JP2023546067A - ｍＲＮＡ治療剤のためのＴ細胞のインビボ標的化 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｔ細胞の細胞表面抗原に特異的に結合するターゲティングドメインにコンジュゲートされていて少なくとも１つの薬剤を含む少なくとも１つの送達用担体を含む組成物に関する。本発明は、がん、感染性疾患、および免疫障害を含む疾患または障害を、記載されている組成物を用いて治療または予防する方法にも関する。

Description

関連する出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１３日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第６３／０９０，９８５号の優先権を主張するものであり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
連邦が資金援助した研究または開発に関する宣言
本発明は政府のサポートを得て、アメリカ国立衛生研究所によって資金援助されたＡＩ０４５００８のもとでなされた。政府は本発明に所定の権利を有する。
活性化、阻害、または修飾を通じて免疫細胞を調節してその特性を変化させることが、一般的で要望の多いタイプの１つの療法になっており、免疫療法と呼ばれている。現在、ＣＡＲ Ｔ細胞はエクスビボで作製されているが、それにはコストと時間がかかる。それに加え、これは、非常に悪性のがんを有する患者や、Ｔ細胞の数が非常に少ない患者にとって、治療の選択肢ではない。ＣＡＲ Ｔ細胞と他の治療剤を安定かつ迅速に生成させるため、インビボでＴ細胞を標的とするｍＲＮＡの送達系を開発することが強く必要とされている。ｍＲＮＡに基づくＣＡＲ Ｔ細胞治療剤は、その一過性であるという性質のほか、ゲノムに組み込まれるリスクが回避されるという理由でＣＡＲ Ｔ細胞によって誘導される毒性のリスクが小さくなることにより、より安全なプラットフォームを提供できる可能性もある。ＣＡＲ Ｔ細胞が一過性に存在することは、特定の病原性細胞を短期間に減らす必要がある多くの疾患（心筋線維症、自己免疫疾患、および他の多くの疾患などの治療）にも適用できると考えられる。
ｍＲＮＡに基づく治療剤を開発する際の鍵となる１つの障害は、効率的なインビボ送達である。したがって本分野では、ｍＲＮＡに基づく現在の免疫療法の導入および大規模な利用と、ｍＲＮＡに基づく新しいクラスのロバストな免疫療法の生成のための、効率的で安全で免疫細胞特異的なｍＲＮＡ送達系が必要とされている。本発明は、この満たされていない要求に応える。
本発明の実施形態の以下の詳細な記述は、添付の図面と合わせて読むときによりよく理解されよう。本発明が図面に示されている実施形態に正確に一致する構成と装置に限定されないことを理解すべきである。
図１Ａは、インビボで標的において発現させるｍＲＮＡ－ＬＮＰの生体内分布を示す実験例の結果を示す。標的向けと非標的向けのルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＬＮＰを注射されたマウスの脾臓から取得したＣＤ３＋細胞調製物におけるタンパク質１ｍｇ当たりのＬＵ値としてのルシフェラーゼｍＲＮＡの定量的発現。
図２Ａと図２Ｂは、異なるＴ細胞サブタイプによるＣｒｅ ｍＲＮＡ－ＬＮＰのインビボ取り込みを示す実験例の結果を示す。図２Ａは、１０μｇのＣｒｅ ｍＲＮＡ－ＬＮＰで治療してから２４時間後の時点で脾臓を回収し、Ｔ細胞サブポピュレーションの中のＺｓＧｒｅｅｎ１＋細胞の％をフローサイトメトリーを利用して求めた実験からのデータを示す。それぞれの記号は１匹の動物を表わし、水平な線は、ＳＥＭ付きの平均を示す。図２Ｂは、異なるＴ細胞サブタイプの中でＺｓＧｒｅｅｎ１陽性細胞を同定するのに利用するゲーティング戦略を示す。
図３は、ＣＤ５を標的とする送達とＦＡＰ ＣＡＲ Ｔのインビボ産生の模式図を示す。
図４Ａ～図４Ｄは、ＣＤ５を標的とする脂質ナノ粒子がインビトロでｍＲＮＡに基づく機能的ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を生成させることを示す。図４Ａと図４Ｂは、ＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＧＦＰ、またはＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲのいずれかとともにインキュベートしてから４８時間後のマウスＴ細胞における（図４Ａ）ＧＦＰと（図４Ｂ）ＦＡＰＣＡＲの発現の代表的なフローサイトメトリーを示す。図４Ｃは、生物学的に独立なレプリケート（ｎ＝４）からのマウスＴ細胞でＦＡＰＣＡＲに関して陽性に染色されたものの定量結果（パーセント）を示す。図４Ｄは、生物学的に独立なレプリケート（ｎ＝３）において、ＦＡＰを発現している標的ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を一晩混合し、殺傷効率を調べた結果を示す。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍである。
図５Ａ～図５Ｃは、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲがインビトロでｍＲＮＡに基づく機能的ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を生成させることを示す。図５Ａは、フローサイトメトリーのための代表的なゲーティング戦略を示す。図５Ｂは、２つの生物学的に独立なレプリケートからのＦＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞の数を増やすと標的ＦＡＰ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞アッセイの殺傷が増加することを示すデータを示す。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。図５Ｃは、インビトロでＣＤ５／ＬＮＰ－ＧＦＰと混合してから２４時間後にヒトＡＣＨ２不死化Ｔ細胞がＧＦＰを発現することを示すデータを示す。
図６Ａ～図６Ｄは、ＣＤ５を標的とする脂質ナノ粒子がインビボでｍＲＮＡに基づくＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を生成させることを示す。図６Ａは、８μｇの対照ＩｇＧ／ＬＮＰ－ＬｕｃまたはＣＤ５／ＬＮＰ－Ｌｕｃを静脈内注射してから２４時間後のＣＤ３＋脾臓細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すデータを示す。棒グラフは２つの生物学的に独立なレプリケートを表わす。図６Ｂは、Ａｉ６マウス（ＲｏｓａＣＡＧ－ＬＳＬ ＺｓＧｒｅｅｎ）に３０μｇの標的なし／ＬＮＰ－Ｃｒｅ（ＮＴ）、ＩｇＧ／ＬＮＰ－Ｃｒｅ、またはＣＤ５／ＬＮＰ－Ｃｒｅを注射したことを示すデータを示す。２４時間後、ＺｓＧｒｅｅｎの発現が（８１．１％）ＣＤ４＋脾臓細胞と（７５．６％）ＣＤ８＋脾臓細胞において観察されたが、多くの（１５．０％）ＣＤ３－脾臓細胞では観察されなかった。棒グラフは２つの生物学的に独立なレプリケートを表わす。図６Ｃは、１０μｇのＬＮＰを注射してから４８時間後にＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷マウスの脾臓からＴ細胞を単離したことを示すデータを示す。代表的なフローサイトメトリー分析は、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲを注射した動物ではＦＡＰＣＡＲが発現するが、対照生理食塩水、ＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ、またはＣＤ５／ＬＮＰ－ＧＦＰを注射した動物では発現しないことを示す。図６Ｄは、ＣにおいてＦＡＰＣＡＲに関して陽性に染色されたマウスＴ細胞の定量結果を示すデータを示す。２つの別々のコホートの中の群ごとにｎ＝２匹の生物学的に独立なマウス。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍである。
図７は、ＣＤ５を標的とする脂質ナノ粒子がインビボでｍＲＮＡに基づくＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を生成させることを示すデータを示す。ＡｎｇＩＩ／ＰＥを用いて１週間損傷させ、ＬＮＰを投与してから４８時間後の動物から単離された脾臓Ｔ細胞からのフローサイトメトリー散乱プロットは、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲの注射でのみＦＡＰＣＡＲ染色を示し、生理食塩水、標的なし（ＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ）、または（ＣＤ５／ＬＮＰ ＧＦＰ）ＬＮＰ対照を含有していてＣＤ５を標的とする無関係のｍＲＮＡでは、染色を示さない。
図８Ａ～図８Ｅは、ＡｎｇＩＩ／ＰＥで損傷させてＦＡＰＣＡＲで治療した動物においてのみ、ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞が、活性化された心臓線維芽細胞からＦＡＰを齧り、ＦＡＰを脾臓に戻すことを実証する代表的な実験データを示す。図８Ａは、ＦＡＰＣＡＲを発現しているＴ細胞が、活性化された線維芽細胞からＦＡＰを齧る模式図を示す。図８Ｂは、２個のＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞の共焦点タイム－ラプス顕微鏡写真を示しており、最初に４０分（矢印）と８５分（矢頭）の時点で免疫シナプスが形成し、次いでＨＥＫ２９３Ｔ細胞からＲＦＰ－ＦＡＰ（マゼンタ色）が齧られる（８５分（矢印）と１５０分（矢頭）の時点でＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞の中に輝点が見られる）。図８Ｃは、１０７個のＭｉｇＲ１－対照Ｔ細胞を養子移入してから２４時間後の非損傷動物、１０７個のＦＡＰＣＡＲ－ＧＦＰ Ｔ細胞を養子移入してから２４時間後の非損傷動物、１０７個のＭｉｇＲ１－対照Ｔ細胞を養子移入してから４８時間後のＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷（７日間）動物、および１０７個のＦＡＰＣＡＲ－ＧＦＰ Ｔ細胞を養子移入してから４８時間後のＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷（７日間）動物の脾臓をＦＡＰで染色した広視野画像を示す（白脾髄領域が点線によって強調されている）。スケール棒：１００μｍ。図８Ｄは、１０７個のＦＡＰＣＡＲ－ＧＦＰ Ｔ細胞を養子移入してから４８時間後のＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷（７日間）動物の脾臓の白脾髄領域におけるＦＡＰ（マゼンタ色）とＦＡＰＣＡＲ－ＧＦＰ（黄色）の共焦点顕微鏡写真を示す。代表的なＦＡＰＣＡＲ＋ Ｔ細胞のＭａｘ－Ｚ射影（左下の小さな写真）と単一のＺ切片（右下の小さな写真）。スケール棒：１０μｍ。図８Ｅは、１０μｇのＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲまたはＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲを４８時間にわたって注射したＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷（７日間）動物からのＦＡＰで染色した脾臓の白脾髄領域（点線の輪郭線）の共焦点顕微鏡写真を示す。ＦＡＰ（灰色とマゼンタ色）とＣＤ３（黄色）が、特にＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ治療条件において重なっている。スケール棒：１００μｍ（上の行；灰色スケール）または１０μｍ（下の行；マージ疑似カラー）。
図９は、ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞が、ＡｎｇＩＩ／ＰＥによって損傷させＦＡＰＣＡＲによって治療した動物においてのみ、活性化された心臓線維芽細胞からＦＡＰを齧り、ＦＡＰを脾臓に戻すことを実証するデータを示す。齧作用の証拠は、１０７個のＦＡＰＣＡＲ－ＧＦＰ Ｔ細胞（同数のＭｉｇＲ１－対照Ｔ細胞の注射ではない）を養子移入してから１、２、および２８日後の時点で、ＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷（７日間）動物の脾臓白脾髄に限定される。養子移入してから１２週間後、脾臓内のＦＡＰ＋ Ｔ細胞の数は劇的に減少するが、稀な細胞を観察することができる。
図１０Ａ～図１０Ｈは、インビボで生成した一過性ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞が損傷後の心機能を改善することを実証する代表的な実験データを示す。野生型成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、埋め込んだ２８日浸透圧ミニポンプを通じて連続的に生理食塩水またはＡｎｇＩＩ／ＰＥを投与した。圧力過負荷損傷の１週間後、標的に向かうＬＮＰを注射した。マウスをさらに２週間後に分析した。図１０Ａは、実験の時系列の模式的表示を示す。１０μｇのＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲを１回だけ注射した後、心エコー測定は、左心室（ＬＶ）体積、拡張期機能、および収縮期機能の改善を示す。（図１０Ｂ）拡張終期と（図１０Ｃ）収縮終期の体積（μＬ）の測定。図１０Ｄは、体重で規格化したＬＶの質量（ｍｇ／ｇ）のＭモード推定を示す。拡張期機能（図１０Ｅ）（ＬＶ充満圧の推定であるＥ／ｅ’）（図１０Ｆ）駆出率（％）、および（図１０Ｇ）全長軸方向ストレイン。図１０Ｈは、代表的なｍモード心エコー検査画像を示す。データは、３つのコホートに広がる群ごとにｎ＝７、７、８匹の生物学的に独立なマウスを表わす，。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍである。示されているｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０５の後のテューキーの事後検定からのものである。
図１１Ａ～図１１Ｂは、インビボで生成した一過性ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞が損傷後の心機能を改善することを実証する代表的な実験データを示す。図１１Ａは、マウスの体重と、（図１１Ｂ）Ａｖｅｒｔｉｎ麻酔下で測定した心拍数を示す。図１１Ｃは、短縮率（％）が収縮期に改善を示すのがＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲで治療した動物においてのみで、対照動物ではそうでないことを示す。
図１２Ａ～図１２Ｂは、インビボで生成したＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞が損傷後の心筋線維化を変化させることを実証する代表的な実験データを示す。ＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷動物に１０μｇのＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲを１回だけ注射してから２週間後のピクロシリウスレッド組織学的分析。図１０Ａからの実験の時系列を参照されたい。図１２Ａは、損傷がないモック動物（生理食塩水ポンプ埋め込みの３週間後＋１週間の時点で生理食塩水注射）、損傷した対照動物（ＡｎｇＩＩ／ＰＥ＋生理食塩水）、標的に向かわないアイソタイプＬＮＰ対照（ＡｎｇＩＩ／ＰＥ＋ＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ）、および治療した動物（ＡｎｇＩＩ／ＰＥ＋ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ）の心臓冠動脈切片におけるピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色でコラーゲン（ピンク色）が強調されることを示す。インセットは左心室心筋の拡大図を示す。スケール棒：１００μｍ。図１２Ｂは、図１２Ａに見られる心室の線維症の割合の定量結果を示す。５つのコホートに広がる群ごとにｎ＝８、１１、１２匹の生物学的に独立なマウス。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍである。示されているｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０５の後のテューキーの事後検定からのものである。
図１３Ａ～図１３Ｃは、インビボで生成したＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞が損傷後の心筋線維化を変化させることを実証する代表的な実験データを示す。図１３Ａは、図１２に示した投与を受けた全動物からの心臓をピクロシリウスレッド染色（ＰＳＲ）した代表例を示す。図１３Ｂは、ＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷で体重に対する心臓の重量の比（ＨＷ／ＢＷ、ｍｇ／ｇ）が増加し、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ治療の後に部分的に回復することを示す。図１３Ｃは、図１３Ａに見られる心室の線維症の割合の定量結果が、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲで治療した動物においてのみ線維症から回復することを示すことを実証するデータを示す。５つのコホートに広がる群ごとにｎ＝８、１１、１２、１２匹の生物学的に独立なマウス。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍである。示されているｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０５の後のテューキーの事後検定からのものである。
図１４は、３週間の生理食塩水またはＡｎｇＩＩ／ＰＥ圧力過負荷損傷の後に示されている注射（生理食塩水またはＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ）をしてから２週間後のさまざまな臓器のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な実験データを示す。
詳細な説明
本開示により、対象における疾患（例えばがん）を治療または予防する組成物と方法として、対象の免疫細胞をインビボで遺伝的にプログラムして標的細胞（例えばがん細胞）を標的として破壊し、そのことによって疾患（例えばがん）を治療または予防することを含む免疫療法のアプローチを用いることによる組成物と方法が提供される。さまざまな実施形態では、本開示によって提供されるのは、対象の免疫細胞（その非限定的な例は、任意のクラスの骨髄細胞（例えば好中球、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および単球）、または任意のクラスのリンパ球（例えばＴ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、またはメモリＴ細胞）、Ｂ細胞（例えば形質細胞とメモリＢ細胞）、およびナチュラルキラー細胞）などである）を特異的に標的とするように操作された送達用担体（例えばリポソームまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））である。さまざまな実施形態では、送達用担体は、プログラムまたは修飾される標的免疫細胞に送達用担体を結合させることのできる１つ以上の細胞ターゲティング部分（例えばタンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、小分子、アプタマー、ビタミン、核酸分子など）を含む。さまざまな実施形態では、送達用担体は、１つ以上の核酸分子（例えばｍＲＮＡ、発現ベクター、またはゲノム編集ベクター）のカーゴを含む。本明細書では、「ゲノム編集ベクター」という用語は、ゲノム編集系の構成要素（その非限定的な例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質、塩基エディタ、またはプライムエディタ、および関連する必要なあらゆる構成要素（適切なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）など）などである）をコードする核酸分子を意味する。Ｋａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．， “ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＤＮＡ Ｂａｓｅ－Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ，” Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ， ２０２０； ２１； ｐ．６２４０を参照されたい（その内容は参照によって組み込まれている）。
送達用担体が標的免疫細胞によって（例えばエンドサイトーシスによって）細胞に取り込まれた後、カーゴ核酸はエンドソームから放出される。カーゴ核酸は、放出されると、例えば標的細胞（例えばがん細胞）に対して特異的な１つ以上の合成表面受容体をｍＲＮＡ、ベクター、またはゲノム編集に基づいて発現させることにより、対象の標的免疫細胞を修飾する。前記１つ以上の表面受容体は、標的細胞（例えばがん細胞）に対して特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む可能性がある。前記１つ以上の表面受容体は、標的細胞（例えばがん細胞）に対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も含む可能性がある。プログラムまたは修飾された免疫細胞は、標的細胞（例えばがん細胞）に結合すると標的細胞の破壊（例えばＴ細胞を媒介とした細胞傷害性）を容易にし、そのことによって対象における疾患を治療または予防する。
さまざまな実施形態において、本発明は、Ｔ細胞ターゲティングドメインにコンジュゲートされていて少なくとも１つの薬剤を含む送達用担体を有する組成物に関する。一実施形態では、Ｔ細胞ターゲティングドメインが結合するのは、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、またはＣＣＲ７である。
一実施形態では、Ｔ細胞ターゲティングドメインはｐａｎ－Ｔ抗原に結合する。一実施形態では、ｐａｎ－Ｔ抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、またはＣＤ７である。一実施形態では、ｐａｎ－Ｔ抗原はＣＤ５である。
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞の多くのサブタイプを標的とするＴ細胞ターゲティングドメインにコンジュゲートされた送達用担体の組み合わせを含む組成物に関する。一実施形態では、この組み合わせは、Ｔ細胞を標的とする２つ以上の送達用担体を含んでおり、２つ以上のＴ細胞抗原を標的とする。一実施形態では、その２つ以上のＴ細胞抗原の選択は、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＣＲ７からなされる。一実施形態では、前記組み合わせは、Ｔ細胞を標的とする２つ以上の送達用担体を含んでおり、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の表面抗原とＣＤ８＋ Ｔ細胞の表面抗原を標的とする。一実施形態では、前記組み合わせは、Ｔ細胞を標的とする２つ以上の送達用担体を含んでおり、ＣＤ４とＣＤ８を標的とする。
ある実施形態では、送達用担体は、ターゲティングドメインにコンジュゲートされたＰＥＧ－脂質を含む脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの薬剤は核酸である。一実施形態では、その核酸は、ヌクレオシドが修飾された核酸分子である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの薬剤はｍＲＮＡ治療剤である。一実施形態では、前記核酸は、ヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡ治療剤である。本発明は、本明細書に記載されている組成物を用いて疾患または障害を治療する方法にも関する。
定義
特に断わらない限り、本明細書で使用されるあらゆる科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書では、以下の用語のそれぞれは、本セクションでその用語に関連付けられた意味を有する。
冠詞「１つの（ａ）」と「１つの（ａｎ）」は、本明細書では、物品の文法的対象の１つ、または２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を意味する。例えば「１つのエレメント」は、１つのエレメント、または２つ以上のエレメントを意味する。
本明細書で測定可能な値（量、持続期間など）に言及するときに用いられる「約」は、指定されている値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％の変動（本開示の方法を実施するのに適切な変動など）を包含することを意味する。
「抗体」という用語は、本明細書では、抗原またはエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。抗体として、天然供給源または組み換え供給源からのインタクト免疫グロブリンと、インタクト免疫グロブリンの免疫反応性部分が可能である。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は多彩な形態で存在することができ、形態に含まれるのは、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ）２のほか、一本鎖抗体とヒト化抗体である（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｉｎ： Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｉｎ： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。
「抗体断片」という用語は、インタクト抗体の一部と、インタクト抗体の抗原性決定可変領域を意味する。抗体断片の非限定的な例に含まれるのは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２とＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、および抗体断片から形成される多重特異性抗体である。
「抗体重鎖」は、本明細書では、全抗体分子の中にその天然の立体構造で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の大きい方を意味する。
「抗体軽鎖」は、本明細書では、全抗体分子の中にその天然の立体構造で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の小さい方を意味する。ｋ軽鎖とｌ軽鎖は２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを意味する。
「合成抗体」は、本明細書では、組み換えＤＮＡ技術を利用して作製される抗体（例えばバクテリオファージによって発現される抗体）を意味する。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって作製された抗体も意味すると解釈すべきである（ただしそのＤＮＡ分子は、抗体タンパク質、またはその抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、そのＤＮＡまたはアミノ酸配列は、本分野で利用可能で周知のＤＮＡまたはアミノ酸配列合成技術を利用して得られたものである）。この用語は、抗体をコードするＲＮＡ分子の合成によって作製された抗体も意味すると解釈すべきである。そのＲＮＡ分子は、抗体タンパク質、またはその抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、そのＲＮＡは、（合成またはクローニングされた）ＤＮＡの転写、または本分野で利用可能で周知の他の技術によって得られた。
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持することができない健康状態にあることであり、疾患が改善されない場合には動物の健康が悪化し続ける。逆に、動物における「障害」は、その動物がホメオスタシスを維持することができる健康状態だが、その動物の健康状態が、障害が不在である場合よりも不利な状態であることである。障害は、治療なしで放置されても、その動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
「有効な量」は、本明細書では、治療または予防の利益を提供する量を意味する。
「コードする」は、ポリヌクレオチドの中にあって、生物プロセスにおいて、規定された配列のヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）または規定された配列のアミノ酸のいずれかと、その結果生じる生物学的特性を有する他のポリマーと巨大分子を合成するための鋳型として機能するヌクレオチドの特定の配列（遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど）の固有の特性を意味する。したがってある遺伝子がタンパク質をコードしているのは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳により細胞または他の生物系の中でタンパク質が産生される場合である。コード鎖（そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同じであり、通常は配列リストの中に提供される）と非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡを転写するための鋳型として利用される）の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると言うことができる。
「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に機能可能に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを意味する。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞が供給すること、またはインビトロ発現系の中に供給することができる。発現ベクターには、本分野で知られているすべてのベクター、例えば組み換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば裸の、またはリポソームの中に含まれた）ＲＮＡ、およびウイルス（例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
「相同な」は、２つのポリペプチドまたは２つの核酸分子の間の配列の類似性または配列の一致を意味する。比較するその２つの配列の両方の中の１つの位置が同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットによって占められているとき（例えば２つのＤＮＡ分子それぞれの中の１つの位置がアデニンによって占められている場合）、それらの分子はその位置が相同である。２つの配列の間の相同率は、２つの配列によって共有されるマッチした位置または相同な位置の数の関数であり、その数を、比較した位置の数で割り、１００を掛ける。例えば２つの配列の中の１０の位置のうちの６つがマッチするか相同である場合には、その２つの配列は６０％相同である。例えばＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。一般に比較は、２つの配列を相同性が最大になるようにアラインメントさせて実施する。
「単離された」は、天然状態から変えられたか取り出されたことを意味する。例えば生きている動物の中に天然状態で存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その同じ核酸またはペプチドが、その天然状態の共存材料から一部または全体が分離されている場合には「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在すること、または非天然環境（例えば宿主細胞など）の中に存在することができる。
本発明の文脈では、一般に見られるヌクレオシド（Ｎ－グリコシド結合を通じてリボース糖またはデオキシリボース糖に結合した核酸塩基）に関して以下の略号を使用する。「Ａ」はアデノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンを意味し、「Ｇ」はグアノシンを意味し、「Ｔ」はチミジンを意味し、「Ｕ」はウリジンを意味する。
特に断わらない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重バージョンであって同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という表現にはイントロンも含まれていてよいが、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンではイントロンを含んでいてもよいという程度である。
「調節する」という用語は、本明細書では、対象における応答のレベルが、治療または化合物なしでのその対象における応答のレベルと比べて、および／または治療なしである以外は同じ対象における応答のレベルと比べて検出可能な増加または減少を示すことを意味する。この用語は、天然のシグナルまたは応答を擾乱し、および／または天然のシグナルまたは応答に影響を与え、そのことによって対象（好ましくはヒト）において有益な治療応答を媒介することを包含する。
特に断わらない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重バージョンであって同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質とＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含むことができる。それに加え、ヌクレオチド配列は、細胞内で翻訳機械によって翻訳することのできる修飾されたヌクレオシドを含むことができる。例えばいくつかの側面では、ヌクレオチド配列は、すべてまたはいくつかのウリジンがシュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、または別の修飾されたヌクレオシドで置き換えられたｍＲＮＡを含む。
「機能可能に連結された」という表現は、調節配列と異種核酸配列の間が機能的に連結されている結果として後者が発現することを意味する。例えば第１の核酸配列が第２の核酸配列に機能可能に連結されているのは、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれているときである。例えばプロモータがコード配列に機能可能に連結されているのは、プロモータがコード配列の転写または発現に影響を与える場合である。一般に、機能可能に連結されたＤＮＡまたはＲＮＡの配列は連続しており、必要な場合には同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域がコンジュゲートされている。
「患者」、「対象」、「個体」などという用語は本明細書では交換可能に使用され、本明細書に記載されている方法に適した任意の動物、またはその細胞（インビトロの細胞または本来の位置にある細胞のどちらでもよい）を意味する。ある非限定的な実施形態では、患者、対象、または個体はヒトである。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって核酸とポリヌクレオチドは本明細書では交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであって加水分解により単量体「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有する。単量体ヌクレオチドを加水分解してヌクレオシドにすることができる。本明細書では、ポリヌクレオチドの非限定的な例に、本分野で利用できる任意の手段によって得られるあらゆる核酸配列が含まれ、手段の非限定的な例に含まれるのは、組み換え手段、すなわち通常のクローニング技術とＰＣＲ（商標）などを利用した組み換えライブラリまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングと、合成手段である。
ある場合には、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は「ヌクレオシドが修飾された核酸」であり、これは、少なくとも１個の修飾されたヌクレオシドを含む核酸を意味する。「修飾されたヌクレオシド」は、修飾を有するヌクレオシドを意味する。例えば１００超の異なるヌクレオシド修飾がＲＮＡにおいて同定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ， ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ： １９９９ ｕｐｄａｔｅ． Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７： １９６－１９７）。
ある実施形態では、「シュードウリジン」は、別の一実施形態では、ｍ１ａｃｐ３Ｙ（１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジンを意味する。別の一実施形態では、前記用語は１Ｙ（１－メチルシュードウリジン）を意味する。別の一実施形態では、前記用語はＹｍ（２’－Ｏ－メチルシュードウリジンを意味する。別の一実施形態では、前記用語はｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）を意味する。別の一実施形態では、前記用語はｍ３Ｙ（３－メチルシュードウリジン）を意味する。別の一実施形態では、前記用語は、さらなる修飾のないシュードウリジン部分を意味する。別の一実施形態では、前記用語は、上記のシュードウリジンの任意のものの一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩を意味する。別の一実施形態では、前記用語は、本分野で知られている他のあらゆるシュードウリジンを意味する。それぞれの可能性が本発明の別の実施形態を表わす。
本明細書では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を意味する。タンパク質またはペプチドは少なくとも２個のアミノ酸を含有していなければならないが、タンパク質またはペプチドの配列が含むことのできるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いにコンジュゲートされた２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書では、前記用語は、短鎖（本分野では一般に例えばペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマートも呼ばれる）と、より長い鎖（本分野では一般にタンパク質と呼ばれ、多くのタイプのタンパク質が存在する）の両方を意味する。「ポリペプチド」には、例えば生物活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれる。
「プロモータ」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列の具体的な転写を開始させるのに必要で、細胞の合成機械または導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列と定義される。例えばバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識され、インビトロでの転写によってｍＲＮＡを生成させるのに使用されるプロモータ。
親和性リガンド（特に抗体）に関して本明細書で用いられるときの「特異的に結合する」という表現は、サンプル中の特定の抗原を認識するが、他の分子は実質的に認識しないか、他の分子には実質的に結合しない抗体を意味する。例えば１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の他の種からのその抗原にも結合できる可能性がある。しかしそのような種交差反応性そのものが抗体の分類を特異的抗体に変えることはない。別の一例では、抗原に特異的に結合する抗体は異なるアレル形態の抗原に結合することもできる。しかしそのような交差反応性そのものが抗体の分類を特異的抗体に変えることはない。いくつかの場合には、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という表現は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種の相互作用に関して使用することができ、その相互作用が化学種の表面の特定の構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する；例えば抗体はタンパク質一般よりは特定のタンパク質構造を認識してそれに結合する。ある抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合には、標識された「Ａ」とその抗体を含有する反応物の中にエピトープＡ（すなわち遊離した標識なしのＡ）を含有する分子が存在していると、その抗体に結合する標識されたＡの量は減るであろう。
「治療的」という用語は、本明細書では治療および／または予防を意味する。治療効果は、疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の抑制、減少、寛解、または消滅によって得られる。
「治療に有効な量」という表現は、研究者、獣医師、医師、または他の臨床医が実現しようとする組織、系、または対象の生物学的または医学的な応答を誘導する、対象とする化合物の量を意味する。「治療に有効な量」という表現には、投与されたときに治療中の疾患または障害の徴候または症状の１つ以上の進行を阻止するか、ある程度緩和するのに十分な化合物の量が含まれる。治療に有効な量は、化合物、疾患とその重症度、および治療される対象の年齢、体重などに応じて変化するであろう。
疾患を「治療する」という用語は、本明細書では、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度の低下を意味する。
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、本明細書では、外来核酸が宿主細胞の中に移される、または導入されるプロセスを意味する。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来核酸がトランスフェクトされた、外来核酸で形質転換された、または外来核酸を形質導入された細胞である。その細胞には初代対象細胞とその子孫が含まれる。
「転写制御下」または「機能可能に連結された」という表現は、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始とポリヌクレオチドの発現を制御するためプロモータがポリヌクレオチドとの関係で現在の位置と向きであることを意味する。
「ベクター」は、単離された核酸を含んでいてその単離された核酸を細胞の内部に送達するのに使用できる物質の組成物である。多数のベクターが本分野で知られており、その非限定的な例に含まれるのは、直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスである。したがって「ベクター」という用語には、自己複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語には、細胞への核酸の導入を容易にする非プラスミドと非ウイルス化合物（例えばポリリシン化合物、リポソームなど）が含まれるとも解釈すべきである。ウイルスベクターの非限定的な例に含まれるのは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどである。
「アルキル」は、炭素原子と水素原子のみからなる直線状の、または分岐した炭化水素鎖基であって、飽和または不飽和（すなわち１つ以上の二重結合および／または三重結合を含有する）であり、１～２４個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ２４アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ１２アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ８アルキル）、または１～６個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ６アルキル）を有し、単結合によって分子の残部に付着しているものを意味する（例えばメチル、エチル、ｎプロピル、１－メチルエチル（イソプロピル）、ｎブチル、ｎペンチル、１，１ジメチルエチル（ｔブチル）、３メチルへキシル、２メチルへキシル、エテニル、プロプ１エニル、ブト－１－エニル、ペント－１－エニル、ペンタ－１，４－ジエニル、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなど）。特に断わらない限り、アルキル基は場合により置換されている。
「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、炭素と水素のみからなる直線状の、または分岐した２価炭化水素鎖であって、分子の残部をある基に連結していて飽和または不飽和（すなわち１つ以上の二重結合を含有する（アルケニレン）および／または三重結合を含有する（アルキニレン））であり、例えば１～２４個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ２４アルキレン）、１～１５個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ１５アルキレン）、１～１２個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ１２アルキレン）、１～８個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ８アルキレン）、１～６個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ６アルキレン）、２～４個の炭素原子（Ｃ２－Ｃ４アルキレン）、１～２個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ２アルキレン）を有するものを意味する（例えばメチレン、エチレン、プロピレン、ｎ-ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ-ブテニレン、プロピニレン、ｎ-ブチニレンなど）。アルキレン鎖は単結合または二重結合を通じて分子の残部に付着するとともに、結合または二重結合を通じて前記基に付着している。分子の残部と前記基へのアルキレン鎖の付着点として、その鎖の中の１個の炭素または任意の２個の炭素が可能である。明細書の中では特に断わらない限り、アルキレン鎖は場合により置換されていてもよい。
「シクロアルキル」または「炭素環」は、炭素原子と水素原子のみからなる安定な非芳香族単環または多環の炭化水素基であって、融合または架橋した環系を含んでいてもよく、３～１５個の炭素原子、好ましくは３～１０個の炭素原子を有し、飽和または不飽和であり、分子の残部に単結合によって付着しているものを意味する。単環基に含まれるのは、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルである。多環基に含まれるのは、例えばアダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、７，７ジメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタニルなどである。特に断わらない限り、シクロアルキル基は場合により置換されている。
「シクロアルキレン」は、２価シクロアルキル基である。明細書の中では特に断わらない限り、シクロアルキレン基は場合により置換されていてもよい。
「ヘテロシクリル」または「複素環」は、２～１２個の炭素原子と、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される１～６個のヘテロ原子とからなる安定な３～１８員の非芳香族環基を意味する。明細書の中では特に断わらない限り、ヘテロシクリル基として単環、二環、三環、四環系が可能であり、その中には融合環系または架橋環系を含めることができ；ヘテロシクリル基の中の窒素、炭素、および硫黄原子は場合により酸化されていてもよく；窒素原子は場合により四級化されていてもよく；ヘテロシクリル基は一部または全体が飽和している可能性がある。ヘテロシクリル基の非限定的な例に含まれるのは、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２-オキソピペラジニル、２-オキソピペリジニル、２-オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４-ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１-オキソ-チオモルホリニル、および１，１-ジオキソ-チオモルホリニルである。特に断わらない限り、ヘテロシクリル基は場合により置換されていてもよい。
「置換された」という用語は、本明細書では、少なくとも１個の水素原子が結合によって非水素原子に置換された上記の任意の基（例えばアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリル）を意味し、非水素原子の非限定的な例は、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩなど）；オキソ基（＝Ｏ）；ヒドロキシル基（－ＯＨ）；アルコキシ基（-ＯＲａ、ただしＲａはＣ１－Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキルである）；カルボキシル基（-ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａまたは－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、ただしＲａはＨ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキルである）；アミン基（-ＮＲａＲｂ、ただしＲａとＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキルである）；Ｃ１－Ｃ１２アルキル基；およびシクロアルキル基である。いくつかの実施形態では、置換基はＣ１－Ｃ１２アルキル基である。他の実施形態では、置換基はシクロアルキル基である。他の実施形態では、置換基はハロ基（フルオロなど）である。他の実施形態では、置換基はオキソ基である。他の実施形態では、置換基はヒドロキシル基である。他の実施形態では、置換基はアルコキシ基である。他の実施形態では、置換基はカルボキシル基である。他の実施形態では、置換基はアミン基である。
「オプションの」または「場合により」（例えば場合により置換された）は、状況のその後に記載されているイベントが起こる可能性、または起こらない可能性があることと、この記述には前記イベントまたは状況が起こる場合とそうでない場合が含まれることを意味する。例えば「場合により置換されたアルキル」は、アルキル基が置換されている可能性と置換されていない可能性があることと、この記述には、置換されたアルキル基と、置換を持たないアルキル基の両方が含まれることを意味する。
範囲：本開示全体を通じ、本発明のさまざまな側面をある範囲の形式で提示することができる。範囲の形式での記述は単に便宜と簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する融通の利かない制限と解釈してはならない。したがって範囲の記述は、具体的に開示されている可能なすべての下位範囲のほか、その範囲内の個々の数値を有すると見なすべきである。例えば１～６などの範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示されている下位範囲のほか、その範囲内の例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６という個々の数字を有すると見なすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
説明
本発明は、一部が、送達用担体を標的に送達するための組成物と方法に関する。１つの側面では、本発明は、ターゲティングドメインにコンジュゲートされた送達用担体を含む組成物に関する。一実施形態では、送達用担体は少なくとも１つの薬剤（治療剤など）を含む。一実施形態では、送達用担体はＲＮＡ分子（その非限定的な例に含まれるのは、ｍＲＮＡ、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡである）を含む。一実施形態では、送達用担体は治療剤を含む。一実施形態では、治療剤はヌクレオシドが修飾されたＲＮＡである。
一実施形態では、組成物はＴ細胞の表面抗原に結合するターゲティングドメインにコンジュゲートされた送達用担体を含み、そのことによって組成物をＴ細胞に向かわせる。
さまざまな実施形態では、ターゲティングドメインは、Ｔ細胞の多くのサブタイプ（例えばｐａｎ－Ｔ抗原）の表面に発現するＴ細胞の細胞表面分子に結合する。標的とすることのできるｐａｎ－Ｔ抗原の非限定的な例に含まれるのは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７である。
さまざまな実施形態では、本発明は、標的に向かう送達用担体の組み合わせを含む組成物に関するものであり、その組み合わせは、第１のＴ細胞抗原を標的とする第１の送達用担体と、少なくとも１つの追加Ｔ細胞抗原を標的とする少なくとも１つの追加送達用担体を含むため、標的に向けられる送達用担体のこの組み合わせはＴ細胞の多くのサブタイプを標的とする。標的にすることのできるＴ細胞抗原の非限定的な例に含まれるのは、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＣＲ７である。
一実施形態では、本発明の組成物は、ＣＤ４を標的とする第１の送達用担体と、ＣＤ８を標的とする第２の送達用担体を含むため、標的に向かう送達用担体のこの組み合わせは、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の組み合わせを標的とする。
一実施形態では、送達用担体は、Ｔ細胞を修飾するための薬剤を含む、または封入している。いくつかの実施形態では、前記薬剤はｍＲＮＡに基づく免疫治療剤である。一実施形態では、送達用担体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子を含む、または封入している。いくつかの実施形態では、核酸分子はＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子である。
本発明は、一部が、疾患または障害の治療を必要とする対象でそれを治療する方法にも関係しており、この方法は、Ｔ細胞の表面抗原に結合するターゲティングドメインにコンジュゲートされた薬剤を含む少なくとも１つの送達用担体を含む組成物を投与することを含む。
Ｔ細胞を標的とする本発明の治療剤組成物を用いて治療することのできる代表的な疾患と障害の非限定的な例に含まれるのは、がん、感染性疾患、および免疫障害である。
送達用担体のカーゴ
さまざまな実施形態では、送達用担体は、免疫細胞の遺伝子を修飾する１つ以上の核酸分子（例えばｍＲＮＡ、発現ベクター、またはゲノム編集ベクター）からなるカーゴを含む。標的免疫細胞によって（例えばエンドサイトーシスによって）送達用担体が細胞に取り込まれた後、カーゴ核酸はエンドソームから放出される。カーゴ核酸は、放出されると対象の標的免疫細胞を変化させて１つ以上の表面部分（例えば細胞受容体）を発現させる。前記１つ以上の表面部分は、標的細胞の１つ以上のマーカーに対して特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。前記１つ以上の表面部分は、標的細胞の１つ以上のマーカーに対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も含むことができる。プログラムまたは修飾された免疫細胞は、標的細胞に結合すると（例えばＴ細胞を媒介とする細胞傷害性による）標的細胞の破壊を容易にし、そのことによって対象における疾患または障害（例えばがん）を治療または予防する。
一実施形態では、本開示において、本明細書に開示されている送達用担体が少なくとも１つの薬剤を含むことを考える。いくつかの実施形態では、その薬剤は、治療剤、イメージング剤、診断剤、造影剤、標識剤、検出剤、または消毒剤である。その薬剤は、典型的には活性成分と見なされていない生物活性を有する物質（香料、甘味剤、香味剤と香味増強剤、ｐＨ調節剤、発泡剤、皮膚軟化剤、増量剤、可溶性有機塩、透過剤、抗酸化剤、染料または着色剤など）も含むことができる。
一実施形態では、送達用担体は少なくとも１つの治療剤を含む。本発明は、どれか特定の治療剤に限定されることはなく、むしろ送達用担体の中に含めることのできる任意の適切な治療剤を包含する。代表的な治療剤の非限定的な例に含まれるのは、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗酸化剤、血栓溶解剤、化学療法剤、抗炎症剤、免疫原、防腐剤、麻酔剤、鎮痛剤、医薬品、小分子、ペプチド、核酸などである。一実施形態では、治療剤は、本明細書の別の箇所に記載されているｍＲＮＡ分子（例えばヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡ分子）である。
核酸剤
１つの側面では、本開示により、核酸カーゴ（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む送達用担体（その非限定的な例に含まれるのは、活性化された線維芽細胞の阻害、不活性化および／または破壊に用いるためのｍＲＮＡ、発現ベクター、ゲノム編集ベクター、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡである）が提供される。さまざまな実施形態では、核酸カーゴとして、ヌクレオシドが修飾された核酸分子（例えばヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡ分子）が可能である。さまざまな実施形態では、前記薬剤は単離された核酸である。ある実施形態では、単離された核酸分子はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の一方である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、前記薬剤は単離された核酸分子はヌクレオシドが修飾されたＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンス分子。
