DK173744B1 - Fremgangsmåde og reagenskombination til diagnose af mikroorganismer - Google Patents

Fremgangsmåde og reagenskombination til diagnose af mikroorganismer Download PDF

Info

Publication number
DK173744B1
DK173744B1 DK198302751A DK275183A DK173744B1 DK 173744 B1 DK173744 B1 DK 173744B1 DK 198302751 A DK198302751 A DK 198302751A DK 275183 A DK275183 A DK 275183A DK 173744 B1 DK173744 B1 DK 173744B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
nucleic acid
fragment
sample
reagent
microorganisms
Prior art date
Application number
DK198302751A
Other languages
English (en)
Other versions
DK275183A (da
DK275183D0 (da
Inventor
Hans Erik Soederlund
Ranki Tuula Marjut
Original Assignee
Sangtec Medical Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangtec Medical Ab filed Critical Sangtec Medical Ab
Publication of DK275183A publication Critical patent/DK275183A/da
Publication of DK275183D0 publication Critical patent/DK275183D0/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173744B1 publication Critical patent/DK173744B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/823—Immunogenic carrier or carrier per se

Description

i DK 173744 B1
Den foreliggende opfindelse angår en mikrobiel diagnostisk fremgangsmåde, til samtidig identificering afen eller flere mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper, baseret på sandwich-hybridisering af nucleinsyrer på en fast bærer. Opfindelsen angår endvidere en serie af reagenskombinationer, der anven-5 des i fremgangsmåden.
Ved traditionel mikrobiel diagnose vises tilstedeværelsen af en mikroorganisme i en given prøve ved isolering af den pågældende mikroorganisme.
Efter berigende dyrkning identificeres mikroorganismen enten på basis af 10 sine biokemiske egenskaber eller ved anvendelse af immunologiske metoder. Denne type diagnose kræver, at mikroorganismen i prøven er levedygtig. Identificering ved isolering er endvidere en besværlig metode, som i tilfælde af vira kan kræve 4-6 uger.
15 Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en diagnostisk fremgangsmåde, i hvilken tilstedeværelsen af en mikroorganisme i en prøve vises ved identificering af dens genetiske materiale, nucleinsyren, ved hjælp af den følsomme og specifikke nucleinsyrehybridiseringsteknik. Nucleinsyre-hybridisering er i sig selv en gammel og velkendt fremgangsmåde til under-2 o søgelse af identiteten af nucleinsyrer. Komplementære nucleinsyrestrenge har evnen til at danne en tæt dobbeltstrenget struktur efter reglerne for baseparring, og det resulterende hybrid kan skilles fra den resterende enkeltstrengede nucleinsyre.
25 Nogle metoder, som er baseret på identifikationen af nucleinsyre(r) er allerede blevet anvendt til mikrobiel diagnose. Enterotoxigene Escherichia coli er blevet identificeret fra faeces-prøver ved kolonihybridisering under anvendelse af genet for toxinproduktion som probe. Positiv hybridisering er vist ved autoradiografi (Moseley, S.L. et al., J. Infect. Dis. (1980) 142. 892-898). Ko-30 lonihybridisering er baseret på den metode, der oprindeligt er udviklet af Grunstein og Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1975) 72, 3961-3965). Hybridisering er også blevet anvendt som en metode til at skelne mellem Herpes simplex virus type 1 og type 2 (Brautigam, A.R. et al., J. Clin.
Microbiol (1980) 12, 226-234), imidlertid ikke i hurtig diagnose, men ved 2 DK 173744 B1 typebestemmelse af viruset efter berigelsesdyrkning. Ved denne metode skilles det dobbeltstrengede hybrid fra fraktionen af nucleinsyrer, der bliver tilbage enkeltstrenget i opløsningen, ved affinitetschromatografi.
5 Det er for nylig blevet offentliggjort, at DNA fra celler inficeret med
Epstein-Barr virus (prøven) efter passende forbehandling blev fikseret direkte på filtrene. Den pågældende nucleinsyre identificeres ved hybridisering af filtrene med den radioaktive probe, og positiv hybridisering detekteres ved autoradiografi (Brandsma, I. og Miller, K. (1980) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 10 77,6851-6855).
En lignende metode som den førnævnte er beskrevet i tysk patentbeskrivelse nr. 2 950 295 og i Lancet, 10. oktober 1982, pp 765-767.1 den tyske patentbeskrivelse omhandles en metode til fremstilling af en radioaktivt mærket 15 DNA-probe ved hjælp af rekombinations-DNA-teknik. Denne DNA-probe er fremstillet ud fra hepatitis B virus. I Lancet-artiklen beskrives anvendelsen af denne probe i en fremgangsmåde til detektering af hepatitis B virus. I denne fremgangsmåde overføres DNA fra prøven til et nitrocellulosefilter, og det fikserede hepatitis DNA fra prøven detekteres ved anvendelse af proben som 20 et reagens.
Fordi der anvendes to reagenser, er fremgangsmåden ifølge opfindelsen mere specifik end den i det foregående beskrevne metode, og den muliggør konstruktion af forskellige prøvesæt, ved hjælp af hvilke forskellige mikro-2 5 organismer eller mikrobielle grupper kan detekteres fra samme prøve uden at forstyrre specificiteten for prøven for hver mikroorganisme eller mikrobiel gruppe, som er på tale. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes to forskellige nucleinsyrefragmentreagenser - det ene knyttet til en fast bærer, det andet mærket med et egnet mærke - og DNA-prøven er på væskeform.
30
Den heri beskrevne opfindelse er baseret på sandwich-hybridiseringsteknik-ken (Dunn, A.R. og Hassell, J A. (1977) Cell 12, 23-36), som forenkler håndteringen af prøven og detekteringen af hybridet. Af denne grund er teknikken særligt egnet til diagnostisk anvendelse.
DK 173744 B1 3
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne. Serien af reagenskombinationer er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 angivne.
5
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan alle de ønskede mikroorganismer eller mikrobielle grupper identificeres ud fra en og samme prøve, som indeholder denaturerede enkeltstrengede nucleinsyrestrenge af mikroorganismerne eller de mikrobielle grupper, der skal identificeres, uden at dele i o prøven. Fremgangsmåden kræver to nucleinsyrereagenser for hver mikroor ganisme eller gruppe af mikroorganismer, der skal identificeres. Reagenserne er to adskilte nucteinsyrefragmenter afledt fra genomet af den mikroorganisme, der skal identificeres, hvilke nucleinsyrer ikke har nogen sekvens fælles, men foretrukkent findes tæt ved hinanden i genomet. Reagenserne 15 kan fremstilles direkte ud fra de mikrobielle genomer eller ved anvendelse af velkendt rekombinant-DNA-teknik. Af de to nucleinsyrefragmenter er det ene knyttet til en fast bærer, fortrinsvis et nitrocellulosefilter, efter at være denatureret, og det andet er også på enkeltstrenget form mærket med et egnet mærke. Når disse nucleinsyrereagenser, to forskellige reagenser for hver 20 mikroorganisme eller mikrobiel gruppe, der skal identificeres, bringes i kontakt med de enkeltstrengede nucleinsyrer, der skal identificeres i prøven, bindes nucleinsyrerne til de komplementære nucleinsyrefragmenter på den faste bærer. De således på bæreren dannede hybrider bliver mærket efter binding til de mærkede komplementære nucleinsyrefragmenter. De mærkede 25 nucleinsyrefragmenter hybridiserer ikke alene til de nucleinsyrefragmenter, der er knyttet til bæreren, men kun til de tilsvarende enkeltstrengede nucleinsyrer stammende fra prøven. Således kan kun de bærere, til hvilke de komplementære nucleinsyrer fra prøven er blevet hybridiseret, blive mærket.
Disse bærere vaskes let, og mærket måles på i og for sig kendt måde.
30
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan i princippet anvendes til identificering af alle enten DNA- eller RNA-holdige organismer, såsom vira, bakterier, svampe og gærarter. Metoden har den specifikke fordel at tillade identificering af alle de bakterier og vira, der kan komme på tale på samme tid og fra 4 DK 173744 B1 samme prøve, uden hensyn til hvorvidt mikroorganismerne indeholder DNA eller RNA. Ved egnet kombination af reagenser er det muligt at udvikle prøvesæt, så hver mikroorganisme, der skal identificeres, har sin egen faste bærer udstyret med en etiket og mærket nucleinsyrereagens. Alle de i rea-5 genskombinationen indeholdte filtre kan sættes til prøven samtidig, sammen med de mærkede nucleinsyrereagenser. Når der har fundet hybridisering sted, vaskes de faste bærere, og deres mærkning måles. Den eneste bærer, der bliver mærket, er den, der indeholder sekvenser komplementære til det mikrobielle genom i den prøve, der undersøges.
10
Kombinationen af fremgangsmåde og reagenser kan f.eks. anvendes i medicinsk mikrobiologi, veterinær mikrobiologi, levnedsmiddelhygiejneundersø-gelser og mikrobiel diagnose for plantesygdomme. Egnede prøvematerialer er f.eks. alle animate og vegetabilske vævshomogenater, patientsekreter, 15 såsom blod, faeces og nasal og uteral slimhinde. Det menes, at fremgangsmåden er tilstrækkelig følsom til at detektere de mikroorganismemængder, der normalt findes i kliniske prøver. Preliminær berigelse af tilstedeværende mikroorganisme i prøven ved dyrkning er selvsagt mulig før identificerings-prøven, og i nogle tilfælde ville det være væsentligt. Metoden er også egnet 20 til undersøgelse af prøver, fra hvilke mikroorganismen ikke længere kan dyrkes, men som indeholder betragtelige mængder mikrobielle rester (f.eks. efter påbegyndelsen af antibiotisk behandling), eller når dyrkning af mikroorganismen er særlig besværlig og vanskelig (f.eks. anaerobe bakterier, som er til stede i stort antal i afsondringsprøver i tilfælde af infektioner forårsaget af 25 anaerobe organismer.
Fremgangsmåden kan tilpasses i form af følgende reagenskombinationer, prøvesæt, dele af hvilke selvsagt kan anvendes separat: 30 Respiratoriske infektioner: a) Bakterier: β-hæmolytiske streptococci (A-gruppe), Haemophilus influenzae, Pneumococci, Mycoplasma pneumoniae, mycobacteria 5 DK 173744 B1 b) Vira: Influenza A, influenza B, parainfluenza 1-3, respiratorisk syncytial virus, adenovira, corona vira, rhinovira 5 Diarré a) Bakterier: salmoneilae, shigellae, Yersinia enterocolitica, enterotoxigene E. coli, Clostridium difficile, campyiobakterier ίο b) Vira: rotavira, parvovira, adenovira, enterovira
Veneriske lidelser: a) Bakterier: Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, 15 Chlamydia trachomatis b) Vira: Herpex simplex virus c) Gærarter: Candida albicans 20 d) Protozoer: Trichomonas vaginalis Sepsis: 25 a) Bakterier: β-hæmolytiske streptococci (A-gruppe), pneumococci, enterobakterier som en enkelt gruppe
Levnedsmiddelhvaieine: 30 a) Bakterier: Salmonella og Clostridium perfringens
Afhængigt af valget af reagenser kan specificiteten af prøven begrænses til en defineret mikrobiel slægt (f.eks. Salmonella) eller til en hel mikrobiel 6 DK 173744 B1 gruppe f.eks. enterobacteriaceae ved at vælge identificerende reagenser fra området af et fælles gen.
Nucleinsyrereagenser, som kræves ved sandwich-hybridiseringsteknikken 5 som beskrevet i opfindelsen, fremstilles ved rekombinant-DNA-teknik. I det følgende er der beskrevet reagensfremstilling og prøveprocedurer for eksempel 1.
Reagenser 10
