ES2666405T3 - Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III - Google Patents
Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III Download PDFInfo
- Publication number
- ES2666405T3 ES2666405T3 ES15189401.1T ES15189401T ES2666405T3 ES 2666405 T3 ES2666405 T3 ES 2666405T3 ES 15189401 T ES15189401 T ES 15189401T ES 2666405 T3 ES2666405 T3 ES 2666405T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- iii
- apolipoprotein
- isis
- seq
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010056301 Apolipoprotein C-III Proteins 0.000 title claims abstract description 179
- 102000030169 Apolipoprotein C-III Human genes 0.000 title claims abstract description 179
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 82
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 247
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 239
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 88
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 85
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 84
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 75
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 73
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 62
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 58
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 55
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 52
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 41
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 39
- -1 5-methylcytosine nucleoside Chemical class 0.000 claims description 38
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 37
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 36
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 36
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 24
- 101000793223 Homo sapiens Apolipoprotein C-III Proteins 0.000 claims description 21
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 14
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 7
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000006575 hypertriglyceridemia Diseases 0.000 claims description 6
- 150000002829 nitrogen Chemical class 0.000 claims description 5
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 4
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical class CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 claims description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 135
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 38
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 198
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 197
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 197
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 197
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 151
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 122
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 114
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 73
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 54
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 46
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 38
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 38
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 38
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 37
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 35
- YIMATHOGWXZHFX-WCTZXXKLSA-N (2r,3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-(2-methoxyethoxy)oxolane-2,4-diol Chemical compound COCCO[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O YIMATHOGWXZHFX-WCTZXXKLSA-N 0.000 description 34
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 32
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 31
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 28
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 28
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 28
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 26
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 25
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 24
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 22
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 21
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 21
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 20
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 20
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 19
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 19
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 19
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 19
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 18
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 18
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 16
- 101000793216 Mus musculus Apolipoprotein C-III Proteins 0.000 description 16
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 16
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 15
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 14
- 125000001570 methylene group Chemical class [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 13
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 11
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 11
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 11
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 11
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical class O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101000793229 Rattus norvegicus Apolipoprotein C-III Proteins 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 9
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 9
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 9
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 9
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 9
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 7
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 7
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 7
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 150000002905 orthoesters Chemical group 0.000 description 7
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 6
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 6
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 6
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 6
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 238000012247 phenotypical assay Methods 0.000 description 6
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 6
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 6
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 6
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 5
- 102000006752 Hepatocyte Nuclear Factor 4 Human genes 0.000 description 5
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 5
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 5
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 108091008634 hepatocyte nuclear factors 4 Proteins 0.000 description 5
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 5
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 4
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical group [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 4
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 101001066129 Homo sapiens Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 101000950669 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 9 Proteins 0.000 description 3
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 3
- 102100037809 Mitogen-activated protein kinase 9 Human genes 0.000 description 3
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 3
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical group [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 102000047486 human GAPDH Human genes 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027962 2-5A-dependent ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010000834 2-5A-dependent ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 2-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=CC=N1 ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 7-methyladenine Chemical compound C1=NC(N)=C2N(C)C=NC2=N1 HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 2
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010046315 IDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 2
- 102000043296 Lipoprotein lipases Human genes 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 101000819572 Mus musculus Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 2
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000034527 Retinoid X Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 101000650578 Salmonella phage P22 Regulatory protein C3 Proteins 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 101001040920 Triticum aestivum Alpha-amylase inhibitor 0.28 Proteins 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine group Chemical group [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12 OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 2
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N floxuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- HXJZHJLLMIGFCM-UHFFFAOYSA-N hydroxy-imino-di(propan-2-yloxy)-$l^{5}-phosphane Chemical compound CC(C)OP(N)(=O)OC(C)C HXJZHJLLMIGFCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=NC2=C1 RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000003196 serial analysis of gene expression Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 125000003808 silyl group Chemical group [H][Si]([H])([H])[*] 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- AELCINSCMGFISI-DTWKUNHWSA-N (1R,2S)-tranylcypromine Chemical compound N[C@@H]1C[C@H]1C1=CC=CC=C1 AELCINSCMGFISI-DTWKUNHWSA-N 0.000 description 1
- MDKGKXOCJGEUJW-VIFPVBQESA-N (2s)-2-[4-(thiophene-2-carbonyl)phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC([C@@H](C(O)=O)C)=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 MDKGKXOCJGEUJW-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGVQZRDQPDLHHV-DPAQBDIFSA-N (3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3-thiol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](S)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 QGVQZRDQPDLHHV-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- PTFYZDMJTFMPQW-UHFFFAOYSA-N 1,10-dihydropyrimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2-one Chemical compound O1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CNC(=O)N2 PTFYZDMJTFMPQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical class C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRANPJDWHYRCER-UHFFFAOYSA-N 1,2-diazepine Chemical compound N1C=CC=CC=N1 LRANPJDWHYRCER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDRBENUDPPWQDP-QMWXCIFZSA-N 1-[(2S,3R,4R,5R)-3-butyl-2-diphenylsilyl-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C(CCC)[C@@]1([C@@](O[C@@H]([C@H]1O)CO)(N1C(=O)NC(=O)C(=C1)C)[SiH](C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)O CDRBENUDPPWQDP-QMWXCIFZSA-N 0.000 description 1
- QTYFNPZWMLUGBH-JQYHKRKISA-N 1-[(2S,3R,4R,5R)-3-butyl-3-[2-(dimethylaminooxy)ethoxy]-2-diphenylsilyl-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C(CCC)[C@@]1([C@@](O[C@@H]([C@H]1O)CO)(N1C(=O)NC(=O)C(=C1)C)[SiH](C1=CC=CC=C1)C1=CC=CC=C1)OCCON(C)C QTYFNPZWMLUGBH-JQYHKRKISA-N 0.000 description 1
- GMZNBKCNDPRJTL-PRULPYPASA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-3-[2-(dimethylaminooxy)ethoxy]-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound CN(C)OCCO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 GMZNBKCNDPRJTL-PRULPYPASA-N 0.000 description 1
- NEVQCHBUJFYGQO-DNRKLUKYSA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-(2-methoxyethoxy)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound COCCO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 NEVQCHBUJFYGQO-DNRKLUKYSA-N 0.000 description 1
- WIPCVBQXKBWNRC-PBAMLIMUSA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxy-3-(2-methoxyethoxy)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](O)[C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C(C)=C1)=O)OCCOC)OC(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 WIPCVBQXKBWNRC-PBAMLIMUSA-N 0.000 description 1
- OYEJRBXHENMLMA-PMHJDTQVSA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-5-[[tert-butyl(diphenyl)silyl]oxymethyl]-4-hydroxy-3-(2-hydroxyethoxy)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](OCCO)[C@H](O)[C@@H](CO[Si](C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C(C)(C)C)O1 OYEJRBXHENMLMA-PMHJDTQVSA-N 0.000 description 1
- QPHRQMAYYMYWFW-FJGDRVTGSA-N 1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@]1(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 QPHRQMAYYMYWFW-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 1
- UBTJZUKVKGZHAD-UHFFFAOYSA-N 1-[5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OCC1C(O)CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 UBTJZUKVKGZHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 1-oxidanylurea Chemical compound N[14C](=O)NO VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 10H-phenothiazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3SC2=C1 WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBPWSSGDRRHUNT-CEGNMAFCSA-N 17α-hydroxyprogesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2 DBPWSSGDRRHUNT-CEGNMAFCSA-N 0.000 description 1
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- HVVJCLFLKMGEIY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dioctadecoxypropyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OCCCCCCCCCCCCCCCCCC HVVJCLFLKMGEIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminopropyl)-7h-purin-6-amine Chemical compound CC(N)CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBUUPFTVAPUWDE-UGZDLDLSSA-N 2-[[(2S,4S)-2-[bis(2-chloroethyl)amino]-2-oxo-1,3,2lambda5-oxazaphosphinan-4-yl]sulfanyl]ethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCS[C@H]1CCO[P@](=O)(N(CCCl)CCCl)N1 PBUUPFTVAPUWDE-UGZDLDLSSA-N 0.000 description 1
- BRLJKBOXIVONAG-UHFFFAOYSA-N 2-[[5-(dimethylamino)naphthalen-1-yl]sulfonyl-methylamino]acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)N(C)CC(O)=O BRLJKBOXIVONAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXUZARPLRQRNNX-DXTOWSMRSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1F UXUZARPLRQRNNX-DXTOWSMRSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 2-fluoroadenine Chemical compound NC1=NC(F)=NC2=C1N=CN2 WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XIFVTSIIYVGRHJ-UHFFFAOYSA-N 2-n,2-n,4-n,4-n,6-n-pentamethyl-1,3,5-triazine-2,4,6-triamine Chemical compound CNC1=NC(N(C)C)=NC(N(C)C)=N1 XIFVTSIIYVGRHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PDBUTMYDZLUVCP-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydro-1,4-benzoxazin-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)CNC2=C1 PDBUTMYDZLUVCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASFAFOSQXBRFMV-LJQANCHMSA-N 3-n-(2-benzyl-1,3-dihydroxypropan-2-yl)-1-n-[(1r)-1-(4-fluorophenyl)ethyl]-5-[methyl(methylsulfonyl)amino]benzene-1,3-dicarboxamide Chemical compound N([C@H](C)C=1C=CC(F)=CC=1)C(=O)C(C=1)=CC(N(C)S(C)(=O)=O)=CC=1C(=O)NC(CO)(CO)CC1=CC=CC=C1 ASFAFOSQXBRFMV-LJQANCHMSA-N 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- NVZFZMCNALTPBY-XVFCMESISA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NVZFZMCNALTPBY-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 5-methyl-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)N=C1N QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJBMMMJOXRZENQ-UHFFFAOYSA-N 6H-pyrrolo[2,3-f]quinoline Chemical compound c1cc2ccc3[nH]cccc3c2n1 NJBMMMJOXRZENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 6S-folinic acid Natural products C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- GZSUIHUAFPHZSU-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-2,3-dihydro-1h-carbazol-4-one Chemical compound C12=CC=CC=C2N(CC)C2=C1C(=O)CCC2 GZSUIHUAFPHZSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035502 ADME Effects 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 102100030970 Apolipoprotein C-III Human genes 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- VANGSNQGPRHWDS-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCCCCCCCC(C(C(CCCCCCCCCCCCCCCC)O)O)O.CCN(CC)CC Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(C(C(CCCCCCCCCCCCCCCC)O)O)O.CCN(CC)CC VANGSNQGPRHWDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N COP(O)=O Chemical class COP(O)=O QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 description 1
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- JZUFKLXOESDKRF-UHFFFAOYSA-N Chlorothiazide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC2=C1NCNS2(=O)=O JZUFKLXOESDKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000002494 Endoribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MPJKWIXIYCLVCU-UHFFFAOYSA-N Folinic acid Natural products NC1=NC2=C(N(C=O)C(CNc3ccc(cc3)C(=O)NC(CCC(=O)O)CC(=O)O)CN2)C(=O)N1 MPJKWIXIYCLVCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101000889990 Homo sapiens Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 101000652338 Homo sapiens Transcription factor Sp1 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 101000652339 Mus musculus Transcription factor Sp1 Proteins 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910004679 ONO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- XGYUOGLHVKHRRK-SCFUHWHPSA-N O[C@@H]1[C@H](OP(O)(CCC#N)N(C(C)C)C(C)C)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(CCC#N)N(C(C)C)C(C)C)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 XGYUOGLHVKHRRK-SCFUHWHPSA-N 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101000885869 Rattus norvegicus Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101100054666 Streptomyces halstedii sch3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030246 Transcription factor Sp1 Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- RLXCFCYWFYXTON-JTTSDREOSA-N [(3S,8S,9S,10R,13S,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-16-yl] N-hexylcarbamate Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC(OC(=O)NCCCCCC)[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 RLXCFCYWFYXTON-JTTSDREOSA-N 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N acetic acid;adamantane Chemical compound CC(O)=O.C1C(C2)CC3CC1CC2C3 XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000005083 alkoxyalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960000473 altretamine Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000005122 aminoalkylamino group Chemical group 0.000 description 1
- MDFFNEOEWAXZRQ-UHFFFAOYSA-N aminyl Chemical compound [NH2] MDFFNEOEWAXZRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N amsacrine Chemical compound COC1=CC(NS(C)(=O)=O)=CC=C1NC1=C(C=CC=C2)C2=NC2=CC=CC=C12 XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001220 amsacrine Drugs 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N anthraquinone Natural products CCC(=O)c1c(O)c2C(=O)C3C(C=CC=C3O)C(=O)c2cc1CC(=O)OC PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037157 anticorticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003524 antilipemic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N barbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=O)N1 HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- IVUMCTKHWDRRMH-UHFFFAOYSA-N carprofen Chemical compound C1=CC(Cl)=C[C]2C3=CC=C(C(C(O)=O)C)C=C3N=C21 IVUMCTKHWDRRMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003184 carprofen Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- 229960002155 chlorothiazide Drugs 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 108700007153 dansylsarcosine Proteins 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N diethylstilbestrol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(\CC)C1=CC=C(O)C=C1 RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N dimyristoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N dodecane-1,1-diol Chemical group CCCCCCCCCCCC(O)O GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 229950002017 esorubicin Drugs 0.000 description 1
- ITSGNOIFAJAQHJ-BMFNZSJVSA-N esorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)C[C@H](C)O1 ITSGNOIFAJAQHJ-BMFNZSJVSA-N 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 229960001395 fenbufen Drugs 0.000 description 1
- ZPAKPRAICRBAOD-UHFFFAOYSA-N fenbufen Chemical compound C1=CC(C(=O)CCC(=O)O)=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZPAKPRAICRBAOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125753 fibrate Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- LPEPZBJOKDYZAD-UHFFFAOYSA-N flufenamic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 LPEPZBJOKDYZAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004369 flufenamic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N folinic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- 235000008191 folinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011672 folinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006359 hepatoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- UUVWYPNAQBNQJQ-UHFFFAOYSA-N hexamethylmelamine Chemical compound CN(C)C1=NC(N(C)C)=NC(N(C)C)=N1 UUVWYPNAQBNQJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000045903 human LPA Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002899 hydroxyprogesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000000055 hyoplipidemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000005414 inactive ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N ketoprofen Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC(C(=O)C=2C=CC=CC=2)=C1 DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001691 leucovorin Drugs 0.000 description 1
- 239000008206 lipophilic material Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 229950000547 mafosfamide Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000006362 methylene amino carbonyl group Chemical group [H]N(C([*:2])=O)C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 125000001893 nitrooxy group Chemical group [O-][N+](=O)O* 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108090000629 orphan nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004164 orphan nuclear receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002340 pentostatin Drugs 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229950000688 phenothiazine Drugs 0.000 description 1
- 229960002895 phenylbutazone Drugs 0.000 description 1
- VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N phenylbutazonum Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M phosphinate Chemical compound [O-][PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 1
- 229960003101 pranoprofen Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000004800 psychological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBQKCCHYAOITMY-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-ol Chemical compound OC1=CC=CC=N1 UBQKCCHYAOITMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- RXTQGIIIYVEHBN-UHFFFAOYSA-N pyrimido[4,5-b]indol-2-one Chemical compound C1=CC=CC2=NC3=NC(=O)N=CC3=C21 RXTQGIIIYVEHBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBUGYKMBLUTIS-UHFFFAOYSA-N pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=CC2=CC=NC2=N1 SRBUGYKMBLUTIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- JJICLMJFIKGAAU-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-9-(1,3-dihydroxypropan-2-yloxymethyl)purin-6-olate Chemical compound [Na+].NC1=NC([O-])=C2N=CN(COC(CO)CO)C2=N1 JJICLMJFIKGAAU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RMLUKZWYIKEASN-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-9-(2-hydroxyethoxymethyl)purin-6-olate Chemical compound [Na+].O=C1[N-]C(N)=NC2=C1N=CN2COCCO RMLUKZWYIKEASN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical group NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical group 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 229960004492 suprofen Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- NOYPYLRCIDNJJB-UHFFFAOYSA-N trimetrexate Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(NCC=2C(=C3C(N)=NC(N)=NC3=CC=2)C)=C1 NOYPYLRCIDNJJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001099 trimetrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N ursodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N 0.000 description 1
- 229960003636 vidarabine Drugs 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/314—Phosphoramidates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
- C12N2310/3341—5-Methylcytosine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/30—Production chemically synthesised
- C12N2330/31—Libraries, arrays
Abstract
Un compuesto de 15 a 30 bases nitrogenadas de longitud dirigidas a: (a) un intrón; (b) una unión intrón-exón; o (c) una unión exón-intrón de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III e inhibe la expresión de la apolipoproteína C-III, en el que dicho compuesto es al menos un 90% complementario a dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, para su uso en terapia.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona compuestos capaces de modular la expresión de apolipoproteína C-III, para su uso en terapia. En particular, la presente invención se refiere a compuestos, en particular compuestos oligonucleótidos, que hibridan con moléculas de ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína C-III. Se muestra en la presente que dichos compuestos modulan la expresión de apolipoproteína C-III.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las lipoproteínas son partículas globulares, similares a micelas, que constan de un núcleo no polar de acilgliceroles y ésteres de colesterilo rodeado por un recubrimiento anfífilo de proteína, fosfolípido y colesterol. Las lipoproteínas se han clasificado en cinco amplias categorías sobre la base de sus propiedades funcionales y físicas: quilomicrones, que transportan los lípidos de la dieta del intestino a los tejidos; lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL); lipoproteínas de densidad intermedia (IDL); lipoproteínas de baja densidad (LDL); todas ellas transportan triacilgliceroles y colesterol del hígado a los tejidos; y lipoproteínas de alta densidad (HDL), que transportan colesterol endógeno de los tejidos al hígado.
Las partículas lipoproteicas experimentan un proceso metabólico continuo y tienen propiedades y composiciones variables. Las densidades de las lipoproteínas aumentan sin disminuir el diámetro de partícula debido a que la densidad de sus recubrimientos exteriores es inferior a la del núcleo interno. Los componentes proteicos de las lipoproteínas se conocen como apolipoproteínas. Al menos nueve apolipoproteínas están distribuidas en cantidades significativas entre las diversas lipoproteínas humanas.
La apolipoproteína C-III es un constituyente de HDL y de lipoproteínas ricas en triglicéridos y tiene un papel en la eridemia hipertríglica, un factor de riesgo de enfermedad arterial coronaria. La apolipoproteína C-III ralentiza la eliminación de lipoproteínas ricas en triglicéridos inhibiendo la lipolisis, tanto inhibiendo la lipoproteína lipasa como interfiriendo en la unión de la lipoproteína a la matriz de glucosaminoglicano de la superficie celular (Shachter, Curr. Opin. Lipidol., 2001, 12, 297-304).
El gen que codifica la apolipoproteína C-III humana (también denominada APOC3, APOC-III, APO CIII y APO C-III) fue clonado en 1984 por tres grupos de investigación (Levy-Wilson y col., DNA, 1984, 3, 359-364; Protter y col., DNA, 1984, 3, 449-456; Sharpe y col., Nucleic Acids Res., 1984, 12, 3917-3932). La secuencia codificante está interrumpida por tres intrones (Protter y col., DNA, 1984, 3, 449-456). El gen de la apolipoproteína C-III humana está ubicado aproximadamente a 2,6 kb en la dirección 3' del gen de la apolipoproteína A-1 y estos dos genes se transcriben de forma convergente (Karathanasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1985, 82, 6374-6378). También se clonó una variante de la apolipoproteína C-III humana con mutación Thr74 a Ala74 a partir de un paciente con un nivel inusualmente alto de apoliproteína C-III en suero. Debido a que la Thr74 está O-glucosilada, el mutante Ala74, por lo tanto, provocó unos niveles aumentados en suero de apolipoproteína C-III que carece del resto carbohidrato (Maeda y col., J. Lipid Res., 1987, 28, 1405-1409).
Se han identificado cinco polimorfismos en la región promotora del gen: C(-641) a A, G(-630) a A, T(-625) a eliminación, C(-482) a T y T(-455) a C). Todos estos polimorfismos están en desequilibrio de unión con el polimorfismo SsfI en la región 3' no traducida. El sitio SsfI distingue los alelos S1 y S2 y el alelo S2 se ha asociado con niveles elevados de triglicéridos en plasma (Dammerman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1993, 90, 4562-4566). El promotor de apolipoproteína C-III está regulado a la baja por la insulina y este sitio polimórfico anula la regulación de insulina. De este modo, la sobreexpresión potencial de apolipoproteína C-III resultante de la pérdida de regulación de insulina puede ser un factor que contribuya al desarrollo de hipertrigliceridemia asociada con el alelo S2 (Li y col., J. Clin. Invest., 1995, 96, 2601-2605). El polimorfismo T(-455) a C se ha asociado con un aumento del riesgo de enfermedad arterial coronaria (Olivieri y col., J. Lipid Res., 2002, 43, 1450-1457).
Además de la insulina, se han identificado otros reguladores de la expresión del gen de la apolipoproteína III. Un elemento de respuesta para el receptor huérfano nuclear rev-erb alfa se ha localizado en las posiciones -23/-18 en la región promotora de la apolipoproteína C-III y el rev-erb alfa disminuye la actividad del promotor de la apolipoproteína C-III (Raspe y col., J. Lipid Res., 2002, 43, 2172-2179). La región promotora de la apolipoproteína CIII -86 a -74 se reconoce por dos factores nucleares CIIIb1 y CIIIB2 (Ogami y col., J. Biol. Chem., 1991, 266, 96409646). La expresión de la apolipoproteína C-III está también regulada al alza por retinoides que actúan a través del receptor X retinoide, y las alteraciones en la abundancia del receptor X de retinoides afectan a la transcripción de apolipoproteína C-III (Vu-Dac y col., J. Clin. Invest., 1998, 102, 625-632). Se ha demostrado que la proteína de especificidad 1 (Sp1) y el factor nuclear del hepatocito 4 (HNF-4) actúan de forma sinérgica para transactivar el promotor de la apolipoproteína C-III a través del sitio de unión HNF-4 (Kardassis y col., Biochemistry, 2002, 41, 12171228). El HNF-4 también actúa conjuntamente con SMAD3-SMAD4 para transactivar el promotor de la apolipoproteína C-III (Kardassis y col., J. Biol. Chem., 2000, 275, 41405-41414).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se ha definido adicionalmente el papel de la apolipoproteína C-III en lipolisis usando ratones transgénicos e inactivados. La sobreexpresión de apolipoproteína C-III en ratones transgénicos provoca hipertrigliceridemia y una eliminación deficiente de triglicéridos VLDL (de Silva y col., J. Biol. Chem., 1994, 269, 2324-2335; Ito y col., Science, 1990, 249, 790-793). Los ratones inactivados con una ausencia total de la proteína apolipoproteína C-III mostraron unos niveles significativamente reducidos de colesterol y triglicéridos en plasma en comparación con ratones de tipo silvestre y estaban protegidos de hipertrigliceridemia posprandial (Maeda y col., J. Biol. chem.,1994, 269, 2361023616).
Actualmente no existen agentes terapéuticos conocidos que afecten a la función de la apolipoproteína C-III. Se ha postulado que el efecto hipolipidémico de la clase de fármacos fibrato tiene lugar a través de un mecanismo en el que el receptor activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR) media el desplazamiento de HNF-4 desde el promotor de apolipoproteína C-III, dando como resultado la supresión transcripcional de la apolipoproteína C-III (Hertz y col., J. Biol. Chem., 1995, 270, 13470-13475). Los fármacos hipolipidémicos de la clase de las estatinas también reducen los niveles de triglicéridos usando un mecanismo desconocido que da como resultado el aumento de ARNm de la lipoproteína lipasa y una disminución de los niveles en plasma de apolipoproteína C-III (Schoonjans y col., FEBS Lett., 1999, 452, 160-164). En consecuencia, existe todavía una necesidad de agentes adicionales capaces de inhibir eficazmente la función de la apolipoproteína C-III.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un compuesto de 15 a 30 bases nitrogenadas de longitud dirigidas a;
(a) un intrón;
(b) una unión intrón-exón; o
(c) una unión exón-intrón
de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III e inhibe la expresión de la apolipoproteína C-III, y en el que dicho compuesto es al menos un 90% complementario a dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, para su uso en terapia.
SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN
En el presente documento se divulgan composiciones y procedimientos para modular la expresión de apolipoproteína C-III. La tecnología antisentido surge como un medio eficaz para reducir la expresión de productos génicos específicos y es excepcionalmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación para la modulación de la expresión de la apolipoproteína C-III.
La presente divulgación se refiere a compuestos, especialmente oligómeros de ácidos nucleicos y similares a ácidos nucleicos dirigidos a un ácido nucleico que codifica la apolopoproteína C-III y que modulan la expresión de la apolipoproteína C-III. También se divulgan composiciones farmacéuticas y de otro tipo que comprenden los compuestos que se divulgan en el presente documento.
También se divulgan procedimientos de análisis de moduladores de apolipoproteína C-III y procedimientos de modulación de la expresión de apolipoproteína C-III en células, tejidos o animales que comprenden poner en contacto dichas células, tejidos o animales con uno o varios compuestos o composiciones de la divulgación. En estos procedimientos, las células o tejidos se ponen en contacto in vivo. Alternativamente, las células o tejidos se ponen en contacto ex vivo.
También se exponen en el presente documento procedimientos para tratar un animal, en particular un ser humano, sospechoso de tener, o que es propenso a tener, una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína C-III. Dichos procedimientos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente o profilácticamente activa de uno o varios de los compuestos o composiciones de la divulgación a una persona con necesidad de tratamiento.
También se divulga un procedimiento para preparar un compuesto de la divulgación que comprende hibridar específicamente in vitro una primera cadena de bases nitrogenadas de al menos 8 bases nitrogenadas contiguas a la secuencia establecida en la SEC ID N°: 4 y/o la SEC ID N°: 18 a una segunda cadena de bases nitrogenadas que comprende una secuencia lo suficientemente complementaria a dicha primera cadena de tal modo que se permita una hibridación estable.
También se divulga en el presente documento un compuesto de la divulgación para su uso en terapia.
También se divulga en el presente documento el uso de un compuesto o composición de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera y todas las afecciones divulgadas en el presente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
documento.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A. Visión general
La presente divulgación usa compuestos, preferentemente oligonucleótidos y especies similares, para su uso en la modulación de la función o el efecto de moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína C-III. Esto se realiza proporcionando oligonucleótidos que se hibridan específicamente con una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína C-III.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "ácido nucleico diana" y "molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III" se han usado por conveniencia para incluir ADN que codifica la apolipoproteína C-III, ARN (incluidos pre-ARNm o ARNm y porciones de los mismos) transcrito a partir de dicho ADN y también ADNc derivado de dicho ARN.
La hibridación de un compuesto de la presente invención con su ácido nucleico diana se denomina generalmente como “antisentido". En consecuencia, el mecanismo incluido en la práctica de realizaciones de la invención se denomina en el presente documento como “inhibición antisentido". Dicha inhibición antisentido se basa típicamente en la hibridación basada en enlaces de hidrógeno de cadenas o segmentos de oligonucleótidos de tal manera que al menos una cadena o un segmento se escinda, se degrade o se vuelva no operativa de cualquier otro modo. A este respecto, es preferente actualmente dirigirse a moléculas específicas de ácido nucleico y a sus funciones para dicha inhibición antisentido.
Las funciones de ADN sobre las que se interfiere incluyen replicación y transcripción. La replicación y la transcripción, por ejemplo, pueden ser a partir de una plantilla celular endógena, un vector, un constructo de plásmido o de otro tipo. Las funciones de ARN sobre las que se interfiere pueden incluir funciones tales como translocación del ARN a un sitio de traducción de proteínas, translocación del ARN a sitios dentro de la célula que están distantes del sitio de síntesis de ARN, traducción de proteínas a partir de ARN, ayuste del ARN para proporcionar una o varias especies de ARN y actividad catalítica o formación de complejos que implican al ARN en las que puede estar involucrado, o pueden estar facilitadas por, el ARN. Un resultado preferente de dicha interferencia con la función de ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de apolipoproteína C-III. En el contexto de la presente divulgación, "modulación" y "modulación de la expresión" quieren decir o bien un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) en la cantidad o en los niveles de una molécula de ácido nucleico que codifica el gen, por ejemplo, ADN o ARN. La inhibición es a menudo la forma preferente de modulación de la expresión y el ARNm es a menudo el ácido nucleico diana preferente.
En el contexto de la presente invención, “hibridación” significa el apareamiento de cadenas complementarias de compuestos oligoméricos. En la presente invención, el mecanismo preferente de apareamiento implica enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inversos, entre nucleósidos complementarios o bases nitrogenadas (bases nucleótidas) complementarias de las cadenas de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, la adenina y la timina son bases nitrogenadas complementarias que se aparean mediante la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación puede tener lugar en diversas circunstancias.
Un compuesto antisentido puede hibridarse específicamente cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleido diana para provocar una pérdida de actividad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en ensayos in vivo o tratamiento terapéutico y en condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
En la presente invención la expresión “condiciones de hibridación restrictivas” o “condiciones restrictivas” se refiere a condiciones en las que un compuesto de la invención se hibridará a su secuencia diana, pero a un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y son diferentes en circunstancias diferentes. En el contexto de la presente invención, “condiciones restrictivas” en las que los compuestos oligoméricos se hibridan a una secuencia diana se determina por la naturaleza y la composición de los compuestos oligoméricos y los ensayos en los que se está investigando.
"Complementario", tal como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad para un apareamiento preciso entre dos bases nitrogenadas de un compuesto oligomérico. Por ejemplo, si una base nitrogenada en una posición determinada de un oligonucleótido (un compuesto oligomérico) es capaz de formar un enlace de hidrógeno con una base nitrogenada en una posición determinada de un ácido nucleico diana, siendo dicho ácido nucleico diana una molécula de ADN, de ARN o de oligonucleótido, entonces la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera que es una posición complementaria. El oligonucleótido y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
la molécula adicional de ADN, ARN u oligonucleótido son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias de cada molécula están ocupadas por bases nitrogenadas que pueden formar enlaces de hidrógeno una con otra. De este modo, "que puede hibridarse específicamente" y "complementario" son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamientos precisos o complementariedad a lo largo de un número suficiente de bases nitrogenadas de tal modo que tenga lugar una unión estable y específica entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana.
Se entiende en la técnica que la secuencia del compuesto antisentido puede ser, pero no necesita ser, complementaria al 100 % a la del ácido nucleico diana para poder hibridarse específicamente. Además, un oligonucleótido puede hibridarse a lo largo de uno o varios segmentos de tal modo que segmentos interpuestos o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle o estructura de horquilla). En una realización, los compuestos antisentido de la presente divulgación comprenden al menos el 70 %, o al menos el 75 %, o al menos el 80 %, o al menos el 85 % de complementariedad de secuencia a una región diana que se encuentra dentro del ácido nucleico diana. En otra realización, los compuestos antisentido de la presente divulgación comprenden el 90 % de complementariedad de secuencia e, incluso más preferentemente, comprenden el 95 % o al menos el 99 % de complementariedad de secuencia con la región diana que se encuentra dentro de la secuencia de ácido nucleico diana a la que están dirigidos. Preferentemente, los compuestos antisentido comprenden al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de un compuesto antisentido divulgado en el presente documento. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 bases nitrogenadas del compuesto antisentido son complementarias a la región diana y, por lo tanto, se hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las bases nitrogenadas no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas entre bases nitrogenadas complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a bases nitrogenadas complementarias. Como tal, un compuesto antisentido de 18 bases nitrogenadas de longitud que tiene 4 (cuatro) bases nitrogenadas no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría un 77,8 % de complementariedad total con el ácido nucleico diana y estaría, por lo tanto, dentro del alcance de la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse de forma rutinaria usando los programas BLAST (basic local alignment search tools (herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales)) y los programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).
