分化簇(CD)是设想以识别和分类存在于白细胞的细胞表面上的抗原的术语系统。起初，表面抗原根据结合至它们的单克隆抗体来命名。由于在不同实验室中对每种抗原通常存在多种单克隆抗体，因此需要采用一致的术语。当前的系统是在1982年通过第1届人白细胞分化抗原(HLDA)国家研讨会所采用的。人细胞分化分子组织继续举办HLDA会议以维持和发展已知的CD标志物列表。
在该命名系统下，对良好鉴定的抗原分配任何数(例如，CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8等)，而为仅被一种单克隆抗体辨别的分子提供临时命名“CDw”，例如，CDw50。还在所分配的数之后添加小写字母以表示共享共有链的较大的分子，例如，CD1a或CD1d。生理学上，CD分子不属于任何具体类别，它们的功能范围从细胞表面受体广泛分布至粘附分子。尽管起初仅用于人白细胞，但是CD分子命名规则目前已扩大覆盖了不同物种(例如，小鼠)以及其他细胞类型。到2016年4月，人CD抗原编号多至CD371。
分别用“+”或“-”来表示来自特定细胞群体表面的特异性抗原的存在或不存在。不同的细胞表达水平还标记为hi或low，例如，中央记忆T细胞是CD62Lhi，而效应因子记忆T细胞是CD62Llow。监测不同CD抗原的表达谱已使得能够根据它们在不同免疫过程中的功能对细胞类型进行鉴定、分离和分型。
本发明公开的递送媒介物可以包括结合至或另外结合一种或多种CD抗原，包括CD1至CD371中的任一种的一种或多种靶向部分。在某些实施方式中，靶向部分是结合至或另外结合下列的那些：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6和CCR7。
在某些实施方式中，靶向部分是结合至或另外结合CD3、CD4、CD5和CD8的那些。
在多个实施方式中，靶向部分是结合至或另外结合T细胞的细胞表面分子的那些。在一个实施方式中，靶向部分结合至或另外结合泛T抗原。在一个实施方式中，泛T抗原是CD2、CD3、CD5或CD7。
在其他实施方式中，靶向部分是结合至或另外结合CD5的那些。
在多个实施方式中，将递送媒介物靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗体或抗体结合片段。这些抗体或抗体结合片段可以包括(但不限于)抗CD1抗体或抗原结合片段、抗CD2抗体或抗原结合片段、抗CD3抗体或抗原结合片段、抗CD4抗体或抗原结合片段、抗CD5抗体或抗原结合片段、抗CD7抗体或抗原结合片段、抗CD8抗体或抗原结合片段、抗CD16抗体或抗原结合片段、抗CD25抗体或抗原结合片段、抗CD26抗体或抗原结合片段、抗CD27抗体或抗原结合片段、抗CD28抗体或抗原结合片段、抗CD30抗体或抗原结合片段、抗CD38抗体或抗原结合片段、抗CD39抗体或抗原结合片段、抗CD40L抗体或抗原结合片段、抗CD44抗体或抗原结合片段、抗CD45抗体或抗原结合片段、抗CD62L抗体或抗原结合片段、抗CD69抗体或抗原结合片段、抗CD73抗体或抗原结合片段、抗CD80抗体或抗原结合片段、抗CD83抗体或抗原结合片段、抗CD86抗体或抗原结合片段、抗CD95抗体或抗原结合片段、抗CD103抗体或抗原结合片段、抗CD119抗体或抗原结合片段、抗CD126抗体或抗原结合片段、抗CD150抗体或抗原结合片段、抗CD153抗体或抗原结合片段、抗CD154抗体或抗原结合片段、抗CD161抗体或抗原结合片段、抗CD183抗体或抗原结合片段、抗CD223抗体或抗原结合片段、抗CD254抗体或抗原结合片段、抗CD275抗体或抗原结合片段、抗CD45RA抗体或抗原结合片段、抗CXCR3抗体或抗原结合片段、抗CXCR5抗体或抗原结合片段、抗FasL、抗IL18R1、抗CTLA-4、抗OX40、抗GITR抗体或抗原结合片段、抗LAG3抗体或抗原结合片段、抗ICOS抗体或抗原结合片段、抗PD-1抗体或抗原结合片段、抗leu-12抗体或抗原结合片段、抗TCR抗体或抗原结合片段、抗TLR1抗体或抗原结合片段、抗TLR2抗体或抗原结合片段、抗TLR3抗体或抗原结合片段、抗TLR4抗体或抗原结合片段、抗TLR6抗体或抗原结合片段、抗NKG2D抗体或抗原结合片段、抗CCR抗体或抗原结合片段、抗CCR1抗体或抗原结合片段、抗CCR2抗体或抗原结合片段、抗CCR4抗体或抗原结合片段、抗CCR6抗体或抗原结合片段和抗CCR7抗体或抗原结合片段。
在某些实施方式中，用于将递送媒介物靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗CD4抗体或抗原结合片段、抗CD5抗体或抗原结合片段和抗CD8抗体或抗原结合片段。
在某些其他实施方式中，用于将递送媒介物靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗CD5抗体或抗原结合片段。
如本文所使用的，“抗体”是指能够非共价、可逆并且以特异性方式结合相应抗原(例如，CD3、CD4、CD5或CD8抗原)的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的四聚体。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。所述重链恒定区由3个结构域，CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。所述轻链恒定区由一个结构域，CL组成。VH和VL区可以进一步再分成高变区，称为“互补决定区”(CDR)，其散布了更保守的区域，称为“框架区”(FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，其从氨基-末端到羧基-末端按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统第一组分(C1q)。
本发明公开的抗体包括(但不限于)单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼科动物抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，抗本发明公开的抗体的抗Id抗体)。所述抗体可以是任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或者亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
如本文所使用的，“互补决定域”或“互补决定区”(“CDR”)可互换地表示VL和VH的高变区。CDR是对这种靶标蛋白具有特异性的抗体链的靶标蛋白结合位点。在每个人VL或者VH中存在3个CDR(CDR1-3，从N-末端按顺序编号)，其构成了约15-20％的可变域。可以通过它们的区域和顺序表示CDR。例如，“VHCDR1”或“HCDR1”两者表示重链可变区的第一CDR。CDR与靶标蛋白表位结构互补，并因此直接负责结合特异性。VL或VH的剩余延伸，即所谓的框架区，显示出较少的氨基酸序列变化(Kuby,Immunology,第4版,第4章.W.H.Freeman&Co.,NewYork,2000)。
可以使用本领域中多种熟知的定义确定CDR和框架区的位置，例如，Kabat、Chothia和AbM(参见，例如，Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997))。抗原结合位点的定义还如下所述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:121-153(1991)；和Rees等人,InSternberg M.J.E.(主编),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996))。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施方式中，CDR对应于作为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方式中，CDR对应于VH，例如，哺乳动物VH，例如，人VH中的氨基酸残基26-35(HC CDR1)、50-65(HCCDR2)和95-102(HC CDR3)；和VL，例如，哺乳动物VL，例如，人VL中的氨基酸残基24-34(LCCDR1)、50-56(LC CDR2)和89-97(LC CDR3)。
轻链和重链两者被分成具有结构和功能同源性的区域。在功能上使用术语“恒定”和“可变”。就此而言，将理解轻链(VL)和重链(VH)部分两者的可变域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予了重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随它们距抗体的抗原结合位点或氨基末端的远离而增大。N-末端是可变区并且恒定区位于C-末端；CH3和CL域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端结构域。
如本文所使用的，“抗原结合片段”是指保留了与抗原表位(如，例如，白细胞的CD3、CD4、CD5或CD8抗原)特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力的抗体的一个或多个部分。结合片段的实例包括(但不限于)单链Fv(scFv)、二硫键-连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；F(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)；和分离的互补决定区(CDR)，或者抗体的其他表位结合片段。
此外，尽管通过单独的基因编码Fv片段的两个域VL和VH，但是可以使用重组方法，通过能够将它们制备为其中VL和VH区配对以形成一价分子的单一蛋白链的合成接头将它们连接(称为单链Fv(“scFv”)；参见，例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。这些单链抗体还旨在涵盖在术语“抗原结合片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗原结合片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。
还可以将抗原结合片段引入单域抗体、大型抗体、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger and Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136,2005)。可以基于多肽，如III型纤连蛋白(Fn3)将抗原结合片段移植至骨架(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单体)。因此，本文中的抗体和抗原结合片段(例如，抗CD5抗原结合片段)可以是多种结构，包括(但不限于)双重特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、抗体融合(有时称为“抗体缀合物”)和分别每种的片段。特异性抗体片段(或抗原结合片段)包括(但不限于)，(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段、(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段、(iii)由单一抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)dAb片段，其由单一可变区组成、(v)分离的CDR区、(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段、(vii)单链Fv分子(scFv)，其中通过肽接头连接VH域和VL域，其允许两个结构域结合以形成抗原结合位点、(viii)双重特异性单链Fv二聚体和(ix)“双链抗体”或“三链抗体”，通过基因融合构建的多价或多重特异性片段。可以修饰所述抗体片段。例如，可以通过掺入连接VH和VL域的二硫桥键来稳定分子。抗体形式和结构的实例描述于Carter,2006,Nature Reviews Immunology 6:343-357和其中引用参考文献，所有参考文献均明确作为参考并入。
可以将抗原结合片段引入包含一对串联的Fv部分(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子，其与互补轻链多肽一起形成抗原结合区对(Zapata等人,Protein Eng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所使用的，“单克隆抗体”是指具有基本相同的氨基酸序列或者来源于相同基因来源的多肽，包括抗体和抗原结合片段。该术语还包括单一分子组成的抗体分子的制备。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所使用的，“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区两者来源于人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区还来源于这些人序列，例如，人种系序列，或者人种系序列的突变形式，或者含有来源于人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000中所述。
在一些实施方式中，抗体是嵌合抗体或其抗原结合片段。嵌合抗体是包含来自不同基因来源的氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，所述嵌合抗体包含来自小鼠的氨基酸序列和来自人的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合抗体包含来源于小鼠的可变域和来源于人的恒定域。
在一些实施方式中，抗体是人源化抗体或其抗原结合片段。如本文所使用的，“人源化”抗体表示包含人框架区(FR)和来自非人(通常小鼠或大鼠)抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的抗体。提供CDR的非人抗体被称为“供体”并且提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。人源化主要依赖于供体CDR在受体(人)VL和VH框架上的移植(Winter美国专利号5,225,539，该专利作为参考完全并入)。该策略被称为“CDR移植(CDR grafting)”。所选受体框架残基向相应供体残基的“回复突变”通常需要恢复在初始移植构建体中失去的亲和力(美国专利号5,693,762，该专利作为参考完全并入)。人源化抗体最优地还将包含免疫球蛋白恒定区的，通常人免疫球蛋白的至少一部分，并因此通常将包含人Fc区。用于非人抗体的人源化和改造的多种技术和方法在本领域中是熟知的(参见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)和其中引用的参考文献，所有参考文献作为参考完全并入)。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化或其他方法可以包括表面重塑法，如(例如)Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:969-973中所述，该参考文献作为参考完全并入。在一个实施方式中，基于选择的方法可以用于使抗体可变区人源化和/或亲和力成熟，即提高可变区对其靶标抗原的亲和力。其他人源化方法可以包括仅部分CDR的移植，其包括(但不限于)美国专利序列号09/810,502；Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125；DePascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084中所述的方法，以上参考文献作为参考完全并入。基于结构的方法可以用于人源化和亲合力成熟，例如，如美国专利系列号10/153,159和相关专利申请中所述，所有参考文献作为参考完全并入。
在一些实施方式中，抗体是人工程化的抗体。人工程化的抗体是指来源于非人来源的抗体，如小鼠，其中已进行了一个或多个取代，从而当向受试者施用抗体时，改善抗体所期望的特征，如提高稳定性或降低免疫原性。在一些实施方式中，在低风险位置进行取代(例如，暴露于溶剂，但对抗原结合或抗体结构无帮助)。这些取代减轻了施用后受试者将对抗体产生免疫应答的风险，且不影响抗体结合至所期望的表位或抗原的能力(参见，例如，Studnicka等人，Protein Eng.1994.7(6):805-814)。
在一些实施方式中，抗体是单链抗体或抗原结合片段。单链抗体或单链可变片段(scFv)是包含如通过合成接头连接在一起的VH域和VL域以形成单一蛋白或多肽的蛋白或多肽(参见，例如，Bird等人,Science.242:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。
在一些实施方式中，抗体是抗体片段或抗原结合片段。抗体片段是来源于抗体的蛋白或多肽。抗原结合片段是来源于能够结合至与它所来源的抗体相同的表位或抗原的蛋白或多肽。
在一些实施方式中，抗体具有降低的糖基化、无糖基化或者是低岩藻糖化的。糖基化是指糖、单糖、二糖、寡糖、多糖或者聚糖部分与分子，如多肽或蛋白的共价连接。这些糖或聚糖部分通常以翻译后方式，在通过B细胞分泌之前连接至抗体。糖基化降低的抗体具有比通常连接至具有基本相同氨基酸序列的抗体的数目少的这些连接的糖或聚糖部分，如当通过B细胞体外或在小鼠或人中体内产生抗体时。不具有糖基化的抗体无连接的糖或聚糖部分。低岩藻糖化的抗体具有比通常连接至具有基本相同氨基酸序列的抗体的数目少的岩藻糖基残基，如当通过B细胞体外或在小鼠或人中体内产生抗体时。
在其他实施方式中，可以以降低免疫原性的方式修饰本文所讨论的抗体和抗原结合片段。减少免疫原性的修饰可以包括降低来源于亲代序列的所处理的多肽与MHC蛋白的结合的修饰。例如，将氨基酸修饰工程化，从而不存在或存在最少数目的预测以高亲合力结合至任何普遍的MHC等位基因的免疫表位。识别蛋白序列中MHC结合表位的一些方法在本领域中是已知的并且可以用于对本发明的抗体中的表位打分。参见，例如，美国专利序列号09/903,378、美国专利序列号10/754,296、美国专利序列号11/249,692和其中引用的参考文献，所有参考文献明确作为参考并入。
CD5靶向部分
在某些其他实施方式中，用于将递送媒介物靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗CD5抗体或抗原结合片段。
