NO332187B1

NO332187B1 - Ostrogenreseptormodulator EM-1538 og farmasoytisk preparat inneholdende denne

Info

Publication number: NO332187B1
Application number: NO20092730A
Authority: NO
Inventors: Fernand Labrie
Original assignee: Endorech Inc
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 2009-07-20
Publication date: 2012-07-23
Also published as: NO20006254D0; HK1040367A1; HUP0103345A3; EP1623712A2; CY1115317T1; KR20010052763A; CY1115069T1; ES2253922T3; TWI258369B; CA2768682C; EP2386304B9; JP2007191484A; US20070027124A1; US7884092B2; BR9911116A; US20070027122A1; MXPA00012306A; PL195772B1; TR200103456T2; PL203704B1

Abstract

Nye fremgangsmåter for medisinsk behandling og/eller inhibering av utvikling av osteoporose, brystcancer, hyperkolesterolemi, hyperlipidemi eller aterosklerose hos utsatte, varmblodige dyr, innbefattet mennesker, som omfatter tilførsel av selektiv østrogenreseptonnodulator, nærrnere bestemt forbindelser med den generelle struktur (I) og en mengde av en kjønnssteroidforløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfat, androst-5-en-3ß,17ß-diol og forbindelser som konverteres in vivo til en av de foregående forløpere. Videre beskrives tilførsel av bisfosfonater i kombinasjon med selektive østrogenreseptormodulatorer og/eller kjønnssteroidforløper for medisinsk behandling og/eller inhibering av utvikling av osteoporose. Farmasøytiske preparater for tilførsel av den eller de aktive bestanddeler og sett som er anvendbare ved utførelse av oppfinnelsen beskrives også.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en alternativ østrogenreseptormodulator kalt EM-1538, samt en farmasøytisk sammensetning inneholdende denne.

Foreliggende oppfinnelse angår en alternativ østrogenmodulator EM -1538

til bruk i behandling av eller for reduksjon av sannsynligheten for å få osteoporose, hyperkolesterolemi, hyperlipidemi eller aterosklerose. EM-1538 kan anvendes alene eller i en ny kombinasjonsbehandling på utsatte varmblodige dyr, innbefattet mennesker. Nærmere bestemt omfatter kombinasjonen tilførsel av en selektiv østrogenreseptormodulator (SERM) og forhøyelse av pasientens nivå av forløper til kjønnssteroider, hvor forløperen kan velges fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron (DHEA), dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) og androst-5-ene-313,17fi-diol (5-diol). Oppfinnelsen gjelder også farmasøytiske preparat inneholdende EM-1538 for anvendelse av den ovenfor nevnte kombinasjon.

Oppfinnelsens bakgrunn

Mennesket, sammen med noen andre primater, skiller seg ut ved at de har binyrer som utskiller store mengder av forløpersteroidene dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) og dehydroepiandrosteron (DHEA) som omdannes til androstenedion (4-dion) og deretter til aktive androgener og/eller østrogener i perifere vev (Labrie et al., i: Important Advances in Oncology. Redigert av V.T. de Vita, S. Hellman, S.A. Rosenberg, J.B. Lippincott, Philadelphia, 193-217, 1985; Labrie, Mol. Cell. Endocrinol., 78: C113-C118,1991; Labrie, et al., i Signal Transduction in Testicular Cells. Ernst Schering Research Foundation Workshop. Redigert av V. Hansson, F.O. Levy, K. Tasken. Springer-Verlag, Berlin-New York (Suppl. 2) s. 185-218,1996; Labrie et al., Steroids, 62: 148-158, 1997). I en nylig undersøkelse (Labrie et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 2403-2409, 1997) har vi beskrevet en dramatisk reduksjon av nivået i sirkulasjonen av dehydroepiandrosteron (DHEA), DHEA-sulfat (DHEA-S), androst-5-en-3fi,17B-diol (5-diol), 5-diol-S, 5-diol-fettsyre estere og androstenedion hos både menn og kvinner med alder mellom 20 og 80 år.

Trass i det markante fall med alder av endogene androgener hos kvinner er anvendelse av androgener hos post-menopausale kvinner begrenset, hovedsakelig grunnet frykten for forhøyet risiko for hjerte-karsykdommer, basert på eldre undersøkelser som viste en ufordelaktig lipidprofil med androgener. Nyere undersøkelser har imidlertid ikke vist signifikant virkning av kombinert østrogen- og androgen behandling på serumnivået av kolesterol, triglyserider, HDL, LDL og HDL/LDL-forholdet, sammenlignet med østrogen alene (Sherwin et al., Am. J. Obstet. GynecoL, 156:414-419,1987). I samsvar med disse observasjoner har vi vist at DHEA, en forbindelse med hovedsakelig androgen innvirkning, tilsynelatende ikke har uheldig virkning på serumlipidprofilen (Diamond et al., J. Endocrinol. 150: S43-S50, 1996). På tilsvarende måte har ingen endring av konsentrasjonen av kolesterol, subfraksjoner av kolesterol eller triglyserider blitt observert etter 6 måneders behandling med estradiol- + testosteron-implantater, sammenlignet med behandling med østradiol alene (Burger et al., Br Med J. Clin. Res Ed., 294: 936-937,1987). Det bør nevnes at en undersøkelse i mennesket har vist et invers forhold mellom serum-DHEA-S og lavtetthets-lipoproteiner (Parker et al., Science, 208:512-514,1980). Senere har det blitt funnet en korrelasjon mellom lav konsentrasjon av testosteron og DHEA i serum og forhøyet mengde viseralt fett, en parameter for forhøyet hjerte-karsykdomsrisiko (Tchernof et al., Metabolism, 44:513-519,1995).

Fem-diol er en forbindelse som biosyntetiseres fra DHEA via vhkningen av reduktiv 17 fi-hydroksysteroid dehydrogenase (17J3-HSD) og forbindelsen er et svakt østrogen.

Forbindelsen har 85 ganger lavere affinitet til østrogenreseptoren enn 17JJ-estradiol (E2) i sytosol fra fremre hypofysekjertel hos rotte (Simard og Labrie, J. Steroid Biochem, 26: 539-546,1987), noe som ytterligere bekrefter resultatene erholdt på samme parameter i humant myometriumvev og brystcancervev (Kreitmann og Bayard, J. Steroid Biochem., 11:1589-1595,1979; Adams et al., Cancer Res. 41:4720-4926,1981; Poulin og Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937, 1986). Imidlertid fremmer 5-estradiol i konsentrasjoner som ligger godt innenfor plasmanivåområdet som finnes hos voksne kvinner celle-proliferasjon og progesteronreseptornivået i de humane brysttumorceller ZR-75-1 (Poulin og Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937,1986) og forhøyer østrogen-avhengig syntese av 52 kDa-glykoprotein i MCF-7-celler (Adams et al., Cancer Res., 41: 4720-4926,1981).

Som nevnt ovenfor er det kjent at senimnivået av DHEA, DHEA-S og 5-diol avtar med alderen og at det følgelig er en dramatisk aldersavhengig reduksjon av dannelsen av androgener og østrogener i perifere målvev. Slike endringer i utskillelsen av DHEA-S og DHEA fører til en markant reduksjon av de biokjemiske og cellulære funksjoner som stimuleres av kjønnssteroider. Som en følge av dette har DHEA-S og DHEA nylig blitt anvendt ved behandling av en rekke tilstander som er forbundet med reduksjon og/eller ubalanse i nivået av kjønnssteroider.

Osteoporose, en tilstand som rammer både menn og kvinner, er forbundet med en reduksjon av androgener og østrogener. Østrogener har blitt vist å redusere hastigheten av bendegraderingen, mens androgener har blitt vist å oppbygge benmassen. Imidlertid krever østrogenerstatningsbehandlingen som hyppig anvendes mot osteoporose tilsetning av progestiner for å motvirke endometriumproliferasjonen og faren for endometriumcancer som induseres av østrogener. Siden både østrogener og progestiner antas å forhøye risikoen for brystcancer (Bardon et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 60: 692-697,1985; Colditz et al., N. Engl. J. Med., 332:1589-1593,1995), er videre anvendelse av østrogen-progestmerstatningsbehandling akseptert av et begrenset antall kvinner og, vanligvis, i for korte tidsrom.

Flere undersøkelser tyder på at osteoporose er en klinisk manifestasjon av androgen-mangel hos menn (Baran et al., Calcif. Tissue Res. 26:103-106, 1978; Odell og Swerdloff, West J. Med. 124:446-475,1976; Smith og Walker, Calif. Tissue Res. 22 (Suppl.): 225-228,1976). Androgenbehandling, som observert med nandrolon-dekanoat, har blitt vist å forhøye den vertebrale benmineraltetthet hos postmenopausale kvinner (Need et al., Arch. Intern. Med., 149:57-60,1989). Behandling av postmenopausale kvinner med nandrolon ga forhøyet kortikalt beinmineralinnhold (Need et al., Clin. Orthop. 225:273-278,1987). Bivhkninger av androgener ble imidlertid observert hos 50% av pasientene. Slike resultater er av interesse, på grunn av at mens nesten alle foreliggende behandlingsformer er begrenset til en reduksjon av beintapet ble en økning av beinmassen observert ved anvendelse av det anabole steroid nandrolon. En tilsvarende stimulering av beindannelsen ved androgener har blitt foreslått i en hypogonadal mann (Baran et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103,1978). En stimulering av beindannelsen hos postmenopausale kvinner behandlet med DHEA i 12 måneder er rapportert i Labrie et al. (J. Clin. Endocrinol. 82:3498-3505, 1997).

DHEA (450 mg/kg, kroppsvekt 3 ganger pr. uke) ga en markant forsinkelse av forekomsten av brysttumorer hos C3H-mus som var genetisk avlet for utvikling av brystcancer (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979). Videre ble risikoen for å utvikle blærecancer funnet å være forhøyet hos menn med lavt serum-DHEA-nivå

(Gordon et al., Cancer Res., 51:1366-1369,1991).

U.S. patentsøknad nr. 5,550,107 gjelder en fremgangsmåte for behandling av brystcancer og endometriumcancer hos utsatte varmblodige dyr som kan omfatte inhibering av hormonsekresjon fra ovariene ved kirurgiske midler (ovariektomi) eller kjemiske midler (anvendelse av en LHRH-agonist, for eksempel [D-Trp<6>, des-Gly- NH2<I0>]LHRH etylamid eller en antagonist) som del av en kombinasjonsbehandling. Antiøstrogener, androgener, progestiner, inhibitorer av kjønnssteroiddannelse (særlig av 17B-hydrosteroid dehydrogenase- eller aromatase-katalysert dannelse av kjønns-steroider), inhibitorer av prolaktinsekresjonen, veksthormonsekresjonen og ACTH-sekresjonen diskuteres. Et motstykke til denne søknad er publisert under internasjonalt publikasjonsnummer WO 90/10462.

I tillegg har hjerte-karsykdommer blitt forbundet med redusert serumnivå av DHEA og DHEA-S og både DHEA og DHEA-S har blitt foreslått å forhindre eller behandle disse tilstander (Barrett-Connor et al.,N. Engl. J. Med. 315:1519-1524, 1986).

Hos aldrende Sprague-Dawley-rotter, har Schwartz (i Kent, Geratrics 37:157-160, 1982) observert at kroppsvekten ble redusert fra 600 til 550 g med DHEA uten at forinntaket ble påvirket. Schwartz (Cancer 39:1129-1132,1979) observerte at C3H-mus gitt DHEA (450 mg/kg, 3 ganger pr. uke) hadde signifikant lavere vektøkning og ble eldre enn kontrolldyrene, samt at de hadde mindre kroppsvekt og var mer aktive. Reduksjonen i kroppsvekt ble oppnådd uten tap av appetitt eller forbegrensning. Videre kunne DHEA forhindre vektøkning hos dyr avlet til å bli fete i voksen alder (i Kent, Geriatrics, 37:157-160, 1982).

DHEA-tilførsel til magre Zucher-rotter reduserte kroppsvektøkningen trass forhøyet forinntak. Behandlede dyr hadde mindre fettputer, noe som sett under ett tyder på at DHEA forhøyer formetabolismen, noe som fører til lavere vektøkning og aklaimulering av fett (Svec et al., Proe. 2<nd>Int. Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, USA, s. 56 i sammendragssamlingen, 1997).

Fedme ble funnet å forbedres hos den mutante A^-mus (Yen et al, Lipids 12: 409-413, 1977) og i Zucker-rotten (Cleary og Zisk, Fed. Proe. 42: 536,1983). DHEA-behandlede C3H-mus så yngre ut enn kontrolldyrene (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132,1979).

DHEA reduserte forekomsten av atereosklerose hos kolesterolforede kaniner (Gordon et al., J. Clin. Invest. 82: 712-720, 1988, Arad et al, Arteriosclerosis 9: 159-166, 1989). Videre har høye serumkonsentrasjoner av DHEA-S blitt rapportert å beskytte mot død grunnet hjerte-karsykdommer hos menn (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524,1986). Nivået i sirkulasjonen av DHEA og DHEA-S har således blitt funnet å korrelere invert med dødelighet grunnet hjerte-karsykdommer (Barrett-Connor et al., N. Engi. J. Med. 315: 1519-1524, 1986) og å avta i parallell med den reduserte immun-kompetanse (Thoman og Weigle, Adv. Immunol. 46: 221-222,1989). En undersøkelse i mennesket har vist en invers sammenheng mellom føtalt serum-DHEA-S og nivået av lavtetthets-lipoprotein (LDL) (Parker et al., Science 208:512,1980).

Anvendelser av DHEA så vel som fordelene ved androgen- og østrogenbehandling diskuteres i internasjonalt patentskrift WO 94/16709.

Korrelasjoner observert innen teknikkens stand antas ikke å lede til behandlings-fremgangsmåter eller profylaktiske fremgangsmåter som er effektive eller så frie for uønskede bivirkninger som kombinasjonsbehandlingene som beskrives heri.

Oppsummering av oppfinnelsen

I

Foreliggende oppfinnelse omfatter forbindelse EM-1538, kjennetegnet ved at den har formelen

Videre omfatter forbindelsen farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter forbindelsen EM-1538.

Det er følgelig et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe effektive forbindelser som kan benyttes til behandling av osteroporose, hyperkolesterolemi, hyperlipidemi, aterosklerose, brystcancer, endometriumcancer, ovariecancer og uterascancer, samtidig som uønskede bivhlaiinger minimaliseres.

Det er et annet formål å tilveiebringe farmasøytiske preparater som er egnet for anvendelse som nevnt ovenfor.

