HU196242B - Process and reagent combination for identifying microorganisms by sandwich-hybridization of nucleic acids - Google Patents

Process and reagent combination for identifying microorganisms by sandwich-hybridization of nucleic acids Download PDF

Info

Publication number
HU196242B
HU196242B HU823529A HU352982A HU196242B HU 196242 B HU196242 B HU 196242B HU 823529 A HU823529 A HU 823529A HU 352982 A HU352982 A HU 352982A HU 196242 B HU196242 B HU 196242B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
nucleic acid
fragment
reagent
sample
dna
Prior art date
Application number
HU823529A
Other languages
English (en)
Inventor
Tuula M Ranki
Hans E Soederlund
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtymae Oy filed Critical Orion Yhtymae Oy
Publication of HU196242B publication Critical patent/HU196242B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/823—Immunogenic carrier or carrier per se

Description

A találmány tárgya eljárás mikroorganizmusok azo fásítására núklemsavnak szilárd hordozón való „Saodwdch” l^lb(14>zálása útján. A találmány a? eljárás sot$n alkalmazott reagenskombinációra is vonatkozik,^ , ι A mikrobák hagyományos azonosítására (diag· nosztikájajTs^rán egy mikrobának adott mintában való jelenlétét a kérdése? mikroba elkülönítésével (izolálásáén mütatjákki. Dúsító tenyésztés utáni a mikrobát biokémiai sajátságai vagy immunoló-; giai módszerek segítségével azonosítják. Ez az aZooo$ftá$Lngód$eer megköveteli, hogy a mintában levó mikr^ÚHkcloáDapotban legyen. Az elkülönítés útján véglett azonosítás .erősen időigényes, ée YÍnjóokesetúbei» 4—6 hetet is igénybe vehet.
, Eta^lröáoy célja olyan azonosítási eljárás (diagnosaikalnlődszeó biztosítása, amelyek során egy tnikrobanaíríadott qintában való jelenlétét úgy mutatjuk kfchogy gphetikai anyagát, a nukleinsáyat az érzékeny és specifikus nukleinsav-hibridizár lásimódszer segítségével azonosítjuk. A nukleigSavak bibHdizáiása önmagában véve régi és jól ismert módszer pukleinsavak azonosságának vizsgálatára, A komplementer nukleinsavszálakazzál a képességgel rendelkeznek, hogy a bázispárkép-. tés szabályainak megfelelően szoros kettóaszá» szerkezetet gjkcynak, és az így keletkező hibrid a megmaradt egyszálú nukleinsavtól elkülöníthető, Néhány olyan eljárást, amely nukleinsav(ak) azonosításéit alapul, már eddig is felhasználtak mikrobák azonosítására. A bélre toxikus Esche* richta coli»t székletmintákban úgy azonosították, hogy a toxin termeléséért felelős gén felhasználásával koJóuiahibrjdizálást végeztek; A pozitív hibridizálást atijoradiográfiával igazolják (Moseley,
S. L. és munkatársai: !. Infect. Dis. 142, 892 (1980). A kolónia-bibridizálás az eredetileg Gránátéin ét Hogness által felfedezett módszeren alapszik (Proc· Natf. Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975)). A Mibrjdizálást a Herpes simplex 1. és X típusának megkülönböztetésére is alkalmazták (Brautigam, A. R. és munkatársai: J. Clin. Microbiol. 12, 226(1980)), de nem gyors diagnosztikai módszerként, hanem a vírus típusának felismerése céljából, dúsító tenyésztés után. Ezen eljárás során a kettóss.zály hibridet az oldatban megmaradó, egyszálú nukleinsavak frakciójától affinitást kromatográfiu segítségével különítik el.
Újabban közölték, hogy Epsetin-Barr vírussal (a mintában) fetőzött sejtekből a dezoxiribonukleinsavat (a következőkben: DNS) megfelelő előkezelés után közvetlenül a szűrőkön rögzítették. A kérdéses noklelnsavat úgy azonosították, hogy a szűrőket a radioaktív mintával hibridizálták, és a pozitív hituJdixálást autoradiográfiával mutatták ki (Brandsma, I. és Miller, K.: Proc. Nalt. Acad. Sci. USA, 77, 6851,(1980).
Hasonló -eljárást közöltek a 2950995 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásban ée a Láncét 1981. október 10-i számának 765—767 oldalain. Az idézett szabadalmi leírásban eljárást ismertettek radioaktívan jelzett DNS minta előállítására a rekombináns DNS mószer segítségével. E DNS mintát hepatitis B vírusból készítettek, A „Láncét” idézet szerint e mintát felhasználták a hepatitis B vírus kimutatására. Az eljárás során a mintából vett DNS-t nitrocellulóz2 ból szűrőre vitték át, és a mintából a szűrőre rögzített hepatitis DNS-t a radioaktív DNS-minta reagensként való alkalmazásával mutatták ki.
Mivel találmányunk szerint két reagenst alkal5 mázunk, eljárásunk (módszerünk) sokkal érzékenyebb, mint a fenhtebb leírt módszer, és lehetővé teszi különböző készletek megszerkesztését, amelyek segítségével különböző mikrobák vagy mikrobacsoportok ugyanazon mintában kimutathatók i 0 anélkül, hogy ez a kérdéses mikrobák vagy mikrobacsoportok kimutatásának specifitását befolyásolná. A találmány szerinti eljárás során két különböző nukleinsavfragmentumból álló reagenst — amelyek közül az. egyik a szilárd hordozóhoz kötődik, a másik pedig megfelelő módon jelezve van — alkalmazunk, és a mintából származó DNS a folyadékfázisban Van.
Találmányunk a sandwich hibridizálási módszeren alapul (Dunn, A. R. Hassel, J. A.: Cell 12,23 ,20 (1977)/ és egyszerűsíti a minta kezelését és a hibrid kimutatását. Ennek következtében a találmány szerinti eljárás különösen alkalmas mikrobák azonosításába (diagnosztikájára).
A találmány szerinti eljárás során az összes, kívánt mikrobák vagy mikrobaesoportok azonosíthatók, egyetlen olyan minta felhasználásával — a minta osztása nélkül — amely denaturált állapotban tartalmazza az azonosítandó mikrobák vagy mikrobacsoportok egyszálú nukleinsavait. Az eljá30 rás minden egyes azonosítandó mikroba vagy mikrobacsoport számára két nukleinsavreagenst igényel. E reagensek két olyan különálló nukleinsavfragmentumok, melyek az azonosítandó mikroba genómájából származnak, s amelyeknek közös szekvenciájuk nincsen, azonban a genómában egymáshoz igen közel helyezkednek el. E reagensek előállíthatók közvetlenül a mikroba genómájából vagy rekombináns DNS módszer alkalmazásával. A nukleinsavfragmentumok egyikét denaturálás után egy szilárd hordozóhoz, előnyösen egy nitrocellulózszűróhöz rögzítjük, a másik nukleinsavfragmentumot — szintén egyszálú alakban — megfelelő jelzéssel látjuk el. Ha ezeket a nukleinsavreagenseket, azaz minden egyes azonosítandó mik45 roba vagy mikrobacsoport számára két különböző reagenst érintkezésbe hozzuk a mintában azonosítandó, egyszálú nukleinsavakkal, akkor a nukleinsavak a a szilárd hordozóhoz kötött, kompié? menter nuklemsavfragmentumokkal összeforrnak („anneal”). A szilárd hordozón így kialakult hibridek a jelzett, komplementer nukleinsavfragmentumokkal való összeforrasztás („anneal”) után jelzetté válnak. A jelzett nukleinsavfragmentumok önmagukban nem hibridizálnak a hordozóhoz kö55 tött nukleinsavfragmentumokkal, hanem csupán a mintából származó, megfelelő egyszálú nukleinsavakkal. Ennek következtében csak azok a hordozók válnak jelzetté, amelyekkel a mintából származó, komplementer nukleinsavak hibridizálták.
Ezek a hordozók könnyen kimoshatók, és ezt követően a jelzés erőssége ismert módszerek segítségével mérhető.
A találmány szerinti eljárás elvileg az összes DNS-t vagy RNS-t tartalmazó organizmusok — így például vírusok, baktériumok, gombák és élesztők — azonosítására alkalmazható. A módszer különleges előnye, hogy az összes, számbave-21 bető baktérium és vírus azonosítását lehetővé teszi egyidőben, ugyanazon minta felhasználásával, tekintet nélkül arra, hogy e mikrobák DNS-t vagy RNS-t tartalmaznak. A reagensek megfelelő kombinációjával lehetővé válik olyan készletek („kit”ek) kidolgozása (összeállítása), amelyekben minden egyes azonosítandó mikroba számára rendelkezésre áll a saját, szilárd hordozója (megfelelő befogó szerkezettel) és a jelzett nukleinsavreagens. A reagenskombinációban jelenlevő összes szúrók egyszerre adhatók a mintához a jelzett nukleinsavreagensekkel együttesen. A hibridizálás lejátszódása után a szilárd hordozókat kimossuk, és jelzésük erősségét megmérjük. Az az egyetlen hordozó válik jelzetté, amely a vizsgált mintában jelenlevő mikrobiális genőmávai komplementér szekvenciákat tartalmazza.
A találmány szerinti módszer és reagensek kombinációja felhasználható például az orvosi és állatorvosi mikrobiológiában, élelmiszerek egészségügyi vizsgálata és növénybetegségek kórokozóinak felderítése során. Minta céljára alkalmas anyagok például az összes állati és növényi szövetek homogenizáturnái, betegek váladékai; például vér, széklet, továbbá az orr vagy a húgyvezeték nyálkahártyájából származó váladékok. Becslés alapján a találmány szerinti eljárás megfelelően érzékeny a klinikai mintákban normális körülmények között jelenlevő mikrobamennyiségek kimutatására, Természetesen lehetséges — és egyes esetekben lényeges — a mintában jelenlevő mikrobának tenyésztése útján való előzetes dúsítása az azonosítási vizsgálat végrehajtása előtt. A találmány szerinti eljárás olyan minták vizsgálatára is alkalmas, amelyekből származó mikrobák tovább már nem tenyészthetők, azonban számba vehető mennyiségű mikrobatörmeléket tartalmaznak (például antibiotikummal való kezelés megkezdése után), vagy ha a mikroba kitenyésztése különösen munkaigényes és nehéz (például anaerob baktériumok esetében, amelyek nagy mennyiségben vannak jelen anaerob kórokozók által okozott fertőzések gennyes váladékaiban.)
A találmány szerinti eljárás felhasználható például az alábbi reagenskombinációk (,,kit”-ek), azaz készletek alakjában amelyek egyes részei természetesen külön-külön is alkalmazhatók.
Légúti fertőzések:
a) Baktériumok:
Strepptococcus β-haemolyticus (A-csoport), Haemophilus influenzáé, pneumococcusok, Mycoplastna pneumoniae, mycobacteriumok;
b) Vírusok:
Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1—3, Vírus syncyiialis respiratorius, adenovírusok, coro na vírusok, rhinovírusok.
Hasmenéssel járó fertőzések:
a) Baktériumok:
salmonellák, sh igeiiák, Wersinia enterocolitica,
E. coli enterotoxigenus, Clostridium diffícilé, campylobacteriumok;
b) Vírusok:
rotavírusok, parvoYírusok, adenovírusok, enterovírusok;
t Nemibetegségek:
a) Baktériumok:
Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis;
b) Vírusok:
Herpex simplex vírus;
c) Élesztőgombák: Candida alblcans.
d) Protozoák’.Trichomonas vaginalis.
Szepszis
a) Baktériumok:
Streptococcus β-haemolyticus (A-csoport), pneumococcusok, entérobacteriumok mint egységes csoport.
Élelmiszer-egészségügy:
. a) Baktériumok:
Salmonella és Clostridium perfringens,
A reagensek megválasztásától függően a vizsgálati módszer specifltása korlátozható egy meghatározott mikrobatörzs (például salmonellák) vagy egy egész mikrobacsoport (például enterobacteriaceae) azonosítására úgy, hogy a közös gén területéről származó reagenseket választunk ki az azonosítás céljára.
A találmányunkban leírt sandwich hibridizálási eljáráshoz szükséges nukleinsav reagenseket a rekombináns DNS-eljárással álltjuk eló. Az alábbi; akban leíquk az 1. példához szükséges reagens előállítását és a vizsgálati eljárást.
Reagensek
A KTL-ból, azaz a Helsinki-i Országos Közegészségügyi Intézetből (National Public Health Institute, Helsinki) származó 2. típusú adenovírust (ATCC VR—846) tenyésztettük, tisztítottuk és DNS-t izoláltunk (Pettérson, U. és Sambrock, J.Mol. Bioi, 73, 125 (1973)/. Ezt a DNS-t a következőkben Adj—DNS-sel jelöljük. A DNS-t BamHI restrikciós enzimmel (BRL, Bethesda Research Laboratories) emésztettük, amely e DNS-t négy, reprodukálható fragmentumra hasítja. E négy fragmentum közül kettőt T4~ligáz enzim ERL) segítségével a pBR322 vektor-plazmid 3BRL) BamHI-helyére építettünk be. Ligáció ^kapcsolás) előtt a framgentumokat nem különítettük el, hanem a plazmidhoz adott, beépített részt minden egyes esetben a klónozás után azono-, sítottuk. Ezt követően a gazdabaktériumot (E.' coli HB101 (K12) gal-, pro~, leu~, hrs-, hmv, recA, síri, F-; a KTL-bol kaptuk) rekombináns piazmidokat tartalmazó DNS plazmid-keverékkel, azaz olyan molekulákkal transzformáltuk, ame3
