CN1025738C - 新肽-醛类化合物的制备方法及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新肽—醛类化合物及其制备方法，以及含有这类化合物的药物组合物。本发明提供通式为(I)的新肽—醛衍生物，式中R1代表氢或C1-6烷基；R2代表C1-6烷基，而且R1和R2与XXXa-氨基酸的氨基相接；XXX代表D-苯丙氨酸残基或侧链上有C1-4烷基的D-α-氨基酸残基；Pro代表L-脯氨酸残基；Xyy代表L-；D-或DL-精氨酸残基；A代表一种酸的残基。本发明的新肽一醛衍生物具有有效的抗血凝活性。

Description

本发明涉及新的肽-醛（Peptide-aldehydes）类化合物，其制备方法，以及含有这些化合物的药物组合物。
本发明的新肽-醛衍生物的通式为（Ⅰ）
Figure 851097367_IMG3
Xxx-Pro-Yyy-H（HA）2（Ⅰ）
R1代表氢或C1-6烷基，
R2代表C1-6烷基，而且，R1和R2与Xxxα-氨基酸的氨基相连接，
Xxx代表D-苯丙氨酸残基或在侧链上有C1-4烷基的P-α-氨基酸基团，
Pro代表L-脯氨酸残基，
Yyy代表L-，D-或DL-精氨酸残基，
A代表酸的残基
上面定义的“C1-6烷基”包括直链或支链烷基，例如，甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，正己基等。
通式为（Ⅰ）的化合物的优选代表在实例中加以阐述。
本发明中尤其优选的代表性化合物是如下衍生物：
N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐;N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐;N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐;N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐;N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐和N-正己基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐。
如所知血液凝块过程和血块溶解作用都是蛋白水解反应的结果。在血液凝块过程中，凝血酶-纤维蛋白原反应是关键的步骤，此时溶解于血浆中的纤维蛋白原转变成不溶性的纤维蛋白聚合物;而在溶解过程中，血纤维蛋白溶酶的蛋白水解作用，使纤维蛋白聚合物裂解成可溶性片断。可用于治疗的、好的抗凝剂指望能抑制血液凝块过程而又使血纤维蛋白溶酶-纤维蛋白反应（血块溶解作用）得以发生。结构为D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨 酸-醛的游离三肽醛的盐类（匈牙利专利No.169，870和比利时专利No.891，708）就是具有这样性质的抗凝剂。这些化合物对血纤维蛋白溶酶-纤维蛋白反应没有影响。在这类化合物的存在下，根据其浓度，或者不形成纤维蛋白血块，或者只形成容易被血纤维蛋白溶酶水解的疏松的血块。然而，已经知道具有末端游离氨基的三肽-醛相当不稳定，迅速失去其当初所具有的较高的酶抑制活性，只有在比利时专利No.891，708所阐述的D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐具有显著的稳定性，在冷溶液中（5℃）相当长的时期内保留着初始的活性。
在较高温度下测定D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸一醛硫酸盐的稳定性时，发现在80到100℃的水溶液中几小时内就发生转变，而在37～40℃时，10到14天才完全转变成稳定的三环化合物，失去了酶抑制活性。该化合物[1，2，4，5，6，6a-六氢-1-苄基-2-氧代-（4′-胍基）-丁基-吡咯并[1，2-a]咪唑并[2，1-c]-吡嗪]的结构是用质谱和核磁共振谱确定的。虽然，已发现相应的酰基-三肽-醛不发生类似的转变，但是该酰基衍生物，即特丁氧羰基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛半硫酸盐既可抑制凝血酶-纤维蛋白原的反应，也可抑制血纤维蛋白溶酶-纤维蛋白反应[参见：比利时专利No.891，708和S.Bajusz等，在“肽合成-结构-功能”（H.D.Rich和E.Gross，皮尔斯化学公司，美国伊里诺伊州，罗克福德，817页]，它们不适合于作抗凝剂。
本发明的目的是制备具有选择性抗凝作用的新型肽-醛，即，D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐，这类化合物更稳定并且不易发生不可逆的环化作用。
