PL203439B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca dehydroepiandrosteron, pochodn a indolu i farmaceutycznie dopuszczaln a zaróbk e, zestaw i zastosowanie dehydroepiandrosteronu - Google Patents

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca dehydroepiandrosteron, pochodn a indolu i farmaceutycznie dopuszczaln a zaróbk e, zestaw i zastosowanie dehydroepiandro- steronu. Cz lowiek ma cech e unikaln a, wraz z pewnymi innymi naczelnymi, posiadania nadnerczy, które wydzielaj a wielkie ilo sci prekursorowych sterydów, siarczanu dehydroepiandrosteronu (DHEA-S) i de- hydroepiandrosteronu (DHEA), które przekszta lcaj a si e w androstenodion (4-dion), a nast epnie w czynne androgeny i/lub estrogeny w tkankach obwodowych (Labrie i in., w: Important Advances In Oncology. Red. V. T. de Vita, S. Hellman, S. A. Rosenberg. J. B. Uppincott, Philadelphia, 193-217, 1985; Labrie, Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113-C118, 1991; Labrie, i in., w Signal Transduction in Testi- cular Cells. Ernst Schering Research Foundation Workshbp. Red. V. Hansson, F. O. Levy, K. Tasken. Springer-Verlag, Berlin-New York (Supl. 2), str. 185-218, 1996; Labrie i in., Steroids, 62: 148-158, 1997). W ostatnich badaniach (Labrie, i in., J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 2403-2409, 1997), opisali- smy ostry spadek kr azacych ilo sci dehydroepiandrosteronu (DHEA), siarczanu DHEA (DHEA-S), an- drost-5-eno-3 ß,17 ß-diolu (5-diolu), 5-diol-S, estrów kwasów t luszczowych 5-diolu i androstenodionu u mezczyzn i kobiet w wieku pomi edzy 20 i 80 lat. Pomimo znacz acego spadku ilo sci endogennych androgenów u kobiet podczas starzenia, za- stosowanie androgenów u kobiet po menopauzie ograniczano g lównie z powodu obawy o zwi ekszone ryzyko choroby sercowo-naczyniowej, w oparciu o dawniejsze badania pokazuj ace niekorzystny profil lipidów przy androgenach. Ostatnie badania nie wykaza ly jednak znacz acego wp lywu kombinowanej terapii estrogenowej i androgenowej na poziomy w osoczu cholesterolu, triglicerydów, HDL, LDL i sto- sunek HDL/LDL w porównaniu z samym estrogenem (Sherwin i in., Am. J. Obstet. Gynecol., 156: 414-419, 1987). Zgodnie z tymi obserwacjami pokazali smy, ze DHEA, zwi azek maj acy g lównie an- drogenny wp lyw, nie wykazuje wyra znie szkodliwego wp lywu na profil lipidów w osoczu (Diamond i in., J. Endocrinol., 150: S43-S50, 1996). Podobnie, nie stwierdzono zmian w stezeniach cholesterolu, jego podfrakcji lub triglicerydów, w czasie terapii samym estradiolem po 6 miesi acach terapii implantami estradiol + testosteron (Burger i in., Br. Med. J. Clin. Res. Ed., 294: 936-937, 1987). Nale zy wspo- mnie c, ze badanie u mezczyzn wykaza lo odwrotna korelacj e pomi edzy DHEA-5 w osoczu i lipoprote- inami o niskiej g esto sci (Parker i in., Science, 208: 512-514, 1980). Niedawno znaleziono korelacj e po- mi edzy niskim poziomem w osoczu testosteronu i DHEA a zwi ekszonym ot luszczeniem trzewi, parame- trem wy zszego zagro zenia sercowo-naczyniowego (Tchernof i in., Metabolism, 44: 513-519, 1995). 5-diol jest zwi azkiem biosyntetyzowanym z DHEA pod dzia laniem redukcyjnej dehydrogenazy 17 ß-hydroksysterydowej (17 ß-HSD) i jest s labym estrogenem. Wykazuje 85-krotnie ni zsze powino- wactwo ni z 17 ß-estradiol (E2) do receptora estrogenu w cytosolu przedniego p lata przysadki szczura (Simard i Labrie, J. Steroid Biochem., 26: 539-546, 1987), potwierdzaj ac dodatkowo dane otrzymane dla tego samego parametru w ludzkiej tkance raka macicy i piersi (Kreitmann i Bayard, J. Steroid Bio- chem., 11: 1589-1595,1979; Adams i in., Cancer Res., 41: 4720-4926, 1981; Poulin i Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986). Jednak ze przy st ezeniach w zakresie poziomów w osoczu u doros lych kobiet, 5-diol wspomaga namna zanie komórek i zwi eksza poziomy receptora progesteronu w komór- kach ludzkiego raka piersi ZR-75-1 (Poulin i Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986) i zwi eksza zale zn a od estrogenu syntez e glikoproteiny 52 kDa w komórkach MCF-7 (Adams i in., Cancer Res., 41: 4720-4926, 1981). Jak wspomniano powy zej, wiadomo, ze poziomy w osoczu DHEA, DHEA-S i 5-diolu spadaj a z wiekiem i odpowiednio, ze wyst epuje silna zale zna od wieku redukcja wytwarzania androgenów i estrogenów w obwodowych docelowych tkankach. Takie zmiany w sekrecji DHEA-S i DHEA powodu- ja znacz acy spadek biochemicznych i komórkowych funkcji stymulowanych sterydami p lciowymi. W wyniku tego, DHEA i DHEA-S stosowano ostatnio w leczeniu wielu stanów, które s a zwi azane ze spadkiem i/lub nierównowag a w poziomach sterydów p lciowych. Osteoporoza, stan powstaj acy u mezczyzn i kobiet, jest zwi azana ze spadkiem ilo sci androgel- nów i estrogenów. Estrogeny okaza ly si e zmniejsza c szybko sc degradacji ko sci, podczas gdy andro- geny okaza ly si e budowa c mas e ko sci. Jednak ze terapia podawania estrogenu zwykle stosowana wobec osteoporozy wymaga dodania progestyn dla przeciwdzia lania przerostom macicy i ryzyku raka macicy indukowanego przez estrogeny. Ponadto, poniewa z estrogeny i progestyny zwi ekszaj a praw- dopodobnie ryzyko raka piersi (Bardon i in., J. Clin. Endocrinol. Metab., 60: 692-697, 1985; ColditzPL 203 439 B1 3 i in., N. Engl. J. Med., 332: 1589-1593, 1995), stosowanie terapii substytucyjnej estrogen-progestin jest akceptowane przez niewiele kobiet i zwykle przez zbyt krótkie okresy. Pewne badania sugeruj a, ze osteoporoza jest kliniczn a manifestacj a niedoboru androgenu u mezczyzn (Baran i in., Calcif. Tissue Res. 26: 103-106, 1978; Odell i Swerdloff, West J. Med. 124: 446-475, 1976; Smith i Walker, Calif. Tissue Res. 22 (Suppl.): 225-228, 1976). Terapia androgenowa, jak zauwa zono dla dekanianu nandrolonu, okaza la si e zwi eksza c g estosc minera lów ko sci kr egów kobiet po menopauzie (Need i in., Arch. Intern. Med., 149: 57-60, 1989). Terapia kobiet po menopau- zie nandrolonem zwi eksza la zawarto sc minera lów w korze ko sci (Need i in., Clin. Orthop. 225: 273- -278, 1987). Androgenne skutki uboczne zarejestrowano jednak u 50% pacjentów. Takie dane s a interesuj ace, poniewa z chocia z prawie wszystkie obecne terapie s a ograniczone do redukcji utraty ko sci, wzrost masy ko sci stwierdzono przy stosowaniu anabolicznego sterydu nandrolonu. Podobn a stymulacj e tworzenia ko sci przez androgeny proponowano u m ezczyzny z niedoczynno scia gonad (Baran i in., Calcif. Tissue Res. 26: 103, 1978). Stymulacj e tworzenia ko sci u kobiet po menopauzie po- traktowanych DHEA przez 12 miesi ecy opisuje Labrie i in. (J. Clin. Endocrinol. 82: 3498-3505, 1997). DHEA (450 mg/kg, b. w., 3 razy tygodniowo) znacz aco opó znia l pojawianie si e guzów piersi u myszy C3H, które genetycznie wyhodowano z rozwojem raka piersi (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979). Ponadto, ryzyko powstania raka p echerza wzrasta lo u mezczyzn maj acych ni zsze poziomy w osoczu DHEA (Gordon i in., Cancer Res. 51: 1366-1369, 1991). Zg loszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US 5 550 107 odnosi si e do sposobu leczenia raka piersi i macicy u podatnych ciep lokrwistych zwierz at, który to sposób mo ze obejmowa c inhibicj e hormonalnej sekrecji jajników metod a chirurgiczn a (wyci ecie jajników) lub chemiczn a (zasto- sowanie agonisty LHRH, np. [D-Trp 6 ,des-Gly-NH 2 10 ]LHRH-etyloamidu lub antagonisty) jako cz esc terapii kombinacyjnej. Omówiono antyestrogeny, androgeny, progestyny, inhibitory tworzenia stery- dów p lciowych (szczególnie i katalizowanego 17 ß-hydroksysterydow a dehydrogenaz a lub aromataz a wytwarzania sterydów p lciowych), inhibitory sekrecji prolaktyny i sekrecji hormonu wzrostu oraz sekre- cji ACTH. Odpowiednik opublikowano pod numerem publikacji mi edzynarodowej WO 90/10462. Ponadto choroby sercowo-naczyniowe wiaze si e ze spadkiem poziomów w osoczu DHEA i -DHEA-5 i zaproponowano, ze DHEA oraz DHEA-5 zapobiegaja lub lecz a te stany (Barrett-Connor i in., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986). U doros lych szczurów Sprague-Pawley, Schwartz (w Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982) za- uwa zy l, ze masa cia la spad la z 600 do 550 g przy pomocy DHEA nie naruszaj ac poboru po zywienia. Schwartz (Cancer 39: 1129-1132, 1979) zauwa zy l, ze myszy C3H otrzymuj ace DHEA (450 mg/kg, 3 razy tygodniowo) uzyska ly znacz aco mniejsz a mas e i wy zszy wiek ni z kontrolne zwierz eta, mia ly mniej t luszczu w ciele i by ly bardziej aktywne. Redukcj e masy cia la uzyskano bez utraty apetytu lub ograniczania pokarmu. Ponadto DHEA mo ze zapobiega c zwi ekszaniu masy u zwierz at hodowanych do uzyskania oty losci w stanie doros lym (Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982). Podawanie DHEA chudym szczurom Zucher zmniejszy lo przyrost masy cia la pomimo wi eksze- go poboru pokarmu. Potraktowane zwierz eta mia ly mniejsze poduszki t luszczu, co ogólnie sugeruje, ze DHEA zwi eksza przemian e pokarmu, zmniejszaj ac przyrost masy i akumulacj e t luszczu (Svec i in., Proc. 2 nd int Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, USA, str. 56 abst., 1997). Oty losc zwi ekszy la si e u zmutowanych myszy AVY (Yen i in., Lipids 12: 409-413, 1977) i szczu- rze Zucker (Cleary i Zisk, Fed. Proc. 42: 536, 1983). Potraktowane DHEA myszy C3H mia ly m lodszy wygl ad ni z kontrolne (Schwartz, Cancer Res, 39: 1129-1132, 1979). DHEA ogranicza wyst epowanie mia zd zycy t etnic u karmionych cholesterolem królików (Gordon i in., J. Clin. Invest 82: 712-720, 1988; Arad i in., Arteriosclerosis 9: 159-166, 1989). Ponadto, wysokie st ezenia w osoczu DHEA-S opisano jako chroni ace przed smierci a od chorób sercowo-naczyniowych u mezczyzn (Barrett-Connor i in., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986). Poziomy w kr azeniu DHEA i DHEA-S okaza ly si e wi ec by c odwrotnie skorelowane ze smiertelno scia z powodu chorób sercowo- -naczyniowych (Barrett-Connor i in., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986) i zmniejszaj a si e równo- legle ze zmniejszaniem immunokompetencji (Thoman i Weigle, Adv. Immunol. 46: 221-222,1989). Badanie u cz lowieka wykaza lo odwrotn a korelacj e pomi edzy DHEA-S w surowicy p lodowej i niskimi g esto sciami lipoprotein (LDL) (Parker i in., Science 208: 512, 1980). Zastosowania DHEA, jak te z korzy sci z terapii androgenowej i estrogenowej omówiono w mi e- dzynarodowej publikacji patentowej WO 94/16709. Nie s adzi si e, ze korelacje zauwa zone w dziedzinie sugeruj a skuteczne sposoby leczenia lub profilaktyki, lub s a wolne od niepo zadanych skutków ubocznych, jak terapie kombinacyjne.PL 203 439 B1 4 Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca dehydroepiandrosteron, selektywny modulator receptora estrogenu i farmaceutycznie dopuszczaln a zaróbk e, która zawiera: a) farmaceutycznie dopuszczaln a zaróbk e, rozcie nczalnik lub no snik; b) leczniczo skuteczn a ilo sc dehydroepiandrosteronu, c) leczniczo skuteczn a ilo sc pochodnej indolu o wzorze ogólnym w którym D wybiera si e z grupy obejmuj acej -OCH 2 CH 2 N(R 7 )R 8 , -CH=CH-CON(R 7 )R 8 , -CC-(CH 2 ) n - -(R 7 )R 8 , R 7 i R 8 niezale znie wybrane z grupy obejmuj acej C 1 -C 6 alkil lub R 7 , R 8 i atom azotu, z którym s a zwi azane, razem tworz a struktur e pier scieniow a wybran a z grupy obejmuj acej pirolidyno, dimetylo- -1-pirolidyno, metylo-1-pirolidynyl, piperydyno, heksametylenoimino i morfolino; w którym X wybiera si e z grupy obejmuj acej: atom wodoru i C 1 -C 6 alkil; w którym R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 i R 6 wybiera si e niezale znie z grupy obejmuj acej: atom wodoru, hy- droksyl, C 1 -C 6 alkil i ugrupowanie przekszta lcane in vivo w hydroksyl. Korzystnie jako pochodn a indolow a zawiera zwi azek o nast epuj acym wzorze: Przedmiotem wynalazku jest zestaw, w którym pierwszy pojemnik zawiera leczniczo skuteczn a ilosc dehydroepiandrosteronu i obejmuj acy drugi pojemnik zawieraj acy leczniczo skuteczn a ilosc po- chodnej indolowej. Korzystnie zestaw wed lug wynalazku jako pochodn a indolow a zawiera zwi azek o nast epuj acym wzorze:PL 203 439 B1 5 Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie dehydroepiandrosteronu do wytwarzania leku do le- czenia lub zmniejszania ryzyka nabycia osteoporozy, w po laczeniu z leczniczo skuteczn a ilo scia po- chodnej indolowej. Korzystnie jako pochodn a indolow a stosuje si e zwi azek o nast epuj acym wzorze Na figurach 1 i 2 pokazano podawanie samego SERM z wytworzeniem znacz acego dzia lania profilaktycznego, nawet w nieobecno sci podawanych prekursorów. W niniejszym opisie selektywny modulator receptora estrogenu (SERM) jest zwi azkiem, który bezpo srednio lub przez aktywny metabolit dzia la jako antagonista receptora estrogenu („antyestro- gen”) w tkance piersi, wytwarzaj ac estrogenne lub estrogenopodobne dzia lanie na tkank e ko sci i po- ziomy cholesterolu we krwi (to jest przez obni zenie cholesterolu w osoczu). Nie sterydowe zwi azki dzia laj ace jako antagoni sci receptora estrogenu in vitro lub w ludzkiej lub szczurzej tkance piersi (szczególnie je sli zwi azek dzia la jak antyestrogen na ludzkie komórki raka piersi) mog a dzia lac jako SERM. Odwrotnie, sterydowe antyestrogeny mog a dzia la c jako SERM, poniewa z nie wykazuj a zad- nego korzystnego dzia lania na cholesterol w osoczu. Nie sterydowe antyestrogeny, które zbadali smy i stwierdzili smy, ze dzia laj a jako SERM, obejmuj a EM-800, EM-01538, Raloxifene, Tamoxifene i Droloxifene. Zbadali smy sterydowy antyestrogen ICI 182780 i stwierdzili smy, ze nie dzia la jako SERM. SERM mo zna podawa c w takich samych