PT2386305E

PT2386305E - Modulador seletivo do recetor de estrogénio em combinação com a dehidroepiandrosterona (dhea) ou análogos

Info

Publication number: PT2386305E
Application number: PT111749339T
Authority: PT
Inventors: Fernand Labrie
Original assignee: Endorech Inc
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2014-04-17
Also published as: NO20006254D0; HK1040367A1; HUP0103345A3; EP1623712A2; CY1115317T1; KR20010052763A; CY1115069T1; ES2253922T3; TWI258369B; CA2768682C; EP2386304B9; JP2007191484A; US20070027124A1; US7884092B2; BR9911116A; US20070027122A1; MXPA00012306A; PL195772B1; TR200103456T2; PL203704B1

Description

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DESCRIÇÃO "MODULADOR SELETIVO DO RECETOR DE ESTROGÉNIO EM COMBINAÇÃO COM A DEHIDROEPIANDROSTERONA (DHEA) OU ANÁLOGOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao tratamento ou redução do risco de adquirir uma perda de massa muscular, utilizando uma nova terapêutica de combinação em animais de sangue quente suscetíveis, incluindo os seres humanos. Em particular, a combinação inclui a administração de um modulador seletivo do recetor de estrogénio (SERM) e o aumento do nível de precursor de esteroides sexuais do doente, sendo o precursor referido selecionado de entre o grupo que consiste em dehidroepiandrosterona (DHEA), sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S), e androst-5-βηο-3β, 173~diol (5-diol). A invenção também diz respeito a kits e composições farmacêuticas para a prática da combinação anterior.

ANTECEDENTES DA TECNOLOGIA RELACIONADA 0 ser humano é único, com alguns outros primatas, por possuir glândulas suprarrenais que segregam grandes quantidades dos precursores de esteroides sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) e dehidroepiandrosterona (DHEA), que são convertidos em androstenodiona (4-diona), e em seguida em androgénios e/ou estrogénios ativos nos tecidos periféricos (Labrie et al., em: Important advances in oncology. Editado por V.T. de Vita, S. Hellman, S.A. Rosenberg, J.B. Lippincott, Filadélfia, 193-217, 1985,

Labrie, Mol. Cell. Endocrinol., 78: C113-C118, 1991, Labrie et al., em Signal transduction in testicular cells. Workshop da Fundação de Investigação Ernst Schering. Editado por V. Hansson, F.O. Levy, K. Taskén. Springer-Verlag, Berlim - Nova Iorque (Suplemento 2), pág. 185-218, 1996, Labrie et al., Steroids, 62: 148-158, 1997). Num 2 estudo recente (Labrie et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 2403-2409, 1997), nós descrevemos um declínio dramático nos níveis de circulação de dehidroepiandrosterona (DHEA), sulfato-DHEA (DHEA-S), androst-5-eno-3β, 17p-diol (5-diol), 5-diol-S, ésteres de ácidos gordos 5-diol, e androstenodiona tanto em homens como em mulheres entre as idades de 20 e 80 anos.

Apesar da queda acentuada em androgénios endógenos em mulheres durante o envelhecimento, o uso de androgénios em mulheres pós-menopausa tem sido limitado, principalmente por causa do temor de um risco aumentado de doença cardiovascular, tal como com base em estudos mais antigos que mostram um perfil de lípidos desfavorável com androgénios. No entanto, os estudos recentes não mostraram nenhum efeito significativo de terapêutica combinada de estrogénio e androgénio sobre os níveis de colesterol no soro, de triglicéridos, de HDL, de LDL e da razão de HDL / LDL, quando comparado com o estrogénio sozinho (Sherwin et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 156: 414-419, 1987). De acordo com estas observações, temos mostrado que a DHEA, um composto que tem uma influência predominantemente androgénica, não tem aparentemente nenhum efeito deletério sobre o perfil de lípidos no soro (Diamond et al., J. Endocrinol., 150: S43-S50, 1996) . Do mesmo modo, não foi observada qualquer alteração nas concentrações de colesterol, das suas sub-frações ou nos triglicéridos, durante um tratamento com estradiol sozinho, após 6 meses de terapêutica com implantes de estradiol + testosterona (Burger et al., Br Med. J. Clin. Res. Ed., 294: 936-937, 1987) . Deve ser mencionado que um estudo no homem mostrou uma correlação inversa entre o DHEA-S no soro e as lipoproteínas de baixa densidade (Parker et al., Science, 208: 512-514, 1980). Mais recentemente, foi encontrada uma correlação entre baixos níveis de testosterona e DHEA no soro e aumento da gordura visceral, um parâmetro de maior 3 risco cardiovascular (Tchemof et al., Metabolism, 44: 513-519, 1995).

Cinco-diol é um composto biosintetizado a partir de DHEA através da ação do redutor 17p-hidroxiesteróide desidrogenase (17pHSD) e é um estrogénio fraco. Tem uma afinidade 85 vezes menor do que o 173-estradiol (E2) para o recetor de estrogénio no citosol da glândula pituitária anterior em ratos (Simard e Labrie, J. Steroid Biochem., 26: 539-546, 1987), o que confirma ainda mais os dados obtidos no mesmo parâmetro no miométrio humano e tecido de cancro da mama (Kreitmann e Bayard, J. Steroid Biochem., 11: 1589-1595, 1979, Adams et al., Câncer Res., 41: 4720- 4926, 1981, Poulin e Labrie, Câncer Res., 46: 4933-4937, 1986) . No entanto, a concentrações bem dentro da gama dos níveis de plasma encontrados em mulheres adultas, o 5-diol aumenta a proliferação celular e os níveis do recetor de progesterona em células do tumor mamário humano ZR-75-1 (Poulin e Labrie, Câncer Res., 46: 4933-4937, 1986), e aumenta a síntese dependente de estrogénio da glicoproteína de 52 kDa em células MCF-7 (Adams et al., Câncer Res., 41: 4720-4926, 1981).

Tal como mencionado anteriormente, sabe-se que os níveis de DHEA, DHEA-S e 5-diol no soro diminuem com a idade e, correspondentemente, que existe uma redução dramática dependente da idade na formação de androgénios e estrogénios em tecidos alvo periféricos. As ditas alterações na secreção de DHEA-S e de DHEA resultam num decréscimo acentuado das funções bioquímicas e celulares estimuladas por esteroides sexuais. Como resultado, a DHEA e o DHEA-S têm sido recentemente utilizados no tratamento de uma variedade de condições patológicas que estão associadas à diminuição e/ou desequilíbrio nos níveis de esteroides sexuais. A osteoporose, uma condição patológica que afeta tanto homens como mulheres, está associada a uma diminuição de 4 androgénios e estrogénios. Os estrogénios têm sido mostrados diminuir a taxa de degradação óssea, ao passo que os androgénios têm sido mostrados aumentar a massa óssea. No entanto, a terapêutica de substituição de estrogénio habitualmente utilizada contra a osteoporose, requer a adição de progestinas para contrariar a proliferação endométrica e o risco de cancro do endométrio induzido por estrogénios. Para além disso, uma vez que se pensa que tanto os estrogénios como as progestinas aumentam o risco de cancro da mama (Bardon et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 60: 692-697, 1985, Colditz et al., N. Engl. J. Med., 332: 1589-1593, 1995), o uso de terapêutica de substituição de estrogénio - progestina é aceite por um número limitado de mulheres e, normalmente, por períodos de tempo muito curtos. Vários estudos sugerem que a osteoporose é uma manifestação clínica da deficiência de androgénio em homens (Baran et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103-106, 1978, Odell e Swerdloff, West J. Med. 124: 446-475, 1976, Smith e Walker, Calif. Tissue Res. 22 (Suplemento): 225-228, 1976). Estudos mostraram que a terapêutica de androgénio, tal como observada com decanoato de nandrolona, aumenta a densidade mineral óssea vertebral em mulheres pós-menopáusicas (Need et al., Arch. Intern. Med., 149: 57-60, 1989) . A terapêutica de mulheres pós-menopáusicas com nandrolona aumentou o conteúdo mineral ósseo cortical (Need et al., Clin. Orthop. 225: 273-278, 1987) . No entanto, os efeitos secundários androgénicos foram registados em 50 % dos pacientes. Os ditos dados são de interesse uma vez que, enquanto quase todas as terapêuticas atuais são limitadas a uma redução da perda óssea, observou-se um aumento da massa óssea com a utilização do esteroide anabólico nandrolona. Tem sido sugerida uma estimulação semelhante de formação óssea por androgénios num macho hipogonadal (Baran et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103, 1978). É relatada em Labrie et 5 al., (J. Clin. Endocrinol. 82: 3498-3505, 1997) uma estimulação de formação óssea em mulheres pós-menopáusicas tratadas com DHEA durante 12 meses. A DHEA (450 mg/kg, por peso corporal, 3 vezes por semana) retardou acentuadamente o aparecimento de tumores da mama em ratinhos C3H que foram criados geneticamente para desenvolverem cancro da mama (Schwartz, Câncer Res. 39: 1129-1132, 1979). Para além disso, descobriu-se que o risco de desenvolver cancro da bexiga é aumentado em homens possuindo níveis mais baixos de DHEA no soro (Gordon et al., Câncer Res. 51: 1366-1369, 1991). O pedido de patente US 5 550 107 refere-se a um método de tratamento de cancro da mama e do endométrio em animais de sangue quente suscetíveis, o que pode incluir a inibição da secreção hormonal do ovário por meios cirúrgicos (ovariectomia) ou por meios químicos (utilização de um agonista de LHRH , por exemplo, [D-Trp6, des-Gli-NH210] LHRH etilamida, ou antagonista), como parte de uma terapêutica de combinação. São discutidos os antiestrogénios, os androgénios, as progestinas, os inibidores da formação de esteroides sexuais (especialmente de 17 β-hidroxiesteróide dehidrogenase ou produção catalisada por aromatase de esteroides sexuais), os inibidores da secreção de prolactina e da secreção da hormona do crescimento e da secreção de ACTH. O equivalente do mesmo foi publicado sob o número de publicação internacional WO 90/10462.

Para além disso, as doenças cardiovasculares têm sido associadas com a diminuição dos níveis da DHEA e do DHEA-S no soro e, tanto a DHEA como o DHEA-S têm sido sugeridos para prevenir ou tratar estas condições (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986).

Em ratos Sprague-Dawley envelhecidos, Schwartz (em Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982) observou que o peso corporal foi reduzido de 600 para 550 g por DHEA, sem afetar a ingestão de alimentos. Schwartz (Câncer 39: 1129- 6 1132, 1979) observou que os ratinhos C3H aos quais foi dada DHEA (450 mg/kg, 3 vezes por semana) ganharam significativamente menos peso e envelheceram mais do que os animais controlo, tinham menos gordura corporal e eram mais ativos. A redução do peso corporal foi alcançada sem perda de apetite ou restrição alimentar. Para além disso, a DHEA pode prevenir o ganho de peso em animais criados para se tornarem obesos na vida adulta (em Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982) . A administração de DHEA a ratos Zucher magros diminuiu o ganho de peso corporal, apesar do aumento da ingestão de alimentos. Os animais tratados tiveram bolsas de gordura menores, portanto, em geral, sugerindo que a DHEA aumenta o metabolismo dos alimentos, resultando em menor ganho de peso e acumulação de gordura (Svec et al., Proc. 2nd Int. Conf. Cortisol e Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, EUA, pág. 56, abst., 1997).

Observou-se que a obesidade melhorava no ratinho mutante Avy (Yen et al., Lipids 12: 409-413, 1977) e no rato Zucker (Clearly e Zisk, Fed. Proc. 42: 536, 1983) . Os ratinhos C3H tratados com a DHEA tinham uma aparência mais jovem do que os controlos (Schwartz, Câncer Res. 39: 1129-1132, 1979). A DHEA reduziu a incidência de aterosclerose em coelhos alimentados com colesterol (Gordon et al., J. Clin. Invest. 82: 712-720, 1988, Arad et al., Arteriosclerosis 9: 159-166, 1989) . Para além disso, estudos relataram que as concentrações elevadas de DHEA-S no soro protegem contra a morte por doenças cardiovasculares em homens (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986) . Descobriu-se, assim, que os niveis circulantes de DHEA e de DHEA-S estão inversamente correlacionados com a mortalidade por doenças cardiovasculares (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986), e diminuem em paralelo com a competência imunológica diminuída (Thoman e Weigle, 7

Adv. Immunol. 46: 221-222, 1989). Um estudo no homem, mostrou uma correlação inversa entre o DHEA-S no soro fetal e os níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) (Parker et al., Science 208: 512, 1980).

Os usos da DHEA, bem como os benefícios da terapêutica de androgénio e estrogénio, são discutidos na publicação de patente internacional WO 94/16709. Não se acredita que as correlações observadas na tecnologia anterior sugiram métodos de tratamento ou profiláticos que sejam eficazes ou tão livres de efeitos secundários indesejáveis, como as terapêuticas de combinação aqui divulgadas.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, é um objeto da presente invenção proporcionar tratamentos eficazes para a perda de massa muscular ou para a redução do risco de aquisição de perda de massa muscular, enquanto minimizam os efeitos secundários indesejáveis.

Constitui um outro objeto proporcionar kits e composições farmacêuticas adequados para utilização nos tratamentos acima referidos ou na redução do risco.

Também é divulgado um método para o tratamento ou a redução do risco de adquirir osteoporose, que compreende o aumento dos níveis de um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona (DHEA), sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) e 3ηάηοε^5-θηο-3β, 17β-diol (5-diol), num paciente com necessidade do tratamento referido ou da redução referida, e que compreende ainda a administração ao paciente referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estrogénio (SERM), como parte de uma terapêutica de combinação.

Também é divulgado um método para o tratamento ou a redução do risco de adquirir hipercolesterolemia, que compreende o aumento dos níveis de um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona e 3ηάΓθ3^5-βηο-3β, 17β-άίο1, num paciente com necessidade do tratamento referido ou da redução referida, e que compreende ainda a administração ao paciente referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estrogénio, como parte de uma terapêutica de combinação.

Também é divulgado um método para o tratamento ou a redução do risco de adquirir hiperlipidemia, que compreende o aumento dos níveis de um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona e 3ηάΓθ3ί-5-θηο-3β, 17β-άϊο1, num paciente com necessidade do tratamento referido ou da redução referida, e que compreende ainda a administração ao paciente referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estrogénio, como parte de uma terapêutica de combinação.

Também é divulgado um método para o tratamento ou a redução do risco de adquirir aterosclerose, que compreende o aumento dos níveis de um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona e 3ηάΓθ3ί-5-θηο-3β, 17β-άϊο1, num paciente com necessidade do tratamento referido ou da redução referida, e que compreende ainda a administração ao paciente referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estrogénio, como parte de uma terapêutica de combinação.

Também é divulgado um método para o tratamento ou a redução do risco de adquirir cancro da mama, que compreende o aumento dos níveis de um precursor de esteroides sexuais 9 selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona e androst-5-eno-3p, 17β-άίο1, num paciente com necessidade do tratamento referido ou da redução referida, e que compreende ainda a administração ao paciente referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estrogénio, como parte de uma terapêutica de combinação.

Também é divulgado um método para o tratamento ou a redução do risco de adquirir cancro do endométrio, que compreende o aumento dos níveis de um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona e androst-5-eno-33, 17p-diol, num paciente com necessidade do tratamento referido ou da redução referida, e que compreende ainda a administração ao paciente referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estrogénio, como parte de uma terapêutica de combinação.

Também é divulgado um método para o tratamento ou a redução do risco de adquirir cancro uterino, que compreende o aumento dos níveis de um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona e androst-5-eno-33, 173~diol, num paciente com necessidade do tratamento referido ou da redução referida, e que compreende ainda a administração ao paciente referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estrogénio, como parte de uma terapêutica de combinação.

Também é divulgado um método para o tratamento ou a redução do risco de adquirir cancro do ovário, que compreende o aumento dos níveis de um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona, sulfato de 10 dehidroepiandrosterona e androst-5-eno-3P, 17β-άίο1, num paciente com necessidade do tratamento referido ou da redução referida, e que compreende ainda a administração ao paciente referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estroqénio, como parte de uma terapêutica de combinação.

Numa outra realização, a invenção proporciona um kit que compreende um primeiro recipiente, que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3p, 17p-diol, e um pró-fármaco que é convertido in vivo em qualquer um dos precursores anteriores, e que compreende ainda um segundo recipiente que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador seletivo do recetor de estrogénio, para utilização numa terapêutica de combinação para o tratamento ou a redução do risco de perda de massa muscular.

Numa outra realização, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende: a) um excipiente, diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável, b) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3p, 17p-diol, e um pró-fármaco que é convertido in vivo em qualquer um dos precursores de esteroides sexuais anteriores, e c) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador seletivo do recetor de estrogénio, para a mesma utilização que o kit descrito anteriormente.