淋巴细胞抗原CD5(CD5，也称为T细胞表面糖蛋白CD5、淋巴细胞抗原T1、Leu-1、Tp67)是人T细胞和B细胞标志物。CD5在几乎所有成熟T淋巴细胞上，在成熟B细胞的小亚型(B1a细胞)上以低密度表达，并且CD5表达在胎儿期以及在几种自身免疫病并且在一些B细胞衍生的淋巴组织增生病症(B-CLL、外套细胞淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤等)和在T细胞衍生的白血病(T细胞急性淋巴母细胞性白血病、T-ALL)中扩大。
CD5是其胞质尾缺少催化活性的信号转导分子。其配体是CD72，其还在B细胞上表达并且具有未知功能。CD5用作双重受体，从而基于细胞类型和发育阶段两者提供刺激或抑制信号。CD5在B1a细胞上的表达已与自体反应性抗体的产生相联系。此外，B1a细胞的扩增已通过它们介导天然抗体的自体反应性、细胞因子的产生以及增强的抗原递呈能力的能力与自体免疫病理发生相联系。
本发明的抗CD5抗体可以是结合至CD5的任何抗体，例如，可以包括任何已知或未被发现的抗CD5抗体的可变区(例如，CDR)。本发明的抗体可以对于CD5显示出选择性。实例包括：全长相对于剪接变体、细胞-表面相对于可溶性形式、对于多种多态性变体的选择性，或者对于靶标的特定构象形式的选择性。本发明的抗体可以结合CD5上的任何表位或区域，并且可以对于所述抗原的片段、突变体形式、剪接形式或异常形式特异。
一些抗CD5抗体和抗原结合片段在本领域中是已知的和/或是可商用的，它们全部可以在本发明中获得使用。
一些抗CD5抗体和抗原结合片段在本领域中是已知的和/或是可商用的，它们全部可以在本发明中获得使用。
表1提供了可以在本发明公开中使用的多种商品化来源的抗CD5抗体的列表。
表1：可商用的示例性抗CD5抗体
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另外，适合的抗CD5抗体或抗原结合片段包括以下文献中所描述的CD5抗体或抗原结合片段：Porro，WO 92/14491，1992年2月18日提交；Lebbetter，EP0336379B1，1988年4月4日提交；Uckun，EP0441917B1，1990年7月12日提交；美国专利号4,361,549、美国专利号4,364,932；美国专利号4,515,893；美国专利号4,637,983；美国专利号4,654,210；美国专利号4,658,019；美国专利号4,803,262；美国专利号6,010,902；美国专利号6,294,167；Lindhofer，美国专利公开号2003/0223999，2003年3月3日提交；Braslawsky，WO 02/096948A2，2002年1月29日提交；Inverardi，WO 02/100334A2，2002年6月11日提交；Bigler,WO 03/030835A2，2002年10月11日提交；Kipriyanov,WO 03/088998A1，2003年4月15日提交；Inverardi,WO 04/052408A1，2002年12月10日提交；Goldenberg,WO 04/058298，2003年12月31日提交；Schuh,WO 94/23747，1994年4月11日提交；Kucherlapati,WO 96/33735，1996年4月29日提交；Kucherlapati,WO 96/34096，1995年4月28日提交；和Vernon,WO 96/41608A2，1996年6月5日提交；Axtell等人,J.Immunol.,(2004)第2928-2932页；Miller等人,Blood,第62卷,第5期(11月),1983:第988-995页；Bikah等人,Intl Immunol,第10卷,第8期,第1185-1196页；Tung等人,BMC Molecule Biol.(2001)2:5；Ravel等人,Blood,第79卷,第6期(3月15日),1992:第1151-1517页；Jaffrezou等人,Blood,第83卷,第2期(1月15日),1994:第482-489页；Martin等人,Blood,第88卷,第3期(8月1日),1996:第824-830页；Derocq等人,J.Immunol.,第141卷,2637-2843,第8期,Oct.15,1988；LeMaistre等人,Blood,第78卷,第5期(9月1日),1991:第1173-1182页；和Oehler等人,J.Exp.Med.,第187卷,第7期,Apr.6,1998,第1019-1028页，所有参考文献借此作为参考完全并入。以上参考文献中所述的分子是非限制性实例。
根据P13379-1(UniParc)，CD5具有以下氨基酸序列：MDSHEVLLAATYLLGTLAAFCLGQSGRGGLDIQVMLSGSNSKCQGQVEIQMENKWKTVCSSSWRLSQDHSKNAQQASAVCKQLRCGDPLALGPFPSLNRPQNQVFCQGSPWSISNCNNTSSQDQCLPLSLICLEPQRTTPPPTTTPPTTVPEPTAPPRLQLVPGHEGLRCTGVVEFYNGSWGGTILYKAKDRPLGLGNLICKSLQCGSFLTHLSGTEAAGTPAPAELRDPRPLPIRWEAPNGSCVSLQQCFQKTTAQEGGQALTVICSDFQPKVQSRLVGGSSVCEGIAEVRQRSQWEALCDSSAARGRGRWEELCREQQCGDLISFHTVDADKTSPGFLCAQEKLSQCYHLQKKKHCNKRVFVTCQDPNPAGLAPGTVASIILTLVLLVVLLAMCGPLVYKKLVKKFRQKKQRQWIGPTGVNQNMSFHRSHTATVRSQVENPTASHVDNEYSQPPRNSHLSAYPALEGALHRSSTQPDNSSDSDYDLQVAQRL(SEQ ID NO:1)。
根据P06127(UniParc)，CD5具有以下氨基酸序列：MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLGRLSWYDPDFQARLTRSNSKCQGQLEVYLKDGWHMVCSQSWGRSSKQWEDPSQASKVCQRLNCGVPLSLGPFLVTYTPQSSIICYGQLGSFSNCSHSRNDMCHSLGLTCLEPQKTTPPTTRPPPTTTPEPTAPPRLQLVAQSGGQHCAGVVEFYSGSLGGTISYEAQDKTQDLENFLCNNLQCGSFLKHLPETEAGRAQDPGEPREHQPLPIQWKIQNSSCTSLEHCFRKIKPQKSGRVLALLCSGFQPKVQSRLVGGSSICEGTVEVRQGAQWAALCDSSSARSSLRWEEVCREQQCGSVNSYRVLDAGDPTSRGLFCPHQKLSQCHELWERNSYCKKVFVTCQDPNPAGLAAGTVASIILALVLLVVLLVVCGPLAYKKLVKKFRQKKQRQWIGPTGMNQNMSFHRNHTATVRSHAENPTASHVDNEYSQPPRNSHLSAYPALEGALHRSSMQPDNSSDSDYDLHGAQRL(SEQ ID NO:2)。
CD4靶向部分
在某些其他实施方式中，用于将递送媒介物靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗CD4抗体或抗原结合片段。
分化簇4(CD4)是具有约55kDa的分子量的糖蛋白，其在大部分胸腺细胞、周围血液T细胞、单核细胞和巨噬细胞的细胞表面上表达。CD4是辅助T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞通讯的共受体。使用其胞内结构域，CD4通过招募酶，酪氨酸激酶Lck，放大通过TCR所产生的信号，所述酪氨酸激酶Lck对于激活被激活的T细胞的信号转导级联的多种分子组分是必不可少的。
CD4是I型跨膜蛋白，其中4个免疫球蛋白超家族结构域(从N末端至细胞膜侧，依次表示为Dl至D4)存在于细胞外侧，并且总计两条N-连接的糖链结合至结构域D3至D4。CD4通过Dl和D2结构域结合至II型主要组织相容性复合体(MHC)，然后激活T细胞。此外，还已知CD4通过D3和D4结构域聚合。CD4的Dl结构域已知用作人类免疫缺陷性病毒(HIV)的受体(Anderson等人,Clinical Immunology and Immunopathology,84(l):73-84),1997)。
CD4包含根据条目No.P01730-1(UniParc)的以下氨基酸序列：MNRGVPFRHLLLVLQLALLPAATQGKKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAFQKASSIVYKKEGEQVEFSFPLAFTVEKLTGSGELWWQAERASSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGNLTLALEAKTGKLHQEVNLVVMRATQLQKNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVSKREKAVWVLNPEAGMWQCLLSDSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEKKTCQCPHRFQKTCSPI(SEQ ID NO:3)。
本发明的抗CD4抗体可以是结合至CD4的任何抗体，例如，可以包括任何已知或未被发现的抗CD4抗体的可变区(例如，CDR)。本发明的抗体可以对于CD4显示出选择性。实例包括：全长相对于剪接变体、细胞-表面相对于可溶性形式、对于多种多态性变体的选择性，或者对于靶标的特定构象形式的选择性。本发明的抗体可以结合CD4上的任何表位或区域，并且可以对于所述抗原的片段、突变体形式、剪接形式或异常形式特异。CD4-阳性细胞的实例包括CD4-阳性T细胞，如Thl细胞、Th2细胞、Thl7细胞、调节性T细胞(Treg)和γδΤ细胞。此外，CD4-阳性细胞与疾病，包括癌症和炎性疾病(例如，自体免疫疾病或变应性疾病)有关。
多种抗CD4抗体和抗原结合片段在本领域中是已知的和/或是可商用的，它们全部可以在本发明中获得使用。
表2提供了可以在本发明公开中使用的多种商品化来源的抗CD4抗体的列表。
表2：可商用的示例性抗CD4抗体
除商品化来源外，文献已报道了大量抗CD4单克隆抗体。多种抗CD4 mAb处于以治疗癌症、免疫疾病和感染为目的的临床进展中。例如，基于以下事实：CD4和HIV之间的结合对于HIV感染必不可少，在作为HIV治疗剂的开发中，识别CD4的Dl结构域的抗体可以抑制HIV感染。作为癌症或免疫疾病的治疗剂所开发的抗CD4 mAb的实例包括扎木单抗(6G5)、ibalizumab、曲加利珠单抗和凯利昔单(CE9.1)。这些抗体是通过特异性攻击作为靶细胞的表达CD4的细胞发挥它们的药物效力的抗体，并且据考虑药物效力的机制主要是由于ADCC活性(Kim等人,Blood,109(11):4655-4662,2007)。
另外，本发明公开考虑使用以下参考文献中所公开的任何抗CD4抗体或其抗体片段：US7338658B2；US5741488A；US5871732A；US9758581B2；Delmonico等人,“Anti-CD4monoclonal antibody therapy,”Clin Transplant,1996,Oct 10(5):第397-403页；Konig等人,“Tregalizumab–A Monoclonal Antibody to Target Regulatory T Cells,”FrontImmunol.2016,第7卷:11；和JF Bach,“Therapeutic monoclonal antibodies,”Ann PharmFr.,2006,64(5):308-11，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
文献中已知的所有以上提及的可商用和抗CD4抗体可以用于本发明公开。
CD8靶向部分
在某些其他实施方式中，用于将递送媒介物靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗CD8抗体或抗原结合片段。
CD8是起到用于与MHC I类分子(pMHCI)复合的肽抗原的TCR识别的共受体的作用的表面糖蛋白。它作为αα同源二聚体或者作为αβ异源二聚体表达(Zamoyska,Immunity,1:243-6,1994)，两条链表达单一胞外Ig超家族(IgSF)V结构域、膜近端铰链区、跨膜结构域和胞质尾。CD8使用其β链以及胞外IgSF V结构域内的互补决定区(CDR)与im以及MHC I型分子的a2和a3结构域相互作用。这种结合提高了T细胞受体对其I类靶标的粘附/亲和力。
另外，通过CD8a链结合的酪氨酸蛋白激酶p561ck4'5介导的内部信号转导级联导致T细胞激活。Lck是初始CD8+ T细胞的激活和扩增所需的；然而，其表达不是记忆CD8+ T细胞对第二抗原体内或体外刺激的应答所必不可少的(Bachman等人,J Exp Med,189:1521-30,1999)。如通过CD8a或CD8B基因靶向的小鼠所示，CD8在MHC I类-限制的T淋巴细胞的成熟与功能中起重要作用(Nakayama等人,Science,263:1131-3,1984)。已发现患有反复细菌感染的一位患者由于CD8a基因中的单一突变而显示出CD8缺陷。CD8的缺少似乎不是CD8+ T细胞谱系提交或外周溶胞功能所必不可少的(de la Calle-Martin等人,J Clin Invest,108:117-23,2001)。
人CD8分子是在细胞毒T细胞(CTL)上表达的糖蛋白和细胞表面标志物。这些是T-淋巴细胞亚型并且在脊椎动物的适应性免疫系统中起重要作用。它们负责除去病毒-感染的细胞或者其他异常细胞，如一些肿瘤细胞。经由T细胞受体(TCR)特异性识别这些细胞，T细胞受体与经由靶细胞上的I类MHC(主要组织相容性复合体)所递呈的特定抗原相互作用。
通过P01732-1(UniParc)表示示例性CD8氨基酸序列，其被称为正规序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLS
NPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGD
TFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPT
PAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV(SEQ ID NO:4)。
多种抗CD8抗体和抗原结合片段在本领域中是已知的和/或是可商用的，它们全部可以在本发明中获得使用。
表3提供了可以在本发明公开中使用的多种商品化来源的抗CD8抗体的列表。
表3：可商用的示例性抗CD8抗体
存在多种本领域中已知的抗CD8抗体，包括单克隆抗体，包括：2D2；4D12.1；7B12IG1 1；8E-1.7；8G5；14；21Thy；51.1；66.2；109-2D4；138-17；143-44；278F24；302F27；AICD8.1；抗T8；B9.1.1；B9.2.4；B9.3.1；B9.4.1；B9.7.6；B9.8.6；B9.1 1；B9.1 1.10；BE48；BL15；BL-TS8；BMAC8；BU88；BW135/80；C1-11G3；CIO；C12/D3；CD8-4C9；CLB-T8/1；CTAG-CD8、3B5；F80-1D4D11；F101-87(S-T8a)；GIO-I；GlO-1.1；HI208；HI209；HI212；HIT8a；HIT8b；HIT8d；ICO-31；ICO-122；IP48；ITI-5C2；ITM8-1；JML-H7；JML-H8；L2；L533；Leu-2a；LT8；LY17.2E7；LY19.3B2；M236；M-T122；M-T415；M-T805；M-T806；M-T807；M-T808；M-T809；M-T1014；MCD8；MEM-31；MEM-146；NU-Ts/c；OKT8；OKT8f；P218；RPA-T8；SM4；T8；T8/2T8-19；T8/2T8-2A1；T8/2T8-1B5；T8/2T8-1C1；T8/7Pt3F9；T8/21thy2D3；T8/21thy；T8/TPE3FP；T8b；T41D8；T811；TU68；TU102；UCHT4；VIT8；VIT8b；WuT8-l；X107；YTC141.1；和/或YTC 182.20。
除商品化来源外，文献已报道了大量抗CD8单克隆抗体。例如，本文中考虑了以下出版物中所述的抗CD8抗体或其片段：AU2014249243B2；10,746,726；9,790,279；9,758,581；9,587,022；8,877,913；8,685,651；8,673,304；8,586,715；8,440,806；8,399,621；7,541,443；7,482,000；7,452,981；7,452,534；7,338,658；6,136,310；6,056,956；5,871,732；和5,741,488，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
文献中已知的所有以上提及的可商用和抗CD8抗体可以用于本发明公开。
CD3靶向部分
在某些其他实施方式中，用于将递送媒介物靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗CD3抗体或抗原结合片段。
CD3抗原与T细胞上的T细胞受体复合物结合。对CD3和靶细胞抗原具有特异性的多重特异性抗原结合蛋白可以引发靶细胞上T细胞的细胞毒活性。即，通过抗原结合蛋白与CD3和与靶细胞，例如，肿瘤细胞的多重特异性结合，可以诱导靶细胞的细胞胞溶。具有CD3结合位点的抗原结合蛋白以及它们的产生在本领域中是已知的(并且描述于(例如)Kipriyanov等人,1999,Journal of Molecular Biology 293:41-56、Le Gall等人,2004,Protein Engineering,Design&Selection,17/4:357-366)。
CD3抗原是5条不变的多肽链的复合物：γ、δ、ε、ζ和η，它们的分子量分别为25-28、21、20、16和22kDa。CD3链以两种不变的二聚体组聚类，与由ζ同源二聚体组成的可变二聚体结合的γ/ε和δ/ε，或者ζ/η，或者ζ/γFcR异源二聚体(γFcR是Fc受体的γ链)，或者γFcR同源二聚体。CD3是包括T细胞受体(TCR)的较大的复合物的一部分。与TCR结合的CD3复合物在免疫应答期间参与结合至I和II类主要组织相容性复合体的肽的识别。当通过MHC复合物将外源抗原递呈至TCR时，可以诱导T细胞激活。通过成熟T淋巴细胞并通过胸腺细胞亚型表达CD3抗原。
多种抗CD3抗体和抗原结合片段在本领域中是已知的和/或是可商用的，它们全部可以在本发明中获得使用。
表4提供了可以在本发明公开中使用的多种商品化来源的抗CD8抗体的列表。
表4：可商用的示例性抗CD3抗体