dawkach jak znane w dziedzinie, gdy te zwi azki sto- suje si e jako antyestrogeny. Zauwa zyli smy te z korelacj e pomi edzy korzystnym wp lywem SERM na cholesterol w osoczu i korzystnym wp lywem estrogennym lub estrogenopodobnym na ko sci i lipidy w osoczu. SERM, które w naszych badaniach dzia la ly korzystnie na wszystkie te parametry, obejmuj a mas e ko sci, poziomy cholesterolu i triglicerydów. Bez wi azania si e z teori a, mo zna s adzi c, ze SERM, z których wiele ko- rzystnie ma dwa pier scienie aromatyczne zwi azane przez jeden do dwu atomów w egla, mog a oddzia- lywa c z receptorem estrogenu dzi eki powy zszej cz esci cz asteczki, która jest najlepiej rozpoznawana przez receptor. Korzystne SERM maj a la ncuchy boczne, które mog a selektywnie wykazywa c antago- nistyczne w la sciwo sci w tkance piersi bez wykazywania znacz acych antagonistycznych w la sciwo sci w innych tkankach. Tak wi ec SERM mog a dzia lac w sposób po zadany jako antyestrogeny w piersi, podczas gdy niespodziewanie i w sposób po zadany dzia laj a jako estrogeny (lub wykazuj a eptrogeno- podobn a aktywnosc) w ko sciach i we krwi (gdzie korzystnie wp lywaj a na stezenia lipidu i cholesterolu). Korzystny wp lyw na cholesterol i lipid przek lada si e na korzystny wp lyw na mia zd zyc e t etnic, na któr a niekorzystnie wp lywaj a niew la sciwe poziomy cholesterolu i lipidu. Wszystkie te choroby leczone jak omówiono w opisie reaguj a korzystnie na androgeny. Zamiast stosowa c androgeny jako takie, zg laszaj acy stosuj a prekursory sterydów p lciowych, takie jak DHEA, DHEA-S, 5-diol lub przedleki przekszta lcane w dowolne takie prekursory sterydów p lciowych. In vivo, DHEA-S przekszta lca si e w DHEA, który z kolei przekszta lca si e w 5-diol. Mo zna s adzi c, ze dowolna tkanka reaguj aca korzystnie na jeden z nich mo ze odpowiada c prawdopodobnie korzystnie na inne. Postaci przedleków aktywnych metabolitów s a dobrze znane w dziedzinie. Patrz np. H. Bundgaard „Design and Application of Prodrugs” (w: A Textbook of Drug Design and Development. Red. H. Bund- gaard i P. Krogggaard-Larsen; Harwook Academic Publishers GmfH, Chur: Szwajcaria, 1991), do la- czane niniejszym jako odno sniki. W szczególno sci, patrz str. 154-155 opisuj ace ró zne grupy funkcyjne aktywnych metabolitów i odpowiednie grupy przedleków, które przekszta lcaj a si e in vivo w ka zd a gru- p e funkcyjn a. Gdy poziomy prekursorów sterydów p lciowych u pacjentów s a podniesione, mo zna zwy-PL 203 439 B1 6 kle tego dokona c przez podawanie takiego prekursora lub podawanie prekursora takiego prekursora. Stosuj ac prekursory zamiast androgenów zmniejsza si e niepozadan a androgenn a aktywno sc w tkan- kach innych ni z docelowe. Tkanki przekszta lcaj a prekursory, takie jak DHEA, w androgeny tylko w na- turalnym i bardziej regulowanym procesie. Znaczny procent androgenów powstaje lokalnie w obwo- dowych tkankach i w ró znym stopniu w ró znych tkankach. Raki reaguj a niekorzystnie na estrogenn a aktywno sc. Z drugiej strony osteoporoza, hiperciole- sterolemia, hiperlipidemia i mia zd zyca t etnic reaguj a korzystnie na estrogenn a lub estrogenopodobn a aktywnosc. Stosuj ac SERM uzyskuje si e po zadane efekty w docelowych tkankach bez niepo zadane- go wp lywu w pewnych innych tkankach. Np., SERM mo ze miec korzystne dzia lanie estrogenne w ko sci (lub na lipid lub cholesterol) unikaj ac niekorzystnego dzia lania estrogennego na piersi. Tak wi ec, prekursor i SERM wywieraj a korzystny wp lyw na docelowe tkanki, minimalizuj ac nie- korzystny wp lyw na pewne inne tkanki. Ponadto istniej a istotne synergie przy stosowaniu obu razem. Np., estrogeny i androgeny wywieraj a korzystne dzia lanie na osteoporoz e ró znymi mechanizmami (estrogen redukuj ac resorpcj e ko sci, androgen pomagaj ac w tworzeniu ko sci). Kombinacja wynalazku zapewnia ko sciom korzystne dzia lanie estrogenu lub estrogenopodobne przez aktywno sc SERM, a tak ze zapewnia korzystny androgen przez lokaln a konwersj e prekursora do androgenu w ko sci. S adzi si e, ze prekursor tak ze dostarcza estrogen. Podobnie dzieje si e w zwi azku z kontrolowaniem lipidu lub cholesterolu (przydatne do leczenia lub zapobiegania mia zd zycy t etnic). Podobna synergia wyst epuje wobec raków piersi, trzonu macicy, jajników lub macicy, gdzie SERM zapewnia po zadane dzia lanie antyestrogenne i prekursor zapewnia po zadane dzia lanie androgenne (przy dowolnej przypadkowej konwersji prekursora do estrogenu lagodzonej przez antyestrogen). Niepo zadane wp lywy s a tak ze lagodzone w synergistyczny sposób przez kombinacj e. Dla innych chorób wszelkie inne dzia lania na tkanki piersi, które mog lyby wynika c z estrogenów wytwarzanych przez prekursor (gdy prekursor stosuje si e do promocji androgennych efektów) s a tak ze lagodzone przez antyestrogenne dzia lanie SERM w tkance piersi. W pewnych przypadkach dodaje si e progestyny uzyskuj ac dalsze dzia lanie androgenne. Pro- gestyny mo zna stosowa c w niskich dawkach znanych w dziedzinie bez niekorzystnego wp lywania na receptory inne ni z receptory androgenu (np. receptory glukokortykoidu). S a one tak ze wzgl ednie wolne od niechcianych androgennych skutków ubocznych (takich jak w losy na twarzy ze nskich pacjentów). Korzystne SERM odnosz a si e: (1) do wszystkich stanów chorobowych; (2) do zastosowa n lecz- niczych i profilaktycznych; i (3) do korzystnych kompozycji farmaceutycznych i zestawów. Korzystnym prekursorem jest DHEA. Pacjent potrzebuj acy leczenia lub zmniejszania ryzyka ataku danej choroby jest tym, u którego zdiagnozowano tak a chorob e lub który jest podatny na atak takiej choroby. Je sli nie powiedziano inaczej, korzystna dawka czynnych zwi azków (steze n i trybów podawa- nia) jest identyczna dla leczniczych i profilaktycznych celów. Dawkowanie dla ka zdego sk ladnika czynnego przedyskutowanego tutaj jest taka sama niezale znie od choroby leczonej (lub choroby, któ- rej mo zliwo sc ataku zmniejszono). Je sli nie powiedziano inaczej lub gdzie tak wynika z kontekstu, dawki odnosz a si e do masy zwi azków czynnych bez farmaceutycznych zaróbek, rozcie nczalników, no sników lub innych sk ladni- ków, chocia z takie dodatkowe sk ladniki do lacza si e u zytecznie, jak pokazano w przyk ladach. Dowolna posta c dawki (kapsu lka, tabletka, zastrzyk lub tym podobne) zwykle stosowana w przemy sle farma- ceutycznym nadaje si e do stosowania tutaj i terminy „zaróbka”, „rozcienczalnik” lub „no snik” obejmuja takie nieaktywne sk ladniki jakie do lacza si e typowo, wraz z czynnymi sk ladnikami w takich postaciach dawek w przemy sle. Np., mo zna stosowa c typowe kapsu lki, pigu lki, pow loki jelitowe, sta le lub ciek le rozcie nczalniki lub zaróbki, srodki smakowe, konserwanty lub tym podobne. Wszystkie czynne sk ladniki u zyte w dowolnej z terapii omówionej tutaj mo zna komponowa c w kompozycje farmaceutyczne, które obejmuj a tak ze jeden lub wi ecej innych sk ladników czynnych. Alternatywnie, mo zna ka zd a podawa c odr ebnie, lecz na tyle jednocze snie w czasie, aby pacjent wy- kazywa l na koniec podwy zszone poziomy we krwi lub inaczej odbiera l korzy sci z ka zdego ze sk ladni- ków czynnych (lub strategii) jednocze snie. Korzystnie jeden lub wiele sk ladników czynnych komponuje sie w pojedynczej kompozycji farmaceutycznej. Korzystnie dostarcza si e zestaw obejmuj acy co naj- mniej dwa odr ebne pojemniki, gdzie zawarto sc co najmniej jednego pojemnika ró zni si e, w ca lo sci lub w czesci, od zawarto sci co najmniej jednego innego pojemnika w odniesieniu do sk ladników czynnych tam zawartych.PL 203 439 B1 7 Terapie kombinacyjne omówione tutaj obejmuj a tak ze zastosowanie sk ladnika czynnego (kom- binacji) do wytwarzania leku do leczenia (lub zmniejszania ryzyka) danej choroby, gdzie leczenie lub zapobieganie obejmuje ponadto inny sk ladnik czynny kombinacji. Figura 1 pokazuje wp lyw leczenia DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) lub EM-800 (75 µg, doustnie, raz dziennie) samym lub w kombinacji przez 9 miesiecy od wyst apienia indukowanego DM- BA raka sutka u szczura przez okres obserwacji 279 dni. Dane wyra zono jako procent lacznej liczby zwierz at w ka zdej grupie. Figura 2 pokazuje wp lyw leczenia DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) lub EM-800 (75 µg, doustnie, raz dziennie) samym lub w kombinacji przez 9 miesi ecy przy przeci etnej liczbie guzów na majace guzy zwierz e (A) i przy przeci etnych rozmiarach guza na maj acego guzy szczura (B) przez okres obserwacji 279 dni. Dane wyra zono jako srednie ± SEM. Figura 3 pokazuje wp lyw leczenia DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) lub EM-800 (75 µg, doustnie, raz dziennie) samym lub w kombinacji przez 9 miesi ecy na poziomy w osoczu triglicerydu (A) i cholesterolu (B) u szczura. Dane wyra zono jako srednie ± SEM. **: P < 0,01 do swiadczalne wo- bec odpowiednich kontrolnych. Figura 4 pokazuje: A) Wp lyw zwi ekszania dawek DHEA (0,3 mg, 1,0 mg lub 3,0 mg) podawa- nych przezskórnie dwa razy dziennie przy przeci etnych rozmiarach guzów ZR-75-1 u nagich myszy z wyci etymi jajnikami (OVX) uzupe lnianych estronem. Kontrolne myszy OVX otrzymuj ace sam no snik stosuje si e jako dodatkowe kontrole. Pocz atkowy rozmiar guza przyj eto jako 100%. DHEA podawano przezskórnie (p. c.) w 0,02 ml 50% roztworu etanolu - 50% glikolu propylenowego na skórze grzbietu. B) Wp lyw leczenia rosn acymi dawkami DHEA lub EM-800 samym lub w kombinacji przez 9,5 miesi ecy na guzy ZR-75-1 u nagich myszy 0VX uzupe lnianych estronem. **, p < i 0,01, potraktowane wzgl edem kontrolnych myszy 0VX uzupe lnianych estronem. Figura 5 pokazuje wp lyw rosn acych dawek doustnych antyestrogenu EM-800 (15 µg, 50 µg lub 100 µg) (A) lub przezskórnego podawania rosn acych dawek DHEA (0,3, 1,0 lub 3,0 mg) kombinowa- nych z EM-800 (15 µg) lub samego EM-800 (B) przez 9,5 miesi aca przy przeci etnych rozmiarach gu- zów ZR-75-1 u nagich myszy z wyci etymi jajnikami (OVX) uzupe lnianych estronem. Pocz atkowy roz- miar guza przyj eto jako 100%. Kontrolne myszy OVX otrzymuj ace sam no snik u zyto jako dodatkowe zwierz eta kontrolne. Estron podawano podskórnie w dawce 0,5 µg raz dziennie, podczas gdy DHEA rozpuszczano w 50% etanolu - 50% glikolu propylenowym i nak ladano na powierzchni e skóry grzbietu dwa razy dziennie w obj eto sci 0,02 ml. Dokonuje si e te z porównania ze zwierz etami OVX otrzymuj a- cymi sam no snik. Figura 6 pokazuje wp lyw 12-miesi ecznego traktowania dehydroepiandrosteronem (DHEA) sa- mym lub w kombinacji z Flutamidem lub EM-800 na obj eto sc ko sci beleczkowatej u szczurów z wyci e- tymi jajnikami. Nietkni ete zwierz eta dodaje si e jako dodatkowe zwierz eta kontrolne. Dane przedsta- wiono jako sredni a ± SEM ** p < 0,01 wzgl edem kontrolnej OVX. Figura 7 pokazuje wp lyw 12-miesi ecznego leczenia dehydroepiandrosteronem (DHEA) samym lub w kombinacji z Flutamidem lub EM-800 na liczb e beleczek u szczurów z wyci etymi jajnikami. Nie- tkni ete zwierz eta dodaje sie jako dodatkowe zwierz eta kontrolne. Dane przedstawiono jako sredni a ± SEM ** p < 0,01 wzgl edem kontrolnej OVX. Figura 8 pokazuje bli zsze przynasady piszczeli z nietkni etych szczurów kontrolnych (A), kontro- lnych z wyci etymi jajnikami (B) i z wyci etymi jajnikami potraktowanych samym DHEA (C) lub w kombi- nacji z Flutamidem (D) lub EM-800 (E). Nale zy zauwa zy c zmniejszon a ilosc ko sci beleczkowatych (T) u kontrolnych zwierz at z wyci etymi jajnikami (B) i znacz acy wzrost obj eto sci ko sci beleczkowatej (T) indukowany po podawaniu DHEA podawanie (C). Dodanie Flutamidu do DHEA cz esciowo zablokowa- lo wp lyw DHEA na obj eto sc ko sci beleczkowatej (D), podczas gdy kombinacja DHEA i EM-800 da la pe ln a ochron e wobec zwi azanej z wyci eciem jajników utraty ko sci. Zmodyfikowany trójbarwny Mas- son-Goldner, powi ekszanie x 80. T: Beleczki, GP: P lytka wzrostowa. Figura 9 pokazuje wp lyw rosn acych dawek (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 i 1 mg/kg) EM-800, EM-1538 i Raloxifene (EM-1105) podawanych doustnie dziennie przez 4 dni na poziom cholesterolu u szczura z wyci etymi jajnikami. Figura 10 pokazuje wp lyw 34-tygodniowego leczenia dehydroepiandrosteronem (DHEA) sa- mym lub w kombinacji z EM-1538 (EM-652 · HCl) na g estosc minera lów w kr egach l ed zwiowych u szczurów z wyci etymi jajnikami. Nietkni ete zwierz eta dodaje si e jako dodatkowe zwierz eta kontrolne. Dane przedstawiono jako sredni a ± SEM ** p < 0,01 wzgl edem kontrolnej OVX.PL 203 439 B1 8 Figura 11 pokazuje polaczone efekty SERM (EM-652) i DHEA na parametry menopauzy. Nie oczekiwano negatywnego wp lywu. Figura 12 pokazuje st ezenia w osoczu DHEA (ng/ml) (o s Y) w funkcji czasu (o s X) po pojedyn- czej doustnej absorpcji korzystnych prekursorów sterydów p lciowych (150 µmol/szczura) u samców szczurów. W ramce podano AUC 24 godziny DHEA indukowanego przez te zwi azki. EM-760 dehydroepiandrosteren EM-900 androst-5-eno-3 ß,17 ß-diol EM-1304 3-octan androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu EM-1305-CS dioctan androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu EM-1397 3-octan, 17-benzoesan androst-5-eno-3 ß,17 ß-diol EM-1400 dibenzoesan androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu EM-1410 dipropionian androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu EM-1474-D dihemisukcynian androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu Figura 13 pokazuje st ezenie w osoczu androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu (ng/ml) (o s Y) w funkcji cza- su (o s X) po doustnej absorpcji prekursora sterydu p lciowego (150 µmol/szczura) u samców szczu- rów. W ramce podano AUC 24 godziny androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu indukowane przez te zwi azki. EM-760 dehydroepiandrosteron EM-900 androst-5-eno-3 ß,17 ß-diol EM-1304 3-octan androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu EM-1305-CS dioctan androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu EM-1397 3-octan, 17-benzoesan androst-5-eno-3 ß,17 ß-diol EM-1400 dibenzoesan androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu EM-1410 dipropionian androst:-5-eno-3 ß,17 ß-diolu EM-1474-D dihemisukcynian androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu Estrogeny s a dobrze znane ze stymulacji namna zania komórek nab lonka piersi, a samo nam- na zanie komórek uwa za si e za zwi ekszaj ace ryzyko raka przez akumulacj e przypadkowych b ledów genetycznych, które mog a spowodowa c nowotworzenie (Preston Martin i in., Cancer. Res. 50: 7415- -21,1990). W oparciu o t e koncepcj e wprowadzono antyestrogeny dla zapobiegania rakowi piersi w celu zmniejszenia szybko sci podzia lu komórek stymulowanego przez estrogeny. Utratcie cykliczno sci jajeczkowania stwierdzanej u samic szczurów Sprague-Dawley po 10 mie- siacach zycia towarzyszy zwi ekszony poziom estrogenu i proiaktyny w osoczu i spadek steze n w oso- czu androgenu i progesteronu (Lu i in., 61 st Annual Meeting of the Endocrine Society 106 (abst. #134), 1979; Tang i in., Biol. Reprod. 