Det er mulig å behandle eller redusere risikoen for å få osteoporose ved å forhøye nivået av en kjønnssteroid forløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron (DHEA), dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) og andros-5-en-3J3,17J3-diol (5-diol), i en pasient med behov for slik behandling eller en slik reduksjon, og videre omfattende tilførsel til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator (SERM) som del av en kombinasjonsbehandling.

Videre er det mulig å behandle eller redusere risikoen for å få hyperkolesterolemi, som omfatter å forhøye nivået av en kjønnssteroidforløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfat og androst-5-ene-3fl,17JJ, i en pasient med behov for slik behandling eller en slik reduksjon, og videre omfattende tilførsel til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator som del av en kombinasjonsbehandling.

Det er også mulig å benytte en behandling av eller reduksjon av risikoen for å få hyperlipidemi, som omfatter å forhøye nivået av en kjønnssteroid forløper utvalgt fra

gruppen som består av dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfat og androst-5-ene-313,17J3-diol i en pasient med behov for slik behandling eller en slik reduksjon, og videre omfattende tilførsel til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator som del av en kombinasjonsbehandling.

Videre er en behandling av eller reduksjon mulig når det gjelder risikoen for å få aterosklerose, som omfatter å forhøye nivået av en kjønnssteroid forløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfat og androst-5-ene-3B,17B, i en pasient med behov for slik behandling eller en slik reduksjon, og videre omfattende tilførsel til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator som del av en kombinasjonsbehandling.

I en annen mulig måte for behandling av eller reduksjon av risikoen for å få brystcancer, omfatter å forhøye nivået av en kjønnssteroid forløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrostei-on, dehydroepiandrosteronsulfat og androst-5-ene-3B,17JJ, i en pasient med behov for slik behandling eller en slik reduksjon, og videre omfattende tilførsel til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator som del av en kombinasjonsbehandling.

Videre er en behandling av eller reduksjon av risikoen for å få endometriumcancer mulig, som omfatter å forhøye nivået av en kjønnssteroid forløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfat og androst-5-ene-3f3,17J3, i en pasient med behov for slik behandling eller en slik reduksjon, og videre omfattende tilførsel til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator som del av en kombinasjonsbehandling.

Behandling av eller reduksjon av risikoen for å få uteruscancer er også mulig, som omfatter å forhøye nivået av en kjønnssteroid forløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfat og androst-5-ene-3J3,17J3, i en pasient med behov for slik behandling eller en slik reduksjon, og videre omfattende tilførsel til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator som del av en kombinasjonsbehandling.

En mulig behandlingsmåte av eller reduksjon av risikoen for å få ovariecancer, omfatter å forhøye nivået av en kjønnssteroid forløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfat og androst-5-ene-3fl,17B, i en pasient med behov for slik behandling eller en slik reduksjon, og videre omfattende tilførsel til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator som del av en kombinasjonsbehandling.

Det er også mulig å frembringe et sett som omfatter en første beholder som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av minst en kjønnssteroid forløper utvalgt fra gruppen som består av dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfat og androst-5-ene-313,17B, og ethvert promedikament som konverteres in vivo til enhver av de forannenvte forløpere, og videre omfattende en andre beholder som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av minst en selektiv østrogenreseptormodulator.

I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som omfatter:

a) en farmasøytisk aksepterbar eksipiens, et fortynningsmiddel eller et bærestoff,

b) en terapeutisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator.

Det er mulig å redusere risikoen for å få brystcancer som ved å tilføre en pasient med

behov for en slik reduksjon av en profylaktisk effektiv mengde av en selektiv østrogenreseptormodulator.

Det er også mulig å redusere sannsynligheten for å få brystcancer ved å kombinere tilførsel av en SERM med tilførsel av en kjønnssteroidforløper. Oppfinnelsen omfatter imidlertid tilførsel av en SERM alene, som vist i for eksempel figur 1 og 2, for å oppnå signifikant profylaktisk virkning selv i fravær av tilførte forløpere. Foretrukne SERM for dette formål er de samme som diskuteres for andre anvendelser heri. Foretrukne doseringer og tilførselsfremgangsmåter er også de samme.

Som benyttet heri er en selektiv østrogenreseptormodulator (SERM) en forbindelse som enten direkte eller via en aktiv metabolitt fungerer som en østrogenreseptorantagonist ("antiøstrogen") i brystvev, men likevel gir østrogenvhkning eller østrogenlignende vkkning på beinvev og på serumkolesterolnivået (dvs. ved å redusere serumkolesterolnivået). Ddce-steroide forbindelser som fungerer som østrogenreseptorantagonist in vitro eller i brystvev hos mennesket eller rotte (særlig dersom forbindelsen virker som et antiøstrogen på humane brystcancerceller) vil sannsynligvis fungere som en SERM.

Omvendt har steroide antiøstrogener en tendens til ikke å fungere som SERM siden de har en tendens til ikke å gi en gunstig virkning på serumkolesterolnivået. Ikke-steroide antiøstrogener som vi har analysert og funnet å fungere som SERM omfatter EM-800, EM-01538, Raloxifen, Tamoxifen og Droloxifen. Vi har analysert det steroide anti-østrogen ICI 182,780 og funnet at dette ikke fungerer som en SERM. SERM i samsvar med oppfinnelsen, kan tilføres i den samme dose som er kjent innen faget når disse forbindelser anvendes som antiøstrogener.

Vi har også bemerket en korrelasjon mellom den gunstige virkning SERM har på serumkolesterol og gunstige østrogenvirkninger eller østrogenlignende virkninger på bein- og serumlipider. SERM har blitt vist i vår forskning å ha gunstig virkning på alle disse parametere, innbefattet beinmasse, kolesterol og triglyseridnivåer. Uten at vi ønsker å begrenses av teori antar vi at SERM, av hvilke mange fortrinnsvis har to aromatiske ringer sammenkoblet med ett eller to karbonatomer, forventes å interagere med østrogenreseptoren via den forhåndliggende del av molekylet som best gjenkjennes av reseptoren. Foretrukne SERM har sidekjeder som selektivt kan gi antagonistiske egenskaper i brystvev uten å ha signifikante antagonistiske egenskaper i andre vev. SERM kan således fortrinnsvis fungere som antiøstrogener i brystet, mens de over-raskende og fordelaktig fungerer som østrogener (eller gir en østrolignende aktivitet) i bein og blod (hvor konsentrasjonen av lipider og kolesterol påvirkes på fordelaktig måte). Den fordelaktige virkning på kolesterol og lipid gir en fordelaktig virkning mot aterosklerose, som vites å påvirkes i uheldig grad av uheldige nivåer av kolesterol og lipid.

Alle sykdommene som diskutert heri responderer fordelaktig på androgener. Snarere enn å anvende androgener i seg selv benytter søkerne kjønnssteroidforløpere som DHEA, DHEAs, 5-diol, eller promedikamenter som konverteres til en slik kjønnsteroidforløper. In vivo konverteres DHEA-S til DHEA, som i sin tur konverteres til 5-diol. Det antas at ethvert vev som responderer fordelaktig på en av disse sannsynligvis vil respondere fordelaktig på de andre. Promedikament-former av aktive metabolitter er velkjente innen faget. Se for eksempel H. Bundgaard "Design and Application of Prodrugs"# (I: A Textbook of Drug Design and Development. Redigert av H. Bundgaard og P. Krogsgaard-Larsen; Harwook Academic Publishers GrnfH, Chur.: Sveits, 1991),. Se spesielt sidene 154-155, som beskriver forskjellige funksjonelle grupper i aktive metabolitter og egnede, tilsvarende promedikamentgrupper som konverteres in vivo til disse funksjonelle gruppene. Når nivået hos en pasient av kjønnssteroid-forløpere forhøyes i kan dette typisk oppnås ved tilførsel av en slik forløper eller ved tilførsel av et promedikament for en slik forløper. Ved å anvende forløpere i stedet for androgener reduseres uønsket androgenaktivitet i andre vev enn målvevet. Vev konverterer forløpere som DHEA til androgener kun gjennom en naturlig og mer regulert prosess. En stor andel av androgenene produseres lokalt i perifere vev og i forskjellig grad i forskjellige vev.

Cancere som behandles responderer ufordelaktig på østrogenaktivitet. Derimot responderer osteoporose, hyper-kolesterolemi, hyperlipidemi og aterosklerose fordelaktig på østrogenaktivitet eller østrogenlignende aktivitet. Ved å anvende SERM i samsvar med oppfinnelsen oppnås fordelaktige virkninger i målvev uten uønskede virkninger i visse andre vev. For eksempel kan en SERM ha fordelaktig østrogenvirkning i bein (eller på lipid eller kolesterol), samtidig som det unngås ufordelaktig østrogenvirkning i brystet.

Således kan både forløpere og SERM gi fordelaktig virkning i målvev samtidig som ufordelaktige virkninger i visse andre vev minimaliseres. Videre kan det oppnås omfattende synergi ved å anvende de to samtidig. For eksempel gir østrogener og androgener fordelaktige virkninger mot osteoporose ved forskjellige mekanismer (østerogen reduserer beinresorpsjonen mens androgen bidrar til beindannelse). Kombinasjonen tilfører fordelaktig østrogenvirkning eller østrogenlignende virkning til bein via aktiviteteten til SERM, og gir også fordelaktig androgen via lokal overføring av forløper til androgen i bein. Forløperen antas også å tilveiebringe østrogen. Det samme gjelder i forbindelse med kontroll av lipid og kolesterol (anvendbart for behandling eller forebyggelse av atero-skelerose). En lignende synergi tilveiebringes mot brystcancer, endometriumcancer, ovariecancer og uteruscancer, hvor SERM gir en fordelaktig antiøstrogen-virkning og forløperen gir en ønsket androgen virkning (hvor eventuell tilfeldig konvertering av forløper til østrogen tas hånd om av antiøstrogenet). Uønskede virloiinger ventes også på en synergistisk måte ved kombinasjonen som anvendes. For alle sykdommer som diskuteres heri dempes eventuelt andre virkninger på brystvev som ellers kunne følge av østrogenproduksjon fra forløperen (dersom forløperen anvendes for å fremme androgene virkninger i samsvar med oppfinnelsen) ved den antiøstrogene vklcning av SERM i brystvev.

Det er også mulig å tilsette progestiner for å gi ytterligere androgen virkning. Progestiner kan anvendes i lave doser, som kjent innen faget, uten på uønsket vis å påvirke andre reseptorer enn androgenreseptorene (for eksempel glukokortikoid reseptorer). De er også relativt fri for uønskede androgene bivirkninger (for eksempel hårvekst i ansiktet hos kvinnelige pasienter).

SERM som diskuteres heri kan gjelde

(1) alle sykdommer som angis å være følsomme for oppfinnelsen,

(2) både terapeutiske og profylaktiske anvendelser, og

(3) foretrukne farmasøytiske preparater.

En mulig forløper er DHEA.

En annen mulig forløper er DHEA-S.

En mulig annen forløper er 5-diol.

Dersom ikke armet er angitt er den foretrukne dosering av de aktive forbindelser (konsentrasjoner og tilførselsveier) identiske for både terapeutiske og profylaktiske formål. Dosen av hver aktiv bestanddel som diskuteres heri er den samme, uavhengig av hvilken sykdom som behandles (eller hvilken sykdom hvis risiko for utvikling reduseres).

Dersom ikke annet er angitt eller åpenbar fra sammenhengen viser dosene heri til vekt av aktive forbindelser, upåvirket av farmasøytiske eksipienser, fortynningsmidler, bærestoffer eller andre ingredienser, selv om slike tilleggsbestanddeler med fordel kan inngå, som vist i eksemplene heri. Enhver doseringsform (kapsel, tablett, injeksjon eller lignende) som vanligvis benyttes i den farmasøytiske industri er egnet for anvendelse heri, og begrepene "eksipiens", 'Tortynningsmiddel" eller "bærestoff' omfatter slike ikke-aktive ingredienser som typisk inngår sammen med aktive bestanddeler i slike doseringsformer innen industrien. Typisk kan for eksempel kapsler, piller, enteriske belegg, faste eller flytende fortynningsmidler eller eksipienser, smaksstoffer, konserveringsmidler eller lignende inngå.

SERM kan anvendes for fremstilling av et medikament for anvendelse i kombinasjon med en kjønnssteroidforløper utvalgt fra gruppen som består av DHEA, DHEA-S, 5-diol og promedikamenter som konverteres til enhver av de ovenfor nevnte kjønnssteroid-forløpere in vivo for behandling av enhver av sykdommene hvor kombinasjonsbehandling antas å være effektiv (dvs. brystcancer, endometrium cancer, uterus cancer, ovarie cancer, osteoporose, hyperkolesterolemi, hyperlipidemi og aterosklerose). Videre er det mulig å anvende en kjønnssteroid forløper utvalgt fra gruppen som består av DHEA, DEHA-S, 5-diol og promedikamenter som konverteres til enhver av de forannevnte kjønnssteroidforløpere in vivo for fremstilling av et medikament for anvendelse i kombinasjon med en SERM for behandling av enhver av de samme sykdommer.

I et tilfelle anvendes DHEA ikke som forløperen. I et annet tilfelle anvendes EM-800 ikke som SERM. I et annet tilfelle anvendes ikke kombinasjonen av DHEA og EM-800. DHEA kan benyttes i kombinasjon med EM-1538.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser virlmingen av behandling med DHEA (10 mg, perkutant en gang daglig) eller EM-800 (75 u.g, oralt, en gang daglig) hver for seg eller i kombinasjon i 9 måneder på forekomsten av DMBA-indusert brystkarsinom hos rotte gjennom den 279-dager lange observasjonsperioden. Verdiene er uttrykt som prosent av det totale antall dyr i hver gruppe. Figur 2 viser virkningen av behandling med DHEA (10 mg, perkutant, en gang daglig) eller EM-800 (75 ug, oralt, en gang daglig) hver for seg eller i kombinasjon i 9 måneder på gjennomsnitthg tumorantall pr. tumorbærende dyr (A) og på gjennomsnittlig tumorstørrelse pr. tumorbærende rotte (B) gjennom den 279 dager lange observasjonsperiode. Verdiene er uttrykt som gjennomsnittsverdier ±SEM. Figur 3 viser virkningen av behandling med DHEA (10 mg, perkutant, en gang daglig) eller EM-800 (75 u,g, oralt, en gang daglig) hver for seg eller i kombinasjon i 9 måneder på nivå av triglyserid (A) og kolesterol (B) i serum hos rotte. Verdiene er uttrykt som middelverdi ±SEM.<**>P<0,01 for eksperimentell verdi sammenlignet med den angjeldende kontroll.

