PT1670828E

PT1670828E - Anticorpos completamente humanos contra 4-1bb humano (cd137)

Info

Publication number: PT1670828E
Application number: PT47948377T
Authority: PT
Inventors: Edward L Halk; Maria Jure-Kunkel; Laura J Hefta; Marc Santoro; Subinay Ganguly
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2004-10-12
Publication date: 2013-11-04
Also published as: CA2542044C; BRPI0415195A; DK1670828T3; US20190062445A1; EP1670828B1; IL174460A0; AU2004279877A1; GEP20094829B; IL174460A; NO20061394L; JP4616838B2; RU2376316C2; NO338685B1; US20160368998A1; ES2432357T3; US8137667B2; RU2006115835A; KR101119266B1; RS20060234A; PL1670828T3

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS COMPLETAMENTE HUMANOS CONTRA 4-lBB HUMANO (CD137)"

Campo da invenção: A invenção está dirigida a anticorpos completamente humanos e, mais especificamente, a anticorpos completamente humanos a 4-lBB humano (CD137). ANTECEDENTES DA INVENÇÃO:

Um extenso corpo de evidência tem demonstrado de forma inequívoca que existe um certo grau de resposta imune contra o cancro em humanos e animais. Nos pacientes com cancro, os componentes celulares do sistema imune são capazes de reconhecer antígenos expressos por células tumorais, tais como diferenciação de antígenos oncofetais produtos de gene mutados (S. Rosenberg, Nature, 411:380-4 (2001); P. van der Bruggen et al., Immunological Rev., 188:51-64 (2002)). Um número de estudos clínicos mostrou que linfócitos infiltrantes de tumor têm significância prognóstica favorável (E. Halapi, Med. Oncol., 15(4): 203-11 (1998); Y. Naito et al. , Câncer Res., 58(16):34 91-4 (1998); L. Zhang et al., N.E. J. Med., 348(3):203-13 (2003)) . Além disso, o tratamento com imunomoduladores, tais como citocinas ou produtos bacterianos, vacinas contra o cancro ou imunoterapêutica adotiva conduziu a regressão de tumor num dado número de pacientes (S. Rosenberg, Câncer J. Sei. Am. 6(S):2 (2000); P. Bassi, Surg. Oncol., 11(1- 2):77-83 (2002); S. Antonia et al., Current Opinion in

Immunol., 16:130-6 (2004)). Apesar destas respostas, a imunidade contra o cancro falha com frequência na eliminação eficaz de células tumorais. As causas para esta falha podem ser agrupadas em três categorias principais: (i) reconhecimento de tumor deficiente pelas células imunes, seja por expressão variável dos antígenos tumorais 2 ou expressão reduzida da classe I do complexo maior de histocompatibilidade (MHC); (ii) microambiente imunossupressor de tumor, como resultado da secreção de citocinas inibidoras por células tumorais (por exemplo, TGF-β); e (iii) fraca imunogenicidade tumoral devido à falta de expressão de moléculas co-estimulantes nas células tumorais, que resulta na incapacidade das células tumorais de estimularem eficazmente as células T. Avanços no nosso entendimento sobre os requisitos para o reconhecimento do antigeno tumoral e função efetora imune indicam que uma estratégia potencial para aumentar uma resposta imune antitumoral é providenciar a co-estimulação através de uma molécula auxiliar. As células T especificas de antigeno tumoral requerem a co-estimulação para iniciar e manter as funções efetoras. Assim, as terapêuticas que direcionam as moléculas co-estimulantes podem ser aplicadas para modular e potenciar a resposta imune aos tumores. 0 modelo atual para a ativação das células T postula que as células T ingénuas (naif) requerem dois sinais para a ativação completa: (i) um sinal providenciado pela ligação de antigenos processados apresentados ao recetor das células T pelas moléculas de classe I do complexo maior de histocompatibilidade (MHC); e (ii) um sinal adicional providenciado pela interação de moléculas co-estimulantes na superfície das células T e seus ligandos nas células apresentadoras de antigeno. 0 reconhecimento de um antigeno por uma célula T ingénua é, por si só, insuficiente para despoletar a ativação das células T. Sem um sinal co-estimulante, as células T podem ser eliminadas por morte ou por indução de anergia. A sinalização através da molécula co-estimulante CD28 parece ser crucial para a iniciação das respostas das células T. Contudo, foi demonstrado que a sinalização por CD137 (4-1BB) é primordial para a manutenção e expansão da resposta imune aos antigenos, bem como, para a geração de células T de memória. 3 0 CD137 (4-1ΒΒ) é um membro da familia de genes do recetor de necrose tumoral (TNF-R), que inclui proteínas envolvidas na regulação da proliferação, diferenciação celular e morte celular programada. 0 CD137 é uma glicoproteína da membrana de tipo I com 30 kDa expressa como um homodímero com 55 kDa. 0 recetor foi inicialmente descrito em ratinhos (B. Kwon et al., P.N.A.S. USA, 86:1963-7 (1989)), e posteriormente identificado em humanos (M. Alderson et al., Eur. J. Immunol., 24: 2219-27 (1994); Z. Zhou et al., Immunol. Lett., 45:67 (1995)) (Ver, também, Pedidos PCT Publicados WO95/07984 e W096/29348, e Patente U.S. N.° 6 569 997 (Ver, SEQ. ID N.° 2)). As formas humana e murina de CD137 são 60% idênticas ao nível do aminoácido. As sequências conservadas ocorrem no domínio citoplasmático, bem como 5 outras regiões da molécula, indicando que esses resíduos podem ser importantes para a função da molécula CD137 (Z. Zhou et al., Immunol. Lett., 45: 67 (1995)). Demonstrou-se que a expressão de CD137 ocorre predominantemente em células da linhagem linfócita, tais como células T ativadas, células exterminadoras naturais (NK) ativadas, células T NK, células T reguladoras de CD4CD25 e também em timócitos ativados e linfócitos intraepiteliais. Além disso, também foi demonstrado que o CD137 é expresso em células de origem mielóide, como as células dendríticas, monócitos, neutrófilos e eosinófilos. Apesar da expressão de CD137 estar maioritariamente restrita às células imunes/inflamatórias, existem relatos que descrevem a sua expressão em células endoteliais associadas com um pequeno número de tecidos de locais inflamatórios e tumores.

As atividades funcionais de CD137 em células T foram amplamente caracterizadas. A sinalização através de CD137 na presença de doses subótimas de anti-CD3 foi demonstrada induzir a proliferação das células T e a síntese de citocina (fundamentalmente IFN-γ) e inibir a morte celular 4 ativada. Estes efeitos foram observados tanto com células T humanas como murinas (W. Shuford et al., J. Exp. Med., 186(1):47-55 (1997); D. Vinay et al., Semin. Immunol., 10(6):481-9 (1998); D. Laderach et al., Int. Immunol., 14(10):1155-67 (2002)). Em humanos e ratinhos, a co-estimulação potência funções efetoras, tais como a produção de IFN-γ e citotoxicidade, aumentando os números de células T CD8+ efetoras e especificas de antigeno. Na ausência de sinalização de anti-CD3, a estimulação através de CD137 não altera a função das células T, indicando que a CD137 é uma molécula co-estimuladora.

Os acontecimentos fisiológicos observados após a estimulação de CD137 em células T são mediados por sinais NF-κΒ e PI3K/ERK1/2 com funções fisiológicas separadas. Os sinais NF-κΒ despoletam a expressão de Bcl-XL, uma molécula anti-apopótica, resultando, assim, numa sobrevivência aumentada, ao passo que os sinais PI3K e ERK1/2 são especificamente responsáveis pela progressão do ciclo celular mediado por CD137 (H. Lee et al., J. Immunol., 169(9):4882-8 (2002)). O efeito da ativação de CD137 n inibição da morte celular induzida pela ativação foi demonstrado in vitro por Hurtado et aL (J. Hurtado et al., J. Immunol., 158 (6):2600-9 (1997)), e num sistema in vivo no qual se mostrou que os anticorpos monoclonais anti-CD137 (mabs) produziram sobrevivência a longo-prazo das células T CD8+ ativadas por superantigeno prevenindo a eliminação clonal (C. Takahashi et al., J. Immunol., 162:5037 (1999)). Posteriormente, dois relatos demonstraram que, em diferentes condições experimentais, o sinal CD137 regulou tanto a expansão clonal como a sobrevivência das células T CD8+ (D. Cooper et al., Eur. J. Immunol., 32(2):521-9 (2002); M. Maus et al., Nat. Biotechnol., 20:143 (2002)). A apoptose reduzida observada após a co-estimulação correlacionou-se com niveis aumentados de Bc1~xl nas células T CD8+, enquanto que a expressão de Bcl-2 5 permaneceu inalterada. Demonstrou-se que a regulação para montante dos genes anti-apoptóticos Bcl-xL e bfl-1 através do 4-1BB era mediada pela ativação de NF-κΒ, uma vez que o PDTC, um bloqueador especifico de NF-κΒ, inibiu a regulação para montante de Bcl-xL mediada por 4-1BB (H. Lee et al., J. Immunol., 169(9):4882-8 (2002)). Por outro lado, a expansão clonal das células T ativadas parece ser mediada por uma expressão aumentada das ciclinas D2, D3 e E, e pela regulação para jusante da proteína p27kipl. Este efeito ocorre de uma maneira simultâneamente dependente e independente de IL-2 (H. Lee et al., J. Immunol., 169(9) :4882-8 (2002)) .

No geral, a estimulação de CD137 resulta em expansão, sobrevivência e funções efetoras aumentadas de células T CD8+ recém-formadas, atuando, em parte, diretamente nessas células. Demostrou-se que ambas células CD4+ e T CD8+ respondem à estimulação de CD137, contudo, parece que o aumento da função das células T é superior nas células CD8+ (W. Shuford et al., J. Exp. Me d., 186(1):47-55 (1997); I. Gramaglia et al., Eur. J. Immunol., 30(2):392-402 (2000); C. Takahashi et al., J. Immunol., 162:5037 (1999)). Com base no papel crítico da estimulação da CD137 na função e sobrevivência das células T CD8+, a manipulação do sistema CD137/CD137L providencia uma abordagem plausível para o tratamento de tumores e patógenos virais.

Recentemente, demonstrou-se a expressão constitutiva de CD137 em células dendríticas recém-isoladas (DCs) em ratinhos (R. Wilcox et al., J. Immunol., 169(8):4230-6 (2002); T. Futagawa et al., Int. Immunol., 14(3):275-86 (2002)) e humanos (S. Pauly et al., J. Leukoc. Biol. 72(1):35-42 (2002)). Estes relatos mostraram que a estimulação de CD137 em DCs resultou na secreção de IL-6 e IL-12, e, mais importante, aumentou a capacidade das DC de estimularem as respostas das células T ao aloantígenos. Além disso, Pan et al. demonstraram que a sinalização por 6 CD137 em DCs resultou na regulação a montante de moléculas de classe I do MHC e co-estimulantes e produziu uma capacidade aumentada da DCs para se infiltrarem em tumores (P. Pan et al., J. Immunol., 172(8):4779-89 (2004)). Assim, a co-estimulação de CD137 em DCs parece ser uma nova via para a proliferação, maturação e migração de DCs.

As células exterminadoras naturais (NK) ativadas expressam a CD137 após a estimulação com citocinas (I. Melero et al., Cell Immunol., 190(2):167-72 (1998); R. Wilcox et al., J. Immunol., 169(8):4230-6 (2002)). Vários relatos demonstraram que as células NK parecem ser criticas para a modulação da resposta imune antitumoral induzida por anticorpos CD137 agonisticos ((I. Melero et al., Cell Immunol., 190(2):167-72 (1998); R. Miller et al., J. Immunol., 169(4):1792-800 (2002); R. Wilcox et al., J. Immunol., 169(8):4230-6 (2002)). O esgotamento de células NK reduz significativamente a atividade antitumoral de mabs anti-CD 137. A ligação de CD137 em células NK induz a proliferação e secreção de IFN-γ, mas não afeta a sua atividade citolitica. Notavelmente, in vitro, as células NK estimuladas por CD137 apresentaram uma atividade imunorreguladora ou "auxiliar" para as células T citoliticas CD8+ resultando na expansão das células T ativadas. Assim, a sinalização da CD137 em células NK pode modular a imunidade inata em relação a tumores.

