ES2432357T3

ES2432357T3 - Anticuerpos enteramente humanos contra 4-1BB humano (CD137)

Info

Publication number: ES2432357T3
Application number: ES04794837T
Authority: ES
Inventors: Maria Jure-Kunkel; Laura J. Hefta; Marc Santoro; Subinay Ganguly; Edward L. Halk
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2004-10-12
Publication date: 2013-12-02
Anticipated expiration: 2024-10-12
Also published as: CA2542044C; BRPI0415195A; PT1670828E; DK1670828T3; US20190062445A1; EP1670828B1; IL174460A0; AU2004279877A1; GEP20094829B; IL174460A; NO20061394L; JP4616838B2; RU2376316C2; NO338685B1; US20160368998A1; US8137667B2; RU2006115835A; KR101119266B1; RS20060234A; PL1670828T3

Abstract

Un anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo que se uneespecíficamente a 4-1BB, que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadenapesada, en el que: 5 dicha región variable de cadena ligera comprende una CDR1 que consiste en los restos aminoacídicos 44-54 deSEC ID Nº: 6, una CDR2 que consiste en los restos aminoacídicos 70-76 de SEC ID Nº: 6, una CDR3 queconsiste en los restos aminoacídicos 109-119 de SEC ID Nº: 6; y dicha región variable de cadena pesada comprende una CDR1 que consiste en los restos aminoacídicos 50-54de SEC ID Nº: 3, una CDR2 que consiste en los restos aminoacídicos 69-84 de SEC ID Nº: 3 y una CDR3 queconsiste en los restos aminoacídicos 117-129 de SEC ID Nº: 3.

Description

Anticuerpos enteramente humanos contra 4-1BB humano (CD137)

Campo de la invención

La invención está dirigida a anticuerpos enteramente humanos y, más específicamente, a los anticuerpos enteramente humanos frente a 4-1BB humano (CD137).

Antecedentes de la invención

Un amplio cuerpo de evidencias ha demostrado de forma inequívoca que existe cierto grado de respuesta inmune contra el cáncer en seres humanos y en animales. En los pacientes de cáncer, los componentes celulares del sistema inmune son capaces de reconocer los antígenos expresados por las células tumorales, tales como diferenciación de antígenos oncofetales o productos génicos mutados (S. Rosenberg, Nature, 411: 380-4 (2001); P. van der Bruggen y col., Immunological Rev., 188: 51-64 (2002)). Un número de estudios clínicos ha mostrado que la infiltración de linfocitos en el tumor tiene un significado de pronóstico favorable (E. Halapi, Med. Oncol., 15(4): 20311 (1998); Y. Naito y col., Cancer Res., 58(16): 3491-4 (1998); L. Zhang y col., N.E. J. Med., 348(3): 203-13 (2003)). Además, el tratamiento con inmunomoduladores, tales como las citoquinas o productos bacterianos, vacunas contra el cáncer o inmunoterapia adoptiva ha llevado a la regresión del tumor en un némero de pacientes (S. Rosenberg, Cancer J. Sci. Am. 6(S): 2 (2000); P. Bassi, Surg. Oncol., 11(1-2): 77-83 (2002); S. Antonia y col., Current Opinion in Immunol., 16: 130-6 (2004)). A pesar de estas respuestas, la inmunidad contra el cáncer fracasa frecuentemente en la eliminación eficaz de las células tumorales. Las causas de este fracaso se pueden agrupar en tres categorías principales: (i) incapacidad de reconocimiento del tumor por parte de las células inmunes, bien por la expresión variable de los antígenos tumorales o por la expresión reducida del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (CMH); (ii) microentorno tumoral inmunosupresor, como resultado de la secreción de citoquinas inhibidoras por las células tumorales (por ejemplo, TGF-β); y (iii) inmunogenicidad tumoral escasa debido a la falta de expresión de moléculas coestimuladoras en las células tumorales, lo que da lugar a la incapacidad de las células tumorales de estimular eficazmente a las células T. Los avances en nuestra comprensión de las necesidades para el reconocimiento de los antígenos tumorales y la función efectora inmune indican que una estrategia potencial para aumentar una respuesta inmune antitumoral es proporcionar una coestimulación por medio de una molécula auxiliar. Las células T específicas contra los antígenos tumorales necesitan la coestimulación para iniciar y mantener las funciones efectoras. Por tanto, pueden aplicarse terapias que dirigen moléculas coestimuladoras para modular y mejorar la respuesta inmune contra los tumores.

El modelo actual de activación de las células T postula que las células T intactas necesitan dos señales para activarse plenamente: (i) una señal proporcionada a través de la unión de los antígenos procesados presentados al receptor de la célula T por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (CMH); y (ii) una señal adicional proporcionada por la interacción de moléculas coestimuladoras sobre la superficie de las células T y sus ligandos sobre las células presentadoras de antígeno. El reconocimiento de un antígeno por una célula T intacta es insuficiente por sí mismo para desencadenar la activación de la célula T. Sin una señal coestimuladora, las células T pueden eliminarse bien sea por muerte o por inducción de anergia. La señalización por medio de la molécula coestimuladora CD28 parece ser la clave para el inicio de las respuestas de la célula T. Sin embargo, la señalización de CD137 (4-1BB) ha demostrado ser primordial para el mantenimiento y la expansión de la respuesta inmune frente antígenos, así como también para la generación de la memoria de las células T.

CD137 (4-1BB) es un miembro de la familia génica del receptor de necrosis tumoral (TNF-R), que incluye proteínas que están implicadas en la regulación de la proliferación celular, la diferenciación y la muerte celular programada. CD137 es una glucoproteína de membrana de tipo I de 30 kDa que se expresa como un homodímero de 55 kDa. El receptor se describió inicialmente en ratones (B. Kwon y col., P.N.A.S. EE.UU., 86: 1963-7 (1989)) y más tarde se identificó en seres humanos (M. Alderson y col., Eur. J. Immunol., 24: 2219-27 (1994); Z. Zhou y col., Immunol. Lett.,

45: 67 (1995)) (Véanse también, las solicitudes PCT publicadas WO95/07984 y WO96/29348 y la Patente de Estados Unidos Nº 6.569.997, (Véase, SEC ID Nº: 2.)). Las formas humana y murina de CD137 son idénticas en el 60% a nivel de aminoácidos. Las secuencias conservadas aparecen en el dominio citoplasmático, así como otras 5 regiones de la molécula, lo que indica que estos restos pueden ser importantes para la función de la molécula de CD137 (Z. Zhou y col., Immunol. Lett., 45: 67 (1995)). La expresión de CD137 ha mostrado estar predominantemente en las células de linaje linfoide tales como las células T activadas, los linfocitos citolíticos naturales activados (NK), células NKT, células T reguladoras de CD4CD25 y también en timocitos activados y linfocitos intraepiteliales. Además, CD137 ha mostrado que se expresa en las células de origen mieloide como las células dendríticas, monocitos, neutrófilos y eosinófilos. Aunque la expresión de CD137 está limitada principalmente a las células inmunitarias/inflamatorias, existen informes que describen su expresión en células endoteliales asociadas con un pequeño número de tejidos de sitios inflamatorios y tumores.

Las actividades funcionales de CD137 en las células T se han caracterizado ampliamente. La señalización por medio de CD137 en presencia de dosis subóptimas de anti-CD3 ha mostrado que induce la proliferación de células T y la síntesis de citoquinas (principalmente IFN-!), e inhibe la muerte de las células activadas. Estos efectos se han observado en células T tanto humanas como murinas (W. Shuford y col., J. Exp. Med., 186(1): 47-55 (1997); D.

Vinay y col., Semin. Immunol., 10(6): 481-9 (1998); D. Laderach y col., Int. Immunol., 14(10): 1155-67 (2002)). Tanto en seres humanos como en ratones, la coestimulación aumenta las funciones efectoras, tales como la producción de IFN-! y la citotoxicidad, mediante el aumento del número de células T específicas de antígeno y efectoras CD8+. En ausencia de la señalización anti-CD3, la estimulación por medio de CD137 no altera la función de las células T, lo que indica que CD137 es una molécula coestimuladora.

Los acontecimientos fisiológicos que se observan a continuación de la estimulación de CD137 sobre las células T están mediados por señales de NF-∀B y PI3K/ERK1/2 con funciones fisiológicas separadas. Las señales de NF-∀B desencadenan la expresión de Bcl-XL, una molécula antiapoptótica, resultando así en un aumento de la supervivencia, mientras que las señales de PI3K y ERK1/2 son responsables específicamente de la progresión del ciclo celular mediado por CD137 (H. Lee y col., J. Immunol., 169(9): 4882-8 (2002)). El efecto de la activación de CD137 sobre la inhibición de muerte celular inducida por activación se ha demostrado in vitro por Hurtado y col. (J. Hurtado y col., J. Immunol., 158 (6): 2600-9 (1997)) y en un sistema in vivo en el que se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales anti-CD137 (mab) daban lugar a la supervivencia a largo plazo de las células T CD8+ activadas por superantígeno previniendo la supresión clónica (C. Takahashi y col., J. Immunol., 162: 5037 (1999)). Posteriormente, dos informes demostraron, en diferentes condiciones experimentales, que la señal de CD137 regulaba tanto la expansión clónica como la supervivencia de las células T CD8+ (D. Cooper y col., Eur. J. Immunol., 32(2): 521-9 (2002); M. Maus y col., Nat. Biotechnol., 20: 143 (2002)). La reducción de la apoptosis que se observó tras la coestimulación estaba correlacionada con el aumento de los niveles de Bcl-XL en células T CD8+, mientras que la expresión de Bcl-2 permanecía sin cambios. Se demostró que la regulación positiva de los genes antiapoptóticos Bcl-XL y bfl-1 por medio de 4-1BB estaba mediada por la activación de NF-∀B, ya que PDTC, un bloqueante específico de NF-∀B inhibía la regulación positiva de Bcl-XL mediada por 4-1BB (H. Lee y col., J. Immunol., 169(9): 4882-8 (2002)). Por otro lado, la expansión clónica de las células T activadas parece que está mediada por el aumento de la expresión de ciclinas D2, D3 y E y la regulación negativa de la proteína p27kip1. Este efecto ocurre tanto de manera dependiente como independiente de la IL-2 (H. Lee y col., J. Immunol., 169(9): 4882-8 (2002)).