El porcentaje de homología, de identidad de secuencia o de complementariedad puede determinarse por, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 cuatro Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, Estados Unidos), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). En algunas realizaciones preferentes, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad, entre el oligómero y la diana es de entre aproximadamente el 50 % y aproximadamente el 60 %. En algunas realizaciones, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad es de entre aproximadamente el 60 % y aproximadamente el 70%. En realizaciones preferentes, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad es de entre aproximadamente el 70 % y aproximadamente el 80 %. En realizaciones más preferentes, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad es de entre aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 90 %. En realizaciones preferentes, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 92 %, de aproximadamente el 94 %, de aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 96 %, de aproximadamente el 97 %, de aproximadamente el 98 % o de aproximadamente el 99 %.
B. Compuestos
De acuerdo con la presente divulgación, los compuestos incluyen compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), empalmadores alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos que se hibridan con al menos una porción del ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos de cadena sencilla, de cadena doble circulares o con forma de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias o bucles internos o terminales. Una vez introducidos en un sistema, los compuestos pueden facilitar la acción de una o varias enzimas o proteínas estructurales para efectuar la modificación del ácido nucleico diana.
Un ejemplo no limitante de dichas enzimas es la ARNasa H, una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son “similares a ADN” producen como respuesta ARNasa H. La activación de ARNasa H, por lo tanto, da como resultado una escisión de la diana de ARN, potenciando de este modo enormemente la eficacia de la inhibición mediada por oligonucleótidos de la expresión génica. Se han postulado papeles similares para otras ribonucleasas tales como las de las familias de enzimas ARNasa III y ribonucleasa L.
Aunque la forma preferente de compuesto antisentido es un oligonucleótido monocatenario, en muchas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
especies la introducción de estructuras bicatenarias, tales como moléculas de ARN bicatenario (ARNds) induce una reducción potente y específica mediada por antisentido de la función de un gen o de sus productos génicos asociados. Este fenómeno tiene lugar tanto en plantas como en animales y se cree que tiene una conexión evolutiva con la defensa contra los virus y el silenciamiento de transposones.
La primera evidencia de que el ARNds podría provocar el silenciamiento génico en animales se tuvo en 1995 por el trabajo en el nematodo, Caenorhabditis elegans (Guo y Kempheus, Cell, 1995, 81, 611-620). Los efectos de interferencia principales del ARNds son postranscripcionales (Montgomery y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507). El mecanismo antisentido postranscripcional definido en Caenorhabditis elegans resultante de la exposición al ARN bicatenario (ARNds) se ha denominado desde entonces ARN de interferencia (ARNi). Se ha generalizado que este término significa silenciamiento génico mediado por antisentido que implica la introducción de ADNds que provoca la reducción específica de secuencia de niveles de ARNm dirigido endógeno (Fire y col., Nature, 1998, 391, 806-811). Recientemente, se ha informado que estos oligómeros de ARN monocatenario de polaridad antisentido de los ARNds son inductores potentes de ARNi (Tijsterman y col., Science, 2002, 295, 694-697).
En el contexto de la presente invención, la expresión "compuesto oligomérico" se refiere a un polímero u oligómero que comprende una pluralidad de unidades monoméricas. En el contexto de la presente invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN) o miméticos, quimeras, análogos y homólogos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos por bases nitrogenadas de origen natural, azúcares y enlaces covalentes entre nucleósidos (esqueleto), así como oligonucleótidos que no tienen porciones de origen natural que operan de modo similar. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos son preferentes a menudo sobre las formas nativas debido a unas propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad potenciada por un ácido nucleico diana y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos de la presente invención también incluyen oligonucleótidos modificados en los que una base nitrogenada diferente está presente en una o varias de las posiciones de nucleótidos en el oligonucleótido. Por ejemplo, si el primer nucleótido es adenosina, pueden producirse oligonucleótidos modificados que contengan timidina, guanosina o citidina es esta posición. Esto puede realizarse en cualquiera de las posiciones del oligonucleótido. Estos oligonucleótidos se analizan después usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresión de la apolipoproteína C-III.
Aunque los oligonucleótidos son una forma preferente de los compuestos de la presente divulgación, la presente divulgación comprende también otras familias de compuestos, incluidos, pero no limitados a, análogos y miméticos de oligonucleótidos tales como los que se describen en el presente documento.
Los compuestos según la divulgación comprenden preferentemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleósidos enlazados). Un experto en la técnica apreciará que esto abarca compuestos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 bases nitrogenadas de longitud.
En una realización preferente, los compuestos tienen de 12 a 50 bases nitrogenadas de longitud. Un experto en la técnica apreciará que esto abarca compuestos de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 bases nitrogenadas de longitud.
En una realización preferente, los compuestos tienen de 15 a 30 bases nitrogenadas de longitud. Un experto en la técnica apreciará que esto abarca compuestos de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 bases nitrogenadas de longitud.
Son compuestos particularmente preferentes los oligonucleótidos de aproximadamente 12 a aproximadamente 50 bases nitrogenadas; son incluso más preferentes los que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 bases nitrogenadas.
Los compuestos antisentido de 8-80 bases nitrogenadas de longitud que comprenden un tramo de al menos ocho (8) bases nitrogenadas consecutivas seleccionadas de entre los compuestos antisentido ilustrativos se consideran también compuestos antisentido adecuados.
Los compuestos antisentido preferidos ejemplares incluyen secuencias de oligonucleótidos que comprenden al menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas desde el extremo 5' de uno de los compuestos antisentido preferentes ilustrativos (siendo las bases nitrogenadas restantes un tramo consecutivo del mismo oligonucleótido que comienza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del compuesto antisentido que puede hibridarse específicamente al ácido nucleico diana y que continúa hasta el oligonucleótido que comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). Similarmente, los compuestos antisentido
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
preferentes están representados por secuencias de oligonucleótidos que comprenden al menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas desde el extremo 3' de uno de los compuestos antisentido preferentes ilustrativos (siendo las bases nitrogenadas restantes un tramo consecutivo del mismo oligonucleótido que comienza inmediatamente cadena abajo del extremo 3' del compuesto antisentido que puede hibridarse específicamente al ácido nucleico diana y que continúa hasta el oligonucleótido que comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). Pueden encontrarse identificados ejemplos de compuestos de una variedad de fuentes de mamífero, incluido el ser humano, en los ejemplos y enumerados en las tablas 1 a 21. Un experto en la técnica equipado con los compuestos antisentido preferentes que se ilustran en el presente documento será capaz, sin una experimentación excesiva, de identificar compuestos antisentido preferentes adicionales.
C. Dianas
"Dirigir” un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico diana que codifica la apolipoproteína CIII, en el contexto de la presente invención, puede ser un proceso de varias etapas. El proceso comienza habitualmente con la identificación de un ácido nucleico diana cuya función es ser modulado. Este ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir de un gen) cuya expresión esté asociada con un trastorno o estado patológico particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente invención, el ácido nucleico diana codifica la apolipoproteína C-III.
El proceso de dirección también incluye habitualmente la determinación de al menos una región, segmento o sitio diana dentro del ácido nucleico diana para una interacción antisentido que tenga lugar de tal modo que dé como resultado el efecto deseado, por ejemplo, la modulación de la expresión. Dentro del contexto de la presente invención, el término “región” se define como una porción de un ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de ácidos nucleicos diana están los segmentos. Los “segmentos” se definen como regiones más pequeñas o subporciones de regiones dentro del ácido nucleico diana. "Sitios", tal como se usa este término en la presente invención, se definen como posiciones dentro de un ácido nucleico diana.
Ya que, tal como se sabe en la técnica, el codón de iniciación de la traducción es típicamente 5'-AUG (en moléculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de iniciación de la traducción también se denomina "codón AUG", el "codón de inicio" o el "codón de inicio AUG". Se ha demostrado que una minoría de genes, que tienen codones de iniciación de la traducción con la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y 5'- AUA, 5'-ACG y 5'-CUG, operan in vivo. De este modo "codón de iniciación de la traducción" y "codón de inicio" pueden abarcar muchas secuencias de codones, incluso aunque el aminoácido iniciador en cada caso sean típicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se sabe en la técnica que los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, cualquiera de los cuales puede usarse con preferencia para la iniciación de la traducción en un tipo celular o tejido particular, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la presente invención, "codón de inicio" y "codón de iniciación de la traducción" se refiere al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de un ARNm transcrito a partir de un gen que codifica la apolipoproteína C-IlI, independientemente de la(s) secuencia(s) de dichos codones. También se sabe en la técnica que un codón de terminación de la traducción (o “codón de detención”) de un gen puede tener de una a tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'- TGA, respectivamente).
Las expresiones “región de codón de inicio” y “región de codón de iniciación de la traducción” se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') a partir de un codón de iniciación de la traducción. De modo similar, las expresiones “región de codón de detención” y “región de codón de terminación de la traducción” se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') a partir de un codón de terminación de la traducción. En consecuencia, la “región de codón de inicio” (o “región de codón de iniciación de la traducción”) y la "región de codón de detención" (o “región de codón de terminación de la traducción”) son todas las regiones que pueden ser dianas eficaces para los compuestos antisentido que se divulgan en el presente documento.
El marco de lectura abierto (ORF) o "región codificante", que se sabe en la técnica que se refiere a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción, también es una región que puede ser una diana eficaz. Dentro del contexto del presente divulgación, una región preferente es la región intragénica que abarca el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.
Otras regiones diana incluyen la región no traducida 5' (5'UTR), conocida en la técnica por referirse a la porción de un ARNm en la dirección 5' a partir de un codón de iniciación de la traducción y que, de este modo, incluye nucleótidos entre el sitio de remate 5' y el codón de iniciación de la traducción de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen), y la región no traducida 3' (3'UTR), conocida en la técnica por referirse a la porción de un ARNm en la dirección 3' a partir de un codón de iniciación de la traducción y que, de este modo, incluye nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm (o nucleótidos correspondientes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en el gen). El sitio de remate 5' de un ARNm comprende un resto de guanosina metilada en N7 unido al resto del extremo 5' del ARNm por medio de un enlace 5'-5' trifosfato. La región de remate 5' de un ARNm se considera que incluye la estructura de remate 5' en sí misma así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio de remate. También es preferente dirigirse a la región de remate 5'.
En consecuencia, la presente divulgación incluye compuestos antisentido que se dirigen a una porción de bases nitrogenadas 1 - 533 tal como se expone en la SEC ID N°: 18. En una realización, los compuestos antisentido se dirigen al menos a una porción de 8 bases nitrogenadas de las bases nitrogenadas 1 - 533 tal como se expone en la SEC ID N°: 18 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región 5' UTR tal como se expone en la SEC ID N°: 18 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región 3' UTR tal como se expone en la SEC ID N°: 18 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región codificante tal como se expone en la SEC ID N°: 18 y las tablas 1 y 4. En otras realizaciones más, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de 8 bases nitrogenadas de un “segmento diana preferente” (tal como se define en el presente documento) tal como se expone en la tabla 3.
Además, la presente divulgación incluye compuestos antisentido que se dirigen a una porción de bases nitrogenadas 1 - 3958 tal como se expone en la SEC ID N°: 4. En una realización, los compuestos antisentido se dirigen al menos a una porción de 8 bases nitrogenadas de las bases nitrogenadas 1 - 3958 tal como se expone en la SEC ID N°: 4 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región 5' UTR tal como se expone en la SEC ID N°: 4 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región 3' UTR tal como se expone en la SEC ID N°: 4 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región codificante tal como se expone en la SEC ID N°: 4 y las tablas 1 y 4. En otras realizaciones más, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de 8 bases nitrogenadas de un “segmento diana preferente” (tal como se define en el presente documento) tal como se expone en la tabla 3.
Aunque algunos tránscritos de ARNm eucariótico se traducen directamente, muchos contienen uno o varias regiones, conocidas como “intrones” que se escinden de un tránscrito antes de traducirse. Las regiones restantes (y, por lo tanto, traducidas) son conocidas como “exones” y se empalman entre sí para formar una secuencia de ARNm continua. Los sitios de ayuste diana, por ejemplo, empalmes intrón-exón o empalmes exón-intrón, también pueden ser particularmente útiles en situaciones en las que el ayuste aberrante está implicado en una enfermedad, o en el que una sobreproducción de un producto de ayuste particular está implicada en una enfermedad. Las uniones de fusión aberrante debidas a reordenamientos o deleciones también son sitios diana preferentes. Los tránscritos de producidos mediante el proceso de ayuste de dos (o más) ARNm de diferentes fuentes génicas son conocidos como "tránscritos de fusión". También se sabe que los intrones pueden actúar como dianas eficaces usando compuestos antisentido que se dirigen, por ejemplo, a ADN o pre-ARNm.
Los tránscritos de ARN alternativos pueden producirse a partir de la misma región genómica de ADN. Estos tránscritos alternativos se conocen generalmente como "variantes". Más específicamente, "las variantes pre-ARNm" son tránscritos producidos a partir del mismo ADN genómico que difieren de otros tránscritos producidos a partir del mismo ADN genómico en bien su posición de inicio o bien su posición de detención y contienen tanto secuencias intrónicas como exónicas.
Por medio de la escisión de una o varias regiones exónicas o intrónicas, o porciones de las mismas, durante el ayuste, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm” más pequeñas. En consecuencia, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante pre-ARNm única debe producir siempre una variante de ARNm única como resultado del ayuste. Estas variantes de ARNm se conocen también como “variantes de ayuste alternativas". Si no tiene lugar un ayuste de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre- ARNm es idéntica a la variante de ARNm .
Las variantes pueden producirse mediante el uso de señales alternativas para iniciar o detener la transcripción. Los pre-ARNm y ARNm pueden poseer más de un codón de inicio o codón de detención. Las variantes que se origina a partir de pre-ARNm o ARNm que usan codones de inicio alternativos son conocidos como “variantes de inicio alternativas” de ese pre-ARNm o ARNm. Esos tránscritos que usan un codón de detención alternativo son conocidos como "variantes de detención alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo específico de variante de detención alternativa es la “variante poliA” en la que los múltiples tránscritos producidos son el resultado de la selección alternativa de una de las “señales de detención poliA” por la maquinaria de la transcripción, produciendo, por lo tanto, tránscritos que terminan en sitios poliA únicos. Dentro del contexto de la divulgación, los tipos de variantes descritos en el presente documento también son ácidos nucleicos diana preferentes.
Las localizaciones del ácido nucleico diana a las que los compuestos antisentido preferentes se hibridan se denominan en adelante en el presente documento “segmentos diana preferentes". Tal como se usa en el presente documento la expresión "segmento diana preferente" se define como al menos una porción de 8 bases nitrogenadas de
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
una región diana a la que se dirige un compuesto antisentido activo. Aunque sin pretender vincularse a ninguna teoría, se cree actualmente que estos segmentos diana representan porciones del ácido nucleico diana que son accesibles para la hibridación.
Aunque las secuencias específicas de determinados segmentos diana preferentes se exponen en el presente documento, un experto en la técnica reconocerá que éstas sirven para ilustrar y describen realizaciones particulares dentro del alcance de la presente divulgación. Los segmentos diana preferentes adicionales pueden ser identificados por un experto.
Los segmentos diana de 8-80 bases nitrogenadas de longitud que comprenden un tramo de al menos ocho (8) bases nitrogenadas consecutivas seleccionadas de entre los segmentos diana preferentes ilustrativos se consideran también dianas adecuadas.
Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas a partir del extremo 5' de uno de los segmentos diana preferentes ilustrativos (siendo las bases nitrogenadas restantes un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del segmento diana y que continúa hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). De forma similar, los segmentos diana preferentes están representados por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas a partir del extremo 3' de uno de los segmentos diana preferentes ilustrativos (siendo las bases nitrogenadas restantes un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente cadena abajo del extremo 3' del segmento diana y que continúa hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). Un experto en la técnica equipado con los segmentos diana preferentes que se ilustran en el presente documento será capaz, sin experimentación excesiva, de identificar segmentos diana preferentes adicionales.
Una vez una o varias regiones, segmentos o sitios diana se haya identificado, se eligen los compuestos antisentido que sean lo suficientemente complementarios a la diana, es decir, que se hibrida lo suficientemente bien y con especificidad suficiente para proporcionar el efecto deseado.
Los compuestos oligoméricos están dirigidos o no están dirigidos a regiones de la secuencia de bases nitrogenadas de la apolipoproteína C-III diana (por ejemplo, tales como las dadas a conocer en los ejemplos 15 y 17) que comprenden las bases nucleótidos 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401450, 451-500, 501-550, 551-600, 601-650, 651-700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 10011050, 1051-1100, 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-1500, 15011550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 1751-1800, 1801-1850, 1851-1900, 1901-1950, 1951-2000, 20012050, 2051-2100, 2101-2150, 2151-2200, 2201-2250, 2251-2300, 2301-2350, 2351-2400, 2401-2450, 2451-2500, 25012550, 2551-2600, 2601-2650, 2651-2700, 2701-2750, 2751-2800, 2801-2850, 2851-2900, 2901-2950, 2591-3000, 30013050, 3051-3100, 3101-3150, 3151-3200, 3201-3250, 3251-3300, 3301-3350, 3351-3400, 3401-3450, 3451-3500, 3501
3550, 3551-3600, 3601-3650, 3651-3700, 3701-3750, 3751-3800, 3801-3850, 3851-3900, 3901-3950, 3951-3958 de SEC ID N°: 4, o cualquier combinación de las mismas.
Además, los compuestos oligoméricos están dirigidos o no están dirigidos a regiones de la secuencia de bases nitrogenadas de la apolipoproteína C-III diana (por ejemplo, tales como las dadas a conocer en los ejemplos 15 y 17) que comprenden las bases nucleótidos 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401450, 451-500, 501-533 de la SEC ID N°: 18, o cualquier combinación de las mismas.
En una realización, los compuestos oligonucleótidos son 100 % complementarios a estas secuencias o a secuencias pequeñas encontradas dentro de cada una de las secuencias enumeradas anteriormente. Preferentemente, los compuestos antisentido comprenden al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de un compuesto antisentido divulgado en el presente documento. En otra realización, los compuestos oligonucleótidos tienen de al menos 3 ó 5 bases nitrogenadas no coincidentes por cada 20 consecutivas en posiciones de bases nitrogenadas individuales a estas regiones diana. Otros compuestos más están dirigidos a regiones de superposición de las porciones identificadas anteriormente de la secuencia de la apoliproteína C-III.
D. Selección y validación de la diana
En una realización adicional, los “segmentos diana preferentes” identificado en el presente documento pueden usarse en un proceso de selección para determinar compuestos adicionales que modulen la expresión de la apolipoproteína C-III. Los "moduladores" son los compuestos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III y que comprende al menos una porción de 8 bases nitrogenadas que es complementaria a un segmento diana preferente. El procedimiento de selección comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferente de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III con uno o más moduladores candidatos y seleccionar uno o varios moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III. Una vez se demuestre que el modulador o los moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, o bien
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
disminuyendo o bien aumentando) la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apopoliproteína CIII, el modulador puede usarse en otros estudios de investigación de la función de la apolipoproteína C-III, o como agente de investigación, de diagnóstico o terapéutico según la presente invención.
Los segmentos diana preferentes que se divulgan en la presente invención también pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos para formar oligonucleótidos bicatenarios (duplicados) estabilizados.
Se ha demostrado en la técnica que dichos restos de oligonucleótido bicatenario modulan la expresión diana y la traducción regulada, así como el procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Además, los restos bicatenarios pueden ser objeto de modificaciones químicas (Fire y col., Nature, 1998, 391, 806-811; Timmons y Fire, Nature 1998, 395, 854; Timmons y col., Gene, 2001, 263, 103-112; Tabara y col., Science, 1998, 282, 430-431; Montgomery y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507; Tuschl y col., Genes Dev., 1999, 13, 31913197; Elbashir y col., Nature, 2001, 411, 494-498; Elbashir y col., Genes Dev. 2001, 15, 188-200). Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana mediante la hibridación clásica de cadena antisentido del dúplex a la diana, desencadenando, por lo tanto, la degradación enzimática de la diana (Tijsterman y col., Science, 2002, 295, 694-697).
Los compuestos de la presente invención también se pueden aplicar en los sectores de descubrimiento de fármacos y la validación de dianas. La presente invención comprende el uso de los compuestos y segmentos dianas preferentes identificados en el presente documento en investigaciones de descubrimiento de fármacos para elucidar la relación que existe entre la apolipoproteína C-III y un estado patológico, fenotipo o afección. Estos procedimientos incluyen detectar o modular la apolipoproteína C-III que comprende poner en contacto una muestra, tejido, célula u organismo con los compuestos de la presente invención, medir el nivel de ácido nucleico o proteína de apolipoproteína C-III y/o un punto final fenotípico o químico relacionado en un punto temporal después del tratamiento y, opcionalmente, comparar el valor medido con una muestra no tratada o una muestra tratada con un compuesto adicional de la presente invención. Estos procedimientos también pueden realizarse en paralelo o en combinación con otros experimentos para determinar la función de genes desconocidos para el proceso de validación de diana o para determinar la validez de un producto génico particular como una diana para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, afección o fenotipo particular.
E. Kits, reactivos de investigación, agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos
Los compuestos divulgados en la presente se usan para agentes de diagnóstico, terapéuticos, de profilaxis y como reactivos de investigación y kits. En una realización, dichos compuestos de la presente invención son útiles en sectores de obesidad y trastores relacionados con el metabolismo tales como hiperlipidemia. Además, los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con especifidad exquisita, se usan a menudo por los expertos para elucidar la función de genes particulares o para distinguir entre funciones de varios miembres de una ruta biológica.
Para su uso en kits y agentes de diagnóstico, los compuestos de la presente invención, bien solos o bien en combinación con otros compuestos o productos terapéuticos, se usan como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatorios para elucidar los patrones de expresión de una porción o el complemento total de genes expresados dentro de células y tejidos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "sistema" se define como cualquier organismo, célula, cultivo celular o tejido que expresa, o se hace competente para expresar productos del gen que codifica la apolipoproteína C-III. Éstos incluyen, pero no están limitados a, seres humanos, animales transgénicos, células, cultivos celulares, tejidos, xenotransplantes y combinaciones de los mismos
Como un ejemplo no limitante, los patrones de expresión dentro de células o tejidos tratados con uno o varios compuestos antisentido se comparan con células o tejidos control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para determinar niveles diferenciales de expresión génica tal como se aplican, por ejemplo, para asociación de enfermedades, ruta de señalización, localización celular, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Estos análisis pueden realizarse en células estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan a patrones de expresión.
Los ejemplos de procedimientos de análisis de expresión génica conocidos en la técnica incluyen chips o microchips de ADN (Brazma y Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (serial analysis of gene expresión (análisis en serie de la expresión génica))(Madden y col., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS (restriction enzyme amplification of digested cDNAs (amplificación de enzimas de restricción de ADN digeridos) (Prashar y Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (total gene expression analysis (análisis de expresión génica total)) (Sut-cliffe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81), chips de proteínas y proteómica (Celis y col., FeBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut y col., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciación de etiquetas de secuencias expresadas (EST) (Celis y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson y col.,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huella genética de ARN sustractiva (SuRF) (Fuchs y col., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson y col., Cytometry, 2000, 41, 203-208), clonación sustractiva, presentación diferencial (DD) (Jurecic y Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridación genómica comparativa (Carulli y col., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), técnicas de FISH (hibridación fluorescente in situ) (Going y Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) y procedimientos de espectrometría de masas (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).
Los compuestos divulgados en el presente documento son útiles para investigación y diagnóstico, debido a que estos compuestos se hibridan con ácidos nucleicos que codifican apolipoproteína C-III. Por ejemplos, los oligonucleótidos que se ha demostrado que se hibridan con la eficacia y en las condiciones que se divulgan en el presente documento como para ser inhibidores eficaces de la apolipoproteína C-III también serán cebadores y sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificación o la detección de genes, respectivamente. Estos cebadores y sondas son útiles en procedimientos que requieren la detección específica de moléculas de ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína C-III y en la amplificación de dichas moléuclas de ácidos nucleicos para la detección o para su uso en estudios posteriores de la apolipoproteína C-III. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas, de la invención con un ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III puede detectarse por medios conocidos en la técnica. Dichos medios pueden incluir la conjugación de una enzima al oligonucleótido, radiomarcado del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También pueden prepararse los kits que usan dichos medios de detección para detectar el nivel de apolipoproteína C-III en una muestra.
También se divulga un procedimiento para preparar un compuesto de la invención que comprende hibridar específicamente in vitro una primera cadena de bases nitrogenadas de al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia establecida en SEQ ID N°: 4 y/o la SEC ID N.°: 18 a una segunda cadena de bases nitrogenadas que comprende una secuencia lo suficientemente complementaria a dicha primera cadena de tal modo que se permita una hibridación estable.
También se divulga en el presente documento un compuesto de la divulgación para su uso en terapia.
También se divulga en el presente documento el uso de un compuesto o composición de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de todas las afecciones divulgadas en el presente documento y de cualquiera de las mismas.
Entre los usos de diagnóstico está la medición de apoliproteína C-III en pacientes para identificar a los que pueden beneficiarse de una estrategia de tratamiento dirigida a reducir los niveles de apolipoproteína C-III. Dichos pacientes adecuados para diagnóstico incluyen pacientes con hipertrigliceridemia (por ejemplo, para tendencias de diagnóstico para enfermedad arterial coronaria), metabolismo de lípidos anormal, obesidad, hiperlipidemia, entre otros trastornos.
La especificidad y sensitividad de antisentido también se usan de un modo controlado por los expertos en la técnica para usos terapéuticos. Los compuestos antisentido se han usado como restos terapéuticos en el tratamiento de estados patológicos en animales, incluidos seres humanos. Los fármacos de oligonucleótidos antisentido, incluidos ribozimas, se han administrado de un modo inocuo y eficaz a seres humanos y actualmente se están llevando a cabo numerosos ensayos clínicos. De este modo, se ha establecido que los compuestos antisentido pueden ser útiles en modalidades terapéuticas que puede configurarse que son útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialemente seres humanos.
Para terapia, un animal, preferentemente un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresión de la apolipoproteína C-III se trata administrando compuestos antisentido según la divulgación. Por ejemplo, en una realización no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal con necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la apolipoproteína C-III. Los inhibidores de la apolipoproteína C-III de la presente divulgación inhiben eficazmente la actividad de la proteína apolipoproteína C-III o inhiben la expresión de la proteína apoliproteína C-III. Por ejemplo, un compuesto de este tipo que reduzca los niveles de apolipoproteína C-III es útil para prevenir la morbimortalidad de sujetos con transtornos cardiacos. Por ejemplo, tal como se demuestra en los ejemplos, la reducción de apolipoproteína C-III puede dar como resultado la reducción de los niveles de colesterol, triglicéridos y glucosa en el suero. De este modo, los inhibidores de la apolipoproteína C-III son útiles en el tratamiento de hipertrigliceridemia, metabolismo anormal de lípidos, metabolismo anormal de colesterol, ateroesclerosis, hiperlipidemia, diabetes, incluida diabetes de tipo 2, obesidad, enfermedad cardiovascular, enfermedad arterial coronaria, entre otros trastornos relacionados con un metabolismo anormal o de otro tipo.
En una realización, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 10 %. Preferentemente, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 30 %. Más preferentemente, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 50 %. De este modo, los compuestos oligoméricos modulan la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en al menos el 10 %, en al menos el 20 %, en al menos el 25 %, en al menos el 30 %, en al
11
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
menos el 40 %, en al menos el 50 %, en al menos el 60 %, en al menos el 70 %, en al menos el 75 %, en al menos el 80 %, en al menos el 85 %, en al menos el 90 %, en al menos el 95 %, en al menos el 98 %, en al menos el 99 % o el 100 %.
Por ejemplo, la reducción de la expresión de apolipoproteína C-III puede medirse en suero, tejido adiposo, hígado o cualquier otro fluido corporal, tejido u órgano del animal. Preferentemente, las células presentes en dichos fluidos, tejidos u órganos que están siendo analizados contienen una molécula de ácido nucleico que codifica la apoliproteína C-III y/o apolipoproteína C-III.
Los compuestos de la presente invención pueden usarse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. El uso de los compuestos y procedimientos de la presente invención también pueden ser útiles profilácticamente.
F. Modificaciones
Tal como se sabe en la técncia, un nucleósido es una combinación base-azúcar. La porción de la base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para los nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido o bien al resto 2', 3' o 5'-hidroxilo del azúcar. Al formar oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí formando un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal pueden unirse posteriormente formando un compuesto circular; no obstante, son preferentes, generalmente, los compuestos lineales. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad de bases nitrogenadas internas y pueden, por lo tanto, plegarse de modo que se produzca un compuesto bicatenario total o parcial. Dentro de los oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan comúnmente formadores del esqueleto entre nucleósidos del oligonucleótido. La unión normal o esqueleto de ARN y ADN es una unión 3' a 5' fosfodiéster.
Uniones entre nucleósidos modificadas (esqueleto)
Los ejemplos específicos de compuestos antisentido útiles en la presente invención incluyen oligonucleótidos que contienen esqueletos modificados o uniones entre nucleósidos no naturales. Tal como se definen en la presente memoria descriptiva, los oligonucleótidos que tienen esqueletos modificados incluyen los que mantienen un átomo de fósforo en el esqueleto y los que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los fines de la presente memoria descriptiva y tal como se refiere a los mismos a veces en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto internucleósidico también pueden considerarse oligonucleótidos.
Los esqueletos de oligonucleótidos modificados preferentes que contienen un átomo de fósforo incluyen, por ejemplo fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y de otros alquilos que incluyen fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, forforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen uniones 3'-5' normales, análogos unidos 2'-5' de los mismos y los que tieen polaridad inversa en los que una o varias uniones entre nucleótidos es una unión 3' a 3', 5'a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleótidos preferentes que tienen polaridad invertida comprenden una unión 3' a 3' única en la unión entre nucleótidos del extremo 3', es decir, un resto de nucleósido invertido sencillo, que puede ser no básico (la base nitrogenada se ha perdido o tiene un grupo hidroxilo en el sitio de la misma). También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de las uniones que contienen fósforo mencionadas anteriormente incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos N°: 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
Los esqueletos de oligonucleótidos modificados preferentes que no incluyen un átomo de fósforo en el mismo tienen esqueletos que se forman por uniones entre nucleósidos alquílicas de cadena corta o cicloalquílicas, uniones entre nucleósidos mixtas de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo, o una o más uniones entre nucleósidos heteroatómicas o heterocíclicas de cadena corta. Éstos incluyen los que tienen uniones de morfolino (formadas en parte desde la porción de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano, esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metileno formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazon; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de los oligonucleótidos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
mencionados anteriormente incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos N°: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
Azúcar modificado y uniones entre nucleótidos - miméticos
En otros miméticos de oligonucleótido preferentes, tanto el azúcar como el enlace entre nucleótidos (es decir, el esqueleto), de las unidades de nucleótidos están reemplazados por grupos nuevos. Las unidades de bases nitrogenadas se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado. Un compuesto de este tipo, un mimético de oligonucleótido que se ha demostrado que tiene propiedades de hibridación excelentes, se denomina un ácido nucleico peptídico (PNA). En compuestos PNA, el esqueleto de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las bases nitrogenadas se mantienen y están unidas directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno azoicos de la porción de amida del esqueleto. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de los compuestos PNA mencionados anteriormente incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos N°: 5.539.082; 5.714.331 y 5.719.262. También se pueden encontrar ensañanzas sobre compuestos PNA en Nielsen y col., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Son realizaciones preferentes de la invención oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleótidos con esqueletos con heteroátomos, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [conocido como un esqueleto de metileno (metilimino) o MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -O-N(CH3)-CH2- CH2- [en el que el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH2-] del documento de patente de Estados Unidos N° 5.489.677 mencionado anteriormente, y los esqueletos de amida del documento de patente de Estados Unidos N°. 5.602.240 mencionado anteriormente. También son preferentes los oligonucleótidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino del documento de patente de Estados Unidos N° 5.034.506 mencionado anteriormente.
