PT2441449E - Modulação da expressão da apolipoproteína c-iii - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DA APOLIPOPROTEÍNA C-III"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona compostos capazes de modulação da expressão da apolipoproteína C-III, para utilização em terapia. Em particular, esta invenção refere-se a compostos, particularmente compostos oligonucleotidicos, que hibridam com moléculas de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III. Mostra-se aqui que tais compostos modulam a expressão da apolipoproteína C-III.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As lipoproteínas são partículas globulares semelhantes a micelas que consistem num núcleo não polar de acilgliceróis e ésteres de colesterilo rodeado por um revestimento anfifílico de proteína, fosfolípido e colesterol. As lipoproteínas foram classificadas em cinco grandes categorias com base nas suas propriedades funcionais e físicas: quilomicra, que transportam lípidos dietéticos do intestino para os tecidos; lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL); lipoproteínas de densidade intermédia (IDL); lipoproteínas de baixa densidade (LDL); todas as quais transportam triacilgliceróis e colesterol do fígado para os tecidos; e lipoproteínas de alta densidade (HDL), que transportam colesterol endógeno dos tecidos para o fígado.

As partículas de lipoproteína sofrem processamento metabólico contínuo e têm propriedades e composições variáveis. A densidade das lipoproteínas aumenta sem diminuir o diâmetro da partícula porque a densidade dos seus revestimentos exteriores é menor que a do núcleo interno. Os componentes proteicos das lipoproteínas são conhecidos como apolipoproteínas. Pelo menos nove apolipoproteínas são distribuídas em quantidades significativas entre as diversas lipoproteínas humanas. A apolipoproteína C-III é um constituinte de HDL e de lipoproteínas ricas em triglicéridos e tem um papel na hipertrigliceridemia, um fator de risco para a doença das artérias coronárias. A apolipoproteína C-III diminui esta eliminação de lipoproteínas ricas em triglicéridos através da inibição da lipólise, tanto através da inibição da lipoproteína-lipase como através da interferência na ligação da lipoproteína à matriz de glicosaminoglicanos da superfície celular (Shachter, Curr. Opin. Lipidol., 2001, 12, 297-304). O gene codificando a apolipoproteína C-III humana (também chamada APOC3, APOC-III, APO CIII, e APO C-III) foi clonado em 1984 por três grupos de investigação (Levy-Wilson et al., DNA, 1984, 3, 359-364; Protter et al., DNA, 1984, 3, 449-456; Sharpe et al. , Nucleic Acids Res., 1984, 12, 3917-3932) . A sequência de codificação é interrompida por três intrões (Protter et al., DNA, 1984, 3, 449-456). O gene da apolipoproteína C-III humana localiza-se aproximadamente 2,6 kB no sentido 3' do gene da apolipoproteína A-l e estes dois genes são transcritos de forma convergente (Karathanasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82, 6374-6378). Foi também clonada uma variante da apolipoproteína C-III humana com uma mutação de Thr74 para Ala74 a partir de um paciente com m nível de apolipoproteína C-III sérica invulgarmente elevado. Uma vez que Thr74 é O-glicosilado, o mutante Ala74 resultou portanto num aumento dos níveis da apolipoproteína C-III sérica sem a porção hidrato de carbono (Maeda et al., J. Lipid Res., 1987, 28, 1405-1409).

Foram identificados cinco polimorfismos na região promotora do gene: C(-641) para A, G(-630) para A, T(-625) para deleção, C(-482) para T e T(-455) para C. Todos estes polimorfismos estão em desequilíbrio de ligação com o polimorfismo SstI na região 3' não traduzida. O local SstI distingue os alelos SI e S2 e o alelo S2 foi associado a níveis elevados de triglicéridos no plasma (Dammerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90, 4562-4566). O promotor da apolipoproteína C-III é subregulado através de insulina e este local polimórfico abole a regulação da insulina. Assim a potencial sobre-expressão de apolipoproteína C-III resultante da perda de regulação da insulina pode ser um fator que contribui para o desenvolvimento da hipertrigliceridemia associada ao alelo S2 (Li et al., J. Clin. Invest., 1995, 96, 2601-2605). O polimorfismo T(-455) para C foi associado a um maior risco de doença das artérias coronárias (Olivieri et al., J. Lipid Res., 2002, 43, 1450-1457).

Além da insulina, foram identificados outros reguladores da expressão do gene da apolipoproteína C-III. Um elemento de resposta para o recetor órfão nuclear rev-erb alfa foi localizado nas posições -23/-18 na região do promotor da apolipoproteína C-III e rev-erb alfa diminui a atividade do promotor da apolipoproteína C-III (Raspe et al., J. Lipid Res., 2002, 43, 2172-2179) . A região do promotor da apolipoproteína C-III -86 a -74 é reconhecida por dois fatores nucleares ClIIbl e CIIIB2 (Ogami et al., J. Biol.

Chem., 1991, 266, 9640-9646). A expressão da apolipoproteina C-III é também sobrerregulada por retinoides atuando através do recetor de retinoide X, e alterações na abundância do recetor de retinoide X afetam a transcrição da apolipoproteina C-III (Vu-Dac et ai., J. Clin. Invest., 1998, 102, 625-632). Mostrou-se que a especificidade da proteína 1 (Spl) e do fator nuclear de hepatócitos-4 (HNF-4) funciona em sinergia para transativar o promotor da apolipoproteina C-III através do local de ligação a HNF-4 (Kardassis et ai., Biochemistry, 2002, 41, 1217-1228) . HNF-4 funciona também em conjunto com SMAD3-SMAD4 para transativar o promotor da apolipoproteina C-III (Kardassis et ai., J. Biol. Chem., 2000, 275, 41405-41414) .

Ratinhos transgénicos e knockout definiram melhor o papel da apolipoproteina C-III na lipólise. A sobre-expressão de apolipoproteina C-III em ratinhos transgénicos leva a hipertrigliceridemia e deficiente eliminação de VLDL-triglicéridos (de Silva et ai., J. Biol. Chem., 1994, 269, 2324-2335; Ito et ai., Science, 1990, 249, 790-793). Ratinhos knockout com uma ausência total da proteína apolipoproteina C-III apresentaram níveis de colesterol e triglicéridos plasmáticos significativamente reduzidos em comparação com ratinhos de tipo selvagem e estavam protegidos contra hipertrigliceridemia pós-prandial (Maeda et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 23610-23616).

Atualmente, não existem agentes terapêuticos conhecidos que afetem a função da apolipoproteina C-III. Foi postulado que o efeito hipolipidémico da classe de fármacos fibratos ocorre através de um mecanismo onde o recetor activado proliferador de peroxissoma (PPAR) medeia o deslocamento de HNF-4 do promotor da apolipoproteina C-III, resultando na supressão da transcrição da apolipoproteina C-III (Hertz et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 13470-13475). A classe de fármacos hipolipidémicos das estatinas também diminui os niveis de triglicéridos através de um mecanismo desconhecido, o que resulta num aumento de ARNm de lipoproteína-lipase e numa diminuição nos niveis plasmáticos da apo C-III (Schoonjans et al., FEBS Lett., 1999, 452, 160-164). Por conseguinte, continua a haver uma necessidade há muito sentida de agentes adicionais capazes de inibir eficazmente a função da apolipoproteina C-III.

SUMARIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um composto de 15 a 30 nucleobases de comprimento dirigido para a região 3' não traduzida (3'UTR) de uma molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteina C-III humana, em que o referido composto híbrida especificamente com a referida molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteina C-III humana e inibe a expressão da apolipoproteina C-III humana, em que o referido composto é pelo menos 90% complementar à referida molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteina C-III humana, para utilização em terapia.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO São aqui divulgadas composições e métodos para modulação da expressão da apolipoproteina C-III. A tecnologia antissentido está a emergir como um meio eficaz para reduzir a expressão de produtos génicos específicos e é excecionalmente útil em várias aplicações terapêuticas, de diagnóstico e de investigação para a modulação da expressão da apolipoproteina C-III. A presente divulgação dirige-se a compostos, especialmente ácido nucleico e oligómeros semelhantes a ácido nucleico, que são dirigidos a um ácido nucleico codificando a apolipoproteina C-III, e que modulam a expressão de apolipoproteina C-III. Composições farmacêuticas e outras compreendendo os compostos aqui divulgados são também divulgadas. São ainda divulgados métodos de pesquisa de moduladores de apolipoproteina C-III e métodos de modulação da expressão da apolipoproteina C-III em células, tecidos ou animais compreendendo o contacto das referidas células, tecidos ou animais com um ou mais dos compostos ou composições da divulgação. Nestes métodos, as células ou tecidos são colocados em contacto in vivo. Alternativamente, as células ou tecidos são colocados em contacto ex vivo. São também aqui expostos métodos de tratamento de um animal, particularmente um humano, suspeito de ter ou de ter tendência para uma doença ou condição associada a expressão de apolipoproteina C-III. Tais métodos compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente ou prof ilaticamente eficaz de um ou mais dos compostos ou composições da divulgação à pessoa a necessitar de tratamento. É também divulgado um método de produção de um composto da divulgação compreendendo a hibridação de forma especifica in vitro de uma primeira cadeia de nucleobases compreendendo uma sequência de pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência exposta em SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: 18 a uma segunda cadeia de nucleobases compreendendo uma sequência suficientemente complementar à referida primeira cadeia de modo a permitir hibridação estável. É também aqui divulgado um composto da divulgação para utilização em terapia.

Descreve-se ainda aqui a utilização de um composto ou composição da divulgação no fabrico de um medicamento para o tratamento de qualquer uma e todas as condições aqui descritas.

DESCRIÇÃO DETALHADA A. Visão Geral A presente divulgação utiliza compostos, de preferência oligonucleótidos e espécies afins, para utilização na modulação da função ou do efeito de moléculas de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III. Isto é conseguido proporcionando oligonucleótidos que hibridam especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III.

Tal como aqui utilizados, os termos "ácido nucleico alvo" e "molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III" foram usados por conveniência para incluir ADN codificando a apolipoproteína C-III, ARN (incluindo pré-ARNm e ARNm ou porções destes) transcrito a partir de tal ADN, e também ADNc derivado de tal ARN. A hibridação de um composto da presente invenção com o seu ácido nucleico alvo é geralmente referida como "antissentido". Por conseguinte, o mecanismo incluído na prática de formas de realização da invenção é aqui referido como "inibição antissentido". Tal inibição antissentido é tipicamente baseada em hibridação baseada em ligações de hidrogénio de cadeias ou segmentos de oligonucleótidos de modo a que pelo menos uma cadeia ou segmento seja clivado, degradado, ou de outra forma tornado inoperativo. A este respeito, prefere-se presentemente dirigir tal inibição antissentido para moléculas de ácido nucleico especificas e suas funções.

As funções de ADN com as quais interferir incluem replicação e transcrição. A replicação e a transcrição, por exemplo, podem ser de um molde celular endógeno, um vetor, uma construção plasmidica ou de outro modo. As funções do ARN com as quais interferir podem incluir funções tais como translocação do ARN para um local de tradução da proteína, translocação do ARN para locais dentro da célula que sejam distantes do local da síntese de ARN, tradução da proteína a partir do ARN, processamento do ARN para produzir uma ou mais espécies de ARN, e atividade catalítica ou formação de complexos envolvendo o ARN que pode estar envolvida com ou ser facilitada pelo ARN. Um resultado preferido de tal interferência com a função do ácido nucleico alvo é a modulação da expressão da apolipoproteína C-III. No contexto da presente divulgação, "modulação" e "modulação da expressão" significam ou um aumento (estimulação) ou uma diminuição (inibição) na quantidade ou nos níveis de uma molécula de ácido nucleico codificando para o gene, p. ex., ADN ou ARN. A inibição é frequentemente a forma preferida de modulação da expressão e o ARNm é frequentemente um ácido nucleico alvo preferido.

No contexto desta invenção, "hibridação" significa o emparelhamento de cadeias complementares de compostos oligoméricos. Na presente invenção, o mecanismo de emparelhamento preferido envolve ligações de hidrogénio, que podem ser ligações de hidrogénio de Watson-Crick, de Hoogsteen ou de Hoogsteen invertidas, entre nucleósidos complementares ou bases nucleotidicas (nucleobases) das cadeias de compostos oligoméricos. Por exemplo, a adenina e a timina são nucleobases complementares, que emparelham através da formação de ligações de hidrogénio. A hibridação pode ocorrer sob circunstâncias variáveis.

Um composto antissentido pode hibridar especificamente quando a ligação do composto ao ácido nucleico alvo interfere com a função normal do ácido nucleico alvo para causar uma perda de atividade, e existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não especifica do composto antissentido a sequências de ácido nucleico não alvo, sob condições em que é desejada ligação especifica, isto é, sob condições fisiológicas no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico, e sob condições nas quais os ensaios são executados no caso de ensaios in vitro.

Na presente invenção, a frase "condições de hibridação rigorosas" ou "condições rigorosas" refere-se a condições sob as quais um composto da invenção hibridará com a sua sequência alvo, mas com um número mínimo de outras sequências. As condições rigorosas são dependentes da sequência e são diferentes em circunstâncias diferentes. No contexto desta invenção, as "condições rigorosas" sob as quais os compostos oligoméricos hibridam com uma sequência alvo são determinadas pela natureza e composição dos compostos oligoméricos e os ensaios em que eles estão a ser investigados. "Complementar", tal como aqui utilizado, refere-se à capacidade de emparelhamento preciso entre duas nucleobases de um composto oligomérico. Por exemplo, se uma nucleobase numa certa posição de um oligonucleótido (um composto oligomérico), for capaz de fazer ligações de hidrogénio com uma nucleobase numa certa posição de um ácido nucleico alvo, sendo o referido ácido nucleico alvo ADN, ARN, ou molécula oligonucleotidica, então a posição da ligação de hidrogénio entre o oligonucleótido e o ácido nucleico alvo é considerada como sendo uma posição complementar. 0 oligonucleótido e o outro ADN, ARN, ou molécula oligonucleotidica são complementares um ao outro quando um número suficiente de posições complementares em cada molécula é ocupado por nucleobases que podem formar ligações de hidrogénio umas com as outras. Assim, "que pode hibridar especificamente" e "complementar" são termos que são usados para indicar um grau suficiente de emparelhamento preciso ou complementaridade ao longo de um número suficiente de nucleobases de modo a que possa ocorrer ligação estável e especifica entre o oligonucleótido e um ácido nucleico alvo.

Entende-se na técnica que a sequência do composto antissentido pode ser, mas não precisa de ser, 100% complementar à do ácido nucleico alvo para poder hibridar especificamente. Além disso, um oligonucleótido pode hibridar ao longo de um ou mais segmentos de modo a que segmentos intervenientes ou adjacentes não estejam envolvidos no evento de hibridação (p. ex., uma estrutura de volta ou estrutura em alfinete). Numa forma de realização, os compostos antissentido da presente divulgação compreendem pelo menos 70%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 85% de complementaridade da sequência com uma região alvo dentro do ácido nucleico alvo. Noutra forma de realização, os compostos antissentido desta divulgação compreendem 90% de complementaridade de sequência e compreendem ainda de preferência 95% ou pelo menos 99% de complementaridade de sequência com a região alvo dentro da sequência de ácido nucleico alvo à qual se dirigem. De preferência, os compostos antissentido compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de um composto antissentido aqui divulgado. Por exemplo, um composto antissentido em que 18 das 20 nucleobases do composto antissentido são complementares a uma região alvo, e portanto hibridarão de forma específica, representaria 90 porcento de complementaridade. Neste exemplo, as nucleobases não complementares restantes podem estar agrupadas ou intercaladas com nucleobases complementares e não precisam de ser contíguas umas às outras ou a nucleobases complementares. Como tal, um composto antissentido que tenha 18 nucleobases de comprimento possuindo 4 (quatro) nucleobases não complementares que sejam flanqueadas por duas regiões de complementaridade completa com o ácido nucleico alvo terá 77,8% de complementaridade global com o ácido nucleico alvo e cai assim dentro do âmbito da presente divulgação. A percentagem de complementaridade de um composto antissentido com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada rotineiramente utilizando programas BLAST (ferramentas de pesquisa de alinhamento local básico) e programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al. , J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang e Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). A percentagem de homologia, identidade de sequência ou complementaridade, podem ser determinadas, por exemplo, através do programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI), utilizando configurações por defeito, que utiliza o algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). Nalgumas formas de realização preferidas, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, entre o composto oligomérico e o alvo está entre cerca de 50% e cerca de 60%. Nalgumas formas de realização, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, está entre cerca de 60% e cerca de 70%. Em formas de realização preferidas, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, está entre cerca de 70% e cerca de 80%. Em formas de realização mais preferidas, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, está entre cerca de 80% e cerca de 90%. Nalgumas formas de realização preferidas, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99%. B. Compostos

De acordo com a presente divulgação, os compostos incluem compostos oligoméricos antissentido, oligonucleótidos antissentido, ribozimas, oligonucleótidos de sequência guia externa (EGS), processadores alternativos, iniciadores, sondas e outros compostos oligoméricos que hibridem com pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo. Como tal, estes compostos podem ser introduzidos na forma de compostos oligoméricos de cadeia simples, de cadeia dupla, circular ou em alfinete e podem conter elementos estruturais tais como protuberâncias ou voltas internas ou terminais. Uma vez introduzidos num sistema, os compostos podem desencadear a ação de uma ou mais enzimas ou proteínas estruturais para realizar a modificação do ácido nucleico alvo.

Um exemplo não limitativo de uma tal enzima é ARNAse H, uma endonuclease celular que cliva a cadeia de ARN de um duplex de ARN:ADN. Sabe-se na técnica que os compostos antissentido de cadeia simples que são "semelhantes a ADN" desencadeiam ARNAse Η. A ativação da ARNAse H resulta, portanto, em clivagem do alvo de ARN, aumentando grandemente assim a eficiência da inibição mediada por oligonucleótidos da expressão génica. Papéis semelhantes foram postulados para outras ribonucleases tais como as da família de enzimas ARNase III e ribonuclease L.

Embora a forma preferida do composto antissentido seja um oligonucleótido antissentido de cadeia simples, em muitas espécies a introdução de estruturas de cadeia dupla, tais como moléculas de ARN de cadeia dupla (ARNcd), induz redução mediada por antissentido potente e específica da função de um gene ou dos seus produtos génicos associados. Este fenómeno ocorre tanto em plantas como em animais e acredita-se ter uma ligação evolutiva a defesa virai e silenciamento de transposões. A primeira evidência de que ARNcd poderia levar a silenciamento de genes em animais ocorreu em 1995 a partir de trabalho no nemátode Caenorhabditis elegans (Guo e Kempheus, Cell, 1995, 81, 611-620). Os efeitos primários de interferência de ARNcd são pós-transcricionais (Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, 95, 15502-15507). O mecanismo antissentido pós-transcricional definido em

Caenorhabditis elegans resultante da exposição a ARN de cadeia dupla (ARNcd) foi desde então designado interferência de ARN (ARNi). Este termo foi generalizado para significar o silenciamento de genes mediado por antissentido envolvendo a introdução de ARNcd levando à redução específica da sequência de níveis de ARNm endógeno alvo (Fire et al., Nature, 1998, 391, 806-811) . Recentemente, foi relatado que oligómeros de ARN de cadeia simples de polaridade antissentido dos ARNcd são potentes indutores de ARNi (Tijsterman et al., Science, 2002, 295, 694-697).

No contexto da presente invenção, o termo "composto oligomérico" refere-se a um polímero ou oligómero compreendendo uma pluralidade de unidades monoméricas. No contexto desta invenção, o termo "oligonucleótido" refere-se a um oligómero ou polímero de ácido ribonucleico (ARN) ou ácido desoxirribonucleico (ADN) ou miméticos, quimeras, análogos e homólogos destes. Este termo inclui oligonucleótidos constituídos por nucleobases de ocorrência natural, açúcares e ligações covalentes internucleósidos (esqueleto), bem como oligonucleótidos possuindo porções de ocorrência não natural que funcionam de forma semelhante. Tais oligonucleótidos modificados ou substituídos são frequentemente preferidos em relação às formas nativas devido a propriedades desejáveis, tais como, por exemplo, maior tomada celular, maior afinidade para um ácido nucleico alvo e maior estabilidade na presença de nucleases.

Os oligonucleótidos da presente invenção incluem também oligonucleótidos modificados em que uma nucleobase diferente está presente numa ou mais das posições de nucleótidos no oligonucleótido. Por exemplo, se o primeiro nucleótido for adenosina, podem ser produzidos oligonucleótidos modificados que contenham timidina, guanosina ou citidina nesta posição. Isto pode ser feito em qualquer uma das posições do oligonucleótido. Estes oligonucleótidos são então testados usando os métodos aqui descritos para determinar a sua capacidade para inibir a expressão da apolipoproteína C-III.

Embora os oligonucleótidos estejam uma forma preferida dos compostos desta divulgação, a presente divulgação abrange também outras famílias de compostos, incluindo mas não se limitando a análogos e miméticos de oligonucleótidos tais como os aqui descritos.

Os compostos de acordo com esta divulgação compreendem de preferência de cerca de 8 a cerca de 80 nucleobases (i.e. de cerca de 8 a cerca de 80 nucleósidos ligados) . Um vulgar perito na técnica apreciará que isto engloba os compostos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ou 80 nucleobases de comprimento.

Numa forma de realização preferida, os compostos são de 12 a 50 nucleobases de comprimento. Um vulgar perito na técnica apreciará que isto engloba os compostos de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 nucleobases de comprimento.

Noutra forma de realização preferida, os compostos têm 15 a 30 nucleobases de comprimento. Um vulgar perito na técnica apreciará que isto engloba os compostos de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleobases de comprimento.

Compostos particularmente preferidos são oligonucleótidos de cerca de 12 a cerca de 50 nucleobases, ainda de maior preferência aqueles compreendendo de cerca de 15 a cerca de 30 nucleobases.

Compostos antissentido de 8-80 nucleobases de comprimento compreendendo um trecho de pelo menos oito (8) nucleobases consecutivas selecionadas a partir dos compostos antissentido ilustrativos são também considerados serem compostos antissentido adequados.

Compostos antissentido preferidos exemplares incluem sequências oligonucleotidicas que compreendem pelo menos as 8 nucleobases consecutivas do terminal 5' de um dos compostos antissentido preferidos ilustrativos (sendo as restantes nucleobases um trecho consecutivo do mesmo oligonucleótido começando imediatamente a montante do terminal 5 ' do composto antissentido que pode hibridar especificamente com o ácido nucleico alvo e continuando até o oligonucleótido conter cerca de 8 a cerca de 80 nucleobases) . Semelhantemente, compostos antissentido preferidos são representados por sequências oligonucleotidicas que compreendem pelo menos as 8 nucleobases consecutivas do terminal 3' de um dos compostos antissentido preferidos ilustrativos (sendo as restantes nucleobases um trecho consecutivo do mesmo oligonucleótido começando imediatamente a jusante do terminal 3' do composto antissentido que se pode hibridar especificamente com o ácido nucleico alvo e continuando até o oligonucleótido conter cerca de 8 a cerca de 80 nucleobases). Compostos exemplares de uma variedade de fontes de mamífero, incluindo humano, podem ser encontrados identificados nos Exemplos e listados nas Tabelas 1 a 21. Um perito na técnica armado com os compostos antissentido preferidos aqui ilustrados será capaz, sem demasiada experimentação, de identificar outros compostos antissentido preferidos. C. Alvos "Dirigir" um composto antissentido para uma molécula de ácido nucleico alvo codificando a apolipoproteina C-III, no contexto desta invenção, pode ser um processo de múltiplos passos. 0 processo começa habitualmente com a identificação de um ácido nucleico alvo cuja função se deseja modular. Este ácido nucleico alvo pode ser, por exemplo, um gene celular (ou transcrito de ARNm a partir do gene) cuja expressão está associada a um distúrbio ou estado de doença particular, ou a uma molécula de ácido nucleico de um agente infecioso. Na presente invenção, o ácido nucleico alvo codifica a apolipoproteina C-III. 0 processo de direcionamento inclui também habitualmente a determinação de pelo menos uma região, um segmento, ou um local alvo dentro do ácido nucleico alvo para que a interação antissentido ocorra de modo a que o efeito desejado, p. ex., modulação da expressão, resulte. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "região" é definido como a uma porção do ácido nucleico alvo possuindo pelo menos uma estrutura, função ou caracteristica identificável. Dentro de regiões de ácidos nucleicos alvo estão os segmentos. Os "segmentos" são definidos como porções menores ou subporções de regiões dentro de um ácido nucleico alvo. "Locais", conforme usado na presente invenção, são definidos como posições dentro de um ácido nucleico alvo.

Uma vez que, tal como é conhecido na técnica, o codão de iniciação da tradução é tipicamente 5'-AUG (em moléculas de ARNm transcritas; 5'-ATG na molécula de ADN correspondente), o codão de iniciação da tradução é também referido como o "codão AUG", o "codão de iniciação" ou o "codão de iniciação AUG". Mostrou-se que uma minoria dos genes, possuindo codões de iniciação da tradução com a sequência de ARN 5'-GUG, 5'-UUG ou 5'-CUG, e 5'-AUA, 5'-ACG e 5'-CUG, funciona in vivo. Assim, os termos "codão de iniciação da tradução" e "codão de iniciação" podem englobar muitas sequências de codões, embora o aminoácido iniciador seja em cada caso tipicamente metionina (em eucariotas) ou formilmetionina (em procariotas). É também conhecido na técnica que os genes eucarióticos e procarióticos podem ter dois ou mais codões de iniciação alternativos, qualquer um dos quais pode ser utilizado preferencialmente para iniciação da tradução num determinado tipo celular ou de tecido, ou sob um conjunto particular de condições. No contexto da invenção, "codão de iniciação" e "codão de iniciação da tradução" refere-se ao codão ou codões que são utilizados in vivo para iniciar a tradução de um ARNm transcrito a partir de um gene codificando a apolipoproteína C-III, independentemente da ou das sequências de tais codões. É também conhecido na técnica que um codão de terminação da tradução (ou "codão de terminação") de um gene pode ter uma de três sequências, isto é, 5'-UAA, 5'-UAG e 5'-UGA (as sequências de ADN correspondentes são 5'-TAA, 5'-TAG e 5'-TGA, respetivamente).

