CN105368861B - 一种fgfr3突变体的重组表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种FGFR3突变体的重组表达载体，它含有缺失外显子7、8和9的突变体FGFR3Δ7‑9，所述突变体FGFR3Δ7‑9缺失的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。此外，本发明还公开了该FGFR3突变体的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：(1)采用搭桥法扩增FGFR3突变体的DNA片断；(2)扩增产物凝胶电泳后行目的基因切胶回收；(3)PCR产物双酶切；(4)连接目的片段和载体片段。此外，本发明还公开了该FGFR3突变体的重组表达载体的应用。实验显示，该重组表达载体在鉴定FGF1/FGF2和FGFR3及其突变体的亲和力、鉴定FGFR3及其突变体形成二聚体的能力，以及鉴定FLAG‑FGFR3 IIIc、FLAG‑FGFR3 Δ7‑9和FLAG‑FGFR3 AT‑I酪氨酸激酶区的激活中均具有良好的应用价值。

Description

一种FGFR3突变体的重组表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种FGFR3突变体的重组表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

慢性肝脏疾病是危害我国人民健康的重大公共卫生问题之一，在我国导致死亡的主要原因中占第六位，人群中乙型肝炎病毒HBV携带率为9.09％，其中慢性乙型肝炎患者约5000万，肝脏炎症的反复发作导致10％～20％的患者发展为肝硬化，其中10％～15％的肝硬化患者最终发展为肝细胞肝癌。除了肝癌的危害以外，肝炎－肝硬化－肝癌的转化过程中的各个阶段都会对患者的健康和生命造成严重危害，对我国产生了沉重的经济负担和社会问题。目前有关乙型肝炎－肝硬化－肝癌病变机制的研究主要包括乙肝易感因素的研究、疫苗保护效率和失败原因、慢乙肝抗病毒治疗反应的宿主细胞的反应、导致肝纤维化和肝硬化进展的宿主因素、肝癌发生发展的遗传及环境因素等。在临床诊断和治疗方面，我国目前尚缺乏有效、特异、具有指导性意义的分子标识物，以及相应的诊断、治疗及其预后检测手段，尤其在特异性药物的研究方面更是严重地滞后。

申请人于2014年7月23日申请了发明名称为“一种肝癌组织中FGFR3的新型剪接变异体及其应用”，专利申请号：201410353903.8，表明该FGFR3新型变异体能作为肝癌的诊断标志物。但是，目前尚未有FGFR3突变体的重组表达载体及其构建方法和应用的具体报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种FGFR3突变体的重组表达载体。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种FGFR3突变体的重组表达载体的构建方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种FGFR3突变体的重组表达载体的应用。

具体而言，在本发明的第一方面，提供了一种FGFR3突变体的重组表达载体，其特征在于：它含有缺失外显子7、8和9的突变体FGFR3Δ7-9，所述突变体FGFR3Δ7-9缺失的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。FGFR3突变体的序列与野生型FGFR3相比，大部分是一致的，只有7-9这部分序列(如SEQ ID NO.1所示)在突变体中是缺失的，本发明主要也是侧重于这部分缺失的序列(如SEQ ID NO.1所示)。

此外，本发明还提供一种包含上述重组表达载体的转化体。

在本发明的另一方面，提供一种所述FGFR3突变体的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：(1)采用搭桥法扩增FGFR3突变体的DNA片断；(2)扩增产物凝胶电泳后行目的基因切胶回收；(3)PCR产物双酶切；(4)连接目的片段和载体片段。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)具体为：

第一，设计PCR引物：

FGFR3-F 5ˊ-gac GGATCC atgggcgcccctgcctgcgccctc-3ˊ，如SEQ ID NO.2所示；反义链：FGFR3-R 5ˊ-gac ACTAGT tcacgtccgcgagcc cccactgct-3ˊ，如SEQ ID NO.3所示；

F(linker7,8,9):cgtacacgctggacgtgctgg ctgaggaggagctgatggaaa，如SEQ IDNO.4所示；R(linker7,8,9):tttccatcagctcctcctcagccagcacg tccagcgtgtacg，如SEQ IDNO.5所示；

第二，通过配对引物FGFR3-F和R(linker7,8,9)；FGFR3-R和F(linker7,8,9)分别PCR扩增出A,B两个DNA片段；

第三，A和B两个DNA片段通过引物F(linker7,8,9)和R(linker7,8,9)的末端将两个片段拼接起来；拼接好的产物作为PCR扩增的模板，以FGFR3-F和FGFR3-R引物进行扩增。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)的第三步中，拼接体系如下：

KOD buffer,3μl；

A片段，8.5μl；

B片段，17μl；

KOD plus,0.5μl；

加水补足30μl；

反应条件：94℃变性5分钟；55℃退火3分钟，68℃延伸15分钟。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，所述PCR产物双酶切按照如下反应体系：

