ES2210979T3 - Compuestos triciclicos sustituidos utiles en el tratamiento de enfermedades inducidas por spla2. - Google Patents

Abstract

SE EXPONE UNA NUEVA CLASE DE TRICICLICOS DE FORMULA (I) EN LA CUAL: A ES FENILO O PIRIDILO, CARACTERIZADO PORQUE EL NITROGENO SE ENCUENTRA EN LAS POSICIONES 5, 6, 7 U 8; UNO ENTRE B O D ES NITROGENO, Y EL OTRO ES CARBONO; Z ES CICLOHEXENILO, FENILO, PIRIDILO, CARACTERIZADO PORQUE EL NITROGENO SE ENCUENTRA EN LAS POSICIONES 1, 2 O 3, O ES UN ANILLO HETEROCICLICO DE 6 MIEMBROS QUE TIENE UN HETEROATOMO SELECCIONADO ENTRE EL GRUPO FORMADO POR AZUFRE U OXIGENO, EN LA POSICION 1, 2 O 3, Y NITROGENO EN LA POSICION 1, 2, 3 O 4; ---ES UN ENLACE DOBLE O SIMPLE; JUNTO CON EL USO DE DICHOS COMPUESTOS PARA INHIBIR LA LIBERACION MEDIADA DE SPLA 2 DE ACIDOS GRASOS PARA EL TRATAMIE NTO DE ENFERMEDADES TALES COMO EL CHOQUE SEPTICO.

Description

Compuestos tricíclicos sustituidos útiles en el tratamiento de enfermedades inducidas por sPLA_{2}.

Esta invención se refiere a nuevos compuestos orgánicos tricíclicos sustituidos útiles para inhibir la liberación de ácidos grasos mediada por sPLA_{2} para dolencias tales como shock séptico.

La estructura y propiedades físicas de la fosfolipasa secretoria no pancreática A_{2} (denominada en lo sucesivo en la presente invención, "sPLA_{2}") se ha descrito ampliamente en dos artículos, designados "Cloning y Recombinant Expression de Phospholipase A_{2} Present en Rheumatoid Arthritic Synovial Fluid" por Seilhamer, Jeffrey J.; Pruzanski, Waldemar; Vadas Peter; Plant, Shelley; Miller, Judy A.; Kloss, Jean; y Johnson, Lorin K.; The Journal of Biological Chemistry, Vol. 264, No. 10, ejemplar del 5 de Abril, pp. 5335-5338, 1989; y "Structure y Properties of a Human Non-pancreatic Phospholipase A_{2}" de Kramer, Ruth M.; Hession, Catherine; Johansen, Berit; Hayes, Gretchen; McGray, Paula; Chow, C. Pingchang; Tizard, Richard; y Pepinsky, R. Blake; The Journal of Biological Chemistry, Vol. 264, No. 10, publicada el 5 de Abril, pp. 5768-5775, 1989; las descripciones de las cuales se incorporan en la presente invención como referencia.

Se cree que sPLA_{2} es un enzima limitante de la velocidad en la cascada del ácido araquidónico que hidroliza los fosfolípidos de la membrana. Así, es importante desarrollar compuestos que inhiban la liberación de ácidos grasos mediada por sPLA_{2} (por ejemplo, ácido araquidónico). Tales compuestos serían de valor para el tratamiento general de dolencias inducidas y/o mantenidas debido a la sobreproducción de sPLA_{2} tales como shock séptico, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto, pancreatitis, shock inducido por trauma, bronquial asma, rinitis alérgica, artritis reumatoide, etc.

Es deseable desarrollar nuevos compuestos y tratamientos para enfermedades inducidas por sPLA_{2} .

Alexander, et al., en las Patentes de los Estados Unidos Nº. 3.939.177 y 3.979.391, describe 1,2,3,4-tetrahidrocarbazoles útiles como agentes antibacterianos.

Esta invención proporciona compuestos tricíclicos que se definen en la Reivindicación 1 dada en lo que sigue.

Estos compuestos tricíclicos sustituidos son efectivos para la liberación de ácidos grasos mediada por sPLA_{2} humana.

Esta invención es también una formulación farmacéutica comprendiendo un compuesto de la Reivindicación 1 en asociación con uno o más diluyentes, vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.

Esta invención es también el uso de un compuesto de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inhibir sPLA_{2} en un mamífero.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inhibir selectivamente sPLA_{2} en un mamífero.

Esta invención también proporciona el uso de un compuesto de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para aliviar los efectos patológicos de sepsis, shock séptico, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto, pancreatitis, shock inducido por trauma, asma bronquial, rinitis alérgica, artritis reumatoide, fibrosis cística, ataque súbito, bronquitis aguda, bronquitis crónica, bronquiolitis aguda, bronquiolitis crónica, osteoartritis, gota, espondilartropatris, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artropatía psoriática, espondilitis enterapátrica, artropatía Juvenil o espondilitis anquilosante juvenil, artropatía reactiva, artritis infecciosa o post-infecciosa, artritis gonocócica, artritis tuberculosa, artritis viral, artritis fúngica, artritis sifilítica, enfermedad de Lyme, artritis asociada con "síndromes vasculíticos", poliarteritis nodosa, vasculitis por hipersensibilidad, granulomatosis de Luegenec, polimialgina reumática, arteritis de las células de articulaciones, artropatris por deposición de cristales de calcio, pseudo gota, reumatismo no articular, bursitis, tenosinomitis, epicondilitis (codo de tenista), síndrome del túnel carpal, lesiones por uso repetitivo (mecanografía), formas misceláneas de artritis, enfermedad neuropática de las articulaciones (charco y articulación), hemartrosis (hemartrosic), Púrpura de Henoch-Schonlein, osteoartropatía hipertrófica, reticulohistiocitosis multicéntrica, artritis asociada con algunas enfermedades, surcoilosis, hemocromatosis, enfermedad de las células falciformes y otras hemoglobinopatrías, hiperlipoproteineimia, hipogammaglobulinemia, hiperparatiroidismo, acromegalia, talasemia, Enfermedad de Behat, lupus eritematoso sistémico, o policondritis recidivante y enfermedades relacionadas.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán de la siguiente descripción así como de las reivindicaciones adjuntas.

Definiciones

Las sales de los compuestos tricíclicos anteriores son un aspecto adicional de la invención. En aquellos casos en los que los compuestos de la invención poseen grupos funcionales ácidos, pueden prepararse diferentes sales, que son más solubles en agua y fisiológicamente adecuadas que el compuesto original. Entre las sales representativas farmacéuticamente aceptables se incluyen, aunque no se limitan a las sales alcalinas y alcalinotérreas, tales como litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y similares. Las sales se preparan de forma conveniente a partir del ácido libre tratando el ácido en solución con una base o mediante la exposición del ácido a una resina de intercambio.

Están incluidas en el ámbito de la definición de sales farmacéuticamente aceptable las sales de adición de compuestos de la presente invención, orgánicas C inorgánicas, relativamente no tóxicas, por ejemplo, amonio, amonio cuaternario, y cations de amina, derivados de bases nitrogenadas de suficiente basicidad para formar sales con los compuestos de esta invención (ver, por ejemplo, S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", J. Phar. Sci., 66: 1-19 (1977)).

Los compuestos de la invención pueden tener centros quirales, y existir en formas ópticamente activas. Los isómeros R- y S- así como las mezclas racémicas entran en el ámbito de esta invención. Puede prepararse un estereoisómero particular mediante procedimientos conocidos usando reacciones estereoespecíficas con materiales de partida conteniendo centros asimétricos ya resueltos, o bien de forma alternativa, mediante la posterior resolución de las mezclas de estereoisómeros usando procedimientos conocidos.

El término "grupo protector ácido" se usa en la presente invención tal y como se usa frecuentemente en química orgánica sintética, para referirse a un grupo que prevenga que un grupo ácido intervenga en una reacción llevada a cabo sobre algún otro grupo funcional de la molécula, pero que pueda eliminarse cuando se desee hacerlo. T w. Greene discute tales grupos en el capítulo 5 de Protective Grupos en Organic Synthesis, John Wiley y Sons, New York, 1981, incorporado en su totalidad en la presente memoria por referencia.

Entre los ejemplos de grupos protectores de ácido se incluyen éster o amido derivados del grupo ácido, tales como, metilo, metoximetilo, metilo-tiometilo, tetrahidropiranilo, metoxietoximetilo, benciloximetilo, fenilo, arilo, etilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-metiltioetilo, t-butilo, ciclopentilo, trifenilmetilo, difenilmetilo, bencilo, trimetilsililo, N,N-dimetilo, pirrolidinilo, piperidinilo, o o-nitroanilida. Un grupo protector ácido preferido es metilo.

Ejemplo 1 Preparación del ácido (R, S)-(9-Bencil-4-carbamoil-1-oxo-3-tia-1,2,3,4- tetrahidrocarbazol-5-il) oxiacetato

1

A. 1-Bencil-4-metoxiindol

2

Se añadió NaH (7,7 g, 191,7 mmol) en porciones a una solución de 4-metoxiindol (21,7 g, 147 mmol) a 0ºC en 750 ml de DMF anhidro. Tras 15 min, la lechada se trató con bromuro de bencilo (17,5 mL, 147 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente agitando durante toda la noche. La mezcla de reacción se vertió sobre 1 l de H_{2}O. Las capas se separaron, y se extrajo la fase acuosa con EtOAc (2 X 200 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H_{2}O (4 x 500 mL), se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía súbita (SiO_{2}; mezcla de hexanos) para proporcionar 32,9 g (138,.6 mmol; 94%) del compuesto titular en forma de sólido blanco. Electrospray MS 238 (M+1);

\newpage

Análisis elemental para C_{16}H_{15}NO:

Calculado: C, 80,98; H, 6,37; N, 5,90,

Encontrado: C, 81,20; H, 6,09; N, 5,83,

B. (1-Bencil-4-metoxiindol-3-il) oxoacetato de metilo

3

Se trató una solución de 1-bencil-4-metoxiindol (31,9 g, 134,4 mmol) en 500 ml de CH_{2}C_{12} y piridina (21,7 mL, 268,8 mmol) a 0ºC con cloruro de oxalil metilo (13,6 mL, 147,9 mmol). Tras 1,5 h a 0ºC, se añadieron 500 ml de solución saturada de NaHCO_{3}. La capa acuosa se extrajo con CHCl_{3} (1 x 200 ml, 2 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a vacío para dar un sólido, que se trituró con EtOAc / mezcla de hexanos para proporcionar 29,8 g (92,1 mmol; 69%) del compuesto titular en forma de polvo color crema.

Electrospray MS 324 (M+l);

Análisis elemental para C_{19}H_{17}NO_{4}:

Calculado: C, 70,58; H, 5,30; N, 4,33,

Encontrado: C, 70,86; H, 5,42; N, 4,49,

C. (R, S)-(1-Bencil-4-metoxiindol-3-il) hidroxiacetato de metilo

4

Una solución de (1-bencil-4-metoxiindol-3-il )oxoacetato de metilo (10 g, 30,9 mmol) en 300 ml de MeOH se trató con NaBH_{4} (1,46 g, 38,6 mmol). Tras agitación durante toda la noche, se añadieron EtOAc y H_{2}O (20 ml de cada uno). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 25 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo crudo se recristalizó en EtOAc / mezcla de hexanos para proporcionar 9,1 g (28,0 mmol; 91%) del compuesto titular en forma de polvo blanco. FDMS 325 (M+);

Análisis elemental para C_{19}H_{19}NO_{4}:

Calculado: C, 70,14; H, 5,89; N, 4,30

Encontrado: C, 70,42; H, 5,93; N, 4,41,

D. Ácido (R, S) -[(1-Bencil-4-metoxiindol-3-il) (carbometoxi) metilo) tioacético

5

Se trató una suspensión a 0ºC de (R, S)-(1-bencil-4-metoxiindol-3-il) hidroxiacetato de metilo (3,5 g, 10,8 mmol) y K_{2}CO_{3} (2,2 g, 16,1 mmol) en 50 ml de CH_{2}Cl_{2} con TEA (0,075 ml, 0,54 mmol). Tras 15 min, se añadió MsCl (1,25 mL, 16,1 mmol). Tras agitación durante 2 h a 0ºC, se añadió ácido mercaptoacético (3 mL, 43 mmol), y la reacción se calentó a reflujo durante toda la noche. La mezcla de reacción se vertió sobre 25 mL de solución saturada de NaHCO_{3}. La capa acuosa se extrajo con 25 ml de CHCl_{3}, se acidificó con HCl 1N y se extrajo de nuevo con CHCl_{3} (3 x 25 ml). Los extractos adicificados se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo aceitoso se purificó mediante cromatografía súbita (SiO_{2}; gradiente de 0% a 2% ácido glacial acético en 1:1 EtOAc / mezcla de hexanos) para proporcionar 2,58 g (6,46 mmol; 60%) del compuesto titular en forma de aceite claro que solidificó con el tiempo. FDMS 399 (M+);

