EA011859B1 - Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени - Google Patents

Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени Download PDF

Info

Publication number
EA011859B1
EA011859B1 EA200601264A EA200601264A EA011859B1 EA 011859 B1 EA011859 B1 EA 011859B1 EA 200601264 A EA200601264 A EA 200601264A EA 200601264 A EA200601264 A EA 200601264A EA 011859 B1 EA011859 B1 EA 011859B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound according
fibronectin
sequence
antibody
carcinoembryonic
Prior art date
Application number
EA200601264A
Other languages
English (en)
Other versions
EA011859B9 (ru
EA200601264A1 (ru
Inventor
Стефан Гиллиес
Кин-Минг Ло
Ян Лэн
Рэкеш Верма
Original Assignee
Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп.
Антисома Плк
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп., Антисома Плк filed Critical Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп.
Publication of EA200601264A1 publication Critical patent/EA200601264A1/ru
Publication of EA011859B1 publication Critical patent/EA011859B1/ru
Publication of EA011859B9 publication Critical patent/EA011859B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Настоящим изобретением предлагается соединение, содержащее участок адресной доставки и эффекторный участок, причем участок адресной доставки включает в себя или содержит моноклонное антитело, обладающее специфичностью в отношении карциноэмбрионального фибронектина или его фрагмента либо разновидности, которое несет на себе связывающую специфичность антигена моноклонного антитела-предшественника, а эффекторный участок включает в себя или содержит интерлейкин-12 или его функциональный фрагмент либо разновидность, отличающееся тем, что моноклонное антитело, обладающее специфичностью в отношении карциноэмбрионального фибронектина, присоединяется к участку карциноэмбрионального фибронектина, отличному от участка ED-B. Кроме того, изобретением предлагается кодирование этих соединений с помощью нуклеиновой кислоты и использование таких соединений в медицине, например, при лечении рака.