抗CD3抗体，包括单克隆抗体在本领域中是已知的，包括：以下中所公开的那些：US2018/0057593、US11007267B2、US10865251B2、US10759858B2、US10906978B2、US20210253701A1、US20200123255A1、US20210095027A1、US20210147561A1、US10544220B2、US20190284278A1、US20190263904A1和US20200048348A1，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
文献中已知的所有以上提及的可商用和抗CD8抗体可以用于本发明公开。
另外，还可以通过任何适合的常规方法制备可以用作本文所使用的递送媒介物上的靶向部分的本发明公开的抗体。在一种方法中，在用所关心的抗原(例如，CD4、CD8或CD5)免疫后，选择具有产生抗体，具体地B淋巴细胞(B细胞)的潜力的体细胞用于MAb产生规程。这些细胞可以得自活组织检查的脾脏或淋巴结，或者得自循环血液。然后，将来自免疫动物的抗体产生B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，通常是与所免疫的动物相同物种或者人或人/小鼠嵌合细胞之一。适合于在杂交瘤-产生融合程序中使用的骨髓瘤细胞系优选地是非抗体-产生的，具有高融合效率，和然后使其不能在仅支持所期望的融合细胞(杂交瘤)生长的特定选择培养基中生长的酶缺陷。可以使用一些骨髓瘤细胞中的任一种，如本领域技术人员已知的(Goding,第65-66页,1986；Campbell,第75-83页,1984)。
产生抗体-产生脾脏或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括在存在一种或多种促进细胞膜融合的试剂(化学或电学)的情况下将体细胞与骨髓瘤细胞混合。Kohler and Milstein(1975；1976)已描述了使用仙台病毒的融合方法，并且Gefter等人(1977)描述了使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的那些方法。电学诱导的融合方法的使用也是适合的(Goding,第71-74页,1986)。
培养提供了从中选择特异性杂交瘤的杂交瘤群体。通常，通过在微量滴定板中的单一克隆稀释，然而测试各个克隆上清液(在约2至3周后)所期望的反应性，通过培养细胞进行杂交瘤的选择。所述测定应是灵敏、简单且快速的，如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、免疫斑点测定等。然后，对所选的杂交瘤进行连续修饰或通过流式细胞分选进行单细胞分选并克隆到各个抗体-产生细胞系中，所述克隆然后可以无限繁殖以提供mAb。
所述细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。可以将杂交瘤样品注射到动物(例如，小鼠)中(通常注射到腹膜腔中)。可选地，在注射前，用烃，具体地油剂，如异十八烷(四甲基十五烷)使动物初免。当以这种方式使用人杂交瘤时，最优地注射免疫受损的小鼠，如SCID小鼠，以防止肿瘤排斥。注射动物出现分泌通过融合细胞杂交体所产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可以放出动物体液，如血清或腹水，以提供高浓度MAb。还可以离体培养单个细胞系，其中MAb被天然分泌到培养基中，从所述培养基可以容易地以高浓度获得它们。作为另外一种选择，可以体外使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。所述细胞系可以适合于在无血清培养基中生长以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果需要，可以使用过滤、离心和多种色谱方法，如FPLC或亲合色谱法进一步纯化通过任一种方式所产生的MAb。本发明公开的单克隆抗体片段可以得自通过包括酶，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的消化，和/或通过化学还原对二硫键的切割的方法的纯化的单克隆抗体。作为另外一种选择，可以使用自动肽合成仪合成通过本发明公开所涵盖的单克隆抗体片段。
还考虑分子克隆方法可以用于产生单克隆。对此，RNA可以分离自杂交瘤系，并且通过RT-PCR获得抗体基因并克隆至免疫球蛋白表达载体。作为另外一种选择，从分离自所述细胞系的RNA制备免疫球蛋白噬粒组合文库并通过使用病毒抗原淘选来选择表达适当抗体的噬粒。这种方法相对于常规杂交瘤技术的优势在于可以在单一轮次产生并筛选很多个抗体，并且通过H和L链组合产生新的特异性，其进一步提高了获得适当抗体的概率。
分别作为参考并入本文的教导在本发明公开中有用的抗体的产生的美国专利包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法的嵌合抗体的产生；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；和美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。
组合
在一个实施方式中，本发明提供了T细胞靶向的递送媒介物的组合，其靶向两种或更多种T细胞抗原。在一个实施方式中，两种或更多种T细胞抗原选自CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6或CCR7。在一个实施方式中，组合包含一个或多个T细胞靶向的递送媒介物，其靶向CD4+ T细胞的表面抗原和CD8+ T细胞的表面抗原。在一个实施方式中，组合包含两种或更多种T细胞靶向的递送媒介物，其靶向CD4和CD8。
在一个实施方式中，T细胞靶向的递送媒介物的组合将相同试剂递送至表达不同表面抗原的T细胞。在一个实施方式中，T细胞靶向的递送媒介物的组合将第一试剂递送至表达第一表面抗原的T细胞的一个亚型，并且将第二不同的试剂递送至表达第二表面抗原的T细胞的第二亚型。因此，在多个实施方式中，可以使用本发明的组合将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10种不同的试剂递送至T细胞。
在一个实施方式中，本发明的T细胞靶向的递送媒介物包含或包封了本文所描述的试剂的组合。在某些实施方式中，包括本文所描述的试剂的组合的组合物具有累加效果，其中组合的整体效果与每种单独的试剂的效果之和近似相等。在其他实施方式中，包括本文所描述的试剂的组合的组合物具有协同作用，其中组合的整体效果大于每种单独的试剂的效果之和。
包含试剂组合的组合物包含处于任何适合的比例的单个试剂。例如，在一个实施方式中，组合物包含1:1比例的两种单独的试剂。然而，组合不局限于任何特定的比例。而是，涵盖了证明有效的任何比例。
缀合
在本发明的多个实施方式中，将递送媒介物缀合至靶向结构域。示例性的缀合方法可以包括(但不限于)共价键、静电相互作用和疏水性(“范德华力”)相互作用。在一个实施方式中，缀合是可逆缀合，从而一旦暴露于特定条件或化学试剂，递送媒介物可以与靶向结构域分离。在另一个实施方式中，缀合是不可逆缀合，从而在正常条件下，递送媒介物不与靶向结构域分离。
在一些实施方式中，缀合包含激活的聚合物缀合的脂质和靶向结构域之间的共价键。术语“激活的聚合物缀合的脂质”是指包含脂质部分和已经由第一偶联基团对聚合物缀合的脂质的官能化激活的聚合物部分的分子。在一个实施方式中，激活的聚合物缀合的脂质包含能够与第二偶联基团反应的第一偶联基团。在一个实施方式中，激活的聚合物缀合的脂质是激活的PEG化的脂质。在一个实施方式中，第一偶联基团结合至PEG化的脂质的脂质部分。在另一个实施方式中，第一偶联基团结合至PEG化的脂质的聚乙二醇部分。在一个实施方式中，第二官能团共价连接至靶向结构域。
第一偶联基团和第二偶联基团可以是本领域技术人员已知共同形成共价键，例如，在温和反应条件或生理条件下形成共价键的任何官能团。在一些实施方式中，第一偶联基团或第二偶联基团选自马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、碳二亚胺、酰肼、五氟苯基(PFP)酯、膦、羟甲基膦、补骨脂素、亚氨酸酯、二硫吡啶、异氰酸酯、乙烯砜、α-卤代乙酰基、芳基叠氮化物、酰基叠氮化物、烷基叠氮化物、双吖丙啶、苯甲酮、环氧化物、碳酸酯、酸酐、磺酰氯、环辛炔、醛和巯基。在一些实施方式中，第一偶联基团或第二偶联基团选自游离胺(-NH2)、游离巯基(-SH)、游离氢氧化物基团(-OH)、羧酸根、酰肼和烷氧基胺。在一些实施方式中，第一偶联基团是对巯基具有反应性的官能团，如马来酰亚胺、二硫吡啶或卤代乙酰基。在一个实施方式中，第一偶联基团是马来酰亚胺。
在一个实施方式中，第二偶联基团是巯基。可以使用本领域技术人员已知的任何方法将巯基布置在靶向结构域上。在一个实施方式中，所述巯基存在于游离半胱氨酸残基上。在一个实施方式中，经由靶向结构域上二硫键的还原，如通过与2-半胱胺的反应显示巯基。在一个实施方式中，经由化学反应，如游离胺和2-亚氨基四氢噻吩或者N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫乙酸酯(SATA)之间的反应，布置所述巯基。
在一些实施方式中，用“点击”化学中所使用的基团官能化聚合物缀合的脂质和靶向结构域。生物正交“点击”化学包含了官能团与1,3-偶极体，如叠氮化物、氧化腈、硝酮、异氰化物之间的反应以及与烯烃或炔烃亲偶极体的连接。示例性亲偶极体包括本领域技术人员已知的任何应变环烯和环炔，包括(但不限于)环辛炔、二苯并环辛炔、一氟化环辛炔、二氟化环辛炔和二芳基氮杂环辛酮。
肽
在一个实施方式中，本发明的靶向结构域包含肽。在某些实施方式中，所述肽靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。
可以使用化学法制备本发明的肽。例如，肽可以通过固相技术合成(Roberge J Y等人(1995)Science 269:202-204)，从树脂切割并通过制备型高效液相色谱纯化。例如，根据生产商所提供的说明，使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)可以实现自动合成。
作为另外一种选择，可以通过重组方式或者通过从较长的多肽切割来制备肽。可以通过氨基酸分析或测序确认肽的组成。
根据本发明的肽的变体可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地保守氨基酸残基)替换的一种变体，并且这种替换的氨基酸残基可以或可以不是由遗传密码所编码的一种变体，(ii)其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基，例如，通过取代基团的连接修饰的残基的一种变体，(iii)其中所述肽是本发明的肽的可变剪接变体的一种变体，(iv)所述肽的片段和/或(V)其中所述肽与另一种肽，如前导序列或分泌序列或用于纯化(例如，His-标签)或用于检测(例如，Sv5表位标签)的序列融合的一种变体。所述片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)所产生的肽。变体可以翻译后修饰或者化学修饰。根据本文的教导内容，这些变体被认为在本领域技术人员的范围内。
如本领域中已知的，通过将一条肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替换与第二条肽的序列相比较，确定两条肽之间的“相似性”。将变体定义为包括不同于原始序列，优选地每个所关心的节段不同于原始序列的小于40％的残基，更优选地每个所关心的节段不同于原始序列的小于25％的残基，更优选地每个所关心的节段不同于小于10％的残基，最优选地每个所关心的节段不同于原始蛋白序列的仅几个残基，并且同时与原始序列足够同源以保持原始序列的功能性的肽序列。本发明包括与原始氨基酸序列至少60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％或95％类似或相同的氨基酸序列。使用本领域技术人员普遍已知的计算机算法和方法确定两条肽之间的同一性程度。优选地，通过使用BLASTP算法确定两条氨基酸序列之间的同一性[BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIHBethesda,Md.20894、Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]。
可以翻译后修饰本发明的肽。例如，属于本发明的范围的翻译后修饰包括信号肽切割、糖基化、乙酰化、异戊二烯化、蛋白水解、豆蔻酰化、蛋白折叠和蛋白水解加工等。一些修饰或加工事件需要引入另外的生物学机器。例如，通过向标准翻译反应添加犬科微粒体膜或非洲蟾蜍卵细胞提取物(美国专利号6,103,489)来检验加工事件，如信号肽切割和核心糖基化。
本发明的肽可以包括通过翻译后修饰或者通过在翻译期间引入非天然氨基酸所形成的非天然氨基酸。
核酸
在一个实施方式中，本发明的靶向结构域包含分离的核酸，包括(例如)DNA寡核苷酸和RNA寡核苷酸。在某些实施方式中，核酸靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。例如，在一个实施方式中，核酸包含特异性结合至所关心的靶标的核苷酸序列。
作为另外一种选择，核酸靶向结构域的核苷酸序列可以包含相对于原始核苷酸序列的序列变化，例如，一个或多个核苷酸的替换、插入和/或缺失，但条件是所得核酸起到原始核酸的作用并且特异性结合至所关心的靶标。
在本文描述中所使用的意义上，当其核苷酸序列相对于核苷酸序列具有至少60％，有利地至少70％，优选地至少85％并且更优选地至少95％的同一性程度时，核苷酸序列与本文描述的任何核苷酸序列“基本同源”。可能的修饰的其他实例包括一个或多个核苷酸在所述序列中的插入、一个或多个核苷酸在任何序列末端的添加或者一个或多个核苷酸在任何序列末端或内部的缺失。使用本领域技术人员普遍已知的计算机算法和方法确定两条多核苷酸之间的同一性程度。优选地，通过使用BLASTN算法确定两条氨基酸序列之间的同一性[BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894、Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]。
抗体
在一个实施方式中，本发明的靶向结构域包含抗体或抗体片段。在某些实施方式中，抗体靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。这些抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab和其单链Fv(scFv)片段、双重特异性抗体、杂合偶联抗体、人和人源化抗体。
抗体可以是完整单克隆或多克隆抗体，和免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、人源化抗体、基因工程单链FV分子(Ladner等人，美国专利号4,946,778)或嵌合抗体，例如，含有鼠科抗体的结合特异性，但是其中剩余部分是人源的抗体。可以使用本领域技术人员已知的方法制备抗体，包括单克隆和多克隆抗体、片段和嵌合体。
可以以多种方式产生这些抗体，包括杂交瘤培养、在细菌或哺乳动物细胞培养物中的重组表达和在转基因动物中的重组表达。生产方法的选择取决于一些因素，包括所期望的抗体结构、抗体上碳水化合物部分的重要性、培养和纯化的容易程度以及成本。可以使用标准表达技术产生多种不同的抗体结构，包括全长抗体、抗体片段，如Fab和Fv片段以及包含来自不同物种的组分的嵌合抗体。可以在细菌表达系统中产生小尺寸的抗体片段，如Fab和Fv片段，其不具有效应因子功能和有限的药物动力学活性。单链Fv片段显示出低免疫原性。
在一个实施方式中，本发明的靶向结构域是特异性结合至T细胞表面抗原的抗体。在一个实施方式中，本发明的靶向结构域是特异性结合至泛T抗原的抗体。在一个实施方式中，泛T抗原是CD2、CD3、CD5或CD7。
肽靶向部分
在一个实施方式中，本发明的靶向结构域包含肽。在某些实施方式中，所述肽靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。
可以使用化学法制备本发明的肽。例如，肽可以通过固相技术合成(Roberge J Y等人(1995)Science 269:202-204)，从树脂切割并通过制备型高效液相色谱纯化。例如，根据生产商所提供的说明，使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)可以实现自动合成。
作为另外一种选择，可以通过重组方式或者通过从较长的多肽切割来制备肽。可以通过氨基酸分析或测序确认肽的组成。
根据本发明的肽的变体可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地保守氨基酸残基)替换的一种变体，并且这种替换的氨基酸残基可以或可以不是由遗传密码所编码的一种变体，(ii)其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基，例如，通过取代基团的连接修饰的残基的一种变体，(iii)其中所述肽是本发明的肽的可变剪接变体的一种变体，(iv)所述肽的片段和/或(V)其中所述肽与另一种肽，如前导序列或分泌序列或用于纯化(例如，His-标签)或用于检测(例如，Sv5表位标签)的序列融合的一种变体。所述片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)所产生的肽。变体可以翻译后修饰或者化学修饰。根据本文的教导内容，这些变体被认为在本领域技术人员的范围内。
如本领域中已知的，通过将一条肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替换与第二条肽的序列相比较，确定两条肽之间的“相似性”。将变体定义为包括不同于原始序列，优选地每个所关心的节段不同于原始序列的小于40％的残基，更优选地每个所关心的节段不同于原始序列的小于25％的残基，更优选地每个所关心的节段不同于小于10％的残基，最优选地每个所关心的节段不同于原始蛋白序列的仅几个残基，并且同时与原始序列足够同源以保持原始序列的功能性的肽序列。本发明包括与原始氨基酸序列至少60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％或95％类似或相同的氨基酸序列。使用本领域技术人员普遍已知的计算机算法和方法确定两条肽之间的同一性程度。优选地，通过使用BLASTP算法确定两条氨基酸序列之间的同一性[BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIHBethesda,Md.20894、Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]。
可以翻译后修饰本发明的肽。例如，属于本发明的范围的翻译后修饰包括信号肽切割、糖基化、乙酰化、异戊二烯化、蛋白水解、豆蔻酰化、蛋白折叠和蛋白水解加工等。一些修饰或加工事件需要引入另外的生物学机器。例如，通过向标准翻译反应添加犬科微粒体膜或非洲蟾蜍卵细胞提取物(美国专利号6,103,489)来检验加工事件，如信号肽切割和核心糖基化。
本发明的肽可以包括通过翻译后修饰或者通过在翻译期间引入非天然氨基酸所形成的非天然氨基酸。
核酸靶向部分
在一个实施方式中，本发明的靶向结构域包含分离的核酸(例如，DNA或RNA)，包括(例如)适体(如(但不限于)prequeosin1-1核转换适体或“evopreQ1-1”或其变体、假结(MMLV病毒基因组假结或“Mpknot-1”)或其变体、tRNA或其变体或G-四链体或其变体)、DNA寡核苷酸和RNA寡核苷酸。在某些实施方式中，核酸靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。例如，在一个实施方式中，核酸包含特异性结合至所关心的靶标的核苷酸序列。
作为另外一种选择，核酸靶向结构域的核苷酸序列可以包含相对于原始核苷酸序列的序列变化，例如，一个或多个核苷酸的替换、插入和/或缺失，但条件是所得核酸起到原始核酸的作用并且特异性结合至所关心的靶标。
在本文描述中所使用的意义上，当其核苷酸序列相对于核苷酸序列具有至少60％，有利地至少70％，优选地至少85％并且更优选地至少95％的同一性程度时，核苷酸序列与本文描述的任何核苷酸序列“基本同源”。可能的修饰的其他实例包括一个或多个核苷酸在所述序列中的插入、一个或多个核苷酸在任何序列末端的添加或者一个或多个核苷酸在任何序列末端或内部的缺失。使用本领域技术人员普遍已知的计算机算法和方法确定两条多核苷酸之间的同一性程度。优选地，通过使用BLASTN算法确定两条氨基酸序列之间的同一性[BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894、Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]。
抗体靶向部分
在多个实施方式中，本发明公开提供了递送媒介物，其包含抗体或抗体片段作为将递送媒介物(例如，脂质体或脂质纳米颗粒)靶向所期望的免疫细胞，例如，细胞毒性T细胞的靶向结构域。
在一个实施方式中，本发明的靶向结构域包含抗体或抗体片段。在某些实施方式中，抗体靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。这些抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab和其单链Fv(scFv)片段、双重特异性抗体、杂合偶联抗体、人和人源化抗体。
抗体可以是完整单克隆或多克隆抗体，和免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、人源化抗体、基因工程单链FV分子(Ladner等人，美国专利号4,946,778)或嵌合抗体，例如，含有鼠科抗体的结合特异性，但是其中剩余部分是人源的抗体。可以使用本领域技术人员已知的方法制备抗体，包括单克隆和多克隆抗体、片段和嵌合体。
可以以多种方式产生这些抗体，包括杂交瘤培养、在细菌或哺乳动物细胞培养物中的重组表达和在转基因动物中的重组表达。生产方法的选择取决于一些因素，包括所期望的抗体结构、抗体上碳水化合物部分的重要性、培养和纯化的容易程度以及成本。可以使用标准表达技术产生多种不同的抗体结构，包括全长抗体、抗体片段，如Fab和Fv片段以及包含来自不同物种的组分的嵌合抗体。可以在细菌表达系统中产生小尺寸的抗体片段，如Fab和Fv片段，其不具有效应因子功能和有限的药物动力学活性。单链Fv片段显示出低免疫原性。
在一个实施方式中，本发明的靶向结构域是特异性结合至T细胞表面抗原的抗体。在一个实施方式中，本发明的靶向结构域是特异性结合至泛T抗原的抗体。在一个实施方式中，泛T抗原是CD2、CD3、CD5或CD7。
T细胞
在多个实施方式中，递送媒介物的靶标可以是体内的任何类型的细胞(即“靶标细胞”)。在优选的实施方式中，靶细胞是免疫细胞，如(但不限于)任何种类的骨髓细胞(例如，嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和单核细胞)或者任何种类的淋巴细胞(例如，T细胞(例如，细胞毒性T细胞、辅助性T细胞或者记忆T细胞)、B细胞(例如，浆细胞和记忆B细胞)和自然杀伤细胞)。
在某些实施方式中，靶细胞是T细胞。在一些实施方式中，可以使用本发明的组合物靶向的T细胞可以是CD4+或CD8+，并且可以包括(但不限于)T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(也称为细胞毒T淋巴细胞，CTL；CD8-T细胞)和记忆T细胞，包括中央记忆T细胞(TCM)、干细胞记忆T细胞(TSCM)、干细胞样记忆T细胞(或干细胞样记忆T细胞)和效应因子记忆T细胞，例如，TEM细胞和TEMRA(CD45RA+)细胞、效应T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、Th22细胞、Tfh(卵泡辅助)细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞(MAIT)和γδT细胞。主要的T细胞的亚型包括TN(初始)、TSCM(干细胞记忆)、TCM(中央记忆)、TTM(瞬时记忆)、TEM(效应因子记忆)和TTE(末端效应因子)、TCR-转基因T细胞、通用细胞因子介导杀伤的重定向T细胞(TRUCK)、肿瘤浸润T细胞(TIL)、CAR-T细胞或者可以用于治疗疾病或病症的任何T细胞。
在一个实施方式中，本发明的T细胞是免疫刺激性细胞，即介导免疫应答的细胞。示例性的免疫刺激性T细胞包括(但不限于)T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(也称为细胞毒T淋巴细胞，CTL；CD8+T细胞)和记忆T细胞，包括中央记忆T细胞(TCM)、干细胞记忆T细胞(TSCM)、干细胞样记忆T细胞(或干细胞样记忆T细胞)和效应因子记忆T细胞，例如，TEM细胞和TEMRA(CD45RA+)细胞、效应T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、Th22细胞、Tfh(卵泡辅助)细胞、自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞(MAIT)和γδT细胞。
治疗方法
在一个实施方式中，T细胞靶向的递送媒介物包含或包封了要向受试者施用的试剂。在一些实施方式中，试剂是核苷修饰的mRNA。本发明因此提供了将至少一种试剂递送至T细胞的方法。
在一个实施方式中，T细胞靶向的递送媒介物包含或包封了用于治疗疾病或病症的治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂是编码CAR的核苷修饰的mRNA。本发明因此提供了将编码CAR的mRNA分子递送至T细胞的方法。在某些实施方式中，方法用于治疗或预防受试者中的疾病或病症。示例性的疾病或病症包括(但不限于)癌症、传染性疾病和免疫学病症。
以下是可以通过所公开的方法治疗或预防的癌症的非限制性实例：急性淋巴母细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、阑尾癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、儿童视通路肿瘤、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒性白血病、慢性脊髓增生病、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食道癌、尤文氏家族肿瘤、颅外癌、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、肝外癌、眼癌，蕈样、胆囊癌、胃(胃)癌、胃肠癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞瘤、妊娠癌、妊娠滋养细胞肿瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多病、霍奇金淋巴瘤、舌癌、下丘脑和视通路胶质瘤、下丘脑肿瘤、眼内(眼)癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾(肾脏细胞)癌、郎格罕细胞癌、郎格罕细胞组织细胞增生症、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性颈鳞癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、霉菌病、脊髓发育不良综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、粒细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓瘤、脊髓增生病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化松果体实质细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层瘤、垂体瘤、浆细胞赘生物、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾脏细胞(肾)癌、肾盂和输尿管癌、涉及染色体15上的nut基因的呼吸道癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌(黑素瘤)、皮肤癌(非黑素瘤)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、颈鳞癌、胃(胃)癌、幕上原始神经外胚层瘤、幕上原始神经外胚层瘤和成松果体细胞瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养叶瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯物伦巨球蛋白血症和胚胎性癌肉瘤。
在一些实施方式中，本发明描绘了用于治疗或预防自体免疫疾病的方法，所述自体免疫疾病包括(但不限于)类风湿性关节炎/血清阴性关节病、骨关节炎、炎症性肠病、全身性红斑狼疮、虹膜炎/葡萄膜视神经炎、特发性肺纤维化、全身性血管炎/韦格纳氏肉芽肿病、结节病，包括(但不限于)、类风湿性关节炎/血清阴性关节病、骨关节炎、炎症性肠病、全身性红斑狼疮、虹膜炎/葡萄膜视神经炎、特发性肺纤维化、全身性血管炎/韦格纳氏肉芽肿病、结节病、心肌炎、心肌梗塞后综合症、开胸-心包切开后综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、抗肾小球基底膜肾炎、间质性膀胱炎、狼疮肾炎、自体免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎、抗合成酶综合征、斑形脱发、自体免疫性血管性水肿、自体免疫性黄体酮皮炎、自体免疫性荨麻疹、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、疱疹样皮炎、盘状红斑狼疮、后天性大疱性表皮松解、结节性红斑、妊娠性类天疱疮、化脓性汗腺炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、线性IgA大疱病(LAD)、硬斑病、寻常天疱疮、急性苔癣痘疹样糠疹、穆-哈二氏病、银屑病、系统性硬皮病、白癜风、阿狄森氏病、1型自身免疫性多内分泌综合征(APS)、2型自身免疫性多内分泌综合征(APS)、3型自身免疫性多内分泌综合征(APS)、自体免疫性胰腺炎(AIP)、1型糖尿病、自体免疫甲状腺炎、奥德甲状腺炎、突眼性甲状腺肿、自体免疫性卵巢炎、子宫内膜异位、自体免疫性睾丸炎、干燥综合征、自体免疫性肠病、腹腔病、克罗恩氏病、显微镜下结肠炎、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合征(APS、APLS)、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自体免疫性淋巴组织增生性综合征、自体免疫性中性白细胞减少、自身免疫性血小板减少性紫癜、冷凝集素病、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、伊文思综合征、恶性贫血、单纯红细胞再生障碍性贫血、血小板减少、德尔肯氏病、成人斯蒂尔氏病、强直性脊柱炎、CREST综合征、药物引起的狼疮、起止点炎相关关节炎、嗜酸细胞性筋膜炎、费尔蒂综合征、IgG4相关疾病、幼年型关节炎、莱姆病(慢性)、混合结缔组织病(MCTD)、汉-罗二氏综合征、帕-罗二氏综合征、帕松纳-特纳综合症、牛皮癣关节炎、反应性关节炎、复发性多软骨炎、腹膜后纤维化、风湿热、Schnitzler综合征、未分化结缔组织病(UCTD)、皮肤肌炎、纤维性肌痛、包含体肌炎、肌炎、重症肌无力、神经性肌强直、副肿瘤性小脑变性、多肌炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性运动轴索神经病、抗N-甲基-D-天冬氨酸(抗NMDA)受体脑炎、巴洛同心圆性硬化症、比克斯塔夫脑炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏脑病、特发性炎症性脱髓鞘疾病、Lambert-Eaton类重症肌无力综合征、多发性硬化(II型)、奥舒兰综合征、与链球菌相关的儿科自身免疫性神经精神病学病症(PANDAS)、进行性炎症性神经病、多动腿综合征、僵人综合征、sydenham舞蹈病、横贯性脊髓炎、自体免疫性视网膜病、自体免疫性葡萄膜炎、科干综合征、格雷夫斯眼病、中间葡萄膜炎、木质性结膜炎、角膜侵蚀性溃疡、视神经脊髓炎、视性眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、巩膜炎、苏萨克氏综合征、交感性眼炎、托洛萨-亨特综合征、自身免疫性内耳病(AIED)、梅尼埃病、疾病、伴有多血管炎的嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、巨细胞性动脉炎、肉芽肿病合并多血管炎(GPA)、IgA血管炎(IgAV)、川崎病、白细胞破裂性血管炎、狼疮血管炎、类风湿血管炎、显微性下多血管炎(MPA)、多发性结节性动脉炎(PAN)、风湿性多肌痛、荨麻疹脉管炎、血管炎和原发性免疫缺陷。
在一些实施方式中，试剂是用于治疗或预防感染或传染性疾病的治疗剂。在一个实施方式中，治疗剂是用于治疗或预防细菌感染或与之有关的疾病或病症的试剂。细菌可以来自以下门中的任一种：酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体门(Chlamydiae)、绿菌门(Chlorobi)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、互养菌门(Synergistetes)、无壁菌门(Tenericutes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热袍菌门(Thermotogae)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。
细菌可以是革兰氏阳性细菌或者革兰氏阴性细菌。细菌可以是好氧细菌或者厌氧细菌。细菌可以是自养细菌或者异养细菌。细菌可以是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。
细菌可以是炭疽杆菌、抗生素抗性细菌、造成疾病的细菌、食物中毒细菌、感染性菌、沙门氏菌(Salmonella bacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌、链球菌(Streptococcus)细菌或者破伤风细菌。细菌可以是分枝杆菌属(mycobacteria)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA)或者艰难梭菌(Clostridium difficile)。
在一个实施方式中，试剂是用于治疗或预防病毒感染或与之有关的疾病或病症的治疗剂。在一些实施方式中，病毒来自以下科中的一种：腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae，包括SARS和SARS-CoV-2)、丝状病毒科(Filoviridae)、肝病毒科(Hepadnaviridae)、疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小核粮核酸病毒(Picornaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)或者披衣病毒科(Togaviridae)。病毒抗原可以来自人类免疫缺陷性病毒(HIV)、基孔肯亚病毒(CHIKV)、登革热病毒、乳头状瘤病毒，例如，人乳头状瘤病毒(HPV)、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒，例如，甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)、天花病毒(重型天花和轻型天花)、牛痘病毒、流感病毒、鼻病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、诺沃克病毒、甲型肝炎病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加利福尼亚脑炎病毒、Hanta病毒(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒、马伯格氏病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也叫做水痘)、巨细胞病毒(CMV)，例如，人CMV、埃-巴二氏病毒(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、拉沙病毒、沙粒病毒或者造成癌症的病毒。
在一个实施方式中，试剂是用于治疗或预防寄生虫感染或与之有关的疾病或病症的治疗剂。在一些实施方式中，寄生虫是原生动物、蠕虫或外寄生虫。蠕虫(即蠕虫)可以是扁虫(例如，蛭和绦虫)、棘头虫或蛔虫(例如，蛲虫)。外寄生虫可以是虱、蚤、蜱和螨。
寄生虫可以是导致以下疾病中任一种的任何寄生虫：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、小袋虫病、浣熊蛔虫病、恰加斯式病、华支睾吸虫病、锥蝇属病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、片山热、利什曼病、莱姆病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、粪类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病和鞭虫病。
