NO163699B - Fremgangsmaate og reagenskombinasjon for diagnose av mikroorganismer. - Google Patents

Abstract

Mikrobiell diagnostisk metode basert på en sandwlch-hybridisering av nukleinsyrer på en fast bærer, samt en reagenskombinasjon for anvendelse ved metoden. Den metode som er beskrevet kan anvendes for å identifisere, ut fra en enkelt prøve som inneholder nukleinsyrer i de mikroorganismer eller mikrobielle grupper som skal diagnostiseres, etter først A gjøre nevnte nukleinsyrer enkelt-strenget, alle mikroorganismene eller de mikrobielle grupper ved å sette til prøven to nukleinsyrereagenser for hver mikroorganisme eller mikrobiell gruppe som skal diagnostiseres, hvorav ett nukleinsyrereagens er festet til en fast bærer i den enkelt-strengede form og det annet inneholder et helt annerledes nukleinsyrefragment fra den samme mikroorganisme eller mikrobielle gruppe, som er merket med en etablert markør. Det gjenkjennende nukleinsyrefragment hybridiserer til en komplementær enkelt-strenget nukleinsyre fra prøven, og det hybrid som således dannes på den partikkelformige bærer blir merket når det komplementære, merkede nukleinsyrefragment fester seg til den enkelt-strengede nukleinsyre som stammer fra prøven. Fordi de merkede nukleinsyrereagenser ikke alene hybridiserer med den faste bærer, blir bare de bærere som inneholder nukleinsyrereagenser som tilsvarer nukleinsyrer i prøven, merket. Merkingen måles ved etablerte metoder.

Description

Oppfinnelsen vedrører en mikrobiell diagnostisk metode for samtidig identifisering av en eller flere mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper. Metoden er basert på "sandwich"-hybridisering av nukleinsyrer på en fast bærer. Oppfinnelsen vedrorer også en serie av reagenskombinasjoner for anvendelse ved denne metode.

I tradisjonelle mikrobielle diagnoser demonstreres nærvær

av en mikroorganisme i en gitt prøve ved isolering av den aktuelle mikroorganisme. Etter anrikningsdyrkning identifiseres mikroorganismen enten på basis av sine biokjemiske egenskaper eller ved anvendelse av immunologiske metoder. Denne type diagnose krever at mikroorganismen i prøven er levedyktig. Identifisering ved isolering er videre en arbeidskrevende metode, som i tilfellet med virus kan kreve 4-6 uker.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe

en diagnostisk metode hvor nærvær av en mikroorganisme i en prøve demonstreres ved identifisering av dens genetiske materiale, nukleinsyren, ved hjelp av den sensitive og spesifikke nukleinsyre-hybridiseringsteknik-k. I seg selv er nukleinsyre-hybridisering en gammel og velkjent metode for undersøkelse av identi-teten til nukleinsyrer. Komplementære nukleinsyretråder har evne til å danne en tett dobbelttrådet struktur i henhold til reglene med pardannelse av baser, og den resulterende hybrid kan separeres fra den residuelle enkelt-trådede nukleinsyre.

Noen metoder som er basert på identifisering av nukleinsyre (r) er allerede blitt anvendt på mikrobielle diagnoser. Enterotoksigen Escherichia coli er identifisert fra faekal-prøver ved kolonihybridisering under anvendelse av genet for toksinproduksjon som en sonde. Positiv hybridisering er demon-strert ved autoradiografi (Moseley, S.L. et al., J. Infect. Dis.

(1980) 142, 892-898). Kolonihybridisering er basert på den

metode som opprinnelig ble utviklet av Griinstein og Hogness (Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1975) 72, 3961-3965). Hybridisering er også anvendt som en metode for å skjelne mellom Herpes simplex virus type 1 og type 2 (Brautigam, A.R. et al., J. Clin.Microbiol

(1980) 12, 226-234), imidlerid ikke i hurtig diagnostikk, men

ved typifisering av viruset etter anrikningsdyrkning. I denne metode separeres den dobbelt-trådede hybrid fra fraksjonen av nukleinsyrer gjenværende enkelt-strenget i løsningen ved affinitets-kromatografi.

Det ble nylig publisert at DNA fra celler infisert med Epstein-Barr-virus (prøven) etter egnet forhåndsbehandling ble fiksert direkte på filterne. Den aktuelle nukleinsyre identifiseres ved hybridisering av filterne med den radioaktive sonde,

og positiv hybridisering påvises ved autoradiografi (Brandsma,

I. og Miller, K. (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 6851-6855).

En lignende metode som angitt ovenfor er beskrevet i BRD-off.skrift nr. 2.950.295 og i Lancet av 10.okt. 1982,

s. 765-767. I det nevnte off.skrift er det beskrevet en frem-gangsmåte for fremstilling av en radioaktivt merket DNA-sonde ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. Denne DNA-sonde lages av hepatitis B virus. I Lancet er anvendelse av denne sonde ved en metode for påvisning av hepatitis B virus beskrevet. Ved denne metode overføres DNA fra prøven til et nitrocellulosefilter, og den fikserte hepatitis DNA fra prøven påvises ved anvendelse av sonden som reagens.