Um efeito paradoxal foi descrito para a estimulação de CD137 no qual os anticorpos CD137 agonisticos podem induzir a supressão de respostas humorais aos antigenos das células T em modelos primatas e de ratinho (H. Hong et al., J. Immunother., 23(6):613-21 (2000); R Mittler et al., J. Exp. Med., 190(10):1535-40 (1999)). Notavelmente, demonstrou-se que os anticorpos CD137 agonisticos produzem uma melhoria significativa dos sintomas associados com as doenças autoimunes dependentes de anticorpo tais como lúpus eritematoso sistémico e encefalomielite autoimune 7 experimental (J. Foell et.al., N.Y. Acad. Sei., 987:230-5 (2003); Y. Sun et al., Nat. Med., 8(12):1405-13 (2002)). Recentemente, Seo et al. demonstraram que, num modelo de ratinho da artrite reumatóide, o tratamento com um anticorpo anti-CD137 agonistico preveniu o desenvolvimento da doença, e nomeadamente, bloqueou a progressão da doença (S. K. Seo et al., Nat. Med. 10; 1099-94 (2004)). O mecanismo responsável por este efeito não foi bem definido, mas no modelo da artrite reumatóide foi mostrado que o tratamento com um anticorpo CD137 agonistico resultou na expansão de células T CD11C-CD8+ produtoras de IFN-γ. O IFN-γ estimula, por sua vez, as células dendriticas para produzir indolamina-2,3-dioxigenase (IDO), que exerce atividades imunossupressoras. Também foi postulado que a sinalização de CD137 nas células T CD4 + ativadas por antigeno resulta na indução da secreção de IFN-γ que ativa macrófagos. Os macrófagos ativados podem, por sua vez, produzir sinais de morte para as células B. A sinalização continua via CD137 nas células T CD4+ pode subsequentemente induzir a morte celular induzida pela ativação (AICD) destas células T ativadas CD4+. Assim, eliminando as células T e B ativadas por antigeno, é observada uma resposta de anticorpo reduzida e, consequentemente, é observada uma redução dramática de doenças inflamatórias mediadas por Th2 (B. Kwon et al., J. Immunol., 168(11):5483-90 (2002)). Estes estudos sugerem um papel para o uso de anticorpos CD137 agonisticos para o tratamento de doenças inflamatórias ou autoimunes, sem induzir uma supressão geral do sistema imune. O ligando natural para CD137, ligando CD137 (CD137L), um membro da glicoproteina com 34kDa da superfamilia TNF, é detetado principalmente em células apresentadoras de antigeno ativadas (APC), tais como as células B, macrófagos, células dendriticas e também em linfomas das células B murinas, células T ativadas e linhas de carcinoma 8 humano de origem epitelial (R. Goodwin et al., Eur. J. Immunol., 23(10):2631-41 (1993); Z. Zhou et al., Immunol. Lett., 45:67 (1995); H. Salih et al., J. Immunol., 165(5): 2903-10 (2000)). A CD137L humana partilha 36% de homologia com o seu correspondente murino (M. Alderson et al. , Eur. J. Immunol., 24: 2219-27 (1994)).

Além de entregar sinais às células que expressam CD137, a ligação de CD137 a CD137L inicia um sinal bidirecional resultando em efeitos funcionais nas células que expressam CD137L. Langstein et al. demonstraram que a ligação da proteina de fusão CD137-Ig a CD137L em monócitos ativados induziram a produção de IL-6, IL-8 e TNF-a, regularam para montante ICAM e inibiram IL-10, resultando numa adesão aumentada (J. Langstein et al., J. Immunol., 160(5):2488-94 (1998)). Além disso, a proliferação de monócitos foi demonstrado juntamente com uma taxa superior de apoptose (J. Langstein et al., J. Leukoc. Biol., 65(6):829-33 (1999)). Estas observções foram confirmadas pelos estudos de Ju et al. (S. Ju et al., Hybrid Hybridomics, 22(5):333-8 (2003)), que mostraram que um anticorpo anti-CD137L functional induziu uma taxa elevada de proliferação dos monócitos sanguineos periféricos. Bloquear o ligando resultou na inibição da ativação das células T. Além disso, a CD137L solúvel foi encontrada no soro dos pacientes com artrite reumatóide e malignidades hematológicas (H. Salih et al., J. Immunol., 167(7): 4059-66 (2001)). Assim, a interação de CD137 influencia a CD137L e produz efeitos funcionais nas células T e APC.

Num outro aspeto importante da função das células T, foi demonstrado que os anticorpos anti-CD137 agonisticos resgataram respostas de células T aos antigenos proteicos em ratinhos com idade avançada. Foi bem documentado que ocorre um declinio relacionado com a idade na resposta imune aos antigenos, um processo conhecido como imunossenescência (R. Miller, Science, 273:70-4 (1996); R. 9

Miller, Vaccine, 18:1654-60 (2000); F. Hakim et al., Curr. Opinion Immunol., 16:151-156 (2004)). Este fenómeno parece ser devido a alterações no equilíbrio entre a extensão da expansão celular e sobrevivência celular ou morte. Bansal-Pakala et al. testaram a hipótese de que a co-estimulação secundária via CD137 pode ser utilizada para aumentar as respostas das células T em situações em que as células T não recebem estimulação suficiente, seja devido à expressão reduzida de CD3 ou CD28, ou à qualidade reduzida dos sinais. Os seus estudos mostraram que ratinhos com idade avançada tinham uma resposta de memória in vitro deficiente comparada com ratinhos jovens (P. Bansal-Pakala et al., J. Immunol., 169(9):5005-9 (2002)). Contudo, quando os ratinhos com idade avançada eram tratado com mabs anti-CD137, as respostas proliferativa e citocina das células T eram idênticas às respostas observadas em ratinhos jovens. Enquanto o mecanismo específico responsável por este efeito não foi elucidado, especulou-se que aumentar tanto a expressão das moléculas anti-apoptóticas, como Bcl-XL, como a promoção da secreção in vivo de IL-2 pode desempenhar um papel no resgate de respostas defeituosas das células T. Estes estudos demonstraram o potencial para os anticorpos anti-CD137 agonísticos para resgatarem respostas fracas de células T em indivíduos idosos imunocomprometidos e tem profundas implicações para o uso de anticorpos anti-CD137 nos pacientes com cancro. uma vez que o

Foi sugerido um papel para a terapêutica dirigida com CD137 no tratamento de cancro por estudos de eficácia in vivo em ratinhos utilizando anticorpos monoclonais CD137 anti-murinos agonísticos. Num artigo por Melero et al., o anticorpo CD137 anti-ratinho agonístico produziu curas em tumores mastocitomas P815 e no modelo de tumor com baixa imunogenicidade Agl04 (I. Melero et al., Nat. Med., 3(6):682-5 (1997)). O efeito anti-tumoral precisou de ambas células T CD4+ e CD8+ e células NK, 10 esgotamento in vivo seletivo de cada subpopulação resultou na redução ou perda completa do efeito anti-tumoral. Também foi demonstrado que foi necessária uma indução mínima de uma resposta imune para que a terapêutica anti-CD137 fosse eficaz. Vários investigadores utilizaram anticorpos anti-CD137 para demonstrarem a viabilidade desta abordagem para a terapêutica de cancro (J. Kim et al., Câncer Res. 61 (5) :2031-7 (2001); 0. Martinet et al., Gene Ther. 9(12) :786-92 (2002); R. Miller et al., J. Immunol. 169(4):1792-800 (2002) ; R. Wilcox et al., Câncer Res. 62(15):4413-8 (2002)). A apoiar os dados de eficácia anti-tumoral com os anticorpos CD137 agonísticos, demonstrou-se que os sinais providenciados por CD137L despoletam a atividade CTL e respostas anti-tumorais (M. DeBenedette et al., J.

Immunol., 163(9):4833-41 (1999); B. Guinn et al., J.

ImmunoL, 162(8):5003-10 (1999)). Vários relatos demonstraram que a transferência de genes do ligando CD137 em carcinomas murinos resultou na rejeição do tumor, demonstrando o requisito de co-estimulação na geração de uma resposta imune eficiente (S. Mogi et al., Immunology, 101(4):541-7 (2000); L Melero et al., Cell Immunol., 190(2): 167-72 (1998); B. Guinn et al., J. Immunol., 162(8):5003-10 (1999)). Salih et al. relataram a expressão de CD137L em carcinomas humanes e linhas de células de carcinoma humano (H. Salih et al., J. Immunol., 165(5):2903-10 (2000)) e demonstraram que as células tumorais que expressam o ligando eram capazes de entregar um sinal co-estimulador a células T que resultou na libertação de IFN-γ e IL-2 e que este efeito estava correlacionado com os níveis de CD137L nos tumores. Não é conhecido se a expressão de CD137L em tumores humanos poderia tornar estes tumores mais suscetíveis a anticorpos CD137 agonísticos.

Ratinhos CD137L -/- ficaram classificados por baixo na 11 importância do sistema CD137/CD137L em respostas das células T a virus e tumores (M. DeBenedette et al., J. Immunol., 163(9):4833-41 (1999); J. Tan et al., J. Immunol., 164 (5) :2320-5 (2000); B. Kwon et al., J. Immunol., 168 (11) :5483-90 (2002)) . Estudos que utilizaram ratinhos deficientes em CD137 e CD137L demonstraram a importância da co-estimulação de CD137 na doença enxerto-vs-hospedeiro, e respostas das células T citoliticas anti-virais. Os ratinhos deficientes em CD137 mostraram uma proliferação aumentada de células T, mas uma redução na produção de citocinas e na atividade das células T citotóxicas (B. Kwon et al., J. Immunol., 168(11):5483-90 (2002) ; D. Vinay et al., Immunol. Cell Biol., 81(3):176-84 (2003) ) . Mais recentemente, foi demonstrado que os ratinhos knockout (CD137-/-) tinham uma frequência superior de metástases de tumor (4 vezes) comparados com os ratinhos controlo. Estes dados sugerem que a restauração da sinalização de CD137 pelo uso de anticorpos anti-CD137 agonisticos é uma abordagem plausível para aumentar as respostas imunes celulares a patógenos virais e cancros.

Além dos dados em modelos de ratinho in vivo que suportam o envolvimento da sinalização de CD137 em respostas imunes antitumorais, os estudos conduzidos em amostras de tumor humanos primários confirmaram o papel de CD137 na geração de células T efetoras. Em pacientes com sarcoma de Ewing, Zhang et al. mostraram que as células T efetoras intratumorais apresentaram o fenótipo CD3+/CD8+/CD28-/CD 137+. Inesperadamente, foi observada a co-existência do crescimento tumoral progressivo e imunidade anti-tumoral (células T efetoras). Os estudos de estimulação ex vivo com células de pacientes demonstraram que a proliferação e a ativação das células T induzidas por tumor precisavam da co-estimulação com CD137L. A estimulação de PBL com anti-CD3/CD137L, mas não anti-CD3/anti-CD28, induziu efetores liticos tumorais. Estes 12 estudos providenciaram evidência adicional de que a co-estimulação mediada pela CD137 poderia resultar na expansão de CTLs reativas de tumor (H. Zhang et al., Câncer Biol. Ther., 2(5):579-86 (2003)). Além disso, a expressão de CD137 foi demonstrada em linfócitos infiltrantes de tumor em carcinomas hepatocelulares (HCC) (Y. Wan et al., World J. Gastroenterol, 10(2):195-9 (2004)). A expressão de CD137 foi detetada em 19 de 19 HCC por RT-PCR e em 13/19 por coloração por imunofluorescência. Contrariamente, a CD137 não foi detetada nas células mononucleares periféricas dos mesmos pacientes. Análises conduzidas em tecidos hepáticos de dadores saudáveis falhou em demonstrar a expressão de CD137. Estes estudos não tentaram correlacionar doença clinica com a expressão de CD137. Assim, os estudos conduzidos em sarcoma de Ewing e carcinoma hepatocelular revelaram a presença de TIL que expressa CD137, com progressão de doença concomitante. Em sarcomas de Ewing foi demonstrado que TILs CD137+ eram capazes de matar células tumorais ex-vivo sugerindo que a via CD137 permanecia intacta nesses pacientes e que, talvez, os fatores supressores no microambiente do tumor inibiam a sua função. Assim, pode ser postulado que a administração sistémica de anticorpos CD137 agonísticos pode providenciar o sinal necessário para a expansão destas células T efetoras.

Além do seu papel no desenvolvimento da imunidade contra o cancro, os dados experimentais suportam o uso de anticorpos CD137 agonisticos para o tratamento de doenças autoimunes e virais (B. Kwon et al., Exp. Mol. Med., 35(1):8-16 (2003); H. Salih et al., J. Immunol., 167(7):4059-66 (2001); E. Kwon et al., P.N.A.S. USA, 96:15074-79 (1999); J. Foell et al., N.Y. Acad. Sei., 987:230.5 (2003); Y. Sun et al., Nat. Med., 8(12):1405-13 (2002) S. K. Seo et al, Nat. Med. 10; 1099-94 (2004)). O documento W09816249 revela um método para aumentar a morte linfocitica de células tumorais num hospedeiro 13 compreendendo administrar ao hospedeiro uma dose eficaz de um anticorpo anti-4-ΙΒΒ (CD137) . Para administração aos tumores, o anticorpo é preferencialmente um anticorpo substancialmente humano (c.f. página 5, I 30-35). O mAb 1D8 murino, gerado imunizando com 4-1BB murino, é reportado como sendo único por se ligar com a região proximal da membrana do dominio extracelular de 4-1BB não envolvida na ligação a 4-1BBL (c.f. página 14, I 28-31). O documento W02004010947 providencia um anticorpo anti-4-ΙΒΒ humano humanizado, isto é, Hu39E3.G4, que não inibe a ligação de 4-1BB humano a um ligando 4-1BB humano. Também é providenciado um método para tratar cancro num indivíduo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo a dito indivíduo. LOO D T et al. (The Journal of Biological Chemistry; 7 Mar. 1997, 272(10): 6448-6456) reporta que a ligação de 4-1BBL ao complexo 4-1BB.LN não desloca a laminina (LN), isto é, os dois ligandos ligam-se a locais proximais, mas diferentes, em 4-1 BB. Anticorpos monoclonais 6/8 anti-4-1 BB bloqueiam a interação entre 4-1BB e 4-1 BBL, enquanto que 7 bloqueia a ligação de LN. O anticorpo 1 D8 mostrou bloquear a ligação de LN mas não de 4-1BB murino e reconhecer a proteína 4-1BB truncada deficiente na ligação de 4-1BBL que carece de domínio homólogo a LN N-terminal (c.f. resumo; página 6452).

