ES2558949T3 - Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III - Google Patents

Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III Download PDF

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Abstract

Un compuesto de 15 a 30 bases nitrogenadas de longitud dirigidas a la región no traducida 3' (3' UTR) de una molécula de ácido nucleico que codifica la la apolipoproteína C-III humana, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III humana e inhibe la expresión de la apolipoproteína C-III humana, en el que dicho compuesto es al menos un 90% complementario con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III humana, para su uso en terapia.

Description

DESCRIPCIÓN
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3’ del compuesto antisentido que puede hibridarse específicamente al ácido nucleico diana y que continúa hasta el oligonucleótido que comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). Pueden encontrarse identificados ejemplos de compuestos de una variedad de fuentes de mamífero, incluido el ser humano, en los ejemplos y enumerados en las tablas 1 a 21. Un experto en la técnica equipado con los compuestos
5 antisentido preferentes que se ilustran en el presente documento será capaz, sin una experimentación excesiva, de identificar compuestos antisentido preferentes adicionales.
C. Dianas
10 "Dirigir” un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico diana que codifica la apolipoproteína C-III, en el contexto de la presente invención, puede ser un proceso de varias etapas. El proceso comienza habitualmente con la identificación de un ácido nucleico diana cuya función es ser modulado. Este ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir de un gen) cuya expresión esté asociada con un trastorno
o estado patológico particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente invención, el 15 ácido nucleico diana codifica la apolipoproteína C-III.
El proceso de dirección también incluye habitualmente la determinación de al menos una región, segmento o sitio diana dentro del ácido nucleico diana para una interacción antisentido que tenga lugar de tal modo que dé como resultado el efecto deseado, por ejemplo, la modulación de la expresión. Dentro del contexto de la presente invención,
20 el término “región” se define como una porción de un ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de ácidos nucleicos diana están los segmentos. Los “segmentos” se definen como regiones más pequeñas o subporciones de regiones dentro del ácido nucleico diana. ”Sitios", tal como se usa este término en la presente invención, se definen como posiciones dentro de un ácido nucleico diana.
25 Ya que, tal como se sabe en la técnica, el codón de iniciación de la traducción es típicamente 5’-AUG (en moléculas de ARNm transcrito; 5’-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de iniciación de la traducción también se denomina "codón AUG", el "codón de inicio" o el "codón de inicio AUG". Se ha demostrado que una minoría de genes, que tienen codones de iniciación de la traducción con la secuencia de ARN 5’-GUG, 5’-UUG o 5’-CUG, y 5’-AUA, 5’-ACG y 5’-CUG, operan in vivo. De este modo "codón de iniciación de la traducción" y "codón de inicio"
30 pueden abarcar muchas secuencias de codones, incluso aunque el aminoácido iniciador en cada caso sean típicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se sabe en la técnica que los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, cualquiera de los cuales puede usarse con preferencia para la iniciación de la traducción en un tipo celular o tejido particular, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la presente invención, "codón de inicio" y "codón de iniciación de la traducción" se
35 refiere al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de un ARNm transcrito a partir de un gen que codifica la apolipoproteína C-III, independientemente de la(s) secuencia(s) de dichos codones. También se sabe en la técnica que un codón de terminación de la traducción (o “codón de detención”) de un gen puede tener de una a tres secuencias, es decir, 5’-UAA, 5’-UAG y 5’-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5’-TAA, 5’-TAG y 5’-TGA, respectivamente).
40 Las expresiones “región de codón de inicio” y “región de codón de iniciación de la traducción” se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5’ o 3’) a partir de un codón de iniciación de la traducción. De modo similar, las expresiones “región de codón de detención” y “región de codón de terminación de la traducción” se
45 refieren a una porción de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5’ o 3’) a partir de un codón de terminación de la traducción. En consecuencia, la “región de codón de inicio” (o “región de codón de iniciación de la traducción”) y la "región de codón de detención" (o “región de codón de terminación de la traducción”) son todas las regiones que pueden ser dianas eficaces para los compuestos antisentido que se divulgan en el presente documento.
50 El marco de lectura abierto (ORF) o "región codificante", que se sabe en la técnica que se refiere a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción, también es una región que puede ser una diana eficaz. Dentro del contexto del presente divulgación, una región preferente es la región intragénica que abarca el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF)
55 de un gen.
Otras regiones diana incluyen la región no traducida 5’ (5’UTR), conocida en la técnica por referirse a la porción de un ARNm en la dirección 5’ a partir de un codón de iniciación de la traducción y que, de este modo, incluye nucleótidos entre el sitio de remate 5’ y el codón de iniciación de la traducción de un ARNm (o nucleótidos
60 correspondientes en el gen), y la región no traducida 3’ (3’UTR), conocida en la técnica por referirse a la porción de un ARNm en la dirección 3’ a partir de un codón de iniciación de la traducción y que, de este modo, incluye nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3’ de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). El sitio de remate 5’ de un ARNm comprende un resto de guanosina metilada en N7 unido al resto del extremo 5’ del ARNm por medio de un enlace 5'-5' trifosfato. La región de remate 5’ de un ARNm se considera que
65 incluye la estructura de remate 5’ en sí misma así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio de remate.
imagen5
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Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), técnicas de FISH (hibridación fluorescente in situ) (Going y Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) y procedimientos de espectrometría de masas (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).
5 Los compuestos de la presente invención son útiles para investigación y diagnóstico, debido a que estos compuestos se hibridan con ácidos nucleicos que codifican apolipoproteína C-III. Por ejemplos, los oligonucleótidos que se ha demostrado que se hibridan con la eficacia y en las condiciones que se divulgan en el presente documento como para ser inhibidores eficaces de la apolipoproteína C-III también serán cebadores y sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificación o la detección de genes, respectivamente. Estos cebadores y sondas son útiles en procedimientos que requieren la detección específica de moléculas de ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína C-III y en la amplificación de dichas moléuclas de ácidos nucleicos para la detección o para su uso en estudios posteriores de la apolipoproteína C-III. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas, de la invención con un ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III puede detectarse por medios conocidos en la técnica. Dichos medios pueden incluir la conjugación de una enzima al
15 oligonucleótido, radiomarcado del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También pueden prepararse los kits que usan dichos medios de detección para detectar el nivel de apolipoproteína C-III en una muestra.
También se divulga un procedimiento para preparar un compuesto de la invención que comprende hibridar específicamente in vitro una primera cadena de bases nitrogenadas de al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia establecida en SEQ ID Nº: 4 y/o la SEC ID N.º: 18 a una segunda cadena de bases nitrogenadas que comprende una secuencia lo suficientemente complementaria a dicha primera cadena de tal modo que se permita una hibridación estable.
25 También se divulga en el presente documento un compuesto de la divulgación para su uso en terapia.
También se divulga en el presente documento el uso de un compuesto o composición de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de todas las afecciones divulgadas en el presente documento y de cualquiera de las mismas.
Entre los usos de diagnóstico está la medición de apoliproteína C-III en pacientes para identificar a los que pueden beneficiarse de una estrategia de tratamiento dirigida a reducir los niveles de apolipoproteína C-III. Dichos pacientes adecuados para diagnóstico incluyen pacientes con hipertrigliceridemia (por ejemplo, para tendencias de diagnóstico para enfermedad arterial coronaria), metabolismo de lípidos anormal, obesidad, hiperlipidemia, entre otros
35 trastornos.