Tal como aqui utilizado, um modulador seletivo do recetor de estrogénio (SERM) é um composto que, quer diretamente ou através do seu metabolito ativo, funciona como um antagonista do recetor de estrogénio 11 ("antiestrogénio") em tecido da mama, no entanto, fornece efeito estrogénico ou semelhante a estrogénio sobre o tecido ósseo e sobre os níveis de colesterol no soro (isto é, por redução do colesterol no soro) . Os compostos não esteroides que funcionam como antagonistas do recetor de estrogénio in vitro ou em tecido da mama humano ou de rato (especialmente se o composto atua como um antiestrogénio em células de cancro da mama humano), são suscetíveis de funcionar como um SERM. Inversamente, os antiestrogénios esteroides tendem a não funcionar como um SERM porque tendem a não exibir qualquer efeito benéfico sobre o colesterol no soro. Os antiestrogénios não esteroides que temos testado e encontrado funcionar como um SERM, incluem o EM-800, o EM-01538, o raloxifen, o tamoxifen e o droloxifen. Nós testamos o antiestrogénio esteroide ICI 182,780 e encontrámos que não funciona como um SERM. Os SERM, de acordo com a invenção, podem ser administrados na mesma dosagem, tal como conhecida na tecnologia, como quando estes compostos são utilizados como antiestrogénios.

Também temos observado uma correlação entre o efeito benéfico que os SERM têm sobre o colesterol no soro, e efeitos benéficos estrogénicos, ou similares ao estrogénio, sobre o osso e sobre os lípidos no soro. Os SERM que foram mostrados na nossa investigação atuar beneficamente em todos estes parâmetros, incluem massa óssea, colesterol e níveis de triglicéridos. Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que os SERM, muitos dos quais, de preferência, têm dois anéis aromáticos ligados por um até dois átomos de carbono, são esperados interagir com o recetor de estrogénio, em virtude da porção anterior da molécula que é melhor reconhecida pelo recetor. Os SERM preferidos têm cadeias laterais que podem causar seletivamente propriedades antagonistas em tecido da mama, sem terem propriedades antagonistas significativas em outros tecidos. Assim, os SERM podem funcionar 12 desejavelmente como antiestrogénios na mama, ao mesmo tempo que surpreendentemente e desejavelmente funcionam como estrogénios (ou proporcionam atividade semelhante a estrogénio) nos ossos e no sangue (onde as concentrações de lipidos e de colesterol são favoravelmente afetadas). 0 efeito favorável sobre o colesterol e lipidos traduz-se a um efeito favorável contra a aterosclerose, que se sabe ser adversamente afetada por niveis inadequados de colesterol e de lipidos.

As doenças tratadas pela invenção, tal como aqui discutidas, respondem favoravelmente a androgénios. Em vez de utilizar androgénios per se, os requerentes utilizam precursores de esteroides sexuais, tais como a DHEA, o DHEA-S, o 5-diol, ou pró-fármacos convertidos em qualquer um destes precursores de esteroides sexuais. In vivo, o DHEA-S é convertido em DHEA que, por sua vez, converte-se em 5-diol. Acredita-se que qualquer tecido que responda favoravelmente a um, é provável que responda favoravelmente aos outros. As formas de pró-fármacos de metabolitos ativos são bem conhecidas na tecnologia. Veja-se, por exemplo, H. Bundgaard "Design and application of prodrugs" (em: A textbook of drug design and development. Editado por H. Bundgaard e P. Krogsgaard-Larsen, Harwook Academic Publishers GmfH, Chur: Suiça, 1991), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Em particular, vejam-se as páginas 154-155, que descrevem vários grupos funcionais de metabolitos ativos, e grupos de pró-fármacos correspondentes adequados que se convertem in vivo em cada grupo funcional. Onde os niveis de precursores de esteroides sexuais de um paciente são aumentados de acordo com a invenção, o que pode ser tipicamente alcançado pela administração de um dito precursor, ou pela administração de um pró-fármaco de um dito precursor. Ao utilizar precursores em vez de androgénios, é reduzida a atividade androgénica indesejável em outros tecidos que não o alvo. 13

Os tecidos convertem precursores tais como a DHEA a androgénios, através apenas de um processo natural e mais regulado. Uma grande percentagem de androgénios é produzida localmente nos tecidos periféricos e, em diferentes graus em diferentes tecidos.

Os cancros tratados tal como aqui divulgado respondem negativamente a atividade estrogénica. Por outro lado, a osteoporose, a hipercolesterolemia, a hiperlipidemia e a aterosclerose respondem favoravelmente a atividade estrogénica ou semelhante a estrogénio. Ao utilizar os SERM são fornecidos efeitos desejáveis em tecidos alvo, sem efeitos indesejáveis em certos outros tecidos. Por exemplo, um SERM pode ter um efeito estrogénico favorável nos ossos (ou em lipidos ou colesterol) , ao mesmo tempo que evitando o efeito estrogénico desfavorável na mama.

Assim, tanto o precursor como o SERM proporcionam um efeito favorável nos tecidos alvo, ao mesmo tempo que minimizando os efeitos desfavoráveis em alguns outros tecidos. Para além disso, existem sinergias significativas em utilizar os dois em conjunto. Por exemplo, os estrogénios e androgénios proporcionam um efeito benéfico contra a osteoporose por diferentes mecanismos (o estrogénio reduzindo a reabsorção óssea, o androgénio contribuindo para a formação do osso). A combinação proporciona ao osso estrogénio benéfico ou efeito semelhante ao estrogénio através da atividade do SERM, e também proporciona androgénio benéfico através da conversão local do precursor para androgénio no osso. 0 precursor também é acreditado fornecer estrogénio. 0 mesmo é verdade em relação ao controlo de lipidos ou de colesterol (útil para o tratamento ou prevenção de aterosclerose). Uma sinergia semelhante é proporcionada contra o cancro da mama, do endométrio, do ovário ou uterino, onde o SERM proporciona um efeito antiestrogénico desejável, e o precursor proporciona um efeito androgénico desejável (com 14 qualquer conversão incidental de precursor em estroqénio sendo mitigada pelo antiestrogénio). Os efeitos indesejáveis também são mitigados de uma forma por sinergia pela combinação. Para todas as doenças discutidas aqui, qualquer outro efeito sobre os tecidos da mama, que poderiam de outra forma resultar de estrogénios produzidos pelo precursor (quando o precursor é utilizado para a promoção de efeitos androgénicos de acordo com a invenção), é mitigado pelo efeito antiestrogénico do SERM no tecido da mama.

Em algumas realizações, são adicionadas progestinas para proporcionar mais efeitos androgénicos. As progestinas podem ser utilizadas em dosagens baixas conhecidas na tecnologia, sem afetar negativamente outros recetores que não os recetores de androgénio (por exemplo, recetores de glucocorticoides). Também estão relativamente livres de efeitos secundários androgénicos indesejados (tais como pelos faciais em pacientes femininas).

Os SERM preferidos discutidos aqui dizem respeito: (1) às doenças da invenção, (2) a aplicações tanto terapêuticas como profiláticas, e (3) a composições farmacêuticas e kits preferidos.

Numa realização, o precursor é DHEA.

Numa outra realização, o precursor é DHEA-S.

Numa outra realização, o precursor é 5-diol.

Um paciente com necessidade de tratamento ou de redução do risco do aparecimento de uma dada doença é aquele que, ou foi diagnosticado com essa doença, ou aquele que é suscetível de adquirir dita doença.

Exceto quando especificado em contrário, a dosagem preferida dos compostos ativos (as concentrações e os modos de administração) da invenção é idêntica tanto para os fins terapêuticos como profiláticos. A dosagem para cada componente ativo discutida aqui é a mesma, independentemente da doença a ser tratada (ou da doença 15 cuja probabilidade de aparecimento está a ser reduzida). A não ser quando indicado em contrário, ou quando resulta aparente a partir do contexto, as dosagens aqui referem-se ao peso de compostos ativos não afetados por excipientes farmacêuticos, diluentes, transportadores ou outros ingredientes, embora ditos ingredientes adicionais são desejavelmente incluídos, tal como mostrado nos exemplos aqui apresentados. Qualquer forma farmacêutica (cápsula, comprimido, injeção ou semelhantes) habitualmente utilizada na indústria farmacêutica é apropriada para utilização aqui, e os termos "excipiente", "diluente" ou "transportador" incluem ditos ingredientes não ativos como são tipicamente incluídos, em conjunto com ingredientes ativos, em ditas formas farmacêuticas na indústria. Por exemplo, podem ser incluídas cápsulas típicas, comprimidos, revestimentos entéricos, diluentes ou excipientes sólidos ou líquidos, aromatizantes, conservantes, ou outros semelhantes.

Todos os ingredientes ativos utilizados em qualquer uma das terapêuticas discutidas aqui podem ser formulados em composições farmacêuticas que também incluem um ou mais dos outros ingredientes ativos. Em alternativa, eles podem ser administrados cada um separadamente, mas suficientemente em simultâneo no tempo para que um paciente, eventualmente, que tem níveis elevados no sangue, ou de outro modo, disfrute dos benefícios de cada um dos ingredientes ativos (ou estratégias) simultaneamente. Em algumas realizações preferidas da invenção, por exemplo, um ou mais ingredientes ativos devem ser formulados numa única composição farmacêutica. Em outras realizações da invenção, é fornecido um kit que inclui pelo menos dois recipientes separados, em que o conteúdo de pelo menos um recipiente é diferente, na totalidade ou em parte, do conteúdo de pelo menos um outro recipiente, em relação a ingredientes ativos contidos nos mesmos. 16

As terapêuticas de combinação discutidas aqui também incluem a utilização de um ingrediente ativo (da combinação) no fabrico de um medicamento para o tratamento (ou redução do risco) da doença em questão, em que o tratamento ou prevenção inclui ainda um outro ingrediente ativo da combinação de acordo com a invenção. Por exemplo, numa realização, a invenção proporciona a utilização de um SERM na preparação de um medicamento para uso, em combinação com um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de DHEA, DHEA-S, 5-diol, e pró-fármacos convertidos in vivo em qualquer um dos precursores de esteroides sexuais anteriores, para o tratamento de, ou a redução do risco de adquirir, uma perda de massa muscular. Numa outra realização, a invenção proporciona a utilização de um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste de DHEA, DHEA-S, 5-diol, e pró-fármacos convertidos in vivo em qualquer um dos precursores de esteroides sexuais anteriores, na preparação de um medicamento para uso, em combinação com um SERM, no tratamento dessas mesmas doenças.

Numa realização da invenção, a DHEA não é utilizada como precursor. Numa outra realização, o EM-800 não é utilizado como um SERM. Numa outra realização, não é utilizada a combinação de DHEA com EM-800.

Numa realização preferida, a DHEA é utilizada em combinação com o EM-1538.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 0 objeto das figuras 1-10 é comparativo à invenção reivindicada. A figura 1 mostra o efeito do tratamento com a DHEA (10 mg, por via percutânea, uma vez por dia) ou com o EM-800 (75 pg, por via oral, uma vez por dia) , isoladamente ou em combinação durante 9 meses, sobre a incidência de carcinoma mamário induzido por DMBA no 17 rato durante todo o período de observação de 27 9 dias. Os dados são expressos como a percentagem do número total de animais em cada grupo. A figura 2 mostra o efeito do tratamento com a DHEA (10 mg, por via percutânea, uma vez por dia) ou o EM-800 (75 pg, por via oral, uma vez por dia) , isoladamente ou em combinação durante 9 meses, no número médio de tumores por animal portador de tumor (A), e no tamanho médio de tumores por rato portador de tumor (B) , ao longo do período de observação de 279 dias. Os dados são expressos como a média ± SEM. A figura 3 mostra o efeito do tratamento com a DHEA (10 mg, por via percutânea, uma vez por dia) ou o EM-800 (75 pg, por via oral, uma vez por dia) , isoladamente ou em combinação durante 9 meses, nos níveis de triglicéridos (A) e de colesterol (B) no soro de rato. Os dados são expressos como a média ± SEM. **: p < 0,01 experimental versus controlo respetivo. A figura 4 mostra: A) Efeito de doses crescentes de DHEA (0,3 mg, 1,0 mg ou 3,0 mg) administradas por via percutânea, duas vezes por dia, no tamanho médio do tumor ZR-75-1 em ratinhos fêmea nus ovariectomizadas (OVX) suplementadas com estrona. Os ratinhos fêmea OVX controlo que receberam o veículo sozinho são utilizados como controlos adicionais. 0 tamanho inicial do tumor foi tomado como 100 %. A DHEA foi administrada por via percutânea (p.c.) numa solução de 0,02 ml de etanol a 50 % - 50 % de propileno glicol na pele dorsal. B) Efeito do tratamento com doses crescentes de DHEA ou de EM-800, isoladamente ou em combinação durante 9,5 meses, no peso do tumor ZR-75-1 em ratinhos nude fêmea OVX suplementadas com estrona. **, p < 0,01, ratinhos fêmea OVX tratadas versus controlos suplementadas com estrona. A figura 5 mostra o efeito do aumento de doses orais do 18 antiestrogénio EM-800 (15 yg, 50 yg ou 100 yg) (A), ou de administração percutânea de doses crescentes de DHEA (0,3, 1,0 ou 3,0 mg) combinadas com o EM-800 (15 yg) ou o EM-800 sozinho (B), durante 9,5 meses, sobre o tamanho médio do tumor ZR-75-1 em ratinhos nude fêmeas ovariectomizadas (OVX) suplementadas com estrona. O tamanho inicial do tumor foi tomado como 100 %. Foram utilizadas como controlos adicionais ratinhos fêmeas OVX controlo que receberam o veiculo isoladamente. A estrona foi administrada por via subcutânea na dose de 0,5 yg uma vez por dia, enquanto a DHEA foi dissolvida em etanol a 50 % - propileno glicol a 50 %, e aplicada na área da pele dorsal duas vezes por dia num volume de 0,02 ml. A comparação é feita também com animais OVX que receberam o veiculo isoladamente. A figura 6 mostra o efeito de 12 meses de tratamento com a dehidroepiandrosterona (DHEA), isoladamente ou em combinação coma flutamida ou o EM-800, sobre o volume de osso trabecular em ratos fêmeas ovariectomizadas. São adicionados animais intactos como controlos adicionais. Os dados são apresentados como a média ± SEM ** p < 0,01 versus controlo de OVX. A figura 7 mostra o efeito de 12 meses de tratamento com a dehidroepiandrosterona (DHEA), isoladamente ou em combinação com a flutamida ou o EM-800, sobre o número trabecular em ratos fêmeas ovariectomizadas. São adicionados animais intactos como controlos adicionais. Os dados são apresentados como a média ± SEM ** p < 0,01 versus controlo de OVX. A figura 8 mostra metáfises da tibia proximal de controlos intactos (A) , de controlos ovariectomizadas (B) , e de ratos fêmeas ovariectomizadas tratadas com a DHEA isoladamente (C), ou em combinação com a flutamida (D) , ou o EM-800 (E) . Observe a quantidade reduzida de osso trabecular (T) em animais controlo 19 ovariectomizadas (B) , e o aumento significativo do volume de osso trabecular (T) induzido após a administração da DHEA (C). A adição de flutamida à DHEA bloqueou parcialmente o efeito da DHEA sobre o volume do osso trabecular (D) , ao passo que a combinação da DHEA e do EM-800 proporcionou uma proteção completa contra a perda óssea associada à ovariectomia. Tricrómico modificado Masson-Goldner, magnificação x80. T: trabéculas, GP: placa de crescimento. A figura 9 mostra o efeito de doses crescentes (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, e 1 mg/kg) de EM-800, EM-1538 e raloxifen (EM-1105), administradas por administração oral, diariamente durante 4 dias, no nível de colesterol de ratos fêmeas ovariectomizadas. A figura 10 mostra o efeito do tratamento de 34 semanas com a dehidroepiandrosterona (DHEA), isoladamente ou em combinação com o EM-1538 (EM-652.HC1), sobre a DMO da coluna lombar em ratos fêmeas ovariectomizadas. São adicionados animais intactos como controlos adicionais. Os dados são apresentados como a média ± SEM ** p < 0,01 versus controlo de OVX. A figura 11 mostra os efeitos combinados do SERM (EM-652) e da DHEA sobre os parâmetros da menopausa. Não é esperado nenhum efeito negativo. A figura 12 mostra a concentração de DHEA no plasma (ng/ml) (eixo do y) em função do tempo (eixo do x) , após uma única absorção por via oral de precursores de esteroides sexuais preferidos da invenção (150 ymol / rato) em ratos machos. É relatado na caixa, a AUC 24 h de DHEA induzida por estes compostos. EM-760 dehidroepiandrosterona EM-900 ηηάηο5^5-θηο-3β, ΐνβ-diol EM-1304 3ηάηο5^5-θηο-3β, ΐνβ-diol 3-acetato EM-1305-CS androst-5-eno-3β, ΐνβ-diol diacetato EM-1397 androst-5-eno-3β, 17β-άϊο1 3 acetato 17 20 benzoato EM-1400 androst-5-eno-3p, 17β-άίο1 dibenzoato EM-1410 androst-5-eno-3p, 17p-diol dipropionato EM-1474-D androst-5-eno-3p, 17p-diol dihemisuccinato A figura 13 mostra a concentração de androst-5-eno-3p, 17β-άίο1 no plasma (ng/ml) (eixo do y) em função do tempo (eixo do x) , após uma única absorção oral de precursores de esteroides sexuais da invenção (150 pmol / rato) em ratos machos. É relatado na caixa, a AUC 24 h de 3ηάΓθ3ΐ-5-θηο-3β, 17β-άίο1 induzida por estes compostos.

EM-760 dehidroepiandrosterona EM-900 ηηάηο3ύ-5-βηο-3β, 17β-ύίο1 EM-1304 3ηύηο3ύ-5-θηο-3β, 17β-ύίο1 3-acetato EM-1305-CS androst-5-eno-3P, 17β-ύίο1 diacetato EM-1397 androst-5-eno-3β, 17β-ύίο1 3 acetato 17 benzoato EM-1400 3ηύηο3Ε-5-βηο-3β, 17β-ύίο1 dibenzoato EM-1410 3ηύΓθ3ύ-5-βηο-3β, 17β-ύίο1 dipropionato EM-1474-D androst-5-eno-3β, 17β-άίο1 dihemisuccinato DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os estrogénios são bem conhecidos por estimular a proliferação de células epiteliais mamárias, e a proliferação celular em si mesma é pensada aumentar o risco de cancro por acumulação de erros genéticos aleatórios que podem resultar em neoplasia (Preston Martin et al., Câncer. Res. 50: 7415-21, 1990). Com base neste conceito, os antiestrogénios foram introduzidos para prevenir o cancro de mama, com o objetivo de reduzir a taxa de divisão celular estimulada por estrogénios. A perda da atividade cíclica dos ovários encontrada em ratos fêmeas Sprague-Dawley após os 10 meses de idade, é acompanhada pelo aumento dos níveis de estrogénio e de prolactina no soro e a diminuição das concentrações de androgénios e de progesterona no soro (Lu et al., 61a

Reunião anual da Sociedade de Endocrinologia 106 (resumo n°' 134), 1979, Tang et al., Biol. Reprod. 31: 399-413, 21 1984, Russo et al., Monographs on pathology of laboratory animais: integument and mammary glands 252-266, 1989, Sortino e Wise, Endocrinology 124: 90-96, 1989, Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991). Estas alterações hormonais que ocorrem espontaneamente em ratos fêmeas envelhecidas estão associadas a proliferação multifocal e a atividade secretora aumentada do tecido acinar / alveolar, bem como a dilatação do dueto da glândula mamária e a formação de quistos (Boorman et al., 433, 1990, Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991) . Deve ser mencionado que as alterações hiperplásicas e neoplásicas da glândula mamária do rato são frequentemente acompanhadas pelo aumento dos níveis de estrogénios e de prolactina (Meites, J. Neural. Transm. 48: 25-42, 1980). O tratamento com EM-800, um SERM da presente invenção, induz atrofia da glândula mamária, que é caracterizada por uma diminuição no tamanho e número das estruturas lobulares, e sem nenhuma evidência de atividade secretora, indicando a potente atividade antiestrogénica do EM-800 na glândula mamária (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). O tratamento com a DHEA, um precursor de esteroides sexuais da presente invenção, leva a uma elevação da DHEA e do 5-diol no soro, enquanto os níveis da 4-diona, da testosterona, da dihidrotestosterona, e de estradiol são apenas moderadamente aumentados, ou mais frequentemente permanecem inalterados, confirmando assim a biotransformação intracelular deste precursor de esteroide em tecidos periféricos (Labrie et al., Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113-C118, 1991) . No entanto, o efeito estimulador da DHEA administrada oralmente sobre os androgénios no soro, tais como a testosterona e a dihidrotestosterona, é de uma amplitude maior do que o efeito nos estrogénios no soro, sugerindo assim que a DHEA é transformada predominantemente em androgénios nestes animais. Esta observação está de acordo com os dados 22 obtidos em mulheres, em que a formação de androgénios a partir da DHEA era uma via mais importante do que a conversão de DHEA em estrogénios (Morales et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 78: 1360-1367, 1994, Labrie et al. , Ann. N. Y. Acad. Sei. 774: 16-28, 1995, Labrie et al., Steroids, 62: 148-158,1997).

Com o conhecimento da potente atividade antiestrogénica descrita anteriormente, resultando em atrofia da glândula mamária e do efeito androgénico predominante da DHEA sobre a glândula mamária, as alterações histomorfológicas observadas em animais tratados com a combinação de um SERM e um precursor de esteroides sexuais são melhor explicadas por uma ação androgénica sem oposição de DHEA na glândula mamária do rato.

De forma mais importante, foi observado que os androgénios exercem uma atividade antiproliferativa direta sobre o crescimento in vitro de células de cancro da mama ZR-75-1 humano, e que um dito efeito inibidor dos androgénios é aditivo ao de um antiestrogénio (Poulin e Labrie, Câncer Res. 46: 4933-4937, 1986, Poulin et al., Breast Câncer Res. Treat. 12: 213-225, 1988) . Foram observados efeitos inibidores semelhantes in vivo em xenotransplantes de ZR-75-1 em ratinhos nude (Dauvois et al., Câncer Res. 51: 3131-3135, 1991). Os androgénios também têm mostrado inibir o crescimento de carcinoma mamário induzido por D MBA no rato, sendo esta inibição revertida pela administração simultânea do antiandrogénio puro flutamida (Dauvois et al., Breast Câncer Res. Treat. 14: 299-306, 1989). Tomados em conjunto, os dados indicam o envolvimento do recetor de androgénio na ação inibitória da DHEA sobre o cancro de mama.

Uma vez que os ant iestrogénios e os precursores de esteroides sexuais exercem efeitos inibidores sobre o cancro da mama através de mecanismos diferentes, a presente divulgação mostra que a combinação de um SERM (EM-800) e de 23 um precursor de esteroides sexuais (DHEA) exerce efeitos inibidores mais potentes, do que cada composto utilizado isoladamente, no desenvolvimento de carcinoma mamário de rato induzido por DMBA, como bem ilustrado nas figuras 1 e 2. De facto, não foi encontrado nenhum tumor induzido por DMBA no final da experiência, em animais que tinham recebido tanto DHEA como EM-800. A presente divulgação descreve também que a combinação de um precursor de esteroides sexuais (DHEA) e um SERM (EM-800) manteve o efeito estimulador da DHEA sobre a formação óssea, e potenciou o efeito inibidor do SERM (EM-800) sozinho na remodelação e reabsorção óssea, tal como demonstrado pelos decréscimos suplementares na excreção urinária de hidroxiprolina e de cálcio, quando foram combinados ambos os compostos. Nós mostrámos que a DHEA tem efeitos benéficos sobre o osso tanto no rato fêmea (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997), como em mulheres pós-menopausa (Labrie et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 3498-3505, 1997). Assim, em ratos fêmeas intactos, o tratamento com a DHEA aumenta a densidade mineral óssea (DMO) do esqueleto total, da coluna lombar e do fémur (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Por outro lado, o tratamento com o EM-800 não teve nenhum efeito significativo sobre a DMO em animais intactos, embora sejam observados efeitos estimulantes potentes no rato fêmea ovariectomizada (Martel et al., dados não publicados) . Uma vez que o EM-800 exerce ditos efeitos estimuladores sobre a DMO do esqueleto total, da coluna lombar e do fémur em ratos fêmeas ovariectomizadas, a ausência de efeito estimulador significativo do EM-800 em animais intactos pode dever-se ao facto de que os esteroides sexuais presentes em ratos fêmeas intactos exercem um efeito máximo sobre a DMO (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). Da mesma forma, a 24 ausência de um efeito significativo do EM-800 em ratos fêmeas ovariectomizadas que já receberam DHEA, deve-se provavelmente aos efeitos estimuladores máximos exercidos pelos androgénios (e possivelmente estrogénios) sintetizados em células ósseas a partir de DHEA exógena.

Os estrogénios são conhecidos por reduzir o colesterol no soro, mas por aumentar ou não ter nenhum efeito sobre os níveis de triglicéridos no soro (Love et al., Ann. Intern. Med. 115: 860-864, 1991, Walsh et al., New Engl. J. Med. 325: 1196-1204, 1991, Barrett-Connor, Am. J. Med. 95 (Supl. 5A) : 40S-43S, 1993, Russell et al., Atherosclerosis 100: 113-122, 1993, Black et al., J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994, Dipippo et al., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995, Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995). A figura 3 mostra que o EM-800 possui tanto efeitos hipocolesterolémicos como hipotrigliceridémicos no rato, mostrando assim a sua ação única sobre o perfil de lípidos no soro que, aparentemente, é diferente de outros SERM, tais como o tamoxifen (Bruning et al., Br. J. Câncer 58: 497-499, 1988, Love et al, J. Natl. Câncer Inst. 82: 1327-1332, 1990, Dipippo et al., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995, Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995), o droloxifen (Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995), e o raloxifen (Black et al., J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994) . A combinação de DHEA e de EM-800 conservou os efeitos hipocolesterolémicos e hipotrigliceridémicos de EM-800, sugerindo assim que dita combinação pode exercer efeitos benéficos sobre os lípidos no soro.

Deve ser mencionado que o perfil de lípidos no soro é marcadamente diferente entre ratos e seres humanos. No entanto, uma vez que está envolvido um mecanismo mediado por um recetor de estrogénio no efeito hipocolesterolémico de estrogénios, bem como antiestrogénios (Lundeen et al., Endocrinology 138: 1552-1558, 1997), o rato continua a ser um modelo útil para estudar o efeito de estrogénios e de 25 "antiestrogénios" na redução do colesterol em humanos.

Em resumo, os dados descritos anteriormente demonstram claramente os efeitos da combinação de um SERM (EM-800) e de um precursor de esteroides sexuais (DHEA) sobre o desenvolvimento de carcinoma mamário induzido por DMBA, bem como os efeitos protetores de dita combinação na massa óssea e lipidos no soro. Ditos dados sugerem os efeitos benéficos adicionais de dita combinação para o tratamento e prevenção da osteoporose, melhorando simultaneamente o perfil de lipidos.

Também já estudámos a interação potencial do efeito inibidor do novo antiestrogénio (EM-800) com o do precursor de esteroides sexuais (DHEA) sobre o crescimento de xenotransplantes de cancro de mama ZR-75-1 humano em ratinhos nude, por administração combinada dos dois fármacos. As figuras 4 e 5 mostram que a DHEA, por si só, nas doses utilizadas, provoca uma inibição de 50 a 80 % no crescimento do tumor, enquanto a inibição quase completa do crescimento do tumor alcançada com uma dose baixa do antiestrogénio não foi afetada pela DHEA.

As limitações das medições da densidade mineral óssea (DMO) são bem conhecidas. Como um exemplo, as medições da DMO não mostraram alterações em ratos tratados com o antiestrogénio esteroide ICI 182780 (Wakeling, Breast Câncer Res. Treat. 25: 1-9, 1993), enquanto que foram observadas alterações inibidoras por histomorfometria (Gallagher et al., Endocrinology 133: 2787-2791, 1993). Foram relatadas diferenças semelhantes com tamoxifen (Jordan et al., Breast Câncer Res. Treat. 10: 31-35, 1987, Sibonga et al., Breast Câncer Res. Treatm. 41: 71-79, 1996).

Deve ser indicado que uma densidade mineral óssea reduzida não é a única anormalidade associada com a resistência óssea reduzida. (Diretrizes para a avaliação pré-clinica e clinica de agentes utilizados na prevenção ou 26 no tratamento da osteoporose pós-menopausa, Divisão de Metabolismo e Produtos Fármacos Endócrinos, FDA, maio de 1994). Assim, é importante analisar as alterações nos parâmetros bioquímicos do metabolismo ósseo, induzidos por vários compostos e tratamentos, a fim de se obter um melhor conhecimento da sua ação. É particularmente importante indicar que a combinação de DHEA e de EM-800 exerceu efeitos benéficos inesperados sobre parâmetros bioquímicos importantes do metabolismo ósseo. De facto, a DHEA por si só não afetou a razão urinária hidroxiprolina / creatinina, um marcador da reabsorção óssea. Para além disso, não pode ser detetado nenhum efeito da DHEA na excreção urinária diária de cálcio ou de fósforo (Luo et al. , Endocrinology 138: 4435-4444, 1997) . Por outro lado, o EM-800 diminuiu a razão urinária de hidroxiprolina / creatinina em 48 %, enquanto que, de forma semelhante à DHEA, não foi observado nenhum efeito do EM-800 na excreção urinária de cálcio ou de fósforo. Para além disso, o EM-800 não teve nenhum efeito sobre a atividade da fosfatase alcalina no soro, um marcador da formação óssea, enquanto a DHEA aumentou o valor do parâmetro em cerca de 75 % (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Um dos efeitos inesperados da combinação de DHEA e de EM-800 refere-se à razão urinária de hidroxiprolina / creatinina, um marcador de reabsorção óssea, a qual foi reduzida em 69 % quando foram combinados DHEA e EM-800, sendo este valor estatisticamente diferente (p < 0,01) da inibição de 48 % alcançada por EM-800 sozinho, enquanto que a DHEA por si só não mostrou qualquer efeito. Assim, a adição de DHEA ao EM-800 aumenta em 50 % o efeito inibidor do EM-800 sobre a reabsorção óssea. De forma mais importante, outro efeito inesperado da adição de DHEA ao EM-800 foi o decréscimo de aproximadamente 84 % no cálcio urinário (desde 23,17 ± 1,55 para 3,71 ± 0,75 pmol / 24 h / 27 100 g (ρ < 0,01), e o decréscimo de 55 % no fósforo urinário (desde 132,72 ± 6,08 para 59,06 ± 4,76 pmol / 24 h / 100 g (p < 0,01), respetivamente, (Luo et al.,

Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Quadro 1 GRUPO URINA SORO CÁLCIO (μιηοΐ / 24 h / 100 q) FÓSFORO (μιηοΐ / 24 h / 100 g) HP / Cr (μιηοΐ / mmol) tALP (IU/1) CONTROLO 23,17 ± 1,55 132,72 ± 6,08 13,04 ± 2,19 114,25 ± 14,04 DHEA (10 mg) 25,87 ± 3,54 151,41 ± 14,57 14,02 ± 1,59 198,38 ± 30,76* EM-800 (75 ug) 17,44 ± 4,5 102,03 ± 25,13 6,81 ± 0,84** 114,11 ± 11,26 HEA + EM-800 3,71 ± 0,75** 59,06 ± 4,76" 4, 06 ± 0,28** 204,38 ± 14,20**

Também é interessante notar que o efeito inibidor potente do EM-800 sobre o colesterol no soro não é prevenido pelo tratamento simultâneo com a DHEA (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Enquanto o raloxifen e compostos semelhantes previnem a perda óssea e diminuem o colesterol no soro (tais como os estrogénios), deve ser mencionado que, quando o raloxifen foi comparado com o premarin na DMO, o efeito do raloxifen sobre a DMO foi menos potente do que o do premarin (Acta do Comité Consultivo de Fármacos de Endocrinologia e Metabolismo, FDA, quinta-feira, reunião n° 68, 20 de novembro de 1997). Por causa dos seus efeitos adversos bem conhecidos sobre o cancro de mama e de útero, a adição de um estrogénio ao raloxifen, o EM-800 ou outros compostos semelhantes, não é uma solução aceitável.

Os resultados atuais obtidos no rato demonstram claramente que a DHEA pode proporcionar os efeitos benéficos que faltam com a utilização de um modulador seletivo do recetor de estrogénio (SERM) por si só, tal como o EM-800, o raloxifen, etc.. Enquanto que um SERM tem efeitos limitados à inibição da reabsorção óssea, acredita- 28 se que a adição de DHEA, 5-diol, DHEA-S estimula a formação óssea (um efeito não encontrado com um SERM ou um estrogénio) e, para além disso, reduz a reabsorção óssea acima do efeito alcançado com o EM-800.