Consequentemente, com base nos papéis de 4-1BB na modulação da resposta imune, seria desejável produzir anticorpos anti-4-lBB humanos com atividades agonisticas que poderiam ser utilizadas no tratamento ou prevenção de doenças humanas, tais como cancro, doenças infeciosas e doenças autoimunes. BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO: O âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações. A presente invenção providencia anticorpos 14 completamente humanos que se ligam a 4-1BB humano (H4-1BB) e que permitem a ligação de H4-1BB a um ligando 4-1BB humano (H4-I BBL). Assim, a invenção está dirigida a anticorpos que se ligam a H4-1BB e que não bloqueiam a ligação de H4-1BB a H4-1BBL, permitindo assim a ligação tanto de um anticorpo da invenção e H4-1BBL a H4-1BB. A invenção também providencia anticorpos com atividades agonísticas de modo que a ligação dos anticorpos a H4-1BB resulta numa melhoria e estimulação de respostas imunes mediadas por H4-1BB. Estes anticorpos podem ser utilizados como imunopotenciadores de uma resposta imune anti-tumoral ou anti-viral, ou como imunomoduladores de doenças autoimunes mediadas por células T. Os anticorpos podem também ser utilizados como ferramentas de diagnóstico para a deteção de H4-1BB no sangue ou tecidos de pacientes com cancro, doenças autoimunes ou outras doenças.

Num aspeto, a invenção providencia um anticorpo monoclonal completamente humano ou porção de ligação ao antigeno do mesmo que se liga especificamente a H4-1BB, compreendendo uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada, em que a região variável da cadeia leve compreende uma CDR1 (região determinante complementar 1) , a CDR2 (região determinante complementar 2) , e uma CDR3 (região determinante complementar 3) conforme representado na FIG. 4, e a região variável da cadeia pesada compreende uma CDR1 (região determinante complementar 1), uma CDR2 (região determinante complementar 2) e uma CDR3 (região determinante complementar 3) conforme representado na FIG. 3 ou FIG. 7. 0 anticorpo monoclonal (mab) pode ser, por exemplo, um anticorpo IgG4 ou anticorpo IgG 1.

Num outro aspeto, a invenção providencia um anticorpo monoclonal completamente humano ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, em que a cadeia leve compreende uma região variável conforme representado na FIG. 4 e a cadeia 15 pesada compreende uma região variável, conforme representado na FIG. 3 ou FIG. 7.

Num outro aspeto, a invenção providencia um anticorpo monoclonal completamente humano compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia leve compreende os residuos de aminoácidos 21-236 da SEQ. ID N.° 6 e a cadeia pesada compreende os residuos de aminoácidos 20-467 da SEQ. ID N.° 3. Noutro aspeto, a invenção providencia um anticorpo monoclonal completamente humano compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia leve compreende os residuos de aminoácidos 21-236 da SEQ. ID N.° 6 e a cadeia pesada compreende os residuos de aminoácidos 20-470 da SEQ. ID N.° 9.

Os anticorpos da invenção têm aplicações terapêuticas amplas como imunomoduladores de doenças, tais como cancro, doenças autoimunes, doenças inflamatórias e doenças infeciosas. A invenção providencia, ainda, um anticorpo ou porção de anticorpo de ligação ao antigeno da invenção para utilização no tratamento de cancro num indivíduo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de dito anticorpo ou porção de anticorpo de ligação ao antigeno ao indivíduo. Num aspeto, esta utilização compreende, ainda, administrar uma vacina. Vacinas adequadas incluem, por exemplo, uma vacina de célula de tumor, uma vacina de ADN, uma vacina de célula de tumor modificada por GM-CSF ou uma vacina de célula dendrítica carregada de antigeno. 0 cancro pode ser, por exemplo, cancro da próstata, melanoma ou cancro epitelial.

Além disso, são revelados aqui um método para aumentar a resposta imune, compreendendo a administração de um anticorpo da invenção e uma vacina gag SIV; um método para aumentar a resposta imune, compreendendo a administração de um anticorpo da invenção e uma vacina PSA; um método para aumentar a resposta imune a uma vacina gag SIV, 16 compreendendo a administração de um anticorpo da invenção; e um método para aumentar a resposta imune a uma vacina PSA, compreendendo a administração de um anticorpo da invenção. A invenção também providencia composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo da invenção ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo e um veiculo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser administrada isolada ou em combinação com um agente, por exemplo, um agente para tratar cancro, tal como um agente quimioterapêutico ou uma vacina ou outro agente imunomodulador.

Além disso, são revelados aqui polinucleotideos isolados compreendendo uma sequência nucleotidica selecionada de: (a) nucleotideos que codificam a sequência de aminoácidos dos residuos de aminoácidos 20-467 da SEQ. ID N.° 3; (b) nucleotideos que codificam a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 3; (c) nucleotideos que codificam a sequência de aminoácidos dos residuos de aminoácidos 21-236 da SEQ. ID N.° 6; (d) nucleotideos que codificam a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 6; (e) nucleotideos que codificam a sequência de aminoácidos dos residuos de aminoácidos 20-470 da SEQ. ID N.° 9; (f) nucleotideos que codificam a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 9; e (g) nucleotideos que codificam um fragmento de uma sequência de aminoácidos de (a) a (f) , tal como uma região variável, região constante, ou uma ou mais CDRs. Os polinucleotideos isolados revelados aqui compreendem, ainda, sequências nucleotidicas que codificam pelo menos uma CDR da FIG. 3, pelo menos uma CDR da FIG. 4, ou pelo menos uma CDR da FIG. 7. Além disso, os polinucleotideos isolados que compreendem a sequência nucleotidica da SEQ. ID N.° 1, SEQ. ID N.° 4 ou SEQ. ID N.° 7 são revelados aqui.

Além disso, polipeptídeos isolados compreendendo uma 17 sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ. ID N.° 3, SEQ. ID N.° 6 e SEQ. ID N.° 9; polipeptídeos isolados compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 20-467 da SEQ. ID N.° 3, polipeptídeos isolados compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 21-236 da SEQ. ID N.° 6, e polipeptídeos isolados compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 20-470 da SEQ. ID N.° 9; bem como os polipeptídeos isolados compreendendo a sequência de aminoácidos de pelo menos uma CDR da FIG. 3, FIG. 4 ou FIG. 7, ou pelo menos a região variável ou constante das FIG. 3, FIG. 4 ou FIG. 7 são revelados aqui.

Além disso, é revelada aqui uma imunoglobulina com especificidade de ligação para H4-1BB, dita imunoglobulina compreendendo uma região de ligação ao antígeno. Num aspeto, a imunoglobulina é um Fab ou F(ab')2 de um anticorpo da invenção.

Além disso, são revelados aqui uma linha de células que produz um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, vetores de expressão recombinantes que incluem os nucleotídeos da invenção e métodos para fabricar os anticorpos da invenção cultivando uma linha de células produtoras de anticorpo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS: A FIG. 1 mostra um mapa de plasmídeo de pDl7-20H4.9.h4a. A FIG. 2 mostra um mapa de plasmídeo de pDl6gate-20H4.9.LC. A FIG. 3 (FIGS. 3A-3H) mostra a sequência nucleotídica do plasmídeo pD17-20H4.9.h4a, incluindo a cadeia codificante (SEQ. ID N.° 1), cadeia complementar (SEQ. ID N.° 2) e sequência de aminoácidos (péptido líder é os resíduos de aminoácidos 1-19 da SEQ. ID N.° 3; cadeia pesada é resíduos de aminoácidos 20-467 da SEQ. ID N.° 3) codificada pela cadeia codificante.

A FIG. 4 (FIGS. 4A-4F) mostra a sequência nucleotídica v pDl6gate-20H4.9.LC, incluindo a cadeia codificante (SEQ. ID 18 Ν.° 4), cadeia complementar (SEQ. ID N.° 5) e sequência de aminoácidos (péptido lider é os residuos de aminoácidos 1-20 da SEQ. ID N.° 6; cadeia leve é residuos de aminoácidos 21-236 da SEQ. ID N.° 6) codificada pela cadeia codificante. A FIG. 5 mostra um esquema da sequência de construção da cadeia pesada 20H4.9-IgGl. A FIG. 6 mostra um esquema da sequência de construção da cadeia leve 20H4.9. A FIG. 7 (FIGS. 7A-7D mostram o nucleotide e sequências de aminoácidos da construção da cadeia pesada 20H4.9-IgGl, incluindo a cadeia codificante (SEQ. ID N.° 7), cadeia complementar (SEQ. ID N.° 8) e sequência de aminoácidos (péptido lider é os residuos de aminoácidos 1-19 da SEQ. ID N.° 9; cadeia pesada é residuos de aminoácidos 20-470 e SEQ. ID N.° 9) codificada pela cadeia codificante. A FIG. 8 (FIGS. 8A-8B) ilustra os resultados obtidos a partir da ligação de mab 20H4.9-IgGl a CD137 humano por ELISA (FIG. 8A) e o efeito do mab 20H4.9-IgGl na interação CD137-CD137L (FIG. 8B). A FIG. 9 (FIGS. 9A-9B) ilustra os resultados obtidos a partir da ligação de mab 20H4.9-IgGl com células de macaco Cynomolgus ou humanas estimuladas por PMA-ionomicina. CEM humanas (FIG. 9A) ou PBMC de macaco (FIG. 9B) foram incubadas com 20H4.9-IgGl ou proteína de fusão CD137L humana. A FIG. 10 (FIGS. 10A-10B) ilustra os resultados obtidos pela indução de IFN-γ em estudos co-estimuladores com anticorpos anti-CD137, que são expressos em n° de vezes de aumento em pg/ml em relação aos controlos. Devido à resposta de fundo variável entre dadores, os dados foram normalizados em relação aos tratamentos controlo (=1). O nível basal IFN-γ mediano para células T humanas (FIG. 10A) ou PBMC de macaco (FIG. 10B) estimuladas com anti-CD3 isolada foi 592 pg/ml e 505 pg/ml, respetivamente. 19 A FIG. 11 providencia gráficos de ressonância de plásmon de ligação do mab 20H4.9-IgG4 e mab 20H4.9-IgGl a CD137 humana.

A FIG. 12 ilustra a ligação dependente da concentração de 20H4.9-IgG4 a células CEM humanas estimuladas por PMA ionomicina, mas nenhuma ligação a células CEM não estimuladas. A FIG. 13 (FIGS. 13A-B) ilustra a indução de IFN-γ em estudos co-estimuladores com anticorpos anti-CD137. Os resultados são expressos como n° de vezes de aumento em pg/ml em relação aos controlos. Devido à resposta de fundo variável entre dadores, os dados foram normalizados em relação aos tratamentos controlo ( = 1) . 0 nivel basal IFN-γ mediano para células T humanas (FIG. 13A) ou PBMC de macaco (FIG. 13B) estimuladas com anti-CD3 isolado foi 592 pg/ml e 505 pg/ml, respetivamente. A FIG. 14 (FIGS. 14A-14B) ilustra os resultados obtidosdo aumento dependente da dose da síntese de IFN-γ pelo mab 20H4.9-IgG4 (FIG. 14A) e o efeito da ligação cruzada do anticorpo pela adição do anticorpo IgG anti-humano ligado de forma cruzada (7 mg/ml) (FIG. 14B). A FIG. 15 ilustra o efeito do mab 20H4.9-IgG4 na sobrevivência das células T e na progressão do ciclo celular. Células T humanas foram co-estimuladas com anti-CD3 (1 ug/ml) ± mab 20H4.9-IgG4 às concentrações listadas. Seis dias depois da iniciação dos ensaios, as células foram recolhidas e coradas com Anexina-V e iodeto de propídio para determinar o número de células vivas (Anexina V/PI negativa) ou ciclina D2 conjugada com PE para detetar células cíclicas. Os resultados representam a média (±SD) de 4 lotes de mab 20H4.9-IgG4 testados em paralelo. A FIG. 16 (FIGS. 16A-16D) mostra em macacos Cynomolgus a resposta de IFN-γ específica de antígeno conforme medido por ELISPOT depois de tratamento com uma vacina de ADN ± anticorpos 4-1B8 anti-humanos. Os animais foram tratados 20 com uma vacina gag SIV (dia 0, 28, 56; FIG. 16A), vacina gag SIV (dia 0, 28, 56) e mab 20H4.9-IgG4 (dia 12, 15 e 19; FIG. 16B) ou vacina gag SIV (dia 0, 28, 56) e hu39E3.G4 (dia 12, 15 e 19; FIG 16C) . Um grupo de animais não foi tratado (FIG. 16D). Em vários momentos após o tratamento, foi recolhido sangue e PBMC foram separados e avaliados pela sua capacidade de segregar IFN-γ na presença de estimulação de antigeno. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO: O âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações. A invenção está dirigida para a preparação e caracterização de anticorpos e fragmentos de ligação ao antigeno do mesmo (incluindo proteínas de fusão que compreendem um fragmento de ligação ao antigeno de um anticorpo da invenção), para utilização no tratamento de uma doença, tal como cancro, doença infeciosa, doença inflamatória ou doença autoimune. O cancro pode ser, por exemplo, cancro da próstata, melanoma ou cancro epitelial.