さまざまな実施形態では、前記送達用担体は、免疫細胞の遺伝子を修飾する１つ以上の核酸分子（例えばｍＲＮＡ、発現ベクター、またはゲノム編集ベクター、ＤＮＡ、またはＲＮＡ）とからなる標的細胞（例えばがん細胞）向けカーゴを含む。（例えばエンドサイトーシスによって）標的免疫細胞に送達用担体が細胞に取り込まれた後、カーゴ核酸はエンドソームから放出される。カーゴ核酸は、放出されると対象の標的免疫細胞を変化させ、興味ある標的細胞（例えばがん細胞）に対して特異的な１つ以上の表面部分（例えば細胞受容体）を発現させる。前記１つ以上の表面部分は、標的細胞（例えばがんマーカー）の１つ以上のマーカーに対して特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。前記１つ以上の表面部分は、標的細胞（例えばがんマーカー）の１つ以上のマーカーに対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も含むことができる。プログラムまたは修飾された免疫細胞は、標的細胞（例えばがん細胞）に結合すると（例えばＴ細胞を媒介とする細胞傷害性によって）標的細胞の破壊を容易にし、そのことによって対象における疾患（例えばがん）を治療または予防する。
一実施形態では、核酸はプロモータ／調節配列（核酸の発現を指示することのできる核酸など）を含む。したがって本発明は、外来核酸を細胞の中に導入し、それに付随してその外来核酸を細胞の中で発現させるための、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２０１２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）とＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているような、そして本明細書の別の箇所に記載されているような発現ベクターと方法を包含する。
ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡ
一実施形態では、本開示の組成物は、ヌクレオシドが修飾された核酸（例えばヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡ分子）を含む。一実施形態では、本発明の組成物は、タンパク質（治療用タンパク質など）をコードする、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡを含む。
例えば一実施形態では、組成物は、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡを含む。一実施形態では、組成物は、ヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡを含む。ヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡは、修飾されていないｍＲＮＡと比べて特別な利点（例えば増大した安定性、低いか存在しない天然の免疫原性、および増加した翻訳が含まれる）を有する。本発明で有用なヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡは、アメリカ合衆国特許第８，２７８，０３６号、第８，６９１，９６６号、および第８，８３５，１０８号にさらに記載されている（そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
ある実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡはいかなる病態生理学的経路も活性化させず、送達のほぼ直後に非常に効率的に翻訳され、インビボで数日間続く連続的なタンパク質産生のための鋳型として機能する（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１８３３－１８４０；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０：９４８－９５３）。生理学的効果を及ぼすのに必要なｍＲＮＡの量は少ないため、ヒトの療法に適用することができる。
ある場合には、コードｍＲＮＡを送達することによるタンパク質の発現は、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、またはウイルスベクターを用いる方法と比べて多くの利点を有する。ｍＲＮＡのトランスフェクションの間、望むタンパク質のコード配列は細胞に送達される物質に過ぎないため、プラスミド骨格、ウイルス遺伝子、およびウイルスタンパク質に付随するあらゆる副作用が回避される。より重要なこととして、ＤＮＡ系ベクターやウイルス系ベクターとは異なり、前記ｍＲＮＡはゲノムに組み込まれるリスクがなく、タンパク質の産生はｍＲＮＡ送達の直後に始まる。例えば高レベルの循環タンパク質が、コードｍＲＮＡのインビボ注射から１５～３０分間以内に測定されている。ある実施形態では、タンパク質よりもｍＲＮＡを用いることには多くの利点もある。循環中のタンパク質の半減期は短いため、タンパク質治療は頻繁な投与を必要とされると考えられるのに対し、ｍＲＮＡは数日間にわたる連続的なタンパク質産生のための鋳型を提供する。タンパク質は精製に問題があり、有害な効果を引き起こす凝集体や他の不純物を含有する可能性がある（Ｋｒｏｍｍｉｎｇａ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ， ２００５， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０５０：２５７－２６５）。
ある実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡは、天然状態で修飾されているヌクレオシドシュードウリジンを含む。ある実施形態では、シュードウリジンを含めることでｍＲＮＡがより安定になり、非免疫原性になり、翻訳可能性が大きくなる（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１８３３－１８４０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８：５８８４－５８９２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：９３２９－９３３８；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：ｅ１４２；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０：９４８－９５３；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５－１７５）。
ＲＮＡの中に修飾されたヌクレオシド（シュードウリジンを含む）が存在していると、その自然免疫原性が抑制されることが実証されている（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３： １６５－１７５）。さらに、タンパク質をコードするインビトロで転写されたシュードウリジン含有ＲＮＡは、修飾されたヌクレオシドを含まないか修飾されたヌクレオシドを含むＲＮＡよりも効率的に翻訳されることが可能である（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１８３３－１８４０）。その後、シュードウリジンの存在がＲＮＡの安全性を改善すること（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：９３２９－９３３８）、そしてＰＫＲの活性化と翻訳の阻害の両方を軽減することが示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８：５８８４－５８９２）。シュードウリジンについて記載されているのと同様の効果が、１－メチル－シュードウリジンを含有するＲＮＡでも観察されている。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドが修飾された核酸分子は、ヌクレオシドが修飾された精製核酸分子である。例えばいくつかの実施形態では、組成物は精製されて二本鎖汚染物質が除去される。いくつかの実施形態では、分取ＨＰＬＣ精製手続きを利用して、より優れた翻訳能力を有し、自然免疫原性がないシュードウリジン含有ＲＮＡを取得する（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：ｅ１４２）。エリスロポエチンをコードするＨＰＬＣで精製したシュードウリン含有ＲＮＡをマウスとマカクに投与すると、血清ＥＰＯレベルが有意に上昇し（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０：９４８－９５３）、したがってシュードウリジン含有ｍＲＮＡがインビボタンパク質療法に適していることが確認される。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドが修飾された核酸分子は非ＨＰＬＣ法を利用して精製される。いくつかの場合には、ヌクレオシドが修飾された核酸分子はクロマトグラフィ法を用いて精製される（その非限定的な例に含まれるのは、ＨＰＬＣと高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）である）。ＦＰＬＣに基づく１つの代表的な精製手続きはＷｅｉｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ９６９： ４３－５４に記載されている。代表的な精製手続きはアメリカ合衆国特許出願公開第ＵＳ２０１６／００３２３１６号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）にも記載されている。
本発明は、シュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、およびポリリボヌクレオチド分子を包含する。ある実施形態では、組成物は単離された核酸を含み、その核酸はシュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む。ある実施形態では、組成物は、単離された核酸を含むウイルスベクターを含み、その核酸はシュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態では、本明細書の別の箇所に記載されているように、ヌクレオシドが修飾された本発明のＲＮＡはＩＶＴ ＲＮＡである。例えばある実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡは、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の一実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡは、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の一実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡは、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。
一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはｍ１ａｃｐ３Ψ（１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジンである。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはｍ１Ψ（１－メチルシュードウリジン）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはΨｍ（２’－Ｏ－メチルシュードウリジンである。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはｍ３Ψ（３－メチルシュードウリジン）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、さらなる修飾のないシュードウリジン部分である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、上記の任意のシュードウリジンの一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、本分野で知られている他の任意のシュードウリジン様ヌクレオシドである。
別の一実施形態では、本発明のヌクレオシドが修飾されたＲＮＡ中で修飾されているヌクレオシドはウリジン（Ｕ）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはシチジン（Ｃ）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはアデノシン（Ａ）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはグアノシン（Ｇ）である。
別の一実施形態では、本発明の修飾されたヌクレオシドはｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはｓ２Ｕ（２－チオウリジン）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはΨ（シュードウリジン）である。別の一実施形態では、修飾されたヌクレオシドはＵｍ（２’－Ｏ－メチルウリジン）である。
他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）；Ａｍ（２’－Ｏ－メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸塩））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１－メチルイノシン）；ｍ１Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）；Ｃｍ（２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５－ホルミルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１－メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）；ｍ２ ２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ２ ２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸塩））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（修飾が不十分なヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルワイオシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル－キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）；ｐｒｅＱ０（７－シアノ－７－デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ１（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）；Ｇ＋（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン ５－オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン ５－オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍ６ ２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）；ｍ６ ２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２’－トリメチルアデノシン）；ｍ２，７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）；ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ１Ａｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）；τｍ５Ｕ（５－タウリノメチルウリジン）；τｍ５ｓ２Ｕ（５－タウリノメチル－２－チオウリジン））；ｉｍＧ－１４（４－デメチルワイオシン）；ｉｍＧ２（イソワイオシン）；またはａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）である。
別の一実施形態では、ヌクレオシドが修飾された本発明のＲＮＡは、上記修飾の２つ以上の組み合わせを含む。別の一実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡは、上記修飾の３つ以上の組み合わせを含む。別の一実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡは、上記修飾の４つ以上の組み合わせを含む。
別の一実施形態では、本発明の修飾されたヌクレオシドの中の残基の０．１％～１００％が（例えばシュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシド塩基いずれかの存在によって）修飾されている。別の一実施形態では、残基の０．１％が修飾されている。別の一実施形態では、修飾された残基の割合は０．２％である。別の一実施形態では、その割合は０．３％である。別の一実施形態では、その割合は０．４％である。別の一実施形態では、その割合は０．５％である。別の一実施形態では、その割合は０．６％である。別の一実施形態では、その割合は０．８％である。別の一実施形態では、その割合は１％である。別の一実施形態では、その割合は１．５％である。別の一実施形態では、その割合は２％である。別の一実施形態では、その割合は２．５％である。別の一実施形態では、その割合は３％である。別の一実施形態では、その割合は４％である。別の一実施形態では、その割合は５％である。別の一実施形態では、その割合は６％である。別の一実施形態では、その割合は８％である。別の一実施形態では、その割合は１０％である。別の一実施形態では、その割合は１２％である。別の一実施形態では、その割合は１４％である。別の一実施形態では、その割合は１６％である。別の一実施形態では、その割合は１８％である。別の一実施形態では、その割合は２０％である。別の一実施形態では、その割合は２５％である。別の一実施形態では、その割合は３０％である。別の一実施形態では、その割合は３５％である。別の一実施形態では、その割合は４０％である。別の一実施形態では、その割合は４５％である。別の一実施形態では、その割合は５０％である。別の一実施形態では、その割合は６０％である。別の一実施形態では、その割合は７０％である。別の一実施形態では、その割合は８０％である。別の一実施形態では、その割合は９０％である。別の一実施形態では、その割合は１００％である。
別の一実施形態では、その割合は５％未満である。別の一実施形態では、その割合は３％未満である。別の一実施形態では、その割合は１％未満である。別の一実施形態では、その割合は２％未満である。別の一実施形態では、その割合は４％未満である。別の一実施形態では、その割合は６％未満である。別の一実施形態では、その割合は８％未満である。別の一実施形態では、その割合は１０％未満である。別の一実施形態では、その割合は１２％未満である。別の一実施形態では、その割合は１５％未満である。別の一実施形態では、その割合は２０％未満である。別の一実施形態では、その割合は３０％未満である。別の一実施形態では、その割合は４０％未満である。別の一実施形態では、その割合は５０％未満である。別の一実施形態では、その割合は６０％未満である。別の一実施形態では、その割合は７０％未満である。
いくつかの一実施形態では、組成物は、一本鎖ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡの精製調製物を含む。例えばいくつかの実施形態では、一本鎖ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡの精製調製物は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製調製物は、少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％が、一本鎖ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡであり、残りが他のすべての核酸分子（ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）である。
別の一実施形態では、所与のヌクレオシドの残基（すなわちウリジン、シチジン、グアノシン、またはアデノシン）の０．１％が修飾されている。別の一実施形態では、修飾されている所与のヌクレオチドの割合は０．２％である。別の一実施形態では、その割合は０．３％である。別の一実施形態では、その割合は０．４％である。別の一実施形態では、その割合は０．５％である。別の一実施形態では、その割合は０．６％である。別の一実施形態では、その割合は０．８％である。別の一実施形態では、その割合は１％である。別の一実施形態では、その割合は１．５％である。別の一実施形態では、その割合は２％である。別の一実施形態では、その割合は２．５％である。別の一実施形態では、その割合は３％である。別の一実施形態では、その割合は４％である。別の一実施形態では、その割合は５％である。別の一実施形態では、その割合は６％である。別の一実施形態では、その割合は８％である。別の一実施形態では、その割合は１０％である。別の一実施形態では、その割合は１２％である。別の一実施形態では、その割合は１４％である。別の一実施形態では、その割合は１６％である。別の一実施形態では、その割合は１８％である。別の一実施形態では、その割合は２０％である。別の一実施形態では、その割合は２５％である。別の一実施形態では、その割合は３０％である。別の一実施形態では、その割合は３５％である。別の一実施形態では、その割合は４０％である。別の一実施形態では、その割合は４５％である。別の一実施形態では、その割合は５０％である。別の一実施形態では、その割合は６０％である。別の一実施形態では、その割合は７０％である。別の一実施形態では、その割合は８０％である。別の一実施形態では、その割合は９０％である。別の一実施形態では、その割合は１００％である。
別の一実施形態では、修飾されている所与のヌクレオチドの割合は８％未満である。別の一実施形態では、その割合は１０％未満である。別の一実施形態では、その割合は５％未満である。別の一実施形態では、その割合は３％未満である。別の一実施形態では、その割合は１％未満である。別の一実施形態では、その割合は２％未満である。別の一実施形態では、その割合は４％未満である。別の一実施形態では、その割合は６％未満である。別の一実施形態では、その割合は１２％未満である。別の一実施形態では、その割合は１５％未満である。別の一実施形態では、その割合は２０％未満である。別の一実施形態では、その割合は３０％未満である。別の一実施形態では、その割合は４０％未満である。別の一実施形態では、その割合は５０％未満である。別の一実施形態では、その割合は６０％未満である。別の一実施形態では、その割合は７０％未満である。
別の一実施形態では、ヌクレオシドが修飾された本発明のＲＮＡは同じ配列を有する修飾されていないＲＮＡ分子よりも細胞の中で効率的に翻訳される。別の一実施形態では、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡは、標的細胞によって翻訳される能力の増強を示す。別の一実施形態では、翻訳がその修飾されていない対応物と比べて２倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が３倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が５倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が７倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が１０倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が１５倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が２０倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が５０倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が１００倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が２００倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が５００倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が１０００倍に増強される。別の一実施形態では、翻訳が２０００倍に増強される。別の一実施形態では、因子は１０～１０００倍である。別の一実施形態では、因子は１０～１００倍である。別の一実施形態では、因子は１０～２００倍である。別の一実施形態では、因子は１０～３００倍である。別の一実施形態では、因子は１０～５００倍である。別の一実施形態では、因子は２０～１０００倍である。別の一実施形態では、因子は３０～１０００倍である。別の一実施形態では、因子は５０～１０００倍である。別の一実施形態では、因子は１００～１０００倍である。別の一実施形態では、因子は２００～１０００倍である。別の一実施形態では、翻訳は、他の任意の大きな量、または量の範囲で増強される。
別の一実施形態では、ヌクレオシドが修飾された本発明のＲＮＡは、インビトロで合成された修飾されていない同じ配列のＲＮＡ分子よりも有意に小さい自然免疫原性を示す。別の一実施形態では、修飾されたＲＮＡ分子は、修飾されていない対応物よりも２倍少ない自然免疫応答を示す。別の一実施形態では、自然免疫原性が３倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が４倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が５倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が６倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が７倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が８倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が９倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が１０倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が１５倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が２０倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が５０倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が１００倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が２００倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が５００倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が１０００倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が２０００倍低下する。別の一実施形態では、自然免疫原性が別の倍数低下する。
別の一実施形態では、「有意により少ない自然免疫原性を示す」は、自然免疫原性の検出可能な低下を意味する。別の一実施形態では、前記表現は、自然免疫原性がある倍数低下することを意味する（例えば上に列挙した倍数低下の１つ）。別の一実施形態では、前記表現は、検出可能な自然免疫応答を開始させることなくヌクレオシドが修飾されたＲＮＡを有効量で投与できるような低下を意味する。別の一実施形態では、前記表現は、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡを、その修飾されたＲＮＡによってコードされたタンパク質の産生を検出可能なほど減少させるのに十分な自然免疫応答を誘導することなく反復して投与できるような低下を意味する。別の一実施形態では、低下は、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡを、その修飾されたＲＮＡによってコードされたタンパク質の検出可能な産生をなくすのに十分な自然免疫応答を誘導することなく反復して投与できる程度の低下である。
ＲＮＡ干渉剤
一実施形態では、ｓｉＲＮＡを用いて標的となるタンパク質のレベルを低下させる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、さまざまな生物と細胞のタイプに二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入することによって相補的ｍＲＮＡの分解が起こる現象である。細胞の中では、Ｄｉｃｅｒとして知られるリボヌクレアーゼによって長いｄｓＲＮＡが切断されて短い２１～２５個のヌクレオチドからなる小さな干渉ＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡになる。ｓｉＲＮＡはその後タンパク質構成成分と組み合わさったＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）になり、プロセスの途中でほどける。活性化されたＲＩＳＣはその後ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖とｍＲＮＡの間の塩基対形成相互作用によって相補的転写産物に結合する。結合したｍＲＮＡは切断され、ｍＲＮＡが配列特異的に分解される結果として遺伝子サイレンシングが起こる。例えばアメリカ合衆国特許第６，５０６，５５９号；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９１（１９）：３０６－３１１；Ｔｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９５：８５４；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， ＴＩＧ １４（７）：２５５－２５８；Ｄａｖｉｄ Ｒ． Ｅｎｇｅｌｋｅ， Ｅｄ．， ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ， Ｅａｇｌｅｖｉｌｌｅ， ＰＡ（２００３）；およびＧｒｅｇｏｒｙ Ｊ． Ｈａｎｎｏｎ， Ｅｄ．， ＲＮＡｉ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（２００３）を参照されたい。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら（２００４， Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）には、ｓｉＲＮＡに対してなされて静脈内全身送達を助ける化学的修飾が記載されている。ｓｉＲＮＡの最適化には、全Ｇ／Ｃ含量、末端におけるＣ／Ｔ含量、Ｔｍ、および３’オーバーハングのヌクレオチド含量を考慮することが含まれる。例えばＳｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃｅｌｌ， １１５：１９９－２０８とＫｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃｅｌｌ １１５：２０９－２１６を参照されたい。したがって本発明は、ＲＮＡｉ技術を利用してＰＴＰＮ２２のレベルを低下させる方法も含む。
１つの側面では、本発明に、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドを含むウイルスベクターが含まれる。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドは標的ポリペプチドの発現を阻害できることが好ましい。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）と本明細書の別の箇所に記載されているように、ウイルスベクターへの望むポリヌクレオチドの組み込みと、ウイルスベクターの選択は本分野で周知である。
ある実施形態では、本明細書に記載されている発現ベクターは、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）剤をコードする。ｓｈＲＮＡ分子は本分野で周知であり、標的のｍＲＮＡに向けられ、そのことによって標的の発現を低下させる。ある実施形態では、コードされたｓｈＲＮＡが細胞によって発現された後、処理されてｓｉＲＮＡになる。例えばある場合には、細胞は、ｓｈＲＮＡを切断してｓｉＲＮＡを形成する天然酵素（例えばｄｉｃｅｒ）を有する。
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスポリヌクレオチドの発現を評価するため、細胞の中に導入される発現ベクターは、発現している細胞を、本発明の送達用担体を用いてトランスフェクトするか感染させようとする細胞の集団から同定するのを容易にする選択マーカー遺伝子またはレポータ遺伝子のいずれか、またはその両方も含有することができる。他の実施形態では、選択マーカーは別のＤＮＡに載せることができ、送達用担体の中に含めることもできる。選択マーカーとレポータ遺伝子の両方を適切な調節配列に隣接させて宿主細胞の中での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーは本分野で知られており、その中には例えば抗生剤耐性遺伝子（ネオマイシン耐性など）が含まれる。
したがって１つの側面では、送達用担体は、送達されるヌクレオチド配列またはコンストラクトを含むウイルスベクターを含有することができる。ウイルスベクターの選択は、それが導入されることになる宿主細胞に依存するであろう。特別な一実施形態では、本発明のベクターは発現ベクターである。適切な宿主細胞に多彩な原核宿主細胞と真核宿主細胞が含まれる。特別な実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、および哺乳類細胞ベクターからなる群から選択される。原核生物ベクターおよび／または真核細胞ベクターに基づく系を本発明で利用してポリヌクレオチド、またはそのコグネイトポリペプチドを生成させることができる。多くのそのような系が市販されていて広く入手することができる。
例示として、核酸配列が導入されるウイルスベクターとしてプラスミドが可能である。プラスミドは、宿主細胞のゲノムの中に導入されたとき、その細胞に組み込まれる、または組み込まれない。本発明のヌクレオチド配列または本発明の遺伝子コンストラクトを挿入することのできるウイルスベクターの非限定的な説明例に含まれるのは、真核細胞の中で発現させるためのｔｅｔ－ｏｎ誘導性ウイルスベクターである。
ベクターは当業者に知られている従来法によって得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。特別な一実施形態では、ウイルスベクターは、動物細胞を形質転換するのに有用なウイルスベクターである。
一実施形態では、組み換え発現ベクターは、ペプチドまたはペプチド模倣体をコードする核酸分子も含有することができる。
プロモータとして、遺伝子またはポリヌクレオチド配列に元々付随しているものが可能であり、それはコード区画および／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られる。このようなプロモータは「内在性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサとして、ポリヌクレオチド配列に元々付随しているものが可能であり、それは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する。あるいはコードしているポリヌクレオチド区画を、自然環境ではポリヌクレオチド配列に元々付随していないプロモータである組み換えプロモータまたは異種プロモータの制御下に置くことによってある利点が得られるであろう。組み換えエンハンサまたは異種エンハンサは、自然環境ではポリヌクレオチド配列に元々付随していないエンハンサも意味する。そのようなプロモータまたはエンハンサには、他の遺伝子のプロモータまたはエンハンサと、他の任意の原核細胞、ウイルス、または真核細胞から単離されたプロモータまたはエンハンサと、「天然」でないプロモータまたはエンハンサ、すなわち異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または発現を変化させる変異を含有するプロモータまたはエンハンサを含めることができる。プロモータとエンハンサの核酸配列を合成によって生成させることに加え、本明細書に開示されている組成物に関連して配列を組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術（ＰＣＲ（商標）が含まれる）を用いて生成させることができる（アメリカ合衆国特許第４，６８３，２０２号、アメリカ合衆国特許第５，９２８，９０６号）。さらに、非核オルガネラ（ミトコンドリア、葉緑体など）の中で配列の転写および／または発現を指示する制御配列も使用できることを考慮する。
当然、発現のために選択した細胞のタイプ、オルガネラ、および生物におけるＤＮＡ区画の発現を効率的に指示するプロモータおよび／またはエンハンサを使用することが重要になる。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質を発現させるためプロモータ、エンハンサ、および細胞のタイプの組み合わせをどのように使用するかを知っている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）を参照されたい。使用されるプロモータとして、構成的プロモータ、組織特異的プロモータ、誘導性プロモータ、および／または導入されたＤＮＡ区画の高レベルの発現を適切な条件下で指示するのに有用な（組み換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生産に有利であるなどの）プロモータが可能である。プロモータとして、異種または内在性のプロモータが可能である。
組み換え発現ベクターは、宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子も含有することができる。適切な選択マーカー遺伝子は、ある種の薬、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリン、またはこれらの部分（免疫グロブリン（好ましくはＩｇＧ）のＦｃ部分など）に対する耐性を与えるタンパク質（Ｇ４１８やハイグロマイシンなど）をコードする遺伝子である。選択マーカーは、興味ある核酸とは別のウイルスベクターに導入することができる。
当業者は、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの生成後、そのｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが、治療用化合物としてのそのｓｉＲＮＡを改善するため修飾することのできるある特徴を有していることを理解しているであろう。したがってｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたは他の結合（ホスホン酸メチル、スルホン、硫酸塩、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、リン酸エステルなど）が含まれるように修飾することにより、分解に抵抗するようにさらに設計することができる（例えばＡｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２８：３５３９－３５４２；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２６：２１９１－２１９４；Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：４７６９－４７８２；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， １９８９ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． １４：９７－１００；Ｓｔｅｉｎ， Ｉｎ： Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｃｏｈｅｎ， ｅｄ．， Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ｐｐ．９７－１１７（１９８９）を参照されたい）。
どのポリヌクレオチドも、インビボでの安定性が増大するようにさらに修飾することができる。可能な修飾の非限定的な例に含まれるのは、５’末端および／または３’末端にフランキング配列を付加すること；骨格内でホスホジエステル結合よりもホスホロチオエートまたは２’Ｏ－メチルを使用すること；および／または非標準塩基（イノシン、キューオシン、およびワイブトシンなど）のほか、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル形態、メチル形態、チオ形態、およびそれ以外の修飾された形態を含めることである。
本発明の一実施形態では、プラスミドウイルスベクターによって発現されるアンチセンス核酸配列を、標的タンパク質の発現を阻害する薬剤として使用する。アンチセンス発現ウイルスベクターを用いて哺乳類細胞または哺乳類そのものにトランスフェクトし、そのことによって標的タンパク質の内在性発現を低下させる。
遺伝子の発現を阻害するためのアンチセンス分子とその利用は本分野で周知である（例えばＣｏｈｅｎ， １９８９， Ｉｎ： Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ参照）。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に対して相補的な（この用語は本明細書の別の箇所で定義されている）ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６２：４０）。細胞の中でアンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、そのことによって遺伝子の翻訳を阻害する。
遺伝子の翻訳を阻害するためアンチセンス法を利用することは本分野で知られており、例えばＭａｒｃｕｓ－Ｓａｋｕｒａ（１９８８， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７２：２８９）に記載されている。このようなアンチセンス分子は、Ｉｎｏｕｅ、１９９３年、アメリカ合衆国特許第５，１９０，９３１号に教示されているように、このアンチセンス分子をコードするＤＮＡを用いた遺伝子発現を通じて細胞に提供することができる。
あるいは本発明のアンチセンス分子は合成によって作製することができ、その後細胞に提供される。約１０個と約３０個の間、より好ましくは約１５個のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴマーが、合成して標的細胞に導入するのが容易であるため好ましい。本発明で考慮する合成アンチセンス分子には、修飾されていないオリゴヌクレオチドと比べて改善された生物活性を有する本分野で知られているオリゴヌクレオチド誘導体が含まれる（アメリカ合衆国特許第５，０２３，２４３号参照）。
本発明の一実施形態では、リボザイムは、標的タンパク質の発現を阻害する薬剤として使用される。標的分子の発現を阻害するのに有用なリボザイムは、標的配列を例えば標的分子をコードするｍＲＮＡ配列と相補的な基本的リボザイム構造の中に組み込む設計にすることができる。標的分子を標的とするリボザイムは、市販の試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、フォスター・シティ、カリフォルニア州）を用いて合成すること、またはそれをコードするＤＮＡから遺伝子発現させることができる。
一実施形態では、前記薬剤は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の１つ以上の構成要素を含むことができ、その中のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は標的分子をコードする遺伝子を標的とし、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチドは複合体を形成して標的となる遺伝子内に変異を誘導する。一実施形態では、前記薬剤は、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸分子を含む。一実施形態では、前記薬剤は、Ｃａｓペプチド、またはＣａｓペプチドをコードする核酸分子を含む。
マイクロＲＮＡ剤
一実施形態では、前記薬剤は、ｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの模倣体を含む。一実施形態では、前記薬剤は、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの模倣体をコードする核酸分子を含む。
ｍｉＲＮＡは、細胞内で、翻訳の阻害によって、または標的となるｍＲＮＡの分解を通じて特定の遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こすことのできる小さな非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、完全に相補的であること、または標的核酸と相補的でない領域を有することができる（その帰結として相補的でない領域が「突起」する）。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡが標的核酸と完全に相補的ではないときなどには翻訳を抑制することによって、またはｍｉＲＮＡが対応する標的に完全な相補性で結合するときには、そのときのみ起こると考えられている標的ＲＮＡの分解を引き起こすことによって、遺伝子の発現を阻害することができる。本開示はｍｉＲＮＡの二本鎖前駆体も含むことができる。ｍｉＲＮＡまたはプリ－ｍｉＲＮＡ（pri-miRNA）として長さが１８～１００個のヌクレオチド、または長さが１８～８０個のヌクレオチドが可能である。成熟ｍｉＲＮＡは、長さが１９～３０個のヌクレオチド、または２１～２５個のヌクレオチド、特に２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドを有することができる。ｍｉＲＮＡ前駆体は典型的には長さが約７０～１００個のヌクレオチドであり、ヘアピン構造を有する。ｍｉＲＮＡは、長いプレ－ｍｉＲＮＡを特異的に処理して機能的ｍｉＲＮＡにする酵素ＤｉｃｅｒとＤｒｏｓｈａによってインビボでプレ－ｍｉＲＮＡから生成する。本開示に登場するヘアピンまたは成熟マイクロＲＮＡ、またはプリ－マイクロＲＮＡ剤は、インビボで細胞に基づく系によって、またはインビトロで化学合成によって合成することができる。
さまざまな実施形態では、前記薬剤は、疾患関連ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、疾患関連ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列をプレ－マイクロＲＮＡ形態、成熟形態、またはヘアピン形態で含む。他の実施形態では、１つ以上の疾患関連ｍｉＲＮＡ、任意のプレ－ｍｉＲＮＡ、任意の断片、またはこれらの任意の組み合わせの配列を含むオリゴヌクレオチドの組み合わせが考えられる。
ｍｉＲＮＡは、望む特徴を与える修飾を含むように合成することができる。例えば修飾は、例えばエンドサイトーシスに依存した機構または独立な機構により、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーションの熱力学、特定の組織またはタイプの細胞への指向性、または細胞透過性を改善することができる。
修飾は、配列特異性を増大させ、その帰結として標的外ターゲティングを減らすこともできる。合成と化学的修飾の方法は、下により詳細に記載されている。望む場合には、ｍｉＲＮＡ分子を修飾してそのｍｉＲＮＡを分解に対して安定にすること、半減期を長くすること、またはそれ以外に有効性を向上させることができる。望ましい修飾が記載されているのは、例えばアメリカ合衆国特許公開第２００７０２１３２９２号、第２００６０２８７２６０号、第２００６００３５２５４号。第２００６０００８８２２号。および第２００５０２８８２４号の中であり、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。ヌクレアーゼ耐性および／または標的への結合親和性を増大させるため、本開示に登場する一本鎖オリゴヌクレオチド剤は、２’－Ｏ－メチル結合、２’－フッ素結合、２’－Ｏ－メトキシエチル結合、２’－Ｏ－アミノプロピル結合、２’－アミノ結合、および／またはホスホロチオエート結合を含むことができる。ロックされた核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）（例えば２’－４’－エチレン架橋核酸）、およびある種のヌクレオチド修飾を含めることによっても標的に対する結合親和性を増大させることができる。オリゴヌクレオチド骨格にピラノース糖を含めることによってエンドヌクレアーゼによる切断を減らすこともできる。オリゴヌクレオチドは、３’カチオン性基を含めることによって、または３’末端の位置のヌクレオシドを３－３’結合で逆転させることによってさらに修飾することができる。別の１つの代替例では、３’末端をアミノアルキル基でブロックすることができる。他の３’複合体はエキソヌクレアーゼによる３’－５’の切断を阻害することができる。理論に囚われることなく、３’は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体的に阻止することによってエキソヌクレアーゼによる切断を阻害する可能性がある。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環複合体または修飾された糖（Ｄ－リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえ、３’－５’－エキソヌクレアーゼを阻止することができる。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡは、いくつかまたはすべてのヌクレオチド間結合がヌクレアーゼ耐性のため修飾されてホスホロチオエートになったオリゴデオキシヌクレオチドギャップを含有する２’修飾オリゴヌクレオチドを含む。ホスホン酸メチル修飾の存在が、そのオリゴヌクレオチドの対応する標的ＲＮＡに対する親和性を増大させ、ＩＣ５Ｑを低下させる。この修飾は、前記修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性も増大させる。本開示の方法と試薬は、抑制性核酸分子の安定性または有効性を増強するために開発される可能性のある任意の技術と組み合わせて使用できることがわかる。
ｍｉＲＮＡ分子は、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含有するヌクレオチドオリゴマーを含む。修飾された骨格を有するオリゴマーには、骨格の中にリン原子を保持するオリゴマーと、骨格の中にリン原子を持たないオリゴマーが含まれる。本開示の目的のため、ヌクレオシド間骨格の中にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもヌクレオチドオリゴマーであると見なされる。修飾されたオリゴヌクレオチド骨格を有するヌクレオチドオリゴマーに含まれるのは、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル－ホスホトリエステル、ホスホン酸メチルと他のホスホン酸アルキル（ホスホン酸３’－アルキレンとホスホン酸キラルが含まれる）、ホスフィネート、ホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、ホスホン酸チオノアルキル、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノリン酸塩である。さまざまな塩、混合された塩、および遊離酸形態も含まれる。
本明細書に記載されているｍｉＲＮＡは成熟形態またはヘアピン形態である可能性があり、裸のオリゴヌクレオチドとして提供することができる。いくつかの場合には、細胞へのｍｉＲＮＡまたは他のヌクレオチドオリゴマーの送達を助ける製剤を用いることが望ましい可能性がある（例えばアメリカ合衆国特許第５，６５６，６１１号、第５，７５３，６１３号、第５，７８５，９９２号、第６，１２０，７９８号、第６，２２１，９５９号、第６，３４６，６１３号、および第６，３５３，０５５号を参照されたい；そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれている）。
いくつかの例では、ｍｉＲＮＡ組成物は、少なくとも一部が結晶、一様に結晶、および／または無水（例えば８０、５０、３０、２０、または１０％よりも少ない水）である。別の一例では、ｍｉＲＮＡ組成物は水相（例えば水を含む溶液）である。この水相または結晶の組成物を送達用担体（例えばリポソーム（特に水相のため）、または粒子（例えば結晶組成物にとって適切である可能性のある微粒子））に組み込むことができる。一般にｍｉＲＮＡ組成物は、想定する投与法に適合するように製剤化される。ｍｉＲＮＡ組成物は、別の薬剤（例えば別の治療剤、またはオリゴヌクレオチド剤を安定化させる薬剤（例えばそのオリゴヌクレオチド剤と複合体になるタンパク質）と組み合わせて製剤にすることができる。さらに別の薬剤に含まれるのは、キレータ（例えばＥＤＴＡ（例えばＭｇなどの２価カチオンを除去するため）、塩、およびＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば特異性が広いＲＮＡｓｅ阻害剤）である。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ組成物は別のｍｉＲＮＡである例えば第２のｍｉＲＮＡ組成物（例えば第１のものとは異なるマイクロＲＮＡ）を含む。さらに別の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００種、またはそれよりも多い種類の異なるオリゴヌクレオチド種を含むことができる。
ある実施形態では、組成物は、ｍｉＲＮＡの活性を模倣するオリゴヌクレオチド組成物を含む。ある実施形態では、組成物は、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列と一致する核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含むため、ｍｉＲＮＡの活性を模倣するように設計されている。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡ活性を模倣するオリゴヌクレオチド組成物は、成熟ｍｉＲＮＡヘアピンを模倣する二本鎖ＲＮＡ分子、または処理されたｍｉＲＮＡデュプレックスを含む。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、内在性ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の核酸塩基配列との一致部を共有する。本発明の組成物に含めるため選択されるオリゴヌクレオチドは、多くある長さの１つにすることができる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、長さが７～１００個の連結されたヌクレオシドが可能である。例えばｍｉＲＮＡと一致する核酸塩基を共有するオリゴヌクレオチドとして、長さが７～３０個の連結されたヌクレオシドが可能である。ｍｉＲＮＡ前駆体と一致部を共有するオリゴヌクレオチドとして、長さが１００個までの連結されたヌクレオシドが可能である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは７～３０個の連結されたヌクレオシドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、または３０個の連結されたヌクレオチドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１９～２３個の連結されたヌクレオシドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが４０から５０、６０、７０、８０、９０、または１００個までの連結されたヌクレオシドである。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体と一致するある部分を有する配列を有する。成熟ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列とそれに対応する本明細書に記載のステム－ループ配列は、ｍｉＲＮＡ配列と注釈に関するオンライン検索可能なデータベースであるｍｉＲＢａｓｅに見いだされる配列である。ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースへの入力事項は、ｍｉＲＮＡ転写産物の予測されるヘアピン部分（ステム－ループ）と、成熟ｍｉＲＮＡ配列の位置と配列に関する情報である。データベースの中のｍｉＲＮＡステム－ループ配列は厳密な前駆体ｍｉＲＮＡ（プレ－ｍｉＲＮＡ）ではなく、いくつかの場合には、プレ－ｍｉＲＮＡと、想定される一次転写産物からの何らかのフランキング配列を含む可能性がある。本明細書に記載のｍｉＲＮＡ核酸塩基配列はｍｉＲＮＡのあらゆるバージョンを包含し、その中にはｍｉＲＢａｓｅ配列データベースのリリース１０．０に記載されている配列と、ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースの以前のあらゆるリリースに記載されている配列が含まれる。配列データベースの１つのリリースの結果としてあるｍｉＲＮＡの名称が変わる可能性がある。配列データベースの１つのリリースの結果として１つの成熟ｍｉＲＮＡ配列にバリエーションが生じる可能性がある。本発明の組成物には、本明細書に記載されているｍｉＲＮＡの任意の核酸塩基配列バージョンとのある一致部を有するオリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物が包含される。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の核酸塩基の領域でｍｉＲＮＡと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％一致する核酸塩基配列を有する。したがってある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、ｍｉＲＮＡと一致しない核酸塩基を１個以上有する可能性がある。