Adenovirus type 2 (stamme deponeret hos KTL, dvs. det nationale offentlige sundhedsinstitut i Helsinki) blev dyrket og renset, og DNA blev isoleret (Petterson, U. og Sambrook, J. (1973) J. Mol. Biol. 73, 125-130) (i det følgende betegnet Ad2-DNA). DNA blev fordøjet med BamHI-restriktionsenzym 15 (BRL, Bethesda Research Laboratories), der opdelte DNA i fire reproducerbare fragmenter. Af disse fire fragmenter blev to indsat på BamHI-stedet i vektorplasmidet pBR 322 (BRL) ved hjælp af T4-ligase (BRL). (Fragmenterne blev ikke adskilt før ligation, men den del, der blev sat til plasmidet, blev i hvert tilfælde identificeret udelukkende efter kloning). Derefter blev bakterie-20 værten (E. coli HB101 (K12) gal", pro"", leu", hrs-, hrm”, recA, str1’, F~) (opnået fra KTL) transformeret med plasmidet DNA sammensat af rekombi-nante plasmider, dvs. molekyler, der havde accepteret fragmenter af adeno-virus-DNA (Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69.
2110-2114). Blandt de transformerede bakteriekloner blev valgt sådanne, der 2 5 mest sandsynligt indeholdt det rekombinante plasmid. Ampicillin- og tetra-cyclin-resistensgener overføres til bakterien af pBR322-plasmidet (Bolivar F. et al. (1977) Gene 2, 95-113). Bakterier indeholdende det rekombinante plasmid er imidlertid følsomme for tetracyclin, fordi BamHI-restriktionsstedet er inden for tetracyclingenet, og den fremmede DNA, som indsættes i dette 30 område, ødelægger genet. Indsætningen af plasmidet blev karakteriseret efter plasmidberigelse ved detektering af størrelsen for restriktionsfragmenterne efter BamHI-fordøjning under anvendelse af agarose-gelelektroforese.
De nabostillede BamHI D- og C-fragmenter fra Ad2-DNA (jvf. genkort) blev valgt som reagenser (Soderlund, H. et al (1976) Cell 7, 585-593). De øn- 7 DK 173744 B1 skede rekombinantplasmider Ad2C-pBR322, KTL nr. E231 og Ad2D-pBR322, KTL nr. EH230, blev dyrket og renset som beskrevet i litteraturen (Clewell, D.B. og Helinski, D.R. (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166).
5 Rekombinant-plasmidet Ad2D-pBR322 blev anvendt som filterreagens. Det er ikke nødvendigt for den foreliggende opfindelse at fjerne plasmidsekven-serne, fordi prøven ikke indeholder pBR322-sekvenser. Til radioaktiv mærkning blev nucleinsyren imidlertid skilt fra pBR322-DNA efter BamHI-for-døjelse ved hjælp af agarose-gelelektroforese. C-fragmentet blev isoleret fra io LGT-agarose (Marine Colloids, Inc.) ved phenolekstraktion eller elektro- eluering (Wieslander, L. (1979) Anal. Biochem. 98, 305-309) og koncentreret ved ethanoludfældning.
Det er særlig formålstjenligt at subklone det nucleinsyrefragment, der er valgt 15 til mærkning, i en separat vektor for at undgå den hybridiseringsbaggrund, der er resultat af den direkte hybridisering med filteret af restplasmidsekven-serne, hvilket forurener det mærkede nucleinsyrereagens. Den enkeltstrengede DNA-fag M13 mp7 (BRL), hvortil DNA-fragmenter opnået ved BamHI-fordøjelse let kan overføres, kan anvendes som en optimal vektor 20 (Messing, J. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 309-323).
Tilknytning af DNA til filteret
Rekombinantplasmidet Ad2D-pBR322 blev denatureret til en enkeltstrenget 25 form og skåret i stykker tilfældigt flere steder ved behandling med 0,2 N
NaOH (5 min. 100 °C), hvorefter DNA blev afkølet og, umiddelbart før overføringen til filteret, neutraliseret og pipeteret til overføringsopløsningen, 4 x SSC medium på is (SSC = 0,15 M NaCI, 0,015 M natriumcitrat). Filtrene (Schleicher og Schull BA85 nitrocellulose) blev omhyggeligt vædet i 4 x 30 SSC-opløsning (ca. 2 timer) før påføringen af DNA. DNA knyttes til filteret i en fortyndet opløsning (0,5 -1,0 pg/ml) ved at suge opløsningen gennem filteret i et svagt vakuum. Filteret er i stand til at absorbere DNA op til ca.
180 pg/cm2 (Kafatos, F.C. et al. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552).
Der har været anvendt DNA-koncentrationer på mellem 0,5 pg DNA/2,5 cm 8 DK 173744 B1 filterdiameter og 1,0 pg DNA/0,7 cm filterdiameter. Efter DNA-filtrering blev filtrene vasket med 4 x SSC, tørret ved stuetemperatur og endelig behandlet i en vakuumovn ved 80 °C i 2 timer, hvorefter DNA på filtrene forbliver stabilt, og filtrene kan opbevares i lange perioder ved stuetemperatur (Southern, 5 E.M. (1975) J. Mol. Biol. £8, 503-517).
Mærkning af det radioaktive nucleinsvrefraament
Det radioaktive mærke, der blev anvendt, var 125l-isotopen. Denne isotop kan 1 o detekteres under anvendelse af γ-tællere, som er tilgængelige i de fleste store laboratorieenheder. Halveringstiden for isotopen er 60 dage, af hvilken grund anvendelsestiden for 125l-mærkede reagenser er ca. 4 måneder.
Mærkning ved "afskærinastranslation" 15
Princippet ved denne fremgangsmåde er at erstatte et af nucleotiderne i nucleinsyren med et radioaktivt nucleotid, hvorpå hele DNA-molekylet bliver mærket. Dette udføres efter den metode, der er offentliggjort af Rigby, P.W.J. et al. (J. Mol. Biol. (1977) 113. 237-251). I reaktionen bliver DNA radioaktivt 2 0 mærket, når opløsningen indeholder 125l-mærket deoxynucleocidtriphosphat som substrat, i dette tilfælde 125l-dCTP (Radiochemical Centre, Amersham: >1500 Ci/mmol). Under optimale betingelser kan der opnås en specifik aktivitet på 109 cpm/pg DNA. Det mærkede DNA renses fra nucleotider, der bliver tilbage i reaktionsblandingen, ved simpel gelfiltrering, f.eks. under 2 5 anvendelse af BioGel P30 (BioRad).
Andre mærkninasmetoder
Det enkeltstrengede nucleinsyrereagens, der fremstilles i M13 mp7-fag mær-30 kes ved kemisk iodisering, ved hvilken der tilsættes reaktiv 125l kovalent til nucleinsyren (Commenford, S.L. (1971) Biochemistry 10,1993-2000, Orosz, J.M. og Wetmur, J.G. (1974) Biochemistry 13, 54675473). Alternativt kan nucleinsyren gøres radioaktiv ved endemærkning med radioaktive nucleoti- 9 DK 173744 B1 derved den terminale transferase (Roychoudhury, R. og Wu, R. (1980) Meth. Enzymol. 65, 43-62).
Den i det foregående beskrevne reagensfremstilling angår mikroorganismer, 5 af hvilke det genetiske materiale er i form af DNA. I tilfælde med RNA-vira finder kloningen af genomfragmenter sted på en sådan måde, at der fremstilles en første DNA-kopi (cDNA) af virus-RNA ved hjælp af omvendt transkriptase efterfulgt af DNA-polymerase til kopiering af den anden DNA-streng, hvorefter DNA klones som beskrevet i det foregående (Salser, lo W, (1979) i Genetic Engineering, Ed. A.M. Chakrabarty, CRC Press, pp.
53-81).
Den mest egnede kloningsmetode vælges afhængigt af den anvendte mikroorganisme. Værterne såvel som vektorerne kan variere. Muligheder omfatter 15 λ-faqe som vektor, andre plasmider, cosmider, kloning, f.eks. i Bacillus subtilis bakterier, etc. (Recombinant DNA, Benchmarck Papers i Microbiology, bind 15, udg. K.J. Denniston og L.W. Enqvist, Dowden, Hutchinson og Ross,
Inc. (1981); Ish-Horowlcz, D. og Burke, J.F. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2989-2998).
20
Udførelse af prøven Prøvebehandling.
25 Den mikrobielle nucleinsyre, der skal bestemmes, må frigøres fra mikroorganismen som sådan og også fra de inficerede celler, hvorefter den må denatureres til den enkeltstrengede form. Virusgenomer kan frigøres ved behandling af prøvematerialet med 1 %'s natriumdodecylsulfat (SDS) og ødelæggelse af de proteiner, der beskytter genomet, ved proteinase K-behandling (1 30 mg/ ml, 37 °C, 60 min.). Bakterieprøver må desuden nedbrydes under anvendelse af lysozym- og EDTA-behandling.
10 DK 173744 B1
Hvis prøven indeholder store mængder viskos højmolekylær cellulær-DNA, må dette deles ved nogle få steder for at nedsætte dets viskositet, f.eks. ved lydbehandling eller ved passage af prøve nogle få gange gennem en fin nål.
5 Hybridisering.
Hybridisering finder sted f.eks. i 50%'s formamid (afioniseret, opbevaret ved -20 °C), i 4 x SSC Denhardt-opløsning (Denhardt, D.T. (1966) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 23,641-646) indeholdende 1% SDS og 0,5 mg/ml l o DNA (laksesædvæske eller kalvethymus) ved 37 °C og sædvanligvis natten over i 16 - 20 timer. De til forsøget valgte filtre inkuberes i en egnet beholder, hvortil hybridiseringsblandingen sættes, og hybridiseringen startes. Hybridi-seringsblandingen indeholder (a) den forbehandlede prøve, hvortil der sættes et eller flere radioaktive nucleinsyrereagenser, der er blevet denatureret 15 sammen ved kogning i 5 minutter efterfulgt af hurtig afkøling ved 0 °C, (b) koncentreret formamid-, SSC og Denhardt-opløsninger, som pipeteres til den denaturerede og afkølede nucleinsyreblanding (a). Efter blanding pipetteres hybridiseringsblandingen til filtrene i hybridiseringsbeholderen. Efter hybridisering vaskes filtrene omhyggeligt og tælles individuelt i y-tælleren.
20
Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.
EKSEMPEL 1 25 Detektering af adenovirus ved sandwich-hybridiseringsmetoden (tabel 1).
Detaljerne i forsøget fremgår af teksten til tabel 1.
Sandwich-hybridiseringsmetoden kan detektere virus-DNA fra en opløsning, men det virale genom kan lige så godt detekteres fra inficerede celler.
30
Hybridiseringsbaggrunden måles i et rør kun indeholdende filteret og det mærkede nucleinsyrereagens, uden prøven. Baggrunden forårsages af pBR322-sekvenserne, der forekommer i det mærkede nucleinsyrereagens.
Disse sekvenser hybridiserer direkte med filteret, uden at prøven deltager.
11 DK 173744 B1
Filtrene indeholdende kalvethymus og uden DNA anvendes i prøven som kontroller, hvilket indikerer på den ene side specificiteten for hybridisering og på den anden side størrelsen af den ikke-specifikke baggrund, der dannes f.eks. fra utilstrækkelig vask.
5 I de efterfølgende tabeller er baggrunden på grund af reagenserne subtraheret fra cpm-værdierne hybridiseret til filtrene.
TABEL 1 10
Adenovirustest __Filtre (cmp) _
Prøve__Adenol) Kalvethymus 2) Blank 3)
Adenovirus type 2-DNA 9000 49 (BRL) (500 ng)____
HeLa-celler (6 x 105) 8200 inficeret med adenovirus____
Filtre: 15 1) Ad2D-pBR322-plasmid, 2 pg 2) Kalvethymus DNA 1 pg (Boehringer Mannheim) 3) Blank (intet DNA) 20 Mærket nucleinsvrereaaens:
Ad2-BamHl C-fragment, renset, specifik aktivitet 90 x 106 cpm/pg (200 000 cpm ,2Sl/reaktion) 12 DK 173744 B1
Hvbridiserina:
50% formamid, 4 x SSC
Denhardt-opløsning indeholdende 0,5 mg/ml laksesperma-DNA og 1 % SDS, 5 37 °C, 16 timer.
Vask: 0,1% SSC, stuetemperatur, 40 minutter.
10
Prøver:
Adenovirus type 2 DNA (BRL) 15 Infektion med type 2 adenovirus fandt sted i HeLa-celler. Cellerne blev derpå revet fra hinanden ved behandling med 1% SDS, efterfulgt af fordøjelse med 1 mg/ml proteinase-K-enzym (Sigma) i 30 min. ved 37 °C. Før denaturering blev prøven passeret gennem en fin nål. De værdier, der fremgår af tabellen, er blevet korrigeret ved subtraktion af reagensbaggrunden opnået ved ud-20 øvelse af en tilsvarende hybridisering, men uden prøve.
EKSEMPEL 2
Detektering af et RNA-virus ved hjælp af sandwich-hybridisering (tabel 2).
25
Det model RNA-virus, der blev anvendt, var Semliki Forest virus (prototype stamme, opnået fra London School af Hygiene and Tropical Medicine), hvoraf genomet er enkeltstrenget RNA. Under anvendelse af virusgenomet som skabelon blev cDNA fremstillet, og det blev klonet ind i Pstl-stedet i 30 pBR322-plasmid som beskrevet af Garoff et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) USA 77, 63766380). Det rekombinante plasmid, der var opnået på denne måde, er pKTH312 KTL No. EH 232. Indsættelsen af dette plasmid stammende fra virusgenomet er ca. 1400 nucleotider langt og fra det strukturelle proteinområde, tilnærmelsesvis fra nucleotid 200 til nucleotid 1600, når 13 DK 173744 B1 nummereringen startes fra begyndelsen af de strukturelle gener (Garoff, H. et al. 1980). Til reagensfremstillingen blev hele det rekomblnante plasmid pKTH312 lineariseret med EcoRi-restriktionsenzym (BRL) (sekvensen stammende fra Semliki Forest virus indeholder ikke genkendelsessteder for 5 EcoRI-enzymet), og det lineære plasmid blev skåret i to fragmenter under anvendelse af Xhol-enzym (BRL). Restriktionsstedet i sidstnævnte blev lokaliseret med Semliki Forest virus sekvensen. Det største EcoRI-Xhol-fragment A (ca. 3900 basepar) blev knyttet til filteret, og det mindre fragment B (ca.
