ES2253922T3

ES2253922T3 - Uso medico de un modulador selectivo de receptor de estrogeno en combinacion con un precursor de esteroide sexual.

Info

Publication number: ES2253922T3
Application number: ES99955419T
Authority: ES
Inventors: Fernand Labrie
Original assignee: Endorecherche Inc
Current assignee: Endorecherche Inc
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2019-06-10
Also published as: IL140178A0; US7884092B2; CA2768682A1; DE69928104D1; EP1623712A3; KR20090018870A; DE69928104T2; EP2386304B1; ES2458218T3; HUP0103345A2; ES2463868T9; EP2386305B9; TR200103456T2; HU230495B1; EP2399582B9; HK1040367B; PT2386305E; PT2386304E; WO1999063974A2; KR20010052763A

Abstract

Uso de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por androst-5-en-3â, 17â- diol, 4-androsten-3, 17-diona, un profármaco de androst-5-en- 3â, 17â-diol y un profármaco de 4-androsten-3, 17-diona, profármaco el cual se convierte in vivo en dicho precursor, y de una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo del receptor de estrógeno en la fabricación de medicamentos para una terapia de combinación para tratar o reducir el riesgo de adquirir osteoporosis.

Description

Uso médico de un modulador selectivo de receptor de estrógeno en combinación con un precursor de esteroide sexual.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para tratar o reducir la probabilidad de adquirir osteoporosis, hipercolesterolemia, hiperlipidemia o ateroesclerosis utilizando una nueva terapia de combinación sobre animales de sangre caliente susceptibles, incluyendo seres humanos. En particular, la combinación incluye administrar un modulador selectivo de receptor de estrógeno (SERM, Selective Estrogen Receptor Modulator) y elevar el nivel de precursor de esteroides sexuales del paciente, seleccionándose dicho precursor del grupo constituido por deshidroepiandrosterona (DHEA), sulfato de deshidroepiandrosterona sulfato (DHEA-S) y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol (5-diol). La invención se refiere también a equipos y composiciones farmacéuticas para practicar la combinación anterior.

Antecedentes de la técnica relacionada

El hombre es, de esta forma, único, con algunos otros primates, a la hora de tener glándulas adrenales que secretan grandes cantidades del precursor de esteroides sulfato de deshidroepiandrosterona (DHEA-S) y deshidroepiandrosterona (DHEA) que se convierten en androstenodiona (4-diona) y después en andrógenos y/o estrógenos activos en tejidos periféricos (Labrie et al., In: Import Advances in Oncology. Publicado por V. T. de Vita, S. Hellman, S. A. Rosenberg, J. B. Lippincott, Philadelphia, 193-217, 1985; Labrie, Mol. Cell. Endocrinol., 78: C113-C118, 1991; Labrie et al., In Signal Transduction in Testicular Cells. Ernst Schering research Foundation Workshop. Publicado por V. Hansson. F. O. Levy, K. Taskén. Springer-Verlag, Berlin-Nueva York (Suppl. 2), pp. 185-218, 1996; Labrie et al., Steroids,62: 148-158, 1997). En un estudio reciente (Labrie et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 2403-2409, 1997) se ha descrito una disminución dramática en los niveles circulantes de deshidroepiandrosterona (DHEA), sulfato de DHEA (DHEA-S), androst-5-en-3\beta,17\beta-diol (5-diol), 5-diol-S, ésteres de ácido graso de 5-diol y androstenodiona en hombres y mujeres entre las edades de 20 y 80 años.

A pesar del descenso acusado en andrógenos endógenos en las mujeres durante el envejecimiento, se ha limitado el uso de andrógenos en mujeres posmenopáusicas principalmente como consecuencia del miedo de un aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular en base a antiguos estudios que mostraba un perfil lipídico desfavorable con andrógenos. Sin embargo, estudios recientes no han mostrado un efecto significativo de terapia combinada con estrógenos y andrógenos sobre los niveles en suero de colesterol, triglicéridos, HDL, LDL, y relación HDL/LDL cuando se compara con estrógenos en solitario (Sherwin et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 156: 414-419, 1987). De acuerdo con estas observaciones, se ha mostrado que DHEA, un compuesto que tiene una influencia predominantemente androgénica, no tiene un efecto aparentemente perjudicial sobre el perfil lipídico en suero (Diamond et al., J. Endocrinol., 150: S43-S50, 1996). De forma similar, no se había observado ningún cambio en las concentraciones de colesterol, sus subfracciones o triglicéridos, durante un tratamiento solamente con estradiol después de 6 meses de terapia con estradiol + implantes de testosterona (Burger et al., Br Med. J. Clin. Res. Ed. 294: 936-937, 1987). Se debería mencionar que un estudio en el hombre ha mostrado una correlación inversa entre DHEA-S en suero y lipoproteína de baja densidad (Parker et al., Science, 208: 512-514, 1980). Más recientemente, se ha encontrado una correlación entre bajos niveles de testosterona y DHEA en suero y un aumento de grasa en vísceras, un parámetro de elevado riesgo cardiovascular (Tchernof et al., Metabolism, 44: 513-519, 1995).

El cinco-diol es un compuesto biosintetizado a partir de DHEA a través de la acción de la 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenada reductora (17\beta-HSD) y es un estrógeno débil. Tiene una afinidad 85 veces inferior que el 17\beta-estradiol (E_{2}) para receptor de estrógeno en citosol de glándula pituitaria anterior de rata (Simard and Labrie, J. Steroid. Biochem., 26: 539-546, 1987), confirmando además los datos obtenidos en los mismos parámetros en tejido afectado por cáncer biométrico y de mama en seres humanos (Kreitmann and Bayard, J. Steroid Biochem., 11: 1589-1595, 1979; Adams et al., Cancer Res. 41: 4720-4926, 1981; Poulin and Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986). Sin embargo a concentraciones bien dentro del intervalo de los niveles de plasma encontrados en mujeres adultas, el 5-diol potencia la proliferación celular y los niveles de receptor de progesterona en células cancerosas de mama humana ZR-75-1 (Poulin and Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986) y aumenta la síntesis dependiente de estrógeno de la glicoproteína de 52 kDa en células MCF-7 (Adams et al., Cancer Res., 41: 4720-4926, 1981).

Tal y como se ha mencionado anteriormente, se sabe que los niveles en suero de DHEA, DHEA-S y 5-diol disminuyen con la edad, y correspondientemente, que se da una reducción dramática dependiente con la edad en la formación de andrógenos y estrógenos en los tejidos periféricos diana. Tales cambios en la secreción de DHEA-S y DHEA dan lugar a una disminución acusada en las funciones bioquímica y celular estimuladas por esteroides sexuales. Como resultado, se han usado recientemente DHEA y DHEA-S en el tratamiento de una serie de afecciones que están asociadas a la disminución y/o desequilibrio en los niveles de esteroides sexuales.

La osteoporosis, una afección que afecta a hombre y mujeres, se asocia a la disminución en andrógenos y estrógenos. Se ha visto que los estrógenos disminuyen la tasa de degradación ósea mientras que los andrógenos se ha visto que construyen masa ósea. Sin embargo, la terapia de reposición de estrógenos comúnmente usada contra la osteoporosis requiere la adición de progestinas para contrarrestar la proliferación endometrial y el riesgo de cáncer endometrial inducido por estrógenos. Además, como se piensa que los estrógenos y progestinas aumentan el riesgo de cáncer de mama (Bardon et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 60: 692-697, 1985; Colditz et al., N. Engl. J. Med., 332: 1589-1593, 1995), el uso de la terapia de reposición de estrógeno-progestina es aceptado por un número limitado de mujeres y, generalmente, durante períodos de tiempo demasiado cortos.

Varios estudios sugieren que la osteoporosis es una manifestación clínica de deficiencia de andrógenos en hombres (Baran et al., Calcif. Tissue res. 26: 103-106, 1978; Odell and Swerdloff, West J. Med. 124: 446-475, 1976; Smith and Walter, Calcio. Tissue Res. 22 (Suppl.): 225-228, 1976). La terapia con andrógenos, tal y como se observa con decanoato de nandrolona, se ha visto que incrementa la densidad mineral ósea vertebral en mujeres posmenopáusicas (Need et al., Arch. Intern. Med., 149; 57-60,1989). La terapia de mujeres posmenopáusicas con nandrolona aumentó el contenido mineral de huso cortical (Need et al., Clin. Orthop. 225: 273-278, 1987). Sin embargo, se registraron efectos secundarios androgénicos en el 50% de los pacientes. Tales datos son de interés ya que aunque casi todas las terapias presentes se limitan a una reducción de masa ósea, se encontró un aumento en la masa ósea con el uso del esteroide anabólico nandrolona. Se ha sugerido una estimulación similar de formación de masa ósea en un hombre hipogonadal (Baran et al., Calcif. Tissue res. 26: 103, 1978). En Labrie et al. (J. Clin. Endocrinol. 82: 3498-3505, 1997) se recoge una estimulación de formación ósea en mujeres posmenopáusicas tratadas con DHEA durante 12 meses.

DHEA (450 mg/kg, b. p., 3 veces a la semana) retrasó claramente la aparición de tumores de mama en ratones C3H, los cuales fueron engendrados genéticamente para desarrollar cáncer de mama (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979). Además, se encontró que el riesgo de desarrollar cáncer de vejiga aumentaba en hombres que tenían niveles bajos de DHEA en suero (Gordon et al., Cancer Res. 51: 1366-1369, 1991).

La solicitud de patente de los EE.UU. U.S. 5.550.107 se refiere a un procedimiento de tratamiento de cáncer de mama y endometrial en animales de sangre caliente susceptibles que puede incluir inhibición de secreción hormonal ovárica por medio quirúrgico (ovariectomía) o medio químico (uso de un agonista de LHRH, por ejemplo [D-Trp^{6}, des-Gly-NH_{2}^{10}]LHRH etilamida, o antagonista) como parte de una terapia de combinación. Se someten a discusión antiestrógenos, andrógenos, progetinas, inhibidores de la formación de esteroides sexuales (especialmente de 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenada o producción catalizada por aromatasa de esteroides sexuales), inhibidores de la secreción de prolactina y de la secreción de la hormona del crecimiento y secreción de ACTH. Se ha publicado una equivalente de lamisca bajo el número de publicación internacional WO 90/10462.

Además, se han asociado las enfermedades cardiovasculares con los niveles disminuidos en suero de DHEA y DHEA-S y se ha sugerido que DHEA y DHEA-S previenen o tratan estas afecciones (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986).

En ratas Sprague-Dawley envejecidas, Schwartz (en Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982) ha observado que el peso corporal se redujo de 600 a 550 g por DHEA sin afectar a la ingesta de alimento. Schwartz (Cancer 39: 1129-1132, 1979) observó que los ratones C3H a los que se les administró DHEA (450 mg/kg, 3 veces a la semana) ganaron de forma significativa menos peso y crecieron más envejecidos que los animales control, tenían menos grasa corporal y eran más activos. La disminución en el peso corporal se logró sin pérdida de apetito o restricción de alimentos. Además, DHEA pudo prevenir ganancia de peso en animales engendrados para llegar a ser obesos en el estado adulto (en Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982).

La administración de DHEA a ratas de Zucher sin grasa disminuyó la ganancia de peso corporal a pesar de una ingesta aumentada de alimentos. Los animales tratados tenían almohadillas de grasa de menor tamaño de esta forma, sobre todo, sugiriendo que DHEA aumenta el metabolismo alimenticio, dando lugar a una ganancia de peso y una acumulación de grasa más bajas (Svec et al., Proc 2^{nd} Int. Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, las Vegas, Nevada, USA, p. 56 abst., 1997).

Se encontró que la obesidad aumentaba en el ratón mutante de A^{vy} (Yen et al., Lipids 12: 409-413, 1977) y en la rata de Zucker (Cleary and Zisk, Fed. Proc. 42: 536, 1983). Los ratones C3H tratados con DHEA tenían un aspecto más joven que los controles (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979).

La DHEA redujo la incidencia de ateroesclerosis en conjos alimentados con colesterol (Gordon et al., J. Clin. Invest. 82: 712-720, 1988; Arad et al., Arteriosclerosis 9: 159-166, 1989). Además, se han registrado elevadas concentraciones en suero de DHEA para proteger contra la muerte de enfermedades cardiovasculares en hombres (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986). De esta forma, se ha encontrado que los niveles circulantes de DHEA y DHEA-S están correlacionados inversamente con la mortandad a partir de enfermedad cardiovascular (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986) y que disminuyen de forma paralela a la competencia inmune disminuida (Thomas and Weigle, Adv. Immunol. 46: 221-222, 1989). Un estudio en el hombre ha mostrado una correlación inversa entre el DHEA-S en suero fetal y niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) (Parker et al., Science 208: 512, 1980).

Los usos de la DHEA así como los beneficios de la terapia con andrógenos y estrógenos se discuten en la publicación de la patente internacional WO 94/16709.

No se cree que las correlaciones observadas en la técnica anterior sugieran un tratamiento o procedimientos profilácticos que resulten eficaces, o con ausencia de efectos secundarios indeseados, tal y como lo son las terapias de combinación descritas aquí.

Resumen de la invención

Según esto, es un objeto de presente invención proporcionar procedimientos eficaces de tratamiento para osteoporosis, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, ateroesclerosis, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de ovario y cáncer de útero a la vez que se minimizan efectos secundarios indeseados.

Otro objeto es proporcionar procedimientos para reducir el riesgo de adquirir las enfermedades anteriores.

Otro objeto es proporcionar equipos y composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en los procedimientos anteriores.

En una realización, la invención se relaciona con un procedimiento para tratar o reducir el riesgo de adquirir osteoporosis comprendiendo aumentar los niveles de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona (DHEA), sulfato de deshidroepiandrosterona (DHEA-S) y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol (5-diol), en un paciente en necesidad de dicho tratamiento o dicha reducción, y comprendiendo además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno (SERM) como parte de una terapia de combinación.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar o reducir el riesgo de adquirir hipercolesterolemia comprendiendo aumentar los niveles de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, en un paciente en necesidad de dicho tratamiento o dicha reducción, y comprendiendo además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno como parte de una terapia de combinación.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar o reducir el riesgo de adquirir hiperlipidemia comprendiendo aumentar los niveles de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, en un paciente en necesidad de dicho tratamiento o dicha reducción, y comprendiendo además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno como parte de una terapia de combinación.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar o reducir el riesgo de adquirir ateroesclerosis comprendiendo aumentar los niveles de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, en un paciente en necesidad de dicho tratamiento o dicha reducción, y comprendiendo además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno como parte de una terapia de combinación.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar o reducir el riesgo de adquirir cáncer de mama comprendiendo aumentar los niveles de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, en un paciente en necesidad de dicho tratamiento o dicha reducción, y comprendiendo además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno como parte de una terapia de combinación.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar o reducir el riesgo de adquirir cáncer endometrial comprendiendo aumentar los niveles de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, en un paciente en necesidad de dicho tratamiento o dicha reducción, y comprendiendo además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno como parte de una terapia de combinación.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar o reducir el riesgo de adquirir cáncer de útero comprendiendo aumentar los niveles de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, en un paciente en necesidad de dicho tratamiento o dicha reducción, y comprendiendo además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno como parte de una terapia de combinación.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar o reducir el riesgo de adquirir cáncer de ovario comprendiendo aumentar los niveles de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, en un paciente en necesidad de dicho tratamiento o dicha reducción, y comprendiendo además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno como parte de una terapia de combinación.

En otra realización, la invención proporciona un equipo que comprende un primer recipiente que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, y cualquier profármaco que se convierta in vivo en cualquiera de los precursores anteriores; y comprendiendo además un segundo recipiente que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador selectivo de receptor de estrógeno.

En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: a) un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable; b) una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por deshidroepiandrosterona, sulfato de deshidroepiandrosterona y androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, y cualquier profármaco que se convierta in vivo en cualquiera de los precursores de esteroides sexuales anteriores; c) una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador selectivo de receptor de estrógeno.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para reducir el riesgo de adquirir cáncer de mama, comprendiendo administrar a un paciente en necesidad de dicha reducción una cantidad profilácticamente eficaz de un modulador selectivo de receptor de estrógeno.