Figur 4 viser:

A) Virkning av økende doser av DHEA (0,3 mg, 1,0 mg eller 3,0 mg) tilført perkutant to ganger daglig på gjennomsnittlig ZR-75-l-tumorstørrelse hos ovariektomiserte (OVX) nakne mus tilføret estron. Kontoll-OVX-mus som ble gitt bærestoff alene anvendes som ytterligere kontroller. Utgangsstørrelsen av tumoren ble satt til 100%. DHEA ble tilført perkutant (p.c.) i 0,02 ml løsning i 50% etanol - 50%

propylen glykol på den dorsale hud.

B) Virkning av behandling med økende doser av DHEA eller EM-800 hver for seg eller i kombinasjon i 9,5 måneder på ZR-75-l-tumorvekt hos OVX nakne mus tilført estron. **, p <0,01 behandlede OVX-mus sammenlignet med kontroll-OVX-mus tilført estron. Figur 5 viser virkningen av økende orale doser av antiøstrogenet EM-800 (15 ug, 50 jig eller 100 ug) (A) eller av perkutan tilførsel av økende doser av DHEA (0,3,1,0 eller 3,0 mg) kombinert med EM-800 (15 ug) eller EM-800 alene (B) i 9,5 måneder på gjennomsnittlig ZR-75-l-tumorstørrelse hos ovariektomiserte (OVX) nakne mus tilført estron.

Utgangsstørrelsen av tumoren ble satt til 100%. Kontroll-OVX-mus som ble tilført bærestoff alene ble benyttet som ytterligere kontroller. Estron ble tilført subkutant i en dose på 0,5 fig en gang daglig, mens DHEA ble løst i 50% etanol - 50% propylen glykol og påført det dorsale hudområdet to ganger daglig i et volum på 0,02 ml. Det ble også sammenlignet med OVX-mus som ble gitt bærestoff alene. Figur 6 viser virkningen av 12-måneders behandling med dehydroepiandrosteron (DHEA) alene eller i kombinasjon med Flutamid eller EM-800 på trabekel beinvolum hos ovariektomiserte rotter. Intakte dyr inngår som ytterligere kontroller. Resultatene er gitt som middelverdi ±SEM<**>p<0,01 ved sammenligning med OVX kontroll. Figur 7 viser virkningen av 12-måneders behandling med dehydroepiandrosteron (DHEA) alene eller i kombinasjon med Flutamid eller EM-800 på trabekel tall hos ovariektomiserte rotter. Intakte dyr inngår som ytterligere kontroller. Resultatene er gitt som middelverdi ±SEM<**>p<0,01 ved sammenMgning med OVX-kontroller. Figur 8 viser proksimale tibia metafyser fra intakte kontrollrotter (A), ovariektomiserte kontrollrotter (B), og ovariektomiserte rotter behandlet med DHEA alene (C) eller i kombinasjon med Flutamid (D) eller EM-800 (E). Bemerk den reduserte mengde trabekelbein (T) hos ovariektomiserte kontrolldyr (B) og den signifikante økning av trabekelbeinvolumet (T) indusert etter DHEA-ttfførsel (C). Tilsetning av Flutamid til DHEA blokkerte delvis vhkningen av DHEA på trabekelbeinvolumet (D), mens kombinasjonen av DHEA og EM-800 ga fullstendig beskyttelse mot det ovariektomi-assosierte beintap. Modifisert trikromatisk Masson-Goldner, forstørrelse x80. T: Trabeculae, GP: Vekstplate. Figur 9 viser virkningen av økende doser (0,01, 0,03, 0,1,0,3 og 1 mg/kg) av EM-800, EM-1538 og Raloxifen (EM-1105) tilført oralt daglig i 4 dager på kolesterolnivået hos ovariektomisert rotte. Figur 10 viser virkningen av 34-ukers behandling med dehydroepiandrosteron (DHEA) alene eller i kombinasjon med EM-1538 (EM-652.HC1) på lumbalryggrad-BMD hos ovariektomiserte rotter. Intakte dyr inngår som ytterligere kontroller. Resultatene er gitt som middelverdi ±SEM<**>p<0,01 ved sammenligning med OVX-kontroll. Figur 11 viser de kombinerte vhknhiger av SERM (EM-652) og DHEA på menopause-parametere. Ingen negativ vhkning forventes.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det er velkjent at østrogener stimulerer proliferasjon av brystepitelceller og at celle-proliferasjon i seg selv antas å øke risikoen for cancer ved akkumulering av tilfeldige genetiske feil som kan føre til neoplasi (Preston Martin et al., Cancer, Res. 50: 7415-21, 1990). Basert på dette konsept har antiøstrogener blitt anvendt for å forebygge brystcancer med det formål å redusere celledelingshyppigheten som stimuleres av østrogener.

Tap av ovariesyklisitet observert hos Sprague-Dawley-hunnrotter etter en alder på 10 måneder ledsages av forhøyet nivå av østrogen og prolaktin i serum og reduserte konsentrasjoner i serum av androgen og progesteron (Lu et al., 61at Annual Meeting of the Endocrine Society 106 (abst. # 134), 1979; Tang et al., Biol. Reprod. 31:399-413, 1984; Russo et al., Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Integument and Mammary Glands 252-266,1989; Sortino og Wise, Endocrnology 124: 90-96,1989; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991). Disse homonendringer som spontant forekommer hos aldrende hunnrotter er forbundet med multifokal proliferasjon og forhøyet sekretorisk aktivitet av akinar vev/alveolar vev, så vel som dilatasjon av brystkjertelkanalen og dannelse av syster (Boorman et al., 433,1990; Cardy, Vet. Pathol. 28:139-145,1991). Det bør nevnes at hyperplastiske og neoplastiske endringer i brystkjertelen hos rotte ofte ledsages av forhøyet nivå av østrogener og prolaktin (Meites, J. Neural. Transm. 48:25-42,1980). Behandling med EM-800, en SERM, induserer atrofi av brystkjertelen som særpreges ved en redusert størrelse og antall av lobulær suTikturer og intet tegn på sekretorisk aktivitet, noe som viser den kraftige anti-østrogen aktivitet av EM-800 i brystkjertelen (Luo et al., Endocrinology 138:4435-4444,1997).

Behandling med DHEA, en kjønnssteroid forløper fører til forhøyelse av DHEA og 5-diol i serum, mens nivået i serum av 4-dion, testosteron, dihydrotestosteron og estradiol kun økes i moderat grad eller, oftere, forblir uendret, noe som bekrefter den intracellulære biotransformasjon av dette forløpersteroid i perifert vev (Labrie et al., Mol. Cell. Endrocrinol. 78: C113-C118,1991). Imidlertid har den stimulerende virkning av oralt tilført DHEA på serumandrogener, for eksempel testosteron og dihydrotestosteron, større utslag enn virkningen på serum østrogener, noe som tyder på at DHEA hovedsakelig transformeres til androgener i disse dyr. Denne observasjon er i samsvar med resultatene erholdt hos kvinner, hvor dannelse av androgener fra DHEA var en viktigere reaksjonsvei enn konvertering av DHEA til østrogener (Morales et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 78:1360-1367,1994; Labrie et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 774: 16-28, 1995; Labrie et al., Steroids 62: 148-158, 1997).

Med kjennskap til den ovenfor beskrevne, kraftige antiøstrogene aktivitet som fører til brystkjertelandrofi og den fremtredende androgene vhkning av DHEA på brystkjertelen kan de histomorfologiske endringer som observeres hos dyr behandlet med en kombinasjon av en SERM og en kjønnssteroid forløper best forklares ved en ikke-motvirket androgen virkning av DHEA på brystkjertel hos rotte.

Det er av stor viktighet at det har blitt observert at androgener utøver en direkte antiproliferativ aktivitet på vekst av humane ZR-75-l-brystcancerceIler in vitro og at denne inhiberende virkning av androgener er additiv til virkningen av et antiøstrogen (Poulin og Labrie, Cancer Res. 46:4933-4937, 1986; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treat. 12,213-225,1988). Tilsvarende inhibitoriske vkkninger har blitt observert in vivo på ZR-75-1 xenotransplantater hos nakne mus (Dauvois et al., Cancer Res. 51:3131-3135,1991). Androgener har også blitt vist å inhibere veksten av DMBA-indusert brystkarsinom hos rotte, hvor denne inhibering reverseres veds samtidig tilførsel av det rene antiandrogen Flutamide (Dauvois et al., Breast Cancer Res. Treat. 14:299-306,1989). Sert under ett tyder de foreliggende resultater på at androgen-reseptoren deltar i den inhiberende virkning av DHEA på brystcancer.

Siden antiøstrogener og kjønnssteroidforløpere utøver inhibitoriske virkninger på brystcancer via forskjellige mekanismer viser kombinasjonen av en SERM (EM-800) og en kjønnssteroid forløper (DHEA) utøver kraftigere inhiberende virkninger enn hver forbindelse anvendt alene på utvikling av DMBA-indusert brystkarsinom hos rotte, noe som illustreres godt i figurene 1 og 2. Faktisk ble ingen DMBA-indusert tumor funnet ved avslutning av eksperimentet hos rotter som var blitt tilført både DHEA og EM-800.

Kombinasjonen av en kjønnssteroid forløper (DHEA) og en SERM (EM-800) opprettholdt den stimulerende virkning av DHEA på beindannelse og forsterket den inhiberende virlcning av SERM (EM-800) alene på beinmetabolisme og -resorpsjon, vist ved ytterligere reduksjon av utskillelse av hydroksyprolin og kalsium i urinen ved kombinasjon av de to forbindelsene.

Vi har vist at DHEA har gunstige vkkninger på bein, både hos hunnrotte (Luo et al., Endocrinology 138:4435-4444, 1997) og postmenopausale kvinner (Labrie et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 3498-3505, 1997). I intakte hunnrotter gir således behandling med DHEA økt beinmineraltetthet (BMD) i skjelettet totalt, i den lumbale ryggrad og i femur (Luo et al., Endocinology 138:4435-4444,1997).

På den andre side hadde behandling med EM-800 ingen signifikant vkkning på BMD hos intakte dyr, selv om kraftige stimulerende virkninger observeres hos ovariektomisert rotte (Martel et al., ikke-publiserte resultater). Siden EM-800 utøver slike stimulerende virkninger på BMD i totalskjelettet, lumbal ryggrad og femur hos ovariektomiserte rotter, kan manglende signifikant stimulerende virkning av EM-800 hos intakte dyr skyldes at kjønnssteroidene som foreligger i intakte hunnrotter utøver en maksimal virkning på BMD (Luo et al., Endocrinology 138:4435-4444, 1997). Tilsvarende kan manglende signifikant virkning av EM-800 hos ovariektomiserte rotter som allerede gis DHEA sannsynligvis skyldes de maksimale stimulerende virkninger som utøves av androgenene (og muligens østrogenene) som syntetiseres i beinceller fra eksogen DHEA.

Det er kjent at østrogener reduserer kolesterolnivået i serum, men forhøyer eller ikke har virkning på nivået av triglyserider i serum (Love et al., Ann. Intern. Med. 115:860-864, 1991; Walsh et al., New Engl. J. Med. 325:1196-1204; 1991; Barret-Connor, Am. J. Med. 95 (Suppl. 5A): 40S-43S, 1993: Russel et al., Atherosclerosis 100: 113-122, 1993; Black et al., J. Clin. Invest. 93: 63-69; 1997; Dipippo et al., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995; Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441,1995). Figur 3 viser at EM-800 besitter både hypokolesterolemiske og hypotriglyseridemiske vfrkninger i rotte, noe som viser forbindelsens enestående virlming på serumhpidprofilen, en virkning som tilsynelatende er forskjellig fra virkningen av andre SERM, for eksempel tamoksifen (Bruning et al., Br J. Cancer 58:497-499,1988; Love et al., J. Nati. Cancer Inst. 82: 1327-1332,1990: Dipippo et al., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995; Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441,1995), droloksifen (Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441,1995) og raloksifen (Black et al., J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994). Kombinasjonen av DHEA og EM-800 bevarte de hypokolesterolemiske og hypotriglyseridemiske virkninger av EM-800, noe som tyder på at en slik kombinasjon kunne ha gunstige virkninger på serumlipider.

Det bør nevnes at serumlipidprofilen hos rotter er markant forskjellig fra profilen hos mennesker. Siden en øsfrogenreseptorformidlet mekanisme inngår i den hypokolesterolemiske virkning av østrogener så vel som antiøstrogener (Lundeen et al., Endocrinology 138:1552-1558,1997), forblir imidlertid rotte en anvendbar modell for undersøkelsen av den kolesterolreduserende virkning av østrogener og "antiøstrogener" hos mennesker.

Kort sagt viser de ovenfor beskrevne resultater tydelig virkningene av kombinasjonen av en SERM (EM-800) og en kjønnssteroid forløper (DHEA) på utvikling av brystkarsinom indusert med DMBA, så vel som de beskyttende virkninger av en slik kombinasjon på beinmasse og serumlipider. Slike resultater tyder på ytterligere gunstige virkninger av en slik kombinasjon forbehandling og forebyggelse av osteoporose, samtidig som lipidprofilen forbedres.

Vi har også undersøkt den mulige interaksjon mellom den inhiberende virkning av det nye antiøstrogen (EM-800) og virkningen av kjønnssteroidforløper (DHEA) på vekst av humane ZR-75-l-brystcancer-xenotransplantater i nakne mus ved kombinert tilførsel av de to medikamentene. Figurene 4 og 5 viser at DHEA alene i de anvendte doser gir 50 til 80% inhibering av tumorveksten, mens den nesten fullstendige inhibering av tumorveksten som ble oppnådd med en lav dose av antiøstrogenet ikke ble påvirket av DHEA.

Begrensningene når det gjelder måling av beinmineraltetthet (BMD) er velkjente. For eksempel viste BMD-målinger ingen endring hos rotter behandlet med steroidal antiøstrogen ICI 182780 (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25: 1-9,1993) mens inhiberende endringer ble observert ved histomorfometri (Gallagher et al., Endocrinology 133:2787-2791,1993). Tilsvarende forskjeller ble rapportert med Tamoxifen (Jordan et al., Breast Cancer Res. Treat. 10:31-35,1987; Sibonga et al., Breast Cancer Res. Treatm. 41: 71-79, 1996).

Det bør nevnes at redusert beinmineraltetthet ikke er den eneste unormalitet som er forbundet med redusert beinstyrke. (Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in the prevention or treatment of postmenopausal osteoporosis, Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FD A, mai 1994). Det er således viktig å analysere endringene i biokjemiske parametre for beinmetabolismen indusert med forskjellige forbindelser og behandlingsformer for å få bedre kunnskaper vedrørende deres virkning.