ある実施形態では、組成物は、ｍｉＲＮＡ、前駆体、模倣体、またはこれらの断片をコードする核酸分子を含む。例えば組成物は、そのｍｉＲＮＡ、前駆体、模倣体、またはこれらの断片を望む哺乳類細胞または組織の中で発現させるのに適したウイルスベクター、プラスミド、コスミド、または他の発現ベクターを含むことができる。
インビトロで転写されるＲＮＡ
一実施形態では、本発明の薬剤は、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明の薬剤は、治療用タンパク質をコードするインビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明の薬剤は、複数の治療用タンパク質をコードするＩＶＴ ＲＮＡを含む。
一実施形態では、ＩＶＴ ＲＮＡは、一過性トランスフェクションの形態で細胞に導入することができる。ＲＮＡは、合成によって作製されたプラスミドＤＮＡ鋳型を用いたインビトロでの転写によって生成する。任意の供給源からの興味あるＤＮＡを、適切なプライマーとＲＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより、インビトロでのｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換することができる。ＤＮＡ供給源として、例えばゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または適切な他の任意のＤＮＡ供給源が可能である。一実施形態では、インビトロでの転写のための望ましい鋳型は、本明細書の別の箇所に記載されている治療用タンパク質である。
一実施形態では、ＰＣＲで使用するＤＮＡはオープンリーディングフレームを含有する。そのＤＮＡは、ある生物のゲノムからの天然ＤＮＡ配列に由来するものが可能である。一実施形態では、そのＤＮＡは、ある遺伝子の一部の興味ある完全長遺伝子である。その遺伝子は、５’および／または３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）のいくらかまたはすべてを含んでいる可能性がある。その遺伝子はエキソンとイントロンを含んでいる可能性がある。一実施形態では、ＰＣＲで使用するＤＮＡはヒト遺伝子である。別の一実施形態では、ＰＣＲで使用するＤＮＡは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲを含むヒト遺伝子である。別の一実施形態では、ＰＣＲで使用するＤＮＡは、病原性生物または片利共生生物（細菌、ウイルス、寄生虫、および真菌が含まれる）からの遺伝子である。別の一実施形態では、ＰＣＲで使用するＤＮＡは、病原性生物または片利共生生物（細菌、ウイルス、寄生虫、および真菌が含まれる）に由来し、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲを含む。あるいはＤＮＡとして、自然界の生物の中では通常発現しない人工ＤＮＡ配列が可能である。１つの代表的な人工ＤＮＡ配列は、遺伝子のうちで、互いに連結されて融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成する部分を含有する配列である。ＤＮＡの互いに連結される部分は、単一の生物、または２つ以上の生物に由来することができる。
ＰＣＲのためのＤＮＡ供給源として使用できる遺伝子には、生物の中で適応免疫応答を誘導または増強するポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。好ましい遺伝子は、短期の治療に有用な遺伝子であるか、用量または発現する遺伝子に関する安全性の懸念がある遺伝子である。
さまざまな実施形態では、プラスミドは、トランスフェクションに使用されるＲＮＡのインビトロでの転写のための鋳型を生成させるのに使用される。
安定性および／または翻訳効率を向上させる能力を有する化学構造も使用できる。ＲＮＡは５’ＵＴＲと３’ＵＴＲを有することが好ましい。一実施形態では、５’ＵＴＲは長さが０～３０００個のヌクレオチドである。コード領域に付加する５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの配列長はさまざまな方法によって変えることができる。方法の非限定的な例に含まれるのは、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲ用プライマーを設計することである。当業者は、このアプローチを利用して、転写されたＲＮＡをトランスフェクトした後に最適な翻訳効率を実現するのに必要な５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの長さを変えることができる。
５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲとして、興味ある遺伝子のための天然の内在性の５’ＵＴＲと３’ＵＴＲが可能である。あるいは興味ある遺伝子に内在していないＵＴＲ配列を、ＵＴＲ配列を順プライマーと逆プライマーに組み込むことによって、または鋳型の他の任意の改変によって付加することができる。興味ある遺伝子に内在していないＵＴＲ配列の使用はＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を変化させるのに有用である可能性がある。例えば３’ＵＴＲ配列の中のＡＵリッチなエレメントはＲＮＡの安定性を低下させることができることが知られている。したがって３’ＵＴＲは、転写されたＲＮＡの安定性を本分野でよく知られているＵＴＲの特性に基づいて増加させるように選択または設計することができる。
一実施形態では、５’ＵＴＲは、内在性遺伝子のコザック配列を含有することができる。あるいは興味ある遺伝子に内在していない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲによって付加するときには、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスコザック配列を再設計することができる。コザック配列はいくつかのＲＮＡ転写産物の翻訳効率を向上させることができるが、効率的な翻訳を可能にするのに全ＲＮＡにとって必要であるようには見えない。多くのＲＮＡにとってコザック配列が必要であることが本分野で知られている。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞の中で安定であるＲＮＡウイルスに由来することが可能である。他の実施形態では、さまざまなヌクレオチド類似体を３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲの中で用いてエキソヌクレアーゼによるＲＮＡの分解を阻止する。
遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成できるようにするため、転写のプロモータは、転写される配列の上流でＤＮＡ鋳型に付着させねばならない。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータとして機能する配列を順プライマーの５’末端に付加するとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモータは、ＰＣＲ産物の中に、転写されるオープンリーディングフレームの上流で組み込まれる。好ましい一実施形態では、プロモータは、本明細書の別の箇所に記載されているようにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータである。他の有用なプロモータの非限定的な例に含まれるのは、Ｔ３とＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモータである。Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６プロモータのためのコンセンサスヌクレオチド配列は本分野で知られている。
好ましい一実施形態では、ＲＮＡは、細胞内でのリボソームへの結合、翻訳の開始、およびｍＲＮＡの安定性を決定する５’末端のキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有する。環状ＤＮＡ鋳型（例えばプラスミドＤＮＡ）上で、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長い鎖状生成物を生成させる。３’ＵＴＲの末端で線状にされたプラスミドＤＮＡが転写される結果として通常のサイズのＲＮＡになるため、真核細胞へのトランスフェクションにおいて転写後にポリアデニル化されるときに有効である。
線状ＤＮＡ鋳型上でファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは転写産物の３’末端を鋳型の最後の塩基を超えて伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ， Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３：６２２３－３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ ａｎｄ Ｂｅｒｚａｌ－Ｈｅｒｒａｎｚ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２７０：１４８５－６５（２００３）。
ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に組み込む従来法は分子クローニングである。しかしプラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列はプラスミドの不安定性を引き起こす可能性がある。それは、プラスミド増殖のための組み換え不能細菌細胞の使用を通じて改善することができる。
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、インビトロでの転写の後にポリ（Ａ）ポリメラーゼ（大腸菌ポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）または酵母ポリＡポリメラーゼなど）を用いてさらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さを１００個のヌクレオチドから３００個と４００個の間のヌクレオチドまで増加させると、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍に増大する。それに加え、３’末端への異なる化学基の付着はＲＮＡの安定性を増大させることができる。このような付着は、修飾された／人工のヌクレオチド、アプタマー、および他の化合物を含有することができる。例えばポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてＡＴＰ類似体をポリ（Ａ）テールの中に導入することができる。ＡＴＰ類似体はＲＮＡの安定性をさらに増大させることができる。
５’キャップもＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい一実施形態では、本方法によって生成したＲＮＡは、５’キャップ１構造を含む。このようなキャップ１構造は、ワクシニアキャッピング酵素と２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素を用いて生成させることができる（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ、マディソン、ウィスコンシン州）。あるいは５’キャップは、本分野で知られていて本明細書に記載されている技術を利用して提供される（Ｃｏｕｇｏｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ２９：４３６－４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ， ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ， ７：１４６８－９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３３０：９５８－９６６ （２００５））。
イメージング剤
一実施形態では、送達用担体はイメージング剤を含む。イメージング剤は、送達用担体を細胞または組織への曝露後に可視化できるようにする材料である。可視化には、裸眼のためのイメージングのほか、装置を用いた検出、または通常は目に見えない情報の検出を必要とするイメージングが含まれるとともに、光子、音、または他のエネルギー量子の検出を必要とするイメージングが含まれる。例に含まれるのは、染色、生死判別染料、蛍光マーカー、放射性マーカー、酵素、またはマーカーまたは酵素をコードするプラスミドコンストラクトである。送達用担体の中で使用できるイメージングとターゲティングのための多くの材料と方法は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｉｍａｇｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ， Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ， ｅｄ．（１９９５）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ボカ・ラトン、フロリダ州の中に提供されている。
分子イメージングに基づく可視化は、典型的には、組織、細胞、または分子のレベルで生物学的プロセスまたは生物分子を検出することを含む。分子イメージングを利用して、遺伝子療法、細胞に基づく療法のための特定の標的を評価することや、診断または研究のツールとしての病的状態を可視化することができる。細胞内に送達できるイメージング剤が特に有用である。なぜならそのようなイメージング剤は細胞内の活性または状態を評価するのに使用できるからである。イメージング剤は、有効であるためには対応する標的に到達せねばならない；そこでいくつかの実施形態では、細胞による効率的な取り込みが望ましい。迅速な取り込みはＲＥＳを回避するためにも望ましい可能性がある。Ａｌｌｐｏｒｔ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １２３７－１２４６（２００１）の中のレビューを参照されたい。
さらに、イメージング剤は、直接にであれ、特定の標的に伴うシグナルを増大させる効果的な増幅技術によってであれ、少量で検出できるようにするため大きな信号対雑音比を提供することが好ましい。増幅戦略は、Ａｌｌｐｏｒｔ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １２３７－１２４６（２００１）に概説されており、例えばアビジン－ビオチン結合系、変換されたリガンドの捕捉、標的に結合した後に物理的挙動が変化するプローブ、および緩和速度の活用を含む。イメージング技術の例に含まれるのは、磁気共鳴イメージング、放射性核種イメージング、コンピュータ断層撮影、超音波、および光学的イメージングである。
本明細書に示されている送達用担体は、例えばイメージング剤を送達用担体に組み込むことにより、さまざまなイメージング技術または戦略において有利に使用することができる。多くのイメージング技術と戦略が知られている。例えばＡｌｌｐｏｒｔ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １２３７－１２４６（２００１）の中のレビューを参照されたい；このような戦略を送達用担体とともに使用するのに適したようにすることができる。適切なイメージング剤に含まれるのは、例えば蛍光分子、標識された抗体、標識されたアビジン：ビオチン結合剤、コロイド状金属（例えば金、銀）、レポータ酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）、超常磁性トランスフェリン、第２のレポータ系（例えばチロシナーゼ）、および常磁性キレートである。
いくつかの実施形態では、イメージング剤は磁気共鳴イメージング造影剤である。磁気共鳴イメージング剤の非限定的な例に含まれるのは、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ′，Ｎ″Ｎ′″－四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデキサン－Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ′″－テトラエチルリン（ＤＯＴＥＰ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ′，Ｎ″－三酢酸（ＤＯＴＡ）、およびこれらの誘導体である（アメリカ合衆国特許第５，１８８，８１６号、第５，２１９，５５３号、第５，３５８，７０４号参照）。いくつかの実施形態では、イメージング剤はＸ線造影剤である。本分野ですでに知られているＸ線造影剤に含まれるのは、多数のハロゲン化誘導体、特に５－アミノ－イソフタル酸のヨード化誘導体である。
小分子剤
さまざまな実施形態では、薬剤は小分子である。薬剤が小分子であるとき、その小分子は、当業者に知られている標準的な方法を利用して取得することができる。そのような方法には化学的有機合成または生物学的手段が含まれる。生物学的手段には、本分野で周知の方法を用いる生物供給源からの精製、組み換え合成、およびインビトロ翻訳系が含まれる。一実施形態では、小分子剤に、有機分子、無機分子、生体分子、合成分子などが含まれる。
多彩な疾患と状態の治療に有用である可能性がある分子的に多様な化合物のコンビナトリアルライブラリと、それらライブラリを作製する方法は、本分野でよく知られている。この方法では当業者に周知の多彩な技術を利用することができる。技術に含まれるのは、固相合成、溶液法、複数の単一化合物の並列合成、化学的混合物の合成、堅固なコア構造、可撓性線状配列、デコンボリューション戦略、タグ付け技術、およびリード発見のためのバイアスのない分子ランドスケープの生成とリード開発のためのバイアス有り構造の対比である。本発明のいくつかの実施形態では、薬剤はコンビナトリアル技術を利用して合成および／または同定される。
小ライブラリ合成のための一般的な１つの方法では、１個の活性化されたコア分子が多数の建築ブロックとともに凝縮される結果として共有結合したコア建設ブロックの集合のコンビナトリアルライブラリが得られる。コアの形と堅固さが、形状空間における建設ブロックの向きを決める。ライブラリは、コア、連結、または建築ブロックを変えることによってバイアスをかけ、特徴づけられた生物構造を標的とすること（「フォーカスされたライブラリ」）、または可撓性コアを用いて構造的バイアスがより少ないものを合成することができる。本発明のいくつかの実施形態では、薬剤は小さなライブラリの合成を通じて合成される。
本明細書に記載されている小分子と小分子化合物は、塩として存在することが、たとえ塩が示されていない場合でも可能であるため、本発明は、当業者によく理解されているように、本明細書に示されている薬剤のあらゆる塩と溶媒和物のほか、薬剤の非塩形態と非溶媒和物形態を包含すると理解される。いくつかの実施形態では、本発明の薬剤の塩は医薬として許容可能な塩である。
本明細書に記載されているいずれかの薬剤に関する互変異性体形態が存在する可能性がある場合には、互変異性体形態の１つまたはいくつかのみ明示的に示されているとしても、それぞれの互変異性体形態がすべて本発明に含まれることが想定されている。例えば２－ヒドロキシピリジル部分が示されているとき、対応する２－ピリドン互変異性体も想定される。
本発明には任意の、またはすべての立体化学形態も含まれ、その中には記載されている薬剤の任意の鏡像異性体形態またはジアステレオマー形態が含まれる。本明細書での構造または名称への言及は、示されている薬剤のあらゆる可能な立体異性体を包含することを意図している。薬剤のあらゆる形態（薬剤の結晶形態または非結晶形態など）も本発明に包含される。本発明の薬剤を含む組成物も想定され、その中には、実質的に純粋な薬剤（その特別な立体化学形態が含まれる）の組成物、またはラセミ混合物または非ラセミ混合物におけるように本発明の薬剤の任意の比率での混合物（その中には２つ以上の立体化学形態が含まれる）を含む組成物が含まれる。
本発明には、本明細書に記載されている任意の薬剤の任意の、またはすべての活性な類似体または誘導体（プロドラッグなど）も含まれる。一実施形態では、薬剤はプロドラッグである。一実施形態では、本明細書に記載されている小分子は誘導体化の候補である。そのためある場合には、本明細書に記載されている小分子の類似体であって変化した効力、選択性、および溶解性を有するものが本明細書に含まれ、それが薬の発見と開発のための有用なリードを提供する。そのためある場合には、最適化の間、薬送達、代謝、新規性、および安全性の問題を考慮して新たな類似体が提供される。
いくつかの場合には、本明細書に記載されている小分子剤は、コンビナトリアル化学と医薬品化学の分野で周知の既知の薬剤の誘導体または類似体である。それら類似体または誘導体は、さまざまな位置で官能基を付加および／または置換することによって調製することができる。そのため本明細書に記載されている小分子は、よく知られている化学合成手続きを用いて誘導体／類似体に変換することができる。例えば水素原子または置換基のすべてを選択的に修飾して新たな類似体を生成させることができる。また、前記連結原子または基を修飾して炭素骨格またはヘテロ原子を有するより長いリンカーまたはより短いリンカーにすることができる。また、環基を変化させ、環の中に異なる原子の数を有するようにすること、および／またはヘテロ原子が含まれるようにすることができる。さらに、芳香族を環基に変換することと、その逆が可能である。例えば環は、５～７個の原子であることと、炭素環または複素環であることが可能である。
本明細書では、「類似体（ａｎａｌｏｇ）」、「類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）」、または「誘導体」という用語は、親化合物または親分子から１つ以上の化学反応によって作製される化合物または分子を意味する。そのため類似体は、本明細書に記載されている小分子剤の構造と似た構造を有する構造であること、または本明細書に記載されている小分子剤の足場に基づくことが可能だが、それとはある構成要素または構造的構成に関して異なるため代謝的に似た作用または逆の作用を有する可能性がある。本発明による任意の小分子阻害剤の類似体または誘導体を用いて疾患または障害を治療することができる。
一実施形態では、本明細書に記載されている小分子剤は、水素基を互いに独立に他の置換基に変えることによって独立に誘導体化すること、または前記小分子剤から類似体を調製することができる。すなわち、各分子上の各原子は独立に、同じ分子上の他の原子に対して修飾することができる。誘導体／類似体を生成させるための伝統的な任意の修飾を利用することができる。例えば前記原子と置換基は独立に、水素、アルキル、脂肪族、鎖ヘテロ原子を有する直鎖脂肪族、分岐した脂肪族、置換された脂肪族、環式脂肪族、１個以上のヘテロ原子を有する複素環式脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族、ポリ芳香族、ポリアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、これらの組み合わせ、ハロゲン、ハロ置換された脂肪族などからなることができる。それに加え、化合物上の任意の環基を誘導体化して環のサイズを大きく、および／または小さくすることのほか、骨格原子を炭素原子またはヘテロ原子に変えることができる。
ポリペプチド剤
他の関連する側面では、前記薬剤は、標的を変化させる単離されたペプチドを含む。例えば一実施形態では、本発明のペプチドは標的に結合することによってその標的を直接阻害または活性化し、そのことによって標的の通常の機能的活性を変化させる。一実施形態では、本発明のペプチドは、内在性タンパク質と競合することによって標的を変化させる。一実施形態では、本発明のペプチドは、トランスドミナント・ネガティブ変異体として作用することによって標的の活性を変化させる。
ポリペプチド剤のバリアントとして、（ｉ）中に含まれるアミノ酸残基の１個以上が、保存された、または保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されているもの（そのように置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされていてもいなくてもよい）、（ｉｉ）１個以上の修飾されたアミノ酸残基（例えば置換基の付着によって修飾された残基）が中に存在しているもの、（ｉｉｉ）そのポリペプチドが、本発明のポリペプチドの選択的スプライスバリアントであるもの、（ｉｖ）そのポリペプチドの断片、および／または（ｖ）そのポリペプチドが、別のポリペプチド（リーダー配列、または分泌配列、または精製（例えばＨｉｓタグ）または検出（例えばＳｖ５エピトープタグ）に使用される配列）と融合しているものが可能である。断片は、元の配列のタンパク質分解（多部位タンパク質分解を含む）による切断を通じて生成したポリペプチドを含む。バリアントは、翻訳後修飾されるか化学的に修飾されてもよい。このようなバリアントは、本明細書の教示から当業者の範囲であると見なされる。
抗体剤
本発明では、標的に対して特異的な抗体または抗体断片を含む送達用担体も考慮する。すなわち抗体は、標的を阻害して有益な効果を提供することができる。
抗体として、インタクトモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と、免疫学的に活性な断片（例えばＦａｂまたは（Ｆａｂ）２断片）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、遺伝子操作された一本鎖ＦＶ分子（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ、アメリカ合衆国特許第４，９４６，７７８号）、またはキメラ抗体（例えばマウス抗体の結合特異性を含むが、残部はヒト起源である抗体）が可能である。抗体は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体、断片、およびキメラを含め、当業者に知られている方法を利用して調製することができる。
抗体は、興味ある免疫化抗原を含有するインタクトポリペプチドまたは断片を用いて調製することができる。動物の免疫化に使用されるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から得ること、または化学的に合成することができ、望むのであれば担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。ペプチドに化学的にカップルさせることのできる適切な基剤に含まれるのは、ウシ血清アルブミンとサイログロブリン、キーホールカサガイヘモシアニンである。その後、カップルしたポリペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット、またはウサギ）を免疫化することができる。
ＣＡＲ剤
一実施形態では、前記薬剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組み換え核酸配列を含む。一実施形態では、薬剤は、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子を含む。一実施形態では、薬剤は、ＣＡＲをコードする修飾されたヌクレオシドｍＲＮＡ分子を含む。
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、本明細書では、免疫エフェクタ細胞の表面に発現して抗原に特異的に結合するように操作された人工Ｔ細胞受容体を意味する。ＣＡＲは、養子細胞移入を伴う療法として利用することができる。Ｔ細胞が患者から取り出されて修飾され、特定の形態の抗原に対して特異的な受容体を発現する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、選択された標的（例えば線維芽細胞の細胞表面受容体）に対する特異性を有する。ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および選択された標的（例えば細胞表面受容体）に特異的に結合する抗原結合領域を含む細胞外ドメインも含むことができる。
一実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組み換え核酸配列（例えばｍＲＮＡ）を含む薬剤を含む送達用担体に関する。一実施形態では、薬剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡ分子（例えば修飾されたヌクレオシドｍＲＮＡ分子）を含む。一実施形態では、薬剤は、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子を含む。一実施形態では、薬剤は、ＣＡＲをコードする、ヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡ分子を含む。
さまざまな実施形態では、本明細書で考慮するＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインはヒンジドメインも含む。ある実施形態では、細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域とゼータ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域は、ＣＡＲのうちで共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分を意味する。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそのリガンドではない細胞表面分子である。
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインの間には、スペーサドメインを組み込むことができる。本明細書では、「スペーサドメイン」という用語は一般に、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の中の細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかに連結する機能がある任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサドメインは、５個のアミノ酸、または１０個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸、または３０個のアミノ酸、または４０個のアミノ酸、または５０個のアミノ酸、または６０個のアミノ酸、または７０個のアミノ酸、または８０個のアミノ酸、または９０個のアミノ酸、または１００個のアミノ酸、または１１０個のアミノ酸、または１２０個のアミノ酸、または１３０個のアミノ酸、または１４０個のアミノ酸、または１５０個のアミノ酸、または１６０個のアミノ酸、または１７０個のアミノ酸、または１８０個のアミノ酸、または１９０個のアミノ酸、または２００個のアミノ酸、または２１０個のアミノ酸、または２２０個のアミノ酸、または２３０個のアミノ酸、または２４０個のアミノ酸、または２５０個のアミノ酸、または２６０個のアミノ酸、または２７０個のアミノ酸、または２８０個のアミノ酸、または２９０個のアミノ酸、または３００個のアミノ酸まで含むことができる。
細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインは、これらドメインの望ましい任意の供給源に由来することが可能である。
ＣＡＲ抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、リガンド結合および／またはシグナル伝達に関係する多彩な細胞外ドメインまたは分泌されたタンパク質の任意のものから得ることができる。一実施形態では、抗原結合ドメインはＩｇ重鎖からなることができ、そのＩｇ重鎖が今度は、ＣＨＩとヒンジ領域が存在するためＩｇ軽鎖と共有結合すること、またはヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインが存在するため他のＩｇ重鎖／軽鎖複合体に共有結合することができる。後者の場合には、キメラコンストラクトにコンジュゲートされる重鎖／軽鎖複合体は、キメラコンストラクトの抗体特異性とは異なる特異性を有する抗体を構成することができる。抗体の機能、望ましい構造、およびシグナル伝達に応じ、鎖全体を用いること、またはＣＨＩ、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインのすべてまたは一部が除去されるか、ヒンジ領域のすべてまたは一部が除去されていてもよい短縮された鎖を用いることができる。
さまざまな実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、ヒト化すること、または完全ヒト配列を含むことができる。
ＣＡＲ膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関し、本開示のＣＡＲは、このＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。一実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つに天然状態で会合している膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合には、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換によって改変することによりそのようなドメインが同じか異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最少にすることができる。
膜貫通ドメインは天然供給源または合成供給源のいずれかに由来することができる。供給源が天然のものである場合には、そのドメインは任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来することができる。本発明で特に用いられる膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来する（すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む）ことが可能である。あるいは膜貫通ドメインは合成したものが可能であり、その場合には疎水性残基（ロイシンとバリンなど）を主に含むことになる。一実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットを合成膜貫通ドメインのそれぞれの端部に見いだすことができる。場合により、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー（例えば長さが２～１０個のアミノ酸だが、それに限定されない）がＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間の結合を形成することができる。別の一実施形態では、リンカーはグリシン－セリンのダブレットである。
ＣＡＲ細胞内ドメイン
さまざまな実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内ドメインは、ＣＡＲが内部で発現する免疫細胞の通常のエフェクタ機能の少なくとも１つの活性化の原因である可能性がある。「エフェクタ機能」という用語は、細胞の１つの特殊化された機能を意味する。例えばＴ細胞のエフェクタ機能は細胞溶解活性またはヘルパー活性である可能性があり、その中にサイトカインの分泌が含まれる。「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、１つのタンパク質のうちでエフェクタ機能シグナルを伝達して細胞が特定の機能を実行するよう指示する部分を意味する。通常は細胞内ドメイン全体を使用できるが、多くの場合に鎖全体を使用する必要はない。細胞内ドメインの短縮された部分を使用する限り、そのように短縮された部分をインタクト鎖の代わりに使用できるが、それがエフェクタ機能シグナルを伝達することが条件である。したがって細胞内ドメインという用語は、細胞内ドメインのうちでエフェクタ機能シグナルを伝達するのに十分な任意の短縮された部分を含むことを意味する。
本開示のＣＡＲで使用するための細胞内ドメインの好ましい例に含まれるのは、抗原受容体に係合した後にシグナル伝達を開始させるのに共同して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と共受容体の細胞質配列のほか、これら配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列である。
ＴＣＲを通じて生成したシグナルのみではＴ細胞の十分な活性化に不十分であり、二次的シグナルまたは共刺激シグナルも必要とされることが知られている。したがってＴ細胞活性化は２つのクラスの細胞内シグナル伝達配列によって媒介されると言える。すなわちＴＣＲを通じて抗原に依存した一次活性化を開始させる配列（一次細胞質グナル伝達配列）と、抗原とは独立なやり方で作用して二次的または共刺激シグナルを提供する配列（二次的細胞質シグナル伝達配列）である。
一次細胞内シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を促進または抑制するように調節する。促進作用をする一次細胞内シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（すなわちＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含有することができる。
本発明で特に使用される一次細胞内シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例に含まれるのは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものである。一実施形態では、本発明のＣＡＲの中の細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞内シグナル伝達配列を含む。
別の一実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含むように、または本発明のＣＡＲの文脈で有用な他の任意の望ましい細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。例えばＣＡＲの細胞内ドメインはＣＤ３ゼータ鎖部分と共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域領域は、ＣＡＲのうちで共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分を意味する。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそのリガンドではない細胞表面分子である。このような分子の例に含まれるのは、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｏｘ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどである。
本発明のＣＡＲの細胞内ドメインの中にある細胞内シグナル伝達配列は、互いにランダムに、または特定の順番で連結させることができる。場合により、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー（例えば長さが２～１０個のアミノ酸）が連結を形成することができる。グリシン－セリンダブレットが、いくつかの実施形態で適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインとＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインと４－ＩＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
さまざまな実施形態では、ＣＡＲとして「第１世代」、「第２世代」、「第３世代」、「第４世代」、または「第５世代」のＣＡＲが可能である（例えばＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ３（４）：３８８－３９８（２０１３）；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２５７：１２７－１３３（２０１４）；Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓ． Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ． ８（４）：３３７－３５０（２０１５）；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３：５４２６－５４３５（２００７）；Ｇａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６５：９０８０－９０８８（２００５）；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：７０－７５（２００２）；Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３：２１４３－２１５０（２００４）；Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）；Ｈｏｌｌｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３２：１６９－１８０（２００９）を参照されたい；そのそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれている）。
本発明で使用するための「第１世代」ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質／細胞内ドメインに融合された膜貫通ドメインに融合された抗原結合ドメイン（例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む。「第１世代」ＣＡＲは典型的には、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）からのシグナルの主要なトランスミッタであるＣＤ３ζ鎖由来の細胞内ドメインを有する。「第１世代」ＣＡＲは、新たな抗原認識を提供し、ＨＬＡを媒介とする抗原提示とは独立に、ＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞両方の活性化を、単一の融合分子内にあるそれら細胞のＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを通じて引き起こすことができる。
本発明で使用するための「第２世代」ＣＡＲは、Ｔ細胞を活性化させることのできる細胞内シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメイン（例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））と、Ｔ細胞の効力と持続性を増大させる設計の共刺激ドメインを含む（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ３：３８８－３９８（２０１３））。したがってＣＡＲの設計では、２つの別々の複合体、すなわちＴＣＲヘテロ二量体とＣＤ３複合体によって生理学的に担われている２つの機能である抗原認識とシグナル伝達を組み合わせることができる。「第２世代」ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞質尾部の中にさまざまな共刺激分子（例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０など）からの細胞内ドメインを含み、細胞に追加シグナルを提供する。
「第２世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８ドメインまたは４－１ＢＢドメインによる共刺激と、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化の両方を提供する。臨床前研究は、「第２世代」ＣＡＲがＴ細胞の抗腫瘍活性を改善できることを示した。例えば「第２世代」ＣＡＲで改変したＴ細胞のロバストな有効性が、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）の患者と急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者でＣＤ１９分子を標的とした臨床試験において実証された（Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ． １（９）：１５７７－１５８３（２０１２））。
「第３世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８ドメインと４－１ＢＢドメインの両方を含むことによる多重共刺激と、例えばＣＤ３ζ活性化ドメインを含むことによる活性化を提供する。
「第４世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８ドメインまたは４－１ＢＢドメインによる共刺激と、構成的または誘導性のケモカイン成分に加えて例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化を提供する。
「第５世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８ドメインまたは４－１ＢＢドメインによる共刺激と、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（構成的または誘導性のケモカイン成分）とサイトカイン受容体（例えばＩＬ－２Ｒβ）の細胞内ドメインによる活性化を提供する。
さまざまな実施形態では、ＣＡＲは多価ＣＡＲ系（例えばＤｕａｌＣＡＲまたは「ＴａｎｄｅｍＣＡＲ」系）に含めることができる。多価ＣＡＲ系は、多重ＣＡＲを含む系または細胞と、２つ以上の抗原を標的とする２価／二重特異性ＣＡＲを含む系または細胞を含む。
本明細書に開示されている実施形態では、上述のように、ＣＡＲは一般に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。特別な非限定的な一実施形態では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。
一実施形態では、抗原結合ドメインはターゲティングドメインであり、このターゲティングドメインが、ＣＡＲを発現しているＴ細胞を興味ある特定の細胞または組織に向かわせる。例えば一実施形態では、ターゲティングドメインは、抗原（例えばサレフ抗原または外来抗原）に特異的に結合する抗体、抗体断片、またはペプチドを含み、そのことによってＣＡＲを発現しているＴ細胞を、抗原を発現している細胞または組織に向かわせる。
興味ある任意の望ましい抗原またはその断片（その非限定的な例に含まれるのは、腫瘍抗原、外来抗原（例えば細菌抗原またはウイルス抗原）または自己抗原である）に反応する本発明のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインを生成させることができる。
腫瘍抗原は、免疫応答を誘導する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の融合分子を含有するＶＭ－ドメインの抗原結合ドメインの選択は、治療するがんの具体的なタイプに依存するであろう。腫瘍抗原は本分野で周知であり、その中に含まれるのは、例えば神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンとテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、およびメソテリンである。別の代表的な腫瘍抗原は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）（黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、またはニューロン－神経膠腫抗原２（ＮＧ２）とも呼ばれる）である。
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能することのできる多数のタンパク質を発現する。これら分子の非限定的な例に含まれるのは、黒色腫における組織特異的抗原（ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、およびＧＰ１００など）と、前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）である。他の標的分子は形質転換関連分子（がん遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２など）のグループに属する。標的抗原のさらに別のグループは癌胎児抗原（癌胎児性抗原（ＣＥＡ）など）である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個別の腫瘍に独自の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３７など）は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これら抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）はモノクローナル抗体を用いた受動的免疫療法の標的として用いられてきたが、成功は限定されている。
本発明で言及される腫瘍抗原のタイプとして腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）も可能である。ＴＳＡは腫瘍細胞に独自であり、体内の他の細胞には生じない。ＴＡＡ関連抗原は腫瘍細胞に独自だが、代わりに抗原に対する免疫寛容状態を誘導できない条件下では正常な細胞の表面にも発現する。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できるようにする条件下で起こる可能性がある。ＴＡＡとして、胎児発達の間に免疫系が未熟で応答できないときに正常な細胞の表面に発現する抗原が可能である。あるいはＴＡＡとして、正常な細胞上に通常はごく低レベルで存在するが腫瘍細胞上にははるかに高いレベルで発現する抗原が可能である。
ＴＳＡ抗原またはＴＡＡ抗原の非限定的な例に含まれるのは、以下のもの、すなわち分化抗原（ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、および腫瘍特異的多系統性抗原（ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５など）など）；過剰発現した胎児性抗原（ＣＥＡなど）；過剰発現したがん遺伝子と変異した腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなど）；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲなど；およびウイルス抗原（エプスタイン・バールウイルス抗原ＥＢＶＡやヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６とＥ７など）である。他の大きなタンパク質系抗原に含まれるのは、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトタンパク質、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ２７．２９、ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０／Ｍａｃ－２結合タンパク質、シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳである。
外来抗原として、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、またはこれらの断片、またはこれらのバリアントが可能である。本発明の組成物と方法を用いて標的とすることのできる代表的なウイルス、細菌、真菌、および寄生虫は、本明細書の別の箇所で論じられている。
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（例えばＢｉＴＥ）剤
さらに別の一実施形態では、本開示の核酸カーゴ分子（例えばｍＲＮＡ、発現ベクター、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集系、またはヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡ分子）は、免疫細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）上の抗原と、興味ある細胞（例えばがん細胞）上の抗原の両方に特異的に結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャをコードすることができる。
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャは、２つの抗体のターゲティング領域（すなわち抗原結合ドメイン）を連結することによって単一の分子として生成する二重特異性分子である。この分子の１つのアームは細胞傷害性Ｔ細胞の表面に見られるあるタンパク質に結合するように操作され、他方のアームは主に標的細胞（例えば活性化された線維芽細胞）の表面に見られるある特定のタンパク質に結合するように設計される。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（すなわちＢｉＴＥ分子）は、両方の標的に係合するとき、細胞傷害性Ｔ細胞と標的細胞の間の架橋を形成することでＴ細胞が標的細胞を認識できるようにして標的細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の応答を生じさせ、そのことによってその標的分子を破壊するに至る。標的細胞と相互作用してその標的細胞に結合する分子の結合アームを変化させ、どの細胞特異的マーカーが存在するかに応じて異なるタイプの細胞を標的とする異なる抗原結合ドメインを創出することができる。さらにＤｉｅｇｏ Ｅｌｌｅｒｍａｎ， “Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ： Ｔｏｗａｒｄｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌ．１５４， Ｆｅｂ． ２０１９， ｐｐ．１０２－１１７を参照することができる（参照によって本明細書に組み込まれている）。
「二重特異性」という用語は、二重特異性分子（例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）が少なくとも２つの異なる抗原決定基（例えば１つはＴ細胞に由来し、もう１つは標的細胞（活性化された線維芽細胞など）に由来する）に特異的に結合できることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれは異なる抗原決定基に対して特異的である。ある実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞の表面に発現する２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
本開示はＢｉＴＥ形式に限定されず、Ｔ細胞リダイレクションに適した適切な任意の二重特異性形式を利用することを考慮する。二重特異性形式に含まれるのは、ディアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９， ２９９－３０５（１９９６））とその誘導体（タンデムディアボディなど）（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３， ４１－６６（１９９９））、ＤＡＲＴ（二重親和性リターゲティング）分子（ディアボディ形式に基づくが、追加の安定性のためＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする）（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ １１７， ４５４２－５１（２０１１））、およびトリオマブ（ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子の全体であって臨床試験において現在評価中でもあり、より大きなサイズ形式を表わす）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６， ４５８－４６７（２０１０）に概説）である。上記の参考文献のそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれている。
二重特異性抗体を作製する方法は本分野で知られている。（例えばＭｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７－５３９（１９８３）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯＪ．， １０：３６５５－３６５９（１９９１）；Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９０：６４４４－６４４８（１９９３）；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８（１９９４）；アメリカ合衆国特許第４，４７４，８９３号；第４，７１４，６８１号；第４，９２５，６４８号；第５，５７３，９２０号；第５，６０１，８１号；第９５，７３１，１６８号；第４，６７６，９８０号；および第４，６７６，９８０号、ＷＯ９４／０４６９０；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；およびＥＰ０３０８９を参照されたい）。二重特異性抗体（ＢｉＴＥを含む）の作製に関するこれら文献のそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれている。