De forma importante, a combinação de EM-800 e DHEA em ratos fêmeas ovariectomizadas tratadas durante 12 meses, tem efeitos benéficos sobre a morfometria óssea. 0 volume do osso trabecular é particularmente importante para a resistência óssea e para prevenir as fraturas ósseas. Assim, no estudo mencionado anteriormente, o volume do osso trabecular da tíbia aumentou de 4,1 ± 0,7 % em ratos fêmeas ovariectomizadas para 11,9 ± 0,6 % (p < 0,01) com a DHEA por si só, enquanto que a adição de EM-800 à DHEA aumentou ainda mais o volume do osso trabecular para 14,7 ± 1,4 %, um valor semelhante ao encontrado em controlos intactos (fig. 6) . A partir de um valor de 0,57 ± 0,08 por mm em ratos fêmeas ovariectomizadas, o tratamento com DHEA resultou num aumento de 137 % no número de osso trabecular em comparação com os controlos ovariectomizadas. O efeito estimulador da DHEA atingiu assim 1,27 ± 0,1 por mm, enquanto que o tratamento simultâneo com o EM-800 e a DHEA resultou num aumento adicional de 28 % no número de osso trabecular (p < 0,01), em comparação com o que se obtém com a DHEA por si só (fig. 7). Da mesma forma, a adição de EM-800 ao tratamento com a DHEA resultou num decréscimo adicional de 15 % (p < 0,05) na separação do osso trabecular, em comparação com o obtida com a DHEA por si só, conduzindo assim a valores não diferentes dos observados em controlos intactos.

Como complemento dos dados numéricos apresentados nas figuras 6 e 7, a figura 8 ilustra o aumento do volume do osso trabecular nas metáfises da tíbia proximal induzido pela DHEA em animais ovariectomizados tratados (C) , em comparação com controlos ovariectomizados (B) , bem como a 29 inibição parcial do efeito estimulador da DHEA após a adição de flutamida ao tratamento com DHEA (D). Por outro lado, a administração de DHEA em combinação com o EM-800 resultou numa prevenção completa da osteopenia induzida por ovariectomia (E) , sendo o volume do osso trabecular comparável ao observado em controlos intactos (A).

Acredita-se que a perda óssea observada na menopausa em mulheres está relacionada com um aumento da taxa de reabsorção óssea, que não é completamente compensada pelo aumento secundário da formação óssea. De facto, os parâmetros tanto da formação óssea como da reabsorção óssea estão aumentados na osteoporose, e tanto a reabsorção como a formação de osso são inibidas pela terapêutica de substituição de estrogénio. Acredita-se que o efeito inibitório da substituição de estrogénios sobre a formação óssea resulta, portanto, de um mecanismo acoplado entre a reabsorção óssea e a formação óssea, de modo a que a redução primária induzida por estrogénio na reabsorção óssea arrasta uma redução na formação óssea (Parfitt, Calcified Tissue International 36 Supl. 1: S37-S45, 1984). A resistência do osso esponjoso e a subsequente resistência a fraturas, não depende apenas da quantidade total de osso esponjoso mas também da microestrutura trabecular, tal como determinado pelo número, dimensão e distribuição das trabéculas. A perda da função dos óvarios em mulheres na pós-menopausa é acompanhada por uma diminuição significativa no volume total do osso trabecular (Melsen et al., Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 86: 70-81, 1978, Vakamatsou et al., Calcified Tissue International 37: 594-597, 1985), relacionada principalmente com um decréscimo do número e, em menor grau, da largura das trabéculas (Weinstein e Hutson, Bone 8: 137-142, 1987) .

No presente estudo, o efeito estimulador androgénico da DHEA foi observado em quase todos os parâmetros 30 histomorfométricos estudados do osso. A DHEA resultou assim num aumento significativo do volume do osso trabecular, bem como do número trabecular, ao passo que diminuiu a área intertrabecular. A fim de facilitar o aspeto da terapêutica de combinação da invenção, para qualquer indicação discutida aqui, a invenção contempla as composições farmacêuticas que incluem tanto o SERM como o precursor de esteroides sexuais (DHEA, DHEA-S, 5-diol) numa única composição para administração simultânea. A composição pode ser adequada para a administração em qualquer forma tradicional, incluindo, mas não se limitando a, administração oral, injeção subcutânea, injeção intramuscular ou administração percutânea. Em outras realizações, é fornecido um kit, em que o kit inclui um ou mais SERM e precursores de esteroides sexuais em separado ou em um recipiente. O kit pode incluir materiais apropriados para a administração oral, por exemplo, comprimidos, cápsulas, xaropes e semelhantes, e para a administração transdérmica, por exemplo, unguentos, loções, géis, cremes, adesivos de libertação prolongada e semelhantes.

Os requerentes acreditam que a administração de SERM e de precursores de esteroides sexuais tem utilidade no tratamento e/ou na prevenção do desenvolvimento de osteoporose, cancro da mama, hipercolesterolemia, hiperlipidemia ou aterosclerose. Os ingredientes ativos da invenção (sejam SERM ou precursor) podem ser formulados e administrados numa variedade de maneiras. No entanto, este objeto não faz parte da invenção reivindicada. O ingrediente ativo para a administração transdérmica ou transmucosa está preferivelmente presente numa quantidade de 0,5 % a 20 % em peso em relação ao peso total da composição farmacêutica, mais preferivelmente entre 2 e 10 %. A DHEA ou o 5-diol devem estar a uma concentração de pelo menos 7 % para a administração percutânea. Em 31 alternativa, o ingrediente ativo pode ser colocado num adesivo transdérmico possuindo estruturas conhecidas na tecnologia, por exemplo, estruturas tais como as apresentadas na patente EP n0' 0279982.

Quando formulado como um unguento, loção, gel ou creme ou semelhantes, o composto ativo é misturado com um transportador adequado que é compatível com a pele ou a mucosa humana, e que aumenta a penetração transdérmica do composto através da pele ou da mucosa. Os transportadores adequados são conhecidos na tecnologia e incluem, mas não estão limitados a, Klucel HF e base de Glaxal. Alguns estão disponíveis comercialmente, por exemplo, a base de Glaxal está disponível pela Glaxal Canada Limited Company. Outros veículos adequados podem ser encontrados em Koller e Buri, S.T.P. Pharma 3(2), 115-124, 1987. O transportador é de preferência um no qual o(s) ingrediente(s) ativo(s) é (são) solúvel (solúveis) à temperatura ambiente na concentração do ingrediente ativo que é utilizada. O transportador deve ter viscosidade suficiente para manter o inibidor sobre uma área localizada de pele ou de mucosa à qual a composição foi aplicada, sem escorrer ou evaporar durante um período de tempo suficiente para permitir uma penetração substancial do precursor através da área localizada de pele ou de mucosa e para a corrente sanguínea, onde irá causar um efeito clínico desejado. O transportador é tipicamente uma mistura de vários componentes, por exemplo, solventes farmaceuticamente aceitáveis e um agente espessante. Uma mistura de solventes orgânicos e inorgânicos pode auxiliar a solubilidade hidrofílica e lipofílica, por exemplo, água e um álcool, tal como o etanol.

Os precursores de esteroides sexuais preferidos são a dehidroepiandrosterona (DHEA) (disponível a partir de Diosynth Inc., Chicago, Illinois, EUA), os seus pró-fármacos (disponíveis a partir de Steraloids, Wilton, New Hampshire, EUA), o 5-androsten-33, 17p-diol e os seus pró- 32 fármacos EM-1304 e EM-01474-D (disponíveis a partir de Steraloids, Wilton, New Hampshire EUA) . 32

o

EM-01474-D É preferido que o precursor de esteroides sexuais seja formulado como um gel alcoólico que contém de 2,0 até 10 % de triglicéridos caprílico - cáprico (Neobee M-5), de 10 a 20 % de hexileno glicol, de 2,0 a 10 % de dietilenoglicol éter monometílico (Transutol) , de 2,0 a 10 % de ciclomet icona (Dow Corning 345), de 1,0 a 2 % de álcool benzílico e de 1,0 a 5,0 % de hidroxipropilcelulose (Klucel HF) . O transportador também pode incluir vários aditivos habitualmente utilizados em unguentos e loções, e bem conhecidos nas tecnologias de cosmética e médica. Por exemplo, podem estar presentes fragrâncias, antioxidantes, perfumes, agentes de gelificação, agentes espessantes, tais como a carboximetilcelulose, agentes tensioativos, estabilizadores, emolientes, agentes corantes e outros agentes semelhantes. Quando utilizado para tratar doenças sistémicas, o local de aplicação na pele deve ser alterado de modo a evitar um excesso de concentração local de ingrediente ativo, e possível superestimulação da pele e 33 glândulas sebáceas por metabolitos androgénicos do precursor de esteroides sexuais.

Numa composição farmacêutica para a administração oral, a DHEA ou outro precursor está preferivelmente presente numa concentração entre 5 e 98 % em peso em relação ao peso total da composição, de um modo mais preferido entre 50 e 98 porcento, especialmente entre 80 e 98 porcento. Um único precursor tal como a DHEA pode ser o único ingrediente ativo, ou, alternativamente, podem ser utilizados uma pluralidade de precursores e/ou seus análogos (por exemplo, uma combinação de DHEA, DHEA-S, 5- diol, ou uma combinação de dois ou mais compostos convertidos in vivo em DHEA, DHEA-S ou 5-diol, ou uma combinação de DHEA ou 5-diol e um ou mais análogos dos mesmos, que são convertidos em DHEA ou 5-diol in vivo, etc.) . O nível de DHEA no sangue é o critério final de dosagem adequada que tem em consideração variações individuais na absorção e no metabolismo.

De preferência, o médico assistente irá, especialmente no início do tratamento, monitorizar a resposta global de um paciente individual e os níveis de DHEA no soro (em comparação com as concentrações preferidas no soro discutidas anteriormente) , e monitorizar a resposta global do paciente ao tratamento, ajustando as dosagens tal como necessário quando o metabolismo ou a reação ao tratamento de um determinado paciente é atípica. O tratamento de acordo com a invenção é adequado para uma continuação indefinida. Espera-se que o tratamento com a DHEA e/ou o 5-diol mantenha simplesmente os níveis de DHEA dentro de uma gama semelhante à que ocorre naturalmente em mulheres antes da menopausa (concentração no soro entre 4 e 10 microgramas por litro) , ou naturalmente em homens adultos jovens (concentração no soro entre 4 e 10 microgramas por litro). O composto SERM e/ou o precursor de esteroides sexuais 34 também podem ser administrados por via oral, e podem ser formulados com excipientes farmacêuticos convencionais, por exemplo, lactose seca por pulverização, celulose microcristalina e estearato de magnésio, na forma de comprimidos ou cápsulas para a administração oral. A substância ativa pode ser trabalhada para formar comprimidos ou núcleos de drageias ao ser misturada com substâncias transportadoras sólidas, pulverulentas, tais como o citrato de sódio, o carbonato de cálcio ou o fosfato dicálcico, e aglutinantes, tais como a polivinilpirrolidona, a gelatina ou os derivados de celulose, possivelmente adicionando também lubrificantes, tais como o estearato de magnésio, o lauril sulfato de sódio, "carbowax" ou o polietileno glicol. Claro gue podem ser adicionadas substâncias para beneficiar o sabor, no caso de formas para a administração oral.

Como outras formas, pode-se utilizar cápsulas de encaixe, por exemplo, de gelatina endurecida, bem como cápsulas de gelatina mole fechadas, gue compreendem um amaciador ou plastificador, por exemplo, a glicerina. As cápsulas de encaixe contêm a substância ativa de preferência sob a forma de granulado, por exemplo, em mistura com enchimentos, tais como a lactose, a sacarose, o manitol, os amidos, tais como o amido de batata ou a amilopectina, os derivados de celulose ou os ácidos silicicos altamente dispersos. Em cápsulas de gelatina mole, a substância ativa é de preferência dissolvida ou suspensa em líquidos adequados, tais como os óleos vegetais ou os polietileno glicóis líquidos. A loção, unguento, gel ou creme deve ser cuidadosamente esfregado na pele para que não seja claramente visível nenhum excesso, e a pele não deve ser lavada nessa região até que tenha ocorrido a maior parte da penetração transdérmica, preferencialmente pelo menos 4 horas e , mais de preferência, pelo menos 6 horas. 35

Um adesivo transdérmico pode ser usado para entregar o precursor de acordo com técnicas conhecidas. É tipicamente aplicado durante um período muito mais longo, por exemplo, de 1 a 4 dias, mas tipicamente, contacta o ingrediente ativo numa área superficial mais pequena, permitindo uma entrega lenta e constante do ingrediente ativo. São adequados para entregar o ingrediente ativo da presente invenção um sem número de sistemas de entrega transdérmica de fármacos, que foram desenvolvidos e estão a ser utilizados. A taxa de libertação é controlada tipicamente por difusão de uma matriz, ou por passagem do ingrediente ativo através de uma membrana de controlo.

Os aspetos mecânicos de dispositivos transdérmicos são bem conhecidos no rato, e são explicados, por exemplo, nas patentes US 5 162 037, 5 154 922, 5 135 480, 4 666 441, 4 624 665, 3 742 951, 3 797 444, 4 568 343, 5 064 654, 5 071 644, 5 071 657. São fornecidos antecedentes adicionais pela patente Europeia 0279982 e no pedido de patente Britânica 2185187. O dispositivo pode ser qualquer um dos tipos gerais conhecidos na tecnologia, incluindo a matriz adesiva e os dispositivos de entrega transdérmica de tipo reservatório. O dispositivo pode incluir matrizes contendo o fármaco, incorporando fibras que absorvem o ingrediente ativo e/ou o transportador. Num dispositivo de tipo reservatório, o reservatório pode ser definido por uma membrana de polímero impermeável ao transportador e ao ingrediente ativo.

Num dispositivo transdérmico, o próprio dispositivo mantém o ingrediente ativo em contacto com a superfície de pele localizada desejada. Em dito dispositivo, a viscosidade do transportador para o ingrediente ativo é menos preocupante do que com um creme ou gel. Um sistema de solvente para um dispositivo transdérmico pode incluir, por exemplo, ácido oleico, lactato de álcool linear e dipropileno glicol, ou outros sistemas de solventes 36 conhecidos na tecnologia. 0 ingrediente ativo pode ser dissolvido ou suspenso no transportador.

Para a fixação na pele, um adesivo transdérmico pode ser montado numa fita adesiva cirúrgica com um buraco perfurado no meio. 0 adesivo é preferivelmente coberto por um forro de libertação para protegê-lo antes da utilização. 0 material tipico adequado para a libertação inclui o polietileno e o papel revestido com polietileno, e, de preferência, um revestimento de silicone para facilitar a remoção. Para aplicar o dispositivo, o forro de libertação é simplesmente removido, e o adesivo anexado à pele do paciente. Na patente US 5 135 480, Bannon et al., descrevem um dispositivo alternativo que possui um meio não adesivo para segurar o dispositivo à pele. O sistema de entrega percutânea ou transmucosa da invenção também pode ser utilizado como um novo sistema de entrega melhorado, para a prevenção e/ou o tratamento de osteoporose ou de outras doenças que respondem favoravelmente ao tratamento com androgénios e/ou estrogénios.

Um modulador seletivo do recetor de estrogénio da invenção tem uma fórmula molecular com as caracteristicas que se seguem: a) dois anéis aromáticos espaçados por 1 até 2 átomos de carbono intermediários, sendo ambos os anéis aromáticos não substituídos ou substituídos por um grupo hidroxilo, ou um grupo convertido in vivo emhidroxilo, e b) uma cadeia lateral que possui um anel aromático e uma função de amina terciária ou um sal da mesma.

Um SERM preferido da invenção é o EM-800 relatado em PCT/CA96/00097 (WO 96/26201). A estrutura molecular do EM-800 é: 37

Outro SERM preferido da invenção é o EM-01538:

0 EM-1538 (também denominado por EM-652.HC1) é o sal cloridrato do antiestrogénio potente EM-652, em comparação com o EM-800, o EM-1538 é um sal mais simples e mais fácil de sintetizar. Também foi fácil de isolar, purificar, é cristalizável e exibiu uma boa estabilidade no estado sólido. Na administração quer de EM-800 ou de EM-1538, acredita-se que resultem no mesmo composto ativo in vivo.

Na medida em que entrem dentro da fórmula da reivindicação 1, outros SERM preferidos da invenção incluem o tamoxifen ((Z)-2-[4-(1,2-difenil-l-butenil)]-N,N-dimetiletanamina) (disponibilizado pela Zeneca, Reino Unido), o toremifen (disponibilizado pela Orion-Farmos Pharmaceuticla, Finlândia, ou Schering-Plough), o droloxifen e o CP-336,156 (cis-lR-[4-pirrolidino-etoxifenil]-2S-fenil-6-hidroxi-l,2,3,4,-tetrahidronaftaleno D-(-)-sal de tartarato) (Pfizer Inc., EUA), o raloxifen (Eli Lilly and Co., EUA), o LY 335563 e o LY 353381 (Eli Lilly and Co., EUA), o iodoxifen (SmithKline Beecham, EUA), o levormeloxifen (3,4-trans-2,2-dimetil-3-fenil-4-[4-(2-(2-(pirrolidin-l-il) etoxi) fenil]-7-metoxicromano) (Novo 38

Nordisk, A/S, Dinamarca), que é divulgado em Shalmi et al., WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038, e Korsgaard et al., WO 97/25036, o GW5638 (descrito por Willson et al. , Endocrinology, 138 (9), 3901-3911, 1997) e os derivados de indol (divulgados por Miller et al., EP 0802183A1) e o TSE 424 desenvolvido por Wyeth Ayers (EUA) e divulgado na JP10036347 (American home products Corporation), e os derivados de estrogénio não-esteroides descritos em WO 97/32837.