Azúcares modificados
Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o varios restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los grupos siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, pudiendo ser el alquilo, el alquenilo y el alquinilo alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Son particularmente preferentes O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O (CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, en los que n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los grupos siguientes en la posición 2': alquilo C1 a C10 inferior, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, o-alcarilo o O-aralquilo inferiores sustituidos, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, Cf3, oCf3, SOcH3, SO2CH3 ONO2, NO2 N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo comunicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Una modificación preferente incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'- MOE) (Martin y col., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación preferente adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'- DMAOE, tal como se describe en ejemplos más adelante en el presente documento, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2, que también se describe en ejemplos más adelante en el presente documento.
Otras modificaciones preferentes incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'- alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-alilo (2'-O-CH2-CH=CH2) y 2'-fluoro (2'-F). La modificación 2' puede estar en la posición arabino (arriba) o en la posición ribo (abajo). Una modificación 2'-arabino es 2'-F. También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleótido, particularmente en la posición 3' del azúcar del nucleótido del extremo 3' o de oligonucleótidos unidos en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en el sitio del azúcar pentofuranosilo. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos N°: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747 y 5.700.920, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
Otra modificación preferente del azúcar incluye ácidos nucleicos inaccesibles (LNA) en los que el grupo 2'- hidroxilo está unido al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar, formando, por lo tanto, un resto de azúcar bicíclico. La unión es preferentemente un grupo metileno (-CH2-)n que hace de puente entre el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', en el que n es 1 ó 2. Los LNA y la preparación de los mismos se describen en las
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Publicaciones de patente internacional N°. WO 98/39352 y WO 99/14226.
Bases nitrogenadas naturales y modificadas
Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituiciones de bases nitrogenadas (a menudo denominadas en la técnica simplemente como "bases"). Tal como se usan en el presente documento, bases nitrogenadas "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases purinas adenina (A) y guanina (G) y las bases pirimidinas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las bases nitrogenadas modificadas incluyen otras bases nitrogenadas sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halo-uracilo y citosina, 5-propinil (-C=C-CHa) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en la posición 8, 5- halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en la posición 5, 7- metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7- desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras bases nitrogenadas modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H- pirimido[5,4-b][1,4]benzoti-azin-2(3H)-ona), abrazaderas en G tales como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4] benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido [4,5-b] indol-2- ona), piridoindol citidina (H-pirido[3',2':4,5] pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las bases nitrogenadas modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base purina o pirimidina está reemplazada por otros heterociclos, por ejemplo, 7- desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras bases nitrogenadas incluyen las divulgadas en el documento de patente de Estados Unidos N° 3.687.808, las divulgadas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, las divulgadas por Englisch y col., Angewandte Chemie, edición internacional, 1991, 30, 613, y las divulgadas por Sanghvi, Y.S., capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas bases nitrogenadas son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C y son actualmente sustituciones de bases preferentes, incluso más particularmente si se combinan con modificaciones 2'-O-metoxietil azúcar.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de algunas de las bases nitrogenadas modificadas citadas anteriormente así como otras bases nitrogenadas incluyen, pero no están limitadas a, el documento de patente de Estados Unidos N° 3.687.808 citada anteriormente, así como los documentos de patente de Estados Unidos N°: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096 y 5.681.941, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud y el documento de patente de Estados Unidos N° 5.750.692, que se encuentra en propiedad conjunta con la presente solicitud.
Conjugados
Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica la unión química al oligonucleótido de uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la presente invención incluyen intercaladores, moléculas comunicadoras, poliaminas, polietileno, glicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de oligómeros y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas y pigmentos. Los grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de la presente invención, incluyen grupos que mejoran la captación, potencian la resistencia a la degradación y/o potencian la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de la presente invención, incluyen grupos que mejoran la captación, la distribución, el metabolismo o la excreción de los compuestos de la presente invención. Se divulgan grupos conjugados representativos en la Solicitud de patente internacional PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992, y en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860. Los restos conjugados incluyen, pero no están limitados a, restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosofolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietileno glicol, o ácido adamantano acético, un resto palmitílico, o un resto de octadecilamina o de hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleótidos de la invención también pueden conjugarse con sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triiodobenzoico,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Los conjugados oligonucleótido- fármaco y su preparación se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos N° 09/334.130 (presentada el 15 de junio de 1999).
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichos conjugados de oligonucleótido incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos N°: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584;
5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735;
4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963;
5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873;
5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810;
5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
Compuestos quiméricos
No es necesario para todas las posiciones en un compuestos dado estar uniformemente modificado y, de hecho, más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un compuesto individual o incluso en un nucleósido individual dentro de un oligonucleótido.
La presente divulgación también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido “quiméricos” o "quimeras," en el contexto de la presente invención, son compuestos antisentido, en particular oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región en la que el oligonucleótido está modificado de modo que confiere sobre el oligonucleótido una resistencia aumentada a la degradación por nucleasa, captación celular aumentada, estabilidad aumentada y/o afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico diana. Una región adicional del nucleótido puede servir con sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplos, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de la ARNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión de la diana de ARN, potenciando ampliamente de este modo la eficacia de la inhibición mediada por oligonucleótidos de la expresión génica. La escisión de los híbridos ARN:ARN puede, de igual manera, realizarse mediante las acciones de endorribonucleasas, tales como ARNasa L, que escinde tanto el ARN celular como vírico. La escisión de la diana de ARN puede detectarse rutinariamente mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en la técnica.
En una realización, los oligonucleótidos quiméricos deseables tienen 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región central que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, flanqueados en ambos lados (direcciones 5' y 3') por cinco 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Las uniones internucleosídicas son fosfortioato a lo largo del oligonucleótido y todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas.
En otra realización, determinados oligonucleótidos quiméricos preferentes son los divulgados en los ejemplos del presente documento. Los oligonucleótidos químericos particularmente quiméricos son los denominados ISIS 304757, ISIS 304758, ISIS 304755, ISIS304800 y ISIS 304756.
Los compuestos antisentido quiméricos de la presente invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos tal como se ha descrito anteriormente. Dichos compuestos también se han denominado en la técnica como híbridos o gapmer. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras híbridas incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos N°: 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356 y 5.700.922, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
G. Formulaciones
Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas o de otro tipo, para asistir en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas formulaciones que asisten la captación, distribución y/o absorción incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos N°: 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575 y 5.595.756.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los compuestos antisentido de la invención comprenden cualesquiera sales farmacéuticamente aceptables, ésteres o sales de dichos ésteres, o cualquier otro compuestos que después de la administración a un animal, incluidos seres humanos, sean capaces de proporcionar (directamente o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se refiere a profármacos y a sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, a sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y a otros bioequivalentes. El término “profármaco” indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, el fármaco) dentro del organismo o de las células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones profármaco de los oligonucleótidos de la presente invención se preparan como derivados de SATE [(S-acetil-2-tioetil) fosfato] según los procedimientos divulgados en la Solicitud internacional de patente N° WO 93/24510 de Gosselin y col., publicada el 9 de diciembre de 1993, o en la Solicitud internacional de patente N°WO 94/26764 y el documento de patente de Estados Unidos N° 5.770.713 de Imbach y col.
La expresión “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que mantienen la actividad biológica deseada del compuesto progenitor y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos. Para oligonucleótidos, los ejemplos preferentes de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
La presente invención también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos antisentido de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por una serie de vías dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y de la zona que se va a tratar. La administración puede ser tópica (que incluye oftálmicamente y por membranas mucosas que incluyen la administración vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen por nebulizador, intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intreperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para la administración oral. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Los vehículos farmacéuticos, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares convencionales pueden ser necesarios o deseables. Los condones, guantes y similares recubiertos también pueden ser útiles.
Las formulaciones farmacéuticas divulgadas en la presente, que pueden estar presentes convenientemente en formas de dosificación unidad pueden prepararse según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de mezclar los ingredientes activos con el/los vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan mezclando uniformemente e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, dar forma al producto.
Las composiciones divulgadas en la presente pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero sin limitarse a, comprimidos, cápsulas, cápsulas en gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener, además, sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluidas, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente incluyen, pero no están limitadas a, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas divulgadas en la presente pueden comprender uno o varios promotores de penetración, vehículos, excipientes y otros ingredientes activos o inactivos.
Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotas que generalmente exceden 0,1 |jm de diámetro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas y el fármaco activo que puede estar presente como solución bien en la fase acuosa, en la fase oleosa o bien por sí mismo como fase separada. Las microemulsiones están incluidas como una realización de la presente invención. Las emulsiones y sus usos son bien conocidas en la técnica y se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
Las formulaciones divulgadas en el presente documento incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta por lípidos anfífilos dispuestos en una bicapa o en bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada a partir de material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que se va a administrar. Los liposomas catiónicos son liposmas cargados positivamente que se cree que interactúan con moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. Los liposomas que son sensibles al pH
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
o están cargados negativamente se cree que atrapan el ADN más que acomplejarse con el mismo. Tanto los liposomas catiónicos como los no catiónicos se han usado para proporcionar ADN a las células.
Los liposomas también incluyen liposomas “estabilizados estéricamente”, una expresión que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o varios lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado una duración en circulación potenciada con respecto a liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la porción lipídica que forma la vesícula del liposoma comprende uno o varios glucolípidos o está derivatizada con uno o varios polímeros hidrófilos, tales como un resto polietileno glicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
Las formulaciones y composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmacéuticos, formulaciones y en emulsiones es bien conocidos en la técnica. Los tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
En una realización, la presente invención usa diversos potenciadores de la penetración para incluir en la administración eficaz de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Además de dirigir la difusión de fármacos no lipófilos a través de membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos. Los potenciadores de la penetraciónpueden clasificarse como que pertenecen a una de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los potenciadores de la penetración se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
Un experto en la técnica reconocerá que las formulaciones se diseñan rutinariamente según su pretensión de uso, es decir, su vía de administración.
Las formulaciones preferentes para administración tópica incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención se mezclan con un agente de administración tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferentes incluyen los neutros (por ejemplo dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearolifosfatidil colina) los negativos (por ejemplo dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y los catiónicos (por ejemplo dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA).
Para la administración tópica o de otro tipo, los oligonucleótidos de la invención pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden acomplejarse con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos preferentes y sus ésteres, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860. Las formulaciones tópicas se describen en detalle en la solicitud de patente de Estados Unidos N° 09/315.298, presentada el 20 de mayo de 1999.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanoparticulas, suspensiones o soluciones en agua o en medios no acuosos, cápsulas, cápsulas en gel, bolsitas, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, espesantes o aglutinantes. Las formulaciones orales preferentes son aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención se administran conjuntamente con uno o varios potenciadores de la penetración tensioactivos o quelantes. Los tensioactivos preferentes incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos y/o sales biliares de los mismos. Los ácidos/sales biliares y ácidos grasos y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860, que se incorpora al presente documento en su totalidad. También son preferentes las combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales grasas en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación particularmente preferente es la sal sódica de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Otros potenciadores de la penetración incluyen polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter. Los oligonucleótidos de la invencón pueden administrarse oralmente, en forma de gránulos que incluye partículas secas pulverizadas o complejos para formar micro o nanopartículas. Los agentes acomplejantes de oligonucleótidos y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.287.860. Las formulaciones orales para oligonucleótidos y su preparación se describen en detalle en la Solicitud de patente publicadda de Estados Unidos N° 2003/0040497 (27 de febrero, 2003) y sus solicitudes principales; la Solicitud de patente publicadda de Estados Unidos N° 2003/0027780 (6 de febrero, 2003) y sus solicitudes principales; y la Solicitud de patente publicada de Estados Unidos N° 10/071.822, presentada el 8 de febrero, 2002.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventicular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a, potenciadores de la penetración, compuestos vehículos y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Determinadas realizaciones de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o varios compuestos oligoméricos y uno o varios de otros agentes quimioterapéuticos que operan mediante un mecanismo no antisentido. Los ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no están limitados a, fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, bis-cloroetilnitrosurea, busulfan, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostaza nitrogenada, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5- azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-
fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposida, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos pueden usarse individualemente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido durante un periodo seguido de MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o varios de otros agentes quimioterapéuticos (por ejemplos, 5-FU, MTX y oligonucleótido o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). Los fármacos antiinflamatorios, que incluyen, pero no se limitan a, fármacos antiinflamatorios y corticoesteroides, y fármacos antivirales, que incluyen, pero no se limitan a. ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en composiciones de la invención. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros fármacos no antisentido también están dentro del ámbito de la presente invención. Pueden usarse juntos o secuencialmente dos o más compuestos combinados.
En otra realización relacionada, las composiciones de la presente invención pueden contener uno o varios compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o varios compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos a regiones diferentes del mismo ácido nucleico diana. Se conocen en la técnica numerosos ejemplos de compuestos antisentido. Pueden usarse juntos o secuenciamente dos o más compuestos combinados.
H. Dosificación
La formulación de composiciones terapéuticas y su administración subsiguiente (dosificación) se asume que está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y de la respuesta del estado patológico que se va tratar, con una duración del curso del tratamiento de varios días a varios meses, o hasta que se efectúe una cura o se logre una disminución del estado patológico. La planificación óptima de la dosificación pueden calcularse a partir de mediciones de la acumulación de fármaco en el organismo del paciente. Los expertos pueden determinar fácilmente las dosis óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales y pueden estimarse, en general, sobre la base de los CE50 que se ha encontrado que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosis varía de 0,01 |jg a 1,00 g por kg de peso corporal y puede administrarse una o más veces al día, a la semana, al mes o al año, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden estimar fácilmente las tasas de repetición para dosificaciones sobre la base del tiempo de residencia medido y las concentraciones de fármaco en fluidos y tejidos corporales. Después de un tratamiento exitoso, puede ser deseable que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado patológico, en la que el nucleótido se administra en dosis de mantenimiento que varían de 0,01 jg a 1,00 g por kg de peso corporal, una o varias veces al día a una vez cada 20 años.
Mientras la presente invención se ha descrito con especificidad según algunas de sus realizaciones preferentes, los siguientes ejemplos sirven sólo como ilustración de la invención y no pretenden limitarla.
EJEMPLOS
Los ejemplos que no se refieran directamente a la invención reivindicada están por motivos de comparación e ilustración.
Ejemplo 1: Síntesis de fosforamiditas de nucleósido
Los compuestos siguientes, que incluyen fosforamiditas y sus intermedios se prepararon tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.426.220 y en la Publicación de patente internacional N° WO 02/36743; 5'-O-dimetoxitritil-timidina intermedio para 5-metil dC amidita, 5'-O-dimetoxitritil-2'-deoxi-5-metilcitidina intermedio para 5-metil-dC amidita, 5'-O-dimetoxitritil-2'-desoxi-N4-benzoil-5-metilcitidina penúltimo intermedio para 5- metil dC amidita, [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-desoxi-N4-benzoil-5-metilcitidin-3’-0-il]-2-cianoetil-W,W-
diisopropilfosforamidita (5-metil dC amidita), 2’-fluorodesoxiadenosina, 2’-fluorodesoxiguanosina, 2’-fluorouridina, 2’- fluorodesoxicitidina, 2’-O-(2-metoxietil) amiditas modificadas, intermedio 2’-O-(2-metoxietil)-5-metiluridina, intermedio penúltimo 5’-O-DMT-2’-O-(2-metoxietil)-5-metiluridina, [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-0-(2-metoxietil)-5-metil- uridin-3’-0-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (MOE T amidita), intermedio 5’-O-dimetoxitritil-2’-0-(2-metoxietil)- 5-metilcitidina, intermedio penúltimo 5’-0-dimetoxitritil-2’-O-(2-metoxietil)-N4-benzoil-5-metil-citidina, [5’-O-(4,4’-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
dimetoxitrifenilmetil)-2'-0-(2-metoxietil)-N4-benzoil-5-metilcitidin-3'-0-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (MOE 5- Me-C amidita), [5'-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-2'-0-(2-metoxietil)-N6-benzoiladenosin-3'-0-il]-2-cianoetil-N,N-
diisopropilfosforamidita (MOE A amidita), [5’-0-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-0-(2-metoxietil)-N4-isobutirilguanosin-3’- 0-il]-2-cianoetil-N,N-diisopro-pilfosforamidita (MOE G amidita), 2'-O-(aminooxietil) nucleósido amiditas y 2’-O- (dimetilaminooxietil) nucleósido amiditas, 2'-(dimetilaminooxietoxi) nucleósido amiditas, 5’-O-terc-butildifenilsilil-O2-2’- anhidro-5-metiluridina, 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina, 2’-O-([2-ftalimidoxi)etil]-5’-f-
butildifenilsilil-5-metiluridina, 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina, 5’-O-terc-
butildifenilsilil-2'-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina, 2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina, 5’-O-DMT-2’-O- (dimetilaminooxietil)-5-metiluridina, 5’-O-DMT-2’-O-(2-N,N-dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3’-[(2-cianoetil)-N,N- diisopropilfosforamidita], 2'-(aminooxietoxi) nucleósido amiditas, N2-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2’-O-(2-etilacetil)-5’- O-(4,4’-dimetoxitritil)guanosina-3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropil-fosforamidita], 2'-dimetilaminoetoxietoxi (2'-DMAEOE) nucleósido amiditas, 2’-O-[2(2-N,N-dimetilami-noetoxi)etil]-5-metil uridina, 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N,N- dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metil uridina y 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metil uridina-3’-O- (cianoetil-N,N-diisopropil) fosforamidita.
Ejemplo 2: Oligonucleótidos y síntesis de oligonucleótidos
Los compuestos antisentido que se usan según la presente invención pueden prepararse conveniente y rutinariamente mediante técnicas bien conocidas de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis se comercializa por parte de varias empresas, incluida, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA, Estados Unidos). Puede usarse adicional o alternativamente cualquier otro medio para dicho síntesis conocido en la técnica. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucléotidos tales como los fosoforotioatos y sus derivados alquilados.
Oligonucleótidos: Los oligonucleótidos de fosfodiéster (P=O) no sustituidos y sustituidos se sintetizan en un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 394) usando química estándar de fosforamidita con oxidación por yodo.
Los fosforotioatos (P=S) se sintetizan de forma similar a los oligonucleótidos de fosfodiéster con las siguientes excepciones: la tiación se efectuó usando una solución al 10 % p/v de 1,1-dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3- ona en acetonitrilo para la oxidación de los enlaces de fosfito. El tiempo de la etapa de reacción de tiación se aumentó a 180 s y fue precedida por la etapa normal de remate. Después de escisión a partir de la columna CPG y desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55 °C (12-16 h), los oligonucleótidos se recuperaron por precipitación con >3 volumenes de etanol de una solución 1 M de NH4OA. Los oligonucleótidos de fosfinato se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos N° 5.508.270.
Los oligonucleótidos de fosfonato de alquilo se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos N° 4.469.863.
Los oligonucleótidos de fosfonato de 3’-desoxi-3’-metileno se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos N°. 5.610.289 ó 5.625.050.
Los oligonucleótidos de fosforamidita se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos N° 5.256.775 ó 5.366.878.
Los oligonucleótidos de fosfonotioato de alquilo se preparan tal como se describe en las Solicitud de patente internacional N° PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).
Los oligonucleótidos de 3’-desoxi-3’-amino fosforamidato se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos N° 5.476.925. Los oligonucleótidos de fosfotriéster se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos N° 5.023.243.
Los oligonucleótidos de borano fosfato se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos N° 5.130.302 y 5.177.198.
Oligonucleósidos: Los oligonucleósidos unidos a metilenmetilimino, también identificados como oligonucleósidos unidos a MMI, los oligonucleósidos unidos a metilendimetilhidrazo, también identificados como oligonucleósidos unidos a MDH y los oligonucleósidos unidos a metilencarbonilamino, también identificados como oligonucleósidos unidos a amida-3 y los oligonucleósidos unidos a metilenaminocarbonilo, también identificados como oligonucleósidos unidos a amida-4, así como compuestos de esqueleto mixto que tienen, por ejemplo, uniones alternas MMI y P=O o P=S se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos N° 5.378.825, 5.386.023, 5.489.677, 5.602.240 y 5.610.289.
Los oligonucleósidos unidos a formacetal y tiformacetal se preparan tal como se describe en los documentos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
patente de Estados Unidos N° 5.264.562 y 5.264.564.
Los oligonucleótidos unidos a óxido de etileno se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos N° 5.223.618.
Ejemplo 3: Síntesis de ARN
En general, la química de síntesis de ARN se base en la incorporación selectiva de varios grupos protectores en reacciones intermedias estratégicas. Aunque un experto en la técnica entenderá el uso de grupos protectores en síntesis orgánica, una clase útil de grupos protectores incluye silil éteres. En particular, se usan silil éteres voluminosos para proteger el 5'-hidroxilo en combinación con un grupo protector de ortoéster lábil frente a ácidos en el 2'-hidroxilo. Este conjunto de grupos protectores se usa, entonces, con tecnología de síntesis en fase sólida estándar. Es importante eliminar, por último, el grupo protector de ortoéster lábil frente a ácidos después de todas las etapas de síntesis. Además, el uso temprano de grupos protectores de sililo durante la síntesis asegura la eliminación sencilla cuando se desee, sin la desprotección no deseada del 2' hidroxilo.
Siguiendo esté procedimiento para proteger secuencialmente el 5'-hidroxilo en combinación con la protección del 2'-hidroxilo mediante grupos protectores que se eliminan diferencialmente y son lábiles químicamente de modo diferencial, se sintetizaron los oligonucleótidos de ARN.
Los oligonucleótidos de ARN se sintetizan en etapas. Cada nucleótido se añade secuencialmente (dirección 3' a 5') a un oligonucleótido unido a un soporte sólido. El primer nucléosido del extremo 3' de la cadena se une covalentemente a un soporte sólido. Se añaden el precursor de nucleótidos, una fosforamidita de ribonucleósido, y el activador, que acopla la segunda base en el extremo 5' del primer nucleósido. El soporte se lava y cualquier grupo 5'- hidroxilo no reaccionado se remata con anhídrido acético para proporcionar restos 5'-acetilo. La unión se oxida después para proporcionar una unión más estable y deseada en última instancia P(V). Al final del ciclo de adición de nucleótidos, el grupo 5'-sililo se escinde con fluoruro. El ciclo se repite para cada nucleótido subsiguiente.
Siguiendo con la síntesis, los grupos protectores de metilo en los fosfatos se escinden en 30 minutos usando 2-carbamoil-2-cianoetilen-1,1-ditiolato de disodio trihidrato (S2Na2) 1 M en DMF. La solución de desprotección se lava a partir del oligonucléotido unido al soporte sólido usando agua. Después, el soporte se trata con metilamina al 40 % en agua durante 10 minutos a 55 °C. Esto libera los oligonucleótidos de ARN a la solución, desprotege las aminas exocíclicas y modifica los grupos 2'. En este estado pueden analizarse los oligonucleótidos mediante HPLC de intercambio aniónico.
Los grupos 2'-ortoéster son los últimos grupos de protección que se eliminan. El grupo protector de ortoéster de monoacetato de etilenglicol desarrollado por Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO, Estados Unidos) es un ejemplo de un grupo protector de ortoéster útil que tiene las siguientes propiedades importantes. Es estable en las condiciones de síntesis de fosforamidita de nucleósidos y la síntesis de oligonucleótidos. No obstante, después de la síntesis de oligonucleótido, el oligonucleótido se trata con metilamina, que no sólo escinde el oligonucleótido del soporte sólido, sino que también elimina los grupos acetilo de los ortoésteres. Los sustituyentes 2-etilhidroxilo resultantes en el ortoéster son menos electroaceptores que su precursor acetilado. Como resultado, el ortoéster modificado se vuelve más lábil frente a la hidrólisis catalizada por ácidos. Específicamente, la velocidad de escisión es aproximadamente 10 veces más rápida después de eliminar los grupos acetilo. Por lo tanto, este ortoéster posee suficiente estabilidad con el fin de ser compatible con la síntesis de oligonucleótidos y ahora, cuando se modifica subsiguientemente, permite que la desprotección se realice en condiciones acuosas relativamente templadas compatibles con el producto de oligonucleótido de ARN final.
Adicionalmente, los procedimientos de síntesis de ARN son bien conocidos en la técnica (Scaringe, S. A. Ph.D. Thesis, Universidad de Colorado, 1996; Scaringe, S. A. y col., J. Am. Chem. Soc, 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M. D. y Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc, 1981, 103, 3185-3191; Beaucage, S. L. y Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J. y col., Acta Chem. Scand. 1990, 44, 639-641; Reddy, M. P. y col., Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F. y col., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin, B. E. y col., Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E. y col., Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331).
Los compuestos antisentido de ARN (oligonucleótidos de ARN) de la presente invención pueden sintetizarse mediante los procedimientos del presente documento o adquirirse de Dharmacon Research, Inc (Lafayette, CO, Estados Unidos). Una vez sintetizados, los compuestos de ARN complementarios pueden alinearse después mediante procedimientos conocidos en la técnica para formar compuestos antisentido bicatenarios (duplicados). Por ejemplo, los dúplex pueden formarse combinando 30 pl de cada una de las cadenas complementarias de oligonucleótidos de ARN (solución de oligonucleótidos de ARN 50 uM) y 15 pl de tampón de alineación 5X (acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM) seguido de calentamiento durante 1 minuto a 90 °C, después 1 hora a 37 °C. Los compuestos antisentido duplicados resultantes pueden usarse en kits, ensayos, análisis u otros procedimientos para investigar el papel de un ácido nucleico diana.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 4: Síntesis de oligonucleótidos quiméricos
Los oligonucleótidos sintéticos, oligonucleósidos u oligonudeótidos/oligonudeósidos mixtos de la invención pueden ser de varios tipos diferentes. Estos incluyen un primer tipo en el que el segmento "hueco" de nucleósidos unidos se posiciona entre los segmentos "flanco" 5' y 3' de nucleósidos unidos y un segundo tipo de “extremo abierto” en el que el segmento “hueco" se localiza bien en el extremo 3' o bien en el 5' del compuestos oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo también se conocen en la técnica como “gapmers" u oligonucleótidos con huecos. Los olignucleótidos del segunto tipo también se conocen en la técnica como "hemimers" o "wingmers".
Oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2'-O-Me]--[2'-desoxi]--[2'-O-Me]
Los oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos de oligonucleótidos de 2'-O-alquil fosforotioato y de 2'-desoxi fosforotioato se sintetizan usando un sintetizador de ADN automático de Applied Biosystems modelo 394, como anteriormente. Los oligonucleótidos se sintetizan usando el sintetizador automático y 2'-desoxi-5'-dimetoxitritil-3- O-fosforamidita para la porción de ADN y 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita para los flancos 5' y 3'. El ciclo de síntesis estándar se modifica incorporando etapas de acoplamiento con tiempos de reacción aumentados para la 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita. El oligonucleótido totalmente protegido se escinde del soporte y se desprotege en amoniaco concentrado (NH4OH) durante 12-16 h a 55 °C. El oligo desprotegido se recupera después usando un procedimiento apropidado (precipitación, cromatografía en columna, volumen reducido al vacío y se analiza espectrofotométricamente para determinar el rendimiento y la pureza por electroforesis capilar y espectrometría de masas.
Oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2'-O-(2-metoxietil)]--[2'-desoxi]--[2'-O-(metoxietil)]
Los oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2'-O-(2-metoxietil)]--[2'-desoxi]--[2'-O-(metoxietilo)] se prepararon igual que en el procedimiento anterior para oligonucleótidos quiméricos de 2'-O-metilo con la sustitución de 2'-O-(metoxietil) amiditas por las 2'-O-metil amiditas.
Oligonucleótidos quiméricos de [2'-O-(2-metoxietil)fosfodiéster]--[2'-desoxi fosforotioato]--[2'-O-(metoxietil) fosfodiéster]
Los oligonucleótidos quiméricos de [2'-O-(2-metoxietil)fosfodiéster]--[2'-desoxi fosforotioato]--[2'-O- (metoxietil) fosfodiéster] se prepararon igual que en el procedimiento anterior para oligonucleótidos de 2'-O-metilo quiméricos con la sustitución de 2'-O-(metoxietil) amiditas por las 2'-O-metil amiditas, oxidación con yodo para generar las uniones entre nucleótidos fosfodiéster dentro de las porciones de los flancos de las estructuras quiméricas y la sulfuración usando 1,1 -dióxido de 3,H-1,2 benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent) para generar las uniones fosforotioato entre nucleótidos para el hueco central.
Otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos y oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos mixtos se sintetizan según el documento de patente de Estados Unidos N° 5.623.065.
Ejemplo 5: Diseño y selección de compuestos antisentido duplicados dirigidos a la apolipoproteína C-III
Una serie de dúplex de ácidos nucleicos que comprende los compuestos antisentido de la presente divulgación y sus complementos se diseña para dirigirse a la apolipoproteína C-III. La secuencia de bases nitrogenadas de la cadena antisentido del dúplex comprende al menos una porción de un oligonucleótido en la tabla 1. Los extremos de las cadenas pueden modificarse por adición de una o varias bases nitrogenadas para formar un saliente. Después, la cadena en sentido correcto del ARNds se diseña y se sintetiza como el complemento de la cadena antisentido y también puede contener modificaciones o adiciones en cada extremo. Por ejemplo, en una realización, ambas cadenas del dúplex de ARNds serían complementarias con respecto a las bases nitrogenadas centrales, teniendo cada una salientes en uno de los extremos o en ambos.