Description

Настоящее изобретение относится к соединениям, используемым для лечения рака. В частности, изобретением предлагаются гибридные белки, содержащие участок антитела, направленный против антигена, характерного для опухолевого новообразования, привитого к интерлейкину-12. Предпочтительные гибридные белки, соответствующие настоящему изобретению, связываются с целевым антигеном особенно прочной связью и могут использоваться при лечении плотных опухолевых образований.
Предпосылки изобретения
Лечение рака с помощью гибридных белков адресной доставки показало себя многообещающим, однако, в связи с этим остается много нерешенных проблем. Например, конъюгированные с антителами цитокины адресной доставки показали себя многообещающими при лечении рака на опытных животных и, в некоторых исследованиях, на человеке, но еще предстоит определить оптимальный выбор антитела/антигена, цитокина и эффекторной функции антитела. Например, Джиллс (С111ек) (И8 5650150) описал общую применимость цитокиновых гибридов для заполнения антител и, в частности, применимость гибридных белков 1Ь2.
Интерлейкин-12 (1Ь-12) является особенно привлекательным цитокином для иммунной терапии адресной доставки препарата, поскольку 1Ь-12 стимулирует иммунную реакцию ТЫ, что наиболее эффективно при атаке на опухолевые клетки. 1Ь-12 довольно токсичен при его систематическом введении и, следовательно, очень важно направлять его действие именно в место нахождения опухоли. Джиллс (Сй1ек) с соавторами (АО 99/29732) описали применимость гибридов 1Ь-12 к антителам, а также показали особые методики, необходимые для доставки гибридных белков 1Ь-12, опираясь на тот факт, что 1Ь12 является цитокином с двумя субъединицами, из которых одна субъединица имеет возможность гомодимеризации. Галин (Найи) с соавторами 2002, ЫаГиге Вю1ес1шо1о§у 20: 264-269 описали гибридный белок, состоящий из неразветвленного компонента 1Й-12, привитого к неразветвленному Ρν (&Ρν) с изменяемыми доменами Ь19, антитело, которое связывается с опухолеспецифической неоваскулятурой. В этой последней молекуле отсутствует участок антитела Рс, и, таким образом, отсутствуют все эффекторные функции. Даже когда 1Ь-12 прививается к компоненту адресной доставки, после введения гибридного белка имеется определенный период, в течение которого этот белковый лекарственный препарат циркулирует в системе организма. В течение этого периода и до того, как лекарственный препарат аккумулируется в опухоли и исчезнет из остальной системы, в организме образуются вторичные цитокины, которые ухудшают результаты.
Следовательно, существует необходимость в улучшенных средствах доставки 1Ь-12 в место нахождения опухоли в теле пациента.
Краткое описание изобретения
Первым аспектом изобретения является создание соединения, содержащего участок, ответственный за адресную доставку, и эффекторный участок, в котором участок адресной доставки состоит из или содержит моноклонное антитело, обладающее специфичностью в отношении карциноэмбрионального фибронектина, или его фрагмент или вариант, который несет в себе способность специфического связывания с карциноэмбриональным фибронектином моноклонного антитела-предшественника, а эффекторный участок состоит из или содержит интерлейкин-12 или его функциональный фрагмент или вариант.
Отличительной особенностью соединений, соответствующих настоящему изобретению, является то, что моноклонное антитело, обладающее специфичностью в отношении карциноэмбрионального фибронектина, связывается с участком карциноэмбрионального фибронектина, отличающимся от участка сверхдомена В участка (ΕΌ-В). Участок ΕΌ-В фибронектина представляет собой домен, который при фрагментировании первичного транскрипта РНК либо присутствует, либо пропускается в фибронектиновых молекулах внеклеточной матрицы (см. ниже). Таким образом, моноклонное антитело, обладающее специфичностью в отношении карциноэмбрионального фибронектина, не связывается с участком ΕΌ-В (домен ΕΌ-В), хотя он связывается с фрагментированным вариантом фибронектина (именуемым «карциноэмбриональный фибронектин»), который содержит такой участок ΕΌ-В.
Под «участком адресной доставки» мы подразумеваем участок соединения, который содержит одну или несколько точек связи, распознающих карциноэмбриональный фибронектин и прикрепляющихся к нему. Карциноэмбриональный фибронектин представляет собой белок, выделяемый опухолевыми клетками, и он связан с опухолевой васкулятурой. Этот белок выделяется также эмбриональной тканью, но он не появляется и не обнаруживается во всех нормальных взрослых тканях, за исключением эндометрии регенерированной ткани и лечения ран (Карнемолла (Сагпето11а) и др., 1989, 1. Се11. Вю1. 108, с. 11391148).
Карциноэмбриональный фибронектин образуется в опухолевых клетках путем чередующегося сращивания, посредством которого дополнительный домен, называемый доменом ΕΌ-В (дупликат ΕΌ-В полного типа II, известный также, как дупликат В экстратипа III [БШВ]), вставляется между фибронектиновыми дупликатами 7 и 8. ΕΌ-В у млекопитающих по данным, полученным на сегодняшний день, является хорошо сохраняющимся доменом со стопроцентной гомологичностью (см. вышеуказанное: Карнемолла (Сагпето11а) и др., 1989 и Френч-Констант (Ртепсй-СопйапГ) и др., 1989, 1. Се11. Вю1. 109, с. 903-914).
Таким образом, изобретением предлагаются соединения для доставки ГЕ-12 или его функциональ
- 1 011859 ного фрагмента либо варианта к опухолевым клеткам нацеливанием его на карциноэмбриональный фибронектин.
Под «специфичностью в отношении к карциноэмбриональному фибронектину» мы подразумеваем, что целенаправленный участок (т.е. моноклонное антитело или его фрагмент либо вариант, который обладает специфической способностью связываться с карциноэмбриональным фибронектином моноклонного антитела-предшественника), связывается с карциноэмбриональным фибронектином, но не связывается в существенной степени с фибронектином, выделяемым нормальной взрослой тканью.
Подходящие моноклонные антитела для адресной доставки к антигенам (в данном случае к карциноэмбриональному фибронектину) могут быть изготовлены известными способами, например, такими, как описано в публикации Мопос1опа1 Аи11Ьоб1ек: А тапиа1 οί 1ес11тс|иек, Η. Ζοΐα (СКС Ргекк, 1988) (Моноклонные антитела: Руководство по методикам приготовления, X. Золя, 1988) и в публикации Моиос1оиа1 НуЬпбота АийЬоб1ек: Тесйшдиек аиб Аррйсайоик, 1 6 К Нште11 (СКС Ргекк, 1982) (Моноклонные гибридизированные антитела: Методики и применение, Хурелл, 1982), а также АийЬобу Еид1иеег1ид, А Ртасйса1 Арргоасй, МсСайейу, 1. е! а1., еб. (1КЬ Ргек, 1996) (Технологии антител, Практический подход, Мак Кафферти Дж. и др. 1996).
Специфический участок адресной доставки соединений, отвечающих настоящему изобретению, характеризуется, как обладающий специфичностью по отношению к участку карциноэмбрионального фибронектина, отличному от участка ΕΌ-Β. Точнее, специфический участок адресной доставки связывается со скрытым эпитопом, который выступает/доступен в карциноэмбриональном фибронектине (содержащем домен ΕΌ-Β), но не выступает/недоступен в нормальном фибронектине (не содержащем домен ΕΌΒ). Как следствие, специфический участок адресной доставки связывается с фрагментированным вариантом фибронектина, содержащим домен ΕΌ-Β, но не связывается с самим доменом ΕΌ-Β.
Таким образом, агенты адресной доставки, содержащие антитело Ь19 или его связывающиеся с антигеном фрагменты (например, \¥О 03/07469), не входят в область распространения настоящего изобретения, поскольку антитело Ь19 связывается с доменом ΕΌ-Β.
Предпочтительно, если специфический участок, ответственный за адресную доставку, связывается с аминокислотной последовательностью, представленной в фибронектине, выделяющемся как в эмбриональной, так и во взрослой ткани. Еще более предпочтительно, если специфический участок, ответственный за адресную доставку, связывается с фланговым участком домена фибронектина, т. е. по соседству с доменом ΕΌ-Β. Наиболее предпочтительно, если специфический участок, ответственный за адресную доставку, связывается с аминокислотной последовательностью, находящейся внутри дупликата 7 домена фибронектина (см. приведенный ниже пример 3).
Для специалиста в данной области техники понятно, что соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут адресно доставляться на карциноэмбриональный фибронектин, выделяемый любыми видами животных. Преимущественно, лекарственные соединения адресно направляются на карциноэмбриональный фибронектин, выделяемый теми видами, которые должны быть подвергнуты терапевтическому лечению. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения специфический участок, ответственный за адресную доставку препарата, является специфичным в отношении карциноэмбрионального фибронектина, выделяемого человеком.
В особенно предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения специфический участок, ответственный за адресную доставку, содержит или состоит из антитела ВС1 или антитела, способного конкурировать со связывающей способностью антитела ВС1 с карциноэмбриональным фибронектином, или его фрагмента либо варианта, который несет в себе специфичность связывания с антигеном моноклонного антитела-предшественника. Приготовление антитела ВС1 описано в ЕР 0344134 В, и оно может быть получено из гибридомы, находящейся в Европейской Коллекции клеточных культур животных, Порт Даун, Великобритания (номер хранения 88042101).
Антитело ВС1 специфически связывается с карциноэмбриональным фибронектином через локальный участок связи, расположенный в дупликате 7, находящийся за пределами домена ΕΌ-Β, который в нормальном фибронектине замаскирован, но является доступным, если в молекуле присутствует домен ΕΌ-Β (Карнемолла (Сагието11а) и др., 1989, 1. Се11. Βώί 109:1139-1148; Карнемолла (Сагието11а) и др., 1992, 1. Βώί Сйет. 267: 24689-24692; Мариани и др., (Майаш), 1997, Саисег 80:2378-2384; см. также приведенный ниже пример 1).
Способы определения того, способно ли испытуемое антитело конкурировать со способностью к связыванию антитела ВС1 с карциноэмбриональным фибронектином, хорошо известны в данной области техники, например, как конкурентный способ Εί-ΙΞΆ.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения антитело ВС1 является антителом человека или гуманизированным антителом. Под «гуманизированным моноклонным антителом» мы подразумеваем моноклонные антитела, обладающие по меньшей мере одной цепью, в которой скелетные участки преимущественно произведены из первого акцепторного моноклонного антитела человеческого происхождения и по меньшей мере один комплементарно-определяющий участок (СЭК) произведен из второго донорного моноклонного антитела, обладающего избирательностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину. Донорное моноклонное антитело может быть человеческого или не че
- 2 011859 ловеческого происхождения, например, это может быть муреиновое моноклонное антитело.
Предпочтительно, если обе цепи гуманизированного моноклонного антитела содержат участки СЭЯ полученные трансплантацией из донорного моноклонного антитела, обладающего избирательностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину.
Преимущественно, если СИЯ-трансплантированная (т.е. гуманизированная) цепь содержит два или три СЭР-участка. взятых из донорного антитела, обладающего избирательностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину.
Удобно, если гуманизированное моноклонное антитело содержит в основной цепи только остатки человеческого происхождения, а участки СОК. из донорного антитела обладают избирательностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину.
Однако для специалиста в данной области техники понятно, что для сохранения и оптимизации избирательной специфичности гуманизированного антитела может оказаться необходимым менять один или несколько остатков в скелетных участках цепи так, чтобы они соответствовали эквивалентным остаткам в донорном антителе.
Предпочтительно, если скелетные участки цепи гуманизированного антитела будут произведены из человеческого моноклонного антитела 1дС.
Способы получения гуманизированных моноклонных антител хорошо известны, например, см. Джонс (1опе§) и др., (1986) №Шге 321:522-525, Райхман (Яеюйшапи) и др., (1988), №Шге 332:323-327, Верхойен (Уегйоеуеп) и др., (1988) 8с1епсе 239:1534-1536 и ЕР 239400.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение, соответствующее первому аспекту изобретения, связывается с карциноэмбриональным фибронектином с высокой степенью сродства антител к антигену. Под «высокой степенью сродства» мы подразумеваем то, что ответственный за адресную доставку участок распознает карциноэмбриональный фибронектин с константой связывания не ниже Кб=10-6 М, предпочтительно не менее Кб=10-7М, приемлемо Кб=10-8М, более приемлемо Кб=10-9М, еще более приемлемо Кб=10-10М или лучше всего Кб=10-11М или даже Кб=10-12М.
Предпочтительно, если соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, связывается с карциноэмбриональным фибронектином более прочной связью, чем исходное моноклонное антитело, например, ВС1, используемое для приготовления участка, ответственного за адресную доставку. Прочность связи, с которой данное вещество и исходное моноклонное антитело связываются с карциноэмбриональным фибронектином, может быть измерена путем определения константы диссоциации их связи с карциноэмбриональным фибронектином (см. примеры 2 и 3).
Лучше всего, если данное соединение связывается с карциноэмбриональным фибронектином по меньшей мере в два раза сильнее, чем моноклонное антитело-предшественник, например, не менее чем в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20 раз сильнее, чем моноклонное тело-предшественник связывается с карциноэмбриональным фибронектином.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения это соединение, соответствующее первому аспекту изобретения, имеет специфический участок, ответственный за адресную доставку, содержащий или состоящий из целого (т.е. ненарушенного) моноклонного антитела, предпочтительно антитела ВС1. Таким образом, специфический участок, ответственный за адресную доставку, может содержать два генных комплекса тяжелых иммуноглобулиновых цепей и две легкие иммуноглобулиновые цепи, которые могут быть связаны дисульфидными связями. Одна или более из этих составляющих цепей могут быть конъюгированными, например, гибридизированными с эффекторным участком. Например, из двух тяжелых иммуноглобулиновых цепей обе могут быть привиты к эффекторному участку.
В альтернативном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения специфический участок, ответственный за адресную доставку, содержит или состоит из связывающегося с антигеном фрагмента моноклонного антитела, обладающего избирательностью по отношению к карциноэмбриональныму фибронектину (например, ВС1).
В распознавании антигена участвуют переменный тяжелый (νΗ) и переменный легкий (Уь) домены антитела; этот факт был впервые обнаружен ранними экспериментами по протеазной ферментации. Дальнейшее подтверждение было найдено при гуманизировании антител грызунов. Переменные домены, взятые из организма грызунов, могут быть привиты к постоянным доменам человеческого происхождения, так что образующееся в результате антитело сохраняет антигенную специфичность исходного антитела, взятого из организма грызунов (Моррисон (МоггБоп) и др. (1984) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 81, 6851-6855).
Избирательность по отношению к антигену обеспечивается переменными доменами и является независимой от постоянных доменов, что известно из экспериментов по бактериальным выделениям фрагментов антитела, все из которых содержали один или несколько переменных доменов. Эти молекулы содержат ЕаЬ-подобные молекулы (Беттер (Вейег) и др., (1988) 8с1епсе 240, 1041); Бу-молекулы (Скерра (8кегга) и др., (1988) 8с1епсе 240, 1038); дисульфидно-связанные Εν-молекулы (Янг (Уоипд) и др., 1995, ЕЕВ8 Бей. 377:135-139); одноцепочечные Εν(8сΕν)-молекулы, где партнерные домены νΗ и VI, связаны через гибкую олигопептидную цепь (Берд (В1гб) и др., (1988) 8с1епсе 242, 423; Хьюстон (Нийоп) и др., (1988) Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 85, 5879) и однодоменные антитела (бАЬ§), состоящие из изолирован
- 3 011859 ных У-доменов (Уард (\Уагф и др., (1989) Ыа1иге 341, 544). Общий обзор методик, использованных в синтезе фрагментов антитела, сохраняющих их специфические точки связывания, можно найти в работе Винтера и Милстейна (ХУйНег&МПЧет (1991) Ыа1иге 349, 293-299).
Преимущества использования фрагментов антитела, а не целых антител, могут быть многократными. Меньший размер фрагментов позволяет быстрее очищаться организму и может давать лучшее соотношение содержания препарата в опухолевых и неопухолевых тканях. РаЬ-, Ρν-, 8сРу-. дисульфид-Ρν- и бАЬ-фрагменты антитела - все могут образовываться внутри бактерий и выделяться в виде секрета из бактерий, таких как Е. сой, или из эукариотных выделительных систем, таких как системы дрожжевых грибков или системы млекопитания, что позволяет обеспечивать производство больших количеств указанных фрагментов.
Предпочтительно, если специфический участок соединений, соответствующих настоящему изобретению, ответственный за адресную доставку к ткани-мишени, содержит связывающийся с антигеном фрагмент гуманизированного антитела, выбранный из группы, в которую входят РаЬ-подобные молекулы, такие как РаЬ и Р(аЬ')2, Ρν-молекулы, дисульфидно-связанные Ρν-молекулы, 8сΡν-молекулы и однодоменные антитела (6АЬ§).
Более предпочтительно, если специфический участок, ответственный за адресную доставку к тканимишени, содержит РаЬ-молекулу или Р(аЬ')2-молекулу.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, имеет специфический участок, ответственный за адресную доставку к ткани-мишени, содержащий переменную область последовательности № 1 тяжелой цепи человеческого ВС1.
аУП'О’УКООТрУМЕКРКОКУТМГООТЗКТАУМБЬЗКЬТЗОПТАУУУСАВ.
ΕνΎΟΝΥΐν/αΝΤ^ΟΤΤν3ν58 (ПОСЛ. № 1)
В преимущественном случае соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, имеет специфический участок, ответственный за адресную доставку к ткани-мишени, содержащий переменную область последовательности № 2 легкой цепи человеческого ВС1.
ЕТУЕТфЗРОТЕЗЬЗРОЕкАТБЗСЗАЗЗЗГЗЗНУЕНтуурфКРСрАРКЬЫ УКТЗМЕ.А501РОИРЗОЗОЗОТОР1Ы18К.РЕРЕОРАУУУСффа831РКГ ВОООТКЬЕЖ (ПОСЛ. № 2)
Удобнее, если соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, имеет специфический участок, ответственный за адресную доставку к ткани-мишени, содержащий переменную область последовательности № 1 тяжелой цепи человеческого ВС1 и переменный участок последовательности № 2 легкой цепи человеческого ВС1.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения участок, ответственный за адресную доставку, содержит одну или несколько постоянных областей антитела, таких как постоянные домены иммуноглобулина СН1, СН2 и СН3. Эти один или несколько постоянных участков для переменной области участка адресной доставки могут быть взяты от одного и того же антитела или от разных антител. Подобным же образом, соединение, соответствующее настоящему изобретению, может содержать тяжелую цепь иммуноглобулина и легкую цепь иммуноглобулина, каждая из которых содержит постоянную область (причем эти постоянные области могут быть взяты от одного и того же или от разных антителпредшественников).
Предпочтительно, если эти одна или несколько постоянных областей антитела содержат домен СН1 или состоят из него.
В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения соединение, соответствующее изобретению, кроме того, содержит компонент иммуноглобулина Рс. Лучше всего, если компонент Рс взят из антитела 1дС1 человека.
Под «компонентом Рс» мы подразумеваем фрагмент антитела, содержащий домены СН2 и СН3 постоянной области тяжелой цепи 1дС. т.е. структурно эквивалентный фрагменту, папаинового деления молекулы 1дС или функционально эквивалентный ему полипептид.
Как уточнялось выше, соединения, соответствующие первому аспекту настоящего изобретения, содержат эффекторный участок, состоящий из 1Ь-12 или содержащий его или его функциональный фрагмент или вариант (т.е. компонент ТБ-12'). В термин «функциональный» фрагмент или вариант мы включаем понятие фрагмента или варианта, способного стимулировать Т111 иммунную реакцию в хозяинемлекопитающем, т.е. установление различий между клетками Т111 и простыми Т-клетками.
Таким образом, эффекторный участок содержит полипептиды, обладающие активностью 1Б-12, или состоит из них.
Предпочтительно, если эффекторный участок содержит человеческий интерлейкин-12 или его функциональный фрагмент или вариант, или состоит из него.
Удобнее, если эффекторный участок содержит одноцепочечный интерлейкин-12 или состоит из не
- 4 011859 го, например, содержащий домен 1Ь-12р35 и домен 1Ь-12р40, или состоящий из них. Предпочтительно, если домен 1Ь-12р35 конъюгирован с доменом 1Ь-12р40 дисульфидной связью.
Предпочтительно, если эффекторный участок содержит домен 1Ь-12р35, имеющий следующую аминокислотную последовательность:
РП.РУАТРРРОМЕФС1ЛШ80КЕЬКАУ8КМЕОКА1ЮТГ.ЕРУРОТЯ'ЯР.ГПНнпг 1ТОКТ81УЕАСХР1^ЬТК№8С1Л8КЕТ81ТГЫО8С1А31ЖТ8ЕММАЬСХ88
ТУРр^РЕЕРОПХТтаКЬСТЬЬН^^ (ПОСЛ. № 3)
Предпочтительно, если эффекторный участок содержит домен 1Ь-12р40, имеющий следующую аминокислотную последовательность:
1теЕКЖРУАУта1Т)УПТ,РАРОЕМУУЕТСРТРЕЮаПУ7'ГЕРр83Е1Л,08 аКТЬЛрУКЕР&РАО5УТСНКШЕУЕ8Н8ШШНККЕРОГтеТР11КРрК ЕРКМКтаЕСТАКОТЗеКЕТС^УЛ.ТП8ТОЬТГ8УК88К088ОРр0УТС0А ΑΤΕ8ΑΕΚνΐ<ΟϋΝΚΕΥΕΥ8νΕ€ρΕϋ8ΑΟΡΑΑΕΕ8ΕΡΙΕνΜνΐ)ΑνΗΐα.ΚΥΗΝ УТЗЗБТДШЛКРОРРКБЛОЕКРЕКМЗР^УЕУЗкЕУРР'ПУЗТРНЗУЕ'ЗЕТЕС νςνςθΚ3ΚΕΕΚΚΟΚνΡΙΤΐΚΤ3ΑΊΎΙ€Ι<ΚΝΑ8Ι8νΚΑρθΚΥΥ333ν3ΕΨΑ 8УРС8 (ПОСЛ. № 4)
В особенно предпочтительном варианте реализации первого аспекта настоящего изобретения соединение представляет собой или содержит гибридное соединение или гибридный белок. Под «гибридным соединением» мы подразумеваем соединение, содержащее один или несколько функционально отдельных участков, причем отдельные участки содержатся внутри линейной одиночной цепи, получаемой способами рекомбинации ДНК. Например, соединение может содержать целое антитело, в котором тяжелая цепь привита к одиночной цепи 1Ь-12. В альтернативном варианте соединение может содержать ЕаЬ или Е(аЬ')2-фрагмент антитела, в котором усеченная тяжелая цепь (т.е. Еб-цепь) привита к одиночной цепи 1Ь-12.
Предпочтительно, если участок, ответственный за адресную доставку, и эффекторный участок гибридного соединения гибридизированы. Эти участки могут быть привиты друг к другу непосредственно или через связующую последовательность (например, чтобы придать участкам большую гибкость по отношению друг к другу).
В подходящем случае связующее звено представляет собой мутированную связующую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность АТАТРСАА или состоящую из нее. [ПОСЛ. № 5].
