JPH0662899A - ナイセリア・ゴノロエエの特異的検出法 - Google Patents
ナイセリア・ゴノロエエの特異的検出法Info
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- JPH0662899A JPH0662899A JP5146050A JP14605093A JPH0662899A JP H0662899 A JPH0662899 A JP H0662899A JP 5146050 A JP5146050 A JP 5146050A JP 14605093 A JP14605093 A JP 14605093A JP H0662899 A JPH0662899 A JP H0662899A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 通常のハイブリダイゼーション条件下で高い
特異性および感受性を有し、その結果、この病原の信頼
性のある定性的および定量的検出を可能にするナイセリ
ア・ゴノロエエに関する核酸プローブを提供すること。 【構成】 本発明は、配列番号１〜１５に示される核酸
配列のうち少なくとも１つを有するナイセリア・ゴノロ
エエ(Ｎeisseria gonorhoeae)特異的核酸プローブ、お
よびかかる核酸プローブを使用する病原ナイセリア種エ
ヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の検出方法を提供す
る。
特異性および感受性を有し、その結果、この病原の信頼
性のある定性的および定量的検出を可能にするナイセリ
ア・ゴノロエエに関する核酸プローブを提供すること。 【構成】 本発明は、配列番号１〜１５に示される核酸
配列のうち少なくとも１つを有するナイセリア・ゴノロ
エエ(Ｎeisseria gonorhoeae)特異的核酸プローブ、お
よびかかる核酸プローブを使用する病原ナイセリア種エ
ヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の検出方法を提供す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ナイセリア・ゴノロエ
エ(Ｎeisseria gonorrhoeae)病原体の検出用特異的核酸
プローブおよびこれらのプローブを使用するナイセリア
・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)の検出方法に関
する。
エ(Ｎeisseria gonorrhoeae)病原体の検出用特異的核酸
プローブおよびこれらのプローブを使用するナイセリア
・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)の検出方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】エヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)は淋
病の病原体である。この性病は、世界中で最も頻繁に起
こる法定感染疾患の１つである。感染だけの数は、毎年
約６０〜６５百万件である[ワールド・ヘルス・スタテ
ィスティカルズ・アニュアル(Ｗorld Ｈealth Ｓtatist
icals Ａnnual)、１９７９：ヘルマン(Ｈerrmann)、「イ
ンネレ・メジツィン・イン・プラクシス・ウント・クリ
ニク」(Ｉnnere Ｍedizinin Ｐraxis und Ｋlinik)；ホ
ルンボシュテル・ハー(Ｈornbostel Ｈ.)、カウフマン
・ヴェー（Ｋaufmann Ｗ.)、ジーゲンターラー・ヴェー
(ＳiegenthalerＷ.)編、ティーメ・フェルラーク(Ｔhie
me Ｖerlag)、１９８５、５９−６２]。症状は、当該疾
患の保菌者の性別に依存する。男性では、主に、生殖器
感染が化膿性炎および尿道口の腫脹として発現し、女性
では、主に、頸部の炎症が起こり、しばしば、尿道の炎
症が起こることもある。女性では、感染の５０％のケー
スで症状が全く生じないか、または非常にわずかに生じ
るだけである。女性の１０〜１５％において、感染はフ
ァローピウス管に広がり、その結果、不妊症の危険が生
じる。１〜３％のケースでは、両方の性において病原体
による全身性浸潤が起こり、これは、関節炎、心内膜炎
および腹膜炎を誘発することもある。感染経路は、しば
しば、無症候性であることもあり、その結果、多くの保
菌者は、自分自身では当該疾患による罹患を認識できず
に、疾患の蔓延に貢献している[デイビス(Ｄavis)ら、
マイクロバイオロジー(Ｍicrobiology)、ハーパー・イ
ンターナショナル・エディション（Ｈarper Ｉnternati
onl Ｅdition)１９８１]。
病の病原体である。この性病は、世界中で最も頻繁に起
こる法定感染疾患の１つである。感染だけの数は、毎年
約６０〜６５百万件である[ワールド・ヘルス・スタテ
ィスティカルズ・アニュアル(Ｗorld Ｈealth Ｓtatist
icals Ａnnual)、１９７９：ヘルマン(Ｈerrmann)、「イ
ンネレ・メジツィン・イン・プラクシス・ウント・クリ
ニク」(Ｉnnere Ｍedizinin Ｐraxis und Ｋlinik)；ホ
ルンボシュテル・ハー(Ｈornbostel Ｈ.)、カウフマン
・ヴェー（Ｋaufmann Ｗ.)、ジーゲンターラー・ヴェー
(ＳiegenthalerＷ.)編、ティーメ・フェルラーク(Ｔhie
me Ｖerlag)、１９８５、５９−６２]。症状は、当該疾
患の保菌者の性別に依存する。男性では、主に、生殖器
感染が化膿性炎および尿道口の腫脹として発現し、女性
では、主に、頸部の炎症が起こり、しばしば、尿道の炎
症が起こることもある。女性では、感染の５０％のケー
スで症状が全く生じないか、または非常にわずかに生じ
るだけである。女性の１０〜１５％において、感染はフ
ァローピウス管に広がり、その結果、不妊症の危険が生
じる。１〜３％のケースでは、両方の性において病原体
による全身性浸潤が起こり、これは、関節炎、心内膜炎
および腹膜炎を誘発することもある。感染経路は、しば
しば、無症候性であることもあり、その結果、多くの保
菌者は、自分自身では当該疾患による罹患を認識できず
に、疾患の蔓延に貢献している[デイビス(Ｄavis)ら、
マイクロバイオロジー(Ｍicrobiology)、ハーパー・イ
ンターナショナル・エディション（Ｈarper Ｉnternati
onl Ｅdition)１９８１]。
【０００３】ナイセリア属は、病原性種および非病原性
種を含むグラム陰性双球菌属に非常に関連する１つのグ
ループである。例えば、ナイセリア・フラバ(Ｎeisseri
a flava)およびエロンガタ（elongata)のような非病原
性ナイセリアは、口腔、気道および生殖路(genital tra
ct)の粘膜をコロニー化し、かつ、ヒトの正常な微生物
叢の一部分である[カイザー(Ｋayser)、メディツィニッ
シェ・ミクロビオロジー（Ｍedizinische Ｍikrobiolog
ie)、ヴィースマン・エー(Ｗiesmann Ｅ.)編、ティーメ
・フェルラーク(Ｔhieme Ｖerlag)、１９８６、１０４
−１４４]。ナイセリアの厳密な関係は、とりわけ、Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験によって証明
された[ホーク(Ｈoke)およびベドロス(Ｖedros)、イン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック
・バクテリオロジー(Ｉnt.Ｊ.Ｓystem.Ｂacteriol.)、
３１(１９８２)、５７−６６]。感染の特異的治療およ
び感染の蔓延の制御に関して欠くことができない条件
は、病原体エヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)に関す
る、迅速で、かつ信頼性のある検出方法であり、これを
使用してエヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)を効率的か
つ特異的に検出することができ、他の種、特にナイセリ
ア属の他の種と明確に区別することができる。
種を含むグラム陰性双球菌属に非常に関連する１つのグ
ループである。例えば、ナイセリア・フラバ(Ｎeisseri
a flava)およびエロンガタ（elongata)のような非病原
性ナイセリアは、口腔、気道および生殖路(genital tra
ct)の粘膜をコロニー化し、かつ、ヒトの正常な微生物
叢の一部分である[カイザー(Ｋayser)、メディツィニッ
シェ・ミクロビオロジー（Ｍedizinische Ｍikrobiolog
ie)、ヴィースマン・エー(Ｗiesmann Ｅ.)編、ティーメ
・フェルラーク(Ｔhieme Ｖerlag)、１９８６、１０４
−１４４]。ナイセリアの厳密な関係は、とりわけ、Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験によって証明
された[ホーク(Ｈoke)およびベドロス(Ｖedros)、イン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック
・バクテリオロジー(Ｉnt.Ｊ.Ｓystem.Ｂacteriol.)、
３１(１９８２)、５７−６６]。感染の特異的治療およ
び感染の蔓延の制御に関して欠くことができない条件
は、病原体エヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)に関す
る、迅速で、かつ信頼性のある検出方法であり、これを
使用してエヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)を効率的か
つ特異的に検出することができ、他の種、特にナイセリ
ア属の他の種と明確に区別することができる。
【０００４】今まで使用された検出方法は培養物の調製
を必要とする。これは物質の運搬における問題を生じ、
培養の間、それらの自己融解酵素系の結果として、淋菌
は温度の変化および脱水のような環境の影響に非常に敏
感である。エヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の培養
は、選択培地（例えば、セーアー−マーティン培地)を
必要とするが、しかしながら、該選択培地上では、例え
ば、エヌ・ラクタミカ(Ｎ.lactamica)のような非病原性
ナイセリア種も増殖することができる。したがって、限
定的診断試験は、炭水化物利用、抗原検出、オキシダー
ゼ反応または蛍光性抗体スクリーニングによって区別す
ることによって行われる。全てのこれらの試験系および
試験されるべき微生物の必要な培養は、非常に時間を消
費し、かつ、主に、微生物学専門研究所で行われなけれ
ばならない。
を必要とする。これは物質の運搬における問題を生じ、
培養の間、それらの自己融解酵素系の結果として、淋菌
は温度の変化および脱水のような環境の影響に非常に敏
感である。エヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の培養
は、選択培地（例えば、セーアー−マーティン培地)を
必要とするが、しかしながら、該選択培地上では、例え
ば、エヌ・ラクタミカ(Ｎ.lactamica)のような非病原性
ナイセリア種も増殖することができる。したがって、限
定的診断試験は、炭水化物利用、抗原検出、オキシダー
ゼ反応または蛍光性抗体スクリーニングによって区別す
ることによって行われる。全てのこれらの試験系および
試験されるべき微生物の必要な培養は、非常に時間を消
費し、かつ、主に、微生物学専門研究所で行われなけれ
ばならない。
【０００５】すでに、数年前に、核酸プローブを使用し
て微生物を特異的に検出することが可能であることが認
識された。リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)と相補的である
核酸プローブが特に適していると思われる。これらのプ
ローブは、各細胞中にこのｒＲＮＡの１０００個〜１０
０００個のコピーおよびこのｒＲＮＡをコードする遺伝
子(ｒＤＮＡ)の数個のコピーが存在するので、非常に敏
感であるという長所を有する。
て微生物を特異的に検出することが可能であることが認
識された。リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)と相補的である
核酸プローブが特に適していると思われる。これらのプ
ローブは、各細胞中にこのｒＲＮＡの１０００個〜１０
０００個のコピーおよびこのｒＲＮＡをコードする遺伝
子(ｒＤＮＡ)の数個のコピーが存在するので、非常に敏
感であるという長所を有する。
【０００６】各細胞は、通常、真正細菌中に以下の構造
を有する多重ｒＲＮＡオペロンを有する：オペロンの
５'末端に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が位置し、これに２３
Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が続き；オペロンの３'末端に５Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子が位置する。個々の遺伝子は、トランス
ファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)遺伝子のいくつか、および転写
後プロセシングに関するシグナル配列をみることができ
るスペーサー領域によってお互いに分離される。ｒＲＮ
Ａオペロンは、まず、単一の前駆体ＲＮＡに転写され
る。次いで、第一次転写物はエンドリボヌクレアーゼお
よびエキソリボヌクレアーゼによって成熟生成物にプロ
セシングされる。これは、２３Ｓ ｒＲＮＡ配列および
スペーサー領域がゲノムおよびＲＮＡ転写物中にＤＮＡ
として存在することを意味する。
を有する多重ｒＲＮＡオペロンを有する：オペロンの
５'末端に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が位置し、これに２３
Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が続き；オペロンの３'末端に５Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子が位置する。個々の遺伝子は、トランス
ファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)遺伝子のいくつか、および転写
後プロセシングに関するシグナル配列をみることができ
るスペーサー領域によってお互いに分離される。ｒＲＮ
Ａオペロンは、まず、単一の前駆体ＲＮＡに転写され
る。次いで、第一次転写物はエンドリボヌクレアーゼお
よびエキソリボヌクレアーゼによって成熟生成物にプロ
セシングされる。これは、２３Ｓ ｒＲＮＡ配列および
スペーサー領域がゲノムおよびＲＮＡ転写物中にＤＮＡ
として存在することを意味する。
【０００７】このようなｒＲＮＡ特異的プローブを使用
する微生物の同定方法は、すでに数回、開示されている
[ＥＰ−Ｂ ０ １５５ ３５９、ＷＯ ８４／０２７２
１、ＥＰ−Ａ ０ ０７６ １２３]。
する微生物の同定方法は、すでに数回、開示されている
[ＥＰ−Ｂ ０ １５５ ３５９、ＷＯ ８４／０２７２
１、ＥＰ−Ａ ０ ０７６ １２３]。
【０００８】配列がｒＲＮＡの部分領域と相補的である
プローブ[ＥＰ−Ａ ０ ２７２ ００９]は、ナイセリア
・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)の検出に既に使
用されたことがある。しかしながら、明確な試験結果
は、ＥＰ−Ａ ０ ２７２ ００９に開示されているプロ
ーブを使用して達成できなかった。さらに、これらのプ
ローブを使用する場合の検出の感度は、培養方法の感度
よりも劣る[パンク(Ｐanke)ら、ジャーナル・オブ・ク
リニカル・マイクロバイオロジー(Ｊ.Ｃlin.Ｍicrobio
l.)、２９、(１９９１)、８８３−８８８]。
プローブ[ＥＰ−Ａ ０ ２７２ ００９]は、ナイセリア
・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)の検出に既に使
用されたことがある。しかしながら、明確な試験結果
は、ＥＰ−Ａ ０ ２７２ ００９に開示されているプロ
ーブを使用して達成できなかった。さらに、これらのプ
ローブを使用する場合の検出の感度は、培養方法の感度
よりも劣る[パンク(Ｐanke)ら、ジャーナル・オブ・ク
リニカル・マイクロバイオロジー(Ｊ.Ｃlin.Ｍicrobio
l.)、２９、(１９９１)、８８３−８８８]。
【０００９】ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gono
rrhoeae)に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
はＥＰ−Ａ ０ ４０８ ０７７に開示されている。これ
らのプローブは、ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria
gonorrhoeae)の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分領域と一致す
る。ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)
の２３Ｓ ｒＲＮＡとハイブリダイズする核酸プローブ
は、ＥＰ−Ａ ０ ４０８０７７に開示されていなかっ
た。しかしながら、このようなプローブは、配列の長さ
が特異的プローブをより大きく選択をさせるので重要な
ものである。
rrhoeae)に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
はＥＰ−Ａ ０ ４０８ ０７７に開示されている。これ
らのプローブは、ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria
gonorrhoeae)の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分領域と一致す
る。ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)
の２３Ｓ ｒＲＮＡとハイブリダイズする核酸プローブ
は、ＥＰ−Ａ ０ ４０８０７７に開示されていなかっ
た。しかしながら、このようなプローブは、配列の長さ
が特異的プローブをより大きく選択をさせるので重要な
ものである。
【００１０】１６Ｓ ｒＲＮＡの配列および２３Ｓ ｒＲ
ＮＡ遺伝子の５'領域由来の配列と一致する核酸プロー
ブはＷＯ ９０／１４４４２に開示されている。しかし
ながら、ナイセリア種の区別を行うために、非常にスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件が適用され
るべきである[６０℃で０.９mol／リットル ＮaＣlの存
在下でのハイブリダイゼーション、６０℃で０.０３mol
／リットル ＮaＣlの存在下で洗浄]。ＷＯ ９０／１４
４４２に開示されているプローブのいくつかは、また、
これらの非常にストリンジェントな条件下でさえ、非病
原種エヌ・フラバ(Ｎ.flava)とハイブリダイズする。Ｅ
Ｐ−Ａ ０ ３３７ ８９６に開示されている２３Ｓ ｒＲ
ＮＡ特異的核酸プローブは、また、非常にストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件を必要とし、これら
の条件下でさえエヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)と特
異的にハイブリダイズしないが、例えばエヌ・メニンギ
チジス(Ｎ.meningitidis)のような他のナイセリア種と
は特異的にハイブリダイズする。しかしながら、１６Ｓ
および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域由来
の核酸プローブはエヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の
検出についてＥＰ−Ａ ０ ４５２ ５９６に提案されて
いるが、非病原性種ナイセリア・シネレー(Ｎeisseria
cinerea)のいくつかの菌株の核酸とハイブリダイズす
る。したがって、これらの前記２３Ｓ ｒＲＮＡプロー
ブおよびｒＲＮＡスペーサー特異的プローブは、エヌ・
ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の特異的検出には適してい
ない。
ＮＡ遺伝子の５'領域由来の配列と一致する核酸プロー
ブはＷＯ ９０／１４４４２に開示されている。しかし
ながら、ナイセリア種の区別を行うために、非常にスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件が適用され
るべきである[６０℃で０.９mol／リットル ＮaＣlの存
在下でのハイブリダイゼーション、６０℃で０.０３mol
／リットル ＮaＣlの存在下で洗浄]。ＷＯ ９０／１４
４４２に開示されているプローブのいくつかは、また、
これらの非常にストリンジェントな条件下でさえ、非病
原種エヌ・フラバ(Ｎ.flava)とハイブリダイズする。Ｅ
Ｐ−Ａ ０ ３３７ ８９６に開示されている２３Ｓ ｒＲ
ＮＡ特異的核酸プローブは、また、非常にストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件を必要とし、これら
の条件下でさえエヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)と特
異的にハイブリダイズしないが、例えばエヌ・メニンギ
チジス(Ｎ.meningitidis)のような他のナイセリア種と
は特異的にハイブリダイズする。しかしながら、１６Ｓ
および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域由来
の核酸プローブはエヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の
検出についてＥＰ−Ａ ０ ４５２ ５９６に提案されて
いるが、非病原性種ナイセリア・シネレー(Ｎeisseria
cinerea)のいくつかの菌株の核酸とハイブリダイズす
る。したがって、これらの前記２３Ｓ ｒＲＮＡプロー
ブおよびｒＲＮＡスペーサー特異的プローブは、エヌ・
ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の特異的検出には適してい
ない。
【００１１】したがって、本発明の目的は、通常のハイ
ブリダイゼーション条件下で高い特異性および感受性を
有する、かくして、この病原体の信頼性のある定性的お
よび定量的検出を可能にするナイセリア・ゴノロエエ
(Ｎeisseria gonorrhoeae)に関する核酸プローブを提供
することである。
ブリダイゼーション条件下で高い特異性および感受性を
有する、かくして、この病原体の信頼性のある定性的お
よび定量的検出を可能にするナイセリア・ゴノロエエ
(Ｎeisseria gonorrhoeae)に関する核酸プローブを提供
することである。
【００１２】この目的は、ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎe
isseria gonorrhoeae)に対して特異的であり、配列番号
１〜１５に示される配列の少なくとも１つを有する核酸
プローブによって達成される。サブグループ配列番号
１、３、５、７、９、１１、１３のオリゴヌクレオチド
の配列は、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分領域またはそ
の３'側に位置するスペーサー領域と一致する。サブグ
ループ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４およ
び１５のオリゴヌクレオチドの配列は、これらの部分領
域と相補的である。細胞ｒＲＮＡまたはその前駆体は、
後者のサブグループを使用して直接ハイブリダイゼーシ
ョン調製法で検出され得るだけであるが、対応するＲＮ
ＡをコードするゲノムＤＮＡは両方のサブグループで検
出され得る。
isseria gonorrhoeae)に対して特異的であり、配列番号
１〜１５に示される配列の少なくとも１つを有する核酸
プローブによって達成される。サブグループ配列番号
１、３、５、７、９、１１、１３のオリゴヌクレオチド
の配列は、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分領域またはそ
の３'側に位置するスペーサー領域と一致する。サブグ
ループ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４およ
び１５のオリゴヌクレオチドの配列は、これらの部分領
域と相補的である。細胞ｒＲＮＡまたはその前駆体は、
後者のサブグループを使用して直接ハイブリダイゼーシ
ョン調製法で検出され得るだけであるが、対応するＲＮ
ＡをコードするゲノムＤＮＡは両方のサブグループで検
出され得る。
【００１３】当該オリゴヌクレオチドの配列を下記「表
１」に示す。
１」に示す。
【００１４】
【表１】 ＊Ｒ：オリゴヌクレオチドは２３Ｓ ｒＲＮＡ配列と一
致する。 Ｓ：オリゴヌクレオチドはスペーサー領域と一致する。
致する。 Ｓ：オリゴヌクレオチドはスペーサー領域と一致する。
【００１５】意外にも、本発明のプローブでナイセリア
・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)を特異的に検出
することが可能である。一般に使用されるあまりストリ
ンジェントではないハイブリダイゼーション条件下(４
０℃で０.９mol／リットル ＮaＣlの存在下でのハイブ
リダイゼーション、４２〜６０℃で０.３６mol／リット
ルＮaＣlの存在下での洗浄)でさえ、これらのプローブ
は、例えば、エヌ・フラバ(Ｎ.flava)およびエヌ・シネ
レー(Ｎ.cinerea)のような非常に関連するナイリア種と
ハイブリダイズしない。したがって、それから結果とし
て生じる高い特異性は、病原体エヌ・ゴノロエエ(Ｎ.go
norrhoeae)とは別に、ヒトの粘膜の一成分である多くの
非病原性ナイセリア種が試験されるべき試料中に存在す
ることができるので、非常に重要性のあるものである。
・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)を特異的に検出
することが可能である。一般に使用されるあまりストリ
ンジェントではないハイブリダイゼーション条件下(４
０℃で０.９mol／リットル ＮaＣlの存在下でのハイブ
リダイゼーション、４２〜６０℃で０.３６mol／リット
ルＮaＣlの存在下での洗浄)でさえ、これらのプローブ
は、例えば、エヌ・フラバ(Ｎ.flava)およびエヌ・シネ
レー(Ｎ.cinerea)のような非常に関連するナイリア種と
ハイブリダイズしない。したがって、それから結果とし
て生じる高い特異性は、病原体エヌ・ゴノロエエ(Ｎ.go
norrhoeae)とは別に、ヒトの粘膜の一成分である多くの
非病原性ナイセリア種が試験されるべき試料中に存在す
ることができるので、非常に重要性のあるものである。
【００１６】本発明のプローブは、少なくとも１４ヌク
レオチド長である。しかしながら、それらは、それらの
５'および／または３'末端に、好ましくは８個までの、
さらなるヌクレオチドを有することができる。しかしな
がら、合計長さが３０ヌクレオチドを越えるべきではな
い。
レオチド長である。しかしながら、それらは、それらの
５'および／または３'末端に、好ましくは８個までの、
さらなるヌクレオチドを有することができる。しかしな
がら、合計長さが３０ヌクレオチドを越えるべきではな
い。
【００１７】したがって、本発明は、配列番号１〜１５
に示される配列の少なくとも１つおよびその５'および
／または３'末端に、さらなるヌクレオチド、好ましく
は８個までのさらなるヌクレオチドを有するナイセリア