Por ejemplo, un dúplex que comprende una cadena antisentido que tiene la secuencia CGAGAGGCGGACGGGACCG (SEC ID N°: 465) y que tiene un saliente de dos bases nitrogenadas de desoxitimidina (dT) tendría las estructuras siguientes (secuencia antisentido SEC ID N°: 466, secuencia complementaria SEC ID N°: 467):
cgagaggcggacgggaccgTT Cadena antisentido
Miimmimiiiii
TTgctctccgcctgccctggc Cadena complementaria
En otra realización, un dúplex que comprende una cadena antisentido que tiene la misma secuencia CGAGAGGCG-GACGGGACCG (SeC ID N°: 465) puede prepararse con extremos romos (ningún saliente de cadena sencilla) tal como se muestra (secuencia antisentido SEC ID N°: 465, secuencia complementaria SEC ID N°: 468):
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cgagaggcggacgggaccg Cadena antisentido
11111M111 ti! 1111 i l
gctctccgcctgccctggc Cadena complementaria
Las cadenas de ARN del dúplex pueden sintetizarse mediante procedimientos divulgados en el presente documento o adquirirse de Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO, Estados Unidos). Una vez sintetizadas, las cadenas complementarias se alinean. Las cadenas sencillas se dividen en partes alícuotas y se diluyen a una concentración 50 pM. Una vez diluidas, se combinan 30 pl de cada cadena con 15 pl de una solución 5X de tampón de alineación. La concentración final de dicho tampón es acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, y acetato de magnesio 2 mM. El volumen final es de 75 pl. Esta solución se incuba durante 1 minuto a 90 °C y después se centrifuga durante 15 minutos. El tubo se deja asentar durante 1 hora a 37 °C y al final de dicho periodo se usan los dúplex de ARNds en experimentación. La concentración final del dúplex de ARNds es 20 pM. Esta solución puede almacenarse congelada (-20 °C) y descongelarse hasta 5 veces.
Una vez preparados, los compuestos antisentido duplicados se evalúan para determinar su capacidad de modulación de la expresión de la apolipoproteína C-III.
Cuando las células han alcanzado un 80 % de confluencia, se tratan con compuestos antisentido duplicados de la invención. Para células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavan una vez con 200 pl de medio de suero reducido OPTI-MEM-1™ (Gibco BRL) y después se tratan con 130 pl de medio OPTI-MEM-1™ que contiene 12 pg/ml de reactivo LIPOFECTIN™ (Gibco bRl) y el compuesto antisentido dúplex deseado a una concentración final de 200 nM. Despúes de 5 horas de tratamiento, el medio se reemplaza con medio reciente. Las células se recogen 16 horas después del tratamiento, en dicho momento se aísla el ARN y se mide la reducción de diana por RT-PCR.
Ejemplo 6: Aislamiento de oligonucléotidos
Después de la escisión a partir del soporte sólido de vidrio poroso contolado y de desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55 °C durante 12-16 horas, los oligonucleótidos u oligonucleótidos se recuperan por precipitación de NH4OAC 1 M con >3 volumenes de etanol. Los oligonucleótidos sintetizados se analizaron por electroscopia de masas por electropulverización (determinación del peso molecular) y por electroforesis en gel capilar y se determinó que eran al menos en el 70 % material de cadena completa. Las cantidades relativas de uniones fosforotioato y fosfodiéster obtenidas en la síntesis se determinaron mediante la relación del peso molecular correcto con respecto al producto de -16 uma (+/-32 +/-48). Para algunos estudios los oligonucleótidos se purificaron por HPLC, tal como se describe por Chiang y col., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con material purificado por HPLC fueron similares a los obtenido con material no purificado por HPLC.
Ejemplo 7: Síntesis de oligonucleótidos. Formato de placas de 96 pocilios
Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante química de fosforamidita en fase sólida P(III) en un sintetizador automático capaz de ensamblar 96 secuencias simultáneamente en un formato de 96 pocillos. Las uniones entre nucleótidos fosfordiéster se realizaron por oxidación con yodo acuoso. Las uniones entre nucleótidos fosforotioato se generaron por sulfuración usando 1,1-dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent) en acetonitrilo anhidro. Las beta-cianoetil-diiso-propil fosforamiditas protegidas de bases se adquirieron de proveedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos, o Pharmacia, Piscataway, NJ, Estados Unidos). Los nucleósidos no estándar se sintetizaron como para los procedimientos estándar o patentados. Se utilizan como beta-cianoetildiisopropil fosforamiditas protegidas de bases.
Los oligonucleótidos se escindieron del soporte y se desprotegieron con NH4OH concentrado a temperatura elevada (55-60 °C) durante 12-16 horas y el producto liberado se secó después al vacío. El producto seco se resuspendió después en agua estéril para proporcionar una placa maestra a partir de la cual se diluyeron después todas las muestras de placas analíticas y de ensayo usando un pipeteador automático.
Ejemplo 8: Análisis de oligonucleótidos. Formato de placas de 96 pocillos
La concentración de oligonucleótidos en cada pocillo se evaluó por dilución de muestras y espectroscopía de absorción UV. La integridad de longitud completa de los productos individuales se evaluó por electroforesis capilar (CE) bien en un formato de 96 pocillos (aparato Beckman P/ACE™ MDQ) o bien, para muestras preparadas individualmente, en un aparato de CE comercial (por ejemplo, un aparato Beckman P/ACE™ 5000, ABI 270). La composición de la base y el esqueleto se confirmó por análisis de masas de los compuestos usando espectroscopía de masas con electropulverización. Todos las placas de ensayo se diluyeron a partir de la placa maestra usando pipeteadores robóticos de varios canales. Se consideró que las placas eran aceptables si al menos el 85 % de los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
compuestos de la placa tenían al menos el 85 % de longitud completa.
Ejemplo 9: Cultivo celular y tratamiento de oligonucleótidos
El efecto de compuestos antisentido en la expresión de ácidos nucleicos diana pueden analizarse en cualquiera de entre una variedad de tipos celulares siempre que el ácido nucleico esté presente en niveles medibles. Esto puede determinarse rutinariamente usando, por ejemplo, PCR o inmunotransferencia (Northern). Los tipos celulares siguientes se proporcionan por fines ilustrativos, pero pueden usarse rutinariamente otros tipos celulares, siempre que la diana se exprese en el tipo celular elegido. Esto puede determinarse fácilmente mediante procedimientos de rutina en la técnica, por ejemplo inmunotransferencia (Northern), ensayos de protección de ribonucleasa o RT-PCR.
Células T-24:
Se obtuvo la linea celular T-24 de carcinoma de vejiga de células transicionales humanas de la Colección estadounidense de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA, Estados Unidos). Las células T-24 se cultivaron de forma rutinaria en medio basal 5A de McCoy (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero de carnero fetal al 10 % (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos), penicilina (100 unidades por ml) y estreptomicina (100 microgramos por ml) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las celular se sometieron rutinariamente a tripsinización y a dilución cuando alcanzaron una confluencia del 90 %. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-primaria N° 353872) a una densidad de 7.000 células/pocillo para su uso en análisis RT-PCR.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo de tejidos de 100 mm o de otro tamaño estándar y se tratan de forma similar usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Células A549:
Se obtuvo la linea celular A549 de carcinoma de pulmón humano de la Colección estadounidense de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA, Estados Unidos). Las células A549 se cultivaron de forma rutinario en medio basal DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero de carnero fetal al 10 % (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos), penicilina (100 unidades por ml) y estreptomicina (100 microgramos por ml) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las celular se sometieron rutinariamente a tripsinización y a dilución cuando alcanzaron una confluencia del 90 %.
Células NHDF:
Se obtuvieron fibroblastos dérmicos de recién nacido humano (NHDF) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD, Estados Unidos). Los NHDF se mantuvieron rutinariamente en medio de crecimiento de fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD, Estados Unidos) suplementado tal como recomienda el proveedor. Las células se mantuvieron durante hasta 10 pasos tal como recomienda el proveedor.
Células HEK:
Se obtuvieron queratinocitos embiónicos humanos (NHDF) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD, Estados Unidos). Los HEK se mantuvieron rutinariamente en medio de crecimiento de queratinocitos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD, Estados Unidos) formulado tal como recomienda el proveedor. Las células se mantuvieron durante hasta 10 pasos tal como recomienda el proveedor.
Células HepG2:
Se obtuvo la linea celular HepG2 de hepatoblastoma humano de la Colección estadounidense de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA, Estados Unidos). Las células HepG2 se cultivaron rutinariamente en MEM de Eagle suplementado con suero de carnero fetal al 10 %, aminoácidos no esenciales y piruvato de sodio 1 mM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Las celular se sometieron rutinariamente a tripsinización y a dilución cuando alcanzaron una confluencia del 90 %. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon- primaria N° 3872) a una densidad de 7.000 células/pocillo para su uso en análisis RT-PCR.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo de tejidos de 100 mm o de otro tamaño estándar y se tratan de forma similar usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Células Hep3B:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se obtuvo la linea celular Hep3B de carcinoma hepatocelular humano de la Colección estadounidense de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA, Estados Unidos). Las células Hep3B se cultivaron de forma rutinaria en MEM de Dulbeccos de alta concentración de glucosa suplementado con suero de carnero fetal al 10 %, L-glutamina e clorhidrato de piridoxina (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Las celular se sometieron rutinariamente a tripsinización y a dilución cuando alcanzan una confluencia del 90 %. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (Falcon-primaria N° 3846) a una densidad de 50.000 células/pocillo para su uso en análisis de RT-PCR.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo de tejidos de 100 mm o de otro tamaño y se tratan de forma similar usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Hepatocitos de ratón primarios:
Los hepatocitos de ratón primarios se prepararon a partir de ratones CD-1 adquiridos de Charles River Labs (Wilmington, MA, Estados Unidos) y se cultivaron de forma rutinaria en DMEM, de alta concentración de glucosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero de bovino fetal al 10 % (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 100 unidades por ml de penicilina y 100 microgramos por ml de espectrosmicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las células se cultivaron hasta un 80 % de confluencia para su uso en experimentos de transfección de oligonucleótidos antisentido.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo de tejidos de 100 mm o de otro tamaño y se tratan de forma similar usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Hepatocitos de rata primarios:
Los hepatocitos de rata primarios se prepararon a partir de ratas Sprague-Dawley adquiridas de Charles River Labs (Wilmington, MA, Estados Unidos) y se cultivaron rutinariamente en DMEM, de alta concentración de glucosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero de bovino fetal al 10 % (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 100 unidades por ml de penicilina y 100 microgramos por ml de espectrosmicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las células se cultivaron hasta un 80 % de confluencia para su uso en experimentos de transfección de oligonucleótidos antisentido.
Tratamiento con compuestos antisentido:
Cuando las células alcanzaron un 65 - 75 % de confluencia, se trataron con oligonucleótidos. Para células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavaron una vez con 100 |jl de medio de suero reducido OPTI- MEM™-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y después se trataron con 130 jl de OPTI- MEM™-1 de medio que contenía 3,75 jg/ml de reactivo LIPOFECTIN™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y la concentración deseada de oligonucleótido. Las células se tratan y los datos se obtienen por triplicado. Despúes de 4-7 horas de tratamiento a 37 °C, el medio se reemplaza con medio reciente. Las células se recogieron 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido.
La concentración de oligonucleótido usado varía de línea celular a línea celular. Para determinar la concentración óptima de oligonucleótido para una línea celular particular, las células se trataron con un oligonucleótido de control positivo a una variedad de concentraciones. Para células humanas el oligonucleótido de control positivo se selecciona de bien ISIS 13920 (TCCGT-CATCGCTCCTCAGGG, SEC ID N°: 1) que está dirigido a H-ras humano, o bien ISIS 18078, (GT-GCGCGCGAGCCCGAAATC, SEC ID N°: 2) que está dirigido a quinasa Jun-N-terminal 2 (JNK2) humana. Ambos controles con 2'-O-metoxietil gapmers (2'-O-metoxietilos se muestran en negrita) con un esqueleto de fosforotioato. Para células de ratón o rata, el oliogonucleótido de control positivo es ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEC ID N°: 3, un 2'-O-metoxietil gapmer (2'-O-metoxietilo se muestra en negrita) con un esqueleto de fosforotioato que está dirigido a c-raf tanto de ratón como de rata. La concentración de oligonucleótido de control positivo que da como resultado un 80 % de inhibición de ARNm de c-H-ras (para ISIS 13920), JNK2 (para ISIS 18078) o c-raf (para ISIS 15770) se usa después como la concentración para seleccionar nuevos nucleótidos en experimentos subsiguientes para esa línea celular. Si no se logra una inhibición del 60 %, la concentración más baja de oligonucleótido de control positivo que da como resultado una inhibición del 60 % de ARNm de c-H-ras, JNK2 o c-raf se usa después como la concentración para seleccionar nuevos nucleótidos en experimentos subsiguientes para esa línea celular. Si no se logra el 60 % de inhibición, esa línea celular particular se considera inadecuada para los experimentos de transfección de oligonucleótidos. Las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que se usan en el presente documento son de 50 nM a 300 nM.
Ejemplo 10: Análisis de la inhibición con oligonucleótidos de la expresión de apolipoproteína C-III
La modulación antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III puede analizarse mediante una variedad
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante análisis de inmunotransferencia (Northern), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR en tiempo real (RT-PCR). Actualmente es preferente la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse sobreel ARN celular total o ARNm de poli(A)+. El procedimiento preferente de análisis de ARN de la presente invención es el uso del ARN celular total tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Los procedimientos de aislamiento son bien conocidos en la técnica. El análisis de inmunotransferencia (Northern) también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se realiza usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7600, 7700 ó 7900, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos, y se usa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los niveles proteicos de la apolipoproteína C-III pueden cuantificarse de una variedad de formas bien conocidas en la técncia, tales como inmunoprecipitación, análisis de inmunotransferencia (Western), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o selección celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a la apolipoproteína C-III pueden identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, tales como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI, Estados Unidos), o pueden prepararse usando procedimientos de generación de anticuerpos monoclonales y policlonales convencionales bien conocidos en la técnica.
Ejemplo 11: Diseño de ensayos fenotípicos y estudios in vivo para el uso de inhibidores de apolipoproteína C-III
Ensayos fenotípicos
Una vez se han identificado los inhibidores de apolipoproteína C-III usando los procedimientos divulgados en el presente documento, los compuestos se analizan adicionalmente en uno o varios ensayos fenotípicos, teniendo cada uno puntos finales medibles que predicen la eficacia en el tratamiento de un estado patológico o trastorno particular. Los ensayos fenotípicos, kits y reactivos para su uso son bien conocidos por los expertos en la técnica y se usan en el presente documento para analizar el papel y/o la asociación de apolipoproteína en estados de salud y de enfermedad. Los ensayos fenotípicos representativos que pueden adquirirse de uno cualquiera de entre varios proveedores comerciales incluyen los ensayos para determinar la viabilidad celular, la citotoxicidad, la proliferación o supervivencia celular (Molecular Probes, Eugene, OR, Estados Unidos; PerkinElmer, Boston, MA, Estados Unidos), ensayos basados en proteínas que incluyen ensayos enzimáticos (Panvera,-LLC, Madison, WI,Estados Unidos; BD Bio-sciences, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos; Oncogene Research Products, San Diego, CA, Estados Unidos), regulación celular, transducción de señales, inflamación, procesos oxidativos y apoptosis (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI, Estados Unidos), acumulación de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos), ensayos de angiogénesis, ensayos de formación de tubos, ensayos de citocinas y hormonas y ensayos de metabolismo (Chemicon International Inc., Temecula, CA, Estados Unidos; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Estados Unidos).
En un ejemplo no limitante, las células que se ha determinado que son apropiadas para un ensayo fenotípico particular (es decir, células MCF-7 seleccionadas para estudios de cáncer de mama; adipocitos para estudios de obesidad) se tratan con inhibidores de la apolipoproteína C-III identificados a partir de estudios in vitro y compuestos control a concentraciones óptimas que se determinan usando los procedimientos descritos anteriormente. Al final del periodo de tratamiento, las células tratadas y no tratadas se analizan usando uno o varios procedimientos específicos para el ensayo para determinar los resultados y puntos finales fenotípicos.
Los puntos finales fenotípicos incluyen cambios en la morfología celular en función del tiempo o de la dosis de tratamiento, así como cambios en niveles de componentes celulares tales como proteínas, lípidos, ácido nucleicos, hormonas, sacáridos o metales. Las mediciones del estado celular, que incluyen pH, estado del ciclo celular, captación o excreción de indicadores biológicos por la célula, son también puntos finales de interés.
El análisis del genotipo de la célula (medición de la expresión de uno o varios de los genes de la célula) después del tratamiento también se usa como indicador de la eficacia o potencia de los inhibidores de apolipoproteína C-III. Los genes caracterizadores o los genes sospechosos de estar asociados con un estado patológico, trastorno o fenotipo específico se miden tanto en células tratadas como en células no tratadas.
Estudios in vivo
Los sujetos individuales de los estudios in vivo descritos en el presente documento son animales vertebrados de sangre caliente que incluyen seres humanos.
El ensayo clínico se somete a controles rigurosos para asegurar que no se ponga en riesgo innecesariamente a los individuos y que éstos estén informados de su papel en el estudio. Para justificar los efectos psicológicos de los tratamientos que se van a recibir, a los voluntarios se les administró aleatoriamente placebo o inhibidor de la apolipoproteína C-III. Además, para evitar que los médicos estuvieran predispuestos con respecto a los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
tratamientos, no se les informó de si la medicación que van a administrar es un inhibidor de la apolipoproteína C-III o un placebo. Usando este enfoque de aleatoriedad, cada voluntario tiene la misma posibilidad de que se le administre el nuevo tratamiento o el placebo.
Los voluntarios reciben bien el inhibidor de apolipoproteína C-III o placebo durante un periodo de ocho semanas y se miden parámetros biólogicos asociados con el estado patológico o trastorno indicado al comienzo (mediciones de línea bases antes de cualquier tratamiento, al final (después del tratamiento final) y a intervalos regulares durante el periodo de estudio. Dichas mediciones incluyen los niveles de moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína C-III o los niveles de proteína apolipoproteína C-III en fluidos corporales, tejidos y órganos en comparación con los niveles de antes del tratamiento. Otras mediciones incluyen, pero no están limitadas a, índices del estado patológico o trastorno que hay que tratar, peso corporal, tensión arterial, valoraciones en suero de indicadores farmacológicos de enfermedad o toxicidad, asó como mediciones de ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción).
La información registrada de cada paciente incluye edad (años), sexo, altura (cm), historial familiar del estado patológico o trastorno (sí/no), valoración de motivación (alguna/moderada/grande) y número y tipo de regímenes de tratamiento previos para la enfermedad o el trastorno indicado.
Los voluntarios que toman parte en este estudio son adultos sanos (edad: 18 a 65 años) y participan en el estudio un número aproximadamente igual de varones que de mujeres. Los voluntarios con determinadas características se distribuyen equitativamente entre el tratamiento con placebo y el tratamiento con inhibidor de apolipoproteína C-III. En general, los voluntarios tratados con placebo no presentan una respuesta al tratamiento o ésta es pequeña, mientras que los voluntarios tratados con inhibidor de apolipoproteína C-III muestran tendencias positivas en el índice del estado patológico o trastorno al finalizar el estudio.
Ejemplo 12: Aislamiento de ARN
Aislamiento de ARNm de Poli(A)+
Se aisló ARNm de Poli(A)+ de acuerdo con Miura y col., (Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764). Otros procedimientos para aislar ARNm de poli(A)+ son rutinarios en la técnica. Brevemente, para células cultivadas en placas de 96 pocillos, el medio de cultivo se eliminó de las células y cada pocillo se lavó con 200 |jl de PBS frío. Se añadieron a cada pocillo 60 jl de tampón de lisis (Tris-HC l10 mM, pH 7,6, EdTA 1 mM, NaCl 0,5 M, NP-40 al 0,5 %, complejo vanadil-ribonucleósido 20 mM), la placa se agitó vigorosamente y después se incubó a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se transfirieron 55 jl de lisado a placas de 96 pocillos recubiertas con Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine, CA, Estados Unidos). Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 jl de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,3 M). Después del lavado final, la placa se transfirió a toallas de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado y después se secaron al aire durante cinco minutos. Se añadieron a cada pocillo 60 jl de tampón de elución (Tris-HCl 5 mM, pH 7,6), precalentados a 70 °C, la placa se incubó sobre una placa caliente a 90 °C y el eluato se transfirió después a una placa nueva de 96 pocillos.
Las células cultivadas en placas estándar de 100 mm o de otro tamaño pueden tratarse de forma similar usando volúmenes apropiados de todas las soluciones.
Aislamiento de ARN total
El ARN total se aisló usando un kit RNEASY 96™ y tampones adquiridos de Qiagen Inc. (Valencia, CA, Estados Unidos) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. Brevemente, para células cultivadas en placas de 96 pocillos, el medio de crecimiento se retiró de las células y cada pocillo se lavó con 200 jl de PBS frío. Se añadieron a cada pocillo 150 jl de tampón RLT y la placa se agitó vigorosamente durante 20 segundos. Después se añadieron a cada pocillo 150 jl de etanol al 70 % y los contenidos se mezclaron pipeteando tres veces hacia arriba y hacia abajo. Después se transfirieron las muestras a una placa RNEASY 96™ de 96 pocillos unida a un colector QIAVAC™ equipado con una bandeja de recogida de desechos y unido a una fuente de vacío. Se aplicó vacío durante 1 minuto. Se añadieron 500 jl de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se incubaron durante 15 minutos y se aplicó de nuevo vacío durante 1 minuto. Se añadieron 500 jl adicionales de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplicó vacío durante 2 minutos. Después se añadió 1 ml de tapón RPE a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplicó vacío durante un periodo de 90 segundos. Después se repitio el lavado con tampón RPE y se aplicó vacío durante 3 minutos adicionales. Después se retiró la placa del colector QIAVAC™ y se transfirió sobre toallas de papel para que se secara. Después se volvió a unir la placa al colector QIAVAC™ equipado con una gradilla de tubos de recolección que contenía tubos de recolección de 1,2 ml. Después se eluyó el ARN pipeteando 140 jl de ARNasa exenta de agua a cada pocillo, incubando durante 1 minuto y, después, aplicando vacío durante 3 minutos.
Las etapas repetitivas de pipeteo y elución puedn automatizarse usando un aparato QIAGEN® Bio-Robot™
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
9604 (Qiagen, Inc., Valencia, CA, Estados Unidos). Esencialmente, después de lisar las células en la placa de cultivo, la placa se transfiere a una cubierta robótica en la que se llevaron a cabo las etapas de pipeteo, tratamiento de ADNasa y de elución.
Ejemplo 13: Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III
La cuantificación de los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III se realizó por PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7600, 7700 ó 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Éste es un sistema de detección por fluorescencia, de tubo cerrado, no basado en gel, que permite la cuantificación de alto rendimiento de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Al contrario que la PCR estándar, en la que los productos de amplificación se cuantifican después de completar la PCR, los productos en PCR cuantitativa en tiempo real se cuantifican según se van acumulando. Esto se realiza incluyen en la reacción PCR una sonda oligonucleótido que se alinea específicamente entre los cebadores de PCR directos e inversos y contiene dos colorantes fluorescentes. Un colorante informador (por ejemplo, FAM o JOE, obtenidos bien de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos, bien de Operon Technologies Inc., Alameda, CA, Estados Unidos, o bien de Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA, Estados Unidos) se une al extremo 5' de la sonda y el colorante inactivador (por ejemplo, TAMRA, obtenido bien de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos, bien de Operon Technologies Inc., Alameda, CA, Estados Unidos, o bien de Integrated dNa Technologies Inc., Coralville, IA, Estados Unidos) se une al extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y los colorantes están intactos, la emisión del colorante informador se inactiva por la proximidad del colorante inactivador 3'. Durante la amplificación, el alineamiento de la sonda con la secuencia diana crea un sustrato que puede escindirse por la actividad de 5'-exonucleasa de la Taq polimerasa. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación por PCR, la escisión de la sonda por Taq polimerasa libera el colorante informador del resto de la sonda (y, en consecuencia, del resto inactivador) y se genera la señal fluorescente específica de secuencia. Con cada ciclo, las moléculas informadoras adicionales se escinden de sus sondas respectivas y se realiza un seguimiento de la intensidad de la fluorescencia a intervalos regulares mediante un láser óptico integrado en un sistema de detección de secuencia ABI PRISM™. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones de señal de ARNm de las muestras de control no tratadas genera una curva estándar que se usa para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido de las muestras de ensayo.
Antes del análisis por PCR cuantitativa, los conjuntos cebador-sonda específicos del gen diana que se analiza se evalúan para determinar su capacidad de ser "multiplexados" con una reacción de amplificación GAPDH. En la multiplexación, tanto el gen diana como el gen patrón interno GAPDH se amplifican simultáneamente en una muestra única. En este análisis, el ARNm aislado de células no tratadas se diluye serialmente. Cada dilución se amplifica en presencia de conjuntos cebador-sonda específicos de GAPDh sólo, del gen diana sólo (“monoplexación”) o de ambos (multiplexación). Siguiendo la amplificación por PCR, se generan curvas estándar de señal de GAPDH y ARNm diana como función de la dilución de las muestras monoplexadas y multiplexadas. Si tanto la pendiente y el coeficiente de correlación de las señales de GAPDH y diana generadas de las muestras multiplexadas están dentro del 10 % de sus valores correspondientes generados de muestras monoplexadas, el conjunto cebador- sonda específico para esa diana se considera multiplexable. También se conocen en la técnica otros procedimientos de PCR.
Los reactivos de PCR se obtuvieron de Invitrogen Corporation, (Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las reacciones de RT-PCR se realizaron añadiendo 20 |jl de cóctel de PCR (2,5 x tampón PCR menos MgCh, MgCh 6,6 mM, dATP, dCTP, dCTP y dGTP, cada uno 375 jM, cebador directo y cebador inverso, cada uno 375 nM, sonda 125 nM, 4 unidades de inhibidor de ARNsa, 1,25 unidades de PLAT-INUM® Taq, 5 unidades de transcriptasa inversa MuLV y 2,5 x colorante ROX) a placas de 96 pocillos que contenían 30 jl de solución de ARN total (20-200 ng). La reacción a tiempo real se llevó a cabo por incubación durante 30 minutos a 48 °C. Siguiendo a 10 minutos de incubación a 95 °C para activar el PLATINUM® Taq, se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas: 95 °C durante 15 segundos (desnaturalización) seguidos de 60 °C durante 1,5 minutos (alineamiento/extensión).
Las cantidades de diana génica obtenidas por RT-PCR en tiempo real se normalizan usando bien el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o bien cuantificando el ARN total usando el reactivo RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, Estados Unidos). La expresión de GAPDH se cuantifica por RT-PCR en tiempo real, operando simultáneamente con la diana, multiplexación, o por separado . El ARN total se cuantifica usando reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, Estados Unidos). Los procedimientos de cuantificación de ARN usando reactivo RiboGreen™ se enseñan en Jones, L.J. y col., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374).
En este ensayo,se pipetean 170 jl de reactivo de trabajo RiboGreen™ (reactivo RiboGreen™ diluido 1:350 en Tris-HCl 10 mM, eDtA 1 mM, pH 7,5) a una placa de 96 pocillos que contiene 30 jl de ARN molecular purificado. La placa se lee en un lector CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.
Las sondas y los cebadores de apolipoproteína C-III humana se diseñaron para que se hibridaran con una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
secuencia de apolipoproteína C-III humana usando información de secuencias publicada (nucleótidos 6238608 a 6242565 de la secuencia de número de acceso del GenBank NT_035088.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 4). Para la apolipoproteína C-III humana los cebadores de PCR fueron: cebador directo: TCAGCTTCATGCAGGGTTACAT (SEC ID N°: 5) cebador inverso: ACGCTGCTCAGTGCATCCT (SEC ID N°: 6) y la sonda PCR fue: FAM-AAGCACGCCACCAAGACCGCC-TAMRA (SEC ID N°: 7) en la que FAM es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador. Para GAPDH humano los cebadores PCR fueron: cebador directo: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEC ID N°: 8) cebador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTC GGGTCTCGCTCCT- GGAAGAT(SEC ID N°: 9) y la sonda PCR fue: 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3' (SEC ID N°: 10) en la que JOE es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador.
Las sondas y los cebadores de apolipoproteína C-III de ratón se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteína C-III de ratón usando información de secuencias publicada (número de acceso del GenBank L04150.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 11). Para la apolipoproteína C-III de ratón los cebadores de pCr fueron: cebador directo: TGCAGGGCTACATGGAACAA (SEC ID N°: 12) cebador inverso: CGGACTCCTGCACGCTACTT (SEC ID N°: 13) y la sonda PCR fue: FAM-CTCCAA-GACGGTCCAGGATGCGC- TAMRA (SEC ID N°: 14) en la que FAM es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador. Para GAPDH de ratón los cebadores PCR fueron:
cebador directo: GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEC ID N°: 15) cebador inverso: GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT(SEC ID N°: 16) y la
sonda PCR fue: 5' JOE-AAGGCCGA-GAATGGGAAGCTTGTCATC- TAMRA 3' (SEC ID N°: 17) en la que JOE es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador.
Ejemplo 14: Análisis de inmunotransferencia (Northern) de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III
Dieciocho horas después del tratamiento antisentido, las monocapas celulares se lavaron dos veces con PBS frío y se lisaron en 1 ml de reactivo RNAZOL™ (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX, Estados Unidos). El ARN total se preparó siguiendo protocolos recomendados por el fabricante. Se fraccionaron veinte microgramos de ARN total por electroforesis a través de geles de agorosa al 1,2 % que contenían formaldehído al 1,1 % usando un sistema tampón MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH, Estados Unidos). El ARN se transfirió del gel a membranas de nailon HYBOND™-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Estados Unidos) mediante transferencia capilar durante la noche usando un sistema tampón de transferencia Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX, Estados Unidos). La transferencia de ARN se confirmó mediante visualización UV. Las membranas se fijaron mediante reticulación UV usando un reticulador UV STRATALINKER™ 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA, Estados Unidos) y después se analizaron usando solución de hibridación QUICKHYB™ (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos) usando las recomendaciones del fabricante para condiciones restrictivas.
Para detectar la apolipoproteína C-III humana se preparó una sonda específica de apolipoproteína PCR humana usando el cebador directo TCAGCTTCATGCaGgGtTACAT (SEC iD N°: 5) y el cebador inverso ACGCTGCTCAGTGCATCCT (SEC ID N°: 6). Para normalizar por variaciones en la eficacia en la carga y la transferencia se retiraron membranas y se analizaron para evaluar el ARN de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humano (Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos).
Para detectar la apolipoproteína C-III de ratón se preparó una sonda específica de apolipoproteína PCR de ratón usando el cebador directo TGCAGGGCTACATGGAACAA (SEC ID N°: 12) y el cebador inverso CGGACTCCTGCACGCTACTT (SEC ID N°: 13). Para normalizar por variaciones en la eficacia en la carga y la transferencia se retiraron membranas y se analizaron para evaluar el ARN de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de ratón (Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos).
Las membranas hibridadas se visualizaron y cuantificaron usando un aparato PHOSPHORIMAGER™ y el programa informático IM-AGEQUANT™ V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, Estados Unidos). Los datos se normalizaron a niveles de GAPDH en controles no tratados.