31: 399-413,1984; Russo i in., Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Integument and Mammary Glands 252-266, 1989; Sortino i Wise, Endocrinology 124: 90-96, 1989; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991). Te zmiany hormonalne, które spontanicznie zachodz a u starzej acych si e samic szczurów, s a zwi azane z wieloogniskowym rozrostem i zwi ekszon a aktywno- sci a wydzielnicz a tkanki gronowej/p echerzykowej, jak te z rozszerzeniem kana lu gruczo lu sutkowego i tworzeniem cyst (Boorman i in., 433, 1990; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991). Nale zy wspo- mnie c, ze zmianom rozrostowym i nowotworowym gruczo lu sutkowego szczura cz esto towarzysz a zwi ekszone poziomy estrogenów i prolaktyny (Meites, J. Neural. Transm. 48: 25-42, 1980). Leczenie EM-800, SERM indukuje zanik gruczo lu sutkowego, co charakteryzuje si e spadkiem rozmiarów i liczby struktur zrazikowych i brakiem dowodów aktywno sci wydzielniczej, co wskazuje na siln a anty- estrogenow a aktywno sc EM-800 w gruczole sutkowym (Luo i in., Endocrinology 138: 4435 1144, 1997). Leczenie DHEA, prekursorem sterydu p lciowego prowadzi do podwy zszenia DHEA i 5-diol w osoczu, podczas gdy poziomy w osoczu 4-dionu, testosteronu, dihydrotestosteronu i estradiolu wzrastaj a tylko umiarkowanie lub cz esciej pozostaj a niezmienione, ograniczaj ac wewn atrzkomórkow a biotransformacj e tego prekursora sterydu do tkanek obwodowych (Labrie i in. , Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113-C118, 1991). Jednak ze wp lyw stymuluj acy doustnie podawanego DHEA na poziomy w oso- czu androgenów, takich jak testosteron i dihydrotestosteron, ma wi eksz a amplitud e ni z efekt na po- ziomy w osoczu estrogenów, sugeruj ac, ze DHEA jest g lównie transformowany do androgenów w tych zwierz etach. Ta obserwacja zgadza si e z danymi otrzymanymi u kobiet, gdzie tworzenie androgenów z DHEA by lo wa zniejszym szlakiem ni z konwersja DHEA w estrogeny (Morales i in., J. Clin. Endocri- nol. Metab. 78: 1360-1367, 1994; Labrie i in., Ann. N. Y. Acad. Sci. 774:16-28, 1995; Labrie i in., Ste- roids 62: 148-158, 1997). Wiedz ac o powy zej opisanej silnej antyestrogennej aktywno sci powsta lej z atrofii gruczo lu, sut- kowego i dominuj acego androgennego wp lywu DHEA na gruczo l sutkowy, histomorfologiczne zmianyPL 203 439 B1 9 widziane u zwierz at potraktowanych kombinacj a SERM i prekursora sterydu p lciowego wyja snia si e najlepiej bezkonkurencyjnym dzia laniem androgennym DHEA w gruczole sutkowym szczura. Co wa zniejsze, zauwa zono, ze androgeny wywieraj a bezpo sredni a przeciwrozrostow a aktyw- nosc na wzrost ludzkich komórek ZR-75-1 raka piersi in vitro i ze takie dzia lanie hamuj ace androge- nów dodaje si e do dzia lania antyestrogenów (Poulin i Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937,1986; Poulin i in., Breast Cancer Res. Treat. 12: 213-225,1988). Podobne dzia lanie hamuj ace zaobserwowano in vivo na heteroprzeszczepach ZR-75-1 u nagich myszy (Dauvois i in., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). Androgeny okaza ly si e tak ze hamowa c wzrost indukowanego DMBA raka sutka u szczura i t e inhibicj e odwraca lo równoczesne podawanie czystego antyandrogenu Flutamidu (Dauvois i in., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299-306, 1989). Lacznie, niniejsze dane wskazuj a na zaanga zowanie recepto- ra androgenu w dzia lanie hamuj ace DHEA na raka piersi. Poniewa z antyestrogeny i prekursory sterydów p lciowych wywieraj a dzia lanie hamuj ace na raka piersi ró znymi mechanizmami, to kombinacja SERM (EM-800) i prekursora sterydu p lciowego (DHEA) wywiera silniejsze dzia lanie hamuj ace ni z ka zdy zwi azek u zyty samodzielnie na rozwój indukowanego DMBA raka sutka szczura, jak pokazano na fig. 1 i 2. Istotnie, nie znaleziono indukowanego DMBA guza na koniec eksperymentu u zwierz at otrzymuj acych DHEA i EM-800. Kombinacja prekursora sterydu p lciowego (DHEA) i SERM (EM-800) zachowuje wp lyw stymulu- jacy DHEA na tworzenie ko sci i wzmacnia dzia lanie hamuj ace samego SERM (EM-800) na obrót me- taboliczny i resorpcj e ko sci, jak pokaza l dalszy spadek wydalania w moczu hydroksyproliny i wapnia przy polaczeniu obu zwi azków. Pokazali smy, ze DHEA wykazuje korzystne dzia lanie na ko sci u samic szczurów (Luo i in., En- docrinology 138: 4435-4444, 1997) i kobiet po menopauzie (Labrie i in., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 3498-3505,1997). Tak wi ec, u nie tkni etych samic szczurów, terapia DHEA z wi eksza g estosc mine- raln a ko sci (BMD) ca lego ko scca, kr egów l ed zwiowych i ko sci udowej (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). Z drugiej strony, terapia EM-800 nie mia la znacz acego wp lywu na BMD u nietkni etych zwierz at, chocia z zaobserwowano silne wp lywy stymuluj ace u szczurów z wyci etymi jajnikami (Martel i in., nie- publikowane dane). Poniewa z EM-800 wywiera takie wp lywy stymuluj ace na BMD ca lego ko scca, kr egi l ed zwiowe i ko sci udowe u szczurów z wyci etymi jajnikami, brak znacz acego wplywu stymuluj a- cego EM-800 u nietkni etych zwierz at mo ze by c spowodowany tym, ze sterydy p lciowe obecne u nie- tkni etych samic szczurów wywieraj a, maksymalny wp lyw na BMD (Luo i in., Endocrinology 138: 4435- -4444, 1997). Podobnie, brak znacz acego wp lywu EM-800 u szczurów z wyci etymi jajnikami ju z pobie- rajacych DHEA jest prawdopodobnie spowodowany maksymalnymi wp lywami stymuluj acymi wywie- ranym przez androgeny (i zapewne estrogeny) zsyntetyzowane w komórkach ko sci z egzogennego DHEA. Wiadomo, ze estrogeny obni zaj a poziomy w osoczu cholesterolu, lecz zwi ekszaj a lub nie maj a wp lywu na poziomy w osoczu triglicerydów (Love i in., Ann. Intern. Med. 115: 860-864, 1991; Walsh i in., New Engl. J. Med. 325: 1196-1204, 1991; Barrett-Connor, Am. J. Med. 95 (Suppl. 5A) : 40S-43S, 1993; Russell i in., Atherosclerosis 100: 113-122, 1993; Black i in., J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994; Dipippo i in., Endocrinology 136: 1020-1033,1995; Ke i in., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995). Figura 3 pokazuje, ze EM-800 wykazuje dzia lanie hipocholesterolemiczne i hipotrigliceryde- miczne u szczura, przedstawiaj ac w ten sposób swoje unikalne dzia lanie na profil lipidów w osoczu, które jest zupe lnie ró zne od dzia lania innych SERM, takich jak tamoxifene (Bruning i in., Br. J. Cancer 58: 497-499,1988; Love i in., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1327-1332, 1990; Dipippo i in., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995; Ke i in., Endocrinology 136: 2435-2441,1995), droloxifene (Ke i in., Endocrino- logy 136: 2435-2441, 1995) i raloxifene (Black i in., J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994). Kombinacja DHEA i EM-800 zachowa la dzia lanie hipocholesterolemiczne i hypotriglicerydemiczne EM-800, co su- geruje, ze taka kombinacja mo ze wywiera c korzystne dzia lanie na lipidy w osoczu. Nale zy zauwa zy c, ze profil lipidów w osoczu jest znacz aco ró zny u szczurów i ludzi. Jednak ze, poniewa z mechanizm mediacji przez receptor estrogenu jest zaanga zowany w efekt hi- pocholesterolemiczny estrogenów, jak te z antyestrogenów (Lundeen i in., Endocrinology 138: 1552- -1558, 1997), szczur pozostaje przydatnym modelem do badania dzia lania obni zaj acego poziom cho- lesterolu estrogenów i „antyestrogenów” u ludzi. W skrócie, powy zej opisane dane wskazuj a wyra znie wp lywy kombinacji SERM (EM-800) i prekursora sterydu p lciowego (DHEA) na rozwój raka sutka indukowanego przez DMBA, jak te z dzia lanie zabezpieczaj ace takiej kombinacji na mas e ko sci i lipidy w osoczu. Dane te sugeruj a do-PL 203 439 B1 10 datkowe korzystne dzia lanie takiej kombinacji w leczeniu i zapobieganiu osteoporozie przy polep- szaniu profilu lipidów. Zbadali smy tak ze potencjalne interakcje efektu hamuj acego nowego antyestrogenu (EM-800) z dzia laniem prekursora sterydu p lciowego (DHEA) na wzrost ludzkiego raka piersi ZR-75-1 w hetero- przeszczepach u nagich myszy przez kombinowane podawanie dwu leków. Fig. 4 i 5 pokazuj a, ze sam DHEA, w u zytych dawkach, powoduje 50 do 80% inhibicji wzrostu guza, podczas gdy prawie ca lkowita inhibicja wzrostu guza uzyskiwana przy niskiej dawce antyestrogenu nie by la zak lócana przez DHEA. Ograniczenia pomiarów g esto sci mineralnej ko sci (BMD) s a dobrze znane. Przyk ladowo, po- miary BMD nie wykaza ly zmian u szczurów potraktowanych sterydowym antyestrogenem ICI 182780 (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25: 1-9, 1993), podczas gdy widoczne by ly histomorfometrycz- nie zmiany inhibicyjne (Gallagher i in., Endocrinology 133: 2787-2791, 1993). Podobne ró znice opisy- wano dla Tamoxifene (Jordan i in., Breast Cancer Res. Treat. 10: 31-35, 1987; Sibonga i in., Breast Cancer Res. Treatm. 41: 71-79, 1996). Nale zy wskaza c, ze zmniejszona g estosc mineralna ko sci nie jest jedyn a nienormalno scia zwi azan a ze zmniejszon a wytrzyma lo scia ko sci. (Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in the prevention or treatment of postmenopausal osteoporosis. Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FDA, May 1994). Jest zatem wa zne zanalizowanie zmian w bioche- micznych parametrach metabolizmu ko sci indukowanych przez ró zne zwi azki i terapie w celu uzyska- nia lepszej wiedzy o ich dzia laniu. Szczególnie wa zne jest wskazanie, ze kombinacje DHEA i EM-800 wywiera ly niespodziewane korzystne dzia lanie na wa zne biochemiczne parametry metabolizmu ko sci. W istocie, sam DHEA nie wp lywa l na stosunek hydroksyprolina/kreatynina w moczu, znacznik resorpcji ko sci. Ponadto, brak wp lywu DHEA mo zna wykry c w dziennym wydalaniu z moczem in., Endocrinology 138: 4435- -4444,1997). EM-800, z drugiej strony, obni za l w moczu stosunek hydroksyprolina/kreatynina o 48%, podczas gdy, podobnie jak u DHEA, nie by lo wida c wp lywu EM-800 na wydalanie w moczu wapnia lub fosforu. Ponadto EM-800 nie mia l wp lywu na poziomy w osoczu aktywno sci zasadowej fosfatazy, znacznika tworzenia ko sci, podczas gdy DHEA zwi eksza l warto sc parametru o oko lo 75% (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). Jeden z niespodziewanych efektów kombinacji DHEA i EM-800 odnosi si e do stosunku w mo- czu hydroksyprolina/kreatynina, znacznika resorpcji ko sci, który zmniejszy l si e o 69%, gdy po laczy lo sie DHEA i EM-800 i ta warto sc by la statystycznie ró zna (p < 0,01) od 48% inhibicji uzyskanej przez sam EM-800, podczas gdy sam DHEA nie wykaza l zadnego dzia lania. Tak wi ec, dodanie DHEA do EM-800 zwi eksza o 50% efekt hamuj acy EM-800 na reabsorpcj e ko sci. Co wa zne, innym niespodzie- wanym efektem dodania DHEA do EM-800 by l oko lo 84% spadek ilo sci wapnia w moczu (od 23,17 ± 1,55 do 3,71 ± 0,75 µmol/24 godziny/100 g (p < 0,01) i 55% spadek ilo sci fosforu w moczu (od 132,72 ± 6,08 do 59,06 ± 4,76 µmol/24 godziny/100 g (p < 0,01), odpowiednio (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). T a b l i c a 1 Mocz Osocze Grupa Wap n ( µmol/24 godz./100 g) Fosfor ( µmol/24 godz./100 g) HP/Cr (µmol/mmol) tALP (IU/l) Kontrolna 23,17 ± 1,55 132,72 ± 6,08 13,04 ± 2,19 114,25 ± 14,04 DHEA (10 mg) 25,87 ± 3,54 151,41 ± 14,57 14,02 ± 1,59 198,38 ± 30,76* EM-800 (75 µg) 17,44 ± 4,5 102,03 ± 25,13 6,81 ± 0,84** 114,11 ± 11,26 HEA + EM-800 3,71 ± 0,75** 59,06 ± 4,76** 4,06 ± 0,28** 204,38 ± 14,20** Ciekawie jest tak ze zauwa zy c, ze silnemu dzia laniu hamuj acemu EM-800 na cholesterol w oso- czu nie zapobiega równoczesna terapia DHEA (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). Podczas gdy Raloxifene i podobne zwi azki zapobiegaj a utracie ko sci i spadkowi ilo sci choleste- rolu w osoczu (jak estrogeny), nale zy zauwa zy c, ze gdy Raloxifene porównywano z Premarinem pod wzgl edem BMD, wp lyw Raloxifene na BMD by l s labszy ni z wp lyw Premarinu (Minutes of the Endocri- nology and Metabolism Drugs Advisory Committee, PDA Thursday, Meeting #68, November 20 thPL 203 439 B1 11 1997). Ze wzgl edu na jego dobrze znane niekorzystne wp lywy na raka piersi i macicy, dodanie estro- genu do Raloxifene, EM-800 lub innych podobnych zwi azków