EA007251B1

EA007251B1 - 3-{(3R,4R)-4-МЕТИЛ-3-[МЕТИЛ-(7H-ПИРРОЛО[2,3-d]ПИРИМИДИН-4-ИЛ)АМИНО]ПИПЕРИДИН-1-ИЛ}-3-ОКСОПРОПИОНИТРИЛ И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ

Info

Publication number: EA007251B1
Application number: EA200301193A
Authority: EA
Inventors: Гленн Эрнест Уилкокс; Кристиан Кехер; Тон Врис; Марк Эдвард Флэнэган; Майкл Джон Манчхоф
Original assignee: Пфайзер Продактс Инк.
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2006-08-25
Also published as: ZA200307982B; FR17C1031I2; TW200413370A; DK1666481T3; SK14652003A3; AU2008203170B2; SI1666481T1; KR20080083028A; CZ20033260A3; ES2369226T3; HRP20030943A2; AU2002304401B2; IS6993A; EP1666481B9; EP1609781A1; ES2393385T3; UY27317A1; EE200300594A; HRP20030943B1; PT1666481E

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения 3-{(3R,4R)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)амино]пиперидин-1-ил}-3-оксопропионитрила и его фармацевтически приемлемых солей.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к способам осуществления разделения хиральных солей из рацемических смесей энантиомеров и, в частности, предшественников энантиомеров, используемых для получения 3 -{(3К,4К)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло [2,3-ά] пиримидин-4-ил)амино ] пиперидин-1 -ил}-3оксопропионитрила и его фармацевтически приемлемых солей, используемых в качестве ингибиторов протеинкиназ, таких как фермент киназа 3 1апи8.

Предпосылки изобретения

Соединения пирроло[2,3-б]пиримидина являются ингибиторами протеинкиназ, таких как фермент киназа 3 1апи8 (1ΆΚ3)), и поэтому используются в терапии в качестве иммуносуппрессивных средств для трансплантации органов, ксенотрансплантации, для лечения волчанки обыкновенной, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, диабета типа I и осложнений, связанных с диабетом, рака, астмы, атопического дерматита, аутоиммунных нарушений щитовидной железы, язвенных колитов, болезни Крона, болезни Альцгеймера, лейкоза и других симптомов, где иммуносуппрессивное средство является желательным. Соединения пирроло[2,3-б]пиримидина, их фармацевтические композиции и способы применения описаны в находящейся на одновременном рассмотрении заявке №09/732669, поданной 8 декабря 2000, и принадлежащей правопреемнику данного изобретения. Раскрытие указанной заявки включено в объем данного изобретения в качестве ссылки. Первоначально получают рацемические смеси соединений пирроло[2,3-б]пиримидина, тогда как индивидуальные энантиомеры, выделенные в по существу чистой форме, являются предпочтительными и иногда требуются для использования в качестве лекарственных средств. Представляется возможным предопределить стереохимию соединений в их синтезе путем использования стереоспецифических соединений-предшественников. Способы данного изобретения, соответственно, непосредственно относятся к способу существенного разделения хиральных солей из рацемических смесей соединений-предшественников, используемых для получения отдельных энантиомерных форм соединений пирроло[2,3-б]пиримидина.

Краткое изложение изобретения

Данное изобретение относится к способам разделения энантиомеров предшественников, используемых для получения 3-{(3К,4К)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)амино]пиперидин-1 -ил }-3-оксопропионитрила.

Данное изобретение также относится к получению стереоспецифических фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей соединения 3-{(3К,4К)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)амино]пиперидин-1-ил}-3-оксопропионитрила.

Данное изобретение также относится к получению стереоспецифических фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей соединения 3-{(3К,4К)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)амино]пиперидин-1-ил}-3-оксопропионитрила. Кислоты, которые используются для получения фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей, упомянутых выше основных соединений данного изобретения, представляют собой кислоты, которые образуют нетоксичные кислотноаддитивные соли, т.е., соли, содержащие фармакологически приемлемые анионы, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, ацетат, лактат, цитрат, кислый цитрат, тартрат, битартрат, сукцинат, малеат, фумарат, глюконат, сахарат, бензоат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, паратолуолсульфонат и памоат [т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси3-нафтоат)].

Изобретение также относится к стереоспецифическим основно-аддитивным солям формулы I. Химические основания, которые могут использоваться в качестве реагентов для получения фармацевтически приемлемых основных солей таких соединений формулы I, которые являются кислотными по происхождению, представляют собой те основания, которые образуют нетоксичные основные соли с такими соединениями. Такие нетоксичные основные соли включают, но не ограничиваются теми, которые получены из таких фармакологически приемлемых катионов, как катионы щелочных металлов (например, калия и натрия), катионы щелочно-земельных металлов (например, кальция и магния), аддитивные соли аммония или водорастворимых аминосолей, такие как Ы-метилглюкамин-(меглумин), и низшие алканоламмониевые и другие основные соли или фармацевтически приемлемые органические амины.

Термин «алкил», как используется в данном описании, если не указано иное, включает насыщенные одновалентные углеводородные радикалы, имеющие прямые или разветвленные фрагменты или их комбинации.