于37℃水浴锅反应4小时，将全部酶切产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳，从胶上切取目的基因片段，放入EP管称重，进行胶回收。

作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，步骤(3)双酶切获得目的基因和pWPI.1载体连接转化；取一灭菌0.2mL EP管，加入以下反应体系：

作为本发明优选的技术方案，将构建好的所述重组表达载体导入宿主细胞，所述宿主细胞为感受态细菌。

在本发明的另一方面，还提供所述重组表达载体的应用，包括其在鉴定FGF1/FGF2和FGFR3及其突变体的亲和力中的应用，在鉴定FGFR3及其突变体形成二聚体的能力中的应用，以及在鉴定FLAG-FGFR3I IIc、FLAG-FGFR3Δ7-9和FLAG-FGFR3AT-I酪氨酸激酶区的激活中的应用。

本发明说明书的术语解释如下：

“FGFR3突变体”：FGFRs基因存在可变剪切位点,不同剪切体与配体的亲和力不同,有各自的优势结合配体,越来越多的证据显示,FGFRs异常的剪切变异事件在肿瘤中发挥着重要的作用。

“重组质粒与表达载体”：通过相关酶的作用，使目的基因与质粒二者相互结合，从而构成重组质粒。使目的基因能够进入细胞并发挥相关功能的运载体即为表达载体，包括目的基因、启动子、终止子、标记基因四个部分，常用细菌质粒进行构建。

“搭桥法”：即重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)，采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计.重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。

“宿主细胞”：病毒侵入的细胞就叫宿主细胞。病毒一般没有成型的细胞核，一般被蛋白质所包裹在里面的是它的遗传物质，在病毒获得宿主后，利用宿主的蛋白质和其他物质制造自己的身体，然后将遗传物质注入到细胞内部感染细胞。

“亲和力”：生物高分子合配基之间形成中间复合物的能力叫做亲合力(Affinity)。两个分子在多个部位结合强度的总和。免疫学上指多价抗体与抗原间亲和力的总称。

“形成二聚体的能力”：FGFR3和FGFRs结合形成复合物的过程需要有硫酸肝素糖蛋白与细胞膜的结合,既而引起FGFR3二聚体的形成,促使FGFR3胞内酪氨酸激酶酪氨酸残基的自身磷酸化,激活了酪氨酸激酶活性。FGFR3单体形成二聚体时所表现出的结合能力。

“酪氨酸激酶区”：FGFR3主要由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，其中的胞内区是酪氨酸蛋白激酶的催化部位，并具有自磷酸化位点。

本发明的有益效果在于，本发明采用搭桥法扩增FGFR3突变体的DNA片断；通过扩增产物凝胶电泳后行目的基因切胶回收、PCR产物双酶切、连接目的片段和载体片段构建FGFR3突变体的重组表达载体；通过实验显示，该重组表达载体在鉴定FGF1/FGF2和FGFR3及其突变体的亲和力中、鉴定FGFR3及其突变体形成二聚体的能力中，以及鉴定FLAG-FGFR3IIIc、FLAG-FGFR3Δ7-9和FLAG-FGFR3AT-I酪氨酸激酶区的激活中，具有表达效率高、表达稳定、转染效率高等优点，具有良好的应用价值。可用于研究FGFR3突变体在诊断肝癌中的作用。

以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1是本发明实施例1中采用搭桥法构建FGFR3突变体的示意图。

图2是本发明实施例1的pWPI.1-FGFR3-IRES2-EGFP及其突变体重组质粒双酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果。其中，M为Marker。

图3是本发明实施例1中重组质粒序列的分析鉴定示意图。

图4是本发明实施例1中检测FGF1/FGF2和FGFR3及其突变体的亲和力的示意图。

图5是本发明实施例2中FGF1-FGFR3亲和力曲线示意图。

图6是本发明实施例2中FGF1-FGFR3Δ7-9亲和力曲线示意图。

图7是本发明实施例3中非变性胶检测FLAG-FGFR3IIIc、FLAG-FGFR3Δ7-9和FLAG-FGFR3AT-I自身形成二聚体的能力的示意图。

图8是本发明实施例3中SDS-PAGE胶鉴定FLAG-FGFR3IIIc、FLAG-FGFR3Δ7-9酪氨酸激酶区的激活的示意图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，如有未尽之处，可以参考相应的PCR和基因测序的实验手册。

实施例1重组表达载体的构建

一、pWPI.1-FGFR3IIIc-IRES2-EGFP、pWPI.1-FGFR3AT-I-IRES2-EGFP及pWPI.1-FGFR3Δ7-9-IRES2-EGFP载体构建和pcDNA3.0-FLAG-FGFR3，pcDNA3.0-HA-FGFR3，pcDNA3.0-FLAG-FGF1，pcDNA3.0-HA-FGF1，pcDNA3.0-FLAG-FGF2，pcDNA3.0-HA-FGF2载体构建(以上载体均为FGFR3野生型IIIc、FGFR3突变体AT I和突变体Δ7-9-相关载体的构建，以及一些实验中标签蛋白的载体构建)