Det er spesielt viktig å nevne at kombinasjonen av DHEA og EM-800 utøvde uventede gunstige virkninger på viktige biokjemiske parametre for beinmetabolismen. Faktisk påvirket DHEA alene ikke forholdet mellom hydroksyprolin og kreatinin i urinen, en markør for beinresorpsjon. Videre kunne ingen virkning av DHEA påvises når det gjaldt daglig utskillelse av kalsium eller fosfor i urinen (Luo et al., Endocrinology 138:4435-4444,1997). EM-800 ga derimot en reduksjon av hydroksyprolinACTeatinin-forholdet i urinen med 48%, mens det som for DHEA ikke kunne observeres noen virkning av EM-800 på utskillelse av kalsium eller fosfor i urinen. EM-800 hadde videre ingen på aktiviteten av alkalisk fosfatase i serum, en markør for beindannelse, mens DHEA økte verdien for denne parameter med tilnærmet 75% (Luo et al., Endocrinology 138:4435-4444,1997).

En av de uventede virlminger av kombinasjonen av DHEA og EM-800 gjelder forholdet mellom hydroksyprolin og kreatinin i urinen, en markør for beinresorpsjon, som ble redusert med 69% når DHEA og EM-800 ble kombinert, denne verdi er statistisk forskjellig (p<0,01) fra intaberingen på 48% som ble oppnådd med EM-800 alene, mens DHEA alene ikke viste noen virkning. Således gir tilsetning av DHEA til EM-800 en forhøyelse på 50% av den inhiberende virkning av EM-800 på bednreabsorbsjonen. En annen uventet virkning av stor betydning av tilsetning av DHEA til EM-800 var reduksjonen på tilnærmet 84% av kalsium i urinen (fra 23,17±3,71±0,75 u,mol/24 timer/100 g (p<0,01), og reduksjonen på 55% av fosfor i urinen (fra 132,72±6,08 til 59,06 ±4,76 umol/24 timer/100 g (p<0,01) (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Det er også av interesse å bemerke at den kraftige inhiberende virkning av EM-800 på serum kolesterol ikke forhindres ved samtidig behandling med DHEA (Luo et al, Endocrinology 138: 4435-4444,1997).

Mens Raloxifene og tilsvarende forbindelser forhindrer beintap og reduserer serum-kolesterolet (i likhet med østrogenet) bør det nevnes at da Raloxifene ble sammenlignet med Premarin på BMD var virkningen av Raloxifene på BMD mindre kraftig enn vfrlaringen av Premarin (Minutes on the Endocrinology and Metabolism Drugs Advisory Committee, FDA Thursday, Meeting # 68,20. november 1997).

De foreliggende resultater erholdt i rotte viser tydelig at DHEA kan gi gunstige virkninger som mangler ved anvendelse av en selektiv østrogenreseptormodulator (SERM) alene, for eksempel EM-800, Raloxifen osv. Mens en SERM har virkninger som er begrenset til inhibering av beinresorpsjon antas tilsetning av DHEA, 5-diol, DHEA-S å stimulere beindannelsen (en virkning som ikke observeres med en SERM eller et østrogen) og videre redusere beinresorpsjonen utover virlcningen som oppnås med EM-800.

Det er av viktighet at kombinasjonen av EM-800 og DHEA i ovariektomiserte rotter behandlet i 12 måneder hadde gunstige virkninger på beinmorfometrien. Trabekelbeinvolumet er spesielt viktig for beinstyrken og for forebyggelse av beinbrudd. I den ovenfornevnte undersøkelsen økte således trabekelbeinvolumet i tibia fra 4,1 ± 0,7% hos ovariektomiserte rotter til 11,9 ± 0,6% (p <0,01) med DHEA alene, mens tilsetning av EM-800 til DHEA økte trabekelbeinvolumet ytterligere til 14,7 ± 1,4%, en verdi som tilsvarer den funnet hos intakte kontrolldyr (figur 6).

Fra en verdi på 0,57 ± 0,08 pr. mm hos ovariektomiserte rotter førte behandling med DHEA til en økning på 137% av trabekelbeintallet, sammenlignet med ovariektomiserte kontroller. Den stimulerende virkning av DHEA nådde således 1,27 ±0,1 pr. mm, mens samtidig behandling med EM-800 og DHEA førte til ytterligere 28% økning av trabekelbeintallet (p < 0,01), sammenlignet med resultatet oppnådd med DHEA alene (figur 7). På tilsvarende måte førte tilsetning av EM-800 til behandlingen med DHEA til ytterligere 15% (p < 0,05) reduksjon av trabekelbeinseparasjonen, sammenlignet med hva som ble oppnådd med DHEA alene, noe som førte til verdier som ikke er forskjellige fra verdiene observert i intakte kontrolldyr.

Som et komplement til de numeriske verdier som gis i figurene 6 og 7, viser figur 8 økningen i trabekelbeinvolum i den proksimale metafyse i tibia indusert med DHEA i ovariektomiserte, behandlede dyr (C), sammenlignet med ovariektomiserte kontrolldyr

(B), så vel som den delvise inhibering av den stimulerende virkning av DHEA etter tilsetning av Flutamide til DHEA-behandling (D). Derimot førte tilførsel av DHEA i

kombinasjon med EM-800 til en fullstendig forebyggelse av den ovariektomi-induserte osteopeni (E), siden trabekelbeinvolumet er sammenlignbart med hva som observeres i intakte kontrolldyr (A).

Beintapet som observeres ved menopause hos kvinner antas å skyldes en økning i hastigheten for beinresorpsjon som ikke fullt ut kompenseres av den sekundære økning i beindannelsen. Faktisk forhøyes parameterene både for beindannelse og beinresorpsjon i osteoporose, og både beinresorpsjon og beindannelse inhiberes ved østrogen-erstatningsbehandling. Den inhiberende virkning av østrogenerstatning på beindannelse antas således å være en følge av en koblet mekanisme mellom beinresorpsjon og beindannelse, slik at den primære østrogeninduserte reduksjon i beinresorpsjonen følges av redusert beindannelse (Parfltt, Calcified Tissue International 36 Suppl 1: S73-S45, 1984).

Cancellus beinstyrke og medfølgende motstandskraft mot beinbrudd avhenger ikke bare av den totale mengde cancellus bein, men også av trabekelmikrostrukturen, bestemt ved antall, størrelse og fordeling av trabekler. Tap av ovariefunksjon hos postmenopausale kvinner ledsages av en signifikant reduksjon av det totale trabekelbeinvolum (Meisen et al., ActaPathologja & Microbiologica Scandinavia 86: 70-81,1978; Vakamatsou et al., Calcified Tissue International 37: 594-597,1985), hovedsakelig grunnet en reduksjon av antall og, i mindre grad, bredden av trabekler (Weinstein og Hutson, Bone 8: 137-142, 1987).

I undersøkelsen ble den androgene stimulerende virkning av DHEA observert på nesten alle de beinhistomorfometriske parametre som ble undersøkt. DHEA førte således til en signifikant økning av trabekelbeinvolumet så vel som av trabekeltallet, mens intertrabekelarealet ble redusert.

For å lette kombinasjonsbehandlingstiden omfattes for enhver indikasjon som diskuteres heri farmasøytiske preparater som omfatter både SERM eller bisfosfonatforbindelsen og kjønnsteroidforløperen (DHEA, DHEAS, 5-diol) i et enkelt preparat for samtidig tilførsel. Preparatet kan være egnet for tilførsel på enhver tradisjonell måte, innbefattet, men ikke begrenset til, oral tilførsel, subkutan injeksjon, intramuskulær injeksjon eller perkutan tilførsel. Det er også mulig å tilveiebringe et sett som omfatter en eller flere SERM eller bisfosfonater og kjønnssteroid-forløpere i adskilte beholdere eller i en beholder. Settet kan omfatte egnede materialer for oral tilførsel, for eksempel tabletter, kapsler, siruper og lignende, og for transdermal tilførsel, for eksempel salver, vandige løsninger, geler, kremer, plastere for vedvarende frigivelse og lignende.

Søkerne antar at tilførsel av SERM og kjønnssteroidforløpere kan anvendes ved behandling og/eller forebyggelse av utvikling av osteoporose, brystcancer, hyperkolesterolemi, hyperhpidemi eller aterosklerose. De aktive bestanddeler ifølge oppfinnelsen (enten SERM, forløper, bisfosfonat eller andre) kan utformes og tilføres på en rekke forskjellige måter).

Aktiv bestanddel for transdermal eller transglukosal tilførsel foreligger fortrinnsvis i en mengde fra 0,5 til 20% (vekt/vekt) relativt til totalvekten av det farmasøytiske preparat, mer foretrukket mellom 2 og 10%. DHEA eller 5-diol bør foreligge i en konsentrasjon på minst 7% for perkutan tilførsel. Alternativt kan den aktive bestanddel plasseres i et transdermalt plaster med struktur som kjent innen faget, for eksempel strukturer beskrevet i europeisk patentskrift nr. 0279982.

Ved tilførsel som en løsning, salve, gel, krem eller lignende er den aktive forbindelse sammenblandet med et egnet bærestoff som er forenelig med human hud eller humane

slimhinner og som fremmer transdermal penetrering av forbindelsen gjennom hud eller slimvev. Egnede bærestoffer er kjent innen faget og omfatter, men er ikke begrenset til, Klucel HF og Glaxal base. Noen er kommersielt tilgjengelige, for eksempel Glaxal-base tilgjengelig fra Glaxal Canada Limited Company. Andre egnede bærestoffer kan finnes i Koller og Buri, S.T.P. Pharma 3(2), 115-124,1987. Bærestoffet er fortrinnsvis et stoff i hvilket den eller de aktive bestanddeler er løselige ved romtemperatur i de anvendte

konsentrasjoner av aktiv bestanddel. Bærestoffet bør ha tilstrekkelig viskositet til å

opprettholde inhibitoren i et lokalisert område av huden eller slimhinnen som preparatet tilføres til, uten at preparatet renner eller fordamper over et tidsrom som er tilstrekkelig til å gi omfattende penetrering av forløperen gjennom det lokaliserte området av huden eller slinihinnen og inn i blodbanen, hvor det vil gi en ønsket klinisk virkning. Bærestoffet er typisk en blanding av flere bestanddeler, for eksempel farmasøytisk aksepterbare løsemidler og et tykningsmiddel. En blanding av organiske og uorganiske løsemidler kan forhøye den hydrofile og lipofile løseligheten, for eksempel vann og en alkohol som etanol.

Kjønnssteroidforløpere kan være dehydroepiandrosteron (DHEA) (tilgjengelige fra Diosynth Inc., Chicago, Illionois, USA), promedikamenter av denne (tilgjengelige fra Steraloids, Wilton, New Hampshire, USA), 5-androsten-3J3,17J3-diol og promedikamenter av denne EM-1304 og EM-01474-D (tilgjengelig fra Steraloids, Wilton, New Hampshire USA).

Kjøimssteroidforløperen kan være utformet som en alkoholisk gel som inneholder fra 2,0 til 10% kaprylsyi-e/kapronsyretriglyserid (Neobee M-5); 10 til 20% heksylenglykol; 2,0 til 10% dietylenglykol-monometyleter (Transutol); 2,0 til 10% syklometikon (Dow Corning 345); 1,0 til 2% benzylalkohol og 1,0 til 5,0% hydroksypropylcellulose (Klucel

HF).

Bærestoffet kan også omfatte forskjellige tilsetningsstoffer som hyppig anvendes i salver og kremer og som er velkjente innen de kosmetiske og medisinske fag. For eksempel kan duftstoffer, antioksidanter, parfymer, geldannende midler, tyknings-midler som karboksymetylcellulose, overflateaktive midler, stabilisatorer, bløt-gjøriiigsmidler, fargestoffer og andre tilsvarende midler foreligge. Ved anvendelse for behandling av systemiske sykdommer kan applikasjonssetet på huden endres for å unngå for høy lokal konsentrasjon av aktiv bestanddel og mulig overstimulering av hud og talgkjertler via androgene metabolitter av kjønnssteroidforløperen.

I et farmasøytisk preparat for oral tilførsel kan DHEA eller en annen forløper foreligge fortrinnsvis i en konsentrasjon på mellom 5 og 98% (vekt/vekt), relativt til totalvekten av preparatet, eller mellom 50 og 98%, eller mellom 80 og 98%. En enkelt forløper, for eksempel DHEA, kan være den eneste aktive bestanddel, eller det kan alternativt anvendes en rekke forløpere og/eller analoger av disse (for eksempel en kombinasjon av DHEA, DHEA-S, 5-diol, eller en kombinasjon av to eller flere forbindelser som konverteres in vivo til DHEA, DHEA-S eller 5-diol, eller en kombinasjon av DHEA eller 5-diol og en eller flere analoger av disse som konverteres til DHEA eller 5-diol in vivo osv. Nivået i blodet av DHEA er det endelige kriterium på en tilstrekkelig dose, som tar hensyn til individuelle variasjoner i absorpsjon og metabolisme.

Den behandlende lege vil fortrinnsvis, særlig ved behandlingens begynnelse, følge den enkelte pasients generelle respons og serumnivået av DHEA (sammenlignet med de foretrukne serumkonsentrasjoner som diskutert ovenfor), og følge pasientens generelle respons på behandlingen, og justere dosene etter behov dersom en gitt pasients metabolisme eller reaksjon på behandlingen er atypisk.

SERM-forbindelsen eller bisfosfonatet og/eller kjønnssteroidforløperen kan også tilføres oralt, og den kan utformes med konvensjonelle farmasøytiske eksipienser, for eksempel spraytørket laktose, milaokrystallinsk cellulose og magnesiumstearat, til

tabletter eller kapsler for oral tilførsel.

Den aktive forbindelse kan utarbeides til tabletter eller dragekjerner ved sammenblanding med faste, pulverformede bæresubstanser, for eksempel natriumsitrat, kalsiumkarbonat eller dikalsiumfosfat, og bindemidler som polyvinylpyrrolidon, gelatin eller cellulosederivater, muligens også ved tilsetning av smøremidler som magnesiumstearat, natrium larulysulfat, "Carbowax" eller polyetylenglykol. Naturligvis kan smaksforbedrende forbindelser tilsettes når det gjelder orale tilførselsformer.