Термин «алкокси», как используется в данном описании, включает О-алкильные группы, в которых алкил является таким, как определен выше.

Термин «галоген», как используется в данном описании, если не указано иное, включает фтор, хлор, бром или йод. Соединения данного изобретения могут содержать двойные связи. Когда такие связи присутствуют, соединения изобретения существуют как в цис-, так и транс-конфигурациях, а также в виде их смесей. Если не указано иное, указанные в данном описании алкильные и алкенильные группы, также как указанные алкильные фрагменты других групп (например, алкокси), могут быть линейными или разветвленными, и они также могут быть циклическими (например, циклопропил, циклобутил, цик

- 1 007251 лопентил, циклогексил или циклогептил) или линейными или разветвленными и содержать циклические фрагменты. Если не указано иное, галоген включает фтор, хлор, бром и йод.

(С₂-С₉)Гетероциклоалкил, когда используется в данном описании, относится к пирролидинилу, тетрагидрофуранилу, дигидрофуранилу, тетрагидропиранилу, пиранилу, тиопиранилу, азиридинилу, оксиранилу, метилендиоксилу, хроменилу, изоксазолидинилу, 1,3-оксазолидин-3-илу, изотиазолидинилу, 1,3тиазолидин-3-илу, 1,2-пиразолидин-2-илу, 1,3-пиразолидин-1-илу, пиперидинилу, тиоморфолинилу, 1,2тетрагидротиазин-2-илу, 1,3-тетрагидротиазин-3-илу, тетрагидротиадиазинилу, морфолинилу, 1,2тетрагидродиазин-2-илу, 1,3-тетрагидродиазин-1-илу, тетрагидроазепинилу, пиперазинилу, хроманилу и т.д. Обычному специалисту в данной области будет понятно, что связывание указанных (С₂С₉)гетероциклоалкильных колец происходит через атом углерода или 8р³-гибридизированный гетероатом азота.

(С₂-С₉)Гетероарил, когда используется в данном описании, относится к фурилу, тиенилу, тиазолилу, пиразолилу, изотиазолилу, оксазолилу, изоксазолилу, пирролилу, триазолилу, тетразолилу, имидазолилу, 1,3,5-оксадиазолилу, 1,2,4-оксадиазолилу, 1,2,3-оксадиазолилу, 1,3,5-тиадиазолилу, 1,2,3тиадиазолилу, 1,2,4-тиадиазолилу, пиридилу, пиримидину, пиразинилу, пиридазинилу, 1,2,4-триазинилу, 1,2,3-триазинилу, 1,3,5-триазинилу, пиразоло[3,4-Ь]пиридинилу, циннолинилу, птеридинилу, пуринилу, 6,7-дигидро-5Н-[1]пириндинилу, бензо[Ь]тиофенилу, 5,6,7,8-тетрагидро-хинолин-З-илу, бензоксазолилу, бензотиазолилу, бензизотиазолилу, бензизоксазолилу, бензимидазолилу, тианафтенилу, изотианафтенилу, бензофуранилу, изобензофуранилу, изоиндолилу, индолилу, индолизинилу, индазолилу, изохинолинилу, хинолилу, фталазинилу, хиноксалинилу, хиназолинилу, бензоксазинилу; и т.д. Обычному специалисту в данной области будет понятно, что связывание указанных (С₂-С₉)гетероарильных колец происходит через атом углерода или §р³-гибридизированный гетероатом азота.

(Сб-Сю)арил, когда используется в данном описании, относится к фенилу или нафтилу.

Соединения, используемые в данном изобретении, включают все конформационные изомеры (например, цис- и транс-изомеры). Соединения, используемые в данном изобретении, имеют центры асимметрии и поэтому являются хиральными и существуют в различных энантиомерных и диастереомерных формах. Данное изобретение относится к разделению оптических изомеров и стереоизомеров предшественников составляющих компонентов и, посредством этого, соединений данного изобретения и их смесей, и ко всем фармацевтическим композициям и способам лечения, в которых они могут быть использованы или включены в них. В этом отношении изобретение включает как Е, так и Ζ конфигурации. Соединения формулы I также могут существовать в виде таутомеров. Данное изобретение относится к таким таутомерам и их смесям. В частности, разделение рацемических смесей энантиомеров соединений, используемых в получении заместителя В¹ формулы I, осуществляют путем обработки рацемической смеси специфическим оптическим изомером дизамещенной винной кислоты или тартрата в подходящем растворителе, таком как этанол с водой или без воды в качестве сорастворителя. Разделение при получении желаемого энантиомера в избытке 90% является возможным в соответствии со способом данного изобретения с использованием растворителей, таких как оптические изомеры винной кислоты и производные винной кислоты, такие как ди-пара-толуол-Е-винная кислота и соль (8)-(+)-анденокислоты (пенцифос, соль (8)-(+)-2-гидрокси-5,5-диметил-4-фенил-1,3,2-диоксифосфоринан-2-оксида).