Fordi to. reagenser anvendes, er vår metode meget mer spesifikk enn den metode som er beskrevet ovenfor og gjør det mulig å konstruere forskjellige sett ved hjelp av hvilke ulike mikrober eller mikrobielle grupper kan påvises fra den samme prøve uten å forstyrre spesifisiteten til testen for hver mikrobe eller mikrobiell gruppe som kommer på tale. Ved frem-gangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvendes to forskjellige nukleinsyrefragmentreagenser - det ene festet til en fast bærer, det annet merket på egnet måte - og DNA-prøven er i flytende tilstand. Det henvises forøvrig til krav 1 og 2.

Den oppfinnelse som her er beskrevet er basert på sandwich-hybridiseringsteknikken (Dunn, A.R. og Hassel, J.A. (1977)

Cell 12, 23-36), som forenkler håndtering av prøven og påvisningen av hybriden. Av denne grunn er teknikken spesielt egnet for diagnostisk anvendelse.

I den metode som er beskrevet her, kan alle de ønskede mikroorganismer eller mikrobielle grupper identifiseres fra én og samme prøve som inneholder denaturerte enkelt-trådede nukleinsyrestrenger av de mikroorganismer eller mikrobielle grupper som skal identifiseres, uten oppdeling av prøve. Metoden krever to nukleinsyrereagenser for hver mikroorganisme eller gruppe av mikroorganismer som skal identifiseres. Reagensene er to separate nukleinsyrefragmenter som stammer fra genomet til den mikroorganisme som skal identifiseres, som ikke har noen sekvens felles, men som fortrinnsvis er beliggende nær hverandre i genomet. Reagensene kan fremstilles direkte fra de mikrobielle genomer eller ved å anvende de etablerte rekombinant-DNA-teknikker. Av de to nukleinsyrefragmenter fikseres ett til en fast bærer, fortrinnsvis et nitrocellulosefilter, etter at det er denaturert, og det annet, også i enkelt-trådet form, merkes på egnet måte radioaktivt. Når disse nukleinsyrereagenser, to ulike reagenser for hver mikroorganisme eller mikrobiell gruppe som skal identifiseres, anbringes i kontakt med de enkelt-trådede nukleinsyrer som skal identifiseres i prøven,

kobles nukleinsyrene til de komplementære nukleinsyrefragmenter på den faste bærer. De hybrider,som således dannes på bæreren blir merket etter hybridiseringen med de merkede komplementære nukleinsyrefragmenter. De merkede nukleinsyrefragmenter hybridiserer ikke alene til de nukleinsyrefragmenter som er knyttet til bæreren, men bare til de tilsvarende enkelt-trådede. nukleinsyrer som stammer fra prøven. Således kan bare de bærere til hvilke de komplementære nukleinsyrer fra prøven har hybridisert, bli merket. Disse bærere kan lett vaskes og merkingen måles ved etablerte metoder.

Metoden i henhold til oppfinnelsen kan i prinsippet anvendes for identifisering av alle organismer som enten inneholder DNA eller RNA, f.eks. virus, bakterier, fungus og

gjær. Metoden har den spesifikke fordel at den tillater identifisering av alle bakterier og viruser som det er mulig kan komme på tale på samme tid og fra samme prøve, uten hensyntagen til om mikroorganismene inneholder DNA eller RNA. Ved egnet kombinasjon av reagenser er det mulig å utvikle "sett", slik at hver mikroorganisme som skal identifiseres har sin egen faste bærer utstyrt med en merkelapp og et merket nukleinsyrereagens. Alle de filtre som er inkludert i reagenskombinasjonen kan settes til prøven samtidig, sammen med de merkede nukleinsyrereagenser. Når hybridiseringen har funnet sted, vaskes de faste bærere og merkingen måles. Den eneste bærer som skal merkes er den ene som inneholder sekvenser komplementært til den mikrobielle genom i den undersøkte prøve.

Kombinasjonen av metode og reagenser kan anvendes f.eks.

i medisinsk mikrobiologi, veterinær-mikrobiologi, matvarehygiene-undersøkelser og mikrobiell diagnostikk av plantesykdommer. Egnede prøvematerialer er f.eks. alle dyre- og plante-vev-homogenater, slike pasientsekresjoner som blod, faeces og nasal og uretral slimhinne. Det kan vurderes at metoden er til-strekkelig sensitiv til å oppdage de mikrobenivåer som normalt er til stede i kliniske prøver. Foreløpig anrikning av den mikroorganisme som er til stede i prøven, ved dyrkning, er naturligvis mulig før identifikasjonstesten og ville i noen tilfeller være essensielt. Metoden er også egnet for under-søkelse av prøver fra hvilke mikroorganismen ikke lenger kan dyrkes, men som inneholder betydelige mengder av mikrobielt debris (f.eks. etter at antibiotisk behandling har begynt), eller hvis dyrkning av mikroorganismen er særlig arbeidskrevende og vanskelig (f.eks. anaerobe bakterier, som er til stede i stort antall i suppurative prøver når det gjelder infeksjoner for-årsaket av anaerober.