La especificidad y sensitividad de antisentido también se usan de un modo controlado por los expertos en la técnica para usos terapéuticos. Los compuestos antisentido se han usado como restos terapéuticos en el tratamiento de estados patológicos en animales, incluidos seres humanos. Los fármacos de oligonucleótidos antisentido, incluidos ribozimas, se han administrado de un modo inocuo y eficaz a seres humanos y actualmente se están llevando a cabo numerosos ensayos clínicos. De este modo, se ha establecido que los compuestos antisentido pueden ser útiles en modalidades terapéuticas que puede configurarse que son útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialemente seres humanos.
45 Para terapia, un animal, preferentemente un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresión de la apolipoproteína C-III se trata administrando compuestos antisentido según la divulgación. Por ejemplo, en una realización no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal con necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la apolipoproteína C-III. Los inhibidores de la apolipoproteína C-III de la presente divulgación inhiben eficazmente la actividad de la proteína apolipoproteína C-III o inhiben la expresión de la proteína apoliproteína C-III. Por ejemplo, un compuesto de este tipo que reduzca los niveles de apolipoproteína C-III es útil para prevenir la morbimortalidad de sujetos con transtornos cardiacos. Por ejemplo, tal como se demuestra en los ejemplos, la reducción de apolipoproteína C-III puede dar como resultado la reducción de los niveles de colesterol, triglicéridos y glucosa en el suero. De este modo, los inhibidores de la apolipoproteína C-III son útiles en el tratamiento de hipertrigliceridemia,
55 metabolismo anormal de lípidos, metabolismo anormal de colesterol, ateroesclerosis, hiperlipidemia, diabetes, incluida diabetes de tipo 2, obesidad, enfermedad cardiovascular, enfermedad arterial coronaria, entre otros trastornos relacionados con un metabolismo anormal o de otro tipo.
En una realización, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 10 %. Preferentemente, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 30 %. Más preferentemente, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 50 %. De este modo, los compuestos oligoméricos modulan la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en al menos el 10 %, en al menos el 20 %, en al menos el 25 %, en al menos el 30 %, en al menos el 40 %, en al menos el 50 %, en al menos el 60 %, en al menos el 70 %, en al menos el 75 %, en al menos
65 el80%,enalmenosel85%,enalmenosel90%,enalmenosel95%,enalmenosel98%,enalmenosel99%
o el 100 %. 11
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Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III humana mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de los tres experimentos en los que se trataron células HepG2 con los oligonucleótidos antisentido. El control positivo para cada dato puntual se identifica en la tabla por el número de secuencia ID. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
Tabla 1 -Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
15
25
35
45
55
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.º SECUENCIA CONTROL SEC ID N.º
167824
5’UTR 4 414 ctggagcagctgcctctagg 79 19 1
167835
Codificante 4 1292 ccctgcatgaagctgagaag 60 20 1
167837
Codificante 18 141 gtgcttcatgtaaccctgca 88 21 1
167846
Codificante 4 1369 tggcctgctgggccacctgg 66 22 1
167848
Codificante 4 3278 tgctccagtagtctttcagg 81 23 1
167851
Codificante 4 3326 tgacctcagggtccaaatcc 41 24 1
304739
5’UTR 4 401 ctctagggatgaactgagca 62 25 1
304740
5’UTR 4 408 cagctgcctctagggatgaa 44 26 1
304741
5’UTR 18 17 ttcctggagcagctgcctct 57 27 1
304742
5’UTR 18 24 acctctgttcctggagcagc 78 28 1
304743
Codón de inicio 18 29 atggcacctctgttcctgga 78 29 1
304744
Codón de inicio 4 1065 gggctgcatcggcacctctgt 73 30 1
304745
Codificante 4 1086 ggcaacaacaaggagtaccc 90 31 1
304746
Codificante 4 1090 ggagggcaacaacaaggagt 80 32 1
304747
Codificante 18 87 agctcgggcagaggccagga 49 33 1
304748
Codificante 18 92 tctgaagctcgggcagaggc 72 34 1
304749
Codificante 18 97 cggcctctgaagctcgggca 11 35 1
304750
Codificante 4 1267 catcctcggcctctgaagct 49 36 1
304751
Codificante 4 1273 gggaggcatcctcggcctct 65 37 1
304752
Codificante 4 1278 gagaagggaggcatcctcgg 82 38 1
304753
Codificante 4 1281 gctqagaagggagqcatcct 75 39 1
304754
Codificante 4 1289 tgcatgaagctgagaaggga 74 40 1
304755
Codificante 18 143 gcgtgcttcatgtaaccctg 95 41 1
304756
Codificante 4 1313 ttggtggcgtgcttcatgta 92 42 1
304757
Codificante 4 1328 gcatccttggcggtcttggt 98 43 1
304758
Codificante 4 1334 ctcagtgcatccttggcggt 97 44 1
304759
Codificante 4 1336 tgctcagtcatccttggcg 93 45 1
304760
Codificante 4 1347 ctcctgcacgctgctcagtg 65 46 1
304761
Codificante 4 1349 gactcctgcacgctgctcag 77 47 1
301762
Codificante 4 1358 gccacctgggactcctgcac 89 48 1
304763
Codificante 18 210 gcccctggcctgctgggcca 71 49 1
5
15
25
35
45
55
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.º SECUENCIA CONTROL SEC ID N.º
304764
Codificante 18 211 agcccctggcctgctgggcc 62 50 1
304765
Codificante 4 3253 gaagccatcggtcacccagc 71 51 1
304766
Codificante 4 3255 ctgaagccatcggtcaccca 85 52 1
304767
Codificante 4 3265 tttcagggaactgaagccat 73 53 1
304768
Codificante 4 3273 cagtagtctttcagggaact 40 54 1
304769
Codificante 4 3283 aacggtgctccagtagtctt 66 55 1
304770
Codificante 4 3287 ccttaacggtgctccagtag 88 56 1
304771
Codificante 4 3295 gaacttgtccttaacggtgc 59 57 1
304772
Codificante 4 3301 ctcagagaacttgtccttaa 88 58 1
304773
Codificante 4 3305 agaactcagagaacttgtcc 75 59 1
304774
Codificante 4 3310 atcccagaactcagagaact 0 60 1
304775
Codificante 4 3320 cagggtccaaatcccagaac 70 61 1
304776
Codificante 4 3332 ttggtctgacctcagggtcc 90 62 1
304777
Codificante 4 3333 gttggtctgacctcagggtc 84 63 1
304778
Codificante 4 3339 gctgaagttggtctgacctc 81 64 1
304779
Codificante 4 3347 cagccacggctgaagttggt 75 65 1
304780
Codón de detención 4 3351 caggcagccacggctgaagt 83 66 1
304781