Os termos "região do codão de iniciação" e "região do codão de iniciação da tradução" referem-se a uma porção de um tal ARNm ou gene que englobe de cerca de 25 a cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer uma das direções (i.e., 5' ou 3 ') de um codão de iniciação da tradução. Semelhantemente, os termos "região do codão de terminação" e "região do codão de terminação da tradução" referem-se a uma porção de um tal ARNm ou gene que englobe de cerca de 25 a cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer uma das direções (i.e., 5' ou 3') de um codão de terminação da tradução. Por conseguinte, a "região do codão de iniciação" (ou "região do codão de iniciação da tradução") e a "região do codão de terminação" (ou "região do codão de terminação da tradução") são todas regiões que podem ser alvejadas de forma eficaz com os compostos antissentido. O enquadramento de leitura aberto (ORF) ou "região de codificação", que é conhecido na técnica para referir a região entre o codão de iniciação da tradução e o codão de terminação da tradução, é também uma região que pode ser atingida de forma eficaz. Dentro do contexto da presente divulgação, uma região preferida é a região intragénica englobando o codão de iniciação ou de terminação da tradução do enquadramento de leitura aberto (ORF) de um gene.

Outras regiões alvo incluem a região 5' não traduzida (5'UTR), conhecida na técnica para referir a porção de um ARNm no sentido 5' do codão de iniciação da tradução, e incluindo assim os nucleótidos entre o local protetor 5' e o codão de iniciação da tradução de um ARNm (ou os nucleótidos correspondentes no gene), e a região 3' não traduzida (3'UTR), conhecida na técnica para referir a porção de um ARNm no sentido 3' do codão de terminação da tradução, e incluindo assim os nucleótidos entre o codão de terminação da tradução e a extremidade 3' de um ARNm (ou nucleótidos correspondentes no gene) . O local protetor 5' de um ARNm compreende um resíduo de guanosina metilado em N7 unido ao resíduo mais 5' do ARNm através de uma ligação trifosfato 5'-5'. A região protetora 5' de um ARNm é considerada como incluindo a própria estrutura protetora 5' , bem como os primeiros 50 nucleótidos adjacentes ao local protetor. É também preferido atingir a região protetora 5'.

Por conseguinte, a presente divulgação inclui compostos antissentido que se dirigem a uma porção das nucleobases 1-533 tal como exposto em SEQ ID NO: 18. Numa forma de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases das nucleobases 1-533 tal como exposto em SEQ ID NO: 18 e nas Tabelas 1 e 4. Noutra forma de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases das nucleobases compreendendo a UTR 5' tal como exposto em SEQ ID NO: 18 e Tabelas 1 e 4. Noutra forma de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases das nucleobases compreendendo a UTR 3' tal como exposto em SEQ ID NO: 18 e Tabelas 1 e 4. Noutra forma de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases das nucleobases compreendendo a região de codificação tal como exposto em SEQ ID NO: 18 e Tabelas 1 e 4. Ainda noutras formas de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases de um "segmento alvo preferido" (tal como aqui definido) tal como exposto na Tabela 3.

Além disso, a presente divulgação inclui compostos antissentido que se dirigem a uma porção das nucleobases 1-3958 tal como exposto em SEQ ID NO: 4. Numa forma de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases das nucleobases 1-3958 tal como exposto em SEQ ID NO: 4 e Tabelas 1 e 4. Noutra forma de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases das nucleobases compreendendo a UTR 5' tal como exposto em SEQ ID NO: 4 e Tabelas 1 e 4. Noutra forma de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases das nucleobases compreendendo a UTR 3' tal como exposto em SEQ ID NO: 4 e Tabelas 1 e 4. Noutra forma de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases das nucleobases compreendendo a região de codificação tal como exposto em SEQ ID NO: 4 e Tabelas 1 e 4. Ainda noutras formas de realização, os compostos antissentido dirigem-se a pelo menos uma porção de 8 nucleobases de um "segmento alvo preferido" (tal como aqui definido) tal como exposto na Tabela 3.

Embora alguns transcritos de ARNm eucarióticos sejam diretamente traduzidos, muitos contêm uma ou mais regiões, conhecidas como "intrões," que são excisadas de um transcrito antes de ser traduzido. As restantes regiões (e portanto traduzidas) são conhecidas como "exões" e são unidas entre si para formar uma sequência de ARNm contínua. Atingir locais de processamento, i.e., junções intrão-exão ou junções exão-intrão, pode também ser particularmente útil em situações em que o processamento aberrante está implicado em doença, ou quando uma sobreprodução de um determinado produto de processamento está implicada em doença. Junções de fusão aberrantes devido a rearranjos ou deleções são também locais alvo preferidos. Os transcritos de ARNm produzidos através do processo de união de dois (ou mais) ARNm de diferentes fontes de genes são conhecidos como "transcritos de fusão". Sabe-se também que os intrões podem ser eficazmente atingidos utilizando compostos antissentido dirigidos, por exemplo, para ADN ou pré-ARNm.

Transcritos de ARN alternativos podem ser produzidos a partir da mesma região genómica do ADN. Estes transcritos alternativos são geralmente conhecidos como "variantes". Mais especificamente, "variantes pré-ARNm" são transcritos produzidos a partir do mesmo ADN genómico que diferem de outros transcritos produzidos a partir do mesmo ADN genómico tanto na sua posição de inicio como de paragem e contêm tanto a sequência intrónica como exónica.

Após excisão de uma ou mais regiões de intrão ou exão, ou porções destas durante o processamento, as variantes pré-ARNm produzem "variantes de ARNm" menores. Por conseguinte, as variantes de ARNm são variantes pré-ARNm processados e cada variante pré-ARNm única deve sempre produzir uma variante ARNm única em resultado do processamento. Estas variantes de ARNm são também conhecidas como "variantes de processamento alternativo". Se não ocorrer qualquer processamento da variante pré-ARNm então a variante pré-ARNm é idêntica à variante de ARNm.

As variantes podem ser produzidas através da utilização de sinais alternativos para iniciar ou terminar a transcrição. Os pré-ARNm e ARNm podem possuir mais de um codão de iniciação ou codão de terminação. As variantes que têm origem num pré-ARNm ou ARNm que utiliza codões de iniciação alternativos são conhecidas como "variantes de iniciação alternativa" desse pré-ARNm ou ARNm. Os transcritos que utilizam um codão de terminação alternativo são conhecidos como "variantes de terminação alternativa" desse pré-ARNm ou ARNm. Um tipo especifico de variante de terminação alternativa é a "variante poliA", em que os múltiplos transcritos produzidos resultam da seleção alternativa de um dos "sinais de terminação poliA" através da maquinaria de transcrição, produzindo assim transcritos que terminam em locais poliA únicos. Dentro do contexto da divulgação, os tipos de variantes aqui descritos são também ácidos nucleicos alvo preferidos.

As localizações no ácido nucleico alvo com que os compostos antissentido preferidos hibridam são aqui abaixo referidas como "segmentos alvo preferidos". Tal como aqui utilizado, o termo "segmento alvo preferido" é definido como pelo menos uma porção de 8 nucleobases de uma região alvo à qual um composto antissentido ativo se dirige. Embora não desejando estar preso pela teoria, acredita-se atualmente que estes segmentos alvo representam porções do ácido nucleico alvo que estão acessíveis para a hibridação.

Embora as sequências específicas de certos segmentos alvo preferidos sejam aqui expostas, um perito na técnica reconhecerá que estas servem para ilustrar e descrever formas de realização particulares dentro do âmbito da presente divulgação. Segmentos alvo preferidos adicionais podem ser identificados por um vulgar perito.

Segmentos alvo de 8-80 nucleobases de comprimento compreendendo um trecho de pelo menos oito (8) nucleobases consecutivas selecionadas de entre os segmentos alvo preferidos ilustrativos são também considerados como sendo adequados para direcionamento.

Os segmentos alvo podem incluir sequências de ADN ou de ARN que compreendam pelo menos as 8 nucleobases consecutivas do terminal 5' de um dos segmentos alvo preferidos ilustrativos (sendo as restantes nucleobases um trecho consecutivo do mesmo ADN ou ARN começando imediatamente a montante do terminal 5' do segmento alvo e continuando até o ADN ou ARN conter cerca de 8 a cerca de 80 nucleobases). Semelhantemente, segmentos alvo preferidos são representados por sequências de ADN ou ARN que compreendem pelo menos as 8 nucleobases consecutivas do terminal 3 ' de um dos segmentos alvo preferidos ilustrativos (sendo as restantes nucleobases um trecho consecutivo do mesmo ADN ou ARN começando imediatamente a jusante do terminal 3' do segmento alvo e continuando até o ADN ou ARN conter cerca de 8 a cerca de 80 nucleobases) . Um perito na técnica armado com os segmentos alvo preferidos aqui ilustrados, será capaz de, sem demasiada experimentação, identificar outros segmentos alvo preferidos.

Uma vez que uma ou mais regiões, segmentos ou locais alvo tenham sido identificados, são escolhidos compostos antissentido que sejam suficientemente complementares com o alvo, i.e., hibridem de forma suficiente bem e com especificidade suficiente, para dar o efeito desejado.

Os compostos oligoméricos são dirigidos para ou não dirigidos para regiões da sequência de nucleobases da apolipoproteína C-III alvo (p. ex., tal como as divulgadas nos Exemplos 15 e 17) compreendendo as nucleobases 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 601-650, 651-700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-1500, 1501-1550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 1751-1800, 1801-1850, 1851-1900, 1901- 1950, 1951-2000, 2001-2050, 2051-2100, 2101-2150, 2151-2200, 2201-2250, 2251-2300, 2301-2350, 2351-2400, 2401-2450, 2451-2500, 2501-2550, 2551-2600, 2601-2650, 2651-2700, 2701-2750, 2751-2800, 2801-2850, 2851-2900, 2901-2950, 2591-3000, 3001-3050, 3051-3100, 3101-3150, 3151-3200, 3201-3250, 3251-3300, 3301-3350, 3351-3400, 3401-3450, 3451-3500, 3501-3550, 3551-3600, 3601-3650, 3651-3700, 3701-3750, 3751-3800, 3801-3850, 3851-3900, 3901-3950, 3951-3958 de SEQ ID NO: 4, ou qualquer combinação destas.

Além disso, os compostos oligoméricos são dirigidos para ou não dirigidos para regiões da sequência de nucleobases da apolipoproteina C-III alvo (p. ex., tal como as divulgadas nos Exemplos 15 e 17) compreendendo as nucleobases 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-533 de SEQ ID NO: 18, ou qualquer combinação destas.

Numa forma de realização, os compostos oligonucleotidicos são 100% complementares a estas sequências ou a sequências pequenas verificadas dentro de cada uma das sequências acima listadas. De preferência, os compostos antissentido compreendem pelo menos 8 nucleobases contíguas de um composto antissentido aqui divulgado. Noutra forma de realização, os compostos oligonucleotídicos têm pelo menos 3 ou 5 desemparelhamentos por 20 nucleobases consecutivas em posições de nucleobases individuais nestas regiões alvo. Outros compostos ainda são dirigidos a regiões sobreponíveis das porções acima identificadas da sequência da apolipoproteina C-III. D. Pesquisa e Validação do Alvo

Noutra forma de realização, os "segmentos alvo preferidos" aqui identificados podem ser empregues numa pesquisa de compostos adicionais que modulem a expressão de apolipoproteína C-III. "Moduladores" são aqueles compostos que diminuem ou aumentam a expressão de uma molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína C-III e que compreendem pelo menos uma porção de 8 nucleobases que é complementar a um segmento alvo preferido. 0 método de pesquisa compreende os passos de colocar um segmento alvo preferido de uma molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III em contato com um ou mais candidatos moduladores, e selecionar um ou mais moduladores candidatos que diminuam ou aumentem a expressão de uma molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III. Uma vez mostrado que o modulador ou moduladores candidatos são capazes de modular (p. ex. diminuir ou aumentar) a expressão de uma molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III, o modulador pode então ser empregue em outros estudos de investigação da função da apolipoproteína C-III, ou para utilização como agente de investigação, diagnóstico, ou terapêutico de acordo com a presente invenção.

Os segmentos alvo preferidos aqui divulgados podem também ser combinados com os seus respetivos compostos antissentido complementares para formar oligonucleótidos de cadeia dupla estabilizados (duplexados).

Mostrou-se na técnica que tais porções oligonucleotídicas de cadeia dupla modulam a expressão do alvo e regulam a tradução bem como o processamento de ARN através de um mecanismo antissentido. Além disso, as porções de cadeia dupla podem ser sujeitas a modificações químicas (Fire et al., Nature, 1998, 391, 806-811; Timmons e Fire, Nature 1998, 395, 854; Timmons et al. , Gene, 2001, 263, 103-112; Tabara et al., Science, 1998, 282, 430-431; Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507; Tuschl et al., Genes Dev., 1999, 13, 3191-3197; Elbashir et al., Nature, 2001, 411, 494-498; Elbashir et al., Genes Dev. 2001, 15, 188-200) . Por exemplo, mostrou-se que tais porções de cadeia dupla inibem o alvo através de hibridação clássica da cadeia antissentido do dúplex com o alvo, desencadeando assim degradação enzimática do alvo (Tijsterman et al., Science, 2002, 295, 694-697) .

Os compostos aqui divulgados podem também ser aplicados nas áreas de descoberta de fármacos e validação do alvo. Está também compreendida a utilização dos compostos e segmentos alvo preferidos aqui identificados nos esforços de descoberta de fármacos para elucidar as relações que existem entre a apolipoproteína C-III e um estado de doença, fenótipo, ou condição. Estes métodos incluem a deteção ou modulação da apolipoproteína C-III compreendendo o contacto de uma amostra, tecido, célula ou organismo com os compostos aqui divulgados, a medição do nível de ácido nucleico ou proteína de apolipoproteína C-III e/ou um ponto final fenotípico ou químico relacionado nalgum momento após o tratamento, e, opcionalmente, a comparação do valor medido com uma amostra não tratada ou amostra tratada com outro composto aqui divulgado. Estes métodos podem também ser realizados em paralelo ou em combinação com outras experiências para determinar a função de genes desconhecidos para o processo de validação do alvo ou para determinar a validade de um produto génico particular como alvo para tratamento ou prevenção de uma determinada doença, condição, ou fenótipo. E. Estojos, Reagentes de Investigação, Agentes de Diagnóstico, e Terapêuticos

Os compostos aqui divulgados são utilizados para diagnóstico, terapia, profilaxia, e como reagentes e estojos de investigação. Numa forma de realização, tais compostos são úteis nas áreas da obesidade e de distúrbios relacionados com o metabolismo tais como hiperlipidemia. Além disso, os oligonucleótidos antissentido, que são capazes de inibir a expressão génica com extraordinária especificidade, são frequentemente utilizados por aqueles com vulgar perícia para elucidar a função de determinados genes ou para distinguir entre as funções de vários membros de uma via biológica.

Para utilização em estojos e diagnóstico, os compostos aqui divulgados, sozinhos ou em combinação com outros compostos ou terapêuticos, são utilizados como ferramentas em análises diferenciais e/ou combinatórias para elucidar padrões de expressão de uma porção ou de todo o complemento de genes expressos nas células e nos tecidos.

Tal como aqui utilizado, o termo "sistema" é definido como qualquer organismo, célula, cultura de células ou tecido que expresse, ou seja tornado competente para expressar os produtos do gene codificando a apolipoproteína C-III. Estes incluem, mas não estão limitados a, humanos, animais transgénicos, células, culturas celulares, tecidos, xenoenxertos, transplantes e combinações destes.

Como um exemplo não limitativo, os padrões de expressão dentro de células ou tecidos tratados com um ou mais compostos antissentido são comparados com células ou tecidos de controlo não tratados com os compostos antissentido e os padrões produzidos são analisados quanto aos níveis diferenciais de expressão génica uma vez que se relacionam com, por exemplo, associação a doença, via de sinalização, localização celular, nível de expressão, dimensão, estrutura ou função dos genes analisados. Estas análises podem ser realizadas em células estimuladas ou não estimuladas e na presença ou ausência de outros compostos que afetem os padrões de expressão.

Exemplos de métodos de análise da expressão génica conhecidos na técnica incluem arrays ou microarrays de ADN (Brazma e Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, et al. , FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (análise em série da expressão génica) (Madden, et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS (amplificação com enzimas de restrição de ADNc digeridos) (Prashar e Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (análise da expressão génica total) (Sutcliffe, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 1976-1981), arrays de proteínas e proteómica (Celis, et al., FEES Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), sequenciação de etiquetas de sequências expressas (EST) (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), determinação da impressão digital subtrativa de ARN (SuRF) (Fuchs, et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203-208), clonagem subtrativa, apresentação diferencial (DD) (Jurecic e Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridação genómica comparativa (Carulli, et al., J.

Cell Blochem. Suppl. , 1998, 31, 286-96), técnicas FISH (hibridação fluorescente in situ) (Going e Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) e métodos de espectrometria de massa (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).

Os compostos aqui divulgados são úteis para investigação e diagnóstico, porque estes compostos hibridam com ácidos nucleicos codificando a apolipoproteína C-III. Por exemplo, oligonucleótidos que se mostra hibridarem com tal eficiência e sob tais condições como aqui divulgado sendo inibidores eficazes de apolipoproteína C-III serão também iniciadores ou sondas eficazes sob condições que favoreçam a amplificação ou deteção do gene, respetivamente. Estes iniciadores e sondas são úteis em métodos que requerem a deteção específica de moléculas de ácido nucleico codificando apolipoproteína C-III e na amplificação das referidas moléculas de ácido nucleico para deteção ou para utilização em outros estudos de apolipoproteína C-III. A hibridação dos oligonucleótidos antissentido, particularmente os iniciadores e as sondas aqui divulgados com um ácido nucleico codificando apolipoproteína C-III podem ser detetados por meio conhecidos na técnica. Tais meios podem incluir conjugação de uma enzima com o oligonucleótido, marcação radioativa do oligonucleótido ou quaisquer outros meios de deteção adequados. Estojos utilizando tais meios de deteção para detetar o nível de apolipoproteína C-III numa amostra podem também ser preparados. É também divulgado um método de produção de um composto aqui divulgado compreendendo a hibridação de forma específica in vitro de uma primeira cadeia de nucleobases compreendendo uma sequência de pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência exposta em SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: 18 com uma segunda cadeia de nucleobases compreendendo uma sequência suficientemente complementar com a referida primeira cadeia de modo a permitir hibridação estável. É também aqui divulgado um composto da divulgação para utilização em terapia. É também aqui divulgada a utilização de um composto ou composição da divulgação no fabrico de um medicamento para o tratamento de qualquer uma e de todas as condições aqui divulgadas.

Entre as utilizações de diagnóstico está a medição da apolipoproteina C-III em pacientes para identificar aqueles que podem beneficiar de uma estratégia de tratamento dirigida à redução dos niveis de apolipoproteina C-III. Tais pacientes adequados para diagnóstico incluem pacientes com hipertrigliceridemia (p. ex., para diagnosticar tendências para a doença das artérias coronárias), metabolismo anormal dos lipidos, obesidade, hiperlipidemia, entre outros distúrbios. A especificidade e sensibilidade do antissentido são também aproveitadas pelos peritos na técnica para utilizações terapêuticas. Os compostos antissentido foram empregues como porções terapêuticas no tratamento de estados de doença em animais, incluindo humanos. Fármacos oligonucleótidos antissentido, incluindo ribozimas, foram administrados com segurança e eficácia a humanos e numerosos ensaios clínicos estão presentemente em curso. Estabelece-se assim que os compostos antissentido podem ser modalidades terapêuticas úteis que podem ser configuradas para serem úteis em regimes de tratamento para o tratamento de células, tecidos e animais, especialmente humanos.

Para terapêutica, um animal, de preferência um humano, suspeito de ter uma doença ou um distúrbio que pode ser tratado através da modulação da expressão de apolipoproteína C-III é tratado através da administração de compostos antissentido, de acordo com esta divulgação. Por exemplo, numa forma de realização não limitativa, os métodos compreendem o passo de administração ao animal a necessitar de tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da apolipoproteína C-III. Os inibidores da apolipoproteína C-III da presente divulgação inibem eficazmente a atividade da proteína apolipoproteína C-III ou inibem a expressão da proteína apolipoproteína C-III. Por exemplo, um tal composto que reduz os níveis de apolipoproteína C-III é útil a prevenir morbidez e mortalidade para sujeitos com distúrbios cardíacos. Por exemplo, tal como demonstrado nos exemplos, a redução na apolipoproteína C-III pode resultar numa redução nos níveis séricos de colesterol, triglicéridos, e glicose. Assim, inibidores da apolipoproteína C-III são úteis no tratamento da hipertrigliceridemia, metabolismo anormal de lípidos, metabolismo anormal do colesterol, aterosclerose, hiperlipidemia, diabetes, incluindo diabetes Tipo 2, obesidade, doença cardiovascular, doença das artérias coronárias, entre outros distúrbios relacionados com metabolismo anormal ou não.

Numa forma de realização, a atividade ou expressão da apolipoproteína C-III num animal é inibida através de cerca de 10%. De preferência, a atividade ou expressão de apolipoproteína C-III num animal é inibida em cerca de 30%.

De maior preferência, a atividade ou expressão de apolipoproteina C-III num animal é inibida em 50% ou mais. Assim, os compostos oligoméricos modulam a expressão do ARNm de apolipoproteina C-III em pelo menos 10%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos 30%, em pelo menos 40%, em pelo menos 50%, em pelo menos 60%, em pelo menos 70%, em pelo menos 75%, em pelo menos 80%, em pelo menos 85%, em pelo menos 90%, em pelo menos 95%, em pelo menos 98%, em pelo menos 99%, ou em 100%.

Por exemplo, a redução da expressão de apolipoproteina C-III pode ser medida no soro, tecido adiposo, fígado ou qualquer outro fluido corporal, tecido ou órgão do animal. De preferência, as células contidas no interior dos referidos fluidos, tecidos ou órgãos a analisar contêm uma molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteina C-III e/ou apolipoproteina C-III.

Os compostos aqui divulgados podem ser utilizados em composições farmacêuticas através da adição de uma quantidade eficaz de um composto com um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável adequado. A utilização dos compostos e métodos aqui divulgados podem também ser úteis profilaticamente. F. Modificações

Tal como é conhecido na técnica, um nucleósido é uma combinação base-açúcar. A porção base do nucleósido é normalmente uma base heterocíclica. As duas classes mais comuns de tais bases heterociclicas são as purinas e pirimidinas. Os nucleótidos são nucleósidos que incluem ainda um grupo fosfato ligado covalentemente à porção açúcar do nucleósido. Para os nucleósidos que incluem um açúcar pentofuranosilo, o grupo fosfato pode ser ligado a qualquer uma das porções 2', 3' ou 5'-hidroxilo do açúcar. Em oligonucleótidos em formação, os grupos fosfato ligam de forma covalente nucleósidos adjacentes uns aos outros para formar um composto polimérico linear. Por sua vez, as respetivas extremidades deste composto polimérico linear podem ser unidas para formar um composto circular, no entanto, os compostos lineares são geralmente preferidos. Além disso, os compostos lineares podem ter complementaridade interna de nucleobases e podem portanto dobrar-se de maneira a produzir um composto de cadeia totalmente ou parcialmente dupla. Dentro dos oligonucleótidos, os grupos fosfato são vulgarmente referidos como formando um esqueleto internucleosidico do oligonucleótido. A ligação normal ou esqueleto de ARN e ADN é uma ligação fosfodiéster de 3' para 5'.

Ligações Internucleosídicas Modificadas (Esqueletos)

Exemplos específicos de compostos antissentido preferidos úteis nesta invenção incluem oligonucleótidos contendo esqueletos modificados ou ligações internucleosídicas não naturais. Tal como definido nesta descrição, oligonucleótidos possuindo esqueletos modificados incluem aqueles que retêm um átomo de fósforo no esqueleto e aqueles que não possuem um átomo de fósforo no esqueleto. Para os fins desta descrição, e como por vezes referenciado na técnica, oligonucleótidos modificados que não têm um átomo de fósforo no seu esqueleto internucleosidico podem também ser considerados ser oligonucleósidos.

Esqueletos oligonucleotídicos modificados preferidos contendo um átomo de fósforo neles incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo e de outros alquilos incluindo fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'-aminofosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos e boranofosfatos possuindo ligações 3 '-5 ' normais, análogos destes ligados em 2'-5', e aqueles possuindo polaridade invertida em que uma ou mais ligações internucleotídicas são uma ligação 3' a 3', 5' a 5' ou 2' a 2' . Oligonucleótidos preferidos possuindo polaridade invertida compreendem uma única ligação 3' a 3' na ligação internucleotídica mais 3', i.e. um único resíduo de nucleósido invertido, que pode ser não básico (a nucleobase está ausente ou possui um grupo hidroxilo no seu lugar). Vários sais, sais mistos e formas de ácidos livres são também incluídos.

Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, mas não se limitam a, Patentes U.S. Nos.: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 e 5,625,050, algumas das quais são de propriedade comum com o presente pedido.

Esqueletos de oligonucleótidos modificados preferidos que não incluem um átomo de fósforo neles têm esqueletos que são formados por ligações internucleosídicas alquilo ou cicloalquilo de cadeia curta, ligações internucleosídicas de heteroátomos mistos e alquilo ou cicloalquilo, ou uma ou mais ligações internucleosídicas heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estes incluem aqueles possuindo ligações morfolino (formadas em parte a partir da porção açúcar de um nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfureto, sulfóxido e sulfona; esqueletos de formacetilo e tioformacetilo; esqueletos de formacetilo e tioformacetilo de metileno; esqueletos de riboacetilo; esqueletos contendo alceno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenoimino e metileno-hidrazino; esqueletos de sulfonato e sulfonamida; esqueletos de amida; e outros possuindo partes componentes N, 0, S e CH2 mistas.

Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação dos oligonucleósidos acima incluem, mas não se limitam a, Patentes U.S. Nos.: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 e 5,677,439, algumas das quais são de propriedade comum com o presente pedido.

Miméticos de Ligações de Açúcares Modificados e Internucleosídicas

Noutros miméticos de oligonucleótidos preferidos, tanto a ligação do açúcar como a internucleosídica (i.e. o esqueleto), das unidades nucleotídicas são substituídos com novos grupos. As unidades de nucleobases são mantidas para hibridação com um ácido nucleico alvo apropriado. Um tal composto, um mimético de oligonucleótido que se mostrou ter excelentes propriedades de hibridação, é referido como um ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos PNA, o açúcar-esqueleto de um oligonucleótido é substituído com um esqueleto contendo amida, em particular um esqueleto de aminoetilglicina. As nucleobases são mantidas e são ligadas diretamente ou indiretamente a átomos de azoto aza da porção amida do esqueleto. Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos.: 5,539,082; 5,714,331; e 5,719,262. Mais ensinamentos sobre compostos PNA podem ser encontrados em Nielsen et ai., Science, 1991, 254, 1497-1500.

Formas de realização preferidas da divulgação são oligonucleótidos com esqueletos de fosforotioato e oligonucleósidos com esqueletos de heteroátomos, e em particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N (CH3) -O-CH2- [conhecido como metileno (metilimino) ou esqueleto MMI], -CH2-O-N (CH3)-CH2-, -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2- e -O-N (CH3) -CH2-CH2- [em que o esqueleto de fosfodiéster nativo é representado como -O-P-0-CH2-] da Patente U.S. No. 5,489,677 acima referenciada, e os esqueletos de amida da Patente U.S. No. 5,602,240 acima referenciada. Também preferidos são oligonucleótidos possuindo as estruturas de esqueleto morfolino da Patente U.S. No. 5,034,506 acima referenciada. Açúcares Modificados

Os oligonucleótidos modificados podem também conter uma ou mais porções açúcar substituídas. Oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': OH; F; 0-, S-, ou N-alquilo; 0-, S-, ou N-alcenilo; 0-, S- ou N-alcinilo; ou O-alquil-O-alquilo, em que o alquilo, alcenilo e alcinilo podem ser alquilo Ci a Cio substituído ou não substituído ou alcenilo e alcinilo C2 a Cio. Particularmente preferidos são 0 [ (CH2) nO] mCH3, 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0 (CH2) nCH3, 0 (CH2) nONH2, e 0 (CH2) nON [ (CH2) nCH3] 2, em que nem são de 1 a cerca de 10. Outros oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': alquilo inferior Ci a Cio, alquilo inferior substituído, alcenilo, alcinilo, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo ou 0-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, 0CF3, S0CH3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo substituído, um grupo de clivagem de ARN, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleótido, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleótido, e outros substituintes possuindo propriedades semelhantes. Uma modificação preferida inclui 2'-metoxietoxilo (2'—0— CH2CH20CH3, também conhecida como 2'-0-(2-metoxietilo) ou 2'-M0E) (Martin et al. , Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) i.e., um grupo alcoxialcoxilo. Outra modificação preferida inclui 2'-dimetilaminooxietoxilo, i.e., um grupo 0 (CH2) 2ON (CH3) 2, também conhecido como 2'-DMA0E, tal como aqui descrito nos exemplos abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietoxilo (também conhecido na técnica como 2'-0-dimetil-amino-etoxi-etilo ou 2 ' -DMAE0E) , i.e., 2 ' -0-CH2-0-CH2-N (CH3) 2, também aqui descrito nos exemplos abaixo.

Outras modificações preferidas incluem 2'-metoxilo (2'—0— CH3) , 2 '-aminopropoxilo (2 '-OCH2CH2CH2NH2) , 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2 ' -0-alilo (2 ' -0-CH2-CH=CH2) e 2'-fluoro (2 ' -F) . A modificação em 2' pode estar na posição arabino (superior) ou ribo (inferior). Uma modificação 2 '-arabino preferida é 2'-F. Modificações semelhantes podem também ser feitas noutras posições no oligonucleótido, em particular a posição 3' do açúcar no nucleótido 3'-terminal ou nos oligonucleótidos ligados em 2'-5' e a posição 5' dos nucleótidos 5'-terminais. Os oligonucleótidos podem também ter miméticos de açúcar tais como porções ciclobutilo em vez do açúcar pentofuranosilo. Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificadas incluem, mas não se limitam a, Patentes U.S. Nos.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5, 627,053; 5, 639, 873; 5, 646, 265; 5, 658,873; 5, 670, 633; 5,792,747; e 5,700,920, algumas das quais são propriedade comum com o presente pedido.

Uma outra modificação preferida do açúcar inclui Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNA) em que o grupo 2'-hidroxilo está ligado ao átomo de carbono em 3' ou 4' do anel do açúcar, formando assim uma porção açúcar biciclica. A ligação é de preferência um grupo metileno (-CH2-)n ligando em ponte o átomo de oxigénio em 2' e o átomo de carbono em 4' em que n é 1 ou 2. Os LNA e a preparação destes são descritos nas Publicações de Patente Internacionais Nos. WO 98/39352 e WO 99/14226.

Nucleobases Naturais e Modificadas

Os oligonucleótidos podem também incluir modificações ou substituições de nucleobases (frequentemente referidas na técnica simplesmente como "bases"). Tal como aqui utilizado, nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G), e as bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) e uracilo (U) . As nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo e outros derivados alquilo de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquilo de adenina e guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracilo e citosina, 5-propinil(-C=c-CH3)uracilo e citosina e outros derivados alcinilo de bases de pirimidina, 6-azo-uracilo, citosina e timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo e outras adeninas e guaninas substituídas em 8, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo e outros uracilos e citosinas substituídos em 5, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7-desazaguanina e 7-desaza-adenina e 3-desazaguanina e 3-desaza-adenina. Outras nucleobases modificadas incluem pirimidinas tricíclicas tais como fenoxazina-citidina(1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina- citidina(lH-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), G-clamps tais como uma fenoxazina-citidina substituída (p. ex. 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol-citidina(2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindo1-citidina(H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Nucleobases modificadas podem também incluir aquelas em que a base purina ou pirimidina é substituída com outros heterociclos, por exemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Outras nucleobases incluem aquelas divulgadas na Patente dos Estados Unidos No. 3,687,808, aquelas divulgadas em "The Concise Enciclopédia Of Polimer Science and Engineering", páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas divulgadas por Englisch et ai., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, e aquelas divulgadas por Sanghvi, Y.S., Capítulo 15, "Antisense Research and Applications", páginas 289-302, Crooke, e Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algumas destas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos aqui divulgados. Estes incluem pirimidinas substituídas em 5, 6-azapirimidinas e purinas substituídas em N-2, N-6 e 0-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo e 5-propinilcitosina. Mostrou-se que as substituições de 5-metilcitosina aumentam a estabilidade do ácido nucleico dúplex em 0,6-l,2°C e são atualmente as substituições de bases preferidas, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietilo.

Patentes do Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de algumas das nucleobases modificadas acima observadas bem como de outras nucleobases modificadas incluem, mas não se limitam à acima observada Patente U.S. No. 3,687,808, bem como as Patentes U.S. Nos.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5, 645, 985; 5, 830, 653; 5,763,588; 6, 005, 096; e 5, 681, 941, algumas das quais são propriedade comum com o presente pedido, e a Patente U.S. No. 5,750,692, que é de propriedade comum com o presente pedido.

Conjugados

Outra modificação dos oligonucleótidos aqui divulgados envolve a ligação química ao oligonucleótido de uma ou mais porções ou conjugados que aumentam a atividade, distribuição celular ou tomada celular do oligonucleótido. Estas porções ou conjugados podem incluir grupos conjugados covalentemente ligados a grupos funcionais tais como grupos hidroxilo primários ou secundários. Grupos conjugados aqui divulgados incluem intercaladores, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietilenoglicóis, poliéteres, grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas dos oligómeros, e grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas de oligómeros. Grupos conjugados típicos incluem colesteróis, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes. Grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas, no contexto desta invenção, incluem grupos que melhoram a tomada, aumentam a resistência à degradação, e/ou reforçam a hibridação específica da sequência com o ácido nucleico alvo. Grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas, no contexto desta invenção, incluem grupos que melhoram a tomada, distribuição, metabolismo ou excreção dos compostos aqui divulgados. Grupos conjugados representativos são divulgados no Pedido de Patente Internacional PCT/US92/09196, apresentado a 23 de outubro de 1992, e Patente U.S. No. 6,287,860. Porções conjugadas incluem, mas não estão limitadas a porções lipídicas tais como uma porção colesterol, ácido eólico, um tioéter, p. ex., hexil-S-tritiltiol, um tiocolesterol, uma cadeia alifática, p. ex., resíduos dodecandiol ou undecilo, um fosfolípido, p. ex., di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamónio, uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol, ou ácido adamantanoacético, uma porção palmitilo, ou uma porção octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Os oligonucleótidos aqui divulgados podem também ser conjugados com fármacos ativos, por exemplo, aspirina, varfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S) -( + )-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triiodo-benzóico, ácido flufenâmico, ácido folínico, uma benzotiadiazida, clorotiazida, uma diazepina, indometicina, um barbiturato, uma cefalosporina, um fármaco sulfa, um antidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico. Os conjugados oligonucleótido-fármaco e a sua preparação são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 09/334,130 (apresentado a 15 de j unho de 19 9 9).

Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de oligonucleótidos incluem, mas não se limitam a, Patentes U.S. Nos.: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 e 5,688,941, algumas das quais são propriedade comum com o presente pedido.

Compostos Quiméricos Não é necessário que todas as posições num dado composto sejam modificadas uniformemente e, de facto, mais do que uma das modificações acima mencionadas podem ser incorporadas num único composto ou mesmo num único nucleósido num oligonucleótido.

São também aqui divulgados compostos antissentido que são compostos quiméricos. Compostos antissentido "quiméricos" ou "quimeras", no contexto da presente invenção, são compostos antissentido, particularmente oligonucleótidos, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma composta por pelo menos uma unidade monomérica, isto é, um nucleótido no caso de um composto oligonucleotidico. Estes oligonucleótidos contêm tipicamente pelo menos uma região em que o oligonucleótido é modificado de modo a conferir ao oligonucleótido maior resistência a degradação por nucleases, maior tomada celular, maior estabilidade e/ou maior afinidade de ligação para o ácido nucleico alvo. Uma região adicional do oligonucleótido pode servir como um substrato para enzimas capazes de clivar híbridos de ARN:ADN ou ARN:ARN. A título de exemplo, ARNAse H é uma endonuclease celular que cliva a cadeia de ARN de um dúplex de ARN:ADN. A ativação da ARNase H resulta, portanto, em clivagem do alvo de ARN, aumentando assim grandemente a eficiência da inibição medida por oligonucleótidos da expressão génica. A clivagem de híbridos de ARN:ARN pode, de um modo igual, ser alcançada através das ações de endorribonucleases, tais como ARNaseL que cliva tanto o ARN celular como o viral. A clivagem do alvo de ARN pode ser detetada rotineiramente através de eletroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridação de ácidos nucleicos associadas conhecidas na arte.

Numa forma de realização, oligonucleótidos quiméricos desejáveis têm 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região central consistindo em dez 2'-desoxinucleótidos, flanqueados em ambos os lados (sentidos 5' e 3') por cinco nucleótidos 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleosídicas são fosforotioato ao longo do oligonucleótido e todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Noutra forma de realização, certos oligonucleótidos quiméricos preferidos são aqueles divulgados nos Exemplos aqui. Oligonucleótidos quiméricos particularmente preferidos são os referidos como ISIS 304757, ISIS 304758, ISIS 304755, ISIS304800, e ISIS 304756.

Os compostos antissentido quiméricos podem ser formados como estruturas compósitas de dois ou mais oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos e/ou miméticos de oligonucleótidos tal como descrito acima. Tais compostos têm também sido referidos na técnica como híbridos ou gapmeros. Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais estruturas híbridas incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos.: 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; e 5,700,922, algumas das quais são propriedade comum com o presente pedido. G. Formulações

Os compostos aqui divulgados podem também ser misturados, encapsulados, conjugados ou de outro modo associados a outras moléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, tal como por exemplo, lipossomas, moléculas dirigidas a recetores, formulações orais, retais, tópicas ou outras, para auxiliar na tomada, distribuição e/ou absorção. Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais formulações auxiliares de tomada, distribuição e/ou absorção incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos.: 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; e 5,595,756.

Compostos antissentido aqui divulgados incluem quaisquer sais, ésteres, ou sais de tais ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro composto que, após administração a um animal, incluindo um humano, seja capaz de proporcionar (direta ou indiretamente) o metabolito biologicamente ativo ou resíduo deste. Por conseguinte, por exemplo, a divulgação é também desenhada para prófármacos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui divulgados, sais farmaceuticamente aceitáveis de tais prófármacos, e outros bioequivalentes. O termo "prófármaco" indica um agente terapêutico que é preparado numa forma inativa que é convertida numa forma ativa (i.e., fármaco) dentro do corpo ou das células deste através da ação de enzimas endógenas ou outros produtos químicos e/ou condições. Em particular, as versões prófármaco dos oligonucleótidos aqui divulgados são preparadas como derivados SATE [ (S-acetil-2-tioetil)fosfato] de acordo com os métodos divulgados na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 93/24510 para Gosselin et ai., publicada a 9 de dezembro de 1993, ou na Publicação de Patente Internacional No. WO 94/26764 e Patente U.S. No. 5,770,713 para Imbach et ai. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui divulgados: i.e., sais que retêm a atividade biológica desejada do composto parental e não conferem efeitos toxicológicos indesejáveis a estes. Para oligonucleótidos, exemplos preferidos de sais farmaceuticamente aceitáveis e suas utilizações são ainda descritos na Patente U.S. No. 6,287,860. A presente divulgação inclui também composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos antissentido aqui divulgados. As composições farmacêuticas aqui divulgadas podem ser administradas de várias maneiras dependendo de se é desejado tratamento local ou sistémico e da área a tratar. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e nas membranas mucosas, incluindo distribuição vaginal e retal), pulmonar, p. ex., através de inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo através de nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica), oral ou parentérica. A administração parentérica inclui injeção ou infusão intravenosa, intraarterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou administração intracraniana, p. ex., intratecal ou intraventricular. Crê-se que oligonucleótidos com pelo menos uma modificação de 2'-O-metoxietilo sejam particularmente úteis para administração oral. Composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos e pós. Transportadores farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos, luvas e semelhantes revestidos podem também ser úteis.

As formulações farmacêuticas aqui divulgadas, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem o passo de colocação em associação os ingredientes ativos com o ou os veículos farmacêuticos ou o ou os excipientes. Em geral, as formulações são preparadas colocando uniformemente e intimamente em associação os ingredientes ativos com veículos líquidos ou transportadores sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, moldando o produto.

As composições aqui divulgadas podem ser formuladas em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis, tais como, mas não se limitando a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas. As composições aqui divulgadas podem também ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem ainda conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode também conter estabilizantes.

As composições farmacêuticas aqui divulgadas incluem, mas não estão limitadas a, soluções, emulsões, espumas e formulações contendo lipossomas. As composições farmacêuticas e formulações aqui divulgadas podem compreender um ou mais estimuladores da penetração, transportadores, excipientes, ou outros ingredientes ativos ou inativos.

As emulsões são tipicamente sistemas heterogéneos de um liquido disperso noutro sob a forma de goticulas habitualmente excedendo 0,1 pm de diâmetro. As emulsões podem conter componentes adicionais para além das fases dispersas, e o fármaco ativo que pode estar presente como uma solução na fase aquosa, fase oleosa ou em si mesmo como uma fase separada. As microemulsões estão incluídas como uma forma de realização da presente divulgação. As emulsões e suas utilizações são bem conhecidas na técnica e são ainda descritas na Patente U.S. No. 6,287,860.

As formulações aqui divulgadas incluem formulações lipossómicas. Tal como aqui utilizado, o termo "lipossoma" significa uma vesícula composta por lípidos anfifílicos dispostos numa bicamada ou bicamadas esféricas. Os lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso que contém a composição a distribuir. Os lipossomas catiónicos são lipossomas com carga positiva, que se crê interagirem com moléculas de ADN com carga negativa para formar um complexo estável. Crê-se que lipossomas que são sensíveis ao pH ou com carga negativa aprisionam ADN em vez de se complexarem com ele. Tanto os lipossomas catiónicos como os não catiónicos foram usados para distribuir ADN a células.

Os lipossomas incluem também lipossomas "estequiometricamente estabilizados", um termo que, como aqui utilizado, se refere a lipossomas compreendendo um ou mais lipidos especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em maiores tempos de vida em circulação em relação a lipossomas sem tais lipidos especializados. Exemplos de lipossomas estequiometricamente estabilizados são aqueles em que parte da porção lipido formador de vesículas do lipossoma compreende um ou mais glicolípidos ou é derivado com um ou mais polímeros hidrófilos, tal como uma porção polietilenoglicol (PEG). Os lipossomas e suas utilizações são melhor descritos na Patente U.S. No. 6.287.860.

As formulações e composições farmacêuticas aqui divulgadas podem também incluir tensioativos. A utilização de tensioativos em produtos farmacológicos, em formulação e em emulsões é bem conhecida na técnica. Os tensioativos e suas utilizações são melhor descritos na Patente U.S. No. 6.287.860.

Numa forma de realização, a presente divulgação emprega vários estimuladores da penetração para afetar a distribuição eficiente de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Além de auxiliar a difusão de fármacos não lipofílicos através das membranas celulares, os estimuladores da penetração aumentam também a permeabilidade de fármacos lipofílicos. Os intensificadores da penetração podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco grandes categorias, isto é, agentes tensioativos, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensioativos não quelantes. Os estimuladores da penetração e suas utilizações são melhor descritos na Patente U.S. No. 6,287,860.

Um perito na técnica reconhecerá que as formulações são rotineiramente concebidas de acordo com o seu uso pretendido, isto é, a via de administração.

Formulações preferidas para administração tópica incluem aquelas em que os oligonucleótidos aqui divulgados estão em mistura com um agente de distribuição tópica tal como lipidos, lipossomas, ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos, esteroides, agentes quelantes e tensioativos. Lipidos e lipossomas preferidos incluem neutros (p. ex. dioleoilfosfatidil-DOPE-etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina-DMPC, distearolifosfatidilcolina) , negativos (p. ex. dimiristoilfosfatidilglicerol-DMPG) e catiónicos (p. ex. dioleoiltetrametilaminopropil-DOTAP e dioleoilfosfatidiletanolamina-DOTMA).

Para administração tópica ou outra, os oligonucleótidos aqui divulgados podem ser encapsulados dentro de lipossomas ou podem formar complexos com eles, em particular com lipossomas catiónicos. Alternativamente, os oligonucleótidos podem ser complexados com lipidos, em particular com lipidos catiónicos. Ácidos gordos e ésteres preferidos, sais farmaceuticamente aceitáveis destes, e suas utilizações são melhor descritos na Patente U.S. No. 6,287,860. As formulações tópicas são descritas em detalhe no Pedido de Patente U.S. No. 09/315,298, apresentado a 20 de maio 1999.

Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, micropartícuias, nanopartícuias, suspensões ou soluções em água ou em meios não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquetas, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsionantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes podem ser desejáveis. Formulações orais preferidas são aquelas em que os oligonucleótidos aqui divulgados são administrados em conjunto com um ou mais estimuladores de penetração, agentes tensioativos e quelantes. Tensioativos preferidos incluem ácidos gordos e/ou ésteres ou sais destes, ácidos biliares e/ou sais destes. Os ácidos biliares/sais e ácidos gordos preferidos e suas utilizações são descritos na Patente U.S. No. 6,287,860. São também preferidas combinações de estimuladores de penetração, por exemplo, ácidos gordos/sais em combinação com ácidos biliares/sais. Uma combinação particularmente preferida é o sal sódico do ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros estimuladores da penetração incluem o éter polioxietileno-9-laurílico, éter polioxietileno-20-cetílico. Os oligonucleótidos aqui divulgados podem ser distribuídos oralmente, na forma granular incluindo partículas secas pulverizadas, ou complexados para formar micro ou nanopartículas. Agentes de complexação de oligonucleótidos e suas utilizações são melhor descritos na Patente U.S. No. 6,287,860. Formulações orais para oligonucleótidos e sua preparação são descritas em detalhe no Pedido de Patente Publicado U.S. No. 2003/0040497 (27 de fevereiro de 2003) e seus pedidos mãe; Pedido de Patente Publicado U.S. No. 2003/0027780 (6 de fevereiro de 2003) e seus pedidos mãe; e Pedido de Patente U.S. No. 10/071,822, apresentado a 8 de fevereiro de 2002.

Composições e formulações para administração parentérica, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não limitados a, estimuladores de penetração, compostos transportadores e outros transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Certas formas de realização da divulgação proporcionam composições farmacêuticas contendo um ou mais compostos oligoméricos e um ou mais outros agentes quimioterapêuticos, que funcionam através de um mecanismo não antissentido. Exemplos de tais agentes quimioterapêuticos incluem, mas não se limitam a fármacos quimioterapêuticos de cancro, tais como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina-arabinósido, bis-cloroetilnitrosureia, bussulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclo-hexilnitrosureia, mostardas de azoto, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiureia, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecano, topotecano, gemcitabina, tenipósido, cisplatina e dietilstilbestrol (DES) . Quando utilizados com os compostos aqui divulgados, tais agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados individualmente (p. ex., 5-FU e oligonucleótido), sequencialmente (p. ex., 5-FU e oligonucleótido durante um período de tempo seguido de MTX e oligonucleótido) , ou em combinação com um ou mais outros desses agentes quimioterapêuticos (p. ex., 5-FU, MTX e oligonucleótido, ou 5-FU, radioterapia e oligonucleótido). Fármacos anti-inflamatórios, incluindo mas não limitados a fármacos anti-inflamatórios não esteroides e corticosteroides, e fármacos antivirais, incluindo mas limitados a ribivirina, vidarabina, aciclovir e ganciclovir, podem também ser combinados em composições aqui divulgadas. Combinações de compostos antissentido e outros fármacos não antissentido são também divulgadas. Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados em conjunto ou sequencialmente.

Noutra forma de realização relacionada, as composições aqui divulgadas podem conter um ou mais compostos antissentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a um primeiro ácido nucleico e um ou mais compostos antissentido adicionais dirigidos a um segundo alvo de ácido nucleico. Alternativamente, as composições aqui divulgadas podem conter dois ou mais compostos antissentido dirigidos a regiões diferentes do mesmo alvo de ácido nucleico. Numerosos exemplos de compostos antissentido são conhecidos na técnica. Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados em conjunto ou sequencialmente. H. Dosagem

Crê-se que a formulação de composições terapêuticas e sua subsequente administração (dosagem) estão dentro da perícia daqueles na técnica. A dosagem depende da gravidade e capacidade de resposta do estado de doença a tratar, com o curso de tratamento a durar de vários dias a vários meses, ou até que a cura se realize ou uma diminuição da doença seja alcançada. Esquemas de dosagem ótimos podem ser calculados a partir de medições de acumulação do fármaco no corpo do paciente. Os vulgares peritos podem facilmente determinar as dosagens ótimas, metodologias de dosagem e taxas de repetição. As dosagens ótimas podem variar dependendo da potência relativa de oligonucleótidos individuais e podem geralmente ser estimadas com base nas EC50 verificadas como sendo eficazes em modelos in vitro e animais in vivo. Em geral, a dosagem é de 0,01 yg a 100 g por kg de peso corporal, e pode ser dada uma vez ou mais diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. Os vulgares peritos na técnica podem facilmente estimar as taxas de repetição de dosagem com base nos tempos de residência medidos e concentrações do fármaco nos fluidos ou tecidos corporais. Após tratamento bem sucedido, pode ser desejável ter o paciente submetido a terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado de doença, em que o oligonucleótido é administrado em doses de manutenção, variando de 0,01 yg a 100 g por kg de peso corporal, de uma ou mais vezes diariamente a uma vez cada 20 anos.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com especificidade de acordo com algumas das suas formas de realização preferidas, os exemplos que se seguem servem apenas para ilustrar a invenção e não se destinam a limitar a mesma.