Metodenvkunne tilpasses i form av følgende reagenskombinasjoner<*>, "sett", idet deler av disse naturligvis kunne anvendes separat: ;Åndedrettsinfeksjoner: ;a) Bakterier: B-hemolytiske streptokokker (A-gruppe), Haemophilus influenzae, Pneumococci, Mycoplasma ;pneumoniae, mycobacteria ;b) Vira: Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1-3 Åndedretts-syncytial virus, adenoviruses, corona- ;viruses, rhinoviruses ;Diareer ;a) Bakterier: salmonellae, shigellae, Yersinia entero-colitica, enterotoxigenic E. coli, Clostridium ;difficile, eampylobacteria ;b) Vira: rotawiruses, parvoviruses, adenoviruses, enteroviruses ;Veneriske sykdommer: ;a) Bakterier: Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis ;b) Vira: Herpex simplex-virus ;c) Gjærsopper: Candida albicans ;d) Protozoa: Trichomonas vaginalis ;Sepsis: ;a) Bakterier: 3-hemolytiske streptokokker (A-gruppe), pneumococci, enterobakterier som en enkelt gruppe ;Matvarehygiene: ;a) Bakterier: Salmonella og Clostridium perfringens ;Avhengig av valget av reagenser kan spesifisiteten ved ;testen begrenses til en definert mikrobiell slekt (f.eks. salmonella) eller til en hel mikrobiell gruppe, f.eks. entero-bacteriaceae, ved å velge identifiserende reagenser fra området av et felles gen. ;De nukleinsyrereagenser som kreves i sandwich-hybridi-seringsteknikken som er beskrevet her-, produseres ved rekombinant-DNA-teknologi. I det følgende beskrives reagensproduksjon og testmetode for eksempel 1. ;Reagenser ;Adenovirus type 2 (stamme deponert ved KTL, dvs. National Public Health Institute, Helsingfors) ble dyrket og renset, og DNA ble isolert (Petterson, U. og Sambrook, J. (1973) J. Mol. Biol. 73 , 125-130) (i det følgende referert til som Ad.,-DNA) . DNA ble digerert med BamHI-restriksjonsjonsenzym (BRL, d.e. Bethesda Research Laboratories) som kutter DMA opp i fire ;reproduserbare fragmenter. Av disse fire fragmenter ble to inn-lemmet på BamHI-setet i vektor-plasmidet pBR 322 (BRL) ved hjelp av T4-ligase (BRL). (Fragmentene ble ikke separert før ligering, men tilføyelsen som ble gjort til plasmidet ble i hvert tilfelle bare identifisert etter kloning). Deretter ble bakterieverten ;(É. coli HB101 (K12) gal-, pro-, leu-, hrs-, hrm-, recA, str<r>, F-) ;(oppnådd fra KTL) transformert med plasmid-DNA sammensatt av ;rekombinantplasmider, dvs. molekyler som hadde mottatt fragmenter av adenovirus-DNA (Cohen, S.N. et al., (1972) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 2110-2114). Blant de transformerte bakteriekloner ble det valgt slike som mest sannsynlig inneholdt rekombinant-plasmidet. Ampicillin- og tetracyklin-resistansgener overføres til bakteriet ved. pBR322-plasmidet (Bolivar F. et al., (1977) ;gen 2, 95-113). Bakterier som inneholder rekombinantplasmidet er imidlertid sensitive overfor tetracyklin, fordi BamHI-restriksjonssetet er i tetracyklingenet og det fremmede DNA som innlemmes i dette område ødelegger genet. Innlemmelsen av plasmidet ble karakterisert etter plasmidanrikning ved bestemmelse av størrelsen på restriksjonsfragmentene etter BamHI-oppslutning med agarosegel-elektroforese. De tilstøtende BamHI D- og C-fragmenter av Ad2-DNA (cf. genkart) ble valgt som reagenser (Soderlund H. et al., (1976) Cell 7, 585-593). De ønskede rekombinantplasmider, Ad2C-pBR322, KTL nr. E231 og Ad2D-pBR322, KTL nr. EH230, ble dyrket og renset som beskrevet i litteraturen (Clewell D.B. og Helinski D.R. (1969) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 62, 1159-1166). ;Rekombinantplasmidet Ad2D-pBR322 ble anvendt som filter-reagens. Det er ikke nødvendig for foreliggende søknad å fjerne plasmidsekvensene, da prøven ikke inneholder pBR322-sekvenser. Imidlertid ble nukleinsyren-, for radioaktiv merking, separert fra pBR322-DNA etter BamHI-oppslutning ved hjelp av agarosegel-elektroforese. C-fragmentet ble isolert fra LGT-agarose (Marine Colloids, Inc.) ved fenol-ekstraksjon eller elektro-eluering (Wieslander L. (1979) Anal. Biochem. 98, 305-309) og konsentrert ved utfelling med etanol. ;Det er spesielt bekvemt å subklone nukleinsyrefragmentet som velges for merking i en separat vektor", slik at man kan unngå hybridiseringsbakgrunnen som resulterer fra den direkte hybridisering med filteret i de residuelle plasmidsekvenser, som kont-aminerer det merkede nukleinsyrereagens. Den enkelt-trådede DNA-fag Ml3 mp7 (BRL), som DNA-fragmentene oppnådd ved BamHI-oppslutning lett kan overføres til, kunne anvendes som en optimal vektor (Messing J:. et al., (1981) Nucleic Acids Res. 9, 309-323). ;Festing av DNA til filteret ;Rekombinantplasmidet Ad2D-pBR322 ble denaturert til en enkelt- trådet form og knekket vilkårlig på forskjellige punkter ved behandling med 0,2N NaOH (5 min., 100°C), hvoretter DNA ble nedkjølt og, umiddelbart før