・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)特異的核酸プロ
ーブに関するものである。
に示される配列の少なくとも１つおよびその５'および
／または３'末端に、さらなるヌクレオチド、好ましく
は８個までのさらなるヌクレオチドを有するナイセリア
・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)特異的核酸プロ
ーブに関するものである。
【００１８】この場合、当該プローブのさらなるヌクレ
オチドは、いずれかの所望のヌクレオチドであることが
できるが、しかしながら、５'もしくは３'末端のｒＤＮ
Ａに存在するヌクレオチドまたはそれらの相補的なヌク
レオチドと一致するこれらのヌクレオチドが好ましい。
オチドは、いずれかの所望のヌクレオチドであることが
できるが、しかしながら、５'もしくは３'末端のｒＤＮ
Ａに存在するヌクレオチドまたはそれらの相補的なヌク
レオチドと一致するこれらのヌクレオチドが好ましい。
【００１９】本発明のエヌ・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoea
e)に対して特異的な核酸プローブは、例えばクローニン
グベクターのようなナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseri
a gonorrhoeae)のＤＮＡまたはＲＮＡに対するホモロジ
ーを有しない他の配列に関連する、一本鎖オリゴヌクレ
オチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチド断片のような種
々の形態で存在することができる。二本鎖プローブを使
用する場合、実際の試験反応を行う前に、プローブを変
性させることが必須である。本発明の核酸プローブは、
修飾ならびに非修飾のリボヌクレオチドおよび／または
デオキシリボヌクレオチドを含有することができる。Ｍ
１３のような一本鎖ベクターおよびｐＢＲ３２２のよう
な二本鎖ベクターならびにその誘導体を使用して、これ
らの核酸プローブをクローン化することができる。さら
にまた、「表１」に挙げたプローブの配列は一緒に結合
することができ、この結果、例えば、１つのベクターに
２つ以上のプローブが存在する。
e)に対して特異的な核酸プローブは、例えばクローニン
グベクターのようなナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseri
a gonorrhoeae)のＤＮＡまたはＲＮＡに対するホモロジ
ーを有しない他の配列に関連する、一本鎖オリゴヌクレ
オチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチド断片のような種
々の形態で存在することができる。二本鎖プローブを使
用する場合、実際の試験反応を行う前に、プローブを変
性させることが必須である。本発明の核酸プローブは、
修飾ならびに非修飾のリボヌクレオチドおよび／または
デオキシリボヌクレオチドを含有することができる。Ｍ
１３のような一本鎖ベクターおよびｐＢＲ３２２のよう
な二本鎖ベクターならびにその誘導体を使用して、これ
らの核酸プローブをクローン化することができる。さら
にまた、「表１」に挙げたプローブの配列は一緒に結合
することができ、この結果、例えば、１つのベクターに
２つ以上のプローブが存在する。
【００２０】本発明は、一本鎖または二本鎖ベクターに
おいてクローン化された配列番号１〜１５で示される配
列の１個または数個のコピーを含有することを特徴とす
るナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)に
対して特異的である核酸プローブに関するものでもあ
る。
おいてクローン化された配列番号１〜１５で示される配
列の１個または数個のコピーを含有することを特徴とす
るナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)に
対して特異的である核酸プローブに関するものでもあ
る。
【００２１】本発明の好ましい具体例では、核酸プロー
ブは標識される。放射性同位体の取込みまたは酵素的標
識化抗体または蛍光標識化抗体によって検出され得るジ
ゴキシゲニン結合ヌクレオチドのような非放射性標識の
取込みのような当業者に公知の全てのタイプの標識化が
これに適している。
ブは標識される。放射性同位体の取込みまたは酵素的標
識化抗体または蛍光標識化抗体によって検出され得るジ
ゴキシゲニン結合ヌクレオチドのような非放射性標識の
取込みのような当業者に公知の全てのタイプの標識化が
これに適している。
【００２２】さらに、本発明は、通常のハイブリダイゼ
ーション条件下で、試験されるべき試料のＤＮＡまたは
ＲＮＡを本発明の少なくとも１つのプローブとハイブリ
ダイズし、ハイブリッド形成を検出することによるエヌ
・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の検出方法に関する。
ーション条件下で、試験されるべき試料のＤＮＡまたは
ＲＮＡを本発明の少なくとも１つのプローブとハイブリ
ダイズし、ハイブリッド形成を検出することによるエヌ
・ゴノロエエ(Ｎ.gonorrhoeae)の検出方法に関する。
【００２３】本発明の核酸プローブは、ｒＲＮＡおよび
細菌ゲノム上の対応するｒＲＮＡ遺伝子とハイブリダイ
ズする。したがって、本発明の方法では、両方の核酸の
タイプを介して定量的および定性的にエヌ・ゴノロエエ
(Ｎ.gonorrhoeae)の存在および不在を決定することがで
きる。
細菌ゲノム上の対応するｒＲＮＡ遺伝子とハイブリダイ
ズする。したがって、本発明の方法では、両方の核酸の
タイプを介して定量的および定性的にエヌ・ゴノロエエ
(Ｎ.gonorrhoeae)の存在および不在を決定することがで
きる。
【００２４】本発明のプローブの少なくとも１つとのハ
イブリダイゼーションを介する検出は、ハイブリダイゼ
ーションを介する通常の核酸の検出方法に従って行われ
る[サザーン(Ｓouthern)、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)、９８、１９７
５、５０３]。固相ハイブリダイゼーション、液中ハイ
ブリダイゼーション、サンドイッチハイブリダイゼーシ
ョン、二成分ハイブリダイゼーションのような全ての公
知のハイブリダイゼーションを使用することができる。
検出は、プローブの放射性または非放射性標識化によっ
て、常法に従って、行われる。
イブリダイゼーションを介する検出は、ハイブリダイゼ
ーションを介する通常の核酸の検出方法に従って行われ
る[サザーン(Ｓouthern)、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)、９８、１９７
５、５０３]。固相ハイブリダイゼーション、液中ハイ
ブリダイゼーション、サンドイッチハイブリダイゼーシ
ョン、二成分ハイブリダイゼーションのような全ての公
知のハイブリダイゼーションを使用することができる。
検出は、プローブの放射性または非放射性標識化によっ
て、常法に従って、行われる。
【００２５】本発明は、本発明の核酸プローブを示す配
列プロトコール１〜１５およびナイセリア・ゴノロエエ
(Ｎeisseria gonorrhoeae)の非放射性検出を示す「図
１」と合わせて以下の実施例によってさらに説明され
る。
列プロトコール１〜１５およびナイセリア・ゴノロエエ
(Ｎeisseria gonorrhoeae)の非放射性検出を示す「図
１」と合わせて以下の実施例によってさらに説明され
る。
【００２６】
実施例１ スターン(Ｓtern)ら[セル(Ｃell)、３７、(１９８４)、
４４７]によって開示されたプロトコールに従って、以
下に挙げられる種の細菌性染色体ＤＮＡの調製を行う。
４４７]によって開示されたプロトコールに従って、以
下に挙げられる種の細菌性染色体ＤＮＡの調製を行う。
【００２７】スロット−ブロット装置を使用して、ニト
ロセルロースフィルターに以下の種の染色体ＤＮＡ(各
々、２５０ng)を適用する。
ロセルロースフィルターに以下の種の染色体ＤＮＡ(各
々、２５０ng)を適用する。
【００２８】病原性ナイセリア種： ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae) ナイセリア・メニンギチジス(Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）
【００２９】非病原性ナイセリア種： エヌ・ラクタミカ（Ｎ.lactamica) エヌ・ムコーザ(Ｎ.mucosa) エヌ・サブフラバ(Ｎ.subflava) エヌ・シッカ(Ｎ.sicca) エヌ・エロンガタ(Ｎ.elongata) エヌ・シネレー(Ｎ.cinerea) エヌ・フラバ(Ｎ.flava) エヌ・デニトリフィカンス(Ｎ.denitrificans)
【００３０】このために、フィルターを２×緩衝液(２
×緩衝液：２mol／リットルＮaＣl、５０mmol／リット
ルＴris−ＨＣl、pＨ７.５および１mmol／リットルＥＤ
ＴＡ)で湿らせ、クランプし、真空にした。ＤＮＡ(濃度
０.１〜１μg／マイクロリットル)に５０マイクロリッ
トルの５０mmol／リットルＴris−ＨＣl(pＨ７.５)、５
mmol／リットルＥＤＴＡを添加し、変性のために３分間
沸騰させた。次いで、すぐに、混合物を氷上に移し、２
×緩衝液５０マイクロリットルを添加し、この溶液をス
ロット−ブロット装置のスロット中にピペットで入れ
た。このスロットを１×緩衝液(水で１：１に希釈した
２×緩衝液)１００マイクロリットルで洗浄し、装置か
らフィルターを取り外し、風乾し、８０℃で２時間、真
空中で焼付けた。
×緩衝液：２mol／リットルＮaＣl、５０mmol／リット
ルＴris−ＨＣl、pＨ７.５および１mmol／リットルＥＤ
ＴＡ)で湿らせ、クランプし、真空にした。ＤＮＡ(濃度
０.１〜１μg／マイクロリットル)に５０マイクロリッ
トルの５０mmol／リットルＴris−ＨＣl(pＨ７.５)、５
mmol／リットルＥＤＴＡを添加し、変性のために３分間
沸騰させた。次いで、すぐに、混合物を氷上に移し、２
×緩衝液５０マイクロリットルを添加し、この溶液をス
ロット−ブロット装置のスロット中にピペットで入れ
た。このスロットを１×緩衝液(水で１：１に希釈した
２×緩衝液)１００マイクロリットルで洗浄し、装置か
らフィルターを取り外し、風乾し、８０℃で２時間、真
空中で焼付けた。
【００３１】常法に従って、本発明のオリゴヌクレオチ
ドとのハイブリダイゼーションを行う。まず、ニトロセ
ルロースフィルターを１×ＶＨＰ(２×ＶＨＰ：０.１％
ウシ血清アルブミン、０.１％フィコール(Ｆicoll) ４
００,０００、０.１％ポリビニルプロピリドン、１％グ
リセロール、１.８mol／リットルＮaＣl、５０mmol／リ
ットルＮa2ＨＰＯ4、５０mmol／リットルＮaＨ2ＰＯ4、
１０mmol／リットルＥＤＴＡおよび１０mg／ミリリット
ル熱変性ニシン精子ＤＮＡ)中で２時間、予備ハイブリ
ダイズする。
ドとのハイブリダイゼーションを行う。まず、ニトロセ
ルロースフィルターを１×ＶＨＰ(２×ＶＨＰ：０.１％
ウシ血清アルブミン、０.１％フィコール(Ｆicoll) ４
００,０００、０.１％ポリビニルプロピリドン、１％グ
リセロール、１.８mol／リットルＮaＣl、５０mmol／リ
ットルＮa2ＨＰＯ4、５０mmol／リットルＮaＨ2ＰＯ4、
１０mmol／リットルＥＤＴＡおよび１０mg／ミリリット
ル熱変性ニシン精子ＤＮＡ)中で２時間、予備ハイブリ
ダイズする。
【００３２】ハイブリダイゼーションのためにＶＨＰを
除去し、ハイブリダイゼーション緩衝液(ＨＢ)中で32Ｐ
標識化オリゴヌクレオチドプローブによって置換した
[ＨＢ：１×ＶＨＰ；製造者の指示書に従って、ランダ
ムプライムされたＤＮＡ標識キット(ベーリンガー・マ
ンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル
・ハフツング(Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ)、カタロ
グ番号１００４ ７６０号)で試料を標識化する]。ハイ
ブリダイゼーションは、４０℃のハイブリダイゼーショ
ンオーブン中で行う。使用前にＨＢを８０℃に加熱す
る。少なくとも６時間のハイブリダイゼーション期間の
後、フィルターを洗浄緩衝液(ＷＢ：０.３６mol／リッ
トルＮaＣl、１０mmol／リットルＮa2ＨＰＯ4、１０mmo
l／リットルＮaＨ2ＰＯ4、２mmol／リットルＥＤＴＡ、
０.０５％ＳＤＳ)中で、最初に室温で２回、次いで、４
２℃で２回洗浄する。洗浄温度は、試料のＧＣ含量に依
存して最大６０℃まで上昇させる。当該種のＤＮＡを最
適に識別させる試験されるプローブに関する実際の最高
洗浄温度を「表２」に示す。
除去し、ハイブリダイゼーション緩衝液(ＨＢ)中で32Ｐ
標識化オリゴヌクレオチドプローブによって置換した
[ＨＢ：１×ＶＨＰ；製造者の指示書に従って、ランダ
ムプライムされたＤＮＡ標識キット(ベーリンガー・マ
ンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル
・ハフツング(Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ)、カタロ
グ番号１００４ ７６０号)で試料を標識化する]。ハイ
ブリダイゼーションは、４０℃のハイブリダイゼーショ
ンオーブン中で行う。使用前にＨＢを８０℃に加熱す
る。少なくとも６時間のハイブリダイゼーション期間の
後、フィルターを洗浄緩衝液(ＷＢ：０.３６mol／リッ
トルＮaＣl、１０mmol／リットルＮa2ＨＰＯ4、１０mmo
l／リットルＮaＨ2ＰＯ4、２mmol／リットルＥＤＴＡ、
０.０５％ＳＤＳ)中で、最初に室温で２回、次いで、４
２℃で２回洗浄する。洗浄温度は、試料のＧＣ含量に依
存して最大６０℃まで上昇させる。当該種のＤＮＡを最
適に識別させる試験されるプローブに関する実際の最高
洗浄温度を「表２」に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】次に、常法に従って、フィルターをＸ線フ
ィルムに暴露し、評価する。
ィルムに暴露し、評価する。
【００３５】種々の核酸プローブの、病原性および非病
原性種とのハイブリダイゼーションの結果を「表３」お
よび「表４」に示す。
原性種とのハイブリダイゼーションの結果を「表３」お
よび「表４」に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
【表４】
【００３８】＊ベルゲイズ・マニュアル・オブ・システ
マティク・バクテリオロジー(Ｂergey's Ｍanual of Ｓ
ystematic Ｂacteriology)、クリーグ・エヌ・アール
(Ｋrieg Ｎ.Ｒ.)、ホルト・ジー(Ｈolt Ｇ.)編、ウイリ
アムズ・アンド・ウイルキンズ(Ｗilliams and Ｗilkin
s)、バルチモア(１９８４)、２８８−２９８に従って分
類した。
マティク・バクテリオロジー(Ｂergey's Ｍanual of Ｓ
ystematic Ｂacteriology)、クリーグ・エヌ・アール
(Ｋrieg Ｎ.Ｒ.)、ホルト・ジー(Ｈolt Ｇ.)編、ウイリ
アムズ・アンド・ウイルキンズ(Ｗilliams and Ｗilkin
s)、バルチモア(１９８４)、２８８−２９８に従って分
類した。
【００３９】核酸プローブの特異性を検査するために、
第２のハイブリダイゼーション調製例で、さらなる対照
として非ナイセリア種(ヒト粘膜のコロナイザーも含む)
のゲノムＤＮＡを取り込む。
第２のハイブリダイゼーション調製例で、さらなる対照
として非ナイセリア種(ヒト粘膜のコロナイザーも含む)
のゲノムＤＮＡを取り込む。
【００４０】このハイブリダイゼーションの結果を「表
５」および「表６」に示す。
５」および「表６」に示す。
【００４１】
【表５】
【００４２】
【表６】
【００４３】実施例２ ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)の非
放射性検出 ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)の非
放射性検出について、まず、特異的ＤＮＡ断片をポリメ
ラーゼ連鎖反応によって増幅させ、この断片を同時にＤ
ＩＧ−１１−ｄＵＴＰの取込みによって標識する。次い
で、これらの標識した断片を、これらの断片とハイブリ
ダイズすることができ、それ故に、カプチャープローブ
として作用することができるオリゴヌクレオチドに添加
する。次いで、これらのオリゴヌクレオチドの３'末端
とビオチンとを結合させ、これによって、これらのオリ
ゴヌクレオチドを、ストレプトアビジンを塗布した微量
滴定プレートに結合させることによって固定化を行う。
次なる洗浄工程で、カプチャープローブとして作用する
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができな
い非特異的ＰＣＲ断片を除去する。結合した特異的ＤＮ
Ａ部の検出は、ジゴキシゲニンに対するＰＯＤとコンジ
ュゲートした抗体およびペルオキシダーゼ反応に関する
ＡＢＴＳR基質溶液の添加の後にジゴキシゲニン標識に
よって行われる。次いで、増幅したＤＮＡ断片をカプチ
ャープローブに結合させて、光度計で測定することがで
きる基質の変換を介して検出することができる(「図
１」を参照)。
放射性検出 ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)の非
放射性検出について、まず、特異的ＤＮＡ断片をポリメ
ラーゼ連鎖反応によって増幅させ、この断片を同時にＤ
ＩＧ−１１−ｄＵＴＰの取込みによって標識する。次い
で、これらの標識した断片を、これらの断片とハイブリ
ダイズすることができ、それ故に、カプチャープローブ
として作用することができるオリゴヌクレオチドに添加
する。次いで、これらのオリゴヌクレオチドの３'末端
とビオチンとを結合させ、これによって、これらのオリ
ゴヌクレオチドを、ストレプトアビジンを塗布した微量
滴定プレートに結合させることによって固定化を行う。
次なる洗浄工程で、カプチャープローブとして作用する
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができな
い非特異的ＰＣＲ断片を除去する。結合した特異的ＤＮ
Ａ部の検出は、ジゴキシゲニンに対するＰＯＤとコンジ
ュゲートした抗体およびペルオキシダーゼ反応に関する
ＡＢＴＳR基質溶液の添加の後にジゴキシゲニン標識に
よって行われる。次いで、増幅したＤＮＡ断片をカプチ
ャープローブに結合させて、光度計で測定することがで
きる基質の変換を介して検出することができる(「図
１」を参照)。
【００４４】実験を行うために、まず、ＥＰ−Ａ ０ ３
４４ ５７８に従って、９６ウエル微量滴定プレートの
ウエルに、４℃で一晩、ストレプトアビジン(ＰＢＳ中
１μg／ミリリットルの溶液１００マイクロリットル)を
塗布し、室温で２時間、ＢＳＡ(１０mg／ミリリットル
のウシ血清アルブミン)３００マイクロリットルとのイ
ンキュベーションによって、遊離している非特異的結合
部位をブロックする。
４４ ５７８に従って、９６ウエル微量滴定プレートの
ウエルに、４℃で一晩、ストレプトアビジン(ＰＢＳ中
１μg／ミリリットルの溶液１００マイクロリットル)を
塗布し、室温で２時間、ＢＳＡ(１０mg／ミリリットル
のウシ血清アルブミン)３００マイクロリットルとのイ
ンキュベーションによって、遊離している非特異的結合
部位をブロックする。
【００４５】染色体淋菌性ＤＮＡ由来の特異的ＤＮＡ断
片の増幅のためにＰＣＲプライマーとして配列番号１お
よび１５のオリゴヌクレオチドを選択する。これらのプ
ライマーのハイブリダイゼーションは５７℃の温度で行
われる。常法に従って、次なるＰＣＲを行う。この方法
で得られた生成物は７５０ｂｐの長さを有する。ＤＮＡ
断片を変性させるために、ＴＥ緩衝液２０マイクロリッ
トルおよび０.５mol／リットルＮaＯＨ １０マイクロリ
ットルを増幅混合物２０マイクロリットルに添加し、室
温で１０分間インキュベートする。この変性混合物を、
酸性化したハイブリダイゼーション溶液(５０mmol／リ
ットル リン酸ナトリウム緩衝液、pＨ６.８、０.０５mo
l／リットルＨＣl、０.７５mol／リットルＮaＣl、７５
mmol／リットル クエン酸ナトリウム、０.０５％ ＢＳ
Ａ、pＨ５.４)４５０マイクロリットルの添加によって
中和する。この溶液にビオチン標識化オリゴヌクレオチ
ド(１００ng／ミリリットル；カプチャープローブ、配
列番号５)を添加する。このハイブリダイゼーション混
合物２００マイクロリットルを、ストレプトアビジンを
塗布した微量滴定プレートに添加し、３７℃で３時間イ
ンキュベートする。ビオチン標識化オリゴヌクレオチド
を介してＤＮＡ断片を微量滴定プレートのストレプトア
ビジンコーティングに結合させる。次いで、該プレート
を０.９％ＮaＣl溶液で３回洗浄し、次いで、コンジュ
ゲート溶液[１００mmol／リットルＴris／ＨＣl(pＨ７.
５)、０.９％ＮaＣl、１％ＢＳＡ中２００mＵ／ミリリ
ットル ＜ＤＩＧ＞−ポリＰＯＤコンジュゲート(Ｆab：
ＰＯＤ＝１：１)]２００マイクロリットルを添加し、３
７℃で３０分間インキュベートする。０.９％ＮaＣl溶
液で３回洗浄した後、ＡＢＴＳR基質溶液(２,２'−アジ
ノ−ジ−[３−エチル−ベンゾチアゾリンスルホナート]
(１.９mmol／リットル))[ＡＢＴＳR緩衝液(ベーリンガ
ー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレン
クテル・ハフツング、カタログ番号第１２０４５３０
号)中のＡＢＴＳR(ベーリンガー・マンハイム・ゲゼル
シャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング、カ
タログ番号第７５６４０７号)]２００マイクロリットル
の添加によって基質反応を開始させる。３７℃で５〜１
５分間インキュベートした後、色の変化を光度計で４０
５nmで測定する[イージー・リーダー(Ｅasy Ｒeader)
ＥＡＲ ４００ ＦＷ 微量滴定プレートリーダー、ＳＬ
Ｔ−ラブインストゥルメンツ(Ｌabinstruments)、グレ
ディヒ／ザルツブルグ]。
片の増幅のためにＰＣＲプライマーとして配列番号１お
よび１５のオリゴヌクレオチドを選択する。これらのプ
ライマーのハイブリダイゼーションは５７℃の温度で行
われる。常法に従って、次なるＰＣＲを行う。この方法
で得られた生成物は７５０ｂｐの長さを有する。ＤＮＡ
断片を変性させるために、ＴＥ緩衝液２０マイクロリッ
トルおよび０.５mol／リットルＮaＯＨ １０マイクロリ
ットルを増幅混合物２０マイクロリットルに添加し、室
温で１０分間インキュベートする。この変性混合物を、
酸性化したハイブリダイゼーション溶液(５０mmol／リ
ットル リン酸ナトリウム緩衝液、pＨ６.８、０.０５mo
l／リットルＨＣl、０.７５mol／リットルＮaＣl、７５
mmol／リットル クエン酸ナトリウム、０.０５％ ＢＳ
Ａ、pＨ５.４)４５０マイクロリットルの添加によって
中和する。この溶液にビオチン標識化オリゴヌクレオチ
ド(１００ng／ミリリットル；カプチャープローブ、配
列番号５)を添加する。このハイブリダイゼーション混
合物２００マイクロリットルを、ストレプトアビジンを
塗布した微量滴定プレートに添加し、３７℃で３時間イ
ンキュベートする。ビオチン標識化オリゴヌクレオチド
を介してＤＮＡ断片を微量滴定プレートのストレプトア
ビジンコーティングに結合させる。次いで、該プレート
を０.９％ＮaＣl溶液で３回洗浄し、次いで、コンジュ
ゲート溶液[１００mmol／リットルＴris／ＨＣl(pＨ７.
５)、０.９％ＮaＣl、１％ＢＳＡ中２００mＵ／ミリリ
ットル ＜ＤＩＧ＞−ポリＰＯＤコンジュゲート(Ｆab：
ＰＯＤ＝１：１)]２００マイクロリットルを添加し、３
７℃で３０分間インキュベートする。０.９％ＮaＣl溶
液で３回洗浄した後、ＡＢＴＳR基質溶液(２,２'−アジ
ノ−ジ−[３−エチル−ベンゾチアゾリンスルホナート]
(１.９mmol／リットル))[ＡＢＴＳR緩衝液(ベーリンガ
ー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレン
クテル・ハフツング、カタログ番号第１２０４５３０
号)中のＡＢＴＳR(ベーリンガー・マンハイム・ゲゼル
シャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング、カ
タログ番号第７５６４０７号)]２００マイクロリットル
の添加によって基質反応を開始させる。３７℃で５〜１
５分間インキュベートした後、色の変化を光度計で４０
５nmで測定する[イージー・リーダー(Ｅasy Ｒeader)
ＥＡＲ ４００ ＦＷ 微量滴定プレートリーダー、ＳＬ
Ｔ−ラブインストゥルメンツ(Ｌabinstruments)、グレ
ディヒ／ザルツブルグ]。
【００４６】
【００４７】配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 GCTGTGGGTA GGGGTGA
【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 TCACCCCTAC CCACAGC
【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 ＣＡＧＧＴＧＧＧＴＡ ＧＧＡＴＧＡＧ
【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 CTCATCCTAC CCACCTG
【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 GTAGGCTGAT GAAGGT
【００５２】配列番号：６ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 ACCTTCATCA GCCTAC
【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 ATCCGGGTTT TCTTAACA
【００５４】配列番号：８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 TGTTAAGAAA ACCCGGAT
【００５５】配列番号：９ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 ACAAGTCGGG CAGGTGC
【００５６】配列番号：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 GCACCTGCCC GACTTGT
【００５７】配列番号：１１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 GAAGGACTTC AAGAGAT
【００５８】配列番号：１２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 ATCTCTTGAA GTCCTTC
【００５９】配列番号：１３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 CGATTTGCAA CAGTTTA
【００６０】配列番号：１４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 TAAACTGTTG CAAATCG
【００６１】配列番号：１５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to rＲＮＡ 配列 TTCTCGGTGT TAAGAAA
【図１】 ナイセリア・ゴノロエエ(Ｎeisseria gonorr
hoeae)の非放射性検出法を示すアルゴリズム。
hoeae)の非放射性検出法を示すアルゴリズム。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンネ・シュテルン ドイツ連邦共和国デー−8122ペンツベル ク、カルヴェンデルシュトラーセ10番 (72)発明者 カリン・ヴォルフ ドイツ連邦共和国デー−8034ゲルメリン グ、フリートラントシュトラーセ23番
Claims (5)
- 【請求項１】 以下の配列：GCTGTGGGTA GGGGTGA(配列
番号１)、TCACCCCTACCCACAGC(配列番号２)、CAGGTGGGTA
GGATGAG(配列番号３)、CTCATCCTAC CCACCTG(配列番号
４)、GTAGGCTGAT GAAGGT(配列番号５)、ACCTTCATCA GCC
TAC(配列番号６)、ATCCGGGTTT TCTTAACA(配列番号７)、
TGTTAAGAAA ACCCGGAT(配列番号８)、ACAAGTCGGG CAGGTG
C(配列番号９)、GCACCTGCCC GACTTGT(配列番号１０)、G
AAGGACTTC AAGAGAT(配列番号１１)、ATCTCTTGAA GTCCTT
C(配列番号１２)、CGATTTGCAACAGTTTA(配列番号１３)、
TAAACTGTTG CAAATCG(配列番号１４)、TTCTCGGTGT TAAGA
AA(配列番号１５)の少なくとも１つを含有するナイセリ
ア・ゴロノエエ(Ｎeisseria gonorrhoeae)特異的核酸プ
ローブ。 - 【請求項２】 ５'および／または３'末端に８個までの
さらなるヌクレオチドを有する請求項１記載のプロー
ブ。 - 【請求項３】 一本鎖または二本鎖ベクター上に１個ま
たは数個のコピーが存在する請求項１または２記載のプ
ローブ。 - 【請求項４】 試験されるべき試料のＤＮＡまたはＲＮ
Ａをプローブとハイブリダイズさせ、次いで、ハイブリ
ッド形成を検出することよりなり、請求項１〜３のいず
れか１項記載のプローブを使用することを特徴とする、
病原性ナイセリア(Ｎeisseria)種エヌ・ゴノロエエ(Ｎ.
gonorrhoeae)の検出方法。 - 【請求項５】 ハイブリッド形成がプローブの標識化に
よって検出される請求項４記載の方法。
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|---|---|---|---|
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| DE4219821-6 | 1992-06-17 |
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|---|---|
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| JPH0817720B2 JPH0817720B2 (ja) | 1996-02-28 |
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|---|---|---|---|
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