本明細書に記載の方法を実施するのに役立つ代表的な二重特異性抗体分子に含まれるのは、（ｉ）２つの抗体、すなわち標的細胞（例えば活性化された線維芽細胞）の表面に発現する抗原に対する結合特異性を有する第１の抗体と、免疫細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）の表面に発現する抗原に対する結合特異性を有する第２の抗体、（ｉｉ）標的細胞（例えば活性化された線維芽細胞）の表面に発現する抗原に対する結合特異性を有する１つの鎖またはアームと、免疫細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）に対する結合特異性を有する第２の鎖またはアームを有する単一の抗体、（ｉｉｉ）例えば追加のペプチドリンカーによってタンデムに連結された２つのｓｃＦｖを介して標的細胞（例えば線維芽細胞）の表面に発現する抗原に対する結合特異性とともに免疫細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）に対する結合特異性も有する一本鎖抗体；（ｉｖ）それぞれの軽鎖と重鎖が短いペプチド結合を通じてタンデムになった２つの可変ドメインを含有する二重可変性ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）；（ｖ）化学的に連結された二重特異性（Ｆａｂ′）２断片；（ｖｉ）２つの一本鎖ディアボディが融合した結果として各標的抗原のため２つの結合部位を有する４価二重特異性抗体になったＴａｎｄａｂ；（ｖｉｉ）フレキシボディ（ｓｃＦｖがディアボディと組み合わさった結果である多価分子）；（ｖｉｉｉ）いわゆる「ドック・アンド・ロック」分子（プロテインキナーゼＡの中の「二量体化とドッキングドメイン」の翻案であり、Ｆａｂに適用して異なるＦａｂ断片に連結された２つの同じＦａｂ断片を含有する３価二重特異性結合タンパク質を生成させることができる）；（ｉｘ）例えばヒトＦｃ－領域の両端に融合した２つのｓｃＦｖを含有するいわゆる「サソリ」分子；（ｘ）ディアボディ；および（ｘｉ）いわゆる「ＩｍｍＴＡＣ」分子（がんに対してｍＴＣＲを動員する免疫；例えばＬｉｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １８：９８０－９８７（２０１２）参照）である。
送達用担体
いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤を送達するための送達用担体を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、その薬剤は、ヌクレオシドが修飾された本発明のｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、送達用担体はコロイド状分散系であり、それは、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルション、ミセル、混合されたミセル、およびリポソームが含まれる）などである。インビトロとインビボで送達用担体として使用するための１つの代表的なコロイド系はリポソーム（例えば人工膜小胞体）である。
前記少なくとも１つの薬剤を宿主細胞（インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）の中に導入するため脂質製剤の使用を考慮する。別の１つの側面では、前記少なくとも１つの薬剤は脂質と会合させることができる。脂質と会合した前記少なくとも１つの薬剤は、リポソームの水性内部の中に封入すること、リポソームの脂質二重層の中に散在させること、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに付着させること、リポソームの中に捕捉すること、リポソームとの複合体にすること、脂質を含有する溶液の中に分散させること、脂質と混合すること、脂質と組み合わせること、懸濁液として脂質の中に含めること、ミセルの中に含めるかミセルとの複合体にすること、またはそれ以外に脂質と会合させることができる。脂質、脂質／核酸、または脂質／発現ベクターが会合した組成物が溶液中でどれか特定の構造に限定されることはない。例えば組成物は、二相構造で存在すること、ミセルとして存在すること、または「崩壊した」構造で存在することができる。組成物は溶液の中に単純に散在させることもでき、おそらくサイズまたは形が一様でない凝集体を形成する。脂質は脂肪物質であり、天然脂質または合成脂質が可能である。例えば脂質には、細胞質の中で自然に生じる脂肪液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体（脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど）を含有する化合物のクラスが含まれる。
脂質とその誘導体
さまざまな実施形態では、送達用担体は脂質またはその誘導体を含むことができる。
脂質は脂肪物質であり、天然脂質または合成脂質が可能である。例えば脂質には、細胞質の中で自然に生じる脂肪液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体（脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒド、およびポリマー（例えばＰＥＧ化脂質）など）を含有する化合物のクラスが含まれる。
使用に適した脂質は商用品供給者から取得することができる。例えばジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はＳｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州から取得することができる；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（プレインヴュー、ニューヨーク州）から取得することができる；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから取得することができる；ジミリスチルジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）と他の脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ．（バーミンガム、アラバマ州）から取得することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノールの中の脂質の貯蔵溶液は約－２０℃で保管することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。
一実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上の安定化脂質を含む。安定化脂質には中性脂質とｐｅｇ化脂質が含まれる。
一実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質を含む。本明細書では、「カチオン性脂質」という用語は、カチオン性である脂質、またはｐＨが脂質のイオン化可能な基のｐＫよりも小さくなるにつれてカチオン性になる（プロトン化される）が、より大きなｐＨ値では徐々により中性になる脂質を意味する。そのため脂質は、ｐＫよりも低いｐＨ値では負に帯電した核酸と会合することができる。ある実施形態では、カチオン性脂質は、ｐＨが低下したときに正電荷になる双性イオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が好ましい。ある実施形態では、カチオン性脂質は、選択したｐＨ（生理学的ｐＨなど）で正味の正電荷を有する多くの脂質種の任意のものを含む。このような脂質の非限定的な例に含まれるのは、塩化Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）；塩化Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；臭化Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；塩化Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、トリフルオル酢酸Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、および臭化Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）である。それに加え、カチオン性脂質の多数の市販の調製物を入手することができ、それらを本発明で使用できる。その中に含まれるのは、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（グランド・アイランド、ニューヨーク州）から市販されていてＤＯＴＭＡと１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されていてトリフルオロ酢酸Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム（ＤＯＳＰＡ）と（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム）；およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（マディソン、ウィスコンシン州）から市販されていてエタノールの中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含むカチオン性脂質）である。以下の脂質はカチオン性であり、生理学的ｐＨよりも下で正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。
一実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。本発明で有用な適切なアミノ脂質に含まれるのはＷＯ２０１２／０１６１８４に記載されているものであり、その全体が本明細書に参照によって組み込まれている。代表的なアミノ脂質の非限定的な例に含まれるのは、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、および２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）である。
適切なアミノ脂質に含まれるのは、式：
を有するものである（上式中、Ｒ１とＲ２は同じであるか異なっており、独立に、場合により置換されたＣ１０－Ｃ２４アルキル、場合により置換されたＣ１０－Ｃ２４アルケニル、場合により置換されたＣ１０－Ｃ２４アルキニル、または場合により置換されたＣ１０－Ｃ２４アシルであり；
Ｒ３とＲ４は同じであるか異なっており、独立に、場合により置換されたＣ１－Ｃ６アルキル、場合により置換されたＣ２－Ｃ６アルケニル、または場合により置換されたＣ２－Ｃ６アルキニルであるか、Ｒ３とＲ４は合わさって、４～６個の炭素原子と、窒素と酸素から選択される１または２個のヘテロ原子とからなる場合により置換された複素環を形成することができ；
Ｒ５は不在であるか存在しているかのいずれであり、存在しているときには水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
ｍ、ｎ、およびｐは同じであるか異なっており、独立に０または１だが、ｍ、ｎ、およびｐが同時に０であることはなく；
ｑは、０、１、２、３、または４であり；
ＹとＺは同じであるか異なっており、独立にＯ、Ｓ、またはＮＨである）。
一実施形態では、Ｒ１とＲ２はそれぞれリノレイルであり、アミノ脂質はジリノレイルアミノ脂質である。一実施形態では、アミノ脂質はジリノレイルアミノ脂質である。
代表的な有用な１つのジリノレイルアミノ脂質は、式：
を有する（上式中、ｎは、０、１、２、３、または４である）。
一実施形態では、カチオン性脂質はＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡである。一実施形態では、カチオン性脂質はＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（上記のＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡであり、その中のｎは２である）である。
一実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（Ｉ）：
の構造、またはその医薬として許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグ、または立体異性体を有する（上式中、
Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または炭素－炭素二重結合であり；
Ｒ１ａとＲ１ｂは出現するごとに独立に、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ１ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ１ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって炭素－炭素二重結合を形成するのいずれかであり；
Ｒ２ａとＲ２ｂは出現するごとに独立に、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ２ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ２ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって炭素－炭素二重結合を形成するのいずれかであり；
Ｒ３ａとＲ３ｂは出現するごとに独立に、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ３ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ３ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって炭素－炭素二重結合を形成するのいずれかであり；
Ｒ４ａとＲ４ｂは出現するごとに独立に、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ４ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ４ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって炭素－炭素二重結合を形成するのいずれかであり；
Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立に、メチルまたはシクロアルキルであり；
Ｒ７は出現するごとに独立に、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ８とＲ９はそれぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ１２アルキルであるか；Ｒ８とＲ９はこれらが付着した窒素原子と合わさって、１個の窒素原子を含む５、６、または７員の複素環を形成し；
ａとｄはそれぞれ独立に、０～２４の整数であり；
ｂとｃはそれぞれ独立に、１～２４の整数であり；
ｅは１または２である）。
式（Ｉ）のある実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、またはＲ４ａの少なくとも１つはＣ１－Ｃ１２アルキルである、またはＬ１またはＬ２の少なくとも１つは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施形態では、Ｒ１ａとＲ１ｂは、ａが６のときにはイソプロピルではない、またはａが８のときにはｎ－ブチルではない。
式（Ｉ）のさらなる実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、またはＲ４ａの少なくとも１つがＣ１－Ｃ１２アルキルであるか、Ｌ１またはＬ２の少なくとも１つが－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり；
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂは、ａが６のときにはイソプロピルではない、またはａが８のときにはｎ－ブチルではない。
式（Ｉ）の他の実施形態では、Ｒ８とＲ９はそれぞれ独立に、置換されていないＣ１－Ｃ１２アルキルであるか；Ｒ８とＲ９はこれらが付着した窒素原子と合わさって、１個の窒素原子を含む５、６、または７員の複素環を形成する；
式（Ｉ）のある実施形態では、Ｌ１またはＬ２のいずれか一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または炭素－炭素二重結合であることが可能である。Ｌ１とＬ２は、それぞれが－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であること、またはそれぞれが炭素－炭素二重結合であることが可能である。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方が－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。他の実施形態では、Ｌ１とＬ２の両方が－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方が－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施形態では、Ｌ１とＬ２の両方が－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（Ｉ）のいくつかの他の実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方が炭素－炭素二重結合である。他の実施形態では、Ｌ１とＬ２の両方が炭素－炭素二重結合である。
式（Ｉ）のさらに別の実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方が－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ１またはＬ２の他方が－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。さらなる実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方が－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ１またはＬ２の他方が炭素－炭素二重結合である。さらに別の実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方が－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方が炭素－炭素二重結合である。
本明細書全体で使用される「炭素－炭素」二重結合は、以下の構造：
の１つを意味すると理解される（上式中、ＲａとＲｂは出現するごとに独立に、Ｈまたは置換基である）。例えばいくつかの実施形態では、ＲａとＲｂは出現するごとに独立に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、またはシクロアルキル（例えばＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキル）である。
他の実施形態では、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（Ｉａ）：
を有する。
他の実施形態では、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（Ｉｂ）：
を有する。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（Ｉｃ）：
を有する。
式（Ｉ）の脂質化合物のある実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ独立に、２～１２の整数、または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ独立に、８～１２または５～９の整数である。いくつかのある実施形態では、ａは０である。いくつかの実施形態では、ａは１である。他の実施形態では、ａは２である、いくつかの実施形態では、ａは３である。さらに別の実施形態では、ａは４である。いくつかの実施形態では、ａは５である。他の実施形態では、ａは６である。さらなる実施形態では、ａは７である。さらに別の実施形態では、ａは８である。いくつかの実施形態では、ａは９である。他の実施形態では、ａは１０である。さらなる実施形態では、ａは１１である。さらに別の実施形態では、ａは１２である。いくつかの実施形態では、ａは１３である。他の実施形態では、ａは１４である。さらなる実施形態では、ａは１５である。さらに別の実施形態では、ａは１６である。
式（Ｉ）のいくつかの他の実施形態では、ｂは１である。他の実施形態では、ｂは２である。さらなる実施形態では、ｂは３である。さらに別の実施形態では、ｂは４である。いくつかの実施形態では、ｂは５である。他の実施形態では、ｂは６である。さらなる実施形態では、ｂは７である。さらに別の実施形態では、ｂは８である。いくつかの実施形態では、ｂは９である。他の実施形態では、ｂは１０である。さらなる実施形態では、ｂは１１である。さらに別の実施形態では、ｂは１２である。いくつかの実施形態では、ｂは１３である。他の実施形態では、ｂは１４である。さらなる実施形態では、ｂは１５である。さらに別の実施形態では、ｂは１６である。
式（Ｉ）のいくつかのさらなる実施形態では、ｃは１である。他の実施形態では、ｃは２である。さらなる実施形態では、ｃは３である。さらに別の実施形態では、ｃは４である。いくつかの実施形態では、ｃは５である。他の実施形態では、ｃは６である。さらなる実施形態では、ｃは７である。さらに別の実施形態では、ｃは８である。いくつかの実施形態では、ｃは９である。他の実施形態では、ｃは１０である。さらなる実施形態では、ｃは１１である。さらに別の実施形態では、ｃは１２である。いくつかの実施形態では、ｃは１３である。他の実施形態では、ｃは１４である。さらなる実施形態では、ｃは１５である。さらに別の実施形態では、ｃは１６である。
式（Ｉ）のいくつかのある別の実施形態では、ｄは０である。いくつかの実施形態では、ｄは１である。他の実施形態では、ｄは２である。さらなる実施形態では、ｄは３である。さらに別の実施形態では、ｄは４である。いくつかの実施形態では、ｄは５である。他の実施形態では、ｄは６である。さらなる実施形態では、ｄは７である。さらに別の実施形態では、ｄは８である。いくつかの実施形態では、ｄは９である。他の実施形態では、ｄは１０である。さらなる実施形態では、ｄは１１である。さらに別の実施形態では、ｄは１２である。いくつかの実施形態では、ｄは１３である。他の実施形態では、ｄは１４である。さらなる実施形態では、ｄは１５である。さらに別の実施形態では、ｄは１６である。
式（Ｉ）のいくつかの他のさまざまな実施形態では、ａとｄは同じである。いくつかの他の実施形態では、ｂとｃは同じである。いくつかの他の特別な実施形態では、ａとｄは同じであり、ｂとｃは同じである。
式（Ｉ）の中のａとｂの和と、ｃとｄの和は、望む特性を有する式（Ｉ）の脂質が得られるようにするため変えることのできる因子である。一実施形態では、ａとｂは、その和が１４～２４の範囲の整数となるように選択される。他の実施形態では、ｃとｄは、その和が１４～２４の範囲の整数となるように選択される。さらなる実施形態では、ａとｂの和と、ｃとｄの和は同じである。例えばいくつかの実施形態では、ａとｂの和とｃとｄの和は両方とも同じ整数であり、１４～２４の範囲が可能である。さらに別の実施形態では、ａ。ｂ、ｃ、およびｄは、ａとｂの和とｃとｄの和が１２以上になるように選択される。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、ｅは１である。他の実施形態では、ｅは２である。
式（Ｉ）のＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの位置の置換基には特に制限がない。ある実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、出現するごとにＨである。ある別の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの少なくとも１つはＣ１－Ｃ１２アルキルである。ある別の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの少なくとも１つはＣ１－Ｃ８アルキルである。ある別の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの少なくとも１つはＣ１－Ｃ６アルキルである。これまでの実施形態のいくつかでは、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－へキシル、またはｎ－オクチルである。
式（Ｉ）のある実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ、およびＲ４ｂは、出現するごとにＣ１－Ｃ１２アルキルである。
式（Ｉ）のさらなる実施形態では、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂの少なくとも１つがＨであるか、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂは、出現するごとにＨである。
式（Ｉ）のある実施形態では、Ｒ１ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接するＲ１ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって、炭素－炭素二重結合を形成する。これまでの実施形態の他の実施形態では、Ｒ４ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接するＲ４ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって、炭素－炭素二重結合を形成する。
これまでの実施形態では、式（Ｉ）のＲ５とＲ６の位置の置換基に特に制限はない。ある実施形態では、Ｒ５またはＲ６の一方または両方はメチルである。ある別の実施形態では、Ｒ５またはＲ６の一方または両方はシクロアルキル（例えばシクロへキシル）である。これらの実施形態では、シクロアルキルは置換されていても置換されていなくてもよい。ある別の実施形態では、シクロアルキルはＣ１－Ｃ１２アルキル（例えばｔ－ブチル）で置換されている。
式（Ｉ）のこれまでの実施形態では、Ｒ７の位置の置換基に特に制限はない。ある実施形態では、少なくとも１つのＲ７はＨである。いくつかの他の実施形態では、Ｒ７は出現するごとにＨである。ある別の実施形態では、Ｒ７はＣ１－Ｃ１２アルキルである。
式（Ｉ）のこれまでの実施形態の他のいくつかでは、Ｒ８またはＲ９の一方はメチルである。他の実施形態では、Ｒ８とＲ９の両方ともメチルである。
式（Ｉ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｒ８とＲ９は、これらが付着した窒素原子と合わさって、５、６、または７員の複素環を形成する。これまでの実施形態のいくつかの実施形態では、Ｒ８とＲ９は、これらが付着した窒素原子と合わさって、５員の複素環（例えばピリジニル環）を形成する。
さまざまな異なる実施形態では、式（Ｉ）の代表的な脂質に含めることができるのは、
である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（Ｉ）の脂質と、少なくとも１つの薬剤と、中性脂質、ステロイド、およびｐｅｇ化された脂質から選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ－５である。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ－６である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（ＩＩ）：
の構造、またはその医薬として許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグ、または立体異性体を有する（上式中、
Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、-Ｏ（Ｃ＝Ｏ）-、-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-、-Ｃ（＝Ｏ）-、-Ｏ-、-Ｓ（Ｏ）ｘ-、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）-、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ-、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、-ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ-、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ-、または直接的な結合であり；
Ｇ１は、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、または直接的な結合であり；
Ｇ２は、－Ｃ（＝Ｏ）-、-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、-Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ、または直接的な結合であり；
Ｇ３はＣ１－Ｃ６アルキレンであり；
ＲａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１ａとＲ１ｂは、出現するごとに独立に、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ１ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ１ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって炭素－炭素二重結合を形成するのいずれかであり；
Ｒ２ａとＲ２ｂは、出現するごとに独立に、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである；または（ｂ）Ｒ２ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ２ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって炭素－炭素二重結合を形成するのいずれかであり；
Ｒ３ａとＲ３ｂは、出現するごとに独立に、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである；または（ｂ）Ｒ３ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ３ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって炭素－炭素二重結合を形成するのいずれかであり；
Ｒ４ａとＲ４ｂは、出現するごとに独立に、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである；または（ｂ）Ｒ４ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ４ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって炭素－炭素二重結合を形成するのいずれかであり；
Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立に、Ｈまたはメチルであり；
Ｒ７はＣ４－Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８とＲ９はそれぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ１２アルキルである；またはＲ８とＲ９は、これらが付着した窒素原子と合わさって、５、６、または７員の複素環を形成し；
ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ独立に、１～２４の整数であり；
ｘは、０、１、または２である）。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）-、-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-、または直接的な結合である。他の実施形態では、Ｇ１とＧ２はそれぞれ独立に、-（Ｃ＝Ｏ）-または直接的な結合である。いくつかの異なる実施形態では、Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）-、-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-、または直接的な結合であり；Ｇ１とＧ２はそれぞれ独立に、－（Ｃ＝Ｏ）-または直接的な結合である。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、-Ｓ-Ｓ-、-Ｃ（＝Ｏ）Ｓ-、-ＳＣ（＝Ｏ）-、-ＮＲａ-、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）-、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ-、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、-ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ-、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ-、-ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＮＲａ-、-ＮＲａＳ（Ｏ）ｘ-、または-Ｓ（Ｏ）ｘＮＲａ-である。
式（ＩＩ）のこれまでの実施形態の他の実施形態では、脂質化合物は、以下の構造（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）：
を有する。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、脂質化合物は構造（ＩＩＡ）を有する。他の実施形態では、脂質化合物は構造（ＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩ）のこれまでの実施形態のいずれにおいても、Ｌ１またはＬ２の一方は-Ｏ（Ｃ＝Ｏ）-である。例えばいくつかの実施形態では、Ｌ１とＬ２のそれぞれは-Ｏ（Ｃ＝Ｏ）-である。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-である。例えばいくつかの実施形態では、Ｌ１とＬ２のそれぞれは-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-である。
式（ＩＩ）の異なる実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は直接的な結合である。本明細書では、「直接的な結合」は、基（例えばＬ１またはＬ２）が不在であることを意味する。例えばいくつかの実施形態では、Ｌ１とＬ２のそれぞれは直接的な結合である。
式（ＩＩ）の他の異なる実施形態では、Ｒ１ａとＲ１ｂの少なくとも１回の出現につき、Ｒ１ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ１ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって、炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）のさらに別の異なる実施形態では、Ｒ４ａとＲ４ｂの少なくとも１回の出現につき、Ｒ４ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ４ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって、炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）のさらなる実施形態では、Ｒ２ａとＲ２ｂの少なくとも１回の出現につき、Ｒ２ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ２ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって、炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）の他の異なる実施形態では、Ｒ３ａとＲ３ｂの少なくとも１回の出現につき、Ｒ３ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ３ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって、炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）のさまざまな他の実施形態では、脂質化合物は、以下の構造（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）：
の一方を有する（上式中、ｅ、ｆ、ｇ、およびｈはそれぞれ独立に、１～１２の整数である）。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、脂質化合物は構造（ＩＩＣ）を有する。他の実施形態では、脂質化合物は構造（ＩＩＤ）を有する。
構造（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）のさまざまな実施形態では、ｅ、ｆ、ｇ、およびｈはそれぞれ独立に、４～１０の整数である。
式（ＩＩ）のある実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ独立に、２～１２の整数、または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ独立に、８～１２または５～９の整数である。あるいくつかの実施形態では、ａは０である。いくつかの実施形態では、ａは１である。他の実施形態では、ａは２である。さらなる実施形態では、ａは３である。さらに別の実施形態では、ａは４である。いくつかの実施形態では、ａは５である。他の実施形態では、ａは６である。さらなる実施形態では、ａは７である。さらに別の実施形態では、ａは８である。いくつかの実施形態では、ａは９である。他の実施形態では、ａは１０である。さらなる実施形態では、ａは１１である。さらに別の実施形態では、ａは１２である。いくつかの実施形態では、ａは１３である。他の実施形態では、ａは１４である。さらなる実施形態では、ａは１５である。さらに別の実施形態では、ａは１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｂは１である。他の実施形態では、ｂは２である。さらなる実施形態では、ｂは３である。さらに別の実施形態では、ｂは４である。いくつかの実施形態では、ｂは５である。他の実施形態では、ｂは６である。さらなる実施形態では、ｂは７である。さらに別の実施形態では、ｂは８である。いくつかの実施形態では、ｂは９である。他の実施形態では、ｂは１０である。さらなる実施形態では、ｂは１１である。さらに別の実施形態では、ｂは１２である。いくつかの実施形態では、ｂは１３である。他の実施形態では、ｂは１４である。さらなる実施形態では、ｂは１５である。さらに別の実施形態では、ｂは１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｃは１である。他の実施形態では、ｃは２である。さらなる実施形態では、ｃは３である。さらに別の実施形態では、ｃは４である。いくつかの実施形態では、ｃは５である。他の実施形態では、ｃは６である。さらなる実施形態では、ｃは７である。さらに別の実施形態では、ｃは８である。いくつかの実施形態では、ｃは９である。他の実施形態では、ｃは１０である。さらなる実施形態では、ｃは１１である。さらに別の実施形態では、ｃは１２である。いくつかの実施形態では、ｃは１３である。他の実施形態では、ｃは１４である。さらなる実施形態では、ｃは１５である。さらに別の実施形態では、ｃは１６である。
式（ＩＩ）のいくつかのある実施形態では、ｄは０である。いくつかの実施形態では、ｄは１である。他の実施形態では、ｄは２である。さらなる実施形態では、ｄは３である。さらに別の実施形態では、ｄは４である。いくつかの実施形態では、ｄは５である。他の実施形態では、ｄは６である。さらなる実施形態では、ｄは７である。さらに別の実施形態では、ｄは８である。いくつかの実施形態では、ｄは９である。他の実施形態では、ｄは１０である。さらなる実施形態では、ｄは１１である。さらに別の実施形態では、ｄは１２である。いくつかの実施形態では、ｄは１３である。他の実施形態では、ｄは１４である。さらなる実施形態では、ｄは１５である。さらに別の実施形態では、ｄは１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｅは１である。他の実施形態では、ｅは２である。さらなる実施形態では、ｅは３である。さらに別の実施形態では、ｅは４である。いくつかの実施形態では、ｅは５である。他の実施形態では、ｅは６である。さらなる実施形態では、ｅは７である。さらに別の実施形態では、ｅは８である。いくつかの実施形態では、ｅは９である。他の実施形態では、ｅは１０である。さらなる実施形態では、ｅは１１である。さらに別の実施形態では、ｅは１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｆは１である。他の実施形態では、ｆは２である。さらなる実施形態では、ｆは３である。さらに別の実施形態では、ｆは４である。いくつかの実施形態では、ｆは５である。他の実施形態では、ｆは６である。さらなる実施形態では、ｆは７である。さらに別の実施形態では、ｆは８である。いくつかの実施形態では、ｆは９である。他の実施形態では、ｆは１０である。さらなる実施形態では、ｆは１１である。さらに別の実施形態では、ｆは１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｇは１である。他の実施形態では、ｇは２である。さらなる実施形態では、ｇは３である。さらに別の実施形態では、ｇは４である。いくつかの実施形態では、ｇは５である。他の実施形態では、ｇは６である。さらなる実施形態では、ｇは７である。さらに別の実施形態では、ｇは８である。いくつかの実施形態では、ｇは９である。他の実施形態では、ｇは１０である。さらなる実施形態では、ｇは１１である。さらに別の実施形態では、ｇは１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｈは１である。他の実施形態では、ｅは２である。さらなる実施形態では、ｈは３である。さらに別の実施形態では、ｈは４である。いくつかの実施形態では、ｅは５である。他の実施形態では、ｈは６である。さらなる実施形態では、ｈは７である。さらに別の実施形態では、ｈは８である。いくつかの実施形態では、ｈは９である。他の実施形態では、ｈは１０である。さらなる実施形態では、ｈは１１である。さらに別の実施形態では、ｈは１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの他のさまざまな実施形態では、ａとｄは同じである。他のいくつかの実施形態では、ｂとｃは同じである。他のいくつかの特別な実施形態では、そしてａとｄは同じであり、ｂとｃは同じである。
式（ＩＩ）のａとｂの和と、ｃとｄの和は、望む特性を有する脂質が得られるようにするため変えることのできる因子である。一実施形態では、ａとｂは、その和が１４～２４の範囲の整数となるように選択される。他の実施形態では、ｃとｄは、その和が１４～２４の範囲の整数となるように選択される。さらなる実施形態では、ａとｂの和と、ｃとｄの和は同じである。例えばいくつかの実施形態では、ａとｂの和とｃとｄの和は両方とも同じ整数であり、１４～２４の範囲が可能である。さらに別の実施形態では、ａ。ｂ、ｃ、およびｄは、ａとｂの和とｃとｄの和が１２以上になるように選択される。
式（ＩＩ）のＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの位置の置換基に特に制限はない。いくつかの実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの少なくとも１つはＨである。ある実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、出現するごとにＨである。ある別の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの少なくとも１つはＣ１－Ｃ１２アルキルである。ある別の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの少なくとも１つはＣ１－Ｃ８アルキルである。ある別の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの少なくとも１つはＣ１－Ｃ６アルキルである。これまでの実施形態のいくつかでは、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－へキシル、またはｎ－オクチルである。
式（ＩＩ）のある実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ、およびＲ４ｂは、出現するごとにＣ１－Ｃ１２アルキルである。
式（ＩＩ）のさらなる実施形態では、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂの少なくとも１つはＨである、またはＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂは、出現するごとにＨである。
式（ＩＩ）のある実施形態では、Ｒ１ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ１ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって、炭素－炭素二重結合を形成する。これまでの実施形態の他の実施形態では、Ｒ４ｂとそれに結合した炭素原子は、隣接したＲ４ｂとそれに結合した炭素原子と合わさって、炭素－炭素二重結合を形成する。
これまでの実施形態では、式（ＩＩ）のＲ５とＲ６の位置の置換基に特に制限はない。ある実施形態では、Ｒ５またはＲ６の一方はメチルである。他の実施形態では、Ｒ５またはＲ６のそれぞれはメチルである。
これまでの実施形態では、式（ＩＩ）のＲ７の位置の置換基に特に制限はない。ある実施形態では、Ｒ７はＣ６－Ｃ１６アルキルである。いくつかの他の実施形態では、Ｒ７はＣ６－Ｃ９アルキルである。これら実施形態のいくつかでは、Ｒ７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＯＲｂ、-Ｓ（Ｏ）ｘＲｂ、-Ｓ-ＳＲｂ、-Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｂ、-ＳＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、-ＮＲａＲｂ、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、-Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、-ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、-ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、-ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＮＲａＲｂ、-ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＲｂ、または-Ｓ（Ｏ）ｘＮＲａＲｂで置換されており、その中のＲａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；ＲｂはＣ１－Ｃ１５アルキルであり；ｘは、０、１、または２である。例えばいくつかの実施形態では、Ｒ７は-（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂまたは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂで置換されている。
式（ＩＩ）のこれまでのさまざまな実施形態では、Ｒｂは、分岐したＣ１－Ｃ１５アルキルである。例えばいくつかの実施形態では、Ｒｂは、以下の構造：
の１つを有する。
式（ＩＩ）のこれまでの実施形態の他のいくつかでは、Ｒ８またはＲ９の一方はメチルである。他の実施形態では、Ｒ８とＲ９の両方ともメチルである。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｒ８とＲ９は、これらが付着した窒素原子と合わさって、５、６、または７員の複素環を形成する。これまでの実施形態のいくつかの実施形態では、Ｒ８とＲ９は、これらが付着した窒素原子と合わさって、５員の複素環（例えばプロリジニル環）を形成する。これまでの実施形態のいくつかの異なる実施形態では、Ｒ８とＲ９は、これらが付着した窒素原子と合わさって、６員の複素環（例えばピペラジニル環）を形成する。
式（ＩＩ）のこれまでの脂質のさらに別の実施形態では、Ｇ３はＣ２－Ｃ４アルキレン（例えばＣ３アルキレン）である。
さまざまな異なる実施形態では、脂質化合物は、以下の構造の１つを有する：
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩ）の脂質と、少なくとも１つの薬剤と、中性脂質、ステロイド、およびｐｅｇ化脂質から選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－９である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１０である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１１である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１２である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－３２である。
いくつかの他の実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（ＩＩＩ）の構造：
またはその医薬として許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグ、または立体異性体を有する（上式中、
Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、-Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ-Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ-、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であるか直接的な結合であり；
Ｇ１とＧ２はそれぞれ独立に、置換されていないＣ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、-Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、-ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
Ｒ４はＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
ｘは、０、１、または２である）。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）：
の１つを有する（上式中、
Ａは、３～８員のシクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり；
Ｒ６は出現するごとに独立に、Ｈ、ＯＨ、またはＣ１－Ｃ２４アルキルであり；
ｎは１～１５の範囲の整数である）。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態のいくつかでは、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）：
の１つを有する（上式中、ｙとｚはそれぞれ独立に、１～１２の範囲の整数である）。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態のいずれでも、Ｌ１またはＬ２の一方は-Ｏ（Ｃ＝Ｏ）-である。例えばいくつかの実施形態では、Ｌ１とＬ２のそれぞれは-Ｏ（Ｃ＝Ｏ）-である。これまでの実施形態のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-または-Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えばいくつかの実施形態では、Ｌ１とＬ２のそれぞれは-（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）：
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）、または（ＩＩＩＪ）：
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態のいくつかでは、ｎは、２～１２の範囲、例えば２～８または２～４の整数である。例えばいくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５、または６である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは５である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態の他のいくつかでは、ｙとｚはそれぞれ独立に、２～１０の範囲の整数である。例えばいくつかの実施形態では、ｙとｚはそれぞれ独立に、４～９、または４～６の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態のいくつかでは、Ｒ６はＨである。これまでの実施形態の他の実施形態では、Ｒ６はＣ１－Ｃ２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ３は置換されていない。他の実施形態では、Ｇ３は置換されている。さまざまな異なる実施形態では、Ｇ３は、直線状Ｃ１－Ｃ２４アルキレンまたは直線状Ｃ１－Ｃ２４アルケニレンである。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態の他のいくつかでは、Ｒ１またはＲ２、またはその両方がＣ６－Ｃ２４アルケニルである。例えばいくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立に、以下の構造：
を有する（上式中、
Ｒ７ａとＲ７ｂは出現するごとに独立に、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
ａは２～１２の整数であり、
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、およびａはそれぞれ、Ｒ１とＲ２のそれぞれが独立に６～２０個の炭素原子を含むように選択される）。例えばいくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態のいくつかでは、Ｒ７ａの少なくとも１回の出現はＨである。例えばいくつかの実施形態では、Ｒ７ａは出現するごとにＨである。これまでの実施形態の他の異なる実施形態では、Ｒ７ｂの少なくとも１回の出現はＣ１－Ｃ８アルキルである。例えばいくつかの実施形態では、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－へキシル、またはｎ－オクチルである。
式（ＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ１またはＲ２、またはその両方は、以下の構造の１つを有する：
式（ＩＩＩ）のこれまでの実施形態のいくつかでは、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＮ、-Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、-ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。いくつかの実施形態では、Ｒ４はメチルまたはエチルである。
さまざまな異なる実施形態では、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、以下の構造の１つを有する：
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質と、少なくとも１つの薬剤と、中性脂質、ステロイド、およびｐｅｇ化脂質から選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－３である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－７である。
ある実施形態では、カチオン性脂質はＬＮＰの中に約３０～約９５モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、カチオン性脂質はＬＮＰの中に約３０～約７０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、カチオン性脂質はＬＮＰの中に約４０～約６０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、カチオン性脂質はＬＮＰの中に約５０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質のみを含む。
ある実施形態では、ＬＮＰは、粒子の形成中にその形成を安定化させる１つ以上の追加の脂質を含む。
安定化させる適切な脂質は中性脂質とアニオン性脂質を含む。
「中性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで帯電していないか中性双性イオン性形態で存在する多数の脂質種の任意の１つを意味する。代表的な中性脂質に含まれるのは、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドである。
代表的な中性脂質に含まれるのは、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）と４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアリオイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）である。一実施形態では、中性脂質は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭから選択される中性脂質を含む。さまざまな実施形態では、カチオン性脂質（例えば式（Ｉ）の脂質）と中性脂質のモル比は約２：１～約８：１の範囲である。
さまざまな実施形態では、ＬＮＰはさらにステロイドまたはステロイド類似体を含む。「ステロイド」は、以下の炭素骨格：
を含む化合物である。
ある実施形態では、ステロイドまたはステロイド類似体はコレステロールである。これら実施形態のいくつかでは、カチオン性脂質（例えば式（Ｉ）の脂質）とコレステロールのモル比は約２：１～１：１の範囲である。
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に帯電したあらゆる脂質を意味する。これらの脂質に含まれるのは、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、および中性脂質にコンジュゲートされた他のアニオン性修飾基である。