overføring til- filteret, nøytralisert og pipettert til overføringsløsningen, 4 x SSC-medium på is (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat). Filterne (Schleicher og Schull BA85 nitrocellulose) ble grundig fuktet i 4 x SSC løsning (ca. 2 h) før påføring av DNA. DNA festes til filteret i fortynnet løsning (0,5-1,0 yg/ml) ved suging av løsningen gjennom filteret i svakt vakuum. Filteret har evne til å absorbere DNA opp til ca. 180 ug/cm 2 (Kafatos F.C. et al., (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552). Vi har anvendt DNA-konsentrasjoner på mellom 0,5 yg DNA/2,5 cm diameter av filter og 1,0 yg DNA/0,7 cm diameter av filter. Etter DNA-filtrering vaskes filterne i 4 x SSC, tørkes ved romtemperatur og innbakes til slutt i vakuumovn ved 80°C i 2 h, hvoretter DNA på filterne forblir stabilt og filterne kan lagres i lange perioder ved romtemperatur (Southern E.M. (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517) . ;Merking av det radioaktive nukleinsyrefragment ;12 5 ;Den radioaktive merking som ble benyttet var I-isotopen. Denne isotop kan påvises med y-tellere, som er tilgjengelige ;i de fleste store laboratorie-enheter. Halveringstiden til isotopen er 60 dager, og av denne grunn er anvendelsesperioden for 12 5I-merkede reagenser ca. 4 måneder. ;" Knekk- translaterings"- merking ;Prinsippet ved denne metode er å forskyve ett av nukleotidene i nukleinsyren med et radioaktivt sådant, hvoretter hele DNA-molekylet blir merket. Dette utføres i henhold til den metode som er publisert av Rigby P.W.J, et al., (J. Mol. Biol. (1977) 113, 237-251). I reaksjonen blir DNA radioaktivt merket når ;12 5 ;løsningen inneholder I-merket deoksynukleosid-trifosfat som ;125 ;substrat, i dette tilfelle I-dCTP (Radiochemical Centre, Amersham: >1500 Ci/mmol). Under optimale betingelser kan det oppnås en spesifikk aktivitet på 10^ c<p>m/yg DNA. Det merkede ;DNA renses for nukleotider som er igjen i reaksjonsblandingen ved enkel gelfiltrering, f.eks. med BioGel P30 (BioRad). ;Andre merkemetoder ;Det enkelt- trådede nukleinsyrereagens som ble produsert ;i M13 mp7-fag merkes ved kjemisk jodering hvorved det ;125 ;reaktive I tilsettes kovalent til nukleinsyren (Commenford S.L. (1971) Biochemistry 10, 1993-2000, Orosz J.M. og Wetmur J.G. ;(1974) Biochemistry 13, 5467-5473). Alternativt kan nukleinsyren gjøres radioaktiv ved. sluttmerking med radioaktive nukleotider ved hjelp av den terminale transferase (Roychoudhury R. og Wu R. (1980) Meth. Enzymol. 65, 43-62). ;Reagensfremstillingen som er beskrevet ovenfor vedrører mikroorganismer hvor det genetiske materiale er i form av DNA. Når det gjelder RNA-vira finner kloningen av genom-fragmenter■ sted på en slik måte at først er det laget en DNA-kopi (cDNA) av virus RNA ved hjelp av revers transkriptase, fulgt av DNA-polymerase for kopiering av den annen DNA-tråd, og deretter klones DNA som beskrevet ovenfor (Salser W. (1979) i Genetic Engineering, Ed. A.M. Chakrabarty, CRC Press, s. 53-81). ;Den mest egnede klonemetode velges i avhengighet av den mikroorganisme som anvendes. Vertene så vel som vektorene kan variere. Muligheter inkluderer A-fagen som vektor, andre plasmider, kosmider, kloning, f.eks. i Bacillus subtilis bakterier osv. (Rekombinant DNA, Benchmarck Papers in Micro-biology, vol. 15, Eds. K.J. Denniston og L.W. Enqvist, Dowden, Hutchinson og Ross, Inc. (1981); Ish-Horowicz D. og Burke J.F. ;(1981) Nucleic Acids Res. 9, 2989-2998). ;Utførelse av testen ;Prøvebehandling ;Den mikrobielle nukleinsyre som skal undersøkes må først frigjøres fra selve mikroben og også fra de infiserte celler, hvoretter den må denatureres til den enkelt- trådede form. Virus-genomer kan frigjøres ved behandling av prøventaterialet med 1% natriumdodecylsulfat (SDS) og ødelegge de proteiner som beskytter genomet ved hjelp av proteinase K-behandling (1 mg/ml, 37°C, 60 min.).. Bakterieprøver må i tillegg brytes ned ved lysozym- og EDTArbehandling. ;Hvis prøven inneholder store mengder av viskøs.cellulær-DNA med høy molekylvekt, må denne skjæres ved få punkter for reduksjon av viskositeten, f.eks. ved sonar behandling eller ved å føre prøven noen få ganger gjennom en fin nål. ;Hybridisering ;Hybridisering finner sted f.eks. i 50% formamid (avionisert, lagret ved -20°C), i 4 x SSC Denhardt-løsning (Denhardt D.T. ;(1966) Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646) som inneholder 1% SDS og 0,5 mg/ml DNA (laksespermier eller kalve-thymus) ved 37°C og vanligvis natten over i 16-20 timer. De filtere som velges for testen inkuberes i et egnet kar som hybridiseringsblandingen tilsettes, og hybridiseringen starter. Hybridiseringsblandingen inneholder (a) den forhåndsbehandlede prøve som er tilsatt den eller de radioaktive nukleinsyrereagenser