EXEMPLOS

Exemplos que não se relacionam diretamente com a invenção reivindicada são para comparação e ilustração.

Exemplo 1: Sintese de Fosforamidites de Nucleósidos

Os seguintes compostos, incluindo amidites e seus intermediários foram preparados tal é como descrito na Patente U.S. No. 6,426,220 e Publicação de Patente Internacional No. WO 02/36743; o intermediário 5'-0-Dimetoxitritil-timidina para amidite 5-metil-dC, o intermediário 5'-O-Dimetoxitritil-2'-desoxi-5-metilcitidina para amidite 5-metil-dC, o penúltimo intermediário 5'-0-Dimetoxitritil-2'-desoxi-N4-benzoil-5-metilcitidina para amidite 5-metil-dC, [5'-O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-2'-desoxi-N4-benzoil-5-metilcitidina-3'-O-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidite (amidite 5-metil-dC), amidites modificadas de 2'-Fluorodesoxiadenosina, 2'-

Fluorodesoxiguanosina, 2'-Fluorouridina, 2'-

Fluorodesoxicitidina, 2'-0-(2-Metoxietil), o intermediário 2'-0-(2-metoxietil)-5-metiluridina, o penúltimo intermediário 5'-O-DMT-2'-0-(2-metoxietil)-5-metiluridina, [5'-O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-2'-O-(2-metoxietil)-5-metiluridin-3 ' - O-il] -2-cianoetil-2\7, N- diisopropilfosforamidite (amidite M0E T) , o intermediário 5'-0-Dimetoxitritil-2'-0-(2-metoxietil)-5-metilcitidina, o penúltimo intermediário 5'-0-dimetoxitritil-2'-O-(2-metoxietil)-N4-benzoil-5-metil-citidina, [5'— O—(4,4' —

Dimetoxitrifenilmetil)-2'-O- (2-metoxietil)-N4-benzoil-5-metilcitidina-3 ' - O-il] - 2-cianoetil-2\7, N- diisopropilfosforamidite (amidite M0E 5-Me-C), [5'—O—(4,4' —

Dimetoxitrifenilmetil)-2'-0-(2-metoxietil)-N6-benzoiladenosin-3 ' -O-il] -2-cianoetil-W,i\7·- diisopropilfosforamidite (amidite M0E A), [5'— O—(4,4' —

Dimetoxitrifenilmetil)-2'-O-(2-metoxietil) -N4-isobutirilguanosin-3'-O-il]-2-cianoetil-W,W-diisopropilfosforamidite (amidite M0E G), amidites de 2'-O- (Aminoxietil)nucleósidos e amidites de 2'-0-(dimetilamino-oxietil)nucleósidos, amidites de 2'- (Dimetilaminoxietoxi)nucleósidos, 5'-0-terc-

Butildifenilsilil-02-2'-anidro-5-metiluridina, 5'-0-terc-

Butildifenilsilil-2'-0-(2-hidroxietil)-5-metiluridina, 2'-0-([2-ftalimidoxi)etil]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina, 5'-0-terc-butildifenilsilil-2'-0-[(2- formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina, 5'-0-terc-

Butildifenilsilil-2'-0-[N,N-dimetilaminoxietil]-5-metiluridina, 2'-0-(dimetilaminoxietil)-5-metiluridina, 5'-O-DMT-2'-0-(dimetilaminoxietil)-5-metiluridina, 5'-0-DMT-2'-0-(2-N,N-dimetilaminoxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidite], amidites de 2'-(Aminoxietoxi)nucleósidos, N2-isobutiril-6-0- difenilcarbamoil-2'-0-(2-etilacetil)-5'-0-(4,4'— dimetoxitritil) guanosina-3'-[ (2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidite], amidites de 2'- dimetilaminoetoxietoxi (2'-DMAEOE)nucleósidos, 2'-0-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metiluridina, 5'-0- dimetoxitritil-2'-0-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metiluridina e 5'-O-Dimetoxitritil-2'-0-[2(2-N,N- dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metiluridina-3'-0-(cianoetil-N,N-diisopropil)fosforamidite.

Exemplo 2: Síntese de oligonucleótidos e oligonucleósidos

Os compostos antissentido utilizados de acordo com esta invenção podem ser produzidos de forma conveniente e rotineira através da técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. 0 equipamento para tal síntese é vendido por vários fornecedores, incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA) . Qualquer outro meio para tal síntese conhecido na técnica pode adicionalmente ou alternativamente ser empregue. É bem conhecida a utilização de técnicas semelhantes para preparar oligonucleótidos tais como os fosforotioatos e derivados alquilados.

Oligonucleótidos: Oligonucleótidos fosfodiéster (P=0) não substituídos e substituídos são sintetizados num sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 394) utilizando química de fosforamidite padrão com oxidação por iodo.

Fosforotioatos (P=S) são sintetizados de forma semelhante a oligonucleótidos fosfodiéster com as seguintes exceções: a tiação foi realizada utilizando uma solução a 10% p/v de 1,1-dióxido de 3,H-l,2-benzoditiol-3-ona em acetonitrilo para a oxidação das ligações fosfito. O tempo do passo de reação de tiação foi aumentado para 180 s e precedido pelo passo normal de proteção. Após clivagem da coluna de CPG e desbloqueamento em hidróxido de amónio concentrado a 55 °C (12-16 h), os oligonucleótidos foram recuperados através de precipitação com >3 volumes de etanol a partir de uma solução de NH4OAC 1 M. Os oligonucleótidos fosfinato são preparados tal como descrito na Patente U.S. No. 5,508,270, aqui incorporada por referência.

Os oligonucleótidos fosfonato de alquilo são preparados tal como descrito na Patente U.S. No. 4,469,863.

Os oligonucleótidos fosfonato de 3'-desoxi-3'-metileno são preparados tal como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5,610,289 ou 5,625,050.

Os oligonucleótidos fosforamidite são preparados tal como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5,256,775 ou 5,366,878.

Os oligonucleótidos alquilfosfonotioato são preparados tal como descrito nos Pedidos de Patente Internacional Nos. PCT/US94/0 0 902 e PCT/US93/06976 (publicados como WO 94/17093 e WO 94/02499, respetivamente).

Os oligonucleótidos fosforamidato de 3'-desoxi-3'-amino são preparados tal como descrito na Patente U.S. No. 5,476,925.

Os oligonucleótidos fosfotriéster são preparados tal como descrito na Patente U.S. No. 5,023,243.

Os oligonucleótidos fosfato de borano são preparados tal como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5,130,302 e 5,177,198.

Oligonucleósidos: oligonucleósidos ligados a metilenometilimino, também identificados como oligonucleósidos ligados a MMI, oligonucleósidos ligados a metilenodimetil-hidrazo, também identificados como oligonucleósidos ligados a MDH, e oligonucleósidos ligados a metilenocarbonilamino, também identificados como oligonucleósidos ligados a amida-3, e oligonucleósidos ligados a metilenoaminocarbonilo, também identificados como oligonucleósidos ligados a amida-4, bem como compostos de esqueleto misto possuindo, por exemplo, ligações alternadas MMI e P=0 ou P=S são preparados tal como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 5,602,240 e 5,610,289.

Os oligonucleósidos ligados a formacetal e tioformacetal são preparados tal como é descrito nas Patentes U.S. Nos. 5,264,562 e 5,264,564.

Os oligonucleósidos ligados a óxido de etileno são preparados tal é como descrito na Patente U.S. No. 5,223,618.

Exemplo 3: Sintese de ARN

Em geral, a química de síntese de ARN baseia-se na incorporação seletiva de vários grupos protetores em reações intermediárias estratégicas. Embora um vulgar perito na técnica compreenda a utilização de grupos protetores em síntese orgânica, uma classe útil de grupos de proteção inclui éteres de sililo. Em particular, são utilizados éteres de sililo volumosos para proteger o 5'-hidroxilo em combinação com um grupo protetor ortoéster sensível a ácido no 2'-hidroxilo. Este conjunto de grupos de proteção é em seguida utilizado com tecnologia padrão de síntese em fase sólida. É importante remover por último o grupo protetor ortoéster sensível a ácido após todos os outros passos de síntese. Além disso, o uso precoce dos grupos de proteção sililo durante a síntese garante remoção fácil quando desejada, sem desproteção indesejada do 2'-hidroxilo.

Após este procedimento para a proteção sequencial do 5' -hidroxilo em combinação com a proteção do 2'-hidroxilo por grupos protetores que são diferencialmente removidos e são diferencialmente lábeis quimicamente, foram sintetizados oligonucleótidos de ARN.

Os oligonucleótidos de ARN são sintetizados de um modo passo-a-passo. Cada nucleótido é adicionado sequencialmente (sentido 3' para 5') a um oligonucleótido ligado ao suporte sólido. 0 primeiro nucleósido na extremidade 3' da cadeia é ligado covalentemente a um suporte sólido. 0 precursor de nucleótido, uma fosforamidite de ribonucleósido, e o ativador são adicionados, acoplando-se a segunda base à extremidade 5' do primeiro nucleósido. 0 suporte é lavado e quaisquer grupos 5'-hidroxilo que não reagiram são protegidos com anidrido acético para produzir porções 5'-acetilo. A ligação é então oxidada para a ligação mais estável e por fim desejada P (V). No final do ciclo de adição de nucleótidos, o grupo 5'-sililo é clivado com fluoreto. 0 ciclo é repetido para cada nucleótido subsequente.

Após a sintese, os grupos de proteção metilo nos fosfatos são clivados em 30 minutos utilizando tri-hidrato de dissódio-2-carbamoil-2-cianoetileno-l,1-ditiolato (S2Na2) 1 M em DMF. A solução de desproteção é lavada a partir do oligonucleótido ligado ao suporte sólido usando água. O suporte é então tratado com metilamina a 40% em água durante 10 minutos a 55°C. Isto liberta os oligonucleótidos de ARN em solução, desprotege as aminas exociclicas, e modifica os grupos 2'-. Os oligonucleótidos podem ser analisados através de HPLC de permuta aniónica nesta fase.

Os grupos 2'-ortoéster são os últimos grupos de proteção a serem removidos. O grupo protetor ortoéster monoacetato de etilenoglicol desenvolvido por Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO) , é um exemplo de um grupo de proteção ortoéster útil, que tem as seguintes propriedades importantes. É estável nas condições de sintese de fosforamidite de nucleósidos e sintese de oligonucleótidos. No entanto, após a sintese de oligonucleótidos o oligonucleótido é tratado com metilamina, que não só cliva o oligonucleótido do suporte sólido como também remove os grupos acetilo dos ortoésteres. Os substituintes 2-etil-hidroxilo resultantes no ortoéster são menos removedores de eletrões que o precursor acetilado. Como resultado, o ortoéster modificado torna-se mais lábil a hidrólise catalisada por ácido. Especificamente, a velocidade de clivagem é aproximadamente 10 vezes mais rápida após os grupos acetilo serem removidos. Portanto, este ortoéster possui estabilidade suficiente para ser compatível com a síntese de oligonucleótidos e ainda, quando subsequentemente modificado, permite que a desproteção seja realizada sob condições aquosas relativamente suaves compatíveis com o produto oligonucleótido de ARN final.

Além disso, métodos de síntese de ARN são bem conhecidos na técnica (Scaringe, S. A. "Ph.D. Thesis, University of Colorado", 1996; Scaringe, S. A., et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M. D. e Caruthers, Μ. H. J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 3185-3191; Beaucage, S. L. e Caruthers, Μ. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J., et al., Acta Chem. Scand., 1990, 44, 639-641; Reddy, Μ. P., et al. , Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F. et al., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin, B. E., et al. , Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331).

Compostos antissentido de ARN (oligonucleótidos de ARN) podem ser sintetizados através dos métodos aqui ou adquiridos a Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO) . Uma vez sintetizados, os compostos antissentido complementares de ARN podem então ser ligados através de métodos conhecidos na técnica para formarem compostos antissentido de cadeia dupla (dúplexes). Por exemplo, os dúplexes podem ser formados através da combinação de 30 pL de cada uma das cadeias complementares de oligonucleótidos de ARN (solução de oligonucleótido de ARN 50 μΜ) e 15 pL de tampão de ligação 5χ (acetato de potássio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM pH 7,4, acetato de magnésio 2 mM) seguido de aguecimento durante 1 minuto a 90°C, depois 1 hora a 37°C. Os compostos antissentido em dúplex resultantes podem ser utilizados em estojos, ensaios, pesguisas, ou outros métodos para investigar o papel de um ácido nucleico alvo.

Exemplo 4: Sintese de Oligonucleótidos Quiméricos

Oligonucleótidos, oligonucleósidos ou oligonucleótidos/oligonucleósidos mistos guiméricos podem ser de vários tipos diferentes. Estes incluem um primeiro tipo em gue o segmento "gap" ("intervalo") de nucleósidos ligados é posicionado entre os segmentos 5' e 3' "wing" ("asa") de nucleósidos ligados e um segundo tipo "open end" ("extremidade aberta") em gue o segmento "gap" se localiza num dos terminais 3' ou 5' do composto oligomérico. Os oligonucleótidos do primeiro tipo são também conhecidos na técnica como "gapmeros" ou oligonucleótidos gapped. Os oligonucleótidos do segundo tipo são também conhecidos na técnica como "hemímeros" ou "wingmeros".

Oligonucleótidos Fosforotioato Quiméricos [2'-0-Me]--[2'-desoxi]--[2'-O-Me]

Oligonucleótidos guiméricos possuindo segmentos oligonucleotidicos fosforotioato de 2'-O-alguilo e 2'-desoxifosforotioato são sintetizados utilizando um sintetizador de ADN automático Applied Biosystems Modelo 394, tal como acima. Os oligonucleótidos são sintetizados usando o sintetizador automático e 2'-desoxi-5'-dimetoxitritil-3 ' -O-f osf oramidite para a porção de ADN e 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforoamidite para as asas 5' e 3'. 0 ciclo de síntese padrão é modificado através da incorporação de passos de acoplamento com aumento dos tempos de reação para a 5'-dimetoxitritil-2'-0-metil-3'-0-fosforamidite. 0 oligonucleótido completamente protegido é clivado do suporte e desprotegido em amónia concentrada (NH4OH) durante 12-16 h a 55°C. 0 oligo desprotegido é então recuperado através de um método apropriado (precipitação, cromatografia em coluna, volume reduzido in vacuo e analisado espectrofotometricamente quanto ao rendimento e à pureza através de eletroforese capilar e através de espectrometria de massa.

Oligonucleótidos Fosforotioato Quiméricos [2'-0-(2-Metoxietil)]—[2'-desoxi]--[2'-0-(Metoxietilo)]

Oligonucleótidos fosforotioato quiméricos [2'-0-(2-metoxietil)]--[2'-desoxi]--[-2'-0-(metoxietilo)] foram preparados de acordo com o procedimento acima para o oligonucleótido quimérico 2'-0-metilo, com a substituição por 2'-0-(metoxietil)amidites das 2'-O-metilamidites.

Oligonucleótidos Quiméricos [Fosfodiéster de 2'-O-(2-Metoxietilo)]--[Fosforotioato 2'-desoxi]--[Fosfodiéster de 2'-O-(2-Metoxietilo)]

Os oligonucleótidos quiméricos [fosfodiéster de 21—0— (2 — metoxietil]--[fosforotioato 2 '-desoxi]--[fosfodiéster de 2'-0-(metoxietilo) ] são preparados de acordo com o procedimento acima para o oligonucleótido quimérico 2 ' -0-metilo com a substituição para 2'-0-(metoxietil)amidites das 2'-O-metilamidites, oxidação com iodo para gerar as ligações internucleotídicas fosfodiéster no interior das porções asa das estruturas quiméricas e sulfuração usando 1,1-dióxido de 3,H-l,2-benzoditiol-3-ona (Reagente Beaucage) para gerar as ligações internucleotídicas fosforotioato para o gap central.

Outros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos e oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos mistos são sintetizados de acordo com a Patente dos Estados Unidos No. 5,623,065.

Exemplo 5: Desenho e pesquisa de compostos antlssentldo em dúplex dirigidos para a apolipoproteína C-III

Uma série de dúplexes de ácidos nucleicos compreendendo os compostos antissentido da presente divulgação e seus complementos são desenhados para atingir a apolipoproteína C-III. A sequência de nucleobases da cadeia antissentido do dúplex compreende pelo menos uma porção de um oligonucleótido na Tabela 1. As extremidades das cadeias podem ser modificadas através da adição de uma ou mais nucleobases naturais ou modificadas para formar uma saliência. A cadeia com sentido do ARNcd é então concebida e sintetizada como o complemento da cadeia antissentido e pode também conter modificações ou adições em qualquer um dos terminais. Por exemplo, numa forma de realização, ambas as cadeias do dúplex de ARNcd serão complementares ao longo das nucleobases centrais, cada uma possuindo saliências num ou em ambos os terminais.

Por exemplo, um dúplex compreendendo uma cadeia antissentido possuindo a sequência CGAGAGGCGGACGGGACCG (SEQ ID NO: 465) e possuindo uma saliência de duas nucleobases de desoxitimidina (dT) teria a seguinte estrutura (Antissentido SEQ ID NO: 466, Complemento SEQ ID NO: 467):

Cadeia Antissentido Complemento

Noutra forma de realização, um dúplex compreendendo uma cadeia antissentido possuindo a mesma sequência CGAGAGGCGGACGGGACCG (SEQ ID NO: 465) pode ser preparado com extremidades cegas (sem nenhuma saliência de cadeia simples), tal como mostrado (Antissentido SEQ ID NO: 465,

Complemento SEQ ID NO: 468) :

Cadeia Antissentido Complemento

As cadeias de ARN do dúplex podem ser sintetizadas através de métodos aqui divulgados ou adquiridas em Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO) . Uma vez sintetizadas, as cadeias complementares são ligadas. As cadeias simples são divididas em alíquotas e diluídas para uma concentração de 50 μΜ. Uma vez diluídas, 30 pL de cada cadeia são combinados com 15 pL de uma solução 5χ de tampão de ligação. A concentração final do referido tampão é acetato de potássio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, e acetato de magnésio 2 mM. 0 volume final é de 75 pL. Esta solução é incubada durante 1 minuto a 90 °C e depois centrifugada durante 15 segundos. O tubo é deixado assentar durante 1 hora a 37 °C tempo ao qual os dúplexes de ARNcd são utilizados em experimentação. A concentração final do dúplex de ARNcd é de 20 pM. Esta solução pode ser armazenada congelada (-20°C) e congelada-descongelada até 5 vezes.

Uma vez preparados, os compostos antissentido em dúplex são avaliados quanto à sua capacidade para modular a expressão da apolipoproteína C-III.

Quando as células atingem 80% de confluência, são tratadas com compostos antissentido em dúplex tal como aqui divulgado. Para células cultivadas em placas de 96 poços, os poços são lavados uma vez com 200 pL de meio OPTI-MEM-l™ de soro reduzido (Gibco BRL) e depois tratados com 130 pL de meio OPTI-MEM-1” contendo reagente LIPOFECTIN” (Gibco BRL) a 12 pg/mL e o composto antissentido dúplex desejado a uma concentração final de 200 nM. Após 5 horas de tratamento, o meio é substituído com meio fresco. As células são colhidas 16 horas após o tratamento, momento ao qual o ARN é isolado e a redução do alvo é medida através de RT-PCR.

Exemplo 6: Isolamento dos Ollgonucleótldos

Após clivagem do suporte sólido de vidro de poro controlado e desbloqueamento em hidróxido de amónio concentrado a 55°C durante 12-16 horas, os oligonucleótidos ou oligonucleósidos são recuperados através de precipitação com N+UOAc 1 M com >3 volumes de etanol. Os oligonucleótidos sintetizados foram analisados através de espectroscopia de massa por eletrovaporização (determinação do peso molecular) e através de eletroforese em gel capilar e considerados serem pelo menos 70% de material inteiro. As quantidades relativas de ligações fosforotioato e fosfodiéster obtidas na síntese foram determinadas através da razão do peso molecular correto relativamente ao produto -16 amu (+/-32 +/-48). Para alguns estudos os oligonucleótidos foram purificados através de HPLC, tal como descrito por Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Os resultados obtidos com material purificado por HPLC eram semelhantes aos obtidos com material não purificado por HPLC.

Exemplo 7: Sintese de Oligonucleótidos - Formato de Placa de 96 Poços

Os oligonucleótidos foram sintetizados através de química de fosforamidite em fase sólida P(III) num sintetizador automático capaz de montar 96 sequências simultaneamente num formato de 96 poços. Ligações internucleotídicas fosfodiéster foram proporcionadas através de oxidação com iodo aquoso. Ligações internucleotídicas fosforotioato foram geradas através de sulfurização utilizando 1,1-dióxido de 3, H-l,2-benzoditiol-3-ona (Reagente Beaucage) em acetonitrilo anidro. Beta-cianoetildiisopropil- fosforamidites padrão com bases protegidas foram adquiridas a fornecedores comerciais (p. ex. PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, ou Pharmacia, Piscataway, NJ). Nucleósidos não padrão são sintetizados de acordo com métodos padrão ou patenteados. São utilizados como beta-cianoetildiisopropil-fosforamidites com bases protegidas.

Os oligonucleótidos foram clivados do suporte e desprotegidos com NH4OH concentrado a temperatura elevada (55-60°C) durante 12-16 horas e o produto libertado foi então seco in vacuo. 0 produto seco foi então ressuspenso em água estéril para se obter uma placa-mãe a partir da qual todas as amostras analíticas e de placas de teste são então diluídas utilizando pipetadores robóticos.

Exemplo 8: Análise dos Oligonucleótidos - Formato de Placa de 96 Poços A concentração do oligonucleótido em cada poço foi avaliada através de diluição das amostras e espectroscopia de absorção de UV. A integridade dos produtos individuais inteiros foi avaliada através de eletroforese capilar (CE), ou no formato de 96 poços (aparelho Beckman P/ACE”MDQ) ou para amostras preparadas individualmente, num aparelho de CE comercial (p. ex., Beckman P/ACE™ 5000, aparelho ABI 270). A composição de bases e esqueleto foi confirmada através de análise de massa dos compostos utilizando espectroscopia de massa de eletrovaporização. Todas as placas de ensaio de teste foram diluídas a partir da placa-mãe utilizando pipetadores robóticos de canal único ou múltiplo. As placas foram julgadas como sendo aceitáveis se pelo menos 85% dos compostos na placa fossem pelo menos 85% inteiros.

Exemplo 9: Cultura celular e tratamento com oligonucleótidos O efeito dos compostos antissentido na expressão do ácido nucleico alvo pode ser testado em qualquer um de uma variedade de tipos celulares desde que o ácido nucleico alvo esteja presente a níveis mensuráveis. Isto pode ser determinado rotineiramente utilizando, por exemplo, PCR ou análise Northern blot. Os seguintes tipos celulares são proporcionados para fins ilustrativos, mas outros tipos celulares podem ser utilizados rotineiramente, desde que o alvo seja expresso no tipo celular escolhido. Isto pode ser facilmente determinado através de métodos de rotina na técnica, por exemplo análise Northern blot, ensaios de proteção de ribonucleases, ou RT-PCR. Células T-24: A linha celular de carcinoma humano da bexiga de células de transição T-24 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) . As células T-24 foram cultivadas rotineiramente em meio basal 5A de McCoy completo (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) suplementado com soro fetal de vitelo a 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) , penicilina a 100 unidades por mL, e estreptomicina a 100 microgramas por mL (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) . As células foram rotineiramente passadas através de tripsinização e diluição quando alcançaram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 96 poços (Falcon-Primaria #353872) a uma densidade de 7000 células/poço para utilização em análise de RT-PCR.

Para Northern blotting ou outras análises, as células podem ser semeadas em placas de cultura de tecido padrão de 100 mm ou outras e tratadas de forma semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido. Células A549: A linha celular de carcinoma do pulmão humano A549 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) . As células A549 foram rotineiramente cultivadas em meio basal DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) suplementado com soro fetal de vitelo a 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), penicilina a 100 unidades por mL, e estreptomicina a 100 microgramas por mL (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). As células foram passadas rotineiramente através de tripsinização e diluição quando alcançaram 90% de confluência. Células NHDF:

Fibroblastos dérmicos neonatais humanos (NHDF) foram obtidos a partir de Clonetics Corporation (Walkersville, MD) . Os NHDF foram rotineiramente mantidos em Meio de Crescimento de Fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) suplementado tal como recomendado pelo fornecedor. As células foram mantidas durante até 10 passagens tal como recomendado pelo fornecedor. Células HEK:

Queratinócitos embrionários humanos (HEK) foram obtidos a partir de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). As HEK foram rotineiramente mantidas em Meio de Crescimento de Queratinócitos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) , formulado tal como recomendado pelo fornecedor. As células foram mantidas rotineiramente durante até 10 passagens tal como recomendado pelo fornecedor. Células HepG2: A linha celular de hepatoblastoma humano HepG2 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células HepG2 foram rotineiramente cultivadas em MEM de Eagle suplementado com soro fetal de vitelo a 10%, aminoácidos não essenciais, e piruvato de sódio 1 mM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). As células foram rotineiramente passadas através de tripsinização e diluição quando alcançaram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 96 poços (Falcon-Primaria #3872) a uma densidade de 7000 células/poço para utilização em análise de RT-PCR.