En un procedimiento para reducir la probabilidad de adquirir cáncer de mama, resulta deseable combinar la administración de un SERM con la administración de un precursor de esteroides sexuales. Sin embargo, la invención incluye también administrar sólo un SERM, lo que se muestra, por ejemplo, en las Figuras 1 y 2, para proporcionar un efecto profiláctico significativo, incluso en ausencia de precursores administrados. Los SERM preferidos con este propósito son los mismos que los que se han discutido para otros usos en la presente memoria descriptiva. Las dosificaciones y procedimientos preferidos son los mismos también.

Tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, un modulador selectivo de receptor de estrógeno (SERM) es un compuesto que funciona directamente o a través de su metabolito activo como un antagonista del receptor de estrógeno ("antiestrógeno") en tejido mamario, proporcionando además un efecto estrogénico o de tipo estrógeno en el tejido óseo y en los niveles en suero de colesterol (es decir, reduciendo el colesterol en suero). Es probable que los compuestos no esteroideos que funcionan in vitro como antagonistas del receptor de estrógeno o en tejido de mama humano o de rata (especialmente si el compuesto actúa como un antiestrógeno en células de mama con cáncer de mama) funcionen como un SERM. Por el contrario, los antiestrógenos esteroideos tienden a no funcionar como SERM porque no tienden a desarrollar ningún efecto beneficioso en el colesterol en suero. Los antiestrógenos no esteroideos que se han sometido a ensayo y se ha encotrado que funcionan como SERM incluyen EM-800, EM-01538, Raloxifeno, Tamoxifeno y Droloxifeno. Se han sometido a ensayo el antiestrógeno esteroideo ICI 182.780 y se ha encontrado que no funciona como SERM. Los SERM según la invención se pueden administrar en la misma dosificación que la conocida en la técnica cuando estos compuestos se usan como antiestrógenos.

Se ha registrado también una correlación entre el efecto beneficioso que los SERM tienen sobre el colesterol en suero y los efectos estrogénicos o de tipo estrógeno beneficiosos sobre el hueso y sobre los lípidos en suero. Los SERM que se han mostrado en la presente investigación actúan de un modo beneficioso sobre todos estos parámetros, incluyendo niveles de masa ósea, colesterol y triglicéridos. Tratando de nos estar encorsetados por la teoría, se cree que los SERM, muchos de los cuales tienen preferiblemente dos anillos aromáticos unidos por uno a dos átomos de carbono, interaccionan con el receptor de estrógeno en virtud de la parte de la molécula anterior que es la que mejor reconoce el receptor. Los SERM preferidos tienen cadenas laterales que pueden provocar de forma selectiva propiedades antagonísticas en tejido de mama sin tener propiedades antagonísticas significativas en otros tejidos. De esta forma, los SERM pueden funcionar según se desee como antiestrógenos en la mama mientras que sorprendentemente y deseablemente funcionan como estrógenos (o proporcionan actividad de tipo estrógeno) en hueso y en sangre (donde quedan afectadas de forma favorable las concentraciones de lípidos y colesterol). El efecto favorable sobre el colesterol y lípidos se traduce en un efecto favorable contra la ateroesclerosis, que es conocida por ser afectada de forma adversa por niveles impropios de colesterol y lípidos.

Todas las enfermedades tratadas por la invención sometidas a discusión en la presente memoria descriptiva responden favorablemente a andrógenos. Mejor que utilizar andrógenos tal cuales, los solicitantes utilizan precursores de esteroides sexuales como por ejemplo DHEA, DHEA-S, 5-diol, o profármacos convertidos a cualquiera de dichos precursores de esteroides sexuales, in vivo, DHEA-S se convierte en DHEA que a su vez se convierte en 5-diol. Se cree que cualquier tejido que responde de forma favorable a uno es probable que responda de forma favorable a los otros. Las formas profármacas de metabolitos activos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, H. Bundgaard "Design and Application of Prodrugs" (En: Textbook of Drug Design and Development. Publicado por H. Bundgaard y P. Krogsgaard-Larsen; Harwook Academic Publishers GmfH, Chur: Suiza, 1991), los contenidos de los cuales se incorporan como referencia en la presente memoria descriptiva. En particular, véanse las páginas 154-155 que describen varios grupos funcionales de metabolitos activos y grupos de profármacos correspondientes adecuados que se convierten in vivo en cada grupo funcional. El que los niveles de precursores de esteroides sexuales en pacientes se eleven según la invención, puede llevarse a cabo administrando tal precursor o administrando un profármaco de tal precursor. Al utilizar precursores en lugar de andrógenos, se reduce la actividad androgénica indeseable en tejidos diferentes de los diana. Los tejidos convierten precursores como por ejemplo DHEA en andrógenos solamente a través de un procedimiento natural y más regulado. Un elevado porcentaje de andrógenos se producen de forma local en tejidos periféricos y en diferentes grados en tejidos diferentes.

Los cánceres tratados según la invención responden de forma adversa a la actividad estrogénica. Por otro lado, la osteoporosis, hipercolesterolemia, hiperlipidemia y ateroesclerosis responden de forma favorable a la actividad estrogénica o de tipo estrógeno. Al usar SERM según la invención, se proporcionan efectos deseables en los tejidos diana sin efectos indeseables en otros ciertos tejidos. Por ejemplo, un SERM puede tener efecto estrogénico favorable en el hueso (o sobre lípidos o colesterol) mientras que evita un efecto estrogénico indeseable en la mama.

De esta forma, el precursor y el SERM proporcionan un efecto favorable en los tejidos diana mientras que minimizan efectos indeseables en otros ciertos tejidos. Además, hay sinergias sustanciales a la hora de usar los dos juntos según la invención. Por ejemplo, los estrógenos y andrógenos proporcionan un efecto beneficioso contra la osteoporosis por diferentes mecanismos (el estrógeno reduciendo la resorción ósea, el andrógeno contribuyendo a la formación ósea). La combinación de la presente invención proporciona hueso con efecto estrogénico o de tipo estrógeno beneficioso a través de la actividad de SERM y proporciona también andrógeno beneficioso a través de la conversión local de precursor a andrógeno en el hueso. Se cree que el precursor proporciona también estrógeno. Lo mismo es verdad en conexión con controlar lípidos o colesterol (útil para tratar o prevenir ateroesclerosis). Se proporciona una sinergia similar contra el cáncer de mama, endometrial, de ovario o de útero en los que el SERM proporciona un efecto antiestrogénico indeseable y el precursor proporciona un efecto androgénico deseable (mitigando el antiestrógeno cualquier conversión accidental de precursor a estrógeno). Los efectos indeseables se mitigan también de un modo sinergístico por la combinación usada en la invención.

Para todas las enfermedades discutidas en la presente memoria descriptiva, cualquier otro efecto sobre los tejidos mamarios que pueda resultar por otro lado de los estrógenos producidos por el precursor (cuando el precursor se usa para promover efectos androgénicos según la invención) se mitiga por el efecto antiestrogénico del SERM en tejido mamario.

En algunas realizaciones, se añaden progestinas para proporcionar un efecto androgénico adicional. Las progestinas pueden usarse a bajas dosificaciones conocidas en la técnica sin afectar de forma adversa a los receptores diferentes de los receptores de andrógeno (por ejemplo, receptores de glucocorticoide). Son también efectos secundarios androgénicos relativamente libres o no deseados (como por ejemplo vello facial con pacientes femeninas).

Los SERM preferidos sometidos a discusión en la presente memoria descriptiva se refieren: (1) a todas las enfermedades establecidas de ser susceptibles a la invención; (2) a aplicaciones terapéuticas y profilácticas; y (3) a composiciones farmacéuticas y equipos preferidos.

En una realización, el precursor es DHEA.

En otra realización, el precursor es DHEA-S.

En otra realización, el precursor es 5-diol.

Un paciente en necesidad de tratamiento o de reducir el riesgo de brote de una enfermedad dada es alguien que ha sido diagnosticado con tal enfermedad o un que es susceptible de adquirir tal enfermedad.

Excepto que se establezca de otra forma, la dosificación preferida de los compuestos activos (concentraciones y modos de administración) de la invención es idéntica para los fines terapéuticos y profilácticos. La dosificación para cada componente activo sometido a discusión en la presente memoria descriptiva es la misma sin importar la enfermedad que se está tratando (o la enfermedad cuya probabilidad de brote se reduzca).

Excepto cuando se recoja de otra forma o cuando se ponga de manifiesto a partir del contexto, las dosificaciones en la presente memoria descriptiva se refieren a peso de compuestos activos no afectado por excipientes, diluyentes, vehículos u otros ingredientes farmacéuticos, aunque tales ingredientes adicionales se incluyen de forma deseable, tal y como se muestra en los ejemplos en la presente memoria descriptiva. Cualquier forma de adminitración de la dosis (cápsula, comprimido, inyección o similares) comúnmente usada en la industria farmacéutica es apropiada para usar en la presente memoria descriptiva, y los término "excipiente", "diluyente" o "vehículo" incluye tales ingredientes no activos ya que se incluyen típicamente, junto con ingredientes activos en tales formas de administración de dosis en la industria. Por ejemplo, pueden incluirse cápsulas, píldoras, recubrimientos entéricos, diluyentes o excipientes sólidos o líquidos, aromatizantes, conservantes típicos o similares.

Todos los ingredientes activos usados en cualquiera de las terapias discutidas en la presente memoria descriptiva pueden formularse en composiciones farmacéuticas que incluyen también uno o más ingredientes activos diferentes. De forma alternativa, cada uno puede administrarse por separado pero de forma suficientemente simultánea en el tiempo de forma que un paciente haya elevado de forma eventual sus niveles sanguíneos o, de otra forma, disfrute de forma simultánea de los beneficios de cada uno de los ingredientes activos (o estrategias). En algunas realizaciones preferidas de la invención, por ejemplo, uno o más ingredientes activos se van a formular en una composición farmacéutica individual. En otras realizaciones de la invención, se proporciona un equipo que incluye al menos dos contenedores separados, en le que los contenidos de al menos un recipiente difiere, en su totalidad o en parte, de los contenidos de al menos otro recipiente con respecto a los ingredientes activos contenidos en el mismo.

Las terapias de combinación sometidas a discusión en la presente memoria descriptiva incluyen también el uso de un ingrediente activo (de la combinación) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento (o reducción del riesgo) de la enfermedad en cuestión en la que el tratamiento o prevención incluye además otro ingrediente activo de la combinación según la invención. Por ejemplo, en una realización, la invención proporciona el uso de un SERM en la preparación de un medicamento para usar en combinación con un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por DHEA, DHEA-S, 5-diol y profármacos convertidos en cualquiera de los precursores de esteroides sexuales anteriores, in vivo, en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades para las que se cree que la presente terapia de combinación es efectiva (es decir, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de útero, cáncer de ovario, osteoporosis, hipercolesterolemia, hiperlipidemia y ateroesclerosis). En otra realización, la invención proporciona el uso de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por DHEA, DHEA-S, 5-diol y profármacos convertidos en cualquiera de los precursores de esteroides sexuales anteriores, in vivo, en la preparación de un medicamento para usar en combinación con un SERM, para el tratamiento de cualquiera de esas mismas enfermedades.

En una realización de la invención, el DHEA no se utiliza como el precursor. En otra realización, EM-800 no se usa como SERM. En otra realización, no se usa la combinación de DHEA con EM-800.

En una realización preferida, el DHEA se usa en combinación con EM-1538.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el efecto del tratamiento con DHEA (10 mg, por vía percutánea, una vez al día) o EM-800 (75 \mug, por vía oral, una vez al día) en solitario o en combinación durante 9 meses sobre la incidencia del carcinoma mamario inducido por DMBA en la rata a lo largo de un período de observación de 279 días. Los datos se expresan como porcentaje de número total de animales en cada grupo.

La Figura 2 muestra el efecto del tratamiento con DHEA (10 mg, por vía percutánea, una vez al día) o EM-800 (75 \mug, por vía oral, una vez al día) por separado o en combinación durante 9 meses sobre el número medio de tumores por animal que padece tumores (A) y sobre el tamaño medio de tumor por rata que padece tumores (B) a lo largo de un período de observación de 279 días. Los datos se expresan como las medias \pm desviaciones estándar de las medias (SEM).

La Figura 3 muestra el efecto del tratamiento con DHEA (10 mg, por vía percutánea, una vez al día) o EM-800 (75 \mug, por vía oral, una vez al día) por separado o en combinación durante 9 meses sobre los niveles en suero de triglicéridos (A) y colesterol (B) en la rata. Los datos se expresan como las medias \pm desviaciones estándar de las medias. **: P<0,01 experimental frente al control respectivo.

La Figura 4 muestra: A) El efecto de dosis crecientes de DHEA (0,3 mg, 1,0 mg o 3,0 mg) administradas por vía percutánea dos veces al día sobre un tamaño medio de tumor ZR-75-1 en ratones desnudos ovariectomizados (OVX) suplementados con estrona. Los ratones OVX control que reciben solamente el vehículo se usan como controles adicionales. El tamaño de tumor inicial se tomó como el 100%. Se administró DHEA por vía percutánea (p. c.) en una solución de 0,02 ml de 50% de etanol-50% de propilenglicol sobre la piel dorsal. B) Efecto del tratamiento con dosis crecientes de DHEA o EM-800 por separado o en combinación durante 9 meses y medio sobre el peso medio del tumor ZR-75-1 en ratones desnudos OVX suplementados con estrona. **: P<0,01, ratones tratados frente a ratones OVX control suplementados con estrona.

La Figura 5 muestra el efecto de dosis orales crecientes del antiestrógeno EM-800 (15 \mug, 50 \mug o 100 \mug) (A) o de administración percutánea de dosis crecientes de DHEA (0,3 mg, 1,0 mg o 3,0 mg) combinadas con EM-800 (15 \mug) o solamente EM-800 (B) durante 9 meses y medio sobre el tamaño medio del tumor ZR-75-1 en ratones desnudos ovariectomizados (OVX) suplementados con estrona. El tamaño de tumor inicial se tomó como el 100%. Los ratones OVX control que reciben el vehículo en solitario se usaron como controles adicionales. La estrona se administró por vía subcutánea a la dosis de 0,5 \mug una vez al día, mientras que DHEA se disolvió en 50% de etanol-50% de propilenglicol y se aplicó sobre el área de piel dorsal dos veces al día en un volumen de 0,02 ml. También se hace una comparación con animales OVX que reciben el vehículo en solitario.

La Figura 6 muestra el efecto de un tratamiento de 12 meses solamente con deshidroepiandrosterona (DHEA) o en combinación con Flutamida o EM-800 sobre volumen de hueso trabecular en ratas ovariectomizadas. Se añaden animales intactos como controles adicionales. Los datos se presentan como media \pm desviación estándar de la media ** P<0,01 frente al Control OVX.

La Figura 7 muestra el efecto de un tratamiento de 12 meses solamente con deshidroepiandrosterona (DHEA) o en combinación con Flutamida o EM-800 sobre el número trabecular en ratas ovariectomizadas. Se añaden animales intactos como controles adicionales. Los datos se presentan como media \pm desviación estándar de la media ** P<0,01 frente al Control OVX.

La Figura 8 muestra metáfisis de tibia proximal a partir de control intacto (A), control ovariectomizado (B) y ratas ovariectomizadas tratadas solamente con DHEA (C) o en combinación con Flutamida (D) o EM-800 (E). Apréciese la cantidad reducida de hueso trabecular (T) en animales control ovariectomizados (B), y el aumento significativo en volumen de hueso trabecular (T) inducido después de la administración de DHEA (C). La adición de Flutamida a DHEA bloqueó parcialmente el efecto de DHEA sobre el volumen de hueso trabecular (T), mientras que la combinación de DHEA y EM-800 proporcionó una protección completa contra la pérdida ósea asociada a la ovariectomía. Tricromo modificado Masson Goldner, magn. x 80.T: Trabéculas. PC: Placa de Crecimiento.

La Figura 9 muestra el efecto de dosis crecientes (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 y 1 mg/kg) de EM-800, EM-1538 y Raloxifeno (EM-1105) administrado diariamente durante 4 días sobre el nivel de colesterol de rata ovariectomizada.

La Figura 10 muestra el efecto de un tratamiento de 34 semanas solamente con deshidroepiandrosterona (DHEA) o en combinación con EM-1538 (clorhidrato de EM-652) sobre espina lumbar DMO en ratas ovariectomizadas. Se añadieron animales intactos como controles adicionales. Los datos se presentan como media \pm desviación estándar de la media ** P<0,01 frente al Control OVX.