Взаимодействие между антиподами - агентом разделения и определенным энантиомером - обеспечивает разделение рацемической смеси, за счет чего осадок вещества для разделения и энантиомера обеспечивает одно из желаемых стереоспецифических веществ, и оставшийся в растворе энантиомер может быть отдельно выделен. Таким образом, в зависимости от желаемого определенного энантиомера и используемого способа разделения (т.е., от осадка или раствора), может быть одновременно выбрана стереоспецифическая природа процесса разделения; например, «Ь» форма агента разделения, такого как производное тартрата, обеспечивает осадок «В» формы заместителя В¹ и раствора, содержащего «Ь» форму, и наоборот.

Упомянутые выше агенты разделения являются эффективными для (либо в осадке, либо в растворе, как описано) обеспечения ЗВ,4В энантиомера соединения формулы:

В соответствии с данным изобретением, способ разделения соединения формулы III осуществляют с использованием следующих стадий:

а) смешение рацемической смеси соединения формулы III в подходящем растворе с агентом разделения, имеющим определенную стереоспецифичность, в течение периода времени, достаточного для то

-2007251 го, чтобы достичь существенного осаждения стереоспецифического изомера рацемической смеси из раствора;

Ъ) в зависимости от стереоспецифической формы желаемого соединения, либо сбор осадка и его очистка, либо сбор маточного раствора и перекристаллизация содержащегося в нем энантиомера.

При использовании некоторых веществ образуется суспензия, а не раствор, и разделение по настоящему изобретению включает конверсию суспензии. Термин «раствор» включает в себя как раствор, так и суспензию.

Температура, при которой осуществляют разделение и осаждение, представляет собой предпочтительно комнатную температуру и несмотря на то, что время осаждения не ограничено, для эффективности процесса время составляет предпочтительно не более, чем приблизительно 4 ч. Для того чтобы облегчить процесс разделения желательно использовать энантиомеры в рацемической смеси, которые находятся в устойчивой форме, и соединение формулы II является наиболее устойчивым в форме кислотноаддитивной соли, такой как соль гидрохлорида, скорее чем в форме свободного основания, и предпочтительно, чтобы перед разделением провести соответствующее преобразование рацемической смеси. Так, например, образование соли гидрохлорида соединения формулы II осуществляют предпочтительно в этаноле с небольшим количеством толуола в качестве сорастворителя. Альтернативно, для образования соли могут быть использованы метанол, изопропанол, ацетонитрил или тетрагидрофуран (или их смесь с водой или без воды в качестве сорастворителя) с сорастворителями, такими как толуол, этилацетат, дихлорметан, дихлорэтан или тетрагидрофуран. Соль НС1 является особенно предпочтительной, поскольку эта форма обеспечивает превосходную очистку и обогащена другими стереоизомерами с предыдущей стадии.

Предпочтительным вытесняющим растворителем, используемым в разделении, является этилацетат. Толуол, ацетонитрил или гептаны также используются в качестве растворителей.

Предпочтительным растворителем для выделения является ацетон. Другие растворители, используемые для этой цели, включают изопропанол, этанол, метилэтилкетон, метилизопропилкетон, ацетонитрил и тетрагидрофуран. Растворители также могут использоваться в качестве сорастворителей, друг с другом или с водой.

Предпочтительные соединения для разделения включают винную кислоту и ее производные, такие как толуоил- и бензоилвинные кислоты в стереоспецифической конформации, как описано. Другие соединения для разделения включают стереоспецифические адено кислоты и их производные.

Для того чтобы облегчить осаждение и перекристаллизацию добавление затравочных кристаллов является необязательным, но предпочтительным для того, чтобы получить более высокий ЭИ (энантиомерный избыток) вещества при меньшем количестве перекристаллизации.

Для иллюстрации процедуры и эффективности данного изобретения ниже представлены следующие примеры. Понятно, что такие примеры, как подробности данного изобретения, не предназначены для ограничения данного изобретения.

Данное изобретение также относится к способу получения 3-{(ЗК,4К)-4-метил-3-[метил-(7Нпирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)амино]шшеридин-1-ил}-3-оксопропионитрила.

Данное изобретение также относится к соединению формулы

где К² и К³ представляют собой водород.

Данное изобретение также относится к конкретному соединению: 3-{(ЗК,4К)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)амино]пиперидин-1-ил}-3оксопропионитрилу.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции для (а) лечения или предотвращения заболевания или состояния, выбранного из отторжении органов при трансплантации, ксенотрансплантации, волчанки обыкновенной, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, диабета типа I и осложнений, связанных с диабетом, рака, астмы, атонического дерматита, аутоиммунных нарушений щитовидной железы, язвенных колитов, болезни Крона, болезни Альцгеймера, лейкемии и других аутоиммунных заболеваний или (Ъ) ингибирования протеинкиназ или киназы 3 1аии§ (ΙΑΚ3) у млекопитающих, включая человека, содержащая эффективное для таких нарушений или состояний количество описанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.