nie jest dopuszczalnym rozwi azaniem. Niniejsze wyniki otrzymane dla szczura wyra znie pokazuj a, ze DHEA mo ze da c korzystne wyni- ki, których nie osi aga si e u zyciem samego selektywnego modulatora receptora estrogenu (SERM), takiego jak EM-800, Raloxifene, itp. Podczas gdy SERM ogranicza swoje dzia lanie do inhibicji resorp- cji ko sci, dodanie DHEA, 5-diolu, DHEA-S prawdopodobnie stymuluje tworzenie ko sci (efekt nie stwierdzony dla SERM lub estrogenu) i dalsze zmniejszenie resorpcji ko sci ponad, efekt uzyskany przez EM-800. Co wa zne, kombinacja EM-800 i DHEA u szczurów z wyci etymi jajnikami leczonymi dla 12 mie- siecy wykazuje korzystny wp lyw na morfometri e ko sci. Obj etosc ko sci beleczkowatej jest szczególnie wa zna dla wytrzyma lo sci ko sci i dla zapobiegania p ekni eciom ko sci. Tak wi ec, w powy zej wspomnia- nym studium, obj eto sc ko sci beleczkowatej piszczeli wzros la od 4,1 ± 0,7% u szczurów z wyci etymi jajnikami do 11,9 ± 0,6% (p < 0,01) dla samego DHEA, podczas gdy dodanie EM-800 do DHEA do- datkowo zwi ekszy lo obj etosc ko sci beleczkowatej o 14,7 ± 1,4%, wartosc podobna do znalezionej u nietkni etych zwierz at kontrolnych (fig. 6). Od warto sci 0,57 ± 0,08 na mm u szczurów z wyci etymi jajnikami, terapia DHEA da la 137% wzrost liczby ko sci beleczkowych w porównaniu ze zwierz etami kontrolnymi z wyci etymi jajnikami. Wp lyw stymuluj acy DHEA osi agn al wi ec 1,27 ± 0,1 na mm, podczas gdy równoczesna terapia EM-800 i DHEA da la dodatkowy 28% wzrost liczby ko sci beleczkowych (p < 0,01) w porównaniu z uzyskanym przez sam DHEA (fig. 7). Podobnie, dodanie EM-800 do terapii DHEA da lo dodatkowy 15% (p < 0,05) spadek oddzielania ko sci beleczkowych, w porównaniu z uzyskiwanym z samym DHEA, prowadz ac do warto sci nie ró zni acych si e od obserwowanych u nietkni etych zwierz at kontrolnych. W uzupe lnieniu do danych numerycznych przedstawionych na fig. 6 i 7, fig. 8 ilustruje wzrost obj eto sci ko sci beleczkowatej w bliskiej przynasadzie piszczeli indukowany przez DHEA u potrakto- wanych zwierz at z wyci etymi jajnikami (C) w porównaniu z kontrolnymi z wyci etymi jajnikami (B), jak te z cz esciow a inhibicj e wp lywu stymuluj acego DHEA po dodaniu Flutamidu do terapii DHEA (D). Z drugiej strony, podawanie DHEA w kombinacji z EM-800 spowodowa lo ca lkowite zapobiegni ecie indukowanej wyci eciem jajników osteopenii (E), przy czym obj eto sc ko sci beleczkowatej jest porów- nywalna z obserwowan a u nietkni etych zwierz at kontrolnych (A). Utrata ko sci obserwowana przy menopauzie u kobiet jest prawdopodobnie spokrewniona ze wzrostem szybko sci resorpcji ko sci, która nie jest w pe lni skompensowana przez wtórne zwi ekszenie tworzenia ko sci. Istotnie, parametry tworzenia ko sci i resorpcji ko sci rosn a w osteoporozie i resorpcja ko sci i jej tworzenie s a hamowane estrogenow a terapi a substytucyjn a. Dzia lanie hamuj ace substytucji estrogenowej na tworzenie ko sci prawdopodobnie wynika ze sprz ezonego mechanizmu pomi edzy resorpcj a ko sci i tworzeniem ko sci, takiego, ze pierwotna indukowana estrogenem redukcja resorpcji ko sci poci aga za sob a redukcj e tworzenia ko sci (Parfitt, Calcined Tissue International 36 Suppl. 1: S37-S45, 1984). Wytrzyma losc ko sci g abczastej i dalsza odporno sc na p ekanie zale zy nie tylko od calkowitej ilo- sci ko sci g abczastej, lecz tak ze od beleczkowatej mikrostruktury, okre slanej liczb a, rozmiarem i dys- trybucj a beleczek. Utracie funkcji jajeczkowania u kobiet po menopauzie towarzyszy znacz acy spadek lacznej obj eto sci ko sci beleczkowatej (Melsen i in., Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 86: 70-81, 1978; Vakamatsou i in., Calcified Tissue International 37: 594-597, 1985), g lównie zwi azany ze spadkiem liczby i w mniejszym stopniu szeroko sci beleczek (Weinstein i Hutson, Bone 8: 137- -142, 1987). W niniejszym badaniu androgenny wp lyw stymuluj acy DHEA obserwowano na prawie wszyst- kich badanych parametrach histomorfometrycznych ko sci. DHEA spowodowa l wi ec znacz acy wzrost obj eto sci ko sci beleczkowatej, jak te z liczby beleczek, podczas gdy zmniejszy l powierzchni e mi edzy- beleczkowat a. Kompozycja wed lug wynalazku mo ze by c odpowiednia do podawania w dowolny tradycyjny sposób, w tym mi edzy innymi doustnego podawania, podskórnej iniekcji, domi esniowej iniekcji lub przezskórnego podawania. Zestaw mo ze obejmowa c odpowiednie substancje do doustnego podawa- nia, np. tabletki, kapsu lki, syropy i tym podobne oraz do przezskórnego podawania, np. ma sci, mlecz- ka, zele, kremy, plastry przed lu zonego uwalniania i tym podobne. Zg laszaj acy s adz a, ze podawanie SERM i prekursorów sterydów p lciowych mo zna wykorzysta c w leczeniu i/lub zapobieganiu rozwoju osteoporozy, raka piersi, hipercholesterolemii, hiperlipidemii lub mia zd zycy t etnic. Sk ladnik czynny do podawania przezskórnego lub przez sluzówkowego jest korzyst-PL 203 439 B1 12 nie obecny w ilo sci od 0,5% do 20% wagowych lacznej masy kompozycji farmaceutycznej, korzystniej pomi edzy 2 i 10%. DHEA lub 5-diol powinien wyst epowa c w st ezeniu co najmniej 7% dla przezskór- nego podawania. Alternatywnie, sk ladnik czynny mo zna umie sci c w transdermalnym plastrze maj a- cym struktury znane w dziedzinie, np. struktury, takie jak przedstawione w europejskim opisie paten- towym nr 0 279 982. Przy komponowaniu jako masc, mleczko, zel lub krem lub tym podobne, zwi azek czynny mie- sza si e z odpowiednim no snikiem, który jest kompatybilny z ludzk a skór a lub sluzówk a i który polep- sza przezskórn a penetracj e zwi azku przez skór e lub sluzówk e. Odpowiednie no sniki s a znane w dzie- dzinie i obejmuj a mi edzy innymi Klucel HP i podstaw e Glaxal. Pewne s a dost epne w handlu, np. pod- stawa Glaxal dost epna z Glaxal Canada Limited Company. Inne odpowiednie no sniki mo zna znalezc u Kollera i Buri, S.T.P. Pharma 3(2), 115-124, 1987. No snik jest korzystnie takim, w którym sk ladnik(i) czynny(e) jest(s a) rozpuszczalny(e) w temperaturze otoczenia przy stosowanym st ezeniu sk ladnika czynnego. No snik powinien mie c dostateczn a lepkosc dla utrzymania inhibitora na zlokalizowanej powierzchni skóry lub sluzówki, na któr a na lo zono kompozycj e, bez sp lywania lub parowania przez okres dostateczny do zapewnienia dostatecznej penetracji prekursora przez zlokalizowan a po- wierzchni e skóry lub sluzówki i do strumienia krwi, gdzie spowoduje pozadany efekt kliniczny. No snik jest typowo mieszanin a kilku sk ladników, np. farmaceutycznie dopuszczalnych rozpuszczalników i srodka zag eszczaj acego. Mieszanina organicznych i nieorganicznych rozpuszczalników mo ze polep- szy c hydrofi low a i lipofi low a rozpuszczalno sc, np. woda i alkohol, taki jak etanol. Korzystnymi prekursorami sterydów p lciowych s a dehydroepiandrosteron (DHEA) (dost epny z Diosynth Inc., Chicago, Illinois, USA), jego przedleki (dost epne z Steraloids, Wilton, New Hampshire, USA), 5-androsten-3 ß,17 ß-diol i jego przedleki EM-1304 i EM-01474-D (dost epne z Steraloids, Wilton, New Hampshire USA). Korzystnie prekursor sterydu p lciowego komponuje si e jako zel alkoholowy zawieraj acy 2,0 do 10% triglicerydu kaprylowego-kaprynowego (Neobee M-5); 10 do 20% glikolu heksylenowego; 2,0 do 10% eteru monometyloego glikolu dietylenowego (Transutol); 2,0 do 10% Cyklomethicone (Dow Cor- ning 345); 1,0 do 2% alkoholu benzylowego i 1,0 do 5,0% hydroksypropylocelulozy (Klucel HF). No snik mo ze tak ze obejmowa c ró zne dodatki zwykle stosowana w ma sciach i mleczkach i do- brze znane w sztuce kosmetycznej i medycznej. Np. mo zna stosowa c srodki zapachowe, przeciwutle- niacze, perfumy, srodki zeluj ace, srodki zag eszczaj ace takie jak karboksymetyloceluloza, surfaktanty, stabilizatory, zmi ekczacze, srodki barwi ace i inne podobne srodki. Przy zastosowaniu do leczenia chorób uk ladowych, miejsce nak ladania na skór e powinno si e zmienia c w celu unikni ecia nadmierne- go miejscowego st ezenia sk ladnika czynnego i mo zliwej nadmiernej stymulacji skóry i gruczo lów lojo- wych przez androgenne metabolity prekursora sterydu p lciowego. W kompozycji farmaceutycznej do doustnego podawania, DHEA lub inny prekursor jest ko- rzystnie obecny w st ezeniu pomi edzy 5 i 98% wagowych ca lkowitej masy kompozycji, korzystniej po- mi edzy 50 i 98%, szczególnie pomi edzy 80 i 98%. Pojedynczy prekursor, taki jak DHEA, mo ze by c jedynym sk ladnikiem czynnym, lub alternatywnie, mo zna stosowa c wiele prekursorów i/lub ich analo- gów (np., kombinacji DHEA, DHEA-S, 5-diolu, lub kombinacji dwu lub wielu zwi azków przekszta lca-PL 203 439 B1 13 nych in vivo w DHEA, DHEA-S lub 5-diol lub kombinacji DHEA lub 5-diolu i jednego lub wielu ich analo- gów, które przekszta lcaj a si e w DHEA lub 5-diol in vivo, itp. Poziom DHEA w krwi jest ko ncowym kryte- rium adekwatnego dawkowania, który uwzgl ednia indywidualne ró znice w absorpcji i metabolizmie. Korzystnie, lekarz lecz acy, szczególnie na pocz atku leczenia, obserwuje ca lkowit a reakcj e in- dywidualnego pacjenta i poziomy DHEA w osoczu (w porównaniu z korzystnymi stezeniami w osoczu omówionymi powy zej) i obserwuje ca lkowit a reakcj e pacjenta na leczenie, reguluj ac dawki w miar e potrzeby, gdy metabolizm lub reakcja pacjentów na leczenie jest nietypowa. Terapia ta nadaje si e do nieokre slonej kontynuacji. Nale zy oczekiwa c, ze terapia DHEA i/lub 5-diolem b edzie po prostu utrzymywa la poziomy DHEA w zakresie podobnym do wyst epuj acego natu- ralnie u kobiet przed menopauz a (st ezenie w osoczu pomi edzy 4 i 10 µg na litr) lub naturalnie u m lo- dych doros lych m ezczyzn (st ezenie w osoczu pomi edzy 4 i 10 µg na litr). Zwi azek SERM lub bisfosfonian i/lub prekursor sterydu p lciowego mo zna tak ze podawa c drog a doustn a i mo zna komponowa c z konwencjonalnymi farmaceutycznymi zaróbkami, np. rozpryskowo suszon a laktoz a, mikrokrystaliczn a celuloz a i stearynianem magnezu w tabletki lub kapsu lki do doust- nego podawania. Czynn a substancj e mo zna przetworzy c w tabletki lub rdzenie dra zetek mieszaj ac ze sta lym, proszkowym no snikiem, takim jak cytrynian sodu, w eglan wapnia lub fosforan diwapnia oraz srodkami wiaz acymi, takimi jak poliwinylopirolidon, zelatyna lub pochodna celulozy, mo zliwie dodaj ac tak ze srodki smaruj ace, takie jak stearynian magnezu, lurylosiarczan sodu, „Carbowax” lub poli(glikol etyle- nowy). Oczywi scie mo zna dodawa c poprawiaj ace smak substancje w przypadku postaci do doustne- go podawania. Jako dalsze postaci mo zna stosowa c zamykane kapsu lki, np. z twardej zelatyny, jak te z dawku- jace mi ekkie zelatynowe kapsu lki obejmuj ace zmi ekczacz lub plastyfikator, np. gliceryn e. Zamykane kapsu lki zawieraj a czynn a substancj e, korzystnie w postaci granulatu, np. w mieszaninie z wype lnia- czami, takimi jak laktoza, sacharoza, mannitol, skrobie, takie jak skrobia kukurydziana lub amylopek- tyna, pochodne celulozy lub dobrze zdyspergowane kwasy krzemowe W mi ekkich zelatynowych kap- su lkach, czynna substancja jest korzystnie rozpuszczona lub zawieszona w odpowiednich cieczach, takich jak oleje ro slinne lub ciek le poli(glikole etylenowe). Mleczko, ma sc, zel lub krem powinien by c starannie wtarty w skór e, aby nie by lo wida c zadnego nadmiaru, a skóra nie powinna by c przemywana w tym regionie a z do zaj scia wi ekszo sci przezskórnej penetracji, korzystnie co najmniej 4 godziny i korzystniej co najmniej 6 godzin. Przezskórny plaster mo zna stosowa c do dostarczania prekursora znanymi technikami. Typowo nak lada si e go na znacznie d luzszy czas, np. 1 do 4 dni, lecz typowo styka sk ladnik czynny na mniej- szej powierzchni, pozwalaj ac na powolne i ci ag le dostarczanie sk ladnika czynnego. Kilka systemów dostarczania przezskórnego leków, opracowanych i zastosowanych, jest odpo- wiednich do dostarczania sk ladnika czynnego. Szybko sc uwalniania jest typowo kontrolowana przez dyfuzj e z matrycy lub przez przechodzenie sk ladnika czynnego przez kontroluj ac a b lon e. Mechaniczne aspekty urz adze n przezskórnych s a dobrze znane u szczurów i wyja sniaj a je, np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 162 037, 5 154 922, 5 135 480, 4 666 441, 4 624 665, 3 742 951, 3 797 444, 4 568 343, 5 064 654, 5 071 644, 5 071 657. Dodatkowe wyja snie- nia daje europejski opis patentowy nr 0 279 982 i brytyjskie zg loszenie patentowe nr 2 185 187. Urz adzenie mo ze by c dowolnego ogólnego typu znanego w dziedzinie, w tym urz adzeniem przezskórnego podawania z przylepn a matryc a i zbiorniczkiem. Urz adzenie mo ze obejmowa c zawie- rajace lek matryce zawieraj ace w lókna, które absorbuj a sk ladnik czynny i/lub no snik. W urz adzeniu typu zbiorniczka, zbiorniczek mo zna zdefiniowa c polimeryczn a b lon a nieprzepuszczaln a dla no snika i sk ladnika czynnego. W urz adzeniu przezskórnym, samo urz adzenie utrzymuje sk ladnik czynny w kontakcie z zadan a zlokalizowan a powierzchni a skóry. W takim urz adzeniu, lepko sc no snika dla sk ladnika czynnego jest mniej wa zna ni z w kremie lub zelu. System rozpuszczalników do przezskórnego urz adzenia mo ze obejmowa c, np. kwas oleinowy, mleczan liniowego alkoholu i glikol dipropylenowy lub inny uk lad roz- puszczalników znany w dziedzinie. Sk ladnik czynny mo zna rozpu sci c lub zawiesi c w no sniku. W celu przyczepienia do skóry, przezskórny plaster mo zna umie sci c na chirurgicznej ta smie przylepnej maj acej otwór przek luty na srodku. Lepiszcze jest korzystnie pokryte odlepian a nak ladk a do jego ochrony przed u zyciem. Typowa substancja odpowiednia dla odlepiania obejmuje polietylen i powlekany polietylenem papier, korzystnie powlekany silikonem dla latwiejszego usuwania. Dla za- stosowania urz adzenia, odlepian a nak ladk e po prostu zdziera si e i lepiszcze przyczepia do skóry pa-PL 203 439 B1 14 cjenta. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 135 480 Bannon i in. opisuj a alter- natywne urz adzenie maj ace nieprzylepne srodki do mocowania| urz adzenia na skórze. Przezskórne lub przez sluzówkowe uk lady dostarczaj ace mo zna tak ze stosowa c jako nowe i po- lepszone uk lady dostarczaj ace dla zapobiegania i/lub leczenia osteoporozy lub innych chorób, które reaguj a korzystnie na terapi e androgenami i/lub estrogenami. Selektywny modulator receptora estrogenu ma wzór cz asteczkowy z nast epuj acymi cechami: a) dwa pier scienie aromatyczne oddzielone 1 do 2 atomami w egla, oba pier scienie aromatycz- ne nie podstawione lub podstawione grup a hydroksylow a lub grup a przekszta lcan a in vivo w hydrok- syl; oraz b) lancuch boczny zawieraj acy pier scie n aromatyczny i grup e funkcyjn a trzeciorz edowej aminy lub jej sól. Jednym z korzystnych SERM jest EM-800 omawiany w PCT/CA96/00097 (WO 96/26201). Bu- dowa cz asteczkowa EM-800 jest nast epuj aca: Innym korzystnym SERM jest EM-01538: EM-1538 (tak ze nazywany EM-652 · HCl) jest chlorowodorkiem silnego antyestrogenu EM-652, w porównaniu z EM-800, EM-1538 jest prostsz a i latwiejsz a w syntezie sol a. Jest tak ze latwy do wy- dzielenia, oczyszczenia, krystalizuje i wykazuje dobr a trwa losc w stanie sta lym. Przy podawaniu EM- -800 lub EM-1538 uwa za si e, ze daj a one ten sam czynny zwi azek in vivo. Inne korzystne SERM obejmuj a Tamoxifene ((Z)-2-[4-(1,2-difenylo-1-butenylo)]-N,N-dimetylo- etanoamina) (dost epny z Zeneca, UK), Toremifene (dost epny z Orion-Farmos Pharmaceuticla, Fin- land, lub Schering-Plough), Droloxifene i CP-336156 (cis-lR-[4'-pirolidyno-etoksyfenylo]-2S-fenylo-6- -hydroksy-1,2,3,4,-tetrahydronaftalen, D-(-)-winian) (Pfizer Inc., USA), Raloxifene (Eli Lilly i CO., USA), LY 335563 i LY 353381 (Eli Lilly i Co., USA), Iodoxifene (SmithKline Beecham, USA), Levormeloxife- ne (3,4-trans-2,2-dimetylo-3-fenylo-4-[4-(2-(2-(pirolidyn-1-ylo)etoksy)fenylo]-7-metoksychroman) (Novo Nordisk, A/S/ Dania), który ujawniaj a Shalmi i in., WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; i Korsgaard i in. WO 97/25036), GW5638 (opisany przez Willsona i in., Endocrinology, 138(9), 3901-3911, 1997) i pochodne indolowe (ujawnione przez Millera i in., EP 0802183A1) i TSE 424 opracowane przez Wyeth Ayers (USA) i ujawnione w JP 10036347 (American Home Products Corporation) oraz pochodne nie sterydowych estrogenów opisane w WO 97/32837. Mo zna stosowa c dowolny SERM u zyty zgodnie z wymaganiami skuteczno sci, jak zaleca produ- cent. Odpowiednie dawki s a znane w dziedzinie. Mo zna stosowa c dowolny inny nie sterydowy anty- estrogen dostepny w handlu. Mo zna stosowa c dowolny zwi azek maj acy aktywno sc podobn a do SERM (przyk lad: Raloxifene).PL 203 439 B1 15 SERM korzystnie podaje si e w zakresie dawek 0,01 do 10 mg/kg masy cia la dziennie (korzyst- nie 0,05 do 1,0 mg/kg), korzystnie 5 mg dziennie, szczególnie 10 mg dziennie, w dwu równo podzielo- nych dawkach dla osoby o przeci etnej masie cia la przy doustnym podawaniu lub w zakresie dawek 0,003 do 3,0 mg/kg masy cia la dziennie (korzystnie 0,015 do 0,3 mg/ml), korzystnie 1,5 mg dziennie, szczególnie 3,0 mg dziennie, w dwu równo podzielonych dawkach dla osoby o przeci etnej masie cia la przy pozajelitowym podawaniu (to jest domi esniowym, podskórnym lub przezskórnym). Korzystnie SERM podaje si e wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcie nczalnikiem lub no snikiem, jak opisa- no poni zej. Korzystne bisfosfoniany obejmuj a Alendronate [kwas (4-amino-1-hydroksybutylideno)bisfosfo- nowy, sól disodowa, hydrat] dost epny z Merck Shape and Dohme pod nazw a handlow a Fosamax, Etidronate [kwas (1-hydroksyetylideno)bisfosfonowy, 2,2'-iminobisetanol] dost epny z Procter and Gamble pod nazwami handlowymi Didrocal i Didronel, Clodronate [kwas (dichlorometyleno)bisfosfo- nowy, sól disodowa] dost epny z Rhöne-Poulenc Rorer pod nazw a handlow a Bonefos lub dost epny z Boehringer Mannheim pod nazw a handlow a Ostac oraz Pamidronate kwas (3-amino-1-hydroksy- propylideno)bisfosfonowy, sól disodowa) dost epny z Geigy pod nazw a handlow a Aredia. Risedronate (kwas 1-hydroksy-2-(3-pirydynylo)etylidenobisfosfonowy, sól monosodowa) jest w badaniach klinicz- nych. Wszelkie inne bisfosfoniany dost epne w handlu mo zna stosowa c w dawkach zalecanych przez producenta. Podobnie mo zna stosowa c prekursory sterydów p lciowych w dawkach zalecanych w dziedzinie, korzystnie w dawkach odtwarzaj acych poziomy w kr azeniu do poziomów zdrowych m ez- czyzn w wieku 20-30 lat lub przedmenopauzalnych doros lych kobiet. W odniesieniu do wszystkich dawek zalecanych w wynalazku, lecz acy lekarz powinien monito- rowa c reakcj e indywidualnego pacjenta i odpowiednio ustawia c dawkowanie. P r z y k l a d 1 Substancje i metodyka Zwierz eta Samice szczurów Sprague-Dawley [Crl:CD(SD)Br] otrzymano w wieku 44-46 dni z Charles River Canada Inc. (St. Constant, Quebec) i trzymano po 2 na klatk e w swietle (12 godzin swia- t la/dziennie; w laczanie o 07:15) i srodowisku o kontrolowanej temperaturze (22 ± 2°C). Zwierz eta otrzymywa ly karm e Purina dla gryzoni i wod e z kranu w dowolnej ilo sci. Badania na zwierz etach pro- wadzono w pomieszczeniach dopuszczonych przez Canadian Council on Animal Care (CCAQ) zgod- nie z CCAC Guide for Care and Use of Experimental Anlmals. Indukcja guzów sutka przez DMBA Raki sutka indukowano przez jednorazowe podawanie do przewodu pokarmowego 20 mg DM- BA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w 1 ml oleju kukurydzianego w wieku 50-52 dni. Dwa miesi a- ce pó zniej pomiary guza prowadzono co dwa tygodnie. Rejestrowano dwie najwi eksze prostopad le srednice ka zdego guza cyrklami dla ocenienia rozmiarów guzów, jak opisano (Asselin i in., Endocrino- logy 101: 666-671, 1977). Miejsce, rozmiar i liczb e guzów zarejestrowano. Terapia Zwierz eta podzielono przypadkowo na grupy, ka zda zawieraj aca 20 szczurów, za wyj atkiem 40 zwierz at w grupie kontrolnej. Zwierz eta leczono przez 282 dni nast epuj acymi: (1) nosnikami kontrol- nymi, dla DHEA i EM-800; (2) EM-800 ((+)-7-piwaloiloksy-3-(4'-piwaloiloksyfenyllo)-4-metylo-2-(4"-(2"'- -piperydynoetoksy)fenylo)-2H-benzopitran) (75 µg, doustnie, raz dziennie) w 0,5 ml 4% etanolu, 4% poli(glikolu etylenowego)-600, 1% zelatyny, 0,9% zawiesiny NaCl; (3) DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) w 0,5 ml i 50% etanolu, 50% glikolu propylenowego; i (4) EM-800 i DHEA. Terapi e rozpo- cz eto na 3 dni przed doustnym podawaniem DMBA. EM-800 zsyntetyzowano w Dziale Chemii Me- dycznej naszego laboratorium, z DHEA zakupiono w Steraloids Inc., Wilton, NH. Wiele zwierz at kontrolnych i pewne leczone EM-800 lub DHEA zwierz eta zabito przez prze- mieszczenie kr egu szyjnego pod znieczuleniem izofluranem 6 miesi ecy po podaniu DMBA ze wzgl edu na zbyt wielkie rozmiary guzów. Warto sci rozmiarów guzów i liczba tych zabitych szczurów, wraz ze zmierzonymi w pó zniejszych okresach u zyjacych zwierz at, zastosowano do pó zniejszej analizy wy- st epowania guzów, sredniej liczby guzów na maj acego guzy szczura i srednich rozmiarów guzów na majacym guzy zwierz eciu. Pozosta le zwierz eta (9 szczurów kontrolnych i 13-19 szczurów z ka zdej innej grupy) nadal podlega lo terapii przez dalsze 3 miesi ace w celu zaobserwowania d lugoterminowej si ly zapobiegawczej DHEA i EM-800 samych lub w kombinacji. Szczury zabito 279 dni po podaniu DM- BA. Macice, pochwy i jajniki natychmiast usuni eto, uwolniono od tkanki lacznej i t luszczowej i zwa zono.PL 203 439 B1 16 Zbieranie i przetwarzanie próbek Próbki moczu z 24 godzin zebrano na koniec eksperymentu od pierwszych 9 szczurów z ka zdej grupy po przeniesieniu do klatek metabolicznych (Allentown Caging Equipment Co., Allentown, NJ). Po dwie próbki moczu zebrano i zanalizowano w ró znych dniach dla ka zdego zwierz ecia w celu zmi- nimalizowania wp lywu dziennych waha n. Tak wi ec, ka zda wartosc pokazana oznacza sredni a z dwu pomiarów przeprowadzonych w dwu ró znych dniach. 0,5 ml toluenu dodano do probówek na mocz dla zapobiegania odparowaniu moczu i wzrost bakterii i obj eto sc moczu zarejestrowano. Krew z tu lowia zebrano po zabiciu i pozostawiono do skrzepni ecia w temperaturze 4°C przez noc przed odwirowa- niem przy 3000 obrotach na minut e przez 30 minut. Analiza moczu i biochemicznych parametrów osocza Swie zych próbek u zyto do zbadania poziomu kreatyniny, wapnia i fosforu w moczu, jak te z po- ziomów w osoczu ca lkowitej aktywnosc zasadowej fosfatazy (tALP), cholesterolu i triglicerydów. Te biochemiczne parametry zmierzono automatycznie w Monarch 2000 Chemistry System (Instru- mentation Laboratory Co. Lexington, MA) w warunkach Good Laboratory Practice. Zmierzono hydro- ksyprolin e w moczu, jak opisano (Podenphant i in., Clinica Chimica Acta 142: 145-148, 1984). Pomiary masy ko sci Szczury znieczulono dootrzewnowym zastrzykiem chlorowodorku ketaminy i diazepamu w daw- kach 50 i 4 mg/kg masy cia la, odpowiednio. Ca ly ko sciec i praw a kosc udow a skanowano stosuj ac absorpcjometri e rentgenowsk a oj podwójnej energii (DEXA; QDR 2000-7.10C, Hologic, Waltham, MA) na urz adzeniu wyposa zonym w oprogramowanie Regional High Resolution. Pola skanowane mia ly wymiary 28,110 x 17,805 cm i 5,0 x 1,902 cm, rozdzielczo sci wynosi ly 0,1511 x 0,0761 cm i 0,0254 x 0,0127 cm, szybko sci skanowania odpowiednio 0,3608 i 0,0956 mm/s dla ca lego ko scca i ko sci udo- wej. Zmierzono zawarto sc minera lów w ko sci (BMC) i g esto sc mineraln a ko sci (BMD) ca lego koscca, kr egów l ed zwiowych i ko sci udowej na zeskanowanych obrazach ca lego ko scca i ko sci udowej. Analizy statystyczne Istotno sc statystyczn a zmierzono wed lug testu wielozakresowego Duncana-Kramera (Biometrics 12: 307-310, 1956). Analizy cz esto sci rozwoju guzów sutka przeprowadzono stosuj ac dok ladny test Fishera (Conover, Practical nonparametric statistics, wyd. 2, 153-170, 1980). Dane przedstawiono jako srednie ± S.E.M. Wyniki Wp lyw rozwój indukowanego DMBA raka sutka Jak zilustrowano na fig. 1, 95% zwierz at kontrolnych uzyska lo wyczuwalne guzy sutka w 29 dni po podawaniu DMBA. Terapia DHEA lub EM-800 czesciowo zapobieg la rozwojowi indukowanego DM- BA raka sutka i zapadalnosc zmala la w ten sposób odpowiednio do 57% (p < 0,01) i 38% (p < 0,01). Co ciekawe, kombinacja obu zwi azków da la znacz aco wy zsze dzia lanie hamuj ace ni z dzia lanie uzy- skiwane przez ka zdy zwi azek samodzielnie (p < 0,01 wzgl edem samego DHEA lub EM-800). W isto- cie, jedyne dwa guzy, które pojawi ly si e w grupie zwierz at potraktowanych obu zwi azkami, znikn ely przed ko ncem eksperymentu. Terapia DHEA lub EM-800 zmniejszy la sredni a liczb e guzów na maj acych guzy zwierz eciu od 4,7 ± 0,5 guzów u kontrolnych zwierz at do odpowiednio 3,4 ± 0,7 (N. S.) i 1,4 ± 0,3 (p < 0,01) gu- zów/zwierz e, podczas gdy nie znaleziono guza na koniec eksperymentu u zwierz at, które otrzymywa ly oba leki (p < 0,01 wzgl edem trzech innych grup) (fig. 2A). Jeden z dwu guzów, które znikn ely pó zniej, by l obecny od dnia 79 do dnia 201 po podaniu DM- BA, a drugi guz by l dotykalny od dnia 176 do dnia 257. Wida c z fig. 2B, ze sam DHEA lub EM-800 zmniejszy l srednie pole guza na maj acym guzy zwierz eciu od 12,8 ± 1,3 cm 2 na koniec eksperymentu do odpowiednio 10,2 ± 2,1 cm 2 (N. S.) i 7,7 ± 1,8 cm 2 (N. S.), podczas gdy terapia kombinacyjna da la warto sc zero (p < 0,01 wzgl edem trzech innych grup). Dwa guzy powsta le w grupie zwierz at potrakto- wanych DHEA i EM-800 nie uros ly wi eksze ni z 1 cm 2 . Nale zy zauwa zy c, ze rzeczywiste warto sci sredniego pola guza, jak te z srednia liczba guzów na maj acym guzy zwierz eciu w grupie kontrolnej powinna by c wy zsza ni z warto sci przedstawione na fig. 2, poniewa z wiele szczurów trzeba by lo zabi c przed ko ncem eksperymentu ze wzgl edu na nad- mierne rozmiary guzów. Warto sci zmierzone w czasie zabicia do laczono wi ec jako takie do oblicze n dokonywanych pó zniej w celu zminimalizowania tendencji w grupie kontrolnej, która, w ka zdym przypadku, pozosta- wa la znacz aco powy zej innych grup.PL 203 439 B1 17 Wp lyw na ko sci D lugoterminowe przezskórne podawanie DHEA samicom szczurów indukowa lo odpowiednio 6,9% (p < 0,01), 10,6% (p < 0,05), i 8,2% (p < 0,01) wzrosty g esto sci mineralnej ko sci (BMD) ca lego ko scca, kr egów l ed zwiowych i ko sci udowej (tablica 2). Z drugiej strony, nie znaleziono znacz acych zmian u zwierz at potraktowanych EM-800. Ponadto, gdy| oba zwi azki podawano jednocze snie, otrzy- mane warto sci by ly porównywalne z uzyskiwanymi z samym DHEA. Terapia DHEA zwi ekszy la poziomy w osoczu aktywno sci lacznej zasadowej fosfatazy (tALP) o 74% (p < 0,05), lecz nie mia la wp lywu na dzienne wydalanie w moczu wapnia i fosforu i stosunek w moczu hydroksyproliny do kreatyniny (tablica 3). Z drugiej strony, terapia EM-800 zmniejszy la stosunek hydroksyproliny do kreatyniny w moczu o 48% (p < 0,01), lecz nie mia la statystycznie znacz acego wp lywu na dzienne wydalanie w moczu wapnia lub fosforu i poziomy aktywno sci tALP w osoczu. Kombinacja DHEA i EM-800 doprowadzi la do wzrostu poziomów aktywnosci w osoczu tALP (p < 0,01) |podobnie do uzyskanych z samym DHEA i zmniejszonego stosunku hydroksyproliny do kreatyniny w moczu o 69%, warto sci znacz aco (p < 0,01) ni zszej ni z uzyskana z samym EM-800. Po- nadto kombinacja obu leków znacz aco