La Figura 11 muestra los efectos combinados del SERM (EM-652) y DHEA sobre parámetros de menopausia. No se espera efecto negativo.

La Figura 12 muestra la concentración plasmática de DHEA (ng/ml) (eje Y) en función del tiempo (eje X) después de una única absorción oral de precursores de esteroides sexuales preferidos de la invención (150 \mumol/rata) en ratas macho. En el cuadro, se recoge AUC a las 24 horas de DHEA inducida por estos compuestos.

EM-760	deshidroepiandrosterona
EM-900	androst-5-en-3\beta,17\beta-diol
EM-1304	androst-5-en-3\beta,17\beta-diol 3-acetato
EM-1305-CS	androst-5-en-3\beta,17\beta-diol diacetato
EM-1397	androst-5-en-3\beta,17\beta-diol 3-acetato-17-benzoato
EM-1400	androst-5-en-3\beta,17\beta-diol dibenzoato
EM-1410	androst-5-en-3\beta,17\beta-diol dipropionato
EM-1474-D	androst-5-en-3\beta,17\beta-diol dihemisuccinato

La Figura 13 muestra la concentración plasmática de androst-5-en-3\beta,17\beta-diol (ng/ml) (eje Y) en función del tiempo (eje X) después de una única absorción oral de precursor de esteroides sexuales de la invención (150 \mumol/rata) en ratas macho. En el cuadro, se recoge AUC a las 24 horas de androst-5-en-3\beta,17\beta-diol inducida por estos compuestos.

Descripción detallada de la invención

Es perfectamente conocido que los estrógenos estimulan la proliferación de las células epiteliales de mama y se piensa que la misma proliferación celular aumenta el riesgo de cáncer por acumulación de errores genéticos aleatorios que pueden dar lugar a neoplasia (Preston Martin et al., Cancer Res. 50: 7415-21, 1990). En base a este concepto, se han introducido antiestrógenos para prevenir el cáncer de mama con el objetivo de reducir la tasa de división celular estimulada por estrógenos.

La pérdida de ciclicidad ovárica encontrada en ratas Sprague Dawley hembra después de 10 meses de edad va acompañada de unos niveles aumentados en suero de estrógeno y prolactina y unas concentraciones disminuidas en suero de andrógeno y progesterona (Lu et al., 61st Annual Meeting of the Endocrine Society 106 (abst. #134), 1979; Tang et al., Biol. Reprod. 31: 399-413, 1984; Russo et al., Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Integument and Mammary Glands 252-266, 1989; Sortino y Wise, Endocrinology 124: 90-96, 1989; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991). Estos cambios hormonales que se dan espontáneamente cuando las ratas hembra envejecen están asociados a una proliferación multifocal y a una actividad secretora aumentada del tejido acinar/alveolar así como la dilatación del conducto de la glándula mamaria y formación de quistes (Boorman et al., 433, 1990; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991). Debería mencionarse que los cambios hiperplásicos y neoplásicos de la glándula mamaria de rata a menudo van acompañados de niveles aumentados de estrógenos y prolactina (Meites, J. Neural. Transm. 48: 25-42, 1980). El tratamiento con EM-800, un SERM de la presente invención, induce atrofia de la glándula mamaria que se caracteriza por una disminución en el tamaño y número de las estructuras lobulares, y una no evidencia de actividad secretora, lo que indica una potente actividad antiestrogénica de EM-800 en la glándula mamaria (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

El tratamiento con DHEA, un precursor de esteroides sexuales de la presente invención, conduce a una elevación de DHEA y 5-diol en suero, mientras que los niveles en suero de 4-diona, testosterona, dihidrotestosterona y estradiol solamente aumentan de forma moderada o, más a menudo, permanecen invariables, confirmando de esta forma la biotransformación intracelular de este precursor de esteroides en tejidos periféricos (Labrie et al., Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113-C-118, 1991). Sin embargo, el efecto estimulador de la DHEA administrada por vía oral sobre los andrógenos en suero, como por ejemplo testosterona y dihidrotestosterona, es de mayor amplitud que el efecto sobre estrógenos en suero, sugiriendo de esta forma que DHEA se transforma predominantemente en andrógenos en estos animales. Esta observación está de acuerdo con los datos obtenidos en mujeres en las que la formación de andrógenos a partir de DHEA resultó una vía más importante que la conversión de DHEA en estrógenos (Morales et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 78: 1360-1367, 1994; Labrie et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 774: 16-28, 1995; Labrie et al., Steroids 62: 148-158, 1997).

Con el conocimiento de la potente actividad antiestrogénica descrita anteriormente que da lugara la atrofia de la glándula mamaria y el efecto androgénico predominante de DHEA sobre la glándula mamaria, como mejor se explican los cambios histomorfológicos vistos en animales tratados con la combinación de un SERM y un precursor de esteroides sexuales es mediante una acción androgénica sin oposición de DHEA en la glándula mamaria de rata.

Se ha observado como lo más importante que los andrógenos ejercen una actividad antiproliferativa directa sobre el crecimiento de células cancerosas de mama humana ZR-75-1 in vitro y que tal efecto inhibidor de andrógenos es aditivo a aquel de un antiestrógeno (Poulin y Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937, 1986; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treat. 12: 213-225, 1988). Se han observado efectos inhibidores similares in vivo sobre xenoinjertos de ZR-75-1 en ratones desnudos (Dauvois et al., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). Se ha mostrado también que los andrógenos inhiben el crecimiento de carcinoma mamario inducido por DMBA en la rata, invirtiéndose esta inhibición por la administración simultánea del antiandrógeno puro Flutamida (Dauvois et al., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299-306, 1989). Tomados juntos, los datos presentes indican el compromiso del receptor de andrógeno en la acción inhibidora de DHEA en el cáncer de mama.

Como los antiestrógenos y los precursores de esteroides sexuales ejercen efectos inhibidores sobre el cáncer de mama por medio de diferentes mecanismos, la presente invención muestra que la combinación de un SERM (EM-800) y de un precursor de esteroides sexuales (DHEA) ejerce efectos inhibidores más potentes que cada compuesto usado por separado sobre el desarrollo de carcinoma mamario en rata inducido por DMBA ilustrado también en las Figuras 1 y 2. De hecho, No se encontró tumor inducido por DMBA al final del experimento en animales que habían recibido DHEA y EM-800.

La presente invención describe que la combinación de un precursor de esteroides (DHEA) y un SERM (EM-800) mantenía el efecto estimulador de DHEA sobre la formación de hueso y potenciaba el efecto inhibidor del SERM (EM-800) en solitario sobre la renovación de hueso tal y como demostraron disminuciones adicionales en hidroxiprolina urinaria y excreción de calcio cuando ambos compuestos se combinan.

Se ha mostrado que la DHEA ejerce efectos beneficiosos sobre el hueso en rata hembra (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997) y en mujeres posmenopáusicas (Labrie et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 3498-3505, 1997). De esta forma, en ratas hembra intactas, el tratamiento con DHEA aumenta la densidad mineral ósea (DMO) del esqueleto total, espina lumbar y fémur (Luo et al., Endocrinology 138: 4435, 1997).

Por otro lado, el tratamiento con EM-800 no tuvo un efecto significativo sobre la en animales intactos aunque se observaron potentes efectos estimuladores en las ratas ovariectomizadas (Martel et al., datos no publicados). Como EM-800 ejerce tales efectos estimuladores sobre la DMO del esqueleto total, espina lumbar y fémur en células ovariectomizadas, la falta de efecto estimulador significativo de EM-800 en animales intactos podría ser debido al hecho de que los esteroides sexuales presentes en ratas hembras intactas ejercen un efecto máximo sobre DMO (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). De forma similar, la falta de un efecto significativo de EM-800 en ratas ovariectomizadas ya recibiendo DHEA es probablemente debido a los efectos estimuladores máximos ejercidos por los andrógenos (y posiblemente estrógenos) sintetizados en las células óseas a partir de DHEA exógeno.

Se sabe que los estrógenos disminuyen el colesterol en suero pero que incrementan o no tienen efecto sobre los niveles de triglicéridos en suero (Love et al., Ann. Intern. Med. 115: 860-864, 1991; Walsh et al., New Engl. J. Med. 325: 1196-1204, 1991; Barrett-Connor, Am. J. Med. 95 (Suppl. 5A): 40S-43S, 1993; Russell et al., Atherosclerosis 100: 113-122, 1993; Black et al., J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994; Dippipo et al., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995; Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995). La Figura 3 muestra que EM-800 posee efectos hipocolesterolémicos e hipotrigliceridémicos en la rata, mostrando de esta forma su acción única sobre el perfil de lípidos en suero que es aparentemente diferente de el de otros SERM, como por ejemplo tamoxifeno (Bruning et al., Br. J. Cancer 58: 497-499, 1988; Love et al., J. natl. Cancer Inst. 82: 1327-1332, 1990; Dippipo et al., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995; Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995), droloxifeno (Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995) y raloxifeno (Black et al., J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994). La combinación de DHEA y EM-800 conservó los efectos hipocolesterolémicos e hipotrigliceridémicos de EM-800, sugiriendo de esta forma que tal combinación podía ejercer efectos beneficiosos sobre los lípidos en suero.

Debería mencionarse que el perfil de lípidos en suero es claramente diferente entre ratas y seres humanos. Sin embargo, como hay involucrado un mecanismo mediado por el receptor de estrógeno en el efecto hipocolesterolémico de los estrógenos así como de los antiestrógenos (Lundeen et al., Endocrinology 138: 1552-1558, 1997), la rata resulta un modelo útil para estudiar el efecto de estrógenos y "antiestógenos" en la disminución del colesterol en seres humanos.

En resumen, los datos descritos anteriormente demuestran claramente los efectos de la combinación de un SERM (EM-800) y de un precursor de esteroides sexuales (DHEA) sobre el desarrollo de carcinoma mamario inducido por DMBA, así como los efectos protectores de tal combinación sobre la masa ósea y los lípidos en suero. Tales datos sugieren los efectos beneficiosos adicionales de tal combinación para el tratamiento y prevención de osteoporosis a la vez que se mejora el perfil lipídico.

Se ha estudiado también la interacción potencial del efecto inhibidor del novedoso antiestrógeno (EM-800) con aquel del precursor de esteroides sexuales (DHEA) sobre el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de mama humano ZR-75-1 en ratones desnudos por administración combinada de los dos fármacos. Las Figuras 4 y 5 muestran que DHEA, por sí mismo, a las dosis usadas, provoca una inhibición del crecimiento de tumor de un 50 a un 80%, mientras que DHEA no afectó a la inhibición casi completa del crecimiento de tumor alcanzada con una dosis baja del antiestrógeno.

Las limitaciones de las medidas de la densidad mineral de hueso (DMO) se conocen bien. Como ejemplo, las medidas de DMO no mostraron cambio en ratas tratadas con el antiestrógeno esteroideo ICI 182780 (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25: 1-9, 1993) mientras que se vieron cambios inhibidores por histomorfometría (Gallagher et al., Endocrinology 133: 2787-2791, 1993). Se registraron diferencias similares con Tamoxifeno (Jordan et al., Breast Cancer Res. Treat. 10: 31-35, 1987; Sibonga et al., Breast Cancer Res. Treatm. 41: 71-79, 1996).

Debería indicarse que la densidad mineral ósea reducida no es una anomalía asociada a una dureza ósea reducida (Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in the prevention or treatment f post-menopausal osteoporosis, Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FDA, mayo de 1994). Por lo tanto es importante analizar los cambios en los parámetros bioquímicos del metabolismo óseo inducido por varios compuestos y tratamientos con el fin de obtener un buen conocimiento de su acción.

Es particularmente importante indicar que la combinación de DHEA y EM-800 ejerció efectos beneficiosos inesperados sobre importantes parámetros bioquímicos de metabolismo óseo. De hecho, DHEA por separado no tuvo ningún efecto sobre la relación hidroxiprolina urinaria/creatinina, un marcador de resorción ósea. Además, no se pudo detectar ningún efecto de DHEA sobre la excreción de calcio o fósforo urinario (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). Por otro lado, EM-800 disminuyó la relación hidroxiprolina urinaria/creatinina en un 48% mientras que, de forma similar a DHEA, no se vio ningún efecto de EM-800 sobre la excreción de calcio o fósforo urinario. Además, EM-800 no tuvo efecto sobre la actividad fosfatas alcalina en suero, un marcador de formación ósea, mientras que DHEA aumentó el valor del parámetro en aproximadamente un 75% (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Uno de los efectos inesperados de la combinación de DHEA y EM-800 se refiere a la relación hidroxiprolina urinaria/creatinina, un marcador de resorción ósea, que se redujo en un 69% cuando se combinaron DHEA y EM-800, siendo este valor estadísticamente diferente (p<0,01) de la inhibición de un 48% alcanzada por EM-800 en solitario, mientras que DHEA en solitario no mostró ningún efecto. Por lo tanto, la adición de DHEA a EM-800 aumenta en un 50% el efecto inhibidor de EM-800 sobre la resorción ósea. De la forma más importante, otro efecto inesperado de la adición de DHEA a EM-800 fue la disminución aproximada de un 84% en calcio urinario (de 23,17 \pm 1,55 a 3,71 \pm 0,75 \mumol/24 h/100 g (p<0,01)) y la disminución de un 55% en fósforo urinario (132,72 \pm 6,08 a 3,71 59,06 \pm 4,76 \mumol/24 h/100 g (p<0,01) respectivamente (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

TABLA 1

Grupo	Orina	Suero
	Calcio (\mumol/24	Fósforo (\mumol/24 g)	HP/Cr	tALP (IU/L)
	h/100 g)	h/100	(\mumol/mmol)
Control	23,17 \pm 1,55	132,72 \pm 6,08	13,04 \pm 2,19	114,25 \pm 14,04
DHEA (10 mg)	25,87 \pm 3,54	151,41 \pm 14,57	14,02 \pm 1,59	198,38 \pm 30,76*
EM-800 (75 \mug)	17,44 \pm 4,5	102,03 \pm 25,13	6,81 \pm 0,84**	114,11 \pm 11,26
HEA + EM-800	3,71 \pm 0,75**	59,06 \pm 4,76**	4,06 \pm 0,28**	204,38 \pm 14,20**

También resulta de interés notar que no se previene el potente efecto inhibidor de EM-80 sobre el colesterol en suero por el tratamiento simultáneo con DHEA (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Aunque el Raloxifeno y compuestos similares previenen la pérdida de masa ósea y la disminuyen el colesterol en suero (como los estrógenos), debería mencionarse que cuando se comparó la DMO con Raloxifeno y Premarina, el efecto del Raloxifeno sobre DMO fue menos potente que aquel de la Premarina (Minutes of the Endocrinology and Metabolism Drugs Advisory Comité, FDA Thursday, Meeting #68, 20 de noviembre de 1997).

Los presentes resultados obtenidos en la rata demuestran claramente que la DHEA puede proporcionar los efectos beneficiosos que faltan con el uso de un modulador selectivo de receptor de estrógeno (SERM) en solitario como por ejemplo EM-800, Raloxifeno, etcétera. Aunque un SERM tiene efectos limitados en la inhibición de resorción ósea, se cree que la adición de DHEA, 5-diol, DHEA-S estimula la formación ósea (un efecto no encontrado con un SERM o un estrógeno) y además reduce la resorción ósea por encima del efecto alcanzado con EM-800.

Lo más importante, la combinación de DHEA y EM-800 en ratas ovariectomizadas tratadas durante 12 meses tiene efectos beneficiosos sobre la morfometría ósea. El volumen de hueso trabecular es particularmente importante para la dureza ósea y para prevenir las fracturas óseas. Por lo tanto, en el estudio anteriormente mencionado, el volumen de hueso trabecular de la tibia aumentó desde un 4,1 \pm 0,7% en ratas ovariectomizadas hasta un 11,9 \pm 0,6% (p<0,01) con DHEA en solitario mientras que la adición de EM-800 a DHEA aumentó adicionalmente el volumen de hueso trabecular hasta un 14,7 \pm 1,4%, un valor similar a aquel encontrado en controles intactos (Figura 6).