Som ytterligere tilførselsformer kan man anvende pluggkapsler, for eksempel av hard gelatin, så vel som lukkede kapsler av myk gelatin som omfatter et mykningsmiddel eller et bløtgjøringsmiddel, for eksempel glyserin. Pluggkapslene inneholder den aktive forbindelsen fortrinnsvis i form av et granulat, for eksempel sammenblandet med fyllstoffer som laktose, sakkarose, mannitol eller stivelser, for eksempel potetstivelse eller amylopektin, cellulosederivater eller høydispergerte kiselsyrer. I kapsler av myk gelatin er den aktive forbindelsen fortrinnsvis løst eller suspendert i egnede væsker, for eksempel vegetabilske oljer eller flytende polyetylenglykoler,

Væsken, salven, gelen eller kremen bør gnis grundig inn i huden slik at intet overskudd er synlig, og huden bør ikke vaskes i dette området før det meste av den transdermale penetrasjon har skjedd, fortrinnsvis i minst 4 timer og, mer foretrukket, minst 6 timer.

Et transdermalt plaster kan anvendes for tilførsel av forløper i samsvar med kjente teknikker. Plasteret påsettes typisk over mye lengere tidsrom, for eksempel 1 til 4 dager, men inneholder typisk aktiv bestanddel i et mindre overflateområde, noe som tillater langsom og konstant tilførsel av aktiv bestanddel.

En rekke systemer for transdermal medikamenttilførsel som har blitt utviklet og er i bruk er egnede for tilførsel av den aktive bestanddel ifølge foreliggende oppfinnelse. Frigivningshastigheten kontrolleres typisk ved matriks diffusjon eller ved at den aktive bestanddel passerer gjennom en kontrollerende membran.

Mekaniske sider ved transdermale innretninger er velkjente innen faget og forklares for eksempel i U.S. patentskrifter nr. 5,162,037, 5,154,922, 5,135,480,4,666,441, 4,624,665,3,742,951,3,797,444,4,568,343, 5,064,654, 5,071,644,5,071,657. Ytterligere bakgrunnsmateriale tilveiebringes av europeisk patentskrift nr. 0279982 og britisk patentsøknad nr. 2185187.

Innretningen kan være enhver av de generelle typer som er kjent innen faget, innbefattet tilførselsinnretninger med klebrig matriks og av reservoartype. Innretningen kan omfatte medikamentholdige matrikser som inneholder fibre som absorberer den aktive bestanddel og/eller bærestoffet. I en inmetning av reservoartype kan reservoaret være definert av en polymermembran som er impermeabel for bærestoffet og den aktive bestanddel.

I en transdermal innretning opprettholder innretningen selv kontakt mellom den aktive bestanddel og det ønskede, lokaliserte hudområdet. I en slik innretning er viskositeten av bærestoffet for den aktive bestanddel av mindre betydning enn for en krem eller gel. Et løsemiddelsystem for en transdermal innretning kan for eksempel omfatte oljesyre, lineær alkohol-laktat og dipropylenglykol, eller andre løsemiddelsystemer som er kjent innen faget. Den aktive bestanddel kan være løst eller suspendert i bærestoffet.

For tilfesting til huden kan et transdermal plaster være montert på en kirurgisk klebetape med et hull i midten. Klebemidlet er fortrinnsvis dekket av et belegg for å beskytte det før anvendelse. Typiske materialer som er egnet for å fjernes omfatter polyetylen og polyetylenbelagt papir, og fortrinnsvis belagt med silikon for lett fjerning. For påføring av innretningen trekkes ganske enkelt belegget av, og klebemidlet festes til pasientens hud. I U.S. patentskrift nr. 5,135,480, beskriver Bannon et al., en alternativ innretning med ikke-klebrige midler for å feste innretningen til huden.

Det perkutane eller transmukosale tilførselssystem kan også anvendes som et nytt og forbedret tilførselssystem for forebyggelse og/eller behandling av osteoporose eller andre sykdommer som responderer fordelaktig på behandling med androgener og/eller østrogener.

En selektiv østrogenreseptormodulator kan ha en molekylformel med følgende egenskaper: a) to aromatiske ringer adskilt av 1 til 2 mellomliggende karbonatomer, hvor de to aromatiske ringer enten er ikke-substituert eller substituert med en hydroksylgruppe

eller en gruppe som konverteres in vivo til hydroksyl, og

b) en sidekjede som besitter en aromatisk ring og en tertiær aminfunksjon, eller et salt av denne.

En SERM kan være EM-800, beskrevet i PCT/CA96/00097 (WO 96/26201). Molekylstrukturen til EM-800 er:

En SERM ifølge oppfinnelsen er EM-01538:

EM-1538 (også betegnet EM-652.HC1) er hydrokloridsaltet av det kraftige antiøstrogen EM-652, sammenlignet med EM-800 er EM-1538 et enklere og lettere salt å syntetisere. Forbindelsen var også lett å isolere og rense, den kunne krystalliseres og viste god stabilitet i fast tilstand. Tilførsel av EM-800 og EM-1538 antas å føre til den samme aktive forbindelse in vivo.

Andre SERM kan omfatte Tamoxifen ((Z)-2-[4-(l,2-difenyl-l-butenyl)]-N,N-dimetyletanamin) (tilgjengelig fra Zeneca, UK), Toremifene (tilgjengelig fra Orion-Farmos Pharmaceuticla, Finland, eller Schering-Plough), Droloxifene og CP-336,156

(cis-lR-t^-pyrrolidmo-eto^

(D-(-)-tartrat-salt) (Pfizer Inc., USA), Raloxifene (Eli Lilly and Co., USA), LY 335563 og LY 353381 (Eli Lilly and Co., USA), Iodoxifene (SmithKlme Beecham, USA), Levormeloxifene (3,4-trans-2,2-dimetyl-3-fenyl-4-[4-(2-(2-(pyrrolidin-l - yl)etoksy)fenyl]-7-metoksykroman)(Novo Nordisk A/S, Danmark), som bekrives i Shalmi et al., WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; og Korsgaard et al., WO 97/25036), GW 5638 (beskrevet av Wilson et al., Endocrinology, 138(9), 3901-3911,1997) og indolderivater (beskrevet av Miller et al., EP 0802183A1) og TSE 424 utviklet av Wyeth Ayers (USA) og beskrevet i JP10036347 (American home products corporation) og ikke-steroide østrogenderivater beskrevet i WO 97/32837.

Enhver SERM, anvendt som påkrevet for effektivitet ifølge produsentens anbefalinger, kan anvendes. Egnede doser er kjent innen faget. Ethvert annet ikke-steroid antiøstrogen som er kommersielt tilgjengelig kan anvendes . Enhver forbindelse med en aktivitet som tilsvarer SERM (for eksempel Raloxifene kan anvendes).

SERM kan tilføres fortrinnsvis i et doseringsområde på mellom 0,01 til 10 mg/kg kroppsvekt pr. dag (mer foretrukket 0,05 til 1,0 mg/kg), hvor 5 mg pr. dag, mer foretrukket 10 mg pr. dag, i to like doser foretrekkes for en person med gjennomsnittlig kroppsvekt ved oral tilførsel, eller i et doseringsområde på mellom 0,003 og 3,0 mg/kg kroppsvekt pr. dag (fortrinnsvis 0,015 til 0,3 mg/ml), hvor 1,5 mg pr. dag, mer foretrukket 3,0 mg pr. dag, i to like doser foretrekkes for en person med gjennomsnittlig kroppsvekt ved parenteral tilførsel (dvs. intramuskulær, subkutan eller perkutan tilførsel). SERM tilføres fortrinnsvis sammen med et farmasøytisk aksepterbart fortynningsmiddel eller bærestoff, som beskrevet nedenfor.

Mulige bisfosfonater kan omfatteAlendronate [(4-amino-l-hydroksybutyliden)bis fosfonsyre dinatriumsalt, hydrat] tilgjengelig fra Merck Shape and Dohme under varemerket Fosamax, Etidronat [(l-hydroksyetyliden)bis fosfonsyre, 2,2'-iminobis etanol] tilgjengelig fra Procter og Gamble under varemerkene Didrocal, Clodronate [(diklormetylen)bis fosfonsyre, natriumsalt], tilgjengelig fra Rhone-Poulence Rorer under varemerket Bonefos eller tilgjengelig fra Boehringer Mannheim under varemerket Ostac og Pamidronate (3-amino-l-hydroksypropyliden)bis fosfonsyre, natriumsalt) tilgjengelig fra Geigy under varemerket Aredia. Risedronate (l-hydroksy-2-(3-pyridinyl)etyliden bisfosfonsyre mononatriumsalt) er under klinisk utprøving. Ethvert annet kommersielt tilgjengelig bisfosfonat kan også anvendes, alle ifølge produsentens anbefalte doseringer. Likeså kan kjønnssteroid forløpere anvendes i doser anbefalt ifølge teknikkens stand, fortrinnsvis i doser som gir nivåer i sirkulasjonen tilsvarende dem hos friske, 20-30 år gamle menn, eller hos premenopausale voksne kvinner.

Når det gjelder alle doseringer som anbefales heri bør den behandlende lege følge den enkelte pasients respons og justere dosen ut fra dette.

Under følger eksempler og referanseeksempler.

EKSEMPLER

Eksempel 1

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

Dyr

Sprague-Dawley-hunnrotter [Crl:CD(SD)Br] ble erholdt i en alder på 44-46 dager fra Charles River Canada Inc. (St. Constant, Quebec) og huset med 2 dyr i hvert bur i et miljø med kontrollert lys (12 timer lys/dag, lysene på kl. 07.15)- og temperatur (22 ± 2°C). Dyrene ble gitt Purina gnagerfor og springvann ad Ubitum. Dyreundersøkelsene ble utført i et laboratorium godkjent av Canadian Council on Animal Care (CCAC) i samsvar med CCAC Guide for Care and Use of Experimental Animals.

Induksjon av brysttumorer med DMBA

Brystkarsinomer ble indusert med en enkelt intragastrisk tilførsel av 20 mg DMBA (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) i 1 ml maisolje i 50-52 dager gamle dyr. To måneder senere ble måling av tumorer utført to ganger i uken. De to største perpendikulære diametre av hver tumor ble målt med passere for estimering av tumor-størrelsen som beskrevet (Asselin et al., Endocrinology 101:666-671, 1977). Tumorsetet, tumorstørrelsen og tumortallet ble notert.

Behandling

Dyrene ble tilfeldig fordelt i grupper som hver omfattet 20 rotter, bortsett fra at kontrollgruppen omfattet 40 dyr. Dyrene ble behandlet i 282 dager med følgende: 1) kontrollbærestoff, både for DHEA og EM-800; 2) EM-800((+)-7-pivaloyloksy-3-(4'-pivaloyloksyfenyl)-4-metyl-(4"-('"-piperidmoetoksy)fenyl)-2H-benzypyran) (75 u,g, oralt, en gang daglig) i 0,5 ml suspensjon i 4% etanol, 4% polyetylenglykol-600,1% gelatin, 0,9% NaCl; 3) DHEA (10 mg, perkutant, en gang daglig) i 0,5 ml 50% etanol, 50% propylenglykol; og

4) både EM-800 og DHEA.

Behandlingen ble innledet 3 dager før oral tilførsel av DMBA. EM-800 ble syntetisert i vårt laboratoriums medisinsk-kjemiske avdeling, mens DHEA ble erholdt fra Steraloids Inc., Wilton, NH.

Mange av kontrolldyrene og noen av de EM-800 og DHEA-behandlede dyr ble avlivet ved serviks dislokasjon under isofuran-indusert anestesi 6 måneder etter tilførsel av DMBA grunnet at tumorene var for store. Verdiene for tumorstørrelse og tumorantall hos disse rotter ved avlivningen, sammen med verdiene målt på senere tidspunkt hos de overlevende dyr, ble anvendt for den påfølgende analyse av tumorhyppighet, gjennomsnittlig tumortall pr. tumorbærende rotte og gjennomsnittlig tumorstørrelse pr. tumorbærende dyr. De gjenværende dyr (9 rotter fra kontrollgruppen og 13-19 rotter fra hver av de andre gruppene) ble fortsatt gitt behandling i ytterligere 3 måneder for å observere den beskyttende langtidsvirkning av DHEA og EM-800, hver for seg eller i kombinasjon. Rottene ble avlivet 279 dager etter tilførsel av DMBA. Uterus, vagina og ovarier ble umiddelbart fjernet, befridd for bindevev og fettvev og veid.

Prøveoppsamling og prøvebehandling

Tjuefire timers urinprøver ble oppsamlet ved eksperiementets avslutning fra de første ni rotter i hver grupper etter overføring til metabolske bur (Allentown Caging Equipment Co., Allentown, NJ). To urinprøver ble oppsamlet og analysert på forskjellig dager for hvert dyr for å minimalisere påvirkningen grunnet daglig variasjon. Hver verdi som vises representerer derfor middelverdien av de to målingene, utført på to forskjellige dager. 0,5 ml toluen ble tilsatt til urinoppsamlingsrørene for å forhindre fordampning av urinen og bakterievekst, og urinvolumet ble notert. Kroppsblod ble oppsamlet ved avUvning og fikk koagulere ved 4°C over natten før sentrifugering ved 3000 rpm i 30 minutter.

Analyse av biokjemiske parametre i urin og serum

Friske prøver ble anvendt for analyse av kreatinin, kalsium og fosfor i urinen, så vel som total alkalisk fosfatase (tALP)-aktivitet, kolesterol og triglyserider i serum. Disse biokjemiske parametre ble målt automatisk med et Monarch 2000 kjemisystem (Instrumentation Laboratory Co. Lexington, MA) under Good Laboratory Practice-betingelser. Hydroksyprolin i urinen ble målt som beskrevet (Podenphant et al., ClimcaChimica Acta 142:145-148,1984).

Måling av beinmasse

Rottene ble bedøvet med en intraperitoneal injeksjon av ketamin-hydroklorid og diazepam i doser på 50 henholdsvis 4 mg/kg kroppsvekt. Hele skjelettet og høyre fremur ble scannet ved anvendelse av dobbelenergi-røntgen absorbsjonmetri (DEXA; QDR 2000-7,10C, Hologic, Waltham, MA) utstyrt med Regional High Resolution programvare. Scanfeltstørrelsen var 28,110 x 17,805 cm og 5,0 x 1,902 cm, resolusjonen var 0,1511 x 0,0761 cm og 0,0254 x 0,0127 cm, mens scannings-hastigheten var 0,3608 og 0,0956 med mer/sek. for det totale skjelettet henholdsvis femur. Både beinmineralinnhold (BMC) og beinmineraltetthet (BMD) for totalt skjelett, lumbar ryggrad og femur ble målt på de scannede bilder av totalt skjelett og femur.

Statistisk analyse

Statistisk signifikans ble målt ifølge flerområdeanalysen til Duncan-Kramer (Biometrics 12:307-310,1956). Analyse av forekomst av utvikling av brysttumorer ble utført ved anvendelse av Fisher's eksakte analyse (Conover, Practical nonparametric statistics, 2. utgave 153-170, 1980). Verdiene er gitt som middelverdi ± S.E.M.