Данное изобретение также относится к способу ингибирования протеинтирозинкиназ или киназы 3 1апи8 (ΙΑΚ3) у млекопитающих, включая человека, заключающемуся во введении указанному млекопи

-3 007251 тающему эффективного количества 3-{(ЗК,4К)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4ил)амино]пиперидин-1-ил}-3-оксопропионитрила или его фармацевтически приемлемой соли.

Данное изобретение также относится к способу лечения или предотвращения заболевания или состояния, выбранного из отторжения органов при трансплантации, ксенотрансплантации, волчанки обыкновенной, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, псориаза, диабета типа I и осложнений, связанных с диабетом, рака, астмы, атопического дерматита, аутоиммунных нарушений щитовидной железы, язвенных колитов, болезни Крона, болезни Альцгеймера, лейкоза и других аутоиммунных заболеваний у млекопитающих, включая человека, заключающемуся во введении указанному млекопитающему эффективного для лечения такого состояния количества 3-{(ЗК,4К)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)амино]пиперидин-1-ил}-3-оксопропионитрила или его фармацевтически приемлемой соли.

н

Подробное описание изобретения

Соединения данного изобретения, которые являются основными по природе, способны к образованию широкого диапазона различных солей с различными неорганическими и органическими кислотами. Хотя такие соли должны быть фармацевтически приемлемыми для введения животным, на практике часто является желательным изначально выделить соединение данного изобретения из реакционной смеси в качестве фармацевтически неприемлемой соли и затем просто преобразовать последнюю обратно в свободное основное соединение обработкой щелочным реагентом и последовательно преобразовать последнее свободное основание в фармацевтически приемлемую кислотно-аддитивную соль. Кислотноаддитивные соли основных соединений данного изобретения легко получают путем обработки основного соединения по существу эквивалентным количеством выбранной минеральной или органической кислоты в среде водного растворителя или в подходящем органическом растворителе, таком как ацетон, метанол или этанол. Желаемую твердую соль легко получить при осторожном выпаривании растворителя. Желаемую соль кислоты также можно осаждать из раствора свободного основания в органическом растворителе при добавлении к раствору подходящей минеральной или органической кислоты.

Те соединения данного изобретения, которые являются по своей природе кислотными, являются способными к образованию основных солей с различными фармакологически приемлемыми катионами. Примеры таких солей включают соли щелочных или щелочно-земельных металлов и, в частности, соли кальция, натрия и калия. Все эти соли получают обычными методами. Химические основания, которые используются в качестве реагентов для получения фармацевтически приемлемых основных солей настоящего изобретения, представляют собой основания, которые образуют нетоксичные основные соли с кислотными соединениями данного изобретения. Такие нетоксичные основные соли включают те соли, которые являются производными от таких фармакологически приемлемых катионов, как натрий, калий, кальций и магний и т.д. Эти соли можно легко получить путем обработки соответствующих кислотных соединений водным раствором, содержащим желаемые фармакологически приемлемые катионы, и затем выпариванием полученного раствора досуха, предпочтительно, при пониженном давлении. Альтернативно, их также можно получить смешением низших алканольных растворов кислотных соединений с желаемым алкоксидом щелочного металла, и затем выпариванием полученного раствора досуха способом, аналогичным ранее описанному. В каждом случае предпочтительно используются стехиометрические количества реагентов для того, чтобы обеспечить завершенность реакции и максимальные выходы желаемого конечного продукта.

-4007251

Композиции по данному изобретению могут быть получены обычным способом с использованием одного или более фармацевтически приемлемых носителей. Таким образом, активные соединения изобретения могут быть изготовлены для перорального, буккального, интраназального, парентерального (например, внутривенного, внутримышечного или подкожного) или ректального введения или в форме, подходящей для введения путем ингаляции или вдувания. Активные соединения по изобретению могут быть также изготовлены в форме для замедленного высвобождения.

Для перорального введения фармацевтические композиции могут иметь форму, например, таблеток или капсул, полученных обычными способами с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как связующие (например, предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или фосфат кальция); лубриканты (например, стеарат магния, тальк или кремнезем); дезинтегранты (например, картофельный крахмал или крахмалгликолят натрия); или увлажнители (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты способами, хорошо известными в данной области. Жидкие препараты для перорального введения могут иметь форму, например, растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены в виде сухого продукта для смешения с водой или другим подходящим растворителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут быть получены обычными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сорбитоловый сироп, метилцеллюлоза или гидрированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или акация); неводные растворители (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры или этиловый спирт); и консерванты (например, метил или пропил пара-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота).

Для буккального введения композиции могут иметь форму таблеток или лепешек, приготовленных обычным способом.

Активные соединения по изобретению могут быть изготовлены в форме композиции для парентерального введения путем инъекции, включая использование обычных катетерных методик или вливания. Фармацевтические композиции для инъекции могут быть представлены в единичной дозированной форме, например, в ампулах, или в упаковках, содержащих множество доз, с добавлением консерванта. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных растворителях, и могут содержать средства для приготовления лекарственных препаратов, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для восстановления подходящим растворителем перед использованием, например, стерильной апирогенной водой.

Активные соединения изобретения также можно изготавливать в форме ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

Для интраназального введения или введения путем ингаляции активные соединения изобретения удобным образом доставляются в форме раствора или суспензии из контейнера с диспергирующим устройством, который сжимается или накачивается пациентом, или доставляются в виде аэрозольного спрея из контейнера, находящегося под давлением или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением, разовая доза может определяться за счет клапана для доставки отмеренного количества. Контейнер, находящийся под давлением, или распылитель может содержать раствор или суспензию активного соединения. Капсулы и картриджи (сделанные, например, из желатина) для использования в ингаляторе или вдувателе, могут изготовляться содержащими порошковую смесь соединения по данному изобретению и подходящего порошкового основания, такого как лактоза или крахмал.

Предложенная доза активных соединений по данному изобретению для перорального, парентерального или буккального введения среднему взрослому человеку для лечения состояний, относящихся к описанным выше (например, ревматоидному артриту) составляет 0,1-1000 мг активного ингредиента на единичную дозу, которая может вводиться, например, от 1 до 4 раз в день.

Аэрозольные композиции для лечения состояний, относящихся к описанным выше (например, астме) у среднего взрослого человека, предпочтительно составлены так, что каждая отмеренная доза или «импульс» аэрозоля содержит 20-1000 мкг соединения по данному изобретению. Верхний предел суточной дозы аэрозоля должен быть в пределах от 0,1 до 1000 мг. Введение можно осуществлять несколько раз в день, например, 2, 3, 4 или 8 раз, получая, например, 1, 2 или 3 дозы каждый раз.

Соединение формулы (I) вводят в фармацевтически приемлемой форме, либо отдельно, либо в комбинации с одним или более дополнительными средствами, которые модулируют иммунную систему млекопитающего, или с противовоспалительными средствами, средствами, которые могут включать, но не ограничиваются этим, циклоспорин А (например, БапЛттипе® или Ыеога1®), рапамицин, РК-506 (такролимус), лефлуномид, дезоксиспергуалин, микофенолят (например, Се11сер1®), азатиоприн (например, 1тигап®), даклизумаб (например, 2епарах®), ОКТ3 (например, Ог11юсо1опе®). А1Сат, аспирин, акктаминофен, ибупрофен, напроксен, пироксикам и противовоспалительные стероиды (например, предни

- 5 007251 золон или дексаметазон); и такие средства могут вводиться как часть одной и той же или в виде отдельной дозированной формы, одним и тем же или различными путями введения, и по одним и тем же или разным схемам введения, в соответствии со стандартной фармацевтической практикой.

ГК-506 (Такролимус) вводят перорально в дозе 0,10-0,15 мг/кг веса тела, каждые 12 ч, в первые 48 ч после операции. Доза контролируется по падению уровней Такролимуса в сыворотке.

Циклоспорин А (пероральная или внутривенная композиция Запбиптипс. или №ога1®, пероральный раствор или капсулы) вводят перорально в дозе 5 мг/кг веса тела, каждые 12 ч, в первые 48 ч после операции. Доза контролируется по падению уровней циклоспорина А в крови.

Активные агенты могут быть представлены в форме композиции замедленного высвобождения в соответствии со способами, хорошо известными обычному специалисту в данной области. Примеры таких композиций можно найти в патентах США 3538214, 4060598, 4173626, 3119742 и 3492397.

Способность 3 -{(3К.,4К.)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло [2,3-6] пиримидин-4-ил)амино ] пиперидин-1ил}-3-оксопропионитрила или его фармацевтически приемлемых солей ингибировать Киназу 3 1апик, следовательно, демонстрировать эффективность для лечения нарушений или состояний, охарактеризованных Киназой 3 1апик, представлена при помощи следующих анализов ίη νίίτο.

Биологический анализ

Ферментный анализ 1АК3 (1Н1:О8Т).

В анализе киназы 1АК3 используют белок, экспрессированный в клетках 8Г9, инфицированных бакуловирусом (слитый белок С8Т и каталитического домена человеческой 1АК3), очищенный аффинной хроматографией на глутатион-сефарозе. Субстрат для реакции представляет собой полиглутаминовую кислоту-тирозин (РСТ(4:1) 8щша са!а1од #Р0275), нанесенный на планшеты Ыипс Мах1 8огр в количестве 100 мкг/мл, в течение ночи при 37°С. На утро, следующее после нанесения, планшеты промывали 3 раза, и добавляли 1АК3 в лунки, содержащие 100 мкл киназного буфера (50 мМ НЕРЕ8, рН 7,3, 125 мМ ЫаС1, 24 мМ МдС1₂) + 0,2 мкМ АТФ + 1 мМ ортованадата Ыа). Реакцию продолжали в течение 30 мин при комнатной температуре, и планшеты промывали еще 3 раза. Уровень фосфорилированного тирозина в данной лунке подсчитывали при помощи стандартного анализа ЕЫ8А с использованием антифосфотирозинового антителя (1СЫ ΡΥ20, са!.#69-151-1).

Ингибирование зависимой от человеческого 1Ь-2 пролиферации Т-бластных клеток.