Codón de detención 4 3361 attgaggtctcaggcagcca 79 67 1
304782
3’UTR 4 3385 tggataggcaggtggacttg 64 68 1
304783
3’UTR 18 369 ctcgcaggatggataggcag 76 69 1
304784
3’UTR 18 374 aggagctcgcaggatggata 58 70 1
304785
3’UTR 18 380 gacccaaggagctcgcagga 73 71 1
304786
3’UTR 18 385 tgcaggacccaaggagctcg 92 72 1
304787
3’UTR 4 3417 tggagattgcaggacccaag 88 73 1
304788
3’UTR 4 3422 agccctggagattgcaggac 69 74 1
304789
3’UTR 4 3425 ggcagccctggagattgcag 76 75 1
304790
3’UTR 4 3445 ccttttaagcaacctacagg 65 76 1
304791
3’UTR 4 3450 ctgtcccttttaagcaacct 53 77 1
304792
3’UTR 4 3456 agaatactgtcccttttaag 72 78 1
304793
3’UTR 4 3461 cactgagaatactgtccctt 67 79 1
304794
3’UTR 4 3469 taggagagcactgagaatac 59 80 1
304795
3’UTR 4 3472 gggtaggagagcactgagaa 74 81 1
304796
3’UTR 4 3509 aggccagcatgcctggaggg 63 82 1
304797
3’UTR 4 3514 ttgggaggccagcatgcctg 55 83 1
304798
3’UTR 4 3521 agctttattgggaggccagc 90 84 1
5
15
25
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.º SECUENCIA CONTROL SEC ID N.º
304799
3’UTR 4 3526 tgtccagctttattgggagg 85 85 1
304800
3’UTR 4 3528 cttgtccagctttattggga 94 86 1
304801
3’UTR 4 3533 agcttcttgtccagctttat 74 87 1
304802
3’UTR 4 3539 catagcagcttcttgtccag 73 88 1
304803
Unión exón:intrón 4 416 acctggagcagctgcctcta 87 89 1
304804
Unión exón:intrón 4 424 agggcattacctggagcagc 68 90 1
304805
Unión exón:intrón 4 1053 acctctgttcctgcaaggaa 74 91 1
304806
Unión exón:intrón 4 1121 aagtgcttacgggcagaggc 78 92 1
304807
Unión exón:intrón 4 1380 gcgggtgtacctggcctgct 52 93 1
304808
Intrón 4 2337 aaccctgttgtgaactgcac 59 94 1
304809
Intrón 4 2405 agtgagcaataccgcctgag 80 95 1
304810
Intrón 4 2542 cgggcttgaattaggtcagg 56 96 1
Tal como se muestra en la tabla 1, las secuencias SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66,
35 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 y 96 mostraron al menos un 45 % de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-III en este ensayo y son, por lo tanto, preferentes. Son más preferentes las secuencias SEC ID Nº 75, 86 y 85. Las regiones diana a las que estas secuencias preferentes son complementarias se denominan en el presente documento “segmentos diana preferentes” y son preferentes, por lo tanto, como diana para los compuestos de la presente divulgación. Los segmentos diana preferentes se muestran en la tabla 3. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferentes que se muestran en la tabla 1. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en un ácido nucleico diana particular al que se une el oligonucleótido. En la tabla 3 se muestran también las especies en las que se han encuentrado cada uno de los segmentos diana preferentes.
45 Ejemplo 16: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
Se desiñó una segunda serie de compuestos antisentido para dirigirla a diferentes regiones del ARN de apolipoproteína C-III de ratón usando secuencias publicadas (número de acceso del GenBank L04150.1, que se incorpora al presente documento como secuencia SEC ID Nº: 11). Los compuestos se muestran en la tabla 2. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en el ácido nucleico diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 2 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil)
55 nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III de ratón mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de los tres experimentos en los que se trataron células hepatocíticas principales con los oligonucleótidos antisentido. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
Tabla 2 -Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
5
15
25
35
45
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
167858
5’UTR 11 1 tagggataaaactgagcagg 47 97
167859
5’UTR 11 21 ctggagtagctagctgcttc 30 98
167860
Codón de inicio 11 41 gctgcatggcacctacgtac 80 99
167861
Codificante 11 62 ccacagtgaggagcgtccgg 86 100
167862
Codificante 11 88 ggcagatgccaggagagcc a 55 101
167863
Codificante 11 104 ctacctcttcagctcgggca 56 102
167864
Codificante 11 121 cagcagcaaggatccctcta 83 103
167865
Codificante 11 131 gcacagagcccagcagcaa g 49 104
167867
Codificante 11 215 ccctggccaccgcagctata 67 105
167868
Codificante 11 239 atctgaagtgattgtccatc 11 106
167869
Codificante 11 254 agtagcctttcaggaatctg 57 107
167870
Codificante 11 274 cttgtcagtaaacttgctcc 89 108
167871
Codificante 11 286 gaagccggtgaacttgtcag 55 109
167872
Codificante 11 294 gaatcccagaagccggtgaa 29 110
167873
Codificante 11 299 ggttagaatcccagaagccg 55 111
167874
Codificante 11 319 tggagttggttggtcctcag 79 112
167875
Codón de detención 11 334 tcacgactcaatagctggag 77 113
167877
3’UTR 11 421 cccttaaagcaaccttcagg 71 114
167878
3’UTR 11 441 agacatgagaacatactttc 81 115
167879
3’UTR 11 471 catgtttaggtgagatctag 87 116
167880
3’UTR 11 496 tcttatccagctttattagg 98 117
Tal como se muestra en la tabla 2, las SEC ID Nº 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111,
112, 113, 114, 115, 116 y 117 mostraron al menos un 45 % de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-III de
ratón en este experimento y son, por lo tanto, preferentes. Son más preferentes las secuencias SEC ID Nº 117, 116 y
100. Las regiones diana a las que estas secuencias preferentes son complementarias se denominan en el presente documento “segmentos diana preferentes” y son preferentes, por lo tanto, como diana para los compuestos de la presente divulgación. Estos segmentos diana preferentes se muestran en la tabla 3. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferentes que se muestran en la tabla 2. Se muestra que estas 55 secuencias contienen timina (T) pero un experto en la técnica apreciará que la timina (T) se reemplaza generalmente por uracilo (U) en secuencias de ARN. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en un ácido nucleico diana particular el que se une el oligonucleótido. En la tabla 3 se muestran también las especies en las que se han encontrado cada uno de los segmentos diana preferentes.
Tabla 3 – Secuencia y posición de segmentos diana preferentes identificados en apolipoproteína C-III.