1850 basepar) blev mærket med 125l under anvendelse af afskæringstransla-l o tionsteknikken.
Både frit Semliki Forest virus og virus-inficerede celler blev anvendt som prøver i dette forsøg. I begge tilfælde var de virus-specifikke nucleinsyrer i prøven sammensat af RNA helt igennem.
15 TABEL 2
Detektering af Semliki Forest virus ved hjælp af sandwich-hybridiseringsmetoden.
20 __ __Filtre (cmp) _
Prøve Semliki Forest Kalvethymus 2) Blank 3) ___virus 1)___
Semliki Forest virus 30 pg__3340__-__33
Celler inficeret med Semliki 2698 8 10
Forest virus (5 x 105)____
Ikke-inficerede celler__10__5__8
Filtre: 1) EcoRI-Xhol-fragment A (1,2 pg) af pKTH312-plasmidet 25 2) Kalvethymus DNA1 pg 3) Blank (intet DNA) Mærkede nucleinsvrereaoenser: 14 DK 173744 B1 ECORI-Xhol-fragment B af plasmidet pKTH312, specifik aktivitet 90 x 106 cpm/pg DNA (200 000 cpm 125l/reaktion).
5
Hvbridiserinq:
Som beskrevet i tabel 1.
10 Vask:
Som beskrevet i tabel 1.
Prøver: 15
Semliki Forest virus (30 pg) blev revet fra hinanden med SDS før prøven. De inficerede celler blev håndteret som beskrevet i tabel 1. Infektionen med Semliki Forest virus blev udført i BHK-21 celler.
20 De i tabellen givne værdier er blevet korrigeret for reagensbaggrund opnået fra en lignende hybridisering uden prøve.
EKSEMPEL 3 25 En virusprøve, hvori den virale messenger-RNA detekteres ved hjælp af sandwich-hybridiseringsmetoden (tabel 3).
Sandwich-hybridiseringsreagenserne blev fremstillet ud fra SV40-virus DNA (BRL) ved at skære DNA i to stykker under anvendelse af Pstl-enzym 3 o (Boehringer Mannheim) som beskrevet af Lebouiitz og Weissman (Curr.
Topics i Microbiol. Immunol. 87, 42-172), og fragmenterne blev isoleret og renset ved agarose-gelelektroforese. Fragment A (4000 basepar) blev radioaktivt mærket med ,25l ved afskæringstranslation, og fragment B (1220 basepar) blev knyttet til filteret.
15 DK 173744 B1 DNA-fragmenteme blev valgt således, at hvert fragment indeholdt områder kodende for både tidlige og sene budbringere. Fragment B indeholder således ca. 700 baser fra det strukturelle proteingen VPI og over 600 baser fra 5 genet for tidlige budbringere. Fordi DNA af SV40-virus i sig selv er en kovalent lukket ring, kan den ikke detekteres ved prøven før linearisering. Når derfor inficerede celler anvendes som prøven, er det muligt at afprøve, hvor godt metoden er tilpasselig til detektering af RNA-kopier af det virale genom.
Som det kan ses fra resultaterne i tabel 3, er prøven velegnet til afprøvning 10 for inficerede celler. Tabellen viser også, at de samme reagenser kan anvendes til at undersøge både viral DNA og mRNA fremstillet derfra.
TABEL 3 15 Detektering af SV40-virus ved sandwich-hybridiseringsteknikken.
__Filtre (cmp) _
Prøve__SV40 1) Kalvethymus 2) Blank 3)
Prøve 1____ SV40 viral DNA (50 ng) 20061 159 104 (linealiseret)____
Ingen prøve_ :_ -_
Prøve 2_ CV1-celler inficeret med 30814 294 580 SV40-virus 40 timer efter infektion (106 celler)____
Ikke-inficerede celler__-_ -_ -_
Filtre: 1) Det korteste fragment Pstl B (0,2 pg) af det cirkulære SV40-virus 2 o DNA fordøjes med Pstl-restrikstionsenzym 2) Kalvethymus DNA 1 pg 3) Blank (intet DNA) Mærket nucleinsvrereaaens: 16 DK 173744 B1
Det længste Pstl A-fragment af SV40-virus DNA, specifik aktivitet 28 x 106 cpm/pg DNA (200 000 cpm 125l/reaktion).
5
Hvbridiserina:
Som beskrevet i tabel I.
Hybridiseringstiden er 40 timer.
10
Vask:
Som beskrevet i tabel 1.
15 Prøver: SV40-virus DNA (BRL) blev lineariseret med EcoRI-restriktionsenzym (BRL).
CV1-celler (Biomedical Centre, Uppsala University) blev inficeret med SV40-virus (opnået fra Janice Y. Chou og Robert G. Martini, NIH, Bethesda), 20 og cellerne blev høstet 40 timer efter infektion. Behandling af prøven var som beskrevet i tabel 1.
De i tabellen angivne værdier er blevet korrigeret for reagensbaggrund, opnået ved en tilsvarende hybridisering udført uden prøve.
25 EKSEMPEL 4
Detektering af Bacillus amyloliquefaciens ved sandwichhybridisering (tabel 4).
30
Reagenserne var fragmenter af α-amylasegenet af B. amyloliquefaciens E 18 (Technical Research Centre af Finland, VTT), som blev isoleret til brug i prøven fra det rekombinante plasmid pKTH10 (Palva, I. et al. (1981) Gene, 15. 43-51) ved behandling med restriktionsenzym og påfølgende aga- 17 DK 173744 B1 rose-gelelektroforese. De til dette forsøg anvendte fragmenter var Clal-EcoRl-fragmentområdet af a-amylasegenet (460 basepar) (Clal Boehringer Mannheim) og ECORl-BamHI-fragmentet (1500 basepar). EcoRI-BamHIfragmentet blev knyttet til filteret, og Clal-EcoRI-fragmentet blev 5 radioaktivt mærket med 125l ved afskæringstranslation.
Som det kan ses fra tabel 4 kunne B. amyloliquefaciens i prøven identificeres ved sandwich-hybridisering på basis af det enkle α-amylasegen. E. coli gav et negativt resultat i denne prøve (kunne ikke skelnes fra baggrunden).
10 TABEL 4
Bakteriediagnose ved sandwich-hydridisering __Filtre (cpm)___
Prøve__a-amylase1) Kalvethymus 2) Blank 3) pKTH 10-plasmid-DNA 5773 47 (lineariseret) 1 pg____
Ingen prøve__-__ -__- E. coli HB101 (109)__-__-__-
Bacillus amyloliquefaciens 3377 (3 x 109)____
Bacillus amyloliquefaciens 2871 (109)_I_I_I_ 15
Filtre: 1) EcoRI-BamHI-fragmentet fra α-amylasegenet fra plasmid pKTHIO, 0,35 pg 2) Kalvethymus 20 3) Blank (intet DNA) Mærket nucleinsvrereaaens: 18 DK 173744 B1
Clal-EcoRI-fragmentet af α-amy i asegenet fra plasmid pKTHIO, specifik aktivitet 35 x 106 cprn/pg (200 000 cpm 125l-reaktion).
5
Hvbridiserina:
Som beskrevet i tabel 1.
10 Vask:
Som beskrevet i tabel 1.
Prøver: 15
Bakterieprøver blev behandlet med lysozym (67 pg/ml) i 30 minutter ved 37 °C, 5 mM EDTA blev endvidere sat til E. coli prøver. Efter behandlingen blev SDS sat til alle prøver (slutkoncentration 2%), hvilke prøver derpå blev passeret to gange gennem en fin nål til reduktion af deres viskositet før de-20 naturering ved kogning som beskrevet i teksten vedrørende håndtering af prøverne.
De værdier, der fremgår af tabellen, er blev korrigeret for reagensbaggrund, opnået fra en tilsvarende hybridisering uden prøve.
25 EKSEMPEL 5
Et eksempel på en reagenskombination i form af et sæt baseret på sandwich-hybridiseringsmetoden (tabel 5).
30
De i dette forsøg undersøgte prøver var celler inficeret med tre vira (adenovirus, SV40 virus og Herpes simplex virus) og en prøve indeholdende Bacillus amyloliquefaciens bakterier. Følgende reagenser blev alle samtidig sat til hver prøve, 5 filtre, hver indeholdende en type DNA fra SV40 virus, adeno- 19 DK 173744 B1 virus, Bacillus amyloliquefaciens α-amylasegen og kalvethymus såvel som et filter uden noget DNA-indhold overhovedet; desuden 200 000 cpm af hvert af følgende mærkede nucleinsyrereagenser: SV40 virus-, adenovirus- og a-amyiasegen-DNA-reagens.
5
Eksemplet viser, at det er muligt uden deling eller fortynding af prøven samtidig at undersøge for en passende række mikroorganismer ved at sætte reagenskombinationen til prøven. Prøven kan indeholde både viral og bakteriel nucleinsyre. Filtrene kan genkendes ved et tegn (= mærke, etiketter), som io identificerer den sekvens, det indeholder, og som angiver, hvilken mikroorganisme, der var knyttet til/hybridiseret til det. Tegnene kan være tal eller bogstaver, f.eks. 1 eller SV40 2 eller Ad etc. eller andre tegn som * for SV40 eller Δ for AD eller o for Bacillus.
15
Et sæt baseret på filter-hybridiseringsteknikken.
20 DK 173744 B1 TABEL 5 ___ Filtre (cpm)__
Prøve SV40 Adeno a-amylase Kalvethymus Blank __1) 2)__3)__4)__5)
Celler 18390 2 13 22 31 inficeret med SV40 virus (106)________
Celler - 8750 5 13 inficeret med adenovirus type 2 (6 x 105)_______
Celler ... 5 13 inficeret med Herpes simplex virus (10e)_________
Bacillus 15 8 6500 16 5 amyloli- quefaciens (109)______
Ikke-infice- - - rede celler ______ 5
Filtre: 1) Som i tabel 3 2) Som i tabel 1 3) Som i tabel 4 10 4) Kalvethymus DNA, 1 pg 5) Blank (intet DNA) Mærkede nucleinsvrereaaenser: 21 DK 173744 B1 S40 virus som i tabel 3 5 Adenovirus som i tabel 1 α-amylasegen som i tabel 4
Hvbridiserino: 10 Som i tabell
Vask:
Som i tabel 1 15
Prøver:
Celleprøver inficeret med SV40 virus og adenovirus er blevet beskrevet i tabel 3 og ! 20 106 Veroceller blev inficeret med Herpex simplex virus type ! Cellerne blev høstet 20 timer efter infektion, da cytopatisk virkning kunne observeres. Prøven blev behandlet som beskrevet for adenovirus-inficerede celler (tabel 1).
25 Bacillus amvloliauefaciens prøve:
Som i tabel 4 Værdierne i tabellen er korrigeret for reagensbaggrund, opnået ved at udføre 30 en lignende hybridisering uden prøve.
Detektering af Escherichia coli ved sandwich-hybridisering (tabe! 6).
22 DK 173744 B1 EKSEMPEL 6 5 Reagenserne blev fremstillet ud fra ompA-gen (outer membrane protein A-gene, ydre membran-protein-A-gen) af Escherichia coli.
Hybridplasmideme pKTH40 og pKTH45, der blev anvendt som udgangsmateriale, blev fremstillet ud fra pTU100-plasmidet beskrevet af Henning et al.
10 (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4360-4364.
Plasmidet pKTH45 (deponeret hos KTL, dvs. National Public Health Institute, Helsinki nr. EH254), anvendt som et filterreagens, var sammensat af 740 basepar fra 5'-terminalenden af ompA-genet indsat i pBR322-plasmidet.
15
Plasmidet pKTH40 indeholder 300 basepar fra 3'-terminalenden af ompA-genet og de umiddelbart følgende 1700 basepar fra genomet af E. coli. pKTH40-plasmidet blev spaltet med BamHI-restriktionsenzymet til modtagelse af DNA-fragmentet af E. coli, som indeholder de 1700 basepar nævnt 20 i det foregående. Dette fragment blev overført til den enkeltstrengede bakte-riofag M13mp7 ifølge de metoder, der er beskrevet af Messing et al. (1981),
Nucl. Acids Res. 9, 309-321, Heidecker et al. (1980), Gene 10, 69-73,
Gardner et al. (1981), Nucl. Acids Res. 9, 2871-2888. Kombinationsfagen mKTH1207 (deponeret hos KTL som nr. EH256) blev mærket med 125l-isotop 25 som beskrevet i det foregående under den generelle gennemgang af mærkningsmetoder og blev anvendt som probe i sandwich-hybridiseringsmetoden.
DNA fra afbrudte E. coli celler såvel som isoleret, renset DNA fra E. coli kan detekteres ved sandwichhybridisering som vist i tabel 6.
30
Detektering af Escherichia coli ved sandwich-hybridisering.
DK 173744 B1 23 TABEL 6 ___Filtre (cpm) _
Prøve__ompA1) Kalvethymus 2) _Blank 3) E. coli K12 HB101 DNA 282 a) 2 x 107_____ E. coli K12 HB101 DNA 2206 a) 2x108____ E. coli K12 HB101 celler 1113 b) 2 x 107____ E. coli K12 HB101 celler 2327 12 5 b) 2 x 10e____ 5 a) antal DNA-molekyler b) antal celler
Filtre: 10 1) pKTH45-plasmid 1,088 pg (2 x 1011 molekyler) 2) Kalvethymus-DNA 1,088 pg 3) Blank (intet DNA) 15 Mærkede nucleinsvrereaaenser: mKTH1207, specifik aktivitet 8 x 107 cpm/pg DNA (200 000 cpm/reaktion) Hvbridiserino: 4 x SCC, 1 x Denhardt-opløsning uden BSA (bovinserumaibumin), 0,25% SDS, 200 pg/ml sildesædvæske-DNA, 17,5 timer, +65 °C.
20 24 DK 173744 B1
Vask:
Som beskrevet i tabel 1.
5 Prøver: E. coll K12 HB101-DNA blev isoleret efter Marmur-metoden beskrevet af Marmur (1961) J. Mol. Biol. 3, 208-218. DNA blev denatureret ved 7 mM NaOH, +100 °C, 5 min.
10
Cellerne blev behandlet med lysozym (500 pg/ml), EDTA (70 mM +37 °C, 30 min.), SDS (0,25%, +65 °C), og den Frie DNA blev denatureret ved kogning ved 14 mM NaOH, +100 °C, 5 min.).
15 Værdierne angivet i tabellen er blevet korrigeret for reagensbaggrund opnået fra en lignende hybridisering uden prøve.