ある実施形態では、ＬＮＰは糖脂質（例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１）を含む。ある実施形態では、ＬＮＰはステロール（コレステロールなど）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ポリマーコンジュゲート脂質を含む。「ポリマーコンジュゲート脂質（polymer conjugated lipid）」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む分子を意味する。ポリマーコンジュゲート脂質の一例はｐｅｇ化脂質である。「ｐｅｇ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を意味する。ｐｅｇ化脂質は本分野で知られており、その中には１-（モノメトキシ-ポリエチレングリコール）-２，３-ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ-ｓ－ＤＭＧ）などが含まれる。
ある実施形態では、ＬＮＰは追加の安定化脂質を含み、それはポリエチレングリコール－脂質（ｐｅｇ化脂質）である。適切なポリエチレングリコール－脂質に含まれるのは、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えばＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールである。代表的なポリエチレングリコール－脂質に含まれるのは、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、およびＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧである。一実施形態では、ポリエチレングリコール－脂質はＮ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオクスルプロピル（dimyristyloxlpropyl）－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。一実施形態では、ポリエチレングリコール－脂質はＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ）である。他の実施形態では、ＬＮＰに含まれるのは、ｐｅｇ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）（１-（モノメトキシ-ポリエチレングリコール）-２，３-ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ｐｅｇ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタン二酸塩（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ｐｅｇ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバミン酸塩（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカンオキシ）プロピル）カルバミン酸塩または２，３－ジ（テトラデカンオキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバミン酸塩など）である。さまざまな実施形態では、カチオン性脂質とｐｅｇ化脂質のモル比は約１００：１～約２５：１の範囲である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、以下の構造（ＩＶ）：
を有するｐｅｇ化脂質、またはその医薬として許容可能な塩、互変異性体、または立体異性体を含む（上式中、
Ｒ１０とＲ１１はそれぞれ独立に、１０～３０個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖であり、そのアルキル鎖は場合により１つ以上のエステル結合によって中断されていて；
ｚは３０～６０の範囲の平均値を有する
ｐｅｇ化脂質（ＩＶ）のこれまでの実施形態のいくつかでは、ｚが４２であるときＲ１０とＲ１１は両方ともｎ－オクタデシルではない。いくつか別の実施形態では、Ｒ１０とＲ１１はそれぞれ独立に、１０～１８個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ１０とＲ１１はそれぞれ独立に、１２～１６個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ１０とＲ１１はそれぞれ独立に、１２個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ１０とＲ１１はそれぞれ独立に、１４個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖である。他の実施形態では、Ｒ１０とＲ１１はそれぞれ独立に、１６個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖である。さらに別の実施形態では、Ｒ１０とＲ１１はそれぞれ独立に、１８個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖である。さらに別の実施形態では、Ｒ１０は、１２個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖であり、Ｒ１１は、１４個の炭素原子を含有する直線状の、または分岐した飽和または不飽和のアルキル鎖である。
さまざまな実施形態では、ｚは、（ＩＩ）のＰＥＧ部分が約４００～約６０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するように選択される範囲にわたる。いくつかの実施形態では、平均ｚは約４５である。
別の実施形態では、ｐｅｇ化脂質は、以下の構造：
の１つを有する（上式中、ｎは、ｐｅｇ化脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌであるように選択される整数である）。
ある実施形態では、追加の脂質はＬＮＰの中に約１～約１０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、追加の脂質はＬＮＰの中に約１～約５モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、追加の脂質はＬＮＰの中に約１モルパーセントまたは約１．５モルパーセント存在する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（Ｉ）の脂質、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡ、中性脂質、ステロイド、およびｐｅｇ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ－６である。異なる実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。他の実施形態では、ステロイドはコレステロールである。さらに異なる実施形態では、ｐｅｇ化脂質は化合物ＩＶａである。
ある実施形態では、ＬＮＰは、このＬＮＰを１個の細胞または細胞集団に向かわせる１つ以上のターゲティング部分を含む。例えば一実施形態では、ターゲティングドメインは、ＬＮＰを細胞表面に見られる受容体に向かわせるリガンドである。
ある実施形態では、ＬＮＰは１つ以上の内部化ドメインを含む。例えば一実施形態では、ＬＮＰは、細胞に結合してＬＮＰの内部化を誘導する１つ以上のドメインを含む。例えば一実施形態では、その１つ以上の内部化ドメインは細胞表面に見られる受容体に結合し、受容体を媒介としたＬＮＰの取り込みを誘導する。ある実施形態では、ＬＮＰはインビボで生体分子に結合することができる。すると細胞表面受容体はＬＮＰが結合した生体分子を認識することができ、内部化が誘導される。例えば一実施形態では、ＬＮＰは全身のＡｐｏＥに結合し、ＬＮＰとそれに付随するカーゴの取り込みにつながる。
他の代表的なＬＮＰとその製造は本分野に記載がある。それは例えば、アメリカ合衆国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２７６２０９、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２８（２）：１７２－１７６；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．， １８（７）： １３５７－１３６４；Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １９（１２）： ２１８６－２２００；Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｃ Ｎａｎｏｍａｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ， １１６（３４）： １８４４０－１８４５０；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．， １３１（５）： Ｅ７８１－９０；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １： ｅ３７；Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．， ５１（３４）： ８５２９－８５３３；Ｍｕｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． ２， ｅ１３９；Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．， ２１（８）： １５７０－１５７８；およびＴａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ９（５）： ６６５－７４の中である（これらのそれぞれはその全体が参照によって組み込まれている）。
以下の反応スキームは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の脂質を作製する方法を図解する。
一般的な反応スキーム１
式（Ｉ）の脂質（例えば化合物Ａ－５）の実施形態は一般的な反応スキーム１（「方法Ａ」）に従って調製することができる（上式中、Ｒは、飽和または不飽和のＣ１－Ｃ２４アルキル、または飽和または不飽和のシクロアルキルであり、ｍは０または１であり、ｎは１～２４の整数である）。一般的な反応スキーム１に関し、構造Ａ－１の化合物は、商用品供給者から購入すること、または当業者に馴染みの方法に従って調製することができる。Ａ－１、Ａ－２、およびＤＭＡＰの混合物をＤＣＣで処理すると臭化物Ａ－３が得られる。あらゆる必要なワークアップおよびまたは精製工程の後、臭化物Ａ－３、塩基（例えばＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）、およびＮ，Ｎ－ジメチルジアミンＡ－４の混合物を、Ａ－５の生成に十分な温度と時間加熱する。
一般的な反応スキーム２
式（Ｉ）の化合物の他の実施形態（例えば化合物Ｂ－５）は、一般的な反応スキーム２（「方法Ｂ」）に従って調製することができる（上式中、Ｒは飽和または不飽和のＣ１－Ｃ２４アルキル、または飽和または不飽和のシクロアルキルであり、ｍは０または１であり、ｎは１～２４の整数である）。一般的な反応スキーム２に示されているように、Ｂ－１の化合物は、商用品供給者から購入すること、または当業者に馴染みの方法に従って調製することができる。Ｂ－１（１当量）の溶液を酸塩化物Ｂ－２（１当量）と塩基（例えばトリエチルアミン）で処理する。粗生成物を酸化剤（例えばクロロクロム酸ピリジニウム）で処理し、中間生成物Ｂ－３を回収する。次いであらゆる必要なワークアップおよび／または精製の後、粗Ｂ－３、酸（例えば酢酸）、およびＮ，Ｎ－ジメチルアミノアミンＢ－４の溶液を還元剤（例えばトリアセトキシホウ水素化ナトリウム）で処理してＢ－５を取得する。
出発材料Ａ－１とＢ－１は上に飽和メチレン炭素のみを含むと示されているが、炭素－炭素二重結合を含む出発材料を用いて炭素－炭素二重結合を含む化合物を調製することもできることに注意すべきである。
一般的な反応スキーム３
式（Ｉ）の脂質（例えば化合物Ｃ－７またはＣ９）の異なる実施形態は、一般的な反応スキーム３（「方法Ｃ」）に従って調製することができる（上式中、Ｒは、飽和または不飽和のＣ１－Ｃ２４アルキル、または飽和または不飽和のシクロアルキルであり、ｍは０または１であり、ｎは１～２４の整数である）。一般的な反応スキーム３に関し、構造Ｃ－１の化合物は、商用品供給者から購入すること、または当業者に馴染みの方法に従って調製することができる。
一般的な反応スキーム４
式（ＩＩ）の化合物（例えば化合物Ｄ－５とＤ－７）の実施形態は、一般的な反応スキーム４（「方法Ｄ」）に従って調製することができる（上式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、ａ、ｂ、ｃ、およびｄは本明細書に定義されている通りであり、Ｒ７’はＲ７またはＣ３－Ｃ１９アルキルを表わす）。一般的な反応スキーム１に関し、構造Ｄ－１とＤ－２の化合物は、商用品供給者から購入すること、または当業者に馴染みの方法に従って調製することができる。あらゆる必要なワークアップの後、Ｄ－１とＤ－２の溶液を還元剤（例えばトリアセトキシホウ水素化ナトリウム）で処理するとＤ－３が得られる。あらゆる必要なワークアップおよび／または精製の後、Ｄ－３と塩基（例えばトリメチルアミン、ＤＭＡＰ）の溶液を塩化アシルＤ－４（またはカルボン酸とＤＣＣ）で処理するとＤ－５が得られる。あらゆる必要なワークアップおよび／または精製の後、Ｄ－５をＬｉＡｌＨ４ Ｄ－６で還元するとＤ－７を得ることができる。
一般的な反応スキーム５
式（ＩＩ）の脂質（例えば化合物Ｅ－５）の実施形態は、一般的な反応スキーム５（「方法Ｅ」）に従って調製することができる（上式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ３、ａ、ｂ、ｃ、およびｄは本明細書に定義されている通りである）。一般的な反応スキーム２に関し、構造Ｅ－１とＥ－２の化合物は、商用品供給者から購入すること、または当業者に馴染みの方法に従って調製することができる。あらゆる必要なワークアップの後、Ｅ－１（過剰量）、Ｅ－２、および塩基（例えば炭酸カリウム）の混合物を加熱するとＥ－３が得られる。あらゆる必要なワークアップおよび／または精製の後、Ｅ－３と塩基（例えばトリメチルアミン、ＤＭＡＰ）の溶液を塩化アシルＥ－４（またはカルボン酸とＤＣＣ）で処理するとＥ－５が得られる。
一般的な反応スキーム６
一般的な反応スキーム６は、式（ＩＩＩ）の脂質を調製するための１つの代表的な方法（方法Ｆ）を提供する。一般的な反応スキーム６の中のＧ１、Ｇ３、Ｒ１、およびＲ３は、式（ＩＩＩ）に関して本明細書の中で定義されている通りであり、Ｇ１’は、Ｇ１の炭素が１個だけ短いホモログを意味する。構造Ｆ－１の化合物は、購入するか、または本分野で知られている方法に従って調製する。適切な凝縮条件（例えばＤＣＣ）下でＦ－１をジオールＦ－２と反応させるとエステル／アルコールＦ－３が生じ、それをその後酸化して（例えばＰＣＣ）アルデヒドＦ－４にすることができる。還元性アミノ化条件下でＦ－４をアミンＦ－５と反応させると式（ＩＩＩ）の脂質が生成する。
当業者は式（ＩＩＩ）の脂質を調製するためのさまざまな代替戦略を利用できることに注意すべきである。例えば式（ＩＩＩ）の他の脂質（ただしＬ１とＬ２はエステル以外である）は、適切な出発材料を用いて類似した方法に従って調製することができる。さらに、一般的な反応スキーム６は式（ＩＩＩ）の脂質の調製を示している（ただしＧ１とＧ２は同じである）；しかしこれは本発明の１つの必要な側面ではなく、Ｇ１とＧ２が異なる化合物を生成させるのに上記の反応スキームを改変することが可能である。
本明細書に記載されているプロセスでは、中間体化合物の官能基を適切な保護基によって保護する必要がある可能性があることを当業者は認識しているであろう。そのような官能基に含まれるのは、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、およびカルボン酸である。ヒドロキシのための適切な保護基に含まれるのは、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えばｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、またはトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどである。アミノ、アミド、およびグアニジノのための適切な保護基に含まれるのは、ｔ－ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどである。メルカプトのための適切な保護基に含まれるのは、-Ｃ（Ｏ）-Ｒ″（ただしＲ″は、アルキル、アリール、またはアリールアルキルである）、ｐ-メトキシベンジル、トリチルなどである。カルボン酸のための適切な保護基に含まれるのは、アルキル、アリール、またはアリールアルキルエステルである。保護基は、当業者に知られていて本明細書に記載されている標準的な技術に従って付加すること、または除去することができる。保護基の使用が詳細に記述されているのは、Ｇｒｅｅｎ， Ｔ．Ｗ． ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｚ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９９）， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙである。当業者であればわかるように、保護基として、ポリマー樹脂（Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂、または２－クロロトリチル－クロリド樹脂など）も可能である。
送達用担体の実施形態
適切な任意の送達用担体形式が考えられる。
いくつかの実施形態では、送達用担体はコロイド状分散系であり、それは、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルション、ミセル、混合されたミセル、およびリポソームが含まれる）などである。インビトロとインビボで送達用担体として使用するための代表的なコロイド系に含まれるのは、リポソーム（例えば人工膜小胞体）と脂質ナノ粒子である。
前記少なくとも１つの薬剤を宿主細胞（インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）の中に導入するため脂質製剤の使用を考慮する。別の１つの側面では、前記少なくとも１つの薬剤は脂質と会合させることができる。脂質と会合した前記少なくとも１つの薬剤は、リポソームの水性内部の中に封入すること、リポソームの脂質二重層の中に散在させること、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに付着させること、リポソームの中に捕捉すること、リポソームとの複合体にすること、脂質を含有する溶液の中に分散させること、脂質と混合すること、脂質と組み合わせること、懸濁液として脂質の中に含めること、ミセルの中に含めるかミセルとの複合体にすること、またはそれ以外に脂質と会合させることができる。脂質、脂質／核酸、または脂質／発現ベクターが会合した組成物が溶液中でどれか特定の構造に限定されることはない。例えば組成物は、二相構造で存在すること、ミセルとして存在すること、または「崩壊した」構造で存在することができる。組成物は溶液の中に単純に散在させることもでき、おそらくサイズまたは形が一様でない凝集体を形成する。
一実施形態では、前記少なくとも１つの薬剤の送達は適切な任意の送達法を含み、その中には本明細書の別の箇所に記載されている代表的な送達法が含まれる。ある実施形態では、対象への前記少なくとも１つの薬剤の送達は、接触の工程の前に前記少なくとも１つの薬剤をトランスフェクション試薬と混合することを含む。別の一実施形態では、本発明の方法はさらに、前記少なくとも１つの薬剤をトランスフェクション試薬とともに投与することを含む。別の一実施形態では、トランスフェクション試薬はカチオン性脂質試薬である。
別の一実施形態では、トランスフェクション試薬は、脂質に基づくトランスフェクション試薬である。別の一実施形態では、トランスフェクション試薬は、タンパク質に基づくトランスフェクション試薬である。別の一実施形態では、トランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミンに基づくトランスフェクション試薬である。別の一実施形態では、トランスフェクション試薬はリン酸カルシウムである。別の一実施形態では、トランスフェクション試薬は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、またはＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）である。別の一実施形態では、トランスフェクション試薬は、本分野で知られている他の任意のトランスフェクション試薬である。
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの薬剤の送達はリポソームを含む。「リポソーム」は、囲まれた脂質二重層または凝集体の生成によって形成された多彩な単一脂質担体と多層膜脂質担体を包含する一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多層膜リポソームは水性媒体によって隔てられた多数の脂質層を有する。多層膜リポソームは、リン脂質が過剰な水溶液の中に懸濁されるときに自発的に形成される。脂質構成要素は閉鎖構造を形成する前に自己再配置を起こし、脂質二重層の間に水と溶けた溶質を捕獲する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５： ５０５－１０）。しかし溶液中で通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物も包含される。例えば脂質はミセル構造を取る可能性、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する可能性がある。
脂質と会合した前記少なくとも１つの薬剤は、リポソームの水性内部の中に封入すること、リポソームの脂質二重層の中に散在させること、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに付着させること、リポソームの中に捕捉すること、リポソームとの複合体にすること、脂質を含有する溶液の中に分散させること、脂質と混合すること、脂質と組み合わせること、懸濁液として脂質の中に含めること、ミセルの中に含めるかミセルとの複合体にすること、またはそれ以外に脂質と会合させることができる。脂質、脂質／核酸、または脂質／発現ベクターが会合した組成物が溶液中でどれか特定の構造に限定されることはない。例えば組成物は、二相構造で存在すること、ミセルとして存在すること、または「崩壊した」構造で存在することができる。組成物は溶液の中に単純に散在させることもでき、おそらくサイズまたは形が一様でない凝集体を形成する。
別の一実施形態では、トランスフェクション試薬がリポソームを形成する。リポソームは、別の一実施形態では、細胞内安定性を増大させ、取り込み効率を上昇させ、生物活性を改善する。別の一実施形態では、リポソームは、細胞膜を構成するこれら脂質と同様に配置された脂質からなる中空球形小胞体である。いくつかの実施形態では、リポソームは水溶性化合物を捕獲するための内部水性空間を含む。別の一実施形態では、リポソームは前記少なくとも１つの薬剤を活性形態の細胞に送達することができる。
一実施形態では、組成物は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と少なくとも１つの薬剤を含む。
「脂質ナノ粒子」という用語は、ナノメートルのオーダー（例えば１～１０００ｎｍ）の少なくとも１つの次元を有していて１つ以上の脂質を含む粒子を意味する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、逆脂質ミセルの中で組織化されて脂質単層エンベロープの中に包まれるか、隣り合った脂質二重層の間に挟まれた少なくとも１つの薬剤（例えば脂質二重層－薬剤－脂質二重層）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの形態は伝統的なリポソームのようではなく、ＬＮＰは、電子が密なコアを有しており、そのコアにおいてカチオン性／イオン化可能な脂質が組織化されて封入された薬剤（例えばｍＲＮＡ分子）の周りで逆ミセルになっているため、水性コアを取り囲む脂質二重層によって特徴づけられる（Ｃｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｈｏｐｅ， ２０１７；Ｇｕｅｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９ｂ）。さまざまな実施形態では、粒子は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも１つの薬剤を含む製剤の中に含まれる。いくつかの実施形態では、このような脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質（例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の脂質）を含むとともに、中性脂質、帯電した脂質、ステロイド、および脂質係留ポリエチレングリコール（例えば構造（ＩＶ）のｐｅｇ化脂質などのｐｅｇ化脂質（化合物ＩＶａなど））から選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの薬剤は、脂質ナノ粒子の脂質部分に封入されるか、脂質ナノ粒子の脂質部分の一部または全体に包まれた水性空間に封入され、そのことによってその薬剤を酵素分解または宿主生物または細胞の機構によって誘導される他の望ましくない効果（例えば有害免疫応答）から保護する。
さまざまな実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は約８３ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は約１０２ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は約１０３ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は実質的に非毒性である。ある実施形態では、前記少なくとも１つの薬剤は、脂質ナノ粒子の中に存在するとき、水溶液の中で細胞内または細胞間の酵素による分解に抵抗する。
ＬＮＰは、前記少なくとも１つの薬剤が付着した粒子、または前記少なくとも１つの薬剤が中で封入されるか複合体になった粒子を形成することのできる任意の脂質を含むことができる。「脂質」という用語は、脂肪酸の誘導体（例えばエステル）である一群の有機化合物を意味し、一般に、水に溶けないが多くの有機溶媒に溶けることを特徴とする。代表的な脂質は本明細書の別の箇所に示されている。
一実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上の安定化脂質を含む。安定化脂質に含まれるのは、中性脂質、アニオン性脂質、およびｐｅｇ化脂質である。
一実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質を含む。本明細書では、「カチオン性またはイオン化可能な脂質」という用語は、カチオン性である脂質、またはｐＨが脂質のイオン化可能な基のｐＫよりも小さくなるにつれてカチオン性になる（プロトン化される）が、より大きなｐＨ値では徐々により中性になる脂質を意味する。そのため脂質は、ｐＫよりも低いｐＨ値では負に帯電した核酸と会合することができる。ある実施形態では、カチオン性脂質は、ｐＨが低下したときに正電荷になる双性イオン性脂質を含む。
さまざまな実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性またはイオン化可能な脂質、安定化脂質、ステロール、および脂質係留ポリエチレングリコール（すなわちＰＥＧ化脂質）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（Ｉ）のイオン性脂質と、少なくとも１つの薬剤と、中性脂質、ステロイド、およびｐｅｇ化脂質から選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ－５である。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ－６である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩ）のイオン性脂質と、少なくとも１つの薬剤と、中性脂質、ステロイド、およびｐｅｇ化脂質から選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－９である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１０である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１１である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－１２である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ－３２である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）のイオン性脂質と、少なくとも１つの薬剤と、中性脂質、ステロイド、およびｐｅｇ化脂質から選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－３である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－７である。
ある実施形態では、カチオン性脂質はＬＮＰの中に約３０～約９５モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、カチオン性脂質はＬＮＰの中に約３０～約７０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、カチオン性脂質はＬＮＰの中に約４０～約６０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、カチオン性脂質はＬＮＰの中に約５０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質のみを含む。
ある実施形態では、ＬＮＰは、カーゴを封入して粒子の形成中にその形成を安定化させるのを助ける１つ以上の安定化脂質（例えば中性またはアニオン性の脂質）を含む。代表的な中性脂質に含まれるのは、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）と４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアリオイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）である。一実施形態では、中性脂質は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。さまざまな実施形態では、カチオン性脂質（例えば式（Ｉ）の脂質）と中性脂質のモル比は約２：１～約８：１の範囲である。
さまざまな実施形態では、ＬＮＰはステロイドまたはステロイド類似体をさらに含む。ある実施形態では、ステロイドまたはステロイド類似体はコレステロールである。これら実施形態のいくつかでは、カチオン性脂質（例えば式（Ｉ）の脂質）とコレステロールのモル比は約２：１～１：１の範囲である。
ある実施形態では、ＬＮＰは糖脂質（例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１）を含む。
ある実施形態では、ＬＮＰは追加の脂質を含み、それは、免疫系の認識を減らし、インビボ分布を改善するポリエチレングリコール－脂質（ｐｅｇ化脂質）である。一実施形態では、ポリエチレングリコール－脂質はＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧである。他の実施形態では、ＬＮＰに含まれるのは、ｐｅｇ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）（１ （モノメトキシポリエチレングリコール）２，３ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ｐｅｇ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタン二酸塩（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ｐｅｇ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバミン酸塩（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカンオキシ）プロピル）カルバミン酸塩または２，３－ジ（テトラデカンオキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバミン酸塩など）である。さまざまな実施形態では、カチオン性脂質とｐｅｇ化脂質のモル比は約１００：１～約２５：１の範囲である。
ある実施形態では、ＰＥＧ化脂質はＬＮＰの中に約１～約１０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質はＬＮＰの中に約１～約５モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質はＬＮＰの中に約１モルパーセントまたは約１．５モルパーセント存在する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（Ｉ）の脂質、ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡ、中性脂質、ステロイド、およびｐｅｇ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ－６である。異なる実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。他の実施形態では、ステロイドはコレステロールである。さらに異なる実施形態では、ｐｅｇ化脂質は化合物ＩＶａである。
ある実施形態では、ＬＮＰは、このＬＮＰを１個の細胞または細胞集団に向かわせる１つ以上のターゲティング部分を含む。例えば一実施形態では、ターゲティングドメインは、ＬＮＰを細胞表面に見られる受容体に向かわせるリガンドである。代表的なターゲティングドメインに含まれるのは、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＣＲ７である。
ある実施形態では、ＬＮＰは１つ以上の内部化ドメインを含む。例えば一実施形態では、ＬＮＰは、細胞に結合してＬＮＰの内部化を誘導する１つ以上のドメインを含む。例えば一実施形態では、その１つ以上の内部化ドメインは細胞表面に見られる受容体に結合し、受容体を媒介としたＬＮＰの取り込みを誘導する。ある実施形態では、ＬＮＰはインビボで生体分子に結合することができる。すると細胞表面受容体はＬＮＰが結合した生体分子を認識することができ、内部化が誘導される。例えば一実施形態では、ＬＮＰは全身のＡｐｏＥに結合し、ＬＮＰとそれに付随するカーゴの取り込みにつながる。
他の代表的なＬＮＰとその製造が記載されているのは、例えばアメリカ合衆国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２７６２０９、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２８（２）：１７２－１７６；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．， １８（７）： １３５７－１３６４；Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １９（１２）： ２１８６－２２００；Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｃ Ｎａｎｏｍａｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ， １１６（３４）： １８４４０－１８４５０；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．， １３１（５）： Ｅ７８１－９０；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １： ｅ３７；Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．， ５１（３４）： ８５２９－８５３３；Ｍｕｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． ２， ｅ１３９；Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．， ２１（８）： １５７０－１５７８；およびＴａｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ９（５）： ６６５－７４であり、そのそれぞれの全体が参照によって組み込まれている。
ターゲティング部分
上記の教示のように、本明細書で考慮する送達用担体（さまざまな形式が含まれる可能性があり、その非限定的な例は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルション、ミセル、混合されたミセル、リポソーム、および脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が含まれる）である）は、この送達用担体（例えばＬＮＰ）を１個の細胞または細胞集団に向かわせる機能を有する１つ以上のターゲティング部分（またはそれと同等な「ターゲティングドメイン」または「ターゲティングリガンド」）を含むことができる。ターゲティング部分は、標的細胞または組織の表面上の標的細胞リガンドと特異的に相互作用してそれに結合することのできる適切な任意の結合剤を含むことができる。ターゲティング部分は、天然のもの、または操作されたものが可能である。ターゲティング部分の非限定的な例に含めることができるのは、タンパク質、ペプチド、抗体または抗体断片、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、小分子、アプタマー、ビタミン、核酸分子などである。本明細書で考慮するターゲティング部分に制限はないが、どれか特定のターゲティング部分を（ａ）送達用担体にカップル（共有結合または非共有結合）させることができ、（ｂ）送達用担体の表面のターゲティング部分と標的細胞または組織の表面の標的細胞リガンドの間の結合または相互作用によって送達用担体が標的細胞または組織に局在化すること、または標的細胞または組織を標的とすることを可能にするか容易にすることが条件である。
標的細胞リガンドは、細胞の表面に、または細胞の外側の細胞外空間に内在性リガンド（炭水化物、脂質、多糖、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、ペプチド、細胞膜成分（例えばコレステロール）など）を含むことができる。ある実施形態では、標的細胞上の内在性リガンドは標的細胞に対して特異的である、すなわちその内在性リガンドは、標的細胞の表面にのみ発現する、および／または含まれる、または少なくとも標的細胞ではない細胞の中に非常に少なく存在する。例えば標的細胞上の内在性リガンドとして、疾患関連タンパク質（例えば健康な細胞では典型的には発現しないがん細胞タンパク質の細胞表面タンパク質）が可能であろう。他の実施形態では、標的細胞上の標的リガンドとして、操作されたリガンド、または非天然リガンド（例えば非天然表面細胞タンパク質を発現する遺伝子改変された標的細胞）が可能である。適切なターゲティングリガンドは、標的細胞の独自の特性を利用して組成物が標的細胞と非標的細胞を区別できるように選択することができる。
この側面は、興味ある標的細胞（例えばリンパ球（Ｔ細胞など））への送達用担体の「選択的送達」と呼ぶことができる。「選択的送達」という用語は、送達用担体が、この送達用担体のターゲティング部分と興味ある標的細胞（例えば特定のＴ細胞サブポピュレーション）の表面の標的細胞リガンドの間の結合相互作用を通じて標的細胞（例えば特定のＴ細胞サブポピュレーション）に共有結合または非共有結合することにより局在化するが、この送達用担体が、標的細胞リガンドを発現しない細胞（すなわちそのような細胞は「非標的細胞」と呼ぶことができる）に結合することはないか、ごくわずか結合することを意味する。「ごくわずか結合する」とは、非標的細胞への送達用担体の結合が、検出されないから、結合増加が、陰性対照（送達用担体に結合しないことが知られているタイプの細胞が可能である）と比べて１％未満、または２％未満、または３％未満、または４％未満、または５％未満、または６％未満、または７％未満、または８％未満、または９％未満、または１０％未満の範囲であることを意味する。
したがって本開示の送達用担体は、この送達用担体に（共有結合または非共有結合で）付着したターゲティング部分を用いることにより、特定のタイプの細胞（例えば特定のタイプのＴ細胞）に局在化させること、またはその細胞を標的とすることができる。ターゲティング部分は、送達用担体の外面に提示または露出されるように付着させてその部分が標的細胞または組織（例えばＴ細胞上の特定のＣＤ抗原（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、またはＣＤ８など））の表面のコグネイト結合ドメインまたはリガンドと相互作用できるようにすることが好ましい。そうすることによって送達用担体は標的細胞または組織（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ５＋、またはＣＤ８＋ Ｔ細胞などに結合することが促進され、または容易になり、その後（例えば能動的な内部化（エンドサイトーシスなど）を通じて）内部化され、一旦細胞の中に入ると送達用担体によって担持されている薬剤（例えばｍＲＮＡ）を同時に放出する。
ターゲティング部分は調製中または調製後に送達用担体の表面に連結させることができることがわかるであろう。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、送達用担体が調製された後にその表面に付着される。他の実施形態では、ターゲティング部分は送達用担体が調製される前に、組み立てられていないその担体の構成要素（例えば脂質）に付着される。このような付着手段は、本分野で知られている任意の手段（本分野で周知であり、本明細書で論じられている適切な任意の結合化学が含まれる）によって実現できる。
いくつかの他の実施形態では、送達用担体、または送達用担体を含む組成物は、標的細胞へのその送達用担体の局在化を増強する１つ以上の追加薬剤をさらに含むことができる。このような追加の薬剤に含めることができるのは、他のペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、または標的細胞への送達用担体の局在化を容易にする他の分子だが、これらは送達用担体に直接カップルさせる必要はない。
一実施形態では、本開示の送達用担体は、この送達用担体を白血球（その中には一般に免疫系細胞の骨髄とリンパ球のクラスが含まれる）に向かわせることのできる１つ以上のターゲティング部分を含む。骨髄細胞に含めることができるのは、例えば好中球、好酸球、マスト細胞、好中球、および単球である。単球はさらに樹状細胞とマクロファージに分類される。リンパ性細胞（またはリンパ球）に含まれるのは、Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞、メモリＴ細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞に細分される）、Ｂ細胞（形質細胞とメモリＢ細胞に細分される）、およびナチュラルキラー細胞である。
当業者は、これらのタイプの白血球のそれぞれについて、送達用担体上に適切にマッチしたターゲティング部分（例えば（送達用担体に共有結合または非共有結合で）カップルされる抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、小分子、ビタミン、またはアプタマー）を設けることにより、本明細書に記載されている送達用担体を局在化させるための手段として利用できる適切な細胞標的リガンドを同定することができよう。すると送達用担体は、特異的で好ましくは選択的なターゲティング部分と細胞標的リガンドの間の相互作用のために標的細胞に局在化する。
さまざまな実施形態では、本開示において、白血球、特に特定のリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー細胞など）を標的および／または局在場所とする送達用担体を考慮する。特別な実施形態では、送達用担体は、この送達用担体をＴ細胞（ヘルパーＴ細胞、メモリＴ細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞が含まれる）に向かわせることのできる１つ以上のターゲティング部分を含む。特別な実施形態では、送達用担体は、この送達用担体を細胞傷害性Ｔ細胞に向かわせることのできる１つ以上のターゲティング部分を含む。
白血球は、異なるタイプの白血球に特徴的で白血球のさまざまなサブポピュレーションを規定するのを助けるＣＤ抗原として知られる細胞表面抗原を含むことを当業者は認識しているであろう。
分化のクラスター（ＣＤ）は、白血球の細胞表面に見られる抗原を同定して分類するために考案された命名法である。最初は、表面抗原は、それに結合したモノクローナル抗体にちなんで命名された。異なる実験室で各抗原に対して多くのモノクローナル抗体が生じることがしばしばあったため、統一性のある命名法を採用する必要が生じた。現在の方法は、１９８２年に第１回国際ヒト白血球分化抗原（ＨＬＤＡ）会議を通じて採用された。ヒト細胞分化分子機構は、既知のＣＤマーカーのリストを維持、発展させるためＨＬＤＡ会議を開催し続けている。
この命名システムの下では、よく特徴づけられている抗原には無作為に番号が割り当てられている（例えばＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８など）のに対し、１つだけのモノクローナル抗体によって認識される分子には仮の名称「ＣＤｗ」（例えばＣＤｗ５０）が与えられている。共通の鎖を共有するより大きな分子を示すため、割り当てられた番号の後に小文字も付加される（例えばＣＤ１ａまたはＣＤ１ｄ）。生理学的には、ＣＤ分子はどの特定のクラスにも属さず、その機能は細胞表面受容体から接着分子までの広い範囲である。ＣＤ分子命名規則は、最初はヒト白血球についてのみ使用されたが、今や拡張され、異なる種（例えばマウス）のほか、他のタイプの細胞をカバーしている。２０１６年４月の時点でヒトＣＤ抗原にはＣＤ３７１まで番号が付けられている。
特定の細胞集団の表面からの特定の抗原の存在または不在はそれぞれ「＋」または「－」と表わされる。変化する細胞発現レベルもｈｉまたはｌｏｗと記され、例えばセントラルメモリＴ細胞はＣＤ６２Ｌｈｉであるのに対し、エフェクタメモリＴ細胞はＣＤ６２Ｌｌｏｗである。異なるＣＤ抗原の発現プロファイルをモニタすることで、さまざまな免疫プロセスにおけるその機能に従って細胞のタイプの同定、単離、表現型決定が可能になった。
本開示の送達用担体は、１つ以上のＣＤ抗原（ＣＤ１～ＣＤ３７１のいずれかが含まれる）に結合または会合する１つ以上のターゲティング部分を含むことができる。ある実施形態では、ターゲティング部分は、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＣＲ７に結合または会合するものである。
ある実施形態では、ターゲティング部分は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、およびＣＤ８と結合または会合するものである。
さまざまな実施形態では、ターゲティング部分は、Ｔ細胞の細胞表面分子に結合または会合するものである。一実施形態では、ターゲティング部分はｐａｎ－Ｔ抗原に結合または会合する。一実施形態では、ｐａｎ－Ｔ抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、またはＣＤ７である。
さらなる実施形態では、ターゲティング部分は、ＣＤ５に結合または会合するものである。
さまざまな実施形態では、送達用担体を標的細胞（例えば白血球）に向かわせるためのターゲティング部分は、抗体または抗体結合断片である。そのような抗体または抗体結合断片の非限定的な例に含めることができるのは、抗ＣＤ１抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ２抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ４抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ５抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ７抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ８抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１６抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ２５抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ２６抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ２７抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ２８抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ３０抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ３８抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ３９抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ４０Ｌ抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ４４抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ４５抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ６２Ｌ抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ６９抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ７３抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ８０抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ８３抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ８６抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ９５抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１０３抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１１９抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１２６抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１５０抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１５３抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１５４抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１６１抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ１８３抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ２２３抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ２５４抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ２７５抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体または抗原結合断片、抗ＣＸＣＲ３抗体または抗原結合断片、抗ＣＸＣＲ５抗体または抗原結合断片、抗ＦａｓＬ、抗ＩＬ１８Ｒ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合断片、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片、抗ＩＣＯＳ抗体または抗原結合断片、抗ＰＤ－１抗体または抗原結合断片、抗ｌｅｕ－１２抗体または抗原結合断片、抗ＴＣＲ抗体または抗原結合断片、抗ＴＬＲ１抗体または抗原結合断片、抗ＴＬＲ２抗体または抗原結合断片、抗ＴＬＲ３抗体または抗原結合断片、抗ＴＬＲ４抗体または抗原結合断片、抗ＴＬＲ６抗体または抗原結合断片、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体または抗原結合断片、抗ＣＣＲ抗体または抗原結合断片、抗ＣＣＲ１抗体または抗原結合断片、抗ＣＣＲ２抗体または抗原結合断片、抗ＣＣＲ４抗体または抗原結合断片、抗ＣＣＲ６抗体または抗原結合断片、および抗ＣＣＲ７抗体または抗原結合断片である。
ある実施形態では、送達用担体を標的細胞（例えば白血球）に向かわせるためのターゲティング部分は、抗ＣＤ４抗体または抗原結合断片、抗ＣＤ５抗体または抗原結合断片、および抗ＣＤ８抗体または抗原結合断片である。
ある別の実施形態では、送達用担体を標的細胞（例えば白血球）に向かわせるためのターゲティング部分は、抗ＣＤ５抗体または抗原結合断片である。
本明細書では、「抗体」は、対応する抗原（例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、またはＣＤ８抗原）に非共有結合により可逆的に特異的なやり方で結合することのできる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを意味する。例えば天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む四量体である。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域とＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分することができ、間には、より保存されていてフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在している。ＶＨとＶＬのそれぞれは３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順番、すなわちＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で並んでいる。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主組織または諸因子（免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクタ細胞）と古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が含まれる）への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
本開示の抗体の非限定的な例に含まれるのは、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体が含まれる）である。抗体として、任意のアイソタイプ／クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のものが可能である。
本明細書では、「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は交換可能であり、ＶＬとＶＨの超可変領域を意味する。ＣＤＲは、抗体鎖の中にあって標的タンパク質に対する特異性を有する標的タンパク質結合部位である。それぞれのヒトＶＬまたはＶＨの中には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３、Ｎ末端から順番に命名）が存在し、可変ドメインの約１５～２０％を構成している。ＣＤＲは、その領域と順番によって命名される。例えば「ＶＨＣＤＲ１」または「ＨＣＤＲ１」は両方とも重鎖可変領域の第１のＣＤＲを意味する。ＣＤＲは構造的に標的タンパク質のエピトープと相補的であるため、結合特異性を直接担っている。ＶＬまたはＶＨの残りのストレッチ（いわゆるフレームワーク領域）はアミノ酸配列の変化がより少ない（Ｋｕｂｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｃｈａｐｔｅｒ４． Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０００）。
ＣＤＲとフレームワーク領域の位置は、本分野でよく知られているさまざまな定義を用いて決定することができる（例えばＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＡｂＭ（例えばＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２９：２０５－２０６（２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４２：８７７－８８３（１９８９）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：７９９－８１７（１９９２）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２７３：９２７－７４８（１９９７）を参照されたい））。抗原結合部位の定義は以下の文献にも記載されている：Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２８：２１９－２２１（２０００）；およびＬｅｆｒａｎｃ， Ｍ． Ｐ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２９：２０７－２０９（２００１）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６２：７３２－７４５（１９９６）；およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：９２６８－９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２０３：１２１－１５３（１９９１）；およびＲｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ． Ｊ． Ｅ．（ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １４１－１７２ｓ（１９９６））。）。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａを組み合わせた番号付けスキームにおけるいくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、またはその両方の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えばいくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＶＨ（例えば哺乳類ＶＨ、例えばヒトＶＨ）の中のアミノ酸残基２６～３５（ＨＣ ＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣ ＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣ ＣＤＲ３）と、ＶＬ（例えば哺乳類ＶＬ、例えばヒトＶＬ）の中のアミノ酸残基２４～３４（ＬＣ ＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣ ＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣ ＣＤＲ３）に対応する。