В этом анализе измеряют ингибирующее действие соединений на зависимую от человеческого 1Ь-2 пролиферацию Т-бластных клеток ίη νίίτο. Так как передача сигнала через 1Ь-2 рецептор требует 1АК3, клеточно-активные ингибиторы 1АК3 должны ингибировать зависимую от 1Ь-2 пролиферацию Тбластных клеток.

Клетки для этого анализа выделяли из свежей человеческой крови. После отделения моноядерных клеток с использованием Ассикрш 8ук1е1п-Н|к1орас.|ие-1077 (81дта#А7054), первичные человеческие Тклетки выделяли при помощи отрицательной выборки, используя Ьутрйо-КМк Т (Опе ЬатЬба, 1пс., Са1#ЬК-50Т). Т-клетки культивировали при 1-2х10⁶/мл в Среде (ВРМ1+10% фетальная телячья сыворотка, инактивированная теплом (Нус1опе Са1. # А-1111-Ь) + 1% пенициллин/стрептомицин (С1Ьсо)) и индуцировали для пролиферации путем добавления 10 мкг/мл РНА (Мигех П1адпок1юк, Са1 # НА 16). Через 3 дня при 37°С в 5% СО₂ клетки промывали 3 раза в Среде, ресуспендировали до плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в Среде плюс 100 единиц/мл человеческого рекомбинантного 1Ь-2 (Κ.&Ό 8ук1етк, Са1 # 202-Ш). Через 1 неделю клетки являются 1Ь-2 зависимыми и могут поддерживаться до трех недель за счет подпитки равными объемами Среды + 100 единиц/мл 1Ь-2 дважды в неделю.

Для анализа способности испытываемых соединений ингибировать зависимую от 1Ь-2 пролиферацию Т-клеток, 1Ь-2-зависимые клетки промывали 3 раза, ресуспендировали в среде и затем высевали (50000 клеток/лунку/0,1 мл) в 96-луночный микротитровальный планшет с плоским дном (Ба1соп#353075). Из 10 мМ исходного раствора тестируемого соединения в ДМСО, серийные двукратные разведения соединения добавляли в лунки в трех повторах, начиная с 10 мкМ. Спустя 1 ч в каждую тестируемую лунку добавляли 10 единиц/мл 1Ь-2. Планшеты затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 72 ч. Затем планшеты метили ³Н-тимидином (0,5 мкКюри/лунку) (ΝΕΝ Са1#ИЕТ-027А) и инкубировали дополнительно 18 ч. Культуральные планшеты затем собирали при помощи 96-луночного планшетного харвестера, и определяли количество ³Н-тимидина, включенного в пролифирирующие клетки, считыванием на сцинтилляционном счетчике Раскатб Тор Соип1. Данные анализировали построением графика зависимости ингибирования пролиферации (%) от концентрации тестируемого соединения. Величину 1С₅₀ (мкМ) определяли из этого графика.

Следующие примеры иллюстрируют получение соединений данного изобретения, но конкретно не ограничивают его. Температуры плавления нескорректированы. Данные ЯМР приведены в частях на миллион (δ) и соотнесены с сигналом дейтерия из содержащего образец растворителя (дейтериохлороформа, если не указано иное). Коммерческие реагенты использовались без дальнейшей очистки. ТГФ относится к тетрагидрофурану. ДМФ относится к Ν,Ν-диметилформамиду. Масс-спектр низкого разрешения (Ьоте РекокФоп Макк 8рес1га (ЬКМ8)) записывали либо на Не\\'1е11 Раскатб 5989®, используя химическую ионизацию (аммоний), либо используя платформу Г1копк (или Мюго Макк) химической ионизации при атмосферном давлении (АРС1)), в которой используется смесь 50/50 ацетонитрил/вода с 0,1%

- 6 007251 муравьиной кислотой в качестве ионизирующего средства. Комнатная или температура окружающей среды относится к 20-25°С.

Пример 1 (образование устойчивой соли). Бис гидрохлорид (1-бензил-4-метилпиперидин-3-ил)метиламина.

К раствору 23,4 кг (1-бензил-4-метилпиперидин-3-ил)метиламина в 10 л толуола и 120 л этанола при 3°С добавляли 25 л в 32% НС1 в воде, поддерживая температуру реакции ниже 10°С. 100 л растворителя отгоняли дистилляцией при частичном вакууме, и при 30°С добавляли 215 л этилацетата. 210 л растворителя отгоняли дистилляцией при частичном вакууме, и добавляли еще 215 л этилацетата, и следующие 210 л растворителя отгоняли дистилляцией при частичном вакууме. При 35°С добавляли 111л ацетона, суспензию охлаждали до 0°С, и затем продукт, бисгидрохлорид (1-бензил-4-метилпипер идин-3 ил)метиламина, отфильтровывали и промывали 55 л ацетона. Мокрую лепешку ресуспендировали 3 раза в этаноле (10 объемных эквивалентов при кипячении с обратным холодильником) для изменения соотношение диастереомеров цис:транс от 91:9 до более чем 97:3. Всего было получено 19,4 кг, выход 62%.