Análisis elemental para C_{21}H_{21}NO_{5}S.O. 2H_{2}O:

Calculado: C, 62,58; H, 5,35; N, 3,48

Encontrado: C, 62,57; H, 5,26; N, 3,55,

E. (R, S)-(9-Bencil-5-metoxi-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) carboxilato de metilo

6

Se trató una solución del ácido carboxílico del apartado D anterior (2.32 g, 5.81 mmol) en 50 mL de 1,2-dicloroetano con cloruro de oxalilo (2.0 ml, 22.9 mmol) y 1 gota de DMF. La mezcla resultante se dejó con agitación a temperatura ambiente durante 3 h, a continuación se concentró a vacío. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía súbita (SiO_{2}; gradiente de 0% a 5% a 10% en EtOAc / mezcla de hexanos) para proporcionar 1,39 g (3.64 mmol; 63%) del compuesto titular en forma de polvo amarillo. FDMS 381 (M+);

Análisis elemental para C_{21}H_{19}NO_{4}S:

Calculado: C, 66,12; H, 5,02; N, 3,67,

Encontrado: C, 66,00; H, 5,26; N, 3,63,

F. Metil (R, S)-(9-Bencilo-5-metoxi-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) carboxiamida

7

Se trató una solución de (R, S)-(9-bencil-5-metoxi-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) carboxilato de metilo (1,1 g, 2,88 mmol) en 25 mL de THF/MeOH/H_{2}O (3:1:1) con LiOH (83 mg, 3,46 mmol) y se dejó con agitación a temperatura ambiente durante toda la noche. La capa acuosa se extrajo con 25 mL de CH_{2}Cl_{2}, se acidificó con HCl 1N y se extrajo de nuevo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 25 mL). Los extractos acidificados se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío. El intermedio crudo ácido se disolvió en 20 ml de 1,2-dicloroetano y se trató con (COCl)_{2} (0,77 mL, 8,82 mmol). Tras 4 h, la mezcla de reacción se concentró a vacío y resuspendió en 20 mL de 1,2-dicloroetano. Se hizo burbujear amoniaco a través de la solución durante 10 min, a continuación se tapó la mezcla de reacción y se dejó reposar durante 1.5 h. La amida cruda se concentró a vacío y se recristalizó en EtOAc / mezcla de hexanos para proporcionar 780 mg (2,13 mmol; 74%) del compuesto titular en forma de un sólido tostado claro FDMS 366 (M+);

Análisis elemental para C_{20}H_{18}N_{2}O_{4}S \cdot 0.2 H_{2}O:

Calculado: C, 64,92; H, 5,01; N, 7,57,

Encontrado: C,, 64,95; H, 5,04; N, 7,78

G. (R, S)-(9-Bencil-5-hidroxi-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) carboxiamida

8

Una solución de metil (R, S)-(9-bencil-5-metoxi-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) carboxiamida a 0ºC en 10 ml de 1,2-dicloroetano se trató con BBr_{3} (2.4 ml, 24.9 mmol). Tras 3 h, la mezcla de reacción se detuvo bruscamente en frío con MeOH y se vertió sobre 20 ml de solución saturada de NaHCO_{3}). La capa acuosa se extrajo con CHCI_{3} (4 x 50 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío. La purificación del residuo crudo mediante cromatografía radial (SiO_{2}; gradiente de 0% a 2% MeOH / CHCl_{3}) para proporcionar 162 mg (0,46 mmol; 28%) del compuesto titular en forma de una espuma marrón. FDMS 352 (M+);

Análisis elemental para C_{19}H_{16}N_{2}O_{3}S \cdot 0.8 H_{2}O:

Calculado: C, 62,21; H, 4,84; N, 7,64

Encontrado: C, 62,57; H, 4,50; N, 7,27

H. (R, S)-(9-Bencilo-4-carbamoil-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) oxiacetato de etilo

9

Se trató una suspensión de (R, S)-(9-bencil-5-hidroxi-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) carboxiamida (145 mg, 0,411 mmol) y CS_{2}CO_{3} (400 mg, 1,23 mmol) en 5 mL de DMF con bromoacetato de etilo (0,046 ml, 0,411 mmol). Tras agitación durante toda la noche, la mezcla de reacción se vertió sobre 20 mL de H_{2}O. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (4 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H_{2}O (3 x 100 mL), se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío. La purificación del residuo crudo mediante cromatografía radial (SiO_{2}; gradiente de 0% a 0.5% MeOH / CHCl_{3}) produjo 120 mg (0,274 mmol; 67%) del compuesto titular en forma de una espuma color tostado claro. FDMS 438 (M+);

Análisis elemental para C_{23}H_{22}N_{2}O_{5}S \cdot 0.3 H_{2}O \cdot 0.4 CHCl_{3}:

Calculado: C, 57,16; H, 4,72; N, 5,70,

Encontrado: C, 57,18; H, 4,61; N, 5,68,

I. Ácido (R, S)-(9-Bencil-4-carbamoil-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il)oxiacético

Se trató una solución de (R, S)-(9-bencil-4-carbamoil-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) oxiacetato de etilo (20 mg, 0,0456 mmol) en 0,5 ml de THF/MeOH/H_{2}O (3:1:1) con LiOH (1.3 mg, 0,0547 mmol). La solución se volvió rápidamente de color naranja claro, y tras 45 min, la capa acuosa se extrajo con 10 ml de CHCl_{3}, se acidificó con HCl 1N y se extrajo de nuevo con CHCl_{3} (3 x 20 ml). Los extractos acidificados se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío para dar un sólido naranja. El ácido crudo se purificó en una columna tipo pipeta (SiO_{2}; gradiente de 0 a 2% MeOH / CHCl_{3}, trazas de ácido glacial acético) para producir 10 mg (0,0244 mmol; 53%) del compuesto titular en forma de un sólido tostado claro. FAB HRMS: m/e para C_{21}H_{19}N_{2}O_{5}S: 411,1015. Encontrado: 411,1010 (M+1).

Ejemplo 2 Preparación del Ácido (R, S)-(9-Bencilo-4-carbamoil-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) oxiacético

10

A. (R, S)-(9-Bencil-4-carbamoil-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il)oxiacetato de etilo

11

Una suspensión de (R, S)-(9-bencilo-4-carbamoil-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) oxiacetato de etilo (75 mg, 0,171 mmol) en 1 mL de MeOH y 1,5 ml de THF (para solubilidad) se trató con NaBH_{4} (8 mg, 0,214 mmol). Tras 20 min, la mezcla de reacción se detuvo bruscamente con 10 ml de H_{2}O. La capas se separaron, y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con K_{2}CO_{3}, se filtraron y se concentraron a vacío. El alcohol crudo intermedio se disolvió inmediatamente en 2 ml de 1,2-dicloroetano. La solución resultante se trató con Et_{3}SiH (0,19 ml, 1,2 mmol). Tras enfriamiento hasta 0ºC, se añadió TFA (0,13 ml, 1,7 mmol) gota a gota. Tras 1 h, la mezcla de reacción se vertió sobre 25 mL de NaHCO_{3} saturado acuoso. La capas se separaron, y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 25 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío. La purificación del residuo crudo mediante cromatografía súbita (SiO_{2}; gradiente de 0% a 0.5% MeOH / CHCl_{3}) produjo 38 mg (0,0895 mmol, 52%) del compuesto titular en forma de un sólido cremoso FDMS 424(M+);

Análisis elemental para C_{23}H_{24}N_{2}O_{4}S \cdot 0.3 H_{2}O \cdot 0.6 CHCl_{3}:

Calculado: C, 56,51; H, 5,06; N, 5,59

Encontrado: C, 56,61; H, 4,87; N, 5,60

B. Ácido (R, S)-(9-Bencil-4-carbamoil-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il)oxiacético)

Se trató una solución de (R, S)-(9-bencil-4-carbamoil-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) oxiacetato de etilo (28 mg, 0,066 mmol) en 0,5 ml de THF/MeOH/ H_{2}O (3:1:1) con LiOH (1,9 mg, 0.079 mmol). Tras 1 h, la capa acuosa se extrajo con 10 ml de CHCl_{3}, se acidificó con HCl 1N y se extrajo de nuevo con CHCl_{3} (3 x 20 mL). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron con Na_{2}SO_{4} se filtraron y se concentraron a vacío. El ácido crudo se purificó en una columna tipo pipeta (SiO_{2}: gradiente de 0 a 1% MeOH / CHCl_{3}trazas de ácido glacial acético) para proporcionar 18 mg (0,045 mmol; 69%) del compuesto titular en forma de un sólido cremoso. FAB HRMS: m/e, calculado para C_{21}H_{21}N_{2}O_{4}S: 397,1222., Encontrado: 397,1216 (M+l).

Ejemplo 3 Clorhidrato del ácido 2-(4-oxo-5-carboxiamida-9-bencil-9H-pirido[3,4-b]indolil)acético

12

A. Preparación de N-[5-(1-bencilo-3-oxo-1,2,3,6-tetrahidropiridinilo)]-2-bromo-3-carbometoxianilina

A una mezcla de 2-bromo-3-carbometoxianilina (12,0 g, 52,2 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (13 8 g, 54 9 mmol) en tolueno / dioxano 2:1 (300 ml) se añadió 1-bencilo-3,5-piperidindiona (13,0 g, 70,2 mmol, Chen, L. -C.; Yang, S. -C. Heterocycles 1990, 31, 911-916). El aparato se equipó con un dispositivo Dean-Starke y la mezcla se calentó a reflujo durante 10 h. La mezcla se concentró a vacío y el residuo se disolvió en cloroformo. Esta solución se lavó tres veces con agua, una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secó (sulfato de sodio), se filtró, y se concentró a vacío para proporcionar un aceite oscuro. La cromatografía (silica gel, cloroformo al 4% metanol/96% cloroformo) proporcionó 2,.0 g (9%) del producto titular en forma de una espuma que pude cristalizarse en acetonitrilo: mp 156-158ºC.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d 7,55 (m, 2 H), 7,40 (m, 6 H), 5,55 (s, 1 H), 3,94 (s, 3 H), 3,85 (m, 2 H), 3,56 (m, 2 H), 3,30 (bs, 1 H), 2 H); MS ES+ m/C 414, g (p), 416,9 (p); IR (KBr, cm) 3185, 2944, 1728, 1603, 1544, 1306.

Análisis elemental para C_{20}H_{19}BrN_{2}O_{3}:

Calculado: C, 57,84; H, 4,61; N, 6,75,

Encontrado: C, 58,13; H, 4,49; N, 6,91,

13

B. Preparación de 2-bencil-4-oxo-5-carbometoxi-1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido[3,4-b]indol

Una mezcla de N-(S-(1-bencil-3-oxo-1,2,3,6-tetrahidropiridinilo)]-2-bromo-3-carbometoxianilina (2,07 g, 4,98 mmol), acetato de paladio(II) (0,112 g, 0,499 mmol), tri-o-tolilfosfina (0,304 g, 0,999 mmol), trietilamina (1,3 mL, 9,3 mmol), y N,N-dimetilparamida (3 ml) en acetonitrilo (12 ml) se colocó en un tubo y se purgó con argón. El tubo se selló y se calentó a 100ºC durante 16 h. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo, se filtró, y el filtrado se concentró a vacío para proporcionar un aceite oscuro. La cromatografía (silica gel, cloroformo al 4% en metanol / cloroformo al 96%) proporcionó 1,28 g (77%) de un aceite, que cristalizó tras almacenaje a 10ºC en EtOAc / hexano mp 174-176ºC.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d 9,25 (bs, 1 H), 7,38 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,30 (m, 5 H), 7,23 (t, J = 8 Hz, 1 H), 3,97 (5, 3 H), 3,75 (s, 2 H), 3,72 (s, 2 H), 3,61 (s, 2 H); MS ES+ m/e 335 (p + 1); IR (KBr, cm ) 3080, 1721, 1628, 1476, 1294, 1138.