196 242 lyek befogadták'az adenovírus-DNS fragmentumait (Cohen, S. N. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972)). A transzformált kiónok közül kiválasztottuk azokat, amelyek a legnagyobb valószínűséggel tartalmazták a rekombináns plazmidot. Ampscillinnel és tetraciklinnel szemben rezisztenciát biztosító géneket a pHB322 plazmiddal vittünk át a baktériumra (Bolivár F. és munkatársai: Gene2, 95 (1977)). A rekombináns plazmidot tartalmazó baktériumok azonban a tetraciklinnel szemben érzékenyek, mivel a BamHIrestrikciós hely a tetraciklin-génen belül helyezkedik el, és az e területre beépülő idegen DNS a gént tönkreteszi. A plazmid beépülését a plazmid feldúsítása után ágy jellemeztük, hogy meghatároztuk a restrikciós fragmentumok nagyságát BamHI emésztés után, agaróz-gélen végzett elektroforézissel. Az Adj—DNA szomszédos BamHI D- és C-fragmentumait (vö. géntérkép) választottuk reagensekként (Söderlung, H. és munkatársai: Cell 7, 585 (1976)/. A kívánt rekombináns plazmidokat — ezek az Ad2C—pBR322, KTL No. E231 és AdD—pBR322, KTL, No. EH230 — az irodalomban leírt módon (Clewelí D. B. és Helínski, D. R.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159 (1969)) tenyésztettük és tisztítottuk.
Szúrón levő reagensként az AdjD—pBR322 rekombináns plazmidot használtuk. A jelenlegi alkalmazás céljára nem szükséges a plazmid-sze'kvenciák eltávolítása, mert a minta nem tartalmazott pBR322-szekvenciákat. A radioaktív jelzés céljára azonban BamHI-emésztés után pBR322— DNS-ből a nukleinsavat agaróz-gélen végzett elektroforézissel elválasztottuk. LGT-agarózról (Maríné Colloids, Inc.) A C-fragmentumot fenollal extrahálva vagy elektro-euálással (Wieslander, L.: Anal, Biochem. 98, 305 (1979)) elkülönítettük, és etanolos kicsapással koncentráltuk.
Különösen célszerű a jelzés céljára kiválasztott nukleinsavfragmentumnak külön vektorba való szubklónozása, hogy elkerüljük a háttér-hibridizálást, mely a jelzett nuklkeinsav reagenst szennyező, megmaradó plazmid szekvenciáknak a szűrővel végbemenő közvetlen hibridizálásából származik. Az M13 mp7 egyszálú DNS-fág (BRL), amelyre a BamHI emésztéssel kapott DNS-fragmentumokat könnyen át tudtuk vinni, optimális vektorként alkalmazható volt (Messing, J. és munkatársai: Nukleic Acids Rés. 9, 309 (1981)).
A DNS megkötése a szűrőn:
Az Ad2D—pBR3422 rekombináns plazmidot egyszálú formává denaturáltuk, és randomizáltan több helyen elmetszettük úgy, hogy 0,2 n nátronlúggal 100°C hőmérsékleten 5 percig kezeltük; azután a DNS-t lehútöttük, közvetlenül a szűrőre való átvitel előtt közömbösítettük, és bepipettáztuk az átvivő oldatba (4xSSC közeg jégen, az SSC jelentése 0,15mól/l NaCl, 0,015 mól/1 nátrium-citrát). A szűröket (Schleícher—SchülI BA85 nitrocelíulóz) alaposan átnedvesítettük a4xSSC oldattal, körülbelül 2 órán át a DNS ráviteíe előtt. A DNS-t híg oldatban (0,5—1,0 pg/ml) Úgy kötöttük a szűrőre, hogy az oldatot enyhe vákuum alkalmazásával átszívattuk a szűrőn. A szűrő alkalmas volt arra, hogy körülbelül 180 pg/cnWg terjedő mennyiségben megkösse a DNS-t (Kafatos, F. C. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 7, 1541 (1979)/. Kísérleteink során 0,5 pg DNS/2,5 cm szűrőátmérő és 1,0 pg DNS/0,7 cm szűrőátmérő közötti DNSkoncentrációkat alkalmaztunk. A DNS szűrése után a szűrőket 4xSSC oldatban megmostuk, szobahőmérsékleten megszárítottuk, végül 800°C hőmérsékleten 2 órán át vákuumban megszárítotθ tűk. E kezelés után a DNS a szűrőkön stabilis marad, és e szúrók szobahőmérsékleten hosszú időn át tárolhatók (Southern, Ε. M.: J. Mól. Bioi,
98,503 (1975).
A nukleinsavfragmentum radioaktív jelzése
Radioaktív jelzés céljából “U-izotópot használtunk. Ez az izotóp γ-számlálók alkalmazásával ?0 mérhető, és ezek a műszerek a legtöbb, nagyobb laboratóriumi egységben rendelkezésre állnak. Az izotóp felezési ideje 60 nap, ezért a mI-vel jelzett reagensek körülbelül 4 hónapig használhatók.
Jelzés „nick-translation (elmetszés és átvitel) segítségével
E módszer alapelve abban áll, hogy a nuklein30 savban levó nukleotidok egyikét radioaktív nukleotiddal helyettesítjük, és így az egész DNS-molekula jelzetté válik. E módszert Rigby P. S. J. és munkatársai eljárása szerint (J. Mól. Bioi. 113, 237 (1977)/ alkalmaztuk. A reakció során a DNS
S5 radioaktívan jelzetté válik, ha az oldat ^Jval jelzett dezoxi-nukleozid-trifoszfátot tartalmaz szubsztrátumként — a mi esetünkben ez ^J-dCTP (Radiochemical Centre, Amersham; >1500 Ci/ mmól). Optimális körülmények között KPcpm/ pg—DNS specifikus aktivitást értünk el. A jelzett DNS-t a nukleotidoktól — amelyek a reakcióelegyben maradtak — egyszerű gélszűréssel, például BioGel P30 (RioRad) alkalmazásával megtisztíttottuk.
Egyébb, jelzésre használt módszerek
Az M13 mp7-fágban termelődött, egyszálú nuk50 leinsavreagenst kémiai jódozással jelöltük: ennek során a 125J-izotóp kovalensen kötődött a nukleinsavhoz (Conunentord, S. L.; Biochemistry 10,1 1993 (1971); Orosz, 1 M. és Wetmur, J. G.: Biochemistry 13, 5467 (1974). A nukleinsavat egy másik módon úgy tettük radioaktívvá, hogy a terminális transzferáz enzim segítségével, radioaktív nukleotidok alkalmazásával végjelzést hajtottunk végre (Roychoudhury, R. és Wu, R.: Meth. Enzymol, 65,43 (1980)).
A reagens fentebb leírt előállítása olyan mikrobákra vonatkozik, amelyek genetikai anyaga DNS alakjában van jelen. RNS-vínisok esetében a genóma-frgmentumok klónozását úgy végeztük, hogy előbb előállítottuk a vírus-RNS DNS-másola65 tát (a következőkben cDNS) fordított (reverz) transzkriptáz enzim segítségével, ezután DNS-polimerázt alkalmaztunk a második DNS-szál máso-41
196 242 lására, és ezt kővetően a fentebb leírtak szerint a DNS-t klónoztuk (Salser, W.: a következő helyen: Genetic Engineering, kiadó A. M. Chakrabarty, CRC Press, 53-81. oldal (1979)).
A legalkalmasabb klónozási módszert a kérdéses mikrobától függően választjuk meg. A gazdaszervezetek és a vektorok variálhatók. Fennáll A-fág vektorként, további plazmidok, kozmidok és például Bacillus subtilis baktériumokban való klónozása alkalmazásának a lehetősége (Recombinant DNA, Benchmarck Papéra in Microbiology, 15. kötet, kiadók: K. J. Denniston és L. W. Enquist; Hutchinson és Ross, Inc. (1981)); IshHorowicz, D. és Bürke, J. F.: Nucleic Acids Rés. 9, 2989 (1981)).
A vizsgálat végrehajtása *
A minta kezelése
A vizsgálandó mikrobiális nukleinsavat a mikrobából és a fertőzött sejtekből fel keli szabadítani, és ezt követően egyszálú formává kell denaturálni. A vírus-genómák úgy szabadíthatók fel, hogy a minta anyagát 1%-os nátrium-dodecil-szulfáttal (a következőkben: SDS) kezeljük, majd a genómát védő fehérjéket proteináz-K kezeléssel elbontjuk (1 mg/ml, 37 °C, 60 percig). Ezenkívül a baktérium mintákat lizozim és etilén-diamin-tetraecetsavas (EDTA) kezeléssel le kell bontani.
Ha a minta nagy mennyiségben tartalmaz viszkózus, nagy molekulasúlyú sejt-DNS-t, akkor ezt néhány helyen el kell metszeni viszkozitásának csökkentése végett, például ultrahangos kezeléssel vagy úgy, hogy a mintát néhányszor egy finom tűn átnyomjuk.
A hibridizálás végezhető például 50%-os (ionmentesített, -20 °C hőmérsékleten tárolt) formamidban, 4xSSC Denhardt-oldattal (Denhardt, D.
T.: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 23, 641 (1966)/, amely 1% SDS-t és 0,5 mg/ml DNS-t tartalmaz (borjú-thymusből vagy lazac spermából). A hibridizálást 37°C hőmérsékleten, általában egy éjszakán át, 16—20 órás időtartammal végezzük. A vizsgálat céljára kiválasztott szűrőket alkalmas tartóedényben inkubáljuk, ehhez hozzáadjuk a hibridizáló keveréket, és a hibridizálást megindítjuk. A hibridizáló keverékek alkotó részei a következők: (a) az előkezelt minta, amelyhez hozzáadjuk a radioaktív nukleinsavreagens(eke)t, amelyeket előzőleg 5 perces forralással és 0°C-ra való gyors lehűtéssel denaturáltunk; (b) koncentrált formamid-, SSC- és Denhardt-oldatok, amelyeket az (a) alatt leírt denaturált és lehűtött nukleinsavkeverékbe pipettázunk. összekeverés után a hibridizáló keveréket a hibridizáló edényben lévő szűrökre pipettázzuk. Hibridizálás után a szűröket gondosan kimossuk, és egyenként γ-számlálóban vizsgáljuk.
A találmányt az alábbi gyakorlati példákban részletesen ismertetjük.
1. példa
Adenovírus kimutatása a sandwich hibridizálás’ eljárással (1. táblázat)
A vizsgálati eljárás részleteit az 1. táblázathoz megadott szövegrész világítja meg, e sandwich hiöridizálási eljárással kimutatható a vírus-DNS oldatban, azonban ugyanilyen megfelelően azonosítható fertőzött sejtekből származó vírus-genóma is.
A háttér-hibridizálást olyan csőben mérjük, amely csak a szűrőt és a jelzett nukleinsavreagenst tartalmazza, minta nélkül. A háttér-hibridizálást a je’zett nukleinsavreagensben jelenlevő pBR322 szekvenciák idézik élő. Ezek a szekvenciák közvetle lül hibridizálnak a szűrővel, a minta közreműködése nélkül. A vizsgálati eljárás során kontrollként boíjú-thymust tartalmazó DNS-t nem tartalmazó szűrőket használunk, ami egyrészt megmutatja a hibridizálás specifitását, másrészt a nem-specifikus háttér-hibridizálás erősségét (amely például a ki ne m elégítő mosás következménye).
Az alábbi táblázatokban a reagensek által előidézett háttér-hibridizálást a szűrökön végbemenő hibridizálás cpm-értékeiből levontuk.
1. Táblázat
Vizsgálat adenovírusra
Minta 1) Adeno- 2) Borjú- 3)Vaknovirus -thymus fféba
2. típusú adenovírus-DNS(BRL) (500 ng) 9000 49 AdenovírussalfertőzőttHeLa-sejtek(6xlOssejt) 8200 — —
Szűrők:
1) 2 pg AdjD—pBR322-plazmid
2) 1 pg boíjú-thymus-DNS (Boehringer Mannheim)
3) Vakpróba (DNS nélkül)
Jelzett nukleinsavreagens:
Tisztított Ad2—BamHI C-fragmentum, fajlagos aktivitása 90 x 106 cpm/p (200 000 cpm125 J/reakció).
Hibridizálás:
50%-os formamid, 4xSSC
0,5 mg/ml lazac sperma—DNS és 1% SDS-t tartalmazó Denhardt-oldat, °C, 16 óra
Mosás:
0,1% SSC, szobahőmérsékleten, 40 percig
Minták:
2. típusú adenovírus—DNS (BRL)
A 2. típusú adenovírussal való fertőzést HeLa>ejteken végeztük. Ezt követően a sejteket 1% 5
196 242
SDS-veí kezelve elroncsoltuk, majd 1 mg/ml proteináz—K enzimmel (Sigma) 30 percen át 37 °C hőmérsékleten emésztést végeztünk. Denaturálás előtt a mintát finom tűn vezettük át. A táblázatban található értékeket úgy kaptuk, hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttér-hibridizálási értéket levontuk.
2. példa
RNS-vírus kimutatása a sandwich hibridizálás segítségével (2. táblázat)
Semliki Forest vírust alkalmaztunk RNS-vírus modellként (prototípus-törzs, amelyet a Londoni Egyetem Egészségügyi és Trópusi Betegségekkel Foglalkozó Tanszékéről kaptunk), amelynek a genómája egyszálú RNS. A vírus-genómát templátként alkalmazva cDNS-t állítottunk eló, amelyet Garoff és munkatársai módszere szerint (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6376 (1980)/ a pBR322 plazmid PstI helyére klónoztunk. Az igy kapott rekombináns plazmid a pKTH312 KTL no, 232. E plazmádnak a vírus-genómából származó, beépült része körülbelül 1400 nukleotid hosszúságú, és a fehérje szerkezetének azon területéről származik, amely megközelítőleg a 200-adik nukieotidtól az 1600-adík nukleotidig terjed, ha a számozást a szerkezeti gének kezdetétől végezzük (Garoff, H. és munkatársai, 1980). A reagensek elkészítése végett a teljes rekombináns pKTH312 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel (BRL) linearizáltuk (a Senliki Forst vírusból származó szekvencia nem tartalmazza az EcoRI enzim felismerésére szolgáló helyeket), és a linearizált plazmidot Xhol enzim alkalmazásával (BRL) két fragmentumra hasítotttűk. Az utóbbiak restrikciós helye a Semliki Forest vírus szekvenciáján felül helyezkedett el. A nagyobbik EcoRI—Xhol A fragmentumot (ez körülbelül 3900 bázispárt tartalmazott) a szűrőkhöz kötöttük, és a kisebbik B fragmentumot (ez körülbelül 1850 bázispárt tartalmazott) a „nick translation” (elmetszés+átviteli) módszer felhasználásával ^J-izótoppal jeleztük.
E vizsgálatunk során mind a szabad Semliki Forest vírust, mind a vírussal fertőzött sejteket használjuk mintaként. A minta vírus-specifikus nukieinsavai mindkét esetben kizárólag RNS-ból álltak.
2. Táblázat
Semliki Forest vírus kimutatása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével ' ——~ — Sgfrflt (Cpm)
Minta 1) Semliki Forest vírus 2) Botjúthytnüs
Semliki Forest vírus (30 pg) 3340 —