Os anticorpos são capazes de se ligarem a H4-1BB e podem apresentar elevada afinidade por H4-1BB e aumentarem eficazmente as respostas das células T. Num aspeto, o anticorpo induz a produção de IFN-γ em ensaios co-estimuladores, mas não afeta a ligação de H4-1BB ao seu ligando correspondente, H4-1BBL, e não fixa o complemento.

Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na arte. Num aspeto, os anticorpos podem ser produzidos por expressão em células transfetadas, tais como células eucarióticas imortalizadas, tais como células de mieloma ou de hibridoma.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados isolados ou em conjunto com outros agentes terapêuticos tais como radioterapêutica (incluindo radiação), terapêutica hormonal, agentes citotóxicos, vacinas e outros agentes imunomoduladores, tais como citocinas e 21 modificadores de resposta biológica. Estes agentes são particularmente úteis no tratamento de cancro e distúrbios imunoproliferativos. A invenção providencia o anticorpo monoclonal (mab) 20H4.9-IgG4. As FIGS. 1 e 2 providenciam mapas de plasmideo de pD17-20H4.9.h4a e pD16gate-20H4.9.LC, respetivamente, que pode ser utilizado para produzir mab 20H4.9-IgG4. A FIG. 3 (FIGS. 3A-3H) providencia a sequência nucleotidica do plasmideo pD17-20H4.9.h4a, incluindo a cadeia codificante (SEQ. ID N.° 1), cadeia complementar (SEQ. ID N.° 2) e sequência de aminoácidos (péptido lider é residuos de aminoácidos 1-19 da SEQ. ID N.° 3; cadeia pesada é residuos de aminoácidos 20-467 da SEQ. ID N.° 3) codificada pela cadeia codificante. A FIG. 4 (FIGS. 4A-4F) mostra a sequência nucleotidica do plasmideo pDl6gate-20H4.9.LC, incluindo a cadeia codificante (SEQ. ID N.° 4), cadeia complementar (SEQ. ID N.° 5) e sequência de aminoácidos (péptido lider é residuos de aminoácidos 1-20 da SEQ. ID N.° 6; cadeia leve é residuos de aminoácidos 21-236 of SEQ. ID N.° 6) codificada pela cadeia codificante.

Noutro aspeto, a invenção providencia o anticorpo monoclonal (mab) 20H4.9-IgGl. A FIG. 5 mostra esquematicamente uma construção de sequência de cadeia pesada do mab 20H4.9-IgGl. A FIG. 6 mostra esquematicamente uma construção de sequência de cadeia leve de mab 20H4.9, para ambos mab 20H4.9-IgG4 e 20 H4.9-IgGl. A FIG. 7 providencia a sequência nucleotidica (cadeia codificante (SEQ. ID N.° 7) e cadeia complementar (SEQ. ID N.° 8)) da construção de sequência da cadeia pesada da FIG. 5 e a sequência de aminoácidos (péptido lider é residuos de aminoácidos 1-19 da SEQ. ID N.° 9; cadeia pesada é residuos de aminoácidos 20-470 da SEQ. ID N.° 9) codificada pela cadeia codificante. A cadeia leve de mab 20H4.9-IgGl é a mesma que a cadeia leve do mab 20H4.9-IgG4. A invenção também abrange anticorpos com substituições 22 de aminoácidos conservadores das sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve representados nas SEQ ID N.° 3, 6 e 9 que não têm substancialmente qualquer efeito na liqação de H4-1BB. As substituições conservadoras incluem tipicamente a substituição de um aminoácido por outro com caracteristicas semelhantes, por exemplo, substituições dentro dos sequintes qrupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina.

Os polinucleotideos que codificam os polipéptidos da invenção tipicamente compreendem, ainda, uma sequência de controlo da expressão operacionalmente ligada a sequências codificantes de polipéptido, incluindo regiões promotoras heterólogas ou naturalmente associadas. Preferencialmente, as sequências de controlo da expressão serão sistemas promotores eucarióticas em vetores capazes de transformar ou transfetar células hospedeiras eucariontes, mas sequências controlo para hospedeiros procarióticos também podem ser utilizadas. Assim que o vetor tenha sido incorporado num hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido em condições adequadas para alto nivel de expressão das sequências nucleotidicas e, conforme desejado, a recolha e purificação da cadeia leve, cadeia pesada, dimeros de cadeia pesada/leve ou anticorpo intacto, fragmentos de ligação ou outra forma de imunoglobulina podem seguir. (Ver, S. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y. (1979)). Os anticorpos de cadeia simples ou minicorpos (anticorpos de cadeia simples fundidos com um ou mais dominios CH) também podem ser produzidos juntando sequências de ácido nucleico que codificam as regiões VL e VH revelados aqui com ADN que codifica um ligante (linker) polipéptido.

Hospedeiros procarióticos, tais como E. coli, e outros micróbios, tais como levedura, podem ser utilizados para 23 expressar um anticorpo da invenção. Além dos microorganismos, também pode ser utilizada cultura de células de tecido de mamífero para expressar e produzir os anticorpos da invenção. As células eucarióticas podem ser preferidas, porque foi desenvolvido um número de linhas de células de hospedeiro adequadas capaz de secretar imunoglobulinas intactas incluindo, por exemplo, linhas de células CHO (ovário de hamster chinês), linhas de células COS (linha de células de fibroblastos de macaco verde Africano), células HeLa, linhas de células de mieloma e hibridomas. Os vetores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo de expressão, tais como um promotor ou potenciador, e locais de informação de processamento necessários, tais como locais de ligação de ribossomas, locais de divisão de ARN, locais de poliadenilação e sequências terminadoras transcripcionais, todos bem conhecidos na arte.

Os vetores que contêm os segmentos de ADN de interesse (por exemplo, as sequências codificantes da cadeia leve e/ou pesada e sequências de controlo de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfeção com cloreto de cálcio é normalmente utilizada para células procarióticas, ao passo que tratamento com fosfato de cálcio, lipofeção ou electroporação podem ser utilizados para outros hospedeiros celulares. (Ver, por exemplo, T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982)).

Uma vez expressos, os anticorpos, os seus dímeros, cadeias pesada e leve individuais e ou outras formas de imunoglobulina podem ser purificados de acordo com procedimentos convencionais na arte, tais como precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e afins. As imunoglobulinas substancialmente puras de, pelo menos, 90 a 95% de homogeneidade são desejáveis e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são ainda mais desejáveis.

Os anticorpos da invenção são úteis para modular respostas imunes de células T e mediadas por anticorpo. Estados de doenças típicos adequados para tratamento incluem cancros, doenças infeciosas, doenças inflamatórias e doenças autoimunes, tais como esclerose múltipla, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico e miastenia grave. A invenção também providencia composições farmacêuticas compreendendo, pelo menos, um anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições farmacêuticas também podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes tamponantes, agentes potenciadores de estabilidade, tais como manitol ou tween 80, agentes de ajuste de toxicidade e afins, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio ou albumina humana.

Os anticorpos e composições farmacêuticas da invenção são particularmente úteis para administração parentérica, incluindo administração subcutânea, intramuscular e intravenosa. As composições farmacêuticas para administração parentérica podem compreender uma solução do anticorpo dissolvida num veículo aceitável, preferencialmente um veículo aquoso. Pode ser utilizada uma variedade de veículos aquosos, todos bem conhecidos na arte, por exemplo, água, água tamponada, solução salina, glicina e afins. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria particulada. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de 25 dosagem. A composição farmacêutica pode ainda compreender um agente adicional para tratamento de uma doença. Num aspeto, a composição farmacêutica inclui um agente para tratamento de um cancro, uma doença infeciosa, doença inflamatória ou doença autoimune. 0 anticorpo da invenção também pode ser co-administrado ou administrado separadamente com um agente adicional para tratamento de uma doença.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados com outros agentes para aumentar a resposta imune a células cancerígenas num paciente. Num aspeto, o anticorpo é utilizado em combinação com um agente imunogénico, tal como células cancerígenas, antígenos tumorais purificados (incluindo proteínas recombinantes, péptidos e moléculas carbohidratos) ou células transfetadas com genes que codificam citocinas estimuladoras imunes e antígenos de superfície celular. Noutro aspeto, o anticorpo é utilizado em combinação com uma vacina, tal como, por exemplo, uma vacina de célula de tumor, uma vacina de ADN, uma vacina de célula de tumor modificada por gene, tal como vacina de célula de tumor modificada por GM-CSF, uma vacina peptídica ou uma vacina de célula dendrítica carregada de antígeno.

Muitas estratégias experimentais para vacinação contra tumores têm sido desenhadas. Numa dessas estratégias, é preparada uma vacina utilizando células tumorais autólogas ou alogénicas. Tem sido demonstrado que estas vacinas celulares são mais eficazes quando as células tumorais são transduzidas para expressar GM-CSF. 0 GM-CSF tem mostrado ser um ativador potente de apresentação de antígeno para vacinação tumoral (Dranoff et al., P.N.A.S., 90:3539-4.3 (1993); E. Jafee et al., J. Clin. Oncol., 19:145-56 (2001); R. Salgia et al., J. Clin. Oncol., 21:624-30 (2003)). O estudo da expressão génica e dos padrões de expressão génica a grande escala em vários tumores tem conduzido à definição dos chamados antígenos específicos de 26 tumor (S. Rosenberg, Immunity 10:281-7 (1999)). Em muitos casos, estes antígenos específicos de tumor são antígenos de diferenciação expressos nos tumores e na célula a partir da gual o tumor surgiu, por exemplo antígenos gp 100 de melanócito, antígenos MAGE, Trp-2. Muitos destes antígenos podem ser mostrados como sendo alvos de células T específicas de tumor encontradas no hospedeiro. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados em conjunto com uma coleção de proteínas recombinantes e/ou péptidos expressos num tumor, de modo a amplificar e dirigir a resposta imune a esses antígenos em direção a uma resposta Thl. Estas proteínas são normalmente vistas pelo sistema imune como auto-antígenos e são, por isso, tolerantes a elas.

Num aspeto, o anticorpo da invenção é combinado com um agente imunodulador compreendendo o antígeno gag SIV (como um modelo para vacina de ADN contra HIV) ou antígeno específico da próstata (PSA) ou uma vacina de ADN compreendendo a sequência nucleotídica que codifica o antígeno gag SIV ou antígeno específico da próstata (PSA). As vacinas PSA são descritas em, por exemplo, M. Pavlenko et al., Br. J. Câncer, 91(4):688-94 (2004); J. Wolchok et al., Semin. Oncol., 30(5):659-66 (2003); J. Kim et al., Clin. Câncer Res., 7(3 Suppl.):882s-889s (2001). As vacinas SIV gag são descritas em, por exemplo, B. Makitalo et al., J. Gen. Virol., 85(Pt 8):2407-19 (2004); N. Letvin et al., J. Virol., 78(14):7490-7 (2004); S. Mossman et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses., 20(4):425-34 (2004); F. Bertley et al., J. Immunol., 172(6):3745-57 (2004); L. Patterson et al., J. Virol., 78(5)2212-21 (2004); E. 0'Neill et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 19(10):883-90 (2003); Z. Bu et al., Virology, 309(2):272-81 (2003). O antígeno tumoral também pode incluir, por exemplo, uma proteína telomerase, que é necessária para a síntese de telomeres dos cromossomas e que é expressa em mais de 85% 27 dos cancros humanos e apenas num número limitado de tecidos somáticos (N. Kim et al., Science, 266,2011-2013 (1994)). O antigeno tumoral também pode ser "neo-antígenos" expressos cem células cancerígenas por causa de mutações somáticas que alteram a sequência proteica ou criam proteínas de fusão entre duas sequências não relacionadas ou idiótipos dos tumores das células B. Outras vacinas tumorais podem incluir as proteínas de vírus implicadas em cancros humanos tais como os vírus do Papiloma Humano (HPV), vírus da hepatite (HBV e HCV) e o vírus do Sarcoma Herpes de Kaposi (KHSV). Outra forma de antigeno específico de tumor que pode ser utilizado com um anticorpo da invenção são as proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do próprio tecido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células tumorais e estas HSPs são altamente eficientes na entrega das células apresentadoras de antigeno para despoletarem a imunidade tumoral (R. Suot et al., Science 269: 1585-1588 (1995); Y. Tamura et al., Science 278:117-120 (1997)).

Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados para aumentar a resposta imune a vacinas a antígenos virais, tais como HIV ou HCV. Os anticorpos da invenção podem também ser utilizados para aumentar a resposta imune a outros agentes imunomoduladores e para despoletar uma resposta imune de memória. Exemplos destes agentes são citocinas tais como GM-CSF, IL-2, IL-15, IL-12, ligando F13, ligando CD40, adjuvantes tais como oligodeoxinucleotídeo CpG (ADN bacteriano) ou anticorpos a OX-40 ou CTLA-4.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Numa aplicação terapêutica, a composição farmacêutica é administrada a um paciente que já padece de uma doença, numa quantidade suficiente para curar ou, pelo menos, parar parcialmente ou tratar a doença. Uma 28 quantidade adequada para conseguir isto é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz." Quantidades eficazes para este uso dependerão da severidade do estado de doença e do paciente (incluindo, por exemplo, o estado geral do sistema imune do próprio paciente) e podem ser determinadas por alguém habilitado na arte. Nas aplicações profiláticas, a composição farmacêutica é administrada a um paciente que ainda não está no estado de doença para aumentar a resistência do paciente ao estado da doença. Tal quantidade é definida como sendo uma "dose profilaticamente eficaz." Neste uso, as quantidades precisas dependem do estado de saúde do paciente (incluindo, por exemplo, o estado geral do sistema imune do próprio paciente) e podem ser determinadas por alguém habilitado na arte. Num aspeto, o uso profilático é para prevenção da recorrência do tumor. Exemplos:

Exemplo 1: Geração de Anticorpos Materiais e Métodos

Foram gerados anticorpos monoclonais completamente humanos para o recetor CD137 (4-1BB) humano no HuMAb-

Ratinho® (Medarex, Inc., Princeton, New Jersey). Ratinhos HuMAb foram imunizados cinco vezes por via intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.) com 25 pg do domínio extracelular da CD137 humana em adjuvante RIBI (Ribi Immunochemical). Antes da fusão, os ratinhos foram reforçados por via intravenosa (i.v.) com a mesma quantidade de antígeno Células de baço de ratinhos imunizados com títulos adequados de anticorpos contra huCD137 foram fundidas com células de mieloma de ratinho seguindo os procedimentos convencionais.

Mab CD3 anti-humano (clone:HIT3a), kits ELISA para IFN-y humano e de macaco, kits de matriz de pérolas citométricas (CBA) e todos os anticorpos conjugados para citometria de fluxo foram comprados de BD Pharmingen (San Diego, Califórnia) . IgGi λ humana e IgGi κ humana foram 29 compradas de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri). Células CEM (ATCC-CRL 2265) foram compradas de ATCC. Os meios de cultura (RPMI) e soro bovino fetal (FBS) foram comprados de Mediatech Inc. (Herndon, Virginia). Células vermelhas Alsevers de ovelha foram compradas de Colorado Serum Co. (Denver, Colorado).

Teste de hibridoma: Deteção da ligação a huCD137 por ELISA: Para identificar hibridomas que segregam anticorpos CD137 anti-humanos, placas de ELISA (Nunc MaxiSorp) foram revestidas com proteína de fusão IgG2b CD137-ratinho humana a 1 yg/ml em PBS durante a noite a 4°C. As placas foram depois lavadas 3 vezes com PBS com 0,01 % Tween-80 (PBS-T), e subsequentemente bloqueadas com PBS-T mais 1% albumina do soro bovina (BSA) durante 20 min à temperatura ambiente. Cinquenta microlitros de sobrenadantes diluídos 1:3 em PBS-T foram adicionados às placas e incubados durante 1-2 horas à temperatura ambiente. Depois, as placas foram lavadas como antes e a ligação dos anticorpos foi detetada por uma incubação com anticorpo IgG anti-humano F(ab')2 de cabra conjugado com fosfatase alcalina (Laboratórios Jackson, West Grove, Pennsylvania). As placas foram desenvolvidas com pNPP e lidas a 405 nm.

Ensaio de bloqueio: Vinte e seis hibridomas secretores de anticorpos que reconheceram huCD137 por ELISA foram avaliados pela sua capacidade de permitir interações CD137-CD137L. Estas análises foram conduzidas inicialmente num formato ELISA. As placas foram revestidas com CD137-muIgG2b humana a 0,2 pg/ml, 100 μΐ/poço. Diluições em série do mab 20H4.9-IgGl, ou anticorpos controlo, diluídos em PBS-T e 1% albumina do soro bovina, foram adicionados à placa. A proteína de fusão CD137L-CD8 foi adicionada aos poços a uma concentração de 0,2 yg/ml. A ligação dos anticorpos foi detetada com um anticorpo anti-CD8 biotinilado (0,2 yg/ml, Ancell Corporation, Bayport, Minnesota). Após várias lavagens, estreptavidina-fosfatase alcalina (1:2000) e pNPP 30 para a deteção de anticorpos ligados foram adicionados e as placas foram lidas a 405 nm.

Para confirmar que os anticorpos selecionados não alteram a ligação CD137-CD137L, anticorpos purificados foram ainda caracterizados por análises BIAcore. Todas as experiências foram realizadas num instrumento BIAcore 3000 (BIAcore Inc., Piscataway, New Jersey). A CD137 humana foi imobilizada de forma covalente a uma elevada densidade numa superfície de dextrano carboximetilado de um sensor BIAcore (BIAcore Inc., Piscataway, New Jersey). Foram realizadas injeções a 2 pg/mL em 10 mM de tampão de acetato, pH 5,0. Ésteres ativos não ocupados foram subsequentemente bloqueados por injeção de um excesso de etanolamina. A regeneração da superfície foi feita com 10 mM glicina, pH 2,0 .

Amostras purificadas de anticorpos anti-CD137 foram diluídas para concentrações entre 200 e 1000 nM utilizando solução salina tamponada HEPES, pH 7,4, suplementada com 0,15 M NaCl e 0,005% tensoativo P20 (HBS-EP). As proteínas de fusão CD137L humana -CD8 (huCD137L) foram utilizadas como fonte de ligando CD137. Foram realizadas experiências nas quais huCD137L foi injetada antes dos anticorpos anti-CD137 ou vice versa. As injeções foram realizadas a uma taxa de fluxo de 5 pL/min. O ligando ligado e anticorpos foram removidos por regeneração com 10 mM tampão de glicina, pH 2,0.

Purificação de células T humanas: Células T ou PBMCs foram obtidas a partir de dadores humanos saudáveis. O sangue foi recolhido em EDTA, suspenso em tampão de elutriação (RPMI contendo 2,5 mM EDTA, 10 pg/ml polimixina B), forrado com meio de separação de linfócito (LSM, Mediatech Inc., Herndon, Virgínia) e centrifugado a 1800 rpm durante 25 minutos. As interfaces celulares foram recolhidas e centrifugadas a 1500 rpm durante 10 minutos. Depois disso, as bolas de células foram ressuspensas em 31 tampão de elutriação e lavadas com células vermelhas de ovelha (SRBC, 1:10 diluição) e incubadas em gelo durante 1 hora. As células foram depois forradas com LSM e centrifugadas a 2500 rpm durante 25 minutos. As interfaces foram removidas e SRBC foram lisados com tampão de lise SRBC. As células T isoladas foram lavadas e ressuspensas em 10% FBS/RPMI.

Análises de citometria de fluxo: A ligação de anticorpos CD137 anti-humanos a CD137 expressa nas células foi determinada por citometria de fluxo. Uma linha de células de leucemia de células T humanas (CEM) ou células monociticas do sangue periférico de macaco Cynomolgus (PBMC) foram utilizadas nestes estudos. Estas células não expressam CD137 constitutivamente, mas o recetor pode ser induzido por estimulação com forbol miristato (PMA, 10 ng/ml) e ionomicina (1 μΜ) durante 18 horas. As células foram depois lavadas e incubadas com várias concentrações dos anticorpos em tampão de coloração (tampão fosfato salino, PBS, mais 1 % FCS e 0,01 % azida de sódio). A ligação dos anticorpos a células estimuladas ou não estimuladas foi detetada por uma IgG anti-humana de cabra conjugada com fluoresceina (FITC) ou ficoeritrina (PE) (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania). Para confirmar a expressão da CD137, foi utilizada uma proteína de fusão que consiste no domínio extracelular do ligando CD137 e CD8 de ratinho (Ancell Corporation, Bayport, Minnesota), seguido de incubação com CD8 anti-ratinho conjugado com PE (BD Pharmingen, San Diego, Califórnia). As amostras foram fixadas em 1% formalina, mantidas a 4 °C e lidas por citometria de fluxo.

Ensaios funcionais: Células T humanas primárias ou PBMC de macaco obtidas de dadores saudáveis foram estimuladas com anticorpo anti-CD3 imobilizado para providenciar o primeiro sinal para a ativação de células T e co-estimuladas com anticorpos CD137 anti-humanos humanos. 32

Como um control não específico, foi utilizado um anticorpo anti-carcinoma humanizado (BR96) à mesma concentração de anticorpo. As placas foram revestidas com anticorpo anti-CD3 (0,5-1 yg/ml) a 4 °C durante a noite. No dia seguinte as células T ou PBMC foram colocadas em placas a concentrações de 1-1,5 xlO5 /poço. A síntese de IFN-γ foi medida após 72 horas de cultura a 37 °C por matriz de pérolas citométricas (CBA) ou por ELISA.

Ensaios de citocina ELISA: Após a estimulação das células T em várias ocasiões, as placas foram centrifugadas e o meio foi removido. Os níveis de citocina foram detetados por uma ELISA de acordo com as instruções do fabricante (BD Pharmingen, San Diego, Califórnia). Resumindo, as amostras teste e padrões foram adicionados a placas com 96 poços revestidas com anti-citocina. Depois de incubação durante 2 horas à temperatura ambiente, as placas foram lavadas 3 vezes em PBS-T e depois incubadas primeiro com um anticorpo detetor funcional, seguido da adição de substrato. A absorvância foi lida a 405 nm e as concentrações foram calculadas com base na curva padrão.

Matriz de pérolas citométricas: Outro método utilizado para determinar a produção de citocina in vítro foi a citometria de fluxo utilizando uma matriz de pérolas citométricas (CBA) desenvolvida por BD Pharmingen. Os níveis de IFN-γ, IL-2, IL-5, IL-4, IL-10 e TNF-α foram medidos em sobrenadantes da cultura seguindo as instruções do fabricante. Os resultados foram analisados por citometria de fluxo com software de análise CBA.

Resultados

Os hibridomas secretores de anticorpos que mostraram ligação à CD137 humana foram ainda expandidos e subclonados. Os anticorpos segregados foram purificados e testados pela sua capacidade de se ligarem a huCD137 e de permitirem a interação de CD137-CD137L. Do painel de 33 anticorpos CD137 anti-humana avaliados, o mab 20H4.9-IgGl foi selecionado para avaliação adicional com base no seu perfil de ligação e propriedades não bloqueadoras. 0 anticorpo 20H4.9-IgGl é IgGl kapa conforme determinado por ELISA utilizando IgGl, 2, 3, 4 e anti-kapa anti-humana fosfatase alcalina e reagentes lambda (Southern Biotech, Birmingham, Alabama) . A FIG. 8 (FIG. 8A - ligação a CD137 humana por ELISA; FIG. 8B - efeito do mab 20H4.9-IgGl na interação CD137-CD137L) providencia a caracterização inicial do mab 20H4.9-IgGl. Diluições em série do mab 20H4.9-IgGl, 26G6 (um anticorpo anti-CD137 bloqueador), ou toxóide tetânico (TT, controlo negativo) foram avaliados pela sua capacidade de alterarem a ligação de CD137 a CD137L. Mab 20H4.9-IgGl a concentrações até 10 yg/ml não bloquearam a ligação de CD137L, enquanto que mab 26G6 inibiu a ligação a concentrações > 0,37 yg/ml.

Mab 20H4.9-IgGl também foi testado para reatividade em direção a CD137 expressa em células T humanas (CEM) e em células monociticas de sangue periférico de macaco Cynomolgus (PBMC) estimuladas com PMA e ionomicina. Estudos prévios determinaram que a CD137 é regulada para montante nas células T seguido de ativação com PMA e ionomicina. As moléculas control consistiram num anticorpo IgG humano irrelevante (controlo negativo) ou proteína de fusão CD137L-CD8 (controlo positivo, BD Pharmingen, San Diego, Califórnia). Os resultados destes estudos indicaram que o mab 20H4.9-IgGl ligado a CEM humanas ativadas e PBMCs de macacos Cynomolgus, com ligação mínima a células não estimuladas. Percentagens semelhantes de células positivas foram detetadas com mab 20H4.9-IgGl ou CD137L. A FIG. 9 providencia os resultados obtidos demonstrando que a ligação de mab 20H4.9-IgGl a PMA-ionomicina estimulou células humanas ou de macaco Cynomolgus. CEM humanas (FIG. 9A) ou PBMC de macaco (FIG. 9B) foram incubadas com 20H4.9-IgGl ou proteína de fusão CD137L humana. Anticorpos 34 secundários foram adicionados e as amostras foram lidas por citometria de fluxo.