^ХН ЯМР (СОзСЮ, 400 МГц): 7,55 (м, 5Н), 4,88 (с, ЗН), 4,52 (д, 1=12,8 Гц, 1Н), 4,45 (д, 1=12,8 Гц, 1Н),

3,76 (м, 1Н), 3,67 (м,1Н), 3,40-3,00 (м, ЗН), 2,78 (3, ЗН), 2,55 (м,1Н), 2,14 (м,1Н), 1,90 (м,1Н), 1,16 (д, 1=7,2 Гц, ЗН).

Пример 2 (разделение). бис[(1-Бензил-4-метилпиперидин-3-ил)метиламин]ди-паратолуоил-Г-тартрат.

К раствору 9,5 кг бисгидрохлорида (1-бензил-4-метилпиперидин-3-ил)метиламина в 16 л воды добавляли 33 л 2н гидроксида натрия. Из смеси осаждали твердые вещества. Суспензию разбавляли 43 л изопропанола и 11 л метанола, чтобы повторно растворить твердые вещества. Добавляли дипаратолуоил-Г-винную кислоту (6,3 кг), с осаждением твердых веществ. Суспензию нагревали при кипячении с обратным холодильником, чтобы повторно растворить твердые вещества, затем медленно охлаждали до 12°С. Добавляли затравочные кристаллы бис[(1-бензил-4-метилпиперидин-3-ил)метиламин]дипаратолуоил-Г-тартрата (180 г), и мутный раствор медленно охлаждали до 15°С. Твердые вещества фильтровали и промывали изопропанолом, чтобы на выходе получить 5,9 кг бис[(1-бензил-4метилпиперидин-3-ил)метиламин]ди-паратолуоил-Ь-тартрата с выходом 44%.

*Н ЯМР (СОзСЮ, 400 МГц): 8,04 (д, 1=8,4 Гц, 2Н), 7,30 (м, 7Н), 5,86 (с, 1Н), 4,91 (с, ЗН), 3,64 (д, 1=12,8 Гц, 1Н), 3,41 (д, 1=12,8 Гц, 1Н), 3,09 (с, 1Н), 2,90 (м, 2Н), 2,40 (с, ЗН), 2,22 (м, 2Н), 1,92 (м, 1Н), 1,57 (м, 2Н), 1,03 (д, 1=7,2 Гц, ЗН).

Пример 3 (разделение фенцифоса).

К раствору 6,83 г (31,3 ммоль) в 250 мл ΙΡΑ и 10 мл воды добавляли 7,57 г (+)фенцифоса (31,3 ммоль), и смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником, чтобы получить чистый раствор. При температуре приблизительно 65°С добавляли затравочные кристаллы с 90% ЭИ. Кристаллизация начиналась в течение 1 ч, и смесь оставляли на ночь для достижения комнатной температуры. Выделение достигало 6,85 г (47%) с 99+% ЭИ. Фильтрат концентрировали, добавляли ТВМЕ, воду и К₂СО₃, и слои разделяли. Органический слой сушили (№₂8О₄), и растворитель выпаривали. Получившееся масло (3,99

г) растворяли в 200 мл ΙΡΑ и 10 мл воды, и добавляли 4,4 г (-) фенцифоса. Смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником и оставляли на ночь остывать до комнатной температуры. Это давало 6 г (41%) соли с 99,9+% ЭИ. Анализы проводили на свободный амин. Свободный амин получали путем обработки соли ТВМЕ, водой и К₂СО₃.

Далее схематически проиллюстрированы способы примеров 1-3 (где Вп означает бензил (-СН₂-СбН₅)): н₃с.,

Н₃с.,„ НС1 > ^в°Д^а / этанол 'Г ] . 2НС1 'Г Д----ΝΒη ΟΗ₃ΗΝ

ΟΗ₃ΗΝ рацемический рацемический

НзС.,, сн₃нм

2ΗΟ

1) ИаОН

2) ди-пара-толуил-Ьтартрат, ΙΡΟ, МеОН рацемический

ΑΝΒη

СНзНК' СООН шс-СХ'о-сн СООН ¹ ’Άί ^2Ηα,..·Α-ΝΒη СН₃НЫ*' рацемический

99% ЭИ свободное основание

Пример 4. Растворяли рацемическую смесь соединения формулы III:

В!

Обработка образца:

Соединение формулы III фильтровали через фильтровальный диск из нейлона 66 с диаметром отверстий 0,2 мкм.

Процедура: (96% этанола 4% воды в качестве растворителя).

0,8711 г соединения формулы III, фильтрата, растворяли в 5,0 мл смеси этанол/вода в соотношении 96:4. Добавляли 1,544 г ди-паратолуоил-й-винной кислоты, и смесь перемешивали, чтобы получить чистый раствор. Раствор оставляли стоять при комнатной температуре в течение приблизительно 4 ч. Получившуюся суспензию фильтровали на фильтровальной бумаге \¥11а£тап#2 и промывали 4,0 мл смеси этанол/вода в соотношении 96:4. Твердые вещества сушили на воздухе с получением 0,488 г диастереомерной соли.