В альтернативном варианте участок, ответственный за адресную доставку, и эффекторный участок соединения, соответствующего настоящему изобретению, являются отдельными компонентами, связанными между собой любым из обычных способов полипептидной сшивки, таким, как, в общем, описаны в работе О'Салливан (О'8иШуап) и др. Апа1. Вюейеш. (1979) 100, 100-108. Например, часть, представляющая собой антитело, может быть обогащена тиольными группами, а энзимная часть может быть подвергнута реакции с бифункциональным агентом, способным реагировать с этими тиольными группами, например, Ν-гидроксисукцинимидным эфиром йодоуксусной кислоты (ΝΗΙΛ) или Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионатом (8ΡΌΡ). Амидные и тиоэфирные связи, полученные, например, с помощью м-малеимидобензоил-№гидроксисукцинимидного эфира, в общем более стабильны в живом организме, чем дисульфидные связи.
В предпочтительном варианте реализации соединение содержит полипептид последовательности № 6. Тяжелая цепь ВС1, привитая к человеческому 1Ь-12р35.
ΕνρΕνςδΟΑΒνΚΚΡΟΑΒνκνΒΟΚΑδσΥΤΕΤΝΪΎΜΪΓ^νκρΑΡΟΟσΕΕ^Τ, ΟΥΙΝΡΥΝΡΟΤ9ΎΝΕΚΓΚ.ΟΚνΤΜΤΟΏΤ8Ι8ΤΑΥΜΕΤ8ΚΤΤ8ϋΒΤΑνΥΥΟΑΒ. ЕУУОНУПУ01ТУССОТЕУЗУ53А8ТКОРЗУРР1-АР88К8ТЗООТААЕаСЕУ КОУЕРЕРУТУБЭДТЗОАТТЗОУНТРРАУСрЗЗОЬУЗЕЗЗУУТУРЗЗЗЬОТОТ У1СНУННКР8]тТОККУЕРК8СОК11ПСРРСРАРЕЬШ6Р8ЛФШ>РКРК ОТЬМ18КТРЕУТСУУУПУ8НЕПРЕУтГУт)ОУЕУ1ШАКТКРКЕЕ0УМ δΤΥΚννδνΤΤνΤΗΰϋΑΤΝΟΚΕΜίΟΚνδΝΚΑΙΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟ νΥΤΙΤΡδΚΕΕΜΤΚΝΟνδΤΤΟΕνΚΟΓΥΡδϋΙΑνΕνΕδΝΟρΡΕΝΝΥΚΊΤΡΡν Π)8ηθ8ΡΡΕΥ8ΚΤΤνθΚ5Κ.ψρρσΝνΡ3σ8νΐ4ΗΕΑΤΗΝΗΎΤΟΚ5ΑΤΑΤΡΟ ΑΑΝΕΡνΑΊΈΟΡΟΜΓΡΟΤΗΗ8ρΝΤΕΚΑν8ΝΜΕςΚΑΚΟ'ΓΤΕΕΥΡΟΤ8ΕΕΙΟΗ ЕПГГКПКТ8Т7ЕАСЕРЕЕЕ'ГКНЕ8СЬНЗКЕТ81ТГНС8СЕА8ККТ8БЪ1МАЕС Ε38)ΎΕηΕΚΜΥ0νΕΕΚΤΜΝΑΚ11ΧΜϋΡΚΚςΐΙ^ϋ0ΗΝσ^ίνΊΒΕΕΜΡΑΕΝΙΤΤ 8ЕТУР0К58ЕЕЕРНТУКТК1КЕС11бЛТАЕ'БбКАУТГОКУМ8У124АЛ (ПОСЛ. № 6)
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение содержит полипептид последовательности № 7.
- 5 011859
Легкая цепь ВС1.
Е1УЬТф8РО1Ъ8Ь8РОЕКАП^С8А888188ПУ1Я^0фИ0<ЗАР1аХГЖГ8 ПЕАЗОГРОКРЗОйОЗОТОГП.ПЗМ.ЕРЕОГАУУУСрфОЗЗП’РТРОЦОТКЕЕ КР.Г/ААР5УГ1ГР₽8ОЕрЕК5СТА8УУСЕЕП8ГГУРЕЕАКУЦ7/КУЕПАЕр8 ΟΝ8ΡΕ8νΊΈρθ8Κϋ8ΊΎ8Ε88ΤΕΤΕ3ΚΑΙ)ΥΕΚ1ΙΚ\ΎΑεΕνΊΉΟΟΕ88ΡνΤ КЗЕИКОЕС (ПОСЛ. № 7)
В особенно предпочтительном варианте реализации изобретения соединение содержит полипептид последовательности № 6 и полипептид последовательности № 7.
Лучше всего, если соединение, кроме того, содержит полипептид последовательности № 4, связанный дисульфидной связью с полипептидом последовательности № 7.
Таким образом, изобретением предлагается гибридный белок, содержащий участки антитела V, направляемые к карциноэмбриональному фибронектину, компонент Те и компонент интерлейкин-12. Конкретно, изобретением предлагается иммуноглобулиновый (1д) гибридный белок, содержащий участки антитела V, которые связываются с карциноэмбриональным фибронектином, привитый к интерлейкину12. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения участки антитела V взяты из антитела ВС1 Карнемолла (Сагпето11а) и др., 1992, 1. ΒίοΙ. СНст. 267: 24689-24692; Мариани (Мапаш) и др., Сапсег 80:2378-2384. Компонент Те предпочтительно производится из человеческого 1§С1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения гибридный белок содержит участки антитела V, как показано в последовательностях № 6 и 7, и компонент интерлейкина-12. Предпочтительно, если компонент интерлейкин-12 является одноцепочечным интерлейкином-12.
Неожиданной отличительной особенностью настоящего изобретения является то, что гибридный белок связывается с карциноэмбриональным фибронектином значительно более прочно, чем само соответствующее антитело ВС1. Такая прочная связь весьма полезна при лечении рака, поскольку более прочная связь приводит к лучшей степени направленности 1Ь-12 на опухоль, чем можно было ожидать, на основании сродства антитела ВС1 с карциноэмбриональным фибронектином. Более прочная связь дает особые преимущества в случае антигенов адресной доставки, которые не претерпевают быстрого превращения, таких как компоненты внеклеточной матрицы.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения используются также постоянные области антитела, например домен СН1. На фиг. 1 показаны некоторые конфигурации переменных областей антитела (заштрихованные овалы), постоянных областей (белые овалы), субъединиц 1Ь-12 р35 (маленькие прямоугольники), субъединиц 1Ь-12 р40 (большие прямоугольники), шарниров и сшивок антитела (толстые линии) и дисульфидных связей (тонкие линии). Особенно предпочтительные варианты реализации изобретения содержат ненарушенные антитела 1д- типа с р35, привитыми к С-концевой последовательности тяжелой цепи, и р40, прикрепленными к р35 посредством дисульфидной связи (фиг. 1А); «мини-тело» с V-областями антитела, соединенное мостиком и прикрепленное через шарнир к домену СН3, р35, привитые к С-концевой последовательности тяжелой цепи, и р40, прикрепленные к р35 дисульфидной связью (фиг. 1В); &Ρν с р35, привитыми к V-области, и р40, прикрепленные дисульфидной связью (фиг. 1С); и РаЬ с р35, привитыми к С-области, и р40, прикрепленные дисульфидной связью (фиг. 1Ό). Субъединица 1Ь-12р35 также может быть прикреплена к Ν-концевой последовательности Vобласти. Субъединица 1Ь-12р40 может быть прикреплена к р35 через дисульфидную связь или через мостик, образуя так называемый компонент «1Ь-12 одиночной цепи» (8с1Ь-12).
В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения используется ненарушенное антитело ВС1 с постоянными областями человеческого 1дС1. Особое преимущество этой молекулы состоит в том, что она обладает эффекторными функциями, такими как АЭСС, которые отсутствуют у мини-тела и гибридных белков РаЬ и &Ρν.
Вторым аспектом настоящего изобретения является создание молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, или участок, ответственный за адресную доставку, эффекторный участок или один или несколько его составляющих полипептидов (например, тяжелая цепь ВС1, легкая цепь ВС1, субъединицы р35 и р40 1Ь-12 и/или компонент Тс). В понятие «нуклеиновая кислота» мы включаем молекулы ДНК, сДНК и мРНК (ΌΝΑ, с^NА, ιηΡΝΑ).
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая этому изобретению, содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из последовательностей № 8, 9 и 10.
- 6 011859
Тяжелая цепь ВС1чел., привитая к субъединице р35 1Ь-12чел. (УН подчеркнуто; р35 выделено жирным шрифтом; заглавные и строчные буквы представляют кодирующую и не кодирующую последовательности соответственно):
Е]УЕТф8РО1Ъ8Е8РОЕКАТЕ8СЗА888188ОТЬ1ГУУффКР0фАРКШУКТЗ ΝΕΑ8ΟΙΡΟΚΓ80308σΐτ)ΕΊΕΤΙ3ΕΕΕΡΕϋΕΑνΥΥ0φφΟ83ΙΡΕΤΡ0φαΤΚΕΕ ΙΚΚΤνΑΑΡ8νΤΙΓΡΡ3ΟΕφΕΚ3σΤΑ3ννσΐΧΝΗΤΎΡ№ΑΚλ^1λ7ΚνϋΝΑΕφ8 ΟN8^Ε8VΤΕ^^8Κ^ЗΤΥ8^88IΤΤ^8ΚΑ^ΥΕΚΗΚVΥΑСΕVΤΗ^Ο^88ΡV^Γ КЗЕИКОЕС
ААСЗССАААОдЕввеассс^бё^Йсдаееессасййёасаёайесс^йобцсссасссМ дссЛдада^дассдс^кссаассГс^кссгасайСОСАОСССССАСААССАСАСЗО ТОТАСАСССТОСССССАТСАССКЭСАбОАВАТбАССААаААССАССТ САОССТОАССТОССТСОТСАААСЮСТТСТАТСССАбСОАСАТСССС СТООАОТОСОАОАОСААТОСССАОССООАОААСААСТАСААОАСС АСОССТСССОТССТООАСТСССгАССЮСТССТГСТТССТСТАТАОСАА ССТСАССОТСЮАСААОАОСАООТООСАССАВСЮОААСОТСТТСТСА ТССТССОТОАТОСАТОАОССТСТОСАСААССАСТАСАСОСАОАА&А СтССССАССОССАССССОООСОСССС.АААССТСССССТССССАСТС САСАСССАССААТСТГСССАТСССТТСАССАСТСССААДАССТС СТСАССССССТСАССААСАТССТССАСААССССАСАСАААСТС ТАСААТТТТАСССТТССАСТГСТСАА6АСАТТСАТСАТСААСАТ АТСАСАА-ААСАТААААССАССАСАСТСВАССССТСТТТАССАТТ ССгААТТААССААСААТСАСАСТТСССТАААТТССАСАСАбАССТ СТТТСАТАА.СГААТСССАНГГСССТССССТССАСАААСАССТСТ ТТТАТСАТббСССГСТСССГТАСТАСТАТТТАТСААСАСТТСАА 6АТСТАССАССТССАСТГСААСАССАТСААТ6САААССТТСТСА ТОСАТССТААСАСССАСАТСТТТСТАСАТСААААСАТССТСССА сттатгсатсасстоатссассссстс.аатттсаасастсасас ТСТСССАСАААААТССТСССТТСААСААССССАТТТТТАТААА.А СТААААТСААССТСТССАТАСТТСГТСАТССТТТСАСгААТТССб ССАСТСАСТАТТСАСАСАСТСАССАССТАТСТСААТССТТССТА А (ПОСЛ. № 8)
- 7 011859
Легкая цепь ВС1чел. (УЪ подчеркнуто; заглавные и строчные буквы представляют кодирующую и не кодирующую последовательности соответственно):
АТССАеТТОССТОГГАаССТОТГООТОСТОАТОТТСТООАТТССТО^^ £аяа£аее£аа£{£аяЕЁаейаЕаа{ЕЕасае£Еайсаййайса«кааЬссай£С{саассаГк1аГе1нкс асаТ81дс1ата1йаайайаСЕааа1^а1есс(вй2а188*с1аае{аа1бсс14аДяа8^а‘ка83сасПЕсаа1
1сасййй1£к[аа£аа£а£айй1ай8с1а1ааааааа1ййв1|51ааааа1:ааас£а11;аса§й:§ааа£аааааааа аа1а1аа£даГйДсаЩааЦН£Щииас1я{аиЩоМс1:саН:йШсайСТГССТТААОСОАААТ ТСТОТТОАСССАОТСТССАОССАСССТОТСТГТОТСТССАООООАААО АОССАСССТСТССТОСАОТСССАО'ГГСААОТАТААОТТССААТТАСТТО САТТООТАССАССАОАААССТОасСАСаСТСССАООСТССТСАТСТАТ АООАСдТССААТСТааСТГСТООСАТСССАОАСАбОТТСАОТааСАдт СССТСТССОАСАаАСТТСАСТСТСАССАТСАОСАСтАСТСЮАОССТОАА СтАТПТССАОТОТАТТАСТОТСАОСАОООТАОТАОТАТАССАТТСАСеТ ТТООССАОССОАССАА(ЗСТ<зСАСгАТСАААСе1аа£1к£а1сс1аГса£££{Ша£аара 88®ас1ааа§аса{£1ва8с1а1£1^8ас1аа^е1аа184сас1аа8с£8сйсва1ссс8саайс1ааас1с18а8й §Вй1к§Йа£§ас81®Ёссайс4й8Сс1ааа8са1^а8й1ас18саа881са@аааа8са18сааа8сссЛса8аа £88с18сааа8аёс1ссаасаааасааШа8аасГйайаа£йаа1ай88йЭаавс1аЁ6аа5ааас1:сааааса1 §1ёаКа1сс§сааасаасасасссаа^5са§аасШёЙас11ааасасса1вс1вШ§сисй1:ссТсадСгАА СТСТООСТбСАССАТСТОТСТТСАТСТТСССОССАТСТОАТОАОСАОТТ ОАААТСТОСААСТОССТСТОТГОТОТОССТССТОААТААСТТСТАТССС АОАОАСЮССАААОТАСАОТООААОСТООАТААСОСССТССААТСООО ТААСТСССАОСАОАОТОТСАСАОАОСАООАСАОСААООАСАОСАССТ АСАОССТСАОСАССАСССТОАСССТОАССАААССАСгАСТАСОАСААА САСАААСТСТАССЗССТОСОААОТСАСССАТСАСЗОСССТОАОСТСОССС ОТСАСЛААСтАОСГГСААСАОСЮСАОАОТОТТАС (ПОСЛ. № 9)
Субъединице р40 1Ь-12чел. (Эта конструкция представляет собой с-ДНК м-РНК р40. ДНК, кодирующая свой свойственный сигнальный пептид, обозначена курсивом, за которым следует ДНК, кодирующая развитую р40):
АТСТ0ТСА.ССА0САСТТ00ТСЛТСГСТТ(ЮТ77ТСС(П-ватТГГТСТ0(ЗС
АТСТССССТСОТОСССА.ТА.ТОСаААСТОААОАААОАТОТГГА.'ГаТСО
ТАОАА1ГООАТГСОТАТССОСАтеССССТОСАОАААТОбТОСТССТ САССТОТОАСАССССТОААОААОАТОСТАТСАССТООАССТТОСхАС САОАОСАОТОАООТСТТАСЮСТСТООСААААСССТСАССАГССААСт ТСАААОАОТТТОаАОАТОСТООССАОТАСАССтатСАСАААООАОО соаооттстааоссаттсостсстостостгсасаааааооааоат ООААТТТООТССАСТОАТАТТТТАААООАССАОААА6ААСССАААА АТААОАССТТТСТААОАТССОАООССААОААТГАТТСТООАСОТТТС
АССТОСТСОТбОСТОАССАСААТСАСТАСТОАГГТОАСА'ГТСАОТОТ
СААААОСА6САОАООСТСГГСТОАСССССААООООТСАСОТОСООА
ОСТОСТАСАСТСТСТОСАОАОАСАОТСАОАСОООАСААСААаОАОТ
АТОАОТАСТСАОТООАОТОССАОСАООАСАОТОССТОСССАОСТОС ТСАООАОАОТСТаСССАТТОАОСТСАТООТООАТОССОТТСАСААС СТСААОТАТСААААСТАСАССАОСАОСТТСТТСАТСАОООАСАТСА ТСАААССТОАСССАСССААОААСТТаСАОСТОААОССАТТАААОАА ТГСТСОССАООТООАООТСАССГОСЮАОТАСССТаАСАССТООАОТ АСТССАСАТТССТАСТТСТСССТОАСАТТСТОСаТТСАаОГССАОСС СААОАОСААОАОАОААААОАААОАТАОАОТСТГСАССЮАСААОАС СТСАОССАСОСТСАТСТСССОСАААААТОССАССАТТАССОТОССО ОСССАООАССОСТАСТАТАОСТСАТСТГООАОСОААТСтООСАТСТО ТОСССТОСАСТГАС (ПОСЛ. № 10)
В альтернативном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности, которые являются перерожденными последовательностями указанных выше нуклеотидных последовательностей (т.е. которые кодируют ту же самую аминокислотную последовательность).
Предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность № 8.
Можно получить преимущество, если молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность № 9.
Удобно, если молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность № 8 и нуклеотидную последовательность № 9.
- 8 011859
В подходящем случае молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность № 10.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является предложение способа получения соединения, соответствующего первому аспекту данного изобретения, причем указанный способ содержит экспрессию одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, соответствующей второму аспекту этого изобретения, в «клетке-хозяине» и изолировании от нее соединения (см. пример 1).
Предпочтительно, чтобы два участка соединения, соответствующего настоящему изобретению, производились в виде гибридного соединения методом рекомбинации ДНК, в котором цепь ДНК содержит соответствующие области, кодирующие эти два участка соединения, расположенные либо по соседству друг с другом, либо разделенные областью, кодирующей пептидный мостик, который не нарушает заданные свойства этого соединения.
Нуклеиновая кислота может экспрессироваться в подходящей клетке-хозяине, чтобы вырабатывать полипептид, содержащий вещество, соответствующее настоящему изобретению. Таким образом, нуклеиновая кислота, кодирующая образование соединения, соответствующего настоящему изобретению, или его часть, может использоваться в соответствии с известными способами, надлежащим образом модифицированными в свете приведенных здесь наставлений, чтобы составить экспрессирующий вектор, который затем будет использован для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и выработки вещества, соответствующего настоящему изобретению. Такие методы включают в себя методы, описанные в патентах США № 4440859, выданном 3 апреля 1984 Руттеру (РиИсг) и др.; 4530901, выданном 23 июля 1985 Вейссману (ХУсМтап); 4582800, выданном 15 апреля 1986 Кроулу (СгоМ); 4677063, выданном 30 июня 1987 Марку (Магк) и др.; 4678751, выданном 7 июля 1987 Гойдделу (Соеббе1); 4704362, выданном 3 ноября 1987 Итакуре (Йакига) и др.; 4710463, выданном 1 декабря 1987 Мюррей (Миггау); 4757006, выданном 12 июля 1988 Туле мл. (Тоо1е, 1г.) и др.; 4766075, выданном 23 августа 1988 Гойдделу (Соеббе1) и др., и 4810648, выданном 7 марта 1989 Сталкеру (81а1кег), - все из которых включены сюда в качестве ссылки.
Если соединение, соответствующее настоящему изобретению, мультимерно, тогда составляющие цепи могут кодироваться единой молекулой нуклеиновой кислоты или отдельной молекулой нуклеиновой кислоты (экспрессируемой в общей клетке-хозяине или в других клетках-хозяевах, а сборка проводится в искусственных условиях).
Нуклеиновая кислота, кодирующая соединение, соответствующее настоящему изобретению, или его часть, может быть присоединена к большому числу других нуклеиновых последовательностей для внедрения в подходящую клетку-хозяина. Вид нуклеиновой кислоты-компаньона будет зависеть от природы клетки-хозяина, способа внедрения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и от того, желательно ли эписомное обслуживание или интеграция.
Следует принимать во внимание, что для предотвращения экспрессии цитотоксической части соединения, соответствующего настоящему изобретению, и уничтожения клеток-хозяев, в которых происходит экспрессирование, может оказаться необходимым связать нуклеиновую кислоту, соответствующую второму аспекту настоящего изобретения, с сигнальной последовательностью, способной управлять секрецией вырабатываемого вещества (или его части) наружу из клетки-хозяина. Примером таких сигнальных последовательностей может служить сигнальная последовательность отрА (например, см. Такахара (Такайага) и др., 1985, 1. Вй. Сйет. 260(5):2670-2674).
В общем, нуклеиновая кислота внедряется в экспрессирующий вектор, такой как плазмид, в надлежащей ориентации и в нужной для экспрессии рамке считывания нуклеотидной последовательности. При необходимости нуклеиновая кислота может быть связана с подходящими транскрипционными и трансляционными регуляторными нуклеотидными последовательностями, распознаваемыми выбранной клеткой-хозяином, хотя такой контроль, в общем, возможен и в экспрессирующем векторе. Например, для усиления трансляции молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соединение, соответствующее настоящему изобретению, может быть связана с согласующей рибосомной связующей последовательностью Козака (такой как ССССССАСС), или может содержать ее.
Затем вектор вводится в клетку-хозяина с помощью стандартных методик. В общем, не все клеткихозяева будут трансформироваться вектором. Поэтому необходимо отобрать трансформируемые клеткихозяева. Одна из методик отбора предполагает внедрение в экспрессирующий вектор нуклеотидной последовательности со всеми необходимыми контрольными элементами, которая кодирует в трансформируемой клетке избирательный признак, такой как антибиотическая устойчивость. В альтернативном варианте ген, ответственный за такой селективный признак, может находиться на другом векторе, который используется для сотрансформации выбранной клетки-хозяина.
Затем клетки-хозяева, трансформированные рекомбинантной нуклеиновой кислотой, соответствующей настоящему изобретению, культурируют в течение достаточного периода времени и в соответствующих условиях, известных в данной области техники, и в свете приведенных здесь указаний, чтобы дать возможность образовываться полипептиду, который впоследствии может быть выделен.
Известны многие экспрессирующие системы, включая бактерии (например, Е.сой и ВасШиз зиЬбйз), дрожжевые грибки (например, 8ассйаготусез сегеу181ае и Рюйа разййз), нитевидные грибки
- 9 011859 (например, АкрегдШик), растительные клетки, животные клетки (например, клетки СО8-1, СО8-7, СНО, МН 3Т3, N80 ВНК) и клетки насекомых (например, клетки Ого5ор1и1а. 8Р9).
Те векторы, которые содержат репликон, такой как прокариотный репликон, могут содержать также соответствующий промотор, такой как прокариотный промотор, способный направлять экспрессию (транскрипцию и трансляцию) генов в трансформируемой ими бактериальной клетке-хозяине, такой как Е. со11.
Промотор является элементом контроля экспрессии, образованным ДНК-последовательностью, которая позволяет осуществлять связывание полимеразы РНК и транскрипцию. Промоторные последовательности, совместимые с выбранными бактериальными клетками-хозяевами, в типичном случае имеются в плазмидных векторах, содержащих подходящие рестрикционные участки для внедрения сегмента ДНК, соответствующей настоящему изобретению.
Типичными прокариотными векторными плазмидами являются рИС18, рИС19, рВК322 и рВК329 (которые могут быть получены от Вюагй ЬаЬогаШпек, КйсЬтопй, СА, И8А), рТгс99А и рКК223-3 (которые можно получить от РНагтааа РЬсаГатау, N1, И8А) и система рΕТ (промотор Т7, Nоνадеη Шй).
Типичной векторной плазмидой клеток млекопитающих является р8УЪ, которую можно получить от Ркагтааа РЬсаГатау, N1, И8А. Этот вектор использует промотор 8У40 для ведения экспрессии клонированных генов, причем наивысший уровень экспрессии был обнаружен в клетках-продуцентах Тантигена, таких как клетки СО8-1.
Примером индуцируемого экспрессирующего вектора клеток млекопитающих является рМ8С, который также можно получить от Ркагтааа. Этот вектор использует глюкокортикоидно-индуцируемый промотор дупликата длинного оконечного участка вируса рака молочной железы мыши для управления экспрессией клонированного гена.
Применимыми плазмидными векторами дрожжевых грибков являются рК8403-406 и рК8413-416, и вообще, они могут быть получены от компании 81га1ацепе С1опШд 8у51ет5, Ьа Йо11а, СА 92037, И8А. Плазмиды рК8403, рК8404, рК8405 и рК8406 представляют собой интеграционные плазмиды дрожжей (У1р8) и они содержат в себе дрожжевые селективные маркеры Ы§3, 1гр1, 1еи2 и ига3. Плазмиды рК8413416 представляют собой центромерные плазмиды дрожжей (УСрк).
Другие применимые векторы для трансформации дрожжевых клеток, такие как РюЫа, содержат 2μплазмид рУХ243 (может быть получен от компании К апй Ό 8у51ет5 Ытйей) и интеграционный вектор группы рРКХ (может быть получен от компании Iην^ΐ^одеη).
Было разработано множество методов для оперативной привязки ДНК к векторам через вспомогательные когезионные окончания. Например, к сегменту ДНК, который должен внедряться в векторную ДНК, могут быть добавлены вспомогательные гомополимерные участки. Затем вектор и ДНК соединяются водородной связью, возникающей между вспомогательными гомополимерными хвостами, с образованием рекомбинантных молекул ДНК.
Альтернативный способ соединения сегмента ДНК с векторами обеспечивается синтетическими связующими мостиками, содержащими один или несколько рестрикционных участков. Сегмент ДНК, образующийся при рестрикционном сбраживании эндонуклеазы, как было описано ранее, обрабатывается бактериофагом Т4 ДНК-полимеразы или ДНК-полимеразой I бактерии Е. со11, т.е. энзимами, которые удаляют выступающие концевые 3'-однострендовые отростки с их 3'-5'-экзонуклеотидной активностью, и внедряют в утопленные 3'-концы способность к полимеризации.
Поэтому комбинация таких функциональных проявлений приводит к образованию тупоконечных сегментов ДНК. Затем эти тупоконечные сегменты инкубируют с большим стехиометрическим избытком молекул-мостиков в присутствии энзима, способного каталитически воздействовать на сшивание тупоконечных молекул ДНК, такого как ДНК-лигаза бактериофага Т4. Таким образом, продуктами реакции являются сегменты ДНК, несущие на своих концах полимерные мостиковые цепочки. Затем эти сегменты ДНК расщепляют подходящим рестрикционным энзимом и пришивают к экспрессирующему вектору, который был расщеплен энзимом, производящим концевые отростки, совместимые с такими отростками сегмента ДНК. Синтетические связующие мостики, содержащие разнообразные рестрикционные эндонуклеазные участки, могут быть в значительных количествах получены из многих источников, включая такие, как !п1егпа11опа1 Вю1ес11по1о§1е5 Шс. №\ν Наνеп, ΟΝ, И8А.
Желательным путем модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей соединение, соответствующее настоящему изобретению, или его часть, является использование полимеразной цепной реакции, как это описано Сайки (8а1к1) и др. (1988) 8аеисе 239, 487-491.
В этом методе нуклеиновая кислота, предназначенная для энзимного умножения, окружается с боков двумя специфическими олигонуклеотидными инициаторами, которые сами становятся включенными в умножаемую нуклеиновую кислоту. Указанные специфические инициаторы могут содержать рестрикционные участки распознавания эндонуклеазы, которые могут использоваться для клонирования в экспрессирующие векторы с помощью известных методов.
Примерный перечень видов дрожжевых грибков, рассматриваемых в качестве предмета для возможного использования при практическом применении настоящего изобретения, включает такие, как РюЫа, 8асскаготусе§, К1иуνе^отусе8, Сапй1йа, ТогЫорык, НащепиИ, 8сЫ7о5асскаготусе5, Сйеготусек,
- 10 011859
Рае11у5о1сп. ОеЬаготусез, Μοΐ5θ1ιιιηί1<ο\νία. Вйойозропйшт, Ьеисозропйшт, Во1гуоа8си8, 8ропйюЬо1и5, Епйотусор818 и им подобные. Предпочтительными видами являются виды, выбранные из группы, состоящей из Р1сЫа, 8ассйаготусе5, Ииууеготусез, Уагго\\1а и Напзепи1а. Примерами 8ассйаготусез являются 8ассйаготусе5 сегеу181ае, 8ассйаготусе5 йайсиз и 8ассаготусез гоихп. Примерами К1иууеготусез являются К1иууеготусез ГгадШз и К1иууеготусез 1асЙ8. Примерами Напзепи1а являются Напзепи1а ро1утогрйа, Напзепи1а апота1а и Напзепи1а сарзиШа. Примером подходящего вида Уагго\\за является Уагго\\1а 11ро1уИса.
Способы трансформации 8. Сегеу131ае в основном рассматриваются в ЕР 251744, ЕР 258067 и АО 90/01063, и все они приводятся здесь путем ссылки.
Подходящие промоторы для 8. Сегеу131ае включают в себя такие, которые связаны с геном РСК1, генами СЛЬ1 или СЛЬ10, СУС1, РНО5, ТКР1, АЭН1, АЭН2, генами для глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, пируватдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы, триозфосфатизомеразы, фосфоглюкозоизомеразы, глюкокиназы, α-сопряженного феромона, а-сопряженного феромона, промотор РКВ1, промотор СИТ и гибридные промоторы, включающие гибриды участков регуляторных областей 5' с участками регуляторных областей 5' других промоторов или с вышестоящими активационными участками (например, промотор по патенту ЕР-А-258067).