En general, la estimulación por CD137 da como resultado el aumento de la expansión, la supervivencia y las funciones efectoras de las células T CD8+ estimuladas por primera vez, actuando, en parte, directamente sobre estas células. Las células T tanto CD4+ como CD8+ han mostrado respuestas a la estimulación por CD137, sin embargo, parece que la mejoría de la función en las células T es mayor en las células CD8+ (W. Shuford y col., J. Exp. Med., 186(1): 47-55 (1997); I. Gramaglia y col., Eur. J. Immunol., 30(2): 392-402 (2000); C. Takahashi y col., J. Immunol., 162: 5037 (1999)). Basándose en el papel crítico de estimulación por CD137 en la función y la supervivencia de las células T CD8+, la manipulación del sistema CD137/CD137L proporciona una estrategia plausible para el tratamiento de tumores y virus patógenos.

Recientemente, la expresión constitutiva de CD137 en células dendríticas (CD) recién aisladas se ha demostrado en ratones (R. Wilcox y col., J. Immunol., 169(8): 4230-6 (2002); T. Futagawa y col., Int. Immunol., 14(3):275-86 (2002)) y en seres humanos (S. Pauly y col., J. Leukoc. Biol. 72(1): 35-42 (2002)). Estos informes muestran que la estimulación por CD137 en las CD da como resultado la secreción de IL-6 e IL-12, y, más importante, mejora la capacidad de las CD para estimular las respuestas de las células T a los aloantígenos. Además, Pan y col., demostraron que la señalización de CD137 en las CD daba como resultado la regulación positiva del CMH de Clase I y las moléculas coestimuladoras y producía un aumento de la capacidad de las CD para infiltrarse en los tumores

(P. Pan y col., J. Immunol., 172(8): 4779-89 (2004)). Por tanto, la coestimulación por CD137 sobre las CD parece ser una ruta novedosa de proliferación, maduración y migración de CD.

Los linfocitos citolíticos naturales (NK) activados expresan CD137 después de la estimulación con citoquinas (I. Melero y col., Cell Immunol., 190(2): 167-72 (1998); R. Wilcox y col., J. Immunol., 169(8): 4230-6 (2002)). Varios informes han demostrado que las células NK parecen ser críticas para la modulación de la respuesta inmune antitumoral inducida por anticuerpos agonistas CD137 ((I. Melero y col., Cell Immunol., 190(2): 167-72 (1998); R. Miller y col., J. Immunol., 169(4): 1792-800 (2002); R. Wilcox y col., J. Immunol., 169(8): 4230-6 (2002)). El agotamiento de las células NK reduce significativamente la actividad antitumoral de los mab anti-CD137. La unión de CD137 sobre las células NK induce la proliferación y la secreción de IFN-!, pero no afecta su actividad citolítica. En particular, in vitro, las células NK estimuladas por CD137 presentaban una actividad inmunorreguladora o “auxiliar” para las células T CD8+ citolíticas que daba como resultado la expansión de las células T activadas. Por lo tanto, la señalización de CD137 sobre las células NK puede modular la inmunidad innata frente a los tumores.

Se ha descrito un efecto paradójico para la estimulación por CD137 en el que los anticuerpos agonistas CD137 pueden inducir la supresión de las respuestas humorales frente a antígenos de células T en modelos de primates y ratones (H. Hong y col., J. Immunother., 23(6): 613-21 (2000); R Mittler y col., J. Exp. Med., 190(10): 1535-40 (1999)). En particular, se ha demostrado que los anticuerpos agonistas CD137 producían una mejoría significativa de los síntomas asociados con las enfermedades autoinmunes dependientes de anticuerpos, tales como el lupus eritematoso sistémico y la encefalomielitis autoinmune experimental (J. Foell y col., N.Y. Acad. Sci., 987: 230-5 2003); Y. Sun y col., Nat. Med., 8(12): 1405-13 (2002)). Recientemente, Seo y col. demostraron que, en un modelo de artritis reumatoide de ratón, el tratamiento con un anticuerpo agonista anti-CD137 prevenía el desarrollo de la enfermedad y de manera extraordinaria, bloqueaba la progresión de la enfermedad (S. K. Seo y col., Nat. Med. 10; 1099-94 (2004)). El mecanismo responsable de este efecto no se ha definido bien, pero en el modelo de artritis reumatoide se ha demostrado que el tratamiento con un anticuerpo agonista de CD 137 daba como resultado la expansión de las células T CD11C-CD8+ productoras de IFN-!. El IFN-! a su vez estimulaba las células dendríticas para producir indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO), que tiene actividades inmunosupresoras. También se ha postulado

5 que la señalización de CD137 sobre las células T CD4+ activadas por antígeno da como resultado la inducción de la secreción de IFN-! que activa los macrófagos. Los macrófagos activados pueden a su vez producir señales de muerte para las células B. La señalización continua a través de CD137 sobre las células T CD4+ puede posteriormente provocar la muerte celular inducida por activación (AICD) de estas células T CD4+ activadas. Por tanto, eliminando las células T activadas por antígeno y las células B, se observa una reducción de la respuesta por anticuerpos y en consecuencia, se observa una reducción drástica de las enfermedades inflamatorias mediadas por Th2 (B. Kwon y col., J. Immunol., 168(11): 5483-90 (2002)). Estos estudios sugieren un papel para el uso de anticuerpos agonistas CD137 en el tratamiento de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, sin inducir una supresión general del sistema inmune.

El ligando natural de CD137, ligando de CD137 (CD137L), una glucoproteína de 34 kDa miembro de la superfamilia

15 del TNF, se detecta principalmente en las células presentadoras de antígeno activadas (CPA), tales como las células B, los macrófagos, células dendríticas y también en los linfomas de células B murinos, células T activadas y líneas de carcinoma humano de origen epitelial (R. Goodwin y col., Eur. J. Immunol., 23(10): 2631-41 (1993); Z. Zhou y col., Immunol. Lett., 45: 67 (1995); H. Salih y col., J. Immunol., 165(5): 2903-10 (2000)). El CD137L humano comparte el 36% de homología con su homólogo murino (M. Anderson y col., Eur. J. Inmunol., 24: 2219-27 (1994)).

Además de suministrar señales a las células que expresan CD137, la unión de CD137 al CD137L inicia una señal bidireccional que da como resultado efectos funcionales sobre las células que expresan CD137L. Langstein y col. demostraron que la unión de la proteína de fusión CD137-Ig al CD137L en monocitos activados inducía la producción de IL-6, IL-8 y TNF-#, regulaba positivamente la ICAM, e inhibía la IL-10, dando como resultado aumento de la adherencia (J. Langstein y col., J. Immunol., 160(5): 2488-94 (1998)). Además, se ha demostrado una

25 proliferación de monocitos acompañada por una tasa más alta de apoptosis (J. Langstein y col., J. Leukoc. Biol., 65(6): 829-33 (1999)). Estas observaciones se confirmaron con los estudios de Ju y col. (S. Ju y col., Hybrids Hybridomics, 22(5): 333-8 (2003)), que mostraron que un anticuerpo funcional anti-CD137L inducía una alta tasa de proliferación de los monocitos de sangre periférica. El bloqueo del ligando daba como resultado la inhibición de la activación de las células T. Además se descubrió CD137L soluble en el suero de pacientes con artritis reumatoide y procesos hematológicos malignos (H. Salih y col., J. Immunol., 167(7): 4059-66 (2001)). Por tanto, la interacción de CD137 con CD137L tiene influencia y produce efectos funcionales en las células T y las CPA.

En otro aspecto importante de la función de las células T, se ha demostrado que los anticuerpos agonistas anti-CD137 rescataban respuestas de las células T frente a las proteínas antigénicas en ratones viejos. Se ha documentado bien que se produce un declive relacionado con la edad en la respuesta inmune frente a los antígenos, 35 un proceso conocido como inmunosenescencia (R. Miller, Science, 273: 70-4 (1996); R. Miller, Vaccine, 18: 1654-60 (2000); F. Hakim y col., Curr. Opinion Immunol., 16: 151-156 (2004)). Este fenómeno parece que se debe a alteraciones en el equilibrio entre la extensión de la expansión celular y la supervivencia o muerte celular. Bansal-Pakala y col. ensayaron la hipótesis de que la coestimulación secundaria por medio de CD137 se puede utilizar para potenciar las respuestas de las células T en situaciones en las que las células T no reciben una estimulación suficiente, debido a la reducción de la expresión de CD3 o CD28 o a la reducción de la calidad de las señales. Sus estudios mostraron que los ratones viejos tenían una respuesta de memoria deficiente in vitro en comparación con los ratones jóvenes (P. Bansal-Pakala y col., J. Immunol., 169(9): 5005-9 (2002)). Sin embargo, cuando los ratones viejos se trataron con mab anti-CD137, las respuestas proliferativas y de citoquinas de las células T fueron idénticas a las respuestas que se observaban en los ratones jóvenes. Aunque no se ha elucidado el mecanismo específico

45 responsable de este efecto, se ha especulado que el aumento tanto de la expresión de las moléculas antiapoptóticas como Bcl-XL como la promoción de la secreción de IL-2 in vivo puede tener un papel en el rescate de las respuestas de células T defectuosas. Estos estudios demostraron el potencial de los anticuerpos agonistas anti-CD137 para rescatar las respuestas débiles de las células T en los individuos ancianos inmunocomprometidos y tienen profundas implicaciones para el uso de anticuerpos anti-CD137 en los pacientes con cáncer.

Se sugirió que la terapia dirigida de CD137 tenía un papel en el tratamiento del cáncer por los estudios de eficacia in vivo en ratones utilizando anticuerpos monoclonales agonistas anti-CD137 murino. En un artículo de Melero y col., el anticuerpo agonista anti-CD137 de ratón produjo curaciones en tumores de mastocitoma P815 y en el modelo de tumor de baja inmunogenicidad Ag104 (I. Melero y col., Nat. Med., 3(6): 682-5 (1997)). El efecto antitumoral necesitaba de células T tanto CD4+ como CD8+ como células NK, puesto que el agotamiento selectivo in vivo de

55 cada subpoblación dio como resultado la reducción o pérdida completa del efecto antitumoral. Se ha demostrado también que era necesaria una inducción mínima de la respuesta inmune para que la terapia fuera eficaz. Varios investigadores han utilizado anticuerpos anti-CD137 para demostrar la viabilidad de esta estrategia en el tratamiento del cáncer (J. Kim y col., Cancer Res., 61(5): 2031-7 (2001); O. Martinet y col., Gene Ther., 9(12): 786-92 (2002); R. Miller y col., J. Immunol., 169(4): 1792-800 (2002); R. Wilcox y col., Cancer Res., 62(15): 4413-8 (2002)).