Análisis elemental para C_{20}H_{18}N_{2}O_{3}:

Calculado: C, 71,84; H, 5,43; N, 8,38,

Encontrado: C, 72, 06; H, 5,31 ; N, 8,31,

14

C. Preparación de 2,9-dibencil-4-oxo-5-carbometoxi-1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido[3,4-b] indol

A una solución de 2-bencil-4-oxo-5-carbometoxi-1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido[3,4-b]indol (0,928 g, 2,78 mmol) en tetrahidrofurano seco (5 mL) se añadió 60% hidruro de sodio en aceite (111 mg). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente hasta que cesó la producción de gas. Se añadió a la mezcla de reacción una solución de ioduro de bencilo (0,606 g, 2,78 mmol) en tetrahidrofurano seco (5 ml) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 60 h. La mezcla se diluyó con cloruro de metileno y se lavó dos veces con solución saturada de cloruro de sodio. La capa orgánica se secó (sulfato de magnesio), se filtró, y se concentró a vacío. El residuo se trituró con acetato de etilo resultando en un precipitado amarillo (163 mg). El filtrado se concentró a vacío y se cromatografió (silica gel, 5% metanol/95% cloruro de metileno) para proporcionar 580 mg más del compuesto titular (total 743 mg, 63%) en forma de un sólido cristalino: mp 198-199ºC.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d 7,43 (d, J = 7 Hz, 1 H), 7,36 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,25 (m, g H), 6,95 (m, 2 H), 5,24 (s, 2 H), 4,01 (5, 3 H), 3,78 (m, 4 H), 3,40 (bs, 2 H); MS EI+ m/e 425 (p + 1); IR (KBr, cm^{-1}) 1726, 1648, 1449, 1291, 1134, 1107.

Análisis elemental para C_{2}H_{24}N_{2}O_{3}:

Calculado : C, 76.40; H, 5.70; N, 6.60.

Encontrado : C, 76.11; H, 5.45 ; N, 6.54.

15

D. Preparación 4-hidroxi-5-carbometoxi-9-bencilo-9H-pirido[3,4-b]indol

Se calentó a reflujo durante 4 h en acético ácido (15 mL) una mezcla de 2,9-dibencil-4-oxo-5-carbometoxi-1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido[3,4-b]indol (521 mg, 1,23 mmol) y paladio-en-carbón al 10% (250 mg). El recipiente de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se purgó con nitrógeno. El recipiente se colocó bajo una presión positiva de hidrógeno y se calentó a 75ºC durante 16 h. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente, se filtró, y se concentró a vacío para proporcionar un sólido naranja. La cromatografía (silica gel, 4% metanol/96% cloruro de metileno) proporcionó 271 mg (60%) del compuesto titular en forma de polvo amarillo mono-hidrato: mp >250ºC.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d 8.46 (s, 1 H), 8,22 (s, 1 H), 8,09 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,70 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,56 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,23 (m, 3 H), 7,08 (m, 2 H), 5,60 (5,2 H), 4,11 (s, 3 H); MS ES+ m/e 333 (p + 1).

Análisis elemental para C_{20}H_{16}N_{2}O) \cdot H_{2}O:

Calculado: C, 68,60; H, 4,98; N, 7,91,

Encontrado: C, 68,56; H, 5,18; N, 8,00,

16

E. Preparación de 4-hidroxi-5-carboxiamida-9-bencilo-9H-pirido[3,4-b]indol

Se disolvió 4-hidroxi-5-carbometoxi-9-bencil-9H-pirido [3,4-b] indol (200 mg, 0,618 mmol) en una solución de amoniaco metanólico 2M (10 mL) y se colocó en un tubo abierto La solución se saturó con amoniaco gaseoso durante 10 minutos. El tubo se selló se calentó a 60-65ºC durante 8 h. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y el precipitado resultante se recogió a vacío para proporcionar 0,12 g (61%) del compuesto titular en forma de un sólido amarillo: mp >250ºC.

^{1}H RMN (DMSO-d6) d 10,99 (s, 1 H, -OH), 8,99 (bs, 1 H, -NH), 8,59 (s, 1 H), 8,55 (bs, 1 H, -NH), 7,96 (d, J = 7 Hz, 1 H), 7,94 (s, 1 H), 7,64 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,57 (d, J = 7Hz, 1 H), 7,22 (m, 3 H), 7,12 (d, J = 7 Hz, 2 H), 5,80 (s, 2 H); MS ES+ m/e 318 (p + 1).

Análisis elemental para C_{19}H_{18}N_{3}O_{2}:

Calculado: C, 71,91; H, 4,76; N, 13,24,

Encontrado: C, 72,20; H, 4,57; N, 13,48,

17

F. Preparación de clorhidrato del ácido 2-(4-oxo-5-carboxiamida-9-bencil-9H-pirido[3,4-b]indolil)acético

Una mezcla de 4-hidroxi-5-carboxiamida-9-bencilo-9H-pirido[3,4-b]indol (57 mg, 0,18 mmol), bromoacetato de metilo (51 mL, 0,54 mmol), y carbonato de cesio (114 mg, 0,349 mmol) en N,N-dimetilparamida (2 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos. La mezcla se trató con un mínimo de agua y metanol y se concentró a vacío. El residuo se disolvió en 1M hidróxido de litio acuoso (0,5 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se concentró a vacío. El residuo se disolvió en ácido clorhídrico acuoso diluido y se purificó mediante HPLC de fase reversa, seguido de liofilización, para proporcionar 28,5 mg (38%) del producto titular.

^{1}H RMN (DMSO-d6) d 12,85 (bs, 9,11 (s, 1 H), 8,66 (s, 1 H), 8,30 (s, 1 H), 7,85 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,76 (d, (m, 3 H), 7,19 (m, 2 H), 5,88 (s, 2 H), m/C 375 (p + 1).

Análisis elemental para C_{21}H_{17}N_{3}O4. \cdot .HCl \cdot 0.5 H_{2}O:

Calculado: C, 60,58; H, 4,47; N, 10,09,

Encontrado: C, 60,39; H, 4,35; N, 9,69,

Ejemplo 4 Preparación del ácido [N-bencilo-1-carbamoil-1-aza-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-8-il]oxiacético A. Preparación de N-bencilo-4-metoxiindol-2-carboxilato de metilo

Se disolvieron 6,15 g de 4-metoxi indol-2-carboxilato de metilo en 30 ml de dimetilparamida, se añadieron a una suspensión de 12 g de carbonato de cesio en 20 ml de dimetilparamida y se calentaron hasta 45-50ºC durante 1 hora. Tras enfriamiento, se añadió bromuro de bencilo en el mismo solvente y se agitó toda la noche a t.a. La acción continuó añadiendo hielo-agua y dos veces con éter. La capa de éter se lavó con agua, salmuera, se secó con sulfato de magnesio, se filtró y se concentró hasta sequedad. 8.6 g (97%).

Espectro de masas: M^{+}+1 (296) mp. 104-5ºC

B. Preparación de N-bencil-2-hidroximetil-4-metoxindol

Se añadió a una suspensión de 0,31 g de hidruro de litio y aluminio (8,2 mmol) en 25 ml de éter a 0-10ºC el N-bencilo-4-metoxi indol-2-carboxilato de metilo (2,95 g) disuelto en 10 ml del mismo disolvente. La mezcla se agitó a t.a. durante 2 horas, se detuvo bruscamente siguiendo el procedimiento normalizado de Fieser y Fieser, se filtró a través de un filtro de celita y se concentró hasta sequedad para proporcionar 2.8 g de mp.142-3ºC alcohol.

Espectro de masas: M^{+}+1 (268)

C. Preparación de N-bencil-4-metoxiindol-2-carboxaldehido

Se calentó a reflujo durante 6 horas una mezcla de 3,2 g de N-bencilo-2-hidroximetil-4-metoxiindol (12 mmol) y 15 g de dióxido de manganeso (172 mmol) en 50 cc de diclorometano seco, se enfrió hasta t.a. y se filtró a través de celita. La concentración hasta sequedad produjo 3.6 g de un sólido amarillo. Mp 130-31ºC

D. Preparación de N-bencilo-4-metoxiindol-2-propionato de metilo

3,1 g (11,7 mmol) de N-bencilo-4-metoxiindol-2-carboxaldehido se combinaron con 3,65 g (35,1 mmol) de ácido malénico y 0,4 g de piperidina en 20 ml de piridina; la mezcla se calentó a 100ºC durante 2 horas, se concentró bajo vacío hasta un tercio de volumen y se acidificó con HCl 1N. El sólido se separó por filtración, se lavó con agua y se secó a vacío para proporcionar 3,0 g de producto (85%). Espectro de masas: M^{+}+1 (308) mp. 208-10ºC. Este material se disolvió en 30 ml de metanol y 1 ml de ácido sulfúrico, se calentó a reflujo durante 2 horas, se enfrió hasta t.a. y se concentró hasta un volumen pequeño. El sólido resultante se aisló mediante filtración. Este material se hidrogenó en metanol-tetrahidrofurano con Pd en carbono al 5% para proporcionar el compuesto titular (2,5 g) con un rendimiento global del 66%.

Espectro de masas: M^{+}+1 (324) mp. 195-6ºC

E. Preparación de N-bencil-1-aza-(3,4-dihidro)-8-metoxicarbazol-2-ona

2,5 g de N-bencil-4-metoxiindol-2-propionato de metilo (7,7 mmol) se disolvieron en 25 ml de éter y se añadieron 2 equivalentes (5,86 g) de bis(2,2,2tricloroetil) azodicarboxilato en porciones a lo largo de media hora, se agitó a t.a. durante toda la noche, se filtró y se concentró hasta sequedad. Este compuesto se disolvió en una pequeña cantidad de éter y se filtró para proporcionar 3,2 g de un sólido verde. 1 g de este complejo se redujo con 1 g de Zn activado en 5 ml de acético ácido. La temperatura se mantuvo a 10ºC durante 1 hora, se dejo calentar hasta t.a. y se agitó durante toda la noche. Se añadió Agua y se basificó con hidróxido de sodio 1N. La Extracción con tetrahidrofurano y acetato de etilo, lavado, secado y concentración produjo un aceite marrón que se cristalizó en alcohol isopropilo. 300 mg de crudo y 130 mg tras cristalización.

Espectro de masas: M^{+}+1 (307) mp. 206-8ºC.

F. Preparación de N-bencil-1-carbamoil-1-aza-8-metoxi-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol

Se trataron 500 mg de N-bencil-1-aza-(3,4-dihidro)-8-metoxicarbazol-2-ona en tetrahidrofurano con 82 mg de hidruro de litio y aluminio a t.a., a continuación se calentaron hasta 50ºC. La acción se continuó de acuerdo con el procedimiento de Fieser y Fieser (The Agents for Organic Synthesis, Fieser, L. et al., John Wiley and Sons, NY 1967, p. 583), se filtraron a través de celita y se concentraron hasta sequedad. 420 mg de producto crudo. Este producto, sin mayor purificación, se trató con isocianato de trimetilsililo en tetrahidrofurano durante dos horas, y a continuación se concentró hasta sequedad. se añadió Éter y se aisló el sólido amorfo mediante filtración. 360 mg.

Espectro de masas: M^{+}+1 (336)

G. Preparación del éster metílico del ácido [N-bencil-1-carbamoil-1-aza-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-8-il] oxiacético

Se disolvieron 300 mg de N-bencil-1-carbamoil-1-aza-8-metoxi-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol en 10 ml de diclorometano y se enfrió hasta -20ºC. se añadieron 10 ml de una solución de tribromuro de boro 1M en el mismo disolvente gota a gota. se agitó a t.a. durante tres horas y se vertió sobre HCl 1N - hielo. Este material se extrajo en acetato de etilo, se lavó con agua, salmuera, se secó con sulfato de magnesio, se filtró y se concentró hasta sequedad para proporcionar 190 mg. Este material se disolvió en 5 ml de dimetilparamida y se añadió un ligero exceso de carbonato de cesio. Tras calentar hasta 35ºC durante 10 minutos se añadió bromoacetato de metilo y se agitó a t.a. durante toda la noche. se añadió Agua, se extrajo con acetato de etilo, se lavó, se secó con sulfato de magnesio, se filtró, y se concentró hasta sequedad. La purificación súbita usando cloroformo- acetato de etilo 3:1 proporcionó 45 mg de producto.

Espectro de masas: M^{+}+1 (394) RMN (CDCl_{3}) 7,3 (m, 5 H), 7,0 (m, 1 H), 6,95 (d, 1H) 6,4 (d, 1H), 5,25 (s, 2H), 5,2 (b, 2H), 4,8 (s, 2H), 3,8 (s, 3H), 2,75 (b, 2H), 2,1 (b, 2H), 1,25 (2, 2H).