Claims (8)

25 DK 173744 B1
1. Mikrobiel diagnostisk fremgangsmåde, baseret på sandwich-hybridisering af nukleinsyrer på en fast bærer, til samtidig identificering af en eller flere 5 mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper, i hvilken fremgangsmåde der anvendes to forskellige nukleinsyrereagenser, hvoraf det ene består af et enkeltstrenget nukleinsyrefragment knyttet til den faste bærer, og det andet består af et enkeltstrenget nukleinsyrefragment mærket med en passende substans, hvilken fremgangsmåde er kendetegnet ved, at en i o serie, som består af mindst to nukleinsyrereagenser for hver mikroorganisme og/eller mikrobiel gruppe, som skal påvises, hvor et af reagenserne er bundet til den faste bærer, og det andet er mærket med en i og for sig kendt substans, er bragt i kontakt med én eneste, udelt prøve, som indeholder nukleinsyrer fra de mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper, som skal påvises, 15 idet disse nukleinsyrer er gjort enkeltstrengede ved i og for sig kendte metoder, hvorved kun de af nukleinsyrerne i nukleinsyreblandingen fra prøven, som der anvendes tilsvarende nukleinsyrereagenser af, hybridiseres med de modsvarende identificerende nukleinsyrefragmenter, som er bundet til den faste bærer, og de hybrider, som derved er dannet og er bundet til den faste 20 bærer, bliver mærket ved hjælp af de modsvarende, mærkede nukleinsyrer, når disse binder sig til de nukleinsyrer, som stammer fra prøven og er fæstet til den faste bærer, og den faste bærers mærkning måles på i og for sig kendt måde.
2. Serie af reagenskombinationer for anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1,kendetegnet ved, at der til serien for hver mikroorganisme og/eller mikrobiel gruppe, som skal identificeres, hører mindst to nukleinsyrereagenser, idet to forskellige nukleinsyrefragmenter, som stammer fra mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper og er nødvendige for de 30 nævnte reagensers fremstilling, er fremstillet ud fra det mikrobielle genoms forskellige dele, men fragmenter, som formodentlig er beliggende nær hinanden, enten direkte fra det mikrobielle genom eller ved at gennemgå i og for sig kendt rekombinations-DNA-teknik, og disse nukleinsyrefragmenter, som er gruppe- eller artsspecifikke og specifikke for hver mikroorganisme, er gjort 26 DK 173744 B1 enkeltstrengede, og det ene fragment er fæstet til en fast bærer, og det andet er mærket med en substans.
3. Serie af reagenskombinationer ifølge krav 2, kendetegnet 5 ved, at den til identificering af adenovirus som nukleinsyrereagens bundet til den faste bærer omfatter adenovirus rekombinantplasmid Ad2DpBR322 og som mærket nukleinsyrereagens adenovirus Ad2BamHl C-fragment.
4. Serie af reagenskombinationer ifølge krav 2, kendetegnet 10 ved, at den til identificering af Semliki Forest-virus som nukleinsyrereagens bundet til den faste bærer omfatter pKTH312-plasmidets EcoRI-Xhol fragment A og som mærket nukleinsyrereagens pKTH312-plasmidets EcoRI-Xhol fragment B.
5. Serie af reagenskombinationer ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den til identificering af SV40-virus som nukleinsyrereagens bundet til den faste bærer omfatter SV40-virus Pst I B-fragment og som mærket nukleinsyrereagens SV40-virus Pstl A-fragment.
6. Serie af reagenskombinationer ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den til identificering af Bacillus amyloloquefaciens som nukleinsyrereagens bundet til den faste bærer omfatter a-amylasegenets EcoRI-BamHI-fragment i Bacillus amyloloquefaciens pKTHIO plasmid og som mærket nukleinsyrereagens α-amylasegenets Clal-EcoRI-fragment i Bacillus 25 amyloliquefaciens pKTH10 plasmid.
7. Serie af reagenskombinationer ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den til identificering af Escherichia coli som nukleinsyrereagens bundet til den faste bærer omfatter plasmidet pKTH45 og som mærket nuklein- 30 syrereagens rekombinantfagen mKTH1207.
8. Serie af reagenskombinationer ifølge krav 2, 3, 5 eller 6, kendetegnet ved, at den til identificering og påvisning af adenovirus, SV40-virus og Bacillus amyloliquefaciens fra samme prøve, hvilken prøve indehol- 27 DK 173744 B1 der nukleinsyrer, som stammer fra forskellige mikroorganismer, som nuklein-syrereagenser bundet til fast bærer omfatter adenovirus Ad2DpBR322 re-kombinantplasmid, SV40-virus Pstl B-fragment samt a-amylasegenets EcoRI-BamHI-fragment i Bacillus amyloloquefaciens pKTHIO plasmid samt 5 som mærkede nukleinsyrereagenser omfatter adenovirus Ad2BamHI C-frag-ment, SV40-virus Pstl A-fragment samt α-amylasegenets Clal-EcoRI-frag-ment i Bacillus amyloliquefactens pKTHIO plasmid.
DK198302751A 1981-10-16 1983-06-15 Fremgangsmåde og reagenskombination til diagnose af mikroorganismer DK173744B1 (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI813251A FI63596C (fi) 1981-10-16 1981-10-16 Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
FI813251 1981-10-16
PCT/FI1982/000038 WO1983001459A1 (en) 1981-10-16 1982-09-29 A method and reagent combination for the diagnosis of microorganisms by sandwich hybridization of nucleic acids
FI8200038 1982-09-29