som er blitt denaturert sammen ved koking i 5 minutter, fulgt av hurtig avkjøling ved 0°C; (b) konsentrerte formamid-, SSC- og Denhardt-løsninger som pipetteres til den denaturerte og avkjølte nukleinsyreblanding (a). Etter blanding pipetteres hybridiseringsblandingen til filterne i hybridiseringskaret. Etter hybridisering vaskes filterne omhyggelig og telles individuelt i y-telleren. ;Oppfinnelsen skal klargjøres i det følgende ved hjelp av noen utførelseseksempler. ;Eksempel 1 ;Påvisning av adenovirus ved sandwich- hybridiseringsroetoden ;(Tabell 1) ;Detaljene ved testen er klargjort i teksten til tabell 1. Sandwich-hybridiseringsmetoden kan påvise virus-DNA fra en løsning, men det virale genom kan like godt påvises fra infiserte celler. ;Hybridiseringsbakgrunnen måles i et rør som bare inneholder filteret og det merkede nukleinsyrereagens, uten prøven. Bakgrunnen forårsakes av pBR322-sekvensene som opptrer i det merkede nukleinsyrereagens. Disse sekvenser hybridiserer direkte med filteret uten at prøven medvirker til det. Filterne som inneholder kalve-thymus og intet DNA anvendes i testen som kontrollprøver, hvilket på den ene side indikerer spesifisiteten ved hybridiseringen og på den annen side nivået av den ikke-spesifikke bakgrunn som opptrer f.eks. på grunn av utilstrekkelig vasking. ;I de følgende tabeller er bakgrunnen som skyldes reagensene subtrahert fra cpm-verdiene hybridisert til filterne. ;Merket nukleinsyrereagens: ;Ad2-BamHI C-fragment, renset, spesifikk aktivitet ;90 x IO<6> cpm/ug (200 000 cpm <1>25I/reaksjon) ;Hybridisering: ;50% formamid, 4 x SSC ;Denhardt-løsning, inneholdende 0,5 mg/ml laksesperma DNA og ;1% SDS, 37°C, 16 h ;Vasking: ;0,1% SSC, romtemperatur, 40 min. ;Prøver: ;Adenovirus type 2. DNA (BRL) ;Infeksjon med type' 2 adenovirus fant sted i HeLa-celler. Cellene ble så oppbrutt ved behandling med 1% SDS, fulgt av oppslutning med 1 mg/ml proteinase-K-enzym (Sigma) i 30 min. ved 37°C. Før denaturering ble prøven ført gjennom en fin nål. De verdier som fremstår i tabellen er korrigert ved subtraksjon av reagensbakgrunnen, oppnådd ved utførelse av en lignende hybridisering, men uten prøve. ;Eksempel 2 ;Påvisning av et RNA- virus ved hjelp av sandwich- hybridisering ;(Tabell 2) ;RNA-virusmodellen som ble anvendt var Semliki Forest-virus (prototyp stamme, oppnådd fra London School of Hygiene and Tropical Medicine), av hvilket genomet er enkelt-strenget RNA. Ved å anvende virus-genomet som sjablong (eller mal) ble cDNA produsert, som ble klonet inn i Pstl-setet i pBR322-plasmidet som beskrevet av Garoff et al. (Proe.Nati. Acad.Sei. (1980) USA 77, 6376-6380). Det således oppnådde rekombinant-plasmid er pKTH312 KTL nr. EH 232. Innlemmelsen av dette plasmid som stammer fra virus-genomet er ca. 1400 nukleotider lang og er fra det strukturelle proteinområde, tilnærmet fra nukleotid 200 til nukleotid 1600 når nummereringen starter fra begynnelsen av de strukturelle gener (Garoff H. et al., 1980). For produksjon av reagens ble hele rekombinant-plasmidet pKTH312 linearisert med EcoRI restriksjonsenzym (BRL) (den sekvens som stammer fra Semliki Forest-virus inneholder ikke gjenkjennelsespunkter for EcoRI-enzymet), og det lineariserte plasmid ble kuttet opp i ;to fragmenter ved anvendelse av Xhol-enzym (BRL). Restriksjons-punktet for sistnevnte ble lokalisert med Semliki Forest-virus-sekvensen. Det største EcoRI-XhoI-fragment A (ca. 3900 basepar) ble knyttet til filteret, og det minste fragment B (ca. 1850 ;125 ;basepar) ble merket med I ved anvendelse av knekk-trans-lateringsteknikken. Både fritt Semliki Forest-virus og virus-infiserte celler ble anvendt som prøver i denne test. I begge tilfeller var de virus-spesifikke nukleinsyrer i prøven sammensatt utelukkende av RNA. ;;Filtere: ;1) EcoRI-XhoI-fragment A (1,2 ug) av pKTH312-plasmidet ;2) Kalve-thymus DNA 1 yg ;3) Blindprøve (intet DNA) ;Merkede nukleinsyrereagenser: ;EcoRI-XhoI-fragment B i plasmidet pKTH312, spesifikk aktivitet 90 x 106 cpm/yg DNA (200 000 cpm <125>I/reaksjon). ;Hybridisering: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Vasking: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Prøver: ;Semliki Forest-virus (30 yg) ble oppbrutt med SDS før testen. ;De infiserte celler ble behandlet som beskrevet i tabell 1. Infeksjonen med Semliki Forest-virus ble utført i BHK-21-celler. ;De verdier som er angitt i tabellen er korrigert med hensyn på reagensbakgrunn, oppnådd fra en lignende hybridisering uten prøve. ;Eks empel 3 ;En virusprøve hvor den virale budbringer RNA påvises ved ;hjelp av sandwich- hybridiseringsmetoden (Tabell 3) ;Sandwich-hybridiseringsreagensene ble produsert av SV40-virus DNA (BRL) ved oppkutting av DNA i to deler med Pstl-enzym (Boehringer Mannheim) som beskrevet av Lebowitz og Weissman (Curr. Topics i Microbiol. Immunol. 87, 43-172), og fragmentene ble isolert og renset ved agarose-gel-elektroforese. Fragment ;125 ;A (4000 base-par) ble radioaktivt merket med I ved knekk-translatering, og fragment B (1200 base-par) ble festet til filteret. ;DNA-fragmentene ble valgt slik at hvert inneholdt områder som kodet for både tidlige og sene budbringere. Således inneholder fragment B ca. 700 baser fra det strukturelle protein-gen VPl og over 600 baser fra genet for tidligere budbringere. Fordi DNA i SV40-virus i seg selv er en kovalent lukket ring, kan den ikke påvises ved testen før linearisering. Derfor er det, når infiserte celler anvendes som prøve, mulig å teste hvor godt metoden lar seg tilpasse påvisning av RNA-kopier av viral-genomet. Som det kan sees av resultatene i tabell 3, er testen utmerket egnet for undersøkelse av infiserte celler. Tabellen viser også at de samme reagenser kan anvendes for å undersøke både viral-DNA og mRNA laget derav. ;Filtere: ;1) Det korteste fragment Pstl B (0,2 yg) av den sirkulære ;SV40-virus-DNA oppsluttet med Pstl-restriksjonsenzym ;2) Kalve-thymus DNA 1 yg ;3) Blindprøve (intet DNA) ;Merket nukleinsyrereagens: ;Det lengste Pstl A-fragment i SV40-virus DNA, spesifikk aktivitet 28 x IO<6> cpm/yg DNA (200 000 cpm <125>I/reaksjon) ;Hybridisering: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Hybridiseringstiden er 40 h ;Vasking: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Prøver: ;SV40-virus DNA (BRL) ble linearisert med EcoRI-restriksjonsenzym (BRL). CVl-celler (Biomedical Centre, Uppsala University) ble infisert med SV40-virus (fra Janice Y. Chou og Robert G. Martini, NIH, Bethesda), og cellene ble innhøstet 40 h etter infeksjon. Behandling av prøven var som beskrevet i tabell 1. ;De verdier som er presentert i tabellen er korrigert for reagensbakgrunn, oppnådd fra en lignende hybridisering utført uten prøve. ;Eksempel 4 ;Påvisning av Bacillus amyloliquefaciens ved sandwich-hybridisering (Tabell 4) ;Reagensene var fragmenter av a-amylase-genet i B. amyloliquefaciens E 18 (Technical Research Centre of Finland, VTT), som ble isolert for formålet med denne test ut fra rekombinant-plasmidet pKTHlO (Palva I et al., (1981) Gene, 15, 43-51) ved behandling med restriksjonsenzym og påfølgende agarose-gel-elektroforese. Fragmentene som ble anvendt for denne test var Clal-EcoRI-fragment-området i a-amylasegenet (460 base-par) ;(Clal Boehringer Mannheim) og EcoRI-BamHI-fragmentet (1500 base-par) . EcoRI-BamHI-fragmentet ble festet til filteret, og Clal-125 ;EcoRI-fragmentet ble radioaktivt merket med I ved knekk-translatering. ;Som det kan sees av tabell 4, var B. amyloliquefaciens i en prøve identifiserbar ved sandwich-hybridisering på basis av enkelt-a-amylase-genet. E. coli ga negativt resultat i denne test (ikke til å skjelne fra bakgrunnen). ;Tabell 4 ;Bakteriell diagnostikk ved sandwich- hybridisering ;Prøve Filtere ( cmp) ;g- amylase 1) Kalve- thymus 2) Blindprøve 3) pKTHlO-plasmid-DNA ;(linearisert) 1 ug 5773 47 ;Ingen prøve - ;E. coli HB101 (IO<9>) - - - ;Bacillus amylolique- ;faciens (3 x IO<9>) 3377 ;Bacillus amylolique- ;faciens (IO<9>) 2871 ;Filtere: ;1) EcoRI-BamHI-fragmentet av a-amylase-genet fra plasmid pKTHIO, 0,35 yg ;2) Kalve-thymus DNA, 1 <y>g ;3) Blindprøve (intet DNA) ;Merket nukleinsyrereagens: ;Clal-EcoRI-fragmentet av a-amylase-genet fra plasmid pKTHIO, spesifikk aktivitet 35 x IO<6> cpm/yg (200 000 cpm <125>I/reaksjon) ;Hybridisering: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Vasking: ;Som beskrevet i tabell 1 ;Prøver: ;Bakterieprøver ble behandlet med lysozym (67 yg/ml) i 30 min. ved 37°C; 5 mM EDTA ble satt til prøver av E. coli også. Etter behandlingen ble SDS satt til alle prøvene (endelig konsentrasjon 2%), som så ble ført to ganger gjennom en fin nål for reduksjon av deres viskositet før de ble denaturert ved koking som beskrevet i den tekst som vedrører håndtering av prøvene. ;De verdier som fremgår av tabellen er korrigert for reagensbakgrunn, oppnådd fra en lignende hybridisering uten prøve. ;Eksempel 5 ;Et eksempel på et reagenskombinasjonssett basert på sandwich- hybridiseringsmetoden (tabell 5) ;De prøver som ble undersøkt i denne test var celler som ;var infisert av tre vira (adenovirus, SV40-virus og Herpes sim<p>lex-virus) og en prøve som inneholdt Bacillus amyloliquefaciens-bakterier. Følgende reagenser ble alle satt samtidig til hver prøve, 5 filtere, hvert inneholdende én type DNA fra SV40-virus, adenovirus, Bacillus amyloliquefaciens-a-amylase-' ;gen og kalve-thymus, så vel som et filter som ikke inneholdt noe DNA i det hele tatt; i tillegg 200*000 cpm av hvert av de følgende merkede nukleinsyrereagenser: SV40-virus-, adenovirus-og a-amylase-gen-DNA-reagens.