1、PCR引物设计及目的基因扩增

通过Primer5.0软件设计引物，正义链：FGFR3-F 5ˊ-gac GGATCCatgggcgcccctgcctgcgccctc-3ˊ，如SEQ ID NO.2所示；反义链：FGFR3-R 5ˊ-gac ACTAGTtcacgtccgcgagcccccactgct-3ˊ，如SEQ ID NO.3所示；引物由上海生工生物工程公司合成。正义链5’端酶切位点为：BamHⅠ，反义链5’端酶切位点为：SpeⅠ。KOD plus酶及缓冲液，dNTP均来自生物宝(TOYOBO)。

以含有全长FGFR3编码序列的质粒(购自addgene)作为模板，进行PCR扩增反应，具体反应条件如下：

反应条件为：

(1)94℃3min

(2)94℃30sec

(3)65℃30sec

(4)72℃1min

(5)步骤(2)至(4)重复35个循环

(6)72℃5min

(7)4℃保存

2、对于FGFR3突变体(以敲除exon7,8,9为例，即FGFR3Δ7-9)的构建，采取搭桥法扩增FGFR3突变体的DNA片断，如图1所示。

搭桥所用引物:

F(linker7,8,9):cgtacacgctggacgtgctgg ctgaggaggagctgatggaaa，如SEQ IDNO.4所示；

R(linker7,8,9):tttccatcagctcctcctcagccagcacgtccagcgtgtacg，如SEQ IDNO.5所示；

类似的FGFR3AT-I的搭桥所用引物：

F(DEL8):ccctacgttaccgtgctcaag ccgaggaggagctggtggagg

R(DEL8):cctccaccagctcctcctcggcttgagcacggtaacgtaggg

搭桥法构建敲除FGFR3外显子7,8,9的FGFR3Δ7-9流程描述如下：

1)，通过图1配对引物(FGFR3-F和R(linker7,8,9)；FGFR3-R和F(linker7,8,9))分别PCR扩增出A,B两个DNA片段；

2)，A和B两个DNA片段通过引物F(linker7,8,9)和R(linker7,8,9)的末端(红色标注)将两个片段拼接起来，拼接体系如下：

KOD buffer,3μl；

A片段，8.5μl；

B片段，17μl；

KOD plus,0.5μl；

加水补足30μl；

反应条件：94℃变性5分钟；55℃退火3分钟，68℃延伸15分钟。

拼接好的产物作为PCR扩增的模板，以FGFR3-F和FGFR3-R引物进行扩增，PCR产物后面的处理流程和FGFR3全长一样。

对于搭桥法敲除7,8,9号外显子的具体解释:通过引物F(linker7,8,9)和R(linker7,8,9)，将两段DNA序列拼接起来，因为这两个引物的末端(红色标注)是完全互补的序列。

二、扩增产物凝胶电泳后行目的基因切胶回收

1、扩增产物凝胶电泳

(1)准确称取琼脂糖0.8g。

(2)将琼脂糖溶于60ml 1×TAE溶液，微波炉加热至沸腾，使琼脂糖完全溶解。

(3)上述溶液冷却至60℃时，加入2μl EB，混匀后倒入准备好的凹槽中，插入上样孔梳子，待其自然冷却。

(4)冷却凝固后，拔出梳子，将凹槽置入电泳槽，1×TAE溶液作为电泳缓冲液。每孔加入PCR产物20μl+上样缓冲液1μl，120V电压下电泳30min。

2、目的基因切胶回收

采用胶回收试剂盒(上海生工生物工程公司)，具体步骤如下：

(1)紫外光照射下，干净刀片将PCR产物中目的条带由琼脂糖凝胶中小心切下。

(2)凝胶称重，置入1.5ml EP管中，加入300～600ul Buffer2；

凝胶浓度≤1％每100mg～300ul，

＞1％，≤1.5％每100mg～400ul，

＞1.5％，＜2％每100mg～500ul，

＞2％每100mg～600ul。

(3)50℃水浴5-10min，间或混匀，至凝胶完全溶解。

(4)将吸附柱柱置入2ml的收集管。

(5)将溶解后的凝胶全部移入吸附柱，8000×g离心30s。

(6)弃去离心液体，QIAquick spin柱中加入500ul wash solution，9000×g离心30s。

(7)重复步骤(6)。

(8)弃去离心液体，吸附柱9000×g离心1min。

(9)将吸附柱另置入一个用于收集产物的1.5ml的Ep管。

(10)向吸附柱中央加入15-40μl Elution Buffer，室温静置1-2min，9000×g离心1min，所得即回收的PCR产物。

(11)将PCR产物进行浓度测定。

三、PCR产物双酶切

双酶切实验按照如下反应体系(invitrogen公司提供的酶和buffer)：

于37℃水浴锅反应4小时，将全部酶切产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳，从胶上切取目的基因片段，放入EP管称重，进行胶回收(具体步骤如上所示)。