H. Preparación del ácido [N-bencilo-1-carbamoil-1-aza-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-8-il] oxiacético

Se disolvieron 15 mg del éster metílico del ácido [N-bencil-1-carbamoil-1-aza-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-8-il] oxiacético en 10 ml de tetrahidrofurano : metanol 7:1 y se añadió 0,5 ml de hidróxido de sodio 1N. Tras agitación a t.a. durante toda la noche, los solventes se eliminaron mediante arrastre con aire, el residuo se acidificó con HCl 1N y el sólido se filtró, se lavó con agua y se secó a vacío.

Espectro de masas: M^{+}+1 (380)

Ejemplo 5 Preparación de 4-metoxi-6-metoxicarbonil-10-fenilmetil-6,7,8,9-tetrahidropirido[1,2-a]indol

18

A. Preparación de 3-fenilmetil-7-metoxiindol

Se calentó a reflujo durante 1,5 horas una mezcla de 15 g (0,086 mol) de clorhidrato del 2-metoxifenilohidrazina y 12 mL (0,09 mol) de 3-fenilpropionaldehido en 300 mL de tolueno con eliminación azeotrópica de agua. La suspensión se enfrió, evaporó a vacío y el residuo se disolvió en 500 mL de diclorometano y se agitó con 9 mL (0,09 mol) de tricloruro de fósforo durante 18 horas. La solución se vertió sobre hielo-agua, se agitó bien, y se volvió básica con bicarbonato de sodio. La fase orgánica se lavó con una solución saturada cloruro de sodio, se secó con sulfato de sodio, y se evaporó a vacío. El residuo se cromatografió en silica gel eluyendo con un gradiente hexano/ éter etílico 5-15% para proporcionar producto, 8 g, 40%, en forma de un aceite viscoso.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 3,95 (s, 3 H), 4,10 (s, 2 H), 6,65 (d, 1 H), 6,90 (s, 1H), 7,00 (t, 1H), 7,10 (d, 1H), 7,20 (m, 1H), 7,30 (m, 4H), 8,20 (br s, 1H).

B. Preparación de 2-[3-fenilmetil-7-metoxiindol-il]-5-cloropentanoato de metilo

Se trató en porciones una solución de 2,7 g (11 mmol) del producto procedente del apartado A en 75 mL de dimetilosulfoxido y unos pocos mililitros de tetrahidrofurano con 480 mg de hidruro de sodio (60% en aceite mineral, 12 mmol), se agitó durante 10 minutos, y a continuación durante 16,5 horas tras la adición de 0,3 g de 18-corona-6 y 1,.7 g (13 mmol) de 2-bromo-cloropentanoato de metilo. La solución se diluyó con acetato de etilo y agua. La fase orgánica se lavó con agua, se lavó con solución saturada cloruro de sodio, se secó con sulfato de sodio, y se evaporó a vacío. El residuo se cromatografió sobre silica gel eluyendo con un gradiente hexano / éter etílico 10-25% para proporcionar producto, 1,7 g, 40%, en forma de un aceite.

^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta: 1,35 (m, 1H), 1,60 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 3,55 (t, 2H), 3,60 (s, 3H), 3,80 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 6,60 (d, 1H), 6,85 (t, 1H), 7,00 (d, 1H), 7,10, (m, 1H), 7,15 (s, IH), 7,20 (m, 4H).

C. Preparación de 4-metoxi-6-metoxicarbonil-10-fenilmetil-6,7,8,9-tetrahidropirido[1,2-a] indol

Se calentó a reflujo una solución de 1,8 g (4,7 mmol) del producto procedente del apartado B y 4 mL (15 mmol) de hidruro de tri-n-butilestaño en 50 mL de tolueno y se trató gota a gota con una solución de 85 mg (0,5 mmol) de 2,2'-azobis (2-metilopropionitrilo). La solución se calentó a reflujo 1 hora tras la adición, se enfrió, se evaporó a vacío, y se capturó en acetato de etilo, se agitó con fluoruro de potasio acuoso, y se filtró. La fase orgánica se lavó con solución saturada cloruro de sodio, se secó con sulfato de sodio, y se evaporó a vacío para proporcionar una mezcla de 4-metoxi-6-metoxicarbonil-10-feniletil- 6,7,8,9,9a,10-hexahidropirido [1,2-a]indol y 2-[3-fenilmetil-7-metoxiindol-1-il] pentanoato de metilo que se disolvió en 25 mL de dioxano y se agitó con 450 mg (2 mmol) de diclorodicianoquinona durante 30 minutos. La solución se evaporó a vacío, se capturó en diclorometano, se filtró a través de florisil, y se evaporó a vacío. El residuo se cromatografió sobre silica gel eluyendo con un gradiente hexano / éter etílico 10-20% para proporcionar el compuesto titular, 75 mg, 5%, en forma de un sólido amorfo:

^{1}H RMN (CDCl_{3})\delta: 1,70 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 2,35 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 3,00 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,80 (5, 3H), 4,00 (q, 2H), 5,65 (m, 1H), 6,50 (d, 1H), 6,,90 (t, 1H), 7,00 (d, 1H), 7,10 (m, 1H), 7,20 (m, 4H).

Ejemplo 6 Preparación del ácido (4-carboxiamida-9-fenilmetil-4,5-dihidrotiopirano [3,4-b] indol-5-il) oxiacético

19

A. Preparación de 3-(4-metoxiindol-3-il)lactato de metilo

Se añadió cloruro estánnico a una solución de 4-metoxiindol (200 mg, 1,36 mmol) y 2,3-epoxipropionato de metilo (258 mg, 2,22 mmol) en 40 ml de tetracloruro de carbono (0,16 ml, 1,39 mmol) gota a gota entre -5 y -10ºC. La mezcla de reacción se agitó a dicha temperatura durante 1 hora y se calentó hasta temperatura ambiente lentamente y con agitación continua. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y solución de bicarbonato de sodio, se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, y se evaporó a vacío para proporcionar 210 mg de un aceite amarillo que se sometió a cromatografía súbita en columna (mezcla de hexanos: acetato de etilo 2:1 a 1:1) para proporcionar producto, 157 mg, 44%, en forma de una espuma amarilla.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d: 1,20 (t, 3H), 3,15(dd, 1H), 3,49 (dd, 1H), 3,95(5, 3H), 4,12 (q, 2H), 4,49(dd, IH), 5,27 (s, 2H), 6,50(d, 1H), 6,83 (d, 1H), 7,08 (m, 2H), 7,31 (m, 5H).

B. Preparación de una mezcla de 2-bromo-3-(4metoxiindol-3-il)propionato de metilo y 2-bromometilo-3-(4metoxi-indol-3-il) acetato de metilo

Se añadió a una solución del producto procedente del apartado A (29 mg, 0,11 mmol) y trifenilfosfina (57,7 mg, 0,22 mmol) en 2 ml de 1,2-dicloroetano una solución de 1,2-dibromotetracloroetano (71,6 mg, 0,22 mmol) en 1 mL de 1,2-dicloroetano a -10ºC. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 15 minutos más. a continuación, se concentró a vacío y se sometió a cromatografía súbita en columna (mezcla de hexanos : éter etílico 2:1) para proporcionar 31 mg, 86%, de una mezcla de 2-bromo-3-(4-metoxiindol-3-il) propionato de metilo y 2-bromometil-3-(4-metoxiindol-3-il) acetato de metilo en forma de un aceite amarillo.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d: 1, 20 (t, 3 H), 3,15 (dd, 1 H), 3,4 g (dd, 1 H), 3,95 (s, 3 H), 4,12 (q, 2 H), 4,4 g (dd, 1 H), 5,27 (s, 2 H), 6,50 (d, 1 H), 6,83 (d, 1H), 7,08 (m, 2H), 7,31(m, 5H).

C. Preparación de una mezcla de 2-bromo-3-(1-fenilmetil-4-metoxiindol-3-il) propionato de metilo y 2-bromometil-3-(1-fenilmetil-4-metoxiindol-3-il)acetato de metilo.

El producto mezcla procedente del apartado B se disolvió en 5 ml de acetonitrilo y se añadió \sim1 equivalente de carbonato de potasio. Se calentó a reflujo durante toda la noche para producir 2-[4-metoxiindol-3,3-il] espirociclopropano carboxilato de metilo. A esta mezcla de reacción se añadieron 2 equivalentes de bromuro de bencilo, y la mezcla se calentó a reflujo durante toda la noche. La mezcla se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía súbita en columna (mezcla de hexanos: éter 97:1) para proporcionar 29 mg, 66%, de ca. mezcla 1:9 de 2-bromo-3-(1- fenilmetil-4-metoxiindol-3-il) propionato de metilo y 2-bromometil-3-(1-fenilmetil- 4-metoxiindol-3-il) acetato de metilo ^{1}H RMN (CDCl_{3}) d: 1,28 (t, 3H), 3,82 (d, 2H), 3,96 (s, 3H), 4,26 (q, 2H), 4,81 (t, 1H), 5,25 (s, 2H), 6,53 (d, 1H), 6,89 (d, IH, 7,02-7,18 (m, 7H).

D. Preparación de 2-acetiltiometilo-3-(1-fenilmetil-4-metoxiindol-3-il) acetato de metilo

Se añadió a una solución del producto mezcla procedente del apartado C (2,87 g, 7,0 mmol) en 15 ml de tetrahidrofurano y 40 ml de dimetilparamida 18-corona-6 (0,31 g) y tioacetato de potasio (12,2g, 0,11 mol) y a continuación se agitó a 50ºC durante 2 horas. La mezcla se diluyó con acetato de etilo y salmuera. La fase orgánica se lavó, se secó y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC y proporcionó 1,89, 64.2%, del producto.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d: 1, 19 (t, 3 H), 2,28 (s, 3H), 3,54 (dd, 2 H), 3,91 (s, 3H), 4,52 (t, 1H), 5,22 (s, 2H), 6,53 (d, 1H), 6,82 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,11 (m, 3H), 7,28 (m, 3H).

E. Preparación de 2-mercaptometil-3-(1-fenilmetil-4-metoxiindol-3-il) acetato de metilo

A una solución del producto procedente del apartado D (0,84 g, 2,0 mmol) en etanol (70 ml) se añadió carbonato de potasio (4,1 g, 30 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. se detuvo bruscamente con solución de clorhídrico ácido y se extrajo con acetato de etilo, se secó, se concentró para proporcionar el producto, 0,74 g, 98%.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d: 1,21 (t, 3 H), 1,55 (t, 1H), 3,03 (m, 2H), 3,91 (s, 1H), 4,19 (q, 2H), 4,50 (t, 1H), 5,22 (s, 3H), 6,48 (d, 1H), 6,83 (d, 1H), 6,98 (s, 1H), 7,10 (m, 3H), 7,27 (m, 3H).

F. Preparación de 2-metoximetilmercaptometil-3-(1-fenilmetil-4-metoxiindol-3-il)acetato de metilo

A una solución del producto procedente del apartado C (0,71 g, 1,92 mmol) en tetrahidrofurano (45 ml) se añadió unos pocos miligramos de 18-corona-6 y hexametildisilazida de potasio (4,54 ml, 0,5 M en tolueno) a -75ºC. La solución se agitó a -75ºC durante 3 minutos y a continuación se añadió iodometil metil éter (0,28 ml, mmol) y se agitó durante 20 minutos a -75ºC. La mezcla de reacción se vertió en una mezcla de acetato de etilo y salmuera. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (mezcla de hexanos: acetato de etilo 3:1) para proporcionar producto, 650 mg, 82%, en forma de un aceite amarillo claro.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d: 1,23 (t, 3H), 3,14 (m, 2H), 3,35 (s, 3H), 3,91 (s, 3H), 4,22 (q, 2H), 4,65 (d, 1H), 4,66 (t, 1H), 4,75 (d, 1H), 5,22 (s, 2H), 6,51 (d, 1H), 6,90 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,07 (m, 3H), 7,28(m, 3H).

G. Preparación de 4-metoxicarbonil-5-metoxi-9fenilometilo-4,5-dihidrotiopirano [3,4-b] indol

Se añadió rápidamente una espátula de bromuro de zinc a una solución de producto procedente del apartado F (518 mg, 1,25 mmol) en diclorometano (10 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4,5 horas. La mezcla se vertió sobre acetato de etilo y solución de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (mezcla de hexanos: acetato de etilo 3:1) para proporcionar 269 mg, 56,4%, del producto en forma de un aceite amarillo.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) d: 1,22 (t, 3H), 3,20 (dd, 1H), 3,59 (d I 1H), 3,72 (d, 1 H), 3,83 (s, 3H), 4,21 (m, 3H), 4,53 (t, 1H), 5,18 (d, IH), 5,24 (d, 1H), 6,43 (di 1H), 6,82 (d, IH), 6,98 (d, IH), 7,09 (ti 1H), 7,22 (m, 4H).

H. Preparación de 4-carboxiamida-5-metoxi-9-fenilmetil-4,5-dihidrotiopirano [3,4-b] indol

Se añadió a una solución del producto procedente del apartado G (120 mg, 0,31 mmol) en benceno (15 ml) amida de metilcloroaluminio preparada recientemente (0,67M, 9,3 ml). La mezcla se agitó a 50ºC durante toda la noche, se enfrió, se añadieron a ácido clorhídrico 10N, y se diluyó con acetato de etilo y salmuera. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (mezcla de hexanos: acetato de etilo 3:1 a acetato de etilo a metanol en diclorometano al 1%) para proporcionar producto, 49,3 mg, 45%. MS FlA 353,4 (M+1).

Análisis elemental para C_{20}H_{20}N_{2}O_{2}S:

Calculado: C 68,16; H 5,72; N 7,95

Encontrado: C, 68,31; H 5,83; N 8,05

I. Preparación de [4-carboxiamida-9-fenilmetil-4,5-dihidrotiopirano[3,4-b] indol-5-il] oxiacetato de etilo

A una solución del producto procedente del apartado H (210 mg, 0,60 mmol) en diclorometano (30 ml) se añadió tribromuro de boro (10 ml, 1M en diclorometano). La mezcla se agitó durante 0,5 horas. La mezcla de reacción se vertió sobre hielo-agua, se extrajo con metanol en diclorometano al 1%, se lavó con salmuera, se secó, y se concentró. El 4-carboxiamida-5-hidroxi-9-fenilmetil-4,5-dihidrotiopirano[3,4-b]indol crudo se disolvió en 13 ml de DMF y la solución resultante se trató con hidruro de sodio (50 mg, 60% en aceite mineral, 1,25 mmol) durante 5 minutos, y a continuación con bromoacetato de etilo (0,09 ml, 1,2 mmol) durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y salmuera. La capa orgánica se lavó, se secó, y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (metanol en diclorometano al 1%-2%) para proporcionar producto 79 mg, 31%, en forma de una espuma amarilla. MS FIA 425,2 (M+1).

Análisis elemental para C_{23}H_{24}N_{2}O_{4}S:

Calculado: C 65,07; H 5,57; N 6,47

Encontrado: C 65,88; H 5,57; N 6,47

J. Preparación del ácido (4-carboxiamida-9-fenilmetil-4,5-dihidrotiopirano[3,4-b]indol-5-il) oxiacético

Se añadió hidróxido de litio (\sim2,5 equiv) A una solución del producto procedente del apartado I (53,7 mg, 0,13 mmol) en una mezcla de solventes (5 ml, tetrahidrofurano: metanol: agua, 3:1:1) La solución se agitó durante toda la noche, se acidificó hasta pH \sim2, y se extrajo con acetato de etilo. La solución orgánica se secó con sulfato de sodio y se evaporó a vacío para proporcionar el compuesto titular, 37 mg, 74%, en forma de un sólido amarillo. MS FIA 397,1 (M+1).

Análisis elemental para C_{21}H_{20}N_{2}O_{4}S:

Calculado: C, 63,62; H, 5,08; N, 7,07

Encontrado: C, 63,83; H, 5,33; N, 6,87

Ejemplo 7 3,4-dihidro-4-carboxiamida-5-metoxi-9-fenilmetilpirano [3,4-b] indol

20

A. Preparación de [4-metoxiindol-3-il] acetato de etilo

Se añadieron lentamente a una solución de 2,94 g (20 mmol) de 4-metoxiindol en 150 ml de tetrahidrofurano 13 ml de n-butil litio (1,6 M en hexano; 20 mmol) seguido por la adición lenta de 20 ml de cloruro de zinc (1,0 M en éter etílico; 20 mmol) a 0-5ºC. Se retiró el baño refrigerador y la solución se agitó durante 2 horas y a continuación se trató con 2,1 ml (25 mmol) de bromoacetato de etilo durante 19 horas, se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua, se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, y se evaporó a vacío. El residuo se cromatografió en silica gel eluyendo con un gradiente hexano/éter etílico 10-50% para proporcionar material de partida (40%) y a continuación producto, 2,3 g, 50%, en forma de un aceite.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 1,25 (t, 3H), 3,85 {s, 3H}, 3,90 (s, 2H), 4,10 (q, 2H), 6,45 (d, 1H), 6,90 (d, 1H), 6,95 (s, 1H), 7,05 (t, 1H), 8,00 (br s, 1H).

B. Preparación de [4-metoxi-1-fenilmetilindol-3-il] acetato de etilo

Se trató en porciones una solución de 1,6 g (6.9 mmol) del producto procedente del apartado A en 75ml de dimetilparamida y 10 ml de tetrahidrofurano con 300 mg de hidruro de sodio (60% en aceite mineral; 7.5 mmol) y a continuación con 1,0 ml (8,4 mmol) de bromuro de bencilo durante 4 horas, y a continuación se diluyó con acetato de etilo y agua. La fase orgánica se lavó con agua, se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, y se evaporó a vacío. El residuo se cromatografió sobre silica gel eluyendo con un gradiente hexano /éter etílico 10-20% para dar producto, 1,0 g, 45%, en forma de un aceite.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 1,25 (t, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,90 (s, 2H), 4,10 (q, 2H), 5,25 (s, 2H), 6,50 (d, 1H), 6,85 (d, 1H), 6,95 (s, 1H), 7,05 (t, 1H), 7,10 (d, 2H), 7,25 (m, 3H), MS ES+ 324,0 (M+1).

C. Preparación de 2-(4-metoxi-1-fenilmetilindol3-il]-3-fenilmetoxipropionato de etilo

A una solución agitada del producto procedente del apartado B (1,4 g, 4,3 mmol) en 50 mL de tetrahidrofurano se añadió hexametidisilazida de potasio (9,54 mL, 0,5M en tolueno; 4,77 mmol) lentamente a -75ºC bajo nitrógeno. La mezcla resultante de la reacción se agitó durante un par de minutes y se trató con clorometil bencil éter (1,7 g, 8,6 mmol) a -75ºC. La mezcla de reacción se agitó a -75ºC durante 0.5 horas y se vertió sobre una mezcla de salmuera y acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía súbita en columna (mezcla de hexanos: acetato de etilo 3:1) para proporcionar producto en forma de un aceite amarillo, 1,34 q, 70,3%.

\newpage

^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta : 1,22 (t, 3H), 3,88 (s, 3H), 3,94 (dd, IH), 4,21 (m, 3H),4,56 ( s, 2 H), 4,75 (dd, 1 H), 5,20 (S, 2 H), 6,40 (d, 1 H), 6,81 (d, 1H), 7,02-7,34 (m, 7H).

D. Preparación de 2-[4-metoxi-1-fenilmetil indol-3-il]-3-hidroxipropionato de etilo

A una solución agitada del producto procedente del apartado C (0,33 g) en acetato de etilo (50 mL) se añadió Pd/C al 5% (0,17 g) y 1mL de ácido clorhídrico 1N. La mezcla de reacción se agitó bajo ca. de 1 atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se filtró, neutralizó con solución de bicarbonato de sodio, y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó con sulfato de sodio y se concentró a vacío para proporcionar producto, 0,23g, 89%, en forma de un aceite amarillo.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 1,21 (t, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,92 (dd, 1H), 4,20 (m, 3H), 4,44 (dd, IH), 5,21 (s, 2H), 6,43 (d, 1H), 6,84 (d, 1H), 6,98 (s, IH), 7,00 (m, 3H), 7,30 (m, 3H).

E. Preparación de 2-[4-metoxi-1-fenilmetilindol-3-il]-3-metoxipropionato de etilo

A una solución agitada del producto procedente del apartado D (0,26 g, 0,74 mmol) en 18 ml de tetrahidrofurano se añadió lentamente a -75ºC hexametildisilil azida de potasio (1,63 ml, en tolueno 0,5 M, 0,815 mmol) Pd/C al 5% (0,17 g) y 1mL de ácido clorhídrico 1N. Se añadió a la mezcla de reacción iodometil metil éter (0,13 ml, 1.48 mmol) a -75ºC. La mezcla de reacción se diluyo con salmuera, y acetato de etilo tras 15 minutos a -75ºC. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna para proporcionar producto, 0,23 g, 79,3%, en forma de un aceite amarillo.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 1,21 (t, 3H), 3,35 (s, 3H), 3,91 (s, 3H), 9,95 (m, 2H), 4,22 (q, 2H), 4,65 (s 2H), 4,72 (dd, 1H), 5,21 (s, 2H), 6,41 (d, 1H), 6,82 (d, 1H), 7,04 (m, 4H), 7,24 (m, 3H).

F. Preparación de 4-4-dihidro-4-etoxicarbonil-metoxi-9-fenilmetilpirano[3,4-b]indol

A una solución agitada de trifluoruro eterato de boro (0,071 ml, 0,55 mmol) en 18 ml de diclorometano se le añadió lentamente una solución del producto procedente del Apartado E (148 mg, 0,37 mmol) en diclorometano (4 ml) a 0-5ºC. Se dejó calentar la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente, y se agitó durante 0,5 horas hasta completar la reacción. La mezcla de reacción se diluyo con, acetato de etilo y salmuera. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se cromatografió sobre sílica gel (mezcla de hexanos: éter etílico 1:1) para proporcionar producto, 49,3 mg, 36,2%, en forma de un sólido blanco.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 1,21 (t, 3H), 3,88 (s, 3H), 4,05 (dd, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,24 (m, 3H), 4,60 (d 1H), 4,78 (d, 1H), 5,04 (d, 1H), 5,18 (d, 1H), 6,44 (d, 1H), 6,82 (d, 1H), 7,01 (m, 4H), 7,22 (m, 3H).

G. Preparación de 3,4-dihidro-4-carboxiamida-5-metoxi-9-fenilmetilpirano[3,4-b] indol

Se añadió a una solución del producto procedente del apartado F (490 mg, 1,34 mmol) en benceno (60-80 mL) amida de metilcloroaluminio recientemente preparada (0,67 M, 60 ml, 40 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 50ºC durante 24 horas, se enfrió, se descompuso mediante la adición de ácido clorhídrico 1N, y se diluyó con acetato de etilo y salmuera. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre silica gel eluyendo con un gradiente diclorometano/ metanol 1-2% para proporcionar producto, 335mg, 74.6%. MS FIA 337,2 (M+l)

Análisis para C_{20}H_{20}N_{2}O_{3}:

Calculado: C, 71,41; H, 5,99; N, 8,33

Encontrado: C, 71,51; H, 6,19; N, 8,26

Ejemplo 8 Preparación del ácido 2-[(9-bencil-4-carbamoil-1,2,3,4-tetrahidrobeta-carbolin-5-il)oxi]acético A. Preparación de 4-(tertbutildimetilsilil)oxiindol

Se añadió imidazol (15,3 g, 225 mmol) a una solución de 4-hidroxiindol (20 g, 150 mmol) en 300 mL de cloruro de metileno anhidro a temperatura ambiente. La mezcla resultante se trató con cloruro de tert-butildimetilsilil (25 g, 165 mmol). Tras agitación durante toda la noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió sobre 300 ml de agua. La capas se separaron, y la fase acuosa se extrajo con metileno (2 X 100 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a vacío para dar una aceite negro. El residuo crudo se purificó sobre Prep 500 (silica gel/ acetato de etilo /mezcla de hexanos; 0% a 5%) para proporcionar el compuesto titular en forma de un sólido ceroso púrpura claro sólido con rendimiento cuantitativo. MS (ion spray, NH_{4}OAc) m/e [M+1]^{+} 248, [M-1]^{-} 246.

Análisis elemental para C_{14}H_{21}NOSi:

Calculado: C, 67,96; H, 8,55; N, 5,66

Encontrado: C, 69,10; H, 8,79; N, 5,70

B. Preparación de ácido etil [4-(tert-H-butildimetilsilil)oxiindol)-3-acético

Se enfrió hasta -10ºC una solución de indol (78) (247 mg, 1,00 mmol) en tetrahidrofurano seco (2 mL) bajo atmósfera de nitrógeno, a continuación, se añadió gota a gota n-butil litio (0,625 mL, 1,00 mmol), 1,6 M en mezcla de hexanos durante 30 sec mediante una jeringuilla. La solución resultante se agitó 15 minutos y se añadió cloruro de zinc (1,0 mL, 1,0 mmol), en éter 1M todo de una vez. La solución se agitó 2 horas mientras se calentaba hasta temperatura ambiente. Se añadió iodoacetato de etilo (0,118 mL, 1,00 mmol) a esta solución todo de una vez. La mezcla de reacción se oscureció, pero permaneció clara. La mezcla se agitó 3 horas a temperatura ambiente y se concentró a vacío. El residuo se purificó directamente sobre silica gel (columna de 30 X 35 mm) eluyendo con cloruro de metileno. La concentración de las fracciones apropiadas produjo 192 mg (57.8%) del producto titular en forma de un sólido blanco.