Сигналом прекращения транскрипции предпочтительно является фланговая 3' последовательность эукариотного гена, которая содержит соответствующие сигналы для прекращения транскрипции и полиаденилации. Подходящими 3' фланговыми последовательностями могут быть, например, такие из генов, которые естественно связаны с последовательностью управления экспрессией, т. е. могут соответствовать промотору. В альтернативном варианте они могут быть разными, и в этом случае предпочтительным будет сигнал прекращения гена ЛНЭ1 8. Сегеу131ае.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформируемой с помощью полинуклеотидного вектора, составленного согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин может быть либо прокариотной, либо эукариотной. Предпочтительными прокариотными клетками-хозяевами являются бактериальные клетки, и в типичном случае это штамм бактерий Е.сой, такой, например, как штаммы Е.со11 ОН5, которые можно получить от ВеИезйа Везеагсй ЬаЬогаЮпез 1пс., ВеЛезйа, ΜΌ, И8А, и КВ1, которые можно получить от Атепсап Туре СиЙиге Со11есОоп (АТСС) оГ ВоскуШ, ΜΌ, И8А (№ АТСС 31343). Предпочтительными эукариотными клетками-хозяевами являются дрожжевые клетки и клетки млекопитающих, преимущественно позвоночные клетки, такие как позвоночные клетки мыши, крысы, обезьяны или клетки человеческой линии, синтезирующие волокнистые структуры. Предпочтительные эукариотные клетки-хозяева включают в себя клетки N80, яичниковые клетки китайского хомячка (СНО), которые могут быть получены от АТСС, как клетки ССБ61, МН эмбриональные клетки швейцарской мыши МН/3Т3, которые можно получить от АТСС, как клетки СРЬ 1658, и произведенные из почки обезьяны СО81-клетки, которые можно получить от АТСС, как клетки СКЕ 1650 или клетки А8О.
Трансформация подходящих клеток-хозяев нуклеиновой кислотой, конструкт которой соответствует настоящему изобретению, осуществляется хорошо известными методами и обычно зависит от используемого вектора. Относительно трансформации прокариотных клеток-хозяев см., например, Кохен (Сойеп) и др., Ргос. №1. Асай. 8сг И8А, 69: 2110 (1972); и Сэмбрук (8атЬгоок) и др., Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬогаЮгу тапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1й 8рппд НагЬог, ΝΥ (1989). Трансформация дрожжевых клеток описана Шерманом (8йегтап) и др., МеШойз 1п Υеаδΐ СепеИсз, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1й 8ргшд НагЬог, ΝΥ (1986). Может использоваться также метод Беггса (Веддз), Мише, 275: 104-109 (1978). Что касается позвоночных клеток, то реагенты, которые могут применяться при рассечении таких клеток, например, фосфат кальция и ОЕАЕ-декстран или липосомные препараты, могут быть получены от компаний 81га1адепе С1ошпд 8уз1етз или ЫГе Тесйпо1од1ез 1пс, СаййегзЬигд, ΜΌ 208777, И8А.
Удачно трансформированные клетки, содержащие конструкт нуклеиновой кислоты, соответствующий настоящему изобретению, могут распознаваться хорошо известными методами. Например, клетки, получившиеся в результате введения экспрессивного конструкта, соответствующего настоящему изобретению, могут выращиваться и давать полипептид, соответствующий настоящему изобретению. Клетки могут быть собраны и подвергнуты лизису, и их ДНК-содержимое может быть исследовано на предмет присутствия нужной ДНК с помощью такого метода, как описаны в работе Соутерна (8ои1йет), 1. Мо1. В1о1., 98: 503 (1975) или в работе Берента (Вегеп!) и др., Вю1есй., 3: 208 (1985). В альтернативном варианте присутствие протеина в надосадочной жидкости может выявляться с помощью антител, как это описано ниже.
Вдобавок к прямому определению присутствия рекомбинантной нуклеиновой кислоты успешную трансформацию можно подтвердить хорошо известными иммунологическими методами, когда рекомбинантная нуклеиновая кислота способна направлять экспрессию белка. Например, клетки, успешно трансформированные экспрессирующим вектором, выделяют белки, проявляющие соответствующую антигенную активность. Образцы клеток, предположительно претерпевших трансформацию, отбирают и оценивают на присутствие белка с помощью подходящих антител.
Таким образом, вдобавок к самим трансформированным клеткам-хозяевам настоящее изобретение
- 11 011859 охватывает также и культуру таких клеток, предпочтительно моноклонную (клонально гомогенную) культуру, или культуру, выведенную из моноклонной культуры в питательной среде. Предпочтительно, если эта культура содержит также белок.
Питательная среда, пригодная для культивирования трансформированных клеток-хозяев, хорошо известна в данной области техники, и ее можно получить из нескольких разных коммерческих источников.
Третьим аспектом настоящего изобретения является вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, соответствующую второму аспекту настоящего изобретения.
Четвертым аспектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, содержащая вектор, соответствующий третьему аспекту настоящего изобретения.
Предпочтительно, если клетка-хозяин является клеткой млекопитающих, такой как клетка N80 или СНО.
Соединение, соответствующее настоящему изобретению, может быть выделено из среды культивирования с использованием последовательности из нескольких или из всех следующих стадий: жидкостная АЬх-хроматография на смешанных смолах, хроматография рекомбинантного белка А и жидкостная хроматография на О-сефарозе. с последующей диафильтрацией тангенциального потока (РеШеои 2) для буферного обмена в составной буфер. В эти стадии может быть включена вирусная дезактивация и удаление. Стадии вирусной дезактивации и удаления не являются необходимыми для собственно очистки, но используются для удовлетворения нормативных соображений.
Подробности методов, пригодных для производства соединения, соответствующего настоящему изобретению, описаны в работе Джиллиса (С1Ше§) и др., (\УО 99/29732, включено сюда в виде ссылки). Другие подходящие методики описаны в Мо1еси1аг С1ошпд: а ЬаЬота1оту Мапиа1: 3-е издание, Сэмбрук и Расселл (8атЬгоок апй Ки88е11), 2001, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬота1оту Рге55.
Пятым аспектом настоящего изобретения является лекарственный препарат, содержащий вещество, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель.
Предпочтительно, если соединение, например гибридный белок, может быть замешано в фосфатную буферную соль (РВ8), в буферы, содержащие аргинин, цитрат, маннит и/или тройник или другой подходящий стандартный буферный агент, входящий в состав белковых препаратов.
Определенные преимущества могут быть получены, если соединение пригодно для парентерально го введения в организм.
Удобно, если препарат исполнен в единичной дозировке, содержащей дневную дозу или единицу, частичную дневную дозу или соответствующую долю активного вещества.
Соединения, отвечающие настоящему изобретению, обычно будут вводиться перорально или каким-либо парентеральным путем в форме лекарственного препарата, содержащего активный ингредиент, возможно в форме нетоксичной органической или неорганической кислоты или основания или аддитивной соли, в фармакологически приемлемой форме дозировки. В зависимости от заболевания и конкретного пациента, которого предстоит лечить, а также в зависимости от пути введения в организм, эти вещества могут назначаться в разных дозировках.
При лечении людей соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут назначаться отдельно, однако, в общем, они будут вводиться в смеси с подходящими фармацевтическим наполнителем, разбавителем или носителем, выбранным с учетом предусмотренного пути введения и стандартной фармакологической практики.
Например, соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться в организм перорально, внутриротно или подъязычно в форме таблеток, капсул, овул, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать ароматизирующие или красящие вещества, и их форма может предусматривать задержанное или контролируемое поступление вещества в организм. Вещества, отвечающие настоящему изобретению, могут вводиться также путем внутрисосудистой инъекции.
Такие таблетки могут содержать наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция двухосновный фосфат кальция и глицин, дезинтеграторы, такие как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный или тапиоковый), натриевый крахмальный гликолят, кроскармелозу натрия и некоторые комплексные силикаты, а также связующие для грануляции, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), гидроксипропилцеллюлозу (НРС), сахарозу, желатин, аравийскую камедь. Дополнительно могут быть добавлены смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк.
Твердые составы подобного типа могут быть использованы в качестве наполнителей в желатиновых капсулах. В этом отношении предпочтительными являются такие наполнители, как лактоза, крахмал, целлюлоза, молочный сахар или высокомолекулярные полиэтиленгликоли. В случае водных суспензий и/или эликсиров вещества, соответствующие настоящему изобретению, могут применяться в комбинации с различными вкусовыми или ароматизирующими веществами, окрашивающими веществами или красителями, с эмульгаторами и/или суспендирующими добавками, а также с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин и их комбинациями.
Соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться также парентерально,
- 12 011859 например, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшино, внутриоболочечно, внутревентрикулярно, внутриастернально, внутрикраниально, внутримышечно или подкожно, либо они могут вводиться методами инфузии. Лучше всего использовать их в форме стерильного водного раствора, который может содержать и другие вещества, например, достаточное количество соли или глюкозы, которые делают раствор изоосмолярным по отношению к крови. Эти водные растворы, при необходимости, должны быть надлежащим образом буферированы (предпочтительно, на рН от 3 до 9). Приготовление подходящих парентеральных препаратов в стерильных условиях легко осуществляется стандартными фармакологическими методами, хорошо известными специалистам в данной области техники.
Препараты, пригодные для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворы, которые придают препарату изоосмолярность по отношению к крови пациента, которому назначено лечение; а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие вещества и загустители. Препараты могут быть представлены в единичной дозировке или в многодозных контейнерах, например, в запаянных ампулах и пузырьках, и они могут храниться в высушенном на холоде (лиофилизированные) состоянии, требующем лишь добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекции прямо перед использованием препарата. Растворы, приготовленные для немедленной инъекции, и суспензии могут готовиться из стерильных порошков, гранул и таблеток, которые были описаны ранее.
Врач будет определять фактическую дозу, которая будет наиболее подходящей для каждого конкретного пациента, и эта доза будет изменяться в зависимости от возраста, веса и реакции конкретного пациента. Дозировки, описанные в примере 9, являются примерами, характерными для среднего случая. Конечно же, на практике могут быть индивидуальные случаи, где назначаются более высокие или более низкие дозировки, и все они попадают в область действия настоящего изобретения.
Шестым аспектом настоящего изобретения является соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, предназначенное для использования в медицине.
Седьмым аспектом настоящего изобретения является использование соединения, соответствующего первому аспекту настоящего изобретения, для изготовления лекарственного препарата для лечения пациентов, больных раком.
Восьмым аспектом настоящего изобретения является способ лечения пациента, больного раком, причем этот способ содержит введение в организм указанного пациента вещества, соответствующего первому аспекту настоящего изобретения.
В принципе, соединения и композиции, соответствующие настоящему изобретению, могут использоваться для лечения любых млекопитающих, включая их детенышей, таких как собак и кошек, а также сельскохозяйственных животных, таких как коровы, лошади и свиньи.
Однако преимущественно пациентом является человек.
Соединения, соответствующие настоящему изобретению, особенно пригодны для лечения плотных опухолей, таких как глиобластомы. Другими предпочтительными показаниями являются раковые опухоли яичников, желудка, ободочной и прямой кишки и поджелудочной железы.
Теперь приведем подробное описание изобретения, ссылаясь при этом на следующие примеры, которые, однако, не ограничивают область распространения изобретения.
На фиг. 1 показана схема предпочтительных конфигураций переменных участков антитела (заштрихованные овалы) постоянных участков (белые овалы), субъединиц 1Ь-12 р35 (маленькие прямоугольники), субъединиц 1Ь-12 р40 (большие прямоугольники), шарниров и сшивающих цепочек антитела (толстые линии) и дисульфидных связей (тонкие линии). Особенно предпочтительные варианты реализации изобретения содержат ненарушенные антитела 1д-типа с р35, привитыми к С-концевой последовательности тяжелой цепи, и р40, прикрепленными к р35 посредством дисульфидной связи (фиг. 1А); «мини-тело» с У-областями антитела, соединенное мостиком и прикрепленное через шарнир к домену СН3, р35, привитые к С-концевой последовательности тяжелой цепи, и р40, прикрепленные к р35 дисульфидной связью (фиг. 1В); кЕу с р35, привитыми к У-области, и р40, прикрепленные дисульфидной связью (фиг. 1С); и ЕаЬ с р35, привитыми к С-области, и р40, прикрепленные дисульфидной связью (фиг. 1Ό). Субъединица 1Ь-12 р35 также может быть прикреплена к Ν-концевой последовательности У-области. Субъединица 1Ь-12 р40 может быть прикреплена к р35 через дисульфидную связь или через мостик, образуя так называемый компонент «Ш-12 одиночной цепи» (кс1Ь-12).
На фиг. 2 показан конструкт рбΗ^11-йиΒС1-М1-йир35 (см. пример 1). На рисунке изображены следующие отличительные особенности:
- 13 011859
Позиции нуклеотида Описание
с 1 (ЕсоК!) до 664 (ХЬа!) Усилитель экспрессии и промотор СМУ
с 664 (ХЬа!) по 1114 Геномный лидер ί-цепи иммуноглобулина мыши
с 1115 по 1439 VI.
с 1440 (ВатН! на1447) ΠΟ1867 Интрон между VI и С1.
с 1868 по 2190 Участок кодирования С1_ и кодон прекращения трансляции
с 2191 ПО 3054 (ЗаП) Нетранслируемый участок 3’ и полиаденилационный сигнал гена каппа-цепи иммуноглобулина человека
с ЗО54(ЗаП) по 3721 (ХИо1) Усилитель экспрессии и промотор СМУ
с 3721 (ΧήοΙ) по 4176 Геномный лидер ί-цепи иммуноглобулина мыши
с 4177 по 4534 УН
С 4535 (ΗίηάΙΙΙ) по 6347 Геномная последовательность постоянного участка у1-гена иммуноглобулина человека с деиммунизированным М1 на узле гибридизации
с 6348 по 6941 Участок кодировки чел. Р35 и кодон прекращения трансляции
с 6942 (ХЬо! при 6944) по 7190 Нетранслируемый участок 3‘ и
с 7191 по 9484 (ЕсоК!) полиаденилационный сигнал позднейшего участка 5У40 Источник репликации и β-лактамазный ген из
с 9484 (ЕсоЕН) по 9713 с 9714 по 10277 рВК322 Усилитель экспрессии и промотор искаженного ЗУ40 □НЕК с-ДНК
с 10278 по 10362 Нетранслируемый участок 3’ ϋΗΕΚ привитого к полиаденилационному сигналу раннего участка ЗУ40 через пришивку прилипающего конца ВдШ к прилипающему концу ВсП
с 10363по10599 Полиаденилационный сигнал раннего участка ЗУ40
На фиг. 3 показан конструкт ρNео-С.МV-1ш (см. пример 1). На рисунке изображены следующие отличительные особенности:
- 14 011859
Позиции нуклеотида Описание
с 218 по 871 Усилитель экспрессии и промотор СМ\/
С 888 ПО 953 Нативный сигнальный пептид Ьи р40
с 954 по 1874 Зрелая последовательность Ни р40 и кодон прекращения трансляции
с 1884 по 2292 Муреиновый каппа- попиаденилационный сигнал
с 2299 по 4591 Источник репликациии и β-лактамазный ген из рВК322
с 3526 по 4386 β-лакгамазный ген
с 5630 по 6424 Неомицино-устойчивый ген
На фиг. 4 показано связывание четырех конструктов (йиВС1-ти1Б12, 1шВС1-11и1Б12. тиВС1 и 1шВС1) с фрагментами рекомбинантного карциноэмбрионального фибронектина ΡΝ789 и ΡΝ7Β89 (см. пример 3).
На фиг. 5А показан подбор дозы нескольких вводимых клеток И-87-МС в зависимости от скорости роста подкожных опухолей (см. пример 5). На фиг. 5В показана противоопухолевая эффективность йиВС1-ти1Б12 в подкожной модели И87-МС на 8СГО-мышах.
На фиг. 6 показана противоопухолевая эффективность 1шВС1-ти1Б12 в подкожной модели А431на 8СГО-мышах (см. пример 5).
На фиг. 7 показана противоопухолевая эффективность 1шВС1-ти1Б12 в подкожной модели РС3тт2 на 8СГО-мышах (см. пример 5).
На фиг. 8 показана противоопухолевая эффективность ЬиВС1-ти1Ь12 в НТ29 подкожной модели на 8СГО-мышах (см. пример 5).
На фиг. 9 показано влияние, оказываемое введением ЬиВС1-ти1Ь12, на (А) поверхность легкого, покрытую метастазами, и (В) на вес легкого после инъекции клеток карциномы простаты РС3тт2 в мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СГО) (см. пример 5).
На фиг. 10 показан фармакокинетический анализ йиВС1-ти1Б12 и йиВС1-йи1Б12, проведенный на мышах (см. пример 5). ВАЬВ/с-мышам делали инъекцию 25 мг йиВС1-ти1Б12 в хвостовую вену. В различные моменты времени ретроорбитальным взятием крови отбирали небольшие образцы крови. Плазму анализировали тестом для улавливания антигенов с античеловеческой 1дС Н&Ь антисывороткой с детектированием с помощью античеловеческого или антимуреинового антитела 1Ь12 (компании Κ.&Ό 8у51ет5). Результаты были нормированы на исходную концентрацию в сыворотке каждой мыши, взятой немедленно после инъекции (1=0). Время полуциркуляции для обеих молекул в организме мышей составляет приблизительно 19 ч.
Примеры
Пример 1. Продуцирование гибридного белка йиВС1-йи1Б12.
I. Формирование экспрессирующих векторов для йиВС1-йи1Б12.
1. Переменная область легкой цепи (УБ).
ДНК, кодирующая переменную область легкой цепи (УБ) гуманизированного антитела ВС1, была представлена в форме плазмида ККА.рММК010. Для приспособления УБ ДНК к экспрессирующему вектору рбНБ11 была использована полимеразная цепная реакция (РСК). Форвардный праймер содержит последовательность 5'-С ТТА АСС САА АТТ СТС ТТС АСС САС ТС-3' [ПОСЛ. № 11], где СТТААС представляет собой участок рестрикционного распознавания А1Ш, а САА является Ν-концевым аминокислотным остатком зрелой УБ. Реверсный праймер имеет последовательность 5'-ССАТССАСТТАСС ТТТ САТ СТС САС СТТ СС-3' [ПОСЛ. № 12], где подчеркнутая последовательность гибридизирована с концом 3' легкой цепи УБ, а ССАТСС добавляет участок рестрикционного распознавания ВатН1 ниже по ходу цепи от донорного участка расщепления УБ.
Для секреции легких и тяжелых цепей гибридного белка 1иВС1 была использована геномическая сигнальная пептидная последовательность гена легкой цепи иммуноглобулина мыши. Для оптимального связывания рибосомы для инициирования трансляции при АТС была введена согласующая последовательность Козака ССАССАТСС |Кохак (1984) №11иге 308: 241]. Это достигалось мутированием первого аминокислотного остатка после преобразования инициирующего кодона из ААС в САС, чтобы получить последовательность ТСТАСАССАССАТССАС [ПОСЛ. № 13], где подчеркнута согласующая последовательность Козака, а участок (ТСТАСА) рестрикционного распознавания ХЬа1 помещается на конце 5'.
На конце 3' сигнального пептида генная последовательность, кодирующая -2 аминокислотный остаток (-1 аминокислота, являющаяся С-оконечным остатком сигнального пептида), была мутагенезирована из серинового остатка в лейкиновый остаток (из АСС в ТТА), так что ДНК, кодирующая конец сигналь
- 15 011859 ного пептида, будет представлять собой СТТААСС. где СТТААСС является созданным рестрикционным участком А1Ш [Ло (Ьо) и др.. (1998) Рго1еш Епдшеетшд 11: 495]. Поэтому сигнальная пептидная последовательность содержит заместитель на первом аминокислотном остатке после инициирующего кодона, и другой заместитель в аминокислотном остатке в -2-положении. Поскольку сигнальный пептид вырезается сигнальной пептидазой внутри клетки и не появляется в секретируемом клеткой белке, эти мутации не влияют на состав продуцируемого антитела. Фрагмент 450-Ьр ХЬа1-А1111, содержащий геномическую сигнальную пептидную последовательность, был пришит к фрагменту А1111-ВатН1, кодирующему УЬ для получения фрагмента ХЬа1-ВатН1, и он, в свою очередь, вводился в рйНЬ11 экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные элементы транскрипции и последовательности постоянных областей иммуноглобулина (см. далее).
2. Переменная область тяжелой цепи (УН).
ДНК, кодирующая переменную область тяжелой цепи (УН) гуманизированного антитела ВС1, была получена в форме плазмида РНА.рСаттаЕ Для приспособления УН ДНК к экспрессирующему вектору рйНЬ11 была использована полимеразная цепная реакция (РСВ). Форвардный праймер содержит последовательность 5'-С ТТА АСС САС СТС САС СТС СТС САС ТС-3' [ПОСЛ. № 14], где СТТААС представляет собой участок рестрикционного распознавания АПН, а САС является Ν-концевым аминокислотным остатком зрелой УН. Реверсный праймер имеет последовательность 5'-ААССТТАСТ ТАС СТС АСС АСА ССС АСА СС-3' [ПОСЛ. № 15], где подчеркнутая последовательность гибридизирована с концом 3' тяжелой цепи УН, а ААССТТ добавляет участок рестрикционного распознавания НшйШ ниже по ходу цепи от донорного участка расщепления УН.
Перед сшиванием с тяжелой цепью ДНК участок ХЬа1 фрагмента 450-Ьр ХЬаЕАПП, содержащего геномную сигнальную пептидную последовательность, был преобразован в участок Х1ю1 путем пришивки соединительного мостика, чтобы получить последовательность ССТССАСССТАСАССАССАТССАС [ПОСЛ. № 16], где ССТССАСС является последовательностью сшивающего мостика Х1о1, СТАСА представляет собой прилипающий конец ХЬа1, который сделан тупым путем заполнения фрагментом Кленова (К1еиоте) ДНК-полимеразы, а ССАССАТСС представляет собой согласующую последовательность Козака (Кохак). Рестрикционный фрагменет ХНо1-АП11, содержащий геномный лидер, пришивался к фрагменту АЛП-НшйШ, содержащему УН-ген, а затем полученный фрагмент Х1ю1-Нтй111 вставлялся в экспрессирующий вектор рйНЬ11, который уже содержит регуляторные элементы транскрипции и последовательности постоянной области иммуноглобулина (см. далее).
3. Постоянные области человеческого гена.
Конструкт легкой цепи использует постоянную область каппа-цепи человеческого гена, а конструкт тяжелой цепи использует постоянные области человеческой гамма-1-цепи. Имеется рестрикционный участок 8та1, расположенный 280 Ьр выше кодона прекращения трансляции в природной последовательности ДНК, кодирующей домен СН3. Этот участок 8та1 был разрушен введением мутации в неструктурной части (ТСС в ТСА). Другая мутация в неструктурной части была введена 10Ьр выше кодона прекращения трансляции для образования последовательности С ССС ССТ ААА (8ТОР) [ПОСЛ. № 17], которая содержит новый участок 8та1 [Ло (Ьо) и др., (1988) Рто1еш Епдшеетшд 11: 495]. Этот рестрикционный участок 8та1 теперь является уникальным в экспрессирующем векторе рйНЬ11, и он используется в качестве узла гибридизации для создания гибридных протеинов антитело-цитокин.
4. с-ДНК, кодирующие субъединицы р35 и р40 человеческого 1Ь-12.