RESULTATER

Virkning på utvikling av DMBA- indusert brystkarsinom

Som vist i figur 1 hadde 95% av kontrolldyrene utviklet palpable biysttumorer 279 dager etter DMBA-tilførsel. Behandling med DHEA eller EM-800 forhindret delvis utvikling av DMBA-indusert brystkarsinom, og hyppigheten ble således redusert til 57% (p<0,01) henholdsvis 38% (p<0,01). Det er av interesse at kombinasjonen av de to forbindelser ga en signifikant høyere inhiberende virkning enn hva som ble oppnådd ved hver forbindelse alene (p<0,01 sammenlignet med DHEA eller EM-800 hver for seg). Faktisk forsvant de to eneste tumorer som ble utviklet i dyregruppen som ble behandlet med begge forbindelser før eksperimentets avslutning.

Behandling med DHEA eller EM-800 reduserte det gjennomsnittlige tumortall pr. tumorbærende dyr fra 4,7 ± 0,5 tumorer hos kontrolldyrene til 3,4 ± 0,7 (ikke signifikant) henholdsvis 1,4 ± 0,3 (p<0,01) tumorer/dyr, mens ingen tumorer ble funnet ved eksperimentets avslutning hos dyr som ble gitt begge medikamenter (p<0,01 ved sammenligning ved de tre andre gruppen) (Fig. 2A). En av de to tumorer som senere forsvant forelå fra dag 79 til dag 201 etter DMBA-tilførsel, mens den andre tumor var palpabel fra dag 176 til dag 257. Det kan sees i fig. 2B at DHEA eller EM-800 hver for seg reduserte det gjennomsnittlige tumoareal pr. tumorbærende dyr fra 12,8 ±1,3 m<2>ved eksperimentets avslutning til 10,2 ± 2,1 cm<2>(ikke signifikant) henholdsvis 7,7 ± 1,8 cm<2>(ikke signifikant), mens kombmasjonsbehmdlingen førte til verdien null (p<0,01 sammenlignet med de tre andre gruppene). De to tumorene som oppsto i gruppen av dyr behandlet med både DHEA og EM-800 ble ikke større enn 1 can2. Det bør nevnes at de reelle verdier for gjennomsnittlig tumorareal så vel som gjennomsnittlig tumortall pr. tumorbærende dyr i kontrollgruppen skulle vært høyere enn verdiene som gis i figur 2, siden mange rotter måtte avlives før eksperimentets avslutning grunne for store tumorer. Verdiene målt på avlivningstidspunktet inngikk således som sådanne i beregningene som ble gjort ved senere tidspunkt for å minimalisere en skjevfordeling i kontrollgruppen, som i alle fall forble signifikant høyere enn de andre grupper.

Vfrkning på bein

Perkutan tilførsel over lang tid av DHEA til hunnrotter induserte 6,9% (p<0,01), 10,6%

(p<0,05), og 8,2% (p<0,01) ølminger i beinmineraltettheten (BMD) i totalskjelettet, lumbal ryggrad henholdsvis femur (tabell 2). Derimot ble ingen signifikant endring funnet hos dyrene behandlet med EM-800. Når begge forbindelser ble tilført samtidig var videre de erholdte verdier sammenlignbare med hva som ble oppnådd med DHEA alene.

Behandling med DHEA ga en økning i den totale alkaliske fosfatase (tALP)-aktivitet i serum med 74% (p<0,05), men hadde ingen virkning på daglig utskillelse av kalsium og fosfor i urinen og på forholdet mellom hydroksyprolin og kreatinin i urinen (tabell 3). Derimot førte behandling med EM-800 til en reduksjon av hydroksyprolin/kreatinin-forholdet i urinen med 48% (p<0,01), men hadde ingen statistisk signifikant virkning på daglig utskillelse av kalsium eller fosfor i urinen og serum-tALP-aktiviteten. Kombinasjonen av DHEA og EM-800 førte til en økning av serum-tALP-aktiviteten (p<0,01) som tilsvarte den oppnådd med DHEA alene og reduserte forholdet mellom hydroksyprolin og kreatinin i urinen med 69%, en verdi som er signifikant (p<0.01) laver enn hva som ble oppnådd med EM-800 alene. I tillegg reduserte kombinasjonen av de to medikamenter signifikant den daglige utskillelse av kalsium og fosfor i urinen med 84% (p<0,01), mens ingen signifikant endring ble observert med de to medikamenter hver for seg (tabell 3).

Virknirig på serumlipidnivå

Behandling over lang tid med EM-800 reduserte nivået av triglyserid og kolesterol i serum med 72% (p<0,01) henholdsvis 45% (p<0,01), mens tilførsel over lang tid av

DHEA reduserte triglyseridnivået i serum med 60% (p<0,01), mens kolesterol-nivået i serum forble upåvirket. Videre ble reduksjonen på 42% (p<0,01) og 52% (p<0,01) av serumkonsentrasjonen av triglyserid og kolesterol målt i dyrene som ble behandlet med både EM-800 og DHEA (figur 3).

Tabell 2

Virkning av behandling med DHEA (10 mg perkutant, en gang daglig) eller EM-800 (75 u,g, oralt, en gang daglig), hver for seg eller i kombinasjon, i 9 måneder på beinmmeraltetthet (BMD) i femur, lumbal ryggrad og total skjelett hos hunnrotte. Målingene ble utført i 9 rotter pr. gruppe. p0,05;** p<0,01, eksperimentell gruppe sammenhgnet med kontrollgruppen.

Tabell 3

Virkning av behandling med DHEA (10 mg perkutant, en gang daglig) eller EM-800 (75 ug, oralt, en gang daglig), hver for seg eller i kombinasjon, i 9 måneder på parametere for beinmetabolismen: Daglig utskillelse av kalsium og fosfor i urinen, forholdet mellom hydroksyprolin og kreatinin i urinen (HP/Cr) og total alkalisk fosfataseaktivitet i serum (tALP). Provene ble oppsamlet fra 9 dyr pr. gruppe. p0,05;<**>p<0,01, for eksperimentell gruppe sammenlignet med kontrollgruppen.

Eksempel 2

SAMMENDRAG

I brystkjertel dannes androgener fra forløpersteroidet dehydroepiandrosteron (DHEA). Klinisk materiale tyder på at androgener har inhiberende vhkninger på brystcancer. På den andre side stimulerer østrogener utvikling og vekst av brystcancer. Vi undersøkte virkningen av DHEA alene eller i kombinasjon med det nylig beskrevne, rene antiøstrogen EM-800 på vekst av tumor-xenotransplantater av den humane brystcancer-cellelinje ZR-75-1 i ovariektomiserte nalene mus.

Musene ble gitt daglige subkutane injeksjoner med 0,5 ug østron (et østrogent hormon) umiddelbart etter ovariektomien. EM-800 (15, 50 eller 100 u.g) ble gitt oralt en gang daglig. DHEA ble tilført to ganger daglig (total dose 0,3,1,0 eller 3,0 mg) til dorsal hud, enten alene eller i kombinasjon med en daglig oral dose på 15 jig EM-800. Endringer i tumorstørrelse som respons på behandlingen ble anslått regelmessig, relativ til målingene som ble gjort på den første dag. Ved eksperimentenes avslutning ble tumorene utdissikert og veid.

En 9,4 gangers økning i tumorstørrelsen på 9,5 måneder ble observert i ovariektomiserte mus som ble gitt østron alene, sammenlignet med mus som ikke ble gitt østron. Tilførsel av 15, 50 eller 100 u,g EM-800 til ovariektomiserte mus tilført østron førte til inhibering på 88%, 93% henholdsvis 94% av tumorstørrelsen. DHEA i doser på 0,3, 1,0 eller 3,0 mg inhiberte på sin side den endelige tumorvekt med 67%, 82% henholdsvis 85%. Tilsvarende inhibering av tumorstørrelsen ble erholdt med en daglig oral dose på 15 fig EM-800, med eller uten forskjellige doser perkutan DHEA. DHEA og EM-800 undertrykket hver for seg veksten av østron-stimulerte ZR-75-1-xenotransplantatrumorer i nakne mus. Tilførsel av DHEA i de angitte doser endrer ikke den inhiberende virkning av EM-800.

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

ZR- 75- 1- celler

De humane brystcancerceller ZR-75-1 ble erholdt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) og rutinemessig dyrket som encellelag i RPMI 1640-medium tilsatt 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat.lOO IU penisillin/ml, 100 u,g streptomysin/ml og 10% føtalt bovint serum i en fuktgjort atmosfære med 95% luft/5% C02ved 37°C som beskrevet (Poulin og Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937,1986; Poulin et al, Breast Cancer Res. Treat. 12: 213-225, 1988). Cellene ble omsådd ukentlig etter behandling med 0,05% trypsin:0,02% EDTA (vekt/vol.) Cellekulturene som ble anvendt for eksperimentene beskrevet i denne rapport var avledet fra passasje 93 av cellelinjen ZR-75-1.

Dyr

Homozygote (nu/nu) atymiske Harlan Sprague-Dawley hunnmus (28 til 42 dager gamle) ble erholdt fra HSD (Indianapolis, Indiana, USA). Musene ble huset i vinylbur med luftfiltertopp i sterilbenker med laminær luftgjennornstrømning og opprettholdt under patogenbegrensede betingelser. Bur, sengematerialer og for ble autoklavert før anvendelse. Vann ble autoklavert, surgjort til pH 2,8 og tilført ad libitum.

Celleinokulering

Musene ble bilateralt ovariektomisert (OVX) en uke før tumorcelleinokulering under anestesi oppnådd ved en intraperitoneal injeksjon på 0,25 ml/dyr av Avertin (amyl-alkohol: 0,8 g/100 ml 0,9% NaCl; og tribrometanol: 2 g/100 ml 0,9% NaCl). 1,5 x IO<6>ZR-75-1 celler i logaritmisk vekstfase ble høstet etter behandhng av encellelaget med

0,05% trypsin/0,01% EDTA (vekt/vol.) ble suspendert i 0,1 ml dyrkingsmedium tilsatt 25% Matrigel og ble inokulert subkutant i begge flanker hos dyrene ved anvendelse av en 1 tomme lang 20-gauge kanyler som beskrevet tidligere (Dauvois et al., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). For å fremme vekst av tumorene ble hvert dyr gitt en daglig subkutan injeksjon av 10 ug estradiol (E2) i et bærestoff bestående av 0,9% NaCl 5% etanol 1% gelatin i 5 uker. Etter at palpable ZR-75-l-tumorer oppsto ble tumor-

diameteren målt med passer, og mus med tumordiameter på mellom 0,2 og 0,7 cm ble utvalgt for denne undersøkelsen.

Hormonbehandling

Alle dyr bortsett fra dyrene i kontroll-OVX-gruppen ble gitt daglige subkutane injeksjoner av 0,5 u,g østron (Ei) i 0,2 ml 0,9% NaCl 5% etanol 1% gelatin. I de angitte grupper ble DHEA tilført perkutant to ganger daglig i doser på 0,3,1,0 eller 3,0 mg/dyr, tilført i et volum på 0,02 ml til det dorsale hudområdet utenfor tumorvekstområdet. DHEA ble løst i 50% etanol 50% propylenglykol. EM-800 ((+)-7-pivaloyloksy-3-(4'-pivaloyloksyfenyl)-4-metyl-2-(4"-(2"'-piperid^ synstetisert som beskrevet tidligere (Gauthier et al., J. Med. Chem. 40:2117-2122, 1997) i avdelingen for medisinsk kjemi ved Laboratory of Molecular Endocrinology ved CHUL Research Center. EM-800 ble løst i 4% (vol/vol) etanol (4% vol/vol) polyetylenglykol (PEG) 600 1% (vekt/vol) gelatin 0,9% (vekt/vol) NaCl. Dyrene i de angitte grupper ble gitt daglige orale doser på 15 50 u,g eller 100 ug EM-800 alene eller i kombinasjon med DHEA, mens dyrene i OVX-gruppen ble gitt bærestoff (0,2 ml 4% etanol 4% PEG 600 1% gelatin 0,9% NaCl) alene. Tumorene ble målt en gang i uken med Verner-passere. To perpendikulære diametere ble målt i cm (L og W), og tumorarealet (cm<2>) ble beregnet ved anvendelse av formelen L/2xW/2 x ti (Dauvois et al., Cancer Res. 51: 3131-3135,1991). Området som ble målt på behandlingens første dag ble satt til 100%, og endringer i tumorstørrelse ble uttrykt som prosent av det opprinnelige tumorareal. For subkutane tumorer generelt er det ikke mulig å anslå det tredimensjonale tumorvolum nøyaktig, derfor ble bare tumorarealene målt. Etter behandling i 295 dager (eller 9,5 måneder) ble dyrene avlivet.

Responskategoriene ble evaluert som beskrevet (Dauvois et al., Breast Cancer Res. Treat. 14:299-306, 1989; Davois et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25:891-897, 1989; Labrie et al., Breast Cancer Res. Treatment 33:237-244, 1995). Kort fortalt tilsvarer partiell regresjon tumorene som hadde en regresjon som var lik eller større enn 50% av den opprinnelige størrelse, stabil respons viser til tumorer som hadde en regresjon som var mindre enn 50% av den opprinnelige størrelse eller som utviklet seg videre med mindre enn 50% av den opprinnelige størrelse, mens fullstendig regresjon viser til de tumorer som ikke kunne påvises ved behandlingens avslutning. Progresjon viser til tumorer som utviklet seg med mer enn 50%, sammenlignet med den opprinnelige størrelse. Ved eksperimentets avslutning ble alle dyr drept ved halshugning. Tumorer, uterus og vagina ble umiddelbart tatt ut, befridd for bindevev og settevev og veid.

Statistisk analyse

Den statistiske signifikans av virkningene av disse behandlinger på tumorstørrelsen ble vurdert ved å anvende en variansanalyse (ANOVA) som evalurte virkningene grunnet DHEA, EM-800 og tid, og gjentatte målinger i de samme dyr utført ved behandlingens innledning og avslutning (individer i gruppen-faktor). De gjentatte målingene ved tid 0 og etter 9,5 måneders behandling utgjør randomiserte blokker av dyr. Tiden analyseres således som en innen blokken-vhkning, mens de to behandlinger anslås som virkninger mellom blokker. Alle inter aksjoner mellom hovedvirkningene inngikk i modellene. Signifikansen av behandlingsfaktorene og deres interaksjoner ble analysert ved å anvende individene innenfor gruppen som feilfaktoren. Resultatene ble logaritmisk transformert. Hypotesene som lå under ANOVA antok normalitet av restverdiene og homogen varians.