Apoyando los datos de la eficacia antitumoral de los anticuerpos agonistas CD137, se ha demostrado que las señales proporcionadas por el CD137L provocan la actividad de CTL y respuestas antitumorales (M. DeBenedette y col., J. Immunol., 163(9): 4833-41 (1999); B. Guinn y col., J. ImmunoL, 162(8): 5003-10 (1999)). Varios informes

demostraron que la transferencia génica del ligando de CD137 en carcinomas murinos daba como resultado el rechazo del tumor, demostrando la necesidad de la coestimulación para generar una respuesta inmune eficaz (S. Mogi y col., Immunology, 101(4): 541-7 (2000); L Melero y col., Cell Immunol., 190(2): 167-72 (1998); B. Guinn y col.,

J. Immunol., 162(8): 5003-10 (1999)). Salih y col. informaron de la expresión del CD137L en carcinomas humanos y líneas celulares de carcinoma humano (H. Salih y col., J. Immunol., 165(5): 2903-10 (2000)) y demostraron que las células tumorales que expresaban el ligando eran capaces de aportar una señal coestimuladora a las células T que daba como resultado la liberación de IFN-! e IL-2 y que este efecto estaba correlacionado con los niveles de CD137L en los tumores. No se sabe si la expresión de CD137L en tumores humanos podría hacer a estos tumores más susceptibles a los anticuerpos agonistas CD137.

Ratones CD137L -/-han puesto de relieve la importancia del sistema CD137/CD137L en las respuestas de las células T frente a tanto virus como tumores (M. DeBenedette y col., J. Immunol., 163(9): 4833-41 (1999); J. Tan y col., J. Immunol., 164(5): 2320-5 (2000); B. Kwon y col., J. Immunol., 168(11): 5483-90 (2002)). Estudios que utilizan ratones deficientes en CD137 y CD137L han demostrado la importancia de la coestimulación de CD137 en la enfermedad del huésped contra injerto y en las respuestas citolíticas antivirales de las células T. Los ratones deficientes en CD137 tenían un aumento de la proliferación de células T, pero tenían una reducción de la producción de citoquinas y de la actividad citotóxica de las células T (B. Kwon y col., J. Immunol., 168(11): 5483-90 (2002); D. Vinay y col., Immunol. Cell Biol., 81(3): 176-84 (2003)). Más recientemente, se ha demostrado que los ratones knock-out (CD137 -/-) tenían una frecuencia más alta de metástasis tumorales (4 veces más) en comparación con los ratones control. Estos datos sugieren que la restauración de la señalización de CD137 mediante el uso de anticuerpos agonistas anti-CD137 es una estrategia factible para el aumento de las respuestas inmunes celulares a virus patógenos y cánceres.

Además de los datos en los modelos de ratón in vivo que apoyan la implicación de la señalización de CD137 en las respuestas inmunes antitumorales, los estudios llevados a cabo en las muestras de tumor humano primario han confirmado el papel de CD137 en la generación de células T efectoras. En los pacientes con sarcoma de Ewing, Zhang y col. demostraron que las células T efectoras intratumorales presentaban el fenotipo CD3/CD8+/CD28/CD137+. Inesperadamente, se observó la coexistencia del crecimiento progresivo del tumor y la inmunidad antitumoral (células T efectoras). Los estudios de estimulación ex vivo con células de pacientes demostraron que la proliferación y activación de las células T inducida por tumor necesitaba la coestimulación con CD137L. La estimulación de PBL con anti-CD3/CD137L, pero sin anti-CD3/anti-CD28, inducía efectores líticos tumorales. Estos estudios proporcionaron pruebas adicionales de que la coestimulación mediada por CD137 podría dar lugar a la expansión de CTL reactivos tumorales (H. Zhang y col., Cancer Biol. Ther., 2(5): 579-86 (2003)). Además se ha demostrado la expresión de CD137 en los linfocitos que infiltraban tumor en carcinomas hepatocelulares (HCC) (Y. Wan y col., World J. Gastroenterol, 10(2): 195-9 (2004)). Se detectó la expresión de CD137 en 19 de 19 HCC por PCR-RT y en 13/19 por tinción inmunofluorescente. Por el contrario, CD137 no se detectó en las células mononucleares periféricas de los mismos pacientes. Los análisis que se llevaron a cabo en tejidos hepáticos de donantes sanos no demostraron expresión de CD137. Estos estudios no intentaban correlacionar la enfermedad clínica con la expresión de CD137. Por tanto, los estudios llevados a cabo en el sarcoma de Ewing y en el carcinoma hepatocelular revelaron la presencia de TIL que expresaban CD137, concomitante con la progresión de la enfermedad. En los sarcomas de Ewing se ha demostrado que TIL CD137+ eran capaces de destruir a las células tumorales ex vivo sugiriendo que la ruta de CD137 estaba intacta en estos pacientes y que quizá unos factores supresores en el microambiente tumoral inhibieron su función. Por consiguiente, puede postularse que la administración sistémica de anticuerpos agonistas CD137 puede proporcionar la señal necesaria para la expansión de estas células T efectoras.

Además de su papel en el desarrollo de la inmunidad frente al cáncer, los datos experimentales apoyan el uso de los anticuerpos agonistas CD137 en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y virales (B. Kwon y col., Exp. Mol. Med., 35(1): 8-16 (2003); H. Salih y col., J. Immunol., 167(7): 4059-66 (2001); E. Kwon y col., P.N.A.S. EE.UU., 96: 15074-79 (1999); J. Foell y col., N.Y. Acad. Sci., 987: 230.5 (2003); Y. Sun y col., Nat. Med., 8(12): 1405-13 (2002)

S. K. Seo y col., Nat. Med. 10; 1099-94 (2004)).

El documento WO9816249 desvela un procedimiento para aumentar la destrucción linfocítica de células tumorales en un huésped que comprende la administración al huésped de una dosis eficaz de un anticuerpo (Ab) anti-4-1BB (CD137). Para su administración a tumores, el Ab preferentemente es un Ab sustancialmente humano (véase, pág. 5, lín. 30-35). El mAb 1D8 murino, generado mediante inmunización con 4-1BB murino, se ha informado que es único en unirse a la región proximal de la membrana del dominio extracelular de 4-1BB no implicado en la unión a 41BBL (véase, pág. 14, lín. 28-31)

El documento WO2004010947 proporciona un anticuerpo anti-4-1BB humano humanizado, es decir Hu39E3.G4, que no inhibe la unión de 4-1BB humano a un ligando 4-1BB humano. También proporciona un procedimiento para tratar el cáncer en un sujeto que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo a dicho sujeto.

LOO D. T. y col. (The Journal of Biological Chemistry; 7 Mar. 1997, 272 (10): 6448-6456) informan que la unión de 41BB al complejo 4-1BB.LN no desplaza la laminina (LN). Es decir, los dos ligandos se unen sitios proximales pero distintos sobre 4-1BB. 6/8 anticuerpos monoclonales anti-4-1BB bloquean la interacción entre 4-1BB y 4-1BBL,

mientras que 7 bloquean la unión a LN. Se ha demostrado que el anticuerpo 1 D8 bloquea la unión de LN pero no de 4-1BB murino y reconoce la proteína 4-1BB truncada sin capacidad de unión a 4-1BBL deficiente que carece del dominio LN-homólogo N-terminal (véase, resumen; pág. 6452).

En consecuencia, en base a los papeles de 4-1BB en la modulación de la respuesta inmune, sería deseable producir anticuerpos anti-4-1BB humano con actividades agonistas que pudieran utilizarse en el tratamiento o prevención de enfermedades humanas tales como cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes.

Breve sumario de la invención

El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones.

La presente invención proporciona anticuerpos enteramente humanos que se unen a 4-1BB humano (H4-1BB) y que permiten la unión de H4-1BB a un ligando 4-1BB humano (H4-1BBL). Por tanto, la invención se refiere a anticuerpos que se unen a H4-1BB y que no bloquean la unión de H4-1BB a H4-1BBL., permitiendo de esta manera la unión de un anticuerpo de la invención y H4-1BBL a H4-1BB. La invención también proporciona anticuerpos con actividades agonistas en los que la unión de los anticuerpos a H4-1BB da como resultado el aumento y la estimulación de las respuestas inmunes mediadas por H4-1BB. Estos anticuerpos se pueden utilizar como potenciadores inmunitarios de una respuesta antitumoral o antiviral o como inmunomoduladores de las enfermedades autoinmunes mediadas por células T. Los anticuerpos pueden también utilizarse como herramientas de diagnóstico para la detección de H41BB en la sangre o tejidos de pacientes con cáncer, enfermedad autoinmune u otras enfermedades.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a H4-1BB, que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera comprende una CDR1 (región determinante de complementariedad 1), una CDR2 (región determinante de complementariedad 2) y una CDR3 (región determinante de complementariedad 3) como se representa en la FIG. 4 y la región variable de cadena pesada comprende una CDR1 (región determinante de complementariedad 1), una CDR2 (región determinante de complementariedad 2) y una CDR3 (región determinante de complementariedad 3) como se representa en la FIG. 2

o la FIG. 7. El anticuerpo monoclonal (mab) puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de IgG4 o un anticuerpo de IgG1.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo, en el que la cadena ligera comprende una región variable como se representa en la FIG.4 y la cadena pesada comprende una región variable como se representa en la FIG. 3 o la FIG. 7.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal enteramente humano que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende los restos aminoacídicos 21-236 de SEC ID Nº: 6 y la cadena pesada comprende los restos aminoacídicos 20-467 de SEC ID Nº: 3. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal enteramente humano que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera comprende los restos aminoacídicos 21-236 de SEC ID Nº: 6 y la cadena pesada comprende los restos aminoacídicos 20-470 de SEC ID Nº: 9.

Los anticuerpos de la invención tienen amplias aplicaciones terapéuticas como inmunomoduladores de enfermedades tales como el cáncer, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades inflamatorias y las enfermedades infecciosas.

La invención proporciona además un anticuerpo o una parte de anticuerpo de unión a antígeno de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer de un sujeto que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo o parte de anticuerpo de unión a antígeno al sujeto. En un aspecto, este uso además comprende la administración de una vacuna. Vacunas adecuadas incluyen, por ejemplo, una vacuna de células tumorales, una vacuna de ADN, una vacuna de células tumorales modificada por GM-CSF o una vacuna de células dendríticas cargada de antígeno. El cáncer puede ser, por ejemplo, cáncer de próstata, melanoma o cáncer epitelial.

Además, se desvelan en el presente documento, un procedimiento para aumentar la respuesta inmune, que comprende la administración de un anticuerpo de la invención y una vacuna gag SIV; un procedimiento para aumentar la respuesta inmune, que comprende la administración de un anticuerpo de la invención y una vacuna PSA; un procedimiento para aumentar la respuesta inmune a una vacuna gag SIV, que comprende la administración de un anticuerpo de la invención; y un procedimiento para aumentar la respuesta inmune a una vacuna PSA, que comprende la administración de un anticuerpo de la invención.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención o una parte de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica se puede administrar sola o en combinación con un agente, por ejemplo, un agente para tratar el cáncer tal como un agente quimioterapéutico o una vacuna u otro agente inmunomodulador.