Os SERM administrados de acordo com a invenção são preferivelmente administrados numa gama de dosagem entre 0,01 e 10 mg/kg de peso corporal por dia (de preferência de 0,05 a 1,0 mg/kg), com 5 mg por dia, especialmente 10 mg por dia, em duas doses igualmente divididas, sendo preferido para uma pessoa de peso corporal médio quando administrados oralmente, ou numa gama de dosagem entre 0,003 e 3,0 mg/kg de peso corporal por dia (de preferência de 0,015 a 0,3 mg/ml) , com 1,5 mg por dia, especialmente 3,0 mg por dia, em duas doses igualmente divididas, sendo preferido para uma pessoa de peso corporal médio quando administrados parentericamente (isto é, administração intramuscular, subcutânea ou percutânea). De preferência, os SERM são administrados em conjunto com um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável, tal como descrito em seguida.

No que diz respeito a todas as dosagens aqui recomendadas, o médico assistente deve monitorizar a resposta do paciente individual, e ajustar a dosagem em conformidade.

EXEMPLOS

Exemplo Comparativo 1 MATERIAIS E MÉTODOS Animais

Os ratos fêmeas Sprague-Dawley [Cri:CD(SD)Br] foram obtidas aos 44-46 dias de idade de Charles River Canada 39

Inc. (St. Constant, Quebec), e alojadas 2 por caixa num ambiente controlado em luz (12 h de luz / dia, luzes acesas às 7hl5), e em temperatura (22 ± 2 °C). Os animais receberam ração Purina para roedores e água da torneira ad libitum. Os estudos com animais foram realizados numa instalação aprovada pelo Canadian Council on Animal Care (CCAC), de acordo com o Guia do CCAC para cuidados e uso de animais experimentais.

Indução de tumores mamários por DMBA

Os carcinomas mamários foram induzidos por uma única administração intragástrica de 20 mg de DMBA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 1 ml de óleo de milho aos 50-52 dias de idade. Dois meses mais tarde, foi realizada a medição do tumor duas vezes por semana. Os dois maiores diâmetros perpendiculares de cada tumor foram registados com compassos para estimar o tamanho do tumor, tal como descrito (Asselin et al., Endocrinology 101: 666-671, 1977) . Foram registados o local do tumor, o tamanho e o número.

Tratamento

Os animais foram divididos aleatoriamente em grupos, cada um contendo 20 ratos, com a exceção dos 40 animais no grupo controlo. Os animais foram tratados durante 282 dias com o seguinte. (1) veículos controlo, tanto para a DHEA como o EM-800, (2) EM-800 (( + )-7-pivaloiloxi-3-(4'- pivaloiloxifenil)-4-metil-2-(4"-(2"'-piperidinoetoxi) fenil)-2H-benzopirano) (75 pg, por via oral, uma vez por dia) em 0,5 ml de uma suspensão de 4 % de etanol, 4 % de polietileno glicol-600, 1 % de gelatina, 0,9 % de NaCl, (3) DHEA (10 mg, por via percutânea, uma vez por dia) em 0,5 ml de 50 % de etanol, 50 % de propileno glicol, e (4) tanto o EM-800 como a DHEA. O tratamento foi iniciado 3 dias antes da administração oral de DMBA. O EM-800 foi sintetizado na Divisão de Química Medicinal do nosso laboratório, ao passo que a DHEA foi adquirida a partir de Steraloids Inc., 40

Wilton, NH.

Muitos dos animais controlo e alguns dos animais tratados com o EM-800 ou com a DHEA foram sacrificados por deslocamento cervical, sob anestesia induzida por isoflurano, 6 meses após a administração de DMBA, devido ao tamanho muito grande dos tumores. Os valores do tamanho e número do tumor destes ratos na altura do sacrifício, juntamente com os medidos em intervalos de tempo posteriores nos animais sobreviventes, foram utilizados para a análise posterior da incidência de tumores, número médio de tumores por rato portador de tumor, e tamanho médio dos tumores por animal portador de tumor. Os restantes animais (9 ratos controlo e 13-19 ratos de cada outro grupo) continuaram a receber o tratamento durante mais um período de 3 meses, a fim de observar a potência preventiva a longo prazo da DHEA e do EM-800, isoladamente ou em combinação. Os ratos foram sacrificados 279 dias após a administração de DMBA. Os úteros, vaginas e ovários foram imediatamente removidos, libertados de tecido conjuntivo e adiposo e pesados.

Recolha e processamento das amostras

Foram recolhidas amostras de urina de vinte e quatro horas no final da experiência, dos primeiros 9 ratos de cada grupo, seguindo a transferência em caixas metabólicas (Allentown Caging Equipment Co., Allentown, NJ). Foram recolhidas duas amostras urinárias, e foram analisadas em dias diferentes para cada animal, a fim de minimizar a influência da variação diária. Portanto, cada valor mostrado representa a média das duas medições efetuadas em dois dias diferentes. Foram adicionados 0,5 ml de tolueno nos tubos de recolha de urina para evitar a evaporação de urina e o crescimento bacteriano, e foi registado o volume urinário. Foi recolhido sangue do tronco durante o sacrifício, e foi deixado a coagular a 4 °C durante a noite antes da centrifugação a 3000 rpm durante 30 minutos. 41

Análise de parâmetros bioquímicos da urina e do soro

Foram utilizadas amostras frescas para o ensaio de creatinina urinária, cálcio e fósforo, bem como da atividade da fosfatase alcalina no soro (tALP), colesterol e triglicéridos. Estes parâmetros bioquímicos foram medidos automaticamente com um Sistema de química Monarch 2000 (Instrumentation Laboratory Co. Lexington, MA), em condições de Boas Práticas de Laboratório. Foi medida a hidroxiprolina urinária tal como descrito (Podenphant et al., Clinica Chimica Acta 142: 145-148, 1984).

Medições da massa óssea

Os ratos foram anestesiados com uma injeção ip de cloridrato de cetamina e diazepam em doses de 50 e 4 mg/kg de peso corporal, respetivamente. Foram rastreados todo o esqueleto e o fémur direito usando absorptiometria de raios-X de energia dupla (DEXA, QDR 2000-7.10C, Hologic, Waltham, MA) , equipada com um software de alta resolução regional. Os tamanhos de campo de rastreio foram 28,110 x 17,805 cm e 5,0 x 1,902 cm, as resoluções foram 0,1511 x 0,0761 cm e 0,0254 x 0,0127 cm, enquanto as velocidades de rastreio foram 0,3608 e 0,0956 mm/s para o esqueleto total e o fémur, respetivamente. Foram medidos nas imagens de rastreio do esqueleto total e do fémur tanto o conteúdo mineral ósseo (CMO) como a densidade mineral óssea (DMO) do esqueleto total, da coluna lombar e do fémur.

Análises estatísticas A significância estatística foi medida de acordo com o teste de múltipla gama de Duncan-Kramer (Biometrics 12: 307-310, 1956). A análise da incidência do desenvolvimento de tumores mamários foi realizada usando o teste exato de Fisher (Conover, Praticai nonparametric statistics, 2a edição 153-170, 1980) . Os dados são apresentados como as médias ± SEM.

RESULTADOS

Efeito sobre o desenvolvimento de carcinoma mamário 42

induzido por DMBA

Tal como ilustrado na figura 1, 95 % dos animais controlo desenvolveu tumores mamários palpáveis aos 279 dias após a administração de DMBA. 0 tratamento com a DHEA ou o EM-800 preveniu parcialmente o desenvolvimento de carcinoma mamário induzido por DMBA e, assim, a incidência foi reduzida para 57 % (p < 0,01) e 38 % (p < 0,01), respetivamente. Curiosamente, a combinação dos dois compostos conduziu a um efeito inibidor significativamente mais elevado do que os obtidos por cada composto isoladamente (p < 0,01 versus a DHEA ou o EM-800 isoladamente) . De facto, os únicos dois tumores que se desenvolveram no grupo de animais tratados com ambos os compostos desapareceram antes do final da experiência. O tratamento com a DHEA ou o EM-800 reduziu o número médio de tumores por animal portador de tumor a partir de 4,7 ± 0,5 tumores em animais controlo para 3,4 ± 0,7 (N.S.) e 1,4 ± 0,3 (p < 0,01) tumores / animal, respetivamente, enquanto que não foi encontrado nenhum tumor no final da experiência nos animais que receberam ambos os fármacos (p < 0,01 versus os outros três grupos) (fig. 2A). Um dos dois tumores que desapareceu mais tarde esteve presente desde o dia 79 ao dia 201 após a administração de DMBA, ao passo que o outro tumor foi palpável desde o dia 176 ao dia 257. Pode ser visto na fig. 2B que a DHEA ou o EM-800 isoladamente diminuíram a área média do tumor por animal portador de tumor de 12,8 ±1,3 cm2no final da experiência para 10,2 ± 2,1 cm2 (N.S.) e 7,7 ± 1,8 cm2 (N.S.), respetivamente, enquanto que o tratamento de combinação resultou num valor nulo (p < 0,01 versus os outros três grupos) . Os dois tumores que se desenvolveram no grupo de animais tratados tanto com a DHEA como com o EM-800 não cresceram maiores do que 1 cm2. Deve ser mencionado que os valores reais da área média do tumor, bem como o número médio de tumores por animal portador de tumor no grupo 43 controlo devem ser mais elevados do que os valores apresentados na figura 2, uma vez que muitos ratos tiveram de ser sacrificados antes do final da experiência devido à dimensão excessiva dos tumores. Os valores medidos na altura do sacrifício foram assim incluídos como tal nos cálculos feitos em intervalos de tempo posteriores, a fim de minimizar um desvio no grupo controlo que, em qualquer caso, permaneceu significativamente acima dos outros grupos.

Efeito sobre o osso A administração percutânea a longo prazo de DHEA a ratos fêmeas induziu aumentos de 6, 9 % (p < 0,01), 10,6 % (p < 0,05) e de 8,2 % (p < 0,01) na densidade mineral óssea (DMO) do esqueleto total, da coluna lombar e do fémur, respetivamente (quadro 2) . Por outro lado, não foi observada nenhuma alteração significativa nos animais tratados com o EM-800. Para além disso, quando ambos os compostos foram administrados simultaneamente, os valores obtidos foram comparáveis aos atingidos com a DHEA isoladamente. O tratamento com a DHEA aumentou a atividade da fosfatase alcalina total no soro (tALP) em 74 % (p < 0,05), mas não teve nenhum efeito sobre a excreção urinária diária de cálcio e de fósforo, e sobre a razão urinária de hidroxiprolina para creatinina (quadro 3). Por outro lado, o tratamento com o EM-800 diminuiu a razão urinária de hidroxiprolina para creatinina em 48 % (p < 0,01), mas não teve nenhuma influência estatisticamente significativa sobre a excreção urinária diária de cálcio ou de fósforo e na atividade de tALP no soro. A combinação de DHEA e de EM-800 conduziu a um aumento na atividade de tALP no soro (p < 0,01) semelhante ao atingido com a DHEA isoladamente, e reduziu a razão urinária de hidroxiprolina para creatinina em 69 %, um valor significativamente (p < 0,01) mais baixo do que o que se obtém com o EM-800 isoladamente. Para além 44 disso, a combinação dos dois fármacos reduziu significativamente a excreção urinária diária de cálcio e de fósforo em 84 % (p < 0,01) e 56 % (p < 0,01), respetivamente, ao passo que não foi observada nenhuma alteração significativa com cada fármaco isoladamente (quadro 3).

Efeito sobre os níveis de lípidos no soro O tratamento a longo prazo com o EM-800 reduziu os níveis de triglicéridos no soro e de colesterol em 72 % (p < 0,01) e em 45 % (p < 0,01), respetivamente, ao passo que a administração a longo prazo de DHEA diminuiu os níveis de triglicéridos no soro em 60 % (p < 0,01), não sendo afetados os níveis de colesterol no soro. Para além disso, foram medidas diminuições de 42 % (p < 0,01) e de 52 % (p < 0,01) nas concentrações de triglicéridos no soro e de colesterol, nos animais tratados tanto com o EM-800 como com a DHEA (fig. 3).

Quadro 2. Efeito do tratamento com a DHEA (10 mg, por via percutânea, uma vez por dia) ou com o EM-800 (75 pg, por via oral, uma vez por dia), isoladamente ou em combinação durante 9 meses, sobre a densidade mineral óssea (DMO) do fémur, da coluna lombar, e do esqueleto total no rato fêmea. As medições foram realizadas em 9 ratos por grupo. *: p < 0,05, **: p < 0,01, experimental versus controlo. GRUPO DMO (g/cm2) ESQUELETO TOTAL COLUNA LOMBAR FÉMUR CONTROLO 0,1371 ± 0,0025 0,1956 ± 0,0067 0,3151 + 0,0063 DHEA (10 mg) 0,1465 ± 0,0010** 0,2163 ± 0,0049* 0,3408 ± 0,0038** EM-800 (75 pg) 0,1356 ± 0,0017 0,1888 ± 0,0045 0,3097 ± 0,0047 DHEA + EM-800 0,1498 ± 0,0019** 0,2108 ± 0,0061 0,3412 ± 0,0056**

Quadro 3. Efeito do tratamento com a DHEA (10 mg, por via percutânea, uma vez por dia) ou o EM-800 (75 pg, por via oral, uma vez por dia) , isoladamente ou em combinação durante 9 meses, sobre os parâmetros do metabolismo ósseo 45 no rato: excreção urinária diária de cálcio e de fósforo, razão urinária de hidroxiprolina para creatinina (HP / Cr), e atividade da fosfatase alcalina total no soro (tALP).

As amostras foram obtidas a partir de 9 animais por grupo. *: p < 0,05, **: p < 0,01 experimental versus controlo. 46 GRUPO URINA SORO CÁLCIO (μιηοΐ / 24 h / 100 g) FÓSFORO (μιηοΐ / 24 h / 100 g) HP / Cr (μιηοΐ / mmol) tALP (IU/1) CONTROLO 23,17 ± 1,55 132,72 ± 6,08 13,04 ± 2,19 114,25 ± 14,04 DHEA (10 mg) 25,87 ± 3,54 151,41 ± 14,57 14,02 ± 1,59 198,38 ± 30,76* EM-800 (75 ug) 17,44 ± 4,5 102,03 ± 25,13 6,81 ± 0,84** 114,11 ± 11,26 HEA + EM-800 3,71 ± 0,75** 59,06 ± 4,76** 4,06 ± 0,28** 204,38 ± 14,20**

Exemplo comparativo 2 RESUMO

Na glândula mamária, são formados androgénios a partir do precursor de esteroides dehidroepiandrosterona (DHEA). A evidência clínica indica que os androgénios têm efeitos inibidores sobre o cancro da mama. Os estrogénios, por outro lado, estimulam o desenvolvimento e o crescimento do cancro da mama. Estudámos o efeito da DHEA isoladamente ou em combinação com o antiestrogénio puro recentemente descrito, o EM-800, sobre o crescimento de xenotransplantes de tumor formados pela linha de células de cancro da mama humano ZR-75-1 em ratinhos fêmeas nus ovariectomizadas.

Os ratinhos receberam injeções subcutâneas diárias de 0,5 pg de estrona (uma hormona estrogénica) imediatamente após a ovariectomia. O EM-800 (15, 50 ou 100 pg) foi administrado por via oral uma vez por dia. A DHEA foi aplicada duas vezes por dia (dose total 0,3, 1,0 ou 3,0 mg) na pele dorsal, quer isoladamente ou em combinação com uma dose oral diária de 15 pg de EM-800 . As alterações na dimensão do tumor em resposta aos tratamentos foram avaliadas periodicamente, relativamente às medições feitas no primeiro dia. No final das experiências, os tumores 47 foram dissecados e pesados.

Foi observado um aumento de 9,4 vezes no tamanho do tumor em 9,5 meses em ratinhos fêmea ovariectomizadas que receberam estrona isoladamente, em comparação com os ratinhos que não receberam estrona. A administração de 15, 50 ou 100 pg de EM-800 em ratinhos fêmea ovariectomizadas suplementadas com estrona conduziu a inibições de 88 %, 93 %, e 94 % no tamanho do tumor, respetivamente. A DHEA, por outro lado, em doses de 0,3, 1,0 ou 3,0 mg inibiu o peso terminal do tumor em 67 %, 82 %, e 85 %, respetivamente.