Ejemplo 15: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi
Se diseñó una serie de compuestos antisentido para dirigirlos a regiones diferentes de ARN de apolipoproteína C-III humana, usando secuencias publicadas (nucleótidos 6238608 a 6242565 de número de acceso del GenBank NT_035088.1, que representa una secuencia genómica que se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 4, y el número de acceso del GenBank NM_000040.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 18). Los compuestos se muestran en la tabla 1. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 1 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2'- desoxi-nucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los flancos están compuestos por 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2'-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III humana mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de los tres experimentos en los que se trataron células HepG2 con los oligonucleótidos antisentido. El control positivo para cada dato puntual se identifica en la tabla por el número de secuencia ID. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 1 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.° SECUENCIA CONTROL SEC ID N.°
- 167824
- 5'UTR 4 414 ctggagcagctgcctctagg 79 19 1
- 167835
- Codificante 4 1292 ccctgcatgaagctgagaag 60 20 1
- 167837
- Codificante 18 141 gtgcttcatgtaaccctgca 88 21 1
- 167846
- Codificante 4 1369 tggcctgctgggccacctgg 66 22 1
- 167848
- Codificante 4 3278 tgctccagtagtctttcagg 81 23 1
- 167851
- Codificante 4 3326 tgacctcagggtccaaatcc 41 24 1
- 304739
- 5'UTR 4 401 ctctagggatgaactgagca 62 25 1
- 304740
- 5'UTR 4 408 cagctgcctctagggatgaa 44 26 1
- 304741
- 5'UTR 18 17 ttcctggagcagctgcctct 57 27 1
- 304742
- 5'UTR 18 24 acctctgttcctggagcagc 78 28 1
- 304743
- Codón de inicio 18 29 atggcacctctgttcctgga 78 29 1
- 304744
- Codón de inicio 4 1065 gggctgcatcggcacctctgt 73 30 1
- 304745
- Codificante 4 1086 ggcaacaacaaggagtaccc 90 31 1
- 304746
- Codificante 4 1090 ggagggcaacaacaaggagt 80 32 1
- 304747
- Codificante 18 87 agctcgggcagaggccagga 49 33 1
- 304748
- Codificante 18 92 tctgaagctcgggcagaggc 72 34 1
- 304749
- Codificante 18 97 cggcctctgaagctcgggca 11 35 1
- 304750
- Codificante 4 1267 catcctcggcctctgaagct 49 36 1
- 304751
- Codificante 4 1273 gggaggcatcctcggcctct 65 37 1
- 304752
- Codificante 4 1278 gagaagggaggcatcctcgg 82 38 1
- 304753
- Codificante 4 1281 gctqagaagggagqcatcct 75 39 1
- 304754
- Codificante 4 1289 tgcatgaagctgagaaggga 74 40 1
- 304755
- Codificante 18 143 gcgtgcttcatgtaaccctg 95 41 1
- 304756
- Codificante 4 1313 ttggtggcgtgcttcatgta 92 42 1
- 304757
- Codificante 4 1328 gcatccttggcggtcttggt 98 43 1
- 304758
- Codificante 4 1334 ctcagtgcatccttggcggt 97 44 1
- 304759
- Codificante 4 1336 tgctcagtcatccttggcg 93 45 1
- 304760
- Codificante 4 1347 ctcctgcacgctgctcagtg 65 46 1
- 304761
- Codificante 4 1349 gactcctgcacgctgctcag 77 47 1
- 301762
- Codificante 4 1358 gccacctgggactcctgcac 89 48 1
- 304763
- Codificante 18 210 gcccctggcctgctgggcca 71 49 1
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.° SECUENCIA CONTROL SEC ID N.°
- 304764
- Codificante 18 211 agcccctggcctgctgggcc 62 50 1
- 304765
- Codificante 4 3253 gaagccatcggtcacccagc 71 51 1
- 304766
- Codificante 4 3255 ctgaagccatcggtcaccca 85 52 1
- 304767
- Codificante 4 3265 tttcagggaactgaagccat 73 53 1
- 304768
- Codificante 4 3273 cagtagtctttcagggaact 40 54 1
- 304769
- Codificante 4 3283 aacggtgctccagtagtctt 66 55 1
- 304770
- Codificante 4 3287 ccttaacggtgctccagtag 88 56 1
- 304771
- Codificante 4 3295 gaacttgtccttaacggtgc 59 57 1
- 304772
- Codificante 4 3301 ctcagagaacttgtccttaa 88 58 1
- 304773
- Codificante 4 3305 agaactcagagaacttgtcc 75 59 1
- 304774
- Codificante 4 3310 atcccagaactcagagaact 0 60 1
- 304775
- Codificante 4 3320 cagggtccaaatcccagaac 70 61 1
- 304776
- Codificante 4 3332 ttggtctgacctcagggtcc 90 62 1
- 304777
- Codificante 4 3333 gttggtctgacctcagggtc 84 63 1
- 304778
- Codificante 4 3339 gctgaagttggtctgacctc 81 64 1
- 304779
- Codificante 4 3347 cagccacggctgaagttggt 75 65 1
- 304780
- Codón de detención 4 3351 caggcagccacggctgaagt 83 66 1
- 304781
- Codón de detención 4 3361 attgaggtctcaggcagcca 79 67 1
- 304782
- 3'UTR 4 3385 tggataggcaggtggacttg 64 68 1
- 304783
- 3'UTR 18 369 ctcgcaggatggataggcag 76 69 1
- 304784
- 3'UTR 18 374 aggagctcgcaggatggata 58 70 1
- 304785
- 3'UTR 18 380 gacccaaggagctcgcagga 73 71 1
- 304786
- 3'UTR 18 385 tgcaggacccaaggagctcg 92 72 1
- 304787
- 3'UTR 4 3417 tggagattgcaggacccaag 88 73 1
- 304788
- 3'UTR 4 3422 agccctggagattgcaggac 69 74 1
- 304789
- 3'UTR 4 3425 ggcagccctggagattgcag 76 75 1
- 304790
- 3'UTR 4 3445 ccttttaagcaacctacagg 65 76 1
- 304791
- 3'UTR 4 3450 ctgtcccttttaagcaacct 53 77 1
- 304792
- 3'UTR 4 3456 agaatactgtcccttttaag 72 78 1
- 304793
- 3'UTR 4 3461 cactgagaatactgtccctt 67 79 1
- 304794
- 3'UTR 4 3469 taggagagcactgagaatac 59 80 1
- 304795
- 3'UTR 4 3472 gggtaggagagcactgagaa 74 81 1
- 304796
- 3'UTR 4 3509 aggccagcatgcctggaggg 63 82 1
- 304797
- 3'UTR 4 3514 ttgggaggccagcatgcctg 55 83 1
- 304798
- 3'UTR 4 3521 agctttattgggaggccagc 90 84 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.° SECUENCIA CONTROL SEC ID N.°
- 304799
- 3'UTR 4 3526 tgtccagctttattgggagg 85 85 1
- 304800
- 3'UTR 4 3528 cttgtccagctttattggga 94 86 1
- 304801
- 3'UTR 4 3533 agcttcttgtccagctttat 74 87 1
- 304802
- 3'UTR 4 3539 catagcagcttcttgtccag 73 88 1
- 304803
- Unión exón:intrón 4 416 acctggagcagctgcctcta 87 89 1
- 304804
- Unión exón:intrón 4 424 agggcattacctggagcagc 68 90 1
- 304805
- Unión exón:intrón 4 1053 acctctgttcctgcaaggaa 74 91 1
- 304806
- Unión exón:intrón 4 1121 aagtgcttacgggcagaggc 78 92 1
- 304807
- Unión exón:intrón 4 1380 gcgggtgtacctggcctgct 52 93 1
- 304808
- Intrón 4 2337 aaccctgttgtgaactgcac 59 94 1
- 304809
- Intrón 4 2405 agtgagcaataccgcctgag 80 95 1
- 304810
- Intrón 4 2542 cgggcttgaattaggtcagg 56 96 1
Tal como se muestra en la tabla 1, las secuencias SEC ID N° 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 y 96 mostraron al menos un 45 % de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-III en este ensayo y son, por lo tanto, preferentes. Son más preferentes las secuencias SEC ID N° 75, 86 y 85. Las regiones diana a las que estas secuencias preferentes son complementarias se denominan en el presente documento “segmentos diana preferentes” y son preferentes, por lo tanto, como diana para los compuestos de la presente divulgación. Los segmentos diana preferentes se muestran en la tabla 3. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferentes que se muestran en la tabla 1. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en un ácido nucleico diana particular al que se une el oligonucleótido. En la tabla 3 se muestran también las especies en las que se han encuentrado cada uno de los segmentos diana preferentes.
Ejemplo 16: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOe y un hueco desoxi
Se desiñó una segunda serie de compuestos antisentido para dirigirla a diferentes regiones del ARN de apolipoproteína C-III de ratón usando secuencias publicadas (número de acceso del GenBank L04150.1, que se incorpora al presente documento como secuencia SEC ID N°: 11). Los compuestos se muestran en la tabla 2. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en el ácido nucleico diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 2 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2'-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III de ratón mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de los tres experimentos en los que se trataron células hepatocíticas principales con los oligonucleótidos antisentido. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 2 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.°
- 167858
- 5'UTR 11 1 tagggataaaactgagcagg 47 97
- 167859
- 5'UTR 11 21 ctggagtagctagctgcttc 30 98
- 167860
- Codón de inicio 11 41 gctgcatggcacctacgtac 80 99
- 167861
- Codificante 11 62 ccacagtgaggagcgtccgg 86 100
- 167862
- Codificante 11 88 ggcagatgccaggagagcc a 55 101
- 167863
- Codificante 11 104 ctacctcttcagctcgggca 56 102
- 167864
- Codificante 11 121 cagcagcaaggatccctcta 83 103
- 167865
- Codificante 11 131 gcacagagcccagcagcaa g 49 104
- 167867
- Codificante 11 215 ccctggccaccgcagctata 67 105
- 167868
- Codificante 11 239 atctgaagtgattgtccatc 11 106
- 167869
- Codificante 11 254 agtagcctttcaggaatctg 57 107
- 167870
- Codificante 11 274 cttgtcagtaaacttgctcc 89 108
- 167871
- Codificante 11 286 gaagccggtgaacttgtcag 55 109
- 167872
- Codificante 11 294 gaatcccagaagccggtgaa 29 110
- 167873
- Codificante 11 299 ggttagaatcccagaagccg 55 111
- 167874
- Codificante 11 319 tggagttggttggtcctcag 79 112
- 167875
- Codón de detención 11 334 tcacgactcaatagctggag 77 113
- 167877
- 3'UTR 11 421 cccttaaagcaaccttcagg 71 114
- 167878
- 3'UTR 11 441 agacatgagaacatactttc 81 115
- 167879
- 3'UTR 11 471 catgtttaggtgagatctag 87 116
- 167880
- 3'UTR 11 496 tcttatccagctttattagg 98 117
Tal como se muestra en la tabla 2, las SEC ID N° 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 114, 115, 116 y 117 mostraron al menos un 45 % de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-III de ratón en este experimento y son, por lo tanto, preferentes. Son más preferentes las secuencias SEC ID N° 117, 116 y 100. Las regiones diana a las que estas secuencias preferentes son complementarias se denominan en el presente documento “segmentos diana preferentes” y son preferentes, por lo tanto, como diana para los compuestos de la presente divulgación. Estos segmentos diana preferentes se muestran en la tabla 3. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferentes que se muestran en la tabla 2. Se muestra que estas secuencias contienen timina (T) pero un experto en la técnica apreciará que la timina (T) se reemplaza generalmente por uracilo (U) en secuencias de ARN. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en un ácido nucleico diana particular el que se une el oligonucleótido. En la tabla 3 se muestran también las especies en las que se han encontrado cada uno de los segmentos diana preferentes.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 3 - Secuencia y posición de segmentos diana preferentes identificados en apolipoproteína C-III.
- SITIO ID
- SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA ASOCIADO INVERSO DE SEC ID ACTIVO EN SEC ID N.°
- 82975
- 4 414 cctagaggcagctgctccag 19 H. sapiens 118
- 82980
- 4 1292 cttctcagcttcatgcaggg 20 H. sapiens 119
- 82981
- 18 141 tgcagggttacatgaagcac 21 H. sapiens 120
- 82985
- 4 1369 ccaggtggcccagcaggcca 22 H. sapiens 121
- 82987
- 4 3278 cctgaaagactactggagca 23 H. sapiens 122
- 220510
- 4 401 tgctcagttcatccctagag 25 H. sapiens 123
- 220512
- 18 17 agaggcagctgctccaggaa 27 H. sapiens 124
- 220513
- 18 24 gctgctccaggaacagaggt 28 H. sapiens 125
- 220514
- 18 29 tccaggaacagaggtgccat 29 H. sapiens 126
- 220515
- 4 1065 acagaggtgccatgcagccc 30 H. sapiens 127
- 220516
- 4 1086 gggtactccttgttgttgcc 31 H. sapiens 128
- 220517
- 4 1090 actccttgttgttgccctcc 32 H. sapiens 129
- 220518
- 18 87 tcctggcctctgcccgagct 33 H. sapiens 130
- 220519
- 18 92 gcctctgcccgagcttcaga 34 H. sapiens 131
- 220521
- 4 1267 agcttcagaggccgaggatg 36 H. sapiens 132
- 220522
- 4 1273 agaggccgaggatgcctccc 37 H. sapiens 133
- 220523
- 4 1278 ccgaggatgcctcccttctc 38 H. sapiens 134
- 220524
- 4 1281 aggatgcctcccttctcagc 39 H. sapiens 135
- 220525
- 4 1289 tcccttctcagcttcatgca 40 H. sapiens 136
- 220526
- 18 143 cagggttacatgaagcacgc 41 H. sapiens 137
- 220527
- 4 1313 tacatgaagcacgccaccaa 42 H. sapiens 138
- 220528
- 4 1328 accaagaccgccaaggatgc 43 H. sapiens 139
- 220529
- 4 1334 accgccaaggatgcactgag 44 H. sapiens 140
- 220530
- 4 1336 cgccaaggatgcactgagca 45 H. sapiens 141
- 220531
- 4 1347 cactgagcagcgtgcaggag 46 H. sapiens 142
- 220532
- 4 1349 ctgagcagcgtgcaggagtc 47 H. sapiens 143
- 220533
- 4 1358 gtgcaggagtcccaggtggc 48 H. sapiens 144
- 220534
- 18 210 tggcccagcaggccaggggc 49 H. sapiens 145
- 220535
- 18 211 ggcccagcaggccaggggct 50 H. sapiens 146
- 220536
- 4 3253 gctgggtgaccgatggcttc 51 H. sapiens 147
- 220537
- 4 3255 tgggtgaccgatggcttcag 52 H. sapiens 148
- 220538
- 4 3265 atggcttcagttccctgaaa 53 H. sapiens 149
- 220540
- 4 3283 aagactactggagcaccgtt 55 H. sapiens 150
- 220541
- 4 3287 ctactggagcaccgttaagg 56 H. sapiens 151
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
SITIO ID
SECUENCIA
DIANA
SITIO DIANA
SECUENCIA
ASOCIADO INVERSO DE SEC ID
ACTIVO EN
220542
220543
220544
220546
220547
220548
220549
220550
220551
220552
220553
220554
220555
220556
220557
220558
220559
220560
220561
220562
220563
220564
220565
220566
220567
220568
220569
220570
220571
220572
220573
220574
220575
220576
220577
220578
SEC ID N
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
18
18
18
18
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
3295
3301
3305
3320
3332
3333 3339 3347 3351 3361 3385 369 374 380 385 3417 3422 3425 3445 3450 3456 3461 3469 3472 3509 3514 3521 3526 3528 3533 3539 416 424 1053 1121 1380
gcaccgttaaggacaagttc
ttaaggacaagttctctgag
ggacaagttctctgagttct
gttctgggatttggaccctg
ggaccctgaggtcagaccaa
gaccctgaggtcagaccaac
gaggtcagaccaacttcagc
accaacttcagccgtggctg
acttcagccgtggctgcctg
tggctgcctgagacctcaat
caagtccacctgcctatcca
ctgcctatccatcctgcgag
tatccatcctgcgagctcct
tcctgcgagctccttgggtc
cgagctccttgggtcctgca
cttgggtcctgcaatctcca
gtcctgcaatctccagggct
ctgcaatctccagggctgcc
cctgtaggttgcttaaaagg
aggttgcttaaaagggacag
cttaaaagggacagtattct
aagggacagtattctcagtg
gtattctcagtgctctccta
ttctcagtgctetectaccc
ccctccaggcatgctggcct
caqqcatgctggcctcccaa
gctggcctcccaataaagct
cctcccaataaagctggaca
tcccaataaagctggacaag
ataaagctggacaagaagct
ctggacaagaagctgctatg
tagaggcagctgctccaggt
gctgctccaggtaatgccct
ttccttgcaggaacagaggt
gcctctgcccgtaagcactt
agcaggccaggtacacccgc
57
58
59 61 62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80 81 82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens H. sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- SITIO ID
- SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA ASOCIADO INVERSO DE SEC ID ACTIVO EN SEC ID N.°
- 220579
- 4 2337 gtgcagttcacaacagggtt 94 H. sapiens 188
- 220580
- 4 2405 ctcaggcggtattqctcact 95 H. sapiens 189
- 220581
- 4 2542 cctgacctaattcaagcccg 96 H. sapiens 190
- 82997
- 11 1 cctgctcagttttatcccta 97 M. musculus 191
- 82999
- 11 41 gtacgtaggtgccatgcagc 99 M. musculus 192
- 83000
- 11 62 ccggacgctcctcactgtgg 100 M. musculus 193
- 83001
- 11 88 tggctctcctggcatctgcc 101 M. musculus 194
- 83002
- 11 104 tgcccgagctgaagaggtag 102 M. musculus 195
- 83003
- 11 121 tagagggatccttgctgctg 103 M. musculus 196
- 83004
- 11 131 cttgctgctgggctctgtgc 104 M. musculus 197
- 83006
- 11 215 tatagctgcggtggccaggg 105 M. musculus 198
- 83008
- 11 254 cagattcctgaaaggctact 107 M. musculus 199
- 83009
- 11 274 ggagcaagtttactgacaag 108 M. musculus 200
- 83010
- 11 286 ctgacaagttcaccggcttc 109 M. musculus 201
- 83012
- 11 299 cggcttctgggattctaacc 111 M. musculus 202
- 83013
- 11 319 ctgaggaccaaccaactcca 112 M. musculus 203
- 83014
- 11 334 ctccagctattgagtcgtga 113 M. musculus 204
- 83016
- 11 421 cctgaaggttgctttaaggg 114 M. musculus 205
- 83017
- 11 441 gaaagtatgttctcatgtct 115 M. musculus 206
- 83018
- 11 471 ctagatctcacctaaacatg 116 M. musculus 207
- 83019
- 11 496 cctaataaagctggataaga 117 M. musculus 208
Debido a que se ha encontrado por experimentación que estos “segmentos diana preferentes” están abiertos a, y accesibles a, hibridación con los compuestos antisentido de la presente divulgación, un experto en la técncia reconocerá o será capaz de determinar, usando nada más que experimentación de rutina, otras realizaciones que abarcan otros compuestos que se hibridan específicamente con estos segmentos diana preferentes y, en consecuencia, inhiben la expresión de la apolipoproteína C-III.
De acuerdo con la presente divulgación, los compuestos antisentido incluyen compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), empalmadores alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos cortos que se hibridan con al menos una porción del ácido nucleico diana.
Ejemplo 17: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi. Compuestos antisentido adicionales
Se diseñó una serie adicional de compuestos antisentido para dirigirlos a regiones diferentes de ARN de apolipoproteína C-III humana, usando secuencias publicadas (nucleótidos 6238608 a 6242565 de número de acceso del GenBank NT_035088.1, que representa una secuencia genómica que se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 4, y el número de acceso del GenBank NM_000040.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 18). Los compuestos se muestran en la tabla 4. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 4 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2'- desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2'-MOE) nucleótidos. Las
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III mediantePCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedios de tres experimentos en los que se trataron células HepG2 con los oligonucleótidos antisentido. Si están presentes, "N.D." indica "sin datos".
Tabla 4 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi _____________________________
- ISIS N°
- SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.°
- 167826
- 4 1063 gctgcatggcacctctgttc 0 209
- 167828
- 4 1110 ggcagaggccaggagcgcca 0 210
- 167830
- 18 91 ctgaagctcgggcagaggcc 9 211
- 167832
- 18 101 tcctcggcctctgaagctcg 0 212
- 167840
- 4 1315 tcttggtggcgtgcttcatg 0 213
- 167842
- 4 1335 gctcagtgcatccttggcgg 38 214
- 167844
- 4 1345 cctgcacgctgctcagtgca 28 215
- 167847
- 4 3256 actgaagccatcggtcaccc 0 216
- 167850
- 4 3306 cagaactcagagaacttgtc 0 217
- 167852
- 4 3336 gaagttggtctgacctcagg 0 218
- 167853
- 4 3420 ccctggagattgcaggaccc 0 219
- 167854
- 4 3426 gggcagccctggagattgca 22 220
- 167855
- 4 3446 cccttttaagcaacctacag 27 221
Ejemplo 18: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Estudio de respuesta a la dosis en células HepG2
Un subconjunto de los oligonucleótidos antisentido de los ejemplos 15 y 17 se analizó adicionalmente en un estudio de respuesta a la dosis. Las dosis de tratamiento de ISIS 167842 (SEC ID N°: 214), ISIS 167844 (SEC ID N°: 215), ISIS 167846 (SEC ID N°: 22), ISIS 167837 (SEC ID N°: 21), ISIS 304789 (SEC ID N°: 75), ISIS 304799 (SEC ID N°: 85) e ISIS 304800 (SEC ID N°: 86) fueron 50, 150 y 300 nM. Los compuestos se analizaron para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III en células HepG2 mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de dos experimentos y se muestran en la tabla 5.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 5 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi
- Dosis de oligonucleótidos
- ISIS N°
- SEC ID N.° 50 nm 150 nM 300 nM
- Porcentaje de inhibición
- 167842
- 214 88 77 92
- 167844
- 215 86 86 84
- 167846
- 22 79 80 79
- 167837
- 21 83 86 84
- 304789
- 75 81 91 92
- 304799
- 85 82 93 88
- 304800
- 86 80 86 91
Estos datos demuestran que la expresión de apolipoproteína C-III está inhibida de un modo dependiente de la dosis después del tratamiento de células con compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III. Estos compuestos se analizaron adicionalmente en células Hep3B para determinar su capacidad para reducir los niveles de ARNm en células Hep3B y se determinó que ISIS 167842 y 167837 inhibieron la expresión de apolipoproteína C-III de un modo dependiente de la dosis en esta línea celular también.
Ejemplo 19: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi. Estudio de respuesta a la dosis en hepatocitos de ratón primarios
Un subconjunto de los oligonucleótidos antisentido del ejemplo 16 se analizó adicionalmente en un estudio de respuesta a la dosis. Las dosis de tratamiento con ISIS 167861 (SEC ID N°: 100), ISIS 167870 (SEC ID N°: 108), ISIS 167879 (SEC ID N°: 116) e ISIS 167880 (SEC ID N°: 117) fueron 40, 120 y 240 nM. Los compuestos se analizaron para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III en células de hepatocitos primarios mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de dos experimentos y se muestran en la tabla 6.
Tabla 6 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi - estudio de respuesta a la dosis
- Dosis de oligonucleótidos
- ISIS N°
- SEC ID N.° 40 nM 120 nM 240 nM
- Porcentaje de inhibición
- 167861
- 100 48 49 61
- 167870
- 108 16 16 46
- 167879
- 116 25 54 81
- 167880
- 117 76 81 93
Estos datos demuestran que la expresión de aplipoproteína C-III de ratón puede inhibirse de un modo dependiente de la dosis mediante tratamiento con compuestos antisentido.
Ejemplo 20: Análisis de inmunotransferencia (Northern) de niveles proteicos de lipoproteína C-III
Los análisis de inmunotransferencia (Western) se realizaron usando procedimientos estándar. Las células se recogieron 16-20 h después del tratamiento con oligonucleótido y se lavaron una vez con PBS, suspendido en tampón Laemmli (100 pl/pocillo), se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel SDS-PAGE al 16 %. El gel se somete a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
150 V durante 1,5 horas y se transfiere a membranas para el análisis de inmunotransferencia (Western). Se usa un anticuerpo primario apropiado dirigido a la apolipoproteína C-III, con un anticuerpo secundario radioetiquetado o etiquetado fluorescentemente dirigido contra las especies de anticuerpo primario. Las bandas se visualizaron usando un instrumento PHOSPHORIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA, Estados Unidos).
Ejemplo 21: Efectos de inhibición antisentido de apolipoproteína C-III (ISIS 167880) en niveles de colesterol y triglicéridos en suero
Se usaron ratones C57BL/6, una cepa de la que se ha informado que es susceptible a la formación inducida por hiperlipidemia de placas ateroescleróticas, en los estudios siguientes para evaluar oligonucleótidos antisentido de apolipoproteína C-III como agentes potenciales para reducir los niveles de colesterol y triglicéridos.
Se evaluaron ratones C57BL/6 machos (n=8) que recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasa) en el transcurso de 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117) sobre los niveles de colesterol y triglicéridos en suero. Los animales control recibieron tratamiento salino. Se dosificó intraperitonealmente a los ratones cada tres días (dos veces a la semana), después de ayunar durante la noche, 50 mg/kg de ISIS 167880 o solución salina durante seis semanas.
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta de roedor normal y después se dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina (control), 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117) o 50 mg/kg de ISIS 167879 (SEC ID N°: 116) durante dos semanas.
A la conclusión del estudio, cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles en suero de colesterol y triglicéridos y se compararon con el control salino. Las mediciones de los niveles de colesterol y triglicéridos en suero se obtuvieron mediante un análisis clínico rutinario.
Los ratones alimentados con dieta rica en grasas con ISIS 167880 mostraron una reducción tanto en colesterol (196 mg/dl para animales control y 137 mg/dl para ISIS 167880) como en triglicéridos (151 mg/dl para animales control y 58 mg/dl para ISIS 167880) en suero al finalizar el estudio.
No se observó ningún efecto en los niveles de colesterol en suero para ratones magros tratados con ISIS 167880 (91 mg/dl para animales control y 91 mg/dl para ISIS 167880), no obstante, los triglicéridos se redujeron (91 mg/dl para animales control y 59 mg/dl para ISIS 167880) al finalizar el estudio.
Los ratones magros tratados con ISIS 167879 mostraron un aumento en el colesterol (91 mg/dl para animales control y 116 mg/dl para ISIS 167879) pero una reducción de triglicéridos (91 mg/dl para animales control y 65 mg/dl para ISIS 167879) en suero al finalizar el estudio.
Estos resultados indican que en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, ISIS 167880 reduce el colesterol y los triglicéridos a niveles que son comparables a miembros de la misma camada magros mientras que no tiene efectos perjudiciales sobre los animales magros. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
Ejemplo 22: Efectos de inhibición antisentido de apolipoproteína C-III (ISIS 167880) en niveles de AST y ALT en suero
Se usaron ratones C57BL/6 en los estudio siguientes para evaluar la toxicidad en hígado de oligonucleótidos antisentido de apolipoproteína C-III.
Se evaluaron ratones C57BL/6 machos (n=8) recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasa) en el transcurso de 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117) sobre los niveles de enzimas hepáticas (AST y ALT). Los animales control recibieron tratamiento salino. Se dosificó intraperitonealmente a los ratones cada tres días (dos veces a la semana), después de ayunar durante la noche, 50 mg/kg de ISIS 167880 o solución salina durante seis semanas.
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta de roedor normal y después se les dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina (control), 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117) o 50 mg/kg de ISIS 167879 (SEC ID N°: 116) durante dos semanas.
Al concluir el estudio y cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de AST y ALT en suero, que se midieron usando procedimientos clínicos rutinarios. El aumento en los niveles de las enzimas hepáticas ALT y AST puede indicar toxicidad y daño en el hígado.
Los ratones alimentados con la dieta rica en grasas tratados con ISIS 167880 mostraron un aumento en los niveles de AST durante la duración del estudio, en comparación con los controles salinos, (157 UI/l para ISIS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
167880, en comparación con 92 UI/l para el control salino).
Los niveles de ALT en ratones alimentados con la dieta rica en grasas aumentaron con el tratamiento con ISIS 167880 durante la duración del estudio, en comparación con los controles salinos, (64 UI/l para ISIS 167880, en comparación con 40 UI/l para el control salino).
Los ratones magros tratados con ISIS 167880 no mostraron un aumento significativo ni en los niveles de AST ni en los de ALT durante la duración del estudio, en comparación con los controles salinos (niveles de AST de 51 UI/l para control en comparación con 58 UI/l para ISIS 167880; niveles de ALT de 26 UI/l para control en comparación con 27 UI/l para ISIS 167880).
Los ratones magros tratados con ISIS 167879 no mostraron ningún cambio en los niveles de AST y mostraron un aumento en los niveles de ALT durante la duración del estudio, en comparación con los controles salinos (niveles de AST de 51 UI/l para control en comparación con 51 UI/l para ISIS 167879; niveles de ALT de 26 UI/l para control en comparación con 21 UI/l para ISIS 167879).
Estos resultados sugieren un efecto de toxicidad en hígado secundario para ISIS 167880 en ratones alimentados con una dieta rica en grasas pero ninguna toxicidad para ISIS 167880 o 167879 en ratones alimentados con una dieta de roedor normal. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
Ejemplo 23: Efectos de inhibición antisentido de apolipoproteína C-III (ISIS 167880) en niveles de glucosa en suero
Se evaluaron ratones C57BL/6 machos (n=8) que recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasa) en el transcurso de 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117) sobre los niveles de glucosa en suero. Los animales control recibieron tratamiento salino. Se dosificó intraperitonealmente a los ratones cada tres días (dos veces a la semana), después de ayunar durante la noche, 50 mg/kg de ISIS 167880 o solución salina durante seis semanas.
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta de roedor normal y después se dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina (control), 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEc ID N°: 117) o 50 mg/kg de ISIS 167879 (SEC ID N°: 116) durante dos semanas.
Al concluir el estudio y cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de glucosa en suero, que se midieron mediante procedimientos clínicos rutinarios.
En los ratones alimentados con la dieta rica en grasas, ISIS 167880 redujo los niveles de glucosa en suero a 183 mg/dl, en comparación con el control salino de 213 mg/dl. En ratones magros, ISIS 167880 no tuvo ningún efecto significativo sobre los niveles de glucosa en suero con mediciones de 203 mg/dl, en comparación con el control salino con 204 mg/dl; mientras que ISIS 167879 sólo aumentó ligeramente los niveles de glucosa en suero a 216 mg/dl.
Estos resultados indican que en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, ISIS 167880 es capaz de reducir la glucosa en suero a niveles comparables a miembros de la misma camada magros, mientras que no tiene efectos perjudiciales sobre los animales magros. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
Ejemplo 24: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III (ISIS 167880) sobre niveles de ARNm de apolipoproteína C-III en ratones C57BL/6
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta rica en grasas y después se les dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina o 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117) durante seis semanas.
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta de roedor normal y después se les dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina (control) o 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEc ID N°: 117) o 50 mg/kg de ISIS 167879 (SEC ID N°: 116) durante dos semanas.
Al terminar el estudio, cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III en el hígado. Los ratones alimentados con la dieta rica en grasas a los que se dosificó ISIS 167880 tenían niveles de ARNm de apolipoproteína C-III del 8 % de la los ratones tratados con solución salina. Los ratones magros mostraron disminución del ARNm de apolipoproteína CIII después del tratamiento con bien ISIS 167880 o bien ISIS 167879. Los ratones magros a los que se dosificó ISIS 167880 tenían niveles de ARNm de apolipoproteína C-III del 21 % de la los ratones tratados con solución salina y los tratados con ISIS 167879 tenían niveles de ARNm de apolipoproteína C-III del 27 % de la los ratones tratados con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
solución salina.