Semliki Forest vírussal fertózött sejtek (5 X105) 2698 8
Nem fertózött sejtek 10 5
Szűrők:
1) 1,2 pg pKTH312 pkaztnidból származó tícoRI—Xhol A-fragmentum.
2) 1 pg boíjú-thymus -DNS
3) vakpróba (DNS nélkül) lelzett nukleinsavreagens:
pKTH312 plazmid EcoRI—Xhol B-fragmentuma, fajlagos aktivitása x lfr5 cpm/DNS pg/200000 cpm ,2SJ/reakció/
Hibridizálás:
Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.
Mosás:
Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.
Minták:
pg Semliki Forest vírust a vizsgálat előtt SDS alkalmazásával elroncsoltunk. A fertózött sejteket az 1. táblázatban adott leírás szerint kezeltük. A Semliki Forest vírussal való fertőzést BHK—21 sejteken végeztük.
A táblázatban található értékeket úgy kaptuk, hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttér-hibridizálási értékeket levontuk.
3. példa
Vírus-minta, melyben a vírus hírvivő (messenger) RNS-ét mutatjuk ki a sandwich hibridizálási eljárás segítségével (3. táblázat)
A sandwich hibridizálási reagenseket SV40-VÍrus-DNS-ból (BRL) állítottuk eló úgy, hogy a DNS-t két részre hasítottuk PstI enzim (Boehringer Mannheim) segítségével Lebowitz és Weissman (Curr. Topics in Microbiol, Immunoi. 87,43) leírása szerint, majd a fragmentumokat agaróz-gélen végzett elektroforézis segítségével elkülönítettük és tisztítottuk. Az Α-fragmentumot (mely 4000 bázispárt tartalmazott) a ^J-izotóp alkalmazásával, „nick translation” (elmetszés+átviteli), ; módszer segítségével ladioaktívan jeleztük, és a B-fragmentumot (mely 1220 bázispárt tartalmazott) kötöttünk a szűrőhöz.
A DNS-fragmentumokat úgy választottuk meg, \ hogy valamennyi tartalmazott mind korai, mind késői hírvivőket kódoló területeket. így például a B-fragmentum körülbelül 700, a VP1 szerkezeti fehérje-génjéből származó bázist, és több mint 600, korai hírvivők (messengerek) céljára szolgáló génből származó bázist tartalmazott. Mivel az SV40 vírust-DNS Önmagában egy kovalensen zárt gyűrű, ez linearizálás előtt vizsgálati eljárásunkkal nem volt kimutatható. Ezért amikor fertózött sejteket használtunk mintaként, lehetővé vált annak megvizsgálása, hogy módszerünk mennyire
196 242 kielégítően alkalmazható a vírus-genóma RNSmásolatainak kimutatására. A 3. táblázat eredményeiből látható, hogy eljárásunk kiválóan alkalmas fertőzött sejtek vizsgálatára. E táblázat arra is rámutat, hogy ugyanazon reagensek alkalmazhatók mind a vírus-DNS mind az abból előállított ír RNS vizsgálatára.
3. Táblázat
SV40 vírus kimutatása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével Szúrók (cpm)
Minta l)SV4óvfruí ,2) Borjú- 3) Vakpróba ________-Üiymus
7. Vizsgálat
Linearizált SV40 vírus DNS (50 mg) 20061 159 104
Minta nélkül — — —
2. Vizsgálat
SV40 vírussal fertőzött CV1 sejtek órával a fertőzés után (106 sejt) 308.4 294 580
Nem fertőzött sejtek — — —
Szűrők:
1) Pstl restrikciós enzimmel emésztett SV40 vírus cirkuláris DNS-éből származó, rövidebb Pstl B-fragmentum(0,2 gg)
2) 1 gg boíjú-thymus-DNS
3) Vakpróba (DNS nélkül)
Jelzett nukleinsavreagens:
Az SV40 vírus-DNS-ből származó hosszabb Pstl A-fragmentum, fajlagos aktivitása 28 x 106 cpm/ggDNS (200 000 cpm U5J/reakció). ·
Hibridizálás:
Az 1. táblázathoz adott leírás szerint; a hibridizálás időtartama 4Ö óra volt.
Mosás:
Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.
Minták:
SV40 vírus-DNS-t (BRL) EcoRI restrikciós enzimmel (BRL) linearizáltunk. CV1 sejteket (Orvosbiológiai Központ, Upsala-i Egyetem) SV40 vírussal (Janice Y. Chou és Róbert G. Martini, Bethesda) fertőztünk, és a fertőzés után 40 órával a sejteket összegyűjtöttük. A mintát az 1. táblázathoz adott leírás szerint kezeltük.
A táblázatban található értékeket úgy kaptuk, hegy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttér-hibridizálási értéke< két levontuk,
4. példa
Bacillus amyloliquefaciens kimutatása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével (4. táblázat)
A reagensek a B. amyloliquefaciens E18 (Finn30 országi Műszáki Kutatóközpont, Vi l*) a-amiláz génjének fragmentumai voltak, amelyeket a vizsgálat céljára a pKTHIO rekombináns plazmidból (Falva, I. és munkatársai: Gene, 75, 43 (1981)) különítettük el úgy, hogy restrikciós enzimmel 35 kezeltük, és ezt követően agaróz gélen elektroforézist végeztünk. Vizsgálatunk céljára alkalmazott fragmentumok és α-amiláz gén Clal—EcoRI frag, mentum-területe (460 bázispár) (Clal; Boehringer Mannheim) és az EcoRI—BamHI fragmentum 4θ vcltak (1500 bázispár). Az EcoRI—BamHI fragmentumot kötöttük a szűrőhöz, és a Clal—EcoRI fragmentumot ^J-izotóppal, „nick translation” (emetszés +átviteli) módszer segítségével radioaktívan jeleztük.
A 4. táblázatból látható, hogy a B. amyloliquefaciens a mintában sandwich hibridizálási eljárással, az egyedüli α-amiláz gén alapján azonosítható volt. A vizsgálat során az E. coli negatív eredményt adott (a háttérből nem volt megkülönböztethető).
4. Táblázat
Baktériumok azonosítása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével Szúrók (cpm)
Minta 1) o-amíláz 2) Borjú- 3) Vakpróba -thymus
pKTH19plazmid-DNS,
linearizált (1 pg) 5773 47
Minta nélkül — — —
E. coli HB101 (10*sejt) — — —
Bacillus amyloliquefaciens
(3x10* sejt) 3377 — —
Bacillus amyloliquefaciens
(KP sejt) 2871 — —
196 242
Szűrök:
pKTHIO plazmidból származó α-amiláz gén EcoRI-BamHI fragmentuma (0,35 pg)
2) 1 pg boíjú-thy mus-DNS
3) Vakpróba (DNS nélkül)
Jelzett nukleinsavreagens:
A pKTHIO plazmidból származó α-amiláz gén Oal—EcoRI fragmentuma, fajlagos aktivitása 35x10® cmp/pg/200000 cpm ^JAreakció.
Hibridizálás:
Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.
Mosás:
Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.
Minták:
A baktériummintákat 67 pg/ml Iizozimmel 37 °C hőmérsékleten 30 percig kezeltük; az E coli. mintákhoz 5 mmól EDTA-reagenst is adtunk. E kezelés után az összes mintához SDS-t adtunk (végkoncentrációja 2%), és a mintákat kétszer egy finom tűn vezettük át viszkozitásuk csökkentése végett, majd forralással denaturáltuk, ahogyan ezt a minták kezelésére vonatkozó szövegrészben leírtuk.
5.
A táblázatban található értékeket úgy kaptuk, hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttér-hibridizálási értékeket levontuk.
5. példa
Példa a sandwich hibridizáldsi eljáráson alapuló reagenskombináciő-készletre (5. táblázat) 10 E vizsgálatunkban alkalmazott minták háromféle vírussal (adenovfrus, SV40 vírus és Herpes simplex) fertőzött sejtek voltak, továbbá egy olyan minta, amely Bacillus amyloliquefaciens baktériumokat tartalmazott. Egyidőben minden egyes min15 tához hozzáadtuk az alább következő reagenseket: négy szűrót, amelyet az SV40 vírusból, adenovírus ból, Bacillus amyloljque&eiens'a-amiláz génből és borjú-thynusból származó DNS egyikét tartalmazták, továbbá egy DNS-t tartalmazó szű2Q rőt; ezt követően hozzáadtuk a következő, jelzett nukleinsav-reagenseket (200000cpm fajlagos aktivitással): SV40 vírus-, adenovfrus- és a-amiláz gén-DNS-reagens.
Példánk azt mutatja, hogy lehetséges a minta felosztása és hígítása nélkül a mikróbák alkalmas sorozatának egyidejű vizsgálata úgy, hogy amintához reagenskombinációt adunk. A minta mind vírusból, mint baktériumból származó nukleinsavat tartalmazhat. A szúrók megjelölhetők (dmké30 vei, befogószerkezettel), és ezzel azonosítható az a szekvencia, amelyet a szűrő tartalmaz és az a mikroba, amely a szűrőre kötődik (hibridizál). A szűrők jelölhetők számokkal vagy betűkkel, például: 1 vagy SV40,2 vagy Ad, stb. vagy más jelzésekkel, például λ SV40 esetében; Δ Ad esetében; _ :at
A szűrők hibridizáíási eljáráson alapuló készlet
Szúrók (cpm)
Minta 1) SV40 2) Adenovírus 3) α-amiláz 4) Borjúthymus 5) Vakpróba
SV40 vírussal fertőzött sejtek
/10® sejti 18 390 2 13 22 31
2. típusú adenovírussal
ferózött sejtek (6x 10® sejt) 8750 5 13 —
Herpes simplex vírussal
fertőzött sejtek (10® sejt) — — — 5 13
Bacillus amyloliquefaciens
(1(P sejt) 15 8 6500 16 5
Nem fertőzött sejtek — az. ι· ,·ίϋΐτ — - —
Szűrők: α-amiláz gén: a 4. táblázathoz adott leírás szerint. Hibridizálás:
1) A 3. táblázathoz-adott leírás szerint. 2) Az 1. táblázathoz adott leírás szerint. 55
3) A 4. táblázathoz adott leírás szerint.
4) 1 pgborjú-thymus-DNS Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.
5) Vakpróba (DNS nélkül) 60 Mosás:
Jelzett nukleinsavreagensek: Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.
SV40 vírus: a 3. táblázathoz adott leírás szerint, 65 Minták:
Adenovírus: az 1. táblázathoz adott leírás sze-
rint, Az SV40 vírussal, illetve adenovírussal fertőzött
196 242 sejtmintákat a 3., illetve 1. táblázathoz adott leírás szerint kaptuk.
106 Verő sejtet 1. típusú Herpes simplex vírussal fertőztünk. A sejteket a fertőzés után 20 órával gyűjtöttük össze, amidőn a cytopathiás (sejtre 5 ártalmas) hatást már megfigyelhettük. A mintát a következőkben úgy kezeltük, ahogyan azt az adenovírusokkal fertőzött sejtek esetére leírtuk (az 1. táblázathoz adott leírás szerint).
Bacillus amyloliquefaciens minta:
A 4. táblázathoz adott leírás szerint.
A táblázatban megadott értékeket úgy kaptuk, 15 hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttéohibridizálási értékeket levontuk.
6. példa
Escherichia coli kimutatása a saruhvlch hibridizálási eljárás segítségével (6, táblázat)
A reagenseket az Escherichia coli ompA-génjé- 25 bői (külső membránfehérje A-gén) állítottuk elő.
A kiinduló anyagként használt pKTH40 és pKTH45 hibrid plazmidokat a Henning és munkatársai által leírt pTUlOO plazmidból készítettük (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,4360 (1979)/. 30
A szfirőreagensként alkalmazott pKTH45 plazmid (Országos Közegészségügyi Intézet, Helsinki,
No. EH 254 számmal letétbe helyezve) 740 bázispárt tartalmazott a pBR322 plazmidba beépített ompA-gén 5'-terminálisából. 35
A pKTH40 plazmid 300 bázispárt tartalmazott az ompA-gén 3'-terminálisából és közvetlenül ezután 1400 bázispárt az E. coli genómájából.
A pKTH40 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel hasítottuk az E. coli DNS-fragmentumának 40 előállítása végett, amely a fentebb említett 1700 bázispárt tartalmazta. E fragmentumot az M13mp7 egyszálú bakteriofágra vittük át Messing és munkatársai módszerével (Nucl. Acids Rés. 9, 309, (1981)/, valamint Heidecker és munkatársai (Gene 45 10, 69 (1980)/, továbbá Grandner és munkatársai (Nucl. Acids Rés. 9,2871 (1981)/ eljárásai szerint.
Az mKTH1207 rekombináns fágot (Országos Közegészségügyi Intézet, Helsinki, No. EH 256 számmal letétbe helyezve) a fentebb leírtak szerint ςθ („Egyéb, jelzésre használt módszerek”) “J-izotóppal jelöltük és így alkalmaztuk a sandwich hibridizálási eljárás során.
A 6. táblázat mutatja, hogy elroncsolt E. coli sejtekből származó DNS, valamint E. coli-ból 55 származó, elkülönített, tisztított DNS kimutatható a sandwich hibridizálási eljárással.
6. Táblázat
Escherichia coli kimutatása a sandwich hibridizálási eljárással
Minta SzúrAk (cpm) J
1) ompA 2) Borjú-thymus 3) Vakpróba
E.coliK12 HB 101 DNS
a) 2xl(F E. colt K12 HB101DNS 282
a) 2X10» E.COÜK12 HB 101 sejtek 2206
b) 2x10» E. coliK12 HB 101 sejtek 1113
b) 2x10» a) a DNS-molekulák száma b) a sejtek száma 2327 12 5
Szűrők:
1) 1,088 pg pKTH45 plazmid (2 X1011 molekula)
2) 1,088 pg boijú-thymus-DNS
3) Vakpróba (NDS nélkül)
Jelzett nukleinsavreagensek:
mKTH1207, fajlagos aktivitás 8X1O7 cpm/pgDNS (200 000 cmp/reakció)
Hibridizálás:
4xSCC, lxDenhardt-oldat szarvasmarha-szérumalbumin nélkül, 0,25% SDS, 200 pg/ml heringsperma-DNS, 17,5 óra 65 C hőmérsékleten.
Mosás:
Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.
Minták:
Az E coli. K12 HB101 DNS-t a Marmur-eljárással különítettük el /(J. Mól. Bioi, 3,208 (1961)/, és a DNS-t 7 mmól-os nátronlúggal 100 °C hőmérsékleten 5 percig denaturáltuk.
A sejteket 500 μ/ml lizozimmel, majd EDTA-val (70 mmólos, 37 °C hőmérsékleten 30 percig), SDSvel (0,25% 65 °C hőmérsékleten) kezeltük, és a szabad DNS-t 134 mmólos nátronlúggal 100 °C hőmérsékleten 5 percig melegítve denaturáltuk. .
196 242
A táblázatban megadott értékeket úgy kaptuk, hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott reagens-háttér-hibridizálási értékeket levontuk.