意外地发现，末端氨基烷基化后的三肽-醛，例如N-甲基-，N-乙基-，或N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐，不会不可逆地转变为上述三环化合物。稳定性试验是将D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐及其相应的N-烷基衍生物的水溶液，在浓度为10mg/ml（pH＝6.0）40℃下贮存5天。用层析法和测定抗凝血酶活性来监测此溶液中发生的变化。
D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐在硅胶板上的薄层层析，展开溶剂是乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水（30∶20∶6∶11），可证明这个转变过程：三肽-醛的斑点（RF＝0.40）逐渐减小，与此同时相应于三环化合物的斑点（RF＝0.60）增大。可是N-甲基，N-乙基，N-异丁基和N，N-二甲基衍生物的色谱则未检出这种转化，只见到相应于未变化的肽的斑点（RF值分别为0.50，0.64和0.37）。
进而还发现N-烷基-三肽一醛的各种其它的盐，例如乙酸盐，也不会变成相应的三环化合物。然而D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛乙酸盐对这种转化又特别敏感。
抗凝血酶活性试验是含有如下组分的体系：
0.2ml0.5%牛纤维蛋白原的0.9%氯化钠溶液，
0.1ml含肽的三（羟甲基）-氨基-甲烷盐酸盐-盐酸缓冲液（pH＝7.2）的溶液，
0.1ml美国标准人凝血酶（NIH，马里兰州，贝塞斯达，美国）溶液，10单位/毫升。
无肽体系血凝块时间是15秒，测定是在“Schnither-Gross凝聚器”中进行。三肽-醛硫酸盐的初始活性是任意制定的，与对照相比，引起凝血时间延长5倍时的摩尔浓度（I80值）。溶液中肽的活性是在第一天、第三天和第五天测定，用初始活性（零天）的百分率表示，结果列于表1。
在观测期间，D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐丧失其初始活性在50%以上，而N-甲基衍生物仍保留其初始活性，N-乙基和N-异丁基衍生物也只降低活性的15～20%。在所应用的实验条件下，L-精氨酸-醛末端片断是容易发生部分消旋化，活性略减就是由于此消旋现象。
N-烷基-三肽-醛对血纤维蛋白溶酶-纤维蛋白反应的影响也进行了研究，并在N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐的例子中以如下的体系作了证明：
0.2ml0.5%牛纤维蛋白原的0.9%氯化钠溶液，
0.1ml含有肽的三（羟甲基）-氨基甲烷盐酸盐-盐酸缓冲液（pH＝7.2）
0.1ml0.1单位的纤维蛋白溶酶溶于缓冲溶液（KABI，斯德哥尔摩，瑞典），
0.1ml美国标准人凝血酶（NIA，美国，马里 兰州，贝塞斯达）10单位/毫升溶液。
在无肽体系中形成的纤维蛋白凝胶的水解时间是10分钟。D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐和上面提及的特丁氧羰基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛半硫酸盐作为参比物质，结果见表2。（见下页）
这些数据说明，N-烷基-三肽-醛的性质与具有游离的氨基末端的相应类似物的性质相似。在少量的肽的存在下，在对照期间内，形成的凝块被水解了，而大量的肽存在下，或者只生成结构相当疏松的凝胶，或者根本不产生凝块。然而，纤维蛋白凝块的血纤维蛋白溶酶水解时间可被酰基-三肽-醛半硫酸盐所增加，而且是依赖于剂量的增加。
上面的实验清楚地表明，末端氨基上烷基化的新的三肽-醛比已知的D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐的稳定性要强的多。这些化合物由于抑制了凝血酶-纤维蛋白原反应但不干扰血纤维蛋白溶酶-纤维蛋白反应，因而是很好的有选择性的抗凝血药物。
通式为（Ⅰ）的新的N-烷基-三肽-醛在体内也呈现有显著的抗凝血活性。肽溶于生理盐水中，给体重为2-3公斤的新西兰雄性家兔口服或静脉注射。静脉灌注0.5～2.0mg/Kg/h，速度是6ml/h为时三小时。口服肽的剂量为20～30mg/Kg，体积
表1、2见文后