四、连接目的片段和载体片段

将以上双酶切获得目的基因和pWPI.1载体连接转化。取一灭菌0.2mL EP管，加入以下反应体系：

五、转化实验(转化感受态菌)

5.1从-80℃冰箱中取出200μL感受态细菌悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

5.2将20μL连接产物全部加入，轻轻摇匀，冰上放置30min。

5.3放入42℃水浴锅中热休克90sec，后迅速置于冰上冷却5min。

5.4向管中加入800μL预温的无抗生素的LB液体培养基，轻柔混匀，37℃100rpm振荡培养1h。

5.5将上述菌液4000rpm离心5min后吸去850μL上清，将剩余液体涂板，倒置培养皿于37℃生化培养箱培养12-16h。同时做3个对照，对照组A：用同体积的无菌ddH2O代替连接产物进行转化实验，涂布于不含抗生素的平板上，以确定感受态大肠杆菌是否有问题；对照组B：用同体积的无菌ddH2O代替连接产物进行转化实验，涂布于含抗生素的平板上，以确定含抗生素的平板是否有问题以及大肠杆菌是否污染；对照组C：用同体积双酶切后的载体质粒产物进行转化实验，涂布于含抗生素的平板上，以确定是否酶切彻底。

5.6根据菌落出现的情况，用枪头挑选不超过20个的菌落，分别加入20μL无菌ddH2O中混匀(取2μL进行菌落PCR鉴定，阳性后再取5μL进行摇菌提质粒)。取2μl混合菌液进行菌落PCR鉴定，反应体系及条件如下：

配好反应液体后震荡混匀，简短离心以收集管壁上的液体，放入PCR仪中，

设置如下反应条件：

95℃预变性10min

95℃变性30sec

57℃退火30sec

72℃延伸180sec

72℃终末延伸10min

其中变性、退火和延伸三个步骤循环35次。

六、小量提取质粒DNA

取经菌落PCR鉴定阳性的菌液5μL加入到5mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养12-16h，即可进行质粒的小量提取，将剩余菌液加入甘油至20％浓度，-80℃保存备用。质粒小抽步骤如下：

(1)37℃，250rpm，摇菌12-16h。

(2)无菌条件下吸取3ml菌液，室温，8000g×2min。

(3)吸去菌液，加Buffer P1250ul(预冷)，颠倒混匀6次左右，充分混匀。

(4)加入250ul Buffer P2，立即快速颠倒5-10次，混匀，室温静置2-4min。

(5)加入350ul P3，温和颠倒5-10次混匀。

(6)最大转速5-10min离心，上清移至吸附柱，9000×g离心，30sec，倒掉收集管中液体。

(7)加入500ul去蛋白液Buffer DW1，9000×g离心，30sec，倒掉收集管中液体。

(8)加入500ul去蛋白液Wash solution，9000×g离心，30sec，倒掉收集管中液体。

(9)重复步骤(8)。

(10)空吸附柱和收集管9000×g离心，60sec。

(11)将吸附柱置入用于收集的另一个干净EP管中。

(12)在吸附膜中央加入50-100ul预热至60℃的Elution Buffer，室温静置1-2min。

(13)9000×g离心，60sec，所得产物-20℃保存。

(14)浓度测定。

七、双酶切鉴定及重组质粒的序列分析鉴定

取一灭菌0.2mL EP管，加入以下反应体系：

于37℃水浴锅反应4小时，将全部酶切产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳，结束后于紫外灯上观察电泳条带。重组载体质粒双酶切鉴定结果如图2所示：pWPI.1-FGFR3-IRES2-EGFP及其突变体重组质粒用BamHI及SpeⅠ双酶切后，可见2000-2400bp处的目的条带及11.5kb处的载体条带。图2中所示的电泳鉴定正确的质粒，由上海生工生物工程公司进行测序鉴定，经鉴定，序列完全正确，既获得了全长的野生型FGFR3慢病毒高表达质粒，又得到了同时敲除外显子7,8以及同时敲除外显子7,8,9的慢病毒高表达质粒，如图2所示，将箭头所指的质粒送去上海博尚测序有限公司，经鉴定，序列完全正确，既获得了全长的野生型FGFR3慢病毒高表达质粒，又得到了同时敲除外显子7,8以及同时敲除外显子7,8,9的慢病毒高表达质粒。

八、pcDNA3.0-FLAG-FGFR3IIIc及其突变体，pcDNA3.0-HA-FGFR3IIIc及其突变体，pcDNA3.0-FLAG-FGF1，pcDNA3.0-HA-FGF1，pcDNA3.0-FLAG-FGF2，pcDNA3.0-HA-FGF2等载体的构建。

实验流程跟高表达FGFR3的慢病毒质粒构建的流程一致，除了引物有差异外，无需赘述。构建FLAG-FGFR3，HA-FGFR3的引物:

(1)构建FLAG-FGFR3，HA-FGFR3的引物:

F(FGFR3)：gac GGATCC atgggcgcccctgcctgcgccctc

R(FGFR3)：gac CTCGAG tcacgtccgcgagcccccactgct

(2)构建FLAG-FGF1，HA-FGF1引物

F(FGF1):gac GAATTC TG atggctgaaggggaaatcacc acc

R(FGF1)：gat ctcgag ttaatcagaagagactggcagggg

(3)构建FLAG-FGF2，HA-FGF2引物

F(FGF2)：gac GAATTC TG atg gcc ttgcccgaggatggc

R(FGF2)：gac ctcgag tcagctcttagcagacattgg

九、细胞瞬时转染

(1)以35mm培养皿中的293T细胞的钙染为例：

1)于转染前一天以1.0×10⁵细胞种于35mm培养皿，转染前3小时给细胞换上1ml新鲜培液，之后分别配制溶液A和溶液B：

溶液A：21l 2M CaCl₂+1-2g大抽质粒+142l d₂H₂O

溶液B：167l 2×HEPES(pH 7.05)

2)逐滴混合溶液A到溶液B中，充分混合后静止10分钟后加入到细胞培养液中混匀。37℃培养6-8小时后换上2ml新鲜培养液继续培养。

(2)脂质体转染试剂Lipofectamine 2000法转染

1)293T细胞在无抗生素有条件下培养至生长状态良好。转染前一天铺板：6孔板，10^5/孔。

2)246l无血清培养液稀释4l脂质体，总体积250l，室温下放5min。

3)无血清培养液稀释1.6g质粒，总体积250l。

4)将质粒和脂质体混合成复合物，室温下放20min。

5)细胞用PBS洗1～2遍，换无血清培养液1500l。

6)没孔缓慢加入复合物500l。

7)37℃，5％CO₂细胞培养箱培养4～6h后，换含10％小牛血清的培养液。

8)培养24h后，在荧光显微镜下观察细胞，若可见绿色荧光，则收集细胞并进行后续实验。

附：溶液配方

2×HEPES缓冲液配制：0.8g NaCl，0.027g NaHPO₄·2H₂O，1.2g HEPES，加d₂H₂O90ml溶解，用0.5M NaOH调节pH值至7.05，用d₂H₂O将体积补充为100ml，用0.22m滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。

十、慢病毒包装与细胞感染

a.复苏并扩增293T细胞于10cm培养皿，待细胞长至70％左右进行转染，转染方法参照上述的钙转。

b.转染前3h将细胞培液换为5ml新鲜培液，混合比例为Carrier：delta8.9：VSVG＝10：7.5：2.5，每盘细胞原则上不超过20μg质粒。转染6-8小时后，将培液换成12ml新鲜培液。超离管于115℃灭菌20min后备用。

c.转染60小时后，显微镜荧光观察细胞转染效率，在80％以上则可收集病毒。将含有病毒的细胞培液用0.45μm的滤膜过滤到准备好的超离管，若细胞漂浮的比较多，则先用50ml离心管低速离心(4000rpm)后再过滤，用培液配平后4℃27000rpm超离2h，小心倾倒掉上清之后加入约50-100μl的DMEM或PBS(避免含有血清)，轻轻吹4-6次悬浮病毒之后4℃冰箱溶解过夜。同步种一块12孔板293T细胞用于病毒滴度测试。

d.将溶解好的病毒12000rpm离心2min后取上清按十次方做不同程度稀释，按1μl、0.1μl，0.01μl等加入12孔板中的293T细胞，感染过夜后换液，2天后观察荧光，进而计算病毒滴度。其余的病毒液按20-30μl/管分装，于液氮中速冻后转移至-80℃冰箱中保存。

e.细胞感染：实验前1天接种1×10⁵个细胞于24孔培养板中，加完全培养基400μl，待细胞融合约50-60％时进行病毒感染；-80℃冰箱保存的病毒在冰上融化后，无菌操作，每孔分别加入稀释好的病毒(病毒数目理论上为细胞数目的10倍以上)，混匀后置37℃培养；如慢病毒对细胞有明显毒性作用，在感染8-12小时后，更换新鲜完全培养基(800μl/well)后继续培养；如慢病毒对细胞没有明显毒性作用，4-6小时后可补加入300μl完全培养基继续培养。病毒感染3-4天后倒置荧光显微镜观察细胞内GFP荧光的强度来决定下一步细胞分选的时间。一般感染48小时即可。胰酶消化收集慢病毒感染的肝癌细胞(总量约1×10⁷)，随即上流式细胞仪(BD,FACSAriaⅡ)。设置GFP阳性分选模式，流速10000个细胞/秒，分选下来的细胞加入37℃预热的培液，放入CO2培养箱继续培养并扩增。

实施例2、鉴定FGF1/FGF2和FGFR3及其突变体的亲和力

一、免疫共沉淀反应鉴定FLAG-FGF1、FLAG-FGF2和HA-FGFR3及其突变体的结合能力

1、常规培育共转HA-FGFR3及FLAG-FGF1的293T细胞两天，收获细胞，加入适量的含蛋白酶抑制剂(roche,protease inhibitor tablets)的RIPA裂解缓冲液(millipore)，冰上或者4℃裂解30min,然后12,000g离心30min后取上清；

2、取少量裂解液(一般是总量的5％)作为input，以备Western blot分析，剩余裂解液中加入1-2μg HA probe(santacruz),先在4℃孵育2h后再加入20-40μl protein A/G-beads(santacruz)，4℃缓慢摇晃孵育过夜，这一步反应主要是把HA-FGFR3免疫沉淀出来；

3、免疫沉淀反应后，在4℃以3,000g速度离心5min，将protein A/G-beads(santacruz)离心至管底；将上清小心吸去(注意不能吸掉protein A/G-beads)。proteinA/G-beads用准备蛋白样品时的裂解缓冲液1ml，洗3-4次，洗涤时的离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤；最后一次洗涤后，去除上清，加入15μl的2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟(将蛋白变性并从protein A/G beads中分离下来)，离心后取上清，弃沉淀，得到的上清即可进行后续WB分析或-80度保存；

4、上样至SDS-PAGE胶,进行Western blotting：

A、蛋白样品裂解：培养皿中培养的细胞用PBS洗一遍，然后直接加入适量1×loading buffer，裂解细胞后煮沸15min，离心待用。

B、制胶及电泳检测：配制下层胶(分离胶)及上层胶(浓缩胶)；上样并垂直电泳(上层胶:10mA/Gel，下层胶:20mA/Gel)；转膜(从上到下依次为滤纸、胶、膜、滤纸)；5％脱脂牛奶(溶于PBS)室温封闭1h；一抗室温作用3h或4℃过夜；0.1％Tween20的TBS(TBS-T)洗膜3次，每次20min；加入二抗，室温反应1h，用TBS-T洗膜3次，每次20min；ECL显色。

C、Strip和重新杂交：用d₂H₂O洗去残余显色底物，将膜浸润在strip buffer中，55℃温育30min，TBST洗膜3次，每次10min，重新封闭后杂交和显色。如图4所示，HA-FGFR3，HA-FGFR3AT-I和HA-FGFR3Δ7-9瞬转293T细胞，以全细胞裂解液(WCL)作为input。

提取转染后的293T细胞总蛋白，以HA probe进行免疫共沉淀，收集免疫混合物，SDS-PAGE电泳后转膜，以M2-FLAG单克隆抗体进行Western blot检测互作蛋白。

如图4所示，在293T细胞中共表达HA-FGFR3及其突变体和FLAG-FGF1或共表达HA-FGFR3及其突变体和FLAG-FGF2蛋白，HA-FGFR3及其突变体能够被HA抗体共沉淀，并以M2-FLAG单克隆抗体进行Western blot检测到FLAG-FGF1、FLAG-FGF2和HA-FGFR3及其突变体的相互作用。此结果表明，FLAG-FGF1和HA-FGFR3及其突变体蛋白之间能够发生互作，FLAG-FGF2也和HA-FGFR3及其突变体蛋白之间能够发生互作。由此可知，HA-FGFR3AT-I和HA-FGFR3Δ7-9均能和FLAG-FGF1、FLAG-FGF2结合，且结合能力较HA-FGFR3强，尤其是HA-FGFR3AT-I。

二、用BIAcore系统定量研究FLAG-FGF1和HA-FGFR3及HA-FGFR3Δ7-9的结合能力

1.1实验材料

使用anti-FLAG M2affinity gel(Sigma公司，A2220)纯化获得FLAG-FGF1和FLAG-FGFR3、FLAG-FGFR3Δ7-9，纯化过程完全按照sigma提供的操作手册进行。乙醇胺、盐酸(上海化学试剂厂)；羧甲基葡聚糖(Fluka Chemical Corporation)；N－羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N－乙基－N－二甲基－氨丙基碳二亚胺(EDC)、BIAcore T100系统、CM5传感芯片、氨基偶联试剂盒(BIAcore GE Company)。

1.2溶液配制

流动相缓冲溶液：HBS缓冲液(10mmol/L HEPES，0.15mol/L NaCl，3.4mol/L EDTA，0.05％P-20，pH7.4)。样品稀释溶液：含1mg/mL羧甲基葡聚糖的HBS缓冲液。再生溶液：10mmol/L HCl与1mol/L NaCl的混合溶液。

1.3芯片表面活化及纯化的FLAG-FGFR3及FLAG-FGFR3Δ7-9的偶联固化

按说明书将FLAG-FGFR3及FLAG-FGFR3Δ7-9通过氨基偶联固化在CM5传感芯片上，具体方法如下：采用过滤并除气的HBS缓冲盐溶液作为流动相溶液，将CM5传感器芯片模块嵌入BIAcore系统；设定流过流动池的流速为8μl/min；用0.2mol/L的EDC和0.05mol/L的NHS等体积混合溶液活化CM5表面10min；注射35μl 1mg/mL的FGFR3到活化表面，使之与CM5芯片表面结合；注射50μl乙醇胺使过量的反应基团失活；快速注射10μl 20mmol/L的HCl，然后用Extraclean除去非共价结合型材料。通过在开始注射FGFR3及其突变体前放置第1个基线报道点，并在注射20mmol/L HCl结束后2min放置第2个报道点，来测定FGF1结合FGFR3及其突变体的水平。

1.4检测FLAG-FGF1与FLAG-FGFR3及FLAG-FGFR3Δ7-9的结合

设定结合FLAG-FGFR3或FLAG-FGFR3Δ7-9的流通池为检测通道，未结合FGFR3的流通池为参比通道，HBS缓冲溶液为流动相，流通池的流速为10μl/min。同时将待测物注入FLAG-FGFR3及FLAG-FGFR3Δ7-9流通池和参比流通池，使结合反应在19～23℃、pH7.4的条件下进行。注射10μl FLAG-FGF1(约1μg)，检测；快速注射10μl 20mmol/L的HCl，用Extraclean再生FLAG-FGFR3或FLAG-FGFR3Δ7-9及其突变体表面；再次注射10μl FLAG-FGF1，重复此循环，以测定其结合到FLAG-FGFR3或FLAG-FGFR3Δ7-9表面的重现性。按上述步骤，分别检测FLAG-FGF1与不同浓度级别的FLAG-FGFR3或FLAG-FGFR3Δ7-9的结合，具体如图所示。

1.5收集数据和整理数据

SPR信号以信号图形式从BIAcore T-100仪器传至BIAcore T-100控制软件中，用Biaevaluation分析软件进行数据处理。待测物每个浓度注射到FGFR3及其突变体流通池后得到的图谱减去注射相同浓度的待测物到参比流通池所得到的图谱，进行参比校正。所得到的曲线可用于拟合最恰当地描述反应动力学的动力学模型，并应用于计算K_A和K_D值。由于K_A＝1/K_D，故一般仅显示K_D值。FGF1-FGFR3亲和力曲线如图5所示，FGF1-FGFR3Δ7-9亲和力曲线如图6所示。

表1：FGF1与FGFR3结合反应的数据

表2：FGF1与FGFR3Δ7-9结合反应的数据

从表1可知，FLAG-FGF1与FLAG-FGFR3结合反应饱和浓度的响应值Rmax为68.4，经Biaevaluation分析软件处理数据后，计算得到FLAG-FGF1与FLAG-FGFR3的结合动力学常数K_D为2.9±0.3nM。

从表2可知，FLAG-FGF1与FLAG-FGFR3Δ7-9结合反应饱和浓度的响应值Rmax为482.5，经Biaevaluation分析软件处理数据后，计算得到FLAG-FGF1与FLAG-FGFR3Δ7-9的结合动力学常数K_D为32.4±0.6nM。

研究结果提示FGF1与FGFR3Δ7-9的亲和力较FGF1与FGFR3的亲和力大，与免疫共沉淀反应法定性的鉴定结果相一致。

实施例3鉴定FGFR3及其突变体形成二聚体的能力

一、293T细胞瞬转pcDNA3.0空载、pcDNA3.0-FLAG-FGFR3IIIc、pcDNA3.0-FLAG-FGFR3Δ7-9和pcDNA3.0-FLAG-FGFR3AT-I，分两组，一组不加FGF1，另一组用含有10ng/mlFGF1的培养基常规培养2天。加入适量的含蛋白酶抑制剂(roche,protease inhibitortablets)的RIPA裂解缓冲液(millipore)，冰上或者4℃裂解30min,然后12,000g离心30min后取上清。

二、上样至不加SDS的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)，进行WesternBlotting。