Estos resultados indican que tanto en ratones alimentados con una dieta rica en grasas como en ratones magros, los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra apolipoproteína C-III son capaces de disminuir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo en una medida similar. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
Tabla 7 - Efectos del tratamiento con ISIS 167880 o 167879 sobre el colesterol, los triglicéridos, la glucosa, la enzima hepática y el ARNm de apolipoproteína C-III en hígado en ratones C57BL/6 magros y alimentados con una dieta rica en grasas
- Unidades medidas del marcador biológico ISIS N° Dieta, duración del experimento
- Rica en grasas, 6 semanas
- Magra, 2 semanas
- Colesterol mg/dl
- control 196 91
- 167880
- 137 91
- 167879
- N.D. 116
- Triglicéridos mg/dl
- control 151 91
- 167880
- 58 59
- 167879
- N.D. 65
- Glucosa mg/dl
- control 213 204
- 167880
- 183 203
- 167879
- N.D. 216
- Enzimas hepáticas
- AST UI/l control 92 51
- 167880
- 157 58
- 167879
- N.D. 51
- ALT UI/l
- control 40 26
- 167880
- 64 27
- 167879
- N.D. 21
- ARNm de polipoproteína C-III % de control 167880 8 % 21 %
- 167879
- N.D. 27 %
En resumen, estos resultados indican que en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, ISIS 167880 es capaz de reducir la glucosa, el colesterol y los triglicéridos en suero a niveles comparables a miembros de la misma camada magros, mientras que no tiene efectos perjudiciales sobre los animales magros. Además, los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra apolipoproteína C-III son capaces de disminuir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo en una medida similar en ratones alimentados con una dieta rica en grasas y ratones magros. Estos resultados sugieren un efecto de toxicidad en hígado secundario para ISIS 167880 en ratones alimentados con una dieta rica en grasas pero ninguna toxicidad para ISIS 167880 o 167879 en ratones alimentados con una dieta de roedor normal.
Ejemplo 25: Inhibición antisentido de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo
Se usaron ratones C57BL/6, una cepa de la que se ha informado que es susceptible a la formación inducida por hiperlipidemia de placas ateroescleróticas, en los estudios siguientes para evaluar oligonucleótidos antisentido de apolipoproteína C-III como agentes potenciales para reducir los niveles de colesterol y triglicéridos. En consecuencia, en una realización adicional, los ratonesC57BL/6 con una dieta rica en grasas se trataron con oligonucleótidos dirigidos a apolipoproteína C-III.
Se analizaron ratones C57BL/6 machos (n=8; 7 a 8 semanas que edad) que recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) para evaluar la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hígado 6 semanas después del trtamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III. Los ratones recibieron dos veces a la semana inyecciones intraperitoneales a una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117), ISIS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
167875 (SEC ID N°: 113), ISIS 167878 (SEC ID N°: 115) o ISIS 167879 (SEC ID N°: 116). Los animales control recibieron tratamiento de solución salina dos veces a la semana durante un periodo de 6 semanas.
Al terminar el estudio, cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron para determinar la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en el hígado. El ARN se aisló del hígado y el ARNm se cuantificó tal como se describe en el presente documento. Se hizo la media de los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de cada grupo de tratamiento (n=8). Con relación a los animales tratados con solución salina, el tratamiento con ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880 dieron como resultado una reducción del 24 %, 56 %, 50 % y 77 % de los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III, respectivamente, lo que demuestra que estos compuestos reducen significativamente la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en el hígado.
Ejemplo 26: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en colesterol, triglicéridos, glucosa en suero y transaminasas en suero
En una realización posterior, los ratones tratados con solución salina o una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117), ISIS 167875 (SEC ID N°: 113), ISIS 167878 (SEC ID N°: 115) o ISIS 167879 (SEC ID N°: 116) tal como se describe en el ejemplo 25 se analizaron para determinar los niveles de colesterol y triglicéridos en suero después de 6 semanas de tratamiento.
Al finalizar el estudio, cuarenta y ocho horas después de la dosis de solución salina o compuestos antisentido, los animales se sacrificaron y se analizaron para determinar los niveles de colesterol, triglicéridos y glucosa en suero mediante análisis rutinarios usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Las transaminasas ALT y AST en suero, aumentos en los que pueden indicar hepatotoxicidad, también se midieron usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Los niveles de colesterol, triglecéridos y glucosa en suero se presentan en la tabla 8 como resultado promedio de cada grupo de tratamiento (n=8) en mg/dl. ALT y AST, que también se muestran en la tabla 8, también se muestran como resultado promedio para cada grupo de tratamiento (n=8), en unidades internaciones/l (UI/l).
Tabla 8 - Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en colesterol, triglicéridos, glucosa y
transaminasas en suero
- Tratamiento
- Marcador en suero
- Solución Salina ISIS 167875 ISIS 167878 ISIS 167879 ISIS 167880
- Colesterol total mg/dl
- 172 197 180 132 155
- Colesterol HDL mg/dl
- 149 162 157 117 137
- Colesterol LDL mg/dl
- 25 37 28 24 21
- Triglicéridos en suero mg/dl
- 126 99 75 60 52
- ALT UI/l
- 24 555 32 45 66
- AST UI/l
- 56 489 76 117 132
- Glucosa mg/dl
- 273 234 251 189 255
Se observó una reducción significativa de los niveles de triglicéridos en suero después del tratamiento con ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880, que redujeron los niveles de triglicéridos el 22 %, 40 %, 52 % y 58 %, respectivamente. Esta reducción de triglicéridos en suero se correlaciona con la reducción de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hígado. Además, las reducciones de triglicéridos en diana y en suero siguiendo al tratamiento con ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880 no fueron acompañadas por hepatotoxicidad, tal como indica la falta de aumentos significativos en los niveles de ALT y AST. Los niveles de glucosa se redujeron significativamente siguiendo el tratamiento con ISIS 167879.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 27: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en el peso corporal y en el peso de los órganos
Los ratones tratados con solución salina o una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117), ISIS 167875 (SEC ID N°: 113), ISIS 167878 (SEC ID N°: 115) o ISIS 167879 (SEC ID N°: 116) tal como se describe en el ejemplo 25 se analizaron para determinar cambios en el peso corporal y en el peso de almohadilla grasa, hígado y bazo. En la conclusión del estudio, cuarenta y ocho horas después de la dosis final de solución salina o de compuesto antisentido, los animales se sacrificaron y se midieron los pesos corporales y de los órganos. Los datos mostrados en la tabla 9 representan pesos promedio de todos los animales de cada grupo de tratamiento (n=8). El peso corporal se presenta en gramos (g), mientras que los pesos de bazo, hígado y almohadilla grasa se presentan en miligramos (mg).
Tabla 9 - Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en el peso corporal y de los
órganos
- Tratamiento
- Solución salina ISIS 167875 ISIS 167878 ISIS 167879 ISIS 167880
- Peso corporal (g)
- 33 30 32 28 30
- Peso del hígado (mg)
- 126 190 141 133 146
- Peso de la almohadilla grasa (mg)
- 182 125 125 61 62
- Peso del bazo (mg)
- 8 12 12 12 14
Tal como resulta evidente en la tabla 9, el tratamiento con compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de ratón dio como resultado reducciones significativos en el peso de la almohadilla grasa. ISIS 167875 e ISIS 167878 produjeron ambos una reducción del 31 % en el peso de la almohadilla grasa, mientras que ISIS 167879 e ISIS 167880 produjeron ambos una reducción del 66 % en el peso de la almohadilla grasa. Los pesos corporales no cambiaron significativamente y el peso de los bazos aumentaron ligeramente siguiendo el tratamiento del compuestos antisentido. Con la excepción de los hígados de los animales tratados con ISIS 167875, los pesos de los hígados no cambiaron significativamente.
Ejemplo 28: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en niveles de triglicéridos en hígado
La esteatosis hepática se refiere a la acumulación de lípidos en el hígado, o “hígado graso”, que está causada frecuentemente por el consumo de alcohol, diabetes e hiperlipidemia y puede progresar hasta el estado final del daño hepático. Dadas las consecuencias perjudiciales de un trastorno de hígado graso, es necesario identificar compuestos que previenen o mejoran la esteatosis hepática. La esteatosis hepática se evaluar tanto mediante mediciones del contenido de triglicéridos en tejidos como mediante el examen de tejidos hepáticos.
El contenido de triglicéridos en el tejido hepático se evaluó en los animales tratados con solución salina o una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID N°: 117), ISIS 167875 (SEC ID N°: 113), ISIS 167878 (SEC ID N°: 115) o ISIS 167879 (SEC ID N°: 116) tal como se describe en el ejemplo 25. El contenido de triglicéridos en el tejido hepático se midió usando el ensayo para triglicéridos GPO (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, Estados Unidos). Los análisis histológicos se realizaron usando procedimientos rutinarios, mediante los que se fijó el tejido hepático en formalina tamponada a pH nuetro, embebida en parafina, se seccionaron y subsiguientemente se tintaron con hematoxilina y eosina, para visualizar núcleos y citoplasma, respectivamente. Alternativamente, el tejido hepático se procuró después de estar recién congelado, seccionado y subsiguientemente tintado con colorante Oil red O para visualizar los depósitos de lípidos y se contratintó con eosina para marcar el citoplasma . Las muestras preparadas se evaluaron mediante microscopía de luz.
Con relación a los ratones tratados con solución salina, los niveles de triglicéridos en tejido hepático se redujeron significativamente en un 25 %, 35 %, 40 % y 64 % siguiendo el tratamiento con ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880, respectivamente. Los análisis histológicos de secciones de hígado tintadas revelaron de forma similar una reducción de triglicéridos en el tejido hepático. De este modo, tal como se demuestra mediante mediciones de triglicéridos en tejido y análisis histológicos de secciones de tejido hepático, el tratamiento con compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III redujeron el contenido de triglicéridos. Como tales, los compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III son agentes terapéuticos candidatos para la prevención o mejora de esteatosis hepática.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 29: Inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en hepatocitos primario de macacos cangrejeros
Los compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III se analizaron para evaluar sus efectos sobre la expresión de apolipoproteína C-III en hepatocitos de macaco cangrejero primarios. Los hepatocitos de macaco cangrejero primarios preplaqueados se adquirieron de InVitro Technologies (Baltimore, MD, Estados Unidos). Las células se cultivaron en DMEM de alta glucosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 100 unidades/ml y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos).
Las células, a una densidad de 80.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos se trataron con 10, 50, 150 y 300 nM de ISIS 304789 (SEQ ID N°: 75), ISIS 304799 (SEC ID N°: 85) o ISIS 304800 (SEC ID N°: 86). ISIS 113529 (CTCTTACT-GTGCTGTGGACA, SEC ID N°: 222) sirvió como oligonucleótido control. ISIS 113529 es un oligonucleótido quimérico ("gapmef) de 20 nucleótidos de longitud, compuesto por una región “hueco” que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada a ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2'-MOE)nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
Después de 24 horas de tratamiento como oligonucleótidos antisentido, se midió el ARNm de apolipoproteína C-III por PCR en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos del presente documento, usando los cebadores y la sonda diseñados para la secuencia de apolipoproteína C-III humana (SEC ID N° 5, 6 y 7) para medir el ARNm de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero. Se usaron cebadores y sonda diseñados para GAPDH humana (SEC ID N° 8, 9 y 10) para medir la expresión de ARNm de GAPDH de macaco cangrejero, con el fin de normalizar las cantidades de diana génica obtenidas por PCR en tiempo real. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al cual se normalizaron los datos. Los datos son la media de tres experimentos y se presentan en la tabla 10.
Tabla 10 - inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en hepatocitos primarios de macacos
cangrejeros
- Dosis de oligonucleótidos
- ISIS N°
- SEC ID N.° 10 nM 50 nM 150 nM 300 nM
- % de inhibición
- 304789
- 75 0 7 1 55
- 304799
- 85 34 60 66 48
- 304800
- 86 9 53 59 57
- 113529
- 222 N.D. N.D. 0 0
Ejemplo 30: Secuencia de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero
Se secuenció una porción del gen de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero. Las posiciones 8 a 476 de la secuencia de ARNm de apolipoproteína C-III (que se incorpora en su totalidad al presente documento como SEC ID N°: 18) contiene el segmento diana al que se hibrida ISIS 304789. Se secuenció la región correspondiente de ARNm de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero. El ARN se aisló y purificó a partir de hepatocitos de macaco cangrejero (InVitro Technologies, Gaith-ersburg, MD, Estados Unidos) y se sometió a una reacción de transcriptasa inversa (kit de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ADNc resultante fue el sustrato para 40 ciclos de amplificación por PCR, usando cebadores 5' y 3' diseñados para las posiciones 8 y 476, respectivamente, del ARNm de apolipoproteína C-III humana (Amplitaq PCR kit, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Siguiendo a la purificación en gel del fragmento de 468 pb resultante, las reacciones de secuenciación directa e inversa de cada producto se realizaron por Retrogen (San Diego, CA, Estados Unidos). La secuencia de macaco cangrejero se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 223 y es en el 92 % idéntica a las posiciones 8 a 476 del ARNm de apolipoproteína C-III humana.
Ejemplo 31: Oligonucleótidos de fosforoditioacto quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi, dirigidos a apolipoproteína C-III de macaco cangrejero
Se usó la secuencia de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero, incorporada al presente documento como SEC ID N°: 223, para diseñar un oligonucleótido antisentido que tiene el 100 % de complementariedad con el ARNm de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero. ISIS 340340 (GGCAGCCCTGGAGGCTGCAG; incorporada el presente docuemento como SEC ID N°: 224) está dirigida al nucleótido 397 de SEC ID N°: 223, dentro de una región
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
que corresponde a la 3' UTR de la apolipoproteína C-III humana con la que se híbrida ISIS 304789. ISIS 340340 es un oligonucleótido quimérico ("gapmer") de 20 nucleótidos de longitud, compuesto por una región “hueco” central que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada a ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2'metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
Ejemplo 32: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi
Con el fin de diseñar oligonucleótidos antisentido para las regiones codificantes y no traducidas de ARNm de apolipoproteína C-III de rata, se secuenció un segmento de ARNm de apolipoproteína C-III de rata para proporcionar la secuencia 3' UTR, ya que la secuencia de ARNm de apolipoproteína C-III de rata publicada está restringida a la región codificante. El ARN se aisló y purificó a partir de hepatocitos de rata (InVitro Technologies, Gaith- ersburg, MD, Estados Unidos) y se sometió a una reacción de transcriptasa inversa (kit de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ADN resultante fue el sustrato para 40 ciclos de amplificación por PCR (Amplitaq PCR kit, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), usando cebadores directos e inversos para alinearse a los extremos 5' y 3', respectivamente, de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón. Siguiendo a la purificación en gel del fragmento de 427 pb resultante, las reacciones de secuenciación directa e inversa de cada producto se realizaron por Retrogen (San Diego, CA, Estados Unidos). La secuencia de rata se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 225 e incluye 121 pb adicionales en la dirección 3' desde el codón de detención de la aplipoproteína C-III con respecto a la secuencia publicada (número de acceso al GenBank NM_012501.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 226).
Se diseñó una serie de compuestos antisentido para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de rata usando la secuencia SEC ID N°: 225. Los compuestos se muestran en la tabla 11. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 11 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” central que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2'-MOE)nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Las sondas y los cebadores de apolipoproteína C-III de ratón se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteína C-III de rata usando información de secuencias publicada (número de acceso del GenBank NM_012501.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 226). Para la apolipoproteína C-III de rata los cebadores de pCR fueron: cebador directo: GAGGGAGAGGGATCCTTGCT (SEC iD N°: 227) cebador inverso: GGACCGTCTTGGAGGCTTG (SEC ID N°: 228) y la sonda PCR fue: FAM-CTGGGCTCTATGCAGGGCTACATGGA- TAMRA, SEC ID N°: 229) en la que FAM es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador. Para GAPDH de rata los cebadores PCR fueron: cebador directo: TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT (SEC ID N°: 230) cebador inverso: CACCGACCTTCACCATCTTGT (SEC ID N°: 231) y la sonda PCR fue JOE- TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA (SEC ID N°: 232) en la que JOE es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador.
Los datos son de un experimento en el que se trataron hepatocitos de rata primarios con una concentración 150 nM de oligonucleótidos antisentido. Los resultados, que se muestran en la tabla 11, se expresan como porcentaje de inhibición con respecto a células control no tratadas. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 11 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.°
- 340982
- Codificante 225 213 TGAACTTATCAGTGAACTTG 0 233
- 340987
- Codificante 225 238 TCAGGGCCAGACTCCCAGAG 7 234
- 340988
- Codificante 225 258 TTGGTGTTGTTAGTTGGTCC 0 235
- 340991
- Codificante 225 258 TTGGTGTTGTTAGTTGGTCC 0 236
- 353932
- Codificante 225 10 AGAGCCACGAGGGCCACGA T 0 237
- 353933
- Codificante 225 20 AGAGGCCAGGAGAGCCACG A 15 238
- 353934
- Codificante 225 30 CAGCTCGGGCAGAGGCCAG G 2 239
- 353935
- Codificante 225 40 TCTCCCTCATCAGCTCGGGC 0 240
- 353936
- Codificante 225 59 GCCCAGCAGCAAGGATCCCT 73 241
- 353937
- Codificante 225 69 CCTGCATAGAGCCCAGCAGC 0 242
- 353938
- Codificante 225 79 TCCATGTAGCCCTGCATAGA 90 243
- 353940
- Codificante 225 99 GGACCGTCTTGGAGGCTTGT 76 244
- 353941
- Codificante 225 109 AGTGCATCCTGGACCGTCTT 61 245
- 353942
- Codificante 225 119 CATGCTGCTTAGTGCATCCT 0 246
- 353943
- Codificante 225 129 CAGACTCCTGCATGCTGCTT 57 247
- 353944
- Codificante 225 139 ACAGCTATATCAGACTCCTG 0 248
- 353945
- Codificante 225 148 CTGGCCACCACAGCTATATC 0 249
- 353946
- Codificante 225 169 AAGCGATTGTCCATCCAGCC 0 250
- 353949
- Codificante 225 195 TGCTCCAGTAGCCTTTCAGG 0 251
- 353950
- Codificante 225 200 GAACTTGCTCCAGTAGCCTT 35 252
- 353951
- Codificante 225 204 CAGTGAACTTGCTCCAGTAG 0 253
- 353952
- Codificante 225 209 CTTATCAGTGAACTTGCTCC 0 254
- 353953
- Codificante 225 217 CCAGTGAACTTATCAGTGAA 0 255
- 353954
- Codificante 225 221 GAGGCCAGTGAACTTATCAG 0 256
- 353955
- Codificante 225 224 CCAGAGGCCAGTGAACTTAT 31 257
- 353956
- Codificante 225 229 GACTCCCAGAGGCCAGTGAA 0 258
- 353957
- Codificante 225 234 GGCCAGACTCCCAGAGGCC A 0 259
- 353958
- Codificante 225 247 AGTTGGTCCTCAGGGCCAGA 0 260
- 353959
- Codificante 225 250 GTTAGTTGGTCCTCAGGGCC 0 261
- 353960
- Codificante 225 254 TGTTGTTAGTTGGTCCTCAG 0 262
- 353961
- Codificante 225 262 AGAGTTGGTGTTGTTAGTTG 0 263
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.°
- 353962
- Codificante 225 267 GCTCAAGAGTTGGTGTTGTT 0 264
- 353963
- Codificante 225 271 CACGGCTCAAGAGTTGGTGT 0 265
- 353964
- Codón de detención 225 275 GTCTCACGGCTCAAGAGTTG 0 266
- 353966
- Codón de detención 225 285 GAACATGGAGGTCTCACGGC 55 267
- 353967
- Codón de detención 225 289 TCTGGAACATGGAGGTCTCA 0 268
- 353968
- 3'UTR 225 293 CACATCTGGAACATGGAGGT 0 269
- 353969
- 3'UTR 225 297 CAGACACATCTGGAACATGG 0 270
- 353970
- 3'UTR 225 301 TGGCCAGACACATCTGGAAC 49 271
- 353972
- 3'UTR 225 309 AGGATAGATGGCCAGACACA 47 272
- 353973
- 3'UTR 225 313 CAGCAGGATAGATGGCCAGA 0 273
- 353974
- 3'UTR 225 317 GAGGCAGCAGGATAGATGG C 38 274
- 353975
- 3'UTR 225 321 TTCGGAGGCAGCAGGATAGA 0 275
- 353976
- 3'UTR 225 325 AACCTTCGGAGGCAGCAGGA 19 276
- 353977
- 3'UTR 225 329 GAGCAACCTTCGGAGGCAGC 88 277
- 353978
- 3' UTR 225 333 CTTAGAGCAACCTTCGGAGG 77 278
- 353979
- 3'UTR 225 337 TCCCCTTAGAGCAACCTTCG 0 279
- 353980
- 3'UTR 225 341 ACTTTCCCCTTAGAGCAACC 45 280
- 353981
- 3'UTR 225 345 ATATACTTTCCCCTTAGAGC 28 281
- 353982
- 3'UTR 225 349 GAGAATATACTTTCCCCTTA 96 282
- 353983
- 3'UTR 225 353 GCATGAGAATATACTTTCCC 69 283
- 353984
- 3'UTR 225 357 AAAGGCATGAGAATATACTT 47 284
- 353985
- 3'UTR 225 361 GGATAAAGGCATGAGAATAT 0 285
- 353986
- 3'UTR 225 365 GGAGGGATAAAGGCATGAGA 0 286
- 353987
- 3'UTR 225 386 GCATGTTTAGGTGAGGTCTG 100 287
- 353988
- 3'UTR 225 390 GACAGCATGTTTAGGTGAGG 0 288
- 353990
- 3'UTR 225 398 TTATTTGGGACAGCATGTTT 0 289
- 353991
- 3'UTR 225 402 GCTTTTATTTGGGACAGCAT 0 290
- 353992
- 3'UTR 225 407 TCCCAGCTTTTATTTGGGAC 22 291
Se diseñó una serie adicional de compuestos antisentido para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de rata usando secuencias descritas en el presente documento (SEC ID N°: 225 y la secuencia con el número de acceso del Genbank NM_ 012501.1, incorporada al presente documento como SEC iD N°: 226). Los compuestos se muestran en la tabla 12. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 12 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2'- desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2'-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
citidina son 5-metilcitidinas.
Tabla 12 - Oligonucleótidos de fosforoditioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi,
dirigidos a apolipoproteína C-III de rata
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.°
- 340937
- Codificante 226 8 CACGATGAGGAGCATTCGGG 292
- 340938
- Codificante 226 13 AGGGCCACGATGAGGAGCAT 293
- 340939
- Codificante 225 6 CCACGAGGGCCACGATGAGG 294
- 340940
- Codificante 225 11 GAGAGCCACGAGGGCCACGA 295
- 340941
- Codificante 225 16 GCCAGGAGAGCCACGAGGGC 296
- 340942
- Codificante 225 21 CAGAGGCCAGGAGAGCCACG 297
- 340943
- Codificante 225 26 TCGGGCAGAGGCCAGGAGAG 298
- 340944
- Codificante 225 31 TCAGCTCGGGCAGAGGCCAG 299
- 340945
- Codificante 225 36 CCTCATCAGCTCGGGCAGAG 300
- 340946
- Codificante 225 41 CTCTCCCTCATCAGCTCGGG 301
- 340947
- Codificante 225 46 GATCCCTCTCCCTCATCAGC 302
- 340948
- Codificante 225 51 GCAAGGATCCCTCTCCCTCA 303
- 340949
- Codificante 225 56 CAGCAGCAAGGATCCCTCTC 304
- 340950
- Codificante 225 61 GAGCCCAGCAGCAAGGATCC 305
- 340951
- Codificante 225 66 GCATAGAGCCCAGCAGCAAG 306
- 340952
- Codificante 225 71 GCCCTGCATAGAGCCCAGCA 307
- 340953
- Codificante 225 76 ATGTAGCCCTGCATAGAGCC 308
- 340954
- Codificante 225 81 GTTCCATGTAGCCCTGCATA 309
- 340955
- Codificante 225 86 GGCTTGTTCCATGTAGCCCT 310
- 340956
- Codificante 225 91 TTGGAGGCTTGTTCCATGTA 311
- 340957
- Codificante 225 96 CCGTCTTGGAGGCTTGTTCC 312
- 340958
- Codificante 225 101 CTGGACCGTCTTGGAGGCTT 313
- 340959
- Codificante 225 106 GCATCCTGGACCGTCTTGGA 314
- 340960
- Codificante 225 111 TTAGTGCATCCTGGACCGTC 315
- 340961
- Codificante 225 116 GCTGCTTAGTGCATCCTGGA 316
- 340962
- Codificante 225 121 TGCATGCTGCTTAGTGCATC 317
- 340963
- Codificante 225 126 ACTCCTGCATGCTGCTTAGT 318
- 340964
- Codificante 225 131 ATCAGACTCCTGCATGCTGC 319
- 340965
- Codificante 225 136 GCTATATCAGACTCCTGCAT 320
- 340966
- Codificante 225 141 CCACAGCTATATCAGACTCC 321
- 340967
- Codificante 225 146 GGCCACCACAGCTATATCAG 322
- 340968
- Codificante 226 163 CTGCTGGCCACCACAGCTAT 323
- 340969
- Codificante 226 168 AGCCCCTGCTGGCCACCACA 324
- 340970
- Codificante 226 173 CATCCAGCCCCTGCTGGCCA 325
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.°
- 340971
- Codificante 226 178 TTGTCCATCCAGCCCCTGCT 326
- 340972
- Codificante 226 179 ATTGTCCATCCAGCCCCTGC 327
- 340973
- Codificante 225 168 AGCGATTGTCCATCCAGCCC 328
- 340974
- Codificante 225 173 TTTGAAGCGATTGTCCATCC 329
- 340975
- Codificante 225 178 AGGGATTTGAAGCGATTGTC 330
- 340976
- Codificante 225 183 CTTTCAGGGATTTGAAGCGA 331
- 340977
- Codificante 225 188 GTAGCCTTTCAGGGATTTGA 332
- 340978
- Codificante 225 193 CTCCAGTAGCCTTTCAGGGA 333
- 340979
- Codificante 225 198 ACTTGCTCCAGTAGCCTTTC 334
- 34980
- Codificante 225 203 AGTGAACTTGCTCCAGTAGC 335
- 340981
- Codificante 225 208 TTATCAGTGAACTTGCTCCA 336
- 34983
- Codificante 225 218 GCCAGTGAACTTATCAGTGA 337
- 340984
- Codificante 225 223 CAGAGGCCAGTGAACTTATC 338
- 340985
- Codificante 225 228 ACTCCCAGAGGCCAGTGAAC 339
- 340986
- Codificante 225 233 GCCAGACTCCCAGAGGCCAG 340
- 340989
- Codificante 225 248 TAGTTGGTCCTCAGGGCCAG 341
- 340990
- Codificante 225 253 GTTGTTAGTTGGTCCTCAGG 342
- 340992
- Codificante 225 263 AAGAGTTGGTGTTGTTAGTT 343
- 340993
- Codificante 225 268 GGCTCAAGAGTTGGTGTTGT 344
- 340994
- Codón de detención 225 272 TCACGGCTCAAGAGTTGGTG 345
- 353939
- Codificante 225 89 GGAGGCTTGTTCCATGTAGC 346
- 353947
- Codificante 225 180 TCAGGGATTTGAAGCGATTG 347
- 353948
- Codificante 225 190 CAGTAGCCTTTCAGGGATTT 348
- 353965
- Codón de detención 225 281 ATGGAGGTCTCACGGCTCAA 349
- 353971
- 3' UTR 225 305 TAGATGGCCAGACACATCTG 350
- 353989
- 3' UTR 225 394 TTGGGACAGCATGTTTAGGT 351
Ejemplo 33: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi. Estudio de respuesta a la dosis en hepatocitos de rata primarios
Se seleccionaron cuatro oligonudeótidos para los estudios de respuesta a la dosis adicionales. Los hepatocitos de rata primarios se trataron con 10, 50, 150 y 300 nM de ISIS 167878 (SEC ID N°: 115), ISIS 167880 (SEC ID N°: 117), ISIS 340982 (SEC ID N°: 233), o el control oligo mezclado ISIS 113529 (SEC ID N°: 222) y se midieron los niveles de ARNm 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al que se normalizaron los datos.
Los resultados de estos estudios se muestran en la tabla 13. Los datos se promediaron a partir de tres experimentos y se expresaron como porcentaje de inhibición con relación a los controles no tratados. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 13 - Inhibición antisentido de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hepatocitos de rata primaria 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos
- Dosis de oligonucleótidos
- ISIS N°
- SEC ID N.° 10 nM 50 nM 150 nM 300 nM
- % de inhibición
- 167878
- 115 0 0 0 4
- 167880
- 117 21 19 20 33
- 340982
- 233 15 70 83 91
- 113529
- 222 N.D. N.D. N.D. 9
Tal como se muestra en la tabla 13, ISIS 340982 fue eficaz en reducir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de un modo dependiente de la dosis.
Ejemplo 34: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi Estudio adicional de respuesta a la dosis en hepatocitos de rata primarios
Se seleccionó un grupo adicional de oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de rata para los estudios de respuesta a la dosis. Los hepatocitos de rata primarios se trataron con una concentración 10, 50, 150 y 300 nM de ISIS 353977 (SEC ID N°: 277), ISIS 353978 (SEC ID N°: 278), ISIS 353982 (SEC ID N°: 282), ISIS 353983 (SEC ID N°: 283) o ISIS 353987 (SEC ID N°: 287) durante un periodo de 24 horas. Los niveles de expesión diana se cuentificaron por PCR en tiempo real tal como se describe en el presente documento. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al que se normalizaron los datos. Los resultados, que se muestran en la tabla 14, son la media de tres experimentos y se presentan como porcentaje de inhibición de ARNm de apolipoproteína relativos a las células control no tratadas.
Tabla 14 - Inhibición dependiente de la dosis de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hepatocitos de rata primarios 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos
- Dosis de oligonucleótidos
- ISIS N°
- SEC ID N.° 10 nM 50 nM 150 nM 300 nM
- % de inhibición
- 353977
- 277 26 10 3 2
- 353978
- 278 46 23 8 5
- 353982
- 282 35 21 10 2
- 353983
- 283 46 23 12 2
- 353987
- 287 38 25 12 4
Estos datos muestran que ISIS 353977, ISIS 353978, ISIS 353982, ISIS 353983 e ISIS 353987 reducen eficazmente el ARNm de apolipoproteína C-III de un modo dependiente de la dosis.
Ejemplo 35: Inhibición antisentido de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo
Se evaluaron los efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en ratas. Se alimentaron ratas Sprague-Dawley macho de 6 semanas de edad (Charles River Labs, Wilmington, MA, Estados Unidos) con una dieta de roedor normal. Los animales recibieron inyecciones intraperitoneales de ISIS 340982 (SEC ID N°: 233) dos veces a la semana durante dos semanas. Un grupo de animales (n= 4) recibieron 75 mg/kg de ISIS 340982 y un grupo de animales (n= 4) recibieron 100 mg/kg de ISIS 340982. Los animales tratados con solución salina (n = 4) sirvieron como grupo control.
Al finalizar el periodo de tratamiento, los animales se sacrificaron y se aisló ARN del hígado. Se midió el ARNm de apolipoproteína C-III tal como se describe para otros ejemplos del presente documento. Los resultados
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
para cada grupo de tratamieto se promediaron y los niveles de ARNm en hígado de ratones tratados con ISIS 340982 se normalizaron con los niveles de ARNm en hígado de los ratones tratados con solución salina. El tratamiento com 75 mg/kg o 100 mg/kg de ISIS 340982 dieron como resultado una reducción del 69 % y una reducción del 84 % en hígado de ARNm de apolipoproteína C-III, respectivamente, lo que demuestra que ISIS 340982 inhibe eficazmente la expresión de ARNm diana in vivo.