寄生虫可以是棘阿米巴、异尖线虫、人蛔虫、马蝇、结肠小袋虫、臭虫、多节绦虫(绦虫)、恙螨、嗜人锥蝇、痢疾内变形虫、肝片吸虫、肠兰伯式鞭毛虫、钩虫、利什曼虫属(Leishmania)、鼻腔舌形虫、肝吸虫、罗阿丝虫、并殖吸虫-肺吸虫、蛲虫、恶性疟原虫、血吸虫、粪类圆线虫、螨、绦虫、刚地弓形虫、锥虫属、鞭虫或者班氏丝虫。
在一个实施方式中，试剂是用于治疗或预防真菌感染或与之有关的疾病或病症的治疗剂。在一些实施方式中，所述真菌是曲霉属(Aspergillus)的种、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、假丝酵母(例如，白假丝酵母(Candida albicans))、球孢子菌属(Coccidioides)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、皮癣霉菌(dermatophyte)、镰刀菌属(Fusarium)的种、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、毛霉亚门(Mucoromycotina)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、凸脐蠕孢属(Exserohilum)或者芽枝霉(Cladosporium)
当通过本发明公开，包括本文详述的方法所提供的，本领域技术人员将理解本发明不局限于已建立的疾病或病症的治疗。具体地，所述疾病或病症不需要已表现出损害受试者的程度；的确，不需要在施用治疗之前在受试者中检测所述疾病或病症。也就是说，不必在本发明可以提供益处之前发生明显的疾病或病症的病征或症状。因此，本发明包括用于预防疾病或病症的方法，其中如先前在本文其他处所讨论的，可以在疾病或病症发病之前向受试者施用组合物，借此预防疾病或病症。
当通过本文中的公开内容所提供时，本领域技术人员将理解疾病或病症的预防涵盖了作为对疾病或病症的发生或发展的预防措施向受试者施用组合物。如在本文其他处更全面地讨论的，调节基因或基因产物的水平或活性的方法涵盖了广泛的技术，其不仅用于调节多肽基因产物的水平和活性，而且还用于调节核酸的表达，包括转录、翻译或两者。
本发明涵盖了递送媒介物的递送，递送媒介物包含缀合至靶向结构域的至少一种试剂。为了实践本发明的方法；技术人员将理解基于本文所提供的发明公开，如何配制和向受试者施用适合的组合物。本发明不局限于任何具体的施用方法或治疗方案。
本领域技术人员将理解可以单独或以任何组合施用本发明的组合物。此外，可以在时间意义上单独或以任何组合施用本发明的组合物，其中它们可以同时，或者在彼此之前和/或之后施用。本领域的技术人员将理解基于本文所提供的发明公开，本发明的组合物可以用于预防或治疗疾病或病症，并且可以单独或与另一种组合物以任何组合使用组合物以实现治疗结果。在多个实施方式中，本文所描述的本发明的任何组合物可以单独或者和与疾病或病症有关的其他分子的其他调节剂组合施用。
本发明的组合物(例如，递送媒介物)向人患者的施用可以通过任何途径，包括(但不限于)静脉内、节点内、皮内、透皮、皮下、肌内、吸入(例如，经由气溶胶)、口腔(例如，舌下)、局部(即皮肤和粘膜表面两者，包括气道表面)、鞘内、关节内、胸膜内、脑内、动脉内、腹膜内、口服、淋巴管内、鼻内、直肠或阴道施用、通过局部导管输注或通过直接病灶内注射。在一个实施方式中，通过限定时间内(例如，0.5至2小时)所提供的静脉内推注或静脉内输注来施用本发明的组合物(例如，递送媒介物)。可以通过蠕动方式或以储罐形式递送本发明的组合物，尽管如本领域熟知的，任何给定情况下最适合的途径将取决于如下因素：受试者的物种、年龄、性别和整体状况、要治疗的病况的性质和严重程度和/或要施用的特定组合物的性质(即剂量、制剂)。在具体的实施方式中，施用途径经由一段时间内的弹丸或连续输注，每周一次或两次。在其他具体的实施方式中，施用途径通过在一个或多个位点(例如，大腿、腰、臀、手臂)所提供的皮下注射，可选地每周一次或两次。在一个实施方式中，通过门诊施用本发明的组合物和/或方法。
在一个实施方式中，本发明包括方法，方法包括施用本文所描述的组合物的组合。在某些实施方式中，方法具有累加效果，其中施用组合物的组合的整体效果与施用每种单独的抑制剂的效果之和近似相等。在其他实施方式中，方法具有协同效果，其中施用组合物的组合的整体效果大于施用每种单独的组合物的效果之和。
方法包括以任何适合的比例施用组合物的组合。例如，在一个实施方式中，方法包括以1:1的比例施用两个单独的组合物。然而，方法不局限于任何特定比例。而是，涵盖了证明有效的任何比例。
药物组合物
可以通过任何药学领域中已知的或此后发展的方法制备本文所描述的药物组合物的制剂(例如，包含一种或多种递送媒介物)。一般地，这些制备方法包括使活性成分(例如，一种或多种递送媒介物)与载体或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如有必要或者如果希望，将所述产物成形或包装成所期望的单剂量或多剂量单元。
尽管对本文所提供的药物组合物的描述主要涉及适合于向人伦理学施用的药物组合物，但是技术人员将理解这些组合物通常适合于向各种各样的动物施用。对适合于向人施用的药物组合物进行改变以使组合物适合于向多种动物施用是很好理解的，并且常规兽医药理学家可以仅通过常规实验(即使有的话)来设计和实施这些改变。考虑了施用本发明的药物组合物的受试者，其包括(但不限于)人及其他灵长类、哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如非人灵长类、牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
可以以适合于眼、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺部、鼻内、口腔、静脉内、脑室内、皮内、肌内或者另一种施用途径的制剂制备、包装或出售在本发明的方法中有用的药物组合物(例如，包含一种或多种递送媒介物)。其他所考虑的制剂包括投射纳米颗粒(projected nanoparticle)、脂质体制剂、包含活性成分的重新包封的红细胞和基于免疫原性的制剂。
可以作为整体，作为单一单位剂量或者作为多个单一单位剂量制备、包装或出售本发明的药物组合物。如本文所使用的，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的单个的量。活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量或者其剂量的便捷的部分(convenient fraction)，如(例如)其剂量的一半或三分之一。
在本发明的药物组合物中，活性成分、药物可用的载体和任何其他成分的相对量将基于所治疗的受试者的身份、体型和状况并且还基于施用组合物的途径而改变。举例来说，组合物可以包括0.1％至100％(w/w)之间的活性成分。
除活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包括一种或多种其他药物活性剂。
可以使用常规技术制备本发明的药物组合物的控释或缓释制剂。
如本文所使用的，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何施用途径，其特征在于物理打破受试者组织并通过所述组织中的破口施用药物组合物。因此，肠胃外施用包括(但不限于)通过组合物的注射，通过手术切口的组合物应用，通过穿透组织的非手术伤口的组合物应用等的药物组合物的施用。具体地，考虑了肠胃外施用，其包括(但不限于)眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、肌内、皮内、胸骨内注射、肿瘤内、静脉内、脑室内和肾透析输注技术。
适合于肠胃外施用的药物组合物制剂包括与药物可用的载体，如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。可以以适合于丸剂施用或者适合于连续施用的形式制备、包装或出售这些制剂。可以以单位剂量形式，如在安瓿瓶中或在含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装或出售注射制剂。用于肠胃外施用的制剂包括(但不限于)处于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液、乳液、糊剂和可植入缓释或生物可降解制剂。这些制剂还可以包括一种或多种其他成分，其包括(但不限于)混悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方式中，以在肠胃外施用所复原的组合物之前，用适合的媒介物(例如，无菌无热原的水)复原的干燥(即粉末或颗粒)形式提供活性成分。
以无菌可注射的水性或油性混悬液或溶液的形式制备、包装或出售药物组合物。可以根据已知技术配制这种混悬液或溶液，并且除活性成分之外，其可以包括本文所描述的其他成分，如分散剂、润湿剂或助悬剂。可以使用无毒的肠胃外-可用的稀释剂或溶剂，如(例如)水或1,3-丁二醇制备这些无菌注射制剂。其他可用的稀释剂和溶剂包括(但不限于)林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油剂，如合成的单或二-甘油酯。其他有用的可胃肠外施用的制剂包括包含处于微晶形式，处于脂质体制剂中或者作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可以包括药物可用的聚合物或疏水性材料，如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。
在多个实施方式中，可以向受试者施用免疫细胞靶向的递送媒介物，从而递送媒介物体内接触靶向的免疫细胞。在其他实施方式中，T细胞可以离体接触所述免疫细胞靶向的递送媒介物，然后转移回到需要细胞继承性转移的受试者。在该实施方式中，从患者除去T细胞，并通过用本文所公开的递送媒介物接触它们离体修饰。
可以以适合于通过颊间隙肺部施用的制剂制备、包装或出售本发明的药物组合物。这种制剂可以包括干燥的颗粒，颗粒包括活性成分并且具有约0.5至约7纳米，并且优选地约1至约6纳米的范围内的直径。这些组合物方便地处于用于使用装置或者使用自抛射溶剂/粉末-分配容器施用的干粉形式，所述装置包括干粉储罐，可以将抛射剂流导向所述干粉储罐以分散所述粉末，并且所述自抛射溶剂/粉末-分配容器如包括溶解或混悬在密封容器中的低沸点抛射剂中的活性成分的装置。优选地，这些粉末包括颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒的直径大于0.5纳米并且按数量计至少95％的颗粒的直径小于7纳米。更优选地，按重量计至少95％的颗粒的直径大于1纳米并且按数量计至少90％的颗粒的直径小于6纳米。干粉组合物优选地包括固体细粉稀释剂，如糖，并且所述干粉组合物方便地以单位剂量形式提供。
低沸点抛射剂通常包括在大气压力下具有小于65°F的沸点的液体抛射剂。通常，所述抛射剂可以占组合物的50至99.9％(w/w)，并且活性成分可以占组合物的0.1至20％(w/w)。所述抛射剂还可以包括其他成分，如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或者固体稀释剂(优选地，具有与包含活性成分的颗粒同数量级的颗粒尺寸)。
适合于肠胃外施用的药物组合物制剂包括与药物可用的载体，如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。可以以适合于丸剂施用或者适合于连续施用的形式制备、包装或出售这些制剂。可以以单位剂量形式，如在安瓿瓶中或在含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装或出售注射制剂。用于肠胃外施用的制剂包括(但不限于)处于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液、乳液、糊剂和可植入缓释或生物可降解制剂。这些制剂还可以包括一种或多种其他成分，其包括(但不限于)混悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方式中，以在肠胃外施用所复原的组合物之前，用适合的媒介物(例如，无菌无热原的水)复原的干燥(即粉末或颗粒)形式提供活性成分。
以无菌可注射的水性或油性混悬液或溶液的形式制备、包装或出售药物组合物。可以根据已知技术配制这种混悬液或溶液，并且除活性成分之外，其可以包括本文所描述的其他成分，如分散剂、润湿剂或助悬剂。可以使用无毒的肠胃外-可用的稀释剂或溶剂，如(例如)水或1,3-丁二醇制备这些无菌注射制剂。其他可用的稀释剂和溶剂包括(但不限于)林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油剂，如合成的单或二-甘油酯。其他有用的可胃肠外施用的制剂包括包含处于微晶形式，处于脂质体制剂中或者作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可以包括药物可用的聚合物或疏水性材料，如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。
如本文所使用的，“其他成分”包括(但不限于)以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；粘结剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学可降解的组成，如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；助悬剂；分散剂或润湿剂；乳化剂，镇痛剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药物可用的聚合物或疏水性材料。可以包括在本发明的药物组合物中的其他“另外的成分”在本领域中是已知的并且描述于(例如)Remington's PharmaceuticalSciences(1985,Genaro主编,Mack Publishing Co.,Easton,PA)，以上文献作为参考并入本文。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述了本发明。除非另作说明，否则仅出于说明的目的提供了这些实施例，并且它们不意欲限制。因此，本发明决不应视为受限于以下实施例，而是应视为涵盖由于本文所提供的教导内容而变得显而易见的任何和所有改变。
在不进行进一步描述的情况下，据信本领域的技术人员可以使用以上描述和以下说明性实施例制备和使用本发明和实践所主张的方法。因此，不应以任何方式将以下工作实施例视为对本发明公开的其余部分的限制。
实施例1：靶向CD5的LNP
目前，靶向特定细胞类型以递送治疗性核酸的能力是体内瞬时和永久基因疗法两者开发的最大障碍。所提供的数据证实可以靶向特定细胞类型和器官的可以使基因疗法发生巨大变化的方法的发展。
通过将CD5结合抗体连接至LNP表面，使LNP靶向CD5+ T细胞。靶向CD5的核苷修饰的mRNA-LNP显示出有效且特异的体外和体内递送(图1)。体内使用Cre/loxP报告分子系统，靶向CD5的mRNA-LNP平台引起了有效且特异的基因编辑(图2)。
本发明使得能够将核酸治疗剂有效体内递送至CD5+-T细胞。本发明可以替换当前用于CAR T疗法的白细胞除去法和T细胞扩增。通过本发明，可以向患者提供含有将CAR T基因插入T细胞的mRNA的靶向T细胞的LNP的单一施用。
实施例2：体内产生的CAR T细胞治疗心脏损伤
心脏成纤维细胞通过良好研究的机制，包括TGFβ-SMAD2/3、白介素-11及其他与免疫系统的相互作用，响应多种心肌损伤而被激活(Khalil等人,2017,J Clin Invest.127:3770-3783；Schafer等人,2017,Nature,552:110-115；Moore-Morris等人,2014,J ClinInvest,124:2921-2934；Yokota等人,2020,Cell,182:545-562；Rurik等人,2021,CircRes,128:1776-1779；Widjaja等人,2021,bioRxiv:doi:10.1101/2021.06.10.447846)。在多种慢性心脏疾病中，这些成纤维细胞不会静止并且分泌过量的胞外基质，从而导致纤维化(Henderson等人,2020,Nature,587:555-566)。纤维化不仅使心肌硬化，而且还不利地影响心肌细胞健康与功能(González等人,2018,J Am Coll Cardiol.71:1696–1706)。尽管对激活的心脏成纤维细胞有深入理解，但是抗纤维化治疗剂的临床试验至今仍令人失望(Rurik等人,2021,Circ Res,128:1776-1779；Henderson等人,2020,Nature,587:555-566；Fan等人,2016,Biomater Res.20:1–13)。此外，一旦纤维化建立，这些干预旨在限制纤维化发展并且设计不重塑纤维化。为了解决这种显著的问题，嵌合抗原受体(CAR)T细胞已作为心力衰竭治疗剂用于特异性消除激活的成纤维细胞(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433)。小鼠心脏病模型中激活的成纤维细胞的除去导致心脏纤维化显著减少和改善的心脏功能(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433)。该工作的一个警告是类似于目前在肿瘤诊所中使用的CAR T细胞疗法的工程化T细胞的无限持久度(Kalos等人,2011,SciTransl Med.3:95ra73-95ra73)。成纤维细胞激活是多种组织中正常创伤-愈合过程的一部分并且持久的抗纤维化CAR T细胞可以在未来损伤环境中具有风险。因此，利用核苷修饰的mRNA技术的功效来开发瞬时抗纤维化CAR T治疗剂。