Seguidamente, foi determinado se mab 20H4.9-IgGl poderia induzir o aumento de IFN-γ em ensaios co-estimuladores na presença de estimulação anti-CD3, o efeito funcional chave desejado para um anticorpo CD137 agonistico. Mab 20H4.9-IgGl foi avaliado pela sua atividade co-estimuladora em estudos funcionais em linfócitos humanos e de macaco. Com base nos dados iniciais, uma concentração de 20 ug/ml de anticorpo anti-CD137 (anticorpo em excesso) foi utilizada nestes estudos. Niveis de anticorpo anti-CD3 entre 0,2-1 pg/ml foram testados que resultaram em 10-20% de linfócitos positivos a CD137. Niveis de IFN-γ em sobrenadantes foram medidos após 72 horas de cultura. Conforme representado na FIG. 10, mab 20H4.9-IgGl aumentou a sintese de IFN-γ em ambos ensaios co-estimuladores humanos e de macaco para niveis significativamente superiores do que os controlos. Os resultados de estudos conduzidos com células T isoladas de 8 dadores humanos saudáveis mostraram que em seis deles, o mab 20H4.9-IgGl aumentou a sintese de IFN-γ entre 2,2 - 4,3 vezes comparado com os controlos. Um dos outros dois dadores mostrou um aumento de 1,6 vezes. O nivel de aumento foi superior ao observado com hu39E3.G4, um anticorpo anti-CD137 humanizado providenciado no Pedido PCT publicado WO04/010947 que mostrou um aumento de IFN-γ em 5 de 8 dadores e a niveis inferiores do que o mab 20H4.9-IgGl (1,5 - 2 vezes de aumento) (FIG. 10A). Em estudos co-estimuladores com macacos, o mab 20H4.9-IgGl também demonstrou atividade funcional aumentada resultando num aumento significativo de IFN-y em relação aos controlos (FIG. 10B) . Tal como nos estudos humanos, o aumento de IFN-y foi consistentemente superior do que com hu39E3.G4. A indução da sintese de TNF-α acima dos niveis controlo também foi observada em cultivos humanas, apesar 35 de a níveis muito inferiores do que o IFN-y. Os níveis de TNF-α induzidos pelo anticorpo anti-CD3 apenas (padrão de valor) foram cerca de 20-50 vezes inferiores aos níveis basais para IFN-y. Mab 20H4.9-IgGl induziu um aumento de ~2 a 4,7 vezes em 3 de 8 dadores. De novo, hu39E3.G4 (testado em paralelo) induziu um aumento de ~2 vezes nos mesmos dadores mas a níveis inferiores. Outras citocinas testadas, IL-2, IL-5, IL-10 e IL-4 não alteraram significativamente com nenhum dos tratamentos.

Em conjunto, estes estudos demonstraram que o mab 20H4.9-IgGl apresentou a atividade funcional desejada tanto em humanos como macacos induzindo um tipo de resposta Thl. Muito importante, uma vez que a atividade anti-tumoral in vivo está associada com a capacidade dos anticorpos anti-CD137 de induzirem a síntese de IFN-y, estes resultados suportaram a seleção de mab 20H4.9-IgGl para troca isotópica.

Exemplo 2: Caracterização in vitro do mab 20H4.9-IgG4

Com base na sua cinética de ligação, na incapacidade de bloquear a interação CD137-CD137L e nos efeitos funcionais em células T humanas, o mab 20H4.9-IgGl foi selecionado para troca para uma forma IgG4. A forma IgG4 do mab 20H4.9-IgGl é 20H4.9-IgG4 (representada nas FIGS. 3 e 4) . A segunda fase destes estudos envolveu a comparação das propriedades in vitro do mab 20H4.9-IgG4 e mab 20H4.9-IgGl. Nesta secção, são descritas as propriedades cinéticas de ligação e efeitos funcionais de ambos anticorpos em linfócitos humanos e de macaco.

Cinética de ligação

As propriedades cinéticas dos anticorpos CD137 anti-humanos foram avaliadas por ressonância de plásmon de superfície utilizando um instrumento BIAcore 3000. O antígeno, IgG2a CD137-murino humana, foi imobilizado covalentemente a uma baixa densidade na superfície de um 36 chip sensor CM5. Mab 20H4.9-IgG4 e mab 20H4.9-IgGl foram injetados a concentrações entre 25 e 200 nM. A FIG. 11 representa injeções a 100 nM para ambos mab 20H4.9-IgGl e mab 20H4.9-IgG4. Os dados calculados utilizando o software BIAevaluation (modelo bivalente, análise de ajuste de curva global) resultou em parâmetros cinéticos que eram semelhantes para ambos anticorpos (ver Quadro 1). As constantes de dissociação KD para mab 20H4.9-IgGl e mab 20H4.9-IgG4 foram determinadas como sendo 11,2 e 16,6 nM, respetivamente. Em condições experimentais semelhantes, o mab 20H4.9-IgG4 não se ligou ao 4-1BB murino.

Quadro 1 - Comparação da cinética de ligação do mab 20H4.9-IgG4 e mab 20H4.9-IgGl_ anticorpo kal (1/Ms) kdi (1 / s) ka2 (1/RUs) kd2 (1/s) Rmax (RU) KA1 KD1 (nM) 2 0H4.9-IgGl 3,43E+04 3,85E-04 2,30E-05 1,51E-03 262 8,91E+07 11,22 2 0H4.9-IgG4 3,92E+04 6,51E-04 0,0755 0, 105 409 6,02E+07 16, 61

Análises de citometria de fluxo

Mab 20H4.9-IgG4 biotinilado a concentrações que oscilam entre 0,32 ng/ml a 5 yg/ml foi testado para ligação a células CEM ± PMA-ionomicina. Mab 20H4.9-IgG4 ligou-se a células CEM estimuladas com PMA-ionomicina de uma forma dependente da concentração. A saturação foi atingida a 0,2 yg/ml. Por outro lado, conforme mostrado para a sua molécula parental, mab 20H4.9-IgGl, o mab 20H4.9-IgG4 não se ligou a células CEM que não estivessem estimuladas com PMA-ionomicina (FIG. 12) . A ligação dependente da concentração do mab 20H4-.9-IgG4 foi demonstrada em células CEM estimuladas com PMA-ionomicina (FIG. 12) . As amostras foram lidas por citometria de fluxo.

Ensaios celular/funcional

Para confirmar que o processo de troca do isótipo do mab 20H4.9-IgGl não alterava a atividade do anticorpo, foram realizados estudos in vitro para comparar a atividade do mab 20H4.9-IgG4 com o mab 20H4.9-IgGl parental em 37 células PBMC de macaco e células T humanas. Os efeitos funcionais do mab 20H4.9-IgG4 em células T humanas ou PBMC de macaco foram determinados e comparados com a sua molécula parental, mab 20H4.9-IgGl. As células T primárias humanas ou PBMC de macaco obtidas de dadores saudáveis foram estimuladas com anticorpo anti-CD3 (0,5 pg/ml-l mg/ml) +/- anticorpos CD137 anti-humanos. A síntese de IFN-γ foi medida após 72 horas de cultivo a 37 °C por matriz de pérolas citométricas (CBA) para amostras humanas ou por ELISA para as amostras de macaco. Os anticorpos foram testados em ensaios co-estimuladores na presença de concentrações subótimas de anticorpo anti-CD3 (1 pg/ml) ou concavalina A (1 pg/ml) (dadores M5170 e 81 apenas). Os resultados são expressos como vezes de aumento em pg/ml em relação aos controlos. Devido à resposta de fundo variável entre dadores, os dados foram normalizados em relação aos tratamentos controlo (=1). A FIG. 13A providencia os resultados das células T humanas e a FIG. 13B providencia os resultados para as PBMC de macaco. Conforme representado nas FIGS. 13A-13B, o mab 20H4.9-IgG4 demonstrou ter propriedades co-estimuladoras produzindo níveis superiores de IFN-γ em células humanas e de macaco do que nos controlos. O nível de aumento da síntese de IFN-γ foi comparável à sua molécula parental em amostras humanas e de macaco.

Subsequentemente, o efeito da ligação cruzada do anticorpo no efeito funcional do mab 20H4.9-IgG4 foi avaliado. Foi mostrado que a ligação cruzada de anticorpos pode resultar na potenciação da sua capacidade de sinalização. Assim, foi realizado um estudo para determinar a atividade funcional de vários lotes de mab 20H4.9-IgG4 ± um anticorpo IgG anti-humana. Conforme mostrado na FIG. 14A, foi observado um aumento significativo da síntese de IFN-γ para todos os lotes testados na ausência de anticorpos ligados de forma cruzada, estabilizando-se a 38 concentrações de 400 ng/ml. O aumento da sintese de IFNy por mab 20H4.9-IgG4 foi aumentada ainda mais pela adição de anticorpo ligado de forma cruzada IgG anti-humano conforme mostrado na FIG. 14B. Lotes diferentes de mab 20H4.9-IgG4 exibiram atividades celulares comparáveis.

Assim, a ligação cruzada de mab 20H4.9-IgG4 resultou num aumento da capacidade do anticorpo de induzir a sintese de IFN-γ. A ligação cruzada do anticorpo in vivo pode ocorrer por recetores celulares para a porção Fc das imunoglobulinass ou por dimerização do anticorpo. Mab 20H4.9-IgG4 é do isótipo IgG4, gue, comparado com outros isótipos IgG, tem baixa afinidade para recetores Fc. Contudo, IgG4 pode ligar-se a FcyRI (CD64) expresso em monócitos e neutrófilos.

Foram utilizadas outras duas abordagens para caracterizar ainda mais o mab 20H4.9-IgG4: (i) efeito na sobrevivência das células T e (ii) efeito na expressão de ciclina D2. Para determinar se o mab 20H4.9-IgG4 poderia despoletar a sinalização através de CD137 em células T humanas e providenciar sinais co-estimulantes a células T conduzindo à sobrevivência e expansão celular, células T humanas estimuladas com anticorpos anti-CD3 +/- mab 20H4.9-IgG4 a concentrações conhecidos por induzir a sintese de IFN-γ foram coradas com anexina-V e iodeto de propidio para determinar o número de células vivas (Anexina V/ iodeto de propidio negativas) e com ciclina D2 para determinar o seu efeito na progressão celular. A FIG. 15 mostra os resultados médios de 4 lotes diferentes de mab 20H4.9-IgG4 na expressão de ciclina D2 e sobrevivência de células T. Concentrações do mab 20H4.9-IgG4 de 0,4-10 yg/ml resultaram num aumento no número de células vivas de aproximadamente 1,8 - 2 vezes e produziram um aumento significativo no número de células T que expressam ciclina D2 (2,5 - 3 vezes).

Exemplo 3: Avaliação in vivo de anticorpos 4-1BB num 39 modelo farmacodinâmico em macacos Cynomolgus.

Este exemplo ilustra a capacidade do mab 20H4.9-IgG4 e do mab hu39E3.G4 para aumentarem a resposta imune específica de antígeno despoletado por vacinas de ADN. Materiais e métodos

Grupos animais experimentais: Macacos Cynomolgus fêmeas e machos (2,5 a 5,0 kg) foram comprados de Charles River BRF (Houston, Texas) para este estudo e foram alojados em pares. Cada grupo experimental consistiu em 4 machos e 2 fêmeas que foram distribuídos aleatoriamente por grupos segundo o peso corporal. Os grupos experimentais foram como se segue:

Grupo 1 - vacina de ADN SIV gag e PSA (2 mg cada), dia 0, 28, 56, i.m., mais controlo de solução salina, i.v., nos dias 12, 15 e 19;

Grupo 2 - vacina de ADN SIV gag e PSA (2 mg cada), dia 0, 28, 56, i.m., mais mab hu39E3.G4, i.v., nos dias 12, 15 e 19;

Grupo 3 - vacina de ADN SIV gag e PSA (2 mg cada), dia 0, 28, 56, i.m., mais mab 20H4.9-IgG4, i.v., nos dias 12, 15 e 19;

Grupo 4 - grupo controlo não tratado.

Imunizações e tratamentos de anticorpo: vacinas de ADN PSA e SIV gag foram obtidas de David B. Weiner, Departmento de Patologia e Laboratório de Medicina, Universidade de Pennsylvania. (Ver, Kim et al., Oncogene 20, 4497-4506 (2001); Muthumani et al., Vaccine 21, 629-637 (2003).)

Os macacos foram imunizados pela via intramuscular com ambas construções de ADN PSA e SIV gag (2 mg/ construção/imunização) simultâneamente, seguido de dois reforços separados por 4 semanas (dias 0, 28 e 56) . Doze dias após a imunização inicial, foi iniciado o tratamento com mab 20H4.9-IgG4 ou mab hu39E3.G4. Anticorpos foram administrados i.v, a 50 mg/kg nos dias 12, 15 e 19 após a primeira imunização. Este esquema foi escolhido porque 40 mostrou suprimir a resposta do anticorpo ao mab hu39E3.G4. Clinica e patologia clinica

Durante o estudo, foram conduzidos exames físicos em todos os macacos pelos veterinários de serviço. Foram recolhidas amostras de sangue para análises hematológicas e de química do soro antes das vacinações e depois aos dias 12, 42, 70, 97, 134 e 168 após as imunizações.

Ensaios imunológicos

Para determinar o efeito nas respostas imunes induzidas por estes regimes terapêuticos, foi usado um ensaio de pontos por imunoabsorção unida a enzimas (ELISPOT) para deteção da produção de IFN-γ por linfócitos estimulados específicos de antígeno. As amostras de sangue para as análises ELISPOT foram recolhidas antes das vacinações e depois aos dias 12, 42, 70, 97, 134 e 168 após as imunizações. Foram utilizados péptidos sintéticos correspondents às sequências completas do antígeno SIV gag e PSA para estimulação ex vivo de PBMC.

Resultados

As células secretoras de IFN-γ específicas de antígeno em resposta a péptidos PSA ou SIV gag foram quantificadas por ELISPOT. A FIG. 16 (FIGS. 16A-16D) ilustra os resultados obtidos dos Grupos 1-4, respetivamente. O nível de resposta a PSA foi muito baixo em todos os grupos, indicando que a vacina por si só não induziu uma resposta imune mensurável e consistente quando comparada com animais não vacinados. Por outro lado, a vacinação SIV gag por si só resultou num número significativo de células secretoras de IFN-γ específicas de antígeno que aumentaram ao longo do tempo (FIG. 16A). Os animais não tratados (não vacinados) mostraram 100-1.000 pontos/106 PBMC durante o estudo (FIG. 16D) . Estes resultados estabeleceram a resposta umbral à vacina; os animais que aparesentaram < 1.000 pontos/106 PBMC foram considerados como não tendo respondido à vacina. No grupo dos animais que receberam a vacina, 5 de 6 macacos 41 mostraram uma resposta aumentada com o tempo, com um número médio de pontos após a terceira imunização (dia 70) de 1.727 pontos/106 PBMC (SD=242, intervalo=l.403-1.968 pontos/106 PBMC). Um macaco foi considerado como não respondendo à vacina (620 pontos/milhão PBMC). Uma vez que nestes estudos não foi feita a digitação MHC, é provável que a ausência de respostas das células T à vacina por alguns macacos possa ter sido devida à falta de correspondência do MHC. Notavelmente, no dia 70, 4 de 6 animais tratados com SIV gag-mais mab 20H4.9-IgG4 apresentaram um número significativamente superior de pontos IFN-γ (FIG. 16C) comparados com os animais controlo (FIG. 16D) e com macacos que forma imunizados apenas com a vacina de ADN (FIG. 16A) . O número médio de pontos após a terceira imunização para o grupo tratado com mab 20H4.9-IgG4 foi de 3.465 pontos/106 PBMC (SD=1,236, intervalo=2.070-4.780 pontos/106 PBMC). Dois macacos nesse grupo não responderam à vacina (< 800 pontos/milhão PBMC). Após a terceira imunização (dia 70), o tratamento com mab hu39E3.G4 mais a vacina de ADN resultou em 6 de 6 animais considerados como respondendo à vacina com um número médio de pontos/ 106 PBMC de 2.348 (SD=588, intervalo=l.738-3.283) (FIG. 16B) . Para este grupo, o intervalo do número de pontos foi inferior comparado com aqueles macaco tratados com mab 20H4.9-IgG4. O tratamento com ambos mab 20H4.9-IgG4 e mab hu9E3.G4 foi bem tolerado e não resultou em nenhumas alterações significativas nos sinais clinicos, química clínica ou parâmetros hematológicos em relação aos macacos controlo.

Estes dados mostram que o tratamento com mab 20H4.9-IgG4 em combinação com uma vacina de ADN despoletou um aumento in vivo da magnitude resposta celular específica ao antígeno teste em relação aos controlos ou ao tratamento com mab hu39E3.G4, conforme medido pelas células secretoras de IFN-γ específicas de antígeno. Uma vez que apenas um 42 nível de dose dos anticorpos e um esquema de dosagem foram utilizados nestes estudos preliminares, é pouco provável que as respostas máximas tenham sido induzidas e é necessário investigação adicional para otimizar as condições. Obviamente, contudo, mesmo com este protocolo não otimizado, foi conseguido um aumento da resposta celular aos antígenos teste com mab 20H4.9-IgG4, o que sugere que a modulação da função de CD137 pode ser uma abordagem atrativa para aumentar a eficácia das vacinas de ADN.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Jure-Kunkel, Maria Hefta, Laura Santoro, Marc Ganguly, Subinay

<120> ANTICORPOS COMPLETAMENTE HUMANOS AGAINST 4-1BB HUMANO

<130> 10060 PCT <150> US 60/510193 <151> 10-10-2003 <150> Sem designar <151> 08-10-2004 <160> 9 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 7057 <212> ADN <213> Artificial 43 <22 0> <223> Sequência artificial <4 Ο 0> 1 cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatC aatagtaatc 60 aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 120 aaatggcccg cetggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgteaa taacgacgta 180 tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg 240 gtaaactgtc cacttggcag tàcatcaagt gtaccatatg ccaágtacgc cccctattga ' 300 cgtcaacgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct eatgggactt 360 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgccatt accacggtga tgcggttttg 420 gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggct tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 480 cattgacgtc aatgggagCC tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg S40 caacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gcacggtggg aggtccatat 600 aagcagagct ccctggctaa ctagagaacc cactgctcac tggcttatcg aaattaatac 660 gacccactat agggagaccc aagcttggta cegccatgaa acacctgtgg cccttecccc 720 tectggtggc agctcccaga tgggtcctgt cccaggtgca actacagcag tggggcgcag 780 gactgttgaa gccctcggag accctgtccc tcacctgcgc tgtctatggt gggtccttca 340 gtggttacts =í=;=?c:gg atacgccagt ccccagagaa ggggctggag tggattgggg 900 44 aaatcaatca tggtggatac gtcacctaca atccgtccct cgagagtcga gtcaccatat 960 cagtagacac gcccaagaac cagttetccc tgaagctgag ctctgtgace gccgcggaca 1020 cggctgtaca ttactgtgcg agggactatg gtccggggaa ttatgactgg tacttcgatc 1090 tctggggccg tggeaeeetg gtcactgtct ectcagetag caccaagggc ceatccçtct 1140 tccccctggc gccctgctec aggagcacct ccgagagcac agcegcectg ggctgcctgg 1200 tcaaggacta cttccccgaa ceggtgacgg cgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg 1260 gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt eeteaggaet ctactccctc agcagcgtgg 1320 tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc 1390 ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agtccaaata tggtccacct tgcccacctt 1440 gcccagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtettcct gttcccccca aaacccaagg 1500 acactctcat gatctcccgg acccccgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg 1560 aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga 1620 caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagea cgtaccgtgt ggteagcgtc ctcaccgtce 1690 tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcetcc 1740 cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gcccegagag ccacaggtgt 1800 acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg aectgcctgg 1860 tcaaaggccc ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaacggg cagccggaga 1920 acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctecctctcc ctctacagca 1980 ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc 2040

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tccgcgcggc cgaagcttat cggtctcatt ggaaaaaaaa attaaaataa aataaaataa 6840 aaactctacc tcaaaecgcg gctagagggc Caggggatac eagctgagag tcatgttaga 6900 cgagactacg gcgtatcaat ecggteatag acgagggacg aacacacaac ctccagcgac 6960 tcatcacgcg ctcgttttaa attcgatgtt gttccgttcc.gaactggctg ttaaçgtact 7020 tcttagacgaatcccaatcc gcaaaacgcg acgaagc ' ' 7057 <210> 3 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 3

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp val Leu Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 53

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Tyr Gly Gly Ser Phe 35 40 45

Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Lfeu 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Vai Thr Tyr Asn Pro 65 70 75 Θ0

Ser Leu Glu Ser Arg Vai Thr Ile Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin 35 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr 100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp 115 120 125

Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140

Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175

Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr 180 185 · 190

Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Sar Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai 195 200 205

Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220

Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Arg Vai Glu Ser 225 230 235 240

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 245 250 255

Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 54

Ue Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai vai vai Asp vai Ser Gin 275 280 285

Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 340 345 350

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 370 375 380

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415

Vai Leu Açp Ser Asp Gly Ser Phe' Phe Leu Tyr - Ser- Arg Leu Thr Vai 420 423 430'

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 435 440 445

His Glu Ala Leu Hís Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 4SS 460

Leu Gly Lys 465 <210> 4 <211> 6435 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 55 <400> 4 gacggatcgg gagatctgct agcccgggtg acctgaggcg cgccggcttc gaatagccag 60 agtaacctct ttttttaatfc ttattttatt ttacttttga gatggagttc ggcgccgatc 120 tcecgateee ctatggtcga ctctcagtac aatetgctet gatgccgcat agttaageca 100 gcatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc 240 tacaacaagg caaggcttga ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg ttaggcgttt 300 tgcgctgctt cgcgacgtac gggccagata tacgcgttga cattgatcat cgactagtta 360 ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt Cccgcgttac 420 ataacttaeg gcaaatggcc cgcctggctg accgeccaac gacccccgce cattgacgtc 400 aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 540 ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 600 gccccctatc gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 660 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gccatcgcta ttaccatggt 720 gacgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 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gcacctacag 1620 cctcagcagc aecctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg 1600 56 cgaagccacc catcagggcc Cgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg 1740 ttagacccag ctttcttgta caaagtggtt gatctagagg gccccattct atagtgtcac 1800 etaaacgcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 1860 gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 1920 taataaaatg aggaaattgc atcgcattgc ctgagtaggt gteattctat tctggggggt 1980 ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 2040 gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc 2100 cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 2160 gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 2220 acgtccgccg ggcctctcaa aaaagggaaa aaaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 2280 atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 2340 ccgeeecatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 2400 gagctattcc agaagtagtg aggaggcttc Cttggaggcc taggcCCCtg caaaaagctt 2460 ggggggacag ctcagggctg egatttcgcg ccaaacttga cggeaatcct agcgtgaagg 2520 ctggtaggat tttatccccg ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt 2580 gtcccaaaat atggggactg gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga 2640 gttcaagtae ttccaaagaa tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt 2700 gattatgggt aggaaaaect ggttctccat tcccgagaag aatcgacctt taaaggacag 2760 aatcaatata gttctcagta gagaactcaa agaaccacca cgaggagcte attttcttgc 2820 caaaagtttg gatgátgcct taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtagá 2880 catggtttgg atagtcggag gcagtectgt ttaccaggaa gccatgaatc aaecaggcca 2940 cctcagaccc tttgtgacaa ggateatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga 3000 aattgatttg gggaaatata aacttctccc agaataeeca ggcgtcctct ctgaggtcca 3060 ggaggaaaaa ggcatcaagt ataagettga agtctacgag aagaaagact aacaggaaga 3120 tgctttcaag ttctccgctc ccctcetaaa getatgçatc tttataagac catgggactc 3180 ttgecggcte tagatctgat ctttgegaag gaaccccact tctgtggtgc gacataattg 3240 gacaaactac ctacagagat ctaaagctct aaggtaaata taaaattttt 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atacgtctcc tcctccgaaa aaacctecgg gctaaagcgc ggtttgaact gacggcagca ccaagctggc cgttcttgcc tctggatggg actggtgttg gagaagteac ccaagaggta aggactcttc ctcttgagtt tcttggtggt attctgaata acttgttçgc cgccaagaca aatggtcctt cctagtacgt ccttaaactt ttgaagaggg tcttatgggt cattcaaact tcagatgctc gggaggattt cgatacgtaa gaaacacttc cttggaatga aatttcgaga ttccacttat ttaacaaaca cacaaaatct acggaaatta ctccttttgg atgacgactg agagttgtaa cctgaaagga agtcttaacg acgaacgaaa cgataaatgt cctCtttata agaeattgga aaaagaatga ggtgtgtccg atggaaatcg aaaaattaaa tatcgtccgt acgaccccta ccccgagatc ccccataggg accaatgcgc gtcgcactgg agaagggaag gaaagagcgg tagagttaat cagtcgttgg gcgggccaag gcgggtaaga ggctccggcg gagccggaga atccgaaaac gtttttcgaa gccgttagga tcgcacttcc aacttgacgt agcagcggca accggaggcg agtccttgct ctcccatttg tcctagacca ttagctggaa atttcctgtc gctcctcgag taaaagaaeg cttaaccgtt catttcatct cggtactcag ttggtccggt tcactgtgca aaaagggtct ccgcaggaga gactccaggt ttctttctga ttgtccttct aaatattctg gtáccctgaa agacaccaca ctgtattaac attttaaaaa ttcacatatt aaggttggat accttgacta acaaaacgag tctcctctac gatgaggagg ttttttettc attcaaaaaa ctcagtacga ggtgtttcct ttttcgacgt aatattcatc cgtattgtca tatctcacag acgataatta catttcccca attattcctt 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2Θ80 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 61 ataaactaca tatcacggaa ctgatctcta gctagtatta gtcggtatgg tgtaaacatc 3840 tccaaaatga acgaaatttt ttggagggtg tggaggggga cttggacttt gtattttact 3900 tacgttaaca acaacaattg aacaaataac gtcgaatatt accaatgttt atttcgctat 3960 cgtagtgttt aaagcgttta tttcgtaaaa aaagtgacgt aagatcaaca ccaaacaggt 4020 ttgagtagtt acatagaata gtacagaccc agccgaccta ctaggaggtc gcgcccctag 4080 agtacgacct caagaagcgg gcggggttga acaaataaeg tegaatatta ccaatgttta 4140 tttcgttatc gtagtgttta aagtgtttat ttcgcaaaaa aagtgacgta agatcaacac 4200 caaacaggtt tgagtagtta catagaatag tacagacata tggcagctgg agatcgatct 4260 cgaaccgcat tagtaccagt atcgacaaag gacacacctt aacaataggc gagtgttaag 4320 gcgtgttgta tgcccggcct tcgtatttca catttcggac cccacggatt actcactcga 4380