軽鎖と重鎖の両方とも、構造と機能が相同な領域に分割される。「定常」と「可変」という用語は機能に関して用いられる。この点に関し、軽（ＶＬ）鎖部分と重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識と特異性を形成することがわかるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、重要な生物学的特性（分泌、胎盤を通じた移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合など）を与える。取り決めにより、定常領域ドメインの番号は、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより離れるに連れて大きくなる。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である；ＣＨ３とＣＬドメインは実際にはそれぞれ重鎖と軽鎖のカルボキシ末端ドメインを含む。
本明細書では、「抗原結合断片」は、抗体のうちで、（例えば結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間的分布によって）抗原（例えば白血球のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、またはＣＤ８抗原など）のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持している１つ以上の部分を意味する。結合断片の非限定的な例に含まれるのは、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィドで連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）断片、１価断片で、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなるもの；Ｆ（ａｂ）２断片、２価断片で、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含むもの；ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６， １９８９）；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエピトープ結合断片である。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組み換え法を利用して合成リンカーによってコンジュゲートさせることができる。合成リンカーによってそれらを単一タンパク質鎖にすることが可能になり、その中でＶＬ領域とＶＨ領域はペアになって１価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」として知られる）；例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６， １９８８と、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：５８７９－５８８３， １９８８）を参照されたい。このような一本鎖抗体も「抗原結合断片」という用語に包含されることが想定されている。これら抗原結合断片は当業者に知られている従来の技術を利用して得られ、これら断片はインタクト抗体と同様に有用性がスクリーニングされる。
抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、およびビス－ｓｃＦｖの中に組み込むこともできる（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６， ２００５参照）。抗原結合断片は、ポリペプチド（フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）など）に基づく足場にグラフトすることができる（アメリカ合衆国特許第６，７０３，１９９号参照；ここにはフィブロネクチンポリペプチドモノボディが記載されている）。したがって本明細書の抗体と抗原結合断片（例えば抗ＣＤ５抗原結合断片）は多彩な構造が可能であり、その非限定的な例は、それぞれ、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体、抗体模倣体、キメラ抗体、抗体融合体（ときに「抗体複合体」と呼ばれる）、およびそれぞれの断片である。特異的抗体断片（または抗原結合断片）の非限定的な例に含まれるのは、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一の可変領域からなるｄＡｂ断片、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ′）２断片（ｖｉｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインがペプチドリンカーによって連結されることで、それら２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することが可能になっている一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、および（ｉｘ）遺伝子融合によって構成された多価または多重特異性の断片である「ディアボディ」または「トリアボディ」である。抗体断片は修飾することができる。例えばＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって分子を安定化させることができる。抗体の形式とアーキテクチャの例は、Ｃａｒｔｅｒ， ２００６， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：３４３－３５７と、その中で引用されている参考文献に記載されている（すべてが参照によって明示的に組み込まれている）。
抗原結合断片は、一対のタンデムＦｖ区画（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むことができ、そのタンデムＦｖ区画は相補的な軽鎖ポリペプチドと合わさって一対の抗原結合領域を形成する（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８：１０５７－１０６２， １９９５；およびアメリカ合衆国特許第５，６４１，８７０号）。
本明細書では、「モノクローナル抗体」は、実質的に同じアミノ酸配列を有するか、同じ遺伝子供給源に由来する抗体と抗原結合断片を含むポリペプチドを意味する。この用語には単一の分子組成である抗体分子の調製物も含まれる。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対する単一の結合特異性と親和性を示す。
本明細書では、「ヒト抗体」に、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれる。さらに、抗体が定常領域を含有している場合には、その定常領域も、そのようなヒト配列（例えばヒト生殖細胞系配列またはヒト生殖細胞系配列の変異バージョン）に由来するか、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６：５７－８６， ２０００）に記載されているように、ヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来する。
いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ抗体またはその抗原結合断片である。キメラ抗体は、異なる遺伝子源からのアミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、マウスからのアミノ酸配列と、ヒトからのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、マウスに由来する可変ドメインと、ヒトに由来する定常ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体またはその抗原結合断片である。「ヒト化」抗体は、本明細書では、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）と、非ヒト（通常はマウスまたはラット）抗体からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を意味する。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体は「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプタ」と呼ばれる。ヒト化は、アクセプタ（ヒト）のＶＬとＶＨのフレームワークへのドナーＣＤＲのグラフトに主に依存する（Ｗｉｎｔｅｒ アメリカ合衆国特許第５，２２５，５３９号、全体が参照によって組み込まれている）。この戦略は「ＣＤＲグラフティング」と呼ばれる。最初にグラフトされたコンストラクトで失われた親和性を再び獲得するには、選択されたアクセプタフレームワーク残基から対応するドナー残基への「復帰変異」がしばしは必要とされる（アメリカ合衆国特許第５，６９３，７６２号、全体が参照によって組み込まれている）。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（典型的にはヒト免疫グロブリンの一部）も含むことになるため、典型的にはヒトＦｃ領域を含むことになる。非ヒト抗体をヒト化して再構成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）する多彩な技術と方法が本分野でよく知られている（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ＆Ｖａｓｑｕｅｚ， ２００４， Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ， ５３３－５４５， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）と、その中で引用されている文献を参照されたい（すべてが全面的に参照によって組み込まれている））。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させるヒト化その他の方法には、例えばＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９６９－９７３（全体が参照によって組み込まれている）に記載されている表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）法を含めることができる。一実施形態では、選択に基づく方法を利用して抗体可変領域をヒト化すること、および／または親和性成熟させること、すなわち可変領域のその標的抗原に対する親和性を増加させることができる。他のヒト化法はＣＤＲの一部のみのグラフティングを含むことができ、方法の例に含まれるのは、アメリカ合衆国シリアル番号第０９／８１０，５０２号；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：１１１９－１１２５；Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：３０７６－３０８４（全面的に参照によって組み込まれている）に記載されている方法である。ヒト化と親和性成熟には、例えばアメリカ合衆国シリアル番号第１０／１５３，１５９号とそれに関連する出願（すべて、全面的に参照によって組み込まれている）に記載されているように、構造に基づく方法を利用することができる。
いくつかの実施形態では、抗体はヒトが操作した抗体である。ヒトが操作した抗体は、非ヒト供給源（マウスなど）に由来していて、抗体が対象に投与されたときのその抗体の望む特徴を改善するため（安定性を増大させる、または免疫原性を低下させるなどのため）に１つ以上の置換がなされた抗体を意味する。いくつかの実施形態では、置換は、低リスクの（例えば溶媒に曝露されるが抗原結合または抗体構造には寄与しない）位置でなされる。このような置換は、抗体の投与後に対象がその抗体に対する免疫応答を生じさせるリスクを、その抗体が望むエピトープまたは抗原に結合する能力に影響を与えることなく低下させる（例えばＳｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １９９４． ７（６）：８０５-８１４を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、抗体は一本鎖抗体または抗原結合断片である。一本鎖抗体または一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）は、合成リンカーなどによって互いにコンジュゲートされたＶＨドメインとＶＬドメインを含むタンパク質またはポリペプチドであり、単一のタンパク質またはポリペプチドを形成している（例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４２：４２３－４２６， １９８８と、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：５８７９－５８８３， １９８８を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、抗体は抗体断片または抗原結合断片である。抗体断片は、抗体に由来するタンパク質またはポリペプチドである。抗原結合断片は、この断片の出所である抗体と同じエピトープまたは抗原に結合することのできるその抗体由来のタンパク質またはポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、抗体は、グリコシル化が減少しているか、グリコシル化がないか、超フコシル化されている。グリコシル化は、分子（ポリペプチドまたはタンパク質など）への糖、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、またはグリカン部分の共有結合を意味する。これらの糖またはグリカン部分は一般に、Ｂ細胞によって分泌される前に翻訳後物において抗体に付着する。グリコシル化が減少した抗体は、抗体がＢ細胞によってインビトロで産生されるときや、マウスまたはヒトのインビボで産生されるときなどに、これらの付着した糖またはグリカン部分が、実質的に同じアミノ酸配列を有する抗体に典型的に付着する数よりも少ない。グリコシル化がない抗体には、付着した糖またはグリカン部分がない。低フコシル化されている抗体は、抗体がＢ細胞によってインビトロで産生されるときや、マウスまたはヒトのインビボで産生されるときなどに、フコシル残基の数が、実質的に同じアミノ酸配列を有する抗体に典型的に付着した数よりも少ない。
さらに別の実施形態では、本明細書で論じられている抗体と抗原結合断片は、免疫原性が低下するように修飾することができる。免疫原性を低下させるための修飾は、親配列に由来する処理されたペプチドがＭＨＣタンパク質に結合するのを減らす修飾を含むことができる。例えばアミノ酸修飾を操作し、優勢ないずれかのＭＨＣアレルに大きな親和性で結合することが予測される免疫エピトープが存在しないかできるだけ少数になるようにすることが考えられる。タンパク質配列中のＭＨＣ結合エピトープを同定するいくつかの方法が本分野で知られており、それを利用して本発明の抗体内のエピトープを点数化することができる。例えばアメリカ合衆国シリアル番号第０９／９０３，３７８号、アメリカ合衆国シリアル番号第１０／７５４，２９６号、アメリカ合衆国シリアル番号第１１／２４９，６９２号と、その中で引用されている文献を参照されたい（すべて、参照によって明示的に組み込まれている）。
ＣＤ５ターゲティング部分
ある別の実施形態では、送達用担体を標的細胞（例えば白血球）に向かわせるためのターゲティング部分は、抗ＣＤ５抗体または抗原結合断片である。
リンパ球抗原ＣＤ５（ＣＤ５は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５、リンパ球抗原Ｔ１、Ｌｅｕ－１、Ｔｐ６７としても知られる）はヒトＴ細胞とＢ細胞のマーカーである。ＣＤ５はほぼすべての成熟Ｔリンパ球の表面に発現し、成熟Ｂ細胞の小さなサブセット（Ｂ１ａ細胞）の表面には低密度で発現していて、ＣＤ５の発現は、胎児期の間といくつかの自己免疫性障害のほか、Ｂ細胞に由来するいくつかのリンパ増殖性疾患（Ｂ－ＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫など）とＴ細胞に由来する白血病（Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ－ＡＬＬ）において増加する。
ＣＤ５は、細胞質尾部が触媒活性を欠くシグナル伝達分子である。そのリガンドはＣＤ７２であり、Ｂ細胞上にも発現していて未知の機能を有する。ＣＤ５は二重受容体として機能し、細胞のタイプと発達段階の両方に依存して促進または阻害いずれかのシグナルを提供する。Ｂ１ａ細胞上のＣＤ５の発現は自己反応性抗体の産生と結び付けられている。さらに、Ｂ１ａ細胞の増殖は、天然抗体の自己反応性を媒介する能力、サイトカインの産生、および増強された抗原提示能力を通じて自己免疫性疾患発症と結び付けられている。
本発明の抗ＣＤ５抗体としてＣＤ５に結合する任意の抗体が可能であり、その中には例えば既知の任意の抗ＣＤ５抗体または未発見の抗ＣＤ５抗体の可変領域（例えばＣＤＲ）を含めることができる。本発明の抗体はＣＤ５に対する選択性を示すことができる。例に含まれるのは、完全長バリアント対スプライスバリアント、細胞表面形態対可溶性形態、さまざまな多型バリアントに対する選択性、または標的の特定の立体的形態に対する選択性である。本発明の抗体はＣＤ５上の任意のエピトープまたは領域に結合することができ、前記抗原の断片、変異体形態、スプライス形態、または異常な形態に対して特異的である。
多数の抗ＣＤ５抗体と抗原結合断片が本分野で知られている、および／または商品として入手可能である。本発明ではそのすべてに用途を見いだすことができる。
多数の抗ＣＤ５抗体と抗原結合断片が本分野で知られている、および／または商品として入手可能である。本発明ではそのすべてに用途を見いだすことができる。
表１は、本開示で使用できるさまざまな市販の抗ＣＤ５抗体のリストを提供する。
それに加え、適切な抗ＣＤ５抗体または抗原結合断片に含まれるのは、Ｐｏｒｒｏ、１９９２年２月１８日に出願されたＷＯ９２／１４４９１；Ｌｅｂｂｅｔｔｅｒ、１９８８年４月４日に出願されたＥＰ０３３６３７９Ｂ１；Ｕｃｋｕｎ、１９９０年７月１２日に出願されたＥＰ０４４１９１７Ｂ１；アメリカ合衆国特許第４，３６１，５４９号、アメリカ合衆国特許第４，３６４，９３２号；アメリカ合衆国特許第４，５１５，８９３号；アメリカ合衆国特許第４，６３７，９８３号；アメリカ合衆国特許第４，６５４，２１０号；アメリカ合衆国特許第４，６５８，０１９号；アメリカ合衆国特許第４，８０３，２６２号；アメリカ合衆国特許第６，０１０，９０２号；アメリカ合衆国特許第６，２９４，１６７号；Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ、２００３年３月３日に出願されたアメリカ合衆国特許出願公開第２００３／０２２３９９９号；Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙ、２００２年１月２９日に出願されたＷＯ０２／０９６９４８Ａ２；Ｉｎｖｅｒａｒｄｉ、２００２年６月１１日に出願されたＷＯ０２／１００３３４Ａ２；Ｂｉｇｌｅｒ、２００２年１０月１１日に出願されたＷＯ０３／０３０８３５Ａ２；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、２００３年４月１５日に出願されたＷＯ０３／０８８９９８Ａ１；Ｉｎｖｅｒａｒｄｉ、２００２年１２月１０日に出願されたＷＯ０４／０５２４０８Ａ１；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、２００３年１２月３１日に出願されたＷＯ０４／０５８２９８；Ｓｃｈｕｈ、１９９４年４月１１日に出願されたＷＯ９４／２３７４７；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、１９９６年４月２９日に出願されたＷＯ９６／３３７３５；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、１９９５年４月２８日に出願されたＷＯ９６／３４０９６；およびＶｅｒｎｏｎ、１９９６年６月５日に出願されたＷＯ９６／４１６０８Ａ２；Ａｘｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００４）ｐｐ２９２８－２９３２；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ．６２， ＮＯ．５（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ）， １９８３： ｐｐ９８８－９９５；Ｂｉｋａｈ， ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ．８， ｐｐ．１１８５－１１９６；Ｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ， ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌ．（２００１）２：５；Ｒａｖｅｌ， ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ７９， Ｎｏ．６（Ｍａｒｃｈ １５）， １９９２： ｐｐ１１５１－１５１７；Ｊａｆｆｒｅｚｏｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ．８３， Ｎｏ．２（Ｊａｎｕａｒｙ １５）， １９９４： ｐｐ４８２－４８９；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ．８８， Ｎｏ．３（Ａｕｇｕｓｔ １）， １９９６： ｐｐ８２４－８３０；Ｄｅｒｏｃｑ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌ．１４１， ２６３７－２８４３， Ｎｏ．８， Ｏｃｔ．１５，１９８８；ＬｅＭａｉｓｔｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ．７８， Ｎｏ．５（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １）， １９９１： ｐｐ１１７３－１１８２；およびＯｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， Ｖｏｌ．１８７， Ｎｏ．７， Ａｐｒ．６， １９９８， ｐｐ１０１９－１０２８（すべて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されているＣＤ５抗体または抗原結合断片である。上記の参考文献に記載されている分子は非限定的な例である。
ＣＤ５は、Ｐ１３３７９－１（ＵｎｉＰａｒｃ）に従う以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＤＳＨＥＶＬＬＡＡＴＹＬＬＧＴＬＡＡＦＣＬＧＱＳＧＲＧＧＬＤＩＱＶＭＬＳＧＳＮＳＫＣＱＧＱＶＥＩＱＭＥＮＫＷＫＴＶＣＳＳＳＷＲＬＳＱＤＨＳＫＮＡＱＱＡＳＡＶＣＫＱＬＲＣＧＤＰＬＡＬＧＰＦＰＳＬＮＲＰＱＮＱＶＦＣＱＧＳＰＷＳＩＳＮＣＮＮＴＳＳＱＤＱＣＬＰＬＳＬＩＣＬＥＰＱＲＴＴＰＰＰＴＴＴＰＰＴＴＶＰＥＰＴＡＰＰＲＬＱＬＶＰＧＨＥＧＬＲＣＴＧＶＶＥＦＹＮＧＳＷＧＧＴＩＬＹＫＡＫＤＲＰＬＧＬＧＮＬＩＣＫＳＬＱＣＧＳＦＬＴＨＬＳＧＴＥＡＡＧＴＰＡＰＡＥＬＲＤＰＲＰＬＰＩＲＷＥＡＰＮＧＳＣＶＳＬＱＱＣＦＱＫＴＴＡＱＥＧＧＱＡＬＴＶＩＣＳＤＦＱＰＫＶＱＳＲＬＶＧＧＳＳＶＣＥＧＩＡＥＶＲＱＲＳＱＷＥＡＬＣＤＳＳＡＡＲＧＲＧＲＷＥＥＬＣＲＥＱＱＣＧＤＬＩＳＦＨＴＶＤＡＤＫＴＳＰＧＦＬＣＡＱＥＫＬＳＱＣＹＨＬＱＫＫＫＨＣＮＫＲＶＦＶＴＣＱＤＰＮＰＡＧＬＡＰＧＴＶＡＳＩＩＬＴＬＶＬＬＶＶＬＬＡＭＣＧＰＬＶＹＫＫＬＶＫＫＦＲＱＫＫＱＲＱＷＩＧＰＴＧＶＮＱＮＭＳＦＨＲＳＨＴＡＴＶＲＳＱＶＥＮＰＴＡＳＨＶＤＮＥＹＳＱＰＰＲＮＳＨＬＳＡＹＰＡＬＥＧＡＬＨＲＳＳＴＱＰＤＮＳＳＤＳＤＹＤＬＱＶＡＱＲＬ（配列番号１）。
ＣＤ５は、Ｐ０６１２７（ＵｎｉＰａｒｃ）に従う以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＰＭＧＳＬＱＰＬＡＴＬＹＬＬＧＭＬＶＡＳＣＬＧＲＬＳＷＹＤＰＤＦＱＡＲＬＴＲＳＮＳＫＣＱＧＱＬＥＶＹＬＫＤＧＷＨＭＶＣＳＱＳＷＧＲＳＳＫＱＷＥＤＰＳＱＡＳＫＶＣＱＲＬＮＣＧＶＰＬＳＬＧＰＦＬＶＴＹＴＰＱＳＳＩＩＣＹＧＱＬＧＳＦＳＮＣＳＨＳＲＮＤＭＣＨＳＬＧＬＴＣＬＥＰＱＫＴＴＰＰＴＴＲＰＰＰＴＴＴＰＥＰＴＡＰＰＲＬＱＬＶＡＱＳＧＧＱＨＣＡＧＶＶＥＦＹＳＧＳＬＧＧＴＩＳＹＥＡＱＤＫＴＱＤＬＥＮＦＬＣＮＮＬＱＣＧＳＦＬＫＨＬＰＥＴＥＡＧＲＡＱＤＰＧＥＰＲＥＨＱＰＬＰＩＱＷＫＩＱＮＳＳＣＴＳＬＥＨＣＦＲＫＩＫＰＱＫＳＧＲＶＬＡＬＬＣＳＧＦＱＰＫＶＱＳＲＬＶＧＧＳＳＩＣＥＧＴＶＥＶＲＱＧＡＱＷＡＡＬＣＤＳＳＳＡＲＳＳＬＲＷＥＥＶＣＲＥＱＱＣＧＳＶＮＳＹＲＶＬＤＡＧＤＰＴＳＲＧＬＦＣＰＨＱＫＬＳＱＣＨＥＬＷＥＲＮＳＹＣＫＫＶＦＶＴＣＱＤＰＮＰＡＧＬＡＡＧＴＶＡＳＩＩＬＡＬＶＬＬＶＶＬＬＶＶＣＧＰＬＡＹＫＫＬＶＫＫＦＲＱＫＫＱＲＱＷＩＧＰＴＧＭＮＱＮＭＳＦＨＲＮＨＴＡＴＶＲＳＨＡＥＮＰＴＡＳＨＶＤＮＥＹＳＱＰＰＲＮＳＨＬＳＡＹＰＡＬＥＧＡＬＨＲＳＳＭＱＰＤＮＳＳＤＳＤＹＤＬＨＧＡＱＲＬ（配列番号２）。
ＣＤ４ターゲティング部分
ある別の実施形態では、送達用担体を標的細胞（例えば白血球）に向かわせるためのターゲティング部分は、抗ＣＤ４抗体または抗原結合断片である。
分化のクラスター４（ＣＤ４）は分子量が約５５ｋＤａの糖タンパク質であり、大半の胸腺細胞、末梢血Ｔ細胞、単球、およびマクロファージの細胞表面で発現する。ＣＤ４は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が抗原提示細胞とコミュニケーションするのを助ける共受容体である。ＣＤ４は自らの細胞内ドメインを利用して、活性化されたＴ細胞のシグナル伝達カスケードの多くの分子成分を活性化させるのに不可欠な酵素チロシンキナーゼＬｃｋをリクルートすることにより、ＴＣＲが生成したシグナルを増幅する。
ＣＤ４はＩ型膜貫通タンパク質であり、その中の４つの免疫グロブリンスーパーファミリードメイン（Ｎ末端から細胞膜側へと順番にＤｌ～Ｄ４と命名されている）は細胞の外側に存在し、合計で２つのＮ結合型糖鎖がドメインＤ３～Ｄ４に結合している。ＣＤ４はＤｌドメインとＤ２ドメインを通じて主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合した後、Ｔ細胞を活性化させる。さらに、ＣＤ４はＤ３ドメインとＤ４ドメインを通じて重合することも知られている。ＣＤ４のＤｌドメインはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の受容体として機能することが知られている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ８４（ｌ）：７３－８４）， １９９７）。
ＣＤ４は、エントリー番号Ｐ０１７３０－１（ＵｎｉＰａｒｃ）に従う以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＮＲＧＶＰＦＲＨＬＬＬＶＬＱＬＡＬＬＰＡＡＴＱＧＫＫＶＶＬＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴＣＴＡＳＱＫＫＳＩＱＦＨＷＫＮＳＮＱＩＫＩＬＧＮＱＧＳＦＬＴＫＧＰＳＫＬＮＤＲＡＤＳＲＲＳＬＷＤＱＧＮＦＰＬＩＩＫＮＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥＶＱＬＬＶＦＧＬＴＡＮＳＤＴＨＬＬＱＧＱＳＬＴＬＴＬＥＳＰＰＧＳＳＰＳＶＱＣＲＳＰＲＧＫＮＩＱＧＧＫＴＬＳＶＳＱＬＥＬＱＤＳＧＴＷＴＣＴＶＬＱＮＱＫＫＶＥＦＫＩＤＩＶＶＬＡＦＱＫＡＳＳＩＶＹＫＫＥＧＥＱＶＥＦＳＦＰＬＡＦＴＶＥＫＬＴＧＳＧＥＬＷＷＱＡＥＲＡＳＳＳＫＳＷＩＴＦＤＬＫＮＫＥＶＳＶＫＲＶＴＱＤＰＫＬＱＭＧＫＫＬＰＬＨＬＴＬＰＱＡＬＰＱＹＡＧＳＧＮＬＴＬＡＬＥＡＫＴＧＫＬＨＱＥＶＮＬＶＶＭＲＡＴＱＬＱＫＮＬＴＣＥＶＷＧＰＴＳＰＫＬＭＬＳＬＫＬＥＮＫＥＡＫＶＳＫＲＥＫＡＶＷＶＬＮＰＥＡＧＭＷＱＣＬＬＳＤＳＧＱＶＬＬＥＳＮＩＫＶＬＰＴＷＳＴＰＶＱＰＭＡＬＩＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦＩＧＬＧＩＦＦＣＶＲＣＲＨＲＲＲＱＡＥＲＭＳＱＩＫＲＬＬＳＥＫＫＴＣＱＣＰＨＲＦＱＫＴＣＳＰＩ（配列番号３）。
本発明の抗ＣＤ４抗体として、ＣＤ４に結合する任意の抗体が可能であり、その中には例えば既知の任意の抗ＣＤ４抗体または未発見の抗ＣＤ４抗体の可変領域（例えばＣＤＲ）を含めることができる。本発明の抗体はＣＤ４に対する選択性を示すことができる。例に含まれるのは、完全長バリアント対スプライスバリアント、細胞表面形態対可溶性形態、さまざまな多型バリアントに対する選択性、または標的の特定の立体的形態に対する選択性である。本発明の抗体はＣＤ４上の任意のエピトープまたは領域に結合することができ、前記抗原の断片、変異体形態、スプライス形態、または異常な形態に対して特異的である。ＣＤ４陽性細胞の例に含まれるのは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈｌ細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈｌ７細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびγδΤ細胞など）である。さらに、ＣＤ４陽性細胞は、がんと炎症性疾患（例えば自己免疫性疾患またはアレルギー性疾患）を含む疾患と関連している。
多数の抗ＣＤ４抗体と抗原結合断片が本分野で知られている、および／または商品として入手可能である。本発明ではそのすべてに用途を見いだすことができる。
表２は、本開示で使用できるさまざまな市販の抗ＣＤ４抗体のリストを提供する。
商用品供給者に加え、ＣＤ４に対する多数のモノクローナル抗体が文献に報告されている。さまざまな抗ＣＤ４ｍＡｂが、がん、免疫疾患、および感染症の治療を目的として臨床で開発中である。例えばＣＤ４とＨＩＶの間の結合がＨＩＶの感染に不可欠であるという事実に基づき、ＨＩＶ治療剤として開発中でＣＤ４のＤｌドメインを認識する抗体はＨＩＶの感染を阻害することができる。がんまたは免疫疾患のための治療剤として開発された抗ＣＤ４ｍＡｂの例に含まれるのは、ザノリムマブ（６Ｇ５）、イバリズマブ、トレガリズマブ、およびケリキシマブ（ＣＥ９．１）である。これら抗体は、標的細胞であるＣＤ４を発現している細胞を特異的に攻撃することによってその医薬品としての有効性を及ぼす抗体であり、医薬品としての有効性の機構は主にＡＤＣＣ活性によると考えられている（Ｋｉｍ ｅｒ ａ／．， Ｂｌｏｏｄ， １０９（１１）： ４６５５－４６６２， ２００７）。
それに加え、本開示では、以下の参考文献に開示されている任意の抗ＣＤ４抗体またはその抗体断片を使用することを考慮する；ＵＳ７３３８６５８Ｂ２；ＵＳ５７４１４８８Ａ；ＵＳ５８７１７３２Ａ；ＵＳ９７５８５８１Ｂ２；Ｄｅｌｍｏｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉ－ＣＤ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， １９９６， Ｏｃｔ．１０（５）： ｐｐ．３９７－４０３；Ｋｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ - Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，” Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１６， Ｖｏｌ．７：１１；およびＪＦ Ｂａｃｈ， “Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ａｎｎ Ｐｈａｒｍ Ｆｒ．， ２００６， ６４（５）： ３０８－１１（これらのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
商品として入手できる上記のものすべてと、文献で知られる抗ＣＤ４抗体を、本開示で使用することができる。
ＣＤ８ターゲティング部分
ある別の実施形態では、送達用担体を標的細胞（例えば白血球）に向かわせるためのターゲティング部分は、抗ＣＤ８抗体または抗原結合断片である。
ＣＤ８は、ＭＨＣクラスＩ分子（ｐＭＨＣＩ）との複合体になったペプチド抗原をＴＣＲが認識するための共受容体として機能する表面糖タンパク質である。ＣＤ８はααホモ二量体またはαβヘテロ二量体のいずれかとして発現し（Ｚａｍｏｙｓｋａ， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １ ：２４３－６， １９９４）、両方の鎖が、単一の細胞外Ｉｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）Ｖドメイン、膜近位ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を発現する。ＣＤ８は、そのβ鎖と、細胞外ＩｇＳＦ Ｖドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）を用い、ＭＨＣクラスＩ分子のｉｍドメインおよびａ２ドメインおよびａ３ドメインと相互作用する。この会合により、Ｔ細胞受容体のそのクラスＩ標的に対する接着／アビディティが増大する。
それに加え、ＣＤ８ａ鎖が会合したチロシンタンパク質キナーゼｐ５６１ｃｋ４’５によって媒介される内部シグナル伝達カスケードがＴ細胞活性化につながる。ＬｃｋはナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化と増殖に必要とされる；しかしその発現は、インビボまたはインビトロでの二次抗原刺激に対するメモリＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答に不可欠ではない（Ｂａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， １８９： １５２１－３０， １９９９）。ＣＤ８ａ遺伝子またはＣＤ８Ｂ遺伝子が標的とされるマウスによって示されるように、ＣＤ８は、ＭＨＣクラスＩ限定Ｔリンパ球の成熟と機能において有用な役割を果たす（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６３： １１３１－３， １９８４）。繰り返される細菌感染に悩まされる１人の患者が、ＣＤ８ａ遺伝子内の単一の変異が原因でＣＤ８欠損を示すことが見いだされた。ＣＤ８の欠如は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞系譜の分化決定または末梢細胞溶解機能のいずれかにとって不可欠であるようには見えなかった（ｄｅ ｌａ Ｃａｌｌｅ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １０８： １１７－２３， ２００１）。
ヒトＣＤ８分子は糖タンパク質であるとともに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の表面で発現する細胞表面マーカーである。ＣＴＬはＴリンパ球のサブセットであり、脊椎動物の適応免疫系において重要な役割を果たす。ＣＴＬはウイルスが感染した細胞または他の異常な細胞（いくつかの腫瘍細胞など）の排除に責任を有する。これらの細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じて特異的に認識され、ＴＣＲが標的細胞上のＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩを通じて提示されるある抗原と相互作用する。
代表的な１つのＣＤ８アミノ酸配列はＰ０１７３２－１（ＵｎｉＰａｒｃ）によって表わされ、以下の正規配列として知られる：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶＫＳＧＤＫＰＳＬＳＡＲＹＶ（配列番号４）。
多くの抗ＣＤ８抗体と抗原結合断片が本分野で知られている、および／または商品として入手可能である。本発明ではそのすべてに用途を見いだすことができる。
表３は、本開示で使用できるさまざまな市販の抗ＣＤ８抗体のリストを提供する。
多くの抗ＣＤ８抗体が、モノクローナル抗体を含めて本分野で知られており、その中に含まれるのは、２Ｄ２；４Ｄ１２．１；７Ｂ１２ ＩＧ１ １；８Ｅ－１．７；８Ｇ５；１４；２１Ｔｈｙ；５１．１；６６．２；１０９－２Ｄ４；１３８－１７；１４３－４４；２７８Ｆ２４；３０２Ｆ２７；ＡＩＣＤ８．１；抗Ｔ８；Ｂ９．１．１；Ｂ９．２．４；Ｂ９．３．１；Ｂ９．４．１；Ｂ９．７．６；Ｂ９．８．６；Ｂ９．１ １；Ｂ９．１ １．１０；ＢＥ４８；ＢＬ１５；ＢＬ－ＴＳ８；ＢＭＡＣ８；ＢＵ８８；ＢＷ１３５／８０；Ｃ１－１１Ｇ３；ＣＩＯ；Ｃ１２／Ｄ３；ＣＤ８－４Ｃ９；ＣＬＢ－Ｔ８／１；ＣＴＡＧ－ＣＤ８、３Ｂ５；Ｆ８０－１Ｄ４Ｄ１１；Ｆ１０１－８７（Ｓ－Ｔ８ａ）；ＧＩＯ－Ｉ；ＧｌＯ－１．１；ＨＩ２０８；ＨＩ２０９；ＨＩ２１２；ＨＩＴ８ａ；ＨＩＴ８ｂ；ＨＩＴ８ｄ；ＩＣＯ－３１；ＩＣＯ－１２２；ＩＰ４８；ＩＴＩ－５Ｃ２；ＩＴＭ８－１；ＪＭＬ－Ｈ７；ＪＭＬ－Ｈ８；Ｌ２；Ｌ５３３；Ｌｅｕ－２ａ；ＬＴ８；ＬＹ１７．２Ｅ７；ＬＹ１９．３Ｂ２；Ｍ２３６；Ｍ－Ｔ１２２；Ｍ－Ｔ４１５；Ｍ－Ｔ８０５；Ｍ－Ｔ８０６；Ｍ－Ｔ８０７；Ｍ－Ｔ８０８；Ｍ－Ｔ８０９；Ｍ－Ｔ１０１４；ＭＣＤ８；ＭＥＭ－３１；ＭＥＭ－１４６；ＮＵ－Ｔｓ／ｃ；ＯＫＴ８；ＯＫＴ８ｆ；Ｐ２１８；ＲＰＡ－Ｔ８；ＳＭ４；Ｔ８；Ｔ８／２Ｔ８－１９；Ｔ８／２Ｔ８－２Ａ１；Ｔ８／２Ｔ８－１Ｂ５；Ｔ８／２Ｔ８－１Ｃ１；Ｔ８／７Ｐｔ３Ｆ９；Ｔ８／２１ｔｈｙ２Ｄ３；Ｔ８／２１ ｔｈｙ；Ｔ８／ＴＰＥ３ＦＰ；Ｔ８ｂ；Ｔ４１Ｄ８；Ｔ８１１；ＴＵ６８；ＴＵ１０２；ＵＣＨＴ４；ＶＩＴ８；ＶＩＴ８ｂ；ＷｕＴ８－ｌ；Ｘ１０７；ＹＴＣ１４１．１；および／またはＹＴＣ１８２．２０である。
商用品供給者に加え、ＣＤ８に対する多数のモノクローナル抗体が文献に報告されている。例えば以下の刊行物に記載されている抗ＣＤ８抗体またはその断片を本明細書で考慮する：ＡＵ２０１４２４９２４３Ｂ２；１０，７４６，７２６；９，７９０，２７９；９，７５８，５８１；９，５８７，０２２；８，８７７，９１３；８，６８５，６５１；８，６７３，３０４；８，５８６，７１５；８，４４０，８０６；８，３９９，６２１；７，５４１，４４３；７，４８２，０００；７，４５２，９８１；７，４５２，５３４；７，３３８，６５８；６，１３６，３１０；６，０５６，９５６；５，８７１，７３２；および５，７４１，４８８（そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
商品として入手できる上記のものすべてと、文献で知られる抗ＣＤ８抗体を、本開示で使用することができる。
ＣＤ３ターゲティング部分
ある別の実施形態では、送達用担体を標的細胞（例えば白血球）に向かわせるためのターゲティング部分は、抗ＣＤ３抗体または抗原結合断片である。
ＣＤ３抗原はＴ細胞上のＴ細胞受容体複合体と会合する。ＣＤ３と標的細胞の抗原に対する特異性を有する多重特異性抗原結合タンパク質は、標的細胞上でＴ細胞の細胞傷害活性を開始させることができる。すなわちＣＤ３と標的細胞（例えば腫瘍細胞）への抗原結合タンパク質の多重特異的結合により、標的細胞の細胞溶解を誘導することができる。ＣＤ３結合部位を有する抗原結合タンパク質とその生成は本分野で知られている（そして例えばＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２９３：４１－５６、Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， １７／４：３５７－３６６に記載されている）。
ＣＤ３抗原は、５つの不変ポリペプチド鎖：γ、δ、ε、ζ、およびη（その分子量は、それぞれ２５～２８、２１、２０、１６、および２２ｋＤａ）の複合体である。ＣＤ３鎖はクラスター化し、２つの不変二量体、すなわちζホモ二量体からなるか、ζ／ηまたはζ／γ ＦｃＲヘテロ二量体（γ ＦｃＲはＦｃ受容体のγ鎖）からなるか、γＦｃＲホモ二量体からなる可変二量体と会合したγ／εとδ／εのグループになる。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むより大きな複合体の一部である。ＴＣＲと会合したＣＤ３複合体が、免疫応答の間に主要組織適合性複合体クラスＩとＩＩに結合したペプチドの認識に関与する。Ｔ細胞活性化は、外来抗原がＭＨＣ複合体を通じてＴＣＲに提示されるときに誘導される可能性がある。ＣＤ３抗原は、成熟Ｔリンパ球によってと、胸腺細胞のサブセットによって発現される。
多くの抗ＣＤ３抗体と抗原結合断片が本分野で知られている、および／または商品として入手可能である。本発明ではそのすべてを使用することができる。
表４は、本開示で使用できる市販のさまざまな抗ＣＤ８抗体のリストを提供する。
抗ＣＤ３抗体は、モノクローナル抗体を含めて本分野で知られており、その中に含まれるのは、ＵＳ２０１８／００５７５９３、ＵＳ１１００７２６７Ｂ２、ＵＳ１０８６５２５１Ｂ２、ＵＳ１０７５９８５８Ｂ２、ＵＳ１０９０６９７８Ｂ２、ＵＳ２０２１０２５３７０１Ａ１、ＵＳ２０２００１２３２５５Ａ１、ＵＳ２０２１００９５０２７Ａ１、ＵＳ２０２１０１４７５６１Ａ１、ＵＳ１０５４４２２０Ｂ２、ＵＳ２０１９０２８４２７８Ａ１、ＵＳ２０１９０２６３９０４Ａ１、およびＵＳ２０２０００４８３４８Ａ１（そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に開示されているものである。
商品として入手できる上記のものすべてと、文献で知られる抗ＣＤ８抗体を、本開示で使用することができる。
それに加え、本明細書で使用される送達用担体上のターゲティング部分として使用できる本開示の抗体は、適切な任意の従来の手段によって作製することもできる。１つのアプローチでは、興味ある抗原（例えばＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ５）を用いた免疫化の後、抗体を産生する可能性のある体細胞（特にＢリンパ球（Ｂ細胞））が、ＭＡｂ生成プロトコルにおいて使用するために選択される。これらの細胞は、生検した脾臓またはリンパ節から、または循環している血液から取得することができる。免疫化された動物からの抗体産生Ｂリンパ球は次いで不死骨髄腫細胞の細胞（一般に、免疫化された動物と同じ種の細胞、またはヒト細胞またはヒト／マウスキメラ細胞）と融合される。ハイブリドーマ産生融合手続きでの使用に適した骨髄腫細胞系は、抗体を産生しないこと、高い融合効率を有すること、酵素が欠損していて望む融合した細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖をサポートする所定の選択培地の中では増殖できなくされていることが好ましい。当業者に知られている多数の骨髄腫細胞の任意の１つを使用することができる（Ｇｏｄｉｎｇ， ｐｐ．６５－６６， １９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ， ｐｐ．７５－８３， １９８４）。
抗体を産生する脾臓またはリンパ節の細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドを生成させる方法は、通常、細胞膜の融合を促進する（化学的または電気的な）１つまたは複数の薬剤の存在下で体細胞を骨髄腫細胞と混合することを含む。センダイウイルスを用いる融合法はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）によって記載されており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧなど）を用いる融合法はＧｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）によって記載されている。電気的に誘導する融合法を利用することも適切である（Ｇｏｄｉｎｇ， ｐｐ．７１－７４， １９８６）。
培養によりハイブリドーマの集団が提供され、そこから特定のハイブリドーマが選択される。典型的には、ハイブリドーマの選択は、微量滴定プレートの中での単一クローン希釈によって細胞を培養した後、（約２～３週間後に）個々のクローン上清で望む反応性を調べることによって実行される。アッセイは、感度がよく、単純で、迅速でなければならない（ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイドット免疫結合アッセイなど）。その後、選択されたハイブリドーマは系列希釈されるか、単一細胞がフローサイトメトリーソーティングによって選別されて個々の抗体産生細胞系にクローニングされ、次いでそのクローンが無限に増殖されてｍＡｂが得られる。
ＭＡｂ産生のための細胞系は２つの基本的なやり方で探すことができる。ハイブリドーマの１つのサンプルを動物（例えばマウス）（のしばしば腹腔）に注射することができる。場合により、その動物は、注射の前に炭水化物、特に油（プリスタン（テトラメチルペンタデカン）など）で予備刺激を与えられる。ヒトハイブリドーマをこのように使用するときには、腫瘍拒絶を阻止するため免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウスなど）に注射することが最適である。注射された動物は腫瘍を発達させ、融合した細胞ハイブリッドによって産生された特定のモノクローナル抗体を分泌する。その後、動物の体液（血清または腹水など）からＭＡｂを高濃度で得ることができる。個々の細胞系はインビトロで培養することもでき、その場合にはＭＡｂが自然に培地の中に分泌され、そこからＭＡｂを容易に高濃度で得ることができる。あるいはヒトハイブリドーマ細胞系をインビトロで使用して細胞上清の中に免疫グロブリンを産生させることができる。高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンを回収する能力を最適化するため、細胞系を無血清培地の中で増殖するのに適した状態にすることができる。
いずれかの手段によって産生されたＭＡｂは、望む場合には、濾過、遠心分離、およびさまざまなクロマトグラフィ法（ＦＰＬＣまたはアフィニティクロマトグラフィなど）を利用してさらに精製することができる。本開示のモノクローナル抗体の断片は、精製したモノクローナル抗体から、酵素（ペプシンまたはパパインなど）を用いた消化、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断を含む方法によって得ることができる。あるいは本開示に包含されるモノクローナル抗体断片は、自動化ペプチド合成装置を用いて合成することができる。
モノクローナルの生成に分子クローニングのアプローチを利用できることも考慮される。そのためにはＲＮＡをハイブリドーマ系から単離し、ＲＴ－ＰＣＲによって抗体遺伝子を取得し、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。あるいは適切な抗体を発現している細胞系からコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリを調製し、ファージミドから単離されたＲＮＡを、ウイルス抗原を用いたパンニングによって選択する。従来のハイブリドーマ技術と比べたこのアプローチの利点は、単一のラウンドでより多くの抗体を生成させてスクリーニングできることと、Ｈ鎖とＬ鎖の組み合わせによって新たな特異性が生じ、それが適切な抗体を見いだす機会をさらに増やすことである。
本開示で有用な抗体の産生を教示するアメリカ合衆国特許（それぞれが参照によって本明細書に組み込まれている）に含まれるのは、コンビナトリアルアプローチを利用したキメラ抗体の産生を記載しているアメリカ合衆国特許第５，５６５，３３２号；組み換え免疫グロブリン調製物を記載しているアメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号；および抗体－治療剤複合体を記載しているアメリカ合衆国特許第４，８６７，９７３号である。
組み合わせ
一実施形態では、本発明により、Ｔ細胞を標的とする送達用担体の組み合わせが提供され、この組み合わせは２つ以上のＴ細胞抗原を標的とする。一実施形態では、その２つ以上のＴ細胞抗原の選択は、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、またはＣＣＲ７からなされる。一実施形態では、組み合わせは、１つ以上のＴ細胞と標的とする送達用担体を含み、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の表面抗原と、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の表面抗原を標的とする。一実施形態では、組み合わせは、２つ以上のＴ細胞を標的とする送達用担体を含み、ＣＤ４とＣＤ８を標的とする。
一実施形態では、Ｔ細胞を標的とする送達用担体の組み合わせは、異なる表面抗原を発現しているＴ細胞に同じ薬剤を送達する。一実施形態では、Ｔ細胞を標的とする送達用担体の組み合わせは、第１の表面抗原を発現しているＴ細胞の１つのサブセットに第１の薬剤を、第２の表面抗原を発現しているＴ細胞の第２のサブセットに第２の異なる薬剤を送達する。したがってさまざまな実施形態では、本発明の組み合わせを用いて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０超の異なる薬剤をＴ細胞に送達することができる。
一実施形態では、Ｔ細胞を標的とする本発明の送達用担体は、本明細書に記載されている薬剤の組み合わせを含むか封入している。ある実施形態では、本明細書に記載されている薬剤の組み合わせを含む組成物は相加効果を有し、組み合わせの全体効果は、それぞれの個別の薬剤の効果の和にほぼ等しい。他の実施形態では、本明細書に記載されている薬剤の組み合わせを含む組成物は相乗効果を有し、組み合わせの全体効果は、それぞれの個別の薬剤の効果の和よりも大きい。
薬剤の組み合わせを含む組成物は、個々の薬剤を適切な任意の比で含む。例えば一実施形態では、組成物は、１：１の比の２つの個別の薬剤を含む。しかし組み合わせがどれか特定の比に限定されることはない。むしろ有効であることが示されている任意の比が包含される。
コンジュゲート
本発明のさまざまな実施形態では、送達用担体はターゲティングドメインにコンジュゲートされる。コンジュゲートの代表的な方法の非限定的な例に含めることができるのは、共有結合、静電相互作用、および疎水性（「ファンデルワールス力」）相互作用である。一実施形態では、コンジュゲートは可逆的なコンジュゲートであるため、送達用担体は、ある条件または化学的薬剤に曝露されるとターゲティングドメインから解離することができる。別の一実施形態では、コンジュゲートは不可逆的なコンジュゲートであるため、通常の条件下では送達用担体はターゲティングドメインから解離しない。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、活性化されたポリマーがコンジュゲートした脂質とターゲティングドメインの間の共有結合を含む。「活性化されたポリマーがコンジュゲートした脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分を含み、第１のカップリング基を有するポリマーがコンジュゲートした脂質が機能化されることを通じてポリマー部分が活性化されている分子を意味する。一実施形態では、活性化されたポリマーがコンジュゲートした脂質は、第２のカップリング基と反応することのできる第１のカップリング基を含む。一実施形態では、活性化されたポリマーがコンジュゲートした脂質は活性化されたｐｅｇ化脂質である。一実施形態では、第１のカップリング基はｐｅｇ化脂質の脂質部分に結合する。別の一実施形態では、第１のカップリング基はｐｅｇ化脂質のポリエチレングリコール部分に結合する。一実施形態では、第２の官能基はターゲティングドメインに共有結合される。
第１のカップリング基および第２のカップリング基として、例えば穏やかな反応条件または生理学的条件のもとで互いに共有結合を形成する当業者に知られている任意の官能基が可能である。いくつかの実施形態では、第１のカップリング基または第２のカップリング基の選択は、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、カルボジイミド、ヒドラジド、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ホスフィン、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、ピリジルジスルフィド、イソシアン酸塩、ビニルスルホン、アルファ－ハロアセチル、アリールアジド、アシルアジド、アルキルアジド、ジアジリン、ベンゾフェノン、エポキシド、炭酸塩、無水物、塩化スルホニル、シクロオクチン、アルデヒド、およびスルフヒドリル基からなる群からなされる。いくつかの実施形態では、第１のカップリング基または第２のカップリング基の選択は、遊離アミン（－ＮＨ２）、遊離スルフヒドリル基（－ＳＨ）、遊離水酸化物基（－ＯＨ）、カルボン酸塩、ヒドラジド、およびアルコキシアミンからなる群からなされる。いくつかの実施形態では、第１のカップリング基は、スルフヒドリル基と反応する官能基である（マレイミド、ピリジルジスルフィド、またはハロアセチルなど）。一実施形態では、第１のカップリング基はマレイミドである。
一実施形態では、第２のカップリング基はスルフヒドリル基である。スルフヒドリル基は、当業者に知られている任意の方法を利用してターゲティングドメインの表面に取り付けることができる。一実施形態では、スルフヒドリル基は遊離システイン残基の表面に存在する。一実施形態では、スルフヒドリル基はターゲティングドメイン上のジスルフィドの還元によって（例えば２－メルカプトエチルアミンとの反応を通じて）露わになる。一実施形態では、スルフヒドリル基は、化学反応（遊離アミンと２－イミノチランまたはＳ－アセチルチオ酢酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＡＴＡ）の間の反応など）によって取り付けることができる。
いくつかの実施形態では、ポリマーがコンジュゲートした脂質とターゲティングドメインは「クリック」化学で使用される基を用いて機能化される。生体直交「クリック」化学は、１，３－双極子を有する官能基（アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、イソシアニドなど）と、アルケンまたはアルキン親双極子を有するリンクの間の反応を含む。代表的な親双極子に含まれるのは、当業者に知られている任意の歪んだシクロアルケンとシクロアルキンであり、その非限定的な例に含まれるのは、シクロオクチン、ジベンゾシクロオクチン、一フッ素化シクロオクチン、二フッ素化シクロオクチン、およびビアリールアザシクロオクチンである。
ペプチド
一実施形態では、本発明のターゲティングドメインはペプチドを含む。ある実施形態では、ペプチドターゲティングドメインは興味ある標的に特異的に結合する。
本発明のペプチドは化学的方法を利用して作製することができる。例えばペプチドは、固相技術によって合成し（Ｒｏｂｅｒｇｅ Ｊ Ｙ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ２０２－２０４）、樹脂から切断し、分取高性能液体クロマトグラフィによって精製することができる。自動合成は、例えばＡＢＩ ４３１ Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者によって提供された指示に従って用いて実現することができる。
あるいはペプチドは、組み換え手段によって、またはより長いポリペプチドからの切断によって作製することができる。ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる。
本発明によるペプチドのバリアントとして、（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が保存された、または保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されたもの（このように置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされていてもいなくてもよい）、（ｉｉ）１つ以上の修飾されたアミノ酸残基（例えば置換基の付着によって修飾された残基）が存在しているもの、（ｉｉｉ）ペプチドが本発明のペプチドのスプライスバリアントであるもの、（ｉｖ）ペプチドの断片、および／または（ｖ）ペプチドが別のペプチド（リーダー配列または分泌配列、または精製（例えばＨｉｓタグ）または検出（例えばＳｖ５エピトープタグ）に使用される配列など）と融合しているものが可能である。断片は、元の配列のタンパク質分解（多部位タンパク質分解を含む）による切断を通じて生成したペプチドを含む。バリアントは、翻訳後に、または化学的に修飾することができる。このようなバリアントは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
本分野で知られているように、２つのペプチドの間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列とその保存されたアミノ酸置換を第２のペプチドの配列と比較することによって求まる。バリアントは、元の配列とは異なる、好ましくは元の配列と興味ある区画ごとに残基の４０％未満が異なる、より好ましくは元の配列と興味ある区画ごとに残基の２５％未満が異なる、より好ましくは興味ある区画ごとに残基の１０％未満が異なる、最も好ましくは元のタンパク質配列と興味ある区画ごとにほんの数個の残基が異なると同時に、元の配列の機能を保持するため元の配列と十分に相同なペプチド配列を含むと定義される。本発明には、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％類似または一致するアミノ酸配列が含まれる。２つのペプチドの間の一致の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムと方法を利用して判断される。２つのアミノ酸配列の間の一致はＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０ （１９９０）］を利用して判断することが好ましい。