Foram obtidas inibições comparáveis no tamanho do tumor com uma dose oral de 15 pg por dia do EM-800, com ou sem diferentes doses de DHEA por via percutânea. A DHEA e o EM-800 suprimiram, independentemente, o crescimento de xenotransplantes de tumores ZR-75-1 de ratinho estimulado com estrona em ratinhos nude. A administração de DHEA às doses definidas não altera o efeito inibidor do EM-800. MATERIAIS E MÉTODOS Células ZR-75-1

As células ZR-75-1 de cancro da mama humano foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD) , e foram cultivadas rotineiramente como monocamadas em meio RPMI 1640, suplementado com 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 100 UI de penicilina / ml, 100 pg de estreptomicina / ml, e 10 % de soro fetal bovino, sob uma atmosfera humidificada de 95 % de ar / 5 % de C02, a 37 °C, tal como descrito (Poulin e Labrie, Câncer Res. 46.: 4933-4937, 1986, Poulin et al., Breast Câncer

Res. Treat. 12: 213-225, 1988). As células foram passadas semanalmente após o tratamento com 0,05 % de tripsina : 0,02 % de EDTA (p/v) . As culturas de células utilizadas para as experiências descritas neste relatório foram derivadas da passagem 93 da linha celular ZR-75-1. 48

Animais

As fêmeas homozigóticas Harlan Sprague-Dawley (nu / nu) de ratinhos atimicos (28 a 42 dias de idade) foram obtidas a partir de HSD (Indianapolis, Indiana, EUA) . Os ratinhos foram alojados em caixas de vinil com topos de filtro de ar em câmaras de fluxo laminar e, mantidos em condições limitadas de organismos patogénicos. As caixas, a cama, e os alimentos foram autoclavados antes do uso. A água foi autoclavada, acidificada a pH 2,8, e fornecida ad libitum.

Inoculação das células

Os ratinhos fêmea foram ovariectomizadas (OVX) bilateralmente uma semana antes da inoculação de células de tumor, sob anestesia alcançada por injeção intraperitoneal de 0,25 ml / animal de avertin (álcool amilico: 0,8 g / 100 ml de NaCl a 0,9 %, e etanol tribromo: 2 g / 100 ml de NaCl a 0,9 %) . Foram recolhidas 1,5 x 106 células ZR-75-1 em fase logarítmica de crescimento após o tratamento da monocamada com 0,05 % de tripsina / 0,02 % EDTA (p/v) , foram suspensas em 0,1 ml de meio de cultura contendo 25 % de Matrigel e, foram inoculadas por via subcutânea em ambos os flancos dos animais, utilizando uma agulha de uma polegada de comprimento, de calibre 20, tal como descrito anteriormente (Dauvois et al., Câncer Res. 51: 3131-3135, 1991) . A fim de facilitar o crescimento dos tumores, cada animal recebeu uma injeção subcutânea diária de 10 pg de estradiol (E2 ) em veículo composto por 0,9 % de NaCl, 5 o. "O de etanol, 1 2--L o de gelatina durante 5 semanas. Após 0 aparecimento de tumores ZR-75-1 palpáveis, foi medido 0 diâmetro do tumor com compasso, e os ratinhos com um diâmetro de tumor entre 0,2 e 0,7 cm foram selecionados para este estudo.

Tratamento hormonal

Todos os animais, exceto aqueles no grupo OVX controlo, receberam injeções subcutâneas diárias de 0,5 pg 49 de estrona (Ei) em 0,2 ml de NaCl a 0,9 %, etanol a 5 %, gelatina a 1 %. Nos grupos indicados, a DHEA foi administrada por via percutânea duas vezes por dia às doses de 0,3, 1,0 ou 3,0 mg / animal, aplicadas num volume de 0,02 ml na pele da área dorsal, fora da área de crescimento do tumor. A DHEA foi dissolvida em 50 % de etanol, 50 % de propileno glicol. O EM-800, ( ( + )-7-pivaloiloxi-3-(4'- pivaloiloxifenil)-l-metil-2-(4"-(2"'-piperidinoetoxi) fenil)-2H-benzopirano), foi sintetizado tal como descrito anteriormente (Gauthier et al., J. Med. Chem. 40: 2117- 2122, 1997) na divisão de química medicinal do Laboratório de Endocrinologia Molecular do Centro de Investigação CHUL. O EM-800 foi dissolvido em 4 % (v/v) de etanol, 4 % (v/v) de polietileno glicol (PEG) 600, 1 % (p/v) de gelatina, 0,9 % (p/v) de NaCl. Os animais dos grupos indicados receberam doses orais diárias de 15 pg, 50 pg ou 100 pg de EM-800, isoladamente ou em combinação com a DHEA, enquanto que os animais do grupo OVX receberam o veículo (0,2 ml de 4 % de etanol, 4 % de PEG 600, 1 % de gelatina, 0,9 % de NaCl) isoladamente. Os tumores foram medidos uma vez por semana com compassos de Vernier. Foram registados dois diâmetros perpendiculares em cm (L e W) , e a área tumoral (cm2) foi calculada usando a fórmula: L/2xW/2xn (Dauvois et al., Câncer Res. 51: 3131-3135, 1991) . A área medida no primeiro dia de tratamento foi tomada como 100 %, e as alterações no tamanho do tumor foram expressas como percentagem da área inicial do tumor. No caso de tumores subcutâneos em geral, não é possível aceder com precisão ao volume a três dimensões do tumor, por conseguinte, apenas foram medidas as áreas dos tumores. Após 291 dias (ou 9,5 meses) de tratamento, os animais foram sacrificados.

As categorias de respostas foram avaliadas tal como descrito (Dauvois et al., Breast Câncer Res. Treat. 14: 299-306, 1989, Dauvois et al., Eur. J. Câncer Clin. Oncol. 25: 891-897, 1989, Labrie et al., Breast Câncer Res. Treat. 50 33: 237-244, 1995). Em resumo, a regressão parcial corresponde aos tumores que regrediram igual ou superior a 50 % do seu tamanho original, a resposta estável refere-se a tumores que regrediram menos de 50 % do tamanho original ou progrediram menos de 50 % do seu tamanho original, enquanto que a regressão completa refere-se àqueles tumores que foram indetetáveis no final do tratamento. A progressão refere-se a tumores que progrediram mais de 50 % em comparação com o seu tamanho original. No final da experiência, todos os animais foram mortos por decapitação. Foram imediatamente removidos os tumores, útero e vagina, libertados de tecido conjuntivo e adiposo e pesados.

Análise estatística A significância estatística dos efeitos dos tratamentos sobre a dimensão do tumor foi avaliada utilizando uma análise de variância (ANOVA), avaliando os efeitos devidos à DHEA, ao EM-800 e tempo, e de medições repetidas nos mesmos animais realizadas no início e no fim do tratamento (sujeitos dentro de fator de grupo) . As medidas repetidas no tempo 0 e após 9,5 meses de tratamento constituem blocos aleatórios de animais. O tempo é, assim, analisado como um efeito intrabloco, enquanto que ambos os tratamentos são avaliados como efeitos entre-blocos. Foram incluídas no modelo todas as interações entre os efeitos principais. A significância dos fatores de tratamento e das suas interações foram analisadas utilizando os sujeitos dentro do grupo como o termo de erro. Os dados foram transformados em logaritmos. As hipóteses subjacentes à ANOVA assumiram a normalidade dos resíduos e a homogeneidade da variância.

Foram realizadas comparações a pares a posteriori por meio do teste de Fisher para diferenças menos significativas. Foram analisados os efeitos principais e a interação dos tratamentos sobre o peso corporal e o peso dos órgãos usando uma ANOVA padrão bidirecional com 51 interações. Todas as ANOVAs foram realizadas utilizando o programa SAS (SAS Institute, Cary, NC, EUA). A significância das diferenças foram declaradas utilizando um teste bilateral com um nivel global de 5 %.

Os dados categóricos foram analisados com um teste de Kruskall-Wallis para variáveis de respostas categóricas ordenadas (resposta completa, resposta parcial, resposta estável e progressão do tumor). Após a avaliação global dos efeitos de um tratamento, os subconjuntos dos resultados apresentados no quadro 4 foram analisados ajustando o valor critico de p para as comparações múltiplas. Os valores exatos de p foram calculados usando o programa StatXact (Cytel, Cambridge, MA, EUA).

Os dados são expressos como as médias ± erro padrão da média (SEM) de 12 a 15 ratinhos em cada grupo.

RESULTADOS

Tal como ilustrado na fig. 4A, os tumores humanos ZR-75-1 aumentaram 9,4 vezes ao longo de 291 dias (9,5 meses) em ratinhos nude fêmea ovariectomizadas tratadas com uma dose diária de 0,5 yg de estrona administrada por via subcutânea, enquanto que em ratinhos OVX controlo, que receberam o veiculo isoladamente, o tamanho do tumor foi reduzido em 36,9 % do valor inicial no decurso do estudo. O tratamento com doses crescentes de DHEA por via percutânea causou uma inibição progressiva do crescimento do tumor ZR-75-1 estimulado comEi. As inibições de 50,4 %, 76,8 % e 80,0 % foram obtidas em 9,5 meses de tratamento com as doses diárias de DHEA de 0,3 mg, 1,0 mg e 3,0 mg por animal, respetivamente (fig. 4A) . De acordo com o decréscimo da carga tumoral total, o tratamento com a DHEA conduziu a um decréscimo acentuado do peso médio dos tumores remanescentes no fim da experiência. De facto, o peso médio do tumor diminuiu de 1,12 ± 0,26 g em ratinhos controlo nus fêmeas ovariectomizadas suplementadas com Ei para 0,37 ± 0,12 g (p = 0,005), 0,20 ± 0,06 g (p = 0,001), 52 e 0,17 ± 0,06 g (p = 0, 0009) nos grupos de animais que receberam a diário doses de 0,3, 1,0 e 3,0 mg de DHEA, respetivamente (fig. 4B). Às doses diárias de 15 pg, 50 pg e 100 pg, o antiestrogénio EM-800 inibiu o tamanho do tumor estimulado por estrogénio em 87,5 % (p < 0,0001), 93,5 % (p < 0,0001), e 94,0 % (p = 0,0003), respetivamente (fig. 5A) , quando comparado com o tamanho do tumor nos animais controlo aos 9.5 meses. As reduções de tamanho do tumor obtidas com as três doses de EM-800 não são significativamente diferentes entre si. Tal como ilustrado na fig. 4B, o peso do tumor no final dos 9,5 meses de estudo diminuiu de 1,12 ± 0,26 g em ratinhos fêmea OVX controlo suplementadas com Ei para 0,08 ± 0,03 g, 0,03 ± 0,01 g e 0,04 ± 0,03 g em animais tratados com as doses diárias de 15 pg, 50 pg e 100 pg de EM-800, respetivamente (p < 0,0001 em todas as doses de EM-800 versus OVX suplementadas com Ei) .

Tal como mencionado anteriormente, o antiestrogénio EM-800, à dose oral diária de 15 pg, causou uma inibição de 87.5 % do crescimento do tumor estimulado por estrona medido aos 9,5 meses. A adição de DHEA às três doses utilizadas não teve nenhum efeito significativo sobre a inibição já acentuada da dimensão do tumor alcançada com a dose diária de 15 pg do antiestrogénio EM-800 (fig. 5B) . Assim, o peso médio do tumor foi reduzido drasticamente de 1,12 ± 0,26 g em ratinhos controlo suplementados com estrona para 0,08 ± 0,03 g (p < 0,0001), 0,11 ± 0,04 g (p = 0,0002), 0,13 ± 0,07 g (p = 0, 0004) e 0,08 ± 0,05 g (p < 0,0001) nos animais que receberam a dose diária de 15 pg do antiestrogénio isoladamente, ou em combinação com as doses de 0,3, 1,0, e 3,0 mg de DHEA, respetivamente (não foi observada nenhuma diferença significativa entre os 4 grupos) (fig. 4B).

Foi também de interesse examinar as categorias de respostas obtidas com os tratamentos indicado 53 anteriormente. Assim, o tratamento com as doses crescentes de DHEA diminuiu, embora não a um nivel de significância estatística (p = 0,088), o número de tumores em progressão, de 87,5 % nos animais OVX controlo suplementados com estrona, para valores de 50,0 %, 53,3 %, e 66,7 % nos animais tratados com as doses diárias de 0,3, 1,0 ou 3,0 mg de DHEA (quadro 4). Por outro lado, as respostas completas aumentaram de 0 % nos ratinhos suplementados com estrona para 28,6 %, 26,7 % e 20,0 % nos animais que receberam as doses diárias de 0,3, 1,0, e 3,0 mg de DHEA por via percutânea. As respostas estáveis, por outro lado, foram medidas a 12,5 %, 21,4 %, 20,0 % e 13,3 % nos ratinhos controlo suplementados com Εχ, e nos três grupos de animais que receberam as doses indicadas anteriormente de DHEA, respetivamente. Nos ratinhos fêmea controlo ovariectomizadas, as taxas de respostas completas, parciais e estáveis foram medidas em 68,8 %, 6,2 % e 18,8 %, respetivamente, enquanto que a progressão foi observada em apenas 6,2 % dos tumores (quadro 4).

As respostas completas ou o desaparecimento dos tumores foram obtidos em 29,4 %, 33,3 %, 26,7 %, e 35,3 % dos tumores, nos animais que receberam o antiestrogénio EM-800 (p = 0,0006) por si só (15 pg), ou em combinação com os 0,3 mg, 1,0 mg ou 3,0 mg de DHEA, respetivamente (quadro 4). A progressão, por outro lado, foi observada em 35,3 %, 44,4 %, 53,3 % e 17,6 % dos tumores, nos mesmos grupos de animais, respetivamente. Não há nenhuma diferença significativa entre os grupos tratados com o EM-800 isoladamente ou em combinação com a DHEA. Não foi observado nenhum efeito significativo do tratamento com a DHEA ou o EM-800 no peso corporal ajustado para o peso do tumor. O tratamento de ratinhos OVX com estrona aumentou o peso uterino de 28 ± 5 mg em ratinhos OVX controlo para 132 ± 8 mg (p <v0,01), enquanto que as doses crescentes de DHEA causaram uma inibição progressiva, 54 mas relativamente pequena, do efeito estimulador da estrona, que atingiu 26 % (p = 0,0008) na dose mais elevada de DHEA utilizada. Pode ver-se na mesma figura que o peso uterino estimulado por estrona diminuiu de 132 ± 8 mg em ratinhos controlo suplementados com estrona para 49 ± 3 mg, 36+2 mg, e 32 + 1 mg (p < 0,0001 em todas as doses versus o controlo) com as doses orais diárias de 15 pg, 50 pg ou 100 pg de EM-800 (p global < 0, 0001), respetivamente. Com quinze microgramas (15 pg) de EM-800, em combinação com os 0,3 mg, 1,0 mg ou 3,0 mg de doses diárias de DHEA, o peso uterino foi medido em 46 ± 3 mg, 59 ± 5 mg e 69 ± 3 mg, respetivamente.

Por outro lado, o tratamento com a estrona aumentou o peso vaginal de 14 i 2 mg em animais OVX para 31+2 mg (p < 0,01), enquanto que a adição de DHEA não teve nenhum efeito significativo. O peso vaginal foi então reduzido para 23 ± 1 mg, 15 ± 1 mg, e 11 ± 1 mg a seguir ao tratamento com as doses diárias de 15 pg, 50 pg ou 100 pg de EM-800, respetivamente (p global e p em pares < 0,0001 em todas as doses versus o controlo). Com a combinação das doses de 0,3 mg, 1,0 mg ou 3,0 mg de DHEA e as de EM-800, o peso vaginal foi medido a 22 ± 1 mg, 25 ± 2 mg e 23 ± 1 mg, respetivamente (N.S. para todos os grupos versus 15 pg de EM-800) . Deve ser mencionado que, com a dose mais elevada utilizada, nomeadamente 100 pg por dia, o EM-800 diminuiu o peso uterino em animais OVX suplementados com estrona para um valor não diferente de controlos OVX, enquanto que o peso vaginal foi reduzido para um valor inferior ao medido em controlos OVX (p < 0,05). A DHEA, provavelmente devido aos seus efeitos androgénicos, contrabalançou parcialmente o efeito de EM-800 no peso do útero e vaginal. 55

Quadro 4. Efeito da administração percutânea de DHEA ou da administração oral do EM-800, isoladamente ou em combinação durante 9,5 meses, sobre as respostas (completa, parcial, estável, e de progressão) de xenotransplantes de tumor de mama ZR-75-1 de humanos em ratinhos nude. GRUPO NÚMERO TOTAL DE ANIMAIS CATEGORIA DE RESPOSTA Completa Parcial Estável Progressão Número e (%) OVX 16 11 1 (6,2) 3 (18,8) 1 (6,2) (68,8) OVX + EI (0,5 pg) 16 0 (0) 0 (0) 2 (12,5) 14 (87,5) 0,3 14 4 (28,6) 0 (0) 3 (21,4) 7 (50,0) mg OVX + EI 1,0 0,5 pg) + mg 15 4 (26,7) 0 (0) 3 (20,0) 8 (53,3) DHEA 3, 0 15 3 (20,0) 0 (0) 2 (13,3) 10 (66,7) mg 15 pg 17 5 (29,4) 1 (5,9) 5 (29,4) 5 6 (35,3) OVX + EI 50 pg 16 4 (25,0) 3 (31,2) 4 (25,0) (0,5 pg) (18,8) + EM-800 100 pg 16 8 (50,0) 3 (18,8) 5 (31,2) 0 (0) 0,3 18 6 (33,3) 0 (0) 4 (22,2) 8 (44,4) OVX + EI (0,5 mg pg) + 1,0 15 4 (26,7) 0 (0) 3 (20,0) 8 (53,3) EM-800 + DHEA mg 3, 0 17 6 (35,3) 0 (0) 8 (47,1) 3 (17,6) mg E2 = estrona, DHEA = dehidroepiandrosterona, OVX = ovariectomizadas

Exemplo comparativo 3

Efeito do composto preferido da invenção sobre os niveis de colesterol de ratos fêmeas ovariectomizadas Animais e tratamento

Foram usados ratos fêmeas Sprague-Dawley (Cri:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canadá) de cinquenta a 60 dias de idade, pesando aproximadamente 190 g na altura da ovariectomia. Os animais foram aclimatados às condições ambientais (temperatura: 22 ± 3 °C, humidade: 50 ± 20 %, ciclos de 12 h de luz - 12 h 56 de escuro, luzes ligadas às 7hl5) durante 1 semana antes da cirurgia. Os animais foram alojados três por caixa e tiveram acesso livre à água da torneira e a uma alimentação de ração de roedor certificada (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO) . A experiência foi conduzida numa instalação aprovada pelo Canadian Council on Animal Care, de acordo com o Guia do CCAC para cuidados e uso de animais experimentais.