A posteriori parvise sammenligninger ble utført ved anvendelse av Fisher's analyse for minste signifikante forskjell. Hovedvirkningene og interaksjonen mellom behandlingene og kroppsvekt og organvekt ble analysert ved anvendelse av en standard toveis ANOVA med interaksjoner. Alle ANOVA ble utført ved anvendelse av programmet SAS (SAS Institute, Cary, NC, USA). Signifikansen mellom forskjeller ble beregnet ved en to-halet analyse med et totalnivå på 5%.

Kategoriske resultater ble analysert med en Kruskall-Walhs-analyse for ordnede, kategoriske responsvariabler (fullstendig respons, delvis respons, stabil respons og tumoprogresjon). Etter totalanslag av en behandlm<g>svirlaiinger ble undergrupper av resultatene presentert i tabell 4 analysert ved å justere den kritiske p-verdi for multiple sammenhgninger. De nøyaktige p-verdier ble beregnet ved anvendelse av programmet StatXact (Cytel, Cambridge, MA, USA).

Resultatene er gitt som middelverdi ± standardfeil av middelverdien (SEM) for 12 til 15 mus i hver gruppe.

RESULTATER

Som vist i figur 4A økte de humane ZR-75-1-tumorene 9,4 ganger over et tidsrom på 291 dager (9,5 måneder) hos ovariektomiserte nalene mus behandlet med en daglig, subkutant tilført dose på 0,5 u,g østron, mens tumorstørrelsen hos kontroll-OVX-mus som kun ble tilført bærestoff ble redusert til 36,9% av den opprinnelige størrelse under forløpet av forsøket.

Behandling med økende doser perkutan DHEA ga en progressiv inhibering av Ep stimulert ZR-75-l-tumorvekst. Inhibering på 50,4%, 76,8% og 80,0% ble oppnådd eter 9,5 måneders behandling med daglige DHEA-doser på 0,3 mg, 1,0 mg henholdsvis 3,0 mg pr. dyr (figur 4A). I overensstemmelse med reduksjonen i den totale tumor-belastning førte behandling med DHEA til en markant reduksjon av gjennomsnitts-vekten av tumorene som fortsatt var tilstede ved eksperimentets avslutning. Faktisk ble den gjennomsnittlige tumorvekt redusert fra 1,12 ± 0,26 g i kontrollgruppen bestående av Ei-tilførte, ovariektomiserte nakne mus til 0,37 ± 0,12 g (P = .005), 0,20 ± 0,06 (P = .001) og 0,17 ± 0,06 g (P = .0009) i dyregruppene som ble gitt daglige DHEA-doser på 0,3,1,0 henholdsvis 3,0 mg (figur 4B).

I daglige doser på 15 u,g, 50 u,g og 100 ug inhiberte antiøstrogenet EM-800 den østrogenstimulerte tumorstørrelse med 87,5% (P<.0001), 93,5% (P<.001), henholdsvis 94,0% (P=.O003) (figur 5 A), ved sammenligning med tumorstørrelsen hos kontrolldyr etter 9,5 måneder.

Tumorstørrelsesreduksjonen som ble oppnådd med de tre EM-800-dosene er ikke signifikant forskjellige fra hverandre. Som vist i figur 4B var tumorvekten etter de 9,5 månedene redusert fra 1,12 ± 0,26 g i kontrollgruppen med Ei-tilførte OVX-mus til 0,08 ± 0,03 g, 0,03 ± 0,01 g og 0,04 ± 0,03 g hos dyr behandlet med daglige EM-800-doser på 15 ug, 50 ug henholdsvis 100 u.g (P=.0001 for alle EM-800-doser sammenlignet med Ei-tilført OVX).

Som nevnt ovenfor ga antiøstrogenet EM-800 i en daglig oral dose på 15 u,g 87,5% inhibering av den østronstimulerte tumorvekst, målt etter 9,5 måneder. Tilsetning av DHEA i de tre anvendte doser hadde ingen signifikant vhlening på den allerede markante inhibering av tumorstørrelsen som ble oppnådd med den daglige dose på 15 u,g av antiøstrogenet EM-800 (figur 5B). Den gjennomsnittlige tumorvekst ble således dramatisk redusert fra 1,12 ± 0,26 i kontrollgruppen med østrontilførte mus til 0,08 ± 0,03 g (P<.0001), 0,11 ± 0,04 g (P=.0002), 0.13 ± 0,07 g (P=.0004) og 0.08 ± 0,05 g (P<.0001) hos dyrene ble gitt den daglige dose på 15 u,g av antiøstrogenet alene eller i kombinasjon med DHEA-doser på 0,3,1,0 henholdsvis 3,0 mg (ingen signifikant forskjell ble observert mellom de 4 gruppene) (figur 4B).

Det var også av interesse å undersøke responskategoriene som ble oppnådd ved behandlingsformene angitt ovenfor. Således reduserte behandling med økende doser

DHEA, om enn ikke til et statistisk signifikant nivå (P=.088), antall tumorer i progresjon fra 87,5% i kontrollgruppen med OVX-dyr tilført østron til verdier på 50,0%, 53,3% og 66,7% hos dyrene som ble behandlet med daglige doser med 0,3,1,0 henholdsvis 3,0 mg DHEA (tabell 4). Fullstendige responser økte derimot fra 0% hos de østrcm-tilførte mus til 28,6%, 26,7% og 20,0% hos dyrene som ble gitt daglige doser med perkutan DHEA på 0,3,1,0, henholdsvis 3,0 mg. Stabile responser ble derimot målt til 12,5%, 21,4%, 20,0% og 13,3% i kontrollgruppen med Ei-tilførte mus og i de tre dyregruppene som ble gitt de ovenforangitte DHEA-doser. I kontrollgruppen med ovariektomiserte mus ble frekvensen av fullstendig, partiell og stabil respons målt til 68,8%, 6,2% henholdsvis 18,8%, mens progresjon kun ble sett for 6,2% av tumorene (tabell 4).

Fullstendig respons eller forsvinning av tumorene ble oppnådd for 29,4%, 33,3%, 26,7% og 35,3% av tumorene hos dyr som ble gitt antiøstrogenet EM-800 (P=.0006) alene (15 u-g) eller i kombinasjon med 0,3 mg, 1,0 mg henholdsvis 3,0 mg DHEA (tabell 4). Progresjon ble derimot observert for 35,3%, 44,4%, 53,3% henholdsvis 17,6% av tumorene i de samme dyregrupper. Det er ingen signifikant forskjell mellom gruppene behandlet med EM-800, enten alene eller i kombinasjon med DHEA.

Ingen signifikant virkning av DHEA- eller EM-800-behandling ble observert på kroppsvekt justert for tumorvekt. Behandling av OVX-mus med østron ga en økning av uterusvekten fra 28 ± 5 mg for OVX-kontrollmus til 132 ± 8 mg (P<.01), mens økende doser av DHEA ga en økende, men relativt liten mhibering av den stimulerende virkning av østron som nådde 26% (P=.0008) for den høyeste DHEA-dose som ble anvendt. Det kan ses fra den samme figur at østronstimulert uterusvekt ble redusert fra 132 ± 8 mg i kontrollgruppen med østrontilførte mus til 49 ± 3 mg, 36 ± 2 mg og 32 ± 1 mg (P<.0001 for alle doser sammenlignet med kontrollgruppen) for daglige orale doser med 15 ut, 50 p.g henholdsvis 100 ug EM-800 (totalt P<.0001). Femten mikrogram 15 u,g EM-800 i kombinasjon med daglige DHEA-doser på 0,3 mg, 1,0 mg eller 3,0 mg ga en uterusvekt på 46 ± 3 mg, 59 ± 5 mg henholdsvis 69 ± 3 mg.

Behandling med østron ga derimot forhøyet vaginavekt fra 14 ± 2 mg hos OVX-dyr til 31 ± 2 mg (P<.01), mens tilsetning av DHEA ikke hadde signifikant virkning. Vaginavekten ble så redusert til 23 ± 1 mg, 15 ± 1 mg og 11 ± 1 mg etter behandling med daglige EM-800-doser på 15 ug, 50 ug henholdsvis 100 ug (total p og parvis P<.0001 for alle doser sammenlignet med kontroll). For kombinasjonen av DHEA-doser på 0,3 mg, 1,0 mg eller 3,0 mg og EM-800 ble vaginavekten målt til 22 ± 1 mg, 25 ± 2 mg henholdsvis 23 ± 1 mg (ikke signifikant for alle grupper sammenlignet med gruppen som fikk 15 jig EM-800). Det bør nevnes at EM-800 i den høyeste anvendte dose, nemlig 100 u,g daglig, ga en reduksjon av uterusvekten hos østrontilførte OVX-dyr til en verdi som ikke var forskjellig fra verdien for OVX-kontrolldyr, mens vaginavekten ble redusert til en verdi som var lavere enn den målt hos OVX-kontrolldyr (P<.05). DHEA motvirket delvis virkningen av EM-800 på vekt av uterus og vagina, trolig grunnet sine androgene virkninger.

Eksempel 3

Virkning av den foretrukne forbindelse ifølge oppfinnelsen på kolesterolnivå hos ovariektomiserte hunnrotter

Dyr og behandling

Femti til seksti dager gamle Sprague-Dawley-hunnrotter (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, StConstant, Canada) med kroppsvekt tilnærmet 190 g på ovariektomi-tidspunktet ble anvendt. Dyrene ble akklimatisert til betingelsene i dyre-stammen (temperatur 22 ± 3°C, luftfuktighet: 50 ± 20%; sykluser med 12 timer lys og 12 timer mørke, lyset på kl. 07.15) i en uke før det kirurgiske inngrep. Dyrene ble huset med tre dyr pr. bur og fikk fri tilgang på springvann og pelletert, godkjent gnagerfor (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St. Louis, MO). Eksperimentet ble utført i et laboratorium godkjent av Canadian Council on Animal Care i samsvar med CCAC Guide for Care and Use of Experimental Animals.

Etthundreogtrettiseks hunnrotter ble ovariektomisert under anestesi med Isoflurane på undersøkelsens dag 0, og ble tilfeldig fordelt på 17 grupper for utførelse av undersøkelsen skissert nedenfor:

Behandlingen startet på dag 10 av undersøkelsen og ble gitt ved oral gavage en gang daglig inntil undersøkelsens dag 13. Dosesuspensjoner ble fremstilt i 0,4% metyl-cellulose og konsentrasjonen ble justert ut fra den gjennomsnittlige kroppsvekt i gruppen, notert på undersøkelsens dag 10, for å gi 0,5 ml doseringssuspensjon pr. rotte. Tilnærmet 24 timer etter siste dose ble dyrene etter faste over natten drept ved tapping av blod fra aorta i bukhulen under anestesi med isoflurane, og blodprøvene ble prosessert for serumfremstilling. Uterus ble fjernet, befridd for gjenværende fett og veid.

Analyse av kolesterol og triglyserid i serum

Totalnivået av kolesterol og triglyserid i serum ble bestemt ved anvendelse av Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems).

Eksempel 4

Androsten-3B,17J3-diol (5-diol) besitter iboende østrogenaktivitet. Som en kjønnssteroid forløper kan forbindelsen i tillegg omdannes til aktive androgener og/eller andre østrogener i perifert intrakrint vev. For å anslå den relative betydning av de androgene og østrogene bestanddeler av vklmingen av 5-diol på beinmassen ble 21 uker gamle rotter ovariektomisert og behandlet perkutant en gang daglig med 2, 5 eller 12,5 mg 5-diol alene eller i kombinasjon med antiandrogenet Flutamide (FLU, 10 mg, en gang daglig), og/eller antiøstrogenet EM-800 (100 u,g, subkutant, en gang daglig) i 12 måneder. Beinmineraltettheten (BMD) ble målt etter 11 måneders behandling. Ovariektomi (OVX) førte til en reduksjon på 12,8% av BMD i femur (p<0,01), mens behandling med den høyeste 5-diol-dose førte til gjenvinning av 34,3% av BMD i femur tapt i løpet av de 11 månedene etter OVX (p<0,01). Samtidig tilførsel av FLU forhindret fullstendig den stimulerende vhlming av 5-diol på BMD i femur, mens tilsetning av EM-800 førte til ytterligere 28,4% stimulering, sammenlignet med virkningen av 5-diol alene. Samtidig tilførsel av 5-diol, FLU og EM-800 ga samme virkning som EM-800 (27%), siden virkningen av 5-diol ble fullstendig blokkert av FLU. Tilsvarende resultater ble erholdt for BMD i lumbal ryggrad, selv om BMD i lumbal ryggrad hos OVX-rotter som ble gitt 12,4 mg 5-diol alene, 12,5 mg 5-diol + EM-800 eller 5-diol + FLU + EM-800 ble restaurert til verdier som ikke var signifikant forskjellige fra verdiene for intakte dyr. Histomorfometrisk analyse viste at de stimulerende virkninger av 5-diol på beinvolum, trabekeltall og den inhiberende virkning på trabekelseparasjonen i sekundær spongjosa i metafyseområdet i den proksimale tibia oppheves av FLU, men forsterkes ytterligere av EM-800. Den markante stimulering av alkalisk fosfatase-aktivitet i serum erholdt etter behandling med 5-diol er 57% (p<0,01 sammenlignet med 12,5 mg 5-diol alene) ble reversert ved samtidig tilførsel av FLU. Behandling med 5-diol hadde ingen statistisk signifikant inhiberende virkning på forholdet mellom kalsium og kreatinin i urinen. Den høyeste 5-diol-dose ga en signifikant reduksjon på 23% (p<0,01) av kolesterol i serum, mens tilsetning av EM-800 reduserte serum kolesterol med 62% (p<0,01).

De foreliggende resultater viser tydelig den stimulerende virkning av 5-diol på beindannelse og tyder på at selv om 5-diol er et svakt østrogen formidles den stimulerende virkning av forbindelsen på beindannelse hovedsakelig med en androgen virkning. Videre viser den additive stimulerende virkning av EM-800 og 5-diol på beinmassen den beinsparende virkning av antiøstrogenet EM-800 i rotte. Den kolesterolreduserende aktivitet av både 5-diol og EM-800 kunne være interessant å anvende for å forebygge hjerte-karsykdommer.

Eksempel 6

Eksempel på syntese av den foretrukne forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Syntese av (S)-(+)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenyl)-4-metyl-2-(4"-(2"-piperidmoetoksy)fenyl)-2H4-benzopyranhydrokloridEM-01538 (EM-652, HC1)

Trinn A- BF3-Et20, toluen; 100°C; 1 time

Trinn C: 3,4-dihydropyran, p-toluensulfonsyre-monohydrat, etylacetat; 25°C under nitrogen, 16 timer, og deretter krystallisasjon fra isopropanol.