本発明のペプチドは翻訳後に修飾することができる。例えば本発明の範囲に入る翻訳後修飾には、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリスチル化、タンパク質折り畳み、およびタンパク質分解処理などが含まれる。いくつかの修飾またはプロセシングイベントは、追加の生物機械の導入を必要とする。例えばプロセシングイベント（シグナルペプチド切断とコアグリコシル化など）は、イヌミクロゾーム膜またはアフリカツメガエルの卵の抽出物（アメリカ合衆国特許第６，１０３，４８９号）を標準的な翻訳反応物に添加することによって調べられる。
本発明のペプチドは、翻訳後修飾によって、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成された非天然アミノ酸を含むことができる。
核酸
一実施形態では、本発明のターゲティングドメインは、単離された核酸（例えばＤＮＡオリゴヌクレオチドとＲＮＡオリゴヌクレオチドが含まれる）を含む。ある実施形態では、核酸ターゲティングドメインは興味ある標的に特異的に結合する。例えば一実施形態では、核酸は、興味ある標的に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。
核酸ターゲティングドメインのヌクレオチド配列は代わりに元のヌクレオチド配列に対する配列バリエーション（例えば１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失）を含むことができるが、得られた核酸が元と同じ機能であり、興味ある標的に特異的に結合することが条件である。
本明細書で用いる意味では、あるヌクレオチド配列が、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかと「実質的に相同である」のは、そのヌクレオチド配列が、本明細書のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の程度の一致であるときである。可能な修飾の他の例に含まれるのは、配列の中への１個以上のヌクレオチドの挿入、配列のいずれかの末端への１個以上のヌクレオチドの付加、または配列のいずれかの末端または内部における１個以上のヌクレオチドの欠失である。２つのポリヌクレオチドの間の一致の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムと方法を利用して求められる。２つのアミノ酸配列の間の一致の程度はＢＬＡＳＴＮアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０（１９９０）］を利用して判断することが好ましい。
抗体
一実施形態では、本発明のターゲティングドメインは抗体または抗体断片を含む。ある実施形態では、抗体ターゲティングドメインは興味ある標的に特異的に結合する。そのような抗体に含まれるのは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂとその一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二重特異性抗体、ヘテロ複合体、ヒト抗体、およびヒト化抗体である。
抗体として、インタクトモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と、免疫学的に活性な断片（例えばＦａｂまたは（Ｆａｂ）２断片）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、遺伝子操作された一本鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ、アメリカ合衆国特許第４，９４６，７７８号）、またはキメラ抗体（例えばマウス抗体の結合特異性を含有するが残部がヒト起源である抗体）が可能である。抗体は、モノクローナルとポリクローナル抗体、断片、およびキメラを含め、当業者に知られている方法を利用して調製することができる。
このような抗体は多彩な方法で生成させることができる。方法に含まれるのは、ハイブリドーマ培養、細菌または哺乳類細胞培養物の中での組み換え発現、およびトランスジェニック動物の中での組み換え発現である。製造方法の選択はいくつかの因子に依存する。因子に含まれるのは、望む抗体構造、抗体上の炭化水素部分の重要性、培養と精製の容易さ、およびコストである。多くの異なる抗体構造（完全長抗体、抗体断片（ＦａｂやＦｖ断片など）のほか、異なる種からの構成要素を含むキメラ抗体が含まれる）を標準的な発現技術を利用して生成させることができる。エフェクタ機能がなく限定された薬物動態活性を有する小さなサイズの抗体断片（ＦａｂとＦｖ断片など）は細菌発現系の中で生成させることができる。一本鎖Ｆｖ断片は低い免疫原性を示す。
一実施形態では、本発明のターゲティングドメインは、Ｔ細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体である。一実施形態では、本発明のターゲティングドメインは、ｐａｎ－Ｔ抗原に特異的に結合する抗体である。一実施形態では、ｐａｎ－Ｔ抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、またはＣＤ７である。
ペプチドターゲティング部分
一実施形態では、本発明のターゲティングドメインはペプチドを含む。ある実施形態では、ペプチドターゲティングドメインは興味ある標的に特異的に結合する。
本発明のペプチドは化学的方法を利用して作製することができる。例えばペプチドは、固相技術によって合成し（Ｒｏｂｅｒｇｅ Ｊ Ｙ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ２０２－２０４）、樹脂から切断し、分取高性能液体クロマトグラフィによって精製することができる。自動合成は、例えばＡＢＩ ４３１ Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者によって提供された指示に従って使用して実現することができる。
あるいはペプチドは、組み換え手段によって、またはより長いポリペプチドからの切断によって作製することができる。ペプチドの組成はアミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる。
本発明によるペプチドのバリアントとして、（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が保存された、または保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されたもの（このように置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされていてもいなくてもよい）、（ｉｉ）１つ以上の修飾されたアミノ酸残基（例えば置換基の付着によって修飾された残基）が存在しているもの、（ｉｉｉ）ペプチドが本発明のペプチドのスプライスバリアントであるもの、（ｉｖ）ペプチドの断片、および／または（ｖ）ペプチドが別のペプチド（リーダー配列または分泌配列、または精製（例えばＨｉｓタグ）または検出（例えばＳｖ５エピトープタグ）に使用される配列など）と融合しているものが可能である。断片は、元の配列のタンパク質分解（多部位タンパク質分解を含む）による切断を通じて生成したペプチドを含む。バリアントは、翻訳後に、または化学的に修飾することができる。このようなバリアントは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
本分野で知られているように、２つのペプチドの間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列とその保存されたアミノ酸置換を第２のペプチドの配列と比較することによって求まる。バリアントは、元の配列とは異なる、好ましくは元の配列と興味ある区画ごとに残基の４０％未満が異なる、より好ましくは元の配列と興味ある区画ごとに残基の２５％未満が異なる、より好ましくは興味ある区画ごとに残基の１０％未満が異なる、最も好ましくは元のタンパク質配列と興味ある区画ごとにほんの数個の残基が異なると同時に、元の配列の機能を保持するため元の配列と十分に相同なペプチド配列を含むと定義される。本発明は、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％類似または一致するアミノ酸配列を含む。２つのペプチドの間の一致の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムと方法を用いて求める。２つのアミノ酸配列の間の一致はＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０（１９９０）］を利用して判断することが好ましい。
本発明のペプチドは翻訳後に修飾することができる。例えば本発明の範囲に入る翻訳後修飾には、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリスチル化、タンパク質折り畳み、およびタンパク質分解処理などが含まれる。いくつかの修飾またはプロセシングイベントは、追加の生物機械の導入を必要とする。例えばプロセシングイベント（シグナルペプチド切断やコアグリコシル化など）は、イヌミクロゾーム膜またはアフリカツメガエルの卵の抽出物（アメリカ合衆国特許第６，１０３，４８９号）を標準的な翻訳反応物に添加することによって調べられる。
本発明のペプチドは、翻訳後修飾によって、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成される非天然アミノ酸を含むことができる。
核酸ターゲティング部分
一実施形態では、本発明のターゲティングドメインは、単離された核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。単離された核酸に含まれるのは、例えばアプタマー（その非限定的な例は、プレケオシン（ｐｒｅｑｕｅｏｓｉｎ）１－１リボスイッチアプタマーすなわち「ｅｖｏｐｒｅＱ１－１」またはそのバリアント、シュードノット（ＭＭＬＶウイルスゲノムシュードノットすなわち「Ｍｐｋｎｏｔ－１」）またはそのバリアント、ｔＲＮＡまたはそのバリアント、またはＧ－クワドゥルプレックスまたはそのバリアントである）、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、核酸ターゲティングドメインは興味ある標的に特異的に結合する。例えば一実施形態では、核酸は、興味ある標的に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。
核酸ターゲティングドメインのヌクレオチド配列は代わりに元のヌクレオチド配列に対する配列バリエーション（例えば１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失）を含むことができるが、得られた核酸が原初の核酸と同じように機能し、興味ある標的に特異的に結合することが条件である。
本明細書で用いる意味では、あるヌクレオチド配列が、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかと「実質的に相同である」のは、そのヌクレオチド配列が、本明細書のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の程度の一致であるときである。可能な修飾の他の例に含まれるのは、配列の中への１個以上のヌクレオチドの挿入、配列のいずれかの末端への１個以上のヌクレオチドの付加、または配列のいずれかの末端または内部における１個以上のヌクレオチドの欠失である。２つのポリヌクレオチドの間の一致の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムと方法を利用して求められる。２つのアミノ酸配列の間の一致の程度はＢＬＡＳＴＮアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０（１９９０）］を利用して判断することが好ましい。
抗体ターゲティング部分
本開示により、さまざまな実施形態において、ターゲティングドメインとして抗体または抗体断片を含む送達用担体が、この送達用担体（例えばリポソームまたは脂質ナノ粒子）を望む免疫細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）に向かわせるために提供される。
一実施形態では、本発明のターゲティングドメインは抗体または抗体断片を含む。ある実施形態では、抗体ターゲティングドメインは興味ある標的に特異的に結合する。そのような抗体に含まれるのは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂとその一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二重特異性抗体、ヘテロ複合体、ヒト抗体、およびヒト化抗体である。
抗体として、インタクトモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と、免疫学的に活性な断片（例えばＦａｂまたは（Ｆａｂ）２断片）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、遺伝子操作された一本鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ、アメリカ合衆国特許第４，９４６，７７８号）、またはキメラ抗体（例えばマウス抗体の結合特異性を含有するが残部がヒト起源である抗体）が可能である。抗体は、モノクローナルとポリクローナル抗体、断片、およびキメラを含め、当業者に知られている方法を利用して調製することができる。
このような抗体は多彩な方法で生成させることができる。方法に含まれるのは、ハイブリドーマ培養、細菌または哺乳類細胞培養物の中での組み換え発現、およびトランスジェニック動物の中での組み換え発現である。製造方法の選択はいくつかの因子に依存する。因子に含まれるのは、望む抗体構造、抗体上の炭化水素部分の重要性、培養と精製の容易さ、およびコストである。多くの異なる抗体構造（完全長抗体、抗体断片（ＦａｂやＦｖ断片など）のほか、異なる種からの構成要素を含むキメラ抗体が含まれる）を標準的な発現技術を利用して生成させることができる。エフェクタ機能がなく限定された薬物動態活性を有する小さなサイズの抗体断片（ＦａｂとＦｖ断片など）は細菌発現系の中で生成させることができる。一本鎖Ｆｖ断片は低い免疫原性を示す。
一実施形態では、本発明のターゲティングドメインは、Ｔ細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体である。一実施形態では、本発明のターゲティングドメインは、ｐａｎ－Ｔ抗原に特異的に結合する抗体である。一実施形態では、ｐａｎ－Ｔ抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、またはＣＤ７である。
Ｔ細胞
さまざまな実施形態では、送達用担体の標的として、体内の任意のタイプの細胞（すなわち「標的細胞」）が可能である。好ましい実施形態では、標的細胞は免疫細胞であり、その非限定的な例は、任意のクラスの骨髄細胞（例えば好中球、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および単球）、または任意のクラスのリンパ球（例えばＴ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、またはメモリＴ細胞）、Ｂ細胞（例えば形質細胞とメモリＢ細胞）、およびナチュラルキラー細胞）である。
ある実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物の標的となることができるＴ細胞としてＣＤ４＋またはＣＤ８＋が可能であり、その非限定的な例に含めることができるのは、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ；ＣＤ８－ Ｔ細胞とも呼ばれる）、およびメモリＴ細胞（セントラルメモリＴ細胞（ＴＣＭ）、幹メモリＴ細胞（ＴＳＣＭ）、幹細胞様メモリＴ細胞（または幹様メモリＴ細胞）、およびエフェクタメモリＴ細胞が含まれる）であり、例えばＴＥＭ細胞とＴＥＭＲＡ（ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞、エフェクタＴ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、Ｔｆｈ（濾胞性ヘルパー）細胞、Ｔ制御細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、およびγδ Ｔ細胞がある。主要なＴ細胞サブタイプに含まれるのは、ＴＮ（ナイーブ）、ＴＳＣＭ（幹細胞メモリ）、ＴＣＭ（セントラルメモリ）、ＴＴＭ（移行メモリ）、ＴＥＭ（エフェクタメモリ）、およびＴＴＥ（ターミナルエフェクタ）、ＴＣＲ－トランスジェニックＴ細胞、サイトカインを媒介とした普遍的殺傷のためリダイレクトされたＴ細胞（ＴＲＵＣＫ）、腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）、ＣＡＲ Ｔ細胞、または疾患または障害の治療に使用できる任意のＴ細胞である。
一実施形態では、本発明のＴ細胞は、免疫刺激細胞、すなわち免疫応答を媒介する細胞である。免疫刺激性である代表的なＴ細胞の非限定的な例に含まれるのは、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ；ＣＤ８＋ Ｔ細胞とも呼ばれる）、およびメモリＴ細胞（セントラルメモリＴ細胞（ＴＣＭ）、幹メモリＴ細胞（ＴＳＣＭ）、幹細胞様メモリＴ細胞（または幹様メモリＴ細胞）、およびエフェクタメモリＴ細胞が含まれる）であり、例えばＴＥＭ細胞とＴＥＭＲＡ（ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞、エフェクタＴ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、Ｔｆｈ（濾胞性ヘルパー）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、およびγδ Ｔ細胞がある。
治療法
一実施形態では、Ｔ細胞を標的とする送達用担体は、対象に投与される薬剤を含む、または封入する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡである。したがって本発明により、少なくとも１つの薬剤をＴ細胞に送達する方法が提供される。
一実施形態では、Ｔ細胞を標的とする送達用担体は、疾患または障害を治療するための治療剤を含む、または封入する。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＣＡＲをコードする、ヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡである。したがって本発明により、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子をＴ細胞に送達する方法が提供される。ある実施形態では、この方法を利用して対象における疾患または障害を治療または予防する。代表的な疾患または障害の非限定的な例に含まれるのは、がん、感染性疾患、および免疫傷害である。
以下が、開示されている方法によって治療または予防することのできるがんの非限定的な例である：急性リンパ芽球白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、虫垂がん、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳と脊髄の腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸がん、小児視路腫瘍、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、頭蓋外がん、性線外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、肝外がん、目がん、菌状息肉症、胆嚢がん、胃の（胃）がん、消化管がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ジスト）、胚細胞腫瘍、妊娠がん、妊娠性トロホブラスト腫瘍、膠芽腫、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部視神経、視床下部腫瘍、眼内（目）がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）がん、ランゲルハンス細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球症、咽頭がん、白血病、唇と口腔のがん、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫と骨肉腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、口がん、多発性内分泌腫瘍症症候群、多発性骨髄腫、真菌症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔と服鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫と悪性線維性組織球腫、骨肉腫と骨の悪性線維性組織球腫、卵巣の、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、中分化型の松果体実質腫瘍、松果体芽腫瘍とテント上原始神経外胚腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系がん、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、腎盂と尿管のがん、染色体１５上のｎｕｔ遺伝子が関与する気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、皮膚がん（黒色腫）、皮膚がん（非黒色腫）、皮膚癌、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織がん、軟組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、胃（胃の）がん、テント上原始神経外胚腫瘍、テント上原始神経外胚腫瘍と松果体芽腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、喉がん、胸腺腫と胸腺癌、甲状腺がん、移行上皮がん、腎盂と尿管の移行上皮がん、トロホブラスト腫瘍、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、視神経視床下部神経膠腫、陰門がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍。
いくつかの実施形態では、本発明は、自己免疫性疾患を治療または予防する方法を特徴とする。自己免疫性疾患の非限定的な例に含まれるのは、関節リウマチ／血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、虹彩毛様体炎症／ぶどう膜炎視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシスであり、その非限定的な例に含まれるのは、関節リウマチ／血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、虹彩毛様体炎症／ぶどう膜炎視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、心筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、抗糸球体基底膜腎炎、間質性膀胱炎、ループス腎炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎、抗合成酵素症候群、円形脱毛症、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円板状エリテマトーデス、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、限局性強皮症、尋常性天疱瘡、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ムッカ－ハーベルマン病、乾癬、全身性強皮症、白斑、アジソン病、自己免疫性多内分泌腺症候群（ＡＰＳ）１型、自己免疫性多内分泌腺症候群（ＡＰＳ）２型、自己免疫性多内分泌腺症候群（ＡＰＳ）３型、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、オード甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性卵巣炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、シェーグレン症候群、自己免疫性腸疾患、セリアック病、クローン病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性大腸炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ、ＡＰＬＳ）、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、寒冷凝集素症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、悪性貧血、赤芽球癆、血小板減少症、有痛脂肪症、成人発症スティル病、強直性脊椎炎、ＣＲＥＳＴ症候群、薬剤誘発性ループス、付着部関連関節炎、好酸球性筋膜炎フェルティ症候群、ＩｇＧ４関連疾患、若年性関節炎、ライム病（慢性）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、回帰性リウマチ、パリー・ロンバーグ症候群、パーソネイジ－ターナー症候群、乾癬性関節炎、反応性関節炎、再発性多発軟骨炎、後腹膜線維症、リウマチ熱、シュニッツラー症候群、診断未確定結合組織病（ＵＣＴＤ）、皮膚筋炎、線維筋痛症、封入体筋炎、筋炎、重症筋無力症、ニューロミオトニア、傍腫瘍性小脳変性症、多発性筋炎、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性運動性軸索型ニューロパチー、抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（抗ＮＭＤＡ）受容体脳炎、バロー同心円硬化症、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン-バレー症候群、橋本脳症、特発性炎症性脱髄性疾患、ランバート－イートン筋無力症候群、多発性硬化症、パターンＩＩ、オシュトラン症候群、小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害（ＰＡＮＤＡＳ）、進行性炎症性ニューロパチー、レストレスレッグス症候群、スティッフパーソン症候群、シデナム舞踏病、横断性脊髄炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性ブドウ膜炎、コーガン症候群、グレーブス眼症、中間部ぶどう膜炎、木質結膜炎、モーレン潰瘍、視神経脊髄炎、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、強膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、トロサ－ハント症候群、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、メニエール病、ベーチェット病、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、巨細胞性動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、ＩｇＡ血管炎（ＩｇＡＶ）、川崎病、白血球破砕性血管炎、ループス血管炎、リウマチ性血管炎、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発筋痛症、蕁麻疹様血管炎、血管炎、および原発性免疫不全である。
いくつかの実施形態では、前記薬剤は、感染症または感染性疾患の治療または予防のための治療剤である。一実施形態では、治療剤は、細菌感染症、またはそれに伴う疾患または障害の治療または予防のための治療剤である。細菌は、以下の門、すなわちアキドバクテリウム、アクチノバクテリア、アクウィフェクス、バクテロイデス、カルディセリクム、クラミジア、クロロビウム、クロロフレクサス、クリシオゲネス、シアノバクテリア、デフェリバクター、デイノコッカス－サーマス、ディクティオグロムス、エルシミクロビウム、フィブロバクテル、ファーミキューテス、フソバクテリウム、ゲンマティモナス、レンティスファエラ、ニトロスピラ、プランクトミケス、プロテオバクテリア、スピロヘータ、シネルギステス、テネリクテス、サーモデスルフォバクテリア、テルモトガ、およびウェルコミクロビウムのいずれか１つに由来することができる。
細菌として、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌が可能である。細菌として、好気性細菌または嫌気性細菌が可能である。細菌として、独立栄養細菌または従属栄養細菌が可能である。細菌として、中温菌、好中菌、極限環境菌、好酸菌、好アルカリ菌、好熱菌、好冷菌、好塩菌、または好濃菌が可能である。
細菌として、炭疽菌、抗生剤耐性菌、疾患を引き起こす細菌、食中毒菌、感染性細菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、または破傷風菌が可能である。細菌として、マイコバクテリア、破傷風菌、ペスト菌、炭疽菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、またはクロストリジウム・ディフィシルが可能である。
一実施形態では、前記薬剤は、ウイルス性の感染症、またはそれに伴う疾患または障害の治療または予防のための治療剤である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、以下の科、すなわちアデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、カリシウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が含まれる）、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、またはトガウイルスの１つに由来する。ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、デング熱ウイルス、パピローマウイルス（例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、ポリオウイルス、肝炎ウイルス（例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ））、天然痘ウイルス（大痘瘡と小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－Ｉ）、有毛細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マーブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペス１型（口唇ヘルペス）、単純ヘルペス２型（性器ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名水疱瘡）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばヒトＣＭＶ）、エプスタイン－バールウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、手足口病ウイルス、ラッサウイルス、アレナウイルス、またはがんを引き起こすウイルスに由来することができる。
一実施形態では、前記薬剤は、寄生虫感染症、またはそれに関連する疾患または障害の治療または予防のための治療剤である。いくつかの実施形態では、寄生虫は、原生動物、蠕虫、または外部寄生虫である。蠕虫（すなわち蠕虫（ｗｏｒｍ））として、扁形動物（例えば吸虫と条虫）、鉤頭虫、または回虫（例えば蟯虫）が可能である。外部寄生虫として、シラミ、ノミ、マダニ、およびダニが可能である。
寄生虫として、以下の疾患の任意の１つを引き起こす任意の寄生虫が可能である：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ赤痢、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ属、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、小型条虫症、イソスポラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、蝿蛆症、オンコセルカ症、シラミ症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、および鞭虫症。
寄生虫として、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、条虫綱（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、イヌシタムシ、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫属－肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、条虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫が可能である。
一実施形態では、前記薬剤は、真菌感染症、またはそれに関連する疾患または障害の治療または予防のための治療剤である。いくつかの実施形態では、真菌は、アスペルギルス属の種、ブラストミセス・デルマティティディス、カンジダ酵母（例えばカンジダ・アルビカンス）、コクシジオイデス属、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、皮膚糸状菌、フザリウム属の種、ヒストプラスマ・カプスラツム、ケカビ亜門、ニューモシスチス・イロベチイ、スポロトリクス・シェンキイ、エクセロヒルム属、またはクラドスポリウム属である。
当業者は、本明細書で詳述した方法を含む本開示で武装したとき、本発明がすでに確立している疾患または障害の治療に限定されないことを認識するであろう。特に、疾患または障害は、対象にとって害が現われる点まで達している必要はない；実際、治療を適用する前に疾患または障害を対象において検出する必要はない。すなわち本発明が利益を提供する前に疾患または障害の有意な徴候または症状が生じる必要はない。したがって本発明には、本明細書の別の箇所でこれまでに論じた組成物を疾患または障害の発症前に対象に投与し、そのことによってその疾患または障害を予防することができるという意味で、疾患または障害を予防する方法が含まれる。
当業者は、本開示で武装したとき、疾患または障害の予防には、疾患または障害の進展または進行に対する予防措置として組成物を対象に投与することが包含されることを認識するであろう。本明細書の別の箇所でより十分に論じられているように、遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性を変化させる方法には、ポリペプチド遺伝子産物のレベルと活性を変化させるだけでなく、核酸の発現（転写、翻訳、またはその両方が含まれる）を変化させる広範な技術が包含される。
本発明は、ターゲティングドメインにコンジュゲートされた少なくとも１つの薬剤を含む送達用担体の送達を包含する。本発明の方法を実施するため；当業者は、本明細書に提示されている開示に基づき、適切な組成物を製剤にして対象に投与する方法を理解していると考えられる。本発明がどれか特定の投与方法または治療計画に限定されることはない。
当業者は、本発明の組成物を単独で、または任意の組み合わせで投与できることがわかるであろう。さらに、本発明の組成物は、時間の意味で単独で、または任意の組み合わせで投与すること、すなわち互いに同時に、前、および／または後に投与することができる。当業者は、本明細書に提示されている開示に基づき、本発明の組成物を使用して疾患または障害を予防または治療できることと、組成物は、単独で、または別の組成物との任意の組み合わせで使用し、治療結果に影響を与えうることを認識しているであろう。さまざまな実施形態では、本明細書に記載されている本発明の任意の組成物を単独で、または疾患または障害に関連する他の分子の他のモジュレータと組み合わせて投与することができる。
ヒト患者への本発明の組成物（例えば送達用担体）の投与は、任意の経路（その非限定的な例に含まれるのは、静脈内、節内、皮内、経皮、皮下、筋肉内、吸入（例えばエアロゾルによる）、口（例えば舌下）、局所（すなわち皮膚と粘膜両方の表面であり、気道表面を含む）、髄腔内、関節内、胸腔内（intraplural）、脳内、動脈内、腹腔内、経口、リンパ内、鼻腔内、直腸、または膣投与である）によって、局所カテーテルを通じた灌流によって、または直接的な病巣内注射によって実現することができる。一実施形態では、本発明の組成物（例えば送達用担体）は、静脈内注射、または規定された期間（例えば０．５～２時間）をかけた静脈内輸液によって投与される。本発明の組成物は、蠕動手段によって、またはデポ剤の形態で送達することができるが、所与のどのケースでも最適な経路は、本分野で周知のように、対象の種、年齢、性別、および全体的な状態、治療する状態の性質と重症度、および／または投与される具体的な組成物の性質（すなわち投与量、製剤）などの因子に依存するであろう。特別な実施形態では、投与経路はボーラスまたはある期間をかけた連続的輸液を通じてであり、週に１回または２回である。他の特別な実施形態では、投与経路は１つ以上の部位（例えば大腿、腰、臀部、腕）になされる皮下注射を通じてであり、場合により週に１回または２回である。一実施形態では、本発明の組成物および／または方法は外来で投与される。
一実施形態では、本発明には、本明細書に記載されている組成物の組み合わせを投与することを含む方法が含まれる。ある実施形態では、前記方法は相加効果を有し、組成物の組み合わせを投与する全体効果は、それぞれの個別の阻害剤を投与する効果の和にほぼ等しい。他の実施形態では、前記方法は相乗効果を有し、組成物の組み合わせを投与する全体効果は、それぞれの個別の組成物を投与する効果の和よりも大きい。
前記方法は、適切な任意の比にした組成物の組み合わせを投与することを含む。例えば一実施形態では、前記方法は、２つの個別の組成物を１：１の比で投与することを含む。しかし前記方法がどれか特定の比に限定されることはない。むしろ有効であることが示された任意の比が包含される。
医薬組成物
（例えば１つ以上の送達用担体を含む）本明細書に記載されている医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているか、今後開発される任意の技術によって調製することができる。一般に、このような調製法は、活性成分（例えば１つ以上の送達用担体）を基剤、または１つ以上の他の補助成分と会合させた後、必要であるか望む場合には、その製品を望む単一の単位用量または複数の単位用量に成形またはパッケージする工程を含む。
本明細書に示されている医薬組成物の記述はヒトへの倫理的な投与に適した医薬組成物に主に向けられているが、そのような組成物は一般にあらゆる種類の動物への投与に適することを当業者は理解しているであろう。ヒトへの投与に適した医薬組成物を改変してさまざまな動物への投与に適した組成物にすることはよく理解されており、獣医学分野の薬理学の当業者は、そのような改変を設計し、必要な場合には単に通常の実験で実現することができる。本発明の医薬組成物を投与することが考えられる対象の非限定的な例に含まれるのは、ヒトとそれ以外の霊長類、哺乳類であり、その中には、商業的に重要な哺乳類（非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌなど）が含まれる。
本発明の方法で有用な（例えば１つ以上の送達用担体を含む）医薬組成物は、目、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口内、静脈内、脳室内、皮内、筋肉内、または別の投与経路に適した製剤に調製して、パッケージ、または販売することができる。考慮する他の製剤に含まれるのは、突起ナノ粒子（projected nanoparticles）、リポソーム調製物、再密封された赤血球を含有する活性成分、および免疫原性に基づく製剤である。
本発明の医薬組成物は、単一単位用量または複数の単一単位用量として調製すること、パッケージすること、またはバルクで販売することができる。本明細書では、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の離散量である。活性成分の量は一般に、対象に投与することになる活性成分の用量に等しいか、そのような用量の便利な分数（例えば用量の半分または１／３など）である。
本発明の医薬組成物の中の活性成分、医薬として許容可能な基剤、および任意の追加成分の相対量は、治療する対象の素性、サイズ、および状態に依存して変化するであろうし、組成物が投与される経路にさらに依存して変化するであろう。例えば組成物は０．１％と１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、活性成分に加え、医薬として活性な１つ以上の追加の薬剤をさらに含むことができる。
本発明の医薬組成物の制御放出製剤または持続放出製剤は従来の技術を利用して作製することができる。
本明細書では、医薬組成物の「非経口投与」には、対象の組織を物理的に突破することを特徴とする任意の投与経路と、突破を通じた組織への医薬組成物の投与が含まれる。したがって非経口投与の非限定的な例に含まれるのは、注射による医薬組成物の投与、外科的切開を通じた組成物の適用、組織に侵入する非外科的傷を通じた組成物の適用などである。特に、非経口投与が考えられる非限定的な例に含まれるのは、眼内、硝子体内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、胸骨内注射、腫瘍内、静脈内、脳室内、および腎臓透析輸液技術である。
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、活性成分を、医薬として許容可能な基剤（減菌水または減菌等張生理食塩水など）と組み合わせて含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製すること、パッケージすること、または販売することができる。注射可能な製剤は、単位剤型（アンプルなど）、または保存剤を含有する複数回投与容器で調製すること、パッケージすること、または販売することができる。非経口投与のための製剤の非限定的な例に含まれるのは、懸濁液、溶液、油性または水性のビヒクルの中のエマルション、ペースト、および埋め込み可能な持続放出製剤または生物分解性製剤である。このような製剤は１つ以上の追加成分をさらに含むことができ、その非限定的な例に含まれるのは、懸濁剤、安定剤、または分散剤である。非経口投与のための製剤の一実施形態では、活性成分は乾燥（すなわち粉末または顆粒）形態で提供され、適切なビヒクル（例えば発熱物質を含まない減菌水）を用いて再構成された後、その再構成された組成物が非経口投与される。
医薬組成物は、減菌された注射可能な水性または油性の懸濁液または溶液の形態で調製すること、パッケージすること、または販売することができる。この懸濁液または溶液は知られている方法に従って製剤化することと、活性成分に加え、追加成分（本明細書に記載されている分散剤、湿潤剤、または懸濁剤など）を含むことができる。このような注射可能な減菌製剤は、非毒性で非経口が許容される希釈剤または溶媒（例えば水または１，３-ブタンジオールなど）を用いて調製することができる。他の許容可能な希釈剤と溶媒の非限定的な例に含まれるのは、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、および不揮発性油（合成モノグリセリドまたはジグリセリドなど）である。有用な他の非経口投与可能な製剤に含まれるのは、微結晶形態の活性成分、リポソーム調製物になった活性成分、または生物分解性ポリマー系の１構成要素としての活性成分を含むものである。持続放出または埋め込みのための組成物は、医薬として許容可能なポリマー材料または疎水性材料（エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩など）を含むことができる。
さまざまな実施形態では、免疫細胞を標的とする送達用担体を対象に投与し、その送達用担体をインビボで標的となる免疫細胞と接触させることができる。他の実施形態では、Ｔ細胞をエクスビボで免疫細胞を標的とする送達用担体と接触させた後、それを必要とする対象に養子細胞移入で移す。この実施形態では、Ｔ細胞を患者から取り出し、本明細書に開示されている送達用担体と接触させることによってエクスビボで改変する。
本発明の医薬組成物は、口腔を通じた肺投与に適した製剤にして調製、パッケージ、または販売することができる。このような製剤は、活性成分を含んでいて約０．５～約７ナノメートル、好ましくは約１～約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含むことができる。このような組成物は、乾燥粉末リザーバを含む装置（推進剤の流れをリザーバに向けて粉末を分散させる）、または自己推進溶媒／粉末分配容器（密封容器の中の低沸点の推進剤に溶かすか懸濁させた活性成分を含む装置など）を用いて投与するため乾燥粉末の形態であることが便利である。このような粉末は、粒子の重量の少なくとも９８％が０．５ナノメートルよりも大きな直径を有し、粒子の数の少なくとも９５％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含むことが好ましい。より好ましくは、粒子の重量の少なくとも９５％が１ナノメートルよりも大きな直径を有し、粒子の数の少なくとも９０％が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は固体微粉末希釈剤（糖など）を含むことが好ましく、単位剤型にすると提供が便利である。
低沸点の推進剤は一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体推進剤を含む。一般に推進剤は組成物の５０～９９．９％（ｗ／ｗ）を占めることができ、活性成分は組成物の０．１～２０％（ｗ／ｗ）を占めることができる。推進剤はさらに、追加成分（液体非イオン性または固体アニオン性界面活性剤、または固体希釈剤（粒子のサイズが活性成分を含む粒子と同程度であることが好ましい）など）を含むことができる。
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、活性成分を、医薬として許容可能な基剤（減菌水または減菌等張生理食塩水など）と組み合わせて含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製、パッケージ、または販売することができる。注射可能な製剤は、単位剤型（アンプルなど）、または保存剤を含有する複数回投与容器で調製、パッケージ、または販売することができる。非経口投与のための製剤の非限定的な例に含まれるのは、懸濁液、溶液、油性または水性のビヒクルの中のエマルション、ペースト、および埋め込み可能な持続放出製剤または生物分解性製剤である。このような製剤は、１つ以上の追加成分（その非限定的な例に懸濁剤、安定剤、または分散剤が含まれる）をさらに含むことができる。非経口投与のための製剤の一実施形態では、活性成分は乾燥（すなわち粉末または顆粒）形態で提供され、適切なビヒクル（例えば発熱物質を含まない減菌水）を用いて再構成された後、その再構成された組成物が非経口投与される。
医薬組成物は、減菌された注射可能な水性または油性の懸濁液または溶液の形態で調製、パッケージ、または販売することができる。この懸濁液または溶液は知られている方法に従って製剤化することができ、活性成分に加えて追加成分（本明細書に記載されている分散剤、湿潤剤、または懸濁剤など）を含むことができる。このような減菌注射製剤は、非毒性で非経口が許容される希釈剤または溶媒（例えば水または１，３-ブタンジオールなど）を用いて調製することができる。他の許容可能な希釈剤と溶媒の非限定的な例に含まれるのは、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、および不揮発性油（合成モノグリセリドまたはジグリセリドなど）である。有用な他の非経口投与可能な製剤に含まれるのは、微結晶形態の活性成分、リポソーム調製物になった活性成分、または生物分解性ポリマー系の１構成要素としての活性成分を含むものである。持続放出または埋め込みのための組成物は、医薬として許容可能なポリマー材料または疎水性材料（エマルション、イオン交換樹脂、ほとんど溶けないポリマー、またはほとんど溶けない塩など）を含むことができる。
本明細書では、「追加成分」の非限定的な例に含まれるのは、以下の１つ以上のものである：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；顆粒剤と崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；着香剤；着色剤；保存剤；生理学的に分解する組成物（ゼラチンなど）；水性のビヒクルと溶媒；油性のビヒクルと溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；バッファ；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生剤；抗真菌剤；安定剤；および医薬として許容可能なポリマー材料または疎水性材料。本発明の医薬組成物に含めることのできる他の「追加成分」は本分野で知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５， Ｇｅｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、イーストン、ペンシルヴェニア州）に記載されている（参照によって本明細書に組み込まれている）。
実験の実施例
本発明を、以下の実験例を参照することによって詳細にさらに説明する。これら実施例は説明のみを目的として提示されており、特に断わらない限り限定する意図はない。したがって本発明は、実施例に限定されると解釈されてはならず、むしろ、本明細書に提示されている教示の結果として明らかになるあらゆるバリエーションを包含すると解釈すべきである。
当業者は、さらなる説明なしで、これまでの記述と以下の説明的実施例を利用し、本発明をなすこと、本発明を利用すること、請求項の方法を実施することができると考えられる。したがって以下の機能する実施例は、いかなる意味でも本開示の残部を制限すると解釈されてはならない。
実施例１：ＣＤ５を標的とするＬＮＰ
現在、特定のタイプの細胞を標的として治療用核酸を送達する能力は、インビボ遺伝子療法の開発にとって、一過性と永続性の両方で最大の課題である。提示されているデータは特定のタイプの細胞と臓器を標的とすることのできる方法が開発されたことを実証しており、遺伝子療法を激変させる可能性がある。
ＬＮＰは、ＣＤ５結合抗体をＬＮＰの表面に付着させることによってＣＤ５＋ Ｔ細胞を標的とした。ＣＤ５を標的とする、ヌクレオシドが修飾されたこのｍＲＮＡ－ＬＮＰは、インビトロとインビボで効率的かつ特異的な送達を示した（図１）。ＣＤ５を標的とするこのｍＲＮＡ－ＬＮＰプラットフォームは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰレポータ系を用いてインビボで強力かつ特異的な遺伝子編集を誘導する（図２）。
本発明により、インビボで核酸治療剤をＣＤ５＋－Ｔ細胞に効率的に送達することが可能になる。本発明は、利用されている現在の白血球アフェレーシスとＴ細胞の増殖をＣＡＲ Ｔ療法で置き換えることができる。本発明では、Ｔ細胞を標的としていてＣＡＲ Ｔ遺伝子をＴ細胞の中に挿入するｍＲＮＡを含有するＬＮＰを患者に一回だけ投与することができる。
実施例２：心臓損傷を治療するためインビボで産生されるＣＡＲ Ｔ細胞
心臓線維芽細胞は、ＴＧＦβ－ＳＭＡＤ２／３、インターロイキン－１１、およびそれ以外と免疫系の相互作用を含むよく研究されている機構を通じてさまざまな心筋損傷に応答し、活性化された状態になる（Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １２７：３７７０－３７８３；Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｎａｔｕｒｅ， ５５２：１１０－１１５；Ｍｏｏｒｅ－Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １２４：２９２１－２９３４；Ｙｏｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｃｅｌｌ， １８２：５４５－５６２；Ｒｕｒｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ， １２８：１７７６－１７７９；Ｗｉｄｊａｊａ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， ｂｉｏＲｘｉｖ： ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０６．１０．４４７８４６）。多くの慢性心疾患では、これら線維芽細胞が休止できずに過剰な細胞外マトリックスを分泌する結果として線維症になる（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｎａｔｕｒｅ， ５８７：５５５－５６６）。線維症は心筋を硬直させるとともに心筋細胞の健康と機能にマイナスの影響を与える（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ７１：１６９６-１７０６）。活性化された心臓線維芽細胞は深く理解されているにもかかわらず、抗線維化治療剤の臨床試験はこれまで期待はずれであった（Ｒｕｒｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ， １２８：１７７６－１７７９；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｎａｔｕｒｅ， ５８７：５５５－５６６；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｒｅｓ． ２０：１-１３）。さらに、これらの介入は線維化進行を制限することを目的としているため、一度確立されている線維症を再モデル化するようには設計されていない。この大きな問題に取り組むため、心不全治療剤としてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いて活性化された線維芽細胞が特異的に除去された（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３）。心疾患のマウスモデルで活性化された線維芽細胞を除去すると、心筋線維化が有意に減少し、心機能が改善される結果になった（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３）。この研究の１つの注意点は、がんクリニックで現在利用されているＣＡＲ Ｔ細胞療法と同様、操作されたＴ細胞の無限の持続性である（Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ３：９５ｒａ７３－９５ｒａ７３）。線維芽細胞活性化は多くの組織における通常の傷治癒プロセスの一部であり、持続する抗線維症ＣＡＲ Ｔ細胞は将来の損傷の状況においてリスクになる可能性がある。したがってヌクレオシドが修飾されたｍＲＮＡの技術の力を活用して一過性の抗線維症ＣＡＲ Ｔ治療剤が開発された。
治療用メッセンジャーＲＮＡは、修飾されたヌクレオシドの組み込み、合成キャッピング、長いポリ－Ａテールの付加を通じて安定化させ、コドンを最適化して増強することができる（Ｗｅｉｓｓｍａｎ， ２０１４， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． １４：２６５-２８１；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２３：１６５-１７５；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １６：１８３３-１８４０）。１－メチルシュードウリジンの組み込みも翻訳を促進する（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １６：１８３３-１８４０；Ａｎｄｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２１７：３３７-３４４）。エクスビボで電気穿孔によってＴ細胞にｍＲＮＡを直接導入することを利用してＣＡＲ Ｔ細胞を作製するのに成功している（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ７０：９０５３-９０６１）；しかしこのプロセスは大きなコストとリスクを伴うとともに、広範囲にわたる基本設備を必要とする。そこで注射後にＣＡＲ Ｔ細胞をインビボで産生することのできる修飾されたｍＲＮＡを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の中にパッケージすることにより、患者からＴ細胞が除去されるのを回避するのに使用できるアプローチが開発された。ＬＮＰ－ｍＲＮＡ技術の根底には、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックに対処する上で決定的に重要であることが証明されたワクチン開発の最近の成功があり、追加の治療戦略にとって例外的に有望である（Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ， １７：２６１-２７９；Ｒｉｚｖｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． １２， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２１－２０９０３－３；Ｋｒｉｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－ ）， ３７１：１４５-１５３；Ｓｚｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ， １２：３４６０；Ｇｉｌｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， １-１０）。ｍＲＮＡがロードされたＬＮＰは、体内に入ると、どれか特定のターゲティング戦略があるわけではないため、さまざまなタイプの細胞（静脈内に注射された場合には特に肝細胞）によってエンドサイトーシスを受ける（Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２１７：３４５-３５１；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １８：１３５７-１３６４）。細胞に取り込まれてからしばらくしてｍＲＮＡはエンドソームを逃れてｍＲＮＡを細胞質の中に放出し、そこで一過性に転写された後、分解される（Ｗｅｉｓｓｍａｎ， ２０１４， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． １４：２６５-２８１）。特定のタイプの細胞への取り込み（とｍＲＮＡ発現）を指示するため、ＬＮＰの表面をターゲティング抗体で修飾することができる（Ｐａｒｈｉｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２９１：１０６－１１５；Ｔｏｍｂａｃｚ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０２１．０６．００４）。理論に囚われることなく、Ｔリンパ球に向かうＬＮＰは十分なｍＲＮＡを送達して機能的ＣＡＲ Ｔ細胞をインビボで産生できると仮定した（図３）。ｍＲＮＡは細胞質に限定されていてゲノムへの組み込みは不可能であること、本来的に不安定であること、そして細胞分裂の間に希釈されることが理由で、これらＣＡＲ Ｔ細胞は、設計上、一過性になろう。