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK275183A DK275183A (da) 1983-06-15
DK275183D0 DK275183D0 (da) 1983-06-15
DK173744B1 true DK173744B1 (da) 2001-09-03

Family

ID=8514776

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198302751A DK173744B1 (da) 1981-10-16 1983-06-15 Fremgangsmåde og reagenskombination til diagnose af mikroorganismer

Country Status (13)

Country Link
US (2) US4486539A (da)
EP (2) EP0098267A1 (da)
JP (2) JPS58501703A (da)
AT (1) ATE31735T1 (da)
AU (1) AU548854B2 (da)
CA (1) CA1192120A (da)
DE (2) DE79139T1 (da)
DK (1) DK173744B1 (da)
FI (1) FI63596C (da)
HU (1) HU196242B (da)
RO (1) RO86356B (da)
SU (1) SU1386031A3 (da)
WO (1) WO1983001459A1 (da)

Families Citing this family (340)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
US5288611A (en) * 1983-01-10 1994-02-22 Gen-Probe Incorporated Method for detecting, identifying, and quantitating organisms and viruses
US5723597A (en) * 1983-01-10 1998-03-03 Gen-Probe Incorporated Ribosomal nucleic acid probes for detecting organisms or groups of organisms
US5567587A (en) * 1983-01-10 1996-10-22 Gen-Probe Incorporated Method for detecting, the presence and amount of prokaryotic organisms using specific rRNA subsequences as probes
US4689295A (en) * 1983-01-20 1987-08-25 Integrated Genetics, Inc. Test for Salmonella
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US4948882A (en) * 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
EP0135587B2 (en) * 1983-02-22 2002-12-18 Syngene, Inc. Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis
IL71064A (en) * 1983-02-28 1989-10-31 Lifecodes Corp Paternity and forensic test involving analysis of dna polymorphic genetic regions
US5593832A (en) * 1983-02-28 1997-01-14 Lifecodes Corporation Method for forensic analysis
CA1228811A (en) 1983-05-05 1987-11-03 Robert G. Pergolizzi Assay method utilizing polynucleotide sequences
CA1222680A (en) * 1983-07-05 1987-06-09 Nanibhushan Dattagupta Testing dna samples for particular nucleotide sequences
US4959309A (en) * 1983-07-14 1990-09-25 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4737454A (en) * 1983-07-14 1988-04-12 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
CA1231303A (en) * 1983-08-05 1988-01-12 Robert J. Carrico Detection of bacteria by nucleic acid hybridization
US5539097A (en) * 1983-09-02 1996-07-23 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide polymeric support system
JPS6091999A (ja) * 1983-10-25 1985-05-23 Fujirebio Inc ポリヌクレオチドの測定方法
GB8331071D0 (en) * 1983-11-22 1983-12-29 Karayiannis P Assay for dna/rna
US4724202A (en) * 1983-12-12 1988-02-09 Molecular Diagnostics, Inc. Use of non-hybridizable nucleic acids for the detection of nucleic acid hybridization
IL73577A (en) * 1983-12-12 1989-10-31 Miles Lab Method and reagent system for detecting dna or rna sequences in a test medium containing single stranded dna or rna using antibodies to intercalation complexes with double stranded nucleic acid
US4777129A (en) * 1983-12-12 1988-10-11 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein
US4849208A (en) * 1984-01-30 1989-07-18 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
US4843122A (en) * 1984-01-30 1989-06-27 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
US4707440A (en) * 1984-01-30 1987-11-17 Enzo Biochem, Inc. Nucleic acid hybridization assay and detectable molecules useful in such assay
US4943523A (en) * 1984-01-30 1990-07-24 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
US5002885A (en) * 1984-01-30 1991-03-26 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method preparation and use
US4849505A (en) * 1984-01-30 1989-07-18 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
FI71768C (fi) * 1984-02-17 1987-02-09 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.
CA1223222A (en) * 1984-02-22 1987-06-23 Nanibhushan Dattagupta Immobilized nucleic acid-containing probes
DE3583640D1 (de) * 1984-04-05 1991-09-05 Florey Howard Inst Hybridisierungs-histochemie.
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US5288609A (en) * 1984-04-27 1994-02-22 Enzo Diagnostics, Inc. Capture sandwich hybridization method and composition
US6221581B1 (en) * 1984-04-27 2001-04-24 Enzo Diagnostics, Inc. Processes for detecting polynucleotides, determining genetic mutations or defects in genetic material, separating or isolating nucleic acid of interest from samples, and useful compositions of matter and multihybrid complex compositions
US4766064A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit
US4766062A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor
US4670380A (en) * 1984-05-23 1987-06-02 Molecular Diagnostics, Inc. Assays utilizing labeled nucleic acid probes
US5132206A (en) * 1984-06-11 1992-07-21 Dreyer William J Fluorescent pigments for tagging biological molecules
US4749647A (en) * 1984-06-22 1988-06-07 Genetic Systems Corporation Polymerization-induced separation assay using recognition pairs
FR2567541B1 (fr) * 1984-07-13 1987-02-06 Pasteur Institut Sonde d'adn et procede pour la detection de " shigelles " et des souches entero-invasives de escherichia coli
US4755458A (en) * 1984-08-30 1988-07-05 Enzo Biochem, Inc. Composition and method for the detection of the presence of a polynucleotide sequence of interest
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US5955261A (en) * 1984-09-04 1999-09-21 Gen-Probe Incorporated Method for detecting the presence of group-specific viral mRNA in a sample
US4775619A (en) * 1984-10-16 1988-10-04 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US5430136A (en) * 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4820630A (en) * 1984-11-23 1989-04-11 Digene Diagnostics, Incorporated Assay for nucleic acid sequences, particularly genetic lesions, using interactive labels
US4734363A (en) * 1984-11-27 1988-03-29 Molecular Diagnostics, Inc. Large scale production of DNA probes
US5242794A (en) * 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
GB2179448B (en) * 1984-12-19 1989-06-07 Blair Malcolm A D Improved sandwich hybridisation technique for the detection of nucleotide sequences
GB8432118D0 (en) * 1984-12-19 1985-01-30 Malcolm A D B Sandwich hybridisation technique
US4670379A (en) * 1984-12-19 1987-06-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide hydridization assays employing catalyzed luminescence
FI72146C (fi) * 1985-01-02 1987-04-13 Orion Yhtymae Oy Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror.
US4785086A (en) * 1985-01-17 1988-11-15 Integrated Genetics, Inc. Test for Campylobacter
US5851767A (en) * 1985-03-04 1998-12-22 The Regents Of The University Of California Detection of prokaryotic organism by DNA hybridization
US4792519A (en) * 1985-03-05 1988-12-20 International Technology Corporation Method for the monitoring and control of microbial populations
US5217866A (en) * 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5470974A (en) * 1985-03-15 1995-11-28 Neu-Gene Development Group Uncharged polynucleotide-binding polymers
US6197563B1 (en) 1985-03-28 2001-03-06 Roche Molecular Systems, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
US6040166A (en) 1985-03-28 2000-03-21 Roche Molecular Systems, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences, including a probe
EP0200113A3 (en) * 1985-04-30 1987-03-18 Pandex Laboratories, Inc. A method of solid phase nucleic acid hybridization assay incorporating a luminescent label
ES8707343A1 (es) * 1985-06-13 1987-07-16 Amgen Un metodo para aislar una secuencia de acido nucleico objetivo seleccionada
US4751177A (en) * 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
US5641630A (en) * 1985-06-13 1997-06-24 Amgen Inc. Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays
US5273882A (en) * 1985-06-13 1993-12-28 Amgen Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays
AU558846B2 (en) * 1985-06-21 1987-02-12 Miles Laboratories Inc. Solid-phase hydridization assay using anti-hybrid antibodies
US4831125A (en) * 1985-07-01 1989-05-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company DNA probe for corynebacterium kutscheri
US4824776A (en) * 1985-07-25 1989-04-25 Molecular Biosystems, Inc. Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays
US5155216A (en) * 1985-08-15 1992-10-13 Amoco Corporation Nucleic acids labeled with a chemiluminescent acridine ester
US4868104A (en) * 1985-09-06 1989-09-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Homogeneous assay for specific polynucleotides
US5595908A (en) * 1985-09-26 1997-01-21 University Of Southern Mississipi Piezoelectric device for detection of polynucleotide hybridization
EP0244471A4 (en) * 1985-10-24 1988-01-28 Siska Diagnostics Inc NUCLEIC ACID SAMPLES MARKED WITH LANTHANIDE CHELATE.
US5258283A (en) * 1985-11-05 1993-11-02 Battelle Memorial Institute Detection and differentiation of coxiella burnetii in biological fluids
US4876186A (en) * 1985-11-05 1989-10-24 Battelle Development Corporation Detection and differentiation of coxiella burnetii in biological fluids
JPS63502477A (ja) * 1985-12-03 1988-09-22 エル・ギユ−リイ・エム・ラフアツト 病気診断のための方法、装置および製品
US4910300A (en) * 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
JP3293820B2 (ja) * 1985-12-13 2002-06-17 エンゾ− バイオケム インコ−ポレイテツド 標的ポリヌクレオチドにハイブリツド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物
FI76119C (fi) * 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
US4968602A (en) * 1986-03-05 1990-11-06 Molecular Diagnostics, Inc. Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
US4925785A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5242823A (en) * 1986-03-07 1993-09-07 International Genetic Engineering, Inc. Cloning of the 38kd Mycoplasma hyorhinis regression-associated antigen
EP0250662B1 (en) * 1986-06-25 1994-08-24 The Regents Of The University Of California Detection of mycoplasma by DNA hybridization
JP2534529B2 (ja) * 1986-07-24 1996-09-18 ブリティシュ・テレコミュニケ−ションズ・パブリック・リミテッド・カンパニ 放射発生器
DE3785658T2 (de) * 1986-08-11 1993-08-12 Siska Diagnostics Inc Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden.
US5849478A (en) * 1986-08-14 1998-12-15 Cashman; Daniel P. Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit
US4917999A (en) * 1986-09-02 1990-04-17 Miles Inc. Oligonucleotide probes for detection of α-amylase genes
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
US7087742B1 (en) 1986-11-24 2006-08-08 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US6150517A (en) 1986-11-24 2000-11-21 Gen-Probe Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US7138516B1 (en) 1986-11-24 2006-11-21 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5541308A (en) * 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5994059A (en) * 1986-11-24 1999-11-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and methods for detecting Streptomyces enterococci
US4946786A (en) * 1987-01-14 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5266466A (en) * 1987-01-14 1993-11-30 President And Fellows Of Harvard College Method of using T7 DNA polymerase to label the 3' end of a DNA molecule
US4942130A (en) * 1987-01-14 1990-07-17 President & Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5145776A (en) * 1987-01-14 1992-09-08 President & Fellows Of Harvard College Method of using T7 DNA polymerase to mutagenize and fill-in DNA
US4994372A (en) * 1987-01-14 1991-02-19 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing
US4795699A (en) * 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5599667A (en) * 1987-03-02 1997-02-04 Gen-Probe Incorporated Polycationic supports and nucleic acid purification separation and hybridization
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
CA1317860C (en) * 1987-04-01 1993-05-18 Daniel Louis Kacian Techniques for preparing specimens for bacterial assays
US5225324A (en) * 1987-04-24 1993-07-06 Bioscience International, Inc. Diagnostics for mycobacteria in public health, medical, and veterinary practice
GB8709803D0 (en) * 1987-04-24 1987-05-28 Mcfadden J J Treatment of crohn's disease &c
US4994368A (en) 1987-07-23 1991-02-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
US5273879A (en) * 1987-07-23 1993-12-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
DE3851810T2 (de) * 1987-07-31 1995-02-09 Gen Probe Inc Polynukleotidentest unter Benutzung von Oligonukleotiden zur Eliminierung von unerwünschten Kreuzreaktionen.
US5089386A (en) * 1987-09-11 1992-02-18 Gene-Trak Systems Test for listeria
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
US5656731A (en) * 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
AU2714988A (en) * 1987-10-23 1989-06-01 Siska Diagnostics, Inc. Lanthanide chelate-tagged nucleic acid probes
US6013531A (en) * 1987-10-26 2000-01-11 Dade International Inc. Method to use fluorescent magnetic polymer particles as markers in an immunoassay
US6348332B1 (en) 1987-11-24 2002-02-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill DNA molecule encoding gonorrhoeal hybrid PIA/PIB protein
CA1340506C (en) * 1987-11-24 1999-04-20 Nicholas H. Carbonetti Production of gonorrheal pi proteins and vaccines
ATE133454T1 (de) * 1987-12-01 1996-02-15 Amoco Corp Nachweis von salmonella
US5354657A (en) * 1988-01-12 1994-10-11 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the highly specific detection of nucleic acids in solid
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US20050019760A1 (en) * 1988-03-05 2005-01-27 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
US7811751B2 (en) 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5024933A (en) * 1988-05-10 1991-06-18 Enzo Biochem, Inc. Method and kit for sample adherence to test substrate
ATE114726T1 (de) * 1988-05-10 1994-12-15 Du Pont Verfahren zum schnellen nachweis von nukleinsäuren.
US5294533A (en) * 1988-07-05 1994-03-15 Baylor College Of Medicine Antisense oligonucleotide antibiotics complementary to the macromolecular synthesis operon, methods of treating bacterial infections and methods for identification of bacteria
US5047523A (en) * 1988-08-02 1991-09-10 Ortho Diagnostic Systems Inc. Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
WO1990006372A1 (en) * 1988-12-01 1990-06-14 Microprobe Corporation Substrates for peroxidase assaying
US7172863B1 (en) 1988-12-09 2007-02-06 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
US5324829A (en) * 1988-12-16 1994-06-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties
CA2005927A1 (en) * 1988-12-21 1990-06-21 Chander Bahl Method of preparing nucleotide probes using a bridging complement
US5237016A (en) * 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US5514550A (en) * 1989-02-03 1996-05-07 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid
CA2009708A1 (en) * 1989-02-13 1990-08-13 Jane D. Madonna Nucleic acid probe for the detection of salmonella human pathogens
US5856092A (en) * 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
US5049489A (en) * 1989-04-17 1991-09-17 The Standard Oil Company 16S rRNA oligonucleotide probes for the identification of sulfate-reducing bacteria
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6955915B2 (en) * 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US6040138A (en) * 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US6919211B1 (en) * 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6379895B1 (en) 1989-06-07 2002-04-30 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US5925525A (en) * 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
EP0405592A3 (en) * 1989-06-30 1991-07-17 Sanyo Chemical Industries Ltd. A method for detection of nucleic acid and reagents for their detection
US5106730A (en) * 1989-07-24 1992-04-21 Microprobe Corporation Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
CA2028012A1 (en) * 1989-10-23 1991-04-24 Randall Dimond Hybridization assay for campylobacter rrna
GB8924989D0 (en) * 1989-11-06 1989-12-28 Scotgen Ltd Method and device for the detection of antibiotic resistance
JP2589618B2 (ja) * 1989-12-14 1997-03-12 デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド 磁気応答性螢光ポリマー粒子及びその利用
CA2032203C (en) * 1989-12-29 2009-05-19 Christine L. Brakel Amplification capture assay
US5721097A (en) * 1990-02-02 1998-02-24 N. V. Innogenetics S.A. Hybridization probes for the detection of branhamella catarrhalis strains
AU7188491A (en) * 1990-02-02 1991-08-21 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes for the detection of (branhamella catarrhalis) strains
US6013431A (en) * 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
US5200314A (en) * 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
AU7429591A (en) * 1990-04-18 1991-10-24 Gene-Trak Systems Nucleic acid probes for the detection of giardia lamblia
HUT64623A (en) * 1990-05-04 1994-01-28 Chiron Corp Protein and nucleinic acid samples and immunic essays containing them
US5670316A (en) * 1990-05-07 1997-09-23 Daikin Industries, Ltd. Diagnostic applications of double D-loop formation
US5232830A (en) * 1990-05-11 1993-08-03 Microprobe Corporation Intrinsic fluorescent quenching methods
US5695926A (en) * 1990-06-11 1997-12-09 Bio Merieux Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
WO1992001471A1 (en) * 1990-07-24 1992-02-06 The Uab Research Foundation Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins vaccines, antibodies, and transformed cells
US6730305B1 (en) 2000-05-08 2004-05-04 The Uab Research Foundation Nucleotide sequences encoding bovine respiratory syncytial virus immunogenic proteins
IL99025A0 (en) * 1990-08-15 1992-07-15 Astra Ab Novel process for the detection of pathogens using dna probes
WO1992008808A1 (en) * 1990-11-14 1992-05-29 Siska Diagnostics, Inc. Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
WO1992010588A1 (en) * 1990-12-06 1992-06-25 Affymax Technologies N.V. Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides
USH1398H (en) * 1990-12-28 1995-01-03 Campbell; James R. DNA-based fluourescent sensor
EP0497464A1 (en) * 1991-01-31 1992-08-05 Amoco Corporation Rapid microbial diagnostics by in situ hybridization in aqueous suspension
ES2108109T3 (es) * 1991-02-14 1997-12-16 Dade Microscan Inc Nuevos oligonucleotidos conjugados con quelatos de lantanidos.
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