Para Northern blotting ou outras análises, as células podem ser semeadas em placas de cultura de tecido padrão de 100 mm ou outras e tratadas de forma semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido. Células Hep3B: A linha celular de carcinoma hepatocelular humano Hep3B foi obtida a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células Hep3B foram rotineiramente cultivadas em MEM de Dulbeccos rico em glicose suplementado com soro fetal de vitelo a 10%, L-glutamina e cloridrato de piridoxina (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). As células foram rotineiramente passadas através de tripsinização e diluição quando alcançaram 90% de confluência. As células foram semeadas em placas de 24 poços (Falcon-Primaria #3846) a uma densidade de 50000 células/poço para utilização em análise de RT-PCR.

Para Northern blotting ou outras análises, as células podem ser semeadas em placas de cultura de tecido padrão de 100 mm ou outras e tratadas de forma semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido.

Hepatócitos primários de ratinho:

Hepatócitos primários de ratinho foram preparados a partir de ratinhos CD-I adquiridos a Charles River Labs (Wilmington, MA) e foram rotineiramente cultivados em DMEM, rico em glicose (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), 100 unidades por ml de penicilina, e 100 microgramas por ml de estreptomicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) . As células foram cultivadas até 80% de confluência para utilização em experiências de transfeção de oligonucleótidos antissentido.

Para Northern blotting ou outras análises, as células podem ser semeadas em placas de cultura de tecido padrão de 100 mm ou outras e tratadas de forma semelhante, utilizando volumes apropriados de meio e oligonucleótido.

Hepatócitos primários de rato:

Hepatócitos primários de rato foram preparados a partir de ratos Sprague-Dawley adquiridos a Charles River Labs (Wilmington, MA) e foram rotineiramente cultivados em DMEM, rico em glicose (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), 100 unidades por mL de penicilina, e 100 microgramas por mL de estreptomicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). As células foram cultivadas até 80% de confluência para utilização em experiências de transfeção de oligonucleótidos antissentido.

Tratamento com compostos antissentido:

Quando as células alcançavam 65-75% de confluência, eram tratadas com oligonucleótido. Para células cultivadas em placas de 96 poços, os poços foram lavados uma vez com 100 pL de meio OPTI-MEM”-l de soro reduzido (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e depois tratadas com 130 pL de meio OPTI-MEM™-1 contendo reagente LIPOFECTIN™ a 3,75 pg/mL (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e a concentração desejada de oligonucleótido. As células são tratadas e os dados são obtidos em triplicado. Após 4-7 horas de tratamento a 37°C, o meio foi substituído com meio fresco. As células foram colhidas 16-24 horas após o tratamento com oligonucleótido. A concentração de oligonucleótido utilizado varia de linha celular para linha celular. Para determinar a concentração de oligonucleótido ótima para uma determinada linha celular, as células são tratadas com um oligonucleótido de controlo positivo a uma variedade de concentrações. Para células humanas o oligonucleótido de controlo positivo é selecionado a partir de ISIS 13920 (TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, SEQ ID NO: 1) que é dirigido para H-ras humana, ou ISIS 18078, (GTGCGCGCGAGCCCGAAATC, SEQ ID NO: 2) que é dirigido para a cinase-2 Jun-N-terminal (JNK2) humana. Ambos os controlos são gapmeros 2'-O-metoxietilo (2'-O-metoxietilos mostrados a negrito) com um esqueleto fosforotioato. Para as células de ratinho ou rato o oligonucleótido de controlo positivo é ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEQ ID NO: 3, um gapmero 2'-O-metoxietilo (2'-O-metoxietilos mostrados a negrito) com um esqueleto fosforotioato que é dirigido a c-raf tanto de ratinho como de rato. A concentração de oligonucleótido de controlo positivo que resulta em 80% de inibição de ARNm de c-H-ras (para ISIS 13920), JNK2 (para ISIS 18078) ou c-raf (para ISIS 15770) é então utilizada como a concentração de pesquisa para novos oligonucleótidos em experiências subsequentes para essa linha celular. Se não for alcançada 80% da inibição, a menor concentração de oligonucleótido de controlo positivo que resulte em 60% de inibição de ARNm de c-H-ras, JNK2 ou c-raf é então utilizada como a concentração de pesquisa de oligonucleótidos em experiências subsequentes para essa linha celular. Se não for alcançada 60% de inibição, essa linha celular particular é considerada inadequada para experiências de transfeção de oligonucleótidos. As concentrações de oligonucleótidos antissentido aqui usadas são de 50 nM a 300 nM.

Exemplo 10: Análise da inibição por oligonucleótidos da

expressão de apolipoproteína C-III A modulação antissentido da expressão da apolipoproteína C-III pode ser ensaiada numa variedade de formas conhecidas na técnica. Por exemplo, os níveis de ARNm de apolipoproteína C-III podem ser quantificados através, p. ex., de análise Northern blot, reação em cadeia da polimerase (PCR) competitiva, ou PCR em tempo real (RT-PCR) . A PCR quantitativa em tempo real é presentemente preferida. A análise de ARN pode ser realizada em ARN celular total ou ARNm poli(A)+. O método preferido de análise do ARN da presente invenção é a utilização de ARN celular total tal como descrito noutros exemplos aqui. Os métodos de isolamento de ARN são bem conhecidos na técnica. A análise Northern blot é também rotina na técnica. A (PCR) quantitativa em tempo real pode ser convenientemente realizada utilizando o Sistema de Deteção de Sequências comercialmente disponível ABI PRISM™ 7600, 7700, ou 7900, disponível em PE-Applied

Biosystems, Foster City, CA e utilizado de acordo com as instruções do fabricante.

Os níveis proteicos da apolipoproteína C-III podem ser quantificados numa variedade de modos bem conhecidos na técnica, tais como imunoprecipitação, análise Western blot (imunotransferência) , ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ou separação de células ativada por fluorescência (FACS). Os anticorpos dirigidos para a apolipoproteína C-III podem ser identificados e obtidos a partir de uma variedade de fontes, tais como o catálogo de anticorpos de MSRS (Aerie

Corporation, Birmingham, MI) ou podem ser preparados através de métodos convencionais de geração de anticorpos monoclonais ou policlonais bem conhecidos na técnica.

Exemplo 11: Desenho de ensaios fenotipicos e estudos in vivo para a utilização de inibidores de apolipoproteína C-III

Ensaios fenotipicos

Uma vez identificados os inibidores da apolipoproteína C-III através dos métodos aqui divulgados, os compostos são melhor investigados num ou mais ensaios fenotipicos, cada um possuindo pontos finais quantificáveis preditivos da eficácia no tratamento de um determinado estado de doença ou condição. Ensaios fenotipicos, estojos e reagentes para a sua utilização são bem conhecidos dos peritos na técnica e são aqui utilizados para investigar o papel e/ou a associação da apolipoproteína C-III na saúde e na doença. Ensaios fenotipicos representativos, que podem ser adquiridos a qualquer um de vários fornecedores comerciais, incluem aqueles para determinação da viabilidade celular, citotoxicidade, proliferação ou sobrevivência celular (Molecular Probes, Eugene, OR; PerkinElmer, Boston, MA) , ensaios baseados em proteínas incluindo ensaios enzimáticos (Panvera, LLC, Madison, WI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ; Oncogene Research Products, San Diego, CA) , regulação celular, transdução de sinal, inflamação, processos oxidativos e apoptose (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI), acumulação de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ensaios de angiogénese, ensaios de formação de tubos, ensaios de citocinas e hormonas e ensaios metabólicos (Chemicon Internacional Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Num exemplo não limitante, as células que estejam determinadas como sendo apropriadas para um determinado ensaio fenotípico (i.e., células MCF-7 selecionadas para estudos de cancro da mama; adipócitos para estudos de obesidade), são tratadas com inibidores da apolipoproteína C-III identificados a partir dos estudos in vitro bem como compostos de controlo a concentrações ótimas que são determinadas através dos métodos descritos acima. No final do período de tratamento, as células tratadas e não tratadas são analisadas através de um ou mais métodos específicos para o ensaio para determinar os resultados fenotípicos e pontos finais.

Pontos finais fenotípicos incluem alterações na morfologia da célula ao longo do tempo ou dose de tratamento bem como alterações nos níveis de componentes celulares tais como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, sacáridos ou metais. As medições do estado celular, que incluem pH, fase do ciclo celular, tomada ou excreção de indicadores biológicos pela célula, são também pontos finais de interesse. A análise do genótipo da célula (medição da expressão de um ou mais dos genes da célula) após tratamento é também utilizada como um indicador da eficácia ou potência dos inibidores da apolipoproteína C-III. Genes característicos, ou os genes que se suspeite estarem associados a um estado de doença, condição, ou fenótipo específico, são medidos tanto em células tratadas como não tratadas.

Estudos in vivo

Os sujeitos individuais dos estudos in vivo aqui descritos são animais vertebrados de sangue quente, o que inclui os humanos. 0 ensaio clinico é submetido a rigorosos controlos para garantir que os indivíduos não são desnecessariamente colocados em risco e que são plenamente informados sobre o seu papel no estudo. Para ter em conta os efeitos psicológicos de receber os tratamentos, é dado aleatoriamente aos voluntários placebo ou inibidor de apolipoproteína C-III. Além disso, para evitar que os médicos sejam tendenciosos nos tratamentos, eles não são informados de se a medicação que estão a administrar é um inibidor da apolipoproteína C-III ou um placebo. Usando esta abordagem de randomização, cada voluntário tem a mesma probabilidade de receber quer o novo tratamento quer o placebo.

Os voluntários recebem quer o inibidor da apolipoproteína C-III quer o placebo durante um período de oito semanas com os parâmetros biológicos associados ao estado de doença indicado ou à condição medidos no início (medições limiares antes de qualquer tratamento), no final (após o tratamento final), e a intervalos regulares durante o período do estudo. Tais medições incluem os níveis de moléculas de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III ou os níveis de proteína apolipoproteína C-III nos fluidos corporais, tecidos ou órgãos em comparação com os níveis pré-tratamento. Outras medições incluem, mas não se limitam a, índices do estado de doença ou condição a tratar, peso corporal, pressão sanguínea, títulos séricos de indicadores farmacológicos da doença ou toxicidade, bem como medições ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção). A informação registada para cada paciente inclui a idade (anos), sexo, altura (cm), história familiar de estado de doença ou condição (sim/não), classificação da motivação (alguma/moderada/grande) e número e tipo de regimes de tratamento anteriores para a doença ou condição indicada.

Os voluntários que participam neste estudo são adultos saudáveis (18 a 65 anos de idade) e mais ou menos um número igual de homens e mulheres a participar no estudo. Voluntários com certas caracteristicas são igualmente distribuídos para tratamento de placebo e inibidor de apolipoproteína C-III. Em geral, os voluntários tratados com placebo têm pouca ou nenhuma resposta ao tratamento, enquanto os voluntários tratados com o inibidor de apolipoproteína C-III mostram tendências positivas no seu índice de estado de doença ou condição na conclusão do estudo.

Exemplo 12: Isolamento de ARN

Isolamento de ARNm Poli (A)+ ARNm poli(A)+ foi isolado de acordo com Miura et al., (Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764). Outros métodos para isolamento de ARNm poli(A)+ são rotina na técnica. Resumidamente, para células cultivadas em placas de 96 poços, o meio de crescimento foi removido das células e cada poço foi lavado com 200 pL de PBS frio. 60 pL de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,5 Μ, NP-40 a 0,5%, complexo vanadil-ribonucleósido 20 mM) foi adicionado a cada poço, a placa foi suavemente agitada e depois incubada à temperatura ambiente durante cinco minutos. 55 pL de lisado foram transferidos para placas de 96 poços revestidas com Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine CA) . As placas foram incubadas durante 60 minutos à temperatura ambiente, lavadas 3 vezes com 200 pL de tampão de lavagem (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,3 M) . Após a lavagem final, a placa foi escorrida sobre toalhas de papel para remover o excesso de tampão de lavagem e em seguida seca ao ar durante 5 minutos. 60 pL de tampão de eluição (Tris-HCl 5 mM, pH 7,6), pré-aquecido a 70°C, foram adicionados a cada poço, a placa foi incubada numa placa quente a 90°C durante 5 minutos, e o eluato foi então transferido para uma placa de 96 poços fresca.

As células cultivadas em placas padrão de 100 mm ou outras podem ser tratadas de forma semelhante, utilizando volumes apropriados de todas as soluções.

Isolamento de ARN Total ARN total foi isolado utilizando um estojo RNEASY 96™ e tampões adquiridos a Qiagen Inc. (Valencia, CA) seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante. Resumidamente, para as células cultivadas em placas de 96 poços, o meio de crescimento foi removido das células e cada poço foi lavado com 200 pL de PBS frio. Foram adicionados 150 pL de tampão RLT a cada poço e a placa foi agitada vigorosamente durante 20 segundos. Foram então adicionados 150 pL de etanol a 70% a cada poço e os conteúdos foram misturados através de pipetagem três vezes para cima e para baixo. As amostras foram então transferidas para a placa de poços RNEASY 96™ ligada a um coletor QIAVAC™ equipado com um tabuleiro de recolha de resíduos e ligado a uma fonte de vácuo. Aplicou-se vácuo durante 1 minuto. Foram adicionados 500 pL de tampão RWl a cada poço da placa RNEASY 96™ e incubou-se durante 15 minutos e o vácuo foi novamente aplicado durante 1 minuto. Foram adicionados 500 pL adicionais de Tampão RWl a cada poço da placa RNEASY 96™ e o vácuo foi aplicado, durante 2 minutos. Foi então adicionado 1 mL de Tampão RPE a cada poço da placa RNEASY 96™ e o vácuo foi aplicado durante um período de 90 segundos. A lavagem com tampão RPE foi então repetida e o vácuo foi aplicado durante mais 3 minutos. A placa foi em seguida removida a partir do coletor QIAVAC™ e seca em toalhas de papel. A placa foi, então religada ao coletor QIAVAC™ equipado com um suporte de tubos de recolha contendo tubos de recolha de 1,2 mL. O ARN foi então eluído pipetando 140 pL de ARNase isenta de água em cada poço, incubando 1 minuto e em seguida aplicando o vácuo durante 3 minutos. A pipetagem repetitiva e os passos de eluição podem ser automatizados utilizando uma aparelho Bio-Robot™ 9604 de QIAGEN® (Qiagen, Inc., Valência, CA). Essencialmente, após lise das células na placa de cultura, a placa é transferida para a plataforma do robot onde é realizada a pipetagem, o tratamento de ADNase e os passos de eluição.

Exemplo 13: Análise de PCR quantitativa em tempo real dos niveis de ARNm de apolipoproteina C-III A quantificação dos níveis de ARNm de apolipoproteina C-III foi realizada através de PCR quantitativa em tempo real utilizando o Sistema de Deteção de Sequências ABI PRISM™ 7600, 7700, ou 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Isto é um sistema de deteção de fluorescência de tubo fechado, não baseado em gel, que permite a quantificação de elevada rendimento de produtos de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Ao contrário da PCR padrão em que os produtos de amplificação são quantificados após a PCR estar completa, os produtos da PCR quantitativa em tempo real são quantificados à medida que se acumulam. Isto é conseguido através da inclusão na reação de PCR de uma sonda oligonucleotídica que hibride especificamente entre os iniciadores de PCR direto e inverso, e contenha dois corantes fluorescentes. Um corante repórter (p. ex., FAM ou JOE, obtido a partir de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA ou Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) é ligado à extremidade 5' da sonda e um corante extintor (p. ex., TAMRA, obtido a partir de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA ou Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) é ligado à extremidade 3' da sonda. Quando a sonda e os corantes estão intactos, a emissão do corante repórter é extinta pela proximidade da extremidade 3' do corante extintor. Durante a amplificação, a ligação da sonda à sequência alvo cria um substrato que pode ser clivado através da atividade 5'-exonucleásica da polimerase Taq. Durante a fase de extensão do ciclo de amplificação por PCR, a clivagem da sonda pela polimerase Taq liberta o corante repórter do resto da sonda (e portanto da porção extintora) e é gerado um sinal fluorescente específico da sequência. Com cada ciclo, moléculas adicionais de corante repórter são clivadas das suas respetivas sondas, e a intensidade da fluorescência é monitorizada a intervalos regulares através de óticas laser integradas no Sistema de Deteção de Sequências ABI Prism™. Em cada ensaio, uma série de reações paralelas contendo diluições em série de ARNm a partir de amostras de controlo não tratadas gera uma curva padrão que é usada para quantificar a percentagem de inibição após tratamento com oligonucleótido antissentido das amostras de teste.

Antes da análise de PCR quantitativa, conjuntos iniciador-sonda específicos do gene alvo a medir são avaliados quanto à sua capacidade para serem "tornados multiplexes" com uma reação de amplificação de GAPDH. Na multiplexação, tanto o gene alvo como o gene de GAPDH padrão interno são amplificados simultaneamente numa única amostra. Nesta análise, o ARNm isolado de células não tratadas é diluído em série. Cada diluição é amplificada na presença de conjuntos iniciador-sonda específicos apenas para GAPDH, apenas para o gene alvo ("unicoplexação") , ou ambos (multiplexação). Após amplificação por PCR, as curvas padrão do sinal de GAPDH e do ARNm alvo em função da diluição são geradas a partir de amostras tanto unicoplexadas como multiplexadas. Se tanto o declive como o coeficiente de correlação como os sinais de GAPDH e alvo gerados a partir das amostras multiplexadas caírem dentro de 10% dos seus valores correspondentes gerados a partir das amostras unicoplexadas, o conjunto iniciador-sonda específico para esse alvo é considerado capaz de multiplexação. Outros métodos de PCR são também conhecidos na técnica.

Os reagentes de PCR foram obtidos a partir de Invitrogen Corporation, (Carlsbad, CA) . As reações de RT-PCR foram realizadas adicionando 20 pL de mistura de PCR (tampão de PCR 2,5χ menos MgCl2, MgCl2 6,6 mM, 375 μΜ cada de dATP, dCTP, dCTP e dGTP, 375 nM cada de iniciador direto e iniciador inverso, 125 nM de sonda, 4 Unidades de inibidor de ARNase, 1,25 Unidades de PLATINUM® Taq, 5 Unidades de transcriptase reversa MuLV, e corante ROX 2,5χ) a placas de 96 poços contendo 30 pL de solução de ARN total (20-200 ng). A reação de RT foi realizada através de incubação durante 30 minutos a 48°C. Após uma incubação de 10 minutos a 95°C para ativar a Platinum® Taq, foram realizados 40 ciclos de um protocolo de PCR em dois passos: 95°C durante 15 segundos (desnaturação) seguido por 60°C durante 1,5 minutos (ligação/extensão) .

As quantidades de gene alvo obtidas através de RT-PCR em tempo real são normalizadas utilizando quer o nível de expressão de GAPDH, um gene cuja expressão é constante, quer através da quantificação do ARN total utilizando reagente RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) . A expressão de GAPDH é quantificada através de RT-PCR em tempo real, sendo corrida simultaneamente com o alvo, multiplexando ou separadamente. 0 ARN total é quantificado utilizando reagente de quantificação de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Os métodos de quantificação de ARN através de reagente RiboGreen™ são ensinados em Jones, L.J., et ai., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374).

Neste ensaio, 170 pL de reagente de trabalho RiboGreen™ (reagente RiboGreen™ diluído 1:350 em Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) é pipetado para uma placa de 96 poços contendo 30 pL de ARN celular purificado. A placa é lida num leitor CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) com excitação a 485 nm e emissão a 530 nm.

As sondas e os iniciadores para a apolipoproteína C-III humana foram concebidos para hibridar com uma sequência da apolipoproteína C-III humana, utilizando informação sobre a sequência publicada (nucleótidos 6238608 a 6242565 da sequência com número de acesso GenBank NT_035088.1, aqui incorporada como SEQ ID NO: 4). Para a apolipoproteína C-III humana os iniciadores de PCR foram: iniciador direto: TCAGCTTCATGCAGGGTTACAT (SEQ ID NO: 5) iniciador inverso: ACGCTGCTCAGTGCATCCT (SEQ ID NO: 6) e a

sonda de PCR foi: FAM-AAGCACGCCACCAAGACCGCC-TAMRA (SEQ ID NO: 7) onde FAM é o corante fluorescente e TAMRA é o corante extintor. Para a GAPDH humana os iniciadores de PCR foram: iniciador direto: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 8) iniciador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTCGGGTCTCGCTCCTGGAAGAT (SEQ ID NO: 9) e a sonda de PCR foi: 5' JOE- CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 10) onde JOE é o corante repórter fluorescente e TAMRA é o corante extintor.

As sondas e os iniciadores para a apolipoproteína C-III de ratinho foram concebidos para hibridar com uma sequência de apolipoproteína C-III de ratinho, utilizando informação sobre a sequência publicada (número de acesso GenBank L04150.1, aqui incorporada como SEQ ID NO: 11) . Para a

apolipoproteína C-III de ratinho os iniciadores de PCR foram: iniciador direto: TGCAGGGCTACATGGAACAA (SEQ ID NO: 12) iniciador inverso: CGGACTCCTGCACGCTACTT (SEQ ID NO: 13) e a sonda de PCR foi: FAM-CTCCAAGACGGTCCAGGATGCGC-TAMRA (SEQ ID NO: 14) onde FAM é o corante repórter fluorescente e TAMRA é o corante extintor. Para GAPDH de ratinho os iniciadores de PCR foram: iniciador direto: GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEQ ID NO: 15) iniciador inverso: GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT(SEQ ID NO: 16) e a

sonda de PCR foi: 5' JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 17) onde JOE é o corante repórter fluorescente e TAMRA é o corante extintor.

Exemplo 14: Análise Northern blot dos niveis de ARNm de

apolipoproteína C-III

Dezoito horas após o tratamento antissentido, monocamadas de células foram lavadas duas vezes com PBS frio e lisadas em 1 mL de reagente RNAZOL™ (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX) . ARN total foi preparado seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante. Vinte microgramas de ARN total foram fracionados através de eletroforese através de géis de agarose a 1,2% contendo formaldeido a 1,1% utilizando um sistema tampão MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH) . 0 ARN foi transferido do gel para membranas de nylon HYBOND”-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) através de transferência capilar de um dia para o outro utilizando um sistema tampão de transferência Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX) . A transferência de ARN foi confirmada através de visualização de UV. As membranas foram fixadas através de reticulação de UV utilizando um STRATALINKER™ UV Crosslinker 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA) e depois sondado utilizando solução de hibridação QUICKHYB™ (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando as recomendações do fabricante para condições rigorosas.

Para detetar apolipoproteína C-III humana, uma sonda especifica da apolipoproteína C-III humana foi preparada através de PCR utilizando o iniciador direto TCAGCTTCATGCAGGGTTACAT (SEQ ID NO: 5) e o iniciador inverso ACGCTGCTCAGTGCATCCT (SEQ ID NO: 6) . Para normalizar as variações no carregamento e na eficiência de transferência as membranas foram limpas e sondadas quanto ao ARN da gliceraldeído-3-fosfato-dehidrogenase humana (GAPDH) (Clontech, Paio Alto, CA).

Para detetar a apolipoproteína C-III de ratinho, uma sonda específica da apolipoproteína C-III de ratinho foi preparada através de PCR utilizando o iniciador direto TGCAGGGCTACATGGAACAA (SEQ ID NO: 12) e o iniciador inverso CGGACTCCTGCACGCTACTT (SEQ ID NO: 13) . Para normalizar as variações no carregamento e na eficiência de transferência as membranas foram limpas e sondadas quanto a ARN de gliceraldeído-3-fosfato-dehidrogenase (GAPDH) de ratinho (Clontech, Paio Alto, CA).

As membranas hibridadas foram visualizadas e quantificadas utilizando um aparelho FOSFORIMAGER™ e Suporte Lógico IMAGEQUANT™ V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . Os dados foram normalizados para níveis de GAPDH em controlos não tratados.

Exemplo 15: Inibição antissentido da expressão da apolipoproteina C-III humana através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi

Foi concebida uma série de compostos antissentido para atingir diferentes regiões do ARN da apolipoproteina C-III humana, utilizando sequências publicadas (nucleótidos 6238608 a 6242565 do número de acesso GenBank NT_035088.1, representando uma sequência genómica, aqui incorporada como SEQ ID NO: 4, e número de acesso GenBank NM_000040.1, aqui incorporada como SEQ ID NO: 18). Os compostos são mostrados na Tabela 1. O "local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5') na sequência alvo particular à qual o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 1 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") com 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região "gap" central consistindo em dez 2'-desoxinucleótidos, que é flanqueada em ambos os lados (sentidos 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos 2'-0-(2-metoxietilo), também conhecidos como (2 ’-MOE)nucleótidos. As ligações internucleosídicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados guanto ao seu efeito nos níveis de ARNm da apolipoproteína C-III humana através de PCR quantitativa em tempo real tal como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são a média de três experiências em que as células HepG2 foram tratadas com os oligonucleótidos antissentido. 0 controlo positivo para cada ponto de dados é identificado na tabela pelo número de ID da sequência. Se estiver presente, "N.D." indica "sem dados".

Tabela 1 - Inibição dos níveis de ARN da apolipoproteína C-III humana através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi

Tal como mostrado na Tabela 1, SEQ ID NOs 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 e 96 demonstraram pelo menos 45% de inibição da expressão da apolipoproteína C-III humana neste ensaio e são portanto preferidos. Mais preferidos são SEQ ID NOs 75, 86 e 85. As regiões alvo com as quais estas sequências preferidas são complementares são aqui referidas como "segmentos alvo preferidos" e são portanto preferidas para direcionamento de compostos da presente divulgação. Estes segmentos alvo preferidos são apresentados na Tabela 3. As sequências representam o complemento inverso dos compostos antissentido preferidos mostrados na Tabela 1. "Local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5' ) no ácido nucleico alvo particular ao qual o oligonucleótido se liga. Também mostrado na Tabela 3 é a espécie em que se verifica cada um dos segmentos alvo preferidos.