Ejemplo 36: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de rata in vivo sobre pesos corporales, de hígado y de bazo
Las ratas tratadas con ISIS 340782 (SEC ID N°: 233) tal como se describe en el ejemplo 35 se analizaron para determinar cambios en el peso corporal y en el peso del hígado y del bazo. Los pesos corporales se registraron al comienzo del estudio (semana 0). Siguiendo al tratamiento de dos semanas con inyecciones dos veces a la semana de solución salino o ISIS 340782 a una concentración de 75 o 100 mg/kg, los animales se sacrificaron, cuarenta y ocho horas después de la inyección cuarta y última, los animales se sacrificaron. Se registraron los pesos corporales, de hígado y de bazo a la conclusión del estudio.
Tabla 15 - Pesos corporales, de hígado y de bazo de ratas tratadas con oligonucleótido antisentido
dirigido a apolipoproteína C-III
- Medida
- Solución Salina Tratamiento con ISIS 340892
- 75 mg/kg
- 100 mg/kg
- Semana 0
- Semana 2 Semana 0 Semana 2 Semana 0 Semana 2
- Peso corporal (g)
- 529 536 485 448 478 425
- Peso del hígado (g)
- N.D. 19 N.D. 14 N.D. 16
- Peso del bazo (mg)
- N.D. 1,1 N.D. 1,6 N.D. 1,6
Estos datos demuestran que la inhibición antisentido de de ARNm de apolipoproteína C-III no estaba asociada con cambios en el peso corporal, del hígado o del bazo.
Ejemplo 37: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de rata in vivo niveles de lípicos y glucosa en sangre
Se analizaron las ratas tratadas tal como se ha descrito en el ejemplo 35 para evaluar los cambios en el colesterol total, los triglicéridos, colesterol HDL, colesterol LDL, ácidos grasos libres y glucosa en sangre. Las muestras de sangre se recogieron justo antes de los tratamientos (semana 0) y se siguió con el tratamiento de dos semanas con inyecciones dos veces a la semana de solución salina o ISIS 340982 (SEC ID N°: 233) a una concentración de 75 o 100 mg/kg. Los niveles de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos, ácidos grasos libres y glucosa se midieron usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Los datos de los cuatro animales de cada grupo de tratamiento se promediaron. Los resultados se muestran en la tabla 16.
Tabla 16 - Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de rata en lípidos y glucosa en
sangre
- Tratamiento
- Marcador biológico medido
- Solución salina 75 mg/kg ISIS 340982 100 mg/kg ISIS 340982
- Semana 0
- Semana 2 Semana 0 Semana 2 Semana 0 Semana 2
- Triglicéridos mg/dl
- 162 162 111 24 139 17
- Colesterol total mg/dl
- 112 102 106 40 107 31
- Colesterol HDL mg/dl
- 66 63 83 23 96 17
- Colesterol LDL mg/dl
- 29 32 35 13 37 10
- Ácidos grasos libres mg/l
- 0,48 0,46 0,72 0,70 0,57 0,53
- Glucosa mg/dl
- 153 151 147 127 164 166
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
A partir de los datos mostrados en la tabla 16 se evidencia que el tratamiento con ISIS 340982, a ambas dosis administradas, reduce significativamente los triglicéridos, el colesterol total, el colesterol HDL y el colesterol LDL en circulación en ratas. Además, estos animales muestran una expresión reducida de ARNm de apolipoproteína CIII en hígado después del tratamiento con ISIS 340982.
Ejemplo 38: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de rata in vivo Transaminasas en suero
Las ratas tratadas tal como se ha descrito en el ejemplo 35 se analizaron para evaluar la toxicidad en el hígado después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido. Después del tratamiento de dos semanas con inyecciones dos veces a la semana de 75 mg/kg y 100 mg/kg de ISIS 340982 (SEC ID N°: 233), los animales se sacrificaron y su sangre se recigió y se procesó para realizar análisis clínicos rutinarios. Los aumentos de transaminasas ALT y AST en suero, que pueden indicar hepatotoxicidad, también se midieron usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Los niveles de ALT y AST, que se muestran en la tabla 17, también se muestran como resultado promedio para cada grupo de tratamiento de 4 animales, en unidades internaciones/litro (UI/l).
Tabla 17 - Efectos del tratamiento con ISIS 340982 sobre los niveles de transaminas en suero
en ratas
- Tratamiento
- transaminasas en suero
- Solución Salina 75 mg/kg de ISIS 340982 100 mg/kg de ISIS 340982
- ALT UI/l
- 70 49 59
- AST UI/l
- 93 127 147
Los niveles de ALT o AST que son el doble que en el control salino se consideran indicativos de hepatotoxicidad. Estos datos muestran que el tratamiento con ISIS 340982 en ratas, tanto a una dosis de 75 mg/kg como de 100 mg/kg, no dio como resultado una hepatotoxicidad significativa.
Ejemplo 39: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de hámster mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi
Con el fin de diseñar oligonucleótidos antisentido para regiones diferentes de ARNm de apolipoproteína CIII de hámster, se secuenció un segmento de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster Mesocricetus auratus para proporcionar un segmento de secuencia de región codificante y 3' UTR, debido a que no estaba disponible ninguna secuencia de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster. El ARN se aisló y purificó a partir de hepatocitos de hámster primarios (InVitro Technologies, Gaith-ersburg, MD, Estados Unidos) y se sometió a una reacción de transcriptasa inversa (kit de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ADNc resultante fue el sustrato para 40 ciclos de amplificación por PCR (Amplitaq PCR kit, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), usando cebadores directos e inversos para alinearse a los extremos 5' y 3', respectivamente, de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón. Siguiendo a la purificación en gel del fragmento de 435 pb resultante, las reacciones de secuenciación directa e inversa de cada producto se realizaron por Retrogen (San Diego, CA, Estados Unidos). La secuencia de hámster se incorpora al presente documento como SEC ID N°: 352.
Se diseñó una serie de compuestos antisentido para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de hámster (SEC ID N°: 352). Los compuestos se muestran en la tabla 18. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 18 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2'- MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
Los compuestos se analizaron para determinar su efecto sobre niveles de apoliproteína C-III hepatocitos primarios de hámster mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Las sondas y cebadores de apolipoproteína C-III de hámster se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteína C-III de hámster, usando la secuencia de ARNm de hámster que se describe en el presente documento (SEC ID N°: 352). Para apolipoproteína C-III de hámster, los cebadores fueron:
cebador directo: CGCTAACCAGCATGCAAAAG (SEC ID N°: 353)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cebador inverso: CACCGTCCATCCAGTCCC (SEC ID N°: 354) y la
sonda PCR fue: FAM-CTGAGGTGGCTGTGCGGGCC-TAMRA (SEC ID N°: 355) en la que FAM es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador.
Para GAPDH de hámster, los cebadores PCR fueron:
cebador directo: CCAGCCTCGCTCCGG (SEC ID N°: 356) cebador inverso: CCAATACGGCCAAATCCG (SEC ID N°: 357)
y la sonda PCR fue JOE-ACGCAATGGTGAAGGTCGGCG-TAMRA (SEC ID N°: 358) en la que JOE es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador.
Los datos son de un experimento en el que se trataron hepatocitos de hámster primarios con una concentración 150 nM de los oligonucleótidos. Los datos, mostrados en la tabla 18, están normalizados para células control no tratadas. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
Tabla 18 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.°
- 352929
- Codificante 352 5 TGCCAAGAGGGCAACAATAG 17 359
- 352930
- Codificante 352 10 AGGAGTGCCAAGAGGGCAAC 62 360
- 352931
- Codificante 352 16 GATGCCAGGAGTGCCAAGAG 50 361
- 352932
- Codificante 352 20 GGCAGATGCCAGGAGTGCCA 51 362
- 352933
- Codificante 352 39 CTCTACCTCATTAGCTTCGG 0 363
- 352934
- Codificante 352 41 CCCTCTACCTCATTAGCTTC 47 364
- 352935
- Codificante 352 44 GACCCCTCTACCTCATTAGC 0 365
- 352936
- Codificante 352 49 GCAAGGACCCCTCTACCTCA 15 366
- 352937
- Codificante 352 54 CAGCAGCAAGGACCCCTCTA 45 367
- 352938
- Codificante 352 59 GAGCCCAGCAGCAAGGACCC 0 368
- 352939
- Codificante 352 65 TGCACAGAGCCCAGCAGCAA 84 369
- 352940
- Codificante 352 70 AGCCCTGCACAGAGCCCAGC 0 370
- 352941
- Codificante 352 75 CATGTAGCCCTGCACAGAGC 0 371
- 352942
- Codificante 352 80 TGTTCCATGTAGCCCTGCAC 49 372
- 352943
- Codificante 352 85 TGGCCTGTTCCATGTAGCCC 55 373
- 352945
- Codificante 352 95 ACCTTCTTGGTGGCCTGTTC 62 374
- 352946
- Codificante 352 106 GCGCATCCTGGACCTTCTTG 0 375
- 352948
- Codificante 352 115 TGCTGGTTAGCGCATCCTGG 0 376
- 352949
- Codificante 352 120 TTGCATGCTGGTTAGCGCAT 3 377
- 352950
- Codificante 352 125 GACTTTTGCATGCTGGTTAG 59 378
- 352951
- Codificante 352 130 CCTCAGACTTTTGCATGCTG 72 379
- 352952
- Codificante 352 135 AGCCACCTCAGACTTTTGCA 75 380
- 352953
- Codificante 352 140 CGCACAGCCACCTCAGACTT 64 381
- 352955
- Codificante 352 153 CCAGTCCCTGGCCCGCACAG 66 382
- 352956
- Codificante 352 159 GTCCATCCAGTCCCTGGCCC 73 383
- 352957
- Codificante 352 161 CCGTCCATCCAGTCCCTGGC 0 384
- 352958
- Codificante 352 165 GCCACCGTCCATCCAGTCCC 0 385
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.°
- 352959
- Codificante 352 170 GTGAAGCCACCGTCCATCCA 12 386
- 352960
- Codificante 352 174 GGAGGTGAAGCCACCGTCCA 0 387
- 352961
- Codificante 352 193 TGCTCCAGTAGCTTTTCAGG 59 388
- 352962
- Codificante 352 200 GTAAATGTGCTCCAGTAGCT 66 389
- 352963
- Codificante 352 205 TGTCAGTAAATGTGCTCCAG 78 390
- 352965
- Codificante 352 214 TGGAGACCGTGTCAGTAAAT 38 391
- 352966
- Codificante 352 217 GGCTGGAGACCGTGTCAGTA 66 392
- 352967
- Codificante 352 221 CAGAGGCTGGAGACCGTGTC 13 393
- 352968
- Codificante 352 225 ATCCCAGAGGCTGGAGACCG 0 394
- 352969
- Codificante 352 230 GAAGAATCCCAGAGGCTGGA 54 395
- 352970
- Codificante 352 269 TCTCAAGGCTCAGTAGCTGG 0 396
- 352971
- Codificante 352 275 TAGAGGTCTCAAGGCTCAGT 70 397
- 352972
- Codón de detención 352 280 GAACGTAGAGGTCTCAAGGC 61 398
- 352973
- Codón de detención 352 286 CATTTGGAACGTAGAGGTCT 64 399
- 352974
- 3' UTR 352 292 CAAGCACATTTGGAACGTAG 0 400
- 352975
- 3' UTR 352 300 TGGACACACAAGCACATTTG 0 401
- 352976
- 3' UTR 352 305 CAGGATGGACACACAAGCAC 43 402
- 352977
- 3' UTR 352 311 GGCCAGCAGGATGGACACAC 81 403
- 352978
- 3' UTR 352 318 GCCCAGAGGCCAGCAGGATG 60 404
- 352979
- 3' UTR 352 348 CCTTTCAAACAACCTTCAGG 56 405
- 352980
- 3' UTR 352 402 GGACAGCATGTTTAGGTGAC 67 406
Se diseñó una serie adicional de oligonucleótidos para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de hámster usando secuencias descritas en el presente documento (SEC ID N°: 352). Los oligonucleótidos se muestran en la tabla 19. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5') numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 19 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5' y 3') por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2'-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 19 - Oligonucleótidos de fosforoditioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi dirigidos a ARNm de apolipoproteína C-III de hámster
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.°
- 352944
- Codificante 352 90 CTTGGTGGCCTGTTCCATGT 407
- 352947
- Codificante 352 110 GTTAGCGCATCCTGGACCTT 408
- 352954
- Codificante 352 145 TGGCCCGCACAGCCACCTCA 409
- 352964
- Codificante 352 210 GACCGTGTCAGTAAATGTGC 410
- 356295
- Codificante 352 1 AAGAGGGCAACAATAGGAGT 411
- 356296
- Codificante 352 6 GTGCCAAGAGGGCAACAATA 412
- 356297
- Codificante 352 15 ATGCCAGGAGTGCCAAGAGG 413
- 356298
- Codificante 352 25 CTTCGGGCAGATGCCAGGAG 414
- 356299
- Codificante 352 31 CATTAGCTTCGGGCAGATGC 415
- 356300
- Codificante 352 60 AGAGCCCAGCAGCAAGGACC 416
- 356301
- Codificante 352 86 GTGGCCTGTTCCATGTAGCC 417
- 356302
- Codificante 352 91 TCTTGGTGGCCTGTTCCATG 418
- 356303
- Codificante 352 96 GACCTTCTTGGTGGCCTGTT 419
- 356304
- Codificante 352 101 TCCTGGACCTTCTTGGTGGC 420
- 356305
- Codificante 352 111 GGTTAGCGCATCCTGGACCT 421
- 356306
- Codificante 352 116 ATGCTGGTTAGCGCATCCTG 422
- 356307
- Codificante 352 121 TTTGCATGCTGGTTAGCGCA 423
- 356308
- Codificante 352 126 AGACTTTTGCATGCTGGTTA 424
- 356309
- Codificante 352 131 ACCTCAGACTTTTGCATGCT 425
- 356310
- Codificante 352 136 CAGCCACCTCAGACTTTTGC 426
- 356311
- Codificante 352 141 CCGCACAGCCACCTCAGACT 427
- 356312
- Codificante 352 146 CTGGCCCGCACAGCCACCTC 428
- 356313
- Codificante 352 151 AGTCCCTGGCCCGCACAGCC 429
- 356314
- Codificante 352 156 CATCCAGTCCCTGGCCCGCA 430
- 356315
- Codificante 352 166 AGCCACCGTCCATCCAGTCC 431
- 356316
- Codificante 352 171 GGTGAAGCCACCGTCCATCC 432
- 356317
- Codificante 352 176 AGGGAGGTGAAGCCACCGTC 433
- 356318
- Codificante 352 181 TTTTCAGGGAGGTGAAGCCA 434
- 356319
- Codificante 352 187 AGTAGCTTTTCAGGGAGGTG 435
- 356320
- Codificante 352 198 AAATGTGCTCCAGTAGCTTT 436
- 356321
- Codificante 352 203 TCAGTAAATGTGCTCCAGTA 437
- 356322
- Codificante 352 208 CCGTGTCAGTAAAT GTGCTC 438
- 356323
- Codificante 352 213 GGAGACCGTGTCAGTAAATG 439
- 356324
- Codificante 352 218 AGGCTGGAGACCGTGTCAGT 440
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- ISIS N°
- REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID N° SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.°
- 356325
- Codificante 352 223 CCCAGAGGCTGGAGACCGTG 441
- 356326
- Codificante 352 228 AGAATCCCAGAGGCTGGAGA 442
- 356327
- Codón detención de 352 274 AGAGGTCTCAAGGCTCAGTA 443
- 356328
- Codón detención de 352 279 AACGTAGAGGTCTCAAGGCT 444
- 356329
- Codón detención de 352 284 TTTGGAACGTAGAGGTCTCA 445
- 356330
- 3' UTR 352 289 GCACATTTGGAACGTAGAGG 446
- 356331
- 3' UTR 352 294 CACAAGCACATTTGGAACGT 447
- 356332
- 3' UTR 352 299 GGACACACAAGCACATTTGG 448
- 356333
- 3' UTR 352 304 AGGATGGACACACAAGCACA 449
- 356334
- 3' UTR 352 309 CCAGCAGGATGGACACACAA 450
- 356335
- 3' UTR 352 314 AGAGGCCAGCAGGATGGACA 451
- 356336
- 3' UTR 352 319 GGCCCAGAGGCCAGCAGGAT 452
- 356337
- 3' UTR 352 324 ACCCAGGCCCAGAGGCCAGC 453
- 356338
- 3' UTR 352 329 GGGCCACCCAGGCCCAGAGG 454
- 356339
- 3' UTR 352 353 CTTTCCCTTTCAAACAACCT 455
- 356340
- 3' UTR 352 358 CAATARTTTCCCTTTCAAAC 456
- 356341
- 3' UTR 352 363 CATGACAATACTTTCCCTTT 457
- 356342
- 3' UTR 352 368 GAAAACATGACAATACTTTC 458
- 356343
- 3' UTR 352 373 GGGATGAAAACATGACAATA 459
- 356344
- 3' UTR 352 396 CATGTTTAGGTGACTTCTGG 460
- 356345
- 3' UTR 352 401 GACAGCATGTTTAGGTGACT 461
- 356346
- 3' UTR 352 406 TTTAGGACAGCATGTTTAGG 462
- 356347
- 3' UTR 352 411 CTTTATTTAGGACAGCATGT 463
- 356348
- 3' UTR 352 416 TCCAGCTTTATTTAGGACAG 464
Ejemplo 40: Inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de hámster mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2'-MOE y un hueco desoxi. Estudios de respuesta a la dosis en hepatocitos de hámster primarios
Se seleccionaron seis oligonudeótidos dirigidos a apolipoproteína C-III de hámster para los estudios de respuesta a la dosis adicionales. Los hepatocitos de hámster primarios se trataron con una concentración 50, 150 y 300 nM de ISIS 352939 (SEC ID N°: 369), ISIS 352952 (SEC ID N°: 380), ISIS 352962 (SEC ID N°: 389), ISIS 352963 (SEC ID N°: 390), ISIS 352971 (SEC ID N°: 397) o ISIS 352977 (SEC ID N°: 403) y se midieron los niveles de ARNm 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al que se normalizaron los datos. Los resultados de estos estudios se muestran en la tabla 20. Los datos se promediaron a partir de tres experimentos y se expresaron como porcentaje de inhibición con relación a los controles no tratados.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 20 - Inhibición antisentido de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hepatocitos de hámster primarios 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos
- Dosis de oligonucleótidos
- ISIS N°
- SEC ID N.° 50 nM 150 nM 300 nM
- % de inhibición
- 352939
- 369 46 64 82
- 352952
- 380 59 68 60
- 352962
- 389 84 0 22
- 352963
- 390 0 0 42
- 352971
- 397 0 27 0
- 352977
- 403 48 72 56
Tal como se muestra en la tabla 20, ISIS 352939 fue eficaz en reducir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster de un modo dependiente de la dosis.
Ejemplo 41: Oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de ratón
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de ratón usando informacion de secuencia publicada (número de acceso del GenBank L04150.1, incorporada al presente documento como SEC ID N°: 11). Ambos están dirigidos a la posición del nucleótido 496 de SEC ID N°: 11), tal como hace ISIS 167880 (SEC ID N°: 117), pero varían en la composición química con relación a ISIS 167880. ISIS 340995 tiene 20 nucleótidos de longitud, está compuestos por una región hueco central de 10 nucleótidos de longitud, mientras que el hueco contiene tanto 2' desoxinucleótidos como 2'-MOE (MOE) nucleótidos. La composición de los nucleótidos se muestra en el tabla 21, en la que los 2'-MOE nucleótidos se indican en negrita y los 2' desoxinucleótidos están subrayados. El hueco está flanqueado por ambos lados (extremos 5' y 3') por “flancos” de 5 nucleótidos compuestos por 2'-MOE nucleótidos. ISIS 340997 (SEC ID N°: 117) tiene 20 nucleótidos de longitud y está compuesto uniformemente por 2'- MOE nucleótidos. A lo largo de ISIS 340995 y de ISIS 340997, las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato y todos los restos de citidinas son citidinas no modificadas.
Tabla 21 - Oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de ratón
- ISISNO
- Región SECUENCIA DIANA SEC ID N° Sitio diana SECUENCIA SEC ID N.°
- 340995
- 3' UTR 11 496 TCTTATCCAGCTTT ATTAGG 117
- 340997
- 3' UTR 11 496 TCTTATCCAGCTTTATTAGG 117
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Isis Pharmaceuticals Inc.
<120> MODULACION DE EXPRESION DE APOLIPOPROTEINA C-III
<130> P067021EP
<150> US 10/418,780 <151> 2003-04-16
<160> 469
<210> 1 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<223> Oligonucleótido Antisentido <400> 1
tccgtcatcg ctcctcaggg 20
<210>2 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido <400>2
gtgcgcgcga gcccgaaatc 20
<210>3 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido <400>3
atgcattctg cccccaagga 20
<210>4 <211> 3958 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 4
ctactccagg
tgaaaggctg
agcctctccc
agttcctgag
ctgtgttcag
agatgggccc
tggggagcca
ctcatctggg
ggcttggggc
gaggcccctg
gtcagctagg
ctgcagggct
tggtggaggg
gcctatgtcc
aaggaatgag
ggcgggacag
- aggggcctga
- aattccagtg 60
- aagccatttc
- ccctctcacc 120
- ggctccccag
- gcccaccccc 180
- cagcgtggac
- tcagtctcct 240
Claims (11)
- 5101520253035404550556065Reivindicaciones1. Un compuesto de 15 a 30 bases nitrogenadas de longitud dirigidas a:(a) un intrón;(b) una unión intrón-exón; o(c) una unión exón-intrónde una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III e inhibe la expresión de la apolipoproteína C-III, en el que dicho compuesto es al menos un 90% complementario a dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, para su uso en terapia.
- 2. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es un oligonucleótido antisentido.
- 3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el compuesto tiene una secuencia que es al menos un 90% complementaria a la molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III humana.
- 4. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el compuesto tiene una secuencia que es al menos un 95% co es 100% omplementaria a la molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III humana.
- 5. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III humana que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 18.
- 6. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que tiene al menos una unión entre nucleósidos, resto de azúcar o base nitrogenada modificada.
- 7. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, que tiene al menos un resto de azúcar 2'-O- metoxietílico, unión entre nucleósidos de fosforotioato o 5-metilcitosina.
- 8. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho compuesto es un oligonucleótido antisentido quimérico.
- 9. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido quimérico es de 20 nucleótidos de longitud, comprendiendo diez 2'-desoxinucleótidos flanqueados en cada lado por cinco nucleótidos 2'- metoxietílicos, en el que los enlaces entre nucleósidos son fosforotioato y todos los restos de citosina son 5- metilcitosinas.
- 10. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con la apolipoproteína C-III en un animal, en el que:(i) la enfermedad o afección implica metabolismo de lípidos anormal;(ii) la enfermedad o afección implica metabolismo de colesterol anormal;(iii) la enfermedad o afección es aterosclerosis;(iv) la enfermedad o afección una afección metabólica anormal;(v) la enfermedad o afección es hiperlipidemia;(vi) la enfermedad o afección es hipertrigliceridemia;(vii) la enfermedad o afección es diabetes;(viii) la enfermedad o afección es obesidad; o(ix) la enfermedad o afección es enfermedad cardiovascular.