EP0533952A4 (en) * 1991-04-15 1993-07-07 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Process for separating or extracting nucleic acid from specimen containing the same
US5556748A (en) * 1991-07-30 1996-09-17 Xenopore Corporation Methods of sandwich hybridization for the quantitative analysis of oligonucleotides
ATE161586T1 (de) 1991-10-11 1998-01-15 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung eines polynukleotids zum gebrauch in ''single-primer'' amplifizierung und phosphorothioat-enthaltende oligonukleotide als primer in nukleinsäureamplifizierung
US5612199A (en) * 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US6652808B1 (en) * 1991-11-07 2003-11-25 Nanotronics, Inc. Methods for the electronic assembly and fabrication of devices
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6017696A (en) 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US5849486A (en) 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US6048690A (en) * 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US5632957A (en) * 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US6569382B1 (en) 1991-11-07 2003-05-27 Nanogen, Inc. Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices
ES2049618B1 (es) * 1991-11-13 1994-11-01 Consejo Superior Investigacion Metodo de diagnostico y clasificacion de especies de trypanosoma cruzi.
WO1993020234A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company A rapid, high capacity nucleic acid based assay
US6100099A (en) 1994-09-06 2000-08-08 Abbott Laboratories Test strip having a diagonal array of capture spots
DE4212555A1 (de) * 1992-04-15 1993-10-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
US5543292A (en) * 1992-06-16 1996-08-06 Hitachi, Ltd. Process for the measurement of nucleic acids
DK0652973T3 (da) * 1992-07-31 1997-09-15 Behringwerke Ag Fremgangsmåde til indføring af definerede sekvenser ved 3-enden af polynukleotider
US7713528B1 (en) 1993-02-18 2010-05-11 Enzo Therapeutics, Inc. Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate
US6294323B1 (en) 1993-04-14 2001-09-25 Behringwerke Ag Self initiating single primer amplification of nucleic acids
EP0701629B1 (en) * 1993-05-28 2006-08-02 Mount Sinai School of Medicine of New York University Bc200 rna, probes therefor and use thereof
DE4344742A1 (de) * 1993-06-09 1994-12-15 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren
US5532122A (en) * 1993-10-12 1996-07-02 Biotraces, Inc. Quantitation of gamma and x-ray emitting isotopes
US5854084A (en) 1996-07-12 1998-12-29 Biotraces, Inc. Enhanced chromatography using multiphoton detection
US6225059B1 (en) 1993-11-01 2001-05-01 Nanogen, Inc. Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics
US7314708B1 (en) * 1998-08-04 2008-01-01 Nanogen, Inc. Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures
US6287517B1 (en) 1993-11-01 2001-09-11 Nanogen, Inc. Laminated assembly for active bioelectronic devices
US6309602B1 (en) 1993-11-01 2001-10-30 Nanogen, Inc. Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials
US6254827B1 (en) 1993-11-01 2001-07-03 Nanogen, Inc. Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6375899B1 (en) 1993-11-01 2002-04-23 Nanogen, Inc. Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system
US7172864B1 (en) 1993-11-01 2007-02-06 Nanogen Methods for electronically-controlled enzymatic reactions
US20040077074A1 (en) * 1993-11-01 2004-04-22 Nanogen, Inc. Multi-chambered analysis device
US6319472B1 (en) 1993-11-01 2001-11-20 Nanogen, Inc. System including functionally separated regions in electrophoretic system
US6331274B1 (en) 1993-11-01 2001-12-18 Nanogen, Inc. Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6726880B1 (en) 1993-11-01 2004-04-27 Nanogen, Inc. Electronic device for performing active biological operations and method of using same
US7582421B2 (en) * 1993-11-01 2009-09-01 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip
US7101661B1 (en) 1993-11-01 2006-09-05 Nanogen, Inc. Apparatus for active programmable matrix devices
US6638482B1 (en) 1993-11-01 2003-10-28 Nanogen, Inc. Reconfigurable detection and analysis apparatus and method
US6315953B1 (en) * 1993-11-01 2001-11-13 Nanogen, Inc. Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides
US6068818A (en) * 1993-11-01 2000-05-30 Nanogen, Inc. Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics
KR100230909B1 (ko) * 1993-11-29 1999-12-01 다니엘 엘. 캐시앙 광범위의 유기체로부터 핵산 추출 방법
DE69506393T2 (de) * 1994-04-04 1999-07-01 Ciba Corning Diagnostics Corp Hybridisation-ligitation-verfahren zum nachweis von spezifischen dns sequenzen
US7323298B1 (en) 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US7857957B2 (en) * 1994-07-07 2010-12-28 Gamida For Life B.V. Integrated portable biological detection system
US6379897B1 (en) * 2000-11-09 2002-04-30 Nanogen, Inc. Methods for gene expression monitoring on electronic microarrays
US6403367B1 (en) 1994-07-07 2002-06-11 Nanogen, Inc. Integrated portable biological detection system
US5545527A (en) * 1994-07-08 1996-08-13 Visible Genetics Inc. Method for testing for mutations in DNA from a patient sample
US8236493B2 (en) 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
CA2163393C (en) * 1994-11-30 2003-04-22 Colleen Marie Nycz Amplification and detection of mycobacteria nucleic acids
US5783387A (en) * 1995-02-06 1998-07-21 The Regents Of The University Of California Method for identifying and quantifying nucleic acid sequence aberrations
US5731153A (en) * 1996-08-26 1998-03-24 The Regents Of The University Of California Identification of random nucleic acid sequence aberrations using dual capture probes which hybridize to different chromosome regions
US5610023A (en) * 1995-03-31 1997-03-11 Lee Laboratories, Inc. Method of purification of clostridium difficile toxin A and production of mono-specific antibodies
US5783453A (en) * 1995-06-29 1998-07-21 Chiron Diagnostics Corporation Non-separation specific binding chemiluminescent assay
US5616465A (en) * 1995-08-09 1997-04-01 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes
US6027879A (en) * 1995-08-09 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe
US5770365A (en) * 1995-08-25 1998-06-23 Tm Technologies, Inc. Nucleic acid capture moieties
US20040086917A1 (en) * 1995-09-27 2004-05-06 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
WO1997035033A1 (en) 1996-03-19 1997-09-25 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
US5814490A (en) * 1996-06-11 1998-09-29 Becton, Dickinson And Company Amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acids
US5910410A (en) * 1996-09-06 1999-06-08 Hewlett-Packard Company Dual tag binding assay
US5853993A (en) * 1996-10-21 1998-12-29 Hewlett-Packard Company Signal enhancement method and kit
US6706473B1 (en) 1996-12-06 2004-03-16 Nanogen, Inc. Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides
EP2295988A2 (en) * 1996-12-31 2011-03-16 High Throughput Genomics, Inc. Multiplexed molecular analysis apparatus and its fabrication method
US6110678A (en) 1997-05-02 2000-08-29 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
DE19741715A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
CA2313483C (en) * 1997-12-12 2017-12-05 Digene Corporation Assessment of human papilloma virus-related disease
US20100105572A1 (en) * 1997-12-19 2010-04-29 Kris Richard M High throughput assay system
US20030096232A1 (en) 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
US6238869B1 (en) 1997-12-19 2001-05-29 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system
US20030039967A1 (en) * 1997-12-19 2003-02-27 Kris Richard M. High throughput assay system using mass spectrometry
US6232066B1 (en) 1997-12-19 2001-05-15 Neogen, Inc. High throughput assay system
US6458533B1 (en) 1997-12-19 2002-10-01 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system for monitoring ESTs
ES2322859T3 (es) 1998-05-01 2009-06-30 Gen-Probe Incorporated Analizador de diagnostico automatizado.
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
WO2000058472A2 (en) 1999-03-31 2000-10-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated dna encoding cullin regulators roc1 and roc2, isolated proteins encoded by the same, and methods utilizing the same
US6235479B1 (en) 1999-04-13 2001-05-22 Bio Merieux, Inc. Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample
US7101989B1 (en) 1999-07-09 2006-09-05 University Of North Carolina At Chapel Hill DsrA protein and polynucleotides encoding the same
FR2803913B1 (fr) * 2000-01-13 2002-08-16 Pasteur Sanofi Diagnostics Procede d'immobilisation de reactif(s) affin(s) sur phase solide hydrophobe
US20050214825A1 (en) * 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
US7582420B2 (en) * 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
AU2001238068A1 (en) * 2000-02-07 2001-08-14 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US8076063B2 (en) * 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
AU2001247328C1 (en) * 2000-03-08 2006-10-26 Datascope Investment Corp. Methods for assay and detection on a microarray
WO2001068916A1 (en) * 2000-03-16 2001-09-20 Bionex, Inc. Method for detecting mutation of nucleic acid
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US20040185464A1 (en) * 2000-09-15 2004-09-23 Kris Richard M. High throughput assay system
US20020169562A1 (en) * 2001-01-29 2002-11-14 Gregory Stephanopoulos Defining biological states and related genes, proteins and patterns
EP1481076A4 (en) 2001-07-12 2005-05-11 Illumina Inc MULTIPLEX NUCLEIC REACTIONS
US6893822B2 (en) 2001-07-19 2005-05-17 Nanogen Recognomics Gmbh Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate
US20050147984A1 (en) * 2001-08-31 2005-07-07 Clondiag Chip Technologies Gmbh Interaction detection on several probe arrays
US6696254B2 (en) * 2001-11-21 2004-02-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection and identification of enteric bacteria
US7041811B2 (en) * 2001-12-19 2006-05-09 Dr. Chip Biotechnology, Inc. Method for detecting Escherichia coli
US20030175709A1 (en) * 2001-12-20 2003-09-18 Murphy George L. Method and system for depleting rRNA populations
US7579147B2 (en) * 2002-05-07 2009-08-25 Wake Forest University Health Sciences Mutations in the macrophage scavenger receptor 1 gene alter risk of prostate cancer, asthma, and cardiovascular disease
BRPI0310060B8 (pt) * 2002-05-17 2021-07-27 Becton Dickinson Co sistema automatizado para isolar, amplificar e detectar uma seqüência de ácido nucléico alvo ou uma proteína
US20030219755A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for performing hybridization assays using target enhanced signal amplification (TESA)
US7601493B2 (en) 2002-07-26 2009-10-13 Nanogen, Inc. Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations
US20040259105A1 (en) * 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
AU2003301825A1 (en) * 2002-10-31 2004-06-07 Pfizer Products, Inc. Panels of molecular targets differentially expressed during cd8+ t-cell priming
US20040191803A1 (en) * 2002-11-22 2004-09-30 Michela Gallagher Target for therapy of cognitive impairment
EP2248912B8 (en) * 2002-11-26 2013-04-17 University of Maryland, Baltimore County High sensitivity assays for pathogen detection using metal-enhanced fluorescence
US20040235019A1 (en) * 2003-03-06 2004-11-25 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Diagnostics and therapeutics for the gene expression signature of PPAR-gamma receptor ligand
CA2525413C (en) 2003-05-19 2010-08-17 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for determining the presence of trichomonas vaginalis in a test sample
JP4675330B2 (ja) 2003-11-14 2011-04-20 デューク ユニバーシティ シャルコー・マリー・ツース病２ａ型の検出方法
GB0411081D0 (en) * 2004-05-18 2004-06-23 Glaxo Group Ltd Novel apparatus
DK1778867T3 (da) * 2004-07-01 2010-08-02 Gen Probe Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til detektering af nucleinsyrer i en biologisk prøve
US7662562B2 (en) * 2004-08-10 2010-02-16 Becton, Dickinson And Company Method for rapid identification of microorganisms
US7828954B2 (en) * 2004-09-21 2010-11-09 Gamida For Life B.V. Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles
US7314542B2 (en) * 2004-09-23 2008-01-01 Nanogen, Inc. Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions
EP1909108B1 (en) 2005-03-10 2019-05-29 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifiying analytes
EP2333561A3 (en) 2005-03-10 2014-06-11 Gen-Probe Incorporated System for performing multi-formatted assays
EP1871913A2 (en) * 2005-03-25 2008-01-02 Ambion, Inc. Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
ATE551433T1 (de) 2005-05-06 2012-04-15 Gen Probe Inc Verfahren und produkte zum erfassen von nukleinsäurezielen
AU2006342447B2 (en) 2005-12-28 2013-06-20 Translational Therapeutics, Inc Translational dysfunction based therapeutics
US20080118914A1 (en) * 2006-01-04 2008-05-22 Charlotte Dawn Blowe Follistatin gene as a genetic marker for first parity litter size in pigs
US20070186298A1 (en) * 2006-01-04 2007-08-09 Blowe Charlotte D Follistatin gene as a genetic marker for reproductive and performance traits in pigs
CA2652454C (en) 2006-05-24 2013-04-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for determining the presence of mycobacterium tuberculosis complex organisms in a test sample
DK1945821T3 (da) 2006-06-06 2011-03-07 Gen Probe Inc Mærkede oligonukleotider og anvendelse deraf i fremgangsmåder til amplifikation af nukleinsyrer
NZ576149A (en) 2006-09-29 2012-06-29 Translational Therapeutics Inc Eif4e regulon-based diagnostics
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
EP1978111B1 (en) 2007-04-02 2013-03-27 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Pseudomonas aeruginosa
EP2657351B1 (en) 2007-12-21 2018-06-20 Biomerieux Sa Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
WO2009126336A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Becton, Dickinson And Company Methods of controlling the sensitivity and dynamic range of a homogeneous assay
EP2806037B1 (en) 2008-05-13 2016-09-21 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
CA2723917A1 (en) 2008-05-30 2009-12-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of salmonella
WO2010019550A2 (en) 2008-08-12 2010-02-18 Shiraz Pharmaceuticals, Inc. Method of identifying disease risk factors
US8288520B2 (en) * 2008-10-27 2012-10-16 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and system
AU2009324884B2 (en) 2008-11-25 2013-10-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting small RNAs, and uses thereof
US8748133B2 (en) 2008-12-30 2014-06-10 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Listeria
AU2010208311B2 (en) * 2009-01-28 2016-07-07 Qiagen Gaithersburg, Inc. Sequence-specific large volume sample preparation method and assay
EP2425019B1 (en) * 2009-05-01 2014-03-19 QIAGEN Gaithersburg, Inc. A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample
CN102427885B (zh) 2009-05-15 2016-10-19 简·探针公司 用于在执行磁性分离工序的仪器中实现磁体的自动移动的方法和设备
US8999675B2 (en) 2009-08-31 2015-04-07 Gen-Probe Incorporated Dengue virus assay
CA2773320C (en) 2009-09-14 2018-02-20 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
AU2010339861A1 (en) 2009-12-21 2012-10-25 Becton, Dickinson And Company Methods for identifying drug resistant Mycobacterium
WO2011087789A2 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
US8790879B2 (en) 2010-01-22 2014-07-29 Gen-Probe Incorporated Probes for detecting the presence of Trichomonas vaginalis in a sample
CN102822353A (zh) 2010-01-29 2012-12-12 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 确定和确认样品中存在hpv的方法
EP2528932B1 (en) 2010-01-29 2016-11-30 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
JP2013531976A (ja) 2010-05-11 2013-08-15 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー ｓｐｎＫ菌株
WO2011146629A2 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Qiagen Gaithersburg Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
AU2011258501B2 (en) 2010-05-25 2016-07-07 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes
EP2743704A3 (en) 2010-07-23 2014-06-25 Beckman Coulter, Inc. System or method of including analytical units
EP2678442B1 (en) 2011-02-24 2019-01-16 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acid
EP2998399A1 (en) 2011-05-03 2016-03-23 Dow AgroSciences LLC Enhancing spinosyn production with oxygen binding proteins
EP4219740A3 (en) 2011-09-06 2023-08-16 Gen-Probe Incorporated Closed nucleic acid structures
DE102011114984B3 (de) * 2011-09-28 2012-11-22 Universität Rostock Sequenzspezifische Analyse von Nukleinsäuren
KR20140091032A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 수송 시스템의 자기 감쇠
KR20140091033A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 컨테이너 검출
CN104105969B (zh) 2011-11-07 2016-10-12 贝克曼考尔特公司 离心机系统和工作流程
EP3373015A1 (en) 2011-11-07 2018-09-12 Beckman Coulter Inc. Aliquotter system and workflow
ES2844324T3 (es) 2011-11-07 2021-07-21 Beckman Coulter Inc Brazo robótico
JP6082018B2 (ja) 2011-11-07 2017-02-15 ベックマン コールター， インコーポレイテッド サンプルを処理するためのシステムおよび方法
CN104169437B (zh) 2011-12-23 2017-07-11 生物梅里埃公司 甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的mecA变体菌株的检测
US9631195B2 (en) 2011-12-28 2017-04-25 Dow Agrosciences Llc Identification and characterization of the spinactin biosysnthesis gene cluster from spinosyn producing saccharopolyspora spinosa
KR102018934B1 (ko) 2012-02-27 2019-09-06 도레이 카부시키가이샤 핵산의 검출 방법
US10472683B2 (en) 2012-06-01 2019-11-12 Akron Biotechnology, LLC. Detection of Mycoplasma in cell cultures and cell culture derived biologicals
WO2014006025A2 (en) 2012-07-02 2014-01-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Marker of pathogenicity in salmonella
US9416403B2 (en) 2012-08-31 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Method of detecting target nucleic acid
US10427162B2 (en) 2016-12-21 2019-10-01 Quandx Inc. Systems and methods for molecular diagnostics
CA3108105A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
JP2022518510A (ja) 2019-01-25 2022-03-15 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 薬物耐性ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出
WO2021041056A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
EP4182482A1 (en) 2020-07-17 2023-05-24 Gen-Probe Incorporated Detection of macrolide-resistant mycoplasma genitalium