zmniejszy la dzienne wydalacie w moczu wapnia i fosforu o od- powiednio 84% (p < 0,01) i 56% (p < 0,01), podczas gdy nie zauwa zono znacz acej zmiany dla ka zde- go leku samego (tablica 3). Wp lyw na poziomy w osoczu lipidów D lugoterminowa terapia EM-800 obni za la poziomy w osoczu triglicerydów i cholesterolu odpo- wiednio o 72% (p < 0,01) i 45% (p < 0,01), podczas gdy d lugoterminowe podawanie DHEA zmniejszy- lo poziomy w osoczu triglicerydów o 60% (p < 0,01), a poziomy cholesterolu we krwi nie zmieni ly si e. Ponadto, 42% (p < 0,01) i 52% (p < 0,01) spadki st eze n w osoczu triglicerydów i cholesterolu zmie- rzono u zwierz at potraktowanych EM-800 i DHEA (fig. 3). T a b l i c a 2 Wp lyw leczenia DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) lub EM-800 (75 µg, doustnie, raz dziennie) samymi lub w kombinacji przez 9 miesi ecy na g esto sc mineraln a ko sci (BMD) ko sci udowej, kr egów l ed zwiowych i ca lego ko scca u samic szczura. Pomiary przeprowadzono dla 9 szczurów na grup e G esto sc mineralna ko sci (g/cm 2 ) Grupa Ca ly ko sciec Kr egi l ed zwiowe Ko sci udowe Kontrolna 0,1371 ± 0,0025 0,195 ± 0,0067 0,3151 ± 0,0063 DHEA (10 mg) 0,1465 ± 0,0010** 0,2161 ± 0,0049* 0,3408 ± 0,0038** EM-800 (75 µg) 0,1356 ± 0,0017 0,1885 ± 0,0045 0,3097 ± 0,0047 DHEA + EM-800 0,1498 ± 0,0019** 0,210 ± 0, 0061 0,3412 ± 0,0056** *: p < 0,05; **: p < 0,01, eksperyment wzgl edem kontroli T a b l i c a 3 Wp lyw leczenia DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) lub EM-800 (75 µg, doustnie, raz dziennie) samym lub w kombinacji przez 9 miesi ecy na parametry metabolizmu ko sci u szczura: dzienne wydalanie w moczu wapnia i fosforu, stosunek w moczu hydroksyproliny do kreatyniny (HP/Cr) oraz poziomy aktywno sci lacznej zasadowej fosfatazy w osoczu (tALP). Próbki otrzymano dla 9 zwierz at w grupie Mocz Osocze Grupa Wap n ( µmol/ /24 h/100 g) Fosfor ( µmol/ /24 h/100 g) HP/Cr (µmol/mmol) tALP(IU/1) Kontrolna 23,17 ± 1,55 132,72 ± 6,08 13,04 ± 2,19 114,25 ± 14,04 DHEA (10 mg) 25,87 ± 3,54 151,41 ± 14,57 14,02 ± 1,59 198,38 ± 30,76* EM-800(75 fig) 17,44 ± 4,5 102,03 ± 25,13 6,81 ± 0,84** 114,11 ± 11,26 DHEA + EM-800 3,71 ± 0,75** 59,06 ± 4,76** 4,06 ± 0,28** 204,38 ± 14,20** *: p < 0,05; **: p < 0,01 eksperyment wzgl edem kontroliPL 203 439 B1 18 P r z y k l a d 2 Streszczenie W gruczole sutkowym androgeny powstaj a z prekursora sterydu dehydroepiandrosteronu (DHEA). Kliniczne dowody wskazuj a, ze androgeny maj a dzia lanie hamuj ace na raka piersi. Estroge- ny, z drugiej strony, stymuluj a rozwój i wzrost raka piersi. Zbadali smy wp lyw DHEA samego lub w kombinacji z nowo opisanym czystym antyestrogenem, EM-800, na wzrost heteroprzeszczepów guzów tworzonych przez lini e komórek ludzkiego raka piersi ZR-75-1 u nagich myszy z wyci etymi jajnikami. Myszy otrzyma ly dzienn a podskórn a iniekcj e 0,5 µg estronu (hormonu estrogennego) zaraz po wyci eciu jajników. EM-800 (15, 50 lub 100 µg) podawano doustnie raz dziennie. DHEA podawano dwa razy dziennie ( laczna dawka 0,3, 1,0 lub 3,0 mg) na skór e grzbietu sam lub w kombinacji z 15 µg dziennie doustnej dawki EM-800. Zmiany w rozmiarach guzów w odpowiedzi na terapi e oceniano periodycznie w odniesieniu do pomiarów z pierwszego dnia. Na koniec eksperymentów guzy wyci eto i zwa zono. 9,4-krotny wzrost rozmiarów guzów w czasie 9,5 miesi aca zaobserwowano u myszy z wyci etymi jajnikami otrzymuj acych sam estron w porównaniu z myszami nie otrzymuj acymi estronu. Podawanie 15, 50 lub 100 µg EM-800 u otrzymuj acych estron u myszy z wyci etymi jajnikami doprowadzi lo do zahamowania odpowiednio 88%, 93% i 94% rozmiarów guzów. DHEA, z drugiej strony, w dawkach 0,3, 1,0 lub 3,0 mg hamowa la ko ncow a mas e guza odpowiednio o 67%, 82% i 85%. Porównywaln a inhibicj e rozmiarowych guzów otrzymano przy dziennej 15 µg doustnej dawce EM-800 w obecno sci lub bez ró znych dawek przezskórnych DHEA. DHEA i EM-800 niezale znie t lumily wzrost stymulowanych estronem mysich heteroprzeszcze- pów guzów ZR-75-1 u nagich myszy. Podawanie DHEA w zdefiniowanych dawkach nie zmienia dzia- lania hamuj acego EM-800. Materia ly i metodyka Komórki ZR-75-1 Komórki ludzkiego raka piersi ZR-75-1 otrzymano z American Type Culture Collection (Rockville, MD) i rutynowo hodowano jako monowarstwy w po zywce RPMl 1640 uzupelnionej 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 IU penicyliny/ml, 100 µg streptomycyny/ml oraz 10% p lodowej surowicy bydl ecej, w wilgotnej atmosferze 95% powietrza/5% CO 2 w temperaturze 37°C, jak opisano (Poulin i Labri, Cancer Res. 46: 4933-4937, 1986; Poulin i in., Breast Caiticer Res. Treat., 12: 213-225, 1988). Komórki poddawano pasa zowaniu co tydzie n po potraktowaniu 0,05% trypsyn a: 0,02% EDTA (wago- wo). Kultury bakterii u zyte w eksperymentach opisane w tym raporcie uzyskano z pasa zu 93 linii ko- mórkowej ZR-75-1. Samice homozygotycznych Harian Sprague-Dawley (nu/nu) bezgrasiczych myszy (wiek 28 do 42 dni) otrzymano z HSD (Indianapolis, Indiana, USA). Myszy trzymano w winylowych klatkach z fil- trem powietrza w dachu w kapturach z laminarnym przep lywem powietrza i w warunkach ograniczonej liczby patogenów. Klatki, pod sció lk e i pokarm autoklawowano przed u zyciem. Wod e autoklawowano, zakwaszano do pH 2,8 i podawano w dowolnej ilo sci. Szczepienie komórek Myszom wyci eto oba jajniki (OVX) na tydzie n przed zaszczepieniem komórek guza pod znie- czuleniem dootrzewnow a iniekcj a 0,25 ml/zwierz e Avertin (alkohol amylowy: 0,8 g/100 ml 0,9% NaCl oraz tribromoetanol: 2 g/100 ml 0,9% NaCl). 1,5 x 10 komórek ZR-75-1 w logarytmicznej fazie wzrostu zebrano po potraktowaniu monowarstwy 0,05% trypsyny/0,02% EDTA (wagowo), zawieszono w 0,1 ml po zywki kultury zawieraj acej 25% Matrigel i zaszczepiono podskórnie z obu boków zwierz etom stosu- jac strzykawk e nr 20 i jednocalow a ig le, jak opisano wcze sniej (Dauvois i in., Cancer Res. 51: 3131- -3135, 1991). W celu u latwienia wzrostu guzów, ka zde zwierz e otrzyma lo dzienn a podskórn a iniekcj e 10 µg estradiolu (E 2 ) w no sniku z lo zonym z 0,9% NaCl, 5% etanolu, 1% zelatyny przez 5 tygodni. Po pojawieniu si e dotykalnych guzów ZR-75-1, srednic e guza zmierzono cyrklami i myszy maj ace srednic e guza pomi edzy 0,2 i 0,7 cm wybrano do tego badania. Terapia hormonalna Wszystkie zwierz eta, poza tymi z grupy kontrolnej OVX otrzyma ly codzienne podskórne iniekcje 0,5 µg estronu (E 1 ) w 0,2 ml 0,9% NaCl, 5% etanolu, 1% zelatyny. We wskazanych grupach, DHEA podawano przezskórnie dwa razy dziennie przy dawkach 0,3, 1,0 lub 3,0 mg/zwierz e podawanychPL 203 439 B1 19 w obj eto sci 0,02 ml na skórze grzbietu poza powierzchni a wzrostu guza. DHEA rozpuszczono w 50% etanolu, 50% glikolu propylenowego. EM-800, ((+)-7-piwaloiloksy-3-(4’-piwaloiloksyfenylo)-4-metylo-2- -(4"-(2"'-piperydynoetoksy)fenylo)-2H-benzopiran), zsyntetyzowano jak opisano wcze sniej (Gauthier i in., J. Med. Chem. 40: 2117-2122, 1997) w dziale chemii medycznej Laboratory of Molecular Endo- crinology CHUL Research Center. EM-800 rozpuszczono w 4% (obj eto sciowo) etanolu, 4% (obj eto- sciowo) poli(glikolu etylenowego) (PEG) 600, 1% (wagowo) zelatyny, 0,9% (wagowo) NaCl. Zwierz eta wskazanych grup otrzyma ly dzienne doustne dawki 15 µg, 50 µg lub 100 µg EM-800 samego lub w kombinacji z DHEA, podczas gdy zwierz eta z grupy OVX otrzyma ly sam no snik (0,2 ml 4% etanol, 4% PEG 600, 1% zelatyny, 0,9% NaCl. Guzy mierzono raz na tydzie n cyrklem Verniera. Rejestrowano prostopad le srednice w cm (L i W) i pole guza (cm 2 ) obliczano stosuj ac wzór: L/2 x W/2 x p (Dauvois i in., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). Pole zmierzone pierwszego dnia leczenia przyj eto jako 100% i zmiany w rozmiarach guzów wyra zano jako procent pocz atkowego pola guza. W przypadku pod- skórnych guzów ogólnie nie jest (mo zliwy dok ladny dost ep w trzech wymiarach do guza, tak wi ec zmierzono tylko pola guzów. Po 291 dniach (lub 9,5 miesi acach) leczenia, zwierz eta zabito. Kategorie odpowiedzi oceniono jak opisano (Dauvois i in., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299- -306, 1989; Dauvois i in., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 891-897, 1989; Labrie i in., Breast Cancer Res. Treat. 33: 237-244, 1995). W skrócie, cz esciowa regresja odpowiada guzom, które zmniejszy ly sie o 50% lub wi ecej ni z 50% pocz atkowych rozmiarów; trwa la odpowied z odnosi si e do guzów, które zmniejszy ly si e o mniej ni z 50% pocz atkowych rozmiarów lub powi ekszy ly o mniej ni z 50% pocz atko- wych rozmiarów, podczas gdy kompletna regresja odnosi si e do guzów, które by ly niewykrywalne na koniec leczenia. Progresja odnosi si e do guzów, które powi ekszy ly si e o wi ecej ni z 50% w porównaniu z ich po- cz atkowymi rozmiarami. Na koniec eksperymentu wszystkie zwierz eta zabito przez odci ecie g lów. Guzy, macic e i pochw e natychmiast usuni eto, uwolniono od tkanki lacznej i t luszczowej i zwa zano. Analiza statystyczna Istotno sc statystyczn a wp lywu leczenia na rozmiary guzów oceniono stosuj ac analiz e wariancji (ANOVA) oceniaj ac a wp lyw zwi azany z DHEA, EM-800 i czasem i ponowne pomiary u tych samych zwierz at przeprowadzono na pocz atku i na ko ncu terapii (osobnicy w grupie czynnikowej). Powtórzone pomiary w czasie 0 i po 9,5 miesi aca leczenia stanowi a stochastyczny blok zwierz at. Czas zanalizo- wano wi ec jako efekt wewn atrzblokowy, podczas gdy obie terapie oceniono jako efekty mi edzy- blokowe. Wszystkie interakcje pomi edzy g lównymi efektami do laczono do modelu. Znaczenie czynni- ków terapii i ich interakcji zanalizowano stosuj ac osobników w grupie jako czynnik b ledu. Dane prze- kszta lcono logarytmicznie. Hipotezy b ed ace podstaw a ANOVA zak lada ly normalno sc reszt i jednorod- nosc wariancji. Porównania parami a posteriori przeprowadzono stosuj ac test Fishera dla najmniej znacz acej ró znicy. G lówne wp lywy i interakcje terapii na mas e cia la i mas e narz adów zanalizowano stosuj ac standardow a dwukierunkow a ANOVA z interakcjami. Wszystkie analizy ANOVA przeprowadzono stosuj ac program SAS (SAS Institute, Cary, NC, USA). Istotno sc ró znic deklarowano stosuj ac dwu- stronny test z lacznym poziomem 5%. Dane w kategoriach zanalizowani testem Kruskalla-Wallisa dla zorganizowanych kategoryjnych zmiennych odpowiedzi (pe lna odpowied z, cz esciowa odpowied z, trwa la odpowied z i progresja guza). Po ogólnej ocenie wyników terapii podgrup e wyników zaprezentowan a w tablicy 4 zanalizowano ustawiaj ac krytyczn a wartosc p dla wielokrotnych porówna n. Dok ladne warto sci p obliczono stosuj ac program StatXactp (Cytel, Cambridge, MA, USA). Dane wyra zono jako srednie ± b lad standardowy sredniej (SEM) 12 do 15 myszy w ka zdej grupie. Wyniki Jak zilustrowano na fig. 4A, ludzkie guzy ZR-75-1 zwi ekszy ly si e 9,4-krotnie w czasie 291 dni (9,5 miesiaca) u nagich myszy z wyci etymi jajnikami potraktowanych dzienn a 0,5 µg podskórnie po- dawan a dawk a estronu, podczas gdy u kontrolnych myszy OVX, które otrzymywa ly sam no snik, roz- miary guzów zmniejszy ly si e do 36,9% pocz atkowej warto sci podczas trwania badania. Terapia rosn acymi dawkami przezskórnymi DHEA spowodowa la post epuj ac a inhibicj e stymu- lowanego E 1 wzrostu guza ZR-75-1. Inhibicje 50,4%, 76,8% i 80,0% osi agni eto przez 9,5 miesi aca leczenia przy odpowiednio 0,3 mg, 1,0 mg i 3,0 mg dziennych dawek DHEA na zwierz e (fig. 4A). Zgodnie ze spadkiem ca lkowitej ilo sci nowotworu, terapia DHEA doprowadzi la do znacz acego spadku sredniej masy guzów pozosta lych na koniec eksperymentu.PL 203 439 B1 20 W istocie, srednia masa guza zmniejszy la si e od 1,12 ± 0,26 g u kontrolnych traktowanych E 1 nagich myszy z wyci etymi jajnikami do odpowiednio 0,37 ± 0,12 g (P = 0,005), 0,20 ± 0,06 g (P = 0,001) i 0,17 ± 0,06 g (P = 0,0009) w grupie zwierz at otrzymuj acej dziennie 0,3, 1,0 i 3,0 mg dawki DHEA (fig. 4B). Przy dziennych dawkach 15 µg, 50 µg i 100 µg, antyestrogen EM-800 hamowa l stymulowane estrogenem rozmiary guzów o odpowiednio 87,5% (P < 0,0001), 9,5% (P < 0,0001) i 94,0% (P = 0,0003) (fig. 5A) w porównaniu z rozmiarami guzów u kontrolnych zwierz at po 9,5 miesi aca. Redukcje rozmiarów guzów uzyskane z trzema dawkami EM- 800 nie ró zni a si e znacz aco po- mi edzy sob a. Jak zilustrowano na fig. 4B, masa guza na koniec 9,5-miesi ecznego badania zmniejszy- la si e od 1,12 ± 0,26 g u kontrolnych traktowanych E 1 myszach OVX do 0,08 ± 0,03 g, 0,03 ± 0,01 g i 0,04 ± 0,03 g u zwierz at potraktowanych dziennie 15 µg, 50 µg i 100 µg dawkami EM-800, odpo- wiednio (P < 0,0001 przy wszystkich dawkach EM-800 wzgl edem traktowanych E 1 OVX). Jak wspomniano powy zej, antyestrogen EM-800, przy dziennej doustnej dawce 15 µg, spowo- dowa l 87,5% inhibicji stymulowanego estronem wzrostu guza mierzonego po 9,5 miesi aca. Dodanie DHEA przy trzech u zytych dawkach nie mia lo znacz acego wp lywu na ju z znacz ac a inhibicj e rozmia- rów guzów uzyskiwane przy 15 µg dziennej dawce antyestrogenu EM-800 (fig. 5B). Tak wi ec, srednia masa guza zosta la silnie zmniejszona od 1,12 ± 0,26 g u kontrolnych traktowanych estronem myszy do 0,08 ± 0,03 g (P < 0001), 0,11 ± 0,04 g (P = 0,0002), 0,13 ± 0,07 g (P = 0, 0004) i 0,08 ± 0,05 g (P < 0001) u zwierz at, które otrzymywa ly dzienn a dawk e 15 µg antyestrogenu samego lub w kombi- nacji z odpowiednio 0,3, 1,0, i 3,0 mg dawkami DHEA (nie zauwa zono znacz acej ró znicy pomi edzy 4 grupami) (fig. 4B). Ciekawie te z by lo zbada c kategorie odpowiedzi uzyskane przy powy zej wskazanych terapiach. Tak wi ec, terapia rosn acymi dawkami DHEA zmniejszy la, chocia z nie do