由图7可知，FLAG-FGFR3IIIc在没有FGF1的刺激下，几乎不形成二聚体，而在FGF1的刺激下可以形成二聚体；而不论是否加FGF1刺激，FLAG-FGFR3Δ7-9均可以形成二聚体；不论是否加FGF1刺激，FLAG-FGFR3AT-I均不能形成二聚体。由此可以知道，FGFR3Δ7-9是非配体依赖的组成性激活受体，而FGFR3AT-I由于不能形成二聚体不能被激活。

实施例4、鉴定FLAG-FGFR3IIIc、FLAG-FGFR3Δ7-9和FLAG-FGFR3AT-I酪氨酸激酶区的激活

一、293T细胞瞬转pcDNA3.0空载、pcDNA3.0-FLAG-FGFR3IIIc、pcDNA3.0-FLAG-FGFR3Δ7-9和pcDNA3.0-FLAG-FGFR3AT-I，分两组，一组不加FGF1，另一组用含有10ng/mlFGF1的培养基常规培养2天。加入适量的含蛋白酶抑制剂(roche,protease inhibitortablets)的RIPA裂解缓冲液(millipore)，冰上或者4℃裂解30min,然后12,000g离心30min后取上清。

二、上样至SDS-PAGE胶，进行Western Blotting。

由图8可知，FLAG-FGFR3IIIc在没有FGF1的刺激下，胞内部分的酪氨酸激酶活性区域之间不能自发磷酸化，从而不能激活其酪氨酸激酶活性，而在FGF1的刺激下，可以检测到胞内部分的酪氨酸激酶活性区域之间的自发磷酸化；而不论是否加FGF1刺激，FLAG-FGFR3Δ7-9均可以检测到胞内部分的酪氨酸激酶活性区域之间的自发磷酸化；事实上，由于缺失exon7和8，FGFR3AT-I发生移码突变，缺失了胞内部分的酪氨酸激酶活性区域，因此不论是否加FGF1刺激，FLAG-FGFR3AT-I均不能检测到胞内部分的酪氨酸激酶活性区域之间的自发磷酸化。由此进一步证实，FGFR3Δ7-9是非配体依赖的组成性激活受体，而FGFR3AT-I不能被激活。

Claims (8)

1.一种FGFR3突变体的重组表达载体的构建方法，所述FGFR3突变体的重组表达载体含有缺失外显子7、8和9的突变体FGFR3Δ7-9，所述突变体FGFR3Δ7-9缺失的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用搭桥法扩增FGFR3突变体的DNA片段；(2)扩增产物凝胶电泳后进行目的基因切胶回收；(3)PCR产物双酶切；(4)连接目的片段和载体片段。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)为：

第一，设计PCR引物：

FGFR3-F 5’-gac GGATCC atgggcgcccctgcctgcgccctc-3’，如SEQ ID NO.2所示；反义链：FGFR3-R 5’-gac ACTAGT tcacgtccgcgagcccccactgct-3’，如SEQ ID NO.3所示；

F(linker7，8，9)：cgtacacgctggacgtgctgg ctgaggaggagctgatggaaa，如SEQ ID NO.4所示；R(linker7，8，9)：tttccatcagctcctcctcagccagcacg tccagcgtgtacg，如SEQ ID NO.5所示；

第二，以含有全长FGFR3编码序列的质粒作为模板，通过配对引物FGFR3-F和R(linker7，8，9)；FGFR3-R和F(linker7，8，9)分别PCR扩增出A,B两个DNA片段；

第三，A和B两个DNA片段通过引物F(linker7，8，9)和R(linker7，8，9)的末端将两个片段拼接起来；拼接好的产物作为PCR扩增的模板，以FGFR3-F和FGFR3-R引物进行扩增。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的第三步中，拼接体系如下：

KODbuffer，3μl；

A片段，8.5μl；

B片段，17μl；

KODplus，0.5μl；

加水补足30μl；

反应条件：94℃变性5分钟；55℃退火3分钟，68℃延伸15分钟。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR产物双酶切按照如下反应体系：

于37℃水浴锅反应4小时，将全部酶切产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳，从胶上切取目的基因片段，放入EP管称重，进行胶回收。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，步骤(3)双酶切获得目的基因和pWPI.1载体连接转化；取一灭菌0.2mL EP管，加入以下反应体系：

于16℃连接过夜。

6.一种转化体的制备方法，其特征在于，将构建好的权利要求1所述重组表达载体导入宿主细胞，所述宿主细胞为感受态细菌。

7.如权利要求1所述的重组表达载体在鉴定FGF1/FGF2和FGFR3及其突变体FGFR3Δ7-9的亲和力中的应用。

8.如权利要求1所述的重组表达载体在鉴定FGFR3及其突变体FGFR3Δ7-9形成二聚体的能力中的应用。