可以通过掺入修饰的核苷、合成封端、添加长多聚-A尾来稳定治疗性信使RNA，并用密码子优化增强(Weissman,2014,Expert Rev Vaccines.14:265–281；Karikó等人,2005,Immunity,23:165–175；Karikó等人,2008,Mol Ther,16:1833–1840)。1-甲基假尿嘧啶核苷整合还增强了翻译(Karikó等人,2008,Mol Ther,16:1833–1840；Andries等人,2015,JControl Release,217:337–344)。通过电穿孔将mRNA直接离体引入T细胞已成功用于制备CAR T细胞(Zhao等人,2010,Cancer Res,70:9053–9061)；然而，该过程具有巨大的成本和风险并且需要广泛的基础设施。因此，发展了可以用于通过在能够在注射后体内产生CAR T细胞的脂质纳米颗粒(LNP)中包装修饰的mRNA避免从患者除去T细胞的方法。LNP-mRNA技术构成了近期已证实在解决COVID-19流行中起关键作用的疫苗发展中成功的基础并且对其他治疗策略具有优良前景(Pardi等人,2018,Nat Rev Drug Discov,17:261–279；Rizvi等人,2021,Nat Commun.12,doi:10.1038/s41467-021-20903-3；Krienke等人,2021,Science(80-),371:145–153；等人,2021,Nat Commun,12:3460；Gillmore等人,2021,N Engl J Med,1-10)。一旦处于体内，缺少任何具体靶向策略的加载了mRNA的LNP被多种细胞类型(具体地，如果静脉内注射，肝细胞)内吞(Pardi等人,2015,J ControlRelease,217:345-351；Akinc等人,2010,Mol Ther,18:1357–1364)。在细胞吸收后不久，mRNA逃逸内涵体，从而将mRNA释放至细胞质，在此在降解前，它被瞬时转录(Weissman,2014,Expert Rev Vaccines.14:265-281)。可以在LNP表面上装饰靶向抗体以指导向特定细胞类型的吸收(和mRNA表达)(Parhiz等人,2018,J Control Release,291:106-115；Tombácz等人,2021,Mol Ther,10.1016/j.ymthe.2021.06.004)。不受理论束缚，假设导向T淋巴细胞的LNP可以递送足够的mRNA以体内产生功能性CAR T细胞(图3)。由于在细胞分裂期间mRNA被限制在细胞质、不能基因组整合、固有不稳定和稀释，通过设计，这些CAR T细胞将是瞬时的。
现将描述在实验中使用的材料和方法。
小鼠
C57BL/6N小鼠得自Charles River Laboratories(Willmington,MA)。Ai6小鼠(RosaCAG-LSL ZsGreen)得自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。在美国实验动物认证委员会(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)认证的机构中，在宾夕法尼亚大学实验动物关怀及使用委员会(IACUC)批准的规程下，符合伦理地进行所有动物研究。
试剂和抗体
Phoenix-ECO逆转录病毒包装细胞(CRL-3214)和HEK293T(CRL-3216)得自美国模式培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA)。ACH2细胞得自Farida Shaheen(宾夕法尼亚大学，CFAR)。每季度测试所有永生化细胞系的支原体污染。血管紧张素II(A9525)和盐酸苯肾上腺素(P6126)购自Millipore Sigma(St.Louis,MO)。渗透性迷你泵(Alzet2004型)得自Durect Corporation(Cupertino,CA)。无菌盐水(0.9％氯化钠)购自Hospira(LakeForest,IL)。荧光素酶测定(E151A)和pGL3-对照质粒得自Promega Corporation(Madison,WI)。通过Twist Bioscience(South San Francisco,CA)，使用NCBI参考序列NM_007986.3合成鼠科FAP表达质粒。将Td_Tomato框内融合至FAP的N-末端(胞内片段)以用于体外胞啃实验。加His-标签的重组小鼠FAP(ab271506)得自Abcam(Cambridge,MA)。His-标签-PE单克隆抗体(克隆D3I10,15024)得自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)。CD3-APC(克隆17A2，20-0032-U100)得自Tonbo Biosciences(San Diego,CA)。
RNA合成并复合至脂质纳米颗粒
所使用的FAPCAR构建体含有具有小鼠CD3ζ和CD28胞质信号转导结构域的来自小鼠特异性FAP单克隆抗体(克隆73.3)的scFv片段(Wang等人,2014,Cancer Immunol Res.2:154–166)。包括了赋予对腺嘌呤核苷-和前列腺素E2介导的抑制的抗性的小肽(RISR-RIAD)(Newick等人,2016,Cancer Immunol Res.4,541–551)。通过P2A自切割肽编码序列将FAPCAR和RISR-RIAD编码序列隔开，并且在用于在哺乳动物细胞中表达的密码子-优化后，将完整序列克隆至具有T7启动子、5'和3'UTR元件和多聚(A)尾的IVT模板质粒中。克隆和无内毒素质粒制备服务由GenScript(Piscataway,NJ)提供。使用m1Ψ-5'-三磷酸酯(TriLinkN-1081)而不是UTP，通过MEGAScript T7试剂盒(Invitrogen AMB13345)产生mRNA，并且所述mRNA含有101个核苷酸长的多聚(A)尾。使用三核苷酸端帽1类似物，CleanCap(TriLink,San Diego,CA)通过共转录进行体外转录的mRNA的封端。如前所述，通过纤维素纯化来纯化mRNA(等人,2019,Mol Ther Nucleic Acids,15:26–35)。通过琼脂糖凝胶电泳分析所有mRNA并在-20℃储存。使用如前所述的自组装方法，将纤维素纯化的含m1ψ的RNA包封在LNP中(Maier等人,2013,Mol Ther,21:1570–1578)，简要地，将可电离阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇-脂质的乙醇脂质混合物与含有mRNA的水溶液在酸性pH快速混合。鉴定加载RNA的颗粒并随后在-80℃以1μg/μl的浓度储存。这些LNP-mRNA的平均水力学直径为约80nm，多分散指数为0.02-0.06且包封效率为～95％。在本研究中使用的LNP是Acuitas Therapeutics具有专利的。
为了制备抗体缀合的LNP-mRNA，如上所述，经由SATA-马来酰亚胺化学将LNP-mRNA与纯化的大鼠抗小鼠CD5，克隆53-7.3(BioLegend)或小鼠抗人CD5，克隆UCHT2(BioLegend)以及对照同种型匹配的IgG缀合(Tombácz等人,2021,Mol Ther,10.1016/j.ymthe.2021.06.004)。简要地，通过插入后技术，用马来酰亚胺官能团(DSPE-PEG-mal)修饰LNP。用SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫乙酸酯)(Millipore Sigma)官能化抗体以引入巯基，从而允许缀合至马来酰亚胺。使用0.5M羟胺对SATA脱保护，随后通过G-25SephadexQuick旋转蛋白柱(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)除去未反应的组分。然后，使用硫醚缀合化学，将抗体上的反应性巯基缀合至马来酰亚胺部分。使用Sepharose CL-4B凝胶过滤柱(Millipore Sigma)进行纯化。通过实施改良的Quant-iT RiboGreen RNA测定(Invitrogen)计算mRNA含量。在添加靶向配体后，将所有靶向和非靶向的LNP制剂保持在4℃并在制备3天内使用。
在一个实施方式中，FAPCAR分子是包含以下氨基酸序列的鼠科-FAPCAR分子：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLKESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTADKRLELVATTNNNGGVTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLQSEDTAMYYCARYGYYAMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTVKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKAAATTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHRSRNSRRNRLLQVTTMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR*(SEQ ID NO:5)，其通过下列编码：
鼠科-FAPCAR编码DNA序列，如下所示：
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCCGGCTCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAAGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCTACGGCATGTCCTGGGTGCGCCAGACCGCCGACAAGCGCCTGGAGCTGGTGGCCACCACCAACAACAACGGCGGCGTGACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCCGCGACAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGTCCTCCCTGCAGTCCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCGCCCGCTACGGCTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCATCTCCGTGACCGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCTCCGGCGGCGGCTCCGACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGCCCGTGTCCCTGGGCGACCAGGCCTCCATCTCCTGCCGCTCCTCCCAGTCCATCGTGCACTCCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGCTTCTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCGTGAAGATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGCTCCCACGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGCCGCCGCCACCACCACCAAGCCCGTGCTGCGCACCCCCTCCCCCGTGCACCCCACCGGCACCTCCCAGCCCCAGCGCCCCGAGGACTGCCGCCCCCGCGGCTCCGTGAAGGGCACCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCATCTGCGTGGCCCTGCTGCTGTCCCTGATCATCACCCTGATCTGCTACCACCGCTCCCGCAACTCCCGCCGCAACCGCCTGCTGCAGGTGACCACCATGAACATGACCCCCCGCCGCCCCGGCCTGACCCGCAAGCCCTACCAGCCCTACGCCCCCGCCCGCGACTTCGCCGCCTACCGCCCCCGCGCCAAGTTCTCCCGCTCCGCCGAGACCGCCGCCAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGAGAAGAAGCGCGCCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCAGCAGCGCCGCCGCAACCCCCAGGAGGGCGTGTACAACGCCCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCACCAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGACCCTGGCCCCCCGCTAA(SEQ ID NO:6)，或其由以下RNA序列编码：
鼠科-FAPCAR编码mRNA序列：
AUGGCCCUGCCCGUGACCGCCCUGCUGCUGCCCCUGGCCCUGCUGCUGCACGCCGCCCGCCCCGGCUCCCAGGUGCAGCUGAAGGAGUCCGGCGGCGGCCUGGUGCAGCCCGGCGGCUCCCUGAAGCUGUCCUGCGCCGCCUCCGGCUUCACCUUCUCCUCCUACGGCAUGUCCUGGGUGCGCCAGACCGCCGACAAGCGCCUGGAGCUGGUGGCCACCACCAAC
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GUGUCCAACCGCUUCUCCGGCGUGCCCGACCGCUUCUCCGGCUCC
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CCGGCACCUCCCAGCCCCAGCGCCCCGAGGACUGCCGCCCCCGCGG
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CUGGGCCCCCCUGGCCGGCAUCUGCGUGGCCCUGCUGCUGUCCCU
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GAGACCGCCGCCAACCUGCAGGACCCCAACCAGCUGUACAACGAG
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GCGCGCCCGCGACCCCGAGAUGGGCGGCAAGCAGCAGCGCCGCCG
CAACCCCCAGGAGGGCGUGUACAACGCCCUGCAGAAGGACAAGAU
GGCCGAGGCCUACUCCGAGAUCGGCACCAAGGGCGAGCGCCGCCG
CGGCAAGGGCCACGACGGCCUGUACCAGGGCCUGUCCACCGCCAC
CAAGGACACCUACGACGCCCUGCACAUGCAGACCCUGGCCCCCCG
CUAA(SEQ ID NO:7)。
在另一个实施方式中，FAPCAR分子是包含以下氨基酸序列的Mu-FAPCAR-Mu-CD28Z-P2A-RISR-RIAD：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLKESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTADKRLELVATTNNNGGVTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLQSEDTAMYYCARYGYYAMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTVKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKAAATTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHRSRNSRRNRLLQVTTMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPESKRRQEEAEQRKLEQYANQLADQIIKEATE*(SEQ ID NO:8)，其通过下列编码：
Mu-FAPCAR-Mu-CD28Z-P2A-RISR-RIAD编码DNA序列：
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCCGGCTCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAAGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCTACGGCATGTCCTGGGTGCGCCAGACCGCCGACAAGCGCCTGGAGCTGGTGGCCACCACCAACAACAACGGCGGCGTGACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCCGCGACAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGTCCTCCCTGCAGTCCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCGCCCGCTACGGCTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCATCTCCGTGACCGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCTCCGGCGGCGGCTCCGACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGCCCGTGTCCCTGGGCGACCAGGCCTCCATCTCCTGCCGCTCCTCCCAGTCCATCGTGCACTCCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGCTTCTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCGTGAAGATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGCTCCCACGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGCCGCCGCCACCACCACCAAGCCCGTGCTGCGCACCCCCTCCCCCGTGCACCCCACCGGCACCTCCCAGCCCCAGCGCCCCGAGGACTGCCGCCCCCGCGGCTCCGTGAAGGGCACCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCATCTGCGTGGCCCTGCTGCTGTCCCTGATCATCACCCTGATCTGCTACCACCGCTCCCGCAACTCCCGCCGCAACCGCCTGCTGCAGGTGACCACCATGAACATGACCCCCCGCCGCCCCGGCCTGACCCGCAAGCCCTACCAGCCCTACGCCCCCGCCCGCGACTTCGCCGCCTACCGCCCCCGCGCCAAGTTCTCCCGCTCCGCCGAGACCGCCGCCAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGAGAAGAAGCGCGCCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCAGCAGCGCCGCCGCAACCCCCAGGAGGGCGTGTACAACGCCCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCACCAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGACCCTGGCCCCCCGCGGCTCCGGCGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCGAGTCCAAGCGCCGCCAGGAGGAGGCCGAGCAGCGCAAGCTGGAGCAGTACGCCAACCAGCTGGCCGACCAGATCATCAAGGAGGCCACCGAGTAA(SEQ ID NO:9)，或者其通过下列编码：