5
15
25
35
45
55
SITIO ID
SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA ASOCIADO INVERSO DE SEC ID ACTIVO EN SEC ID N.º
82975
4 414 cctagaggcagctgctccag 19 H. sapiens 118
82980
4 1292 cttctcagcttcatgcaggg 20 H. sapiens 119
82981
18 141 tgcagggttacatgaagcac 21 H. sapiens 120
82985
4 1369 ccaggtggcccagcaggcca 22 H. sapiens 121
82987
4 3278 cctgaaagactactggagca 23 H. sapiens 122
220510
4 401 tgctcagttcatccctagag 25 H. sapiens 123
220512
18 17 agaggcagctgctccaggaa 27 H. sapiens 124
220513
18 24 gctgctccaggaacagaggt 28 H. sapiens 125
220514
18 29 tccaggaacagaggtgccat 29 H. sapiens 126
220515
4 1065 acagaggtgccatgcagccc 30 H. sapiens 127
220516
4 1086 gggtactccttgttgttgcc 31 H. sapiens 128
220517
4 1090 actccttgttgttgccctcc 32 H. sapiens 129
220518
18 87 tcctggcctctgcccgagct 33 H. sapiens 130
220519
18 92 gcctctgcccgagcttcaga 34 H. sapiens 131
220521
4 1267 agcttcagaggccgaggatg 36 H. sapiens 132
220522
4 1273 agaggccgaggatgcctccc 37 H. sapiens 133
220523
4 1278 ccgaggatgcctcccttctc 38 H. sapiens 134
220524
4 1281 aggatgcctcccttctcagc 39 H. sapiens 135
220525
4 1289 tcccttctcagcttcatgca 40 H. sapiens 136
220526
18 143 cagggttacatgaagcacgc 41 H. sapiens 137
220527
4 1313 tacatgaagcacgccaccaa 42 H. sapiens 138
220528
4 1328 accaagaccgccaaggatgc 43 H. sapiens 139
220529
4 1334 accgccaaggatgcactgag 44 H. sapiens 140
220530
4 1336 cgccaaggatgcactgagca 45 H. sapiens 141
220531
4 1347 cactgagcagcgtgcaggag 46 H. sapiens 142
220532
4 1349 ctgagcagcgtgcaggagtc 47 H. sapiens 143
220533
4 1358 gtgcaggagtcccaggtggc 48 H. sapiens 144
220534
18 210 tggcccagcaggccaggggc 49 H. sapiens 145
220535
18 211 ggcccagcaggccaggggct 50 H. sapiens 146
220536
4 3253 gctgggtgaccgatggcttc 51 H. sapiens 147
220537
4 3255 tgggtgaccgatggcttcag 52 H. sapiens 148
220538
4 3265 atggcttcagttccctgaaa 53 H. sapiens 149
220540
4 3283 aagactactggagcaccgtt 55 H. sapiens 150
220541
4 3287 ctactggagcaccgttaagg 56 H. sapiens 151
5
15
25
35
45
55
SITIO ID
SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA ASOCIADO INVERSO DE SEC ID ACTIVO EN SEC ID N.º
220542
4 3295 gcaccgttaaggacaagttc 57 H. sapiens 152
220543
4 3301 ttaaggacaagttctctgag 58 H. sapiens 153
220544
4 3305 ggacaagttctctgagttct 59 H. sapiens 154
220546
4 3320 gttctgggatttggaccctg 61 H. sapiens 155
220547
4 3332 ggaccctgaggtcagaccaa 62 H. sapiens 156
220548
4 3333 gaccctgaggtcagaccaac 63 H. sapiens 157
220549
4 3339 gaggtcagaccaacttcagc 64 H. sapiens 158
220550
4 3347 accaacttcagccgtggctg 65 H. sapiens 159
220551
4 3351 acttcagccgtggctgcctg 66 H. sapiens 160
220552
4 3361 tggctgcctgagacctcaat 67 H. sapiens 161
220553
4 3385 caagtccacctgcctatcca 68 H. sapiens 162
220554
18 369 ctgcctatccatcctgcgag 69 H. sapiens 163
220555
18 374 tatccatcctgcgagctcct 70 H. sapiens 164
220556
18 380 tcctgcgagctccttgggtc 71 H. sapiens 165
220557
18 385 cgagctccttgggtcctgca 72 H. sapiens 166
220558
4 3417 cttgggtcctgcaatctcca 73 H. sapiens 167
220559
4 3422 gtcctgcaatctccagggct 74 H. sapiens 168
220560
4 3425 ctgcaatctccagggctgcc 75 H. sapiens 169
220561
4 3445 cctgtaggttgcttaaaagg 76 H. sapiens 170
220562
4 3450 aggttgcttaaaagggacag 77 H. sapiens 171
220563
4 3456 cttaaaagggacagtattct 78 H. sapiens 172
220564
4 3461 aagggacagtattctcagtg 79 H. sapiens 173
220565
4 3469 gtattctcagtgctctccta 80 H. sapiens 174
220566
4 3472 ttctcagtgctctcctaccc 81 H. sapiens 175
220567
4 3509 ccctccaggcatgctggcct 82 H. sapiens 176
220568
4 3514 caqqcatgctggcctcccaa 83 H. sapiens 177
220569
4 3521 gctggcctcccaataaagct 84 H. sapiens 178
220570
4 3526 cctcccaataaagctggaca 85 H. sapiens 179
220571
4 3528 tcccaataaagctggacaag 86 H. sapiens 180
220572
4 3533 ataaagctggacaagaagct 87 H. sapiens 181
220573
4 3539 ctggacaagaagctgctatg 88 H. sapiens 182
220574
4 416 tagaggcagctgctccaggt 89 H. sapiens 183
220575
4 424 gctgctccaggtaatgccct 90 H. sapiens 184
220576
4 1053 ttccttgcaggaacagaggt 91 H. sapiens 185
220577
4 1121 gcctctgcccgtaagcactt 92 H. sapiens 186
220578
4 1380 agcaggccaggtacacccgc 93 H. sapiens 187
5
15
25
35
SITIO ID
SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA ASOCIADO INVERSO DE SEC ID ACTIVO EN SEC ID N.º
220579
4 2337 gtgcagttcacaacagggtt 94 H. sapiens 188
220580
4 2405 ctcaggcggtattqctcact 95 H. sapiens 189
220581
4 2542 cctgacctaattcaagcccg 96 H. sapiens 190
82997
11 1 cctgctcagttttatcccta 97 M. musculus 191
82999
11 41 gtacgtaggtgccatgcagc 99 M. musculus 192
83000
11 62 ccggacgctcctcactgtgg 100 M. musculus 193
83001
11 88 tggctctcctggcatctgcc 101 M. musculus 194
83002
11 104 tgcccgagctgaagaggtag 102 M. musculus 195
83003
11 121 tagagggatccttgctgctg 103 M. musculus 196
83004
11 131 cttgctgctgggctctgtgc 104 M. musculus 197
83006
11 215 tatagctgcggtggccaggg 105 M. musculus 198
83008
11 254 cagattcctgaaaggctact 107 M. musculus 199
83009
11 274 ggagcaagtttactgacaag 108 M. musculus 200
83010
11 286 ctgacaagttcaccggcttc 109 M. musculus 201
83012
11 299 cggcttctgggattctaacc 111 M. musculus 202
83013
11 319 ctgaggaccaaccaactcca 112 M. musculus 203
83014
11 334 ctccagctattgagtcgtga 113 M. musculus 204
83016
11 421 cctgaaggttgctttaaggg 114 M. musculus 205
83017
11 441 gaaagtatgttctcatgtct 115 M. musculus 206
83018
11 471 ctagatctcacctaaacatg 116 M. musculus 207
83019
11 496 cctaataaagctggataaga 117 M. musculus 208
Debido a que se ha encontrado por experimentación que estos “segmentos diana preferentes” están abiertos a, y accesibles a, hibridación con los compuestos antisentido de la presente divulgación, un experto en la técncia reconocerá o será capaz de determinar, usando nada más que experimentación de rutina, otras realizaciones que abarcan otros compuestos que se hibridan específicamente con estos segmentos diana 45 preferentes y, en consecuencia, inhiben la expresión de la apolipoproteína C-III.
De acuerdo con la presente divulgación, los compuestos antisentido incluyen compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), empalmadores alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos cortos que se hibridan con al menos una porción del ácido nucleico diana.
Ejemplo 17: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Compuestos antisentido adicionales
55 Se diseñó una serie adicional de compuestos antisentido para dirigirlos a regiones diferentes de ARN de apolipoproteína C-III humana, usando secuencias publicadas (nucleótidos 6238608 a 6242565 de número de acceso del GenBank NT_035088.1, que representa una secuencia genómica que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 4, y el número de acceso del GenBank NM_000040.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 18). Los compuestos se muestran en la tabla 4. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 4 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las 65 uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de
citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III mediantePCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedios de tres experimentos en los que se trataron células HepG2 con los oligonucleótidos antisentido. Si están presentes, "N.D." indica "sin datos".