A partir de un valor de 0,57 \pm 0,08 por milímetro en ratas ovariectomizadas, el tratamiento con DHEA dio lugar a un aumento de un 137% en el número de hueso trabecular comparado con los controles ovariectomizados. El efecto estimulador de DHEA alcanzó de esta forma 1,27 \pm 0,1 por milímetro mientras que un tratamiento simultáneo con EM-800 y DHEA dio lugar a un aumento adicional de un 28% en el número de hueso trabecular (p<0,01) comparado con aquel alcanzado por solamente DHEA (Figura 7). De forma similar, la adición de EM-800 al tratamiento con DHEA, dio lugar a una disminución adicional de un 15% (p<0,05) en la separación de hueso trabecular, comparado con aquel alcanzado por solamente DHEA, conduciendo de esta forma a valores no diferentes de aquellos vistos en controles intactos.

Como complemento a los datos numéricos presentados en las Figuras 6 y 7, la Figura 8 ilustra el aumento en volumen de hueso trabecular en la metáfisis de tibia proximal inducido por DHEA en animales tratados ovariectomizados (C) comparado con los controles ovariectomizados (B), así como la inhibición parcial del efecto estimulador de DHEA después de la adición de Flutamida al tratamiento con DHEA (D). Por otro lado, La administración de DHEA en combinación con EM-800 dio lugar a una prevención completa de la osteopenia inducida por ovariectomía (E), siendo comparable el volumen de hueso trabecular con aquel visto en los controles intactos (A).

La pérdida ósea observada en la menopausia en mujeres se cree que está relacionado con un aumento de la tasa de resorción ósea que no está totalmente compensado con el aumento secundario en la formación ósea. De hecho, los parámetros de formación y resorción ósea aumentan en la osteoporosis y la resorción y formación óseas se inhiben por terapia de reposición de estrógenos. El efecto inhibidor de la reposición de estrógenos sobre la formación ósea se cree por lo tanto que resulta de un mecanismo acoplado entre la resorción ósea y la formación ósea, de tal forma que la reducción primaria inducida por estrógeno en la resorción ósea logra una reducción en la formación ósea (Parfitt, Calcified Tissue Internacional 36 Suppl. 1: S37-S45, 1984).

La dureza del hueso cancloso y conscuente resistencia frente a la fractura no solamente depende de la cantidad total de hueso canceloso, sino también de la microestructura trabecular, tal y como se determina por el número, tamaño y distribución de las trabéculas. La pérdida de función ovárica en mujeres posmenopáusicas va acompañada de una disminución significativa del volumen total de hueso trabecular (Melsen et al., acta Patologica & Microbiologica Scandinavia 86: 70-81, 1978; Vakamatsou et al., Calcified Tissue Internacional 37: 594-597, 1985), relacionada principalmente con una disminución en el número y, en un menor grado, en la anchura o trabéculas (Weinstein y Hutson, Bone 8: 137-142, 1987).

En el presente estudio, el efecto estimulador androgénico de DHEA se observó sobre casi todos los parámetros histomorfométricos óseos estudiados. De esta forma, DHEA dio lugar a un aumento significativo en el volumen de hueso trabecular así como en el número trabecular, mientras que el área trabecular disminuyó.

Con el fin de facilitar el aspecto de la terapia de combinación de la invención, para cualquier indicación sometida a discusión en la presente memoria descriptiva, la invención contempla composiciones farmacéuticas que incluyen el SERM o el compuesto bisfosfonato y el precursor de esteroides sexuales (DHEA, DHEA-S, 5-diol) en una sola composición para administración simultánea. La composición puede ser adecuada para administración mediante cualquier modo tradicional incluyendo, pero no limitado a, administración oral, inyección subcutánea, inyección intramuscular o administración percutánea. En otras realizaciones, se proporciona un equipo, incluyendo el equipo uno o más SERM o bisfosfonato y precursores de esteroides sexuales por separado o en un recipiente. El equipo puede incluir materiales apropiados para administración oral, por ejemplo comprimidos, cápsulas, jarabes y similares, y para administración transdérmica, por ejemplo pomadas, lociones, geles, cremas, parches de liberación prolongada y similares.

Los solicitantes creen que la administración de los SERM y precursores de esteroides sexuales tiene utilidad en el tratamiento y/o prevención del desarrollo de osteoporosis, cáncer de mama, hipercolesterolemia, hiperlipidemia o ateroesclerosis. Los ingredientes activos de la invención (SERM o precursor o bisfosfonato o de otra forma) puede formularse y administrarse de una serie de modos.

El ingrediente activo para administración transdérmica o a través de la mucosa está presente preferiblemente a razón de un 0,5% a un 20% en peso relativo al peso total de la composición farmacéutica, más preferiblemente entre un 2 y un 10%. DHEA o 5-diol deberían estar a una concentración de al menos un 7% para administración percutánea. De forma alternativa, el ingrediente activo puede disponerse en un parche transdérmico que tenga estructuras conocidas en la técnica, por ejemplo, estructuras como por ejemplo aquellas establecidas en la patente europea E.P. nº 0279982.

Cuando se formula en forma de pomada, loción, gel o crema o similares, el compuestos activo se mezcla con un vehículo adecuado que es compatible con la piel o mucosa humana y que favorece la penetración transdérmica del compuesto a través de la piel o mucosa. En la técnica se conocen vehículos adecuados e incluyen, pero no se limitan a, Klucel HF y base Glaxal. Algunos están disponibles en el mercado, por ejemplo base Glaxal disponible en Glaxal Canada Limited Company. Otros vehículos adecuados pueden encontrarse en Koller and Buri, S. T. P. Pharma 3(2), 115-124, 1987. El vehículo es preferiblemente uno en el que el/los ingrediente(s) activo(s) es/son soluble(s)
a temperatura ambiente a la concentración a la que se usa el ingrediente activo. El vehículo debería de tener suficiente viscosidad para mantener el inhibidor sobre un área localizada de piel o mucosa a la que se ha aplicado la composición, sin desplazarse o evaporarse durante un período de tiempo suficiente para permitir la penetración sustancial del precurso a través del área localizada de piel o mucosa, y en el torrente sanguíneo en el que provocará un efecto clínico deseable. El vehículo es típicamente una mezcla de varios componentes, por ejemplo disolventes farmacéuticamente aceptables, y un agente espesante. Una mezcla de disolventes orgánicos e inorgánicos puede ayudar a la solubilidad hidrófila y lipófila, por ejemplo agua y un alcohol, como por ejemplo etanol.

Los precursores de esteroides sexuales son deshidroepiandrosterona (DHEA) (disponible en Diosynth Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.), sus profármacos (disponibles en Steraloids, Wilton, New Hampshire, EE.UU.), 3-androsten-3\beta,17\beta-diol y sus profármacos EM-1304 y EM-01474-D (disponibles en Steraloids, Wilton, New Hampshire,, EE.UU.).

1

2

Se prefiere que el precursor de esteroides sexuales se formule en forma de gel alcohólico conteniendo un 2,0 a un 10% de triglicérido caprílico-cáprico (Neobee M-5); un 10 a un 20% de hexilenglicol; un 2,0 a un 10% de monoetiléter de dietilenglicol (Transutol); un 2,0 a un 10% de Ciclometicona (Dow Corning 345); un 1,0 a un 2% de alcohol bencílico y un 1,0 a un 5,0% de hidroxipropilcelulosa (Klucel HF).

El vehículo puede incluir también varios aditivos comúnmente usados en pomadas y lociones y bien conocidos en las técnicas cosméticas y médicas. Por ejemplo puede haber presentes fragancias, antioxidantes, perfumes, agentes gelificantes, agentes espesantes como por ejemplo carboximetilcelulosa, tensioactivos, estabilizantes, emolientes, agentes colorantes y otros agentes similares. Cuando se usa para tratar enfermedades sistémicas, el lugar de aplicación sobre la piel debería cambiarse con el fin de evitar una excesiva concentración local de ingrediente activo y posible sobre-estimulación de la piel y glándulas sebáceas por metabolitos androgénicos del precursor de esteroides sexuales.

En una composición farmacéutica para administración oral, DHEA u otro precursor está presente preferiblemente en una concentración de entre un 5 y un 98% en peso relativo al peso total de la composición, más preferiblemente entre un 50 y un 98 por ciento, especialmente entre un 80 y un 98 por ciento. Un único precursor como por ejemplo DHEA puede ser el único ingrediente activo o, de forma alternativa, pueden usarse una serie de precursores y/o sus análogos (por ejemplo, una combinción de DHEA, DHEA-S, 5-diol, o una combinación de dos o más compuestos convertidos in vivo en DHEA, DHEA-S, 5-diol, o una combinación de de DHEA o 5-diol y uno o más análogos de los mismos que se convierten in vivo en DHEA o 5-diol, etcétera. El nivel de DHEA en sangre es el criterio final para adecuar la dosificación que tiene en cuenta la variación individual e absorción y metabolismo.

Preferiblemente, el médico encargado, especialmente al comienzo del tratamiento, seguirá una respuesta global del paciente individual y los niveles de DHEA en suero (en comparación con las concentraciones en suero preferidas discutidas anteriormente) y seguirá la respuesta global del paciente al tratamiento, ajustando las dosificaciones como fuese necesario, cuando el metabolismo o reacción al tratamiento de un paciente dado sea atípica.

El tratamiento según la invención es adecuado para una continuación indefinida. Se espera que el tratamiento con DHEA y/o 5-diol mantendrá simplemente los niveles de DHEA dentro de un intervalo similar a aquel que se da en la naturaleza en mujeres antes de la menopausia (concentración en suero entre 4 y 10 microgramos por litro), o en la naturaleza en hombres adultos jóvenes (concentración en suero entre 4 y 10 microgramos por litro).

El compuesto SERM o bisfosfonato y/o el precursor de esteroides sexuales pueden administrarse también por vía oral, y pueden formularse con excipientes farmacéuticos convencionales, por ejemplo lactosa secada por pulverización, celulosa microcristalina y estearato de magnesio en comprimidos o en cápsulas para administración oral.

La sustancia activa puede encapsularse en comprimidos o en grajeas mezclándose con sustancias vehículo pulverulentas sólidas, como por ejemplo citrato sódico, carbonato cálcico o fosfato dicálcico, y aglutinantes como por ejemplo polivinilpirrolidona, gelatina o derivados de celulosa, posiblemente añadiendo también lubricantes como por ejemplo estearato de magnesio, laurilsulfato sódico, "Carbowax" o polietilenglicol. Por supuesto, pueden añadirse sustancias que mejora el sabor en el caso de formas para administración oral.

Como formas adicionales, uno puede usar cápsulas en forma de punzón, por ejemplo de gelatina dura, así como cápsulas cerradas de gelatina suave que comprenden un agente que suaviza la superficie o plastificante, por ejemplo glicerina. Las cápsulas en forma de punzón contienen la sustancia activa preferiblemente en forma de granulado, por ejemplo en mezcla con cargas, como por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol, almidones, como por ejemplo almidón o amilopectina de patata, derivados de celulosa o ácidos silícicos altamente dispersos. En cápsulas de gelatina suave, la sustancia activa está preferiblemente disuelta o suspendida en líquidos adecuados, como por ejemplo aceites vegetales o polietilenglicoles líquidos.

La loción, pomada, gel o crema debería extenderse de forma meticulosa sobre la piel, de forma que el exceso no quede claramente visible, y no se debería lavar la piel en esa región hasta que se haya dado la mayor parte de la penetración transdérmica, preferiblemente al menos 4 horas y, más preferiblemente, al menos 6 horas.

Puede usarse un parche transdérmico para suministrar el precursor según técnicas conocidas. Se aplica típicamente durante un período mucho más largo, por ejemplo 1 a 4 días, pero el ingrediente activo entra en contacto típicamente con un área de superficie más pequeño, permitiendo un suministro lento y constante de ingrediente activo.

Una serie de sistemas de suministro de fármacos transdérmicos que se han desarrollado, y están en uso, son adecuados para suministrar el ingrediente activo de la presente invención. La tasa de liberación está controlada típicamente por una matriz de difusión, o por el paso del ingrediente activo a través de una membrana de control.

Los aspectos mecánicos de los dispositivos transdérmicos se conocen bien en la rata y se explican, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. 5.162.037, 5.154.922, 5.135.480, 4.666.441, 4.624.665, 3.742.951, 3.797.444, 4.568.343, 5.064.654, 5.071.644, 5.071.657, cuyas descripciones se incorporan como referencia en la presente memoria descriptiva. La patente europea 0279982 y la solicitud de patente británica 2185187 proporcionan unos antecedentes adicionales.

El dispositivo puede ser cualquiera de los tipos generales conocidos en la técnica, incluyendo dispositivos de suministro transdérmico de matriz adhesiva y del tipo depósito. El dispositivo puede incluir matrices que contienen fármacos que incorporan fibras que absorben el ingrediente activo y/o vehículo. En un dispositivo de tipo depósito, el depósito puede estar definido por una membrana polimérica impermeable al vehículo y al ingrediente activo.

En un dispositivo transdérmico, el mismo dispositivo mantiene al ingrediente activo en contacto con la superficie de piel localizada deseada. En tal dispositivo, la viscosidad del vehículo para el ingrediente activo es de menor importancia que con una crema o gel. Un sistema disolvente para un dispositivo transdérmico puede incluir, por ejemplo, ácido oleico, lactato de alcohol lineal y dipropilenglicol, u otros sistemas disolventes conocidos en la técnica. El ingrediente activo puede estar disuelto o suspendido en el vehículo.

Para unirse a la piel, se puede montar el parche transdérmico sobre una cinta adhesiva quirúrgica que tenga un agujero perforado en el centro. El adhesivo está cubierto preferiblemente con una tira fácilmente separable para protegerlo antes de su uso. Material típico adecuado para la tira fácilmente separable incluye polietileno y papel revestido de polietileno, y preferiblemente revestido de silicona para facilitar su retirada. Para aplicar el dispositivo, simplemente se retira la tira fácilmente separable y el adhesivo se une a la piel del paciente. En la patente de los EE.UU. 5.135.480, la descripción que se incorpora como referencia, Bannon et al., describe un dispositivo alternativo que tiene un medio no adhesivo para asegurar el dispositivo a la piel.

El sistema de suministro percutáneo o a través de la mucosa de la invención puede usase también como un sistema de suministro novedoso y mejorado para la prevención y/o tratamiento de osteoporosis u otras enfermedades que responden favorablemente al tratamiento con andrógeno y/o estrógenos.

Un modulador selectivo del receptor de estrógeno de la invención tiene una fórmula molecular con las siguientes características: a) dos anillos aromáticos espaciados por 1 ó 2 átomos de carbono intermedios, estando ambos anillos aromáticos no sustituidos o sustituidos por un grupo hidroxilo o un grupo convertido in vivo a hidroxilo; y b) una cadena lateral que posee un anillo aromático y una función amina terciaria o una de sus sales.

Un SERM de la invención preferido es EM-800, recogido en el documento PCT/CA96/
00097 (documento WO96/26201). La estructura molecular de EM-800 es:

3

Otro SERM de la invención preferido es EM-01538

4

El EM-1538 (también denominado clorhidrato de EM-652) es la sal clorhidrato del potente antiestrógeno EM-652; comparado con EM-800, EM-1538 es una sal más simple y fácil de sintetizar. Resultó también más fácil de aislar, purificar, cristalizar y mostró una buena estabilidad del estado sólido. A la hora de administrar EM-800 y EM-1538, se cree que dan lugar al mismo compuesto activo in vivo.

Otros SERM preferidos de la invención incluyen Tamoxifeno ((Z)-2-[4-(1,2-difenil-1-butenil)]-N,N-dimetil-etanamina) (disponible en Zeneca, Reino Unido), Toremifeno (disponible en Orion-Farmos Pharmaceutical, Finlandia, o Schering Plough), Droloxifeno y CP-336.156 sal D-(-)-tartrato de (cis-1R-[4'-pirrolidin-etoxifenil]-2S-fenil-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno) (Pfizer Inc, EE.UU.), Raloxifeno (Eli Lilly and Co., EE.UU.), LY 335563 y LY 353381 (Ely Lilly and Co., EE.UU.), Idoxifeno (SmithKline Beecham, EE.UU.), Levormeloxifeno (3,4-trans-2,2-dimetil-3-fenil-4-[4-(2-(2-(pirrolidin-1-il)etoxi)fenil]-7-metoxicroman) (Novo Nordisk, A/S Dinamarca), el cual se describe en Shalmi et al., en los documentos WO97/25034, WO 97/25035, WO 97/25038; y Korsgaard et al., documentos WO 97/25036, GW5638 (descrito por Willson et al., Endocrinology, 138 (9), 3901-3911, 1997) y derivados indólicos (descrito por Miller et al., documento EP 0802183A1) y TSE 424 desarrollado por Wyeth Avers (EE.UU.) y descrito en el documento JP10036347 (American home products corporation) y derivados no esteroideos de estrógeno descritos en el documento 97/32837.

Puede usarse cualquier SERM usado tal y como se requiere por su eficacia, tal y como recomienda el fabricante. En la técnica se conocen bien las dosificaciones apropiadas. Puede usarse cualquier otro antiestrógeno no esteroideo disponible en el mercado según la invención. Cualquier compuesto que tenga actividad similar a los SERM (ejemplo: puede usarse Raloxifeno).

Los SERM administrados según la invención se administran preferiblemente en un intervalo de dosificación entre 0,01 y 10 mg/kg de peso corporal por día (preferiblemente 0,05 a 1,0 mg/kg), con 5 mg por día, especialmente 10 mg por día, prefiriéndose en dos dosis divididas de igual manera para una persona de peso corporal medio cuando se administran por vía oral, o en un intervalo de dosificación entre 0,003 y 3,0 mg/kg de peso corporal por día (preferiblemente 0,015 a 0,3 mg/kg), con 1,5 mg por día, especialmente 3 mg por día, prefiriéndose en dos dosis divididas de igual manera para una persona de peso corporal medio cuando se administran por vía parenteral (es decir, administración intramuscular, subcutánea o percutánea), Los SERM se administran preferiblemente junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable tal y como se describe posteriormente.

Los bisfosfonatos de la invención preferidos incluyen Alendronato [sal disódica de tipo hidrato del ácido (4-amino-1-hidroxibutiliden)bis fosfónico] disponible en Merck Shape and Dohme bajo el nombre comercial de Fosamaz, Etidronato [ácido (1-hidroxietiliden)bis fosfónico, 2,2'-iminobis etanol] disponible en Procter and Gamble bajo los nombres comerciales de Dicrocal y Didronel, Clodronato [sal disódica del ácido (diclorometilen)bis fosfónico] disponible en Rhône-Poulenc Rorer bajo el nombre comercial de Bonefos, o disponible en Boehringer Mannheim bajo el nombre comercial de Ostac, y Pamidronato (sal disódica del ácido (3-amino-1-hidroxipropiliden)bis fosfónico) disponible en Geigy bajo el nombre comercial de Aredia. Risedronato (sal monosódica del ácido 1-hidroxi-2-(3-piridinil)etiliden bisfofónico) está en desarrollo clínico. Pueden usarse cualesquier otros bisfosfonatos disponibles comercialmente según la invención, todos a la dosificación recomendada por el fabricante. Del mismo modo pueden utilizarse precursores de esteroides sexuales a las dosificaciones recomendadas en la técnica anterior, preferiblemente a dosificaciones que reestablezcan los niveles circulantes a aquellos de mujeres sanas de edad entre 20 y 30 años o a aquellos de mujeres adultas posmenopáusicas.

Con respecto a la totalidad de las dosificaciones recomendadas en la presente memoria descriptiva, el médico encargado debería seguir la respuesta individual del paciente y ajustar la dosificación según eso.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y procedimientos Animales

Se obtuvieron ratas hembra Sprague-Dawley [Crl:CD(SD)Br] con 44-46 días de edad en Charles River Canada Inc. (St. Constant, Quebec) y se colocaron 2 por caja en un ambiente controlado de luz (12 horas de luz diurna; luces encendidas a las 7:15 horas) y temperatura (22 \pm 2ºC). Los animales recibieron alimento para roedores Punna y agua del grifo a voluntad. Los estudios sobre los animales se llevaron a cabo en un local aprobado por el Consejo Canadiense sobre el Cuidado de los Animales (CCAC, Canadian Council on Animal Care) de acuerdo con la Guía para el Cuidado y uso de Animales Experimentales del CCAC.

Inducción de tumores mamarios por DMBA

Se indujeron carcinomas mamarios mediante una única administración intragástrica de 20 mg de DMBA (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO) en 1 ml de aceite de maíz a los 50-52 días de edad. Dos meses más tarde, se llevó a cabo la medida de tumores cada dos semanas. Se registraron los dos parámetros perpendiculares más largos de cada tumor con calibres para estimar el tamaño del tumor tal y como se describe (Asselin et al., Endocrinology 101: 666-671, 1977). Se registraron el lugar, tamaño y número de tumores.

Tratamiento

Se dividió a los animales de forma aleatoria en grupos, conteniendo cada uno 20 ratas con la excepción de 40 animales en el grupo control. Se trató a los animales durante 282 días con lo siguiente: (1) vehículos control, para DHEA y EM-800; (2) EM-800 ((+)-7-pivaloiloxi-3-(4'-pivaloiloxifenil)-4-metil-2-(4''-(2'''-piperidinoetoxi)fenil)-2H-benzopirano) (75 \mug, por vía oral, una vez al día) en 0,5 ml de una suspensión con etanol al 4%, polietilenglicol 600 al 4%, gelatina al 1%, NaCl al 0,9%; (3) DHEA (10 mg, por vía percutánea, una vez al día) en 0,5 ml de 50% de etanol y 50% de propilenglicol; y (4) EM-800 y DHEA. El tratamiento se inició tres días antes de la administración oral de DMBA. El EM-800 en la División de Química aplicada a Medicina en el laboratorio de los solicitantes, mientras que la DHEA se adquirió en Steraloids Inc., Wilton, NH.

Muchos de los animales control y algunos de los animales tratados con EM-800 o con DHEA se sacrificaron por dislocación cervical bajo anestesia inducida por isoflurano 6 meses después de la administración de DMBA como consecuencia de un tamaño demasiado grande de los tumores. Los valores de tamaño y número de tumores de estas ratas en el momento del sacrificio, junto con aquellos medidos a los intervalos de tiempo más tardíos de los animales supervivientes, se usaron para el análisis posterior de la incidencia de tumores, número medio de tumores por rata que padecía tumores y tamaño medio de tumor por animal que padecía tumores. Los animales que quedaron (9 ratas de los controles y 13-19 ratas de cada uno de los otros grupos) continuaron recibiendo el tratamiento durante un período de otros tres meses con el fin de observar la potencia preventiva a largo plazo de DHEA y EM-800 por separado o en combinación. Las ratas se sacrificaron 279 días después de la administración de DMBA. Se recuperaron inmediatamente los úteros, vaginas y ovarios, se limpiaron de tejido conectivo y adiposo y se pesaron.

Recuperación de muestras y procesamiento

Se recuperaron muestras de orina de veinticuatro horas al final del experimento de las 9 primeras de cada grupo después de transferirlas en jaulas metabólicas (Allentown Caging Equipment Co., Allentown, N J). Se recuperaron y se analizaron dos muestras urinarias en diferentes días para cada animal con el fin de minimizar la influencia de la variación diaria. Por lo tanto, cada valor mostrado representa la media de las dos medidas llevada acabo en dos días diferentes. Se añadieron 0,5 ml de tolueno en los tubos de recolección de orina para prevenir la evaporación de la orina y el crecimiento de bacterias, y se registró el volumen de orina. Tras el sacrificio se recuperó la sangre del tronco y se dejó coagular a 4ºC durante una noche antes de una centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos.

Análisis de orina y parámetros bioquímicos del suero

Se usaron muestras recién tomadas para el ensayo de creatinina urinaria, calcio y fósforo así como de actividad fosfatasa alcalina total (tALP, total alkaline phosphatase), colesterol y triglicéridos. Estos parámetros bioquímicos se midieron de forma automática con un sistema Monarch 2000 Chemistry System (Instrumentation Laboratory Co. Lexington, M A) bajos condiciones de Buenas Prácticas de Laboratorio. La hidroxiprolina urinaria se midió tal y como se describe en Podenphant et al., Clinica Chimica Acta 142: 145-148,1984).

Medidas de masa ósea

Se anestesió a las ratas con una inyección i.p. de clorhidrato de cetamina y diazepam a dosis de 50 y 4 mg/kg de peso corporal respectivamente. Se hizo un escáner del esqueleto completo y del fémur derecho usando absorciometría por rayos X de doble energía (DEXA; QDR 2000-7.10C, Hologic, Waltham, M A) equipado con un programa de alta resolución regional. Los tamaños de campo de escaneo fueron 28,110 x 17,805 cm y 5,0 x 1,902 cm, las resoluciones fueron 0,1511 x 0,0761 cm y 0,0254 x 0,0127 cm, mientras que las velocidades de escaneo fueron 0,3608 y 0,0956 mm/segundo para el esqueleto total y el fémur respectivamente. El contenido mineral óseo (CMO) y la densidad mineral ósea (DMO) del esqueleto total, espina lumbar y fémur se midieron en las imágenes escaneadas de esqueleto total y fémur.

Análisis estadísticos

Se midió la significancia estadística según la prueba de intervalo múltiple de Duncan-Kramer (Biometrics 12: 307-310, 1956). Se llevó a cabo un análisis de la incidencia del desarrollo de tumores mamarios usando la prueba exacta de Fisher (Conover, Practical nonparametric statistics, 2ª Edición 153-170, 1980). Los datos se representan como medias \pm desviaciones estándar de las medias (S.E.M.)

Resultados Efecto sobre el desarrollo de carcinoma mamario inducido por DMBA

Tal y como se ilustra en la Figura 1, el 95% de los animales control desarrollaron tumores mamarios apreciables a los 279 días después de la administración de DMBA. El tratamiento con DHEA o EM-800 previno parcialmente el desarrollo de carcinoma mamario inducido por DMBA, y la incidencia por lo tanto se redujo a un 57% (p<0,01) y aun 38% (p<0,01) respectivamente. Resulta de interés que la combinación de los dos compuestos condujo a un efecto inhibidor significativamente más alto que aquellos logrados por cada compuesto por separado (p<0,01 frente a DHEA o EM-800 por separado). De hecho, los dos únicos tumores que se desarrollaron en el grupo de animales tratados con ambos compuestos desaparecieron antes del final del experimento.

El tratamiento con DHEA o EM-800 disminuyó el número medio de tumores por animal que padecía tumores de 4,7 \pm 0,5 tumores en animales control a 3,4 \pm 0,7 (N. S.) y 1,4 \pm 0,3 (p<0,01) tumores/animal respectivamente, mientras que no se encontraron tumores al final del experimento en los animales que recibieron ambos fármacos (p<0,01 frente a los otros tres grupos) (Figura 2A).Uno de los dos tumores que desaparecieron al final estuvo presente desde el día 79 hasta el día 201 después de la administración de DMBA, mientras que el otro tumor estuvo patente desde el día 176 hasta el día 257. En la Figura 2B se puede ver que DHEA o EM-800 por separado disminuyeron el área media de tumor por animal que padecía tumores de 12,8 \pm 1,3 cm^{2} al final del experimento a 10,2 \pm 2,1 cm^{2} (N. S.) y 7,7 \pm 1,8 cm^{2} (N. S.) respectivamente, mientras que el tratamiento de combinación dio lugar a un valor cero (p<0,01 frente a los otros tres grupos). Los dos tumores que se desarrollaron en el grupo de animales tratados con DHEA y EM-800 no crecieron más de 1 cm^{2}. Debería mencionarse que los valores reales de área media de tumor así como el número medio de tumores por animal que padecía tumores en el grupo control deberían ser más elevados que los valores presentados en la Figura 2, ya que muchas ratas tuvieron que ser sacrificadas antes del final del experimento como consecuencia del tamaño excesivo de los tumores. Los valores medidos en el momento del sacrificio se incluyeron por lo tanto como tales en los cálculos realizados en los intervalos de tiempo finales con el fin de minimizar un sesgo en el grupo control que, en cualquier caso, permanecieron significativamente por encima de los otros grupos.

Efecto sobre el hueso

Una administración percutánea a largo plazo de DHEA a ratas hembra indujo aumentos de un 6,9% (p<0,01), un 10,6% (p<0,05) y un 8,2% (p<0,01) en la densidad mineral ósea (DMO) de esqueleto total, espina lumbar y fémur respectivamente (Tabla 2). Por otro lado, no se encontró un cambio significativo en los animales tratados con EM-800. Además, cuando ambos compuestos se administraron simultáneamente, los valores obtenidos fueron comparables a aquellos alcanzados con solamente DHEA.

El tratamiento con DHEA aumentó la actividad fosfatasa alcalina total (tALP) en suero en un 74% (p<0,05), pero no tuvo efecto sobre la excreción diaria en orina de calcio y fósforo y sobre la relación de hidroxiprolina a creatinina en orina (Tabla 3). Por otro lado, el tratamiento con EM-800 disminuyó la relación de hidroxiprolina a creatinina en orina en un 48% (p<0,01), pero no tuvo una influencia estadísticamente significativa sobre la excreción diaria en orina de calcio y fósforo y la actividad tALP. La combinación de DHEA y EM-800 condujo a un aumento en la actividad tALP en suero (p<0,01) similar a aquel alcanzado con solamente DHEA y redujo la relación de hidroxiprolina a creatinina en orina en un 69%, un valor significativamente (p<0,01) más bajo que aquel alcanzado con solamente EM-800. Además, la combinación de los dos fármacos redujo significativamente la excreción diaria en orina de calcio y fósforo en un 84% (p<0,01) y un 56% (p<0,01) respectivamente, mientras que no se observó un cambio significativo con cada fármaco por separado (Tabla 3).

Efecto sobre los niveles de lípidos en suero

El tratamiento a largo plazo con EM-800 disminuyó los niveles de triglicéridos y colesterol en suero en un 72% (p<0,01) y en un 45% (p<0,01) respectivamente, mientras que la administración a largo plazo de DHEA disminuyó los niveles de triglicéridos en suero en un 60% (p<0,01), no siendo afectados los niveles de colesterol en suero. Además, se midieron disminuciones de un 42% (p<0,01) y un 52% (p<0,01) en concentraciones de triglicéridos y colesterol en suero en los animales tratados con EM-800 y DHEA (Figura 3).

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TABLA 2

\begin{minipage}[t]{155mm} Efecto del tratamiento con solamente DHEA (10 mg, por vía percutánea, una vez al día) o EM-800 (75 \mu g, por vía oral, una vez al día) o en combinación durante 9 meses sobre densidad mineral ósea (DMO) de fémur, espina lumbar y esqueleto total en la rata hembra. Las medidas se llevaron a cabo en 9 ratas por grupo. : p<0,05; *: p<0,01, experimental contra control \end{minipage}
Grupo	DMO (g/cm^{2})
	Esqueleto total	Espina Lumbar	Fémur
Control	0,1371 \pm 0,0025	0,1956 \pm 0,0067	0,3151 \pm 0,0063
DHEA (10 mg)	0,1465 \pm 0,0010**	0,2163 \pm 0,0049*	0,3408 \pm 0,0038**
EM-800 (75 \mug)	0,1356 \pm 0,0017	0,1888 \pm 0,0045	0,3097 \pm 0,0047
DHEA + EM-800	0,1498 \pm 0,0019**	0,2108 \pm 0,0061	0,3412 \pm 0,0056**

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TABLA 3

\begin{minipage}[t]{155mm} Efecto del tratamiento con solamente DHEA (10 mg, por vía percutánea, una vez al día) o EM-800 (75 \mu g, por vía oral, una vez al día) o en combinación durante 9 meses sobre parámetros de metabolismo óseo en la rata: excreción diaria en orina de calcio y fósforo, relación de hidroxiprolina a creatinina en orina (HP/Cr) y actividad fosfatasa alcalina total (tALP) en suero. Las muestras se obtuvieron de 9 animales por grupo. : p<0,05; *: p<0,01, experimental contra control \end{minipage}
Grupo	Orina	Suero
	Calcio	Fósforo	HP/Cr	tALP (IU/l)
	(\mumol/24h/100g)	(\mumol/24h/100g)	(\mumol/mmol)
Control	23,17 \pm 1,55	132,72 \pm 6,08	13,04 \pm 2,19	114,25 \pm 14,04
DHEA (10 mg)	25,87 \pm 3,54	151,41 \pm 14,57	14,02 \pm 1,59	193,38 \pm 30,76*
EM-800 (75 \mug)	17,44 \pm 4,5	102,03 \pm 25,13	6,81 \pm 0,84**	114,11 \pm 11,26
DHEA + EM-800	3,71 \pm 0,75**	59,06 \pm 4,76**	4,06 \pm 0,28**	204,38 \pm 14,20**

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Ejemplo 2 Resumen

En la glándula mamaria, los andrógenos se forman a partir del precursor de esteroides deshidroepiandrosterona (DHEA). La evidencia clínica indica que los andrógenos tienen efectos inhibidores sobre el cáncer de mama. Los estrógenos, por otro lado, estimulan el desarrollo y crecimiento del cáncer de mama. Se estudió el efecto de DHEA en solitario o en combinación con el antiestrógeno puro recién descrito, EM-800, sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumores formados por la línea celular de cáncer de mama humano ZR-75-1 en ratones desnudos ovariec-
tomizados.

Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas diarias de 0,3 \mug de estrona (una hormona estrogénica) inmediatamente después de la ovariectomía. El EM-800 (15, 50 y 100 \mug) se administró por vía oral una vez al día. Se aplicó DHEA dos veces al día (dosis totales de 0,3, 1,0 y 3,0 mg) sobre la piel dorsal en solitario o en combinación con una dosis oral diaria de 15 \mug de EM-800. Los cambios en el tamaño de los tumores en respuesta a los tratamientos se determinaron periódicamente en relación a las medidas realizadas en el primer día. Al final de los experimentos, los tumores se diseccionaron y se pesaron.

Se observó un aumento de 9,4 veces en el tamaño del tumor en 9 meses y medio en ratones ovariectomizados que recibieron solamente estrona en comparación con ratones que no recibieron estrona. La administración de 15, 50 y 100 \mug de EM-800 en ratones oaveriectomizados suplementados con estrona condujo a las inhibiciones de un 88%, un 93% y un 94% en el tamaño del tumor respectivamente. Por otro lado, DHEA a dosis de 0,3, 1,0 y 3,0 mg inhibió el peso de tumores terminales en un 67%, un 82% y un 85% respectivamente. Se obtuvieron inhibiciones comparables en el tamaño de los tumores con una dosis oral diaria de 15 \mug de EM-800 con o sin diferentes dosis de DHEA
percutánea.

DHEA y EM-800 suprimieron de forma independiente el crecimiento de xenoinjerto de tumores ZR-75-1 en ratón estimulado por estrona en ratones desnudos. La administración de DHEA a las dosis definidas no altera el efecto inhibidor de EM-800.

Materiales y procedimientos Células ZR-75-1

Las células de cáncer de mama humano ZR-75-1 se obtuvieron a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, M D) y se cultivaron de forma rutinaria en forma de monocapas en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, 100 IU de penicilina/ml, 100 \mug de estreptomicina/ml y suero fetal bovino al 10% bajo una atmósfera humidificada de un 95% de aire/5% de CO2 a 37ºC (tal y como se describe en Poulin and Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treat. 12: 213-225, 1988). Se hicieron pases de células cada semana después de tratamiento con tripsina al 0,05%: AEDT al 0,02% (peso volumen). Los cultivos celulares usados para los experimentos descritos es este informe derivaron del pase 93 de la línea celular ZR-75-1.

Animales

Se obtuvieron ratones hembra atímicos homozigóticos Harlan Sprague-Dawley (nu/nu) (edad de 28 a 42 días) de HSD (Indianápolis, Indiana, EE.UU.). Los ratones se colocaron en jaulas de vinilo con filtros de aire en la parte superior en cubiertas de flujo de aire laminar y se mantuvieron en condiciones con limitación de patógenos. Las jaulas, lechos, y alimento se pasaron por el autoclave antes de usarse. El agua se pasó por el autoclave, se acidificó a pH 2,8 y se proporcionó a voluntad.

Inoculación celular

Los ratones se ovariectomizaron (OVX) de forma bilateral una semana antes de la inoculación de células tumorales bajo anestesia lograda por inyección intraperitoneal de 0,25 ml/animal de Avertina (alcohol amílico: 0,8 g/100 ml de NaCl al 0,9%; y tribromoetanol: 2g/100 ml de NaCl al 0,9%). Se recuperaron 1,5 x 10^{6} células ZR-15-1 en fase de crecimiento logarítmico después del tratamiento de la monocapa con tripsina al 0,05%/AEDT al 0,02% (peso/volumen), se suspendieron en 0,1 ml de medio de cultivo que contenía Matrigel al 25% y se inocularon por vía subcutánea en ambos flancos de los animales usando una aguja de calibre 20 de 2,54 cm de longitud tal y como se ha descrito previamente (Dauvois et al., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991(. Con el fin de favorecer el crecimiento de los tumores, cada animal recibió una inyección subcutánea diaria de 10 \mug de estradiol (E_{2}) en un vehículo compuesto de NaCl al 0,9%, etanol al 5% y gelatina al 1% durante 5 semanas. Después de la aparición de tumores palpables en ZR-75-1, se midió con calibres el diámetro de los tumores, y los ratones que tenían un diámetro de tumor entre 0,2 y 0,7 cm se seleccionaron para este estudio.

Tratamiento hormonal

Todos los animales, excepto aquellos en el grupo control OVX, recibieron inyecciones subcutáneas diarias de 0,5 \mug de estrona (E_{1}) en 0,2 ml de NaCl al 0,9%, etanol al 5% y gelatina al 1%. En los grupos indicados, se administró DHEA por vía percutánea dos veces al día a dosis de 0,3, 1,0 y 3,0 mg/animal aplicadas en un volumen de 0,02 ml sobre el área de piel dorsal fuera del área de crecimiento del tumor. Se disolvió DHEA en 50% de etanol y 50% de propilenglicol. EM-800, ((+)-7-pivaloiloxi-3-(4'-pivaloiloxifenil)-4-metil-2-(4''-(2'''-piperidinoetoxi)fenil)-2H-benzopirano) se sintetizó tal y como se describe al principio (Gauthier et al., J. Med. Chem. 40: 2117-2122, 1997) en la división de química médica del Laboratorio de Endocrinología Molecular del Centro de Investigación CHUL. EM-800 se disolvió en etanol al 4% (volumen/volumen), polietilenglicol 600 al 4% (volumen/volumen), gelatina al 1% (peso/volumen), NaCl al 0,9% (peso/volumen). Los animales de los grupos indicados recibieron dosis orales diarias de 15 \mug, 50 \mug y 100 \mug de EM-800 en solitario o en combinación con DHEA, mientras que los animales del grupo OVX recibieron el vehículo (0,2 ml de etanol al 4%, polietilenglicol 600 al 4%, gelatina al 1%, NaCl al 0,9%) en solitario. Los tumores se midieron una vez a la semana con calibres Vernier. Se registraron dos diámetros perpendiculares en cm (L y W) y se calculó el área del tumor (cm^{2}) usando la fórmula: L/2xW/2 x \pi (Dauvois et al., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). El área medida en el primer día de tratamiento se tomó como el 100% y los cambios en el tamaño de los tumores se expresaron como porcentaje del área del tumor inicial. En casos de tumores subcutáneos en general, no es posible determinar de forma exacta el volumen tridimensional del tumor, por lo tanto, solamente se medirán áreas de tumores. Después de 291 días (o 9 meses y medio) de tratamiento, se sacrificaron los
animales.

Las categorías de respuestas se evaluaron tal y como se describe (Dauvois et al., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299-306, 1989; Dauvois et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 891-897, 1989; Labrie et al., Breast Cancer Res. Treat. 33 : 237-244, 1995). En pocas palabras, la reversión parcial corresponde a los tumores que revirtieron en igual a o en más de un 50% de su tamaño original; respuesta estable se refiere a tumores que revirtieron en menos de un 50% del tamaño original o progresaron menos de un 50% de su tamaño original, mientras que reversión completa se refiere a aquellos tumores que fueron indetectables al final del tratamiento. Progresión se refiere a tumores que progresaron más de un 50% en comparación con su tamaño original. Al final del experimento, se mató a todos los animales por decapitación. Los tumores, úteros y vaginas se recuperaron inmediatamente, se limpiaron de tejidos conectivo y adiposo y se pesaron.

Análisis estadísticos

La significancia estadística de los efectos de los tratamientos sobre el tamaño de los tumores se determinó usando un análisis de varianza (ANOVA) evaluando los efectos debidos a DHEA, EM-800 y tiempo, y se llevaron a cabo medidas repetidas en los mismos animales al inicio y al final del tratamiento (sujetos dentro del factor de grupo). Las medidas repetidas a tiempo 0 y después de 9 meses y medio de tratamiento constituyen bloques aleatorios de animales. El tiempo se analiza de esta forma como un efecto dentro del bloque mientras que ambos tratamientos se determinan como efectos entre bloques. Todas las interacciones entre los efectos principales se incluyeron en el modelo. La significancia de los factores de tratamiento y de sus interacciones se analizó usando los sujetos dentro del grupo como el término de error. Los datos se transformaron a logaritmos. Las hipótesis que suscriben el ANOVA asumieron la normalidad de los residuales y la homogeneidad de la varianza.

Se llevaron a cabo a posteriori comparaciones por pares usando la prueba de Fisher para la diferencia significativa más baja. Se analizaron los principales efectos y la interacción de los tratamientos sobre el peso corporal y el peso de los órganos usando un ANOVA convencional de doble vía con interacciones. Los ANOVA se llevaron a cabo usando el programa SAS (SAS Institute, Cary, N C, EE.UU.). Se declaró la significancia de las diferencias usando una prueba de 2 colas con un nivel total de un 5%.

Los datos categóricos se analizaron con una prueba de Kruskall-Walls para variables de respuesta categórica ordenada (respuesta completa, respuesta parcial, respuesta estable y progresión del tumor). Después de una determinación global de los efectos de un tratamiento, se analizaron los subgrupos de los resultados presentados en la Tabla 4 ajustando el valor crítico de p para comparaciones múltiples. Los valores exactos de p se calcularon usando el programa StatXact (Cytel, Cambridge, M A, EE.UU.).

Los datos se expresan en forma de medias desviaciones estándar de la media (SEM, Standard Error of the Mean) de 12 a 15 ratones en cada grupo.

Resultados

Tal y como se ilustra en la Figura 4A, los tumores humanos ZR-75-1 aumentaron en 9,4 veces durante 291 días (9 meses y medio) en ratones desnudos ovariectomizados tratados con una dosis diaria administrada por vía subcutánea de 0,5 \mug de estrona mientras que en ratones OVX control que recibían el vehículo en solitario, el tamaño del tumor disminuyó hasta un 36,9% del valor inicial durante le transcurso del estudio.

El tratamiento con dosis crecientes de DHEA percutáneo provocó una inhibición progresiva de crecimiento de tumor ZR-75-1 estimulado por E_{1}. Se lograron inhibiciones de un 50,4%, un 76,8% y un 80,0% a los 9 meses y medio de tratamiento con las dosis diarias de DHEA por animal de 0,3 mg, 1,0 mg y 3,0 mg respectivamente (Figura 4A). De acuerdo con la disminución en la carga total de tumor, el tratamiento con DHEA condujo a una disminución acusada del peso medio de los tumores que quedaban al final del experimento. De hecho, el peso medio de los tumores disminuyó de 1,12 \pm 0,26 g en ratones desnudos ovariectomizados control suplementados con E_{1} a 0,37 \pm 0,12 g (P=0,005), 0,20 \pm 0,06 g (P=0,001) y 0,17 \pm 0,06 g (P=0,0009) en los grupos de animales que recibieron las dosis diarias de 0,3, 1,0 y 3,0 mg de DHEA respectivamente (Figura 4B).

A las dosis diarias de 15 \mug, 50 \mug y 100 \mug, el antiestrógeno EM-800 inhibió el tamaño de tumores estimulado por estrógenos en un 87,5% (P<0,0001), un 93,5% (P<0,0001) y un 94,0% (P=0,0003) respectivamente (Figura 5A) cuando se compara con el tamaño de los tumores en animales control a los 9 meses y medio.

Las reducciones en el tamaño de los tumores alcanzadas cuando las tres dosis de EM-800 no son significativamente diferentes entre ellas. Tal y como se ilustra en la Figura 4B, el peso de los tumores al final del estudio de 9 meses y medio disminuyó de 1,12 \pm 0,26 g en ratones OVX suplementados con E_{1} a 0,08 \pm 0,03 g, 0,03 \pm 0,01 g y 0,04 \pm 0,03 g en animales tratados con las dosis diarias de 15 \mug, 50 \mug y 100 \mug de EM-800 respectivamente (P<0,0001 a las dosis de EM-800 frente a OVX suplementados con E_{1}).

Tal y como se menciona anteriormente, el antiestrógeno EM-800, a la dosis diaria oral de 15 \mug, provocó una inhibición de un 87,5% crecimiento de tumores estimulado por estrona medido a los 9 meses y medio. La adición de DHEA a las tres dosis usadas no tuvo un efecto significativo sobre la inhibición ya acusada del tamaño de los tumores lograda con la dosis de 15 \mug del antiestrógeno EM-800 (Figura 5B). De esta forma, el peso medio de los tumores se redujo dramáticamente de 1,12 \pm 0,26 g en ratones control suplementados con estrona a 0,08 \pm 0,03 g (P<0,0001), 0,11 \pm 0,04 g (P=0,0002), 0,13 \pm 0,07 g (P=0,0004) y 0,08 \pm 0,05 g (P=0,0001) en los animales que recibieron la dosis diaria de 15 \mug del antiestrógeno en solitario o en combinación con las dosis de 0,3, 1,0 y 3,0 mg de DHEA respectivamente (no se recogió una diferencia significativa entre los 4 grupos) (Figura 4B).

También fue de interés examinar las categorías de respuestas logradas con los tratamientos indicados anteriormente. De esta forma, el tratamiento con las dosis crecientes de DHEA disminuido, aunque no a un nivel de significancia estadística (P=0,088), el número de tumores que progresan de un 87,5% en los animales OVX control suplementados con estrona a valores de un 50,0%, un 53,3% y un 66,7% en los animales tratados con las dosis de 0,3, 1,0 y 3,0 mg de DHEA (Tabla 4). Por otro lado, las respuestas completas aumentaron desde un 0% en los ratones suplementados con estrona a un 28,6%, un 26,7% y un 20,0% en los animales que recibieron las dosis diaria de 0,3, 1,0 y 3,0 mg de DHEA percutánea. Por otro lado, las respuestas estables se midieron a un 12,5%, un 21,4%, un 20,0% y un 13,3% en los ratones control suplementados con E_{1} y en los tres grupos de animales que recibieron las dosis indicadas anteriormente de DHEA respectivamente. En ratones control ovariectomizados, las tasas de respuestas completas, parciales y estables se midieron a un 68,8%, un 6,2% y a un 18,8% respectivamente, mientras que sólo se vio progresión en un 6,2% de los tumores (Tabla 4).

Las respuestas completas de desaparición de los tumores se lograron en un 29,4%, un 33,3%, un 26,7% y en un 35,3% de los tumores en los animales que recibieron solamente el antiestrógeno EM-800 (P=0,0006) (15 \mug) o en combinación con los 0,3 mg, 1,0 mg y 3,0 mg de DHEA respectivamente (Tabla 4). Por otro lado se vio progresión en un 35,3%, un 44,4%, un 53,3% y en un 17,6% de los tumores, en los mismos grupos de animales respectivamente. No hay una diferencia significativa entre los grupos tratados con EM-800, en solitario o en combinación con
DHEA.

No se observó un efecto significativo del tratamiento con DHEA o con EM-800 sobre el peso corporal ajustado para peso de los tumores. El tratamiento de ratones OVX con estrona aumentó el peso uterino de 28 \pm 5 mg en ratones control OVX a 132 \pm 8 mg (P<0,01) mientras que dosis crecientes de DHEA provocaron una inhibición progresiva pero relativamente pequeña del efecto estimulador de la estrona que logró un 26% (P=0,0008) a la dosis más alta usada de DHEA. Puede verse en la misma figura que el peso uterino estimulado por estrona disminuyó de 132 \pm 8 mg en ratones control suplementados con estrona a 49 \pm 3 mg, 36 \pm 2 mg y 32 \pm 1 mg (P<0,0001 todas las dosis frente al control) con las dosis orales diarias de 15 \mug, 50 \mug y 100 \mug de EM-800 (P<0,0001 global) respectivamente. Quince microgramos (15 \mug) de EM-800 en combinación con las dosis diarias de 0,3 mg, 1,0 mg y 3,0 mg de DHEA, se determinó el peso uterino en 46 \pm 3 mg, 59 \pm 5 mg y 69 \pm 3 mg respectivamente.

Por otro lado, el tratamiento con estrona aumentó el peso vaginal de 14 \pm 2 mg en animales OVX a 31 \pm 2 mg (P<0,01) mientras que la adición de DHEA no tuvo un efecto significativo. El peso vaginal se redujo entonces a 23 \pm 1 mg, 15 \pm 1 mg y 11 \pm 1 mg después del tratamiento con las dosis diarias de 15 \mug, 50 \mug y 100 \mug de EM-800 respectivamente (p global y P<0,0001 por pares a todas las dosis frente al control). En combinación con las dosis de 0,3 mg, 1,0 mg y 3,0 mg de DHEA y de EM-800, el peso vaginal se midió en 22 \pm 1mg, 25 \pm 2 mg y 23 \pm 1 mg respectivamente (N.S. para todos los grupos contra de EM-800). Debería mencionarse que a la dosis usada más elevada, recogida como 100 \mug al día, EM-800 disminuyó el peso uterino en animales OVX suplementados con estrona a un valor no diferente de aquel de los controles OVX, mientras que el peso vaginal se redujo a un valor por debajo de aquel medido en controles OVX (P<0,05). DHEA, probablemente debido a sus efectos androgénicos, contrarrestó parcialmente el efecto de EM-800 sobre los pesos uterino y vaginal.

TABLA 4

\begin{minipage}[t]{155mm} Efectos de la administración percutánea de DHEA o administración oral de EM-800 en solitario o en combinación durante 9 meses y medio sobre las respuestas (completa, parcial, estable y progresión) de xenoinjertos de tumor de mama humano ZR-75-1 en ratones desnudos.\end{minipage}
Grupo	Nº Total de animales	Categoría de respuesta
		Completa	Parcial	Estable	Progresión
		Número y (%)
OVX		16	11 (68,8)	1 (6,2)	3 (18,8)	1 (6,2)
OVX + E1 (0,5 \mug)		16	0 (0)	0 (0)	2 (12,5)	14 (87,5)
OVX + E1 (0,5 \mug)	0,3 mg	14	4 (28,6)	0 (0)	3 (21,4)	7 (50,0)
+ DHEA	1,0 mg	15	4 (26,7)	0 (0)	3 (20,0)	8 (53,3)
	3,0 mg	15	3 (21,0)	0 (0)	2 (13,3)	10 (66,7)
OVX + E1 (0,5 \mug)	15 \mug	17	5 (29,4)	1 (5,9)	5 (29,4)	6 (35,3)
+ EM-800	50 \mug	16	4 (25,0)	3 (18,8)	5 (31,2)	4 (25,0)
	100 \mug	16	8 (50,0)	0 (0)	3 (18,8)	5 (31,2)
OVX + E1 (0,5 \mug)	0,3 mg	18	6 (33,3)	0 (0)	4 (22,2)	(44,4)
+ EM-800 + DHEA	1,0 mg	15	4 (26,7)	0 (0)	3 (20,0)	8 (53,3)
	3,0 mg	17	6 (35,3)	0 (0)	8 (47,1)	3 (17,6)
E_{1} = estrona; DHEA = deshidroepiandosterona; OVX = ovariectomizado

Ejemplo 3 Efecto del compuesto de la invención preferido sobre los niveles de colesterol de ratas hembras ovariectomizadas Animales y tratamiento

Se usaron ratas hembra Sprague-Dawley de cincuenta a sesenta días de edad (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory Inc., St. Constant, Canada) que pesaban aproximadamente 190 g en el momento de la ovariectomía. Los animales se aclimataron a las condiciones ambientales (temperatura 22 \pm 3ºC; humedad: 50 \pm 20%; ciclos de 12 horas de día y 12 horas de noche; luces encendidas a las 7:15 horas) durante una semana antes de la intervención quirúrgica. Los animales se colocaron de tres en tres en jaulas y se les permitió libre acceso a agua del grifo y a alimento aglomerado certificado para roedores (Lab Diet 5002, Ralston, Purina, St-Louis, M O). El experimento se llevó a cabo en una instalación aprobada por el Consejo Canadiense sobre el Cuidado de Animales de acuerdo con la guía del CCAC Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales.

Se ovariectomizaron ciento treinta y seis ratas hembra bajo anestesia con isofluorano en el día 0 del estudio y se distribuyeron aleatoriamente en 17 grupos de animales para llevar a cabo el estudio resumido a continuación:

Grupo 1: OVX CONT

Grupo 2: OVX + EM-800 (0,01 mg/kg, po, ID)

Grupo 3: OVX + EM-800 (0,03 mg/kg, po, ID)

Grupo 4: OVX + EM-800 (0,1 mg/kg, po, ID)

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Grupo 5: OVX + EM-800 (0,3 mg/kg, po, ID)

Grupo 6: OVX + EM-800 (1 mg/kg, po, ID)

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Grupo 7: OVX + EM-01538 (0,01 mg/kg, po, ID)

Grupo 8: OVX + EM-01538 (0,03 mg/kg, po, ID)

Grupo 9: OVX + EM-01538 (0,1 mg/kg, po, ID)

Grupo 10: OVX + EM-01538 (0,3 mg/kg, po, ID)

Grupo 11: OVX + EM-01538 (1 mg/kg, po, ID)

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Grupo 12: OVX + Raloxifeno (EM-1105) (0,01 mg/kg, po, ID)

Grupo 13: OVX + Raloxifeno (EM-1105) (0,03 mg/kg, po, ID)

Grupo 14: OVX + Raloxifeno (EM-1105) (0,1 mg/kg, po, ID)

Grupo 15: OVX + Raloxifeno (EM-1105) (0,3 mg/kg, po, ID)

Grupo 16: OVX + Raloxifeno (EM-1105) (1 mg/kg, po, ID)

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Grupo 17: INT CONT

La administración de tratamientos comenzó en el día 10 del estudio y fue por gavaje oral una vez al día hasta el día 13 del estudio. Las suspensiones de dosificación se prepararon en metilcelulosa al 0,4% y la concentración se ajustó según según el peso corporal medio del grupo registrado en el día 10 del estudio con el fin de dar 0,5 ml de suspensión de dosificación por rata. Aproximadamente 24 horas después de la última dosificación, se sacrificaron los animales más rápidos durante la noche por exanguinación en la aorta abdominal bajo anestesia con isofluorano y se procesaron muestras sanguíneas para preparación de suero. Se recuperaron lo úteros, se les despojó de grasa residual y se pesaron.

Ensayos de colesterol y triglicéridos en suero

Los niveles de colesterol y triglicéridos totales en suero se determinaron usando los sistemas Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems.

Ejemplo 4

El androst-5-en-3\beta,17\beta-diol (5-diol) posee actividad estrogénica intrínseca. Además, como precursor de esteroides sexuales, puede transformarse en los andrógenos activos y/u otros estrógenos en tejidos intracrinos periféricos. Con el fin de determinar la importancia relativa de los componentes androgénicos y estrogénicos de la acción del 5-diol sobre la masa ósea, se ovariectomizaron ratas de veintiuna semanas de edad y se trataron por vía percutánea una vez al día con 2, 5 ó 12,5 mg de 5-diol por separado o en combinación con el antiandrógeno Flutamida (FLU, 10 mg, s.c., una vez al día) y/o el antiestrógeno EM-800 (100 \mug, s.c., una vez al día) durante 12 meses. Después de 11 meses de tratamiento se midió la densidad mineral ósea (DMO). La ovariectomía (OVX) condujo a una disminución de un 12,8% en la DMO femoral (p<0,01) miestras que eltratamiento con la dosis más elevada de 5-diol restauró un 34,3% de la pérdida de DMO femoral durante los 11 meses después de la OVX (p<0,01). La administración simultánea de FLU previno completamente el efecto estimulador del 5-diol sobre la DMO femoral, mientras que la adición de EM-800 dio lugar a una estimulación adicional de un 28,4% comparada con el efecto del 5-diol en solitario. La administración simultánea de 5-diol, FLU y EM-800 solamente mostró el efecto de EM-800 (27%) ya que el efecto de 5-diol quedó completamente bloqueado por FLU. Se obtuvieron resultados comparables sobre la DMO de espina lumbar aunque la DMO de espina lumbar en ratas OVX que recibieron 12,5 mg de 5-diol en solitario, 12,5 mg de 5-diol + EM-800 o 5-diol + FLU + EM-800 se restauró a valores no significativamente diferentes de aquellos de animales intactos. El análisis histomorfométrico muestra que los efectos estimuladores de 5-diol sobre el volumen del hueso, número trabecular y el efecto inhibidor sobre la separación trabecular de la espongiosa secundaria del área de metáfisis de la tibia proximal son anulados por FLU, pero aún más potenciados por EM-800. La estimulación acusada de la actividad fosfatasa alcalina en suero obtenida después del tratamiento con 5-diol se invierte en un 57% (p<0,01 frente a 12,5 mg de 5-diol en solitario) por la administración simultánea de FLU. El tratamiento con 5-diol no tuvo un efecto inhibidor estadísticamente significativo sobre la relación en orina de calcio a creatinina. La dosis más alta de 5-diol provocó una reducción significativa de un 23% (p<0,01) de colesterol en suero mientras que la adición de EM-800 disminuyó el colesterol en suero en un 62% (p<0,01).

Los presentes datos muestran claramente el efecto estimulador de 5-diol sobre la formación ósea y sugiere que aunque el 5-diol es un estrógeno débil, su efecto estimulador sobre la formación ósea está mediado predominantemente por un efecto androgénico. Además, los efectos estimuladores aditivos de EM-800 y 5-diol sobre la masa ósea demuestran el efecto de acumulación de hueso del antiestrógeno EM-800 en la rata. La actividad disminuidora de colesterol de 5-diol y EM-800 podría tener una utilidad interesante para la prevención de enfermedades cardiovasculares.

5

Ejemplo 6 Ejemplo de síntesis del compuesto preferido de la invención Síntesis de clorhidrato de (S)-(+)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4''-(2'''-piperidinoetoxi)fenil)-2H-1- benzopirano, EM-01538 (clorhidrato de EM-652)

Esquema 1

6

Etapa A: BF_{3}.Et_{2}O, tolueno; 100ºC; 1 hora.

Etapa C: 3,4-dihidropirano, monohidrato de ácido p-toluensulfónico, acetato de etilo; 25ºC en atmósfera de nitrógeno, 16 horas, y después cristalización en isopropanol.

Etapas D, E y F:

(1) piperidina, tolueno, aparato Dean & Stark, reflujo en atmósfera de nitrógeno; (2) 1,8-diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno, DMF, 3 horas de reflujo; (3) CH_{3}MgCl, THF, -20 a 0ºC y después temperatura ambiente durante 24 horas.

Etapas G, H: ácido (1S)-(+)-10-canforsulfónico, acetona, agua, tolueno, temperatura ambiente, 48 horas.

Etapa HH: etanol al 95%, 70ºC, después temperatura ambiente durante 3 días.

Etapa HHR: recirculación de las aguas madres y lavado del ácido (S)-10-canforsulfónico de la etapa HH, reflujo; 36 horas, después temperatura ambiente durante 16 horas.

Etapa I:

(1) DMF acuoso, Na_{2}CO_{3}, acetato de etilo;

(2) etanol, ácido clorhídrico diluido;

(3) agua

Síntesis de 2-tetrahidropiraniloxi-4-hidroxi-2'-(4''-tetrahidropiraniloxifenil) acetofenona (4)

Una suspensión de 2,4-dihidroxi-2'-(4''-hidroxifenil)acetofenona 3 (97,6 g, 0,4 mol) (disponible en Chemsyn Science Laboratorios, Lanexa, Kansas) en 3,4-dihidropirano (218 ml, 3,39 mol) y acetato de etilo (520 ml) se trató con monohidrato de ácido p-toluensulfónico (0,03 g, 0,158 mmol) a aproximadamente 25ºC. La mezcla de reacción se agitó en atmósfera de nitrógeno sin calentamiento externo durante aproximadamente 16 horas. La mezcla se lavó entonces con una solución de bicarbonato sódico (1 g) y cloruro sódico (5 g) en agua (100 ml). Se separaron las fases y la fase orgánica se lavó con salmuera (20 ml). Cada lavado se recuperó con 50 ml de acetato de etilo. Se juntaron todas las fases orgánicas y se filtraron a través de sulfato sódico.

El disolvente (aproximadamente 600 ml) se eliminó por destilación a presión atmosférica y se añadió isopropanol (250 ml). Se destiló disolvente adicional (aproximadamente 300 ml) a presión atmosférica y se añadió isopropanol (250 ml). Se destiló disolvente adicional (aproximadamente 275 ml) a presión atmosférica y se añadió isopropanol (250 ml). La solución se enfrió a aproximadamente 25ºC con agitación y después de aproximadamente 12 horas, se filtró el sólido cristalino, se lavó con isopropanol y se secó (116,5 g, 70%).

Síntesis de 4-hidroxi-4-metil-2-(4'-[2''-piperidino]-etoxi)fenil-3-(4'''-tetrahidropiraniloxi)fenil-7-tetrahidropiraniloxi-cromano (10)

Una solución de 2-tetrahidropiraniloxi-4-hidroxi-2'-(4''-tetrahidropiraniloxifenil) acetofenona 4 (1 kg, 2,42 mol), 4-[2-(1-piperidino)etoxi]benzaldehído 5 (594 g, 2,55 mol) (disponible en Chemsyn Science Laboratorios, Lanexa, Kansas) y piperidina (82,4 g, 0,97 mol) (disponible en Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisconsin) en tolueno (8 l) se puso a reflujo en atmósfera de nitrógeno con un aparato Dean & Stark hasta que se recuperó un equivalente de agua (44 ml).

Se eliminó el tolueno (6,5 l) de la solución por destilación a presión atmosférica. Se añadieron dimetilformamida (6,5 l) y 1,8-diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno (110,5 g, 0,726 mol). La solución se agitó durante aproximadamente 8 horas a temperatura ambiente para isomerizar la calcona 8 a cromanona 9 y después se añadió a una mezcla de agua y hielo (8 l) y tolueno (4 l). Se separaron las fases y la capa de tolueno se lavó con agua (5 l). Los lavados acuosos combinados se extrajeron se extrajeron con tolueno (3 x 4 l). Los extractos combinados de tolueno se lavaron finalmente con salmuera (3 x 4 l), se concentraron a presión atmosférica hasta 5,5 l y después se enfriaron a -10ºC.

Con enfriamiento continuado externo y agitación en atmósfera de nitrógeno, se añadió una solución 3 M de cloruro de metilmegnesio en THF (2,5 l, 7,5 mol) (disponible en Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisconsin) manteniendo la temperatura por debajo de 0ºC. Después de que se añadiera todo el reactivo de Grignard, se retiró el enfriamiento externo y se dejó calentar la muestra hasta temperatura ambiente. La mezcla se agitó a esta temperatura durante aproximadamente 24 horas.

La mezcla se enfrió de nuevo a aproximadamente -20ºC y con enfriamiento continuado externo y agitación, se añadió lentamente una solución saturada de cloruro amónico (200 ml), manteniendo la temperatura por debajo de 0ºC. La mezcla se agitó durante 2 horas y después se añadió la solución saturada de cloruro amónico (2 l) y tolueno (4 l) y se agitó durante 5 minutos. Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con tolueno (2 x 4 l). Los extractos combinados de tolueno se lavaron con ácido clorhídrico diluido hasta que la solución comenzó a ser homogénea y después con salmuera (3 x 4 l). La solución de tolueno se concentró finalmente a presión atmosférica hasta 2 l. Esta solución se usó directamente en la siguiente etapa.

Síntesis de la sal del ácido (2R,S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4''-[2'''-piperidino]etoxi)fenil)-2H-1-benzopiran (1S)-10-canforsulfónico (\pm12)

A la solución de 4-hidroxi-4-metil-2-(4'-[2''-piperidino]-etoxi)fenil-3-(4'''-tetrahidropiraniloxi)fenil-7-tetrahidropiraniloxi-cromano (10) se añadió acetona (6 l), agua (0,3 l) y ácido (S)-10-canforsulfónico (561 g, 2,42 mol) (disponible en Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisconsin).La mezcla se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 48 horas, tiempo después del cual se filtró el sólido sal del ácido (2R,S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4''-[2'''-piperidino]etoxi)fenil)-2H-1-benzopiran (1S)-10-canforsulfónico (12), se lavó con acetona y se secó (883 g). Este material se usó en la siguiente etapa (HH) sin purificación adicional.

Síntesis de la sal del ácido (2S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4''-[2'''-piperidino]etoxi)fenil)-2H-1-benzopiran (1S)-10-canforsulfónico (13, sal de (+)-EM-652(1S)-CSA)

Se calentó una suspensión de la sal del ácido (2R,S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4''-[2'''-piperidino]etoxi)fenil)-2H-1-benzopiran (1S)-10-canforsulfónico (12) (759 g) en etanol al 95% con agitación a aproximadamente 70ºC hasta que el sólido se hubo disuelto. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente con agitación, sembrando después con unos pocos cristales de la sal del ácido (2S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4''-[2'''-piperidino]etoxi)fenil)-2H-1-benzopiran (1S)-10-canforsulfónico (13). La solución se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente tres días en total. Los cristales se filtraron, se lavaron con etanol al 95% y se secaron (291 g, 76%). El rendimiento del producto fue de un 94,2% y la pureza de un 98,8%.

Síntesis de clorhidrato de (S)-(+)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4''-(2'''-piperidinoetoxi)fenil)-2H-1-benzopirano, EM-01538 (clorhidrato de EM-652)

Una suspensión del compuesto13 (sal de (+)-EM-652(1S)-CSA, 500 mg, 0,726 mmol) en dimetilformamida (11 \mul, 0,15 mmol) se trató con una solución acuosa de carbonato sódico 0,5 M (7,0 ml, 3,6 mmol), y se agitó durante 15 minutos. La suspensión se trató con acetato de etilo (7,0 ml) y se agitó durante 4 horas. La fase orgánica se lavó entonces con una solución acuosa saturada de carbonato sódico (2 x 5 ml) y salmuera (1 x 5 ml), se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró. Una solución de la espuma rosa resultante (EM-652) en etanol (2 ml) se trató con ácido clorhídrico 2 N (400 \mul, 0,80 mmol), se agitó durante 1 hora, se trató con agua destilada (5 ml) y se agitó durante 30 minutos. La suspensión resultante se filtró, se lavó con agua destilada (5 ml), se secó al aire y a alto vacío (65ºC) para dar un polvo cremoso (276 mg, 77%): polvo fino de color blanquecino; Calorimetría de barrido: pico crítico de fusión a 219ºC, \DeltaH = 83 j/g; [\alpha]^{24}D = 154º en 10 mg/ml de etanol; RMN de ^{1}H (300 MHz, CD_{3}OD) \delta(ppm) 1,6 (ancho, 2H, H-4'''), 1,85 (ancho, 4H, H-3'''' y 5''''), 2,03 (s, 3H, CH_{3}), 3,0 y 3,45 (ancho, 4H, H-2'''' y 6''''), 3,47 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-3'''), 4,26 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-2'''), 5,82 (s, 1H, H-2), 6,10 (t, J = 2,3 Hz, 1H, H-8), 6,35 (dd, J = 8,4, 2,43 Hz, 1H, H-6), 6,70 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-3' y H-5'), 6,83 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-3'' y H-5''), 7,01 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2' y H-6'), 7,12 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5), 7,24 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-2'' y H-6''). RMN de ^{13}C (CD_{3}OD, 73 MHz) \deltappm 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 138,96, 159,33. Composición elemental: C, H, N, Cl; teoría: 70,51, 6,53, 2,84, 7,18%; encontrado: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89%.

Ejemplo 7 Ensayos in vivo de biodisponibilidad de los profármacos de androst-5-en-3\beta,17\beta-diol 1) Principio

Los ensayos de la biodisponibilidad de profármacos de precursores de esteroides sexuales se llevaron a cabo en ratas midiendo las concentraciones en plasma de los compuestos después de una única administración oral de los compuestos.

a) Animales y tratamiento

Se obtuvieron ratas hembra Sprague-Dawley [Crl:CD(SD)Br] que pesaban 275-350 g en Charles-River Canada Inc., y se colocaron 2 por jaula durante el período de aclimatación, e individualmente durante el período de estudio. Los animales se mantuvieron en un régimen de 12 horas de luz: 12 horas de oscuridad (luces encendidas a las 8:00 horas). Los animales recibieron alimento certificado para roedores (Lab Diet 5002, aglomerados) y agua del grifo a voluntad. Se hizo ayunar a las ratas (solamente acceso a agua) al comienzo de la tarde-noche antes de la administración de la dosis.

Cada compuesto que se iba a someter a ensayo se administró a tres animales en forma de suspensión en metilcelulosa al 0,4% por gavaje oral a una dosis de 150 \mug/rata. Se recogió una muestra sanguínea de aproximadamente 0,7 ml de la vena yugular de las ratas bajo anestesia inducida por isofluorano 1, 2, 3, 4 y 7 horas después del gavaje. Las muestras sanguíneas se transfirieron inmediatamente en un Microtainer refrigerado de 0,75 ml que contenía AEDT y se conservaron en un baño de hielo y agua hasta centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos. La separación del plasma se llevó a cabo rápidamente (en menos de 50 minutos) después de la recuperación de la sangre. Se transfirió entonces una alícuota de 0,25 ml de plasma a un tubo de borosilicato (13 x 100) y se congeló rápidamente en hielo seco. Las muestras de plasma se conservaron a -80ºC hasta la medida de la concentración en plasma de los esteroides sexuales o de los precursores de los esteroides sexuales por GC-MS.

Resultados

En las Figuras 12 y 13 se muestran la absorción oral y AUC.

Ejemplos de composición farmacéutica

Se establecen posteriormente, por medio de ejemplo y no de limitación, varias composiciones farmacéuticas que utilizan como SERM activo preferido EM-800 o EM-1538 y como precursor de esteroides sexuales activo preferido DHEA, EM-1304 o EM-01474-D. Otros compuestos de la invención o combinación de los mismos, pueden usarse en lugar de (o en adición a) EM-800 o EM-1538, DHEA, EM-1304 o EM-01474-D. La concentración del ingrediente activo puede variar a lo largo de un amplio intervalo tal y como se discute en la presente memoria descriptiva. Las cantidades y tipos de otros ingredientes que pueden incluirse se conocen bien en la técnica.

Ejemplo A

Comprimido
Ingrediente	% en peso (por peso de composición total)
EM-800	5,0
DHEA	15,0
Gelatina	5,0
Lactosa	58,5
Almidón	16,5

Ejemplo B

Cápsula de gelatina
Ingrediente	% en peso (por peso de composición total)
EM-800	5,0
DHEA	15,0
Lactosa hidratada	65,0
Almidón	4,8
Celulosa microcristalina	9,8
Estearato de magnesio	0,4

Ejemplos de equipos

Se establecen posteriormente, por medio de ejemplo y no de limitación, varios equipos que utilizan como SERM activo preferido EM-800 o EM-1538 y como precursor de esteroides sexuales activo preferido DHEA, EM-1304 o EM-01474-D. Otros compuestos de la invención o combinación de los mismos, pueden usarse en lugar de (o en adición a) EM-800 o EM-1538, DHEA, EM-1304 o EM-01474-D. La concentración del ingrediente activo puede variar a lo largo de un amplio intervalo tal y como se discute en la presente memoria descriptiva. Las cantidades y tipos de otros ingredientes que pueden incluirse se conocen bien en la técnica.

Ejemplo A

El SERM se administra por vía oral mientras que el precursor de esteroides sexuales se administra por vía percutánea.

Composición de SERM para administración oral (cápsulas)
Ingrediente	% en peso (por peso de composición total)
EM-800	5,0
Lactosa hidratada	80,0
Almidón	4,8
Celulosa microcristalina	9,8
Estearato de magnesio	0,4

Composición del precursor de esteroides sexuales para administración tópica (gel).

Ingrediente	% en peso (por peso de composición total)
DHEA	10,0
Triglicérido caprílico capricho (neobee M-5)	5,0
Hexilenglicol	15,0
Transcutol (monoetiléter de dietilenglicol)	5,0
Alcohol bencílico	2,0
Ciclometicona (Dow Corning 345)	5,0
Etanol (absoluto)	56,0
Hidroxipropilcelulosa (1500 cps) (KLUCEL)	2,0

Ejemplo B

El SERM y el precursor de esteroides sexuales se administran oralmente.

Composición de antiestrógeno no esteroideo para administración oral (cápsulas).

Ingrediente	% en peso (por peso de composición total)
EM-800	5,0
Lactosa hidratada	80,0
Almidón	4,8
Celulosa microcristalina	9,8
Estearato de magnesio	0,4

Composición del precursor de esteroides sexuales para administración oral (cápsula de gelatina).

Ingrediente	% en peso (por peso de composición total)
DHEA	15,0
Lactosa hidratada	70,0
Almidón	4,8
Celulosa microcristalina	9,8
Estearato de magnesio	0,4

Otros SERM pueden sustituir a EM-800 o EM-01538 en las formulaciones anteriores, así como otros precursores de esteroides sexuales pueden sustituir a DHEA, EM-1304 o EM-01474-D. Puede incluirse más de un SERM o más de un precursor, en cuyo caso el porcentaje combinado en peso es preferiblemente aquel del porcentaje en peso para el precursor por separado o SERM por separado dado en los ejemplos anteriores.

La invención se ha descrito en términos de realizaciones y ejemplos preferidos, pero no queda limitada de ese modo. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la aplicabilidad y alcance más amplios de la invención que sólo está limitada por las reivindicaciones de la atente en la presente memoria descriptiva.

Claims

1. Uso de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, 4-androsten-3,17-diona, un profármaco de androst-5-en-3\beta,17\beta-diol y un profármaco de 4-androsten-3,17-diona, profármaco el cual se convierte in vivo en dicho precursor, y de una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo del receptor de estrógeno en la fabricación de medicamentos para una terapia de combinación para tratar o reducir el riesgo de adquirir osteoporosis,

en el que dicho modulador selectivo del receptor de estrógeno tiene la siguiente fórmula:

7

en el que R_{1} y R_{2} son independientemente hidrógeno, hidroxilo o un resto que se convierte in vivo en hidroxilo;

en el que Z es un resto bivalente que cierra el anillo;

en el que R_{100} es un resto bivalente que separa L del anillo B en 4-10 átomos intermedios;

en el que L es un resto polar bivalente o trivalente seleccionado del grupo de -SO-, -CON-, -N< y -SON<;

en la que G_{1} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, un hidrocarburo con C_{1} a C_{5} o un resto bivalente que se une a G_{2} y a L para formar un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros, y halo o derivados insaturados de los anteriores;

en el que G_{2} está ausente o se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, un hidrocarburo con C_{1} a C_{5} o un resto bivalente que se une a G_{1} y a L para formar un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros, y halo o derivados insaturados de los anteriores;

en el que G_{3} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, metilo y etilo; y en el que dicho profármaco convertido in vivo en dicho precursor de esteroides sexuales tiene la fórmula general:

8

en el que X se selecciona del grupo constituido por H-, ROC-, RCO_{2}CHRa- y RbSO_{2}- (seleccionándose R del grupo constituido por hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{18}) lineal o ramificado, alquenilo (C_{2}-C_{18}) lineal o ramificado o alquinilo (C_{2}-C_{18}) lineal o ramificado, arilo, furilo, alcoxi (C_{1}-C_{18}) lineal o ramificado, alqueniloxi (C_{2}-C_{18}) lineal o ramificado o alquiniloxi (C_{2}-C_{18}) lineal o ramificado, ariloxi, furiloxi, y análogos de halógeno o carboxilo de los anteriores; siendo Ra hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{6}); y seleccionándose Rb del grupo constituido por hidroxilo (o sales del mismo), metilo, fenilo y p-toluilo);

en el que Y es oxígeno carbonílico o Y representa un \beta-OX (teniendo X el mismo significado que anteriormente) y \alpha-H y en el que Y no es oxígeno carbonílico cuando X es H-.

2. El uso según la reivindicación 1 comprendiendo además el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un bisfosfonato para la fabricación de medicamentos para dicha terapia de combinación.

3. El uso según la reivindicación 1 comprendiendo además el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una progestina para la fabricación de medicamentos para dicha terapia de combinación.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, en el que el precursor no es 4-androsten-3,17-diona.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, en el que Z en el modulador selectivo del receptor de estrógeno se selecciona del grupo constituido por -O-, -NH-, -S- y -CH_{2}-.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que el modulador selectivo del receptor de estrógeno es un derivado de benzopirano de la siguiente estructura general:

9

en el que D es -OCH_{2}CH_{2}N(R_{3})R_{4} (seleccionándose independientemente R_{3} y R_{4} del grupo constituido por alquilo C_{1}-C_{4}, o siendo R_{3}, R_{4} y el átomo de nitrógeno al cual se unen todos juntos siendo una estructura en anillo seleccionada del grupo constituido por pirrolidino, dimetil-1-pirrolidino, metil-1-pirrolidinilo, piperidino, hexametilenimino y morfolino),

en el que R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente del grupo constituido por: hidrógeno, hidroxilo y un resto convertido in vivo en hidroxilo.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que el derivado de benzopirano es un compuesto óptimamente activo que tiene una configuración absoluta S sobre el carbono 2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, teniendo dicho compuesto la estructura molecular:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

en la que R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidroxilo y un resto convertible in vivo en hidroxilo.

en el que R_{3} es una especie seleccionada del grupo constituido por pirrolidinilo saturado, insaturado o sustituido, piperidino saturado, insaturado o sustituido, piperidinilo saturado, insaturado o sustituido, morfolino saturado, insaturado o sustituido, resto cíclico que contiene nitrógeno, resto policíclico que contiene nitrógeno y NRaRb (siendo Ra y Rb independientemente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6} lineal o ramificado, alquenilo C_{2}-C_{6} lineal o ramificado y alquinilo C_{2}-C_{6} lineal o ramificado).

8. El uso según la reivindicación 7, en el que dicho compuesto o sal carece sustancialmente de enantiómero (2R).

\newpage

9. El uso según la reivindicación 6, en el que dicho modulador selectivo del receptor de estrógeno se selecciona del grupo constituido por:

11

12

13

14

10. El uso según la reivindicación 6, en el que el derivado de benzopirano es una sal de un ácido seleccionado del grupo constituido por ácido acético, ácido adípico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido canforsulfónico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido yodhídrico, ácido bromhídrico, ácido clorhídrico, ácido de hidroclorotiazida, ácido hidroxinaftoico, ácido láctico, ácido maleico, ácido metanosulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido 1,5 naftalendisulfónico, ácido nítrico, ácido palmítico, ácido piválico, ácido fosfórico, ácido propiónico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácidotereftálico, ácido p-toluensulfónico y ácido valérico.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que el ácido es ácido clorhídrico.

12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 3 a 6, en el que dicho modulador selectivo del receptor de estrógeno es:

15

13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el profármaco convertido in vivo en dicho precursor de esteroides sexuales se selecciona del grupo constituido por:

16

17

14. Uso de un precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, 4-androsten-3,17-diona, un profármaco de androst-5-en-3\beta,17\beta-diol y un profármaco de 4-androsten-3,17-diona, profármaco el cual se convierte in vivo en dicho precursor, en la fabricación de medicamentos para una terapia de combinación para tratar o reducir el riesgo de adquirir osteoporosis, terapia de combinación la cual incluye adicionalmente el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo del receptor de estrógeno, en el que dicho modulador selectivo del receptor de estrógeno tiene la siguiente fórmula:

18

en el que Z es un resto bivalente que cierra el anillo;

19

15. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador selectivo del receptor de estrógeno para la fabricación de medicamentos para una terapia de combinación para tratar o reducir el riesgo de adquirir osteoporosis, terapia de combinación la cual incluye adicionalmente el uso de precursor de esteroides sexuales seleccionado del grupo constituido por androst-5-en-3\beta,17\beta-diol, 4-androsten-3,17-diona, un profármaco de androst-5-en-3\beta,17\beta-diol y un profármaco de 4-androsten-3,17-diona, profármaco el cual se convierte in vivo en dicho precursor, en el que dicho modulador selectivo del receptor de estrógeno tiene la siguiente fórmula:

20

en el que Z es un resto bivalente que cierra el anillo;

21