Claims (8)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás mikrobáknak vagy mikrobacsoportoknak nukleinsavak szilárd hordozón végbemenő sandwich hibridizálásán alapuló azonosítására, melynek során két különböző, közös szekvenciával nem rendelkező, de az adott mikroba vagy mikrobacsoport genómájában előnyösen egymáshoz közel elhelyezkedő nukleinsavreagenst alkalmazunk az adott mintában jelenlevő mikroba vagy mikrobacsoport azonosítására, amely nukleinsavreagensek egyike egy szilárd hordozóhoz kötött, egyszálú nukleinsavfragmentum, a másik pedig egy megfelelő jelzéssel ellátott, egyszálú nukleinsavfragmentum, azzal jellemezve, hogy a különböző mikrobák vagy mikrobacsoportok egyidejű azonosítására nukleinsavreagensek sorozatát hozzuk érintkezésbe az osztatlan mintában levő, összes mikrobák és mikrobacsoportok nukleinsavaival úgy, hogy a mintából származó nukleinsavákat előbb ismert módon egyszálúvá alakítjuk, majd a szilárd hordozóhoz kötött, komplementér nukleinsav-fragmentumokkal hibridizáljuk, ugyanakkor a hordozóhoz kötött hibrideket a minta nukleinsavainak és a jelzett nukleinsav-fragmentumoknak az összeforrasztása következtében jelzettekké tesszük, majd a hordozóhoz kötődő jelzés erősségét megmérjük,
  2. 2. Reagenskombinációk sorozata, az 1, igénypont szerinti eljárás megvalósítására azzál jellemezve, hogy minden egyes azonosítandó mikroba vagy mikíobacsoport számára két nukleinsavreagenst tartalmaz, az előnyösen egymáshoz közeli helyekről származó egyszálú, csoport vagy fajspecifikus nukleinsavfragmentumok egyike szilárd hordozóhoz van kötve, míg a másik megfelelő jelzéssel van ellátva.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti regenskombinációk sorozata, azzal jellemezve, hogy adenovírus azonosítására szilárd hordozóhoz kötött nukleinsavreagensként az adenovírus rekombináns AD2—DpBR322 plazmidját, jelzett nukleinsavreagensként pedig az adenovírus At^—BamHI Cfragmentumát tartalmazza.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti reagenskombinációk sorozata, azzal jellemezve, hogy Sémiiké Forest
  5. 5 vírus azonosítására szilárd hordozóhoz kötött nukleinsavreagensként a pKTH312 plazmid EcoRI— Xhol A-fragmentumát, jelzett nukleinsavreagensként pedig a pKTH312 plazmid EcoRI—Xhol B-fragmentumát tartalmazza.
    10 5, A 2. igénypont szerinti reagenskombinációk sorozata, azzal jellemezve, hogy SV40 vírus azonosítására szilárd hordozóhoz kötött nukleinsavreagensként az SV40 vírus PstI B-fragmentumát, jelzett nukleinsavreagensként pedig az SV40 vírus
    15 PstI A-fragmentumát tartalmazza.
  6. 6. A 2. igénypont szerinti reagenskombinációk sorozata, azzal jellemezve, hogy Bacillus amylollquefaciens azonosítására szilárd hordozóhoz kötött nukleinsavreagensként a Baecillus amyloliqu20 efaeiens pKTHIO plazmid α-amiláz génjének EcoRI-BamHI fragmentumát, jelzett nukleinsavreagensként pedig a Bacillus amyloliquefadens pKTHIO plazmid α-amiláz génjének Clal-EcoRI fragmentumát tartalmazza. ,
    25
  7. 7. A 2. igénypont szerinti reagemskombinációk , sorozata, azzal jellemezve, hogy E. coli azonosítására szilárd hordozóhoz kötött nukleinsavreagensként pKTH45 plazmidot, és jelzett nukleinsavreagensként mKTH1207 rekombinációs fágot tartal30 máz.
  8. 8. A 2., 3., 5. és 6. igénypontok bármelyike szerinti reagenskombinációk sorozata, azzal jellemezve, hogy egy ugyanazon — különöző mikrobákból eredő nukleinsavakat tartalmazó — mintá35 ból származó különböző mikrobák, vírusok és baktériumok, úgy mint adenovírus, SV40 vírus és Bacillus amyioliquefaciens azonosítására és megkülönböztetésére a kombináció szilárd hordozóhoz kötött nukleinsavregensként az adenovírus
    4θ Ad2—DpBR322 rekombináns plazmidját, az SV4Q \ írus PstI B-fragmentumát és a Bacillus amyloliquefaciens pKTHIO plazmid α-amiláz génjének EcoRI-BamHI fragmentumát, jelzett nukleinsavreagensekként pedig az adenovírus Adj—BamHI
    45 C-fragmentumát, az SV40 vírus PstI A-fragmentumát és a Bacillus amyioliquefaciens pKTHIO plazmid α-amiláz génjének Clal-EcoRI fragmentumát tartalmazza.
HU823529A 1981-10-16 1982-09-29 Process and reagent combination for identifying microorganisms by sandwich-hybridization of nucleic acids HU196242B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI813251A FI63596C (fi) 1981-10-16 1981-10-16 Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
PCT/FI1982/000038 WO1983001459A1 (en) 1981-10-16 1982-09-29 A method and reagent combination for the diagnosis of microorganisms by sandwich hybridization of nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU196242B true HU196242B (en) 1988-10-28