с-ДНК субъединиц р35 и р40 человеческого 1Ь12 были клонированы из человеческих периферийных моноцитов крови (РВМС) с использованием полимеразной цепной реакции (РСВ). Первая цепь сДНК была синтезирована с использованием олиго-йТ-праймера и обращенной транскриптазы. Продукт с-ДНК был использован в качестве шаблона для РСВ. Для субъединицы р35 сенсорный праймер имел последовательность 5'-ССАСАААССААСАСАССАСАС-3' [ПОСЛ. № 18], а антисенсорный праймер имел последовательность 5'-ССАСССАССТССАСТТТТАССААССАТТСАС-3' [ПОСЛ. № 19]. Сенсорный праймер выводится из последовательности в 5'-нетранслированной области передачи р35 сразу перед участком Хта1 тогда как антисенсорный праймер кодирует кодон прекращения трансляции, за которым вскоре следует рестрикционный участок Х1ю1 для направленного клонирования. Праймерами для субъединицы р40 с-ДНК были 5'-СТСССТССТСТСТАСАССААСАТСТСТС-3' [ПОСЛ. № 20] в случае сенсорного праймера, и 5'-ССТТСТССАСААССТААСТССАССССАСАС-3' [ПОСЛ. № 21] в случае антисенсорного праймера. Сенсорный праймер вводит уникальный участок ХЬа1 выше участка начала трансляции, тогда как антисенсорный праймер вводит Х1ю1-участок ниже кодона прекращения трансляции.
5. Конструкция ДНК йиВС1-Н-цепь-чел. Р35.
Клонированная р35 с-ДНК после подтверждения последовательности была приспособлена к экспрессии в качестве гибридного белка следующим образом. При гибридном соединении аминокислотным остатком на С-окончании СН3 является лизин, а на Ν-окончании остатком зрелой р35 является аргинин. Для минимизации протеолиза при гибридном соединении с этими двумя основными остатками оба из них были мутагенизированы в аланин, который, как было показано ранее, в случае иммуноцитокина 1Ь2 продлевает период сывороточного полураспада [Джиллис (Сййек) и др., (2002) С1ш. Сапсег Век. 8: 210].
- 16 011859
Для реконструкции гибридного соединения имеется удобный участок Ва11, расположенный как раз на 11 базисных конъюгации (Ьр) ниже зрелого Ν-окончания р35. Следовательно, олигонуклеотидный связующий мостик Хта1-Ва11, состоящий из сенсорной цепи 5'-ССС ССС ССС ОСА ААС СТС ССС СТС 6-3' [ПОСЛ. № 22] и антисенсорной цепи 5'-С САС ССС САС СТТ ТСС ССС СС-3' [ПОСЛ. № 23], где ССС ССА обозначает два аланиновых заместителя, был синтезирован и пришит к рестрикционному фрагменту Ва11-Хйо1, кодируя остаток субъединицы р35. Полученный фрагмент Хта1-Хйо1, в свою очередь, был пришит к уникальному рестрикционному участку Хта1 в экспрессирующем векторе рбНЬ11, образуя гибридное соединение СН3-р35. Пептидная последовательность в этом соединении ^8^8РСААN^РУ [ПОСЛ. № 24], где АА представляют собой два аланиновых заместителя, является неизвестной и потенциально иммуногенной. Действительно, она содержит эпитоп потенциального Т-фага-помощника, который может быть удален мутацией остатков Ь8Ь8 в АТАТ, опираясь на биотехнологию, именуемую деиммунизацией. Полученная в результате деиммунизированная гибридная последовательность называется последовательностью М1. Поэтому ДНК йиВС1-Н-цепь-М1-йи р35 состоит из фрагмента ХйоБНшбШ, кодирующего сигнальный пептид УН, фрагмента НшбШ-ХтаТ, кодирующего постоянные области геномной человеческой Н-цепи 1дС1 с деиммунизированным соединением, и фрагмент Хта1-Хйо1, кодирующий субъединицу р35.
6. Экспрессирующий вектор рбНЬ11-йиВС1-йи р35.
Экспрессирующий вектор рбНЬ11 выведен из рбНЬ7, который был описан ранее (Джиллис (С1Ше8) и др., (1998) 1. 1ттипо1. 160: 6195). Как и в векторе рбНЬ7, две транскрипторные единицы для Ь и Н цепей в векторе рбНЬ11 содержат усилитель-промотор СМУ [Босхарт (Вокйай) и др., (1985) Се11 41: 521530]. ДНК для усилителя-промотора СМУ были получены из фрагмента АИШ-НтбШ доступной рс^NАI (1пуйгодеп Согр. 8ап Э|ецо. СА). На конце 3' Ь-цепь использует 3'-нетранслированную область и полиаденилационный сигнал человеческого гена с иммуноглобулиновой каппа-цепью, а Н-цепь использует 3'-нетранслированную область и полиаденилационный сигнал позднейшего участка 8У 40.
Главное различие между рбНЬ7 и рбНЬ11 заключается в транскрипторной единице для селекционного маркера дигидрофолатредуктазы (ЭНБК). Усилитель 8У40 для этой транскрипторной единицы был нарушен в рбНЬ11 следующим образом. В усилителе/промоторе 8У40 имеется 72 Ьр-дупликации, и внутри каждой из этих 72 дупликаций имеется рестрикционный участок 8рй1. Прививка участка 8а11 5' усилителя к удаленному участку 8рй1 через олигонуклеидный мостик-переходник приводит к отмене 120 Ьр из двух дупликаций Ьр. Такой безусилительный промотор должен давать намного более низкий уровень экспрессии селекционного маркера ЭНБК. Теоретически это должно выражаться в меньшем числе устойчиво тренсфектированных клеточных клонов, которые для выживания при выборе медикамента должны бы иметь плазмид, встроенный в активную область транскрипции хромосомы, так чтобы из безусилительного промотора экспрессировалось достаточное количество ЭНБК. Интересующие нас гены, возникающие под действием полностью функциональных усилителей и промоторов, должны экспрессироваться в этой активной области транскрипции на значительно более высоких уровнях. Кроме того, в рбНЬ11 ориентация этой ослабленной транскрипторной единицы была перевернута, так что СМСусилитель для легкой цепи при экспрессировании ЭНБК не может оказывать прямого действия на удаленный промотор 8У40.
Конструкт рбНЬ11-йиВС1-М1-йир35 был в значительной степени картирован ограничением расщепления эндонуклеазы. Кодирующие области целых Ь- и Н-цепей были полностью секвенированы. Его отличительные свойства показаны на фиг. 2.
7. Экспрессирующий вектор для субъединицы йи р40.
Клонированная р40 с-ДНК, содержащая полностью открытую рамку считывания, после подтверждения последовательности была вшита в отдельный экспрессирующий вектор, как фрагмент ХЬа1-Хйо1. Этот экспрессирующий вектор р№о-СМУ-йи р40 содержит неомициноустойчивый ген для отбора трансфектированных клеток с использованием неомицинового аналога С418. Экспрессия р40 контролируется усилителем-промотором СМУ, и использует муреиновый каппа-полиаденилационный сигнал.
Конструкт р№о-СМУ-йи р40 был в значительной степени картирован ограничением расщепления эндонуклеазы. Его отличительные свойства показаны на фиг. 3.
II. ДНК и протеиновые последовательности йиВС1-йи1Ь12.
1. Пептидная и ДНК последовательность легкой цепи йиВС1-йи1Ь12.
Пептидная последовательность секретируемой легкой цепи гуманизированной ВС1-йи1Ь12 имеет следующий вид (УЬ подчеркнуто):
Е1УЪТО8Р01Ъ8Е8РОЕКАТЬЗС8А858188ТтН\УУООКРООАРКБЕ1УК Т8НБА801РРВЕ808080ТОГ1Ъ,П8КЕВРЫ)РАУУУС000881РЕТР&00 ΙΏ^^ΤνΑΑΡ8νΡΠΤΡ8ΡΕςΐΚ8ΟΤΑ8νναΐ1^^ΒΕΑΚνρΨΚν ОЙАБф8(ЗМ8СЕ8УТЕрО8К0£ТУ8Е88ТЬТЪ8КАП¥ЕКНКУ¥АСЕУТН 6ОЬ88РУТК8Е№.ОЕС (ПОСЛ. № 7)
- 17 011859
Последовательности ДНК конструкта легкой цепи, начиная с кодона инициирования трансляции АТС, и заканчивая кодоном прекращения трансляции ТАС, приведены ниже (УЪ подчеркнуто; заглавные и строчные буквы представляют кодирующие и не кодирующие последовательности соответственно):
АТСОАОТТОССТСТТАОССТОТТСОТССТОАТОТТСТООАТТССТСдС са§а{д@дааса1:г1Ёс1а1аа1даааайа^ааа1дйаГдссХ8^а{й81с1аа81аа18ссйадаадСдас( а§асасйдсаайсасййй1ее£ааВааёа§айй1аЕВсеа1ааааваа1ёйаб®баааайааас£а1саса
СТТААОСОАААТТОТОТТОАСОСАОТСТССАаОСАСССТОТСТТТОТ СТССАОСОСАААОАОССАСССТСТССТОСАСТОССАСтТТСААОТАТ ААаТТССААТТАСТТССАТТООТАССАССАСАААССТОСССАаОСТ СССАСОСТССТСАТСТАТАООАСОТССДАТСТООСТТСТОЭСАТССС АОАСАОСТТСАОТСОСАОТОССТСТ(КЮАСАСАСТТСАСТСТСАСС АТСАОСАОАСТСЮАСССТОААОАТТТТдСАОТаТАТГАСТСЗТСАОС А<ЗССТАаТАОТАТАССАТТСАСаТТТОСССАОО(ЗОАССААОСТОаА ОАТСАААСеШе1ййа1ссШса£гг1йисаяаайК£ас1ааавдса1е1саес1а1Е1д1дас{аа1 Вд1аагд£сас1аадо1:§сдсда1сссдсаайс1ааасЩ1:2аёа8до1сд8а1дасЁ1д§ссаТ{сЩ:дсс1аа а£саП8а£Шас1§саа2£1са£аааавса1дсааа2ссс1са£аа1££йдсааа&а£сЩсаасаааасаа 1:йадаасШаПаад8аа1адддй8аа§с4а£2аа§ааас1сааааса1саа2аййааа1асдсисйдд1с1с Сй§с1а1аайа1хб^а1аа§са18с1§ййс1д1с1§1сос1аасаб5ссс1д^ана1ссёсааасаасасас ссааё5Исаваа91Й2Йасйааасасса1сс1д1и£Сйс1Йсс1садОААСТОТООСТСгСАСС АТСТОТСТТСАТСТТСССаССАТСТОАТОАССАСТ/ТОАААТСТСКЗАА СТСССТСТеГГОТСТОССТОСТСААТААСТТСТАТСССАСАОАСССС АААОТАСАСтеОААССТСОАТААСОСССТССААТСООСТААСТССС АСОАСАОТОТСАСАОАОСАбСАСАССААСтОАСАССАССТАСАОСС ТСАСтСАОСАСССТОАСОСТСАОСАААОСАСАСТАССАОАААСАСА ААОТСТАСОССТОСОААОТСАСССАТСАОООССТОАССТСССССОТ САСАААПАССТТСААСАСОООАОАОТОТТАС (ПОСЛ. № 9)
2. Пептидная и ДНК последовательность тяжелой цепи йиВС1-йи1Ь12.
Пептидная последовательность секретируемой тяжелой цепи 1шВС1-1шр35 имеет следующий вид (УН подчеркнуто, деимунизированное М1 соединение изображено курсивом, а человеческий р35 - жирным шрифтом):
ЕУОЕУО8САРУККР6АБУКУ8СКА8СУТРТНУУМНУ/УВ.ОАРСООЕЕ
ΨΕΟΥΙΝΡΥΝΡΟΤΟΥΝΕΡΓΚΟΚ.νΤΜΤΟΡΤ8Ι8ΤΑΥΜΕΕ8ΚΕΤ8ΡΡΤΑνΥ
УСАКЕУУ0ЫУ№О№УОО0ТЕУ5У88А8ТКОР8УЕРЕАР88К8Т8ССтТА
АЕОСЬУКРУТРЕРУТУ81УН8САЕТ5СУНТРРАУЬС88СЕУ8Т88УУТУР
838Ε^ΤΥΐατνΝΗΚΡ3ΝΤΚνΡΚΚνΕΡΚ80ΡΚΤΗΤΩΡΡσΡΑΡΕΕΕθσΡ
8УЕЕЛТРКРКРТЕМ18КТРЕУТСУ7УРУ8НЕРРЕУ1аТЖ¥УРОУЕУНМ
ΑΧΉζΡΚΕΕρΥΝ8ΤΥΚνΥ8νΐΤνΕΗςΡΨΕΝσΚΕΥΚΟΚΎ.3ΝΚΑΕΡΑΡΕ
КТ18КАКСфР1ШРфУУТЕРР81ШЕМТ№фУ8ЕТСЕУКСЕУРЗР1АУЕ7ЛВ 8NΟ^ΡΕNNΎΚ^ΤΡΡV^^8^σ8ΕΓ^Υ8Κ^ΤV^Κ8ΚΨ^^σNVΡ8С5VΜΗΕ ΑΕΗΗΗΥΤςΚ8^^ΓΡσΑίΝΕΡνΑΤΡΡΡΟΜΕΡ(ΧΒΗ8ς}ΝΕΕΗΑν8ΝΜ ЬСКАНЧТ1£ВУРСТ8ЕЕП)НЕР1ТКРКТ8ТУЕАСЬРЪЕЬТК№8СЕН 81ЖТ8ЕП7Я<^СЕА811КТ8ЕММАЬСЬ881¥ЕРЕКМУрУЕЕКТМЦАК
ΕΣΐν№ΡΙ<Ί^ρΐΕΕΟΡΝΜΕΑνΊΡΕΤ,Μφ3ΥΕΝΕΝ8ΕΤλ·ΤΟΚ88ΕΕΕΡΡΕΥΚ Τ^ΐαθίΕΕΗΑΤΊΚΠθνΤΙΡΚνΜ8ΥΕΝΑ8 (ПОСЛ. № 6)
Последовательности ДНК конструкта тяжелой цепи, начиная с кодона инициирования трансляции АТС, и заканчивая кодоном прекращения трансляции ТАА, приведены ниже (УН подчеркнуто; заглавные и строчные буквы представляют кодирующие и не кодирующие последовательности соответственно):
- 18 011859
АТОСАСТТОССТО’£ТАОССТ01ТОСТОСТОАТ&ТТСТСЮАТТССте^ £а£8а£а£а£§£аа£фа£е8а£§а8аа1^асад£йадса£§а£сжЛдаа!сссаидсСсаПсса{£1а !а^са±£8@Г(^аа£а12^с±1Мсйсса§са!§§^сс{с{^^аа!асй£|±а5а§£§а£2Пс са@а^§ааса1^сШаа^ааё^Швааа!^а1§ес!^§а^1:с!аав1аа(1£ссЙаёаа@1§ас!
2й§ааа1аааааааааЖ13йб^8^1са1Ёаа1Ш^^!аасШ^Шс1с|в!саД^Мса8СТГС СТТААОСОАСОТОСАОСТССТССАаТСТССШСТаАСОТСААОААО ССТОСОаССТСАСТОАЛОСТСТССТОСААСОСТТСТООАТАСАССТГ САССААСТАСаТААТОСАСТОССТССОАСАСЮССССТОСАСААСтСЮ С1ТОАОТОССТС<ЮАТАТАТТ,4АТССТТАСААТОАтеаТАСТСАОТА СААТОАОА0<ЗТТСАА400САССЮТСАССАТСАСС0ССЮАСАССтТСС АТСАОТАСАСССТАТАТООАОСТОАОСАСССТОАСТГСТСАССАСА ССОСбОТОТАТТАСТОТССОАдАОАООТСТАТООТАЛСТАСАТСТО (ЮаСААСТСЮООССАОСгаААСССТООТСТССОТСТСОТСАО^иаё сйМайггса££сса£есс1йассййесЮййЕесаейаа£аЕегс!аайа!каяясаяеХяйСЕссай сс১с§сасасссаа!£ссса15аёсссаёасас1^асвсг8ааилс8о6£аса§йаа£аассса5䧧 сс!с18С2ссс!28ёссса2с1с1§1сссасаосйС881саса18ёсассасс1с1сй£са£ССТССАСС аасоосссатсоотсггссссстоосассстсстссааоаосасстс ТОССвССАСАССОССССТССССТСССТбОТСААСгСАСТАСТГСССС ОААССОСТОАС6СТСТСОТООААСТСАООСОСССТОАССАСССОСО ТОСАСАССТТСССООСТОТССТАСАОТССТСАООАСТСТАСТСССТС АОСАОСОТООтеАССОТбСССТССАОСАОСГГОСОСАСССАСАССТ АСАТСТОСААСОТСААТСАСААОСССАОСААСАССААООТСОАСАА СА6АОТТОе18а8ай8ссайсасад8аеедае§е1е^Ес1£^айссаё§с1са8свс1сйбс с^ас§са1сссв8сШ8са§£сссаЁ1соа888сайсааееса§8ссссе1с(всс1:сйсасссв8а2§ ссЩдсосйссссасЛса^ска^Ёйаяайе&^с/^сШЙссссаддйс/д^оад^сасад^сйаё £^сосс1зассса£§ссс^сасасааа8^8са££С8с1е&5сй:аЕасс1ёссаа®аёсса£а1сс8в®а ^ассс1£сссс!дас»{ш£сссассссааа^ссааас1йссас!ссс1саяс1с5^сассйс1с1сс1сс са§а11сса^аас!сссаа!сис1£1<±£са^ССССАААТСТТСТСАСААААСТСАС АСАТССССАССОТОСССАОеШессаасссайесс^сессйссавсЛсааезсадаса йй1ассс^Ёай1а£СС{йса1сса£££аса£кссссайсс£££!£сиасаск1ссасс!сса1с!:сйсс!са ИСАССТОААСТССТССШООАССОТСАОТСТТССТСТГССССССААА АСССААОСАСАСССТСАТОАТСТСССООАССССТОАСЮТСАСАТОС ОТСОТСОТСОАССТОАСССАСОААОАСССТОАОСТСААОТТСААСТ оаТАСОТОаАСаОСОТОСАООТОСАТААТОССААОАСАААОССОС ОООАСОАОСАОТАСААСАОСАСОТАССОТСТСЮТСАОСОТССТСАС ССТССТССАССАОСАСТООСТСААТООСААСОАСТАСААОТОСААО ОТСТССААСАААОСССТСССАОСССССАТСОАОААААССАТСТССА
ААСгССАААО^^асссей^^асеа^ссасагййаса^азёсс^оЩ^сссасссЩ! гссс1§аеа^ассёс151ассаасйс1§1ссйаса§ОССАСССССОАОААССАСАОО ТОТАСАСССТССССССАТСАСОООАООАОАТОАССААСгААССАООТ САОССТОАССТОССТООТСАААСОСТТСТАТСССАОСОАСАТСОСС ОТООАОТОСОАОАОСААТСООСАСССООАСААСААСТАСААОАСС АСОССТСССОТОСТООАСТССОАСОСтСТССТТСТТССТСТАТАОСАА ОСТСАССОТООАСААОАОСАООТСОСАССАСОООААСОТСТТСТСА ТОСТССОтеАТОСАТОАСОСТСТОСАСААССАСТАСАСОСАОААйА ОСОССАССОСОАССССОООСОССОСАААССТССССЙТОСССАСТС сасасссассаатстгсссатсссгтсассастсссаааасстс стсасссссюгсассалсатсстссасаассссасасааастс ТАСААТТТТАСССТГССАСТТСТСААСАСАТТСАТСАТСААСАТ атсасаааасатаааассассасастссасссстсттгассатт ССААТТААССААСААТСАСАСТТСССТАААТТССАСАСАСАССТ СТТТСАТААСТААТССЮАвТТСССТССССТССАСАААСАССТСТ ТТТАТСАТСССССТСТСССТТАСТАСТАГГГАТСААСАСТТСАА 6АТСТАССА6СТ6СА6ТТСААСАССАТСААТ6САААССТТСТСА ТССАТССТААСАСССАСАТСТТТСТАСАТСААААСАТССТСЧЗСА СТГАТТСАТСАОСТСАТССАСССССТСААТТТСААСАСТСАСАС ТСгТбССАСАААААТССТСССТТСгААСААССССАТТТТТАТАААА СТААААТСААСМТТСТССАТАСТТСТТСАТбСТТТСАСААТТССС ССАСТСАСТА'ГГСАСАСАСТСАССАССТАТСТСЛАТССТТССТА А (ПОСЛ. № 8)
- 19 011859
1. Пептидная и ДНК последовательность субъединицы р40.
Пептидная последовательность секретируемой субъединицы человеческой р40 имеет следующий вид:
ШЕ1ЖКОУУУУЕШ(У¥РОАРОЕМУЛЪТСО1РЕЕООтУТШЦ83ЕУЕ
ОЗОКЗЪтафУКЕРОПАОфУТСНКСОЕУЬЗНЗШЬНККЕООХУ/ВТОЩК
ЭЦКЕРКМКЗТЪкСЕАКМУЗОЮЛСУЛУЬГПЗТОЬТРЗУКЗЗК&ЗЗОРОО 7ТСОААТ1^АЕКУКСОМСЕУЕ¥ЗУЕСЦЕ08АСРААЕЕЗЬРЕУМУПАУ ΗΚΕΚΥΕΝΥΤ38ΡΠΐωΐΙΚΈΟΡΡΏ<Ες£ΚΡΕΚΝ8ΚφνΕν3%ΈΥΡϋ·Π¥8ΤΡ Н8УР8ЬТРСУрУ(^КБК1<ЕККПКУПВКТЗА1Х1СКККА313УВАфОЕ УТЗЗЗУ/ЗЕ^АЗУРСЗ (ПОСЛ. № 4)
Последовательности ДНК конструкта р40, начиная с кодона инициирования трансляции АТС, и заканчивая кодоном прекращения трансляции ТАС, приведены ниже (конструктом является с-ДНК ρ40тΚNΑ.; ДНК, кодирующая по собственному сигнальному пептиду, обозначена курсивом, а за ней следует ДНК, кодирующая по зрелому р40):
А.ТСТ(}ТСАССАвСА&'1ТООТСАТСТС1ТОа2ТГГСССТОСТ1тС1'ООС 4ТСТССССГС(9ТСХ?ССАТАТССОААСТОААОАААаАТОТТТАТ6ТСО ТАОААТТССАТТООТАТССООАТСССССТООАОАААТООГООТССТ САССТОТОАСАССССТОААСААОАТССТАТСАССТСОАССТТООАС САОАОСАОтеАОСТСТТАСЮСТСТОССААААСССТСАССАТССААа ТСАААОАОТТТООАОАТОСТСОССАбТАСАССТОТСАСАААСОАСЮ СОАООТТСТААОССАТТСОСТССТССТОСТТСАСАААААОСтААаАТ ООААТТТОСТССАСТОАТАТГП'АААОСтАССАаАААОААСССАААА АТААОАССТГТСТААОАТОСОАСЮССААОААТТАТТСТСС-АСОТП’С АССТССТС&ТСССТСАСОАСААТСАОТАСТОАТТТаАСАТТСАОТаТ СААААОСАОСАОАООСТСТТеГОАСССССААООООТОАСОТОСОСА ССТССТАСАСТСТСТОСАОАОАОАбТСАОАСОООАСААСААООАОТ АТСАОТАСТСАОТСОАОТОССАОСАСаАСАОТОССТОСССАОСТОС ТОАООАОАСТСТОСССАТТОАООТСАТООТСОАТОССОТТСАСААО СТСААОТАТОААААСТАСАССА6САСЗСТТСТТСАТСАСШАСАТСА ТСАААССТОАСССАСССААОААСТТОСАбСТОААОССАТГАААОАА ТТСТСООСАООТООАООТСАОСТСООАОТАСССТОАСАССТСЮАСТ АСТССАСАТГССТАСТГСТСССТОАСАТГСТОССТТСАСЮТССАООС СААОАОСААОАОАОААААОАААСАТАОАОТСТТСАСООАСААОАС СТСАОССАССЮТСАТСТОССОСАААААТСССАОСАТТАСтСаТОССа (ЗСССАСОАССОСТАСТАТАОСТСАТСТТСзОАОСбААТбСОСАТСТС· ТССССТОСАОТТАС (ПОСЛ. № 10)
Пример 2. Характеристика связывания (исследование I).
Для изучения связывания образцового гибридного белка ВС1-1Ы2, соответствующего настоящему изобретению, с карциноэмбриональным фибронектином были проведены эксперименты по плазменному поверхностному резонансу и по окраске с использованием иммунной метки.
В ходе исследования связывания гибридного белка ВС1-1Ы2 с его адресным антигеном было установлено, что этот гибридный белок связывается со своей мишенью более прочно, чем само соответствующее антитело ВС1. Например, с помощью метода плазменного поверхностного резонанса было измерено связывание ВС1 и ВС1-1Ы2 с полипептидом, содержащим домены человеческого фибронектина 7, ΕΌ-Β, 8 и 9. Результаты двух экспериментов приведены в табл. 1.
Таблица 1
тиВС1 (муреиновые постоянные области) ПиВС1 (человеческие постоянные области) Пи ВС1-И12
Скорость внедрения (1/моль/сек.) 1,65x103 (эксп. 2) 6,2x10 (эксп. 1) 7,3x10 (эксп. 2) 1,7x10 (эксп. 1) 1,9x10 (эксп. 2)
Скорость выхода 1/сек.) 1,1x10э (эксп. 2) 7,8x10 (эксп. 1) 1,0x10’2 (эксп. 2) 1,3x10' (эксп. 1) 1,6x10' (эксп. 2)
Константа диссоциации (нМ) 686 125 (эксп. 1) 138 (эксп. 2) 7,7 (эксп. 1) 8,3 (эксп. 2)
Результаты показывают, что связывание ЬиВС1-1Ь12 с его адресным антигеном не менее чем в раз более сильное; наиболее вероятно, что оно в 16 раз превышает прочность связи соответствующего
- 20 011859
1шВС1. взятого самого по себе.
Для подтверждения результатов. полученных методом плазменного поверхностного резонанса. у иммунодефицитных 8СГО-мышей СВ 17 в соответствии со стандартными процедурами создавали подкожные опухоли И87 МС. и срезы опухолей исследовали методом окраски с использованием иммунной метки с применением антитела 1шВС1 и гибридного белка 1иВС1-1Ь12. Было обнаружено. что интенсивность окрашивания с гибридным протеином 1шВС1-1Б12 была значительно больше. чем с антителом 1шВС1 (данные не приводятся).
Пример 3. Характеристика связывания (исследование II).
Введение.
Техника плазменного поверхностного резонанса (8РК.) была использована для демонстрации специфичности связывания антигена (т.е. распознавания только рекомбинантного карциноэмбрионального фибронектина ΡΝ7Β89). и для определения/сравнения значений констант кинетической скорости/сродства для муреиновых и человеческих антител ВС1 и иммуноцитокинов ВС1-1Ы2. Все реагенты. использованные при измерениях. и программное обеспечение были предоставлены компанией Вюсоге (см. список реагентов и программ. приведенный в приложении).
Анализ.
ΕΌ-В-негативный (ΕΝ789) и ΕΌ-В-позитивный (ΕΝ7Β89) рекомбинантные фибронектины (см. нижеследующий раздел «Данные последовательности») связывались в комплекс в двух разных проточных ячейках полупроводникового датчика СМ5 с использованием стандартной процедуры образования амино-комплексов и комплексообразующих реагентов. представленных компанией Вюсоге. Две другие проточные ячейки были оставлены пустыми и использовались в качестве негативных контрольных поверхностей. Для демонстрации антигенной специфичности различные антитела ВС1 и иммуноцитокины разбавляли до концентрации 500 нМ в потоке буферного раствора ΗΕΡΕ8 (НВ8-ЕР). Образцы впрыскивали по поверхностям со связанным фибронектином в течение 5 мин. и сравнивали кривые связывания. Поток буферного раствора (НВЗ-ΕΡ) вводили над каждой контрольной поверхностью в качестве негативного контроля для получения базовой линии нулевого сигнала. Поверхности полупроводникового датчика восстанавливали в течение 1 мин импульсным введением 0.1М раствора НС1 (рН 1.5). после чего в течение следующей 1 мин пропускали 0.1М раствор Н3РО4.
Для проведения кинетического анализа с датчиком связывали только ΕΌ-В-позитивный фибронектин (ЕЮВ89). В три разные проточные ячейки были введены три разные плотности. Четвертая проточная ячейка была оставлена без связанного фибронектина и использовалась для контроля негативной реакции. Было приготовлено от четырех до пяти концентраций каждой из молекул путем двухкратного последовательного разбавления в диапазоне концентраций от 1000 до 125 нМ (тиВС1). от 200 до 25 нМ (1иВС1) и от 100 до 6.25 нМ (муреиновый и человеческий ВС1-1Б12). Последовательные разбавления производились трижды в потоке буферного раствора (НВЗ-ΕΡ). Раствор каждой концентрации впрыскивали в течение 5 мин (ассоциация). а затем в следующие 5 мин следовала промывка потоком буферного раствора (диссоциация) со скоростью потока 10 Тл/мин. Проточные ячейки восстанавливали также. как это было описано выше в экспериментах по определению антигенной специфичности. Построение кривых проводили с помощью программного обеспечения. предоставленного компанией Вюсоге. Подробности построения кривых приведены в приложении.
Результаты.
В то время. как различные молекулы ВС1 связываются с рекомбинантным карциноэмбриональным фибронектином ΡΝ7Ε89 с различной интенсивностью. они вовсе не связываются с рекомбинантным «нормальным» фибронектином ΕΝ789 (см. фиг. 4). Это указывает на то. что во всех исследованных молекулах ВС1 как антитела. так и иммуноцитокины сохраняют свою антигенную специфичность (если сравнивать с исходным тиВС1). Эти данные также показывают. что кинетика связывания антигена в случае разных молекул различна.
Кинетический анализ показывает. что константы скорости для разных молекул действительно значительно различаются (см. табл. 2).
Таблица 2
Молекула Скорость внедрения ка (х 104 М-’с’) Скорость выхода к„ (х 10%1) Сродство Ко (нм)
тиВС1 0,17 0,65 377
ОиВС1 5,76 3,12 54
НиВС1-ти(Ы2 7,95 1,09 13,9
пиВС1-Ьи!М2 5,09 0,87 17,3
Кроме того. иммуноцитокины ВС1-1Б12 имеют намного более высокое сродство по отношению к ΡΝ7Ε89. чем как муреиновые. так и человеческие антитела. Несмотря на различия в константах скорости. 1шВС1-ти1Б12 и 1шВС1-1ш1Б12 обладают практически одинаковым сродством при связывании их
- 21 011859 антител. Эти данные указывают на то, что гуманизирование антитела ВС1, а также последующее формирование иммуноцитокина 601-1612 сопровождается образованием молекулы с повышенным сродством к рекомбинантному карциноэмбриональному фибронектину.
Выводы.
Все из молекул ВС1 избирательно связываются с рекомбинантным карциноэмбриональным фибронектином ΡΝ7Β89, что указывает на то, что конструирование иммуноцитокина 1ιιιΒί.'-1ιιιΙΕ12 не сопровождается потерей антигенной специфичности. Гуманизирование муреинового антитела ВС1 приводит к получению молекулы с повышенной способностью внедрения. Это повышение сродства возникает благодаря значительному ускорению захвата. Гуманизированное антитело связывается со своим антигеном почти в 34 раза быстрее, чем его муреиновый конкурент. Однако гуманизирование оказывает также и негативное влияние. Скорость выхода для ΙιιιΒΤΊ приблизительно в 5 раз быстрее, чем у тиΒС1. Введение ΙΠ2 в антитело для создания иммуноцитокина ЕС? 1 -IИ12 позволяет устранить этот недостаток, что выражается в получении скоростей выхода, аналогичных скоростям выхода, характерным для тиΒС1. В искусственной среде 1ιι.ιΒί.Ί-1ιιιΙΕ12 представляет собой иммуноцитокин с высоким сродством, который потенциально может быть использован в качестве молекулы для адресной доставки в опухоль в живом организме.
Данные последовательности (а) Фрагмент фибронектина 789
ЮСи8 ΡΝ789ΌΝΑ 1126 Ьр ι-ηΚΝΑ РК! 01-ОСТ-1999
ОПРЕДЕЛЕНИЕ человеческая м-РНК для фибронектиновых доменов
789 (№ Εϋ-Β) в рОЕ12 (рА332)
МЮ Получена из д31396 и рОЕ12 (Спадеп).
ВЕРСИЯ Х02761.1 61:31396
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА чередующееся расщепление; фибронектин
ИСТОЧНИК человеческий организм
ОРГАНИЗМ Ното эар1еп8
Еикагуо(а; Ме1агоа; СНопбаТа; Сгап1а1а; \/ег(еЬга1а; МаттаИа;
Еуфепа; Рлта1ез; Са1агп111П1; НотюНае; Ното.
С08 <208... 1068 /рго<1ис{=”Рп МКО8-789-НННННН
Лгап51айоп“н
М1168У7ТРЬ8РРТТЛ..НТЕАМ>ОтеУЪГ/3'ЙТК8ТГРО1 ТОУШТП?ТНСН20аЫЗЬЕЕУУНАОф88СТЕОТЛ,ЗРОЬ ΕΥΗν8νΎΤνΚϋϋ08ΥΡΙ80Τ№ΑνΡΡΡΊΌυϊΡΓΝΙΟ ΡΟΊΤίΡνΤινΑΡΡΡ3ΙΟ£ΊΚΕΕνΚΥ3ΡνΚΝ·ΕΕθνΑΕΤ3Ι8 Ρ8ϋΝΑννΤΤΝΤΤΡ<3ΊΈΥνν8ν88νΥΕςΗΕ5ΤΡΕΚ.&ΚςΚ ΤΟ^8ΡΤΟΜΓ8ϋΓΓΑΝ8ΡΊΥΗν7ΙΑΡΚΑΤΠ’6ΥΚΙΚΗΗ
ΡΒΗΡ86ΚΡΚΒΒΚνΡΗ3ΒΝ8ΓαΤΝΣΤΡΟΤΕΥνν8ΓνΑΕ
МОЕЕЕЗРШОНВКЗНННННН (ПОСЛ. Νί 25)
Примечание 1. Группа с 1 по 207 является р^Ε-последовательностью, начинающейся с инициатора и включающей в себя промотор-инициатор фхадеи (ССС6АААА6Т6ССАССТ6). Группа с 1069 по 1126 является ]}ΟΕ12-последовательностью, начинающейся с конца гексагистидиновой метки и простирающаяся до инициирующей последовательности обращения фхадеи (6ТТСТ6А66ТСАТТАСТ66). Фибронектин-производная последовательность (т.е. без МКС8 и гексагиксидиновой метки, записана строчными буквами).
Примечание 2. Имейте в виду, что кодирующая последовательность имеет мутации СС(230)А>СА(230)А, приводящую к изменению Р8ф; А(286)СА>6(286)СА, приводящую к изменению Т27А; ТСА(657)>ТС6(657), приводящую к изменению 81508.
БАЗОВЫЕ НОМЕРА 319 а 297 с 226 д 2841
ПРОИСХОЖДЕНИЕ
- 22 011859