为2ml，给药后30分钟自兔的耳静脉采血样，用凝血弹性描记仪测定全血的凝块时间[H.Harter：Zeitschrift    fur    Klinische    Medicin153，423（1955）]，同时也测定血浆凝血酶时间[R.T.S.Jim：J.Lab.Clin.Med.50，45（1957）]。表3（见下页）列出了为达到治疗效果所需要的最低剂量（M.Verstraete    and    R.Verwilghen    in    Drug    Treatment，Znd    ed.，：G.S.Avery，churchill    Livingstone，εdinburgh-London，1980，P919），D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐作为参比物质。
这些数据说明，N-烷基-三肽-醛的效力与参比物质的相似或相同。
基于家兔静脉灌注实验，用于给人静脉灌注的剂量确定为1～2mg/kg/h。
通式（Ⅰ）的N-烷基-三肽-醛的制备是用N-末端二肽片断作为酰化剂，将已保护了胍基的精氨酸内酰胺酰化，生成的被保护的三肽内酰胺还原成被保护的三肽-醛，除去保护基，N-烷基-三肽-醛以其盐的形式分离出。
本发明的进一步特征是提供制备通式为（Ⅰ）的新三肽-醛的方法，其中R1，R2，Xxx，Pro，Yyy和A的含义与上述同。制备方法的特征是用肽化学中已知的方法，将精氨酸内酰胺的胍基保护后，与N-保护的-N-单烷基-Xxx-Pro-OH或N，N-二烷基-Xxx-Pro-OH二肽缩合，生成的保护了的三肽内酰胺还原成保护了的三肽-醛，除去保护基后，生成的N-烷基或N，N-二烷基-三肽-醛以盐的形式被分离。
原料N-单烷基或N，N-二烷基-Xxx-Pro-OH二肽也是新的。
表3见文后
本发明的进一步特征是提供了作为原料的新的N-单烷基或N，N-二烷基-Xxx-Pro-OH二肽的制备方法，其特征是用肽化学的已知方法，将N-末端氨基已保护了的氨基酸Xxx与L-脯氨酸缩合，生成的被保护的二肽再烷基化，或者具有游离末端氨基的Xxx-Pro-OH二肽进行单或双烷基化，或者Xxx氨基酸的氨基先单烷基化并保护，或先二烷基化，而后用肽化学中已知的方法与L-脯氨酸缩合。
按照本发明的方法所特选的实例，D-苯丙氨酰-L-脯氨酰的N-苄氧羰基衍生物在氢化钠存在下，用碘甲烷甲基化，生成的N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸用混合酸酐法与L-精氨酸内酰胺缩合，生成的保护了的三肽内酰胺用氢化铝锂还原成N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛。在硫酸存在下，保护基用氢化法除去，生成的N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐被分离出。
根据本发明方法的进一步选定的实例，将D-苯丙氨酰-L-脯氨酸在甲醛的存在下，进行氢化。生成的N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸用混合酸酐法与Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺缩合，生成的被保护的三肽内酰胺用氢化铝锂还原，得N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛，在硫酸存在下用氢化法除去保护基团， 最后分离出N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐。
按照本发明的进一步实例，D-苯丙氨酸在乙醛的存在下，进行氢化，生成的N-乙基-D-苯丙氨酸用苄氧羰基保护，生成它的2，4，5-三氯苯酯，然后与L-脯氨酸缩合。得到的N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨用混合酸酐法与N-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺偶和。得到的被保护的三肽内酰胺用氢化铝锂还原，生成N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛，在硫酸存在下，用氢化法除去保护基，分离生成的N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐。
上面提及的方法制备出具有D.L.L构型的产物，可能最终含有一定量的具有D.L.D构型的产物，不过这并不影响它们的治疗应用。
在通式（Ⅰ）的肽和上述它们的衍生物的酸加成盐中，活性在于碱基，而酸并不重要，虽然为了治疗的目的，最好是用药理学及药剂学上可以接受的酸。这类适宜的酸的例子包括（a）无机酸：盐酸，氢溴酸，磷酸，偏磷酸，硝酸和硫酸（b）有机酸：酒石酸，乙酸，柠酸酸，苹果酸，乳酸，富马酸，苯甲酸，羟基乙酸，葡萄糖酸，古洛糖酸，琥珀酸和芳磺酸，例如对甲苯磺酸。在制药学和药理学上可以接受的酸加成盐与那些不适于药用的盐（例如氢氟酸盐和高氯酸盐）一起，可用来分离和纯制碱基，因此不适于药用的盐用熟知的方法在制备可供药用的盐时也是很有价值的。含有多个游离氨基的肽或其衍生物可以生成单或多个酸加成盐，或与多种酸形成混合盐。