Exemplo 16: Inibição antissentido da expressão de apolipoproteína C-III de ratinho através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi.

Uma segunda série de compostos antissentido foi concebida para atingir diferentes regiões do ARN da apolipoproteína C-III de ratinho, utilizando sequências publicadas (número de acesso GenBank L04150.1, aqui incorporada como SEQ ID NO: 11) . Os compostos são mostrados na Tabela 2. "Local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5') no ácido nucleico alvo particular ao qual o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 2 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região "gap" central consistindo em dez 2' -desoxinucleótidos, que é flanqueada em ambos os lados (sentidos 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por 2 '-O-(2-metoxietilo)nucleótidos, também conhecidos como (2'-MOE)nucleótidos. As ligações internucleosidicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados quanto ao seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína C-III de ratinho através de PCR quantitativa em tempo real tal como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são a média de três experiências em que hepatócitos primários de ratinho foram tratados com os oligonucleótidos antissentido. Se estiver presente, "N.D." indica "sem dados".

Tabela 2 - Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína C-III de ratinho por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2 ' -MOE e vim gap desoxi

Tal como mostrado na Tabela 2, SEQ ID NOs 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 114, 115, 116 e 117 demonstraram pelo menos 45% de inibição da expressão da apolipoproteína C-III de ratinho nesta experiência e são portanto preferidos. Mais preferidos são as SEQ ID NOs 117, 116, e 100. As regiões alvo às quais estas sequências preferidas são complementares são aqui referidas como "segmentos alvo preferidos" e são portanto preferidos para alvo dos compostos da presente divulgação. Estes segmentos alvo preferidos são mostrados na Tabela 3. As sequências representam o complemento inverso dos compostos antissentido preferidos mostrados na Tabela 2. Mostra-se que estas sequências contêm timina (T), mas um perito na técnica apreciará que a timina (T) é geralmente substituída por uracilo (U) nas sequências de ARN. O "local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5') no ácido nucleico alvo particular ao qual o oligonucleótido se liga. É também mostrada na Tabela 3 a espécie em que cada um dos segmentos alvo preferidos foi verificado.

Tabela 3 - Sequência e posição dos segmentos alvo preferidos identificados na apolipoproteína C-III.

Uma vez que estes "segmentos alvo preferidos" foram verificados através de experimentação estarem abertos a, e acessíveis para, hibridação com os compostos antissentido da presente divulgação, um perito na técnica reconhecerá, ou será capaz de determinar, utilizando não mais do que experimentação de rotina, outras formas de realização que englobem outros compostos que hibridem especificamente com estes segmentos alvo preferidos e inibam por conseguinte a expressão da apolipoproteína C-III.

De acordo com a presente divulgação, os compostos antissentido incluem compostos oligoméricos antissentido, oligonucleótidos antissentido, ribozimas, oligonucleótidos de sequências guias externas (EGS), processadores alternativos, iniciadores, sondas e outros compostos oligoméricos curtos que hibridem com pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo.

Exemplo 17: Inibição antissentido da expressão de apolipoproteína C-III humana através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi - compostos antissentido adicionais

Uma série adicional de compostos antissentido foi concebida para atingir diferentes regiões do ARN da apolipoproteína C-III humana, utilizando sequências publicadas (nucleótidos 6238608 a 6242565 da sequência com o número de acesso GenBank NT_035088.1, representando uma sequência genómica, aqui incorporada como SEQ ID NO: 4, e o número de acesso GenBank NM_000040.1 aqui incorporada como SEQ ID NO: 18). Os compostos são mostrados na Tabela 4. O "local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5') na sequência alvo particular à qual o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 4 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região "gap" central consistindo em dez 2'-desoxinucleótidos, que é flanqueada em ambos os lados (sentidos 5'e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas de 2'-0-(2-metoxietilo)nucleótidos, também conhecidos como (2 ' — MOE)nucleótidos. As ligações internucleosidicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados quanto ao seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína C-III humana através de PCR quantitativa em tempo real tal como aqui descrito em outros exemplos. Os dados são a média de três experiências nas quais células HepG2 foram tratadas com os oligonucleótidos antissentido. Se estiver presente, "N.D." indica "sem dados".

Tabela 4 - Inibição dos níveis de ARNm da apolipoproteína C-III humana através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2 ' -MOE e vim gap desoxi

Exemplo 18: Inibição antissentido da expressão de apolipoproteina C-III humana através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi: estudo de dose-resposta em células HepG2

Um subconjunto dos oligonucleótidos antissentido dos Exemplos 15 e 17 foi ainda investigado num estudo de dose-resposta. As doses de tratamento de ISIS 167842 (SEQ ID NO: 214), ISIS 167844 (SEQ ID NO: 215), ISIS 167846 (SEQ ID NO: 22), ISIS 167837 (SEQ ID NO: 21), ISIS 304789 (SEQ ID NO: 75), ISIS 304799 (SEQ ID NO: 85), e ISIS 304800 (SEQ ID: 86) foram 50, 150 e 300 nM. Os compostos foram analisados quanto ao seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteina C-III humana em células HepG2 através de PCR quantitativa em tempo real tal como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são a média de duas experiências e são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 - Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteina C-III humana através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2 ' -MOE e vim gap desoxi

Estes dados demonstram que a expressão da apolipoproteína C-III é inibida de uma forma dependente da dose, após tratamento das células com compostos antissentido dirigidos para a apolipoproteína C-III. Estes compostos foram ainda analisados em células Hep3B quanto à sua capacidade para reduzir os níveis de ARNm em células Hep3B e determinou-se que ISIS 167842 e 167837 inibiram a expressão de apolipoproteína C-III de uma forma dependente da dose também nesta linha celular.

Exemplo 19: Inibição antissentido da expressão da apolipoproteína C-III de ratinho através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi - estudo de dose-resposta em hepatócitos primários de ratinho 0 subconjunto IA dos oligonucleótidos antissentido no Exemplo 16 foi ainda investigado em estudos de dose-resposta. As doses de tratamento com ISIS 167861 (SEQ ID NO: 100), ISIS 167870 (SEQ ID NO: 108), ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116), e ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) foram 40, 120 e 240 nM. Os compostos foram analisados quanto ao seu efeito nos níveis de ARNm de apolipoproteína C-III de ratinho em hepatócitos primários através de PCR quantitativa em tempo real tal como aqui descrito noutros exemplos. Os dados são médias de duas experiências e são apresentados na Tabela 6.

Tabela 6 - Inibição dos níveis de ARNm de apolipoproteína C-III de ratinho através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2' -MOE e vim gap desoxi - estudo de dose-resposta

Estes dados demonstram que a expressão da apolipoproteína C-III de ratinho pode ser inibida de um modo dependente da dose através de tratamento com compostos antissentido.

Exemplo 20: Análise Western blot dos níveis de proteína apolipoproteína C-III A análise Western blot (análise de imunotransferência) é realizada utilizando métodos padrão. Células são colhidas 16-20 h após o tratamento de oligonucleótidos, lavadas uma vez com PBS, suspensas em tampão de Laemmli (100 μΐ/poço), fervidas durante 5 minutos e carregadas num gel de SDS-PAGE a 16%. Os géis são corridos durante 1,5 horas a 150 V e transferidos para membrana para western blotting. Anticorpo primário apropriado dirigido à apolipoproteína C-III é utilizado, com um anticorpo secundário marcado com radiação ou fluorescência dirigido contra a espécie do anticorpo primário. As bandas são visualizadas utilizando um instrumento FOSFORIMAGER” (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) .

Exemplo 21: Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteina C-III (ISIS 167880) nos niveis séricos de colesterol e triglicéridos

Ratinhos C57BL/6, uma estirpe relatada como sendo suscetível a formação de placas ateroscleróticas induzida por hiperlipidemia, foram usados nos seguintes estudos para avaliar oligonucleótidos antissentido da apolipoproteina C-III como potenciais agentes para baixar os níveis de colesterol e de triglicéridos.

Ratinhos C57BL/6 machos (n=8) recebendo uma dieta rica em gordura (60% das kcal em gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas quanto aos efeitos de ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) sobre os níveis séricos de colesterol e triglicéridos. Os animais de controlo receberam tratamento com solução salina. Aos ratinhos foi administrado por via intraperitoneal a cada três dias (duas vezes por semana), após jejum de um dia para o outro, ISIS 167880 a 50 mg/kg ou solução salina durante seis semanas.

Ratinhos C57BL/6 machos alimentados com uma dieta de roedor normal foram mantidos em jejum de um dia para o outro e foi-lhes depois administrada por via intraperitoneal a cada três dias solução salina (controlo), ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) a 50 mg/kg ou ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116) a 50 mg/kg durante duas semanas.

No final do estudo, quarenta e oito horas após as injeções finais, os animais foram sacrificados e avaliados quanto aos níveis séricos de colesterol e de triglicéridos e comparou-se com o controlo de solução salina. As medições dos níveis séricos de colesterol e triglicéridos foram obtidas através de análises clínicas de rotina.

Os ratinhos alimentados com dieta rica em gordura tratados com ISIS 167880 mostraram uma redução nos níveis séricos tanto do colesterol (196 mg/dL para os animais de controlo e 137 mg/dL para ISIS 167880) como dos triglicéridos (151 mg/dL para os animais de controlo e 58 mg/dL para ISIS 167880) no final do estudo. Não foi observado qualquer efeito nos níveis de colesterol sérico para ratinhos magros tratados com ISIS 167880 (91 mg/dL para os animais de controlo e 91 mg/dL para ISIS 167880), no entanto os triglicéridos foram reduzidos (91 mg/dL para animais de controlo e 59 mg/dL para ISIS 167880) no final do estudo.

Os ratinhos magros tratados com ISIS 167879 mostraram um aumento no colesterol sérico (91 mg/dL para os animais de controlo e 116 mg/dL para ISIS 167879) mas uma redução nos triglicéridos (91 mg/dL para os animais de controlo e 65 mg/dL para ISIS 167879) no fim do estudo.

Estes resultados indicam que, em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gordura, ISIS 167880 reduz o colesterol e os triglicéridos para níveis que são comparáveis com os dos irmãos da mesma ninhada embora não possuindo efeitos deletérios nos animais magros. (Ver Tabela 7 para resumo dos dados in vivo) .

Exemplo 22: Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteina C-III (ISIS 167880) nos niveis séricos de AST e ALT

Foram utilizados ratinhos C57BL/6 nos seguintes estudos para avaliar a toxicidade hepática de oligonucleótidos antissentido de apolipoproteina C-III.

Ratinhos C57BL/6 (n=8) recebendo uma dieta rica em gordura (60% das kcal em gordura) foram avaliados ao longo do curso de 6 semanas quanto aos efeitos de ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) nos niveis de enzimas hepáticas (AST e ALT). Os animais de controlo receberam tratamento com solução salina. Aos ratinhos foi administrado por via intraperitoneal a cada três dias (duas vezes por semana), após jejum de um dia para o outro, ISIS 167880 a 50 mg/kg ou solução salina durante seis semanas.

Ratinhos C57BL/6 machos alimentados com uma dieta de roedor normal foram mantidos em jejum de um dia para o outro depois foi-lhes administrado por via intraperitoneal a cada três dias solução salina (controlo), ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) a 50 mg/kg ou ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116) a 50 mg/kg durante duas semanas.

No final do estudo e quarenta e oito horas após as injeções finais, os animais foram sacrificados e avaliados quanto aos niveis séricos de AST e ALT, que foram medidos através de métodos clínicos de rotina. Níveis das enzimas hepáticas ALT e AST aumentados podem indicar toxicidade e danos no fígado.

Ratinhos alimentados com alto teor de gordura tratados com ISIS 167880 mostraram um aumento nos níveis de AST ao longo da duração do estudo em comparação com os controlos de solução salina (157 UI/L para ISIS 167880, em comparação com 92 UI/L para o controlo de solução salina).

Os níveis de ALT em ratinhos alimentados com alto teor de gordura aumentaram através dos tratamentos com ISIS 167880 ao longo da duração do estudo, em comparação com os controlos de solução salina (64 UI/L para ISIS 167880, em comparação com 40 UI/L para o controlo de solução salina).

Ratinhos magros tratados com ISIS 167880 não mostraram qualquer aumento significativo nos níveis de AST e ALT ao longo da duração do estudo em comparação com os controlos de solução salina (níveis de AST de 51 UI/L para o controlo, em comparação com 58 UI/L para ISIS 167880; níveis de ALT de 26 UI/L para o controlo em comparação com 27 UI/L para ISIS 167880).

Ratinhos magros tratados com ISIS 167879 não mostraram qualquer alteração nos níveis de AST e mostraram uma diminuição nos níveis de ALT ao longo da duração do estudo em comparação com os controlos de solução salina (níveis de AST de 51 UI/L para o controlo em comparação com 51 UI/L para ISIS 167879; níveis de ALT de 26 Ul/L para o controlo em comparação com 21 UI/L para ISIS 167879).

Estes resultados sugerem um efeito menor de toxicidade hepática de ISIS 167880 em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gordura, mas nenhuma toxicidade hepática de ISIS 167880 ou 167879 em ratinhos alimentados com uma dieta normal de roedor. (Ver Tabela 7 para resumo dos dados in vivo).

Exemplo 23: Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteina C-III (ISIS 167880) nos niveis séricos de glicose

Ratinhos C57BL/6 machos (n=8) que receberam uma dieta rica em gordura (60% das kcal em gordura) foram avaliados ao longo de um curso de 6 semanas quanto aos efeitos de ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) nos niveis séricos de glicose. Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina. Aos ratinhos foi administrado por via intraperitoneal a cada três dias (duas vezes por semanas) , após jejum de um dia para o outro, ISIS 167880 a 50 mg/kg ou solução salina durante seis semanas.

Ratinhos C57BL/6 machos alimentados com uma dieta de roedor normal foram mantidos em jejum de um dia para o outro e foi-lhes depois administrado por via intraperitoneal a cada três dias solução salina (controlo), ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) a 50 mg/kg ou ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116) a 50 mg/kg durante duas semanas.

No final do estudo e quarenta e oito horas após as injeções finais, os animais foram sacrificados e avaliados quanto aos niveis séricos de glicose, que foram medidos através de métodos clínicos de rotina.

Nos ratinhos alimentados com alto teor de gordura, ISIS 167880 reduziu os níveis séricos de glicose para 183 mg/dL, em comparação com o controlo de solução salina de 213 mg/dL. Em ratinhos magros, ISIS 167880 não teve qualquer efeito significativo nos níveis séricos de glicose com medições de 203 mg/dL, em comparação com o controlo de solução salina de 204 mg/dL; enquanto ISIS 167879 aumentou apenas ligeiramente os níveis séricos de glicose para 216 mg/dL.

Os resultados indicam que, em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gordura, ISIS 167880 é capaz de reduzir a glicose no soro para níveis comparáveis aos dos irmãos magros da mesma ninhada, ao mesmo tempo que não possui efeitos deletérios nos animais magros. (Ver Tabela 7 para resumo dos dados in vivo).

Exemplo 24: Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteina C-III (ISIS 167880) nos niveis de ARNm de apolipoproteina C-III em ratinhos C57BL/6

Ratinhos C57BL/6 machos receberam uma dieta rica em gordura (60% das kcal em gordura), jejuaram de um dia para o outro, e foi-lhes administrada por via intraperitoneal a cada três dias solução salina ou ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) a 50 mg/kg durante seis semanas.

Ratinhos C57BL/6 machos alimentados com uma dieta de roedor normal foram mantidos em jejum de um dia para o outro e foi-lhes depois administrado por via intraperitoneal a cada três dias solução salina (controlo) ou ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117) a 50 mg/kg ou ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116) a 50 mg/kg durante duas semanas.

No final do estudo, quarenta e oito horas após as injeções finais, os animais foram sacrificados e avaliados quanto aos níveis de ARNm de apolipoproteina C-III no fígado. Os ratinhos alimentados com alto teor de gordura aos quais foi administrado ISIS 167880 tinham níveis de ARNm de apolipoproteina C-III de 8% dos dos ratinhos tratados com solução salina. Os ratinhos magros apresentaram uma diminuição do ARNm de apolipoproteína C-III após o tratamento quer com ISIS 167880 quer com ISIS 167879. Os ratinhos magros aos quais foi administrado ISIS 167880 tiveram níveis de ARNm de apolipoproteína C-III de 21% dos dos ratinhos tratados com solução salina e aqueles aos quais foi administrado ISIS 167879 tinham níveis de ARNm de apolipoproteína C-III de 27% dos dos ratinhos tratados com solução salina.

Estes resultados indicam que tanto em ratinhos alimentados com alto teor de gordura como em ratinhos magros, os oligonucleótidos antissentido dirigidos contra apolipoproteína C-III são capazes de diminuir os níveis de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo numa extensão semelhante. (Ver a Tabela 7 para resumo dos dados in vivo).

Tabela 7 - Efeitos do tratamento com ISIS 167880 ou 167879 no colesterol, triglicéridos, glicose, enzimas hepáticas, e ARNm da apolipoproteína C-III no fígado, em ratinhos C57BL/6 magros e alimentados com alto teor de gordura.

Em resumo, estes resultados indicam que, nos ratinhos alimentados com uma dieta rica em gordura, ISIS 167880 é capaz de reduzir a glicose, o colesterol e os triglicéridos séricos a níveis comparáveis aos dos irmãos da mesma ninhada, ao mesmo tempo que não possui efeitos deletérios nos animais magros. Além disso, os oligonucleótidos antissentido dirigidos contra a apolipoproteína C-III são capazes de diminuir os niveis de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo numa extensão semelhante tanto nos ratinhos alimentados com elevado teor de gordura como nos ratinhos magros. Estes resultados sugerem um efeito de toxicidade hepática menor de ISIS 167880 em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gordura mas nenhuma toxicidade hepática de ISIS 167880 ou 167879 em ratinhos alimentados com uma dieta de roedor normal.

Exemplo 25: Inibição antissentido de ARNm de apolipoproteina C-III in vivo

Ratinhos C57BL/6, uma estirpe que está relatada como sendo suscetível a formação de placas ateroscleróticas induzida por hiperlipidemia, foram utilizados nos seguintes estudos para avaliar oligonucleótidos antissentido de apolipoproteina C-III como potenciais agentes para baixar os níveis de colesterol e de triglicéridos. Por conseguinte, numa outra forma de realização, ratinhos C57BL/6 com uma dieta rica em gordura foram tratados com oligonucleótidos antissentido dirigidos a apolipoproteina C-III.

Ratinhos C57BL/6 machos (n=8; 7 a 8 semanas de idade) recebendo uma dieta rica em gordura (60% das kcal em gordura) foram avaliados quanto à expressão do ARNm de apolipoproteina C-III no fígado após 6 semanas de tratamento com oligonucleótidos antissentido dirigidos à apolipoproteina C-III. Os ratinhos receberam injeções intraperitoneais duas vezes por semana a uma dose de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117), ISIS 167875 (SEQ ID NO: 113), ISIS 167878 (SEQ ID NO: 115) ou ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116). Os animais de controlo receberam tratamento de solução salina duas vezes por semana durante um período de 6 semanas.

No final do estudo, quarenta e oito horas após as injeções finais, os animais foram sacrificados e avaliados quanto à expressão de ARNm de apolipoproteina C-III no fígado. O ARN foi isolado a partir do fígado e o ARNm foi quantificado tal como aqui descrito. Foi calculada a média dos níveis de ARNm de apolipoproteina C-III de cada grupo de tratamento (N=8) foram em média. Em relação aos animais tratados com solução salina, o tratamento com ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880 resultou numa redução de 24%, 56%, 50% e 77% nos níveis de ARNm de apolipoproteína C-III, respetivamente, demonstrando que estes compostos reduziram significativamente a expressão de ARNm de apolipoproteína C-III no fígado.

Exemplo 26: Efeitos da inibição antissentido de apolipoproteína C-III no colesterol, triglicéridos, glicose séricos e transaminases séricas

Os ratinhos tratados com solução salina ou uma dose de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117), ISIS 167875 (SEQ ID NO: 113), ISIS 167878 (SEQ ID NO: 115) ou ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116) tal como descrito no Exemplo 25 foram avaliados quanto aos níveis séricos de colesterol e de triglicéridos após 6 semanas de tratamento.

No final do estudo, quarenta e oito horas após a dose de solução salina ou composto antissentido, os animais foram sacrificados e avaliados quanto aos níveis séricos de colesterol, triglicéridos e glicose através de análise de rotina utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY) . Os aumentos das transaminases séricas, ALT e AST, que podem indicar hepatotoxicidade, foram também medidos usando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY). Os níveis séricos de colesterol, triglicéridos e glicose são apresentados na Tabela 8 como média dos resultados de cada grupo de tratamento (n=8), em mg/dL. ALT e AST, também mostradas na Tabela 8, são também mostradas como a média dos resultados de cada grupo de tratamento (n=8), em unidades internacionais/L (UI/L).

Tabela 8 - Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteina C-III no colesterol, triglicéridos, glicose e transaminases séricos

Uma redução significativa dos níveis séricos de triglicéridos foi observada após o tratamento com ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880, que reduziram os níveis de triglicéridos em 22%, 40%, 52% e 58%, respetivamente. Esta redução nos triglicéridos séricos correlacionou-se com a redução na expressão de ARNm da apolipoproteina C-III hepática. Além disso, as reduções no alvo e nos triglicéridos no soro após tratamento com ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880 não foram acompanhadas de hepatotoxicidade, tal como indicado pela falta de aumentos significativos nos níveis de ALT e AST. Os níveis de glicose foram significativamente reduzidos após o tratamento com ISIS 167879.

Exemplo 27: Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteina C-III no peso corporal e peso dos órgãos

Os animais tratados com solução salina ou uma dose de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117), ISIS 167875 (SEQ ID NO: 113), ISIS 167878 (SEQ ID NO: 115) ou ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116) tal como descrito no Exemplo 25 foram avaliados quanto a alterações no peso corporal, camada de gordura, pesos do fígado e do baço. No final do estudo, quarenta e oito horas após a dose final de solução salina ou composto antissentido, os animais foram sacrificados e foram medidos os pesos corporais e dos órgãos. Os dados mostrados na Tabela 9 representam pesos médios de todos os animais em cada grupo de tratamento (n=8). O peso corporal é apresentado em gramas (g) , enquanto os pesos do baço, do fígado e da camada de gordura são apresentados em miligramas (mg).

Tabela 9 - Efeitos da inibição antissentido de apolipoproteina C-III nos pesos corporal e dos órgãos

Tal como é evidente na Tabela 9, o tratamento com compostos antissentido dirigidos à apolipoproteina C-III de ratinho resultou em reduções significativas no peso da camada de gordura. ISIS 167875 e ISIS 167878 levaram ambos a uma redução de 31% no peso da camada de gordura, enquanto ISIS 167879 e ISIS 167880 resultaram ambos numa redução de 66% do peso da camada de gordura. Os pesos corporais não foram significativamente alterados e os pesos dos baços estavam ligeiramente aumentados após tratamento com o composto antissentido. Com a exceção dos fígados dos animais tratados com ISIS 167875, os pesos dos fígados não foram significativamente alterados.

Exemplo 28: Efeitos da Inibição antissentido da apolipoproteina C-III nos níveis de triglicéridos no fígado A esteatose hepática refere-se à acumulação de lípidos no fígado, ou "fígado gordo", que é frequentemente causada por consumo de álcool, diabetes e hiperlipidemia e pode evoluir para lesão hepática de fase final. Dadas as consequências deletérias de uma condição de fígado gordo, é útil identificar compostos que impeçam ou melhorem a esteatose hepática. A esteatose hepática é avaliada tanto através da medição do teor de triglicéridos nos tecidos como através do exame histológico do tecido do fígado. O teor de triglicéridos no tecido hepático foi avaliado nos animais tratados com solução salina ou uma dose de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117), ISIS 167875 (SEQ ID NO: 113), ISIS 167878 (SEQ ID NO: 115) ou ISIS 167879 (SEQ ID NO: 116) tal como é descrito no Exemplo 25. O teor de triglicéridos do tecido hepático foi medido utilizando o ensaio de Triglicéridos GPO (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) . A análise histológica foi realizada através de procedimentos de rotina, em que o tecido hepático foi fixado em formalina tamponada neutra, embebido em parafina, seccionado e posteriormente corado com hematoxilina e eosina, para se visualizar núcleos e citoplasma, respetivamente. Alternativamente, o tecido hepático foi obtido e em seguida imediatamente congelado, seccionado, e subsequentemente corado com corante óleo vermelho 0 para se visualizar depósitos lipídicos e contrastado com eosina para marcar o citoplasma. As amostras preparadas foram avaliadas através de microscopia ótica.

Relativamente aos ratinhos tratados com solução salina, os niveis de triglicéridos do tecido hepático foram significativamente reduzidos, em 25%, 35%, 40% e 64% após tratamento com ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880, respetivamente. A análise histológica das secções do fígado coradas revelou de modo semelhante uma redução nos triglicéridos de tecido do fígado. Assim, tal como demonstrado através da medição de triglicéridos dos tecidos e de análises histológicas das secções de tecido do fígado, o tratamento com compostos antissentido apontados à apolipoproteína C-III reduziu o teor de triglicéridos no fígado. Como tal, os compostos antissentido dirigidos à apolipoproteína C-III são agentes terapêuticos candidatos para a prevenção ou melhoria de esteatose hepática.