Además, se desvelan en el presente documento, polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: (a) los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de los restos aminoacídicos 20-467 de SEC ID Nº: 3; (b) los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:

3; (c) los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de los restos aminoacídicos 21-236 de SEC ID Nº:

6: (d) los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 6; (e) los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de los restos aminoacídicos 20-470 de SEC ID Nº: 9; (f) los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 9; y (g) los nucleótidos que codifican un fragmento de una secuencia de aminoácidos de (a) a (f), tal como una región variable, una región constante o una o más CDR. Los polinucleótidos desvelados en el presente documento además comprenden secuencias de nucleótidos que codifican al menos una CDR de la FIG. 3, al menos una CDR de la FIG. 4 o al menos una CDR de la FIG. 7. Además, se desvelan en el presente documento, los polinucleótidos aislados que comprenden las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 4o SEC ID Nº: 7.

Adicionalmente, se desvelan en el presente documento, los polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 9; los polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos aminoacídicos 20-467 de SEC ID Nº: 3, los polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos aminoacídicos 21-236 de SEC ID Nº: 6 y los polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos aminoacídicos 20-470 de SEC ID Nº: 9; así como los polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de al menos una CDR de la FIG. 3, la FIG. 4 o la FIG.7 o al menos la región variable o constante de la FIG. 3, la FIG. 4 o la FIG. 7.

Además, se desvela en el presente documento, una inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por H4-1BB, dicha inmunoglobulina comprendiendo una región de unión a antígeno. En un aspecto, la inmunoglobulina es un Fab

o F(ab’)2 de un anticuerpo de la invención.

Además, se desvelan en el presente documento una línea celular que produce un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo de la invención, vectores de expresión recombinantes que incluyen los nucleótidos de la invención y procedimientos para preparar los anticuerpos de la invención cultivando una línea celular productora de anticuerpos.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra un mapa plasmídico de pD17-20H4.9.h4a. La FIG. 2 muestra un mapa plasmídico de pD16gate-20H4.9.L.C. La FIG. 3 (FIG. 3A-3H) muestra la secuencia de nucleótidos del plásmido pD17-20H4.9.h4a, incluyendo la cadena codificante (SEC ID Nº: 1), la cadena complementaria (SEC ID Nº: 2) y la secuencia de aminoácidos (el péptido líder es los restos aminoacídicos 1-19 de SEC ID Nº: 3; la cadena pesada es los restos aminoacídicos 20-467 de SEC ID Nº: 3) codificadas por la cadena codificante. La FIG.4 (FIG. 4A-4F) muestra la secuencia de nucleótidos del plásmido pD16gate-20H4.9.L.C, incluyendo la cadena codificante (SEC ID Nº: 4), la cadena complementaria (SEC ID Nº: 5) y la secuencia de aminoácidos (el péptido líder es los restos aminoacídicos 1-20 de SEC ID Nº: 6; la cadena ligera es los restos aminoacídicos 21-236 de SEC ID Nº: 6) codificados por la cadena codificante. La FIG. 5 muestra un esquema de la construcción de la secuencia de cadena pesada de 20H4.9-IgG1. La FIG. 6 muestra un esquema de la construcción de cadena ligera del 20H4.9 La FIG. 7 (FIG. 7A-7D) muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción de cadena pesada de 20H4.9-IgG 1, incluyendo la cadena codificante (SEC ID Nº: 7), la cadena complementaria (SEC ID Nº: 8) y la secuencia de aminoácidos (péptido líder es los restos aminoacídicos 1-19 de SEC ID Nº: 9; la cadena pesada es los restos aminoacídicos 20-470 de SEC ID Nº: 9) codificados por la cadena codificante. La FIG. 8 (FIG. 8A-8B) ilustra los resultados obtenidos de la unión del mab 20H4.9-IgG1 a CD137 humano por ELISA (FIG. 8A) y el efecto del mab 20H4.9-IgG1 sobre la interacción CD137/CD137L (FIG. 8B). La FIG. 9 (FIG. 9A-9B) ilustra los resultados obtenidos de la unión del mab 20H4.9-IgG1 a las células humanas

o de mono cinomolgus estimuladas con PMA-ionomicina. Las CEM humanas (FIG. 9A) o las PBMC de mono (FIG. 9B) se incubaron con 20H4.9-IgG1 o la proteína de fusión humana CD137L. La FIG. 10 (FIG. 10A-10B) ilustra los resultados obtenidos mediante la inducción de IFN-! en los estudios de coestimulación con anticuerpos anti-CD137, que se expresan como el aumento en veces en pg/ml con respecto a los controles. Debido a la respuesta de fondo variable entre los donantes, los datos se normalizaron en relación a los tratamientos de control (=1). El nivel medio de línea basal de IFN-! para las células T humanas (FIG. 10A) o PBMC de mono (FIG. 10B) estimuladas con anti-CD3 solo, fue 592 pg/ml y 505 pg/ml respectivamente. La FIG. 11 proporciona representaciones de resonancia de plasmón de unión de mab 20H4.9-IgG4 y mab 20H4.9-IgG1 a CD137 humano. La FIG. 12 ilustra la unión dependiente de la concentración de 20H4.9-IgG4 a las células CEM humanas estimuladas por PMA ionomicina, pero no la unión de las células CEM no estimuladas. La FIG. 13 (FIG. 13A-B) ilustra la inducción de IFN-! en estudios de coestimulación con anticuerpos anti-CD137. Los resultados se expresan como el aumento en veces en pg/ml con respecto a los controles. Debido a la respuesta de fondo variable entre los donantes, los datos se normalizaron con relación a los tratamientos de control (=1). El nivel medio de línea basal de IFN-! para las células T humanas (FIG. 13A) o las PBMC de mono (FIG. 13B) estimuladas con anti-CD3 solo fue 592 pg/ml y 505 pg/ml respectivamente.

La FIG. 14 (FIG. 14A-14B) ilustra los resultados obtenidos del aumento dependiente de la dosis de la síntesis de IFN-! por el mab 20H4.9-IgG4 (FIG.14A) y el efecto del entrecruzamiento de anticuerpos mediante la adición de anticuerpos anti-IgG humana de entrecruzamiento (7 ∃g/ml) (FIG. 14B). La FIG. 15 ilustra el efecto de mab 20H4.9-IgG4 sobre la supervivencia de las células T y la progresión del ciclo

5 celular. Las células T humanas se coestimularon con anti-CD3 (1 ug/ml) ± mab 20H4.9-IgG4 a las concentraciones que se enumeran. Seis días después del inicio de los ensayos, la células se recogieron y se tiñeron con Anexina-V y yoduro de propidio para determinar el número de células vivas (Anexina V/PI negativa)

o con ciclina D2 conjugada con PE para detectar las células en ciclo. Los resultados representan la media (±DT) de 4 lotes de mab 20H4.9-IgG4 ensayados en paralelo.

10 La FIG. 16 (FIG. 16A-16D) muestra la respuesta de IFN-! específica de antígeno en monos cinomolgus medida con ELISPOT después del tratamiento con vacuna de ADN ± anticuerpos anti-4-1BB humanos. Los animales se trataron con una vacuna gag SIV (día 0, 28, 56; FIG. 16A), vacuna gag SIV (día 0, 28, 56) y mab 20H4.9-IgG4 (día 12, 15 y 19; FIG. 16B) o vacuna gag SIV (día 0, 28, 56) y hu39E3.G4 (día 12, 15 y 19; FIG 16C). Un grupo de animales se dejó sin tratar (FIG. 16D). En diversos momentos después del tratamiento, se recogió

15 sangre y se separaron las PBMC y se evaluaron en cuanto a su capacidad para secretar IFN-! en presencia de estimulación antigénica.

Descripción detallada de la invención

El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones.

La invención está dirigida a la preparación y caracterización de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los

20 mismos (incluyendo las proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención), para su uso en el tratamiento de una enfermedad, tal como un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune. El cáncer puede ser, por ejemplo, cáncer de próstata, melanoma o cáncer epitelial.

Los anticuerpos son capaces de unirse a H4-1BB y pueden presentar una alta afinidad por H4-1BB y potenciar de

25 forma eficaz las respuestas de las células T. En un aspecto, el anticuerpo induce la producción de IFN-! en los ensayos de coestimulación, pero no afecta la unión de H4-1BB a su ligando correspondiente, H4-1BBL y no fija el complemento.

Los anticuerpos de la invención pueden producirse por procedimientos bien conocidos en la técnica. En un aspecto, los anticuerpos se pueden producir por expresión en células transfectadas, tales como células eucariotas

30 inmortalizadas, tales como células de mieloma o hibridoma.

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar solos o junto con otros agentes terapéuticos tales como radioterapia (incluyendo radiación), terapia hormonal, agentes citotóxicos, vacunas y otros agentes inmunomoduladores, tales como citoquinas y modificadores de respuesta biológica. Estos agentes son particularmente útiles en el tratamiento del cáncer y trastornos inmunoproliferativos.

35 La invención proporciona el anticuerpo monoclonal (mab) 20H4.9-IgG4. Las FIG. 1 y 2 proporcionan los mapas plasmídicos de pD17-20H4.9h4a y pD16gate-20H4.9.LC, respectivamente, que se pueden utilizar para producir el mab 20H4.9-IgG4. La FIG. 3 (FIG 3A-3H) proporciona la secuencia de nucleótidos del plásmido pD17-20H4.9h4a, incluyendo la cadena codificante (SEC ID Nº: 1), la cadena complementaria (SEC ID Nº: 2) y la secuencia de aminoácidos (el péptido líder está formado por los restos aminoacídicos 1-19 de SEC ID Nº: 3; la cadena pesada

40 está formada por los restos aminoacídicos 20-467 de SEC ID Nº: 3) codificada por la cadena codificante. La FIG. 4 (FIG. 4A-4F) muestra la secuencia de nucleótidos del plásmido pD16gate-20H4.9.LC, incluyendo la cadena codificante (SEC ID Nº: 4), la cadena complementaria (SEC ID Nº: 5), la secuencia de aminoácidos (el péptido líder está formado por los restos aminoacídicos 1-20 de SEC ID Nº: 6; la cadena ligera está formada por los restos aminoacídicos 21-236 de SEC ID Nº: 6) codificada por la cadena codificante.