Family

ID=8514776

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU823529A HU196242B (en) 1981-10-16 1982-09-29 Process and reagent combination for identifying microorganisms by sandwich-hybridization of nucleic acids

Country Status (13)

Country Link
US (2) US4486539A (hu)
EP (2) EP0098267A1 (hu)
JP (2) JPS58501703A (hu)
AT (1) ATE31735T1 (hu)
AU (1) AU548854B2 (hu)
CA (1) CA1192120A (hu)
DE (2) DE79139T1 (hu)
DK (1) DK173744B1 (hu)
FI (1) FI63596C (hu)
HU (1) HU196242B (hu)
RO (1) RO86356B (hu)
SU (1) SU1386031A3 (hu)
WO (1) WO1983001459A1 (hu)

Families Citing this family (340)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
US5288611A (en) * 1983-01-10 1994-02-22 Gen-Probe Incorporated Method for detecting, identifying, and quantitating organisms and viruses
US5723597A (en) * 1983-01-10 1998-03-03 Gen-Probe Incorporated Ribosomal nucleic acid probes for detecting organisms or groups of organisms
US5567587A (en) * 1983-01-10 1996-10-22 Gen-Probe Incorporated Method for detecting, the presence and amount of prokaryotic organisms using specific rRNA subsequences as probes
US4689295A (en) * 1983-01-20 1987-08-25 Integrated Genetics, Inc. Test for Salmonella
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US4948882A (en) * 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
EP0135587B2 (en) * 1983-02-22 2002-12-18 Syngene, Inc. Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis
IL71064A (en) * 1983-02-28 1989-10-31 Lifecodes Corp Paternity and forensic test involving analysis of dna polymorphic genetic regions
US5593832A (en) * 1983-02-28 1997-01-14 Lifecodes Corporation Method for forensic analysis
CA1228811A (en) 1983-05-05 1987-11-03 Robert G. Pergolizzi Assay method utilizing polynucleotide sequences
CA1222680A (en) * 1983-07-05 1987-06-09 Nanibhushan Dattagupta Testing dna samples for particular nucleotide sequences
US4959309A (en) * 1983-07-14 1990-09-25 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4737454A (en) * 1983-07-14 1988-04-12 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
CA1231303A (en) * 1983-08-05 1988-01-12 Robert J. Carrico Detection of bacteria by nucleic acid hybridization
US5539097A (en) * 1983-09-02 1996-07-23 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide polymeric support system
JPS6091999A (ja) * 1983-10-25 1985-05-23 Fujirebio Inc ポリヌクレオチドの測定方法
GB8331071D0 (en) * 1983-11-22 1983-12-29 Karayiannis P Assay for dna/rna
US4724202A (en) * 1983-12-12 1988-02-09 Molecular Diagnostics, Inc. Use of non-hybridizable nucleic acids for the detection of nucleic acid hybridization
IL73577A (en) * 1983-12-12 1989-10-31 Miles Lab Method and reagent system for detecting dna or rna sequences in a test medium containing single stranded dna or rna using antibodies to intercalation complexes with double stranded nucleic acid
US4777129A (en) * 1983-12-12 1988-10-11 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein
US4849208A (en) * 1984-01-30 1989-07-18 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
US4843122A (en) * 1984-01-30 1989-06-27 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
US4707440A (en) * 1984-01-30 1987-11-17 Enzo Biochem, Inc. Nucleic acid hybridization assay and detectable molecules useful in such assay
US4943523A (en) * 1984-01-30 1990-07-24 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
US5002885A (en) * 1984-01-30 1991-03-26 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method preparation and use
US4849505A (en) * 1984-01-30 1989-07-18 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
FI71768C (fi) * 1984-02-17 1987-02-09 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.
CA1223222A (en) * 1984-02-22 1987-06-23 Nanibhushan Dattagupta Immobilized nucleic acid-containing probes
DE3583640D1 (de) * 1984-04-05 1991-09-05 Florey Howard Inst Hybridisierungs-histochemie.
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US5288609A (en) * 1984-04-27 1994-02-22 Enzo Diagnostics, Inc. Capture sandwich hybridization method and composition
US6221581B1 (en) * 1984-04-27 2001-04-24 Enzo Diagnostics, Inc. Processes for detecting polynucleotides, determining genetic mutations or defects in genetic material, separating or isolating nucleic acid of interest from samples, and useful compositions of matter and multihybrid complex compositions
US4766064A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit
US4766062A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor
US4670380A (en) * 1984-05-23 1987-06-02 Molecular Diagnostics, Inc. Assays utilizing labeled nucleic acid probes
US5132206A (en) * 1984-06-11 1992-07-21 Dreyer William J Fluorescent pigments for tagging biological molecules
US4749647A (en) * 1984-06-22 1988-06-07 Genetic Systems Corporation Polymerization-induced separation assay using recognition pairs
FR2567541B1 (fr) * 1984-07-13 1987-02-06 Pasteur Institut Sonde d'adn et procede pour la detection de " shigelles " et des souches entero-invasives de escherichia coli
US4755458A (en) * 1984-08-30 1988-07-05 Enzo Biochem, Inc. Composition and method for the detection of the presence of a polynucleotide sequence of interest
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US5955261A (en) * 1984-09-04 1999-09-21 Gen-Probe Incorporated Method for detecting the presence of group-specific viral mRNA in a sample
US4775619A (en) * 1984-10-16 1988-10-04 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US5430136A (en) * 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4820630A (en) * 1984-11-23 1989-04-11 Digene Diagnostics, Incorporated Assay for nucleic acid sequences, particularly genetic lesions, using interactive labels
US4734363A (en) * 1984-11-27 1988-03-29 Molecular Diagnostics, Inc. Large scale production of DNA probes
US5242794A (en) * 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
GB2179448B (en) * 1984-12-19 1989-06-07 Blair Malcolm A D Improved sandwich hybridisation technique for the detection of nucleotide sequences
GB8432118D0 (en) * 1984-12-19 1985-01-30 Malcolm A D B Sandwich hybridisation technique
US4670379A (en) * 1984-12-19 1987-06-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide hydridization assays employing catalyzed luminescence
FI72146C (fi) * 1985-01-02 1987-04-13 Orion Yhtymae Oy Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror.
US4785086A (en) * 1985-01-17 1988-11-15 Integrated Genetics, Inc. Test for Campylobacter
US5851767A (en) * 1985-03-04 1998-12-22 The Regents Of The University Of California Detection of prokaryotic organism by DNA hybridization
US4792519A (en) * 1985-03-05 1988-12-20 International Technology Corporation Method for the monitoring and control of microbial populations
US5217866A (en) * 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5470974A (en) * 1985-03-15 1995-11-28 Neu-Gene Development Group Uncharged polynucleotide-binding polymers
US6197563B1 (en) 1985-03-28 2001-03-06 Roche Molecular Systems, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
US6040166A (en) 1985-03-28 2000-03-21 Roche Molecular Systems, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences, including a probe
EP0200113A3 (en) * 1985-04-30 1987-03-18 Pandex Laboratories, Inc. A method of solid phase nucleic acid hybridization assay incorporating a luminescent label
ES8707343A1 (es) * 1985-06-13 1987-07-16 Amgen Un metodo para aislar una secuencia de acido nucleico objetivo seleccionada
US4751177A (en) * 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
US5641630A (en) * 1985-06-13 1997-06-24 Amgen Inc. Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays
US5273882A (en) * 1985-06-13 1993-12-28 Amgen Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays
AU558846B2 (en) * 1985-06-21 1987-02-12 Miles Laboratories Inc. Solid-phase hydridization assay using anti-hybrid antibodies
US4831125A (en) * 1985-07-01 1989-05-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company DNA probe for corynebacterium kutscheri
US4824776A (en) * 1985-07-25 1989-04-25 Molecular Biosystems, Inc. Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays
US5155216A (en) * 1985-08-15 1992-10-13 Amoco Corporation Nucleic acids labeled with a chemiluminescent acridine ester
US4868104A (en) * 1985-09-06 1989-09-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Homogeneous assay for specific polynucleotides
US5595908A (en) * 1985-09-26 1997-01-21 University Of Southern Mississipi Piezoelectric device for detection of polynucleotide hybridization
EP0244471A4 (en) * 1985-10-24 1988-01-28 Siska Diagnostics Inc NUCLEIC ACID SAMPLES MARKED WITH LANTHANIDE CHELATE.
US5258283A (en) * 1985-11-05 1993-11-02 Battelle Memorial Institute Detection and differentiation of coxiella burnetii in biological fluids
US4876186A (en) * 1985-11-05 1989-10-24 Battelle Development Corporation Detection and differentiation of coxiella burnetii in biological fluids
JPS63502477A (ja) * 1985-12-03 1988-09-22 エル・ギユ−リイ・エム・ラフアツト 病気診断のための方法、装置および製品
US4910300A (en) * 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
JP3293820B2 (ja) * 1985-12-13 2002-06-17 エンゾ− バイオケム インコ−ポレイテツド 標的ポリヌクレオチドにハイブリツド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物
FI76119C (fi) * 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
US4968602A (en) * 1986-03-05 1990-11-06 Molecular Diagnostics, Inc. Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
US4925785A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5242823A (en) * 1986-03-07 1993-09-07 International Genetic Engineering, Inc. Cloning of the 38kd Mycoplasma hyorhinis regression-associated antigen
EP0250662B1 (en) * 1986-06-25 1994-08-24 The Regents Of The University Of California Detection of mycoplasma by DNA hybridization
JP2534529B2 (ja) * 1986-07-24 1996-09-18 ブリティシュ・テレコミュニケ−ションズ・パブリック・リミテッド・カンパニ 放射発生器
DE3785658T2 (de) * 1986-08-11 1993-08-12 Siska Diagnostics Inc Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden.
US5849478A (en) * 1986-08-14 1998-12-15 Cashman; Daniel P. Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit
US4917999A (en) * 1986-09-02 1990-04-17 Miles Inc. Oligonucleotide probes for detection of α-amylase genes
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
US7087742B1 (en) 1986-11-24 2006-08-08 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US6150517A (en) 1986-11-24 2000-11-21 Gen-Probe Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US7138516B1 (en) 1986-11-24 2006-11-21 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5541308A (en) * 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5994059A (en) * 1986-11-24 1999-11-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and methods for detecting Streptomyces enterococci
US4946786A (en) * 1987-01-14 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5266466A (en) * 1987-01-14 1993-11-30 President And Fellows Of Harvard College Method of using T7 DNA polymerase to label the 3' end of a DNA molecule
US4942130A (en) * 1987-01-14 1990-07-17 President & Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5145776A (en) * 1987-01-14 1992-09-08 President & Fellows Of Harvard College Method of using T7 DNA polymerase to mutagenize and fill-in DNA
US4994372A (en) * 1987-01-14 1991-02-19 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing
US4795699A (en) * 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5599667A (en) * 1987-03-02 1997-02-04 Gen-Probe Incorporated Polycationic supports and nucleic acid purification separation and hybridization
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
CA1317860C (en) * 1987-04-01 1993-05-18 Daniel Louis Kacian Techniques for preparing specimens for bacterial assays
US5225324A (en) * 1987-04-24 1993-07-06 Bioscience International, Inc. Diagnostics for mycobacteria in public health, medical, and veterinary practice
GB8709803D0 (en) * 1987-04-24 1987-05-28 Mcfadden J J Treatment of crohn's disease &c
US4994368A (en) 1987-07-23 1991-02-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
US5273879A (en) * 1987-07-23 1993-12-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
DE3851810T2 (de) * 1987-07-31 1995-02-09 Gen Probe Inc Polynukleotidentest unter Benutzung von Oligonukleotiden zur Eliminierung von unerwünschten Kreuzreaktionen.
US5089386A (en) * 1987-09-11 1992-02-18 Gene-Trak Systems Test for listeria
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
US5656731A (en) * 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
AU2714988A (en) * 1987-10-23 1989-06-01 Siska Diagnostics, Inc. Lanthanide chelate-tagged nucleic acid probes
US6013531A (en) * 1987-10-26 2000-01-11 Dade International Inc. Method to use fluorescent magnetic polymer particles as markers in an immunoassay
US6348332B1 (en) 1987-11-24 2002-02-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill DNA molecule encoding gonorrhoeal hybrid PIA/PIB protein
CA1340506C (en) * 1987-11-24 1999-04-20 Nicholas H. Carbonetti Production of gonorrheal pi proteins and vaccines
ATE133454T1 (de) * 1987-12-01 1996-02-15 Amoco Corp Nachweis von salmonella
US5354657A (en) * 1988-01-12 1994-10-11 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the highly specific detection of nucleic acids in solid
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US20050019760A1 (en) * 1988-03-05 2005-01-27 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
US7811751B2 (en) 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5024933A (en) * 1988-05-10 1991-06-18 Enzo Biochem, Inc. Method and kit for sample adherence to test substrate
ATE114726T1 (de) * 1988-05-10 1994-12-15 Du Pont Verfahren zum schnellen nachweis von nukleinsäuren.
US5294533A (en) * 1988-07-05 1994-03-15 Baylor College Of Medicine Antisense oligonucleotide antibiotics complementary to the macromolecular synthesis operon, methods of treating bacterial infections and methods for identification of bacteria
US5047523A (en) * 1988-08-02 1991-09-10 Ortho Diagnostic Systems Inc. Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
WO1990006372A1 (en) * 1988-12-01 1990-06-14 Microprobe Corporation Substrates for peroxidase assaying
US7172863B1 (en) 1988-12-09 2007-02-06 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
US5324829A (en) * 1988-12-16 1994-06-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties
CA2005927A1 (en) * 1988-12-21 1990-06-21 Chander Bahl Method of preparing nucleotide probes using a bridging complement
US5237016A (en) * 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US5514550A (en) * 1989-02-03 1996-05-07 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid
CA2009708A1 (en) * 1989-02-13 1990-08-13 Jane D. Madonna Nucleic acid probe for the detection of salmonella human pathogens
US5856092A (en) * 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
US5049489A (en) * 1989-04-17 1991-09-17 The Standard Oil Company 16S rRNA oligonucleotide probes for the identification of sulfate-reducing bacteria
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6955915B2 (en) * 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US6040138A (en) * 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US6919211B1 (en) * 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6379895B1 (en) 1989-06-07 2002-04-30 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US5925525A (en) * 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
EP0405592A3 (en) * 1989-06-30 1991-07-17 Sanyo Chemical Industries Ltd. A method for detection of nucleic acid and reagents for their detection
US5106730A (en) * 1989-07-24 1992-04-21 Microprobe Corporation Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
CA2028012A1 (en) * 1989-10-23 1991-04-24 Randall Dimond Hybridization assay for campylobacter rrna
GB8924989D0 (en) * 1989-11-06 1989-12-28 Scotgen Ltd Method and device for the detection of antibiotic resistance
JP2589618B2 (ja) * 1989-12-14 1997-03-12 デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド 磁気応答性螢光ポリマー粒子及びその利用
CA2032203C (en) * 1989-12-29 2009-05-19 Christine L. Brakel Amplification capture assay
US5721097A (en) * 1990-02-02 1998-02-24 N. V. Innogenetics S.A. Hybridization probes for the detection of branhamella catarrhalis strains
AU7188491A (en) * 1990-02-02 1991-08-21 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes for the detection of (branhamella catarrhalis) strains
US6013431A (en) * 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
US5200314A (en) * 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
AU7429591A (en) * 1990-04-18 1991-10-24 Gene-Trak Systems Nucleic acid probes for the detection of giardia lamblia
HUT64623A (en) * 1990-05-04 1994-01-28 Chiron Corp Protein and nucleinic acid samples and immunic essays containing them
US5670316A (en) * 1990-05-07 1997-09-23 Daikin Industries, Ltd. Diagnostic applications of double D-loop formation
US5232830A (en) * 1990-05-11 1993-08-03 Microprobe Corporation Intrinsic fluorescent quenching methods
US5695926A (en) * 1990-06-11 1997-12-09 Bio Merieux Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
WO1992001471A1 (en) * 1990-07-24 1992-02-06 The Uab Research Foundation Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins vaccines, antibodies, and transformed cells
US6730305B1 (en) 2000-05-08 2004-05-04 The Uab Research Foundation Nucleotide sequences encoding bovine respiratory syncytial virus immunogenic proteins
IL99025A0 (en) * 1990-08-15 1992-07-15 Astra Ab Novel process for the detection of pathogens using dna probes
WO1992008808A1 (en) * 1990-11-14 1992-05-29 Siska Diagnostics, Inc. Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
WO1992010588A1 (en) * 1990-12-06 1992-06-25 Affymax Technologies N.V. Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides
USH1398H (en) * 1990-12-28 1995-01-03 Campbell; James R. DNA-based fluourescent sensor
EP0497464A1 (en) * 1991-01-31 1992-08-05 Amoco Corporation Rapid microbial diagnostics by in situ hybridization in aqueous suspension
ES2108109T3 (es) * 1991-02-14 1997-12-16 Dade Microscan Inc Nuevos oligonucleotidos conjugados con quelatos de lantanidos.
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
EP0533952A4 (en) * 1991-04-15 1993-07-07 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Process for separating or extracting nucleic acid from specimen containing the same