Mu-FAPCAR-Mu-CD28Z-P2A-RISR-RIAD编码mRNA序列：AUGGCCCUGCCCGUGACCGCCCUGCUGCUGCCCCUGGCCCUGCUGCUGCACGCCGCCCGCCCCGGCUCCCAGGUGCAGCUGAAGGAGUCCGGCGGCGGCCUGGUGCAGCCCGGCGGCUCCCUGAAGCUGUCCUGCGCCGCCUCCGGCUUCACCUUCUCCUCCUACGGCAUGUCCUGGGUG
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动物实验
将成年雄性小鼠随机分组并经由植入的28-天渗透性迷你泵(Alzet2004型)，通过恒定输注(1.5μg/g/天)血管紧张素II和(50μg/g/天)去氧肾上腺素损伤。用含有无菌盐水(0.9％氯化钠)的泵假损伤对照小鼠。在AngII/PE损伤7天后，在2-3％异氟烷全身麻醉下，经由眶后静脉窦静脉内注射LNP。通过功效分析估计实验数。出于多种原因，从本报告中包含的数据中排除LNP处理小鼠的一个小群组：第一，未包括阳性对照组。第二，一半动物具有明显的指示过量损伤的左心室后壁异常和令人困惑的超声心动图定量。在LNP施用后2周，使用配备有MS400(18-38MHZ)换能器的Fujifilm VisualSonics超声波系统(VisualSonicsInc,Toronto,ON Canada)，通过超声波心动描记法测定左心室功能。通过用0.005mL/g的2％阿佛丁(2,2,2-三溴乙醇，Millipore Sigma)腹膜内注射，使小鼠轻微麻醉。左心室(LV)收缩功能：获得二维长-轴、短-轴M-模式图像。LV舒张功能：以改良的4室顶面视图获得经二尖瓣流入模式图和组织多普勒图。使用Vevo Lab软件(Visual Sonics Inc,Toronto,ON,Canada)，分析图像的LV结构和功能。速记员对处理条件不清楚。
FAPCAR T细胞的产生
如前所述，产生了具有FAPCAR序列基因组整合的小鼠T细胞(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433；Wang等人,2014,Cancer Immunol Res.2:154–166)。简要地，使用阴性选择(StemCell Technologies 19851)，从野生型10-14周大的雄性小鼠分离小鼠T细胞，使用CD3/CD28 Dynabeads(Gibco 11453D)激活并使用100单位/mL的重组小鼠白介素-2(R&D Systems 402-ML)扩增。在含有10％ FBS(Atlanta Biologicals S11150)、4mM L谷氨酰胺(Invitrogen 25030081)、青霉素/链霉素(Invitrogen 15140122)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen 11360079)和50μM 2-巯基乙醇(Gibco 21985023)的RPMI 1640(Invitrogen11875085)中生长T细胞。使用Phoenix-ECO病毒产生细胞(ATCC CRL-3214)包装FAPCAR逆转录病毒颗粒。通过涂覆0.5μg/cm2Retronectin(Takara T100B)的板来辅助FAPCAR逆转录病毒对T细胞的感染。
通过将LNP与分离和激活的T细胞的混合体外产生了具有FAPCAR构建体的瞬时mRNA表达的小鼠T细胞(如以上所描述的)。将5μgLNP/100万个T细胞在T细胞培养基中组合并在指定时间点经由流式细胞术测定FAPCAR表达。
流式细胞术
用加His-标签的重组FAP(Abcam ab271506)和兔-抗His-PE(Cell SignalingTech 15024S)，将经由阴性选择(StemCell Technologies 19851)从小鼠脾脏分离的T细胞对FAPCAR表达染色。使用Accuri C6 Plus或者BD LSR II(BD Biosciences San Jose,CA)测定细胞。所有图的设门策略首先是使用FSC-A/FSC-H选择淋巴细胞(FSC-A/SSC-A)和单一细胞(图5A)。初步实验包括活-死可固定绿色染色(live-dead fixable green，InvitrogenL34970)，其中通过该设门策略所分析的淋巴细胞为≥98％活的。使用FlowJo软件(10.7.1版，BD Ashland,OR)产生图。
体外杀伤测定
根据生产商的建议，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen 11668027)，通过用鼠科FAP和荧火虫荧光素酶质粒转染HEK293T细胞(ATCC CRL-3216)制备靶标细胞。在转染至96-孔板并与指定比例的FAPCAR T细胞共培养过夜后48小时，将3000个靶标细胞重新铺板。用DPBS清洗细胞，然后裂解并根据生产商的建议(Promega E151A)在PerkinElmer VictorX3酶标仪(Waltham,MA)上测定荧光素酶发光。荧光素酶减少表明通过功能性FAPCAR T细胞消除了表达FAP的HEK293T靶标细胞。杀伤效率等于100-((测试RLU/无T细胞平均RLU)*100)，其中RLU是相对发光单位。
组织学
将组织在4％多聚甲醛中固定过夜并且用乙醇逐步脱水。根据标准规程进行苏木精和伊红(H&E)染色。如前所述，通过费城研究所儿童医院(the Children's Hospital ofPhiladelphia Research Institute)的病理学核心实验室(Pathology Core Laboratory)完成天狼猩红(PSR染色(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433)。使用DMi8S广视野显微镜(配备有4X/0.13 HC PL FLUOTAR和20X/0.80 PH2 HC PL APO物镜)，使用DFC7000 T照相机，SP8共聚焦(配备有HydD检测器，20X/0.5 HC LP FLUOTAR和63X/1.40 HC PL APOCS2物镜)并使用默认设置通过Lightning去卷积(Leica Microsystems,Buffalo Grove,IL)，获得图像。基于在至少4个心脏切片/小鼠中，在ImageScope(Aperio)软件中的PSR染色的颜色去卷积，无分别地定量室和隔膜两者的纤维化百分比。
统计学
使用学生t检验评价两组之间的差异。使用单因素方差分析(ANOVA)确定多个组的显著性。使用Tukey事后多重比较检验进一步分析显著ANOVA结果(p<0.05)。误差线表示平均标准误差(SEM)。计算统计量并使用RStudio(1.4.1106版,Boston,MA)和ggplot2(3.3.3版)在R(4.0.5版，Rproject.org)中产生图。绘制卡通图并在Illustrator(25.3.1版，AdobeInc.San Jose,CA)中编译图。
现在描述实验结果。
产生了编码设计针对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(激活的成纤维细胞的标志物)的CAR的含有修饰的核苷的mRNA，并将其在靶向CD5的LNP中包装(称为“靶向抗体/LNP-mRNA载物”或者CD5/LNP-FAPCAR)(图1)(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433；Wang等人,2014,Cancer Immunol Res.2:154–166)。CD5通过T细胞天然表达并且是B细胞的小亚组，并且不需要T细胞效应因子功能(Boumsell等人,1980,J Exp Med,152:229–234；Soldevila等人,2011,Curr Opin Immunol,23:310–318)。作为第一个概念验证实验，将编码FAPCAR或GFP的含有修饰的mRNA的CD5/LNP与新分离的激活的鼠科T细胞体外培育48小时。靶向CD5的LNP将它们的mRNA载物递送至培养中的绝大多数的T细胞，其中如通过流式细胞术所测量的(图5A)，在暴露于CD5/LNP-GFP后78％表达GFP(图4A)并且在暴露于CD5/LNP-FAPCAR后83％的T细胞表达FAPCAR(图4B和图4C)。用同种型对照(IgG)抗体修饰并因此不明确针对淋巴细胞的LNP仅能够将mRNA体外递送至小部分(7％)T细胞(图4B和图4C)。这些LNP-产生的CAR T细胞能够以类似于病毒工程化的FAPCAR T细胞的剂量依赖性方式(图5B)有效体外杀伤表达FAP的靶细胞(图4D)。在人T细胞中，经由靶向的LNP的体外基因转移也是可能和有效的(89-93％)，如通过用CD5/LNP-GFP靶向ACH2细胞所证实的(图5C)。
然后，评价了CD5靶向的脂质纳米颗粒mRNA是否还可以有效体内重编程T细胞。据发现静脉内注射含荧光素酶mRNA的CD5/LNP(CD5/LNP-Luc)的小鼠在它们的脾脏T细胞中表达大量的荧光素酶活性，而注射同种型-对照(非靶向)IgG/LNP-Luc的小鼠不会(图6A)。在另一项实验中，CD5/LNP加载了编码Cre重组酶的mRNA(CD5/LNP-Cre)并注射至Ai6 Cre-报告分子小鼠(Rosa26CAG-LSL-ZsGreen)。基因重组的证据(ZsGreen表达)特异性地存在于来自注射CD5/LNP-Cre的动物的CD3+ T细胞中(CD4+和CD8+亚型两者)，而在CD3-(非T)细胞(主要代表B和树突状细胞和巨噬细胞)或者在注射IgG/LNP-Cre的小鼠(图6B)中几乎没有Cre重组酶活性的迹象。然后，在所建立的通过经由植入的28-天渗透性迷你泵的血管紧张素II和去氧肾上腺素(AngII/PE)的恒定输注所产生的心脏损伤和纤维化的鼠科高血压模型中，评价了靶向的LNP是否可以将FAPCAR mRNA(CD5/LNP-FAPCAR)递送至T细胞(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433；Kaur等人,2016,Circ Res.118:1906–1917)。将小鼠损伤1周以允许在注射CD5/LNP-FAPCAR之前建立纤维化(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433)。在LNP注射后48小时，一致的FAPCAR T细胞群体(17.5-24.7％)排它地存在于接受CD5/LNP-FAPCAR的小鼠中(图6C、图6D和图7)。相反，非靶向(IgG/LNP-FAPCAR)和靶向的含有GFP的LNP(CD5/LNP-GFP)不产生FAPCAR T细胞(图6C、图6D和图7)。
先前已将CAR T细胞疗法与称为胞啃的过程相关，其中淋巴细胞通过来自抗原-递呈细胞的免疫学突触提取表面分子(Hamieh等人,2019,Nature,568:112–116；Joly等人,2003,Nat Immunol,4:815–815；Martínez-Martín等人,2011,Immunity.35:208–222)(图8A)。作为原位产生功能性FAPCAR T细胞的进一步支持，实施实验以确定通过CD5/LNP-FAPCAR mRNA体内产生的FAPCAR T细胞还是继承性转移的离体病毒工程化的CAR T细胞显示出胞啃迹象。首先，将逆转录病毒-工程化的FAPCAR T细胞与过表达加RFP标签的FAP的HEK293T细胞体外混合并通过活体成像共聚焦显微镜检查观察胞啃(图8B)。来自用继承性转移的病毒转导的加GFP标签的FAPCAR T细胞处理的AngII/PE损伤动物的脾脏的免疫荧光分析在脾脏的白髓区显示出广泛的FAP染色，这在用对照T细胞处理的损伤动物或未损伤动物中未观察到(图8C图9)。将损伤并处理的动物脾脏中的FAP+细胞对GFP共染色，其表明它们是转导的细胞。此外，FAP染色显示为与胞啃一致的胞质斑点(图8D)。胞啃可以以多种方式，特别是通过抗原扩散增强免疫应答(Bossart,2020,Clin Cancer Res,26:4442–4447)。与这种情况一致，在损伤/处理动物脾脏中观察到了一些FAP+/GFP-阴性细胞，这在对照中未观察到(图8D箭头)。还在用CD5/LNP-FAPCAR疗法处理的损伤动物脾脏中观察到了含有FAP+斑点的CD3+淋巴细胞，但是在用IgG/LNP-FAPCAR对照处理的那些中未观察到(图8E)。尚无有关在疗法后在脾脏中显示出胞啃的CAR T细胞的已知在先报道，这可能是因为在先研究集中在针对淋巴细胞标志物的CAR T细胞，这些标志物在脾脏中难以与内源表达相区分。这些发现与CD5/LNP-FAPCAR处理后体内产生的功能性抗FAP CAR T细胞一致。
然后，如前所观察的，评价了CD5/LNP-FAPCAR处理是否能够改善损伤小鼠中的心脏功能(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430-433)。为了测试这种情况，通过经由28-天渗透性迷你泵递送的AngII/PE在小鼠中引起心脏损伤。1周后，当纤维化明显时(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433)，静脉内注射10μg LNP。注射后2周，通过超声波心动描记法分析心脏功能(图10A)。在用体内产生的、瞬时FAPCAR T细胞处理的损伤小鼠中观察到了标记的功能性改善，这与使用继承性转移的病毒FAPCAR T细胞的上述研究一致。用CD5/LNP FAPCAR处理的AngII/PE-损伤小鼠显示出正常的左心室(LV)舒张末期和收缩末期容积(图10B和图10C)。另外，与先前研究一致(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433)，在CD5/LNP-FAPCAR注射后，体重归一化的LV质量(以M模式估计)未显示出统计学显著差异，尽管与对照损伤小鼠相比注意到改善趋势(图10D)。重要地，LV舒张功能(E/e')返回未损伤水平(图10E)。LV收缩功能也显著改善，如通过射血分数(图10F)和整体纵向应变(图10G和图10H)所测量的。非靶向IgG/LNP-FAPCAR的注射不改变LV功能(图11)。在靶向LNP处理后，在舒张和收缩功能两者中观察到显著改善。与先前结果一致(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433)，在处理动物中仅观察到了心脏重量与体重之比(心脏肥大的量度)的微小修正(图13A)。如通过用天狼猩红染色所评价的，组织学分析突出显示了在用CD5/LNP169 FAPCAR处理的损伤小鼠和用盐水或IgG/LNP-FAPCAR对照处理的那些小鼠之间胞外基质的整体负担的显著改善(图12A、图12B、图13B和图13C)。此外，除由不表达FAP的激活的成纤维细胞所产生的持久性血管周围纤维化外，处理动物亚组(12只中的5只)与未损伤对照难以区分(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433)(图13D箭头)。其中通过基因消融或用病毒转导的CART细胞处理消除表达FAP的激活的成纤维细胞的在先研究还已显示出血管周围纤维化的持久性(Aghajanian等人,2019,Nature.573:430–433；Kaur等人,2016,Circ Res.118:1906–1917)。因此，CD5/LNP-FAPCAR处理导致功能改善和间质性纤维化减小。重要地，在CD5/LNP-FAPCAR注射后，在非心脏器官中未观察到总体组织学变化(图14)。
这些实验结果提供了证实可以静脉内递送包封在靶向的LNP中的修饰的mRNA以体内产生功能性工程化T细胞的数据。修饰的mRNA/LNP SARS-CoV-2疫苗的显著成功和安全性已刺激大量工作来延伸这种治疗平台以解决多种病理学。通过将LNP靶向特定细胞类型，如本文对于淋巴细胞所证实的，修饰的mRNA治疗剂可能具有远大的应用。对于某些病症，使用mRNA体内产生工程化T细胞是吸引人的，因为所产生的CAR T细胞的瞬时性质可能限制毒性并允许准确剂量施用。不同于癌症患者，患有纤维化病症的那些患者可能不需要完全除去病理性细胞(激活的成纤维细胞)，但是可能在症状上受益于疾病负担的整体降低。此外，靶向的LNP-mRNA技术提供了滴定剂量施用和根据需要重新剂量施用的有利能力。将需要今后的研究来优化剂量施用策略、LNP组成和靶向方法以进一步增强治疗效果和限制潜在毒性。尽管如此，能够工程化特定免疫功能的“现成”治疗剂的可能性为用于解决心力衰竭及其他纤维化病症的巨大医学负担的可放大且可承受途径提供了希望。
本文所引用的每篇专利、专利申请和专利公开的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。尽管已参考具体实施方式公开了本发明，但是显然在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域其他技术人员可以设计本发明的其他实施方式和变化。所附权利要求旨在视为包括所有这些实施方式和等价变化。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会(THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OFPENNSYLVANIA)
哈明德·帕尔兹(Parhiz, Hamideh)
德鲁·韦斯曼(Weissman, Drew)
伊斯特万·通巴兹(Tombacz, Istvan)
<120> mRNA治疗剂对T细胞的体内靶向
<130> 046483-6214-00WO
<150> US 63/090,985
<151> 2020-10-13
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 494