45 En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo monoclonal (mab) 20H4.9-IgG1. La FIG. 5 muestra esquemáticamente una construcción de la secuencia de la cadena pesada del mab 20H4.9-IgG1. La FIG. 6 muestra esquemáticamente una construcción de la secuencia de la cadena ligera del mab 20H4.9, para ambos mab 20H4.9-IgG4 y 20H4.9-IgG1. La FIG. 7 proporciona la secuencia de nucleótidos (cadena codificante (SEC ID Nº: 7) y cadena complementaria (SEC ID Nº: 8)) de la construcción de la secuencia de la cadena pesada de la FIG. 5 y la secuencia

50 de aminoácidos (el péptido líder está formado por los restos aminoacídicos 1-19 de SEC ID Nº: 9; la cadena pesada está formada por los restos aminoacídicos 20-470 de SEC ID Nº: 9) codificada por la cadena codificante. La cadena ligera del mab 20H4.9-IgG1 es la misma que la cadena ligera del mab 20H4.9-IgG4.

La invención también engloba anticuerpos con sustituciones de aminoácidos conservativas de las secuencias de las cadenas pesada y ligera representadas en las SEC ID Nº: 3, 6 y 9 que no tienen sustancialmente ningún efecto

55 sobre la unión de H4-1BB. Las sustituciones conservativas incluyen típicamente la sustitución de un aminoácido por otro con características similares, por ejemplo, sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención comprenden además típicamente una secuencia de control de expresión que está unida operativamente a las secuencias codificantes de polipéptidos, incluyendo las regiones promotoras asociadas naturalmente o heterólogas. Preferentemente, las secuencias de control de expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped 5 eucariotas, pero también se pueden utilizar las secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en un huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos y, según se desee, se puede continuar con la recolección y purificación de la cadena ligera, la cadena pesada, los dímeros de cadena ligera/pesada o el anticuerpo intacto, fragmentos de unión y otras formas de inmunoglobulinas. (Véase, S. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis,

10 Academic Press, N.Y. (1979)). También se pueden producir anticuerpos de cadena única o minicuerpos (anticuerpos de cadena única fusionados a uno o más dominios CH) uniendo las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones VL y VH desveladas en el presente documento con el ADN que codifica un engarce polipeptídico.

Se pueden utilizar los huéspedes procariotas, tales como E. coli y otros microbios, tales como levaduras, para expresar un anticuerpo de la invención. Se pueden utilizar, además de los microorganismos, los cultivos celulares de 15 tejidos de mamíferos, para expresar y producir los anticuerpos de la invención. Pueden preferirse las células eucariotas, debido a que se han desarrollado varias líneas de células huésped capaces de segregar inmunoglobulinas intactas, incluyendo, por ejemplo, las líneas de células CHO (de ovario de hámster chino), líneas de células COS (línea de células de fibroblastos de mono verde africano), células HeLa, líneas de células de mieloma, e hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir las secuencias de control de

20 expresión, tales como un promotor o potenciador y sitios de procesamiento de la información necesarios, tales como los sitios de unión a ribosomas, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación transcripcional, todas ellas bien conocidas en la técnica.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés (por ejemplo, las secuencias codificantes de la cadena pesada y/o ligera y las secuencias de control de expresión) se pueden transferir a la célula huésped por

25 procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular, Por ejemplo la transfección en cloruro cálcico, se utiliza comúnmente en células procariotas, mientras que se puede utilizar el tratamiento con fosfato cálcico, lipofección o electroporación en otros huéspedes celulares (Véase por ejemplo, T. Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982)).

Una vez expresados, los anticuerpos, sus dímeros, las cadenas individuales pesada y ligera y otras formas de

30 inmunoglobulina se pueden purificar de acuerdo con los procedimientos de referencia en la técnica, tales como precipitación con sulfato amónico, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Son deseables las inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos el 90 al 95% de homogeneidad y son más deseables el 98 al 99% o más de homogeneidad.

Los anticuerpos de la invención son útiles para modular las respuestas inmunes de las células T y mediadas por

35 anticuerpos. Las patologías típicas adecuadas para el tratamiento incluyen cánceres, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y miastenia grave.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar por

40 técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como los agentes de ajuste de pH y de tamponamiento, agentes que aumentan la estabilidad tales como manitol o Tween 80, agentes que ajustan la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, lactato sódico o albúmina humana.

45 Los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para administración parenteral, incluyendo la administración subcutánea, intramuscular e intravenosa. Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral pueden comprender una solución del anticuerpo disuelto en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Se puede utilizar una diversidad de vehículos acuosos, todos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina, glicina y similares. Estas soluciones son estériles

50 y generalmente libres de materia particulada. Es especialmente provechoso formular las composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación.

La composición farmacéutica puede además comprender un agente adicional para el tratamiento de una enfermedad. En un aspecto, la composición farmacéutica incluye un agente para el tratamiento del cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune. El anticuerpo de la invención

55 también puede administrarse en conjunto o administrarse por separado de un agente adicional para el tratamiento de una enfermedad.

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar con otros agentes para mejorar la respuesta inmune frente a las células cancerosas en un paciente. En un aspecto, el anticuerpo se utiliza en combinación con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos) o células transfectadas con genes que codifican citoquinas

5 inmunoestimulantes y antígenos de superficie celular. En otro aspecto, el anticuerpo se utiliza en combinación con una vacuna, tal como, por ejemplo una vacuna de células tumorales, una vacuna de ADN, una vacuna de células tumorales modificada genéticamente, tal como una vacuna de células tumorales modificadas por GM-CSF, una vacuna peptídica o una vacuna de células dendríticas cargadas con antígeno.

Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores. En una de estas estrategias,

10 se prepara una vacuna utilizando células tumorales autólogas o alogénicas. Estas vacunas celulares han demostrado ser las más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. El GM-CSF ha demostrado ser un activador potente de la presentación antigénica para la vacunación tumoral (Dranoff y col., P.N.A.S., 90: 3539-4.3 (1993); E. Jafee y col., J. Clin. Oncol., 19: 145-56 (2001); R. Salgia y col., J. Clin. Oncol., 21: 624-30 (2003)).

15 El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en diversos tumores ha llevado a la definición de los llamados antígenos específicos de tumor (S. Rosenberg, Immunity 10: 281-7 (1999)). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula a partir de la cual surgió el tumor, por ejemplo, los antígenos melanocíticos gp 100, antígenos MAGE, Trp-2. Se ha podido demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de las células T específicas de tumor que se

20 encuentran en el huésped. Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar junto con una colección de proteínas y/o péptidos recombinantes expresados en un tumor con el fin de amplificar y dirigir la respuesta inmune a estos antígenos hacia una respuesta Th1. Esas proteínas normalmente son vistas por el sistema inmune como autoantígenos y por tanto los toleran.

En un aspecto, el anticuerpo de la invención se combina con un agente inmunomodulador que comprende el

25 antígeno gag SIV (como un modelo para la vacuna de ADN del VIH) o el antígeno específico de próstata (PSA) o una vacuna de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno gag SIV o el antígeno específico de próstata (PSA). Las vacunas de PSA se describen en, por ejemplo, M. Pavlenko y col., Br. J. Cancer, 91(4): 688-94 (2004); J. Wolchok y col., Semin. Oncol., 30(5): 659-66 (2003); J. Kim y col., Clin. Cancer Res., 7(3 Suppl.): 882s-889s (2001). Las vacunas gag SIV se describen en, por ejemplo, B. Makitalo y col., J. Gen. Virol.,

30 85(Pt 8): 2407-19 (2004); N. Letvin y col., J. Virol., 78(14): 7490-7 (2004); S. Mossman y col., AIDS Res. Hum. Retroviruses., 20(4): 425-34 (2004); F. Bertley y col., J. Immunol., 172(6): 3745-57 (2004); L. Patterson y col., J. Virol., 78(5)2212-21 (2004); E. O’Neill y col., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 19(10): 883-90 (2003); Z. Bu y col., Virology, 309(2): 272-81 (2003).

El antígeno tumoral también puede incluir, por ejemplo, la proteína telomerasa, que se necesita para la síntesis de

35 los telómeros de los cromosomas y que se expresa en más del 85% de los cánceres humanos y solamente en un número limitado de tejidos somáticos (N. Kim y col., Science, 266, 2011-2013 (1994)). El antígeno tumoral puede ser también “neo-antígenos” expresados en las células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas o el idiotopo de los tumores de células B. Otras vacunas tumorales pueden incluir las proteínas de los virus implicados en los cánceres

40 humanos tales como los Virus del Papiloma Humano (VPH), Virus de la Hepatitis (VHB y VHC) y el Herpes Virus del Sarcoma de Kaposi (HVSK). Otra forma de antígeno tumoral específico que se puede utilizar con un anticuerpo de la invención son las proteínas de choque térmico purificadas (HSP) aisladas a partir del propio tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en el suministro a las células presentadoras de antígeno para inducir inmunidad tumoral (R. Suot y col.,

45 Science 269: 1585-1588 (1995); Y. Tamura y col., Science 278: 117-120 (1997)).

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar también para aumentar la respuesta inmune a las vacunas frente a antígenos virales, tales como VIH o VHC. Los anticuerpos de la invención también se pueden utilizar para aumentar la respuesta inmune a otros agentes inmunomoduladores y para provocar una respuesta inmune de memoria. Los ejemplos de estos agentes son las citoquinas tales como GM-CSF, IL-2, IL-15, IL-12, ligando F-13, 50 ligando CD40, adyuvantes tales como el oligodesoxinucleótido CpG (ADN bacteriano) o anticuerpos frente a OX-40

o CTLA-4.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En la aplicación terapéutica, la composición farmacéutica se administra a un paciente que ya padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o detener o tratar al menos parcialmente la enfermedad. Una 55 cantidad adecuada para conseguir esto se define como una “dosis terapéuticamente eficaz”. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la patología y del paciente (incluyendo, por ejemplo, el estado general del sistema inmune del propio paciente) y puede determinarla un experto en la técnica. En las aplicaciones profilácticas, la composición farmacéutica se administra a un paciente todavía no tiene la patología, para aumentar la resistencia del paciente a la patología. Tal cantidad se define como que es una “dosis profilácticamente eficaz”. En 60 este uso, las cantidades precisas dependen del estado de salud del paciente (incluyendo, por ejemplo, el estado general del sistema inmune del propio paciente) y puede determinarla un experto en la técnica. En un aspecto, el

uso profiláctico es para la prevención de la reaparición tumoral.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de Anticuerpos

Materiales y Procedimientos

Los anticuerpos monoclonales enteramente humanos frente al receptor CD137 humano (4-1BB) se generaron en el HuMAb-Mouse® (Medarex, Inc., Princeton, Nueva Jersey). Los ratones HuMAb se inmunizaron cinco veces por vía intraperitoneal (i.p.) y por vía subcutánea (s.c.) con 25 ∃g del dominio extracelular de CD137 humano en adyuvante RIBI (Ribi Immunochemical). Antes de la fusión, los ratones se reforzaron por vía intravenosa (i.v.) con la misma cantidad de antígeno. Las células del bazo de los ratones inmunizados con títulos adecuados de anticuerpos frente a huCD137 se fusionaron con células de mieloma de ratón siguiendo los procedimientos convencionales.