US5556748A (en) * 1991-07-30 1996-09-17 Xenopore Corporation Methods of sandwich hybridization for the quantitative analysis of oligonucleotides
ATE161586T1 (de) 1991-10-11 1998-01-15 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung eines polynukleotids zum gebrauch in ''single-primer'' amplifizierung und phosphorothioat-enthaltende oligonukleotide als primer in nukleinsäureamplifizierung
US5612199A (en) * 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US6652808B1 (en) * 1991-11-07 2003-11-25 Nanotronics, Inc. Methods for the electronic assembly and fabrication of devices
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6017696A (en) 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US5849486A (en) 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US6048690A (en) * 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US5632957A (en) * 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US6569382B1 (en) 1991-11-07 2003-05-27 Nanogen, Inc. Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices
ES2049618B1 (es) * 1991-11-13 1994-11-01 Consejo Superior Investigacion Metodo de diagnostico y clasificacion de especies de trypanosoma cruzi.
WO1993020234A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company A rapid, high capacity nucleic acid based assay
US6100099A (en) 1994-09-06 2000-08-08 Abbott Laboratories Test strip having a diagonal array of capture spots
DE4212555A1 (de) * 1992-04-15 1993-10-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
US5543292A (en) * 1992-06-16 1996-08-06 Hitachi, Ltd. Process for the measurement of nucleic acids
DK0652973T3 (da) * 1992-07-31 1997-09-15 Behringwerke Ag Fremgangsmåde til indføring af definerede sekvenser ved 3-enden af polynukleotider
US7713528B1 (en) 1993-02-18 2010-05-11 Enzo Therapeutics, Inc. Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate
US6294323B1 (en) 1993-04-14 2001-09-25 Behringwerke Ag Self initiating single primer amplification of nucleic acids
EP0701629B1 (en) * 1993-05-28 2006-08-02 Mount Sinai School of Medicine of New York University Bc200 rna, probes therefor and use thereof
DE4344742A1 (de) * 1993-06-09 1994-12-15 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren
US5532122A (en) * 1993-10-12 1996-07-02 Biotraces, Inc. Quantitation of gamma and x-ray emitting isotopes
US5854084A (en) 1996-07-12 1998-12-29 Biotraces, Inc. Enhanced chromatography using multiphoton detection
US6225059B1 (en) 1993-11-01 2001-05-01 Nanogen, Inc. Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics
US7314708B1 (en) * 1998-08-04 2008-01-01 Nanogen, Inc. Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures
US6287517B1 (en) 1993-11-01 2001-09-11 Nanogen, Inc. Laminated assembly for active bioelectronic devices
US6309602B1 (en) 1993-11-01 2001-10-30 Nanogen, Inc. Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials
US6254827B1 (en) 1993-11-01 2001-07-03 Nanogen, Inc. Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6375899B1 (en) 1993-11-01 2002-04-23 Nanogen, Inc. Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system
US7172864B1 (en) 1993-11-01 2007-02-06 Nanogen Methods for electronically-controlled enzymatic reactions
US20040077074A1 (en) * 1993-11-01 2004-04-22 Nanogen, Inc. Multi-chambered analysis device
US6319472B1 (en) 1993-11-01 2001-11-20 Nanogen, Inc. System including functionally separated regions in electrophoretic system
US6331274B1 (en) 1993-11-01 2001-12-18 Nanogen, Inc. Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6726880B1 (en) 1993-11-01 2004-04-27 Nanogen, Inc. Electronic device for performing active biological operations and method of using same
US7582421B2 (en) * 1993-11-01 2009-09-01 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip
US7101661B1 (en) 1993-11-01 2006-09-05 Nanogen, Inc. Apparatus for active programmable matrix devices
US6638482B1 (en) 1993-11-01 2003-10-28 Nanogen, Inc. Reconfigurable detection and analysis apparatus and method
US6315953B1 (en) * 1993-11-01 2001-11-13 Nanogen, Inc. Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides
US6068818A (en) * 1993-11-01 2000-05-30 Nanogen, Inc. Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics
KR100230909B1 (ko) * 1993-11-29 1999-12-01 다니엘 엘. 캐시앙 광범위의 유기체로부터 핵산 추출 방법
DE69506393T2 (de) * 1994-04-04 1999-07-01 Ciba Corning Diagnostics Corp Hybridisation-ligitation-verfahren zum nachweis von spezifischen dns sequenzen
US7323298B1 (en) 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US7857957B2 (en) * 1994-07-07 2010-12-28 Gamida For Life B.V. Integrated portable biological detection system
US6379897B1 (en) * 2000-11-09 2002-04-30 Nanogen, Inc. Methods for gene expression monitoring on electronic microarrays
US6403367B1 (en) 1994-07-07 2002-06-11 Nanogen, Inc. Integrated portable biological detection system
US5545527A (en) * 1994-07-08 1996-08-13 Visible Genetics Inc. Method for testing for mutations in DNA from a patient sample
US8236493B2 (en) 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
CA2163393C (en) * 1994-11-30 2003-04-22 Colleen Marie Nycz Amplification and detection of mycobacteria nucleic acids
US5783387A (en) * 1995-02-06 1998-07-21 The Regents Of The University Of California Method for identifying and quantifying nucleic acid sequence aberrations
US5731153A (en) * 1996-08-26 1998-03-24 The Regents Of The University Of California Identification of random nucleic acid sequence aberrations using dual capture probes which hybridize to different chromosome regions
US5610023A (en) * 1995-03-31 1997-03-11 Lee Laboratories, Inc. Method of purification of clostridium difficile toxin A and production of mono-specific antibodies
US5783453A (en) * 1995-06-29 1998-07-21 Chiron Diagnostics Corporation Non-separation specific binding chemiluminescent assay
US5616465A (en) * 1995-08-09 1997-04-01 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes
US6027879A (en) * 1995-08-09 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe
US5770365A (en) * 1995-08-25 1998-06-23 Tm Technologies, Inc. Nucleic acid capture moieties
US20040086917A1 (en) * 1995-09-27 2004-05-06 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
WO1997035033A1 (en) 1996-03-19 1997-09-25 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
US5814490A (en) * 1996-06-11 1998-09-29 Becton, Dickinson And Company Amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acids
US5910410A (en) * 1996-09-06 1999-06-08 Hewlett-Packard Company Dual tag binding assay
US5853993A (en) * 1996-10-21 1998-12-29 Hewlett-Packard Company Signal enhancement method and kit
US6706473B1 (en) 1996-12-06 2004-03-16 Nanogen, Inc. Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides
EP2295988A2 (en) * 1996-12-31 2011-03-16 High Throughput Genomics, Inc. Multiplexed molecular analysis apparatus and its fabrication method
US6110678A (en) 1997-05-02 2000-08-29 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
DE19741715A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
CA2313483C (en) * 1997-12-12 2017-12-05 Digene Corporation Assessment of human papilloma virus-related disease
US20100105572A1 (en) * 1997-12-19 2010-04-29 Kris Richard M High throughput assay system
US20030096232A1 (en) 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
US6238869B1 (en) 1997-12-19 2001-05-29 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system
US20030039967A1 (en) * 1997-12-19 2003-02-27 Kris Richard M. High throughput assay system using mass spectrometry
US6232066B1 (en) 1997-12-19 2001-05-15 Neogen, Inc. High throughput assay system
US6458533B1 (en) 1997-12-19 2002-10-01 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system for monitoring ESTs
ES2322859T3 (es) 1998-05-01 2009-06-30 Gen-Probe Incorporated Analizador de diagnostico automatizado.
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
WO2000058472A2 (en) 1999-03-31 2000-10-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated dna encoding cullin regulators roc1 and roc2, isolated proteins encoded by the same, and methods utilizing the same
US6235479B1 (en) 1999-04-13 2001-05-22 Bio Merieux, Inc. Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample
US7101989B1 (en) 1999-07-09 2006-09-05 University Of North Carolina At Chapel Hill DsrA protein and polynucleotides encoding the same
FR2803913B1 (fr) * 2000-01-13 2002-08-16 Pasteur Sanofi Diagnostics Procede d'immobilisation de reactif(s) affin(s) sur phase solide hydrophobe
US20050214825A1 (en) * 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
US7582420B2 (en) * 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
AU2001238068A1 (en) * 2000-02-07 2001-08-14 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US8076063B2 (en) * 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
AU2001247328C1 (en) * 2000-03-08 2006-10-26 Datascope Investment Corp. Methods for assay and detection on a microarray
WO2001068916A1 (en) * 2000-03-16 2001-09-20 Bionex, Inc. Method for detecting mutation of nucleic acid
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US20040185464A1 (en) * 2000-09-15 2004-09-23 Kris Richard M. High throughput assay system
US20020169562A1 (en) * 2001-01-29 2002-11-14 Gregory Stephanopoulos Defining biological states and related genes, proteins and patterns
EP1481076A4 (en) 2001-07-12 2005-05-11 Illumina Inc MULTIPLEX NUCLEIC REACTIONS
US6893822B2 (en) 2001-07-19 2005-05-17 Nanogen Recognomics Gmbh Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate
US20050147984A1 (en) * 2001-08-31 2005-07-07 Clondiag Chip Technologies Gmbh Interaction detection on several probe arrays
US6696254B2 (en) * 2001-11-21 2004-02-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection and identification of enteric bacteria
US7041811B2 (en) * 2001-12-19 2006-05-09 Dr. Chip Biotechnology, Inc. Method for detecting Escherichia coli
US20030175709A1 (en) * 2001-12-20 2003-09-18 Murphy George L. Method and system for depleting rRNA populations
US7579147B2 (en) * 2002-05-07 2009-08-25 Wake Forest University Health Sciences Mutations in the macrophage scavenger receptor 1 gene alter risk of prostate cancer, asthma, and cardiovascular disease
BRPI0310060B8 (pt) * 2002-05-17 2021-07-27 Becton Dickinson Co sistema automatizado para isolar, amplificar e detectar uma seqüência de ácido nucléico alvo ou uma proteína
US20030219755A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for performing hybridization assays using target enhanced signal amplification (TESA)
US7601493B2 (en) 2002-07-26 2009-10-13 Nanogen, Inc. Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations
US20040259105A1 (en) * 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
AU2003301825A1 (en) * 2002-10-31 2004-06-07 Pfizer Products, Inc. Panels of molecular targets differentially expressed during cd8+ t-cell priming
US20040191803A1 (en) * 2002-11-22 2004-09-30 Michela Gallagher Target for therapy of cognitive impairment
EP2248912B8 (en) * 2002-11-26 2013-04-17 University of Maryland, Baltimore County High sensitivity assays for pathogen detection using metal-enhanced fluorescence
US20040235019A1 (en) * 2003-03-06 2004-11-25 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Diagnostics and therapeutics for the gene expression signature of PPAR-gamma receptor ligand
CA2525413C (en) 2003-05-19 2010-08-17 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for determining the presence of trichomonas vaginalis in a test sample
JP4675330B2 (ja) 2003-11-14 2011-04-20 デューク ユニバーシティ シャルコー・マリー・ツース病２ａ型の検出方法
GB0411081D0 (en) * 2004-05-18 2004-06-23 Glaxo Group Ltd Novel apparatus
DK1778867T3 (da) * 2004-07-01 2010-08-02 Gen Probe Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til detektering af nucleinsyrer i en biologisk prøve
US7662562B2 (en) * 2004-08-10 2010-02-16 Becton, Dickinson And Company Method for rapid identification of microorganisms
US7828954B2 (en) * 2004-09-21 2010-11-09 Gamida For Life B.V. Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles
US7314542B2 (en) * 2004-09-23 2008-01-01 Nanogen, Inc. Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions
EP1909108B1 (en) 2005-03-10 2019-05-29 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifiying analytes
EP2333561A3 (en) 2005-03-10 2014-06-11 Gen-Probe Incorporated System for performing multi-formatted assays
EP1871913A2 (en) * 2005-03-25 2008-01-02 Ambion, Inc. Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
ATE551433T1 (de) 2005-05-06 2012-04-15 Gen Probe Inc Verfahren und produkte zum erfassen von nukleinsäurezielen
AU2006342447B2 (en) 2005-12-28 2013-06-20 Translational Therapeutics, Inc Translational dysfunction based therapeutics
US20080118914A1 (en) * 2006-01-04 2008-05-22 Charlotte Dawn Blowe Follistatin gene as a genetic marker for first parity litter size in pigs
US20070186298A1 (en) * 2006-01-04 2007-08-09 Blowe Charlotte D Follistatin gene as a genetic marker for reproductive and performance traits in pigs
CA2652454C (en) 2006-05-24 2013-04-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for determining the presence of mycobacterium tuberculosis complex organisms in a test sample
DK1945821T3 (da) 2006-06-06 2011-03-07 Gen Probe Inc Mærkede oligonukleotider og anvendelse deraf i fremgangsmåder til amplifikation af nukleinsyrer
NZ576149A (en) 2006-09-29 2012-06-29 Translational Therapeutics Inc Eif4e regulon-based diagnostics
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
EP1978111B1 (en) 2007-04-02 2013-03-27 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Pseudomonas aeruginosa
EP2657351B1 (en) 2007-12-21 2018-06-20 Biomerieux Sa Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
WO2009126336A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Becton, Dickinson And Company Methods of controlling the sensitivity and dynamic range of a homogeneous assay
EP2806037B1 (en) 2008-05-13 2016-09-21 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
CA2723917A1 (en) 2008-05-30 2009-12-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of salmonella
WO2010019550A2 (en) 2008-08-12 2010-02-18 Shiraz Pharmaceuticals, Inc. Method of identifying disease risk factors
US8288520B2 (en) * 2008-10-27 2012-10-16 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and system
AU2009324884B2 (en) 2008-11-25 2013-10-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting small RNAs, and uses thereof
US8748133B2 (en) 2008-12-30 2014-06-10 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Listeria
AU2010208311B2 (en) * 2009-01-28 2016-07-07 Qiagen Gaithersburg, Inc. Sequence-specific large volume sample preparation method and assay
EP2425019B1 (en) * 2009-05-01 2014-03-19 QIAGEN Gaithersburg, Inc. A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample
CN102427885B (zh) 2009-05-15 2016-10-19 简·探针公司 用于在执行磁性分离工序的仪器中实现磁体的自动移动的方法和设备
US8999675B2 (en) 2009-08-31 2015-04-07 Gen-Probe Incorporated Dengue virus assay
CA2773320C (en) 2009-09-14 2018-02-20 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
AU2010339861A1 (en) 2009-12-21 2012-10-25 Becton, Dickinson And Company Methods for identifying drug resistant Mycobacterium
WO2011087789A2 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
US8790879B2 (en) 2010-01-22 2014-07-29 Gen-Probe Incorporated Probes for detecting the presence of Trichomonas vaginalis in a sample
CN102822353A (zh) 2010-01-29 2012-12-12 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 确定和确认样品中存在hpv的方法
EP2528932B1 (en) 2010-01-29 2016-11-30 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
JP2013531976A (ja) 2010-05-11 2013-08-15 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー ｓｐｎＫ菌株
WO2011146629A2 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Qiagen Gaithersburg Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
AU2011258501B2 (en) 2010-05-25 2016-07-07 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes
EP2743704A3 (en) 2010-07-23 2014-06-25 Beckman Coulter, Inc. System or method of including analytical units
EP2678442B1 (en) 2011-02-24 2019-01-16 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acid
EP2998399A1 (en) 2011-05-03 2016-03-23 Dow AgroSciences LLC Enhancing spinosyn production with oxygen binding proteins
EP4219740A3 (en) 2011-09-06 2023-08-16 Gen-Probe Incorporated Closed nucleic acid structures
DE102011114984B3 (de) * 2011-09-28 2012-11-22 Universität Rostock Sequenzspezifische Analyse von Nukleinsäuren
KR20140091032A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 수송 시스템의 자기 감쇠
KR20140091033A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 컨테이너 검출
CN104105969B (zh) 2011-11-07 2016-10-12 贝克曼考尔特公司 离心机系统和工作流程
EP3373015A1 (en) 2011-11-07 2018-09-12 Beckman Coulter Inc. Aliquotter system and workflow
ES2844324T3 (es) 2011-11-07 2021-07-21 Beckman Coulter Inc Brazo robótico
JP6082018B2 (ja) 2011-11-07 2017-02-15 ベックマン コールター， インコーポレイテッド サンプルを処理するためのシステムおよび方法
CN104169437B (zh) 2011-12-23 2017-07-11 生物梅里埃公司 甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的mecA变体菌株的检测
US9631195B2 (en) 2011-12-28 2017-04-25 Dow Agrosciences Llc Identification and characterization of the spinactin biosysnthesis gene cluster from spinosyn producing saccharopolyspora spinosa
KR102018934B1 (ko) 2012-02-27 2019-09-06 도레이 카부시키가이샤 핵산의 검출 방법
US10472683B2 (en) 2012-06-01 2019-11-12 Akron Biotechnology, LLC. Detection of Mycoplasma in cell cultures and cell culture derived biologicals
WO2014006025A2 (en) 2012-07-02 2014-01-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Marker of pathogenicity in salmonella
US9416403B2 (en) 2012-08-31 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Method of detecting target nucleic acid
US10427162B2 (en) 2016-12-21 2019-10-01 Quandx Inc. Systems and methods for molecular diagnostics
CA3108105A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
JP2022518510A (ja) 2019-01-25 2022-03-15 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 薬物耐性ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出
WO2021041056A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
EP4182482A1 (en) 2020-07-17 2023-05-24 Gen-Probe Incorporated Detection of macrolide-resistant mycoplasma genitalium