Ctgagtgtaa ttaacgcaac gcgagtgacg ggcgaaaggt cagccctttg gacagcacgg 4440 ccgacgcaat tacttagccg gttgcgcgce ccectccgcc aaacgcacaa cccgcgagaa 4500 ggcgaaggag cgagtgactg agcgacgcga gccagcaagc cgacgccgct cgccatagtc 4$60 gagtgagctt ccgceattat gccaataggt gtcttagtcc cctattgcgt cctttcttgt 4620 acactcgttt tccggtcgtt ttceggtcct cggcattttt ccggegcaac gaccgcaaaa 4680 aggtatccga ggcgggggga ctgctcgtag tgcttttagc tgcgagttca gtctccaccg 4740 ctttgggctg tcctgatatt tccatggtcc gcaaaggggg accttcgagg gagcacgcga 4800 gaggacaagg ctgggacggc gaatggccta tggacaggcg gaaagaggga agcccttcgc 4860 accgcgaaag' agtatcgagt gcgacatcca tagagtcaag ccacatccag caagcgaggt 4920 tcgacccgac acacgtgett ggggggcaag tcgggctggc gaegcggaat aggccattga - 4 980 5520 tagcagaact caggctgggc cattctgtgc tgaatagcgg tgacegtcgt cggtgaccat 504.0 tgtcctaacc gtctcgcccc atacacccgc cacgatgtct caagaacttc accaccggat $100 tgatgccgat gtgatettcc ttgtcataaa ccatagacgc gagacgactt cggtcaatgg 5160 aagccttttt ctcaaccatc gagaactagg cegtttgttt ggtggcgacc ategccacca 5220 aaaaaaeaaa cgttcgtcgt ctaatgcgcg tcttttttEc ctagagttct tctaggaaac $280 tagaaaagat gccccagact gcgagccacc ttgcttttga gtgcaattcc ctaaaaccag $340 tactctaata gtttttccta gaagtggatc caggaaaatt taatttttac ttcaaaattt $400 agttagattt catatataet catttgaacc agactgteaa tggttacgaa ttagtcactc 5460 cgtggataga gtcgctagac agataaagca agtaçgtacc aacggactga ggggcagcac 62 62 acctattgat gctatgccct cccgaatggt ctgggtgcga gtggcegagg tccaaatagt gcgtcttcac caggacgttg aaataggcgg cgatctcatt catcaagcgg tcaattatca tagcaccaca gtgcgagcag caaaccatac tccgcccaat gtactagggg gtacaacacg tagcaacagt cttcattcaa ccggcgtcac ttaagagaat gacagtacgg taggcattct tccagtaaga ctcttatcac atacgccgct ctattatggc gcggtgcatc gtcttgaaat cccgctcttg agagttccta gaatggcgac egtgggttga ctagaagtcg tagaaaatga ccttccgttt tacggcgctt tttccctcac gagaaggaaa aagttataat aacttcgtaa tataaactta cataaatctt tttatttgtt cacggtggac tgcag agaccggggt cacgacgtta ctatggcgct cgttatttgg tcggtcggcc ttcccggctc aggtaggtca gataattaac aacggccctt aacgcgttgc aacaacggta acgatgtccg cgaagtaagt cgaggccaag ggctgctagt ttttttcgcc aatcgaggaa gccaggaggc aatagtgagt accaataccg tcgtgacgta acgaaaagac actgaecact catgagttgg ggctcaacga gaacgggccg cagttatgcc tttcacgagt agtaacc.ttt cgcaagaagc aactctaggt caagctacat tgggtgagca aagtggccgc aaagaeccac tcgtttttçt tcccgctgtg cctttaeaac ttatgagtat atagtcccaa taacagagea ctcgcccatg catccccaag gcgcgtgtaa aggggctttt 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 ¢060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6435 <210> 6 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 6

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cya Arg Ala 5er Gin Ser 35 40 45

Vai Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60 63

Arg Leu leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 6S 70 75 SO

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr. Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110

Asn Trp Pio Pro Ala leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile 115 120 125 lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 H0

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 ISO

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 17S

Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 1B0 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220

Ser Pro val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 7 <211> 1413 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 7 64 atgaaacace tgtggttctt cctcctcctg gtggcagctc ceagatgggt cctgtcccag 60 gtgcaactac agcagtgggg cgcaggactg ttgaagectc cggagaccct gtccctcacc 120 tgcgctgtct atggtgggtc cttcagtggt tactactgga gctggatacg ccagtcccca 180 gagaaggggc tggagtggac tggggaaacc aatcatggtg gatacgtcac ctacaatccg 240

tccctcgaga gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag 30D ctgagctctg tgaccgccgc ggacacggct gtatattact gtgcgaggga ctatggtccg 360 gggaattatg actggtacct egatctctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 420 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaceet cctccaagag eacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg S40 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggçtgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatccgca acgCgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agCtgagccc 720 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960 agcacgtaee gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ceatcgagaa aaccacctce 1080 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140 ctgaccaaga accaggtcag ectgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gectcecgtg 1260 ctggactccg aeggctcett cttcctctae agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa céactacacg 1380 cagààgagcc tctccctgtc cccgggtaaa tga ' 1413 <210> 8 <211> 1413 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial 65 <4Ο0> 8 tactttgtgg acaccaagaa ggaggaggac caccgtcgag ggtctaccca ggacagggtc 60 cacgttgatg tcgtcacccc gcgtcccgac aacttcggaa gcctctggga cagggagtgg 120 a:?cgacaga taccacccag gaagtcacea atgatgacct cgacctatgc ggtcaggggt 180 scctcaccta acccctttag ttagtaccac ctatgcagtg gatgttaggc 240 . agggagctct cagcteagtg gtatagtcat ctgtgcaggt tcttggtcaa gagggacttc 300 gaetcgagac actggeggcg cctgtgccga catataatga cacgctccct gataccaggc 360 eeettaatae tgaecatgaa gctagagacc ccggeaccgt gggaccagtg acagaggagt 420 cggaggtggt tcccgggtag ccagaagggg gaccgtggga ggaggttctc gtggagaccc 480 ccgtgtcgcc gggacccgac ggaccagttc ctgatgaagg ggcttggcca ctgccacagc 540 aeettgagtc egegggactg gtegccgcac gtgtggaagg gccgaeagga tgteaggagt 600 cctgagatga gggagtcgtc gcaccactgg cacgggaggt cgtcgaaccc gtgggtctgg 660 atgtagacgt tgcacttagt gttcgggtcg ttgtggttcc acctgttctc tcaactcggg 720 tttagaacac tgttttgagt gtgtacgggt ggcacgggtc gtggacttga ggacccccct 780 ggcagtcaga aggagaaggg gggttttggg ttcctgtggg agtactagag ggcctgggga 840 ctccagtgta cgcaccacca cctgcactcg gtgcttctgg gactccagtt caagttgacc 900 atgcacctgc cgcacctcca cgtaCtacgg ttctgtttcg gcgccctect cgtcatgttg 960 tcgtgcatgg cacaccagtc gcaggagtçg caggacgtgg tccCgaccga cttaccgttc 1020 ctcatgtCca cgttccagag gttgtttcgg gagggtcggg ggtagctctt ttggcagagg 1080 cttcggtttc ccgtcggggc tcttggtgtc cacatgtggg acgggggtag ggccctactc 1140 gactggttct tggtccagtc ggactggacg gaccagtttc cgaagatagg gtcgctgtag 1200 cggcacctca ccctctcgtt acccgtcggc ctcctgttga tgttctggtg cggagggcac 1260 gacctgaggc tgccgaggaa gaaggagatg tcgttcgagt ggcacctgtt ctcgtccacc 1320 gtcgteccct tgcagaagag tacgaggcac tacgtactcc gagacgtgtt ggtgatgtgc 1380 gtcttetçgg agagggacag gggcccattt act 1413- <210> 9 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 66 <4 Ο Ο> 9

Met X Lys Hi S Leu Trp 5 Phe Phe Leu Leu Leu 10 Val Ala Ala Pro Arg 15 Trp val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 67

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Tyr Gly Gly Ser Phe 35 40 45

Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly kev S0 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His 65 70

Gly Gly Tyr Vai Thr Tyr Asn Pro 75 80

Ser Leu Glu Ser Arg Vai Thr Ile 85

Ser Vai Asp Thr Ser Lya Asn Gin 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 100

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro 115 120

Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp 125

Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Vai 130 135

Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys 140

Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 145 150

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 165

Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 170 175

Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly '* 18Ò

Ala Leu Thr.Ser Gly Vai His'Thr 185 190 ’

Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser 195 200

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai 205

Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu 210 215

Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 220 val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Arg Vai Glu Pro 225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 68

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr pro Glu Vai Thr Cys Vai vai vai Asp 275 280 285

Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 290 295 300

Val Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 40S 410 415 thr' Pro Pró Val' Letl Asp Ser Asip Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys .420 425 . . 430 .

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val phe Ser Cys 435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 69

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP nao assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição • WO 9507984 A [0004] • WO 9629348 A [0004] • US 6569997 B [0004] • WO 9816249 A [0019] • WO 2004010947 A [0020] • WO 04010947 A [0073] • US 60510193 B [0094]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal completamente humano ou porção de ligação ao antigeno do mesmo que se liga especificamente a 4-1BB, compreendendo uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada, em que: A dita região variável da cadeia leve compreende uma CDR1 que consiste nos resíduos de aminoácidos 44-54 da SEQ. ID N.° 6, uma CDR2 que consiste nos resíduos de aminoácidos 70-76 da SEQ. ID N.° 6 e uma CDR3 que consiste nos resíduos de aminoácidos 109-119 da SEQ. ID N.° 6; e a dita região variável da cadeia pesada compreende uma CDR1 que consiste nos resíduos de aminoácidos 50-54 da SEQ. ID N.° 3, uma CDR2 que consiste nos resíduos de aminoácidos 69-84 da SEQ. ID N.° 3 e uma CDR3 que consiste nos resíduos de aminoácidos 117-129 da SEQ. ID N.° 3.

2. O anticorpo monoclonal completamente humano ou porção de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1, em que: a dita cadeia leve compreende uma região variável que consiste nos resíduos de aminoácidos 21-129 da SEQ. ID N.° 6; e a dita cadeia pesada compreende uma região variável que consiste nos resíduos de aminoácidos 20-140 da SEQ. ID N.° 3.

3. Um anticorpo monoclonal completamente humano que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a dita cadeia leve compreende os resíduos de aminoácidos 21-236 da SEQ. ID N.° 6 e a dita cadeia pesada compreende os resíduos de aminoácidos 20-467 da SEQ. ID N.° 3.

4. Uma composição farmacêutica que compreende: o anticorpo monoclonal completamente humano ou porção de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1 ou 2; e um 2 veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Uma composição farmacêutica que compreende: o anticorpo monoclonal completamente humano da reivindicação 3; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

6. 0 anticorpo monoclonal completamente humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilização no tratamento de cancro.

7. A utilização de um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 20-467 da SEQ. ID N.° 3 e um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 21-236 da SEQ. ID N.° 6 para produzir um anticorpo monoclonal completamente humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

8. A utilização de um polinucleotídeo que compreende a sequência nucleotídica da SEQ. ID N.° 1 e um polinucleotídeo que compreende a sequência nucleotídica da SEQ. ID N.° 4 para produzir um anticorpo monoclonal completamente humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma região variável da cadeia leve codificada pela sequência nucleotídica da SEQ. ID N.° 4 e uma região variável da cadeia pesada codificada pela sequência nucleotídica da SEQ. ID N.° 1.