Tabla 4 -Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de
fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
10
15
20
25
30
ISIS Nº
SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
167826
4 1063 gctgcatggcacctctgttc 0 209
167828
4 1110 ggcagaggccaggagcgcca 0 210
167830
18 91 ctgaagctcgggcagaggcc 9 211
167832
18 101 tcctcggcctctgaagctcg 0 212
167840
4 1315 tcttggtggcgtgcttcatg 0 213
167842
4 1335 gctcagtgcatccttggcgg 38 214
167844
4 1345 cctgcacgctgctcagtgca 28 215
167847
4 3256 actgaagccatcggtcaccc 0 216
167850
4 3306 cagaactcagagaacttgtc 0 217
167852
4 3336 gaagttggtctgacctcagg 0 218
167853
4 3420 ccctggagattgcaggaccc 0 219
167854
4 3426 gggcagccctggagattgca 22 220
167855
4 3446 cccttttaagcaacctacag 27 221

Ejemplo 18: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Estudio de respuesta a la dosis en células HepG2
35
40 Un subconjunto de los oligonucleótidos antisentido de los ejemplos 15 y 17 se analizó adicionalmente en un estudio de respuesta a la dosis. Las dosis de tratamiento de ISIS 167842 (SEC ID Nº: 214), ISIS 167844 (SEC ID Nº: 215), ISIS 167846 (SEC ID Nº: 22), ISIS 167837 (SEC ID Nº: 21), ISIS 304789 (SEC ID Nº: 75), ISIS 304799 (SEC ID Nº: 85) e ISIS 304800 (SEC ID Nº: 86) fueron 50, 150 y 300 nM. Los compuestos se analizaron para determinar su 45 efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III en células HepG2 mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de dos experimentos y se muestran en la tabla 5.
50
55
60
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Estos resultados indican que tanto en ratones alimentados con una dieta rica en grasas como en ratones
magros, los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra apolipoproteína C-III son capaces de disminuir los niveles de
ARNm de apolipoproteína C-III in vivo en una medida similar. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
Tabla 7 -Efectos del tratamiento con ISIS 167880 o 167879 sobre el colesterol, los triglicéridos, la glucosa, la enzima hepática y el ARNm de apolipoproteína C-III en hígado en ratones C57BL/6 magros y alimentados con una dieta rica en grasas
15
25
35
Unidades medidas del marcador biológico
ISIS Nº Dieta, duración del experimento
Rica en grasas, 6 semanas
Magra, 2 semanas
Colesterol mg/dl
control 196 91
167880
137 91
167879
N.D. 116
Triglicéridos mg/dl
control 151 91
167880
58 59
167879
N.D. 65
Glucosa mg/dl
control 213 204
167880
183 203
167879
N.D. 216
Enzimas hepáticas
AST UI/l control 92 51
167880
157 58
167879
N.D. 51
ALT UI/l
control 40 26
167880
64 27
167879
N.D. 21
ARNm de polipoproteína C-III % de control
167880 8 % 21 %
167879
N.D. 27 %
45 En resumen, estos resultados indican que en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, ISIS 167880 es capaz de reducir la glucosa, el colesterol y los triglicéridos en suero a niveles comparables a miembros de la misma camada magros, mientras que no tiene efectos perjudiciales sobre los animales magros. Además, los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra apolipoproteína C-III son capaces de disminuir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo en una medida similar en ratones alimentados con una dieta rica en grasas y ratones magros. Estos resultados sugieren un efecto de toxicidad en hígado secundario para ISIS 167880 en ratones alimentados con una dieta rica en grasas pero ninguna toxicidad para ISIS 167880 o 167879 en ratones alimentados con una dieta de roedor normal.
Ejemplo 25: Inhibición antisentido de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo
55 Se usaron ratones C57BL/6, una cepa de la que se ha informado que es susceptible a la formación inducida por hiperlipidemia de placas ateroescleróticas, en los estudios siguientes para evaluar oligonucleótidos antisentido de apolipoproteína C-III como agentes potenciales para reducir los niveles de colesterol y triglicéridos. En consecuencia, en una realización adicional, los ratonesC57BL/6 con una dieta rica en grasas se trataron con oligonucleótidos dirigidos a apolipoproteína C-III.
Se analizaron ratones C57BL/6 machos (n=8; 7 a 8 semanas que edad) que recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) para evaluar la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hígado 6 semanas después del trtamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III. Los ratones recibieron dos veces a la semana inyecciones intraperitoneales a una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), ISIS
65 167875 (SEC ID Nº: 113), ISIS 167878 (SEC ID Nº: 115) o ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116). Los animales control
recibieron tratamiento de solución salina dos veces a la semana durante un periodo de 6 semanas.
Al terminar el estudio, cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron para determinar la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en el hígado. El ARN se
5 aisló del hígado y el ARNm se cuantificó tal como se describe en el presente documento. Se hizo la media de los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de cada grupo de tratamiento (n=8). Con relación a los animales tratados con solución salina, el tratamiento con ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880 dieron como resultado una reducción del 24 %, 56 %, 50 % y 77 % de los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III, respectivamente, lo que demuestra que estos compuestos reducen significativamente la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en el hígado.
Ejemplo 26: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en colesterol, triglicéridos, glucosa en
suero y transaminasas en suero
15 En una realización posterior, los ratones tratados con solución salina o una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), ISIS 167875 (SEC ID Nº: 113), ISIS 167878 (SEC ID Nº: 115) o ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116) tal como se describe en el ejemplo 25 se analizaron para determinar los niveles de colesterol y triglicéridos en suero después de 6 semanas de tratamiento.
Al finalizar el estudio, cuarenta y ocho horas después de la dosis de solución salina o compuestos antisentido, los animales se sacrificaron y se analizaron para determinar los niveles de colesterol, triglicéridos y glucosa en suero mediante análisis rutinarios usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Las transaminasas ALT y AST en suero, aumentos en los que pueden indicar hepatotoxicidad, también se midieron usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Los
25 niveles de colesterol, triglecéridos y glucosa en suero se presentan en la tabla 8 como resultado promedio de cada grupo de tratamiento (n=8) en mg/dl. ALT y AST, que también se muestran en la tabla 8, también se muestran como resultado promedio para cada grupo de tratamiento (n=8), en unidades internaciones/l (UI/l).
Tabla 8 -Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en colesterol, triglicéridos, glucosa y transaminasas en suero
35
45
55
Tratamiento
Marcador en suero
Solución Salina ISIS 167875 ISIS 167878 ISIS 167879 ISIS 167880
Colesterol total mg/dl
172 197 180 132 155
Colesterol HDL mg/dl
149 162 157 117 137
Colesterol LDL mg/dl
25 37 28 24 21
Triglicéridos en suero mg/dl
126 99 75 60 52
ALT UI/l
24 555 32 45 66
AST UI/l
56 489 76 117 132
Glucosa mg/dl
273 234 251 189 255
Se observó una reducción significativa de los niveles de triglicéridos en suero después del tratamiento con ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880, que redujeron los niveles de triglicéridos el 22 %, 40 %, 52 % y 58 %, respectivamente. Esta reducción de triglicéridos en suero se correlaciona con la reducción de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hígado. Además, las reducciones de triglicéridos en diana y en suero siguiendo al tratamiento con ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880 no fueron acompañadas por hepatotoxicidad, tal como indica la falta de aumentos significativos en los niveles de ALT y AST. Los niveles de glucosa se redujeron significativamente siguiendo el tratamiento con ISIS 167879.