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896217A (en) * 1973-03-19 1975-07-22 Summa Corp Method and apparatus for radioimmunoassay with regeneration of immunoadsorbent
US3930956A (en) * 1973-10-29 1976-01-06 The Regents Of The University Of Michigan Method for the genetic detection of microorganisms
SU649751A1 (ru) * 1977-06-14 1979-02-28 Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.М.В.Ломоносова Способ идентификации микроорганизмов
US4139346A (en) * 1977-11-28 1979-02-13 Enzo Bio Chem Incorporated Nucleic acid and protein binding paper
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
FR2444713A1 (fr) * 1978-12-18 1980-07-18 Pasteur Institut Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant
US4302204A (en) * 1979-07-02 1981-11-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Transfer and detection of nucleic acids
US4359535A (en) * 1979-10-01 1982-11-16 George Pieczenik Autonomously replicating DNA containing inserted DNA sequences
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
US4446237A (en) * 1981-03-27 1984-05-01 Life Technologies, Inc. Method for detection of a suspect viral deoxyribonucleic acid in an acellular biological fluid
EP0062286A1 (en) * 1981-03-31 1982-10-13 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Diagnostic test for hepatitis B virus
CA1219824A (en) * 1981-04-17 1987-03-31 David C. Ward Modified nucleotides and methods of preparing and using same
JPS5840099A (ja) * 1981-07-17 1983-03-08 アモコ・コ−ポレ−ション 光−放射ポリヌクレオチドの交雑診断方法
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser

Also Published As

Publication number Publication date
US4563419A (en) 1986-01-07
RO86356B (ro) 1985-04-01
DK275183A (da) 1983-06-15
SU1386031A3 (ru) 1988-03-30
EP0079139A1 (en) 1983-05-18
DK275183D0 (da) 1983-06-15
AU8957582A (en) 1983-05-05
JPS58501703A (ja) 1983-10-13
US4486539A (en) 1984-12-04
CA1192120A (en) 1985-08-20
FI63596B (fi) 1983-03-31
EP0098267A1 (en) 1984-01-18
DE3277917D1 (en) 1988-02-11
DE79139T1 (de) 1983-11-24
FI63596C (fi) 1983-07-11
ATE31735T1 (de) 1988-01-15
EP0079139B1 (en) 1988-01-07
WO1983001459A1 (en) 1983-04-28
AU548854B2 (en) 1986-01-02
RO86356A (ro) 1985-03-15
JPH0632637B1 (hu) 1994-05-02
DK173744B1 (da) 2001-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU196242B (en) Process and reagent combination for identifying microorganisms by sandwich-hybridization of nucleic acids
US4358535A (en) Specific DNA probes in diagnostic microbiology
Stone et al. Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth cultivation-PCR procedure
Marshall et al. Frequency of tetracycline resistance determinant classes among lactose-fermenting coliforms
JPS60100056A (ja) 核酸ハイブリダイゼ−シヨン法による細菌の検出方法
EP0232085B1 (en) Campylobacter probe
US7270982B2 (en) Helicobacter pylori antigens in blood
EP0133288A2 (en) Bacterial detection by nucleic acid hybridization, labeled probes and test kit therefore
Watterworth et al. Multiplex PCR-DNA probe assay for the detection of pathogenic Escherichia coli
JP4469338B2 (ja) 臨床検体中の病原性マイコバクテリアを検出する方法
JP2792462B2 (ja) サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
JP2000511058A (ja) Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための組成物および方法
TW200417609A (en) Nucleic acid primer for acidophilic bacteria and a method for identifying acidophilic bacteria
US5432055A (en) Detection of Porphyromonas gingivalis
JPH0767657A (ja) クレブシエラ属菌の検出及び塩基配列
JPH11332599A (ja) 腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
Zwadyk et al. Nucleic acid probes in clinical microbiology
JP2004525626A (ja) ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより歯周病原性細菌を検出するためのオリゴヌクレオチド・プローブ
JP3141976B2 (ja) 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
JPH11332600A (ja) 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
JP3331977B2 (ja) 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
NO163699B (no) Fremgangsmaate og reagenskombinasjon for diagnose av mikroorganismer.
Butcher et al. The electrophoretic analysis of low molecular weight nucleic acids from Crohn's disease tissues in the search for an unconventional small infections agent
JPH06505143A (ja) マイコバクテリウム・ツベルクローシスの検出に有用な核酸プローブ
Nix Characterization and diagnostic applications of conserved genetic elements in Clavibacter michiganensis subspecies

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SANGTEC MEDICAL AB, SE

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB, SE