poziomu istotno sci staty- stycznej (P = 0,088), liczb e rosn acych guzów, od 87,5% u kontrolnych zwierz at OVX traktowanych estronem do warto sci 50,0%, 53,3% i 66,7% u zwierz at potraktowanych dziennymi dawkami 0,3, 1,0 lub 3,0 mg DHEA (tablica 4). Pe lne odpowiedzi, z drugiej strony, wzrasta ly od 0% u traktowanych estronem myszy do 28,6%, 26,7% i 20,0% u zwierz at utrzymuj acych 0,3, 1,0 i 3,0 mg dziennej dawki przezskórnej DHEA. Trwa le odpowiedzi, z drugiej strony, zmierzono uzyskuj ac 12,5%, 21,4%, 20,0% i 13,3% u kon- trolnych traktowanych myszy i w trzech grupach zwierz at, które otrzymywa ly odpowiednio powy zej wskazane dawki DHEA. U kontrolnych myszy z wyci etymi jajnikami wielko sci kompletnych, cz escio- wych i trwa lych odpowiedzi zmierzono uzyskuj ac odpowiednio 68,8%, 6,2% i 18,8%, podczas gdy progresj e widziano tylko dla 6,2% guzów (tablica 4). Pe lne odpowiedzi lub znikniecie guzów uzyskano dla 29,4%, 33,3%, 26,7% i 35,3% guzów u zwierz at, które otrzymywa ly sam andestrogen EM-800 (P = 0,0006) (15 µg) lub w kombinacji odpo- wiednio z 0,3 mg, 1,0 mg lub 3,0 mg DHEA (tablica 4). Progresj e, z drugiej strony, zauwa zono dla odpowiednio 35,3%, 44,4%, 53,3% i 17,6% guzów w tej samej grupie zwierz at. Nie ma znacz acej ró znicy pomi edzy grupami potraktowanymi EM-800, samym lub w kombinacji z DHEA. Nie zauwa zono zadnego znacz acego wp lywu terapii DHEA lub EM-800 na mas e cia la z uwzgl ednieniem masy guza. Terapia myszy 0VX estronem zwi eksza la mas e macicy od 28 ± 5 mg u kontrolnych myszy OVX do 132 ± 8 mg (P < 0,01), podczas gdy zwi ekszanie dawek DHEA spowo- dowa lo progresywn a, lecz wzgl ednie ma la inhibicj e wp lywu stymuluj acego estronu, który osi agn al 26% (P = 0,0008) przy najwy zszej u zytej dawce DHEA. Wida c z tej samej figury, ze masa macicy stymulowanej estronem zmniejszy la si e ze 132 ± 8 mg u kontrolnych traktowanych estronem myszy do 49 ± 3 mg, 36 ± 2 mg i 32 ± 1 mg (P < 0,0001 przy wszystkich dawkach wzgl edem kontrolnych) z dziennymi doustnymi dawkami odpowiednio 15 µg, 50 µg lub 100 µg EM-800 ( lacznie P < 0, 0001). 15 µg EM-800 w kombinacji z 0,3 mg, 1,0 mg lub 3,0 mg dziennej dawki DHEA da lo zmierzon a mas e macicy odpowiednio 46 ± 3 mg, 59 ± 5 mg i 69 ± 3 mg. Z drugiej strony, terapia estronem zwi eksza mas e pochwy od 14 ± 2 mg u zwierz at OVX do 31 ± 2 mg (P < 0,01), podczas gdy dodanie DHEA nie mia lo znacz acego wp lywu. Masa pochwy zmniej- szy la si e nast epnie do 23 ± 1 mg, 15 ± 1 mg i 11 ± 1 mg po terapii dziennymi odpowiednio 15 µg, 50 µg lub 100 µg dawkami EM-800 (ca lkowite p i P < 0,0001 dla par przy wszystkich dawkach wzgl edem kontrolnych).PL 203 439 B1 21 W kombinacji z 0,3 mg, 1,0 mg lub 3,0 mg dawkami DHEA i EM-800, mas e pochwy zmierzono otrzymuj ac odpowiednio 22 ± 1 mg, 25 ± 2 mg i 23 ± 1 mg (N. S. dla wszystkich grup wzgl edem 15 µg EM-800). Nale zy zauwa zy c, ze przy najwy zszej u zytej dawce, 100 µg dziennie, EM-800 zmniejszy l mas e macicy w traktowanych estronem zwierz etach OVX do warto sci nie ró znej od warto sci dla kon- trolnych OVX, podczas gdy masa pochwy zmniejszy la si e do warto sci poni zej zmierzonej dla kontrol- nych zwierz at OVX (P < 0,05). DHEA, zapewne wskutek jego androgennego wp lywu, cz esciowo zwal- cza l wp lyw EM-800 na mas e macicy i pochwy. T a b l i c a 4 Wp lyw przezskórnego podawania DHEA lub doustnego podawania EM-800 samych lub w kombinacji przez 9,5 miesi aca na odpowiedzi (pe ln a, czesciow a, trwa la i progresj e) hetero-przeszczepów ludzkich guzów piersi ZR-75-1 u nagich myszy Kategoria odpowiedzi Pe lna Czesciowa Trwa la Progresja Grupa Laczna licz- ba zwierzat Liczba i % OVX 16 11 (68,8) 1 (6,2) 3 (18,8) 1 (6,2) OVX + E 1 (0,5 µg) 16 0 (0) 0 (0) 2 (12,5) 14 (87,5) OVX + E 1 (0,5 µg) + DHEA 0,3 mg 1,0 mg 3,0 mg 14 15 15 4 (28,6) 4 (26,7) 3 (20,0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (21,4) 3 (20,0) 2 (13,3) 7 (50,0) 8 (53,3) 10 (66,7) OVX + E 1 (0,5 µg) + EM-800 15 mg 50 mg 100 mg 17 16 16 5 (29,4) 4 (25,0) 8 (50,0) 1 (5,9) 3 (18,8) 0 (0) 5 (29,4) 5 (31,2) 3 (18,8) 6 (35,3) 4 (25,0) 5 (31,2) OVX + E 1 (0,5 µg) + EM-800 + DHEA 0,3 mg 1,0 mg 3,0 mg 18 15 17 6 (33,3) 4 (26,7) 6 (353) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 4 (22,2) 3 (20,0) 8 (47,1) 8 (44,4) 8 (53,3) 3 (17,6) E 1 = estron; DHEA = dehydroepiandrosteron; OVX = z wyci etymi jajnikami P r z y k l a d 3 Zwierz eta i terapia U zyto samic szczurów Sprague-Dawley w wieku 50 do 60 dni (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada) wa zacych oko lo 190 g w okresie wyci ecia jajników. Zwierz eta przy- zwyczajono do warunków srodowiska (temperatura: 22 ± 3°C; wilgotno sc: 50 ± 20%; cykle 12 godzin swiat la - 12 godzin nocy, w laczanie swiat la o 07:15) przez 1 tydzie n przed zabiegiem. Zwierz eta trzy- mano po trzy na klatk e i mia ly one swobodny dost ep do wody z kranu i granulowanej certyfikowanej karmy dla gryzoni (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO). Eksperyment prowadzono w po- mieszczeniu dopuszczonym przez Canadian Council on Animal Care zgodnie z CCAC Guide for Care and Use of Experimental Animals. Wyci eto jajniki 136 samicom szczurów pod znieczuleniem izofluranem w dniu 0 badania i po- dzielono je przypadkowo na 17 grup zwierz at dla przeprowadzenia bada n wyja snionych poni zej: Grupa 1: OVX Kontrolne Grupa 2: OVX + EM-800 (0,01 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 3: OVX + EM-800 (0,03 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 4: OVX + EM-800 (0,1 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 5: OVX + EM-800 (0,3 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 6: OVX + EM-800 (1 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 7: OVX + EM-01538 (0,01 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 8: OVX + EM-01538 (0,03 mg/kg, doustnie, ID)PL 203 439 B1 22 Grupa 9: OVX + EM-01538 (0,1 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 10: OVX + EM-01538 (0,3 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 11: OVX + EM-01538 (1 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 12: OVX + Raloxifene EM-1105 (0,01 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 13: OVX + Raloxifene EM-1105 (0,03 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 14: OVX + Raloxifene EM-1105 (0,1 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 15: OVX + Raloxifene EM-1105 (0,3 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 16: OVX + Raloxifene EM-1105 (1 mg/kg, doustnie, ID) Grupa 17: INT Kontrolne Podawanie leków rozpocz eto w dniu 10 badania i podawano doustnie zg lebnikiem raz dziennie do dnia 13 badania. Dawkowane zawiesiny wytworzono w 0,4% mtylocelulozie i st ezenie ustawiono odpowiednio do sredniej masy cia la grupy zanotowanej w dniu 10 badania w celu wytworzenia 0,5 ml dawkowanej zawiesiny na szczura. Oko lo 24 godziny po ostatnim dawkowaniu, wyposzczone przez noc zwierz eta zabito przez wy- krwawienie z t etnicy brzusznej pod znieczuleniem izofluranem i próbki krwi przetworzono dla wytwo- rzenia osocza. Macice usuni eto, oczyszczono z pozosta lego t luszczu i zwa zono. Test cholesterolu i triglicerydów w osoczu Laczne poziomy cholesterolu i triglicerydów w osoczu okre slono stosuj ac Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems. P r z y k l a d 4 Androsteno-3 ß,17 ß-diol (5-diol) wykazuje wewn etrzn a aktywno sc estrogenn a. Ponadto, jako prekursor sterydów p lciowych, mo ze by c przekszta lcony w aktywne androgeny i/lub inne estrogeny w obwodowych wydzielniczych tkankach. W celu przetestowania wzgl ednej wa zno sci androgennych i estrogennych sk ladników dzia lania 5-diolu na mas e ko sci, 21-tygodniowym szczurom wyci eto jajniki i traktowano przezskórnie raz dzien- nie 2, 5 lub 12,5 mg 5-diolu samego lub w kombinacji z anty-androgenem Flutamide (FLU, 10 mg podskórnie, raz dziennie) i/lub antyestrogenem EM-800 (100 µg, podskórnie, raz dziennie) przez 12 miesi ecy. Gesto sc mineraln a ko sci (BMD) zmierzono po 11 miesi acach terapii. Wypi ecie jajników (OVX) doprowadzi lo do 12,8% spadku w udowym BMD (p < 0,01), podczas gdy terapia najwy zsz a dawk a 5-diolu odtworzy la 34,3% udowego BMD utraconego podczas 11 miesi ecy po OVX (p < 0,01). Jednoczesne podawanie FLU ca lkowicie zapobieg lo wp lywowi stymuluj acemu 5-diolu na udowe BMD, podczas gdy dodanie EM-800 spowodowa lo dodatkow a 28,4% stymulacj e w porównaniu z wp lywem samego 5-diolu. Równoczesne podawanie 5-diolu, FLU i EM-800 tylko wyjawi lo wp lyw EM-800 (27%), poniewa z wp lyw 5-diolu zosta l ca lkowicie zablokowany przez FLU. Porównywalne wyniki otrzymano dla BMD kr egów l ed zwiowych, chocia z BMD kr egów l ed zwio- wych u szczurów OVX otrzymuj acych 12,5 mg samego 5-diolu, 12,5 mg 5-diolu + EM-800 lub 5-diol + FLU + EM-800 powróci la do warto sci nie ró zni acych si e znacz aco od tych dla nietkni etych zwierz at. Histomorfometryczna analiza pokazuje, ze wp lywy stymuluj ace 5-diolu na obj etosc ko sci, liczb e bele- czek i dzia lanie hamuj ace na oddzielanie beleczek we wtórnej g abczasto sci obszaru bliskiej przyna- sady piszczeli s a hamowane przez FLU, lecz z kolei wzmagane przez EM-800. Znacz aca stymulacja poziomu aktywno sci w osoczu zasadowej fosfatazy uzyskana po terapii 5-diolem wynosi 57% (p < 0,01 wobec 12,5 mg samego 5-diolu) i jest odwracana równoczesnym po- dawaniem FLU. Terapia 5-diolem nie mia la statystyczne znacz acego dzia lania hamuj acego na stosu- nek wapnia do kreatyniny w moczu. Najwy zsza dawka 5-diolu powodowa la znacz ace 23% (p < 0,01) zmniejszenie ilo sci cholesterolu w osoczu, podczas gdy dodanie EM-800 zmniejszy lo ilo sc cholestero- lu w osoczu o 62% (p < 0,01). Niniejsze dane wyra znie pokazuj a wp lyw stymuluj acy 5-diolu on two- rzenie ko sci i sugeruj a, ze chocia z 5-diol jest s labym estrogenem, jego wp lyw stymuluj acy na tworze- nie ko sci jest g lównie mediowany efektem androgennym. Ponadto, dodatkowe wp lywy stymuluj ace EM-800 i 5-diolu na mas e ko sci pokazuj a oszcz edzaj acy ko sci wplyw antyestrogenu EM-800 u szczu- ra. Aktywno sc obni zania poziomu cholesterolu 5-diolu i EM-800 mo ze mie c interesuj ace zastosowanie przy zapobieganiu chorobom sercowo-naczyniowym.PL 203 439 B1 23 P r z y k l a d 5 Grupa Zasadowa fosfataza w osoczu OH-prolina /kreatynina w moczu LH Poziomy mRNA GnRH Cholesterol Triglicerydy IU/l µmol/mmol ng/ml ziarn srebra na komórk e mmol/l mmol/l Nietkni eta kontrola 30 ± 3** 15,4 ± 1,3 0,09 ± 0,03** 33,7 ± 0,7** 2,28 ± 0,12 1,4 ± 0,2 Kontrola OVX 51 ± 4 11,7 ± 1,2 3,55 ± 0,50 44,0 ± 0,9 2,29 ± 0,16 1,1 ± 0,1 OVX + MPA 57 ± 4 11,7 ± 1,2 2,51 ± 0,20* 35,5 ± 0,7** 2,55 ± 0,14 1,3 ± 0,1 OVX + E 2 41 ± 5 9, 2 ± 0,9 2,37 ± 0,45* 40,4 ± 0,8** 2,02 ± 0,15 0,8 ± 0,1 OVX + DHT 56 ± 5 7,8 ± 0,7* 1,55 ± 0,27** 38,8 ± 0,7** 2,44 ± 0,16 0,9 ± 0,1 OVX + DHEA 201 ± 25** 7,3 ± 1,0* 0,02 ± 0,01** 34,5 ± 0,7** 1,78 ± 0,16* 0,8 ± 0,1 OVX + DHEA + FLU 103 ± 10** 14,5 ± 1,2 1,13 ± 0,24** 41,5 ± 0,7* 2,27 ± 0,15 0,8 ± 0,1 OVX + DHEA + EM-800 202 ± 17** 6,4 ± 1,0** LD** 39,2 ± 0, 7** 0,63 ± 0,09** 1,0 ± 0,2 LD: Granice wykrywalno sci: 0,01 ng/ml * p < 0,05; ** p < 0,01 wzgl edem kontroli OVX P r z y k l a d 6 Przyk lad syntezy korzystnego zwi azku wed lug wynalazku Synteza chlorowodorku (S)-(+)-7-hydroksy-3-(4’-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4"-(2"’-piperydyno- etoksyfenylo)-2H-1-benzopiranu, EM-01538 (EM-652, HCl)PL 203 439 B1 24 Etap A: BF 3 ·Et 2 O, toluen; 100°C; 1 godzina. Etap C: 3,4-dihydropiran, monohydrat kwasu p-toluenosulfonowego, octan etylu; 25°C pod azo- tem, 16 godzin, a nast epnie krystalizacja w izopropanolu. Etapy D, E i F: (1) piperydyna, toluen, aparat Deana i Starka, refluks pod azotem; (2) 1,8-diazabicyklo[5,4,0]udndec-7-en, DMF, refluks 3 godziny; (3) CH 3 MgCl, THF, -20 do 0°C i nast epnie temperatura pokojowa przez 24 godziny; Etapy G, H: Kwas (1S)-(+)-10-kamforosulfonowy, aceton, woda, toluen, temperatura pokojowa, 48 godzin. Etap HH: 95% etanol, 70°C, nast epnie temperatura pokojowa 3 dni. Etap HHR: Zawracanie cieczy macierzystej i przemywanie z etapu HH. Kwas (1S)-10-kamforosulfonowy, refluks; 36 godzin, nast epnie temperatura pokojowa przez 16 godzin. Etap I: (1) Wodny roztwór DMF, Na 2 CO 3 , octan etylu; (2) etanol, rozcie nczony HCl; (3) woda. Synteza 2-tetrahydropiranyloksyhydroksy-2'-(4"-tetrahydropiranyloksyfenylo)acetofenonu (4) Zawiesin e 2,4-dihydroksy-2'-(4"-hydroksyfenylo)acetofenonu 3 (97,6 g, 0,4 mol) (dost epny z Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) w 3,4-dihydropiranie (218 ml, 3,39 mol) i octanu etylu (520 ml) potraktowano monohydratem kwasu p-toluenosulfonowego (0,03 g, 0,158 mmol) w tem- peraturze oko lo 25°C. Mieszanin e reakcyjn a mieszano pod azotem bez zewn etrznego ogrzewania przez oko lo 16 godzin. Mieszanin e przemyto nast epnie roztworem wodorow eglanu sodu (1 g) i chlor- ku sodu (5 g) w wodzie (100 ml). Fazy oddzielono i faz e organiczn a przemyto solank a (20 ml). Ka zde pop luczyny ekstrahowano ponownie 50 ml octanu etylu. Wszystkie fazy organiczne polaczono i prze- s aczono przez siarczan sodu. Rozpuszczalnik (oko lo 600 ml) usuni eto przez destylacj e pod ci snieniem atmosferycznym i do- dano izopropanol (250 ml). Dodatkowy rozpuszczalnik (oko lo 300 ml) destylowano pod ci snieniem atmosferycznym i dodano izopropanol (250 ml). Dodatkowy rozpuszczalnik (oko lo 275 ml) destylowa- no pod ci snieniem atmosferycznym i dodano izopropanol (250 ml). Roztwór och lodzono w temperatu- rze oko lo 25°C z mieszaniem i po oko lo 12 godzinach krystaliczne cia lo sta le przes aczono, przemyto izopropanolem i osuszono (116,5 g, 70%). Synteza 4-hydroksy-4-metylo-2-(4’-[2"-piperydyno]etoksy)fenylo-3-(4"’-tetrahydropiranyloksy)fe- nylo-7-tetrahydropiranyloksychromanu (10) Roztwór 2-tetrahydropiranyloksy-4-hydroksy-2'-(4"-tetrahydropiranyloksyfenylo)acetofenonu 4 (1 kg, 2,42 mol), 4-[2-(1-piperydyno)etoksy]benzaldehydu 5 (594 g, 2,55 mol) (dost epny z Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) i piperydyn e (82,4 g, 0,97 mol) (dost epny z Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) w toluenie (8 l) poddawano refluksowi pod azotem z aparatem Deana i Starka do zebrania jednego równowaznika wody (44 ml). Toluen (6,5 1) usuni eto z roztworu przez destylacj e pod ci snieniem atmosferycznym. Dodano dimetyloformamid (6,5 1) i 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (110,5 g, 0,726 mol). Roztwór mieszano przez oko lo 8 godzin w temperaturze pokojowej do izomeryzacji chalkonu 8 do chromanonu 9 i na- st epnie dodano do mieszaniny wody z lodem (8 l) i toluenem (4 l). Fazy oddzielono i warstw e tolu- enow a przemyto wod a (5 l). Po laczone wodne pop luczyny ekstrahowano toluenem (3 x 4 l). Po laczo- ne ekstrakty toluenowe przemyto na koniec solank a (3 x 4 l), zat ezono pod ci snieniem atmosferycz- nym do 5,5 l i nast epnie och lodzono do -10°C. Przy ci ag lym zewn etrznym ch lodzeniu i mieszaniu pod azotem dodano 3M roztwór chlorku me- tylomagnezu w THF (2,5 l, 7,5 mol) (dost epny z Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.), utrzymuj ac temperatur e poni zej 0°C. Po dodaniu ca lo sci reagentu Grignarda zewn etrzne ch lodzenie usuni eto i mieszanin e pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej. Mieszanin e mieszano w tej temperaturze przez oko lo 24 godziny. Mieszanin e ponownie och lodzono do oko lo -20°C i przy ci ag lym zewn etrznym ch lodzeniu i mie- szaniu dodano powoli nasycony roztwór chlorku amonu (200 ml), utrzymuj ac temperatur e poni zej 20°C. Mieszanin e mieszano przez 2 godziny i nast epnie dodano nasycony roztwór chlorku amonu (2 l) i toluen (4 l) i mieszano przez 5 minut. Fazy oddzielono i warstw e wodn a ekstrahowano toluenem (2 x 4 l). Po laczone toluenowe ekstrakty przemyto rozcie nczonym kwasem chlorowodorowym, a z roztwórPL 203 439 B1 25 stal si e jednorodny i nast epnie solank a (3 x 4 l). Roztwór toluenowy zatezono na koniec pod ci snie- niem atmosferycznym do 2 l. Ten roztwór u zyto bezpo srednio w nast epnym etapie. Synteza soli kwasu (1S)-10-kamforosulfonowego (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4- -metylo-2-(4"-[2"'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu (±12) Do roztworu toluenowego 4-hydroksy-4-metylo-2-(4'-[-2"-piperydyno]etoksy)-fenylo-3-(4'"-tetra- hydropiranyloksy)fenylo-7-tetrahydropiranyloksychromanu (10) dodano aceton (6 l), wod e (0,3 l) i kwas (S)-10-kamforosulfonowy (561 g, 2,42 mol) (dost epny z Aldrich Chemical Company Inc., Mil- waukee, Wis.). Mieszanin e mieszano pod azotem przez 48 godzin, po czym stala sól kwasu (1S)-10- -kamforosulfonowego (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4"-[2"'-piperydyno]eto- ksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu (12) przes aczono, przemyto acetonem i osuszono (883 g). Tej substan- cji u zyto w nast epnym (HH) etapie bez dalszego oczyszczania. Synteza soli kwasu (1S)-10-kamforosulfonowego (2S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-me- tylo-2-(4"-[2'"-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu (13, sól (+)-EM-652(1S)-CSA) Zawiesin e soli kwasu (1S)-10-kamforosulfonowego (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4- -meylo-2-(4"-[2'"-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-benzopiranu 12 (759 g) w 95% etanolu ogrzewano z mieszaniem do oko lo 70°C, a z cia lo sta le rozpuszczono. Roztwór pozostawiono do och lodzenia do temperatury pokojowej z mieszaniem, nast epnie zaszczepiono kilkoma kryszta lami soli kwasu (1S)-10- -kamforosulfonowego (2S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4"-fenylo)-2H-1-benzopira- nu 13. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez oko lo trzy dni lacznie. Kryszta ly przes a- czono, przemyto 95% etanolem i osuszono (291 g, 76%). Wydajno sc produktu wynosi la 94,2% i czy- stosc 98,8%. Synteza chlorowodorku (S)-(+)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4"-(2’"-piperydyno- etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu, EM-01538 (EM-652, HCl) Zawiesin e zwi azku 13 (sól EM-652-(+)-CSA, 500 mg, 0,726 mmol) w dimetyloformamidzie (11 µl, 0,15 mmol) potraktowano 0,5 M wodnym roztworem w eglanu sodu (7,0 ml, 3,6 mmol) i mieszano przez 15 minut. Zawiesin e potraktowano octanem etylu (7,0 ml) i mieszano przez 4 godziny. Faz e organiczn a przemyto wodnym nasyconym roztworem w eglanu sodu (2 x 5 ml) i solank a (1 x 5 ml), osuszono nad siarczanem magnezu i zat ezono. Roztwór powsta lej ró zowej piany (EM-652) w etanolu (2 ml) potraktowano 2N kwasem chlorowodorowym (400 µl, 0,80 mmol), mieszano przez 1 godzin e, potraktowano destylowan a wod a (5 ml) i mieszano przez 30 minut. Powsta la zawiesin e przes aczono, przemyto wod a destylowan a (5 ml), osuszono na powietrzu i pod silnie zmniejszonym ci snieniem (65°C) z wytworzeniem 77%); drobny bia lawy proszek; kalorymetria skaningowa: pocz atek piku top- nienia w temperaturze 219°C, ?H = 83 J/g; [ a] 24 D = 154° w metanolu 10 mg/ml. 1 H NMR (300 MHz, CD 3 OD) d (ppm) 1,6 (szerokie, 2H, H-4'"), 1,85 (szerokie, 4H, H-3"" i 5""), 2,03 (s, 3H, CH 3 ), 3,0 i 3,45 (szerokie, 4H, H-2"" i 6""), 3,47 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-3"'), 4,26 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-2"'), 5,82 (s, 1H, H-2), 6,10 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-8), 6,35 (dd, J = 8,4, 2,43 Hz, 1H, H-6), 6,70 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-3’ i H-5’), 6,83 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-3" i H-5"), 7,01 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2' i H-6'), 7,12 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5), 7,24 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-2" i H-6"); 13 C RMN (CD 3 OD, 75 MHz) d ppm 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,02 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 158,96, 159,33. Sk lad elementarny: C, H, N, Cl: teoretycznie; 70,51, 6,53, 2,84, 7,18%, znalezione: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89%. P r z y k l a d 7 Testy in vivo biodost epno sci przedleków androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu 1) Zasada Testy biodost epno sci przedleków p lciowych przeprowadzono na samcach mierz ac st ezenia w osoczu zwi azków podawaniu zwi azków. a) Zwierz eta i terapia Samce szczurów Sprague-Dawley [Crl:CD(SD)Br] wazace 275-350 g otrzymano z Charles- -River Canada Inc. i trzymano po 2 na klatk e podczas okresu przyzwyczajania i indywidualnie pod- czas okresu bada n. Zwierz eta trzymano w re zimie 12 godzin o swietlenia: 12 godzin ciemno sci (zapa- lanie swiat la o 08:00). Zwierz eta otrzymywa ly certyfikowany pokarm dla gryzoni (Lab Diet # 5002, granulki) i wod e z kranu w dowolnej ilo sci. Szczury wyposzczono (dost ep tylko do wody) rozpoczyna- jac od wieczora przed dawkowaniem.PL 203 439 B1 26 Ka zdy zwi azek testowany podawano trzem zwierz etom jako zawiesin e w 0,4% metylocelulozie zg lebnikiem doustnym przy dawce 150 µg/szczura. Jedn a próbk e krwi ~0,7 ml pobrano z zy ly szyjnej szczurów pod znieczuleniem indukowanym Izofluranem w 1, 2, 3, 4 i 7 godzin po stosowaniu zg lebni- ka. Próbki krwi natychmiast przeniesiono do och lodzonego pojemnika 0,75 ml Microtainer zawieraj a- cego EDTA i trzymano w la zni z wod a z lodem do odwirowania przy 3000 obrotach na minut e przez 10 minut. Oddzielanie osocza przeprowadzono szybko (mniej ni z 50 minut) po zebraniu krwi. Jedn a prób- k e 0,25 ml osocza przeniesiono nast epnie do borokrzemianowej probówki (13 x 100) i szybko zamro- zono na suchym lodzie. Próbki osocza trzymano w temperaturze -80°C a z do pomiaru st ezenia w osoczu sterydów p lciowych lub prekursorów sterydów p lciowych metod a GC-MS. Wyniki Doustn a absorpcj e i AUC pokazano na fig. 12 i 13. Przyk lady kompozycji farmaceutycznej Poni zej, przyk ladowo przedstawiono kilka kompozycji farmaceutycznych wykorzystuj acych ko- rzystny czynny SERM EM-800 lub EM-1538 i korzystny czynny prekursor sterydu p lciowego DHEA, EM-1304 lub EM-01474-D. Inne zwi azki lub ich kombinacje mo zna stosowa c w miejsce (lub poza) EM- -800 lub EM-1538, DHEA, EM-1304 lub EM-01474-D. St ezenie sk ladnika czynnego mo zna zmienia c w szerokim zakresie, jak przedstawiono tutaj. Ilo sci i typy innych sk ladników, które mo zna do lacza c, s a dobrze znane w dziedzinie. P r z y k l a d A Tabletka Sk ladnik % wagowych (wzgl edem masy ca lej kompozycji) EM-800 5,0 DHEA 15,0 Zelatyny 5,0 Laktoza 58,5 Skrobia 16,5 P r z y k l a d B Kapsu lka zelatynowa Sk ladnik % wagowych (wzgl edem masy ca lej kompozycji) EM-800 5,0 DHEA 15,0 Uwodniona laktoza 65,0 Skrobia 4,8 Celuloza mikrokrystaliczna 9,8 Stearynian magnezu 0,4 Przyk lady zestawów Poni zej, przyk ladowo przedstawiono kilka zestawów wykorzystuj acych korzystny czynny SERM EM-800 lub EM-1538 i korzystny czynny prekursor sterydu p lciowego DHEA, EM-1304 lub EM-01474-D. Inne zwi azki lub ich kombinacje mo zna stosowa c w miejsce (lub poza) EM-800 lub EM-1538, DHEA, EM-1304 lub EM-01474-D. St ezenie sk ladnika czynnego mo zna zmienia c w szerokim zakresie, jak przed- stawiono tutaj. Ilo sci i typy innych sk ladników, które mo zna do lacza c, s a dobrze znane w dziedzinie. P r z y k l a d A SERM jest podawany doustnie, a prekursor sterydu p lciowego jest podawany przezskórnie.PL 203 439 B1 27 Kompozycja SERM do doustnego podawania (kapsu lki) Sk ladnik % wagowych (wzgl edem masy ca lej kompozycji) EM-800 5,0 Uwodniona laktoza 80,0 Skrobia 4,8 Celuloza mikrokrystaliczna 9,8 Stearynian magnezu 0,4 Kompozycja prekursora sterydu p lciowego do miejscowego podawania ( zel) Sk ladnik % wagowych (wzgl edem masy ca lej kompozycji) DHEA 10,0 Kaprylowy-kaprynowy trigliceryd (Neobee M-5) 5,0 Glikol heksylenowy 15,0 Transcutol (eter monomety- lowy glikolu dietylenowego) 5,0 Alkohol benzylowy 2,0 Cyklometykon (Dow Corning 345) 5,0 Etanol (absolutny) 56,0 Hydroksypropyloceluloza (1500 cps) (KLUCEL) 2,0 P r z y k l a d B SERM i prekursor sterydu p lciowego s a podawane doustnie. Niesterydowa antyestrogenowa kompozycja do doustnego podawania (kapsu lki) Sk ladnik % wagowych (wzgl edem masy ca lej kompozycji) EM-800 5,0 Uwodniona laktoza 80,0 Skrobia 4,8 Celuloza mikrokrystaliczna 9,8 Stearynian magnezu 0,4 Kompozycja prekursora sterydu p lciowego do doustnego podawania (kapsu lka zelatynowa) Sk ladnik % wagowych (wzgl edem masy ca lej kompozycji) 1 2 DHEA 15,0 Uwodniona laktoza 70,0PL 203 439 B1 28 cd. tabeli 1 2 Skrobia 4,8 Celuloza mikrokrystaliczna 9,8 Stearynian magnezu 0,4 Inne SERM mo zna podstawi c za EM-800 lub EM-01538 w powy zszych kompozycjach, jak te z inne inhibitory sterydów p lciowych mo zna podstawi c za DHEA, EM-1304 lub EM-01474-D. Mo zna do lacza c wi ecej ni z jeden SERM lub wi ecej ni z jeden prekursor, w którym to przypadku po laczony procent wagowy jest korzystnie procentem wagowym dla pojedynczego prekursora lub pojedynczego SERM podanego w przyk ladach powy zej. PL

Claims (6)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca dehydroepiandrosteron, selektywny modulator re- ceptora estrogenu i farmaceutycznie dopuszczaln a zaróbk e, znamienna tym, ze zawiera a) farmaceutycznie dopuszczaln a zaróbk e, rozcie nczalnik lub no snik; b) leczniczo skuteczn a ilo sc dehydroepiandrosteronu, c) leczniczo skuteczn a ilo sc pochodnej indolu o wzorze ogólnym w którym D wybiera si e z grupy obejmuj acej -OCH 2 CH 2 N(R 7 )R 8 , -CH=CH-CON(R 7 )R 8 , -CC-(CH 2 ) n - -(R 7 )R 8 , R 7 i R 8 niezale znie wybrane z grupy obejmuj acej C 1 -C 6 alkil lub R 7 , R 8 i atom azotu, z którym s a zwi azane, razem tworz a struktur e pier scieniow a wybran a z grupy obejmuj acej pirolidyno, dimetylo- -1-pirolidyno, metylo-1-pirolidynyl, piperydyno, heksametylenoimino i morfolino; w którym X wybiera si e z grupy obejmuj acej: atom wodoru i C 1 -C 6 alkil; w którym R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 i R 6 wybiera si e niezale znie z grupy obejmuj acej: atom wodoru, hy- droksyl, C 1 -C 6 alkil i ugrupowanie przekszta lcane in vivo w hydroksyl.
2. 2. Kompozycja farmaceutyczna wed lug zastrz. 1, znamienna tym, ze jako pochodn a indolow a zawiera zwi azek o nast epuj acym wzorze:PL 203 439 B1 29
3. 3. Zestaw, znamienny tym, ze pierwszy pojemnik zawiera leczniczo skuteczn a ilosc dehydro- epiandrosteronu i obejmuj acy drugi pojemnik zawieraj acy leczniczo skuteczna ilosc pochodnej indo- lowej, jak okre slono w zastrz. 1.
4. 4. Zestaw wed lug zastrz. 3, znamienny tym, ze jako pochodn a indolow a zawiera zwi azek o na- st epuj acym wzorze:
5. 5. Zastosowanie dehydroepiandrosteronu do wytwarzania leku do leczenia lub zmniejszania ry- zyka nabycia osteoporozy, w po laczeniu z leczniczo skuteczn a ilo scia pochodnej indolowej, jak okre- slono w zastrz. 1
6. 6. Zastosowanie wed lug zastrz. 5, znamienne tym, ze jako pochodn a indolow a stosuje si e zwi azek o nast epuj acym wzorze:PL 203 439 B1 30 RysunkiPL 203 439 B1 31PL 203 439 B1 32PL 203 439 B1 33PL 203 439 B1 34PL 203 439 B1 35PL 203 439 B1 36PL 203 439 B1 37PL 203 439 B1 38PL 203 439 B1 39PL 203 439 B1 40PL 203 439 B1 41PL 203 439 B1 42PL 203 439 B1 43PL 203 439 B1 44PL 203 439 B1 45PL 203 439 B1 46 Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 z l. PL