El mab anti-CD3 humano (clon: HIT3a), los kits de ELISA para IFN-! humano y de mono, los kits de matriz de perlas citométricas (CBA) y todos los anticuerpos conjugados para la citometría de flujo se adquirieron en BD Pharmigen (San Diego, California). La IgG1% humana y la IgG1∀ humana se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri). Las células CEM (ATCC-CRL 2265) se adquirieron en la ATCC. Los medios de cultivo (RPMI) y el suero bovino fetal (FBS) se adquirieron en Mediatech Inc. (Herndon, Virginia). Los glóbulos rojos de oveja Alsevers se adquirieron en Colorado Serum Co. (Denver, Colorado).

Exploración de hibridoma: Detección de unión a huCD137 por ELISA: Para identificar los hibridomas que secretan anticuerpos anti-CD137 humanos, las placas de ELISA (Nunc MaxiSorp) se revistieron con proteína de fusión CD137 humano-IgG2b de ratón a 1 ∃g/ml en PBS durante una noche a 4 ºC. Las placas se lavaron posteriormente 3 veces con PBS con Tween-80 al 0,01% (PBS-T) y posteriormente se bloquearon con PBS-T más albúmina sérica bovina al 1% (BSA), durante 20 min a temperatura ambiente. Se añadieron a las placas cincuenta microlitros de los sobrenadantes diluidos 1:3 en PBS-T y se incubaron durante 1-2 h a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron las placas como anteriormente y se detectó la unión de los anticuerpos por incubación con anticuerpo anti-IgG humana de F(ab’)2 de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Laboratories, West Grove, Pennsylvania). Las placas se desarrollaron con pNPP y se leyeron a 405 nm.

Ensayo de bloqueo: Se evaluaron veintiséis hibridomas que secretaban anticuerpos que reconocían huCD137 por ELISA para determinar su capacidad de permitir las interacciones CD137-CD137L. Estos análisis se llevaron a cabo inicialmente en un formato de ELISA. Las placas se revistieron con 100 ∃l/pocillo de CD137 humano-mulgG2b a 0,2 ∃g/ml. Se añadieron a la placa diluciones en serie de 20H4.9-IgG1 o anticuerpos de control, diluidos en PBS-T y albúmina sérica bovina al 1%. Se añadió la proteína de fusión CD137L-CD8 a los pocillos a una concentración de 0,2 ∃g/ml. Se detectaron los anticuerpos unidos con un anticuerpo anti-CD8 biotinilado (0,2 ∃g/ml, Ancell Corporation, Bayport, Minnesota). Después de varios lavados, se añadieron estreptavidina-fosfatasa alcalina (1:2000) y pNPP para la detección de los anticuerpos unidos y las placas se leyeron a 405 nm.

Para confirmar que los anticuerpos seleccionados no alteraron la unión CD137-CD137L, los anticuerpos purificados se caracterizaron además con análisis BIAcore. Todos los experimentos se llevaron a cabo con un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore Inc., Piscataway, Nueva Jersey). CD137 humano se inmovilizó covalentemente a alta densidad sobre una superficie de dextrano carboximetilado de una microplaca sensora BIAcore (BIAcore Inc., Piscataway, Nueva Jersey). Las inyecciones se llevaron a cabo a 2 ∃g/ml en tampón de acetato 10 mM, a pH 5,0. Los ésteres activos sin ocupar se bloquearon posteriormente por inyección de un exceso de etanolamina. La regeneración de la superficie se realizó con glicina 10 mM, pH 2,0.

Las muestras purificadas de los anticuerpos anti-CD137 se diluyeron a concentraciones entre 200 y 1000 nM utilizando solución salina tamponada con HEPES, a pH 7,4, complementado con NaCl 0,15 mM y surfactante P20 (HBS-EP) al 0,005%. Las proteínas de fusión humanas CD137L-CD8 (huCD137L) se utilizaron como una fuente de ligando CD137. Los experimentos se llevaron a cabo de forma que el huCD137L se inyectó antes que los anticuerpos anti-CD137 o viceversa. Las inyecciones se llevaron a cabo a un caudal de 5 ∃l/min. Los ligandos y anticuerpos unidos se eliminaron por regeneración con tampón de glicina 10 mM, pH 2,0.

Purificación de células T humanas: Las células T o las PBMC se obtuvieron de donantes humanos sanos. La sangre se recolectó en EDTA, se suspendió en tampón de separación por elución (RPMI que contiene EDTA 2,5 mM y polimixina B a 10 ∃g/ml), con una capa inferior de Medio de Separación de Linfocitos (LSM, Mediatech Inc., Herndon, Virginia) y se centrifugó a 1800 rpm durante 25 minutos. Se recogieron las interfaces celulares y se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos. Posteriormente, los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de separación por elución y se lavaron en Glóbulos Rojos de Oveja (SRBC, a una dilución de 1:10) y se incubaron en hielo durante 1 hora. Posteriormente se colocó una capa de LSM por debajo de las células y se centrifugaron a 2500 rpm durante 25 minutos. Las interfaces se eliminaron y los SRBC se lisaron con Tampón de Lisis de SRBC. Las células T aisladas se lavaron y se resuspendieron en FBS/RPMI al 10%.

Análisis de Citometría de Flujo: La unión de los anticuerpos anti-CD137 humano a CD137 expresado en las células se determinó por citometría de flujo. Se utilizó para estos estudios una línea celular de células T de leucemia humanas (CEM) o células monocíticas de sangre periférica de monos cinomolgus (PBMC). Estas células no expresan CD137 de manera constitutiva, pero el receptor puede inducirse por estimulación con forbol miristato (PMA, a 10 ng/ml) e ionomicina (1 ∃M) durante 18 h. Las células se lavaron posteriormente y se incubaron con diversas concentraciones de los anticuerpos en tampón de tinción (solución salina tamponada con fosfato, PBS, más FBS al 1% y azida sódica al 0,01%). La unión de los anticuerpos a las células estimuladas o no estimuladas se detectó por un anti-IgG humana de cabra conjugado con fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania). Para confirmar la expresión de CD137, se utilizó una proteína que consistía en el dominio extracelular del ligando CD137 y CD8 de ratón (Ancel Corporation, Bayport, Minnesota) seguido por incubación con anti-CD8 de ratón conjugado con PE (BD Pharmigen, San Diego, California). Se fijaron las muestras en formalina al 1%, se mantuvieron a 4 ºC y se leyeron por citometría de flujo.

Ensayos Funcionales: Células T humanas primarias o PMBC de mono obtenidas de donantes sanos se estimularon con anticuerpos inmovilizados anti-CD3 para proporcionar la primera señal de activación a las células T y se coestimularon con anticuerpos humanos anti-CD137 humano. Como control no específico se utilizó un anticuerpo anti-carcinoma humanizado (BR96) a la misma concentración de anticuerpo. Las placas se revistieron con anticuerpo anti-CD3 (0,5-1 ∃g/ml) a 4 ºC durante una noche. Al día siguiente las células T o las PBMC se sembraron en placas a concentraciones de 1-1,5 x 105/pocillo. Se midió la síntesis de IFN-! después de 72 horas de cultivo a 37 ºC por matriz de perlas citométricas (CBA) o por ELISA.

Ensayos de citoquina

ELISA: Tras la estimulación de las células T en diversos momentos, las placas se centrifugaron y el medio se eliminó. Los niveles de citoquina se detectaron por un ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen, San Diego, California). En resumen, las muestras de ensayo y los patrones se añadieron a unas placas de 96 pocillos revestidas con anti-citoquina. Después de incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces en PBS-T y luego se incubaron primero con un anticuerpo detector de trabajo, seguido por adición de sustrato. Se leyó la absorbancia a 405 nm y se calcularon las concentraciones en base a la curva estandar.

Matriz de Perlas Citométricas: Otro procedimiento que se utilizó para determinar la producción de citoquinas in vitro fue la citometría de flujo utilizando la matriz de Perlas Citométricas (CBA) desarrollado por BD Pharmingen. Se midieron los niveles de IFN-!, IL-2, IL-5, IL-4, IL-10 y TNF-# en los sobrenadantes de cultivo siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se analizaron mediante citometría de flujo con el software de análisis de CBA.

Resultados

Los hibridomas que secretaban anticuerpos que mostraban unión con CD137 humano se expandieron adicionalmente y se subclonaron. Los anticuerpos secretados se purificaron y se ensayó su capacidad para unirse a huCD137 y para permitir la interacción entre CD137-CD137L. Del panel de anticuerpos anti-CD137 humano evaluados, el mab 20H4.9-IgG1 se seleccionó para evaluación adicional basándose en su perfil de unión y sus propiedades no bloqueantes. El anticuerpo 20H4.9-IgG1 es una IgG1 kappa como se determinó por ELISA utilizando fosfatasa alcalina anti-IgG1, 2, 3, 4 humana y reactivos anti-kappa y lambda (Southern Biotech, Birmingham, Alabama). La FIG.8 (FIG. 8A – unión al CD137 humano mediante ELISA; FIG. 8B – efecto del mab 20H4.9-IgG1 sobre la interacción CD137-CD137L) proporciona la caracterización inicial del mab 20H4.9-IgG1. Se evaluaron las diluciones en serie del mab 20H4.9-IgG1, 26G6 (un anticuerpo bloqueante anti-CD137) o toxoide tetánico (TT, control negativo) en cuanto a su capacidad para alterar la unión de CD137 al CD137L. El mab 20H4.9-IgG1 a concentraciones de hasta 10 ∃g/ml no bloqueaba la unión al CD137L, mientras que el mab 26G6 inhibió la unión a concentraciones >0,37 ∃g/ml.