Vart'eksempel viser at det er mulig, uten oppdeling eller fortynning av prøven, samtidig å undersøke en passende serie av mikroorganismer ved tilsetning av reagenskombinasjonen til prøven. Prøven kan inneholde både viral og bakteriell nukleinsyre. Filterne kan gjenkjennes ved hjelp av et tegn (merke, merkelapper), som identifiserer sekvensen det inneholder og som angir hvilken mikroorganisme som ble knyttet/hybridisert til det. Tegnene kan være tall eller bokstaver, f.eks. 1 eller SV40 2 eller Ad etc. eller andre tegn slik som x for SV40

eller A for AD eller 0 for Bacillus.

Merkede nukleinsyrereagenser: SV40-virus som i tabell 3 Adenovirus som i tabell 1 a-amylase-gen som i tabell 4

Hybridisering:

Som i tabell 1

Vasking:

Som i tabell 1

Prøver:

Celleprøver infisert med SV40-virus og adenovirus er beskrevet henholdsvis i tabellene 3 og 1.

10 Vero-celler ble infisert med Herpes simplex-virus

type 1. Cellene ble innhøstet 20 h etter infeksjon da cyto-patisk effekt kunne observeres. Prøven ble behandlet som beskrevet for adenovirus-infiserte celler (tabell 1).

Bacillus amyloliquefaciens- prøve:

Som i tabell 4.

Verdiene i tabellen er korrigert med hensyn på reagensbakgrunn, oppnådd ved utførelse av en lignende hybridisering uten prøve.

Eksempel 6

Påvisning av Escherichia coli ved sandwich- hybridisering

(Tabell 6)

Reagensene ble fremstilt ut fra ompA-genet (ytre membran-protein A -gen) i Escherichia coli.

Hybridplasmidene pKTH40 og pKTH45, anvendt som utgangs-materiale, ble fremstilt ut fra det pTUlOO-plasmid som er beskrevet av Henning et al., (1979) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 4360-4364.

Plasmidet pKTH45 (deponert ved KTL, dvs. National Public Health Institute, Helsingfors nrEH254), anvendt som filter-reagens, var sammensatt av 740 base-par fra 5' -terminalenden i ompA-genet innsatt i pBR322-plasmidet.

Plasmidet pKTH40 inneholder 300 base-par fra 3' -terminalenden i ompA-genet og de umiddelbart følgende 1700 base-par fra genomet i E. coli. pKTH40-plasmidet ble spaltet med BamHI-restriksjonsenzymet for mottagelse av DNA-fragmentet i E. coli, som inneholder de 1700 base-par som er nevnt ovenfor. Dette fragment ble overført til den enkelt-strengede bakteriofag M13mp7 ved de metoder som er beskrevet av Messing et al. (1981), Nucl. Acids Res. 9, 309-321, Heidecker et al. (1980), Gene 10, 69-73, Gardner et al. (1981), Nucl. Acids Res. 9, 2871-2888. Rekombinasjonsfagen mKTHl207 (deponert ved KTL nrEH256) ble merket med 12 5I-isotop som beskrevet på side 8 under over-skriften "Andre merkemetoder " og ble anvendt som sonde i sandwich-hybridiseringsmetoden.

DNA fra oppbrutte E. coli-celler, såvel som isolert, renset DNA fra E. coli, kan påvises ved sandwich-hybridisering som vist i tabell 6.

Merket nukleinsyrereagens:

mKTHl207, spesifikk aktivitet 8 x IO<7> cpm/ug DNA

(200 000 cpm/reaksjon)

Hybridisering:

4 x SCC, 1 x Denhardt-løsning uten BSA (okseserum-albumin), 0,25% SDS, 200 yg/ml sildesperma DNA, 17,5 h, +65°C

Vasking:

Som beskrevet i tabell 1

Claims (8)

1. Prøver r E. coli K12 HB101 -DNA ble isolert i henhold til Marmur-metoden beskrevet av Marmur (1961) J. Mol. Biol. 3, 208-218. DNA ble denaturert ved 7mM NaOH, +100°C, 5 min.