ССССОАААА0 ТОССАССТОА ССТСТААСАА АССАТТАТТА ТСАТОАСАТТ ААССТАТААА
ААТАОСС0ТА ТСАСОАСССС СТТТСОТС1Т САССТСОАОА аатсатаааа аатттаттто
121 СТГГСТОАОС ОСАТААСААТ ТАТААТАОАТ ТСААТТОТОА СССКЗАТААСА аптсасаса
181 СААТТС АТТА ААСгАООАОАА. АТТААСТАТО АОА0ОАТСЦ ^К^асасс ай£1йеса
241 ссаасааас! ^саСс^а ^сааассй дасасЕцдад ΐβοίοοοη^ί с1сс1^§£ав
301 аддадсасса сссса^аса! 1ас1йдйа1 адаайасса саасссйас ааас^сса^
361 садкаааай сШ§£аада адД^ссаХ детсада 8с1сс1£састГ£а1аас
421 сЦа^сссд βοσίβ^α^ΐβ саа1£1са£С £Шасас18 {саа^З31^ саадааа§1
481 §1осс1а1с1 с1^а1аооа1 са1сссадс£ цНсс1сс1с ссайдасс! дсдаНсасс
541 аасай£21г са®асасса1 £сд1£1сасс 1дк§с1ссас сссса1сся1 Х^аШаасс
601 аасХХссХдд ХдсдХХасХс ассХ^Хзааа ааХдаддаад аХдХХдсада дХХдХсааХХ
661 ХсХссХХсае асааХдсадХ вдХсХХааса ааХсХссХдс сХддХасгща аХаХдХадХд
721 адХдХсХсса дХдХсХасда асаасаХдад адсасассХс ХХададдаад асадааааса
781 ддХсХХдаХХ ссссаасХ§§ саИдасй! ХсХдаХаХХа сХдссаасХс ХХйасХдХд
841 сасХддаХХд сХссХсдадс сассаХсасХ ддсХасадда ХссдссаХса Хссс^адсас
901 ХХсапХддда йасйсдада адаХсдддХд ссссасХсХс ддаайсса! сасссХсасс
961 аассХсасХс саддсасада вХаХдХддХс а§са1сдХ[д сХсйааХдд садададдаа 1021 адХсссХШ ХдаХХддсаО АТССАСАТСТ САТСАССАТС АССАТСАСТА АОСТТААТТА
1081 ОСТСАОСТТО ОАСТССТО1Т ОАТА0АТССА ОТААТОАССТ САОААС (ПОСП. № 26) (а) Фрагмент фибронектина 7В89
СОСХУЗ ΕΝ7Β89.ΡΝΑ 1399 Ьр шКИА ΡΚΙ 01-ОСТ-1999
ОПРЕДЕЛЕНИЕ человеческая м-РНК для для фибронектиновых доменов
7В89 в рОЕ12 (рАЗЗЗ)
МЮ Получена из д31396 и рОЕ12 (СИадел)
ВЕРСИЯ Х02761.1 61:31396
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА чередующееся расщепление; фибронектин
ИСТОЧНИК человеческий организм
ОРГАНИЗМ Ното зарела
ЕикагуоХа; Ме1агоа; СГюгбаХа; Сгагаа(а; Уег1еЬга(а; МаттаНа;
ЕуХЬепа; РптаХез; СаХагпЫпц Ноггчтбае; Ното.
СОЗ <208... 1341 /ргобисНТп МК.О8-7В89-НННННН /£пшз1а£1011=п
ΜΚΟδΥ^ΤδΡΤΤΤΜΕΕΑΝΡϋΤΟνΤΙΎδΤΤΕϊΰΊΤΡϋΙ ТО¥КПТТТта(39СОН81£ЕУ7НА1Х288СТЮЖДРОЬ ЕУЯУЗУУТУКВОКЕЗУРБПТПРЕУРЦЬТОЬЗРдОрр О881С1Л^тШ881ДО¥МТУУААОЕа1Р1РЕСРГО 88ν0ΥΥΐνΓΟΙ23ΡΟ®ΥΟΙ5νΊΤΙ^6ΟΕ8ΑΡΙΊΤ.Τ(ϊ(2 ТАУРРРТО1ЛЕ1М1ОРО’ГМЯУТХУАРРР310Г'1№Т.УКУ 8ΡνΚΝΕΕθνΑΕΕ8Ι8Ρ5ΟΝΑννΤΐΝΙ£Ρ0ΤΕΥνν8ν88 УУЕСНЕ8ТРЬКО^КТ0ЬО8Р'ГеШР30ГГА№КГУН7/ ΙΑΡΚΑΊΤΓ0ΎΚΙΚΗΗΡΕΗΡ8ΟΚΡΚΕΟΒ.νΡ^ΚΝ8ΠΧΤ М.ТРОТЕУУУ81УАШ0ВВЕ8РШОК8В5НННННН (ПОСЛ. № 27)
Примечание 1. Группа с 1 по 207 является рЦЕ-последовательностью, начинающейся с инициатора и включающей в себя промотор-инициатор Ц1адеп (ССС6АААА6Т6ССАССТ6). Группа с 1342 по 1399 является рОЕ12-последовательностью, начинающейся с конца гексагистидиновой метки и простирающаяся до инициирующей последовательности обращения Ц1адеп (6ТТСТ6А66ТСАТТАСТ66). Фибронектин-производная последовательность (т.е. без МК.С8 и гексагиксидиновой метки, записана строчными буквами).
Примечание 2. Имейте в виду, что кодирующая последовательность имеет мутации
- 23 011859
СС(230)А>СА(230)А, приводящую к изменению Р8О; А(286)СА>С(286)СА, приводящую к изменению Т27А; ТСА(930)>ТСС(930), приводящую к изменению 82418.
БАЗОВЫЕ НОМЕРА 390 а 368 с 290 д 351 ΐ
ПРОИСХОЖДЕНИЕ
ССССОААААС ТОССАССТОА СОТСТААОАА АССАТТАТТА
ТСАТСтАСАТТ ААССТАТААА
ААТАОССОТА ТСАСОА6ОСС СТТГСОТСГГ САССТСОАОА
ААТСАТАААА ААТТТАТГТО
121 СТГГОТСАОС ООАТААСААТ ТАТААТАСАТ ТСААТТОТСА
ОСООАТААСА АТТТСАСАСА
181 ОААТТСАТТА ААОАССАОАА АГГААСТАТО АОАООАТС1д
ГддСдасасс айдЫсса
241 ссаасааай 1дса(с1££а £§сааассс1 дасайдвад {дйсасадг ЛссГщдад
301 аддадсасса ссссадаса1 1айддйа1 адаайасса саасссс1ас ааасддссад
361 саеавааай ййддаада адГвдЮса! §с1§а1са§а дс1сс1дсас ШГдаГаас
421 с1§а#1ссс§ дсйд^ади саа1д1сад! дШасасгд 1саадда1да сааддааад!
481 £1ссс1а{с1 с1£а1асса( са!сссаца§ §1§ссссаас 1сас1даос1 аа£сШ:£й
541 даШаассд айсаадса! сддсс1@^д (ддассссдс 1ааас1:сйс сассайай
601 щд^ассдса {сасад1ад1 ^дсддсадда даадд(а1сс с1аШй§а адаЩГ§1д
661 дайсйсад 1адда1айа сасадкаса 8Й£°1ё§а.8с сдддсайда с1±«а1а£с
721 адсдйака сйЛсайаа Шсддсдад адГдсссйа с1асас1дас аоаасааасд
781 дйдйсйс с1сссас1§а сж1дсдайс ассаасайд д1ссадасас са1дсд1:е1с
841 асс1£явс1с сасссссаСс сайдаШа ассаасШж ТщЦдсдйа йсасйзрд
901 аааяя^адд аадаГдйдс ададйд1са аШйссй садасаа1£с ад1дд1сйа
961 асаааййсс 1дсйдд1ас а^ааШ^а д1дад1дЬй ссад1§1с£а сдаасаасаТ
1021 дададсасас йсйададд аадасадааа асад^сйд айссссаас ^дсайдас
1081 йййдаХа йайдссаа с1сййай д1дсас1дда йдйсс1сд адссассаГс
1141 айддйаса. ддйссдсса Ьа&ссдад сасйсад1д ддадасйсд адаадаЮдд
1201 дСдссссай йсддаайс саЬассйс ассаассйза йссаддсас ададЕагд1д
1261 д1садса1сд ИдсЬйааЛддсададад дааад1сс<я 1айдайдд саСАТССАОА ’ 1321 ТСТСАТСАСС АТСАССАТСА СТААОСТГАА ТТАССТСАОС
ТТООАСТССТ ОГГСАТАОАТ
1381 ССАОТААТОА ССТСАОААС (ПОСЛ. № 28)
Использованные материалы и методы.
1. Материалы: В1асоге АВ, Иррка1а номера по каталогу и информацию о контактах можно поучить на интернет-странице: \\л\лт.Ыасоге.сот
В1асоге 2000
Программа В1АСои1го1 (управляет прибором)
Программа В1АЕуа1иа1юи (анализ данных)
Главный датчик 8ешог СЫр СМ5 (сертифицированный)
Буфер НВ8-ЕР
Набор для аминного связывания
2. Кинетические параметры: параметры построения графика зависимости подбираются в программе В1АЕуа1иа1юи кривая Е11=бивалентна (анализируемым веществом является антитело)
Начало введения=0 с
Ассоциация=30-270 с
Прекращение введения=300 с
Диссоциация=330-600 (5,5 мин)
Пример 4. Определение в искусственных условиях эффективности при лечении рака.
Чтобы проверить применимость гибридного белка ВС1-1Б12 для лечения рака гибридный белок 1шВС.'1-ти1Б12 был конструктирован и экспрессирован в соответствии со стандартными методиками (см. пример 1 и Джиллис (ОИйек) и др., XVО 99/29732, включенный сюда в виде ссылки). В этом белке использован муреиновый 1Б-12, поскольку человеческий 1Б-12 не распознается муреиновыми рецепторами 1Б-12.
Иммунодефицитные мыши 8СГО СВ 17 с глиобластомными опухолями И87МО объемом около 140 мм3 были подвергнуты лечению либо 1шВС1. либо НиВС1-1Б12. как это показано в табл. 3.
- 24 011859
Таблица 3
Белок Режим воздействия Объем опухоли на 8-й день Объем опухоли на 13-й день
ЬиВС1-И12 20 мкг, дни 0-7 85 60
НиВС1-11_12 5 мкг, дни 0-7 130 120
ПиВС1-1И2 5 мкг, дни 0, 2, 4, 6, 10,12 115 70
ИиВС1 400 мкг, дни 0,4 170 175
- (РВ5) Дни 0-7 180 195
Пример 5. Эффективность киВО-дЕтиШ^ на модельных опухолях мышей.
1. Введение.
Цель исследования состояла в определении эффективности применения НиВСЮ-Р на различных моделях опухолей мышей. 1шВС1 (гуманизированное антитело ВС1) адресно направлено на изоформу человеческого фибронектина В-ΡΝ, которая присутствует в субэндотелиальной внеклеточной матрице (ЕСМ) неоваскулятуры васкуляризированных опухолей. В-ΡΝ является хорошей опухолевой меткой, поскольку он карциноэмбриональный и ангиогенетически ассоциирован, и не обнаруживается в нормальных взрослых тканях. Поскольку НиВС1 распознает только человеческий В-ΡΝ и не вступает в перекрестную реакцию с муреиновым В-ΡΝ, для доклинических исследований были использованы ксеногенные модели опухолей, включающие человеческие опухолевые клетки, имплантированные в мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СШ) и в бесшертных мышей. Кроме того, поскольку ^12 является видоспецифическим веществом, 1ШВС1-1ШШ12 (гибридный белок гуманизированного антитела ВС1 - человеческого ^12), предназначенный для людей, не действует в мышах. Поэтому для проведения оценки на муреиновых моделях мы изготовили киВС1-муреиновый И12 в качестве суррогата кандидатного лекарственного средства.
2. Материалы и методы.
2.1. Виды мышей.
Иммунодефицитные 8СШ СВ 17 и бесшерстные мыши были приобретены у компаний Тасошс, СЬаг1ек Ктег, и Гасккоп ЬаЬ.
2.2. Линии опухолевых клеток.
Аденокарцинома простаты человека РС3тт2 была принесена в дар д-ром Ральфом Рейсфельдом (Ка1рЬ КейГе1й) из 8сг1рр§ ВекеагсЬ ШййШе. Астроцитома человека И-87 МО, эпидермоидная карцинома человека А431 и карцинома толстой кишки человека НТ29 были получены от Атепсап Сикиге Со11есНоп.
2.3. Белки.
Белок 1и.1ВС1-д1-ти[Е12 был аналогичен НиВС1-§1-М1-ти!Е12. Он представляет собой гибридный белок гуманизированного антитела ВС1 с человеческими постоянными областями д1 и муреиновым Ю2, а М1 представляет собой деиммунизированный гибридизирующий связующий элемент (см. приведенный выше пример 1).
1шВСΊ-β1-ти[^12 был изготовлен аналогичным способом, как и 1ШВС1-1ШШ12 (см. приведенный выше пример 1), за исключением того, что тир40 и тир35 были заменены на 1шр40 и 1шр35 соответственно.
3. План эксперимента, схема дозировки и оценка результатов.
3.1. Модель подкожной И-87МС у иммунодефицитных мышей 8СШ СВ17.
02-23 Действие ИиВСЧ-дЫШ-тиЮЗ в клетках асторцитомы И87М6 человека на подкожной модели опухоли у 8СШ СВ 17-мышей.
Мыши: возраст 7 недель, самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области 8СШ СВ 17-мышей 4х106 клеток опухоли И-87МС в 0,1 мл РВ8 в соответствии с протоколом.
Группировка и лечение.
Лечение начинали, когда размер опухоли достигал ~100 мм3. Мышей сортировали на 5 групп (п=8) с одинаковыми размерами и тяжестью опухоли:
- 25 011859
1. РВЗ 0,2 мл Дни 0-8
2. ЬиВС1-д1-М1-ти1Б12 20 мкг ежедневно Дни 0-8
3. ЬиВС1-д1-М1-ти1И2 5 МКГ ежедневно Дни 0-8
4. ЬиВС1-д1-М1-тиИ12 20 мкг ежедневно Через день, всего 12 ДОЗ
5. (1иВС1 чистый 0,5 мг за 1 раз Дни 0 и 4 (только 3 мыши)
Анализ результатов лечения.
Измерение размеров опухоли проводили дважды в неделю.
Размер опухоли определяли по формуле ширинахдлинахвысотах0,5236.
Умерщвляли каждую мышь с размерами опухоли более 5000 мм3.
В соответствующие моменты времени вычисляли отношение Т/С (отношение объемов леченой и контрольной опухолей).
3.2. Модель подкожной А431 у иммунодефицитных мышей 8СГО СВ17.
02-37 Действие ВС1-д1-М1-ти1Ь12 в А431 на подкожной модели опухоли у 8С1Э СВ17-мышей.
Мыши: возраст 8 недель, 8СГО СВ17-мыши, самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области 8СГО СВ17-мышей 1 х 106 жизнеспособных клеток опухоли А431 в 0,1 мл РВ8 в соответствии с протоколом.
Группировка и лечение.
Лечение начинали, когда размер опухоли достигал ~100 мм3. Мышей сортировали на 2 группы (п=8) с одинаковыми размерами и тяжестью опухоли:
1. РВЗ 0,2 мл Дни 0-7
2. ПиВС1-ти11_12 20 мкг ежедневно Дни 0-7
Анализ результатов лечения.
Измерение размеров опухоли проводили дважды в неделю.
Размер опухоли определяли по формуле ширинахдлинахвысотах0,5236.
Умерщвляли каждую мышь с размерами опухоли более 5000 мм3.
В соответствующие моменты времени вычисляли отношение Т/С (отношение объемов леченой и контрольной опухолей).
3.3. Модель подкожной РС3тт2 у иммунодефицитных мышей 8СШ СВ17.
02-44 Действие ВС1-д1-М1-ти1Ь12 в РС3тт2 на подкожной модели опухоли у 8СШ СВ17-мышей.
Мыши: возраст 8 недель, 8СШ СВ17-мыши, самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области 8СШ СВ17-мышей 2х106 жизнеспособных клеток опухоли РС3тт2 в 0,1 мл РВ8 в соответствии с протоколом.
Группировка и лечение.
Лечение начинали, когда размер опухоли достигал ~100 мм3. Мышей сортировали на 2 группы (п=7) с одинаковыми размерами и тяжестью опухоли:
1. РВЗ 0,2 мл Дни 0-6
2. ВС1-д1-тиИ12 20 мкг ежедневно Дни 0-6
Анализ результатов лечения.
Измерение размеров опухоли проводили дважды в неделю.
Размер опухоли определяли по формуле ширинахдлинахвысотах0,5236.
Умерщвляли каждую мышь с размерами опухоли более 5000 мм3.
В соответствующие моменты времени вычисляли отношение Т/С (отношение объемов леченой и контрольной опухолей).
3.4. Модель подкожной НТ-29 у бесшерстных мышей.
02-70 Действие йиВС1-д1-М1-ти1Ь12 в НТ-29 на подкожной модели опухоли у бесшерстных мышей.
Мыши: возраст 6-7 недель, бесшерстные мыши (бесш.м./бесш.м.), самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области бесшерстных мышей 1х106 жизнеспособных клеток опухоли НТ-29 в 0,1 мл РВ8 в соответствии с протоколом.
Группировка и лечение.
Лечение начинали, когда размер опухоли достигал ~100 мм3. Мышей сортировали на 2 группы (п=5) с одинаковыми размерами и тяжестью опухоли:
1. РВЗ 0,2 мл Дни 0-4
2. ЬиВС1-д1-ти1И2 20 мкг ежедневно Дни 0-4
- 26 011859
Анализ результатов лечения.
Измерение размеров опухоли проводили дважды в неделю.
Размер опухоли определяли по формуле ширинахдлинахвысотах0,5236. Умерщвляли каждую мышь с размерами опухоли более 5000 мм3.
В соответствующие моменты времени вычисляли отношение Т/С (отношение объемов леченой и контрольной опухолей).
3.5. Модель легочной метастазы РС3тт2 у иммунодефицитных мышей 8СШ СВ17.
03-11 Действие ВС1-д1-М1-ти1Ь12 в модели легочной метастазы РС3тт2 у 8СШ СВ17-мышей. Мыши: возраст 8 недель, 8СШ СВ17-мыши, самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области 8СШ СВ17-мышей 2х106 жизнеспособных единичных клеток опухоли РС3тт2 в 0,3 мл РВ8 ί.ν. в день 0.
Группировка (п=8) и лечение:
1. РВ5 0,2 мл
2. ВС1-д1-М1-тиИ12 16 мкг
3. ВС1-д1-М1-тиИ12 8 мкг ежедневно Дни 11-15 ежедневно Дни 11-15 ежедневно Дни 11-15
Завершение.
Умерщвляли мышей на 28-й день или когда контрольная мышь слабела.
Удаляли легкие и закрепляли их в растворе Боуина.
Определяли вес легких и вес тела.
Подсчитывали метастазы легких.
Проверяли и отмечали наличие метастаз в других органах и в лимфатических узлах.
4. Результаты.
4.1. Модель подкожной И-87МС у иммунодефицитных мышей 8СШ СВ17.
Вначале нам необходимо определить модель подкожной опухоли с использованием астроцитомы И-87МС человека, которая была выбрана потому, что в клетках этой линии опухолей имеет место высокий уровень экспрессии В-ΓΝ (Мариан (Мапапе) и др., 1997, Сапсег 80: 2378). Было проведено титрование, чтобы определить необходимое для инъекции число клеток, обеспечивающее оптимальный рост опухоли. Для образования подкожной опухоли в спину каждой мыши вводили инъекцией различное число жизнеспособных клеток (от 1 до 6х106) и следили за скоростью роста опухолей (фиг. 5А). Интересно отметить, что независимо от числа введенных инъекцией клеток, скорости роста опухолей оставались низкими в течение приблизительно 3 недель, после чего все они быстро возрастали.
Для проведения последующих экспериментов в спину каждой мыши делали инъекцию 4х106 жизнеспособных клеток. Через шесть дней средний размер опухолей составлял приблизительно 135 мм3, и тогда начинали лечение (день 0). Две группы мышей лечили в течение 8 последующих дней, вводя им ежедневную дозу либо 5, либо 20 мкг йиВС1-ти1Ь12. Третья группа получала дневную дозу 20 мкг йиВС1-ти1Ь12 в каждый второй день до суммы в 12 доз. Для сравнения четвертая группа мышей получала дневную дозу 0,5 мг антитела 1шВС1 в день 0 и в день 4. Результаты, полученные на этих 4 подопытных группах и на контрольной группе, которой вводили РВ8, показаны на фиг. 5В. Опухоли у мышей РВ8-контрольной группы медленно увеличивались, и на день 19 достигали объема 430 мм3, и с этого времени начинался экспоненциальный рост опухолей, так что на день 35 их средний размер достигал 5627 мм3. Лечение антителом не оказало влияния на рост опухоли. На этой модели у иммунодефицитных мышей лечение различными дозировками йиВС1-ти1Ь12 было эффективным в течение приблизительно 3 недель. На день 23 средний размер опухоли у группы, получившей 8 ежедневных доз 20 мкг, был приблизительно 446 мм3, а средний размер опухоли у двух групп, получивших дозы 80 мкг, составлял приблизительно 380 мм3, по сравнению с более чем 1000 мм3 для РВ8-контрольной группы. Однако лечение только задержало фазу экспоненциального роста приблизительно на 4 дня, поскольку, начиная со дня 23 и по день 35, опухоли у всех трех групп росли экспоненциально с такой же скоростью роста, как в группе, получавшей лечение препаратом РВ8.
В табл. 4 показаны средние объемы опухолей (в мм3) в каждой их групп в разные дни.
- 27 011859
Таблица 4
Дни РВ8 НиВС1-М1т и11-12 (20 мкг ежедневно х8) ЬиВС1-М1ти1Ь12 (5 мкг ежедневно х8) ЬиВС1-М1ти1И2 (20 мкг через день х12) КиВС1 ЧИСТЫЙ (0,4 мг ежедневная доза х2)
0 133,6 134,3 134,8 135,6 144.4
5 163,7 123 135,5 133,4 169,9
8 175,7 91,1 125 113.8 184,2
12 180,3 66,3 115,6 75,9 194,9
15 232 88,8 100 91.9 255,4
19 429,8 215,1 191,9 178,2 425,8
23 1005,5 377,9 446,1 389,3 1059,9
27 2166.6 893,5 1263 976.4 2275,6
30 3474,7 1577,8 2106,2 1658,3 3664,5
35 5626,5 3122,2 3989 3347.4 5847,6
4.2. Модель подкожной А431 у иммунодефицитных 8СГО-мышей.
Одноцикловое лечение 7-ю последовательными ежедневными дозами по 20 мкг 1шВС1-пш1Ь12 каждая было эффективным на подкожной модели человеческой меланомы А431 у 8СГО-мышей, давая на день 14 отношение Т/С, равное 0,31, и на день 25, равное 0,26 (см. фиг. 6).
В табл. 5 показаны средние объемы опухолей (в мм3) в каждой их групп в разные дни.
Таблица 5
День РВ8 ЬиВС1-91>ти1И2 (20 мкг, дни 0-6)
0 117,8 117,8
3 279,8 205,1
8 632,1 298,7
11 917,3 369,1
14 1390,9 425,0
17 1974,8 506,3
22 3106,1 780,3
25 4238,9 1093,3
4.3. Модель подкожной РС3тт2 у иммунодефицитных 8СГО-мышей.
Одноцикловое лечение 7-ю последовательными ежедневными дозами по 20 мкг 1шВС1-пш1Ь12 каждая было эффективным на подкожной модели человеческой карциномы простаты у 8СГО-мышей, давая на день 15 отношение Т/С, равное 0,34, и на день 25, равное 0,33 (см. фиг. 7).
В табл. 6 показаны средние объемы опухолей (в мм3) в каждой их групп в разные дни.
Таблица 6
День РВ5 КиВС1-д1-ти11-12 (20 мкг, дни 0-6)
0 109,9 109,7
2 224,3 184.7
7 768,8 363,7
9 988,7 435,8
12 1396,0 512,7
15 1777,8 608,3
19 2504,9 805,1
22 3115,8 963,4
27 4058,1 1351,3
4.4. Модель подкожной НТ-29 у бесшерстных мышей.
Одноцикловое лечение 5-ю последовательными ежедневными дозами по 20 мкг 1шВС1-пш1Ь12 каждая было эффективным на подкожной модели человеческой карциномы простаты у 8СГО-мышей (очевидно, опечатка. Следует читать «подкожной модели человеческой НТ-29 у бесшерстных мышей...» Примеч. переводчика), давая на день 13 отношение Т/С, равное 0,46, и на день 20, равное 0,43 (см. фиг. 8). Поскольку это было всего лишь одноцикловое лечение, и у бесшерстных мышей функциональные Т-клетки отсутствуют, не слишком удивляет тот факт, что после дня 20 скорость роста опухолей в группе, получавшей лечение, начинала увеличиваться. Интересно было бы оценить эффективность второго цикла лечения, проведенного в это время.
В табл. 7 показаны средние объемы опухолей (в мм3) в каждой их групп в разные дни.
- 28 011859
Таблица 7
День РВ5 1шВС1-д1-ти1Ь12 (20 мкг, дни 0-4)
0 81,4 82,5
4 152,1 113,2
7 250,0 143,7
10 317,3 172,9
13 468,1 216,8
17 672,8 286,0
20 837,0 359,9
25 1248,3 570,2
28 1646,8 793,9
4.5. Модель легочной метастазы РС3тт2 у иммунодефицитных 8СШ-мышей.
В этой ксеногеничной модели человеческая карцинома простаты РС3тт2 вводилась инъекцией мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СШ) за 11 дней до начала лечения, что давало достаточно времени для образования метастаз. Несмотря на отсутствие функциональных Т- и Вклеток у 8СШ-мышей, 5 ежедневных инъекций йцВС1-ти1Ь12 по 16 мкг полностью искоренили образовавшиеся метастазы у всех мышей и предотвратили их разрастание, что следует из результатов измерений поверхности легких, покрытой метастазами (фиг. 9А) и тяжести опухоли (фиг. 9В). Даже дозировка 8 мкг была очень эффективна, снижая метастазы легких приблизительно на 85% по отношению к РВ8контрольной группе.
В табл. 8 показана сводка данных по эффективности применения йиВС1-ти1Ь12 на моделях опухолей у мышей. Отношение Т/С для подкожных (к.с.) опухолей представляет собой отношение среднего объема опухоли в группе, получающей лечение, к среднему объему опухоли в РВ8-контрольной группе. Для модели легочной метастазы Т/С представляет собой отношение средней тяжести опухоли в группе, прошедшей лечение, к тяжести опухоли в РВ8-контрольной группе.
Таблица 8
Опухоль Модель Лечение Дозировка Результаты
Т/С Величина Р (относительно к контр, гр.)
А431 Эпидермоидная карцинома подкожная ВС1-у1-Ми1М2 20 мкг; дни 0-6 0,26 0,00038 на день 35
НТ-29 Карцинорма толстой кишки подкожная ВС1-у1-Ми1И2 20 мкг; дни 0-4 0.43 0,076 на день 28
РСЗтт2 Аденокарцинома простаты подкожная ВС1-у1-Ми11_12 20 мкг; дни 0-6 0,33 0,000039 на день 27
легочная метастаза ВС1-у1-МиШ12 ВС1-у1-Ми1Ь12 МН8-у2Ь-Ми1Ь12 16 мкг; дни 11-15 8 мкг; дни 11-15 8 мкг; дни 11-15 0,01/0,266 0 0,126/0,266 0,0028 на день 27 0,0016 0,0084
ίΙ87-Μ<3 Асторобластома подкожная ВС1-у1-Ми11_12 ВС1-у1-Ми11_12 ВС1-у1-МиИ12 НиВС1 чист. 20 мкг; дни 0-7,16-23 5 мкг; дни 0-7,16-23 20 мкг; 2д до дня 22 0,4 мг; дни 0,4 0,55 0,71 0,59 0,0027 на день 35 0,022 0,012 0,89
5. Обсуждение результатов.
Кандидатное лекарственное вещество йиВС1-йи1Ь12 нельзя оценить на современных муреиновых моделях опухолей, поскольку человеческий 1Ь12 является видоспецифическим. Поэтому мы изготовили челВС1-муреиновый 1Ь12, и показали, что эта суррогатная молекула обладала эффективностью в различных ксеногенных моделях метастаз и подкожных опухолей, как это показано в табл. 8. Невзирая на то, что у 8СШ-мышей отсутствуют функциональные клетки Т и В, один цикл лечения с 7 ежедневными инъекциями замедлили рост опухолей на 74 и 67% соответственно в моделях опухолей А431 и РС3. Такие результаты являются впечатляющими, особенно с учетом того факта, что йиВС1-ти1Ь12 характеризуется очень высокой скоростью очищения организма в α-фазе в мышах в сравнении с йиВС1-йи1Ь12 (см. нижеприведенные фиг. 10 и приложение). Одиночный цикл лечения, состоящий из 5 ежедневных инъекций, также был эффективен в модели НТ-29 на бесшерстных мышах, замедляя рост опухоли на 57%. Эффективность могла бы повыситься при многоцикловом лечении препаратом йиВС1-йи1Ь12 в клинике, где пациенты, проходящие курс постхимиотерапийного лечения, могут иметь значительно более функциональную иммунную систему, чем иммунодефицитные 8СШ-мыши. В экспериментальной
- 29 011859 модели метастаз легкого на 8СГО-мышах 5 ежедневных инъекций йцВС1-ти1Ь12 с разовой дозой 16 мкг почти полностью искоренило метастазы. которым позволили образоваться за 11 дней до начала эксперимента.
6. Приложение. Фармакокинетика йиВС1-ти1Ь12 и ЬиВС1-йи1Ь12.
Фармакокинетику йиВС1-ти1Ь12 и ЬиВС1-йи1Ь12 определяли на бесшерстных мышах Ва1Ь/с. Было обнаружено. что йиВС1-йи1Ь12 в организме мышей имеет большее значение сывороточного полупериода. чем йиВС1-ти1Ь12. особенно в α-фазе (фиг. 10).
Пример 9. Методы лечения.
Соединение. например гибридный протеин. соответствующий настоящему изобретению. может применяться следующим образом.
Проводится лечение пациента. больного раком. например глиобластомой. Предпочтительным путем введения препарата является внутривенная или подкожная инъекция. но возможны также внутримышечный. внутрибрюшинный. внутрикожный или другие пути инъекции. Возможны также введение ингаляцией. орально или с помощью суппозиториев. а также другие пути введения. Предпочтительным является назначение препарата в виде четырехнедельного цикла. три раза в неделю. за которым следует отсутствие лечения в течение следующих трех недель. но оно может быть и более или менее частым. в зависимости от фармакокинетического поведения белка ВС1-1Ы2 в данном конкретном пациенте. Дозировка для взрослых людей весом около 70 кг находится в диапазоне приблизительно от 4 до 20 мг в одной дозе. Наиболее предпочтительной дозировкой является приблизительно 10 мг на взрослого пациента весом 70 кг. проходящего лечение один раз в месяц. Наблюдение за реакцией пациентов проводится в соответствии со стандартной процедурой.