El mab 20H4.9-IgG1 también se ensayó en cuanto a la reactividad hacia CD137 expresado en las células T humanas (CEM) y en las células monocíticas en sangre periférica del mono cinomolgus (PMBC) estimuladas con PMA e ionomicina. Los estudios previos determinaron que CD137 está regulado positivamente en las células T después de la activación con PMA e ionomicina. Las moléculas de control consistían en un anticuerpo IgG humano irrelevante (control negativo) o proteína de fusión CD137-CD8 (control positivo, BD Pharmingen, San Diego, California). Los resultados de estos estudios indicaron que el mab 20H4.9-IgG1 se unió a CEM humanas y PBMC de monos cinomolgus activadas, con una unión mínima a las células no estimuladas. Porcentajes similares de células positivas se detectaron con mab 20H4.9-IgG1 o con CD137L. La FIG. 9 proporciona los resultados obtenidos que demuestran la unión de mab 20H4.9-IgG1 a las células humanas estimuladas con PMA-ionomicina o células de mono cinomolgus. Las CEM humanas (FIG. 9A) o las PBMC de mono (FIG. 9B) se incubaron con proteína de fusión 20H4.9-IgG1 o CD137L humana. Se añadieron anticuerpos secundarios y las muestras se leyeron por citometría de flujo.

A continuación, se determinó si el mab 20H4.9-IgG1 podía inducir el aumento de IFN-! en ensayos coestimuladores en presencia de estimulación anti-CD3, el efecto clave deseado para un anticuerpo agonista CD137. Se evaluó el

mab 20H4.9-IgG1 con respecto a su actividad coestimuladora en estudios funcionales en linfocitos humanos y de mono. Basándose en los datos iniciales, se utilizó una concentración de anticuerpo anti-CD137 de 20 ∃g/ml (exceso de anticuerpo) en estos estudios. Se ensayaron los niveles de anticuerpo anti-CD3 entre 0,2-1 ∃g/ml los cuales dieron como resultado que el 10-20% de los linfocitos eran positivos a CD137. Se midieron los niveles de IFN-! en los sobrenadantes después de 72 h de cultivo. Como se muestra en la FIG.10, el mab 20H4.9-IgG1 aumentó la síntesis de IFN-! en los ensayos coestimuladores tanto en seres humanos como en monos hasta niveles significativamente más altos que en los controles. Los resultados de los estudios llevados a cabo con células T aisladas de 8 donantes humanos sanos mostraron que en seis de ellos, el mab 20H4.9-IgG1 aumentaba la síntesis de IFN-! entre 2,2-4,3 veces en comparación con los controles. Uno de los otros dos donantes mostró un aumento de 1,6 veces. El nivel de aumento fue superior al que se observó con hu39E3.G4, un anticuerpo anti-CD137 humanizado proporcionado en la Solicitud PCT publicada WO04/010947 que mostró un aumento de IFN-! en 5 de 8 donantes y a niveles más bajos que el mab 20H4.9-IgG1 (aumento de 1,5 – 2 veces) (FIG. 10A). En los estudios coestimuladores de mono, el mab 20H4.9-IgG1 también demostró un aumento de la actividad funcional que dio como resultado un aumento significativo de IFN-! con respecto a los controles (FIG. 10B). Como en los estudios con seres humanos, el aumento de IFN-! fue consistentemente mayor que con hu39E3.G4.

También se observó la inducción de síntesis de TNF-# por encima de los niveles de control en cultivos humanos, aunque a niveles mucho menores que IFN-!. Los niveles de TFN-# inducidos por el anticuerpo anti-CD3 solo (línea basal) eran aproximadamente de 20-50 veces menor que los niveles de la línea basal de IFN-!. El mab 20H4.9-IgG1 inducía un aumento de ~ 2 a 4,7 veces en 3 de los 8 donantes. De nuevo, el hu39E3.G4 (ensayado en paralelo) inducía un aumento de ~ 2 veces en los mismos donantes pero a niveles más bajos. Otras citoquinas que se ensayaron, IL-2, IL-5, IL-10, e IL-4 no cambiaron significativamente con ningún tratamiento.

En conjunto, estos estudios demostraron que el mab 20H4.9-IgG1 presentaba la actividad funcional deseada tanto en seres humanos como en monos, induciendo una respuesta de tipo Thl. Significativamente, como la actividad antitumoral in vivo se asocia con la capacidad de los anticuerpos anti-CD137 para inducir la síntesis de IFN-!, estos resultados apoyan la selección del mab 20H4.9-IgG1 para el cambio de isotipo.

Ejemplo 2: Caracterización in vitro del mab 20H4.9-IgG1

Basándose en su cinética de unión, la incapacidad para bloquear la interacción entre CD137-CD137L y los efectos funcionales sobre las células T humanas, se seleccionó el mab 20H4.9-IgG1 para cambiarlo a una forma IgG4. La forma IgG4 del mab 20H4.9-IgG1 es 20H4.9-IgG4 (representado en las FIG. 3 y 4).

La segunda fase de estos estudios implicaba la comparación de las propiedades in vitro del mab 20H4.9-IgG4 y el mab 20H4.9-IgG1. En esta sección, se describen las propiedades de cinética de unión y los efectos funcionales de ambos anticuerpos en linfocitos humanos y de mono.

Cinética de unión

Las propiedades cinéticas de los anticuerpos anti-CD137 humano se evaluaron por resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIAcore 3000. El antígeno, CD137 humano-IgG2a murina, se inmovilizó covalentemente a baja densidad en la superficie de una microplaca sensora CM5. El mab 20H4.9-IgG4 y el mab 20H4.9-IgG1 se inyectaron a concentraciones entre 25 y 200 nM. La FIG. 11 representa las inyecciones a 100 nM de tanto el mab 20H4.9-IgG1 como del mab 20H4.9-IgG4. Los datos calculados utilizando el software BIAevaluation (análisis de ajuste de curva global, modelo bivalente) dieron como resultado unos parámetros de cinética que eran similares en ambos anticuerpos (véase la Tabla 1). Las constantes de disociación KD para el mab 20H4.9-IgG1 y para el mab 20H4.9-IgG4 se determinaron como 11,2 y 16,6 nM, respectivamente. En condiciones experimentales similares, el mab 20H4.9-IgG4 no se une a 4-1BB murino.

Tabla 1 – Comparación de la cinética de unión del mab 20H4.9-IgG4 y el mab 20H4.9-IgG1

Anticuerpo: Ka1 (1/Ms) Kd1 (1/s) Ka2 (1/UR) Kd2 (1/s) Rmáx (UR) KA1 KD1 (nM)

20H4.9-IgG1: 3,43E+04 3,85E-04 2,30E-05 1,51E-03 262 8,91E+07 11,22

20H4.9-IgG4: 3,92E+04 6,51E-04 0,0755 0,105 409 6,02E+07 16,61

Análisis de citometría de flujo

El mab 20H4.9-IgG4 biotinilado a concentraciones que varían de 0,32 ng/ml a 5 ∃g/ml se ensayó con respecto a su unión con las células CEM ± PMA-ionomicina. El mab 20H4.9-IgG4 se unió a las células CEM estimuladas por PMAionomicina de manera dependiente de la concentración. La saturación se alcanzó a 0,2 ∃g/ml. Por otro lado, como se ha demostrado para su molécula parental, mab 20H4.9-IgG1, el mab 20H4.9-IgG4 no se unía a las células CEM que no estaban estimuladas por PMA-ionomicina (FIG. 12). La unión dependiente de la concentración del mab 20H4.9-IgG4 se ha demostrado con las células CEM estimuladas con PMA-ionomicina (FIG. 12). Las muestras se

leyeron por citometría de flujo.

Ensayos celulares/ funcionales

Para confirmar que el proceso de cambio de isotipo del mab 20H4.9-IgG1 no alteraba la actividad del anticuerpo, se llevaron a cabo estudios in vitro para comparar la actividad del mab 20H4.9-IgG4 con respecto al mab 20H4.9-IgG1 parental en PBMC de mono y células T humanas. Los efectos funcionales del mab 20H4.9-IgG4 sobre las células T

o PBMC humanas o de mono se determinaron y se compararon con su molécula parental, el mab 20H4.9-IgG1. Las células T primarias humanas o las PBMC de mono obtenidas de donantes sanos se estimularon con anticuerpo anti-CD3 (0,5 ∃g/ml-1 ∃g/ml) +/-anticuerpos anti-CD137 humano. Se midió la síntesis de IFN-! después de 72 h de cultivo a 37 ºC por matriz de perlas citométricas (CBA) para las muestras humanas o por ELISA para las muestras de mono. Los anticuerpos se ensayaron en ensayos coestimuladores en presencia de concentraciones subóptimas de anticuerpo anti-CD3 (1 ∃g/ml) o Concavalina A (1 ∃g/ml) (donantes M5170 y 81 solamente). Los resultados se expresan como el aumento en veces en pg/ml sobre los controles. Debido a la respuesta de fondo variable entre los donantes, los datos se normalizaron en relación con los tratamientos de control (=1). La FIG. 13A proporciona los resultados en las células T humanas y la FIG. 13B proporciona los resultados de las PBMC de mono. Como se muestra en las FIG. 13A-13B, el mab 20H4.9-IgG4 demostró propiedades coestimuladoras que daban lugar a niveles más altos de IFN-! en células humanas y de mono en comparación con los controles. El nivel del aumento de la síntesis de IFN-! era comparable con su molécula parenteral en las muestras humana y de mono.

Posteriormente, se evaluó el efecto del entrecruzamiento de anticuerpo sobre el efecto funcional del mab 20H4.9-IgG4. Se ha demostrado que el entrecruzamiento de los anticuerpos puede dar lugar a la potenciación de su capacidad de señalización. Así, se llevó a cabo un estudio para determinar la actividad funcional de varios lotes de mab 20H4.9-IgG4 ± un anticuerpo anti-IgG humana. Como se muestra en la FIG. 14A, se observó un aumento significativo de IFN-! en todos los lotes ensayados en ausencia de anticuerpos de entrecruzamiento, con una meseta a concentraciones de 400 ng/ml. El aumento de la síntesis de IFN-! por el mab 20H4.9-IgG4 aumentó más por adición del anticuerpo de entrecruzamiento anti-IgG humana como se muestra en la FIG. 14B. Los diferentes lotes de mab 20H4.9-IgG4 tenían actividades celulares comparables.

Por tanto, el entrecruzamiento del mab 20H4.9-IgG4 daba como resultado un aumento de la capacidad del anticuerpo para inducir la síntesis de IFN-!. El entrecruzamiento de anticuerpo in vivo puede producirse por medio de receptores celulares para la parte Fc de las inmunoglobulinas o por dimerización del anticuerpo. El mab 20H4.9-IgG4 es del isotipo IgG4, el cual, en comparación con otros isotipos de IgG, tiene una afinidad baja por los receptores Fc. Sin embargo, las IgG4 pueden unirse a Fc!RI (CD64) que se expresa en los monocitos y los neutrófilos.