   Cellene ble behandlet med lysozym (500 ug/ml), EDTA (70 mM +37°C, 30 min.), SDS (0,25%, +65°C), og den frie DNA ble denaturert ved koking ved 14 mM NaOH, +100°C, 5 min.

   De verdier som er presentert i tabellen er korrigert med hensyn på reagensbakgrunn oppnådd fra en lignende hybridisering uten prøve. 1. Mikrobiell diagnostisk metode for samtidig identifisering av en eller flere mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper, hvor metoden baserer seg på sandwichhybridisering av nukleinsyrer på en fast bærer, hvorved det anvendes to ulike nukleinsyrereagenser hvorav det ene består av et enkelt-trådet nukleinsyrefragment, bundet til den faste bærer, og det andre består av et enkelt-trådet nukleinsyrefragment merket med en passende substans.karakterisert ved at en serie som består av minst to nukleinsyrereagenser for hver mikroorganisme og/eller mikrobielle gruppe som skal påvises, hvor ett av reagensene er bundet til den faste bærer og det andre er merket med en i og for seg kj ent substans, er brakt i kontakt med én eneste, udelt prøve som inneholder nukleinsyrer fra de mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper som skal påvises, idet disse nukleinsyrer er gjort enkelt-trådet ved i og for seg kjente metoder, hvorved kun de av nukleinsyrene i nukleinsyreblandingen fra prøven som det anvendes tilsvarende nukleinsyrereagenser av, hybridiseres med de motsvarende identifiserende nukleinsyrefragmenter som er bundet til den faste bærer, og de hybrider som derved er dannet og er bundet til den faste bærer, blir merket ved hjelp av de motsvarende, merkede nukleinsyrer når disse binder seg til de nukleinsyrer som stammer fra prøven og er festet til den faste bærer, og den faste bærers merking måles ved i og for seg kjente metoder.
2. 2. Serie av reagenskombinasjoner for anvendelse ved fremgangs-måten i henhold til krav 1,

   karakterisert ved at.det til serien for hver mikroorganisme og/eller mikrobielle gruppe som skal identifiseres, hører minst to nukleinsyrereagenser, idet to ulike nukleinsyrefragmenter som stammer fra mikroorganismer og/eller mikrobielle grupper og er nødvendig for de nevnte reagensers fremstilling, er fremstilt ut fra det mikrobielle genoms ulike deler, men fragmenter som formodentlig er beliggende nær hverandre, enten direkte fra det mikrobielle genom eller ved å gjennomgå i og for seg kjent rekombinasjons-DNA-teknikk og disse nukleinsyrefragmenter som er gruppe- eller artsspesifikke og spesifikke for hver mikroorganisme, er gjort enkelt-trådet og det ene fragment er festet til en fast bærer og det andre er merket med en substans.
3. 3. Serie av reagenskombinasjoner som angitt i krav 2, karakterisert ved at den for identifisering av adenovirus som nukleinsyrereagens bundet til den faste bærer omfatter adenovirus rekombinantplasmid Ad2DpBR322 og som merket nukleinsyrereagens, adenovirus Ad2BamHI C-fragment.
4. 4. Serie av reagenskombinasjoner som angitt i krav 2, karakterisert ved at den for identifisering av Semliki Forest-virus som nukleinsyrereagens bundet til den faste bærer omfatter pKTH312-plasmidets EcoRI-XhoI fragment A og som merket nukleinsyrereagens pKTH312-plasmidets EcoRI-xhoI fragment B.
5. 5. Serie av reagenskombinasjoner som angitt i krav 2, karakterisert ved at den for identifisering av SV40-virus som nukleinsyrereagens bundet til den faste bærer omfatter SV40-virus Pstl B-fragment og som merket nukleinsyrereagens SV40-virus Pstl A-fragment.
6. 6. Serie av reagenskombinasjoner som angitt i krav 2, karakterisert ved at den for identifisering av Bacillus amyloloquefaciens som nukleinsyrereagens bundet til den faste barer omfatter a-amylasegenets EcoRI-BamHI-fragment i Bacillus amyloloquefaciens pKTHIO plasmid og som. merket nukleinsyrereagens oc-amylasgenets Clal-EcoRI-fragment i Bacillus amyloliquefaciens pKTHIO plasmid.
7. 7. Serie av reagenskombinasjoner som angitt i krav 2, karakterisert ved at den for identifisering av Escherichia coli som nukleinsysrereagens bundet til den faste bærer omfatter plasmidet pKTH45 og som merket nukleinsyrereagens rekombinantfagen mKTH1207.
8. 8. Serie av reagenskombinasjoner som angitt i krav 2, 3, 5 og 6,karakterisert ved at den for identifisering og påvisning av adenovirus, SV40-virus og Bacillus amyloli-quef aciens fra samme prøve, hvilken prøve inneholder nukleinsyrer som stammer fra ulike mikroorganismer, som nukleinsyrereagenser bundet til fast bærer omfatter adenovirus Ad2DpBR322 rekombinant-plasmid, SV40-virus Pstl B-fragment samt a-amylasegenets EcoRI-BamHI-fragment i Bacillus amyloloquefaciens pKTHIO plasmid samt som merkede nukleinsyrereagenser omfatter adenovirus Ad2BamHI C-fragment, SV40-virus Pstl A-fragment samt a-amylasegenets Clal-EcoRI-fragment i Bacillus amyloliquefaciens pKTHIO plasmid.