MS (ion spray, NH_{4}OAc) m/e [M+l)^{+} 334, [M-1]^{-} 332.

Análisis elemental para C_{18}H_{27}NO_{3}Si:

Calculado: C, 64,86; H, 8,11; N, 4,20

Encontrado: C, 65,11; H, 8,02; N, 4,24

C. Preparación del ácido etil [2,9-bis-bencil-5-(tert-butildimetilsilil)oxi-1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolin]-4 acético

Se enfrió hasta -78ºC una solución del éster (79) (5,08 g, 15,2 mmol) en tetrahidrofurano seco (100 ml), a continuación se trató gota a gota con bis (trimetilsilil) amida de potasio 0,5 M en tolueno (32 mL, 16 mmol). La solución resultante se agitó 10 min, a continuación se añadió todo de una vez ioduro de bencilo (3,329, 15,2 mmol). Se retiró el baño refrigerante, la mezcla se calentaron rápidamente hasta 0ºC, a continuación lentamente hasta a temperatura ambiente. Tras agitación durante 75 minutes a temperatura ambiente, la mezcla se concentró a vacío. El residuo se capturó en éter y se lavó veces sucesivas con 10% ácido cítrico acuoso, agua y solución saturada de bicarbonato de sodio. La solución etérea se secó con sulfato de magnesio y se concentró a vacío. El residuo se purificó sobre silica gel (columna de 70 X 130 mm) eluyendo con 500 ml cloruro de metileno /mezcla de hexanos 1:1, y a continuación con 500 mL de cloruro de metileno. Se combinaron las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron a vacío para producir 5.90 g (91%) de ácido etil (1bencil-4-(tert-butildimetilsilil)oxiindol-3-acético en forma de un aceite marrón. Se combinaron y se calentaron a reflujo bencilamina (2,14 g, 20,0 mmol) y paraformaldehido (1,80 g, 120 mmol) en metanol anhidro (10 ml) durante 2 horas. La mezcla se concentró a vacío y se secó bajo vacío durante 30 minutes para producir bencil bis(metoximetil)amina cruda en forma de un aceite acuoso blanco. Este material se usó inmediatamente sin posterior purificación. A una solución fría de ácido etil (1-bencil-4-(tert-butildimetilsilil)oxiindol]-3-acético (190 mg, 0,45 mmol) en tetrahidrofurano seco (2 ml) se añadió bis(trimetilsilil) amida de potasio (0,98 ml, 0,49 mmol), 0,5 M en tolueno, gota a gota mediante una jeringuilla. Tras agitación de la mezcla durante 10 minutos, se añadió cloruro de trimetilsililo (0,057 mL, 0,45 mmol) todo de una vez. La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente, a continuación se concentró a vacío. El residuo se secó en 30 minutos bajo vacío para producir el acetal trimetilsilil ceteno (81). El acetal ceteno residual (81) se disolvió inmediatamente en cloruro de metileno (30 ml) al que se añadió bencil bis(metoximetil) amina recientemente preparada (175 mg, 0,90 mmol). La mezcla se enfrió hasta -78ºC y se trató con cloruro de zinc 1 M en éter (0,9 ml, 0,9 mmol). La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 45 minutos más. La mezcla se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio, a continuación se hizo pasar a través de un tapón de silica gel eluyendo con 1:4 acetato de etilo /hexano. se combinaron las fracciones deseadas y se concentraron a vacío, a continuación se purificó adicionalmente mediante un cartucho SCX (1g, Varian) con metanol y amonio. Las fracciones deseadas se combinaron, se concentraron y se purificaron sobre silica gel eluyendo con cloruro de metileno para producir 34 mg (14%) del indol tricíclico titular. MS (ion spray, NH_{4}OAc) m/e [M+l]^{+} 555.

Análisis elemental para C_{34}H_{42}N_{2}O_{3}Si:

Calculado: C, 73,64; H, 7,58; N, 5,05

Encontrado: C, 73,42; H, 7,61; N, 5,15

D. Preparación de ácido etil 2-[(2,9-bis-bencil-4-carbamoil-1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolin-5-il)oxi]acético

Se trató un solución de 565 mg (1,02 mmol) del compuesto procedente del Apartado C en 10 mL 1:1 metanol /tetrahidrofurano con 5 mL (5 mmol) hidróxido de litio 1N bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calentó brevemente, se dejó con agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, a continuación se concentró a vacío a hasta aproximadamente 5 mL. El pH de la solución se ajustó hasta \sim5 a 6 con ácido clorhídrico 1N. El precipitado resultante se recogió y se secó para producir 430 mg (102%) del hidroxiácido. Este producto se suspendió en hidroxibenzotriazol (160 mg, 1.19 mmol) y clorhidrato de 1-(3dimetiloaminopropil)-3-etilocarbodiimida (940 mg, 2,30 mmol) en 30 ml de tetrahidrofurano/ cloruro de metileno 1:1. La mezcla se agitó vigorosamente durante 10 minutos, se saturó con amonio gaseoso, se agitó vigorosamente durante 1 hora, a continuación se concentró a vacío. El residuo se sometió a reparto entre acetato de etilo y solución saturada de bicarbonato de sodio. La solución de acetato de etilo se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró a vacío. El residuo se hizo pasar a través de un tapón de silica gel con acetato de etilo. El eluyente se evaporó para producir 175 mg (43%) de la carboxiamida.

Este compuesto se disolvió en 3 ml de tetrahidrofurano seco, se enfrió hasta -70ºC y se trató con bis (trimetilsilil)amida de potasio 0,5 M en tolueno (0,85 mL, 0,425 mmol). La solución se agitó 10 min, a continuación se añadió bromoacetato de etilo todo de una vez. La reacción se agitó 6 horas mientras se calentaba hasta temperatura ambiente. La mezcla se concentró a vacío y el residuo se purificó sobre silica gel eluyendo con acetato de etilo para producir 86 mg (41%) del compuesto titular. MS (ion spray, NH_{4}OAc) m/e [M+1]^{+}. 498.

Análisis elemental para C_{30}H_{31}N_{3}O_{4}:

Calculado: C, 72,43; H, 6,24; N, 8,45

Encontrado: C, 72,54; H, 6,36; N, 8,64

E. Preparación del ácido 2-[(2,9-bis-bencil-4-carbamoil-1,2,3,4tetrahidro-beta-carbol-5-il)oxi]acético

Se agitó una solución del compuesto procedente del apartado D (78 mg, 0,16 mmol) en 2 mL tetrahidrofurano /metanol 1:1 con hidróxido de litio 1M (0,63 mL, 0,63 mmol) durante 3 horas. La mezcla se concentró a vacío para proporcionar un sólido blanco. El sólido se suspendió en 2 mL de agua y se ajustó el pH hasta 5 a 6 con ácido clorhídrico 1N formando un sólido blanco ligeramente distinto. El nuevo sólido se recogió mediante filtración y se secó bajo vacío para producir 68 mg (93%) del compuesto titular. MS (ion spray, NH_{4}OAc) m/e [M+1]^{+} 470.

Análisis elemental para C_{25}H_{27}N_{3}O_{4} \cdot 0,8 H_{2}O:

Calculado: C, 69,49; H, 5,96; N, 8,68

Encontrado: C, 69,50; H, 5,64; N, 8,54

F. Preparación de clorhidrato del ácido 2-[(9-bencil-4-carbamoil-1-,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolin-5-il)oxi]acético

Se trató una suspensión del compuesto procedente del apartado C (68 mg, 0,14 mmol) con 3-4 gotas de HCl 1N para realizar la solución. A esta solución se añadió paladio en carbono 10% (70 mg). El recipiente se purgó apropiadamente con nitrógeno e hidrógeno, a continuación se agitó bajo atmósfera de hidrógeno durante 18 h. La mezcla se filtró y los sólidos se lavaron abundantemente con metanol. El filtrado se concentró a vacío para producir una mezcla de ácido y metil éster. La mezcla se trató con LiOH acuoso 1N (0,3 ml) en aproximadamente 2 mL de metanol durante 2 h. La mezcla se concentró a vacío y el residuo se acidificó hasta pH=5 con HCl 1N causado la formación de un precipitado. El precipitado se recogió mediante filtración. El filtrado se concentró a vacío para dejar un residuo. El sólido recogido y el residuo se purificaron mediante cromatografía en fase reversa para producir 31 mg (68%) del compuesto titularen forma de la sal de HCl MS (ion spray) m/e [M+1]^{+} 380. IR (KBr, cm^{-1}) 3393 (br), 3100-2500 (COOH), 1735, 1671, 1638, 1615, 1445, 1263, 1133, 731, 722.

Uso terapéutico de los compuestos tricíclicos

Se cree que los compuestos descritos en la presente invención realizan su acción terapéutica beneficios principalmente mediante la inhibición directa de la sPLA2 humana, y no ejerciendo de antagonistas de ácido araquidónico, ni de otros agentes activos por debajo del ácido araquidónico en la cascada del ácido araquidónico, tales como 5-lipoxigenasas, ciclooxigenasas, etc.

El procedimiento de la invención para inhibir la emisión de ácidos grasos controlada por sPLA_{2} comprende la puesta en contacto de sPLA_{2} con una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de fórmula (I) o su sal.

Los compuestos de la invención pueden usarse en un procedimiento para tratar un mamífero (por ejemplo, un ser humano) para aliviar los efectos patológicos de shock séptico, síndrome del estrés respiratorio en adultos, pancreatitis, trauma, bronquial asma, rinitis alérgica, y artritis reumatoide; en el que el procedimiento de la presente invención comprende administrar al mamífero un compuesto de fórmula (1) en una cantidad terapéuticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para inhibir la liberación de ácidos grasos mediada por sPLA_{2} y para de esta forma inhibir o prevenir y sus productos perjudiciales. La cantidad terapéutica de compuesto de la invención necesario para inhibir sPLA_{2} puede determinarse rápidamente tomando una muestra de fluido corporal y analizando su en sPLA_{2} mediante procedimientos convencionales.

En todo este documento, la persona o animal a tratar se describirán como un "a mamífero", y deberá entenderse que el sujeto más preferido es un ser humano. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el estudio de dolencias adversas del sistema nervioso central de los animales no humanos está en sus inicios, y que en algunos casos tales tratamientos se están comenzando a usar. De acuerdo con esto, se contempla el uso de los presentes compuestos en animales no humanos. Deberá entenderse que los intervalos de dosificación para otros animales serán necesariamente bastante diferentes de las dosis administradas a los seres humanos, y de acuerdo con ello, deberá recalcularse el rango de dosificación descrito. Por ejemplo, un perro pequeño puede tener la décima parte de tamaño de un ser humano típico, y por tanto será necesario usar una dosis mucho más pequeña. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva para un determinado animal no humano se realiza de la misma forma descrita más adelante para el caso de los humanos, y los veterinarios están bien acostumbrados a realizar tales determinaciones.

Formulaciones farmacéuticas de la invención

Como se ha indicado anteriormente, los compuestos de esta invención son útiles para inhibir la liberación de ácidos grasos mediada por sPLA_{2} tales como ácido araquidónico. Por el término "inhibir" debe entenderse la prevención o reducción terapéuticamente significativa en la liberación de ácidos grasos mediada por sPLA_{2} mediante los compuestos de la invención. Por "farmacéuticamente aceptable" debe entenderse el vehículo, diluyente o excipiente compatible con el resto de los ingredientes de la formulación y no contraproducentes para el paciente.

En general, los compuestos de la invención se administran de la forma más deseables a una dosis que consiga generalmente resultados eficaces sin causar ningún efecto secundario serio, o si se desea, la dosificación puede dividirse en subunidades convenientes administradas en los tiempos deseables a lo largo del día.

La dosis específica de un compuesto administrado de acuerdo con esta invención para obtener efectos terapéuticos o profilácticos estará, por supuesto, determinada por las circunstancias particulares que rodeen el caso, incluyendo, por ejemplo, la ruta de administración, la edad, peso y respuesta del paciente individual, la dolencia a tratar y la severidad de los síntomas del paciente. Las dosis diarias típicas contendrán un nivel de dosificación no toxico desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta 50 mg/kg de peso corporal de compuesto activo de esta invención.

Preferiblemente la formulación farmacéutica es en forma de dosis unitaria. La forma de dosis unitaria puede ser una cápsula o comprimido por sí mismo, o un número diario adecuado de estas. La cantidad de ingrediente activo en una dosis unidad de la composición puede variarse o ajustarse entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 miligramos o más de acuerdo con el tratamiento particular implicado. Puede apreciarse que puede ser necesario realizar variaciones rutinarias de la dosificación dependiendo de la edad y dolencia del paciente. la dosificación también dependerá de la ruta de administración.

Una dolencia "crónica" se refiere a una dolencia deteriorante de progreso lento y larga duración. Como tales, se tratan cuando se diagnostican y se continúa durante todo el curso de la enfermedad. Una dolencia "aguda" es una exacerbación de corta duración seguida por un periodo de remisión. En un episodio agudo, se administra el compuesto al inicio de los síntomas y se interrumpe cuando los síntomas desaparecen.

Pancreatitis, shock inducido por trauma, asma bronquial, rinitis alérgica y artritis reumatoide pueden producirse en forma de un episodio agudo o crónico. Así, el tratamiento de estas dolencias contempla tanto la forma aguda como la crónica. Shock séptico y síndrome de dificultad respiratoria en el adulto, por otra parte, son dolencias agudas que se tratan cuando se diagnostican.

El compuesto puede administrarse por diferentes rutas, entre las que se incluyen las rutas oral, aerosol, rectal, transdermal, subcutánea, intravenosa, intramuscular, e intranasal. Las formulaciones Farmacéuticas de la invención se preparan combinando (por ejemplo, mezclando) una cantidad terapéuticamente efectiva de los compuestos de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente adecuado para lo mismo. Las presentes formulaciones farmacéutica se preparan mediante procedimientos conocidos usando ingredientes bien conocidos y rápidamente disponibles.

Para fabricar las composiciones de la presente invención, el ingrediente activo se mezclará usualmente con un vehículo, o se diluirá mediante un vehículo, o se encerrará en el interior de un vehículo que puede estar en la forma de una cápsula, saquito, papelillo u otro contenedor. Cuando el vehículo actúa como diluyente, puede ser un material sólido, semi-sólido o liquido que actúa como un vehículo, o puede estar en la forma de comprimidos, píldoras, polvos, grageas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (con un medio sólido o liquido), o ungüentos, conteniendo, por ejemplo, hasta un 10% en peso del compuesto activo. Los compuestos de la presente invención se formulan preferiblemente antes de su administración.

Puede usarse cualquier vehículo adecuado conocido en la técnica para las formulaciones farmacéutica. En tales formulaciones, el vehículo puede ser un sólido, liquido, o mezcla de un sólido y un liquide Las formulaciones sólidas incluyen polvos, comprimidos y cápsulas. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes suspensores, ligantes, agentes desintegrantes de comprimidos y material encapsulante.

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Los comprimidos para administración oral pueden contener excipientes adecuados tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio, junto con agentes desintegrantes, tales como maíz, almidón, o ácido algínico, y/o agentes ligantes, por ejemplo, gelatina o acacia, y agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

En polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que se mezcla con el ingrediente activo finamente dividido. En comprimidos, el ingrediente activo se mezcla con un vehículo teniendo las necesarias propiedades ligantes en las proporciones adecuadas, y se compacta con el tamaño y forma deseados. Los polvos y comprimidos, preferiblemente, contienen entre aproximadamente 1 a aproximadamente 99 por ciento en peso del ingrediente activo, que es el compuesto nuevo de esta invención. vehículos sólido Adecuado son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metil celulosa, carboximetil celulosa sódica, ceras de bajo punto de fusión y manteca de cacao.

Las formulaciones en forma de líquidos estériles incluyen suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires.

El ingrediente activo puede disolverse o suspenderse en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tales como agua estéril, solvente orgánico estéril o una mezcla de ambos. El ingrediente activo puede disolverse a menudo en un solvente orgánico adecuado, por ejemplo propilén glicol acuoso. Pueden fabricarse otras composiciones dispersando el ingrediente activo finamente dividido en almidón acuoso o solución de carboximetil celulosa sódica, o en un aceite adecuado.

"Ingrediente activo" se refiere a un compuesto de acuerdo con Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato adecuado para lo mismo.

Formulación 1

Se preparan cápsulas de gelatina dura usando los siguientes ingredientes:

	Cantidad (mg/cápsula)
Ácido 2-[4-oxo-5-carboxiamida-9-(4metilobencilo)-9H-pirido [3,4b]
indolil]acético	250
Almidón, seco	200
Estearato de magnesio	10
Total	\overline{460}	mg

Formulación 2

Se preparan comprimidos usando los siguientes ingredientes:

	Cantidad
	(mg/comprimido)
Ácido 2-[4-oxo-5-carboxiamida-9-(4-trifluorometilbencil)-9H-pirido
[3,4b]indolil]acético	250
Celulosa, microcristalina	400
Dióxido de silicio, pirolizado	10
Ácido esteárico	5
Total	\overline{460}	mg

Los componentes se mezclan y comprimen para formar comprimidos, pesando 665 mg cada uno

Formulación 3

Se prepara una solución para aerosol conteniendo los siguientes ingredientes:

	Peso
Ácido 2-[4-oxo-5-carboxiamida-9-(3-benzoilbencilo)-9H-pirido [3,4b] indolil]acético	0,25
Etanol	25,75
Propelente 22 (Clorodifluorometano)	74,00
Total	\overline{100,00}

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El compuesto activo se mezcla con etanol, y se añade la mezcla a una porción del propelente 22, se enfría hasta -30ºC y se transfiere a un dispositivo de relleno. Se alimenta entonces la cantidad requerida a un contenedor de acero inoxidable y se diluye con el resto del propelente. Entonces, el contenedor se equipa con la unidad de válvula.

Formulación 4

Se preparan comprimidos. Conteniendo 60 mg de ingrediente activo cada uno.

	Cantidad (mg/cápsula)
Ácido 2-[4-oxo-5-carboxiamida-9-(2,4,6-trifluorobencil)-9H-pirido [3,4-b]
indolil] acético	60,0	mg
Almidón	45,0	mg
celulosa microcristalina	35,0	mg
Polivinilpirrolidona (como solución al 10% en agua)	4,0	mg
carboximetil almidón sódico	4,5	mg
estearato de magnesio	0,5	mg
Talco	1,0	mg
Total	\overline{150,0}	mg

El ingrediente activo, almidón y celulosa se hacen pasar a través de un tamiz con malla USA 45 y se mezclan completamente. Se mezcla la solución acuosa conteniendo polivinilpirrolidona con el polvo resultante, y la mezcla a continuación se hacen pasar a través de un tamiz con malla USA 14. Los gránulos así producidos se secan a 50ºC y se hacen pasar a través de un tamiz con malla USA 18. El carboximetil almidón sódico, estearato de magnesio y talco, previamente tamizados a través de un tamiz con malla USA 60 se añaden a continuación a los gránulos, que tras la mezcla, se comprimen en una empastilladora para producir comprimidos, pesando cada uno 150 mg.

Formulación 5

Se preparan cápsulas de la forma siguiente, conteniendo cada una 80 mg de ingrediente activo.

Ácido 2-[4-oxo-5-carboxiamida-9-(2fluorobencilo)-9H-pirido [3,4b]indolil]
acético tetrahidrocarbazol-4-carboxiamida	80	mg
Almidón,	59	mg
Celulosa microcristalina	59	mg
Estearato de magnesio	2	mg
Total	\overline{460}	mg

El ingrediente activo, celulosa, almidón, y estearato de magnesio se combinan, se hacen pasar a través de un tamiz con malla USA 45 tamiz con malla USA, y se rellenan cápsulas de gelatina dura, en cantidades de 200 mg.

Formulación 6

Se preparan supositorios de la forma siguiente, conteniendo cada uno 225 mg de ingrediente activo:

Ácido 2-[4-oxo-5-carboxiamida-9pentafluorobencilo-9H-pirido(3,4b]indolil]acético	225	mg
Glicéridos de ácido graso saturado	2.000	mg
Total	\overline{\text{2.225}}	mg

Se hace pasar el ingrediente activo a través de un tamiz con malla USA 60 y se suspende en los glicéridos de ácido graso saturado, fundidos previamente usando la mínima cantidad de calor necesaria. A continuación se vierte la mezcla en un molde para supositorios de 2 g de capacidad nominal, y se deja enfriar.

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Formulación 7

Se preparan de la manera siguiente suspensiones, conteniendo cada uno 50 mg de ingrediente activo por dosis de 5 m:

Ácido 2-[4-oxo-5-carboxiamida-9-(3,4,5-trimetoxibencil)-9H-pirido[3,4b]	50	mg
indolil] acético
Carboximetil celulosa sódica	50	mg
Jarabe	1,25	ml
Solución de ácido benzoico	0,10	ml q.v.
Aroma y sabor		q.v.
Color		q.v.
Agua purificada hasta completar	5	ml

Se hace pasar el ingrediente activo a través de un tamiz con malla USA. 45 y se mezcla con la carboximetil celulosa de sodio y jarabe para formar una pasta suave. La solución de ácido benzoico, aroma y sabor y color se diluyen con una porción del agua y se añaden con agitación. A continuación se añade suficiente agua para producir el volumen requerido.

Formulación 8

Se prepara una formulación intravenosa como sigue:

Ácido 2-[4-oxo-5-carboxiamida-9-(3,5-difluorobencil)-9H-pirido[3,4b]indolil]acético	100	mg
Solución salina isotónica	1,000	ml

La solución con los ingredientes se administra generalmente de forma intravenosa a un caudal de 1 ml por minuto.

Experimentos de ensayo Ensayo Ejemplo 1

Se usó el siguiente procedimiento de ensayo cromogénico para identificar y evaluar inhibidores de la fosfolipasa A2 secretada humana recombinante. El ensayo descrito en la presente invención se adaptó para ensayos de cribado de alto volumen usando placas de microvaloración de 96 pocillos. Se encuentra una descripción general de este procedimiento de ensayo en el artículo "Analysis de Human Synovial Fluid Phospholipase A_{2} on Short Chain Phosphatidilcholine- Mixed Micelles: Development of a Spectrophotometric Assay Suitable for a Microtiterplate Reader", de Laure J. Reynolds, Lori L. Hughes, y Edward A Dennis, Analytical Biochemistry, 204, pp. 190-197, 1992 (la descripción del cual se incorpora en la presente invención como referencia):

Reactivos

TAMPÓN DE REACTION

CaCl_{2} \cdot 2 H_{2}O (1,47 g/L)

KCl (7,455 g/L)

Albúmina de suero bovino (libre de ácidos grasos) (1 g/l)

(Sigma A-7030, producto de Sigma Chemical Co,

St, Louis MO, USA)

TRIS HCl (3,94 g/l)

pH 7,5 (ajustado con NaOH)

TAMPON DE ENZIMA

0,05 NaOAc \cdot, 3 H_{2}O, pH 4,5

0,2 NaCl

pH ajustado a 4,5 con ácido acético

DTNB - ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico

DIHEPTANOIL TIO - PC RACÉMICO

1,2-bis(heptanoiltio)-1,2-dideoxi-sn

glicero-3-fosforilcolina racémica

TRITON X-100^{TM} preparado a 6,249 mg/ml en

tampón de reacción para igualar 10 \muM

TRITON X-IOO^{TM} es un detergente polioxietilenado no iónico suministrado por Pierce Chemical Company,

3747 N. Meridian Road, Rockparad, Illinois 61101.

Mezcla de reacción

Un volumen medido de difeptanoil tio PC racémico suministrado en cloroformo a una concentración de 100 mg/ml se lleva a sequedad y se redisolvió en la solución acuosa de detergente no iónico TRITON X-I00^{TM} 10 milimolar. se añadió a la solución el Tampón de reacción, y a continuación DTNB para conseguir la mezcla de reacción.

La mezcla de reacción así obtenida contiene difeptanoil tio PC racémico 1 mM, detergente Triton X-I00^{TM} 0,29 mm, y DTMB 0,12 mm en una solución acuosa tamponada a pH 7,5.