Se han utilizado otras dos estrategias para caracterizar adicionalmente al mab 20H4.9-IgG4: (i) el efecto sobre la supervivencia de las células T y (ii) el efecto sobre la expresión de ciclina D2. Para determinar si el mab 20H4.9-IgG4 podía provocar la señalización a través de CD137 en las células T humanas y proporcionar señales coestimuladoras a las células T que dieran lugar al aumento de la supervivencia celular y la expansión, células T humanas estimuladas con anticuerpos anti-CD3 +/-mab 20H4.9-IgG4 a concentraciones que se sabía que inducían la síntesis de IFN-! se tiñeron con anexina-V y yoduro de propidio para determinar el número de células vivas (negativas a Anexina V/yoduro de propidio) y con ciclina D2 para determinar su efecto sobre la progresión celular. La FIG. 15 muestra los resultados promedio de 4 lotes diferentes de mab 20H4.9-IgG4 sobre la expresión de ciclina D2 y la supervivencia de células T. Las concentraciones de mab 20H4.9-IgG4 de 0,4-10 ∃g/ml daban como resultado un aumento del número de células vivas de aproximadamente 1,8-2 veces y producían un aumento significativo en el número de células T que expresan ciclina D2 (2,5-3 veces).

Ejemplo 3: Evaluación in vivo de los anticuerpos 4-1BB en un modelo farmacocinético en monos cinomolgus

Este ejemplo ilustra la capacidad del mab 20H4.9-IgG4 y el mab hu39E3.G4 para aumentar la respuesta inmune específica de antígeno inducida por las vacunas de ADN.

Materiales y Procedimientos

Grupos animales experimentales: Los monos cinomolgus machos y hembras (2,5 a 5,0 kg) se adquirieron en Charles River BRF (Houston, Texas) para este estudio y se alojaron en parejas. Cada grupo experimental consistía en 4 machos y 2 hembras que se habían colocado al azar en grupos según el peso corporal. Los grupos experimentales eran de la manera siguiente:

Grupo 1 – vacuna de ADN gag SIV y PSA (2 mg cada una), los días 0, 28, 56, i.m., más solución salina como control, i.v., los días 12, 15 y 19; Grupo 2 – vacuna de ADN gag SIV y PSA (2 mg cada una), los días 0, 28, 56, i.m., más mab hu39E3.G4, i.v., los días 12, 15 y 19; Grupo 3 – vacuna de ADN gag SIV y PSA (2 mg cada una), los días 0, 28, 56, i.m., más mab 20H4.9-IgG4, i.v., los días 12, 15 y 19; Grupo 4 – Grupo control sin tratamiento.

Inmunizaciones y tratamientos con anticuerpos: Las vacunas de ADN PSA y gag SIV se obtuvieron de David B. Weiner, Departamento de Patología y Laboratorio de Medicina, Universidad de Pensilvania. (Véase, Kim y col., Oncogene 20, 4497-4506 (2001); Muthumani y col., Vaccine 21, 629-637 (2003)).

Los monos se inmunizaron por la vía intramuscular con construcciones de ADN PSA y gag SIV (2 mg/construcción/inmunización) simultáneamente, seguido por dos refuerzos con 4 semanas de separación (días 0, 28 y 56). Doce días después de la inmunización inicial, se inició el tratamiento con mab 20H4.9-IgG4 o mab hu39E3.G4. Se administraron los anticuerpos i.v., a 50 mg/kg, los días 12, 15 y 19 después de la primera inmunización. Este protocolo se eligió debido a que demostró que suprimía la respuesta de anticuerpo frente al mab hu39E3.G4.

Clínica y Patología clínica

A lo largo del curso del estudio se llevaron a cabo exámenes físicos en todos los monos por los veterinarios encargados. Se recogieron muestras de sangre para análisis de hematología y de bioquímica sérica antes de las vacunaciones y luego 12, 42, 70, 97, 134 y 168 días después de las inmunizaciones.

Ensayos inmunológicos

Para determinar el efecto de las respuestas inmunes inducidas por estos regímenes terapéuticos, se utilizó un ensayo de puntos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISPOT) para la detección de la producción de IFN-! por los linfocitos estimulados por el antígeno específico. Las muestras de sangre para los análisis ELISPOT se recogieron antes de las vacunaciones y después a los 12, 42, 70, 97, 134 y 168 días después de las inmunizaciones. Se utilizaron péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias completas del antígeno gag SIV y PSA para la estimulación ex vivo de PBMC.

Resultados

Se cuantificaron las células secretoras de IFN-! específicas de antígeno en respuesta a los péptidos PSA o gag SIV por ELISPOT. La FIG. 16 (FIG. 16A-16D) ilustra los resultados obtenidos de los Grupos 1-4 respectivamente. El nivel de respuesta al PSA fue muy bajo en todos los grupos, indicando que la vacuna por sí misma no inducía una respuesta inmune medible y consistente cuando se comparaba con los animales no vacunados. Por otro lado, la vacunación sola con gag SIV dio como resultado un número significativo de células secretoras de IFN-! específicas de antígeno que aumentaba con el tiempo (FIG. 16A). Los animales sin tratar (no vacunados) mostraron 100-1.000 puntos/106 PBMC a lo largo del curso del estudio (FIG. 16D). Estos resultados establecieron la respuesta umbral a la vacuna; los animales que presentaron < 1.000 puntos/106 PBMC se consideró que no respondían. En el grupo de animales que recibieron la vacuna, 5 de 6 monos mostraron una respuesta aumentada a lo largo del tiempo, con un número medio de puntos después de la tercera inmunización (día 70) de 1.727 puntos/106 PBMC (DT=242, intervalo=1.403-1.068 puntos/106 PBMC). Un mono se consideró que no respondía (620 puntos/millón de PBMC). Ya que en estos estudios no se hizo la tipificación de CMH, es probable que la falta de respuesta de las células T a la vacuna por parte de algunos monos pueda deberse a un error de coincidencia con CMH. Notablemente, en el día 70, 4 de 6 animales tratados con gag SIV más mab 20H4.9-IgG4 presentaron un número significativamente más alto de puntos de IFN-! (FIG. 16C) en comparación con los animales de control (FIG. 16D) y con macacos que se inmunizaron con vacunas de ADN en solitario (FIG. 16A). El número medio de puntos después de la tercera inmunización para el grupo tratado con el mab 20H4.9-IgG4 fue de 3.465 puntos/106 PBMC (DT=1.236, intervalo=2.070-4.780 puntos/106 PBMC). Dos monos en ese grupo no respondieron a la vacuna (< 800 puntos/millón PBMC). A continuación de la tercera inmunización (día 70), el tratamiento con mab hu39E3.G4 más vacuna de ADN dio como resultado 6 de los 6 animales que se consideró como que respondieron con un número medio de puntos/106 PBMC de 2.348 (DT=588, intervalo=1.738-3.283) (FIG. 16B). Para este grupo, el intervalo del número de puntos era más bajo en comparación con los macacos tratados con mab 20H4.9-IgG4.

El tratamiento con tanto mab 20H4.9-IgG4 como mab hu9E3.G4, se toleró bien y no produjo ningún cambio significativo en los signos clínicos, los parámetros de química clínica, o parámetros hematológicos en relación con los monos control.

Estos datos muestran que el tratamiento con mab 20H4.9-IgG4 en combinación con una vacuna de ADN provocaba un aumento de la magnitud in vivo de la respuesta celular específica al antígeno de ensayo en relación a los controles o al tratamiento con hu39E3.G9, medido mediante las células secretoras de IFN-! específicas de antígeno. Ya que se utilizó un solo nivel de dosis de los anticuerpos y un solo régimen de dosificación en estos estudios preliminares, es poco probable que se indujeran respuestas máximas y es necesario trabajo adicional para optimizar las condiciones. Claramente, sin embargo, incluso con este protocolo no optimizado, se consiguió una mejora de la respuesta celular frente a los antígenos de ensayo con el mab 20H4.9-IgG4, sugiriendo que la modulación de la función de CD137 puede ser una estrategia atractiva para aumentar la eficacia de las vacunas de ADN.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Jure-Kunkel, Maria Hefta, Laura Santoro, Marc Ganguly, Subinay 5 <120> ANTICUERPOS ENTERAMENTE HUMANOS CONTRA 4-1BB HUMANO

<130> 10060 PCT

<150> US 60/510193 10 <151>

<150> Pendiente de asignación

<151> 15 <160> 9

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1 20 <211> 7057

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 25 <223> Secuencia artificial

<400> 1

<210> 2

<211> 7057 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223>: Secuencia artificial 10

<400> 2

<210> 3

<213> Artificial

<220>

<223>: Secuencia artificial 10

<400> 3

<210> 4

<211> 6435 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<400> 4

<210> 5

<211> 6435 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223>: Secuencia artificial 10

<400> 5

<210> 6

<213> Artificial

<220>

<223>: Secuencia artificial 10

<400> 6

<210> 7

<211> 1413 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<400> 7

<210> 8

<211> 1413 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223>: Secuencia artificial 10

<400> 8

<210> 9

<213> Artificial

<220>

<223>: Secuencia artificial 10

<400> 9

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a 4-1BB, que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que:

dicha región variable de cadena ligera comprende una CDR1 que consiste en los restos aminoacídicos 44-54 de SEC ID Nº: 6, una CDR2 que consiste en los restos aminoacídicos 70-76 de SEC ID Nº: 6, una CDR3 que consiste en los restos aminoacídicos 109-119 de SEC ID Nº: 6; y dicha región variable de cadena pesada comprende una CDR1 que consiste en los restos aminoacídicos 50-54 de SEC ID Nº: 3, una CDR2 que consiste en los restos aminoacídicos 69-84 de SEC ID Nº: 3 y una CDR3 que consiste en los restos aminoacídicos 117-129 de SEC ID Nº: 3.
2.

El anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que:

dicha cadena ligera comprende una región variable que consiste en los restos aminoacídicos 21-129 de SEC ID Nº: 6; y dicha cadena pesada comprende una región variable que consiste en los restos aminoacídicos 20-140 de SEC ID Nº: 3.
3.

Un anticuerpo monoclonal enteramente humano que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que dicha cadena ligera comprende los restos aminoacídicos 21-236 de SEC ID Nº: 6 y dicha cadena pesada comprende los restos aminoacídicos 20-467 de SEC ID Nº: 3.
4.

Una composición farmacéutica que comprende:

el anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5.

Una composición farmacéutica que comprende:

el anticuerpo monoclonal enteramente humano de la reivindicación 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6.

El anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de un cáncer.
7.

Uso de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de los restos aminoacídicos 20-467 de SEC ID Nº: 3 y un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de los restos aminoacídicos 21-236 de SEC ID Nº: 6 para producir un anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
8.

Uso de un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 y un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 4 para producir un anticuerpo monoclonal enteramente humano o una parte de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 4 y una región variable de cadena pesada codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1.