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896217A (en) * 1973-03-19 1975-07-22 Summa Corp Method and apparatus for radioimmunoassay with regeneration of immunoadsorbent
US3930956A (en) * 1973-10-29 1976-01-06 The Regents Of The University Of Michigan Method for the genetic detection of microorganisms
SU649751A1 (ru) * 1977-06-14 1979-02-28 Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.М.В.Ломоносова Способ идентификации микроорганизмов
US4139346A (en) * 1977-11-28 1979-02-13 Enzo Bio Chem Incorporated Nucleic acid and protein binding paper
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
FR2444713A1 (fr) * 1978-12-18 1980-07-18 Pasteur Institut Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant
US4302204A (en) * 1979-07-02 1981-11-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Transfer and detection of nucleic acids
US4359535A (en) * 1979-10-01 1982-11-16 George Pieczenik Autonomously replicating DNA containing inserted DNA sequences
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
US4446237A (en) * 1981-03-27 1984-05-01 Life Technologies, Inc. Method for detection of a suspect viral deoxyribonucleic acid in an acellular biological fluid
EP0062286A1 (en) * 1981-03-31 1982-10-13 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Diagnostic test for hepatitis B virus
CA1219824A (en) * 1981-04-17 1987-03-31 David C. Ward Modified nucleotides and methods of preparing and using same
JPS5840099A (ja) * 1981-07-17 1983-03-08 アモコ・コ−ポレ−ション 光−放射ポリヌクレオチドの交雑診断方法
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser

Also Published As

Publication number Publication date
US4563419A (en) 1986-01-07
RO86356B (ro) 1985-04-01
DK275183A (da) 1983-06-15
SU1386031A3 (ru) 1988-03-30
HU196242B (en) 1988-10-28
EP0079139A1 (en) 1983-05-18
DK275183D0 (da) 1983-06-15
AU8957582A (en) 1983-05-05
JPS58501703A (ja) 1983-10-13
US4486539A (en) 1984-12-04
CA1192120A (en) 1985-08-20
FI63596B (fi) 1983-03-31
EP0098267A1 (en) 1984-01-18
DE3277917D1 (en) 1988-02-11
DE79139T1 (de) 1983-11-24
FI63596C (fi) 1983-07-11
ATE31735T1 (de) 1988-01-15
EP0079139B1 (en) 1988-01-07
WO1983001459A1 (en) 1983-04-28
AU548854B2 (en) 1986-01-02
RO86356A (ro) 1985-03-15
JPH0632637B1 (da) 1994-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK173744B1 (da) Fremgangsmåde og reagenskombination til diagnose af mikroorganismer
Thomas et al. Non-radioactively labelled polynucleotide and oligonucleotide DNA probes, for selectively detecting Escherichia coli strains producing Vero cytotoxins VT1, VT2 and VT2 variant
WO1993004202A1 (en) Polynucleotide probes for salmonella
Watterworth et al. Multiplex PCR-DNA probe assay for the detection of pathogenic Escherichia coli
Reingold et al. Identification of a new Escherichia coli She haemolysin homolog in avian E. coli
Lisby et al. Construction of a DNA amplification assay for detection of Legionella species in clinical samples
Bloom et al. Characterization of the Aleutian disease virus genome and its intracellular forms
EP0507830B1 (en) C. difficile specific oligonucleotides
JP2792462B2 (ja) サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
JPH0662899A (ja) ナイセリア・ゴノロエエの特異的検出法
Kirii et al. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli by colony hybridization with biotinylated enterotoxin probes
Ranki et al. Nucleic acid sandwich hybridization in adenovirus diagnosis
Rubino et al. IS200 fingerprint of Salmonella enterica serotype Typhimurium human strains isolated in Sardinia
Palva ompA gene in the detection of Escherichia coli and other Enterobacteriaceae by nucleic acid sandwich hybridization
Snelling et al. The commonly-used DNA probe for diffusely-adherent Escherichia coli cross-reacts with a subset of enteroaggregative E. coli
CZ298165B6 (cs) Oligonukleotidy a zpusob detekce Pectinatus frisingensis a Pectinatus cerevisiiphilus s pouzitím techto oligonukleotidu
KR19990088425A (ko) 장관출혈성대장균검출을위한올리고뉴클레오티드및이를이용한검출방법
NO163699B (no) Fremgangsmaate og reagenskombinasjon for diagnose av mikroorganismer.
CN113249504B (zh) 牛源大肠杆菌检测引物探针组合、试剂盒及应用
Begaud et al. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli in faecal specimens by acetylaminofluorene-labelled DNA probes
Montenegro et al. 1.9 Molecular Epidemiology by Colony Hybridization Using Cloned Genes
JP4534294B2 (ja) ベロ毒素遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド及びそれを用いたベロ毒素遺伝子の検出方法
JPH04293486A (ja) 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
JPH11332600A (ja) 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
JP2885081B2 (ja) エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired