DK171403B1

DK171403B1 - Peptidaldehyder og farmaceutiske præparater indeholdende sådanne forbindelser, samt fremgangsmåder til fremstilling heraf

Info

Publication number: DK171403B1
Application number: DK596385A
Authority: DK
Inventors: Sandor Bajusz; Erzsebet Szell; Daniel Bagdy; Eva Barabas; Mariann Dioszegi; Zsuzsa Fittler; Ferencz Jozsa; Gyula Horvath; Eva Tomori
Original assignee: Gyogyszerkutato Intezet
Priority date: 1984-12-21
Filing date: 1985-12-20
Publication date: 1996-10-14
Also published as: AU585561B2; US4703036A; ES550296A0; FI85980B; PT81746B; ES8708237A1; CN1025738C; CA1261547A; FI85980C; ATE68002T1; SU1384203A3; EP0185390A3; FI855118A0; EP0185390B1; EP0185390A2; DK596385D0; IL77416A; HUT38954A; PT81746A; HU192646B

Description

i DK 171403 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte peptidaldehyder og farmaceutiske præparater indeholdende sådanne forbindelser.

Ifølge opfindelsen er der tilvejebragt peptidalde-5 hydderivater med den almene formel R1

Xxx-Pro-Yyy-H.(HA)_ I

10 1 2 hvor R er hydrogen eller en C,, alkylgruppe og R er t 2 en C^_g alkylgruppe, idet både R og R er bundet til amino-gruppen i α-aminosyregruppen Xxx,

Xxx er en D-fenylalaninrest eller en D-a-aminosyre-15 gruppe med en C^_4 alkylgruppe i sidekæden,

Pro en L-prolinrest,

Yyy en L-, D- eller DL-argininrest og A en syrerest.

I de foran angivne definitioner menes der med C^_g 20 alkyl en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe, fx metyl, ætyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl eller n-hexyl.

Foretrukne repræsentanter for forbindelser med den almene formel I er dem der er beskrevet i omstående eksempler.

25 Særlige foretrukne repræsentanter for forbindelserne ifølge opfindelsen er følgende derivater: N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat, N,N-dimetyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd- sulfat, 30 N-ætyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat, N-isobutyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd- sulfat, N-metyl-D-alloisoleucyl-L-prolyl-L-argininaldehyd-sulfat og 35 N-n-hexyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd- sulfat.

Det er kendt at både blodkoaguleringsprocessen og lysis af blodklumper er resultater af proteolytiske reaktio- DK 171403 Bl 2 ner.Ved blodstørkningsprocessen repræsenterer thrombin-fibrinogen-reaktionen nøgletrinnet i hvilket fibrinogenet, opløst blodplasma, omdannes til den uopløselige fibrinpoly-mer, mens fibrinpolymeren ved den lytiske proces spaltes 5 til opløselige fragmenter på grund af den proteolytiske virkning af plasmin. Gode antikoagulanter til anvendelse i terapien forventes at inhibere blodkoaguleringsprocessen og at tillade plasmin-fibrin-reaktionen (lysis af det størknede blod) at forløbe. Fri tripeptidaldehydsalte af struk-10 turen D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd (ungarsk patentskrift nr. 169.870 og belgisk patentskrift nr.

891.708) er antikoagulanter med sådanne egenskaber. Disse forbindelser har ingen indflydelse på plasmin-fibrin-reaktionen. I nærværelse af dem og i afhængighed af deres kon-15 centration sker der enten ikke nogen dannelse af en fibrin-klump, eller der dannes kun en løs blodklump som let lyse-res af plasmin. Det er imidlertid også kendt at tripeptid-aldehyder med en fri aminoterminal gruppe er forholdsvis ustabile og hurtigt mister deres oprindelige høje enzymin-20 hiberende aktivitet, kun D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin- aldehydsulf at , beskrevet i belgisk patentskrift nr. 891.708, har væsentlig stabilitet og bevarer sin oprindelige aktivitet i kold opløsning (5°C) i en forlænget periode.

Ved afprøvning af stabiliteteni af D-fenylalanyl-25 L-prolyl-argininaldehydsulfat ved højere temperaturer viste det sig at det i vandig opløsning ved 80-100°C omdannedes i løbet af timer og ved 37-40°C i løbet af 10-14 dage praktisk talt fuldstændigt til-en stabil tricyklisk forbindelse uden nogen enzyminhiberende virkning. Strukturen af denne 30 forbindelse (1,2,4,5,6,6a-hexahydro-l-benzyl-2-oxo-8-(4’-guanidino)-butylpyrrolo[1,2-a]-imidazolo(2,1-c]-pyrazin) bekræftedes ved massespektrometri og NMR-spektroskopi.

Skønt det viste sig at de tilsvarende acyl-tripeptid-aldehyder ikke undergår en lignende omdannelse så inhiberer 35 acylderivaterne, dvs. t-butyloxykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydhemisulfat, ikke desto mindre både thrombin-fibrinogen-reaktionen og plasmin-fibrin-reaktionen (belgisk patentskrift nr. 891.708 og S. Bajusz et 3 DK 171403 B1 al i Peptides, Synthesis-Structure-Function (red.: H.D.

Rich og E. Gross), Pierce Chem. Co., Rockford, Illinois, USA, side 817) og disse forbindelser er mindre velegnede til antikoagulantterapi.

5 Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe hidtil ukendte peptidaldehyder som har den selektive antikoagulant-styrke som findes hos D-fenyl-alanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat, men som er mere stabile og ikke tilbøjelige til irreversibel ringslutning.

10 Det har nu uventet vist sig at tripeptidaldehyder som er alkylerede ved deres terminale aminogrupper, dvs. N-metyl-, N-ætyl- eller N-isobutyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulf at ikke omdannes irreversibelt til de ovennævnte tricykliske forbindelser. Ved stabilitetsaf-15 prøvning af vandige opløsninger af D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat såvel som af de tilsvarende N-alkyl-derivater ved en koncentration på 10 mg/ml (pH = 6,0) blev opløsningerne opbevaret ved 40°C i 5 dage. Omdannelsernes fremadskriden i opløsningerne overvågedes ved kromatografe-20 ring og ved måling af antithrombinaktiviteten.

Tyndlagskromatografering af D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat på silikaplader under anvendelse af et fremkalderopløsningsmiddel af ætylacetat/pyridin/ed-dikesyre/vand 30:20:6:11 viste at omdannelsesprocessen: 25 tripeptid-aldehydpletten (Rp = 0,40) gradvis gik ned under samtidig forøgelse af den plet som svarer til den tricykliske forbindelse (Rp = 0,6), mens ingen sådan omdannelse var konstaterbar i kromatogrammerne af N-metyl-, N-ætyl-, N-isobutyl- og N,N-dimetylderivaterne, idet blot pletterne 30 svarende til de intakte peptider var synlige (Rp henholdsvis 0,43, 0,50, 0,64 og 0,37).

Det viste sig desuden også at forskellige andre salte af N-alky1-tripeptidaldehyder, nemlig acetater, ligeledes ikke omdannes til de tilsvarende tricykliske forbin-35 delser mens D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydacetat er i særlig høj grad følsom for sådan.ne omdannelser.

Antithrombin-aktiviteterne bedømtes i et system indeholdende følgende komponenter: 4 DK 171403 B1 0,2 ml 0,5% oksefibrinogen i en 0,9%s opløsning af natriumklorid, 0,1 ml tris-(hydroxymetyl)-aminometan-hydroklorid/salt-syrepuffer pH 7,2 indeholdende peptidopløsnin-5 gen, og 0,1 ml US standard humant thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA), 10 enheder/ml opløsning. Koaguleringstiden for det peptidfrie system er 15 sekunder, målt i. et "Schnither-Gross-Coagulometer" .

10 Den oprindelige aktivitet af tripeptidaldehydsulfa- terne opstilledes arbitrært som den molære koncentration der inducerer en femdobbelt forlængelse af koaguleringstiden i det system som sammenlignes med kontrollen (Igg-værdi). Aktiviteten af peptiderne i opløsningerne, bedømt 15 på den 1., 3. og 5. dag, udtryktes som en procentdel af den oprindelige aktivitet (dag nul). Resultaterne fremgår af tabel 1.

I løbet af observationsperioden mistede D-fenylala-nyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat mere end 50% af sin 20 oprindelige aktivitet mens N-metylderivatet bevarede sin oprindelige styrke og aktiviteten af N-ætyl- og N-isobutyl-derivatet også reduceredes, men kun med 15-20%. Under de anvendte forsøgsbetingelser er forekomst af partiel racemi-sering i den terminale L-argininaldehyddel mest sandsynlig i 25 og den svage reduktion af aktiviteten kan tilskrives dette fænomen.

30 35 6 DK 171403 B1

Virkningen af N-alkyltripeptidaldehyder på plasmin-fibrin-reaktionen undersøgtes også og eftervistes på N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat i følgende system: 5 0,2 ml 0,5 %s oksefibrinogen i en 0,9%s opløsning af na triumklorid, 0,1 ml tris-(hydroxymetyl)-aminometanhydroklorid/saltsyrepuffer pH 7,2 indeholdende peptidet, 0,1 ml 0,1 enhed plasmin opløst i pufferopløsning (KABI, 10 Stockholm, Sverige) og 0,1 ml US standard humant thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA), 10 enheder/ml opløsning.

Nedbrydningstiden for den i det peptidfrie system dannede fibringel er 10 minutter.

15 D-Fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat og ovennævnte t-butyloxykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydhemisulf at brugtes som referencestoffer. Resultaterne fremgår af tabel 2.

20

Tabel 2

Virkning af tripeptidaldehyder på plasmin-fibrin-reaktionen.

Peptidaldehyd Peptid- Lysistid for indhold fibrin-koagel* 25 _μΜ '_min .

N-Metyl-D-fenylalanyl-L- 0,18 10 prolyl-L-argininaldehydsulfat 0,36 xx — 0,72 intet koagel dannet 30 D-Fenylalanyl-L-prolyl-L-ar- 0,18 10 gininaldehydsulfat (kontrol) 0,36 xx 0,72 intet koagel dannet t-Butyloxykarbonyl-D-fenyl- 0,18 10 alanyl-L-prolyl-L-argininalde- 0,36 20 hydhemisulfat (kontrol) 0,72 40 DK 171403 B1 5 i

G

>

G

jo 'I

cu

O

m

c o m o o G

qj σ> o oo oo in

4-> o#5 G i—I H

to q g

Hl CP

H 4-> C ·

3d) ftj C

ΙΛ 4-1 (NI 1 I G

Ό H O O lO O Η H

>i > tp o o oo in O h

f -H tO iH i—I M-4 O

G 4-1 Q ^ Ό X C 4-1

H < NC

(0 O

Ό i—I H X

-H O O O O G

4J CP O O O o λ; Ό

CL, ro Η Η Η H Cl G

o) d ·* ε a > Η G π>

i4 -Q QJ

4-1 C

H CP

Hi 4-> 1) -H

rO QJ Ό H

4-> — c

J-t -^t .—I *· OJ

CJ > O H g

cn -h c O E

c 4-i -- — -— — ε (o

Η ΛίΕΡ dP dP dP dP C. W

C ro ro O O O O

KJ Ό o O O O -H 4-1

$ O ' H H i—Ί »“i G

r-1 H ' ' —^ ’ ’ C £

CL, hX 0) G

O G 2 CP 4-1 3 i c in G C -H >1 5ji -η» in η i-η m Ό cn

p—I *r4 Cl O CN Γ4 ΓΟ <N C

T3 α 00 - * - »rO-Η

H C OH O O O OH

QJ r0 -Ω C

X! > « N

ro CO

[h U4 O -H

ro -H 4-i i 4-i in c Hl O'

ry >i C rO C

44 I H -H G H

o Η I o C Hi Hl

4J >i H C -H G

•η η ^ a ,CP Ή H

> 0 Η I Cl C

Π Ci O J G C CP

4_i a ^ i i o ro

X I dl H J H O

ro— J 4-1 I 4-1 4-1 I — X

Co ItojrOCrOHH ro H *. H HI I Hl ro 4-1 >i O Cl Hl 3 ro >,hhhhHhCi 4-)r0 g cor^aGCO-p c o il roincwHtnciC n ii C< η Ό i0 Ό >i fl Q, O o n>

XX G >, H >, C >. I .* CH

4J a h.CG.CGXIpX'— OG

—i ^ >, G H G H G I X SO

4j 33 CO >i Ό I Ό H 4-1 ΌΧΙ CO >i GHCHQH^rO hO rOO x: H ro O <0 I <0 C Hi +J Ό

O G i i hi I η I rO h a E

•H'T Ό Q C I C >i C H 3 GG

h i h Q h 4J H ro W O, Hl

CPO ro hCICCChO

CG Ό >, -Η Η H XJ -H >1 >1 C 4-> •η > h 4J cp>«cpo cp c x: gg

Ci 4-1 CJV44->S-iinCiGG QO

3 +J a 2 ιί Si tOM tOtcO

CG G I I I I I I I H

tiiCi (X ZJZdZvJQG X

7 DK 171403 B1 x Lysistiden for den i den peptidfri opløsning dannede fibringel er 10 minutter.

xx Ingen mulig lysistid på grund af et koagel med ret løs struktur.

5

De i tabel 2 anførte data viser at egenskaberne af N-alkyltripeptidaldehyder ligner egenskaberne af de respektive analoger ved en fri terminal'aminogruppe. I nærværelse af små mængder af peptiderne lyseres det dannede 10 koagel i løbet af kontroltiden, mens der i nærværelse af større mængder enten kun dannes en gel med forholdsvis løs struktur eller der dannes slet ikke nogen klump. Imidlertid forøges plasmin-lysistiden for fibrinklumpen dosisafhængigt af acyltripeptidaldehydhemisulfater.

15 Disse resultater viser tydeligt at de nye tripeptid- aldehyder som er alkylerede på deres N-terminale aminogrup-per er signifikant mere stabile end det kendte D-fenylala-nyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat. De er gode selektive antikoagulanter ved at inhibere thrombin-fibrinogen-reak-20 tionen mens de ikke griber ind i plasmin-fibrin-reaktionen.

N-alkyltripeptidaldehyderne med den almene formel I udviser også signifikant antikoagulant aktivitet in vivo. Opløst i isotonisk saltopløsning blev peptiderne indgivet oralt eller intravenøst til hankapiner af stammen New 25 Zealand med en vægt på 2-3 kg. Ved intravenøs tilførsel blev der givet infusioner på 0,5-2,0 mg/kg/t med en hastighed på 6 ml/t i 3 timer. Ved oral indgift blev der givet doser på 20-30 mg/kg af peptiderne i rumfang på 2 ml. Efter tilførslen blev der udtaget blodprøver i 30 minutters perio-30 der fra kaninernes ørevener og koaguleringstiden for helblod bestemtes i en thromboelastograf (H. Harter: Zeit-schrift fur klinische Medizin 153, 423 (1955)) og samtidig måltes plasmathrombintiden (R.T.S. Jim: J. Lab. Clin. Med.

50, 45 (1957)). De laveste doser der behøvedes for at give 35 terapeutisk virkning (M. Verstraete og R. Verwilghen i Drug Treatment, 2. udgave, red. G.S. Avery, Churchill Livingstone, Edinburgh-London 1980, side 919) er vist i 8 DK 171403 B1 tabel 3 hvor iv står for intravenøs og po for oral indgift og D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat tjener som referencestof.

De anførte data viser at effektiviteten af N-alkyl-5 tripeptidaldehyder er af lignende højde som eller identisk med virkningen af referencestoffet.

Tabel 3

Antikoagulant virkning in vivo af tripeptidaldehyder i 10 hankaniner af stammen New Zealand.

Tripeptidaldehyd Laveste virksomme dosis iv po mg/kg/t mg/kg/t 15 N-Metyl-D-fenylalanyl-L-pro- lyl-L-argininaldehydsulfat 0,5 20 N-Ætyl-D-fenylalany1-L-prolyl- L-argininaldehydsulfat 0,5 20 N-Isobutyl-D-fenylalany1-L- 20 prolyl-L-argininaldehydsulfat 0,5 20 N,N-Dimetyl-D-fenylalany1-L- prolyl-L-argininaldehydsylfat 2,0 30 N-Metyl-D-alloisoleucy1-L-prolyl-L-argininaldehydsulf at 1,0 30 25 D-Fenylalanyl-L-prolyl-L-argi- ninaldehydsulfat (kontrol) 0,5 20 På basis af forsøgene med intravenøse infusioner hos kaniner blev dosis til human intravenøs infusion anslået 30 til 1-2 mg/kg/t.

N-Alkyltripeptidaldehyderne med den almene formel I kan fremstilles ved acylering af argininlaktamet, beskyttet ved guanidingruppen, med den N-terminale dipeptiddel som acylkomponent, hvorpå den dannede beskyttede tripeptid-35 laktam reduceres til det beskyttede tripeptidaldehyd og beskyttelsesgruppen eller -grupperne fjernes og N-alkyltri-peptidaldehydet isoleres i form af et salt.

9 DK 171403 B1

Man kan således ifølge opfindelsen fremstille de omhandlede hidtil ukendte tripeptidaldehyder med den almene formel I, hvor 1 2 R , R , Xxx, Pro, Yyy og A har de foran angivne betydninger, ved på i peptidkemien kendt måde at kondensere en 5 argininlaktam, hvis guanidingruppe er beskyttet, med et N-beskyttet N-monoalkyl-Xxx-Pro-OH- eller N,N-dialkyl-Xxx-Pro-OH-dipeptid, hvorpå den dannede beskyttede tripep-tidlaktam reduceres til det beskyttede tripeptidaldehyd, beskyttelsesgruppen eller -grupperne fjernes og det resul-10 terende N-alkyl- eller N,N-dialkyltripeptidaldehyd isoleres i form af et syreadditionssalt.

De som udgangsmaterialer anvendte N-monoalkyl- eller N,N-dialkyl-Xxx-Pro-OH-dipeptider er også hidtil ukendte.

Disse som udgangsmaterialer anvendte hidtil ukendte 15 N-monoalkyl- eller N,N-dialkyl-Xxx-Pro-OH-dipeptider kan fremstilles ved at man ved i peptidkemien kendte metoder kondenserer Xxx-aminosyren, hvis N-terminale aminogruppe er beskyttet, med L-prolin, hvorpå det resulterende beskyttede dipeptid alkyleres, eller ved at et Xxx-Pro-OH-dipep-20 tid med en fri aminoterminal gruppe mono- eller dialkyle-res, eller ved at en Xxx-aminosyre, hvis aminogruppe er monoalkyleret og beskyttet eller dialkyleret, kondenseres ved i peptidkemien i og for sig kendte metoder med L-prolin.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden 25 ifølge opfindelsen metyleres N-benzyloxykarbonylderivatet af D-fenylalanyl-L-prolin i nærværelse af natriumhydrid med metyljodid hvorpå det vundne N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolin kondenseres ved den blandede anhydridmetode til L-argininlaktam og den resulterende 30 beskyttede tripeptidlaktam reduceres med litiumaluminiumhy-drid til N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N“-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd. Beskyttelsesgrupperne fjernes ved hydrogenolyse i nærværelse af svovlsyre og det resulterende N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-35 aldehydsulfat isoleres.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden underkastes D“fenylalanyl-L-prolin hydrogenolyse i nærværelse af formaldehyd. Det dannede N,N-dimetyl-D- 10 DK 171403 B1 fenylalanyl-L-prolin kondenseres ved den blandede anhydrid-metode med Nw-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam og den resulterende beskyttede tripeptidlaktam reduceres med liti-umaluminiumhydrid til N,N-dimetyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-5 L-argininaldehyd hvorpå beskyttelsesgrupperne fjernes ved hydrogenolyse i nærværelse af svovlsyre og det dannede N,N-dimetyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat isoleres.

Ved yderligere en udførelsesform for fremgangsmåden 10 underkastes D-fenylalanin hydrogenolyse i nærværelse af acetaldehyd og det resulterende N-ætyl-D-fenylalanin forsynes med en benzyloxykarbonyl-beskyttelsesgruppe, dets 2,4,5-triklorfenylester dannes og derefter kondenseres der med L-prolin. Det vundne N-benzyloxykarbonyl-N-ætyl-15 D-fenylalanyl-L-prolin kobles ved den blandede anhydridme-tode til en Nw-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam. Den vundne beskyttede tripeptidlaktam reduceres med litiumaluminium-hydrid til N-benzylkarbonyl-N-ætyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N(1)-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd, beskyttelsesgrupper-20 ne fjernes ved hydrogenolyse i nærværelse af svovlsyre og det resulterende N-ætyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydsulfat isoleres.

Produkterne med D,L,L-konfiguration, fremstillet på de foran beskrevne måder, kan eventuelt indeholde en 25 vis mængde af et produkt med D,L,D-konfiguration, men det påvirker ikke deres terapeutiske anvendelse.

Hos syreadditionssaltene af peptiderne med den almene formel I og deres derivater som foran nævnt beror aktiviteten på basen og syren er af mindre betydning, selv om 30 den til terapeutiske formål fortrinsvis er farmakologisk og farmaceutisk acceptabel for modtageren. Eksempler på sådanne syrer er (a) mineralske syrer såsom saltsyre, brom-brintesyre, fosforsyre, metafosforsyre, salpetersyre og svovlsyre; (b) organiske syrer som vinsyre, eddikesyre, 35 citronsyre, æblesyre, mælkesyre, fumarsyre, benzoesyre, glykolsyre, glukonsyre, gulonsyre, ravsyre og arylsulfon-syre, fx p-toluensulfonsyre. De farmaceutiske farmakologisk acceptable syreadditionssalte sammen med de salte som ikke Π DK 171403 B1 er helt så acceptable (fx salte med fluorbrintesyre eller perklorsyre) er nyttige ved isolering og rens.-ning af baserne, og de uacceptable salte er naturligvis også værdifulde til fremstilling af de acceptable salte 5 ved teknikker der er i og for sig velkendte. De peptider og derivater deraf som indeholder et antal frie aminogrup-per kan vindes i form af mono- eller polysyreadditionssal-te eller som blandede salte med flere forskellige syrer. Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater 10 der som virksom bestanddel indeholder mindst én forbindelse med den almene formel I sammen med et eller flere farmaceutiske bærestoffer.

De farmaceutiske præparater kan fremstilles ved metoder der alment anvendes i den farmaceutiske industri.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af I 5 farmaceutiske præparater er ejendommelig ved det i krav 9's kendetegnende del angivne.

Opfindelsen skal belyses mere udførligt ved hjælp af de følgende eksempler.

20 Rp-værdierne i eksemplerne er bestemt ved tyndlags- kromatografering på silikagel (Kieselgel G, Reanal, Budapest) i følgende fremkaldersystemer: 1. Ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 960:20:6:11 2. Ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 480:20:6:11 25 3. Ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 240:20:6:11 4. Ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 120:20:6:11 5. Ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 60:20:6:11 6. Ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 30:20:6:11.

30 Eksempel 1 N-Metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat Trin 1: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-^^ibenzyloxykarbgnyl-L-argininlaktam______________ 35 42,95 g (0,11 mmol) N-t-butyloxykarbonyl-Nu-benzyl- oxykarbonyl-L-argininlaktam suspenderes i 110 ml vandfri kloroform hvorpå der under konstant omrøring tilsættes 275 ml af en opløsning af saltsyre i ætylacetat (0,11-0,15 g/ml). Efter omrøring i 3 timer fortyndes reaktionsblandin-40 gen med 400 ml diætylæter, de udfældede krystaller filtre- 12 DK 171403 B1 res og vaskes to gange med 100 ml diætylæter og to gange med 50 ml acetone hvorpå produktet tørres i en vakuumexsic-cator i nærværelse af fosforpentoxyd og kaliumhydroxyd.

Efter tørring i ca. 1 time opløses krystallerne i 100 ml 5 dimetylformamid og afkøles til -15°C, og ved denne temperatur og under omrøring tilsættes der først 20 ml og senere yderligere 10-15 ml triætylamin for at sikre konstaterbart overskud af basen i gasfasen. Den resulterende suspension sættes til følgende blandede anhydrid.

10 50,9 g (0,1 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-mety1-D-feny1- alanyl-L-prolin-cyklohexylammoniumsalt opløses i 200 ml diætylæter og 120 ml IN svovlsyre. Diætylæterlaget vaskes med 3 x 30 ml vand og tørres over natriumsulfat og opløsningsmidlet afdampes fra et vandbad på 40°C ved et tryk 15 på 25-30 millibar. Remanensen opløses sammen med 11,2 ml (0,1 mol) N-metylmorfolin i 70 ml dimetylformamid og afkøles til -15°C, hvorpå der ved denne temperatur tilsættes 13,2 ml (0,1 mol) isobutyloxykarbonylklorid. Efter fuldført tilsætning fortsættes omrøring i 5 minutter hvorpå oven-20 nævnte suspension i dimetylformamid sættes til det dannede blandede anhydrid. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved -15°C og derefter i yderligere 1 time ved 0°C hvorefter den fortyndes med 200 ml benzen og de udfældede salte filtreres. Der sættes 150 ml vand til ^enzen-dimetylforma-25 midfiltratet og lagene adskilles. Det nedre vandige dime-tylformamidfiltrat ekstraheres med 3 x 50 ml benzen. De forenede benzenekstrakter vaskes med 3 x 30 ml vand, tørres over vandfrit natriumsulfaf" og inddampes fra et vandbad på 40°C ved et tryk på 20-25 millibar. Den olieagtige rema-30 nens opløses i en blanding af 60 ml benzen/tetrahydrofuran 8:2 og underkastes kromatografering på en kolonne fremstillet ud fra 750 g Kieselgel-60 i en opløsningsmiddelblanding af benzen/tetrahydrofuran. Fraktioneringen overvåges ved tyndlagskromatografering på silikagel i et fremkalderopløs-35 ningsmiddel bestående ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 480:20:6:11 og produktets Rp-værdi er 0,70-0,76. De fraktioner der indeholder det rene produkt forenes og koncentreres på et vandbad med en temperatur på 40°C ved 20-25 milli- 13 DK 171403 B1 bar til 100 ml. Denne remanens blandes med 500 ml petroleumsæter og den resulterende suspension filtreres, vaskes to gange med 100 ml petroleumsæter og tørres i en vakuumexsic-cator i nærværelse af svovlsyre og paraffinspåner. Udbytte 5 45 g (65%). [a]^° = +13,5° (c = 1 i tetrahydrofuran). Rp = 0,70-0,76.

Beregnet for C^H^C^Ng (682,75): C 65,08 H 6,20 N 12,31 Fundet: C 65,4- H 6,4 N 12,1% 10 Trin 2: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl- N Hilden zylgxykarbgnyl^L-argininaldehyd___________ 34,15 g (0,05 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-f enylalanyl-L-prolyl-Na)-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam (eksempel 1, trin 1) opløses i 150 ml tetrahydrofuran, 15 opløsningen afkøles til -20°C og under konstant omrøring tilsættes der 0,0375 mol litiumaluminiumhydrid opløst i tetrahydrofuran. Reduktionens fremadskriden overvåges ved tyndlagskromatografering i et fremkalderopløsningsmiddel-system af ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 240:20:6:11 20 (R -værdierne af laktamen og aldehydet er henholdsvis ca.

r 0,8 og 0,5). Hvis det behøves tilsættes der yderligere portioner litiumaluminiumhydrid hvorpå reaktionsblandingen syrnes med IN svovlsyre til pH 2 under afkøling og omrøring. Opløsningen fortyndes med ca. 300 ml vand indtil den bliver 25 uklar og derefter ekstraheres den to gange med 100 ml n-hexan. Derpå ekstraheres det vandige tetrahydrofuranlag med 2 x 250 ml metylenklorid. De forenede metylenklorid-ekstrakter vaskes med 2 x 50 ml vand, 2 x 50 ml 5%s natrium-hydrogenkarbonatopløsning og på ny 2 x 50 ml vand og til 30 slut tørres opløsningen over vandfrit natriumsulfat og koncentreres til 50-60 ml på et vandbad på højst 40°C ved 20-25 millibar. Derefter sættes der benzen til remanensen og koncentreringen gentages på lignende måde. Koncentratet fortyndes med 100 ml cyklohexan. Det dannede bundfald fil-35 treres, vaskes med 2 x 30 ml cyklohexan og tørres i en vakuumexsiccator over paraffinspåner. Udbytte 27 g (70%) indeholdende ét mol cyklohexan ifølge analysedata. Rp = 14 DK 171403 B1 0,52-0,62. [<*]q° = +16,8° (c = 1 i tetrahydrofuran) .