Trinnene D. E og F:

(1) piperidin, toluen, Dean & Stark-apparat refluks under nitrogen; (2) l,8-diazabisyklo[5,4,0]undec-7-en, DMF, refluks 3 timer;

(3) CH3MgCl, THF, -20 til 0°C og deretter romtemperatur i 24 timer.

Trinnene G. H:

(lS)-(+)-10-kamfersulfonsyre, aceton, vann, toluen, romtemperatur, 48 timer.

Trinn HH:

95% etanol, 70°C, deretter romtemperatur i 3 dager.

Trinn HHR:

Resyklering av moderlut og vask av trinn HH

(S)-lO-kamfersulfonsyre, refluksering i 36 timer og så romtemperatur i 16 timer.

Trinn I:

(1) DMF, vandig, Na2C03, etylacetat;

(2) etanol, diluteHCl

(3) vann

Syntese av 2-tetrahydropyranyloksy-4-hydroksy-2'-(4"-tetrahydrpyranyloksy-fenyl)actofenon (4).

En suspensjon på 2,4-dihydroksy-2<*->(4"-liydroksyfenyl)acetofenon 3 (97,6 g, 0,4 mol)

(tilgjengelig fra Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) i 3,4-dihydropyran (218 ml, 3,39 mol) og etylacetat (520 ml) ble behandlet med p-toluensulfonsyre-monohydrat (0,03 g, 0,158 mmol) ved tilnærmet 25°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt under nitrogen uten ytre oppvarming i tilnærmet 16 timer. Blandingen ble så vasket med en løsning av natriumbikarbonat (1 g) og natriumklorid (5 g) i vann (100 ml). Fasene ble skilt fra hverandre og den organiske fase vasket med saltlake (20 ml). Hver vask ble tilbakeekstrahert med 50 ml etyl acetat. Alle de organiske faser ble slått sammen og filtrert gjennom natriumsulfat.

Løsemiddel (ca. 600 ml) ble fjernet ved destillasjon ved atmosfærisk trykk, og isopropanol (250 ml) ble tilsatt. Ytterligere løsemiddel (ca. 300 ml) ble avdestillert ved atmosfærisk trykk, og isopropanol (250 ml) ble tilsatt. Ytterligere løsemiddel (ca. 275 ml) ble avdestillert ved atmosfærisk trykk, og isopropanol (250 ml) ble tilsatt. Løsningen ble avkjølt til tilnærmet 25°C under omrøring, og etter tilnærmet 12 timer ble det krystallinske faste stoff fraifltrert, vasket med isopropanol og tørket (116,5 g, 70%). Syntese av 4-hydroksy-4-metyl-2-(4' - [2"-piperidino] -etoksy)fenyI-3-(4" tetrahydropyranyIoksy)fenyl-7-tetrahydropyranyloksy-kroman (10).

En løsning av 2-tetrahydropyranyloksy-4-hydrokosy-2'-(4"-tetrahydropyranyloksy-fenyl)acetofenon 4 (1 kg, 2,42 mol), 4-[2-(l-piperidino)-etoksy]benzaldehyd 5 (594 g, 2,55 mol) (tilgjengelig fra Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansa) og piperidin (82,4 g, 0,97 mol) (tilgjengelig fra Aldrich Chemical Company Inc., Milvaukee, Wis.) i toluen (8 1) ble refluksert under nitrogen i et Dean & Stark-apparat inntil en ekvivalent vann (44 ml) var oppsamlet.

Toluen (6,51) ble fjernet fra tøsningen ved destillasjon ved atmosfærisk trykk. Dimetylformamid (6,5 1) og lJ8-diazabisyklo[5,4,0]undec-7-en (110, 5 g, 0,726 mol) ble tilsatt. Løsningen ble omrystet i tilnærmet 8 timer ved romtemperatur for isomerisering av chalcon 8 til kromanon 9 og deretter tilsatt til en blanding av vann og is (81) og toluen (41). Fasene ble separert og toluensjiktet vasket med vann (5 1). De sammenslåtte vaskevann ble ekstrahert med toluen (3x41). De sammenslåtte toluen ekstrakter ble til slutt vasket med saltlake (3x41), konsentrert ved atmosfærisk trykk til 5,5 1 og deretter avkjølt til -10°C.

Under fortsatt ytre avkjøling og omrøring under nitrogen ble en 3M løsning av metyl-magnesiumklorid i THF (2,5 1,7,5 mol) (tilgjengelig fra Aldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, Wis.) tilsatt, mens temperaturen ble holdt under 0°C. Etter at alt Grignard-reagens var tilsatt ble den ytre avlcjøling fjernet og blandingen ble oppvarmet til romtemperatur. Blandingen ble omrørt ved denne temperatur i tilnærmet 24 timer.

Blandingen ble igjen avkjølt til tilnærmet -20°C, og under fortsatt ytre avkjøling og omrøring ble mettet ammoniumklorid-løsning (200 ml) langsomt tilsatt mens temperaturen ble holdt under 20°C. Blandingen ble omrørt i 2 timer og så tilsatt mettet ammoniumkloridløsning (2 1) og toluen (41) og omrørt i 5 minutter. Fasene ble separert og vannsjiktet ekstrahert med toluen (2x41). De sammenslåtte toluenekstraktene ble vasket med fortynnet saltsyre inntil løsningen ble homogen, og så med saltlake (3x41). Toluenløsningen ble til slutt konsentrert ved atmosfærisk trykk til 21. Denne løsningen ble anvendt direkte i neste trinn.

Syntese av (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenyl)-4-metyl-2-(4"-[2'"-piperidino]etoksy)fenyl)-2H-l-benzopyran (1S)-10 kamfersulfonsyresalt (±12). Til tolunløsningen av 4-hydroksy-4-metyl-2-(4'-[2"-piperidino]-etoksy)-fenyl-3-(4"'-tetrahydropyranyloksy)fenyl-7-tetrahydropyranyloksykroman (10) ble tilsatt aceton (6 1), vann (0,3 1) og (S)-lO-kamfersulfonsyre (561 g, 2,42 mol) tilgjengelig fra Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) Blandingen ble omrystet under nitrogen i 48 timer, hvoretter det faste (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenyl)-4-metyl-2-(4"-[2"'-piperidion]etoksy)fenyl)-2H-l-benzopyran (lS)-lO-kamfersulfonsyresalt (12) ble frafiltrert, vasket med aceton og tørket (883 g). Dette materialet ble anvendt i neste (HH) trinn uten ytterligere rensning.

Syntese av (2S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenyl)-4-metyl-2-(4"-[2"'-piperidino]etoksy)fenyl)-2H-l-benzopyran (1S)-10 kamfersulfonsyresalt (13, (+)-EM-652(lS)-CSA-salt).

En suspensjon av (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenyl)-4-metyl-2-(4"-[2'"-piperidino]etoksy)fenyl)-2H-l-benzopyran (1S)-10 kamfersulfonsyresalt ±12 (759 g) i 95% etanol ble oppvarmet under omrøring til tilnærmet 70°C inntil det faste stoff var oppløst. lesningen ble avkjølt til romtemperatur under omrøring og så tilsatt noen få krystaUer(2S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenyl)-4-metyl-2-(4"-[2"'-piperidino]etoksy)fenyl)-2H-l-benzopyran (1S)-10 kamfersulfonsyresalt 13. Løsningen ble omrørt ved romtemperatur i til sammen tilnærmet 3 dager. Krystallene ble frafiltrert, vasket med 95% etanol og tørket (291 g, 76%). Produktets de var 94,2% og renheten 98,8%.

Syntese av (S)-(+)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenyl)-4-metyl-2-(4"-(2'"-piperidinoetoksy)fenyl)-2H-l-benzopyran hydroklorid EM-01538 (EM-652, HC1). En suspensjon av forbindelse 13 (EM-652-(+)-CSA-salt, 500 mg, 0,726 mmol) i dimetylformamid (11 ul, 0,15 mmol) ble behandlet med en 0,5 M vandig natrium-karbonatiøsning (7,0 ml, 3,6 mmol) og omrørt i 15 minutter. Suspensjonen ble behandlet med etylacetat (7,0 ml) og omrørt i 4 timer. Den organiske fasen ble så vasket med en vandig mettet natriumkarbonatløsning (2x5 ml) og saltlake (1x5 ml), tørket over magnesiumsulfat og konsentrert. En løsning av det resulterende lyserøde skum (EM-652) i etanol (2 ml) ble behandlet med 2 N saltsyre (400 ul, 0,80 mmol), omrørt i 1 time, behandlet med destillert vann (5 ml) og omrørt i 30 minutter. Den resulterende suspensjon ble filtrert, vasket med destillert vann (5 ml), tørket i luft og under høyvakuum (65°C) for erholdelse av et kremaktig pulver (276 mg, 77%); Parameter for det gråhvite pulver: Scannende Calorimetri: Smeltepunktstart ved 219°C, AH = 83 J/g; [a]<24>D= 154° i metanol 10 mg/ml;

<*>HNMR (300 MHz, CD3OD) 8 (ppm) 1,6 (bred, 2H, H-4"'), 1,85 (bred, 4H, H-3"" og 5""), 2,03 (s, 3H, CH3), 3,0 og 3,45 (bred, 4H, H-2"" og 6""), 3,47 (t, J = 4,9 Hz, 2H,

H-3'"), 4,26 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-2"'), 5,82 (s, 1H, H-2), 6,10 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-8), 6,35 (dd, J = 8,4,2,43 Hz, 1H, H-6), 6,70 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-3' og H-5'), 6,83 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-3" og H-5"), 7,01 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2' og H-6'), 7,12 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5), 7,24 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-2" og H-6").

<13>C RMN (CD3OD, 75 MHz) 5 ppm 14,84, 22,50,23,99, 54,78, 57,03,62,97, 81,22, 104,38,109,11, 115,35, 116,01, 118,68,125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59,134,26, 154,42, 157,56, 158,96,159,33.

Elementær sammensetning: C, H, N, Cl:

Teori: 70,71,6,53,2,84,7,18%. Funnet: 70,31,6,75,2,65,6,89%.

Eksempel 7

In vivo-analyse av biotilgjengelighet av promedikamenter av androst-5-en-3fi,17fi-diol

1) Prinsipp

Analyse av biotilgjengeligheten av promedikamenter av kjønnssteroidforløpere ble utført i Sprague Dawley-hannrotter ved å måle plasmakonsentrasjonen av forbindelsene etter en enkelt oral tilførsel av forbindelsene.

2) Dyr oe behandling

Sprague-Dawley-hannrotter [Crl:CD(SD)Br] med kroppsvekt på 275-350 g ble erholdt fra Charles-River Canada Inc. og huset med 2 dyr pr. bur under alddimatiserings-periodenog hver for seg under forsøket. Dyrene ble holdt under betingelser med 12 timers lys og 12 timers mørke (lysene på kl. 08.00). Dyrene ble gitt godkjent gnagerfor (Laboratoriediett nr. 5002 i pelletform) og springvann ad libitum. Rottene ble fastet (kun tilgang til vann) med start aftenen før dosetilførsel).

Hver forbindelse som skulle analyseres ble tilført til tre dyr som en suspensjon i 0,4% ved oral gavage i en dose på 150 umg/rotte. En blodprøve på tilnærmet 0,7 ml ble tappet fra rottenes halsvene under isofuran-indusert anestesi 1,2,3,4, og 7 timer etter gavage. Blodprøvene ble umiddelbart overført til en avkjølt 0,75 ml mikrotainer med EDTA og oppbevart i et is-vannbad inntil de ble sentrifugert ved 3000 rpm i 10 rninutter. Separasjon av plasma ble utført hurtig (mindre enn 50 minutter) etter oppsamling av blodet. Et uttak på 0,25 ml plasma ble så overført til et bosilikatrør (13 x 100) og hurtig nedfrosset i tørris. Plasmaprøvene ble oppbevart ved -80°C inntil måling av plasmakonsentrasjonen av kjønnssteroid eller kjønnssteroidforløper ved GC-MS.

Resultater:

Oral absorbsjon og AUC er vist i figurene 12 og 13.

EKSEMPLER PÅ FARMASØYTISKE PREPARATER

Beskrevet nedenfor, som eksempler og ikke som begrensninger, er flere farmasøytiske preparater som omfatter de foretrukne aktive SERM EM-800 eller EM-1538 og de foretrukne aktive kjønnssteroidforløpere DHEA, EM-1304 eller EM-01474-D. Andre forbindelser ifølge oppfinnelsen eller kombinasjoner av disse kan anvendes i stedet for (eller i tillegg til) EM-800 eller EM-1538, DHEA, EM-1304 eller EM-01474-D. Konsentrasjonen av aktiv bestanddel kan variere over et vidt område, som diskutert heri. Menge av og typer andre bestanddeler som kan inngå er velkjent innen faget.

Eksempel A

Tablett

Eksempel B Gelatinkapsel

EKSEMPLER PÅ SETT

Beskrevet nedenfor, er flere sett hvor aktive SERM EM-800 eller EM-1538 anvendes og de kjønns-steroidforløpere DHEA, EM-1304 eller EM-10474-D. Andre forbindelser kan anvendes i stedet for (eller i tillegg til) EM-800 eller EM-1538, DHEA, EM-1304 eller EM-01474-D. Konsentrasjonen av aktiv bestanddel kan variere over et bredt område, som diskutert heri. Mengden av og typer andre bestanddeler som kan inngå er velkjent innen faget.

Eksempel A

SERM tilføres oralt, mens kjønnssteroidforløper tilføres perkutant

SERM-preparat

for oral tilførsel (kapsler)

Kjønnssteroidforløperpreparat for topisk tilførsel (gel)

Eksempel B

SERM og kjøimssteroidforløperen tilføres oralt Ikke-steroid antiøstrogen preparat for oral tilførsel (kapsler)

Kjørmssteroidforløperpreparat for oral tilførsel

(Gelatinkapsel)

Andre SERM kan erstatte EM-800 eller EM-01538 i preparatene ovenfor, og likeså kan andre kjørmssteroidinhibitorer erstatte DHEA, EM-1304 eller EM-01474-D. Mer enn en SERM eller mer enn en forløper kan inngå, hvorved det foretrekkes at den samlede vektprosent er lik vektprosenten for en enkelt forløper eller en enkelt SERM gitt i eksemplene ovenfor.

Claims

1. jForbindelse EM-1538,karakterisert vedat den har formelen

2. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det omfatter forbindelsen EM-1538.

3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 2,karakterisert vedat det omfatter en farmasøytisk aksepterbar eksipiens, et foi^yrmrngsmiddel eller bærestoff samt en terapeutisk effektiv mengde av: