SU649751A1 - Способ идентификации микроорганизмов - Google Patents

Claims (2)

1. Изобретение относитс  к облаети микробиологии и может быть использовано нри проведении массовы.х эиидемиологических исследований, при лнквидации очагов инфекцио .нных заболеваний, при разработке эффективных поливакцин, а также в различных област х микробиологической промышленности . Известен способ идентификации микроорганизмов путем «X культивИровани , отделени  выросших клеток с последующим их лизисом, выделени  из лизата ДН1, очистки, гибр.идмзации полученной ДНК с ДНК реперного штамма и учета процента гомологии в нуклеотидной последовательно сти. Однако известный способ  вл етс  трудоемким и длительным (50-60 ч). Цель изобретени  - ускорить и упростить способ. Эта цель достигаетс  тем, что лизие клеток провод т при 37-50° С в течение 30-60 мин, ДНК из лизата выдел ют 1,5- 2,5-кратным объемом этилового спирта, очистку провод т 0,54-0,6%-ным объемом изопропилового спирта, а гибридизацию ведут в течение 8-10 ч. Пример 1. Суспензию бактериальных клеток Е. соИ ВЗТ, полученную в жидкой глюкозо-минеральной среде, содержащей 6 г NasHPOi, 3 г КН2РО4, 3 г ХН.;С1, 1 лг.; 1 М раствора MgSO4, 4 г глюкозы, 2 ли тимидииа и до 1 л Н2О, фиксируют после осаждени  клеток 2-3 объемами 96%-кого этилового спирта, затем суспензию центрпфугируют в течение 10 мин при 3000-5000 об/мин и из осадка отбирают навеску 1 г сырой биомассы. Клетки рес}спендируют в 50 мл солевого раствора (0,3 М NaCl, 0,03/М цитрата натри ), центрифугируют повторно 10 мин при 3000-5000 об/мин и осадок ресуспеидпруют в 20 M.I буфера, содержащего 0,15 MNaCl + 0,1 М ЭДТА-1-0,015 М цитрата натри  +0,1 М триса , рН 8,0 и лизируют добавлением 1 л/л 20%-ного раствора додецилсульфата натри  в прис тствии 100 мкг/мл нроназы в течение 30 мин при 37° С. После завернюни  лизиса и просветлени  лизата добавл ют XaCI до конечной концентрации 2 Л1 и осаждают ДНК из лизата 2 объемами этилового спирта. Выпавший осадок ДНК перенос т в 10 л(л 1 М ацетата натри  рН 7,0 и поеле растворени  ДНК осаждают 1,54%-пым объемом изопропплового спирта (по отношенпю к исходному раствору Юлгл). Выпавший медузообразпый осадок перенос т в 10 мл солевого раствора (0,015 М NaCl+ 0,0015 М цитрата натри ). После растворешш ДНК денатурируют, добавл   в раствор по капл м 10 М NaOH до рН 12,0 и прогрева  в течение 30 мин при 60° С, нейтрализуют 0,1 н. НС и довод т концентрацию солей в растворе до 0,9 Л1 NaCl + 0,09 Л- цитрата натри . После этого раствор денатурированной ДНК иронускают через мембранные фильтры, промывают каждый фильтр 10 мл раствора 0,3 М NaCl + 0,03 М цитрата натри  и высушивают нри 60° С в течение 2 ч. ДНК, выделенной на 1 г бактериальной массы, достаточно дл  нанесени  на 10 фильтров. После нанесени  фильтры помещают в тефлоновые или стекл нные биксы, содер;кагцие 2 мл раствора 0,3 М NaCl-f 0,03 М цитрата натри  и меченые С-тимидинО М фрагменты ДПК Е. соИ ВЗТ в соотношенни 1: 100 к количеству немеченной ДНК, и смесь инкубируют при 60° С в течение 8 ч. Затем определ ют радиоактивность с помощью изотопного счетчика «Marki. Количество реассоцинрованной ДНК (в процента .х) нодсчитываю-т как количество импульсов св завшейс  ДНК и эту цифру принимают за 100% в гомологичной реакции (ДНК Е. соИ ВЗТХДНК Е. соИ ВЗТ). Процент гомологии рассчитывают как количество )1 шульсов св завшейс  ДНК (в процентах ) в гетерологичной реакции, например ДНК Е. соИ 761ХДНК Е. соИ ВЗТ (ренерный штамм) имеет 89% гомологии. Пример
2. 2. Спиртовую суспензию бактериальных клеток Е. coli ВЗТ, соответствующую 1 г сырой биомассы, фильтруют через мембранный фильтр диаметром 10 см с размером пор 0,23-0,45 ммк в течение 2-3 мин под вакуумом, фильтр перенос т Б 100 мл солевого раствора (0,15 М NaCl + -i-G,01 М ЭДТА, рН 7), встр хивают 1 - 2мин и повторно фильтруют суспензию через новый фильтр, затем ресуспендируют в 10 мл солевого раствора, содержащего 0.5 М NaCl + 0,1 /И ЭДТА, рН 7,0-8,0. К сус ензпи добавл ют 10 мл 1 н. МаОН и выдерживают при ЗТО С в течение 1 ч. К щелочному лизату добавл ют 1 каплю универсального индикатора и нейтрализуют смесь оследовательным приливанием 5 мл 1,5 н. IIC1, 5 мл 1 М трис-UCi буфера рН 7,4- 7,8 с 0,05 М ЭДТА н по капл м 2 мл 1,5 н. НС до рН 7,0-7,5. После этого к лизату добавл ют 50 мкг.мл панкреатической рибонуклеазы , инкубируют 30 мин нрн 37° С, затем внос т 100 м.кг1мл проназы И инкубацию продолжают в течение 1 ч. В зкий лизат пропускают 3-5 раз через шпвиц на 50-100 л(л и нанос т на мембранные ф.ильтры . Дальнейшие операции после нанесени  на фильтры провод т, как в примере 1. Предлагаемый способ прост, так как в нем отсутствуют трудоемкие онерации, сокращает врем  до 11 -13 ч и обеспечивает высокую точность. Формула изобретени  Способ идентификации микроорганизмов путем их культивировани , отделени  выросших клеток с последующим их лизисом , выделени  из лизата ДНК, очистки, гибридизации полученной ДНК с ДНК реперного штамма и учета процента гомологии в нуклеотидной носледовательности, отличающийс  тем, что, с целью ускорени  и упрощени  способа, лйзис клеток провод т при температуре 37-50 С в течение 30-60 мин, ДНК из лнзата выдел ют 1,5-2,5-кратным объемом этилового снирта , очистку провод т обработкой 0,54- 0,6%-ным объемом изопропилового спирта, а гибридизацию ведут в течение 8-10 ч.