- 11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en terapia.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US418780 | 2003-04-16 | ||
US10/418,780 US7598227B2 (en) | 2003-04-16 | 2003-04-16 | Modulation of apolipoprotein C-III expression |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2666405T3 true ES2666405T3 (es) | 2018-05-04 |
Family
ID=33159181
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04749914T Expired - Lifetime ES2373101T3 (es) | 2003-04-16 | 2004-04-15 | Modulación de la expresión de apolipoproteína c-iii. |
ES11185507.8T Expired - Lifetime ES2558949T3 (es) | 2003-04-16 | 2004-04-15 | Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III |
ES15189401.1T Expired - Lifetime ES2666405T3 (es) | 2003-04-16 | 2004-04-15 | Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04749914T Expired - Lifetime ES2373101T3 (es) | 2003-04-16 | 2004-04-15 | Modulación de la expresión de apolipoproteína c-iii. |
ES11185507.8T Expired - Lifetime ES2558949T3 (es) | 2003-04-16 | 2004-04-15 | Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US7598227B2 (es) |
EP (4) | EP3412284A1 (es) |
AT (1) | ATE529103T1 (es) |
AU (2) | AU2004231550B2 (es) |
CA (2) | CA2522560C (es) |
CY (1) | CY1117030T1 (es) |
DK (2) | DK1622597T3 (es) |
ES (3) | ES2373101T3 (es) |
HK (1) | HK1169609A1 (es) |
HU (1) | HUE027411T2 (es) |
PL (1) | PL2441449T3 (es) |
PT (1) | PT2441449E (es) |
SI (1) | SI2441449T1 (es) |
WO (1) | WO2004093783A2 (es) |
Families Citing this family (139)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9181551B2 (en) | 2002-02-20 | 2015-11-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US9657294B2 (en) | 2002-02-20 | 2017-05-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
US7511131B2 (en) | 2002-11-13 | 2009-03-31 | Genzyme Corporation | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
US20060009410A1 (en) * | 2002-11-13 | 2006-01-12 | Crooke Rosanne M | Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals |
WO2004085996A2 (en) | 2003-03-20 | 2004-10-07 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Biomarkers for longevity and disease and uses thereof |
US7598227B2 (en) * | 2003-04-16 | 2009-10-06 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of apolipoprotein C-III expression |
US9062306B2 (en) * | 2003-04-29 | 2015-06-23 | Biocrine Ab | Methods for identifying compounds for treating type 1 diabetes |
US20050287558A1 (en) | 2004-05-05 | 2005-12-29 | Crooke Rosanne M | SNPs of apolipoprotein B and modulation of their expression |
EP1976567B1 (en) | 2005-12-28 | 2020-05-13 | The Scripps Research Institute | Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets |
CA3044969A1 (en) * | 2006-05-05 | 2007-12-21 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating gene expression |
WO2008118883A1 (en) | 2007-03-24 | 2008-10-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Administering antisense oligonucleotides complementary to human apolipoprotein b |
US9764057B2 (en) | 2007-06-06 | 2017-09-19 | Innotere Gmbh | Hydraulic cement-based implant material and use thereof |
JP5924834B2 (ja) | 2008-09-02 | 2016-05-25 | アマリン ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド | エイコサペンタエン酸およびニコチン酸を含む製薬組成物ならびにこの製薬組成物を用いる方法 |
US8153606B2 (en) | 2008-10-03 | 2012-04-10 | Opko Curna, Llc | Treatment of apolipoprotein-A1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to apolipoprotein-A1 |
ES2616051T3 (es) | 2008-12-02 | 2017-06-09 | Wave Life Sciences Japan, Inc. | Método para la síntesis de ácidos nucleicos modificados en el átomo de fósforo |
RU2746478C2 (ru) | 2008-12-04 | 2021-04-14 | КьюРНА, Инк. | Лечение связанных с геном-супрессором опухолей заболеваний посредством ингибирования природного транскрипта в антисмысловой ориентации относительно этого гена |
WO2010065671A2 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Curna, Inc. | Treatment of vascular endothelial growth factor (vegf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to vegf |
CN102317458B (zh) | 2008-12-04 | 2018-01-02 | 库尔纳公司 | 通过红细胞生成素(epo)天然反义转录物的抑制对epo相关疾病的治疗 |
WO2010083615A1 (en) * | 2009-01-26 | 2010-07-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein c-iii expression |
PT2396038E (pt) | 2009-02-12 | 2016-02-19 | Curna Inc | Tratamento das doenças associadas com o factor neurotrófico derivado do cérebro (bdnf) por inibição do produto antisenso natural da transcrição para bdnf |
ES2656290T3 (es) | 2009-03-16 | 2018-02-26 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor nuclear (derivado de eritroide 2) similar al 2 (NRF2) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a NRF2 |
WO2010107838A1 (en) | 2009-03-16 | 2010-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Targeting apolipoprotein b for the reduction of apolipoprotein c-iii |
EP2408920B1 (en) | 2009-03-17 | 2017-03-08 | CuRNA, Inc. | Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1 |
CN102458109B (zh) | 2009-04-29 | 2015-02-11 | 阿马里纳制药公司 | 稳定的药物组合物和使用其的方法 |
RU2624506C2 (ru) | 2009-04-29 | 2017-07-04 | АМАРИН КОРПОРЕЙШН ПиЭлСи | Фармацевтические композиции, содержащие ера и сердечно-сосудистое средство, и способы их применения |
CN103223177B (zh) | 2009-05-06 | 2016-08-10 | 库尔纳公司 | 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病 |
KR101722541B1 (ko) | 2009-05-06 | 2017-04-04 | 큐알엔에이, 인크. | Ttp에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료 |
US9012139B2 (en) | 2009-05-08 | 2015-04-21 | Curna, Inc. | Treatment of dystrophin family related diseases by inhibition of natural antisense transcript to DMD family |
CA2762369C (en) | 2009-05-18 | 2021-12-28 | Joseph Collard | Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor |
EP2432882B1 (en) | 2009-05-22 | 2019-12-25 | CuRNA, Inc. | TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3 |
CA2764683A1 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Joseph Collard | Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene |
PT2443246T (pt) | 2009-06-15 | 2018-03-14 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Composições e métodos para reduzir os triglicéridos sem aumentar os níveis de ldl-c num indivíduo em terapia de estatinas concomitante |
EP2443237B1 (en) | 2009-06-16 | 2017-02-22 | CuRNA, Inc. | Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene |
JP6128846B2 (ja) | 2009-06-16 | 2017-05-17 | クルナ・インコーポレーテッド | パラオキソナーゼ(pon1)に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるpon1遺伝子関連疾患の治療 |
CN102597238B (zh) | 2009-06-24 | 2016-06-29 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对肿瘤坏死因子受体2(tnfr2)的天然反义转录物来治疗tnfr2相关的疾病 |
CN102482672B (zh) | 2009-06-26 | 2016-11-09 | 库尔纳公司 | 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病 |
US9744183B2 (en) | 2009-07-06 | 2017-08-29 | Wave Life Sciences Ltd. | Nucleic acid prodrugs and methods of use thereof |
CA2768947C (en) | 2009-07-24 | 2018-06-19 | Opko Curna, Llc | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
CN102762731B (zh) | 2009-08-05 | 2018-06-22 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对胰岛素基因(ins)的天然反义转录物来治疗胰岛素基因(ins)相关的疾病 |
KR101827015B1 (ko) | 2009-08-11 | 2018-02-07 | 큐알엔에이, 인크. | 아디포넥틴(adipoq)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(adipoq) 관련된 질환의 치료 |
EP2982755B1 (en) | 2009-08-21 | 2020-10-07 | CuRNA, Inc. | Treatment of 'c terminus of hsp70-interacting protein' (chip) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to chip |
JP5964232B2 (ja) | 2009-08-25 | 2016-08-03 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | ‘iqモチーフ含有gtpアーゼ活性化タンパク質’(iqgap)に対する天然アンチセンス転写産物の阻害によるiqgap関連疾患の治療 |
BR122019016628B8 (pt) | 2009-09-23 | 2021-07-27 | Amarin Corp Plc | uso de uma composição compreendendo um derivado de hidróxi de atorvastatina ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um óleo compreendendo etil eicosapentaenoato ou etil docosahexaenoato para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença cardiovascular |
WO2011038210A2 (en) | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Curna, Inc. | Treatment of filaggrin (flg) related diseases by modulation of flg expression and activity |
KR101823702B1 (ko) | 2009-12-16 | 2018-01-30 | 큐알엔에이, 인크. | 막 결합 전사 인자 펩티다제, 부위 1(mbtps1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 mbtps1 관련 질환의 치료 |
US8940708B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-01-27 | Curna, Inc. | Treatment of hepatocyte growth factor (HGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HGF |
JP6031356B2 (ja) | 2009-12-23 | 2016-11-24 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | Ucp2に対する天然アンチセンス転写産物の阻害による脱共役タンパク質2(ucp2)関連疾患の治療 |
CA2785177C (en) | 2009-12-29 | 2019-09-24 | Curna, Inc. | Treatment of tumor protein 63 (p63) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to p63 |
CN102782134B (zh) | 2009-12-29 | 2017-11-24 | 库尔纳公司 | 通过抑制核呼吸因子1(nrf1)的天然反义转录物而治疗nrf1相关疾病 |
JP6083735B2 (ja) | 2009-12-31 | 2017-02-22 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | インスリン受容体基質2(irs2)および転写因子3(tfe3)に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるインスリン受容体基質2(irs2)関連疾患の治療 |
WO2011082409A2 (en) | 2010-01-04 | 2011-07-07 | Curna, Inc. | Treatment of interferon regulatory factor 8 (irf8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irf8 |
WO2011085066A2 (en) | 2010-01-06 | 2011-07-14 | Curna, Inc. | Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene |
EP2524039B1 (en) | 2010-01-11 | 2017-11-29 | CuRNA, Inc. | Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg |
RU2611192C2 (ru) | 2010-01-25 | 2017-02-21 | Курна, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РНКазой Н1, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К РНКазе Н1 |
US8962586B2 (en) | 2010-02-22 | 2015-02-24 | Curna, Inc. | Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (PYCR1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PYCR1 |
CA2795145C (en) | 2010-04-02 | 2019-01-22 | Curna, Inc. | Treatment of colony-stimulating factor 3 (csf3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to csf3 |
TWI644675B (zh) | 2010-04-09 | 2018-12-21 | 可娜公司 | 藉由抑制纖維母細胞生長因子21(fgf21)之天然反義轉錄物以治療fgf21相關疾病 |
KR101915115B1 (ko) | 2010-05-03 | 2018-11-05 | 큐알엔에이, 인크. | 시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료 |
TWI531370B (zh) | 2010-05-14 | 2016-05-01 | 可娜公司 | 藉由抑制par4天然反股轉錄本治療par4相關疾病 |
US8895528B2 (en) | 2010-05-26 | 2014-11-25 | Curna, Inc. | Treatment of atonal homolog 1 (ATOH1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ATOH1 |
CN102971423B (zh) | 2010-05-26 | 2018-01-26 | 库尔纳公司 | 通过抑制蛋氨酸硫氧化物还原酶a(msra)的天然反义转录物而治疗msra相关疾病 |
PT2585596T (pt) | 2010-06-23 | 2021-03-23 | Curna Inc | Tratamento de doenças relacionadas com a subunidade alfa de canais de sódio dependentes de voltagem (scna) por inibição da transcrição antissentido natural para scna |
US8980860B2 (en) | 2010-07-14 | 2015-03-17 | Curna, Inc. | Treatment of discs large homolog (DLG) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to DLG |
AU2011282217B2 (en) * | 2010-07-19 | 2015-12-03 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) expression |
JP5868324B2 (ja) | 2010-09-24 | 2016-02-24 | 株式会社Wave Life Sciences Japan | 不斉補助基 |
CN103210086B (zh) | 2010-10-06 | 2017-06-09 | 库尔纳公司 | 通过抑制唾液酸酶4(neu4)的天然反义转录物而治疗neu4相关疾病 |
EP2630241B1 (en) | 2010-10-22 | 2018-10-17 | CuRNA, Inc. | Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua |
AU2011329777B2 (en) * | 2010-11-17 | 2016-06-09 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of alpha synuclein expression |
WO2012068340A2 (en) | 2010-11-18 | 2012-05-24 | Opko Curna Llc | Antagonat compositions and methods of use |
KR102010598B1 (ko) | 2010-11-23 | 2019-08-13 | 큐알엔에이, 인크. | Nanog에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 nanog 관련된 질환의 치료 |
US11712429B2 (en) | 2010-11-29 | 2023-08-01 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Low eructation composition and methods for treating and/or preventing cardiovascular disease in a subject with fish allergy/hypersensitivity |
NZ744990A (en) | 2010-11-29 | 2019-10-25 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Low eructation composition and methods for treating and/or preventing cardiovascular disease in a subject with fish allergy/hypersensitivity |
CA2834232A1 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of apolipoprotein ciii (apociii) expression |
CA2838588C (en) | 2011-06-09 | 2021-09-14 | Curna, Inc. | Treatment of frataxin (fxn) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fxn |
EP2723351B1 (en) | 2011-06-21 | 2018-02-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibition of expression of protein c (proc) genes |
EP2723756B1 (en) | 2011-06-21 | 2020-03-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibition of expression of apolipoprotein c-iii (apoc3) genes |
SG10201700554VA (en) | 2011-07-19 | 2017-03-30 | Wave Life Sciences Pte Ltd | Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids |
KR101355394B1 (ko) * | 2011-08-03 | 2014-01-29 | 서울대학교산학협력단 | 임신성 당뇨 조기 진단 정보를 제공하는 방법 및 임신성 당뇨 조기 진단 정보를 제공하는데 사용되는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트 |
MX365525B (es) | 2011-09-06 | 2019-06-06 | Curna Inc | Compuestos que regulan la expresión de subunidades alfa de canales de sodio regulados por voltaje en enfermedades relacionadas con epilepsia mioclónica severa de la infancia. |
US11291643B2 (en) | 2011-11-07 | 2022-04-05 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of treating hypertriglyceridemia |
EP2775837A4 (en) | 2011-11-07 | 2015-10-28 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | METHODS OF TREATING HYPERTRIGLYCERIDEMIA |
HUE038570T2 (hu) | 2011-11-14 | 2018-10-29 | Regeneron Pharma | Készítmények és eljárások izomtömeg és izomerõ növelésére GDF8 és/vagy aktivin A specifikus antagonizálásával |
WO2013089157A1 (ja) | 2011-12-12 | 2013-06-20 | 国立大学法人大阪大学 | オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する高脂血症治療剤 |
JP6307442B2 (ja) | 2012-01-06 | 2018-04-04 | アマリン ファーマシューティカルス アイルランド リミテッド | 対象の高感度(hs−crp)のレベルを低下させる組成物および方法 |
KR20140136488A (ko) | 2012-03-15 | 2014-11-28 | 큐알엔에이, 인크. | 뇌 유래 신경영양 인자(bdnf)에 대한 천연 안티센스 전사체의 저해에 의한 뇌 유래 신경영양 인자(bdnf)관련 질환의 치료 |
KR20150036252A (ko) | 2012-06-29 | 2015-04-07 | 애머린 파마슈티칼스 아일랜드 리미티드 | 스타틴 요법 중인 대상체에서 심혈관 사건의 위험을 감소시키는 방법 |
WO2014010718A1 (ja) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | 株式会社新日本科学 | キラル核酸アジュバント |
CA2878945A1 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Wave Life Sciences Pte. Ltd. | Chiral control |
AU2013288048A1 (en) | 2012-07-13 | 2015-01-22 | Wave Life Sciences Ltd. | Asymmetric auxiliary group |
US20150265566A1 (en) | 2012-11-06 | 2015-09-24 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and Methods for Lowering Triglycerides without Raising LDL-C Levels in a Subject on Concomitant Statin Therapy |
US9814733B2 (en) | 2012-12-31 | 2017-11-14 | A,arin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions comprising EPA and obeticholic acid and methods of use thereof |
US20140187633A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of treating or preventing nonalcoholic steatohepatitis and/or primary biliary cirrhosis |
US9452151B2 (en) | 2013-02-06 | 2016-09-27 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of reducing apolipoprotein C-III |
US9624492B2 (en) | 2013-02-13 | 2017-04-18 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions comprising eicosapentaenoic acid and mipomersen and methods of use thereof |
AU2014216137B2 (en) * | 2013-02-14 | 2018-05-10 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of Apolipoprotein C-III (ApoCIII) expression in lipoprotein lipase deficient (LPLD) populations |
US9662307B2 (en) | 2013-02-19 | 2017-05-30 | The Regents Of The University Of Colorado | Compositions comprising eicosapentaenoic acid and a hydroxyl compound and methods of use thereof |
US9283201B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-03-15 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for treating or preventing obesity in a subject in need thereof |
US20140271841A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Pharmaceutical composition comprising eicosapentaenoic acid and derivatives thereof and a statin |
EP3633039A1 (en) | 2013-05-01 | 2020-04-08 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods |
US10966968B2 (en) | 2013-06-06 | 2021-04-06 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Co-administration of rosiglitazone and eicosapentaenoic acid or a derivative thereof |
EP3656386A1 (en) | 2013-06-21 | 2020-05-27 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating apolipoprotein c-iii expression for improving a diabetic profile |
JP6694382B2 (ja) | 2013-06-21 | 2020-05-13 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッドIonis Pharmaceuticals,Inc. | 標的核酸を調節するための組成物および方法 |
US20150045431A1 (en) * | 2013-08-06 | 2015-02-12 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of treating a cardiovascular disorder in a subject on apo-c3 modulating therapy |
TW201536329A (zh) | 2013-08-09 | 2015-10-01 | Isis Pharmaceuticals Inc | 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法 |
US20150065572A1 (en) | 2013-09-04 | 2015-03-05 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of treating or preventing prostate cancer |
US9585859B2 (en) | 2013-10-10 | 2017-03-07 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for lowering triglycerides without raising LDL-C levels in a subject on concomitant statin therapy |
HUE052243T2 (hu) * | 2013-12-24 | 2021-04-28 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Az angiopoietin-szerû 3 expressziójának modulációja |
WO2015108047A1 (ja) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 株式会社新日本科学 | 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤 |
JPWO2015108048A1 (ja) | 2014-01-15 | 2017-03-23 | 株式会社新日本科学 | 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤 |
US10322173B2 (en) | 2014-01-15 | 2019-06-18 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent |
KR20220106232A (ko) | 2014-01-16 | 2022-07-28 | 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 | 키랄 디자인 |
CN106255755B (zh) | 2014-05-01 | 2020-07-24 | Ionis制药公司 | 用于调节血管生成素样蛋白3表达的组合物和方法 |
WO2015179693A1 (en) | 2014-05-22 | 2015-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated antisense compounds and their use |
US10561631B2 (en) | 2014-06-11 | 2020-02-18 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of reducing RLP-C |
WO2015195662A1 (en) | 2014-06-16 | 2015-12-23 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of reducing or preventing oxidation of small dense ldl or membrane polyunsaturated fatty acids |
CN113846101A (zh) * | 2014-11-17 | 2021-12-28 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 载脂蛋白C3(APOC3)iRNA组合物及其使用方法 |
BR112017015307A2 (pt) * | 2015-02-27 | 2018-01-16 | Ionis Pharmaceuticals Inc | modulação de expressão de apolipoproteína c-iii (apociii) em populações de lipodistrofia |
TW201713690A (zh) | 2015-08-07 | 2017-04-16 | 再生元醫藥公司 | 抗angptl8抗體及其用途 |
WO2017055627A1 (en) * | 2015-10-02 | 2017-04-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Apoc3 mutations for the diagnosis and therapy of hereditary renal amyloidosis disease |
WO2017062862A2 (en) | 2015-10-09 | 2017-04-13 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods thereof |
EP4119569A1 (en) | 2015-11-06 | 2023-01-18 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated antisense compounds for use in therapy |
JP2018531605A (ja) | 2015-11-06 | 2018-11-01 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッドIonis Pharmaceuticals,Inc. | アポリポタンパク質(a)発現の調節 |
US10406130B2 (en) | 2016-03-15 | 2019-09-10 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Methods of reducing or preventing oxidation of small dense LDL or membrane polyunsaturated fatty acids |
EP3522898A4 (en) | 2016-10-06 | 2020-05-27 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | METHOD FOR CONJUGATING OLIGOMERIC COMPOUNDS |
EP3541839A1 (en) | 2016-11-17 | 2019-09-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating obesity with anti-angptl8 antibodies |
CN110177544A (zh) | 2016-11-29 | 2019-08-27 | 普尔泰克健康有限公司 | 用于递送治疗剂的外泌体 |
WO2018104499A1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-14 | Juntti Berggren Lisa | Methods for treating and limiting development of obesity and fatty liver disorders |
US10966951B2 (en) | 2017-05-19 | 2021-04-06 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for lowering triglycerides in a subject having reduced kidney function |
JP2020522510A (ja) | 2017-06-02 | 2020-07-30 | ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドWave Life Sciences Ltd. | オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法 |
SG11201912178VA (en) * | 2017-09-11 | 2020-01-30 | Arrowhead Pharmaceuticals Inc | Rnai agents and compositions for inhibiting expression of apolipoprotein c-iii (apoc3) |
TWI809004B (zh) | 2017-11-09 | 2023-07-21 | 美商Ionis製藥公司 | 用於降低snca表現之化合物及方法 |
SG11202006526YA (en) | 2018-01-12 | 2020-08-28 | Bristol Myers Squibb Co | Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof |
CN111787981A (zh) | 2018-03-01 | 2020-10-16 | 瑞泽恩制药公司 | 改变身体组成的方法 |
US11058661B2 (en) | 2018-03-02 | 2021-07-13 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for lowering triglycerides in a subject on concomitant statin therapy and having hsCRP levels of at least about 2 mg/L |
SG11202102872QA (en) | 2018-09-24 | 2021-04-29 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Methods of reducing the risk of cardiovascular events in a subject |
WO2021167841A1 (en) | 2020-02-18 | 2021-08-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof |
US20230113556A1 (en) | 2020-03-26 | 2023-04-13 | National Cerebral And Cardiovascular Center | Antisense nucleic acid targeting apoc3 |
JP2023543898A (ja) * | 2020-10-02 | 2023-10-18 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド | Apociii発現を減少させるための方法 |
WO2023034870A2 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for reducing dmpk expression |
Family Cites Families (218)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4534899A (en) | 1981-07-20 | 1985-08-13 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US4426330A (en) | 1981-07-20 | 1984-01-17 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
US4476301A (en) | 1982-04-29 | 1984-10-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon |
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US4824941A (en) | 1983-03-10 | 1989-04-25 | Julian Gordon | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5118800A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
US5118802A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside |
US5550111A (en) | 1984-07-11 | 1996-08-27 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof |
FR2567892B1 (fr) | 1984-07-19 | 1989-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons |
US5367066A (en) | 1984-10-16 | 1994-11-22 | Chiron Corporation | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
US5258506A (en) | 1984-10-16 | 1993-11-02 | Chiron Corporation | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains |
US4828979A (en) | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
FR2575751B1 (fr) | 1985-01-08 | 1987-04-03 | Pasteur Institut | Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques |
US5405938A (en) | 1989-12-20 | 1995-04-11 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US4762779A (en) | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US5317098A (en) | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
JPS638396A (ja) | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体 |
EP0260032B1 (en) | 1986-09-08 | 1994-01-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
ATE113059T1 (de) | 1987-06-24 | 1994-11-15 | Florey Howard Inst | Nukleosid-derivate. |
US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US4924624A (en) | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
US5188897A (en) | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
US5525465A (en) | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
DE3738460A1 (de) | 1987-11-12 | 1989-05-24 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierte oligonukleotide |
EP0348458B1 (en) | 1987-11-30 | 1997-04-09 | University Of Iowa Research Foundation | Dna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes |
US5403711A (en) | 1987-11-30 | 1995-04-04 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
US5082830A (en) | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
JPH03503894A (ja) | 1988-03-25 | 1991-08-29 | ユニバーシィティ オブ バージニア アランミ パテンツ ファウンデイション | オリゴヌクレオチド n‐アルキルホスホラミデート |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5175273A (en) | 1988-07-01 | 1992-12-29 | Genentech, Inc. | Nucleic acid intercalating agents |
US5262536A (en) | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
US5194599A (en) | 1988-09-23 | 1993-03-16 | Gilead Sciences, Inc. | Hydrogen phosphonodithioate compositions |
US5512439A (en) | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
US5599923A (en) | 1989-03-06 | 1997-02-04 | Board Of Regents, University Of Tx | Texaphyrin metal complexes having improved functionalization |
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
US5108921A (en) | 1989-04-03 | 1992-04-28 | Purdue Research Foundation | Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US5256775A (en) | 1989-06-05 | 1993-10-26 | Gilead Sciences, Inc. | Exonuclease-resistant oligonucleotides |
US4958013A (en) | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5227170A (en) | 1989-06-22 | 1993-07-13 | Vestar, Inc. | Encapsulation process |
US5451463A (en) | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5591722A (en) | 1989-09-15 | 1997-01-07 | Southern Research Institute | 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity |
US5356633A (en) | 1989-10-20 | 1994-10-18 | Liposome Technology, Inc. | Method of treatment of inflamed tissues |
US5527528A (en) | 1989-10-20 | 1996-06-18 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Solid-tumor treatment method |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
US5721218A (en) | 1989-10-23 | 1998-02-24 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides with inverted polarity |
ATE269870T1 (de) | 1989-10-24 | 2004-07-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | 2'-modifizierte oligonukleotide |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5264562A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5292873A (en) | 1989-11-29 | 1994-03-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
US5130302A (en) | 1989-12-20 | 1992-07-14 | Boron Bilogicals, Inc. | Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same |
US5580575A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
US5469854A (en) | 1989-12-22 | 1995-11-28 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods of preparing gas-filled liposomes |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5646265A (en) | 1990-01-11 | 1997-07-08 | Isis Pharmceuticals, Inc. | Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites |
US5670633A (en) | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US5623065A (en) | 1990-08-13 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
US5681941A (en) | 1990-01-11 | 1997-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US5220007A (en) | 1990-02-15 | 1993-06-15 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides |
US5149797A (en) | 1990-02-15 | 1992-09-22 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides |
WO1991013080A1 (en) | 1990-02-20 | 1991-09-05 | Gilead Sciences, Inc. | Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers |
US5214136A (en) | 1990-02-20 | 1993-05-25 | Gilead Sciences, Inc. | Anthraquinone-derivatives oligonucleotides |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
GB9009980D0 (en) | 1990-05-03 | 1990-06-27 | Amersham Int Plc | Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides |
DK0455905T3 (da) | 1990-05-11 | 1998-12-07 | Microprobe Corp | Dipsticks til nukleinsyrehybridiseringsassays og fremgangsmåde til kovalent immobilisering af oligonukleotider |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5378825A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5386023A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-31 | Isis Pharmaceuticals | Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling |
EP0544824B1 (en) | 1990-07-27 | 1997-06-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5223618A (en) | 1990-08-13 | 1993-06-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5688941A (en) | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
PT98562B (pt) | 1990-08-03 | 1999-01-29 | Sanofi Sa | Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
US6852536B2 (en) * | 2001-12-18 | 2005-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of CD36L 1 expression |
US5177196A (en) | 1990-08-16 | 1993-01-05 | Microprobe Corporation | Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
WO1992005186A1 (en) | 1990-09-20 | 1992-04-02 | Gilead Sciences | Modified internucleoside linkages |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
ATE198598T1 (de) | 1990-11-08 | 2001-01-15 | Hybridon Inc | Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden |
US6582908B2 (en) | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
AU9146591A (en) * | 1990-12-10 | 1992-07-08 | Gilead Sciences, Inc. | Inhibition of transcription by formation of triple helixes |
CA2098838C (en) | 1990-12-21 | 2002-11-26 | Frances M. Sladek | Liver enriched transcription factor |
US5672697A (en) | 1991-02-08 | 1997-09-30 | Gilead Sciences, Inc. | Nucleoside 5'-methylene phosphonates |
JP3220180B2 (ja) | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | 薬剤含有タンパク質結合リポソーム |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5578444A (en) | 1991-06-27 | 1996-11-26 | Genelabs Technologies, Inc. | Sequence-directed DNA-binding molecules compositions and methods |
US5371241A (en) | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
US5877009A (en) * | 1991-08-16 | 1999-03-02 | Trustees Of Boston University | Isolated ApoA-I gene regulatory sequence elements |
NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
US5521291A (en) | 1991-09-30 | 1996-05-28 | Boehringer Ingelheim International, Gmbh | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
DE59208572D1 (de) | 1991-10-17 | 1997-07-10 | Ciba Geigy Ag | Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte |
US5594121A (en) | 1991-11-07 | 1997-01-14 | Gilead Sciences, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines |
TW393513B (en) | 1991-11-26 | 2000-06-11 | Isis Pharmaceuticals Inc | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines |
US5484908A (en) | 1991-11-26 | 1996-01-16 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines |
EP1256589A3 (en) | 1991-11-26 | 2003-09-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomers containing modified pyrimidines |
US5792608A (en) | 1991-12-12 | 1998-08-11 | Gilead Sciences, Inc. | Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use |
US5359044A (en) | 1991-12-13 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Cyclobutyl oligonucleotide surrogates |
US5700922A (en) | 1991-12-24 | 1997-12-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
US5565552A (en) | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
US5595726A (en) | 1992-01-21 | 1997-01-21 | Pharmacyclics, Inc. | Chromophore probe for detection of nucleic acid |
FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1994-10-28 | Centre Nat Rech Scient | Oligothionucleotides. |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US20030068301A1 (en) | 1992-05-14 | 2003-04-10 | Kenneth Draper | Method and reagent for inhibiting hepatitis B virus replication |
FR2692265B1 (fr) | 1992-05-25 | 1996-11-08 | Centre Nat Rech Scient | Composes biologiquement actifs de type phosphotriesters. |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
EP0577558A2 (de) | 1992-07-01 | 1994-01-05 | Ciba-Geigy Ag | Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte |
US5272250A (en) | 1992-07-10 | 1993-12-21 | Spielvogel Bernard F | Boronated phosphoramidate compounds |
US5652355A (en) | 1992-07-23 | 1997-07-29 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
EP0652890B1 (en) | 1992-07-27 | 1998-01-14 | HYBRIDON, Inc. | Oligonucleotide alkylphosphonothioates |
US5583020A (en) | 1992-11-24 | 1996-12-10 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
JP3351476B2 (ja) | 1993-01-22 | 2002-11-25 | 三菱化学株式会社 | リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム |
DE69400208T2 (de) | 1993-01-25 | 1996-11-28 | Hybridon Inc | Olionukleotidalkylphosphonate und -phosphonothioate |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
US5395619A (en) | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
GB9304620D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Compounds |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
WO1994022864A1 (en) | 1993-03-30 | 1994-10-13 | Sterling Winthrop Inc. | Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them |
HU9501974D0 (en) | 1993-03-31 | 1995-09-28 | Sterling Winthrop Inc | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
DE4311944A1 (de) | 1993-04-10 | 1994-10-13 | Degussa | Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen |
US5462854A (en) | 1993-04-19 | 1995-10-31 | Beckman Instruments, Inc. | Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes |
FR2705099B1 (fr) | 1993-05-12 | 1995-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation. |
US5534259A (en) | 1993-07-08 | 1996-07-09 | Liposome Technology, Inc. | Polymer compound and coated particle composition |
US5543158A (en) | 1993-07-23 | 1996-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable injectable nanoparticles |
US5417978A (en) | 1993-07-29 | 1995-05-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use |
US5502177A (en) | 1993-09-17 | 1996-03-26 | Gilead Sciences, Inc. | Pyrimidine derivatives for labeled binding partners |
US5801154A (en) * | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
US5457187A (en) | 1993-12-08 | 1995-10-10 | Board Of Regents University Of Nebraska | Oligonucleotides containing 5-fluorouracil |
US5446137B1 (en) | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
PT733059E (pt) | 1993-12-09 | 2001-03-30 | Univ Jefferson | Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas |
US5595756A (en) | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
US5646269A (en) | 1994-04-28 | 1997-07-08 | Gilead Sciences, Inc. | Method for oligonucleotide analog synthesis |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
US5543152A (en) | 1994-06-20 | 1996-08-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5597696A (en) | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
US5597909A (en) | 1994-08-25 | 1997-01-28 | Chiron Corporation | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use |
US5591721A (en) | 1994-10-25 | 1997-01-07 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
US5512295A (en) | 1994-11-10 | 1996-04-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery |
US5792747A (en) | 1995-01-24 | 1998-08-11 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone |
US5693773A (en) | 1995-06-07 | 1997-12-02 | Hybridon Incorporated | Triplex-forming antisense oligonucleotides having abasic linkers targeting nucleic acids comprising mixed sequences of purines and pyrimidines |
US5652356A (en) | 1995-08-17 | 1997-07-29 | Hybridon, Inc. | Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides |
IT1277025B1 (it) * | 1995-12-04 | 1997-11-04 | Cooperativa Centro Ricerche Po | Classe di oligonucleotidi fosfodiesterici ad attivita' citotossica composizioni farmaceutiche che li contengono e loro uso |
EP0856579A1 (en) | 1997-01-31 | 1998-08-05 | BIOGNOSTIK GESELLSCHAFT FÜR BIOMOLEKULARE DIAGNOSTIK mbH | An antisense oligonucleotide preparation method |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
DE69834038D1 (de) | 1997-07-01 | 2006-05-18 | Isis Pharmaceutical Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre |
JP4236812B2 (ja) | 1997-09-12 | 2009-03-11 | エクシコン エ/エス | オリゴヌクレオチド類似体 |
US6238921B1 (en) | 1998-03-26 | 2001-05-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression |
US20030228597A1 (en) | 1998-04-13 | 2003-12-11 | Cowsert Lex M. | Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation |
US6228642B1 (en) | 1998-10-05 | 2001-05-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-(α) (TNF-α) expression |
EP1156812A4 (en) | 1999-02-23 | 2004-09-29 | Isis Pharmaceuticals Inc | MULTIPARTICULAR FORMULATION |
US5998148A (en) * | 1999-04-08 | 1999-12-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression |
US20040006031A1 (en) | 2002-07-02 | 2004-01-08 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of HMG-CoA reductase expression |
US6020199A (en) * | 1999-07-21 | 2000-02-01 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of PTEN expression |
US6171860B1 (en) | 1999-11-05 | 2001-01-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of rank expression |
US6300132B1 (en) | 1999-12-17 | 2001-10-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of telomeric repeat binding factor 2 expression |
US6287860B1 (en) | 2000-01-20 | 2001-09-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of MEKK2 expression |
US6395544B1 (en) | 2000-10-11 | 2002-05-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of BCAS1 expression |
US6426220B1 (en) | 2000-10-30 | 2002-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of calreticulin expression |
US6440737B1 (en) | 2000-11-01 | 2002-08-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of cellular apoptosis susceptibility gene expression |
US6607916B2 (en) * | 2001-02-08 | 2003-08-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of Casein kinase 2-alpha expression |
WO2002085308A2 (en) | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense and anti-inflammatory based compositions to treat respiratory disorders |
US6893822B2 (en) | 2001-07-19 | 2005-05-17 | Nanogen Recognomics Gmbh | Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate |
US7407943B2 (en) | 2001-08-01 | 2008-08-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
US7227014B2 (en) * | 2001-08-07 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression |
US7507808B2 (en) | 2002-12-12 | 2009-03-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of endothelial lipase expression |
US7314750B2 (en) * | 2002-11-20 | 2008-01-01 | Affymetrix, Inc. | Addressable oligonucleotide array of the rat genome |
US7598227B2 (en) | 2003-04-16 | 2009-10-06 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of apolipoprotein C-III expression |
DE202005008426U1 (de) | 2005-05-31 | 2005-09-15 | Ricon Sieb Und Foerdertechnik | Fördervorrichtung mit Fördertuch |
US8935416B2 (en) | 2006-04-21 | 2015-01-13 | Fortinet, Inc. | Method, apparatus, signals and medium for enforcing compliance with a policy on a client computer |
US9209196B2 (en) | 2011-11-30 | 2015-12-08 | Sharp Kabushiki Kaisha | Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device |
US9400902B2 (en) | 2012-05-22 | 2016-07-26 | Trimble Navigation Limited | Multi-modal entity tracking and display |
-
2003
- 2003-04-16 US US10/418,780 patent/US7598227B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-04-15 WO PCT/US2004/010946 patent/WO2004093783A2/en active Application Filing
- 2004-04-15 ES ES04749914T patent/ES2373101T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-15 DK DK04749914.0T patent/DK1622597T3/da active
- 2004-04-15 DK DK11185507.8T patent/DK2441449T3/en active
- 2004-04-15 EP EP18162847.0A patent/EP3412284A1/en not_active Withdrawn
- 2004-04-15 HU HUE11185507A patent/HUE027411T2/hu unknown
- 2004-04-15 AU AU2004231550A patent/AU2004231550B2/en not_active Expired
- 2004-04-15 AT AT04749914T patent/ATE529103T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-04-15 EP EP04749914A patent/EP1622597B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-15 CA CA2522560A patent/CA2522560C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-15 EP EP15189401.1A patent/EP3002007B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-15 PT PT111855078T patent/PT2441449E/pt unknown
- 2004-04-15 CA CA2958943A patent/CA2958943A1/en not_active Abandoned
- 2004-04-15 SI SI200432281T patent/SI2441449T1/sl unknown
- 2004-04-15 PL PL11185507T patent/PL2441449T3/pl unknown
- 2004-04-15 ES ES11185507.8T patent/ES2558949T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-15 EP EP11185507.8A patent/EP2441449B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-15 US US10/553,722 patent/US7750141B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-15 ES ES15189401.1T patent/ES2666405T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-01-28 AU AU2010200324A patent/AU2010200324B2/en not_active Expired
- 2010-05-17 US US12/781,479 patent/US8530439B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-10-18 HK HK12110359.0A patent/HK1169609A1/zh unknown
-
2013
- 2013-08-07 US US13/961,646 patent/US9365848B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2015
- 2015-12-07 CY CY20151101109T patent/CY1117030T1/el unknown
-
2016
- 2016-04-29 US US15/143,222 patent/US9624496B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2017
- 2017-03-03 US US15/449,444 patent/US20170275620A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2666405T3 (es) | Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III | |
US7825235B2 (en) | Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression | |
US8158597B2 (en) | Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression | |
WO2004009024A2 (en) | Modulation of protein kinase c-iota expression | |
WO2004048522A2 (en) | Modulation of huntingtin interacting protein 2 expression | |
US20050048495A1 (en) | Isoform-specific targeting of splice variants | |
WO2004043398A2 (en) | Modulation of jumonji expression | |
US7700574B2 (en) | Modulation of RANKL expression | |
US20040137623A1 (en) | Delivery of oligonucleotide compounds into osteoclasts and modulation of osteoclast differentiation | |
AU2013231079A1 (en) | Modulation of apolipoprotein c-iii expression | |
WO2004043391A2 (en) | Modulation of mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11 expression | |
WO2004052301A2 (en) | Modulation of matrix metalloproteinase 11 expression | |
WO2004048523A2 (en) | Modulation of ku86 expression | |
WO2004054502A2 (en) | Modulation of tek expression |