Procedimiento de ensayo

1. Añadir 0,2 ml de mezcla de reacción a todos los pocillos;

2. Añadir 10 \mul de compuesto de ensayo (o solvente blanco) a los pocillos apropiados, mezclar 20 segundos;

3. Añadir 50 nanogramos de sPLA_{2} (10 microlitros) a los pocillos apropiados;

4. Incubar la placa a 40ºC durante 30 minutos;

5. Leer la absorbancia de los pocillos a 405 nanómetros con un lector automático de placas.

Todos los compuestos se ensayaron por triplicado. Típicamente, los compuestos se ensayaron a una concentración final de 5 \mug/ml. Se consideró que los compuestos eran activos cuando presentaban una inhibición del 40% o superior en comparación con las reacciones de control no inhibidas, cuando se realizaba la medida a 405 nanómetros. La falta de aparición de color a 405 nanómetros evidenció la inhibición. Los compuestos que se encontraron inicialmente activos se volvieron a ensayar para confirmar su actividad y, si resultaba suficientemente activo, se determinaban los valores de IC_{50}. Típicamente, los valores de IC_{50} se determinaron diluyendo el compuesto de ensayo dos veces de forma que la concentración final en la reacción estuvo entre 45 \mug/mL y 0,35 \mug/ml. Los inhibidores más potentes requirieron diluciones significativamente mayores. En todos los casos, se determinó el % de inhibición medida a 405 nanómetros generado por las reacciones enzimáticas conteniendo inhibidores comparado con las reacciones de control no inhibidas. Cada muestra se valoró por triplicado y los valores resultantes se promediaron para representación y cálculo de los valores de IC_{50}. Los valores de IC_{50} se determinaron representando el logaritmo de la concentración frente a los valores de inhibición en el intervalo entre 10 y 90% de inhibición.

Los compuestos de la presente invención (Ejemplos 1-8) se ensayaron en el Ensayo Ejemplo 1 y resultaron efectivos a concentraciones inferiores a 100 \muM.

Ensayo Ejemplo 2 Procedimiento

Se sacrificaron cobayas macho raza Hartley (500-700 g) mediante dislocación cervical, y se extrajeron intactos su corazón y pulmones, que se guardaron en tampón Krebs aireado (95% 02:5% C02) buffer. Se diseccionaron tiras dorsales de la pleura (4 x 1 x 25 mm) de los segmentos intactos del parénquima (8 x 4 x 25 mm) cortados paralelos al extremo exterior de los lóbulos pulmonares inferiores. Se ligaron en los correspondientes extremos dos tiras pleurales adyacentes, obtenidas de un único lóbulo y representando una única muestra de tejido, e independientemente unidas a un rodillo de soporte metálico. Uno de los rodillos estaba unido a un transductor fuerza - desplazamiento Grass Modelo FT03C, producto de Grass Medical Instruments Co., Quincy, MA, USA). Los cambios en la tensión isométrica se mostraron en un monitor y registrador térmico (producto de Modular Instruments, Malvern, PA). Todos los tejidos se situaron en bajos encamisados para tejidos de 10 ml, mantenidos a 37ºC. Los baños de tejido estuvieron aireados continuamente y contenían solución modificada de Krebs con la siguiente composición (milimolar) NaCl, 118.2; KC1, 4.6; CaC12.2H20, 2.5; MgS04.7H20, 1.2; NaHC03, 24.8; KH2P04, 1.0; y dextrosa, 10.0. Se emplearon tiras Pleurales procedentes del lóbulo pulmonar opuesto para un experimento parejo. Los datos preliminares generados a partir de las curvas tensión /respuesta demostraron que la tensión de descanso de 800 mg era óptima. Se dejó equilibrar los tejidos durante 45 min, a la vez que el fluido del baño se cambiaba periódicamente.

Curvas acumulativas concentración - respuesta

Inicialmente, los tejidos se excitaron 3 veces con KCl (40 rnM) para ensayar la viabilidad tisular y para obtener una respuesta consistente. Tras registrar la máxima respuesta al KCl, los tejidos se lavaron y se les dejó retornar a la línea base antes de la siguiente prueba. Se obtuvieron las curves acumulativas tensión - concentración a partir de las tiras pleurales incrementando la concentración de agonista (sPLA2) en el bajo de tejido en incrementos semilogarítmicos (10) mientras la concentración anterior permanecía en contacto con los tejidos (Ref. I, supra.). la concentración de Agonista se incrementaba tras alcanzar la meseta de contracción excitada por la concentración precedente. Se obtuvo una curva concentración - respuesta a partir de cada tejido. Para minimizar la variabilidad entre tejidos obtenidos de diferentes animales, las respuestas contráctiles se expresaron como porcentaje de la respuesta máxima obtenida con la prueba final del KCl. Al estudiar los efectos de diferentes fármacos sobre los efectos contráctiles de sPLA_{2}, se añadieron los compuestos y sus vehículos respectivos a los tejidos 30 minutos antes de comenzar las curvas concentración - respuesta del sPLA_{2}.

Análisis estadístico

Los datos de los distintos experimentos se calcularon y presentaron en f como porcentaje de la respuesta máxima obtenida con KCl (media \pm D.E.). Para estimar el desplazamiento hacia la derecha inducido por el fármaco en las curvas concentración - respuesta, las curvas se analizaron mediante procedimientos de modelado estadístico no linear similares a los que describe Waud (1976), Equation 26, p. 163, (Ref.2). El modelo incluye cuatro parámetros: la máxima respuesta del tejido, que se asumió la misma para cada curva, el EC50 para la curva de control, la pendiente de las curvas y el pA_{2}, la concentración de antagonista que requiere un incremento doble de agonista para alcanzar una respuesta similar. Se determinó que la pendiente de Schild era 1, procedimientos de modelado estadístico no linear similares a los que describe Waud (1976), Equation 27, p. 164 (Ref. 2). La pendiente de Schild igual a 1 indica que el modelo es consistente con la hipótesis de un antagonista competitivo, sin embargo, la pA2 puede interpretarse como la KB aparente, la constante de disociación del inhibidor.

Para estimar la supresión de las respuestas máximas inducidas por el fármaco, se determinaron las respuestas de sPLA_{2} (10 \mug/ml) en la ausencia y presencia del fármaco, y se calculo la supresión porcentual para cada pareja de tejidos. Los ejemplos representativos de las actividades inhibitorias se presentan en la Tabla 2, a continuación.

Ref. 1 - Van, J.M.: Cumulative dose-response curves. II. Technique for the making de dose-response curves en isolated organs y the evaluation de drug parameters. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., 143: 299-330, 1963.

Ref. 2 - Waud, D.: Analysis de dose-response relationships. en Advances in General and Cellular Pharmacology eds Narahashi, Bianchi 1:145-178, 1976.

Los compuestos de la presente invención (Ejemplos 1-19) se ensayaron en el Ensayo Ejemplo 2 y se encontraron efectivos a concentraciones inferiores a 20 \muM.

Ensayo Ejemplo 3 Ensayo sPLA2 con ratones transgénicos Materiales y procedimientos

Los ratones utilizados en estos estudios fueron ratones transgénicos maduros, de entre 6-8 meses de edad, estimulados con ZnSO_{4}, hemizigóticos de la línea 2608a (Fox et. al. 1996). Los ratones transgénicos de esta línea expresan la sPLA2 humana en el hígado y otros tejidos, y alcanzan típicamente niveles de sPLA2 humana en su circulación de aproximadamente 173 + 10 ng/ml cuando se estimulan al máximo con ZnSO_{4} (Fox, et al. 1996). Los ratones fueron alojados bajo temperatura y humedad constante y recibieron comida y agua a voluntad. La iluminación en el animalario se mantuvo con un ciclo luz / oscuridad de 12 horas, y todos los experimentos se realizaron a la misma hora del día, al principio del periodo de luz.

Para el ensayo intravenoso, se administraron compuestos o placebos en forma de bolo IV mediante la vena de la cola con un volumen de 0,15 ml- El placebo consistió en dimetilosulfoxido al 1-5%, etanol al 1-5% y polietilén glicol 300 al 10-30%; en H_{2}O, las concentraciones de estos ingredientes se ajustaron de acuerdo con la solubilidad del compuesto. Los ratones se sangraron retroorbitalmente antes de la administración de la droga o placebo, así como 30 minutos, 2 y 4 horas posterior a esta. Se usaron entre tres y seis ratones para cada dosificación. La actividad catalítica de PLA2 en el suero se analizó con un ensayo de micela fosfatidilcolina / deoxicolina modificado (Fox, et al. 1996, Schadlich, et al., 1987) utilizando deoxicolato de sodio 3 mM y 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina 1 mM.

Para ensayo oral, los compuestos se disolvieron en etanol 1-5% / polietilen glicol 300 10-30% en H20 o se suspendieron en dextrosa al 5% en H_{2}O y se administraron mediante alimentación oral forzada. Se preparó suero a partir de sangre retroorbital y se ensayó buscando la actividad catalítica de PLA2, como anteriormente.

Referencias

Fox, N., M. Song, J. Schrementi, J. D. Sharp, D. L. White, D. W. Snyder, L. W. Hartley, D. G. Carlson, N. J. Bach, R. D. Dillard, S. C. Draheim, J. L. Bobbitt, L. Fisher y C. D. Mihelich. 1996.

Eur. J. Pharmacol. 308: 195.

Schadlich, H.R., M. Buchler, y H. G. Beger, 1987, J. Clin. Chem. Clin.

Biochem. 25, 505.

Los compuestos de la presente invención se ensayaron en el Ensayo Ejemplo 3 y se encontraron efectivos.

Claims (7)

1. un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por ácido (R,S)-(9-bencil-4-carbamoil-1-oxo-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il)oxiacético; ácido (R,S)-(9-bencil-4-carbamoil-3-tia-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-5-il) oxiacético; clorhidrato del ácido 2-(4-oxo-5-carboxiamida-9-bencil-9H-pirido [3,4b] indolil) acético; ácido [N-bencil-1-carbamoil-1-aza-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-8il] oxiacético; 4-metoxi-6-metoxicarbonil-10-fenilmetil-6,7,8,9-tetrahidropirido[1,2-a]indol; ácido (4-carboxamido-9-fenilmetil-4,5-dihidrotiopirano[3,4b]indol-5-il)oxiacético; 3,4-dihidro-4-carboxamidol-5-metoxi-9-fenilometilopirano[3,4-b]indol; ácido 2-[(9-bencil-4-carbamoil-1,2,3,4-tetrahidro-betacarbolin-5-il)oxi]acético, o un racemato, solvato, tautómero, isómero óptico, o sal farmacéuticamente aceptable adecuada del mismo.

2. Una formulación farmacéutica comprendiendo un compuesto como el que se reivindica en la Reivindicación 1 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente adecuado del mismo.

3. Una formulación farmacéutica adaptada para el tratamiento de una dolencia asociada con la inhibición de sPLA_{2}, conteniendo un compuesto como el que se reivindica en la Reivindicación 1 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente adecuado para lo mismo.

4. El uso de un compuesto que se reivindica en la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inhibir selectivamente sPLA_{2} en un mamífero.

5. El uso de Reivindicación 4 en el que dicho mamífero es un ser humano.

6. El uso de un compuesto como el que se reivindica en la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar artritis reumatoide, osteoartritis, accidente cerebrovascular, apoptosis, asma, bronquitis crónica, aguda bronquitis, fibrosis cística, enfermedad del intestino inflamatorio, o pancreatitis.

7. El uso de un compuesto como el que se reivindica en la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para aliviar los efectos patológicos de sepsis, shock séptico, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto, pancreatitis, shock inducido por trauma, asma bronquial, rinitis alérgica, artritis reumatoide, fibrosis cística, accidente cerebrovascular, bronquitis aguda, bronquitis crónica, bronquiolitis aguda, bronquiolitis crónica, osteoartritis, gota, espondilartropatris, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artropatía psoriática, espondilitis enterapátrica, artropatía Juvenil o espondilitis anquilosante juvenil, artropatía reactiva, artritis infecciosa o post-infecciosa, artritis gonocócica, artritis tuberculosa, artritis viral, artritis fúngica, artritis sifilítica, enfermedad de Lyme, artritis asociada con "síndromes vasculíticos", poliarteritis nodosa, vasculitis por hipersensibilidad, granulomatosis de Luegenec, polimialgina reumática, arteritis de las células de articulaciones, artropatris por deposición de cristales de calcio, pseudo gota, reumatismo no articular, bursitis, tenosinomitis, epicondilitis (codo de tenista), síndrome del túnel carpal, lesiones por uso repetitivo (mecanografía), formas misceláneas de artritis, enfermedad de las articulaciones neuropáticas (charco y articulación), hemartrosis (hemartrosic), púrpura de Henoch-Schonlein, osteoartropatía hipertrófica, reticulohistiocitosis multicéntrica, artritis asociada con algunas enfermedades, surcoilosis, hemocromatosis, enfermedad de las células falciformes y otras hemoglobinopatrías, hiperlipoproteineimia, hipogammaglobulinemia, hiperparatiroidismo, acromegalia, talasemia, Enfermedad de Behat, lupus eritematoso sistémico, o policondritis recidivante y enfermedades relacionadas.