実験で使用する材料と方法をこれから説明する。
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から獲得した。Ａｉ６マウス（ＲｏｓａＣＡＧ－ＬＳＬ ＺｓＧｒｅｅｎ）はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バー・ハーバー、メイン州）から取得した。すべての動物研究は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）によって認定された施設において、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルの元で倫理的に実施された。
試薬と抗体
Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯレトロウイルスパッケージング細胞（ＣＲＬ－３２１４）とＨＥＫ２９３Ｔ（ＣＲＬ－３２１６）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、ヴァージニア州）から３７８取得した。ＡＣＨ２細胞はＦａｒｉｄａ Ｓｈａｈｅｅｎ（ペンシルヴェニア大学、ＣＦＡＲ）から取得した。すべての不死化細胞系はマイコプラズマ汚染を年に４回検査される。アンジオテンシンＩＩ（Ａ９５２５）とフェニレフリン塩酸塩（Ｐ６１２６）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔモデル２００４）はＤｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（クパチーノ、カリフォルニア州）から取得した。減菌生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）はＨｏｓｐｉｒａ（レイク・フォレスト、イリノイ州）から購入した。ルシフェラーゼアッセイ（Ｅ１５１Ａ）とｐＧＬ３－対照プラスミドはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マディソン、ウィスコンシン州）から取得した。マウスＦＡＰ発現プラスミドは、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（南サンフランシスコ、カリフォルニア州）によってＮＣＢＩ基準配列ＮＭ＿００７９８６．３を用いて合成された。インビトロ齧作用実験のため、Ｔｄ＿Ｔｏｍａｔｏがフレーム内でＦＡＰのＮ末端（細胞内断片）に融合された。Ｈｉｓタグ付き組み換えマウスＦＡＰ（ａｂ２７１５０６）はＡｂｃａｍ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から取得した。Ｈｉｓ－タグ－ＰＥモノクローナル抗体（クローンＤ３Ｉ１０、１５０２４）はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンヴァース、マサチューセッツ州）から取得した。ＣＤ３－ＡＰＣ（クローン１７Ａ２、２０－００３２－Ｕ１００）はＴｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から取得した。
ＲＮＡを合成し、脂質ナノ粒子に入れて複合体にする
使用したＦＡＰＣＡＲコンストラクトは、マウスのＣＤ３ζとＣＤ２８という細胞質シグナル伝達ドメインを有するマウス特異的ＦＡＰモノクローナル抗体（クローン７３．３）からのｓｃＦｖ断片を含有していた（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２：１５４-１６６）。アデノシンとプロスタグランジンＥ２を媒介とした抑制に対する耐性を与える小さなペプチドが含まれる（ＲＩＳＲ－ＲＩＡＤ）（Ｎｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ４， ５４１-５５１）。ＦＡＰＣＡＲとＲＩＳＲ－ＲＩＡＤをコードする配列はＰ２Ａ自己切断ペプチドコード配列によって隔てられており、哺乳類細胞の中で発現させるためコドンを最適化した後、完全な配列を、Ｔ７プロモータ、５’と３’のＵＴＲエレメント、およびポリ（Ａ）テールを有するＩＶＴ鋳型プラスミドにクローニングした。クローニングと無エンドトキシンプラスミド調製のサービスはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）によって提供された。ｍＲＮＡはＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＭＢ１３３４５）によりｍ１Ψ－５’－三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｎ－１０８１）をＵＴＰの代わりに用いて作製され、長さがヌクレオチド１０１個のポリ（Ａ）テールを含有していた。インビトロで転写されたｍＲＮＡのキャッピングを、トリヌクレオチドキャップ１類似体ＣｌｅａｎＣａｐ（ＴｒｉＬｉｎｋ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて同時転写で実施した。以前に記載されているようにして（Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １５：２６-３５）、ｍＲＮＡをセルロース精製によって精製した。全ｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分析し、－２０℃で保管した。セルロース精製によるｍ１Ψ含有ＲＮＡを以前に記載されているように（Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２１：１５７０-１５７８）自己集合プロセスを利用してＬＮＰの中に封入した、簡単に述べると、イオン化可能なカチオン性脂質、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびポリエチレングリコール－脂質のエタノール性脂質混合物を酸性ｐＨのｍＲＮＡを含有する水溶液と素早く混合した。ＲＮＡがロードされた粒子を特徴づけた後、１μｇ／μｌの濃度にして－８０℃で保管した。これらＬＮＰ－ｍＲＮＡの平均流体力学的直径は約８０ｎｍであり、多分散指数は０．０２～０．０６、封入効率は約９５％であった。この研究で使用したＬＮＰはＡｃｕｉｔａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに所有権がある。
抗体がコンジュゲートしたＬＮＰ－ｍＲＮＡを調製するため、以前に記載されているようにして（Ｔｏｍｂａｃｚ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０２１．０６．００４）、ＬＮＰ－ｍＲＮＡを、精製したラット抗マウスＣＤ５であるクローン５３－７．３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはマウス抗ヒトＣＤ５であるクローンＵＣＨＴ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、および対照であるアイソタイプが合致したＩｇＧと、ＳＡＴＡ-マレイミド化学によってコンジュゲートさせた。簡単に述べると、挿入後技術によってＬＮＰをマレイミド官能基（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ｍａｌ）で修飾した。抗体をＳＡＴＡ（Ｓ－アセチルチオ酢酸Ｎ－スクシンイミジル）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）で機能化してスルフヒドリル基を導入し、マレイミドにコンジュゲートできるようにした。０．５Ｍのヒドロキシルアミンを用いてＳＡＴＡの保護を外した後、反応しなかった成分をＧ－２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ タンパク質カラム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナポリス、インディアナ州）によって除去した。その後、チオエーテルコンジュゲート化学を利用して抗体上の反応性スルフヒドリル基をマレイミド部分にコンジュゲートさせた。精製は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂゲル濾過カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した。改変したＱｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を実施することによってｍＲＮＡ含量を計算した。ターゲティングリガンドの添加後、標的に向かうＬＮＰ調製物と標的に向かわないＬＮＰ調製物をすべて４℃で保管し、調製から３日以内に使用した。
一実施形態では、ＦＡＰＣＡＲ分子はマウスＦＡＰＣＡＲ分子であり、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＧＳＱＶＱＬＫＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＴＡＤＫＲＬＥＬＶＡＴＴＮＮＮＧＧＶＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＱＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＹＧＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＩＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＳＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＶＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹＨＲＳＲＮＳＲＲＮＲＬＬＱＶＴＴＭＮＭＴＰＲＲＰＧＬＴＲＫＰＹＱＰＹＡＰＡＲＤＦＡＡＹＲＰＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ＊（配列番号５）。これは、
マウスＦＡＰＣＡＲをコードする以下のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＧＴＧＣＡＣＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＧＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＴＡＡ（配列番号６）によってコードされるか、以下のＲＮＡ配列、すなわち
マウスＦＡＰＣＡＲをコードするｍＲＮＡ配列：
ＡＵＧＧＣＣＣＵＧＣＣＣＧＵＧＡＣＣＧＣＣＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＣＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＵＣＣＣＡＧＧＵＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＵＧＧＵＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＣＵＧＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＧＣＧＣＣＧＣＣＵＣＣＧＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＧＧＣＡＵＧＵＣＣＵＧＧＧＵＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＧＵＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＧＵＧＡＣＣＵＡＣＵＡＣＣＣＣＧＡＣＵＣＣＧＵＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＣＵＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＵＧＵＡＣＣＵＧＣＡＧＡＵＧＵＣＣＵＣＣＣＵＧＣＡＧＵＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＵＧＵＡＣＵＡＣＵＧＣＧＣＣＣＧＣＵＡＣＧＧＣＵＡＣＵＡＣＧＣＣＡＵＧＧＡＣＵＡＣＵＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＵＣＵＣＣＧＵＧＡＣＣＧＵＧＵＣＣＵＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＵＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＧＡＣＧＵＧＣＵＧＡＵＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＵＧＵＣＣＣＵＧＣＣＣＧＵＧＵＣＣＣＵＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＵＣＣＡＵＣＵＣＣＵＧＣＣＧＣＵＣＣＵＣＣＣＡＧＵＣＣＡＵＣＧＵＧＣＡＣＵＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＵＡＣＣＵＧＧＡＧＵＧＧＵＡＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＵＣＣＣＣＣＡＡＧＣＵＧＣＵＧＡＵＣＵＡＣＡＡＧＧＵＧＵＣＣＡＡＣＣＧＣＵＵＣＵＣＣＧＧＣＧＵＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＵＵＣＵＣＣＧＧＣＵＣＣＧＧＣＵＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＵＵＣＡＣＣＧＵＧＡＡＧＡＵＣＵＣＣＣＧＣＧＵＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＵＧＧＧＣＧＵＧＵＡＣＵＡＣＵＧＣＵＵＣＣＡＧＧＧＣＵＣＣＣＡＣＧＵＧＣＣＣＵＡＣＡＣＣＵＵＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＵＧＧＡＧＡＵＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＧＵＧＣＵＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＵＣＣＣＣＣＧＵＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＵＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＵＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＵＣＣＧＵＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＵＧＧＡＣＵＵＣＧＣＣＵＧＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＧＣＣＣＣＣＣＵＧＧＣＣＧＧＣＡＵＣＵＧＣＧＵＧＧＣＣＣＵＧＣＵＧＣＵＧＵＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＣＡＣＣＣＵＧＡＵＣＵＧＣＵＡＣＣＡＣＣＧＣＵＣＣＣＧＣＡＡＣＵＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＵＧＣＵＧＣＡＧＧＵＧＡＣＣＡＣＣＡＵＧＡＡＣＡＵＧＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＵＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＵＡＣＣＡＧＣＣＣＵＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＵＵＣＧＣＣＧＣＣＵＡＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＡＧＵＵＣＵＣＣＣＧＣＵＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＵＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＵＧＡＡＣＣＵＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＵＡＣＧＡＣＧＵＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＵＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＧＵＧＵＡＣＡＡＣＧＣＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＵＡＣＵＣＣＧＡＧＡＵＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＵＧＵＡＣＣＡＧＧＧＣＣＵＧＵＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＵＡＣＧＡＣＧＣＣＣＵＧＣＡＣＡＵＧＣＡＧＡＣＣＣＵＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＵＡＡ（配列番号７）によってコードされる。
別の一実施形態では、ＦＡＰＣＡＲ分子はＭｕ－ＦＡＰＣＡＲ－Ｍｕ－ＣＤ２８Ｚ－Ｐ２Ａ－ＲＩＳＲ－ＲＩＡＤであり、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＧＳＱＶＱＬＫＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＴＡＤＫＲＬＥＬＶＡＴＴＮＮＮＧＧＶＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＱＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＹＧＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＩＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＳＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＶＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹＨＲＳＲＮＳＲＲＮＲＬＬＱＶＴＴＭＮＭＴＰＲＲＰＧＬＴＲＫＰＹＱＰＹＡＰＡＲＤＦＡＡＹＲＰＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＥＳＫＲＲＱＥＥＡＥＱＲＫＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ＊（配列番号８）。これは、Ｍｕ－ＦＡＰＣＡＲ－Ｍｕ－ＣＤ２８Ｚ－Ｐ２Ａ－ＲＩＳＲ－ＲＩＡＤをコードするＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＧＴＧＣＡＣＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＧＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＴＡＡ（配列番号９）によってコードされるか、Ｍｕ－ＦＡＰＣＡＲ－Ｍｕ－ＣＤ２８Ｚ－Ｐ２Ａ－ＲＩＳＲ－ＲＩＡＤをコードするｍＲＮＡ配列：
ＡＵＧＧＣＣＣＵＧＣＣＣＧＵＧＡＣＣＧＣＣＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＣＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＵＣＣＣＡＧＧＵＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＵＧＧＵＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＣＵＧＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＧＣＧＣＣＧＣＣＵＣＣＧＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＧＧＣＡＵＧＵＣＣＵＧＧＧＵＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＧＵＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＧＵＧＡＣＣＵＡＣＵＡＣＣＣＣＧＡＣＵＣＣＧＵＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＣＵＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＵＧＵＡＣＣＵＧＣＡＧＡＵＧＵＣＣＵＣＣＣＵＧＣＡＧＵＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＵＧＵＡＣＵＡＣＵＧＣＧＣＣＣＧＣＵＡＣＧＧＣＵＡＣＵＡＣＧＣＣＡＵＧＧＡＣＵＡＣＵＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＵＣＵＣＣＧＵＧＡＣＣＧＵＧＵＣＣＵＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＵＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＧＡＣＧＵＧＣＵＧＡＵＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＵＧＵＣＣＣＵＧＣＣＣＧＵＧＵＣＣＣＵＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＵＣＣＡＵＣＵＣＣＵＧＣＣＧＣＵＣＣＵＣＣＣＡＧＵＣＣＡＵＣＧＵＧＣＡＣＵＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＵＡＣＣＵＧＧＡＧＵＧＧＵＡＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＵＣＣＣＣＣＡＡＧＣＵＧＣＵＧＡＵＣＵＡＣＡＡＧＧＵＧＵＣＣＡＡＣＣＧＣＵＵＣＵＣＣＧＧＣＧＵＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＵＵＣＵＣＣＧＧＣＵＣＣＧＧＣＵＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＵＵＣＡＣＣＧＵＧＡＡＧＡＵＣＵＣＣＣＧＣＧＵＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＵＧＧＧＣＧＵＧＵＡＣＵＡＣＵＧＣＵＵＣＣＡＧＧＧＣＵＣＣＣＡＣＧＵＧＣＣＣＵＡＣＡＣＣＵＵＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＵＧＧＡＧＡＵＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＧＵＧＣＵＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＵＣＣＣＣＣＧＵＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＵＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＵＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＵＣＣＧＵＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＵＧＧＡＣＵＵＣＧＣＣＵＧＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＧＣＣＣＣＣＣＵＧＧＣＣＧＧＣＡＵＣＵＧＣＧＵＧＧＣＣＣＵＧＣＵＧＣＵＧＵＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＣＡＣＣＣＵＧＡＵＣＵＧＣＵＡＣＣＡＣＣＧＣＵＣＣＣＧＣＡＡＣＵＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＵＧＣＵＧＣＡＧＧＵＧＡＣＣＡＣＣＡＵＧＡＡＣＡＵＧＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＵＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＵＡＣＣＡＧＣＣＣＵＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＵＵＣＧＣＣＧＣＣＵＡＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＡＧＵＵＣＵＣＣＣＧＣＵＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＵＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＵＧＡＡＣＣＵＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＵＡＣＧＡＣＧＵＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＵＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＧＵＧＵＡＣＡＡＣＧＣＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＵＡＣＵＣＣＧＡＧＡＵＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＵＧＵＡＣＣＡＧＧＧＣＣＵＧＵＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＵＡＣＧＡＣＧＣＣＣＵＧＣＡＣＡＵＧＣＡＧＡＣＣＣＵＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＵＣＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＵＵＣＵＣＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＡＧＵＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＧＣＵＧＧＡＧＣＡＧＵＡＣＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＵＡＡ（配列番号１０）によってコードされる。
動物実験
雄の成体マウスを無作為に群に分け、埋め込んだ２８日浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔモデル２００４）を通じた（１．５μｇ／ｇ／日）アンジオテンシンＩＩと（５０μｇ／ｇ／日）フェニレフリンの定常的輸液で損傷させた。対照マウスは、減菌生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）を含有するポンプで損傷させたシャムであった。ＡｎｇＩＩ／ＰＥを用いた損傷の７日後に後眼窩静脈洞を通じ、２～３％イソフルラン全身麻酔下でＬＮＰを静脈内注射した。実験の回数を検出力分析によって推定した。ＬＮＰで処理したマウスの１つの小さなコホートを複数の理由でこの報告に含まれるデータから除外した。第１に、陽性対照群は含めなかった。第２に、半数の動物は過剰な損傷を示す顕著な左心室後壁の異常を有していたため、心エコー検査の定量を不明確にする。左心室機能は、ＬＮＰ投与の２週間後にＭＳ４００（１８～３８ＭＨＺ）トランスデューサを備えるＦｕｊｉｆｉｌｍ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ超音波システム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ、トロント、ＯＮ、カナダ国）を用いて心エコー検査によって調べた。０．００５ｍＬ／ｇの２％Ａｖｅｒｔｉｎ（２，２，２－トリブロモエタノール、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射してマウスを軽く麻酔した。左心室（ＬＶ）収縮期機能：二次元長軸、短軸Ｍモード画像を取得した。ＬＶ拡張期機能：僧帽弁流入パターンと組織ドップラーを改変心尖四腔像で取得した。Ｖｅｖｏ Ｌａｂソフトウエア（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ、トロント、オンタリオ州、カナダ国）を用いて画像でＬＶの構造と機能を分析した。分析者は処理条件を知らされなかった。
ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞の生成
ＦＡＰＣＡＲ配列がゲノムに組み込まれたマウスＴ細胞を以前に記載されているようにして生成させた（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２：１５４-１６６）。簡単に述べると、マウスＴ細胞を１０～１４週の野生型マウスから陰性選択を利用して単離し（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １９８５１）、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ １１４５３Ｄ）を用いて活性化させ、１００単位／ｍＬの組み換えマウスインターロイキン－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ４０２－ＭＬ）を用いて増殖させた。Ｔ細胞は、１０％のＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｓ１１１５０）、４ｍＭのＬグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２５０３００８１）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５１４０１２２）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１３６００７９）、および５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ２１９８５０２３）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１８７５０８５）の中で増殖させた。Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１４）を用いてＦＡＰＣＡＲレトロウイルス粒子をパッケージした。Ｔ細胞へのＦＡＰＣＡＲレトロウイルス感染は、０．５μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｔ１００Ｂ）で被覆したプレートによって容易になった。
ＬＮＰを（上記のようにして）単離されて活性化されたＴ細胞と混合することにより、ＦＡＰＣＡＲコンストラクトの一過性ｍＲＮＡ発現があるマウスＴ細胞をインビトロで生成させた。１００万個のＴ細胞につき５μｇのＬＮＰをＴ細胞培地の中で組み合わせ、示されている時点でフローサイトメトリーによってＦＡＰＣＡＲの発現を調べた。
フローサイトメトリー
ＦＡＰＣＡＲの発現を探すため、陰性選択によってマウス脾臓から単離したＴ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １９８５１）をＨｉｓタグ付き組み換えＦＡＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ２７１５０６）とウサギ抗Ｈｉｓ－ＰＥ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ １５０２４Ｓ）で染色した。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ ＰｌｕｓまたはＢＤ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて細胞を調べた。すべてのプロットに関するゲーティング戦略は、ＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈを用いてリンパ球（ＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ａ）と単一細胞を最初に選択するというものであった（図５Ａ）。予備的実験はｌｉｖｅ－ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌ３４９７０）を含んでおり、このゲーティング戦略で分析したリンパ球は９８％以上が生きていると判断された。プロットは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（バージョン１０．７．１、ＢＤアッシュランド、オレゴン州））を用いて作成した。
インビトロ殺傷アッセイ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１６６８０２７）を製造者が勧めるようにして使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）にマウスＦＡＰとホタルルシフェラーゼプラスミドをトランスエクトすることにより、標的細胞を作製した。３０００個の標的細胞をトランスフェクションの４８時間後に９６ウエルのプレートに再播種し、示されている比のＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞とともに一晩共培養した。細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、溶解させ、ルシフェラーゼの蛍光を製造者の勧めに従って（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１５１Ａ）ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３プレート・リーダー（ウォルサム、マサチューセッツ州）で調べた。ルシフェラーゼの減少は、ＦＡＰを発現しているＨＥＫ２９３Ｔ 標的細胞が機能的ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞によって排除されたことを示す。殺傷効率は、１００－（（調べるＲＬＵ／Ｔ細胞なしの平均ＲＬＵ）×１００）に等しい（ただしＲＬＵは相対蛍光単位である）。
組織学
組織を４％パラホルムアルデヒドの中に一晩固定し、エタノールで徐々に脱水した。ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）を標準的なプロトコルに従って実施した。ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって以前に記載されているようにして完了させた（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３）。ＤＦＣ７０００ Ｔカメラを用いた（４Ｘ／０．１３ ＨＣ ＰＬ ＦＬＵＯＴＡＲ対物レンズと２０Ｘ／０．８０ ＰＨ２ ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ対物レンズを備えた）ＤＭｉ８Ｓ広視野顕微鏡、（ＨｙｄＤ検出器、２０Ｘ／０．５ ＨＣ ＬＰ ＦＬＵＯＴＡＲ対物レンズ、および６３Ｘ／１．４０ ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ２対物レンズを備えた）ＳＰ８共焦点を用いて画像を取得し、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、バッファロー・グローヴ、イリノイ州）をデフォルト設定で用いてデコンボリュートした。ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ）ソフトウエアの中で、心室と隔膜両方の線維症の割合をマウス１匹につき少なくとも４つの心臓切片においてＰＳＲ染色の色彩デコンボリューションに基づきブラインドで定量した。
統計
スチューデントｔ検定を利用して２つの群の間の差を評価した。有意性は、複数の群に関して一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を利用して判断した。有意なＡＮＯＶＡの結果（ｐ＜０．０５）をテューキー（Tukey）の事後多重比較検定を利用してさらに分析した。誤差棒は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。Ｒ（バージョン４．０．５、Ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）の中でＲＳｔｕｄｉｏ（バージョン１．４．１１０６、ボストン、マサチューセッツ州）とｇｇｐｌｏｔ２（バージョン３．３．３）を用いて統計を計算し、グラフを作成した。模式図を描き、図をＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ（バージョン２５．３．１、Ａｄｏｂｅ Ｉｎｃ． サンノゼ、カリフォルニア州）にコンパイルした。
実験結果をこれから説明する
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）（活性化された線維芽細胞の１つのマーカー）に対して設計されたＣＡＲをコードする修飾されたヌクレオシド含有ｍＲＮＡを生成させ、ＣＤ５を標的とするＬＮＰ（「ターゲティング抗体／ＬＮＰ－ｍＲＮＡカーゴ」またはＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲと呼ぶ）の中にパッケージした（図１）（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２：１５４-１６６）。ＣＤ５は、Ｔ細胞と、Ｂ細胞の小さなサブセットによって自然に発現され、Ｔ細胞エフェクタ機能には必要とされない（Ｂｏｕｍｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， １５２：２２９-２３４；Ｓｏｌｄｅｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２３：３１０-３１８）。最初の概念検証実験として、ＦＡＰＣＡＲまたはＧＦＰのいずれかをコードする修飾されたｍＲＮＡを含有するＣＤ５／ＬＮＰを、新たに単離されて活性化されたマウスＴ細胞とともにインビトロで４８時間インキュベートした。ＣＤ５を標的とするＬＮＰは自らのｍＲＮＡ カーゴを培養物の中のＴ細胞の圧倒的多数に送達し、フローサイトメトリーによって測定したとき（図５Ａ）、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＧＦＰへの曝露後に７８％がＧＦＰを発現し（図４Ａ）、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲへの曝露後にＴ細胞の８３％がＦＡＰＣＡＲを発現した（図４Ｂと図４Ｃ）。アイソタイプ対照（ＩｇＧ）抗体で装飾したため明示的にはリンパ球に向かわないＬＮＰはインビトロでｍＲＮＡをわずかな割合（７％）のＴ細胞に送達できるのみであった（図４Ｂと図４Ｃ）。ＬＮＰが生成させたこれらＣＡＲ Ｔ細胞は、ウイルスで操作したＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞と同様、ＦＡＰを発現している標的細胞をインビトロで用量に依存して（図５Ｂ）効果的に殺すことができた（図４Ｄ）。ＣＤ５／ＬＮＰ－ＧＦＰを用いてＡＣＨ２細胞を標的とすることによって実証されたように、インビトロで標的に向けられるＬＮＰを通じた遺伝子導入もヒトＴ細胞において可能であり、効率的（８９～９３％）である（図５Ｃ）。
次に、ＣＤ５を標的とする脂質ナノ粒子ｍＲＮＡがＴ細胞をインビボで効率的に再プログラムすることもできるかどうかを評価した。ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するＣＤ５／ＬＮＰ（ＣＤ５／ＬＮＰ－Ｌｕｃ）を静脈内注射されたマウスは自らの脾臓Ｔ細胞の中で豊富なルシフェラーゼ活性を発現することが見いだされた一方で、アイソタイプ－対照（標的に向かわない）ＩｇＧ／ＬＮＰ－Ｌｕｃを注射されたマウスはそうでなかった（図６Ａ）。別の１つの実験では、ＣＤ５／ＬＮＰにＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡをロードし（ＣＤ５／ＬＮＰ－Ｃｒｅ）、Ａｉ６ Ｃｒｅ－レポータマウス（Ｒｏｓａ２６ＣＡＧ－ＬＳＬ－ＺｓＧｒｅｅｎ）に注射した。遺伝子組み換えの証拠（ＺｓＧｒｅｅｎ発現）が、ＣＤ５／ＬＮＰ－Ｃｒｅを注射された動物からのＣＤ３＋ Ｔ細胞（ＣＤ４＋サブセットとＣＤ８＋サブセットの両方）で特異的に見いだされたが、ＣＤ３－（非Ｔ）細胞（主にＢ細胞と樹状細胞とマクロファージ）では、またはＩｇＧ／ＬＮＰ－Ｃｒｅを注射されたマウスでは、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性の証拠がほとんどなかった（図６Ｂ）。次に、標的に向かうＬＮＰがＦＡＰＣＡＲ ｍＲＮＡ（ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ）をＴ細胞に送達できるかどうかを、埋め込んだ２８日浸透圧ミニポンプを通じたアンジオテンシンＩＩとフェニルエフリン（ＡｎｇＩＩ／ＰＥ）の定常的な輸液によって心損傷と線維症が生じた確立されたマウス高血圧モデルにおいて評価した（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３；Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １１８：１９０６-１９１７）。マウスを１週間損傷させて線維症を確立した後、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲを注射した（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３）。ＬＮＰを注射してから４８時間後、ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞の一貫した集団（１７．５～２４．７％）が、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲを投与されたマウスでのみ見られた（図６Ｃ、図６Ｄ、および図７）。それとは対照的に、標的に向かわないＬＮＰ（ＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ）と、ＧＦＰを含有する標的向けＬＮＰ（ＣＤ５／ＬＮＰ－ＧＦＰ）は、ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を生成させなかった（図６Ｃ、図６Ｄ、および図７）。
ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、リンパ球が抗原提示細胞からの免疫シナプスを通じて表面分子を抽出する齧作用と呼ばれるプロセスと以前に関連づけられている（Ｈａｍｉｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ， ５６８：１１２-１１６；Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ４：８１５-８１５；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ３５：２０８-２２２）（図８Ａ）。機能的ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞がその場で産生されることのさらなる支持材料として、インビボでＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ ｍＲＮＡを用いて産生されるか、エクスビボでウイルスを用いて操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を養子移植されるかのいずれかであるＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞が齧作用の証拠を示すかどうかを調べる実験を実施した。第１に、レトロウイルスで操作したＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を、ＲＦＰタグ付きＦＡＰを過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞とインビトロで混合し、ライブ－イメージング共焦点顕微鏡法で齧作用を観察した（図８Ｂ）。ウイルスを用いて形質導入されたＧＦＰタグ付きＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を養子移植して治療したＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷動物からの脾臓の免疫蛍光分析により、脾臓の白脾髄領域における広範なＦＡＰ染色が明らかになったが、それは、対照Ｔ細胞で治療した損傷動物、または非損傷動物では見られなかった（図８Ｃと図９）。損傷後に治療された動物の脾臓の中のＦＡＰ＋細胞がＧＦＰに関して共染色された。これは、それらの細胞が、形質導入された細胞であることを示す。さらに、ＦＡＰ染色は齧作用に合致する細胞質の輝点として出現した（図８Ｄ）。齧作用は免疫応答を多くのやり方で（特に抗原の広がりを通じて）増大させる可能性がある（Ｂｏｓｓａｒｔ， ２０２０， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２６：４４４２-４４４７）。このことに合致するように、いくつかのＦＡＰ＋／ＧＦＰ陰性細胞が損傷／治療動物の脾臓で観察されたが、対照では観察されなかった（図８Ｄ矢印）。ＦＡＰ＋輝点を含有するＣＤ３＋リンパ球も、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ療法で治療した損傷動物の脾臓で観察されたが、ＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ対照で治療した損傷動物では観察されなかった（図８Ｅ）。療法の後に脾臓で齧作用を示すＣＡＲ Ｔ細胞に関する以前の報告は知られていない。それはおそらく、以前の研究が、リンパ球マーカーに向かうＣＡＲ Ｔ細胞に焦点を当てていて、それを脾臓における内在性発現から識別することが難しかったからであろう。これらの知見は、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ治療の後に機能的抗ＦＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞がインビボで生成することに合致する。
次に、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ治療が、以前に観察された（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３）ように損傷マウスにおいて心機能を改善できるかどうかを評価した。これを調べるため、２８日浸透圧ミニポンプを通じてＡｎｇＩＩ／ＰＥを送達してマウスで心損傷を誘導した。１週間後に線維症が明らかになったとき（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３： ４３０-４３３）、１０μｇのＬＮＰを静脈内注射した。注射の２週間後、心機能を心エコー検査によって分析した（図１０Ａ）。機能の顕著な改善が、インビボで産生される一過性ＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞で治療した損傷マウスで観察され、養子移入されたウイルスＦＡＰＣＡＲ Ｔ細胞を用いた以前の研究と整合していた。ＡｎｇＩＩ／ＰＥによる損傷マウスをＣＤ５／ＬＮＰ ＦＡＰＣＡＲで治療すると、正常化した左心室（ＬＶ）拡張終期と収縮終期の体積を示した（図１０Ｂと図１０Ｃ）。また、以前の研究（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３）と整合するように、体重で規格化したＬＶの質量（Ｍモードで評価）は、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲを注射した後に統計的に有意な差を示さなかったが、対照損傷マウスと比べて改善される傾向が記録された（図１０Ｄ）。重要なことだが、ＬＶ拡張期機能（Ｅ／ｅ’）は非損傷レベルに戻った（図１０Ｅ）。ＬＶ収縮期機能も、駆出率（図１０Ｆ）と全長軸方向ストレイン（図１０Ｇと図１０Ｈ）によって測定したときに顕著に改善した。非ターゲティングＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲの注射はＬＶ機能を変化させなかった（図１１）。標的に向かうＬＮＰで治療した後に実質的な改善が拡張期機能と収縮期機能の両方で観察された。以前の結果（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３）と整合するように、体重に対する心臓の重量の比（心肥大の１つの指標）のほんのわずかな修正が、治療した動物で観察された（図１３Ａ）。組織学的分析をピクロシリウスレッドでの染色によって評価したとき、ＣＤ５／ＬＮＰ１６９ ＦＡＰＣＡＲで治療した損傷マウスと、生理食塩水またはＩｇＧ／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲという対照で治療した損傷マウスの間で、細胞外マトリックスの全体的負荷の有意な改善が注目された（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ）。さらに、治療した動物のサブセット（１２匹のうちの５匹）を非損傷対照から識別することができなかったが、ＦＡＰを示さない活性化された線維芽細胞から生じる持続性の線維症は別である（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３）（図１３Ｄ矢印）。（ＦＡＰを発現している活性化された線維芽細胞が、遺伝子除去によって、またはウイルスを用いて形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞での治療によって排除された以前の研究は、血管周囲線維症の持続も示した（Ａｇｈａｊａｎｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔｕｒｅ． ５７３：４３０-４３３；Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １１８：１９０６-１９１７）。したがってＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲ治療の結果として機能が改善し、間質性線維症が減少した。重要なこととして、ＣＤ５／ＬＮＰ－ＦＡＰＣＡＲを注射した後に心臓以外の臓器で大きな組織学的変化は観察されなかった（図１４）。
これらの実験結果は、機能が操作されたＴ細胞をインビボで産生させるため、標的に向かうＬＮＰの中に封入された修飾されたｍＲＮＡを静脈内に送達することが可能であることを実証するデータを提供する。修飾されたｍＲＮＡ／ＬＮＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの顕著な成功と安全性が、多くの病状に対処するためのこの治療プラットフォームを拡張する幅広い取り組みを刺激した。ＬＮＰを特定のタイプの細胞に向けることにより、本明細書でリンパ球に関して実証されたように、修飾されたｍＲＮＡ治療剤は広範囲に及ぶ応用を有する可能性が大きい。ｍＲＮＡを用いたインビトロでの操作されたＴ細胞の生成は、ある障害にとって魅力的である。なぜなら生成したＣＡＲ Ｔ細胞が一過性であるという性質が毒性を制限する可能性が大きく、厳密な投与を可能にするからである。がんを有する患者とは異なり、線維症を患っている患者は病原性細胞（活性化された線維芽細胞）を完全に除去する必要がない可能性があるが、疾患の負荷の全体的な減少により症状面での利益が得られる可能性がある。さらに、標的に向けられるＬＮＰ－ｍＲＮＡ技術には、投与を調節し、必要に応じて再投与するという有利な能力がある。投与戦略、ＬＮＰ組成物、およびターゲティングアプローチを最適化して治療効果をさらに増強するとともに潜在的な毒性を制限するため、さらなる研究が必要になろう。しかし特異的免疫機能を操作することのできる「在庫から入手できる」治療剤の可能性は、心不全と他の線維症の莫大な医療負荷に対処するための大規模に実現可能で手頃な手段の将来性を提供する。
本明細書で引用したそれぞれの特許、特許出願、および刊行物の開示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。本発明を具体的な実施形態を参照して開示してきたが、本発明の他の実施形態とバリエーションを他の当業者が本発明の真の精神と範囲を逸脱することなく考案できることは明らかである。添付の請求項は、そのような実施形態と、同等なバリエーションをすべて含むと解釈されることが想定されている。

Claims (23)

  1. ターゲティングドメインにコンジュゲートされた少なくとも１つの送達用担体を含む組成物であって、前記ターゲティングドメインはＴ細胞の細胞表面抗原に特異的に結合し、さらに前記送達用担体が少なくとも１つの薬剤を含む、組成物。
  2. 前記Ｔ細胞の前記細胞表面抗原が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＣＲ７からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. Ｔ細胞の前記細胞表面抗原がｐａｎ－Ｔ抗原である、請求項１の組成物。
  4. 前記ｐａｎ－Ｔ抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
  5. ターゲティングドメインにコンジュゲートされた１つ以上の追加の送達用担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物であって、前記ターゲティングドメインはＴ細胞の細胞表面抗原に特異的に結合し、前記送達用担体が少なくとも１つの薬剤を含む、組成物。
  6. Ｔ細胞ターゲティングドメインにコンジュゲートされた少なくとも２つの送達用担体を含み、それぞれのターゲティングドメインが異なるＴ細胞抗原を標的とする、請求項５に記載の組成物。
  7. Ｔ細胞ターゲティングドメインにコンジュゲートされた第１の送達用担体と、Ｔ細胞ターゲティングドメインにコンジュゲートされた第２の送達用担体とを含む、請求項６に記載の組成物であって、前記第１の送達用担体の前記ターゲティングドメインが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＣＲ７からなる群から選択される抗原を標的とし、前記第２の送達用担体の前記ターゲティングドメインが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１９、ＣＤ１２６、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８３、ＣＤ２２３、ＣＤ２５４、ＣＤ２７５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＦａｓＬ、ＩＬ１８Ｒ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ｌｅｕ－１２、ＴＣＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＣＲ７からなる群から選択される抗原を標的とする、組成物。
  8. 前記第１の送達用担体の前記ターゲティングドメインがＣＤ８を標的とし、かつ前記第１の送達用担体の前記ターゲティングドメインがＣＤ４を標的とする、請求項７に記載の組成物。
  9. Ｔ細胞ターゲティングドメインにコンジュゲートされた少なくとも２つの送達用担体を含み、それぞれの送達用担体が異なる薬剤を含む、請求項５に記載の組成物。
  10. 前記送達用担体が、リポソーム、脂質ナノ粒子、およびミセルからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記送達用担体が脂質ナノ粒子である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記脂質ナノ粒子が、前記ターゲティングドメインにコンジュゲートされたＰＥＧ－脂質を含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記少なくとも１つの薬剤が前記脂質ナノ粒子の中に封入されている、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記少なくとも１つの薬剤が、治療剤、イメージング剤、診断剤、造影剤、標識剤、検出剤、および消毒剤からなる群から選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記少なくとも１つの薬剤が治療剤である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記治療剤が、ヌクレオシドが修飾された核酸分子を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記核酸分子がｍＲＮＡ分子を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記治療剤が、ヌクレオシドが修飾された核酸分子を含み、前記核酸分子が、キメラ抗原受容体をコードする、請求項１４に記載の組成物。
  19. 前記ターゲティングドメインが、核酸分子、ペプチド、抗体、および小分子からなる群から選択される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記ターゲティングドメインが抗体である、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ターゲティングドメインが抗ＣＤ５抗体である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 疾患または障害の治療または予防を必要とする対象においてその疾患または障害を治療または予防する方法であって、前記対象に請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  23. 前記疾患または障害が、がん、感染性疾患、および免疫障害からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
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