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 1
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1 5 10 15
Leu Ala Ala Phe Cys Leu Gly Gln Ser Gly Arg Gly Gly Leu Asp Ile
20 25 30
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Lys Val Gln Ser Arg Leu Val Gly Gly Ser Ser Val Cys Glu Gly Ile
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<213> 人
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Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Arg Leu Ser Trp Tyr Asp Pro Asp
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<213> 人
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的，鼠-FAPCAR
<400> 5
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<212> DNA
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<220>
<223> 化学合成的，鼠-FAPCAR
<400> 6
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60
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cgctacggct actacgccat ggactactgg ggccagggca tctccgtgac cgtgtcctcc 420
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accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg cagaccctgg ccccccgcta a 1491
<210> 7
<211> 1491
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的，鼠-FAPCAR
<400> 7
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ucccgcaacu cccgccgcaa ccgccugcug caggugacca ccaugaacau gaccccccgc 1080
cgccccggcc ugacccgcaa gcccuaccag cccuacgccc ccgcccgcga cuucgccgcc 1140
uaccgccccc gcgccaaguu cucccgcucc gccgagaccg ccgccaaccu gcaggacccc 1200
aaccagcugu acaacgagcu gaaccugggc cgccgcgagg aguacgacgu gcuggagaag 1260
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<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的，Mu-FAPCAR-Mu-CD28Z-P2A-RISR-RIAD
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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145 150 155 160
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile
165 170 175
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
180 185 190
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Val Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
245 250 255
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的，Mu-FAPCAR-Mu-CD28Z-P2A-RISR-RIAD
<400> 9
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60
cccggctccc aggtgcagct gaaggagtcc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggctcc 120
ctgaagctgt cctgcgccgc ctccggcttc accttctcct cctacggcat gtcctgggtg 180
cgccagaccg ccgacaagcg cctggagctg gtggccacca ccaacaacaa cggcggcgtg 240
acctactacc ccgactccgt gaagggccgc ttcaccatct cccgcgacaa cgccaagaac 300
accctgtacc tgcagatgtc ctccctgcag tccgaggaca ccgccatgta ctactgcgcc 360
cgctacggct actacgccat ggactactgg ggccagggca tctccgtgac cgtgtcctcc 420
ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc tccggcggcg gctccgacgt gctgatgacc 480
cagacccccc tgtccctgcc cgtgtccctg ggcgaccagg cctccatctc ctgccgctcc 540
tcccagtcca tcgtgcactc caacggcaac acctacctgg agtggtacct gcagaagccc 600
ggccagtccc ccaagctgct gatctacaag gtgtccaacc gcttctccgg cgtgcccgac 660
cgcttctccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccgtga agatctcccg cgtggaggcc 720
gaggacctgg gcgtgtacta ctgcttccag ggctcccacg tgccctacac cttcggcggc 780
ggcaccaagc tggagatcaa ggccgccgcc accaccacca agcccgtgct gcgcaccccc 840
tcccccgtgc accccaccgg cacctcccag ccccagcgcc ccgaggactg ccgcccccgc 900
ggctccgtga agggcaccgg cctggacttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccccctg 960
gccggcatct gcgtggccct gctgctgtcc ctgatcatca ccctgatctg ctaccaccgc 1020
tcccgcaact cccgccgcaa ccgcctgctg caggtgacca ccatgaacat gaccccccgc 1080
cgccccggcc tgacccgcaa gccctaccag ccctacgccc ccgcccgcga cttcgccgcc 1140
taccgccccc gcgccaagtt ctcccgctcc gccgagaccg ccgccaacct gcaggacccc 1200
aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc cgccgcgagg agtacgacgt gctggagaag 1260
aagcgcgccc gcgaccccga gatgggcggc aagcagcagc gccgccgcaa cccccaggag 1320
ggcgtgtaca acgccctgca gaaggacaag atggccgagg cctactccga gatcggcacc 1380
aagggcgagc gccgccgcgg caagggccac gacggcctgt accagggcct gtccaccgcc 1440
accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg cagaccctgg ccccccgcgg ctccggcgcc 1500
accaacttct ccctgctgaa gcaggccggc gacgtggagg agaaccccgg ccccgagtcc 1560
aagcgccgcc aggaggaggc cgagcagcgc aagctggagc agtacgccaa ccagctggcc 1620
gaccagatca tcaaggaggc caccgagtaa 1650
<210> 10
<211> 1650
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的，Mu-FAPCAR-Mu-CD28Z-P2A-RISR-RIAD
<400> 10
auggcccugc ccgugaccgc ccugcugcug ccccuggccc ugcugcugca cgccgcccgc 60
cccggcuccc aggugcagcu gaaggagucc ggcggcggcc uggugcagcc cggcggcucc 120
cugaagcugu ccugcgccgc cuccggcuuc accuucuccu ccuacggcau guccugggug 180
cgccagaccg ccgacaagcg ccuggagcug guggccacca ccaacaacaa cggcggcgug 240
accuacuacc ccgacuccgu gaagggccgc uucaccaucu cccgcgacaa cgccaagaac 300
acccuguacc ugcagauguc cucccugcag uccgaggaca ccgccaugua cuacugcgcc 360
cgcuacggcu acuacgccau ggacuacugg ggccagggca ucuccgugac cguguccucc 420
ggcggcggcg gcuccggcgg cggcggcucc uccggcggcg gcuccgacgu gcugaugacc 480
cagacccccc ugucccugcc cgugucccug ggcgaccagg ccuccaucuc cugccgcucc 540
ucccagucca ucgugcacuc caacggcaac accuaccugg agugguaccu gcagaagccc 600
ggccaguccc ccaagcugcu gaucuacaag guguccaacc gcuucuccgg cgugcccgac 660
cgcuucuccg gcuccggcuc cggcaccgac uucaccguga agaucucccg cguggaggcc 720
gaggaccugg gcguguacua cugcuuccag ggcucccacg ugcccuacac cuucggcggc 780
ggcaccaagc uggagaucaa ggccgccgcc accaccacca agcccgugcu gcgcaccccc 840
ucccccgugc accccaccgg caccucccag ccccagcgcc ccgaggacug ccgcccccgc 900
ggcuccguga agggcaccgg ccuggacuuc gccugcgaca ucuacaucug ggccccccug 960
gccggcaucu gcguggcccu gcugcugucc cugaucauca cccugaucug cuaccaccgc 1020
ucccgcaacu cccgccgcaa ccgccugcug caggugacca ccaugaacau gaccccccgc 1080
cgccccggcc ugacccgcaa gcccuaccag cccuacgccc ccgcccgcga cuucgccgcc 1140
uaccgccccc gcgccaaguu cucccgcucc gccgagaccg ccgccaaccu gcaggacccc 1200
aaccagcugu acaacgagcu gaaccugggc cgccgcgagg aguacgacgu gcuggagaag 1260
aagcgcgccc gcgaccccga gaugggcggc aagcagcagc gccgccgcaa cccccaggag 1320
ggcguguaca acgcccugca gaaggacaag auggccgagg ccuacuccga gaucggcacc 1380
aagggcgagc gccgccgcgg caagggccac gacggccugu accagggccu guccaccgcc 1440
accaaggaca ccuacgacgc ccugcacaug cagacccugg ccccccgcgg cuccggcgcc 1500
accaacuucu cccugcugaa gcaggccggc gacguggagg agaaccccgg ccccgagucc 1560
aagcgccgcc aggaggaggc cgagcagcgc aagcuggagc aguacgccaa ccagcuggcc 1620
gaccagauca ucaaggaggc caccgaguaa 1650

Claims (23)

1.组合物，其包含缀合至靶向结构域的至少一种递送媒介物，其中所述靶向结构域特异性结合至T细胞的细胞表面抗原，并且进一步其中所述递送媒介物包含至少一种试剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述T细胞的所述细胞表面抗原选自CD1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6和CCR7。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述T细胞的所述细胞表面抗原是泛T抗原。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述泛T抗原选自CD2、CD3、CD5和CD7。
5.根据权利要求1所述的组合物，还包括一种或多种缀合至靶向结构域的另外的递送媒介物，其中靶向结构域特异性结合至T细胞的细胞表面抗原，其中所述递送媒介物包含至少一种试剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含至少两种缀合至T细胞靶向结构域的递送媒介物，其中每种靶向结构域靶向不同的T细胞抗原。
7.根据权利要求6所述的组合物，其包含缀合至T细胞靶向结构域的第一递送媒介物，其中所述第一递送媒介物的靶向结构域靶向选自下列的抗原：CD1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6和CCR7，和缀合至T细胞靶向结构域的第二递送媒介物，其中所述第二递送媒介物的靶向结构域靶向选自下列的抗原：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6和CCR7。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述第一递送媒介物的靶向结构域靶向CD8并且所述第二递送媒介物的靶向结构域靶向CD4。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含至少两种缀合至T细胞靶向结构域的递送媒介物，其中每种递送媒介物包含不同的试剂。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述递送媒介物选自脂质体、脂质纳米颗粒和胶束。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述递送媒介物是脂质纳米颗粒。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含缀合至靶向结构域的PEG-脂质。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述至少一种试剂被包封在所述脂质纳米颗粒中。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述至少一种试剂选自治疗剂、成像剂、诊断剂、造影剂、标记剂、检测剂和清毒剂。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述至少一种试剂是治疗剂。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述治疗剂包含核苷修饰的核酸分子。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述核酸分子包含mRNA分子。
18.根据权利要求14所述的组合物，其中所述治疗剂包含编码嵌合抗原受体的核苷修饰的核酸分子。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中靶向结构域选自核酸分子、肽、抗体和小分子。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中靶向结构域是抗体。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中靶向结构域是抗CD5抗体。
22.治疗或预防对其有需要的受试者中疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-21中任一项所述的组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述疾病或病症选自癌症、传染性疾病和免疫学病症。
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