Claims (50)

1. Соединение. содержащее участок. ответственный за адресную доставку. и эффекторный участок. в котором:
(ί) участок. ответственный за адресную доставку. содержит моноклональное антитело. обладающее специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину. или его фрагмент либо вариант. который сохраняет специфичность связывания с карциноэмбриональным фибронектином исходного моноклонального антитела. или состоит из него. и (ίί) эффекторный участок содержит интерлейкин-12 или его функциональный фрагмент либо вариант или состоит из него.
характеризующееся тем. что моноклональное антитело. обладающее специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину. связывается с участком карциноэмбрионального фибронектина. не являющимся участком ΕΌ-В.
2. Соединение по п.1. в котором участок. ответственный за адресную доставку. способен связываться с аминокислотной последовательностью. присутствующей в фибронектине. экспрессируемой как в эмбриональной. так и в нормальной взрослой ткани.
3. Соединение по п.1 или 2. в котором участок. ответственный за адресную доставку. способен связываться с аминокислотной последовательностью в пределах дупликации 7 домена фибронектина.
4. Соединение по любому из пп.1-3. в котором участок. ответственный за адресную доставку. является специфичным в отношении человеческого карциноэмбрионального фибронектина.
5. Соединение по любому из пп.1-4. в котором моноклональное антитело. обладающее специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину. представляет собой антитело ВС1 или антитело. способное конкурировать с антителом ВС1 по способности связываться с карциноэмбриональным фибронектином.
6. Соединение по п.5. в котором моноклональным антителом. обладающим специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину. является антитело ВС1.
7. Соединение по любому из пп.1-6. в котором моноклональное антитело является человеческим или гуманизированным моноклональным антителом.
8. Соединение по п.6 или 7. связывающееся с карциноэмбриональным фибронектином более прочно. чем исходное моноклональное антитело.
9. Соединение по п.8. связывающееся с карциноэмбриональным фибронектином по меньшей мере в два раза прочнее. чем исходное моноклональное антитело.
10. Соединение по п.8 или 9. связывающееся с карциноэмбриональным фибронектином по меньшей мере в 10 раз прочнее. чем исходное антитело ВС1 связывается с карциноэмбриональным фибронектином.
11. Соединение по любому из пп.1-10. в котором участок. ответственный за адресную доставку. содержит полипептид последовательности № 1.
12. Соединение по любому из предыдущих пунктов. в котором участок. ответственный за адресную доставку. содержит полипептид последовательности № 2.
13. Соединение по п.11 или 12. в котором участок. ответственный за адресную доставку. содержит
- 30 011859 полипептид последовательности № 1 и полипептид последовательности № 2.
14. Соединение по любому из пп.1-13, в котором участок, ответственный за адресную доставку, содержит фрагмент моноклонального антитела, связывающийся с антигеном, обладающий специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину, или состоит из него.
15. Соединение по п.14, в котором участок, ответственный за адресную доставку, состоит из или содержит фрагмент, связывающийся с антигеном, выбранный из группы, состоящей из ЕаЬ-подобных молекул, таких как ЕаЬ и Е(аЬ')2, Εν-молекул, дисульфидно-связанных Εν-молекул, 8сЕу-молекул и однодоменных антител (6ЛЬ§).
16. Соединение по любому из пп.1-15, в котором участок, ответственный за адресную доставку, содержит одну или несколько постоянных областей антитела.
17. Соединение по п.16, в котором одна или несколько постоянных областей антитела содержит домен СН1 или состоит из него.
18. Соединение по любому из пп.1-17, в котором дополнительно содержится Ес-компонент.
19. Соединение по п.18, в котором Ес-компонент произведен из человеческого 1дС1.
20. Соединение по любому из пп.1-19, в котором участок, ответственный за адресную доставку, содержит ненарушенное антитело ВС1 или состоит из него.
21. Соединение по любому из пп.1-20, в котором эффекторный участок содержит человеческий интерлейкин-12 или его функциональный фрагмент либо вариант или состоит из него.
22. Соединение по любому из пп.1-21, в котором эффекторный участок содержит одноцепочечный интерлейкин-12 или состоит из него.
23. Соединение по п.22, в котором одноцепочечный 1Ь-12 состоит из домена 1Ь-12р35 и домена 1Ь12р40.
24. Соединение по п.23, в котором домен 1Ь-12р35 конъюгирован с доменом 1Ь-12р40 дисульфидной связью.
25. Соединение по любому из пп.1-24, в котором веществом является гибридный белок.
26. Соединение по любому из пп.1-25, в котором участок, ответственный за адресную доставку, привит к эффекторному участку.
27. Соединение по п.26, содержащее иммуноглобулиновую тяжелую цепь, привитую к эффекторному участку.
28. Соединение по п.27, в котором иммуноглобулиновая тяжелая цепь и эффекторный участок соединены между собой через мутированную сшивающую последовательность.
29. Соединение по п.28, в котором сшивающий мостик содержит аминокислотную последовательность ЛТЛТРОЛЛ (ПОСЛ. № 5) или состоит из нее.
30. Соединение по любому из пп.1-29, в котором вещество содержит полипептид последовательности № 6.
31. Соединение по любому из пп.1-30, в котором вещество содержит полипептид последовательности № 7.
32. Соединение по п.30 или 31, в котором вещество содержит полипептид последовательности № 6 и полипептид последовательности № 7.
33. Соединение по любому из пп.30-32, дополнительно содержащее полипептид последовательности № 4, связанный дисульфидной связью с полипептидом последовательности № 6.
34. Гибридный белок, содержащий У-области антитела, направленные к карциноэмбриональному фибронектину, Ес-компонент и компонент интерлейкина-12, отличающийся тем, что У-области антитела связываются с областью карциноэмбрионального фибронектина, не являющейся областью ΕΌ-Β.
35. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соединение, соответствующее любому из пп.1-34, или участок, ответственный за адресную доставку, эффекторный участок или их составляющий полипептид.
36. Молекула нуклеиновой кислоты по п.35, содержащая одну или несколько нуклеотидных последовательностей, выбранных из групп, содержащих последовательности № 8-10.
37. Молекула нуклеиновой кислоты по п.36, содержащая нуклеотидную последовательность № 8.
38. Молекула нуклеиновой кислоты по п.36 или 37, содержащая нуклеотидную последовательность № 9.
39. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.36-38, содержащая нуклеотидную последовательность № 8 и нуклеотидную последовательность № 9.
40. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, соответствующую любому из пп.35-39.
41. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, соответствующую любому из пп.35-39, или вектор, соответствующий п.40.
42. Способ изготовления соединения, соответствующего любому из пп.1-34, или участка, ответственного за адресную доставку, эффекторного участка или их составляющего полипептида, содержащий экспрессирование молекулы нуклеиновой кислоты, по любому из пп.35-39, в клетке-хозяине и отделение от нее этого вещества, участка или составляющего компонента.
- 31 011859
43. Лекарственный препарат, содержащий соединение по любому из пп.1-34 и фармацевтически приемлемый носитель.
44. Лекарственный препарат по п.43, пригодный для парентерального введения в организм.
45. Соединение по любому из пп.1-34, предназначенное для применения в медицине.
46. Применение вещества, соответствующего любому из пп.1-34, для приготовления медикамента, предназначенного для лечения пациента, больного раком.
47. Способ лечения пациента, больного раком, содержащий назначение указанному пациенту соединения по любому из пп.1-34.
48. Применение по п.46 или способ по п.47, где млекопитающим является человек.
49. Применение по п.46 или способ по п.47, где у пациента имеется плотная опухоль.
50. Применение по п.46 или способ по п.47, где раковым заболеванием является глиобластома.
EA200601264A 2004-01-05 2005-01-05 Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени EA011859B9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53430704P 2004-01-05 2004-01-05
PCT/GB2005/000007 WO2005066348A2 (en) 2004-01-05 2005-01-05 Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200601264A1 EA200601264A1 (ru) 2007-12-28
EA011859B1 true EA011859B1 (ru) 2009-06-30
EA011859B9 EA011859B9 (ru) 2013-07-30

Family

ID=34748996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601264A EA011859B9 (ru) 2004-01-05 2005-01-05 Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8420087B2 (ru)
EP (1) EP1702069A2 (ru)
JP (1) JP2007517506A (ru)
AU (1) AU2005203962C1 (ru)
CA (1) CA2552590A1 (ru)
EA (1) EA011859B9 (ru)
WO (1) WO2005066348A2 (ru)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8975374B2 (en) 2006-10-20 2015-03-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
AU2007311946A1 (en) * 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-cancer agent comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
ES2807753T3 (es) 2007-10-30 2021-02-24 Philogen Spa Un antígeno asociado con artritis reumatoide
MX2011011044A (es) * 2009-04-22 2011-11-04 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de anticuerpos con sitios de enlace de receptor fc neonatal (fcrn) modificados.
BR112012029611A2 (pt) * 2010-05-21 2017-07-25 Merrimack Pharmaceuticals Inc proteína de fusão biespecífica, composição farmacêutica, método de tratamento de dano ao tecido em um indivíduo, método de promoção da regeração ou sobrevivência do tecido em um indivíduo e molécula de ácido nucleico
ES2872964T3 (es) * 2011-07-27 2021-11-03 Philogen Spa Inmunoconjugado de IL-12
JP6158933B2 (ja) 2012-10-03 2017-07-05 フィロゲン エスピーエー 炎症性腸疾患に関連する抗原
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
CN105543279A (zh) * 2014-10-30 2016-05-04 常州卡斯比生物科技有限公司 一种防治辐射线损伤、肿瘤治疗的IL-12/Fc融合蛋白的制备方法及其药剂
KR20180030180A (ko) 2015-07-16 2018-03-21 필로겐 에스.피.에이. Il22 면역컨쥬게이트
WO2017041001A2 (en) 2015-09-04 2017-03-09 The California Institute For Biomedical Research Insulin immunoglobulin fusion proteins
US10450349B2 (en) 2016-03-04 2019-10-22 Purdue Research Foundation Multivalent fibronectin-integrin binding compositions and methods of use thereof
WO2017214262A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 The Pacific Heart, Lung, & Blood Institute Compositions and methods for treating cancer
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
JP2022536898A (ja) 2019-06-12 2022-08-22 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ－１５プロドラッグおよびその使用方法
AU2020353235A1 (en) * 2019-09-28 2022-03-31 AskGene Pharma, Inc. Cytokine prodrugs and dual-prodrugs
TW202241935A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 美商世紀治療股份有限公司 具有可調適受體專一性之嵌合抗原受體系統

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999029732A2 (en) * 1997-12-08 1999-06-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
WO2002002143A2 (en) * 2000-06-29 2002-01-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
WO2003093478A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Molmed Spa Immunoconjugates for the treatment of tumours

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) * 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) * 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
NO794196L (no) * 1978-12-22 1980-06-24 Biogen Nv Fremgangsmaate ved fremstilling av et rekombinert dna molekyl
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4678751A (en) * 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) * 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) * 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4469797A (en) * 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4757006A (en) * 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) * 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) * 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8615701D0 (en) 1986-06-27 1986-08-06 Delta Biotechnology Ltd Stable gene integration vector
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
GB8620926D0 (en) 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
PT88641B (pt) 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
US5120525A (en) * 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
IT1217724B (it) 1988-05-26 1990-03-30 Ist Naz Ric Sul Cancro Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
JP3092811B2 (ja) 1988-07-23 2000-09-25 デルタ バイオテクノロジー リミテッド ペプチドおよびｄｎａ配列
US5457038A (en) * 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6750329B1 (en) * 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
AU641673B2 (en) 1989-06-29 1993-09-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE69019609T2 (de) * 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
US5073627A (en) * 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
ATE366311T1 (de) 1989-12-22 2007-07-15 Hoffmann La Roche Zytotoxischer lymphozyten-reifefaktor 35kd untereinheit und monoklonale antikörper spezifisch dafür
JP3319594B2 (ja) 1990-03-20 2002-09-03 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 定常領域の代わりに受容体結合性リガンドを有するキメラ抗体
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) * 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) * 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1993024135A1 (en) * 1992-05-26 1993-12-09 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
CA2125763C (en) * 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
AU689214B2 (en) 1994-02-01 1998-03-26 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Fusion proteins that include antibody and nonantibody portions
AU701302B2 (en) 1994-05-13 1999-01-21 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Improvements in or relating to peptide delivery
CN1117155C (zh) 1994-07-29 2003-08-06 史密丝克莱恩比彻姆有限公司 新型化合物
ATE208633T1 (de) 1994-09-16 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
EP1621206A1 (en) 1994-12-12 2006-02-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Chimeric cytokines and uses thereof
US6485726B1 (en) * 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
DE69632949T2 (de) * 1995-03-10 2005-07-28 Genentech, Inc., South San Francisco Die aktivierung von rezeptoren durch gas6
WO1996040792A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
GB9511935D0 (en) 1995-06-13 1995-08-09 Smithkline Beecham Plc Novel compound
AU1407997A (en) 1995-12-01 1997-06-19 Beth Israel Hospital Il-12 p40 subunit fusion polypeptides and uses thereof
US6620413B1 (en) * 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
CA2238307A1 (en) 1995-12-27 1997-07-10 Genentech, Inc. Ob protein derivatives having prolonged half-life
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US5756541A (en) 1996-03-11 1998-05-26 Qlt Phototherapeutics Inc Vision through photodynamic therapy of the eye
US6046310A (en) 1996-03-13 2000-04-04 Protein Design Labs., Inc. FAS ligand fusion proteins and their uses
WO1997043316A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
US5922685A (en) * 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
WO1998000127A1 (en) 1996-07-02 1998-01-08 Bar-Ilan University Retinoyloxy(substituted)alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases
ES2176574T3 (es) * 1996-09-03 2002-12-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Utilizacion de anticuerpos bi y triespecificos para la induccion de inmunidad tumoral.
US5994104A (en) * 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
NZ514145A (en) 1996-12-20 2003-08-29 Amgen Inc OB fusion protein compositions and methods
US6737057B1 (en) 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
JP4086908B2 (ja) 1997-04-17 2008-05-14 アムジエン・インコーポレーテツド 安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質と抗体Ｆｃ鎖とのコンジュゲートを含む組成物および方法
AU8182298A (en) 1997-07-10 1999-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins
CZ20003099A3 (cs) 1998-02-25 2002-04-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Zvýąení doby poloviční ľivotnosti cirkulujících fúzních proteinů odvozených od protilátek
ES2267263T3 (es) 1998-04-15 2007-03-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Coadministracion de un inhibidor de la angiogenesis para reforzar la respuesta inmunologica por medio de la mediacion de una proteina de fusion de una citoquina con un anticuerpo.
HUP0101343A3 (en) 1998-04-17 2003-10-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor
CA2341029A1 (en) * 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
HUP0103329A3 (en) 1998-08-25 2003-09-29 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Expression and export of angiostatin and endostatin as immunofusis
US6335176B1 (en) * 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
CA2356401A1 (en) 1999-01-07 2000-07-13 Lexigen Pharmaceuticals, Corp. Expression and export of anti-obesity proteins as fc fusion proteins
WO2000067761A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 Wake Forest University Compositions and methods for identifying antigens which elicit an immune response
BR0010725A (pt) 1999-05-19 2002-02-19 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas de interferon-alfa como proteìnas de fusão de fc
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
JP2003514552A (ja) 1999-11-12 2003-04-22 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態
CA2399832C (en) 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US8623373B2 (en) * 2000-02-24 2014-01-07 Philogen S.P.A. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
RU2363707C2 (ru) 2001-02-19 2009-08-10 Мерк Патент Гмбх Искусственные белки с пониженной иммуногенностью
AU2002248571B2 (en) 2001-03-07 2007-01-18 Merck Patent Gmbh Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
EP1476180A4 (en) 2001-08-13 2005-04-20 Univ Southern California INTERLEUKIN-2 MUTANTS WITH REDUCED TOXICITY
EP2354791A1 (en) 2001-12-04 2011-08-10 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
ES2337566T3 (es) 2002-03-11 2010-04-27 Philogen S.P.A. Anticuerpos derivados de anti ed-b l19 y vasculatura tumoral objetivo.
JP2005526769A (ja) 2002-03-15 2005-09-08 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療剤を全身搬送するための中央気道投与

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999029732A2 (en) * 1997-12-08 1999-06-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
WO2002002143A2 (en) * 2000-06-29 2002-01-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
WO2003093478A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Molmed Spa Immunoconjugates for the treatment of tumours

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARNEMOLLA B. ET AL.: "A tumor-associated fibronectin isoform generated by alternative splicing of messenger RNA precursors" JOURNAL OF CELL BIOLOGY 1989 UNITED STATES, vol. 108, no. 3, 1989, pages 1139-1148, XP002342604, ISSN: 0021-9525, abstract, page 1140, right-hand column, paragraph RESULTS - page 1144, right-hand column, figure 5, table III *
DICKERSON ERIN B. ET AL.: "Development of an IL-12 fusion protein for molecular targeting of tumor vasculature" PROCEEDINGS OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH ANNUAL MEETING, no. 41, March 2000 (2000-03), page 798, ABSTRACT NO. 5074, XP002342607 & 91ST ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH.; SAN FRANCISCO, CALIFORNIA, USA; APRIL 01-05, 2000, ISSN: 0197-016X, the whole document *
HALIN C. ET AL.: "Enhancement of the antitumor activity of interleukin-12 by targeted delivery to neovasculature" NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, vol. 20, no. 3, March 2002 (2002-03), pages 264-269, XP002256784, ISSN: 1087-0156, the whole document *
HALIN CORNELIA ET AL.: "Synergistic therapeutic effects of a tumor targeting antibody fragment, fused to interleukin 12 and to tumor necrosis factor alpha." CANCER RESEARCH, vol. 63, no. 12, 15 June 2003 (2003-06-15), pages 3202-3210, XP002342601, ISSN: 0008-5472, abstract, figures, page 3204, right-hand column - page 3207, right-hand column *
HUANG X. ET AL.: "TUMOR INFARCTION IN MICE BY ANTIBODY-DIRECTED TARGETING OF TISSUE FACTOR TO TUMOR VASCULATURE" SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, US, vol. 275, 24 January 1997 (1997-01-24), pages 547-550, XP002071588, ISSN: 0036-8075, the whole document *
LADELL KRISTIN ET AL.: "A combination of plasmid DNAs encoding murine fetal liver kinase 1 extracellular domain, murine interleukin-12, and murine interferon-gamma inducible protein-10 leads to tumor regression and survival in melanoma-bearing mice." JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE (BERLIN), vol. 81, no. 4, April 2003 (2003-04), pages 271-278, XP002342606, ISSN: 0946-2716, abstract, figures *
MAJEWSKI S. ET AL.: "INTERLEUKIN-12 INHIBITS ANGIOGENESIS INDUCED BY HUMAN TUMOR CELL LINES IN VIVO" JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, NEW YORK, NY, US, vol. 106, no. 5, 1996, pages 1114-1118, XP000949299, ISSN: 0022-202X, abstract, page 1116-page 1117 *
PENG L.S. ET AL.: "Mechanism of antitumor activity of a single-chain interleukin-12 IgG3 antibody fusion protein (mscIL-12.her2.IgG3)" JOURNAL OF INTERFERON AND CYTOKINE RESEARCH, vol. 21, no. 9, 2001, pages 709-720, XP002342605, ISSN: 1079-9907, abstract, page 712-page 715; figures, page 715, left-hand column, last paragraph - right-hand column, paragraph 2 *
THORPE P.E. ET AL.: "The First International Conference on Vascular Targeting: Meeting overview" CANCER RESEARCH 01 MAR 2003 UNITED STATES, vol. 63, no. 5, 1 March 2003 (2003-03-01), pages 1144-1147, XP002342602, ISSN: 0008-5472, page 1145, left-hand column *
VAN VLIET A.I. ET AL.: "Distribution of fibronectin isoforms in human renal disease" JOURNAL OF PATHOLOGY 2001 UNITED KINGDOM, vol. 193, no. 2, 2001, pages 256-262, XP002342603, ISSN: 0022-3417, abstract, page 257, left-hand column, last paragraph - right-hand column, paragraph 1, page 258; figure 1, page 260; table 2 *
VITI F. ET AL.: "Increased binding affinity and valence of recombinant antibody fragments lead to improved targeting of tumoral angiogenesis" CANCER RESEARCH 15 JAN 1999 UNITED STATES, vol. 59, no. 2, 15 January 1999 (1999-01-15), pages 347-352, XP002124782, ISSN: 0008-5472, abstract, page 348-page 350 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2005203962A1 (en) 2005-07-21
AU2005203962C1 (en) 2012-11-08
EP1702069A2 (en) 2006-09-20
EA011859B9 (ru) 2013-07-30
CA2552590A1 (en) 2005-07-21
US20070202103A1 (en) 2007-08-30
JP2007517506A (ja) 2007-07-05
WO2005066348A2 (en) 2005-07-21
AU2005203962B2 (en) 2010-10-07
EA200601264A1 (ru) 2007-12-28
WO2005066348A3 (en) 2005-11-10
US8420087B2 (en) 2013-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA011859B1 (ru) Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени
EP3297672B1 (en) Trispecific binding proteins and methods of use
US10308721B2 (en) Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
ES2240981T3 (es) Citocina denominada lerk-7.
ES2301491T3 (es) Anticuerpo humano de trasplante con region de determinacion de la complementariedad contra gangliosido gd3 y derivados del anticuerpo contra gangliosido gd3.
US7939056B2 (en) Interleukin-10 compositions for the treatment of adenocarcinomas
CN110036032A (zh) 抗muc16(粘蛋白16)抗体
EA009026B1 (ru) Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях
CN101160321A (zh) Q3 sparc缺失突变体及其用途
JP7102670B2 (ja) 抗ｐｄ‐ｌ１抗体とｉｌ‐７との融合
KR20200123782A (ko) 암치료를 위해 화학치료제와 병용된 다중결합 항-dr5 결합분자의 용도
EA010803B1 (ru) Модифицированные белки буганины, цитотоксины и способы их применения
HU230586B1 (hu) Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására
KR20210008487A (ko) 항-cd24 조성물 및 이의 용도
BR112019026803A2 (pt) anticorpos apenas de cadeia pesada anti-bcma
HU230399B1 (hu) Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai
EA015706B1 (ru) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с полипептидом il-22ra, гуманизированное антитело, полученное из указанного антитела, гибридомы, продуцирующие антитело, и применение указанного антитела
US20150218247A1 (en) Taci as an anti-tumor agent
JP2004513876A (ja) 抗−腫瘍剤としてのｔａｃｉ
JP2000504716A (ja) Ｔｎｆアンタゴニストを用いた血管障害の治療方法
JPH04228089A (ja) 高カルシウム血症治療・予防剤
TW201726748A (zh) 新穎抗－ｍｍｐ１６抗體及使用方法
JP2003261460A (ja) 肺選択的癌転移の診断薬および治療薬
EP1746106A2 (en) Use of TACI as an anti-tumor agent
FR2652746A1 (fr) Application d&#39;agents actifs pour la preparation d&#39;un medicament destine au traitement de lymphomes ou assimiles.

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ MD TJ TM RU

RH4A Grant of a duplicate of a eurasian patent
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ MD TJ TM RU