Beregnet for C^H^O^Ng .CgH^2 (768,93): C 67,16 H 7,34 N 10,93 Fundet: C 66,6 H 7,2 N 10,4% 5

Trin 3: N-Metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd-sulfat_________________________________________ 23,1 g (0,03 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-f enylalanyl-L-prblyl-Nb)-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd ^0 (eksempel 1, trin 2) opløses i 150 ml ætanol, der tilsættes 50 ml deioniseret vand og 48 ml IN svovlsyre og blandingen underkastes hydrogenolyse i nærværelse af 3 g 10%s Pd/C katalysator. Hydrogenolysens fremadskriden overvåges ved tyndlagskromatografering i et fremkalderopløsningsmid-del af ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 30:20:6:11 (Rp-værdier af udgangsmateriale, mellemprodukt og slutproduktet er henholdsvis ca. 0,9, 0,7 og 0,4). Efter fuldført reaktion filtreres katalysatoren og vaskes med 3 x 30 ml deioniseret vand. Filtratet og vaskevæskerne forenes og 20 koncentreres til ca. 100 ml i en roterende evaporator.

Den vandige remanens fortyndes til ca. 200 ml med deioniseret vand og dens pH-værdi kontrolleres. Hvis den ikke er mellem 6,0 og 6,5 reguleres den med 0,IN svovlsyre eller en ionbytterharpiks i OH formen(fx AG 1X8), hvorpå 25 opløsningen frysetørres. Udbytte 12,4 g (75%). Rp = 0,39-0,47. Mp° = "131° (c = 1 i vand).

Beregnet for c21H3203N6.7/8 H2S04.2,5 H20 (547,37): C 46,07 H 7,13 N 15,35 S 5,12 Fundet: C 46,4 H 7,2 N 15,5 S 5,0% 30

Udgangsmaterialerne kan fremstilles ved følgende fremgangsmåde: N-Benzyloxykarbony1-N-metyl-D-fenylalany1-L-prolin 55 Trin A: Benzyloxykarbonyl-D-fenylalanin-2,4,5-triklorfenyl- ester_____________________________________________ 60,0 g (0,2 mol) benzyloxykarbonyl-D-fenylalanin 15 DK 171403 B1 (H. Yajima og K. Kubo: J. Am. Chem. Soc. 8_7, 2039-2044 (1965)) og 39,4 g (0,2 mol) 2,4,5-triklorfenol opløses i 200 ml tetrahydrofuran, opløsningen afkøles til 5-10°C og derefter tilsættes der under omrøring i løbet af ca.

30 minutter 41,2 g (0,2 mol) dicyklohexylkarbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres i 6 timer uden afkøling. Det udfældede dicyklohexylurinstof frafiltreres og vaskes med 3 x 50 ml tetrahydrofuran hvorpå de forenede tetrahydrofuran-opløsninger inddampes ved nedsat tryk. Remanensen krystalliseres fra 300 ml varm ætanol, filtreres, vaskes med 2 x 50 ml ætanol med en temperatur på 5-10°C og derefter tørres krystallerne i en vakuumexsiccator. Udbytte 72 g (75%), Smp. 139-141°C. [e]^° = +37° (c = 1 i dimetylforma-mid) .

Beregnet for C23Hi8°4NC*3 (478»75): C 57,70 H 3,79 N 2,92 Cl 22,22 Fundet: C 57,7 H 3,9 N 3,0 Cl 22,2%

Trin B: Benzyloxykarbonyl^D^fenylalanyl^L^prolin 71,8 g (0,15 mol) benzyloxykarbonyl-D-fenylalanin- 2,4,5-triklorfenylester (eksempel 1, trin A) opløses under omrøring og ved stuetemperatur i 180 ml vandfrit pyridin hvorpå der tilsættes 17,3 g (0,15 mol) L-prolin og 21,0 ml (0,15 mol) triætylamin. Omrøringen .fortsættes indtil prolinet er opløst hvorpå reaktionsblandingen henstår i 4-6 timer. Derefter koncentreres den til 80-100 ml på et vandbad med en temperatur på 40°C ved 13-20 millibar og remanensen opløses i en blanding af 250 ml vand og 90 ml diætylæter. Det vandige lag vaskes med 2 x 30 ml diætylæter, de forenede æterfaser vaskes med 2 x 30 ml 5%s opløsning af natriumhydrogenkarbonat og derefter syrnes de forenede vandige lag med 3N saltsyre til pH 2. Den fraskilte olie ekstraheres med 3 x 120 ml ætylacetat og de forenede ætyl-acetatopløsninger vaskes 3 gange med 40 ml vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres derefter til 50-100 ml på et vandbad med en temperatur på 40°C ved 15-20 millibar. Remanensen krystalliseres fra 200 ml æter.

16 DK 171403 B1

Krystallerne filtreres og vaskes med 2 x 40 ml æter. Udbytte 50,4 g (85%), smp. 132-133°C, [ α ]j?° = -46,4° (c = 2 i dime- 3 υ tylformamid). Rp = 0,5.

Beregnet for ^22^24^5^2 (396,43): C 66,65 H 6,10 N 7,07 5 Fundet: C 66,4 H 6,25 N 7,2%

Trin C: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolin-2¥lsi2hexyl ammoniums alt__________ 39,6 g (O', 1 mol) benzyloxykarbonyl-D-fenylalanyl-L-^ prolin (eksempel 1, trin B) og 50 ml (0,8 mol) metyljodid opløses i 300 ml vandfrit tetrahydrofuran. Til denne opløsning, afkølet til 0°C, sættes der 13,2 g (0,3 mol) natrium-hydridsuspension i 8-10 portioner under konstant omrøring og omrøringen fortsættes i 2 timer. Derefter sættes der ^ 500 ml ætylacetat til reaktionsblandingen for at nedbryde det dannede natriumhydroxyd og derpå meget forsigtigt 10 ml vand for at nedbryde overskydende natriumhydrid, og til slut inddampes opløsningen på et vandbad med en temperatur på 40°C ved 15-20 millibar. Remanensen opløses i en 20 blanding af 250 ml vand og 100 ml diætylæter. Det vandige lag vaskes med 100 ml diætylæter og de forenede diætylæter- faser med 50 ml 5%s natriumhydrogenkarbonatopløsning. Hydro- genkarbonatlaget og de vandige lag forenes, syrnes med 5n kaliumhydrogensulfat til pH 2 og ekstraheres med 2 x 150 2 5 ml ætylacetat. De forenede ætylacetatfaser vaskes i rækkefølge med 100 ml vand, 50 ml 10%s opløsning af natriumtio-sulfat og 100 ml vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes på et vandbad med en temperatur på højst 40°C ved 15-20 millibar. Remanensen opløses i 600 ml benzen, 3® der tilsættes 12 ml (0,105 mol) cyklohexylamin og opløsningen henstår ved stuetemperatur. De dannede krystaller filtreres, vaskes med 2 x 200 ml benzen og tørres i en vakuumexsiccator over paraffinspåner. Udbytte 38,2 g (75%).

2

Rp = 0,53-0,60 (og cyklohexylamin: 0,01-0,05). Smp. 160- 1 163°C. M^° = +12,1° (c = 1 i metanol).

17 DK 171403 B1

Beregnet for C23H26°5N2'C6H13N (509'83): C 68,34 H 7,71 N 8,25

Fundet. C 68,5 H 7,8 N 8,3% 5 Na-t-Butyloxykarbonyl-NM-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam Trin D: Na-t-Butyloxykarbonyl-Na)-benzyloxykarbonyl-L-argi-ninhydrat________________________________________ 65,8 g (0,2 mol) t-butyloxykarbonyl-L-arginin-hydro-kloridhydrat (D. Yamashiro et al: J. Am. Chem. Soc. 94, 2855-2859 (1972)) opløses i 100 ml 4N natriumhydroxyd og afkøles til 5-10°C, hvorpå der under konstant omrøring tilsættes 80 ml (0,5 mol) benzyloxykarbonylklorid og ca.

150 ml 4N natriumhydroxyd med en hastighed som sikrer at reaktionsblandingens pH-værdi stedse overstiger 12. Deref-ter omrøres reaktionsblandingen i yderligere 3-4 timer, fortyndes med 150 ml vand og ekstraheres med 100 ml diætyl-æter. Systemet skiller sig i tre faser. De nedre to faser vaskes gentagne gange med 100 ml diætylæter hvorpå der tilsættes 300-400 ml metanol for at opnå en homogen opløs-20 ning og pH reguleres om nødvendigt med 4N natriumhydroxyd til 12. Efter at opløsningen har henstået i 6-8 timer ekstraheres den med 2 x 100 ml af en 1:1 blanding af petroleumsæter og diætylæter og pH reguleres til 6-7 med iseddikesyre (der behøves ca. 50 ml). Derefter ekstraheres opløsningen 25 med 3 x 140 ml metylenklorid og metylenkloridopløsningerne forenes, vaskes med 2 x 60 ml vand og inddampes fra et vandbad med en temperatur på 40°C ved 25-30 millibar. Der sættes 300 ml benzen og 600 ml vand til remanensen og der omrøres i 2-3 timer ved 20°C hvorefter blandingen henstår 20 ved 10°C natten over. De dannede krystaller filtreres, vaskes med 300 ml vand og 300 ml benzen og tørres i en vakuumex siccator i nærværelse af fosforpentoxyd og paraffinspåner. Udbytte 60 g (70%). Smp. 122-124°C. [α]^° = -20,7° (c = 1 i pyridin).

25 Beregnet for ci9H28°6N4*H2° (426,46): C 53,51 H 7,09 N 13,14 Fundet: C 53,35 H 7,2 N 13,1% 18 DK 171403 B1

Trin E: Na-t-Butyloxykarbony l-Ntl,-benzyloxykarbonyl-L-argi-ninlaktam________________________________________ 59,7 g (0,14 mol) Na-t-butyloxykarbonyl-Na)-benzyl-oxykarbonyl-L-argininhydrat (eksempel 1, trin D) og 19,6 ^ g (0,14 mol) triætylamin opløses i 200 ml tetrahydrofuran. Opløsningen afkøles til -10°C og ved denne temperatur og under omrøring tilsættes der 18,5 ml (0,14 mol) isobutyl-oxykarbonylklorid og derpå efter 10 minutters forløb 19,6 ml (0,14 mol) triætylamin. Omrøringen fortsættes i yderli-^ gere en time ved 0°C og en time uden afkøling hvorpå blandingen udhældes over 1000 ml isvand. De dannede krystaller filtreres, vaskes med 2 x 100 ml isvand og opløses derpå i 280 ml kloroform. Kloroformopløsningen vaskes med 2 x 100 ml isvand, tørres over vandfrit kalciumklorid og ind-dampes på et vandbad med en temperatur på højst 40 C ved 20-25 millibar. Den krystallinske remanens suspenderes i 70 ml petroleumsæter, filteres, vaskes med 2 x 30 ml petroleumsæter og tørres i en vakuumexsiccator i nærværelse af fosforpentoxyd. Udbytte 44 g (81%). Smp. 164-166°C.

^ [a]p^ = -24° (c = 1 i tetrahydrofuran).

Beregnet for C19H26°5N4 <390'43): c 58,44 H 6,71 N 14,35 Fundet: C 58,7 H 6,8 N 14,1%

Eksempel 2 , 25 ---------- N,N-Dimetyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat Trin 1: N,N-Dimetyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-Nu-benzyloxy-karbonYl^L^argininlaktam^hydrgklorid___________ 4,3 g (0,011 mol) N°‘-t-butyloxykarbonyl-N<,,-benzyloxy-30 karbonyl-L-argininlaktam (eksempel 1, trin E) omdannes ved den i eksempel 1, trin 1 beskrevne fremgangsmåde ved anvendelse af proportionale mængder opløsningsmidler og reagenser. Den resulterende suspension sættes til det nedenstående blandede anhydrid.

^ 3,26 g (0,01 mol) N,N-dimetyl-D-fenylalanyl-L-prolin- hydrat og 2,2 ml (0,02 mol) N-metylmorfolin opløses i en blanding af 50 ml benzen og 5 ml ætanol. Blandingen koncen 19 DK 171403 B1 treres til 10-15 ml på et vandbad ved en temperatur på højst 40°C ved 40-50 millibar og derefter afdestilleres der fire portioner på hver 40 ml benzen fra blandingen, der til slut inddampes til tørhed. Remanensen opløses i 10 ml dimetylformamid og afkøles til -15°C, og ved denne temperatur tilsættes der 1,32 ml (0,01 mol) isobutyloxykar-bonylklorid og efter 5 minutter ovennævnte suspension i dimetylformamid. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved -15°C og i yderligere 1 time ved 0°C hvorpå der tilsættes 40 ml ætylacetat og de udfældede salte frafiltreres. Der udhældes 20 ml vand i filtratet og de dannede lag adskil les. Det vandige dimetylformamidlag ekstraheres med 3 x 5 ml ætylacetat. De forenede ætylacetatopløsninger vaskes med 2 x 15 ml vand, 2 x 15 ml 5%s opløsning af natriumhy-drogenkarbonat og derpå på ny med 2 x 15 ml vand og ekstrakten tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres til 10-15 ml på et vandbad med en temperatur på 40°C ved 20-25 millibar. Derefter sættes der saltsyre/ætylacetat til den tilbageværende opløsning for at sikre at den gas-formige fase er sur, og opløsningen fortyndes med 30-40 ml diætylæter. Det dannede bundfald filtreres, vaskes med diætylæter og tørres i nærværelse af svovlsyre og kalium- 4 hydroxyd i en vakuumexsiccator. Udbytte 2,7 g (45%). Rp = 0,43. [a]^ = -56,0° (c = 1 i kloroform).

Beregnet for C^QH^gO^Ng.9/5 HCI.2H2O (666,13): C 54,09 H 6,90 N 12,62 Cl 9,58 Fundet: C 54,0 H 7,0 N 12,6 Cl 9,8%

Trin 2: N,N-Dimetyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-Nu>-benzyloxy-?S§£bonyl-L-argininaldehydsulf at________________ 2,4 g (0,004 mol) N,N-dimetyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N“-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam-hydroklorid (eksempel 2, trin 1) opløses i 15 ml tetrahydrofuran og afkøles til -20°C og under konstant omrøring tilsættes der 0,003 mol litiumaluminiumhydrid suspenderet! tetrahydrofuran. Reduktionens fremadskriden overvåges ved tyndlagskromatografering i et fremkaldersystem af ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 20 DK 171403 B1 60:20:6:11 (R -værdien af laktamet og af aldehydet er hen- Γ holdsvis 0,35 og 0,2). Om nødvendigt tilsættes der yderligere portioner litiumaluminiumhydrid hvorpå reaktionsblandingen syrnes til pH 5 med N svovlsyre under afkøling og 5 omrøring (ca. 30 ml), og der ekstraheres med 2 x 15 ml kloroform. Det vandige tetrahydrofuranlag ekstraheres med 3 x 20 ml n-butanol. De forenede butanolekstrakter vaskes med 10 ml vand mættet med n-butanol og opløsningen koncentreres til 5-10 ml på et vandbad med temperatur på højst 10 40°C og ved 15-20 millibar. Remanensen fortyndes med 30 ml æter. Det dannede bundfald filtreres og vaskes med 2 x 10 ml diætylæter og 2 x 10 ml petroleumsæter hvorpå den opløses i en blanding af 20 ml kloroform og 5 ml metanol.

Den uopløselige remanens filtreres og filtratet inddampes 15 ved den foran beskrevne metode.

Den olieagtige remanens blandes med 30 ml diætylæter og det dannede bundfald filtreres, vaskes med 2 x 20 ml diætylæter og 2 x 20 ml petroleumsæter og tørres derefter i en vakuumex siccator i nærværelse af paraffinspå-20 ner, svovlsyre og kaliumhydroxyd. Udbytte 2,25 g (85%). r| = 0,48-0,54.

Beregnet for C3qH38°5N6’H2S04 (660»73): C 54,53 H 6,10 N 12,72 S 4,84 Fundet: C 55,0 H6,5 N 12,1 S 4,7% 25

Trin 3: N,N-Dimetyl-D-fenylalany1-L-prolyl-L-argininalde-hydsulfat_______________________________________ 1,32 g (0,002 mol) N,N-dimetyl-D-fenylalanyl-L-pro-lyl-Nw-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehydsulfat (eksempel 30 2, trin 2) opløses i en blanding af 5 ml deioniseret vand og 15 ml ætanol og hydrogeneres i nærværelse af 0,2 g 10%s Pd/C katalysator. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med 2 x 10 ml deioniseret vand. Filtratet og vaskevæskerne forenes og koncentreres til 5-10 ml på et vandbad med en 35 temperatur på maksimalt 40°C og ved 15-20 millibar hvorpå opløsningen fortyndes til 20 ml med deioniseret vand. Om nødvendigt reguleres pH enten med 0,1N svovlsyre eller 21 DK 171403 B1 med en ionbytterharpiks (dvs. AG 1X8) i OH -formen til 6,0-6,5 hvorpå opløsningen frysetørres. Udbytte 0,85 g (80%) . Rp = 0,35-0,39.

Beregnet for C22^34°3N6 ·Η2^4 ’ ^ H2° (566,67): 5 C 46,60 H 7,47 N 14,82 S 5,66

Fundet: C 45,5 H 7,4 N 14,3 S 5,2%

Udgangsmaterialet, N,N-dimetyl-D-fenylalanyl-L-pro-linhydrat kan fremstilles på følgende måde: 10 11,9 g (0,03 mol) benzyloxykarbonyl-D-fenylalanyl- L-prolin (eksempel 1, trin B) opløses i 200 ml 50%s vandig metanol og hydrogeneres i nærværelse af 9,7 ml (ca. 0,12 mol) formaldehydopløsning og 6 g 10%s Pd/C katalysator. Reaktionens fremadskriden overvåges ved tyndlagskromatogra-15 fering i et fremkalderopløsningsmiddel af ætylacetat/pyri-din/eddikesyre/vand 30:20:6:11 (Rp-værdien af udgangsmaterialet og slutproduktet er henholdsvis 0,95 og 0,45). Efter fuldførelse af reaktionen filtreres katalysatoren og vaskes med 2 x 50 ml vandig metanol hvorpå filtratet og vaskevæ-20 skerne forenes og inddampes på et vandbad med en temperatur på 40°C ved 20-25 millibar. Remanensen opløses i 60 ml ætylacetat, der tilsættes 0,5 ml vand og opløsningen henstår ved 5-10°C natten over. De dannede krystaller filtreres, vaskes med 2 x 15 ml ætylacetat med en temperatur 25 på 5-10°C og tørres i en vakuumexsiccator over paraffinspåner, svovlsyre og kaliumhydroxyd. Udbytte 6,5 g (67%).

2 0

Smp. 228-229°C. [a]D = -159° (c = 1 i vand).

Beregnet for C^gH22°3N2*H2^ (308,37): C 62,31 H 7,85 N 9,08 30 Fundet: C 62,5 H 8,0 N 8,95%

Eksempel 3 N-Ætyl-D-fenylalany1-L-prolyl-L-arginin-aldehydsulfat ^ Trin 1: N-Benzyloxykarbonyl-N-ætyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N^ibenzyloxykarbony1^L^argininlaktam_____________ 2,1 g (0,005 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-ætyl-D-fenyl-alanyl-L-prolin og 2,15 g (0,0055 mol) Na-t-butyloxykarbcnyl- 22 DK 171403 B1 Νω- benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam (eksempel 1, trin E) omdannes og kondenseres ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 1, under anvendelse af proportionale mængde reagenser og opløsningsmidler. Under behand-5 lingen af reaktionsblandingen og under søjlekromatograferin-gen overvåges produkt indholdet dog ved tyndlagskromatogra-fering i et fremkaldersystem af benzen/tetrahydrofuran 8:2. De fraktioner som indeholder det rene hovedprodukt (Rp = 0,4-0,5) forenes og inddampes på et vandbad med en 10 temperatur på 40°C ved 15-20 millibar. Remanensen oparbejdes med diisopropylæter, filtreres, vaskes med diisopropylæter og tørres i en vakuumexsiccator i nærværelse af svovlsyre 2 og paraffinspåner. Udbytte 1,9 g (54%). Rp = 0,75-0,85.

15 Trin 2: N-Benzyloxykarbonyl-N-ætyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N^zbenzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd____________ 1,4 g (0,002 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-ætyl-D-fenyl-alanyl-L-prolyl-Ncu-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam (eksempel 3, trin 1) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskre- 2 0 vet i eksempel 1, trin 2, under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 1,15 g (72%) som i henhold til analyse indeholder ét mol cyklohexan.

Rp = 0,55-0,65.

Beregnet for .C^H^ (782,95)*: 25 C 67,49 H 7,47 N 10,73

Fundet: C 67,6 H 7,5 N 10,5%

Trin 3: N-Ætyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsul- fat ___ ___ ___ ___ ________ 30 0,78 g (0,001 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-ætyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-Nu-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd (eksempel 3, trin 2) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 3 under anvendelse af propor-25 tionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 0,75 g (70%). Rp = 0,4-0,5.

Beregnet for C22H34°3N6.5/6 H2S04. 3,5 H20 (575,27): C 45,93 H 7,48 N 14,61 S 4,64

Fundet: C 46,1 H7,6 N 14,2 S4,6% 23 DK 171403 B1 5 Udgangsmaterialet N-benzyloxykarbonyl-N-ætyl-D-fenyl- alanin-L-prolin kan fremstilles på følgende måde:

Trin A: N-Ætyl-D-feny1alanin 8,28 g (0,05 mol) D-fenylalanin opløses i 100 ml 20%s vandig ætanol og hydrogeneres i nærværelse af 5,65 ml (0,1 mol) acetaldehyd og 2 g 10%s Pd/C katalysator i to dage. Katalysatoren filtreres og vaskes med 60 ml 2N saltsyre og de forenede vandige opløsningers pH-værdi reguleres med 4N natriumhydroxyd til 7. Det dannede bundfald ^ filtreres, vaskes med 3 x 20 ml vand og tørres i en vakuum-exsiccator over vandfrit kalciumklorid. Udbytte 4,85 g (50%). [a]p^ = -53° (c = 1 i 0,1N natriumhydroxyd).

Beregnet for cnH3302N (193,24): C 68,37 H 7,82 N 7,25 Fundet: C 68,5 H 7,65 N 7,2% 20

Trin B: N-Benzyloxykarbony1-N-ætyl;D-fenylalanin 2,9 g (0,015 mol) N-ætyl-D-fenylalanin (eksempel 3, trin A) opløses i 22,5 ml 2N natriumhydroxyd, der tilsæt- tes 10 ml dioxan, blandingen afkøles t'il 5-10°C og derefter tilsættes der 2,5 ml (ca. 0,017 mol) benzyloxykarbonylklo- rid hvorpå reaktionsblandingen omrøres i 3 timer under afkøling. Derpå fortyndes den med 40 ml vand og ekstrahe- res med 30 ml af en blanding af diætylæter/petroleumsæter 1:1, hvorved der dannes et trefasesystem. De to nedre faser 30 . .

ekstraheres pa ny med 30 ml diætylæter hvorpå de forenede diætylæterlag vaskes med 20 ml vand. De vandige lag forenes og syrnes med N svovlsyre til pH 2. Det udskilte produkt ekstraheres med 3 x 30 ml ætylacetat. Ætylacetatlagene forenes, vaskes med 2 x 20 ml vand, tørres over vandfrit 35 natriumsulfat og inddampes pa et vandbad med en temperatur på højst 40°C ved 15-20 millibar. Udbytte 2,7 g (55%) af 2 et olieagtigt produkt. R„ = 0,5-0,6.

Γ 25 DK 171403 B1 opløsningsmidler. Under behandlingen af reaktionsblandingen og under søjlekromatografering overvåges produktindholdet i fraktionerne ved tyndlagskromatografering i et fremkalder- opløsningsmiddelsystem af ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 5 480:20:6:11. De fraktioner som indeholder det rene produkt (Ri; = 0,75-0,85) forenes, inddampes på et vandbad med en i o o temperatur på ca. 40°C ved 15-20 millibar og remanensen behandles med petroleumsæter, filtreres,- vaskes med petroleumsæter og tørres i en vakuumexsiccator over paraffinspå-10 ner. Udbytte 2,7 g (75%). Rp = 0,75-0,85. [α]^° = -5,8° (c = 1 i tetrahydrofuran).

Beregnet for C4qH48°7N6. 2/3 C4HgO (772,90): C 66,30 H 6,95 N 10,87

Fundet: C 65,0 H 6,8 N 10,80% 15

Trin 2: N-Benzyloxykarbonyl-N-isobutyl-D-fenylalanyl-L-EiQiYil^ibenzyloxykarbgnyl-L^argininaldehyd___ 1,45 g (0,002 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-isobutyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-Nu-benzyloxykarbonyl-L-argininlak-20 tam (eksempel 4, trin 1) reduceres ved den i eksempel 1, trin 2 beskrevne fremgangsmåde under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte -5 20 1,0 g (62%). Rp = 0,24. [a)D = +2,3 (c = 1 i tetrahydrofuran ) . , 25 Beregnet for C^gHggO^Ng.1/4 CgH^ (747,89): C 66,64 H 7,14 N 11,24

Fundet: C 66,3 H 7,1 N 11,2%

Trin 3: N-Isobutyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd-30 sulfat____________________________________________ 0,81 g (0,001 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-isobutyl- D-fenylalanyl-L-prolyl-Nu-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd (eksempel 4, trin 2) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 3 under anvendelse af pro-35 portionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 0,45 g (80%). Rp = 0,64.

24 DK 171403 B1

Trin C: N;;Benzyloxykarbonyl;N-æty 1-D;;f enylalanyl^L-prol in 2,6 g (0,008 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-ætyl-D-fenyl-alanin (eksempel 3, trin 2) opløses i 10 ml tetrahydrofuran og ved 0°C tilsættes der 1,6 g (0,008 mol) 2,4,5-triklorfe-^ nol og 1,65 g (0,008 mol) dicyklohexylkarbodiimid hvorpå blandingen henstår ved stuetemperatur i 4 timer. Remanensen opløses i 40 ml benzen, vaskes med 2 x 20 ml 5%s opløsning af natriumhydrogenkarbonat og 2 x 20 ml vand hvorpå der tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes på et vand-bad med en temperatur på ca. 40°C ved 15-20 millibar. Den tilbageværende olie opløses i 10 ml pyridin, der tilsættes 0,92 g (0,008 mol) L-prolin og 1,12 ml (0,008 mol) triætyl-amin og blandingen omrøres ved stuetemperatur indtil proli-net er gået i opløsning. Derefter henstår opløsningen i ^ 4-5 timer hvorpå den inddampes på et vandbad med en tempe ratur på ca. 40°C ved 15-20 millibar. Remanensen opløses i en blanding af 25 ml vand og 10 ml diætylæter. Det vandige lag vaskes med 2 x 10 ml diætylæter og de forenede æterekstrakter vaskes med 10 ml 5%s opløsning af natriumhydro-genkarbonat. De vandige lag forenes og syrnes til pH 2 med 3N saltsyre. Det fraskilte produkt ekstraheres med 3 x 15 ml benzen, benzenlagene forenes, vaskes med 3 x 5 ml vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes på et vandbad med en temperatur på ca.i 40°C ved 15-20 milli-25 bar. Udbytte 2,2 g (64%) af en olie. Rp = 0,5-0,6.

Eksempel 4 N-Isobutyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat 30 Trin 1: N-Benzyloxykarbonyl-N-isobutyl-D-fenylalanyl-L-EEQiYilN^ibenzyloxykarbonyl-L^argininlaktam____ 2,26 g (0,005 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-isobutyl-D-fenylalanyl-L-prolin og 2,15 g (0,0055 mol) Na-t-butyloxy-karbonyl-Nu>-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam (eksempel 55 i, trin E) omdannes og kondenseres i overensstemmelse med den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 1, under anvendelse af proportionale mængder reagenser og

Beregnet for C24H38°3N6 . H2SO4.4 H20 (628,74): C 45,84 H 7,69 N 13,36 S 5,1

Pundet: C 45,8 H 7,2 N 13,4 S 4,9% 26 DK 171403 B1 5 Udgangsmaterialet N-benzyloxykarbonyl-N-isobutyl-D- fenylalanyl-L-prolin kan fremstilles på følgende måde:

Trin A: N3Isobuty1;D-fenylalanin

Ud fra 8,"25 g (0,05 mol) D-fenylalanin og under ud-^ nyttelse af den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 3, trin A, dog med den forskel at der bruges 9,1 ml (0,1 mol) isobutyraldehyd i stedet for acetaldehyd, vindes der 8,7 g (70%) af produktet. = “29,9° (c = 1 i 0,1N na- triumhydroxyd).

15 Beregnet for c13H1902N.1/2 H20 (230,30): C 67,79 H 8,75 N 6,08

Fundet: C 67,2 H 8,9 N 6,15%

Trin B: N-Benzyloxykarbony1-N-isobutyl^D^fenylalanin 20 3,32 g (0,015 mol) N-isobutyl-D-fenylalanin (eksempel 4, trin A) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 3, trin B. Udbytte 3,2 g (60%) af en olie.

Rp = 0,6-0,7.

» 25

Trin C: N-Benzyloxykarbonyl-N-isobutyl-D-fenylalanyl-L-prolin________________________________________ 2,85 g (0,008 mol) tf-benzyloxykarbonyl-N-isobutyl-D-fenylalanin (eksempel 4, trin B) omdannes ved den frem-30 gangsmåde der er beskrevet i eksempel 3, trin C. Udbytte 2,45 g (67%) af en olie. R^ = 0,65-0,70.

Eksempel 5 ^ N-Metyl-D-alloisoleucyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat

Trin 1: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-alloisoleucyl-L-pro-lyllN^-benzyloxykarbgnyl-L^argininlaktam_________ 4,3 g (0,011 mol) Na-t-butyloxykarbonyl-Nll,-benzyloxy- 27 DK 171403 B1 karbonyl-L-argininlaktam (eksempel 1, trin E) og 4,8 g (0,01 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-alloisoleucyl-L-prolin-cyklohexyl-ammoniumsalt omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 1, under anvendelse 5 af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler.

Under søjlekromatografering forenes de fraktioner som inde- 2 holder det produkt der vandrer med Rp = 0,74-0,80, den vundne remanens behandles med 40 ml diisopropylæter, bundfaldet filtreres, vaskes med 2 x 20 ml diisopropylæter og 10 tørres i en vakuumexsiccator over svovlsyre og paraffinspåner. Udbytte 4,3 g (66%) Rp = 0,74-0,80.

Bregnet for c34H4407Ng (648,74): C 62,94 H 6,84 N 12,96 Fundet: C 63,1 H 6,9 N 12,7% 15 Trin 2: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-alloisoleucyl-L-pro-i¥ilN^ibenzyloxykarbgnyl;L-argininaldehyd________ 3,25 g (0,005 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-alloisoleucyl-L-prolyl-Nu)-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam (eksempel 5, trin 1) omdannes ved den fremgangsmåde der 20 er beskrevet i eksempel 1, trin 2, under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 2,5 g (66%) af et produkt som ifølge elementæranalyse inde- „ 3 holder et mol cyklohexan. Rp = 0,55.

Beregnet for -CgH^ (734,91): 25 C 65,37 H 7,95 N 11,43

Fundet: C 65,0 H 7,8 N 11,6%

Trin 3: N-Metyl-D-alloisoleucyl-L-prolyl-L-argininaldehyd- sulfat___________________________________________ 30 1,47 g (0,002 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-alloisoleucyl-L-prolyl-N“-benzyloxykarbonyl-L-argininalde-hyd (eksempel 5, trin 2) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 3 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 35 0,85 g (87%). Rp = 0,4.

Beregnet for c18H3403N6 . H2SC>4.4 H20 (552,65): C 39,12 H 8,02 N 15,21 S 5,80

Fundet: C 39,2 H 7,70 N 15,1 S 5,7% 28 DK 171403 B1 5 Udgangsmaterialet N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D- alloisoleucyl-L-prolin-cyklohexylammoniumsalt kan fremstilles ved følgende metode:

Trin A: N-Benzyloxykarbonyl-D-alloisoleucyl-L-prolin-10 cyklghexylarmoniumsalt______________________ 13,3 g (0,05 mol) benzyloxykarbonyl-D-alloisoleucin (M. Winitz et al: J. Am. Chem. Soc. ^8, 2423-2430 (1956)) og 9,9 g (0,05 mol) 2,4,5-triklorfenol opløses i 50 ml ætylacetat, der tilsættes 10,2 g (0,05 mol) dicyklohexylkarbo-diimid og blandingen henstår natten over. Det udfældede dicyklohexylurinstof filtreres og filtratet inddampes på et vandbad med en temperatur på ca. 40°C ved 15-20 millibar. Remanensen opløses i 100 ml n-hexan, ekstraheres med 20 ml IN natriumhydroxyd og 2 x 20 ml vand hvorpå ekstrakten 20 tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes på den foran beskrevne måde. Remanensen opløses i 50 ml pyridin, der tilsættes 5,7 g (0,05 mol) L-prolin og 7,0 ml (0,05 mol) triætylamin og blandingen omrøres indtil L-prolinet er opløst hvorpå den henstår natten over. Så inddampes blandingen 25 på et vandbad ved en temperatur på ca. 40°C ved 15-20 millibar. Remanensen opløses i 50 ml 5%s natriumhydrogenkarbonat-opløsning og 50 ml diætylæter. Det vandige lag vaskes med 2 x 30 ml æter og syrnes derefter med 3N saltsyre til pH 3. Det fraskilte produkt ekstraheres med 3 x 30 ml ætylace-tat, ætylacetatekstrakterne forenes, vaskes med 3 x 30 ml vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes på den foran beskrevne måde. Remanensen opløses i 100 ml diiso-propylæter, der tilsættes 6,0 ml (0,052 mol) cyklohexylamin og opløsningen henstår i 4-5 timer. De dannede krystaller 55 filtreres, vaskes med 3 x 30 ml diisopropylæter og tørres i en vakuumexsiccator over svovlsyre og kaliumhydroxyd. Udbytte 14,5 g (62%). Smp. 138-140°C. = 0,35-0,40.

29 DK 171403 B1 [aj^° = -30,7° (c = 1 i metanol).

Beregnet for C^9H26^5N2*^6H13N (461,59): C 65,05 H 8,52 N 9,10

Fundet: C 65,4 H 8,5 N 9,05% 5

Trin B: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-alloisoleucyl-L-pro- iiQlSY?Si2h®XYi§n!rooniumsalt_______________________ 9,25 g (0,02 mol) benzyloxykarbonyl-D-alloisoleucyl-L-prolin-cyklohexylammoniumsalt (eksempel 5, trin A) oplø-10 ses i 50 ml diætylæter og 50 ml 0,5N svovlsyre. Det vandige lag ekstraheres med 20 ml diætylæter og de forenede æterlag vaskes med 3 x 30 ml vand hvorpå ekstrakten tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes på et vandbad med en temperatur på ca. 40°C ved 20-30 millibar. Inddampningsre-15 sten, N-benzyloxykarbonyl-D-alloisoleucyl-L-prolin, omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 3 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 8,1 g (85%). Smp. 120-123°C.

r| = 0,55-0,60. Mn° = +43,8° (c = 1 i metanol), r U

20 Beregnet for C20H28°5N2‘C6H13N (475,61): C 65,65 H 8,69 N 8,83

Fundet: C 65,6 H 8,7 N 8,75%

Eksempel 6 i 25 ---------- N-n-Hexyl-D-fenylalany1-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat Trin 1: N-Benzyloxykarbonyl-N-n-hexyl-D-fenylalanyl-L-pro-iYilN^ibenzylgxykarbgnYl;L-argininaldehyd________ 3,5 g (0,01 mol) N-n-hexyl-D-fenylalanyl-L-prolin 30 (trin A) opløses i en blanding af 10 ml dioxan og 14 ml 2N natriumhydroxyd hvorpå der ved 5-10°C tilsættes 2,1 ml (0,028 mol) benzyloxykarbonylklorid og blandingen omrøres i 4 timer. Derefter fortyndes reaktionsblandingen med 30 ml vand og ekstraheres med 2 x 20 ml petroleumsæter. Det 35 vandige lag syrnes med IN svovlsyre til pH 2-3 og ekstraheres med 3 x 20 ml ætylacetat. De forenede ætylacetatlag vaskes med 3 x 10 ml vand, tørres over vandfrit natriumsul- 30 DK 171403 B1 fat og inddampes ved et tryk på 20-25 millibar. Udbytte 2,9 g (60%) af en olie, R^ = 0,48.

Γ

Dette produkt og 2,58 g (0,0066 mol) N°-t-butyloxy-karbony1-N“-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam (eksempel 5 1, trin E) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 1 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Efter søjlekromatografe- ring forenes de fraktioner som indeholdet det rene hoved-2 produkt (Rp = 0-,68) og inddampes ved 20-25 millibar.

t 2 10 Udbytte 2,7 g (60%) af et olieagtigt produkt med Rp = 0,68.

Dette produkt omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 2, urtdar anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 2,2 g (80%). Rp = 0,53.

15 Beregnet for C42H54°7N6 (699,82): C 66,82 H 7,21 N 11,13 Fundet: C 66,5 H 7,4 N 11,4%

Trin 2: N-n-Hexyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd-sulfat___________________________________________ 20 0,74 g (0,001 mol) N-benzyloxykarbony1-N-n-hexyl- D-fenylalany1-L-prolyl-Νω-benzyloxykarbonyl-L-argininalde-hyd (eksempel 6, trin 1) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 3 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Rp = 25 0,75.

Beregnet for c26H4203N6.H2S04.4 H20 (656,79): C 47,54 H 7,98 N 12,80 S 4,88 Fundet: C 47,6 H 8,1 N 12,7 S 4,8% 20 Udgangsmaterialet N-n-hexyl-D-fenylalanyl-L-prolin kan fremstilles ved følgende fremgangsmåde: 7,9 g (0,02 mol) N-benzyloxykarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolin (eksempel 1, trin B) og 4,9 ml (0,04 mol) kapryl-aldehyd opløses i 100 ml 80%s ætanol og opløsningen under-35 kastes hydrogenolyse i nærværelse af 6 g 10%s Pd/C katalysator. Ved reaktionens slutning frafiltreres katalysatoren og filtratet inddampes. Den krystallinske remanens suspen- 31 DK 171403 B1 deres i 20 ml vand, filtreres og vaskes to gange med vand hvorpå den tørres over fosforpentoxyd i en vakuumexsicca-tor. Udbytte 3,0 g (60%). Rp = 0,6. [a]^° = -97,3° (c = 1 i 0,1N natriumhydroxyd).

5 Beregnet for c2oH30°3N2 (346,45): C 69,33 H 8,73 N 8,08 Fundet: C 68,9 H8,8 N 8,0%

Eksempel 7 q N-Metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-D-argininaldehydsulfat

Trin 1: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-P-fenylalanyl-L-prolyl-ω N.ibenzyloxykarbonyl^P^argininlaktam______________ 4,3 g (0,011 mol) Na-t-butyloxykarbonyl-NW-benzyl-oxykarbonyl-P-argininlaktam og 5,09 g (0,01 mol) N-benzyl-15 oxykarbonyl-N-metyl-P-fenylalanyl-L-prolin-cyklohexylammo- niumsalt (eksempel 1, trin C) omdannes og kondenseres ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 1 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 4,5 g (65%). [a]^0 = +28,3° (c = 20 li tetrahydrofuran). Rp = 0,55-0,65 (stylacetat), Rp = 0,7-0,8 (D,L,L-form):.

Beregnet for C37H4207Ng (682,75): C 65,08 H 6,20 N 12,31 Fundet: C 65,2 H 6,3 N 12,2% 25 Trin 2: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-P-fenylalanyl-L-prolyl- U) _ ibenzy 1 oxykarbonyl-P margin inaldehyd_____________ 3,41 g (0,005 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-P-fe-nylalanyl-L-prolyl-Nu-benzyloxykarbonyl-P-argininlaktam (eksempel 7, trin 1) reduceres ved den fremgangsmåde der 30 er beskrevet i eksempel 1, trin 2 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 2,7 g (70%) af et produkt der ifølge elementæranalysen indeholder ét mol cyklohexan. R^ = 0,57-0,67. [o]^° = +45,5° (c = 1 i tetrahydrofuran).

35 Beregnet for C37H44°7Ng,C6H12 (768,93): C 67,16 H 7,34 N 10,93 Fundet: C 66,8 H 7,1 N 10,8% 32 DK 171403 B1

Trin 3: N-Metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-D-argininaldehyd-sulfat_________________________________________ 2,31 g (0,003 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-Nu,-benzyloxykarbonyl-D-argininaldehyd ^ (eksempel 7, trin 2) underkastes hydrogenolyse ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 3 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 1,24 g (75%). R® = 0,39-0,47. [α']^° = -75° (c = 1 i vand) .

10

Udgangsmaterialet, N°-t-butyloxykarbonyl-Nw-benzyl-oxykarbonyl-D-argininlaktam kan fremstilles ved følgende fremgangsmåde: 5,97 g (0,014 mol) Na-t-butyloxykarbonyl-Na)-benzyl-oxykarbonyl-D-argininhydrat, fremstillet ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin D, dog med den forskel at der bruges t-butyloxykarbonyl-D-arginin-hydroklo-ridhydrat som udgangsmateriale, omdannes ved den fremgangsmåde der er anvendt i eksempel 1, trin E under anvendelse 20 af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 40 g (73%). Smp. 155-156°C. [α]^° = +24° (c = 1 i tetrahydrofuran).

Eksempel 8 > 25 ---------- N-Metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-DL-argininaldehydsulfat Trin 1: N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N^zbenzyloxykarbonyi-DL-argininlaktam______________ 4,3 g (0,011 mol) Na-t-butyloxykarbonyl-Nh>-benzyloxy-30 karbonyl-DL-argininlaktam og 5,09 g (0,010 mol) N-benzyloxy-karbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolin-cyklohexylammonium-salt (eksempel 1, trin C) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 1 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 35 4,0 g (60%). = +21° (c = 1 i tetrahydrofuran). Rp = 0,55-0,65 (D,L,D-form) og Rp = 0,7-0,8 (D,L,L-form) (ætylacetat ) .

DK 171403 Bl 33

Trin 2: N-Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-pro-iyilii!!ib§nzyloxykarbonyl-DL-argininaldehyd_____ 3,41 g (0,005 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N“-benzyloxykarbonyl-DL-argininlaktam ^ (eksempel 8, trin 1) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 2 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 2,9 g (75%) af et produkt som indeholder' ét mol cyklohexan.

Ri! = 0,52-0,67. [a]*0 = +32,5° (c = 1 i tetrahydrofuran) .

10 F D

Trin 3: N-Metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-DL-argininaldehyd-sulfat__________________________________________ 2,31 g (0,003 mol) N-benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-^ ^ fenylalanyl-L-prolyl-Na,-benzyloxykarbonyl-DL-argininaldehyd (eksempel 8, trin 2) omdannes ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 1, trin 3 under anvendelse af proportionale mængder reagenser og opløsningsmidler. Udbytte 1,15 g (70%). Rp = 0,39-0,47. [a]^° = -109° (c = 1 i vand).

20

Eksempel 9

Farmaceutisk præparat

Et 2-ampuls præparat egnet til 6 og 12 timers intravenøs infusion fremstilles på følgende måde: 25 ' N-Metyl-D-fenylalany1-L-prolyl-L-argininaldehydsul- fat (420-840 mg) og humant albumin (40-80 mg) underkastes fælles frysetørring. Indholdet af den frysetørrede ampul opløses før brugen i sterilt, kimfri isotonisk saltopløsning (100-200 ml), i en anden ampul.

30 35

Claims

1. Peptidaldehydderivat, kendetegnet ved, at det har den almene formel 5 Xxx-Pro-Yyy-H.(HA), I R2^ in hvor R^ er hydrogen eller en C, , alkylgruppe, 2 1 2 R en alkylgruppe, idet R og R er bundet til aminogruppen i α-aminosyregruppen Xxx, Xxx er en D-fenylalaninrest eller en D-a-aminosyre- gruppe der i sidekæden har en alkylgruppe,

15 Pro en L-prolinrest, Yyy en L-, D- eller DL-argininrest og A en syrerest.

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet 1 2 ved,at R er hydrogen og R en metylgruppe. 2ø

3. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet 1 2 ved,at R og R begge er metylgrupper.

4. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved,at Xxx er en D-fenylalaninrest.

5 J^Xxx-Pro-Yyy-H. (HA)« I 2' * R hvor R^ betegner hydrogen eller en C, , alkylgruppe, og 2 1ϊ° 2 R en alkylgruppe, idet R og R er bundet til 10 aminogruppen i a-aminosyren Xxx, Xxx en D-fenylalaninrest eller en D-a-aminosyregrup-pe der i sidekæden har en alkylgruppe, Pro en L-prolinrest, Yyy en L-, D- eller DL-argininrest og 15 A en syrerest, kendetegnet ved, at man ved en metode der er kendt i peptidkemien kondenserer en argininlaktam med beskyttet guanidingruppe med et N-beskyttet N-monoalkyl-Xxx-Pro-OH-eller N,N-dialkyl-Xxx-Pro-OH-dipeptid, hvorpå den herved 20 vundne beskyttede tripeptidlaktam reduceres til det beskyttede tripeptidaldehyd, beskyttelsesgruppen eller -grupperne fjernes og det resulterende N-alkyl- eller N,N-dialkyltri-peptidaldehyd isoleres i form af et syreadditionssalt.

5. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved,at Yyy er en L-argininrest.

6. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er N-metyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininalde-hydsulf at, N, N-dimetyl-D-ferry lal any 1-L-prolyl -L-arginin-aldehydsulfat, N-ætyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininalde- 3ø hydsulfat, N-isobutyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininalde-hydsulfat, N-metyl-D-alloisoleucyl-L-prolyl-L-argininalde-hydsulfat eller N-n-hexyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydsulfat.

7. Farmaceutisk præparat med antikoagulant virkning, 35 kendetegnet ved,at det som virksom bestanddel indeholder mindst én forbindelse med den almene formel I som angivet i krav 1 sammen med et eller flere farmaceutiske bærestoffer. DK 171403 B1

8. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk 25 præparat, kendetegnet ve<^ at man blander mindst en forbindelse med den almene formel I med et eller flere farmaceutiske bærestoffer, fortyndingsmidler og/eller additiver . 30