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5
15
25
35
45
55

Tabla 11 -Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
340982
Codificante 225 213 TGAACTTATCAGTGAACTTG 0 233
340987
Codificante 225 238 TCAGGGCCAGACTCCCAGAG 7 234
340988
Codificante 225 258 TTGGTGTTGTTAGTTGGTCC 0 235
340991
Codificante 225 258 TTGGTGTTGTTAGTTGGTCC 0 236
353932
Codificante 225 10 AGAGCCACGAGGGCCACGA T 0 237
353933
Codificante 225 20 AGAGGCCAGGAGAGCCACG A 15 238
353934
Codificante 225 30 CAGCTCGGGCAGAGGCCAG G 2 239
353935
Codificante 225 40 TCTCCCTCATCAGCTCGGGC 0 240
353936
Codificante 225 59 GCCCAGCAGCAAGGATCCCT 73 241
353937
Codificante 225 69 CCTGCATAGAGCCCAGCAGC 0 242
353938
Codificante 225 79 TCCATGTAGCCCTGCATAGA 90 243
353940
Codificante 225 99 GGACCGTCTTGGAGGCTTGT 76 244
353941
Codificante 225 109 AGTGCATCCTGGACCGTCTT 61 245
353942
Codificante 225 119 CATGCTGCTTAGTGCATCCT 0 246
353943
Codificante 225 129 CAGACTCCTGCATGCTGCTT 57 247
353944
Codificante 225 139 ACAGCTATATCAGACTCCTG 0 248
353945
Codificante 225 148 CTGGCCACCACAGCTATATC 0 249
353946
Codificante 225 169 AAGCGATTGTCCATCCAGCC 0 250
353949
Codificante 225 195 TGCTCCAGTAGCCTTTCAGG 0 251
353950
Codificante 225 200 GAACTTGCTCCAGTAGCCTT 35 252
353951
Codificante 225 204 CAGTGAACTTGCTCCAGTAG 0 253
353952
Codificante 225 209 CTTATCAGTGAACTTGCTCC 0 254
353953
Codificante 225 217 CCAGTGAACTTATCAGTGAA 0 255
353954
Codificante 225 221 GAGGCCAGTGAACTTATCAG 0 256
353955
Codificante 225 224 CCAGAGGCCAGTGAACTTAT 31 257
353956
Codificante 225 229 GACTCCCAGAGGCCAGTGAA 0 258
353957
Codificante 225 234 GGCCAGACTCCCAGAGGCC A 0 259
353958
Codificante 225 247 AGTTGGTCCTCAGGGCCAGA 0 260
353959
Codificante 225 250 GTTAGTTGGTCCTCAGGGCC 0 261
353960
Codificante 225 254 TGTTGTTAGTTGGTCCTCAG 0 262
353961
Codificante 225 262 AGAGTTGGTGTTGTTAGTTG 0 263
5
15
25
35
45
55
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
353962
Codificante 225 267 GCTCAAGAGTTGGTGTTGTT 0 264
353963
Codificante 225 271 CACGGCTCAAGAGTTGGTGT 0 265
353964
Codón de detención 225 275 GTCTCACGGCTCAAGAGTTG 0 266
353966
Codón de detención 225 285 GAACATGGAGGTCTCACGGC 55 267
353967
Codón de detención 225 289 TCTGGAACATGGAGGTCTCA 0 268
353968
3’UTR 225 293 CACATCTGGAACATGGAGGT 0 269
353969
3’UTR 225 297 CAGACACATCTGGAACATGG 0 270
353970
3’UTR 225 301 TGGCCAGACACATCTGGAAC 49 271
353972
3’UTR 225 309 AGGATAGATGGCCAGACACA 47 272
353973
3’UTR 225 313 CAGCAGGATAGATGGCCAGA 0 273
353974
3’UTR 225 317 GAGGCAGCAGGATAGATGG C 38 274
353975
3’UTR 225 321 TTCGGAGGCAGCAGGATAGA 0 275
353976
3’UTR 225 325 AACCTTCGGAGGCAGCAGGA 19 276
353977
3’UTR 225 329 GAGCAACCTTCGGAGGCAGC 88 277
353978
3’ UTR 225 333 CTTAGAGCAACCTTCGGAGG 77 278
353979
3’UTR 225 337 TCCCCTTAGAGCAACCTTCG 0 279
353980
3’UTR 225 341 ACTTTCCCCTTAGAGCAACC 45 280
353981
3’UTR 225 345 ATATACTTTCCCCTTAGAGC 28 281
353982
3’UTR 225 349 GAGAATATACTTTCCCCTTA 96 282
353983
3’UTR 225 353 GCATGAGAATATACTTTCCC 69 283
353984
3’UTR 225 357 AAAGGCATGAGAATATACTT 47 284
353985
3’UTR 225 361 GGATAAAGGCATGAGAATAT 0 285
353986
3’UTR 225 365 GGAGGGATAAAGGCATGAGA 0 286
353987
3’UTR 225 386 GCATGTTTAGGTGAGGTCTG 100 287
353988
3’UTR 225 390 GACAGCATGTTTAGGTGAGG 0 288
353990
3’UTR 225 398 TTATTTGGGACAGCATGTTT 0 289
353991
3’UTR 225 402 GCTTTTATTTGGGACAGCAT 0 290
353992
3’UTR 225 407 TCCCAGCTTTTATTTGGGAC 22 291
Se diseñó una serie adicional de compuestos antisentido para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de rata usando secuencias descritas en el presente documento (SEC ID Nº: 225 y la secuencia con el número de acceso del Genbank NM_ 012501.1, incorporada al presente documento como SEC ID Nº: 226). Los compuestos se muestran en la tabla 12. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 12 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las 65 uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. 46
5
15
25
35
45
55

Tabla 12 -Oligonucleótidos de fosforoditioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi, dirigidos a apolipoproteína C-III de rata
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
340937
Codificante 226 8 CACGATGAGGAGCATTCGGG 292
340938
Codificante 226 13 AGGGCCACGATGAGGAGCAT 293
340939
Codificante 225 6 CCACGAGGGCCACGATGAGG 294
340940
Codificante 225 11 GAGAGCCACGAGGGCCACGA 295
340941
Codificante 225 16 GCCAGGAGAGCCACGAGGGC 296
340942
Codificante 225 21 CAGAGGCCAGGAGAGCCACG 297
340943
Codificante 225 26 TCGGGCAGAGGCCAGGAGAG 298
340944
Codificante 225 31 TCAGCTCGGGCAGAGGCCAG 299
340945
Codificante 225 36 CCTCATCAGCTCGGGCAGAG 300
340946
Codificante 225 41 CTCTCCCTCATCAGCTCGGG 301
340947
Codificante 225 46 GATCCCTCTCCCTCATCAGC 302
340948
Codificante 225 51 GCAAGGATCCCTCTCCCTCA 303
340949
Codificante 225 56 CAGCAGCAAGGATCCCTCTC 304
340950
Codificante 225 61 GAGCCCAGCAGCAAGGATCC 305
340951
Codificante 225 66 GCATAGAGCCCAGCAGCAAG 306
340952
Codificante 225 71 GCCCTGCATAGAGCCCAGCA 307
340953
Codificante 225 76 ATGTAGCCCTGCATAGAGCC 308
340954
Codificante 225 81 GTTCCATGTAGCCCTGCATA 309
340955
Codificante 225 86 GGCTTGTTCCATGTAGCCCT 310
340956
Codificante 225 91 TTGGAGGCTTGTTCCATGTA 311
340957
Codificante 225 96 CCGTCTTGGAGGCTTGTTCC 312
340958
Codificante 225 101 CTGGACCGTCTTGGAGGCTT 313
340959
Codificante 225 106 GCATCCTGGACCGTCTTGGA 314
340960
Codificante 225 111 TTAGTGCATCCTGGACCGTC 315
340961
Codificante 225 116 GCTGCTTAGTGCATCCTGGA 316
340962
Codificante 225 121 TGCATGCTGCTTAGTGCATC 317
340963
Codificante 225 126 ACTCCTGCATGCTGCTTAGT 318
340964
Codificante 225 131 ATCAGACTCCTGCATGCTGC 319
340965
Codificante 225 136 GCTATATCAGACTCCTGCAT 320
340966
Codificante 225 141 CCACAGCTATATCAGACTCC 321
340967
Codificante 225 146 GGCCACCACAGCTATATCAG 322
340968
Codificante 226 163 CTGCTGGCCACCACAGCTAT 323
340969
Codificante 226 168 AGCCCCTGCTGGCCACCACA 324
340970
Codificante 226 173 CATCCAGCCCCTGCTGGCCA 325
5
15
25
35
45
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
340971
Codificante 226 178 TTGTCCATCCAGCCCCTGCT 326
340972
Codificante 226 179 ATTGTCCATCCAGCCCCTGC 327
340973
Codificante 225 168 AGCGATTGTCCATCCAGCCC 328
340974
Codificante 225 173 TTTGAAGCGATTGTCCATCC 329
340975
Codificante 225 178 AGGGATTTGAAGCGATTGTC 330
340976
Codificante 225 183 CTTTCAGGGATTTGAAGCGA 331
340977
Codificante 225 188 GTAGCCTTTCAGGGATTTGA 332
340978
Codificante 225 193 CTCCAGTAGCCTTTCAGGGA 333
340979
Codificante 225 198 ACTTGCTCCAGTAGCCTTTC 334
34980
Codificante 225 203 AGTGAACTTGCTCCAGTAGC 335
340981
Codificante 225 208 TTATCAGTGAACTTGCTCCA 336
34983
Codificante 225 218 GCCAGTGAACTTATCAGTGA 337
340984
Codificante 225 223 CAGAGGCCAGTGAACTTATC 338
340985
Codificante 225 228 ACTCCCAGAGGCCAGTGAAC 339
340986
Codificante 225 233 GCCAGACTCCCAGAGGCCAG 340
340989
Codificante 225 248 TAGTTGGTCCTCAGGGCCAG 341
340990
Codificante 225 253 GTTGTTAGTTGGTCCTCAGG 342
340992
Codificante 225 263 AAGAGTTGGTGTTGTTAGTT 343
340993
Codificante 225 268 GGCTCAAGAGTTGGTGTTGT 344
340994
Codón de detención 225 272 TCACGGCTCAAGAGTTGGTG 345
353939
Codificante 225 89 GGAGGCTTGTTCCATGTAGC 346
353947
Codificante 225 180 TCAGGGATTTGAAGCGATTG 347
353948
Codificante 225 190 CAGTAGCCTTTCAGGGATTT 348
353965
Codón de detención 225 281 ATGGAGGTCTCACGGCTCAA 349
353971
3’ UTR 225 305 TAGATGGCCAGACACATCTG 350
353989
3’ UTR 225 394 TTGGGACAGCATGTTTAGGT 351

Ejemplo 33: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Estudio de respuesta a la dosis en hepatocitos de rata primarios
55 Se seleccionaron cuatro oligonucleótidos para los estudios de respuesta a la dosis adicionales. Los hepatocitos de rata primarios se trataron con 10, 50, 150 y 300 nM de ISIS 167878 (SEC ID Nº: 115), ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), ISIS 340982 (SEC ID Nº: 233), o el control oligo mezclado ISIS 113529 (SEC ID Nº: 222) y se midieron los niveles de ARNm 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al que se normalizaron los datos.
Los resultados de estos estudios se muestran en la tabla 13. Los datos se promediaron a partir de tres experimentos y se expresaron como porcentaje de inhibición con relación a los controles no tratados. Si está presente, "N.D." indica "sin datos". 65
imagen31
imagen32
imagen33
fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador.
Para GAPDH de hámster, los cebadores PCR fueron:
5 cebador directo: CCAGCCTCGCTCCGG (SEC ID Nº: 356) cebador inverso: CCAATACGGCCAAATCCG (SEC ID Nº: 357) y la sonda PCR fue JOE-ACGCAATGGTGAAGGTCGGCG-TAMRA (SEC ID Nº: 358) en la que JOE es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador.
10 Los datos son de un experimento en el que se trataron hepatocitos de hámster primarios con una concentración 150 nM de los oligonucleótidos. Los datos, mostrados en la tabla 18, están normalizados para células control no tratadas. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
15
fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Tabla 18 -Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster mediante oligonucleótidos de
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
352929
Codificante 352 5 TGCCAAGAGGGCAACAATAG 17 359
352930
Codificante 352 10 AGGAGTGCCAAGAGGGCAAC 62 360
352931
Codificante 352 16 GATGCCAGGAGTGCCAAGAG 50 361
352932
Codificante 352 20 GGCAGATGCCAGGAGTGCCA 51 362
352933
Codificante 352 39 CTCTACCTCATTAGCTTCGG 0 363
352934
Codificante 352 41 CCCTCTACCTCATTAGCTTC 47 364
352935
Codificante 352 44 GACCCCTCTACCTCATTAGC 0 365
352936
Codificante 352 49 GCAAGGACCCCTCTACCTCA 15 366
352937
Codificante 352 54 CAGCAGCAAGGACCCCTCTA 45 367
352938
Codificante 352 59 GAGCCCAGCAGCAAGGACCC 0 368
352939
Codificante 352 65 TGCACAGAGCCCAGCAGCAA 84 369
352940
Codificante 352 70 AGCCCTGCACAGAGCCCAGC 0 370
352941
Codificante 352 75 CATGTAGCCCTGCACAGAGC 0 371
352942
Codificante 352 80 TGTTCCATGTAGCCCTGCAC 49 372
352943
Codificante 352 85 TGGCCTGTTCCATGTAGCCC 55 373
352945
Codificante 352 95 ACCTTCTTGGTGGCCTGTTC 62 374
352946
Codificante 352 106 GCGCATCCTGGACCTTCTTG 0 375
352948
Codificante 352 115 TGCTGGTTAGCGCATCCTGG 0 376
352949
Codificante 352 120 TTGCATGCTGGTTAGCGCAT 3 377
352950
Codificante 352 125 GACTTTTGCATGCTGGTTAG 59 378
352951
Codificante 352 130 CCTCAGACTTTTGCATGCTG 72 379
352952
Codificante 352 135 AGCCACCTCAGACTTTTGCA 75 380
352953
Codificante 352 140 CGCACAGCCACCTCAGACTT 64 381
352955
Codificante 352 153 CCAGTCCCTGGCCCGCACAG 66 382
352956
Codificante 352 159 GTCCATCCAGTCCCTGGCCC 73 383
352957
Codificante 352 161 CCGTCCATCCAGTCCCTGGC 0 384
352958
Codificante 352 165 GCCACCGTCCATCCAGTCCC 0 385
5
15
25
35
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
352959
Codificante 352 170 GTGAAGCCACCGTCCATCCA 12 386
352960
Codificante 352 174 GGAGGTGAAGCCACCGTCCA 0 387
352961
Codificante 352 193 TGCTCCAGTAGCTTTTCAGG 59 388
352962
Codificante 352 200 GTAAATGTGCTCCAGTAGCT 66 389
352963
Codificante 352 205 TGTCAGTAAATGTGCTCCAG 78 390
352965
Codificante 352 214 TGGAGACCGTGTCAGTAAAT 38 391
352966
Codificante 352 217 GGCTGGAGACCGTGTCAGTA 66 392
352967
Codificante 352 221 CAGAGGCTGGAGACCGTGTC 13 393
352968
Codificante 352 225 ATCCCAGAGGCTGGAGACCG 0 394
352969
Codificante 352 230 GAAGAATCCCAGAGGCTGGA 54 395
352970
Codificante 352 269 TCTCAAGGCTCAGTAGCTGG 0 396
352971
Codificante 352 275 TAGAGGTCTCAAGGCTCAGT 70 397
352972
Codón de detención 352 280 GAACGTAGAGGTCTCAAGGC 61 398
352973
Codón de detención 352 286 CATTTGGAACGTAGAGGTCT 64 399
352974
3’ UTR 352 292 CAAGCACATTTGGAACGTAG 0 400
352975
3’ UTR 352 300 TGGACACACAAGCACATTTG 0 401
352976
3’ UTR 352 305 CAGGATGGACACACAAGCAC 43 402
352977
3’ UTR 352 311 GGCCAGCAGGATGGACACAC 81 403
352978
3’ UTR 352 318 GCCCAGAGGCCAGCAGGATG 60 404
352979
3’ UTR 352 348 CCTTTCAAACAACCTTCAGG 56 405
352980
3’ UTR 352 402 GGACAGCATGTTTAGGTGAC 67 406
Se diseñó una serie adicional de oligonucleótidos para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de hámster usando secuencias descritas en el presente documento (SEC ID Nº: 352). Los oligonucleótidos se muestran en la tabla 19. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular 45 al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 19 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
55
5
15
25
35
45
55

Tabla 19 -Oligonucleótidos de fosforoditioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi dirigidos a ARNm de apolipoproteína C-III de hámster
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
352944
Codificante 352 90 CTTGGTGGCCTGTTCCATGT 407
352947
Codificante 352 110 GTTAGCGCATCCTGGACCTT 408
352954
Codificante 352 145 TGGCCCGCACAGCCACCTCA 409
352964
Codificante 352 210 GACCGTGTCAGTAAATGTGC 410
356295
Codificante 352 1 AAGAGGGCAACAATAGGAGT 411
356296
Codificante 352 6 GTGCCAAGAGGGCAACAATA 412
356297
Codificante 352 15 ATGCCAGGAGTGCCAAGAGG 413
356298
Codificante 352 25 CTTCGGGCAGATGCCAGGAG 414
356299
Codificante 352 31 CATTAGCTTCGGGCAGATGC 415
356300
Codificante 352 60 AGAGCCCAGCAGCAAGGACC 416
356301
Codificante 352 86 GTGGCCTGTTCCATGTAGCC 417
356302
Codificante 352 91 TCTTGGTGGCCTGTTCCATG 418
356303
Codificante 352 96 GACCTTCTTGGTGGCCTGTT 419
356304
Codificante 352 101 TCCTGGACCTTCTTGGTGGC 420
356305
Codificante 352 111 GGTTAGCGCATCCTGGACCT 421
356306
Codificante 352 116 ATGCTGGTTAGCGCATCCTG 422
356307
Codificante 352 121 TTTGCATGCTGGTTAGCGCA 423
356308
Codificante 352 126 AGACTTTTGCATGCTGGTTA 424
356309
Codificante 352 131 ACCTCAGACTTTTGCATGCT 425
356310
Codificante 352 136 CAGCCACCTCAGACTTTTGC 426
356311
Codificante 352 141 CCGCACAGCCACCTCAGACT 427
356312
Codificante 352 146 CTGGCCCGCACAGCCACCTC 428
356313
Codificante 352 151 AGTCCCTGGCCCGCACAGCC 429
356314
Codificante 352 156 CATCCAGTCCCTGGCCCGCA 430
356315
Codificante 352 166 AGCCACCGTCCATCCAGTCC 431
356316
Codificante 352 171 GGTGAAGCCACCGTCCATCC 432
356317
Codificante 352 176 AGGGAGGTGAAGCCACCGTC 433
356318
Codificante 352 181 TTTTCAGGGAGGTGAAGCCA 434
356319
Codificante 352 187 AGTAGCTTTTCAGGGAGGTG 435
356320
Codificante 352 198 AAATGTGCTCCAGTAGCTTT 436
356321
Codificante 352 203 TCAGTAAATGTGCTCCAGTA 437
356322
Codificante 352 208 CCGTGTCAGTAAATGTGCTC 438
356323
Codificante 352 213 GGAGACCGTGTCAGTAAATG 439
356324
Codificante 352 218 AGGCTGGAGACCGTGTCAGT 440
5
15
25
35
45
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
356325
Codificante 352 223 CCCAGAGGCTGGAGACCGTG 441
356326
Codificante 352 228 AGAATCCCAGAGGCTGGAGA 442
356327
Codón de detención 352 274 AGAGGTCTCAAGGCTCAGTA 443
356328
Codón de detención 352 279 AACGTAGAGGTCTCAAGGCT 444
356329
Codón de detención 352 284 TTTGGAACGTAGAGGTCTCA 445
356330
3’ UTR 352 289 GCACATTTGGAACGTAGAGG 446
356331
3’ UTR 352 294 CACAAGCACATTTGGAACGT 447
356332
3’ UTR 352 299 GGACACACAAGCACATTTGG 448
356333
3’ UTR 352 304 AGGATGGACACACAAGCACA 449
356334
3’ UTR 352 309 CCAGCAGGATGGACACACAA 450
356335
3’ UTR 352 314 AGAGGCCAGCAGGATGGACA 451
356336
3’ UTR 352 319 GGCCCAGAGGCCAGCAGGAT 452
356337
3’ UTR 352 324 ACCCAGGCCCAGAGGCCAGC 453
356338
3’ UTR 352 329 GGGCCACCCAGGCCCAGAGG 454
356339
3’ UTR 352 353 CTTTCCCTTTCAAACAACCT 455
356340
3’ UTR 352 358 CAATARTTTCCCTTTCAAAC 456
356341
3’ UTR 352 363 CATGACAATACTTTCCCTTT 457
356342
3’ UTR 352 368 GAAAACATGACAATACTTTC 458
356343
3’ UTR 352 373 GGGATGAAAACATGACAATA 459
356344
3’ UTR 352 396 CATGTTTAGGTGACTTCTGG 460
356345
3’ UTR 352 401 GACAGCATGTTTAGGTGACT 461
356346
3’ UTR 352 406 TTTAGGACAGCATGTTTAGG 462
356347
3’ UTR 352 411 CTTTATTTAGGACAGCATGT 463
356348
3’ UTR 352 416 TCCAGCTTTATTTAGGACAG 464

Ejemplo 40: Inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de hámster mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Estudios de respuesta a la dosis en hepatocitos de hámster primarios
Se seleccionaron seis oligonucleótidos dirigidos a apolipoproteína C-III de hámster para los estudios de respuesta a la dosis adicionales. Los hepatocitos de hámster primarios se trataron con una concentración 50, 150 y 300 nM de ISIS 352939 (SEC ID Nº: 369), ISIS 352952 (SEC ID Nº: 380), ISIS 352962 (SEC ID Nº: 389), ISIS 55 352963 (SEC ID Nº: 390), ISIS 352971 (SEC ID Nº: 397) o ISIS 352977 (SEC ID Nº: 403) y se midieron los niveles de ARNm 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al que se normalizaron los datos. Los resultados de estos estudios se muestran en la tabla 20. Los datos se promediaron a partir de tres experimentos y se expresaron como porcentaje de inhibición con relación a los controles no tratados.

Claims (1)

  1. imagen1
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