Exemplo 29: Inibição antissentido de apolipoproteína C-III em hepatócitos primários de macaco Cinomolgo

Compostos antissentido dirigidos para a apolipoproteína C-III humana foram testados quanto aos seus efeitos sobre a expressão da apolipoproteína C-III em hepatócitos primários de macaco Cinomolgo. Hepatócitos primários de macaco Cinomolgo pré-plaqueados foram adquiridos a InVitro Technologies (Baltimore, MD). As células foram cultivadas em DMEM rico em glicose (Invitrogen Life Technologies,

Carlsbad, CA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), estreptomicina a 100 unidades/mL e 100 yg/mL (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).

As células a uma densidade de 80000 células por poço numa placa de 24 poços foram tratadas com 10, 50, 150 e 300 nM de ISIS 304789 (SEQ ID NO: 75), ISIS 304799 (SEQ ID NO: 85) ou ISIS 304800 (SEQ ID NO: 86). ISIS 113529 (CTCTTACTGTGCTGTGGACA, SEQ ID NO: 222) serviu como oligonucleótido de controlo. ISIS 113529 é um oligonucleótido quimérico ("gapmero") com 20 nucleótidos de comprimento, constituído por uma região "gap" central consistindo em dez 2'-desoxinucleótidos, que é flanqueada em ambos os lados (sentidos 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por 2'-0-(2-metoxietil)nucleótidos, também conhecidos como (2'— MOE)nucleótidos. As ligações internucleosídicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Após 24 horas de tratamento com oligonucleótidos antissentido, o ARNm de apolipoproteína C-III foi medido através de PCR em tempo real tal como aqui descrito por outros exemplos, utilizando os iniciadores e a sonda concebidos para a sequência de apolipoproteína C-III humana (SEQ ID NOs 5, 6 e 7) para medir o ARNm de apolipoproteína C-III de macaco Cinomolgo. Os iniciadores e a sonda concebidos para a GAPDH humana (SEQ ID NOs 8, 9 e 10) foram utilizados para medir a expressão do ARNm de GAPDH de macaco Cinomolgo, com o objetivo de normalizar as quantidades de gene alvo obtidas através de PCR em tempo real. As células não tratadas serviram como controlo para o qual os dados foram normalizados. Os dados são a média de três experiências e são apresentados na Tabela 10.

Tabela 10 - Inibição antissentido de apolipoproteina C-III em hepatócitos primários de macaco Cinomolgo

Exemplo 30: Sequência de apolipoproteina C-III de macaco

Cinomolgo

Uma porção do gene de apolipoproteina C-III de macaco Cinomolgo foi sequenciada. As posições 8 a 476 da sequência de ARNm de apolipoproteina C-III humana (aqui incorporada na sua totalidade como SEQ ID NO: 18) contêm o segmento alvo com o qual o ISIS 304789 híbrida. A região correspondente do ARNm da apolipoproteina C-III de macaco Cinomolgo foi sequenciada. O ARN foi isolado e purificado a partir de hepatócitos primários de macaco Cinomolgo (InVitro Technologies, Gaithersburg, MD) e foi submetido a uma reação de transcriptase reversa (estojo de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). O ADNc resultante foi o substrato para 40 ciclos de amplificação por PCR, utilizando iniciadores 5' e 3' concebidos para as posições 8 e 476, respetivamente, do ARNm da apolipoproteina C-III humana (estojo de PCR Amplitaq, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Após purificação em gel do fragmento resultante de 468 pb, foram realizadas reações de sequenciação direta e inversa de cada produto através de Retrogen (San Diego, CA). Esta sequência de macaco Cinomolgo é aqui incorporada como SEQ ID NO: 223 e é 92% idêntica às posições 8 a 476 do ARNm da apolipoproteína C-III humana.

Exemplo 31: Oligonucleótido fosforotioato quimérico possuindo asas 2'-MOE e vim gap desoxi, dirigido à apolipoproteína C-III de macaco Cinomolgo A sequência da apolipoproteína C-III de macaco Cinomolgo aqui incorporada como SEQ ID NO: 223 foi utilizada para conceber um oligonucleótido antissentido possuindo 100% de complementaridade com o ARNm da apolipoproteína C-III de Cinomolgo. ISIS 340340 (GGCAGCCCTGGAGGCTGCAG; aqui incorporada como SEQ ID NO: 224) dirige-se aos nucleótidos 397 de SEQ ID NO: 223, dentro de uma região correspondendo à UTR 3' da apolipoproteína C-III humana com a qual ISIS 304789 híbrida. ISIS 340340 é um oligonucleótido quimérico ("gapmero") de 20 nucleótidos de comprimento composto por uma região "gap" central consistindo em 2' -desoxinucleótidos, que é flanqueada em ambos os lados (sentidos 5' e 3') por "asas" de 5 nucleótidos. As asas são compostas por nucleótidos 2'-metoxietilo (2'-MOE). As ligações internucleosídicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do nucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Exemplo 32: Inibição antissentido da expressão de apolipoproteina C-III de rato através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi

Para os objetivos de concepção de oligonucleótidos antissentido tanto para as regiões de codificação como não traduzidas do ARNm da apolipoproteina C-III de rato, um segmento do ARNm da apolipoproteina C-III de rato foi sequenciado para proporcionar uma sequência UTR 3', uma vez que a sequência do ARNm da apolipoproteina C-III de rato publicada está restringida à região de codificação. 0 ARN foi isolado e purificado a partir de hepatócitos primários de rato (InVitro Technologies, Gaithersburg, MD) e foi submetido a uma reação de transcriptase reversa (estojo de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) . 0 ADNc resultante foi o substrato para 40 ciclos de amplificação por PCR (Amplitaq PCR kit, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) , utilizando os iniciadores direto e inverso que se ligam às extremidades mais 5' e mais 3', respetivamente, do ARNm de apolipoproteina C-III de ratinho. Após purificação em gel do fragmento resultante de 427 pb, foram realizadas reações de sequenciação direta e inversa de cada produto através de Retrogen (San Diego, CA) . Esta sequência de rato é aqui incorporada como SEQ ID NO: 225 e inclui 121 pb adicionais no sentido 3' do codão de terminação da apolipoproteina C-III, em relação à sequência publicada (número de acesso GenBank NM_012501.1, aqui incorporada como SEQ ID NO: 226).

Foi concebida uma série de compostos antissentido para regiões alvo diferentes do ARNm da apolipoproteina C-III de rato, utilizando SEQ ID NO: 225. Os compostos são mostrados na Tabela 11. O "local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5') na sequência alvo particular à qual o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 11 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região "gap" central consistindo em dez 2'-desoxinucleótidos, que é flanqueada de ambos os lados (sentidos 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por 2'-0-(2- metoxietil)nucleótidos, também conhecidos como (2'— MOE)nucleótidos. As ligações internucleosidicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Os compostos foram analisados quanto ao seu efeito nos níveis de ARNm da apolipoproteína C-III de rato através de PCR quantitativa em tempo real tal como aqui descrito noutros exemplos. As sondas e os iniciadores da apolipoproteína C-III de rato foram concebidos para hibridar com uma sequência de apolipoproteína C-III de rato, utilizando informação sobre a sequência publicada (número de acesso GenBank NM_012501.1, aqui incorporada como SEQ ID NO: 226). Para a apolipoproteína C-III de rato os iniciadores de PCR foram: iniciador direto: GAGGGAGAGGGATCCTTGCT (SEQ ID NO: 227) iniciador inverso: GGACCGTCTTGGAGGCTTG (SEQ ID NO: 228) e a sonda de PCR foi: FAM-CTGGGCTCTATGCAGGGCTACATGGA-TAMRA, SEQ ID NO: 229) onde FAM é o corante fluorescente e TAMRA é o corante extintor. Para GAPDH de rato os iniciadores de PCR foram: iniciador direto: TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT (SEQ ID NO: 230) iniciador inverso: CACCGACCTTCACCATCTTGT (SEQ ID NO: 231) e a sonda de PCR foi JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA (SEQ ID NO: 232) onde JOE é o corante repórter fluorescente e TAMRA é o corante extintor.

Os dados são de uma experiência em que hepatócitos primários de rato foram tratados com 150 nM dos oligonucleótidos antissentido. Os resultados, apresentados na Tabela 11, são expressos como percentagem de inibição relativamente às células de controlo não tratadas. Se estiver presente, "N.D." indica "sem dados".

Tabela 11 - Inibição antissentido dos níveis de ARNm da apolipoproteína C-III de rato através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi

Foi concebida uma série adicional de oligonucleótidos para regiões alvo diferentes do ARN da apolipoproteína C-III de rato, utilizando sequências aqui descritas (SEQ ID NO: 225 e a sequência com o número de acesso Genbank NM_012501.1, aqui incorporada como SEQ ID NO: 226). Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 12. 0 "local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5') na sequência alvo particular à qual o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 12 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região "gap" central consistindo em oito 2'-desoxinucleótidos, que é flanqueada de ambos os lados (sentidos 5' e 3') por "asas" de 3 nucleótidos. As asas são compostas por 2'-0-(2-metoxietil)nucleótidos, também conhecidos como (2 ' — MOE)nucleótidos. As ligações internucleosidicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Tabela 12 - Oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2' -MOE e vim gap desoxi dirigidos ao ARNm da apolipoproteina C-III de rato

Exemplo 33: Inibição antissentido da apolipoproteina C-III de rato através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e vim gap desoxi: estudo de dose-resposta em hepatócitos primários de rato

Quatro oligonucleótidos foram selecionados para estudos adicionais de resposta à dose. Hepatócitos primários de ratinho foram tratados com 10, 50, 150, e 300 nM de ISIS 167878 (SEQ ID NO: 115), ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117), ISIS 340982 (SEQ ID NO: 233), ou o oligo de controlo baralhado ISIS 113529 (SEQ ID NO: 222) e os níveis de ARNm foram medidos 24 horas após o tratamento de oligonucleótidos tal como aqui descrito noutros exemplos. As células não tratadas serviram como controlo para o qual os dados foram normalizados.

Os resultados destes estudos são apresentados na Tabela 13. Os dados são a média de três experiências e são expressos como percentagem de inibição, relativamente a controlos não tratados. Quando presente, "N.D." indica "sem dados".

Tabela 13 - Inibição antissentido da expressão de ARNm de apolipoproteina C-III em hepatócitos primários de rato 24 horas após o tratamento com oligonucleótidos

Tal como mostrado na Tabela 13, ISIS 340982 foi eficaz a reduzir os níveis de ARNm de apolipoproteína C-III de um modo dependente da dose.

Exemplo 34: Inibição antissentido da apolipoproteína C-III de rato através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi: estudo adicional de dose-resposta em hepatócitos primários de rato

Um grupo adicional de oligonucleótidos antissentido dirigidos a apolipoproteína C-III de rato foi selecionado para estudos de resposta à dose. Hepatócitos primários de rato foram tratados com 10, 50, 150 e 300 nM de ISIS 353977 (SEQ ID NO: 277), ISIS 353978 (SEQ ID NO: 278), ISIS 353982 (SEQ ID NO: 282), ISIS 353983 (SEQ ID NO: 283), ou ISIS 353987 (SEQ ID NO: 287) durante um período de 24 horas. Os níveis de expressão do alvo foram quantificados através de PCR em tempo real tal como aqui descrito. As células não tratadas servem como controlo para o qual os dados foram normalizados. Os resultados, apresentados na Tabela 14, são a média de três experiências e são apresentados como percentagem de inibição do ARNm da apolipoproteína C-III, relativamente a células de controlo não tratadas.

Tabela 14 - Inibição dependente da dose da expressão de ARNm de apolipoproteína C-III em hepatócitos primários de rato 24 horas após o tratamento com oligonucleótidos

Estes dados demonstram que ISIS 353977, ISIS 353978, ISIS 353982, ISIS 353983, e ISIS 353987 reduzem eficazmente ο ARNm da apolipoproteína C-III de um modo dependente da dose.

Exemplo 35: Inibição antissentido da apolipoproteína C-III de rato in vivo: níveis de ARNm

Foram avaliados os efeitos da inibição antissentido de apolipoproteína C-III em ratos. Ratinhos Sprague-Dawley machos de 6 semanas de idade (Charles River Labs, Wilmington, MA) foram alimentados com uma dieta normal de roedor. Os animais receberam injeções intraperitoneais de ISIS 340982 (SEQ ID NO: 233) duas vezes por semana durante duas semanas. Um grupo de animais (n=4) recebeu ISIS 340982 a 75 mg/kg e um grupo de animais (n=4) recebeu ISIS 340982 a 100 mg/kg. Os animais tratados com solução salina (n=4) serviram como grupo de controlo.

No final do período de tratamento, os animais foram sacrificados e o ARN foi isolado a partir do fígado. O ARNm da apolipoproteína C-III foi medido tal como aqui descrito por outros exemplos. Os resultados de cada grupo de tratamento foram avaliados e os níveis de ARNm nos fígados de ratinhos tratados com ISIS 340982 foram normalizados para os níveis de ARNm nos fígados de ratinhos tratados com solução salina. O tratamento com ISIS 340982 a 75 mg/kg ou 100 mg/kg resultou numa redução de 69% e numa redução de 84% no ARNm da apolipoproteína C-III hepática, respetivamente, demonstrando que ISIS 340982 inibiu eficazmente a expressão do ARNm alvo in vivo.

Exemplo 36: Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteina C-III de rato in vivo: pesos corporais, dos fígados e dos baços

Os ratos tratados com ISIS 340782 (SEQ ID NO: 233) tal como descrito no Exemplo 35 foram avaliados quanto a alterações nos pesos corporais, dos figados e dos baços. Os pesos corporais foram registados no inicio do estudo (Semana 0). Após o tratamento de duas semanas com injeções duas vezes por semana de solução salina ou ISIS 340782 a 75 ou 100 mg/kg, os animais foram sacrificados, quarenta e oito horas após a quarta e última injeções, os animais foram sacrificados. Os pesos corporais, dos figados e dos baços foram registados no final do estudo.

Tabela 15 - Pesos corporais, dos fígados e dos baços em ratos tratados com oligonucleótido antissentido dirigido a apolipoproteina C-III

Estes dados demonstram que a inibição antissentido do ARNm da apolipoproteina C-III não estava associada a alterações significativas no peso corporal, do figado ou do baço.

Exemplo 37: Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteina C-III de rato in vivo: niveis de lipidos e de glicose no sangue

Os ratos tratados tal como descrito no Exemplo 35 foram avaliados quanto a alterações no colesterol total, triglicéridos, colesterol HDL, colesterol LDL, ácidos gordos livres e glicose no sangue. Amostras de sangue foram colhidas imediatamente antes dos tratamentos (Semana 0) e após o tratamento de duas semanas com injeções duas vezes por semana de solução salina ou ISIS 340982 (SEQ ID NO: 233) a 75 ou 100 mg/kg. Os niveis de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos, ácidos gordos livres e glicose foram medidos através de métodos clínicos de rotina utilizando um Analisador Clinico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY) . Foi calculada a média dos dados dos quatro animais em cada grupo de tratamento. Os resultados são apresentados na Tabela 16.

Tabela 16 - Efeitos da inibição antissentido de apolipoproteina C-III de rato nos lipidos e na glicose no sangue

A partir dos dados apresentados na Tabela 16 torna-se evidente que o tratamento com ISIS 340982, a ambas as doses administradas, reduziu significativamente os triglicéridos em circulação, o colesterol total, o colesterol HDL e o colesterol LDL em ratos. Além disso, estes animais exibiram reduzida expressão de ARNm de apolipoproteína C-III no fígado após tratamento com ISIS 340982.

Exemplo 38: Efeitos da inibição antissentido da apolipoproteína C-III de rato in vivo: transaminases séricas

Os ratos tratados tal como descrito no Exemplo 35 foram avaliados quanto à toxicidade no fígado após o tratamento com oligonucleótidos antissentido. Após o tratamento de duas semanas com injeções duas vezes por semana de ISIS 340982 (SEQ ID NO: 233) a 75 mg/kg e 100 mg/kg, os animais foram sacrificados e o sangue foi colhido e processado para análise clínica de rotina. Os aumentos das transaminases séricas, ALT e AST, que podem indicar hepatotoxicidade, foram também medidos utilizando um Analisador Clínico Olympus (Olympus America Inc. , Melville, NY) . Os níveis de ALT e AST, mostrados na Tabela 17, são mostrados como o resultado médio dos 4 animais em cada grupo de tratamento, em unidades internacionais/L (UI/L).

Tabela 17 - Efeitos do tratamento com ISIS 340982 nas transaminases séricas em ratos

Níveis de ALT ou AST que sejam o dobro dos do controlo de solução salina são considerados indicativos de hepatotoxicidade. Estes dados demonstram que o tratamento com ISIS 340982 dos ratos, a uma dose quer de 75 mg/kg quer de 100 mg/kg, não resultaram em hepatotoxicidade significativa.

Exemplo 39: Inibição antissentido de expressão da apolipoproteina C-III de hamster através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi

Para o objetivo de concepção de oligonucleótidos antissentido para regiões diferentes do ARNm da apolipoproteina C-III de hamster, um segmento do ARNm da apolipoproteina C-III de hamster Mesocricetus auratus foi sequenciado para proporcionar um segmento da região de codificação e da sequência UTR 3 ' , uma vez que não estava disponível nenhuma sequência publicada do ARNm da apolipoproteina C-III de hamster. 0 ARN foi isolado e purificado a partir de hepatócitos primários de hamster e foi submetido a uma reação de transcriptase reversa (estojo da Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) . 0 ADNc resultante foi o substrato para 40 ciclos de amplificação por PCR (estojo Amplitaq PCR, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) , utilizando os iniciadores direto e inverso complementares às extremidades 5' e 3', respetivamente, da sequência de ARNm de apolipoproteina C-III de ratinho. Após purificação em gel do fragmento de 435 pb resultante, as reações de sequenciação direta e inversa de cada produto foram realizadas através de Retrogen (San Diego, CA). Esta sequência de hamster é aqui incorporada como SEQ ID NO: 352.

Foi concebida uma série de oligonucleótidos para regiões alvo do ARNm da apolipoproteina C-III de hamster (SEQ ID NO: 352) . Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 18. O "local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5') na sequência alvo particular à qual o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 18 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região "gap" central consistindo em dez 2'-desoxinucleótidos, que é flanqueada em ambos os lados (sentidos 5' e 3') por "asas" de cinco nucleótidos. As asas são compostas por 2 '-O- (2-metoxietil)nucleótidos, também conhecidos como (2'-MOE)nucleótidos. As ligações internucleosidicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Os compostos foram analisados quanto ao seu efeito nos níveis de apolipoproteina C-III de hamster em hepatócitos primários de hamster através de PCR quantitativa em tempo real tal como aqui descrito noutros exemplos. As sondas e os iniciadores para a apolipoproteina C-III de hamster foram concebidos para hibridar com uma sequência de apolipoproteina C-III de hamster, utilizando a sequência de ARNm de hamster aqui descrita (SEQ ID NO: 352) . Para a apolipoproteina C-III de hamster os iniciadores de PCR foram: iniciador direto: CGCTAACCAGCATGCAAAAG (SEQ ID NO: 353) iniciador inverso: CACCGTCCATCCAGTCCC(SEQ ID NO: 354) e a sonda de PCR foi: FAM-CTGAGGTGGCTGTGCGGGCC-TAMRA (SEQ ID NO: 355) em que FAM é o corante fluorescente e TAMRA é o corante extintor.

Para GAPDH de hamster os iniciadores de PCR foram: iniciador direto: CCAGCCTCGCTCCGG (SEQ ID NO: 356) iniciador inverso: CCAATACGGCCAAATCCG (SEQ ID NO: 357) e a sonda de PCR foi JOE-ACGCAATGGTGAAGGTCGGCG-TAMRA (SEQ ID NO: 358) em que JOE é o corante repórter fluorescente e TAMRA é o corante extintor.

Os dados são de uma experiência na qual hepatócitos primários de hamster foram tratados com 150 nM dos oligonucleótidos. Os dados, mostrados na Tabela 18, são normalizados para células de controlo não tratadas. Se estiver presente, "N.D." indica "sem dados".

Tabela 18 - Inibição antissentido dos níveis de ARNm de apolipoproteina C-III de hamster através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2'-MOE e um gap desoxi

Foi concebida uma série adicional de oligonucleótidos para regiões alvo diferentes do ARN da apolipoproteína C-III de hamster aqui descrito (SEQ ID NO: 352). Os oligonucleótidos são mostrados na Tabela 19. 0 "local alvo" indica o número do primeiro nucleótido (mais 5') na sequência alvo particular ao qual o oligonucleótido se liga. Todos os compostos na Tabela 19 são oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região "gap" central consistindo em oito 2'-desoxinucleótidos, que é flanqueada de ambos os lados (sentidos 5' e 3') por "asas" de 3 nucleótidos. As asas são compostas por 2'-0-(2-metoxietil)nucleótidos, também conhecidos como (2 ' — MOE)nucleótidos. As ligações internucleosidicas (esqueleto) são fosforotioato (P=S) ao longo do oligonucleótido. Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas.

Tabela 19 - Oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2' -MOE e vim gap desoxi dirigido ao ARNm da apolipoproteina C-III de hamster

Exemplo 40: Inibição antissentido da apolipoproteina C-III de hamster através de oligonucleótidos fosforotioato quiméricos possuindo asas 2 '-MOE e vim gap desoxi: estudos de resposta à dose em hepatócitos primários de hamster

Seis oligonucleótidos dirigidos à apolipoproteina C-III de hamster foram selecionados para estudos adicionais de resposta à dose. Hepatócitos primários de hamster foram tratados com 50, 150, e 300 nM de ISIS 352939 (SEQ ID NO: 369), ISIS 352952 (SEQ ID NO: 380), ISIS 352962 (SEQ ID NO: 389), ISIS 352963 (SEQ ID NO: 390), ISIS 352971 (SEQ ID NO: 397), ou ISIS 352977 (SEQ ID NO: 403) e os níveis de ARNm foram medidos 24 horas após o tratamento com oligonucleótidos tal como aqui descrito noutros exemplos. As células não tratadas serviram como controlo para o qual os dados foram normalizados.

Os resultados destes estudos são mostrados na Tabela 20. Os dados são a média de três experiências e são expressos como percentagem de inibição, relativamente a controlos não tratados.

Tabela 20 - Inibição da expressão de ARNm de apolipoproteina C-III em hepatócitos primários de hamster 24 horas após o tratamento com oligonucleótidos

Tal como mostrado na Tabela 20, ISIS 352939 foi eficaz na redução dos níveis de ARNm de apolipoproteina C-III de hamster de um modo dependente da dose.

Exemplo 41: Oligonucleótidos antissentido dirigidos à apolipoproteina C-III de ratinho

Oligonucleótidos antissentido adicionais dirigidos para a apolipoproteina C-III de ratinho foram concebidos utilizando a informação sobre a sequência publicada (número de acesso GenBank L04150.1, aqui incorporada como SEQ ID NO: 11) . Ambos se dirigem à posição do nucleótido 496 de SEQ ID NO: 11, tal como ISIS 167880 (SEQ ID NO: 117), mas variam na composição química relativamente a ISIS 167880. ISIS 340995 tem 20 nucleótidos de comprimento, compostos por uma região gap central de 10 nucleótidos de comprimento, em que o gap contém tanto 2'-desoxinucleótidos como 2'-MOE (MOE)nucleótidos. A composição de nucleótidos é mostrada na Tabela 21, onde os nucleótidos 2'-MOE estão indicados a negrito, e os 2'- desoxinucleótidos estão sublinhados. 0 gap é flanqueado de ambos os lados (extremidades 5' e 3') por "asas" de 5 nucleótidos compostas por nucleótidos 2'-MOE. ISIS 340997 (SEQ ID NO: 117) tem 20 nucleótidos de comprimento e é composto de modo uniforme por nucleótidos 2'-MOE. Ao longo tanto de ISIS 340995 como de ISIS 340997, as ligações internucleosídicas (esqueleto) são fosforotioato e todos os resíduos de citidina são citidinas não modificadas.

Tabela 21 - Oligonucleótidos antissentido dirigidos a apolipoproteina C-III de ratinho

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110>Rosanne, M. Crooke Mark J. Graham Kristina M. Lemonidis Kenneth W. Dobie

<120> MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DA APOLIPOPROTEINA C-III

<130> BIOL0004US <140> 10/418,780 <141> 2003-04-16 <160> 224

<210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 1 tccgtcatcg ctcctcaggg 20

<210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 2 gtgcgcgcga gcccgaaatc 20

<210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 3 atgcattctg cccccaagga 20 <210> 4 <211> 3958 <212> ADN <213> H. sapiens <22 0> <4Ο0> 4 ctactccagg ctgtgttcag ggcttggggc tggtggaggg aggggcctga aattccagtg 60 tgaaaggctg agatgggccc gaggcccctg gcctatgtcc aagccatttc ccctctcacc 120 agcctctccc tggggagcca gtcagctagg aaggaatgag ggctccccag gcccaccccc 180 agttcctgag ctcatctggg ctgcagggct ggcgggacag cagcgtggac tcagtctcct 240 agggatttcc caactctccc gcccgcttgc tgcatctgga caccctgcct caggccctca 300 tctccactgg tcagcaggtg acctttgccc agcgccctgg gtcctcagtg cctgctgccc 360 tggagatgat ataaaacagg tcagaaccct cctgcctgtc tgctcagttc atccctagag 420 gcagctgctc caggtaatgc cctctgggga ggggaaagag gaggggagga ggatgaagag 480 gggcaagagg agctccctgc ccagcccagc cagcaagcct ggagaagcac ttgctagagc 540 taaggaagcc tcggagctgg acgggtgccc cccacccctc atcataacct gaagaacatg 600 gaggcccggg aggggtgtca cttgcccaaa gctacatagg gggtggggct ggaagtggct 660 ccaagtgcag gttcccccct cattcttcag gcttagggct ggaggaagcc ttagacagcc 720 cagtcctacc ccagacaggg aaactgaggc ctggagaggg ccagaaatca cccaaagaca 780 cacagcatgt tggctggact ggacggagat cagtccagac cgcaggtgcc ttgatgttca 840 gtctggtggg ttttctgctc catcccaccc acctcccttt gggcctcgat ccctcgcccc 300 tcaccagtcc cccttctgag agcccgtatt agcagggagc cggcccctac tccttctggc 960 agacccagct aaggttctac cttaggggcc acgccacctc cccagggagg ggtccagagg 1020 catggggacc tggggtgccc ctcacaggac acttccttgc aggaacagag gtgccatgca 1080 gccccgggta ctccttgttg ttgccctcct ggcgctcctg gcctctgccc gtaagcactt 1140 ggtgggactg ggctgggggc agggtggagg caacttgggg atcccagtcc caatgggtgg 1200 tcaagcagga gcccagggct cgtccatagg ccgatccacc ccactcagcc ctgctctttc 1260 ctcaggagct tcagaggccg aggatgcctc ccttctcagc ttcatgcagg gctacatgaa 1320 gcacgccacc aagaccgcca aggatgcact gagcagcgtg caggagtccc aggtggccca 1380 gcaggccagg tacacccgct ggcctccctc cccatccccc ctgccagctg cctccattcc 1440 caeceaeecc tgceetggtg agateeeaac aatggaatgg aggtgcteea geeteeeetg 1500 ggcctgtgcc tcttcagcct cctctttcct cacagggcct ttgtcaggct gctgcgggag 1560 agatgacaga gttgagactg cattcctccc aggtccctcc tttctcccca gagcagtcct 1620 agggcgcgcc gttttagccc tcatttccat tttcctttcc tttccctttc tttccctttc 1680 tatttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt 1740 tctttctttc ctttctttct ttcttttctt ctttctttct ttcctttctt tctctttctt 1800 tctttctttc tttccttttt ctttctttcc ctctcttcct ttctctcttt ctttcttctt 1860 cttttttttt taatggagtc tccctctgtc acccaggctg gagtgcagtg gtgccatctc 1920 ggctcactgc aacctccgtc tcccgggttc aacccattct cctgcctcag cctcccaagt 1980 agctgggatt acaggcacgc gccaccacac ccagctaatt tttgtatttt tagcagagat 2040 ggggtttcac catgttggcc aggttggtct tgaattcctg acctcagggg atcctcctgc 2100 ctcggcctcc caaagcgctg ggattacagg catgagccac tgcgcctggc cccattttcc 2160 ttttctgaag gtctggctag agcagtggtc ctcagccttt ttggcaccag ggaccagttt 2220 tgtggtggac aatttttcca tgggccagcg gggatggttt tgggatgaag ctgttccacc 2280 tcagatcatc aggcattaga ttctcataag gagccctcca cctagatccc tggcatgtgc 2340 agttcacaac agggttcaca ctcctatgag aatgtaaggc cacttgatct gacaggaggc 2400 ggagctcagg cggtattgct cactcaccca ccactcactt cgtgctgtgc agcccggctc 2460 ctaacagtcc atggaccagt acctatctat gacttggggg ttggggaccc ctgggctagg 2520 ggtttgcctt gggaggcccc acctgaccta attcaagccc gtgagtgctt ctgctttgtt 2580 ctaagacctg gggccagtgt gagcagaagt gtgtccttcc tctcccatcc tgcccctgcc 2640 catcagtact ctcctctccc ctactccctt ctccacctca ccctgactgg cattagctgg 2700 catagcagag gtgttcataa acattcttag tccccagaac cggctttggg gtaggtgtta 2760 ttttctcact ttgcagatga gaaaattgag gctcagagcg attaggtgac ctgccccaga 2820 tcacacaact aatcaatcct ccaatgactt tccaaatgag aggctgcctc cctctgtcct 2880 accctgctca gagccaccag gttgtgcaac tccaggcggt gctgtttgca cagaaaacaa 2940 tgacagcctt gacctttcac atctccccac cctgtcactt tgtgcctcag gcccaggggc 3000 ataaacatct gaggtgacct ggagatggca gggtttgact tgtgctgggg ttcctgcaag 3060 gatatctctt ctcccagggt ggcagctgtg ggggattcct gcctgaggtc tcagggctgt 3120 cgtccagtga agttgagagg gtggtgtggt cctgactggt gtcgtccagt ggggacatgg 3180 gtgtgggtcc catggttgcc tacagaggag ttctcatgcc ctgctctgtt gcttcccctg 3240 actgatttag gggctgggtg accgatggct tcagttccct gaaagactac tggagcaccg 3300 ttaaggacaa gttctctgag ttctgggatt tggaccctga ggtcagacca acttcagccg 3360 tggctgcctg agacctcaat accccaagtc cacctgccta tccatcctgc cagctccttg 3420 ggtcctgcaa tctccagggc tgcccctgta ggttgcttaa aagggacagt attctcagtg 3480 ctctcctacc ccacctcatg cctggccccc ctccaggcat gctggcctcc caataaagct 3540 ggacaagaag ctgctatgag tgggccgtcg caagtgtgcc atctgtgtct gggcatggga 3600 aagggccgag gctgttctgt gggtgggcac tggacagact ccaggtcagg caggcatgga 3660 ggccagcgct ctatccacct tctggtagct gggcagtctc tgggcctcag tttcttcatc 3720 tctaaggtag gaatcaccct ccgtaccctg ccttccttga cagctttgtg cggaaggtca 3780 aacaggacaa taagtttgct gatactttga taaactgtta ggtgctgcac aacatgactt 3840 gagtgtgtgc cccatgccag ccactatgcc tggcacttaa gttgtcatca gagttgagac 3900 tgtgtgtgtt tactcaaaac tgtggagctg acctccccta tccaggccac ctagccct 3958

<210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <400> 5 tcagcttcat gcagggttac at 22

<210> 6 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <400> 6 acgctgctca gtgcatcct 19

<210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> Sonda de PCR <4Ο0> 7 aagcacgcca ccaagaccgc c 21

<210> 8 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <400> 8 gaaggtgaag gtcggagtc

<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <400> 9 gaagatggtg atgggatttc 20

<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sonda de PCR <4 0 0> 10 caagcttccc gttctcagcc 20 <210> 11 <211> 518 <212> ADN <213> M. musculus <22 0> <4 0 0> 11 cctgctcagt tttatcccta gaagcagcta gctactccag gtacgtaggt gccatgcagc 60 cccggacgct cctcactgtg gccctcttgg ctctcctggc atctgcccga gctgaagagg 120 tagagggatc cttgctgctg ggctctgtgc agggctacat ggaacaagcc tccaagacgg 180 tccaggatgc gctaagtagc gtgcaggagt ccgatatagc tgcggtggcc aggggctgga 240 tggacaatca cttcagattc ctgaaaggct actggagcaa gtttactgac aagttcaccg 300 gcttctggga ttctaaccct gaggaccaac caactccagc tattgagtcg tgagacttct 360 gtgttgcaga tgtgcctgtt cctccatcct gctgcccccc tccaggcctg ccaggtggcc 420 cctgaaggtt gctttaaggg gaaagtatgt tctcatgtct tcacccctcc ctagatctca 480 cctaaacatg ctgtccctaa taaagctgga taagaagc 518

<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <4 0 0> 12 tgcagggcta catggaacaa 20

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> Iniciador de PCR <4 Ο 0> 13 cggactcctg cacgctactt 20

<210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sonda de PCR <4 0 0> 14 ctccaagacg gtccaggatg cgc 23

<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <4 0 0> 15 ggcaaattca acggcacagt 20

<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR <4 0 0> 16 gggtctcgct cctggaagat 20 <210> 17

<211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sonda de PCR <4 0 0> 17 aaggccgaga atgggaagct tgtcatc 27 <210> 18 <211> 533 <212> ADN <213> H. sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (47)... (346) <4 0 0> 18 tgctcagttc atccctagag gcagctgctc caggaacaga ggtgcc atg cag ccc 55

Met Gin Pro 1 egg gta etc ett gtt gtt gee etc etg geg etc ctg gee tet gee ega 103

Arg Val Leu Leu Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg 5 10 15 get tea gag gee gag gat gee tee ett etc age ttc atg cag ggt tac 151

Ala Ser Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Leu Ser Phe Met Gin Gly Tyr 20 25 30 35 atg aag eae gee ace aag ace gee aag gat gca ctg age age gtg cag 199

Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu Ser Ser Val Gin 40 45 50 gag tee cag gtg gee cag cag gee agg ggc tgg gtg acc gat ggc ttc 247

Glu Ser Gin Val Ala Gin Gin Ala Arg Gly Trp Val Thr Asp Gly Phe 55 60 65 agt tee ctg aaa gac tac tgg age acc gtt aag gac aag ttc tet gag 295

Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys Phe Ser Glu 70 75 80 ttc tgg gat ttg gac cct gag gtc aga cca act tea gee gtg get gee 343

Phe Trp Asp Leu Asp Pro Glu Val Arg Pro Thr Ser Ala Val Ala Ala 85 90 95 tga gacctcaata ccccaagtcc acctgcctat ccatcctgcg agctcettgg 396 * gtcctgcaat ctccagggct gcccctgtag gttgcttaaa agggacagta ttctcagtge 456 tctcctaccc cacctcatgc ctggcccccc tccaggeatg ctggcctccc aataaagetg 516 gacaagaagc tgctatg 533

<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 19 ctggagcagc tgcctctagg 20

<210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 20 ccctgcatga agctgagaag 20

<210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 21 gtgcttcatg taaccctgca 20

<210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 22 tggcctgctg ggccacctgg 20

<210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 23 tgctccagta gtctttcagg 20

<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 24 tgacctcagg gtccaaatcc 20

<210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 25 ctctagggat gaactgagca 20

<210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 26 cagctgcctc tagggatgaa 20 <210> 27 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 27 ttcctggagc agctgcctct 20

<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 28 acctctgttc ctggagcagc 20

<210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 29 atggcacctc tgttcctgga 20

<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 30 gggctgcatg gcacctctgt 20

<210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 31 ggcaacaaca aggagtaccc 20

<210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 32 ggagggcaac aacaaggagt 20

<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 33 agctcgggca gaggccagga 20

<210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 34 tctgaagctc gggcagaggc 20

<210> 35 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 35 cggcctctga agctcgggca 20

<210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 36 catcctcggc ctctgaagct 20

<210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 37 gggaggcatc ctcggcctct 20

<210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 38 gagaagggag gcatcctcgg 20

<210> 39 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 39 gctgagaagg gaggcatcct 20

<210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 40 tgcatgaagc tgagaaggga 20

<210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 41 gcgtgcttca tgtaaccctg 20

<210> 42 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 42 ttggtggcgt gcttcatgta 20

<210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 43 gcatccttgg cggtcttggt 20 <210> 44 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 44 ctcagtgcat ccttggcggt 20

<210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 45 tgctcagtgc atccttggcg 20

<210> 46 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 4 6 ctcctgcacg ctgctcagtg 20

<210> 47 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 47 gactcctgca cgctgctcag 20

<210> 48 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 48 gccacctggg actcctgcac 20

<210> 49 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 49 gcccctggcc tgctgggcca 20

<210> 50 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 50 agcccctggc ctgctgggcc 20

<210> 51 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 51 gaagccatcg gtcacccagc 20

<210> 52 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 52 ctgaagccat cggtcaccca 20

<210> 53 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 53 tttcagggaa ctgaagccat 20

<210> 54 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 54 cagtagtctt tcagggaact 20

<210> 55 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 55 aacggtgctc cagtagtctt 20

<210> 56 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 56 ccttaacggt gctccagtag 20

<210> 57 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 57 gaacttgtcc ttaacggtgc 20

<210> 58 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 58 ctcagagaac ttgtccttaa 20

<210> 59 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 59 agaactcaga gaacttgtcc 20

<210> 60 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 60 atcccagaac tcagagaact 20 <210> 61 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 61 cagggtccaa atcccagaac 20

<210> 62 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 62 ttggtctgac ctcagggtcc 20

<210> 63 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 63 gttggtctga cctcagggtc 20

<210> 64 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 64 gctgaagttg gtctgacctc 20

<210> 65 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 65 cagccacggc tgaagttggt 20

<210> 66 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 66 caggcagcca cggctgaagt 20

<210> 67 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 67 attgaggtct caggcagcca 20

<210> 68 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 68 tggataggca ggtggacttg 20

<210> 69 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 6 9 ctcgcaggat ggataggcag 20

<210> 70 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 70 aggagctcgc aggatggata 20

<210> 71 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 71 gacccaagga gctcgcagga 20

<210> 72 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 72 tgcaggaccc aaggagctcg 20

<210> 73 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 73 tggagattgc aggacccaag 20

<210> 74 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 74 agccctggag attgcaggac 20

<210> 75 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 75 ggcagccctg gagattgcag 20

<210> 76 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 76 ccttttaagc aacctacagg 20

<210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 77 ctgtcccttt taagcaacct 20 <210> 78 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 78 agaatactgt cccttttaag 20

<210> 79 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 79 cactgagaat actgtccctt 20

<210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 80 taggagagca ctgagaatac 20

<210> 81 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 81 gggtaggaga gcactgagaa 20

<210> 82 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 82 aggccagcat gcctggaggg 20

<210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 83 ttgggaggcc agcatgcctg 20

<210> 84 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 84 agctttattg ggaggccagc 20

<210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 85 tgtccagctt tattgggagg 20

<210> 86 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 86 cttgtccagc tttattggga 20

<210> 87 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 87 agcttcttgt ccagctttat 20

<210> 88 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 88 catagcagct tcttgtccag 20

<210> 89 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 89 acctggagca gctgcctcta 20

<210> 90 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 90 agggcattac ctggagcagc 20

<210> 91 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 91 acctctgttc ctgcaaggaa 20

<210> 92 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 92 aagtgcttac gggcagaggc 20

<210> 93 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 93 gcgggtgtac ctggcctgct 20

<210> 94 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 94 aaccctgttg tgaactgcac 20 <210> 95 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 95 agtgagcaat accgcctgag 20

<210> 96 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 9 6 cgggcttgaa ttaggtcagg 20

<210> 97 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 97 tagggataaa actgagcagg 20

<210> 98 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 98 ctggagtagc tagctgcttc 20

<210> 99 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 99 gctgcatggc acctacgtac 20

<210> 100 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 100 ccacagtgag gagcgtccgg 20

<210> 101 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 101 ggcagatgcc aggagagcca 20

<210> 102 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 102 ctacctcttc agctcgggca 20

<210> 103 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 103 cagcagcaag gatccctcta 20

<210> 104 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 104 gcacagagcc cagcagcaag 20

<210> 105 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 105 ccctggccac cgcagctata 20

<210> 106 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 106 atctgaagtg attgtccatc 20

<210> 107 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 107 agtagccttt caggaatctg 20

<210> 108 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 108 cttgtcagta aacttgctcc 20

<210> 109 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 109 gaagccggtg aacttgtcag 20

<210> 110 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 110 gaatcccaga agccggtgaa 20

<210> 111 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 111 ggttagaatc ccagaagccg 20 <210> 112 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 112 tggagttggt tggtcctcag 20

<210> 113 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 113 tcacgactca atagctggag 20

<210> 114 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 114 cccttaaagc aaccttcagg 20

<210> 115 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 115 agacatgaga acatactttc 20

<210> 116 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 116 catgtttagg tgagatctag 20

<210> 117 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 117 tcttatccag ctttattagg 20

<210> 118 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 118 cctagaggca gctgctccag 20

<210> 119 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 119 cttctcagct tcatgcaggg 20

<210> 120 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 120 tgcagggtta catgaagcac 20

<210> 121 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 121 ccaggtggcc cagcaggcca 20

<210> 122 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 122 cctgaaagac tactggagca 20

<210> 123 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 123 tgctcagttc atccctagag 20

<210> 124 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 124 agaggcagct gctccaggaa 20

<210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 125 gctgctccag gaacagaggt 20

<210> 126 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 126 tccaggaaca gaggtgccat 20

<210> 127 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 127 acagaggtgc catgcagccc 20

<210> 128 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 128 gggtactcct tgttgttgcc 20 <210> 129 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 129 actccttgtt gttgccctcc 20

<210> 130 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 130 tcctggcctc tgcccgagct 20

<210> 131 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 131 gcctctgccc gagcttcaga 20

<210> 132 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 132 agcttcagag gccgaggatg 20

<210> 133 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 133 agaggccgag gatgcctccc 20

<210> 134 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 134 ccgaggatgc ctcccttctc 20

<210> 135 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 135 aggatgcctc ccttctcagc 20

<210> 136 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 136 tcccttctca gcttcatgca 20

<210> 137 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 137 cagggttaca tgaagcacgc 20

<210> 138 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 138 tacatgaagc acgccaccaa 20

<210> 139 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 139 accaagaccg ccaaggatgc 20

<210> 140 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 140 accgccaagg atgcactgag 20

<210> 141 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 141 cgccaaggat gcactgagca 20

<210> 142 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 142 cactgagcag cgtgcaggag 20

<210> 143 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 143 ctgagcagcg tgcaggagtc 20

<210> 144 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 144 gtgcaggagt cccaggtggc 20

<210> 145 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 145 tggcccagca ggccaggggc 20 <210> 146 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 146 ggcccagcag gccaggggct 20

<210> 147 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 147 gctgggtgac cgatggcttc 20

<210> 148 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 148 tgggtgaccg atggcttcag 20

<210> 149 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 149 atggcttcag ttccctgaaa 20

<210> 150 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 150 aagactactg gagcaccgtt 20

<210> 151 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 151 ctactggagc accgttaagg 20

<210> 152 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 152 gcaccgttaa ggacaagttc 20

<210> 153 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 153 ttaaggacaa gttctctgag 20

<210> 154 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 154 ggacaagttc tctgagttct 20

<210> 155 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 155 gttctgggat ttggaccctg 20

<210> 156 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 156 ggaccctgag gtcagaccaa 20

<210> 157 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 157 gaccctgagg tcagaccaac 20

<210> 158 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 158 gaggtcagac caacttcagc 20

<210> 159 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 159 accaacttca gccgtggctg 20

<210> 160 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 160 acttcagccg tggctgcctg 20

<210> 161 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 161 tggctgcctg agacctcaat 20

<210> 162 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 162 caagtccacc tgcctatcca 20 <210> 163 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 163 ctgcctatcc atcctgcgag 20

<210> 164 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 164 tatccatcct gcgagctcct 20

<210> 165 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 165 tcctgcgagc tccttgggtc 20

<210> 166 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 166 cgagctcctt gggtcctgca 20

<210> 167 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 167 cttgggtcct gcaatctcca 20

<210> 168 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 168 gtcctgcaat ctccagggct 20

<210> 169 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 169 ctgcaatctc cagggctgcc 20

<210> 170 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 170 cctgtaggtt gcttaaaagg 20

<210> 171 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 171 aggttgctta aaagggacag 20

<210> 172 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 172 cttaaaaggg acagtattct 20

<210> 173 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 173 aagggacagt attctcagtg 20

<210> 174 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 174 20 gtattctcag tgctctccta 20

<210> 175 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 175 ttctcagtgc tctcctaccc 20

<210> 176 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 176 ccctccaggc atgctggcct 20

<210> 177 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 177 caggcatgct ggcctcccaa 20

<210> 178 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 178 gctggcctcc caataaagct 20

<210> 179 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 179 cctcccaata aagctggaca 20 <210> 180 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 180 tcccaataaa gctggacaag 20

<210> 181 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 181 ataaagctgg acaagaagct 20

<210> 182 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 182 ctggacaaga agctgctatg 20

<210> 183 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 183 tagaggcagc tgctccaggt 20

<210> 184 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 184 gctgctccag gtaatgccct 20

<210> 185 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 185 ttccttgcag gaacagaggt 20

<210> 186 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 186 gcctctgccc gtaagcactt 20

<210> 187 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 187 agcaggccag gtacacccgc 20

<210> 188 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 188 gtgcagttca caacagggtt 20

<210> 189 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 189 ctcaggcggt attgctcact 20

<210> 190 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 190 cctgacctaa ttcaagcccg 20

<210> 191 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 191 cctgctcagt tttatcccta 20

<210> 192 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 192 gtacgtaggt gccatgcagc 20

<210> 193 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 193 ccggacgctc ctcactgtgg 20

<210> 194 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 194 tggctctcct ggcatctgcc 20

<210> 195 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 195 tgcccgagct gaagaggtag 20

<210> 196 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 196 tagagggatc cttgctgctg 20 <210> 197 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 197 cttgctgctg ggctctgtgc 20

<210> 198 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 198 tatagctgcg gtggccaggg 20

<210> 199 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <4 0 0> 199 cagattcctg aaaggctact 20

<210> 200 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 200 ggagcaagtt tactgacaag 20

<210> 201 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 201 ctgacaagtt caccggcttc 20

<210> 202 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 202 cggcttctgg gattctaacc 20

<210> 203 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 203 ctgaggacca accaactcca 20

<210> 204 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 204 ctccagctat tgagtcgtga 20

<210> 205 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 205 cctgaaggtt gctttaaggg 20

<210> 206 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 206 gaaagtatgt tctcatgtct 20

<210> 207 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 207 ctagatctca cctaaacatg 20

<210> 208 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 208 cctaataaag ctggataaga 20

<210> 209 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 209 gctgcatggc acctctgttc 20

<210> 210 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 210 ggcagaggc caggagcgcca 20

<210> 211 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 211 ctgaagctcg ggcagaggcc 20

<210> 212 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 212 tcctcggcct ctgaagctcg 20

<210> 213 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 213 tcttggtggc gtgcttcatg 20

<210> 214 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 214 gctcagtgca tccttggcgg 20

<210> 215 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 215 cctgcacgct gctcagtgca 20

<210> 216 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 216 actgaagcca tcggtcaccc 20

<210> 217 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 217 cagaactcag agaacttgtc 20

<210> 218 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 218 gttggtc tgacctcagg 20

<210> 219 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 219 ccctggagat tgcaggaccc 20

<210> 220 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 220 gggcagccct ggagattgca 20

<210> 221 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 221 cccttttaa gcaacctacag 20

<210> 222 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Antissentido <400> 222 cgagaggcgg acgggaccg 19

<210> 223 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Composto Oligomérico <22 0> <221> misc_feature <222> (1)...(19) <223> as bases nestas posições são ARN <400> 223 cgagaggcgg acgggaccgt t 21

<210> 224 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Composto Oligomérico <22 0> <221> misc feature <222> (3)...(21) <223> as bases nestas posições são ARN <400> 224 ttgctctccg cctgccctgg c 21

Lisboa, 12 de novembro de 2015

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de 15 a 30 nucleobases de comprimento dirigido à região 3' não traduzida (3'UTR) de uma molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III humana, em que o referido composto híbrida especificamente com a referida molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III humana e inibe a expressão da apolipoproteína C-III humana, em que o referido composto é pelo menos 90% complementar à referida molécula de ácido nucleico codificando apolipoproteína C-III humana, para utilização em terapia.
2. 2. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto é um oligonucleótido antissentido.
3. 3. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o composto tem uma sequência que é pelo menos 95% ou é 100% complementar à molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III.
4. 4. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico codificando a apolipoproteína C-III humana possuindo a sequência de SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:18.
5. 5. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, possuindo pelo menos uma ligação internucleosídica, porção açúcar ou nucleobase modificada.
6. 6. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 5, possuindo pelo menos uma porção açúcar 2'-0-metoxietilo, ligação internucleosídica fosforotioato ou 5-metilcitosina.
7. 7. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido composto é um oligonucleótido antissentido quimérico.
8. 8. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o referido oligonucleótido quimérico tem 20 nucleótidos de comprimento, compreendendo dez 2'-desoxinucleótidos, flanqueado de cada lado por cinco nucleótidos 2'-metoxietilo, em que as ligações internucleosídicas são fosforotioato, e todos os resíduos de citosina são 5-metilcitosinas.
9. 9. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para utilização em tratamento de um animal possuindo uma doença ou condição associada a apolipoproteína C-III num animal, em que: (i) a doença ou condição envolve metabolismo de lípidos anormal; (ii) a doença ou condição envolve metabolismo de colesterol anormal; (iii) a doença ou condição é aterosclerose; (iv) a doença ou condição é uma condição metabólica anormal; (v) a doença ou condição é hiperlipidemia; (vi) a doença ou condição é hipertrigliceridemia (vii) a doença ou condição é diabetes; (viii) a doença ou condição é obesidade; ou (ix) a doença ou condição é doença cardiovascular.
10. 10. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1 e um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável, para utilização em terapia, em que o composto tem uma sequência consistindo na sequência de nucleobases de SEQ ID NO: 87, e é um oligonucleótido quimérico de 20 nucleótidos de comprimento, compreendendo uma região de intervalo (gap) consistindo em dez 2'-desoxinucleótidos, flanqueada de cada lado por cinco nucleótidos 2'-O-metoxietilo, em que as ligações internucleosidicas são ligações fosforotioato ao longo do oligonucleótido e todos os resíduos de citosina são 5-metilcitosinas. Lisboa, 12 de novembro de 2015