0,488 г диастереомерной соли суспендировали в 50 мл воды, затем добавляли 50 мл метиленхлорида. рН смеси доводили до приблизительно 9, используя насыщенный бикарбонат натрия с последующим добавлением 1,0 и гидроксида натрия. После регулирования достижения уровня рН, слои разделяли и слой метиленхлорида фильтровали через фильтровальную бумагу \¥11а£тап#2. Растворители затем удаляли выпариванием при пониженном давлении с получением масла светло-оранжевого цвета. Вес не определяли. Это масло оценивали с помощью газовой хроматографии.

Аналитический анализ: 97,3% желаемого энантиомера, определенного по нормализованной площади пика (процент).

Пример 5.

Процедура: (100% этанол в качестве растворителя).

0,8714 г (1-бензил-4-метилпиперидин-3-ил)метиламина растворяли в 5,0 мл 200-градусного этанола. Добавляли 1,544 г ди-паратолуоил-й-винной кислоты, и смесь перемешивали, чтобы получить чистый раствор. Раствор оставляли стоять при комнатной температуре в течение приблизительно 4 ч. Получившуюся суспензию фильтровали на фильтровальной бумаге \¥Ъа1тап#2 и промывали 4,0 мл смеси этанол/вода в соотношении 96:4. Твердые вещества сушили на воздухе с получением 0,628 г диастереомерной соли.

0,628 г диастереомерной соли суспендировали в 50 мл воды, затем добавляли 50 мл метиленхлорида. рН смеси доводили до приблизительно 9, используя насыщенный бикарбонат натрия с последующим добавлением 1,0 и гидроксида натрия. По завершении достижения уровня рН, слои разделяли и слой метиленхлорида фильтровали через фильтровальную бумагу \¥Ьа1:тап#2. Растворители затем удаляли выпариванием при пониженном давлении с получением масла светло-желтого цвета. Вес не определяли. Оценку масла проводили аналитическим анализом: 90,5% желаемого энантиомера, определенного при нормализованной площади пика (процент).

Пример 6. 3 - {(3 К,4К)-4 -Метил-3 - [метил-(7Н-пирро ло [2,3 -ά] пиримидин-4-ил)амино] пиперидин-1 ил} -3-оксопропионитрил.

Способ А. (ЗК,4К)-(1-Бензил-4-метилпиперидин-3-ил)метил-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)амин.

4-хлорпирроло[2,3-й]пиримидин (5,37 г, 34,9 ммоль), полученный способом Оауо11, 1. Ат. Сйет. 8ос., 82, 131 (1960), который введен в данное описание посредством ссылки в полном объеме, продукт примера 2 (6 г, 27,5 ммоль) и карбонат калия (11,4 г, 82,5 ммоль) соединяли в воде (60 мл). Суспензию нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 90 ч. Смесь охлаждали до 90°С и добавляли толуол (60 мл). Двухфазную смесь фильтровали при помощи фильтра и слои разделяли. Водный слой экстрагировали толуолом. Объединенные толуоловые слои промывали 1н №ОН. обрабатывали активированным углем и фильтровали с помощью фильтра. Толуол выпаривали в вакууме, и остаток кристаллизовали из смеси изопропилацетата и гексанов 1:1с получением 5 г не совсем белого твердого вещества; выход 54%. БКМ8: 336,1 (М+1).

Способ В. Метил-((ЗК,4К)-4-метилпиперидин-3-ил)-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)амин.

К продукту способа А (0,7 г, 2,19 ммоль), растворенному в 15 мл этанола, добавляли 1,5 мл 2 и хлороводородной кислоты, и реакционную смесь дегазировали пропусканием через нее азота. К реакционной смеси затем добавляли 0,5 г 20% гидроксида палладия на угле (50% воды) (АМпсй) и полученную

- 8 007251 смесь встряхивали (Рагг-Бйакег) в атмосфере водорода при 50 фунт/кв.дюйм (345 кПа) и комнатной температуре в течение 2 дней. Отфильтрованную через целит реакционную смесь концентрировали досуха в вакууме, и остаток очищали флэш-хроматографией (силикагель; 5% метанол в дихлорметане), получая 0,48 г (90%) указанного в заголовке соединения. ЬКМБ: 246,1(М+1).

Способ С. 3-{(3К,4К)-4-Метил-3-[метил-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)амино]пиперидин-1ил}-3-оксопропионитрил.

К перемешиваемому раствору продукта способа В (1,0 г), растворенному в 30 мл этанола, добавляли 0,82 г 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира цианоуксусной кислоты, и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтровали через СеШе® и концентрировали в вакууме. Остаток повторно растворяли в дихлорметане, промывали насыщенным водным бикарбонатом натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали досуха в вакууме, получая 1,1 г (86%) указанного в заголовке соединения в виде желтой пены. ЬКМБ: 313 (М+1).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соединение 3-{(3В,4В)-4-метил-3-[метил-(7Н-пирроло[
2,
3-б]пиримидин-4-ил)амино] пиперидин-1ил}-3-оксопропионитрил или его фармацевтически приемлемая соль.
4^8) Евразийская патентная организация, ЕАПВ