Foram ovariectomizadas no dia 0 do estudo cento e trinta e seis ratos fêmeas, sob anestesia de isoflurano, e foram distribuídas aleatoriamente em 17 grupos de animais para realizar Grupo 1: OVX o estudo CONT descrito em seguida: Grupo 2: OVX + EM-800 (0,01 mg/kg, po, ID Grupo 3: OVX + EM-800 (0,03 mg/kg, po, ID Grupo 4: OVX + EM-800 (0,1 mg/kg, po, ID) Grupo 5: OVX + EM-800 (0,3 mg/kg, po, ID) Grupo 6: OVX + EM-800 (1 mg/kg, po, ID) Grupo 7: OVX + EM-01538 (0,01 mg/kg, po,

Grupo 8: OVX + EM-01538 (0,03 mg/kg, po, ID)

Grupo 9: OVX + EM-01538 (0,1 mg/kg, po, ID)

Grupo 10: OVX + EM-01538 (0,3 mg/kg, po, ID)

Grupo 11: OVX + EM-01538 (1 mg/kg, po, ID)

Grupo 12: OVX + raloxifen (EM-1105) (0,01 mg/kg, po, ID) Grupo 13: OVX + raloxifen (EM-1105) (0,03 mg/kg, po, ID) Grupo 14: OVX + raloxifen (EM-1105) (0,1 mg/kg, po, ID)

Grupo 15: OVX + raloxifen (EM-1105) (0,3 mg/kg, po, ID)

Grupo 16: OVX + raloxifen (EM-1105) (1 mg/kg , po, ID)

Grupo 17: INT CONT A administração dos tratamentos foi iniciada no dia 10 do estudo e foram administrados por sonda esofágica, uma vez por dia, até ao dia 13 do estudo. As suspensões de dosagem foram preparadas em 0,4 % de metilcelulose, e a concentração foi ajustada de acordo com o peso médio do corpo do grupo registado no dia 10 do estudo, a fim de dar 57 0,5 ml de suspensão de dosagem por rato. Aproximadamente 24 horas após a última dosagem, os animais mais rápidos durante a noite foram mortos por sangria na aorta abdominal, sob anestesia com isoflurano, e foram processadas amostras de sangue para a preparação de soro. Os úteros foram removidos, limpos de gordura remanescente e pesados.

Ensaios de colesterol e de triglicéridos no soro

Os níveis totais de colesterol e de triglicéridos no soro foram determinados utilizando o sistema de diagnóstico de laboratório da Boehringer Mannheim.

Exemplo comparativo 4 O androsteno-3p, 17β-ύίο1 (5-diol) possui atividade estrogénica intrínseca. Para além disso, como um precursor de esteroides sexuais, pode ser transformado em androgénios ativos e/ou outros estrogénios em tecidos periféricos intracrina. Para avaliar a importância relativa dos componentes androgénicos e estrogénicos da ação de 5-diol sobre a massa óssea, foram ovariectomizadas ratos fêmea de vinte e uma semanas de idade e tratadas por via percutânea uma vez por dia com 2, 5 ou 12,5 mg de 5-diol, isoladamente ou em combinação com o antiandrogénio flutamida (FLU, 10 mg, sc, uma vez por dia), e/ou o antiestrogénio EM-800 (100 pg, sc, uma vez por dia) durante 12 meses. A densidade mineral óssea (DM0) foi medida depois de 11 meses de tratamento. A ovariectomia (OVX) conduziu a um decréscimo de 12,8 % na DMO femoral (p < 0,01), enquanto que o tratamento com a dose mais elevada de 5-diol restaurou 34,3 % da DMO femoral perdida durante os 11 meses após a OVX (p < 0,01). A administração simultânea de FLU preveniu completamente o efeito estimulador do 5-diol sobre a DMO femoral, enquanto que a adição de EM-800 resultou numa estimulação adicional de 28,4 % em comparação com o efeito do 5-diol isoladamente. A administração simultânea de 5-diol, FLU e de EM-800 apenas exibiu o efeito do EM-800 (27 58 %) , uma vez que o efeito do 5-diol foi completamente bloqueado pela FLU. Foram obtidos resultados comparáveis na DMO da coluna lombar, embora a DM0 da coluna lombar em ratos OVX que recebem 12,5 mg de 5-diol isoladamente, 12,5 mg de 5-diol + EM-800 ou 5-diol + FLU + EM-800 foi restaurada para valores não significativamente diferentes dos de animais intactos. A análise histomorfométrica mostra que os efeitos estimuladores do 5-diol sobre o volume ósseo, número trabecular, e o efeito inibidor sobre a separação trabecular de esponjosa secundária da área de metáfises da tíbia proximal são abolidos pela FLU, mas reforçados por EM-800. A estimulação acentuada da atividade da fosfatase alcalina no soro obtida após o tratamento com 5-diol é de 57 % (p < 0,01 vs 12,5 mg de 5-diol isoladamente) , revertida pela administração simultânea de FLU. O tratamento com 5-diol não teve nenhum efeito inibidor estatisticamente significativo sobre a razão urinária de cálcio para creatinina. A dose mais elevada de 5-diol causou uma redução significativa de 23 % (p < 0,01) de colesterol no soro, enquanto que a adição de EM-800 diminuiu o colesterol no soro em 62 % (p < 0,01). Os dados atuais mostram claramente o efeito estimulador do 5-diol sobre a formação óssea e, sugerem que, apesar do 5-diol ser um estrogénio fraco, o seu efeito estimulador sobre a formação óssea é predominantemente mediada por um efeito androgénico. Para além disso, os efeitos estimuladores aditivos do EM-800 e do 5-diol sobre a massa óssea, demonstram o efeito de poupança de osso do antiestrogénio EM-800 no rato. A atividade de redução do colesterol, tanto do 5-diol como do EM-800, pode ter utilidade interessante para a prevenção de doenças cardiovasculares. 59Exemplo 5 _ Fosfatase Grupo . alcalina no soro OH-prolina / creatinina urinária LH Níveis de ARNm GnRH Colesterol Triglicéridos IU / 1 pmol / ng / grãos mmol / 1 mmol / 1 mmol ml de prata por célula Controlo 30 ± 3** 15,4 + 1,3 0,09 + 33,7 + 2,28 + 1,4 + 0,2 intacto 0,03** 0,7** 0,12 OVX 51 ± 4 11,7 ± 1,2 3,55 ± 44, 0 ± 2,29 ± 1,1 ± 0,1 controlo 0,50 0,9 0,16 OVX + 57 + 4 11,7 ± 1,2 2,51 ± 35,5 + 2,55 + 1,3 ± 0,1 MPA 0,20* 0,7** 0, 14 OVX + e2 41 + 5 9,2 ± 0,9 2,37 ± 40,4 ± 2,02 + 0,8 ± 0,1 0,45* 0, 8** 0,15 OVX + 56 + 5 7,8 ± 0,7* 1,55 + 38, 8 ± 2,44 + 0,9 ± 0,1 DHT 0,27** 0,7** 0,16 OVX + 201 ± 7,3 ± 1,0* 0,02 + 34,5 ± 1,78 + 0,8 ± 0,1 DHEA 25** 0,01** 0,7** 0, 16* OVX + 103 ± 14,5:1 ± 1,13 + 41,5 ± 2,27 ± 0, 8 ± 0,1 DHEA + 10** 1,2 0,24** 0,7* 0,15 FLU OVX + 202 ± 6,4 + LD** 39,2 + 0,63 + 1,0 ± 0,2 DHEA + EM-800 η * * 1, 0** 0,7** 0,09** LD: Limite de deteção: 0,01 ng/ml * p < 0,05 , ** p < 0,01 versus OVX controlo

Exemplo 6

Exemplo de síntese do composto preferido da invenção Síntese de cloridrato de (S)- ( + )-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4"-(2"'-piperidinoetoxi) fenil)-2H-l-benzopiran EM-01538 (EM-652, HC1) 60 Esquema 1

EM-OISJ8

Etapa A: BF3 -Et20, tolueno, 100 °C, 1 hora.

Etapa C: 3,4-di-hidropirano, mono-hidrato de ácido p-toluenossulfónico, acetato de etilo, 25 °C, sob azoto, 16 horas, e, em seguida, cristalização em isopropanol.

Etapas D, E e F: (1) piperidina, tolueno, aparato Dean & Stark, refluxo sob azoto, (2) 1,8-diazabiciclo [5, 4, 0] undec-7-eno, DMF, refluxo de 3 horas, (3) CH3MgCl, THF, -20 a 0 °C e, em seguida, à temperatura ambiente durante 24 horas,

Etapas G, H: ácido (IS)- ( + )-10-canforsulfónico, acetona, água, tolueno, temperatura ambiente, 48 horas.

Etapa HH: 95 % de etanol, 70 °C, em seguida, temperatura ambiente durante 3 dias.

Etapa HHR: Reciclagem do liquido original e lavagem da 61

etapa HH ácido (S)-10-canforsulfónico, refluxo, 36 horas, em seguida temperatura ambiente durante 16 horas.

Etapa I: (1) DMF aquoso, Na2C03, acetato de etilo, (2) etanol, HC1 diluido, (3) água. Síntese de acetofenona de 2-tetrahidropiraniloxi-4-hidroxi-2'-(4"-tetrahidropiraniloxifenil) (4).

Uma suspensão de acetofenona de 2,4-di-hidroxi-2'-(4"-hidroxifenil) 3 (97,6 g, 0,4 moles) (disponível a partir de Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) em 3,4-dihidropirano (218 ml, 3,39 mol) e acetato de etilo (520 ml) foi tratada com mono-hidrato de ácido p-toluenossulfónico (0,03 g, 0,158 mmol) a cerca de 25 °C. A mistura de reação foi agitada sob azoto, sem aquecimento externo durante cerca de 16 horas. A mistura foi em seguida lavada com uma solução de bicarbonato de sódio (1 g) e cloreto de sódio (5 g) em água (100 ml) . As fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com uma solução salina (20 ml). Cada lavagem foi de novo extraída com 50 ml de acetato de etilo. Todas as fases orgânicas foram combinadas e filtradas através de sulfato de sódio. O solvente (cerca de 600 ml) foi removido por destilação à pressão atmosférica e foi adicionado isopropanol (250 ml). Foi destilado solvente adicional (cerca de 300 ml) à pressão atmosférica e foi adicionado isopropanol (250 ml). Foi destilado solvente adicional (cerca de 275 ml) à pressão atmosférica e foi adicionado isopropanol (250 ml). A solução foi arrefecida até cerca de 25 °C com agitação e, após cerca de 12 horas, o sólido cristalino foi filtrado, lavado com isopropanol e seco (116,5 g, 70 %) . Síntese de 4-hidroxi-4-metil-2-(4'-[2"-piperidino]- etoxi) fenil-3-(4'''-tetrahidropiraniloxi) fenil-7- 62 tetrahidropiraniloxi-cromano (10). Uma solução de acetofenona de 2-tetrahidropiraniloxi-4-hidroxi-2'-(4"-tetrahidropiraniloxifenil) 4 (1 kg, 2,42 mol), benzaldeído de 4-[2-(1-piperidino) etoxi] 5 (594 g, 2,55 mol) (disponível a partir de Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) e piperidina (82,4 g, 0,97 mol) (disponibilizado pela Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisconsin) em tolueno (8 1) foi aquecida a refluxo, sob azoto, com um dispositivo de Dean & Stark até que foi recolhido um equivalente de água (44 ml). O tolueno (6,5 1) foi removido da solução por destilação à pressão atmosférica. Foram adicionados dimetilformamida (6,5 1) e 1,8-diazabiciclo [5,4,0] undec-7-eno (110,5 g, 0,726 mol) . A solução foi agitada durante cerca de 8 horas à temperatura ambiente para isomerizar a chalcona 8 a cromanona 9 e, em seguida, ser adicionada a uma mistura de água e gelo (8 1) e tolueno (4 1). As fases foram separadas e a camada de tolueno lavada com água (5 1) . As lavagens aquosas combinadas foram extraídas com tolueno (3 x 4 1). Os extratos de tolueno combinados foram finalmente lavados com uma solução salina (3 x 4 1) , concentrados à pressão atmosférica para 5,5 1 e, em seguida, arrefecidos a -10 °C.

Com arrefecimento externo contínuo e agitação sob azoto, foi adicionada uma solução a 3 M de cloreto de metilmagnésio em THF (2,5 1, 7,5 mol) (disponível a partir de Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis), mantendo a temperatura abaixo de 0 °C. Depois de todo o reagente de Grignard ter sido adicionado, o arrefecimento externo foi removido e a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente. A mistura foi agitada a esta temperatura durante cerca de 24 horas. A mistura foi novamente arrefecida até cerca de -20 °C e, com arrefecimento externo contínuo e agitação, foi adicionada lentamente uma solução saturada de cloreto de 63 amónio (200 ml), mantendo a temperatura abaixo de 20 °C. A mistura foi agitada durante 2 horas e, em seguida, adicionada a solução saturada de cloreto de amónio (2 1) e tolueno (4 1), e agitada durante cinco minutos. As fases foram separadas e a camada aquosa foi extraída com tolueno (2 x 4 1). Os extratos de tolueno combinados foram lavados com ácido clorídrico diluído, até a solução se tornar homogénea e, em seguida, com solução salina (3x4 1) . A solução de tolueno foi finalmente concentrada à pressão atmosférica para 2 1. Esta solução foi utilizada diretamente na etapa seguinte. Síntese de sal de ácido de (2R,S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)—4-metil-2-(4"-[2"'-piperidino] etoxi) fenil)-2H-l-benzopirano (IS)-10-canforsulfónico (+:12). À solução de tolueno de 4-hidroxi-4-metil-2-(4'-[-2"-piperidino]-etoxi)-fenil-3-(4'"-tetrahidropiraniloxi) fenil-7- tetrahidropiraniloxicromano (10) foi adicionada acetona (6 1) , água (0,3 1) e ácido (S)-10-canforsulfónico (561 g, 2,42 mol) (disponibilizado pela Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.). A mistura foi agitada sob azoto durante 48 horas, tempo após o qual o sólido de sal de ácido de (2R,S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4"-[2"'-piperidino] etoxi) fenil)-2H-l-benzopirano (1S) — 10-canforsulfónico (12) foi filtrado, lavado com acetona e seco (883 g) . Este material foi usado na etapa seguinte (HH) passo sem purificação adicional. Síntese de sal de ácido de (2S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4"-[2"'-piperidino] etoxi) fenil)-2H-l-benzopirano (IS)-10-canforsulfónico (13, sal de (+)-EM-652 (ÍS)-CSA). Uma suspensão de sal de ácido de (2R,S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-meti1-2-(4"-[2"'-piperidino] etoxi) fenil)-2H-benzopirano (IS)-10- canforsulfónico ± 12 (759 g) em etanol a 95 % foi aquecida com agitação para cerca de 70 °C, até o sólido se ter dissolvido. A solução foi deixada arrefecer até à 64 temperatura ambiente, com agitação, em seguida adicionaram-se alguns cristais de sal de ácido de (2S)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4"-[2"'-piperidino] etoxi) fenil)-2H-l-benzopirano (IS)-10-canforsulfónico 13. A solução foi agitada à temperatura ambiente durante cerca de três dias no total. Os cristais foram filtrados, lavados com etanol a 95 % e secos (291 g, 76 %). A de do produto foi de 94,2 % e a pureza de 98,8 %. Síntese de cloridrato de (S)-(+)-7-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil)-4-metil-2-(4"-(2"'-piperidinoetoxi) fenil)-2H-l-benzopirano EM-01538 (EM-652, HC1) . Uma suspensão do composto 13 (sal de EM-652-(+)-CSA, 500 mg, 0,726 mmol) em dimet ilf ormamida (11 μΐ, 0,15 mmol) foi tratada com uma solução aquosa a 0,5 M de carbonato de sódio (7,0 ml, 3,6 mmol), e agitada durante 15 minutos. A suspensão foi tratada com acetato de etilo (7,0 ml) e agitada durante 4 h. A fase orgânica foi então lavada com uma solução aquosa saturada de carbonato de sódio (2x5 ml) e solução salina (1x5 ml), seca sobre sulfato de magnésio, e concentrada. Uma solução da espuma rosa resultante (EM-652) em etanol (2 ml) foi tratada com ácido clorídrico a 2 N (400 μΐ, 0,80 mmol), agitada durante 1 h, tratada com água destilada (5 ml), e agitada durante 30 minutos. A suspensão resultante foi filtrada, lavada com água destilada (5 ml) , seca ao ar e sob vácuo elevado (65 °C) para dar um pó cremoso (276 mg, 77 %) : pó fino esbranquiçado, Calorimetria de varrimento: início do pico de fusão a 219 °C, ΔΗ = 83 J/g, [0C]24D= 154 ° em metanol a 10 mg/ml. RMN (300 MHz, CD3OD) δ (ppm) 1,6 (largo, 2H, H-4'"), 1,85 (largo, 4H, H-3"" e 5""), 2,03 (s, 3H, CH3) , 3,0 e 3,45 (largo, 4H, H-2"" e 6""), 3,47 (t, J =

Hz, 2H, H- -3"'), , 4,26 (t, J = = 4 ,9 Hz, 2H, H-2 ' ") , i—1 H—2) , 6, 10 (d, J = = 2, 3 H Z, 1H, H- -8) , 6, 35 (dd, 2, 43 Hz, 1H , H-6), 6 ,70 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H -3 ' 6, 83 (d, J = 8,7 Hz, 2H , H -3" e H- 5") , 7,01 (d, Hz, 2H, H -2' e H-6'), 7, 12 (d, J = 8,4 Hz, 1H, 1 65 7,24 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-2" eH-6"), 13C RMN (CD3OD, 75 MHz) δppm 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 158,96, 159,33. Composição elementar: C, Η, N, Cl, teoria: 70,51, 6,53, 2,84, 7,18, % encontrada: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89 %. EXEMPLO 7

Ensaios in vivo da biodisponibilidade de pró-fármacos de androst-5-eno-3p, 17|5-diol 1) Principio

Os ensaios da biodisponibilidade de pró-fármacos de precursores de esteroides sexuais foram efetuados em ratos machos Sprague-Dawley, medindo as concentrações no plasma dos compostos, após a administração oral única de compostos. a) Animais e tratamento

Foram obtidos ratos machos Sprague-Dawley [Cri:CD (SD)Br] pesando 275-350 g a partir de Charles-River Canada Inc., e alojados 2 por caixa durante o período de aclimatação e, individualmente durante o período do estudo. Os animais foram mantidos sob um regime de 12 horas de luz : 12 horas de escuridão (luzes acesas às 8h00). Os animais receberam ração certificada para roedor (Lab Diet n°' 5002, ração) e água da torneira ad libitum. Os ratos foram mantidos em jejum (acesso apenas a água) começando na noite antes da dosagem.

Cada composto a ser testado foi administrado a três animais por sonda esofágica, na forma de suspensão em 0,4 % de met ilcelulose, a uma dose de 150 pmg / rato. Foi recolhida uma amostra de sangue de -0,7 ml da veia jugular de ratos sob anestesia induzida por isoflurano a 1, 2, 3, 4, e 7 horas após a administração por sonda. As amostras de sangue foram imediatamente transferidas para um Microtainer de 0,75 ml refrigerado contendo EDTA, e mantidas num banho 66 de água gelada até à centrifugação a 3000 rpm durante 10 minutos. A separação do plasma foi realizada rapidamente (menos de 50 minutos) após a recolha de sangue. Uma alíquota de 0,25 ml de plasma foi, em seguida, transferida para um tubo de borossilicato (13 x 100) e foi rapidamente congelada em gelo seco. As amostras de plasma foram mantidas a -80 °C até à medição da concentração do esteroide sexual ou dos precursores de esteroides sexuais no plasma por GC-MS.

Resultados: A absorção oral e as AUC são apresentadas nas figuras 12 e 13.

EXEMPLOS DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Estabelecido em seguida, a titulo de exemplo, estão várias composições farmacêuticas que utilizam o SERM ativo preferido EM-800 ou o EM-1538, e o precursor de esteroides sexuais ativo preferido DHEA, EM-1304 ou EM-01474-D. Podem ser usados outros compostos da invenção ou a combinação dos mesmos, em lugar de (ou em adição a) EM-800 ou EM-1538, DHEA, EM-1304 ou EM-01474-D. A concentração de ingrediente ativo pode ser variada ao longo de uma vasta gama, tal como aqui discutido. As quantidades e tipos de outros ingredientes que podem ser incluídos são bem conhecidos na tecnologia.

Comprimido Ingrediente % de peso (por peso da composição total) EM-800 cn > o DHEA 15, 0 Gelatina 5, 0 Lactose 58,5 Amido 16, 5 67

Exemplo B Cápsula de gelatina Ingrediente % de peso (por peso da composição total) EM-800 5, 0 DHEA 15, 0 Lactose hidratada 65, 0 Amido > co Celulose kO > co microcristalina Estearato de 0,4 magnésio

EXEMPLOS DE KITS

Estabelecido em seguida, a título de exemplo, estão vários kits que utilizam o SERM ativo preferido EM-800 ou o EM-1538, e o precursor de esteroides sexuais ativo preferido DHEA, EM-1304 ou EM-01474-D. Podem ser usados outros compostos da invenção ou a combinação dos mesmos, em lugar de (ou em adição a) EM-800 ou EM-1538, DHEA, EM-1304 ou EM-01474-D. A concentração de ingrediente ativo pode ser variada ao longo de uma vasta gama, tal como aqui discutido. As quantidades e tipos de outros ingredientes que podem ser incluídos são bem conhecidos na tecnologia. Exemplo A 0 SERM é administrado oralmente, ao passo que o precursor de esteroides sexuais é administrado por via percutânea__

Composição do SERM para a administração oral (cápsulas) Ingrediente % de peso (por peso da composição total) EM-800 5, 0 Lactose hidratada 80,0 Amido 4,8 68

Composição do SERM para a administração oral (cápsulas) Ingrediente % de peso (por peso da composição total) Celulose microcristalina 9,8 Estearato de magnésio 0,4

Composição do precursor de esteroides sexuais para a administração tópica (gel) Ingrediente % de peso (por peso da composição total) DHEA 10,0 Triglicérido caprilico -cáprico (Neobee M-5) 5, 0 Hexileno glicol 15, 0 Transcutol (éter monometílico de dietilenoglicol) 5, 0 Álcool benzilico O Cs] Ciclometicona (Dow coming 345) 5, 0 Etanol (absoluto) 56, 0 Hidroxipropilcelulose (1500 cps) (KLUCEL) 2,0

Exemplo B 0 SERM e o precursor de esteroides sexuais são administrados por via oral 69

Composição antiestrogénica nao-esteroide para a administração oral (cápsulas) Ingrediente % de peso (por peso da composição total) EM-800 5, 0 Lactose hidratada 80,0 Amido 4,8 Celulose microcristalina 9,8 Estearato de magnésio 0,4

Composição do precursor de esteroides sexuais para a administração oral (Cápsula de gelatina) Ingrediente % em peso (por peso da composição total) DHEA 15, 0 Lactose hidratada 70, 0 Amido 00 Celulose microcristalina 00 oú Estearato de magnésio 0,4

Nas formulações anteriores podem ser substituídos por EM-800 ou EM-01538 outros SERM, bem como podem ser substituídos por DHEA, EM-1304 ou EM-01474-D outros inibidores de esteroides sexuais. Podem ser incluídos mais do que um SERM ou mais do que um precursor, em cujo caso a percentaqem por peso combinada é preferivelmente a da percentagem em peso para o único precursor ou único SERM dado nos exemplos anteriores. 70 A invenção foi descrita em termos de realizações preferidas e exemplos. Os peritos na tecnologia irão reconhecer facilmente a aplicabilidade mais ampla e o âmbito da invenção, que é limitada pelas reivindicações de patente aqui. 71

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição US 5550107 A [0009] WO 9010462 A [0009] WO 9416709 A [0015] EP 0279982 A [0075] [0089] US 5162037 A [0089] US 5154922 A [0089] US 5135480 A [0089] [0092] US 4666441 A [0089] US 4624665 A [0089] US 3742951 A [0089] US 3797444 A [0089] US 4568343 A [0089] US 5064654 A [0089] US 5071644 A [0089] US 5071657 A [0089] GB 2185187 A [0089] CA 9600097 W [0095] WO 9626201 A [0095] WO 9725034 A, Shalmi [0098] WO 9725035 A [0098] WO 9725037 A [0098] WO 9725038 A [0098] WO 9725036 A, Korsgaard [0098] EP 0802183 Al, Miller [0098] JP 10036347 B [0098] WO 9732837 A [0098] 72

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição para utilização como um medicamento numa terapêutica de combinação para o tratamento ou a redução do risco de adquirir perda de massa muscular, compreendendo a composição: a) um precursor de esteroides sexuais selecionado a partir do grupo que consiste em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3P, 173~diol, 4-androsteno-3, 17-diona, e um pró-fármaco que é convertido in vivo em qualquer um dos precursores de esteroides sexuais anteriores, e b) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador seletivo do recetor de estrogénio que é um derivado de benzopirano, em que o pró-fármaco convertido in vivo num precursor de esteroides sexuais tem a fórmula geral:

XO em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em H-, ROC-, RC02CHRa- e RbS02- (sendo R selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogénio, alquilo (C1-C18) linear ou ramificado, alcenilo (C2-C18) linear ou ramificado, alcinilo (C2-C18) linear ou ramificado, arilo, furilo, alcoxi (C1-C18) linear ou ramificado, alceniloxi (C2-C18) linear ou ramificado, alciniloxi (C2-C18) linear ou ramificado, ariloxi, furiloxi, e análogos de halogénio ou de carboxilo dos anteriores, sendo Ra hidrogénio ou alquilo (C1-C6), e sendo Rb selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxilo (ou sais do mesmo), metilo, fenilo e 2 p-toluilo), em que Y é oxigénio do carbonilo ou Y representa um β-ΟΧ (tendo X o mesmo significado como anteriormente) e α-H, e em que o modulador seletivo do recetor de estrogénio tem a fórmula que se segue:

R em que Ri e R2 são independentemente hidrogénio, hidroxilo ou uma fração que é convertida em hidroxilo in vivo, em que Z é uma fração bivalente de fecho, em que o R100 é uma porção bivalente que distancia L do anel B por 4-10 átomos intervenientes, em que L é uma fração polar bivalente ou trivalente selecionada a partir do grupo de -SO-, -CON-, —N<, e -SON<, em que Gi é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogénio, um hidrocarboneto de Cl a C5 ou uma fração bivalente que liga G2 e L para formar um anel heterocíclico de 5 a 7 membros, e derivados halo ou insaturados dos anteriores, em que G2 ou está ausente ou é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogénio, um hidrocarboneto de Cl a C5, ou uma fração bivalente que une Gi e L para formar um anel heterocíclico de 5 a 7 membros, e derivados halo ou insaturados dos anteriores, em que G3 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogénio, metilo e etilo, em que o derivado de benzopirano tem a estrutura geral que se segue: 3

em que D é — OCH2CH2N (R3) R4 (sendo R3 e R4 ou selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em alquilo C1-C4, ou R3, R4 e o átomo de azoto ao qual estão ligados formam, em conjunto, uma estrutura de anel selecionada a partir do grupo que consiste em anel de pirrolidino, dimetil-l-pirrolidino, metil-l-pirrolidinilo, piperidino, hexametilenoimino, morfolino), em que Ri e R2 são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em: hidrogénio, hidroxilo, e uma fração convertida em hidroxilo in vivo, e em que G3 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogénio, metilo e etilo.

2. Um kit que compreende um primeiro recipiente que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos, um precursor de esteroides sexuais, definido na reivindicação 1, e que compreende ainda um segundo recipiente que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos, um modulador seletivo do recetor de estrogénio, definido na reivindicação 1, para utilização numa terapêutica de combinação para o tratamento ou a redução do risco de perda de massa muscular.

3. A composição para utilização da reivindicação 1, que compreende ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma progestina. 4

4. A composição ou o kit para utilização de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o precursor não é 4-androsteno-3, 17-diona.

5. A composição ou o kit para utilização de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o derivado de benzopirano é um composto opticamente ativo tendo uma configuração absoluta S no carbono 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto referido tem a estrutura molecular: 5'

em que Ri e R2 são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidroxilo e uma fração convertivel em hidroxilo in vivo, em que R3 é uma espécie selecionada a partir do grupo que consiste em pirrolidinilo saturado, insaturado ou substituído, piperidino saturado, insaturado ou substituído, piperidinilo saturado, insaturado ou substituído, morfolino saturado, insaturado ou substituído, fração cíclica contendo azoto, fração policíclica contendo azoto, e NRaRb, (sendo Ra e Rb independentemente hidrogénio, alquilo C1-C6 linear ou ramificado, alcenilo C2-C6 linear ou ramificado, e alcinilo C2-C6 linear ou ramificado).

6. A composição ou o kit para utilização da reivindicação 5, em que o composto referido ou sal carece substancialmente de (2R)-enantiómero. 5

7. A composição ou kit para utilização de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o modulador seletivo do recetor de estrogénio referido é selecionado a partir do grupo que consiste em: EM-800 EM-01520

EM-01533 EM-01518

6

8. A composição ou kit para utilização de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o derivado de benzopirano é um sal de um ácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido adipico, ácido benzenossulfónico, ácido benzoico, ácido canforsulfónico, ácido citrico, ácido fumárico, ácido iodidrico, ácido bromidrico, ácido clorídrico, ácido hidroclorotiazida, ácido hidroxinaftóico, ácido láctico, ácido maleico, ácido metanossulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido 1,5-naftalenodissulfónico, ácido nitrico, ácido palmitico, ácido piválico, ácido fosfórico, ácido propiónico, ácido succinico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácido tereftálico, ácido p-toluenossulfónico, e ácido valérico.

9. A composição ou o kit para a utilização de qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 4, em que o modulador seletivo do recetor de estrogénio referido é: EM-153S

e o precursor de esteroides sexuais é selecionado a partir do grupo que consiste em dehidroepiandrosterona, sulfato de dehidroepiandrosterona, androst-5-eno-3P, 17β-άίο1.

10. A composição ou o kit para a utilização das reivindicações 1 ou 2, em que o composto convertido in vivo num precursor de esteroides sexuais tem a fórmula geral: 7

em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em H-, ROC-, RC02CHRa- e RbS02- (sendo R selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogénio, alquilo (C1-C18) linear ou ramificado, alcenilo (C2-C18) linear ou ramificado, alcinilo (C2-C18) linear ou ramificado, arilo, furilo, alcoxi (C1-C18) linear ou ramificado, alceniloxi (C2-C18) linear ou ramificado, alciniloxi (C2-C18) linear ou ramificado, ariloxi, furiloxi, e análogos de halogénio ou de carboxilo dos anteriores, sendo Ra hidrogénio ou alquilo (C1-C6), e sendo Rb selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxilo (ou sais do mesmo), metilo, fenilo e p-toluilo), em que Y é oxigénio do carbonilo ou Y representa um β-ΟΧ (tendo X o mesmo significado como anteriormente) e a-H.

11. A composição ou o kit para a utilização das reivindicações 1, 2 ou 6, em que o composto convertido in vivo num precursor de esteroides sexuais é selecionado a partir do grupo que consiste em: EM-1304 AcO Ο

EM-01474-D

12. A composição para utilização da reivindicação 1, que compreende um diluente, veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, uma quantidade terapeuticamente eficaz de EM-1535 HO

H \ [ -*N,cr

e uma quantidade terapeuticamente eficaz de dehidroepiandrosterona.