根据本发明的进一步特征是提供新的药物组合物，其中至少含有一种通式为（Ⅰ）的化合物为活性成分，并有一种或多种药用载体、稀释剂和/或添加剂。
药物组合物的制备，是用制药工业上常用的方法进行。
下面所述的非限定的实例，详细解释了本发明。
实例中的RF值由硅胶板薄层层析法测定（KieselgelG，Reanal，布达佩斯），展开剂系统如下：
1、乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-960∶20∶6∶11
2、乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-480∶20∶6∶11
3、乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-240∶20∶6∶11
4、乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-120∶20∶6∶11
5、乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-60∶20∶6∶11
6、乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-30∶20∶6∶11
实例1
N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐第1步：N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
42.95g（0.11毫摩尔）N-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺悬浮于110ml无水氯仿，在不停地搅拌下，加入275ml盐酸的乙酸乙酯溶液（0.11～0.15g/ml）。搅拌3小时后，反应混合物用400ml乙醚稀释，将析出的结晶过滤，用100ml乙醚和50ml丙酮各洗两次，然后将产物置于有五氧化二磷和氢氧化钾的真空干燥器上干燥。干燥大约一小时后，结晶溶于100ml二甲基甲酰胺中，冷却到-15℃并在此温度和搅拌下先加入20ml三乙胺，进而再加入10～15ml三乙胺，以保持在气相空间中有可以检测出的过量碱。得到的悬浮液加到如下的混合酸酐中。
50.9g（0.1摩尔）的N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸环己铵盐溶解于200ml乙醚和120ml1N硫酸中。乙醚层用水洗涤三次，每次30ml，洗后用无水硫酸钠干燥、溶剂在40℃水浴上压力为25～30毫巴下蒸发。残留物与11.2ml（0.1摩尔）的N-甲基吗啉共同溶于70ml二甲基甲酰胺中，冷却到-15℃，并在此温度下加入13.2ml（0.1摩尔）的异丁氧羰基氯化物，加完后再搅拌5分钟，然后将上面制得的二甲基甲酰胺悬浮液加到该混合酸酐中。在-15℃下搅拌该反应混合物1小时，然后在0℃下搅拌1小时，200ml苯将其稀释，沉淀出的盐滤出。加150ml水到苯-二甲基甲酰胺的滤液中，并分出各层。下层的二甲基甲酰胺的水溶液滤液用苯提取三次，每次50ml。合并的苯提取液用水洗涤三次，每次30ml，无水硫酸钠干燥，在40℃水浴和20～25毫巴压力下蒸发溶剂。油状残留物溶于60ml苯-四 氢呋喃（8∶2）混合液中，用750g硅胶-60制备柱进行层析，溶剂是苯-四氢呋喃混合液。分离出的流分用硅胶薄层层析监测，展开剂是乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-480∶20∶6∶11，产物的RF值是0.70到0.76，将含有纯产物的流分合并后在水浴温度40℃压力为20～25毫巴下浓缩到100毫升。残留液与500ml石油醚混合，过滤生成的悬浮液，用100ml石油醚洗涤两次，产物在有硫酸和石蜡薄片的真空器中干燥，产量45g（65%）、[α]20 D＝+13.5°（C＝1，四氢呋喃），R20 F＝0.70～0.76。
元素分析C37H42O7N6（682.75）
计算值C    65.08%    H6.20%    N12.31%
实验值C    65.4%    H6.4%    N12.1%
第二步：N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛
34.15g（0.05摩尔）的N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺（实例1，第1步）溶解于150ml四氢呋喃，冷却至-20℃在不停搅拌下加入0.0375摩尔氢化铝锂的四氢呋喃溶液。还原过程用薄层层析监测，展开剂是乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-240∶20∶6∶11（内酰胺和醛的RF值大约分别为0.8和0.5），如必要再加些氢化铝锂，反应混合物在冷却和搅拌下用1N硫酸酸化成pH2。溶液用水稀释直至变浑（大约300ml），然后用100ml正己烷提取两次。水-四氢呋喃层用250ml二氯甲烷提取两次。二氯甲烷提取液合并后用50ml水洗涤两次，用50ml5%碳酸氢钠溶液洗涤两次，再用50ml水洗涤两次，无水硫酸钠干燥，在不超过40℃的水浴上20～25毫巴压力下浓缩到50～60ml。残留液中加入100ml苯，以同样的方式重复浓缩。浓缩物用100ml环己烷稀释。过滤出生成的沉淀，用30ml环己烷洗涤两次，在真空干燥器中用石蜡薄片干燥，产量27g（70%），根据分析数据含有1摩尔的环己烷。R3 F＝0.52～0.62，[α]20 D＝+16.8°（C＝1，四氢呋喃）
元素分析C37H44O7N6·C6H12（768.93）
计算值：C    67.16%    H7.34%    N10.93%
实验值：C    66.6%    H7.2%    N10.4%
第3步：N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
23.1g（0.03摩尔）的N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛（实例1，第2步）溶于150ml乙醇，然后，加50ml去离子水和48ml1N硫酸，混合物在3g的10%钯/碳催化剂存在下进行氢化，氢化过程用薄层层析监测，展开溶剂是乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-30∶20∶6∶11（原料，中间体和最终产物的RF值分别是0.9，0.7和0.4），反应完全后，滤除催化剂，用30ml去离子水洗涤3次，合并滤液和洗涤液，在旋转蒸发器上浓缩到大约100ml，残留的水溶液用大约200ml的去离子水稀释，并调节其pH值，若pH不在6.0和6.5之间，用0.1N硫酸或离子交换树脂（AGI×8）调节，然后将此溶液冷冻干燥。
产量12.4g（75%）。R6 F＝0.39～0.47;[α]20 D＝-131°（C＝1，水）
元素分析C21H32O3N6·7/8（H2SO4）·2.5（H2O）（547.37）
计算值：C    46.07%    H7.13%    N15.35%    S5.12%
实验值：C    46.4%    H7.2%    N15.05%    S5.0%
原料可用如下的方法制备：
N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸
步骤A：苄氧羰基-D-苯丙氨酸2，4，5-三氯苯酯
60.0g（0.2摩尔）的苄氧羰基-D-苯丙氨酸[H.Yaj-ima and K.Kubo：J.Am.chem.Soc.872039-2044（1965）]和39.4g（0.2摩尔）的2，4，5-三氯苯酚溶解于200ml四氢呋喃中，将此溶液冷却到5-10℃，然后，在搅拌下加入41.2g（0.2摩尔）的二环己基碳二亚胺，为时约30分钟。搅拌反应混合物6小时，不必冷却。滤出沉淀的二环己基脲，用50ml四氢呋喃洗涤三次。合并四氢呋喃溶液，减压蒸发溶剂，残留物用300ml热乙醇结晶，过滤，用50ml15-10℃的乙醇洗涤两次，结晶在真空干燥器中干燥。产量72g（75%），M.P.139-141℃，[α]20 D＝+37°（C＝1，二甲基甲酰胺）。
元素分析C23H18O4Cl3（478.75）
计算值：C    57.70%    H3.79%    N2，92%    C122.22%
实验值：C    57.7%    H3.9%    N3.0%    C122.2%
步骤B：苄氧羰基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸
71.8g（0.15摩尔）苄氧羰基-D-苯丙氨酸 -2，4，5-三氯苯酯（实例1，步骤A）在搅拌和室温下溶于180ml无水吡啶，然后加入17.3g（0.15摩尔）L-脯氨酸和21.0ml（0.15摩尔）三乙胺。继续搅拌直至脯氨酸溶解，反应混合物放置4～6小时。在40℃水浴上压力为13～20毫巴下浓缩到80～100毫升。残留物溶解于250ml水和90ml乙醚的混合物中。水层再用30ml乙醚洗涤两次，合并乙醚相，用30ml5%碳酸氢钠溶液洗涤两次，合并水层，用3N的盐酸酸化至pH2。分出的油状物用120ml乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯溶液，用40ml水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，接着，在40℃水浴上压力为15～20毫巴下浓缩成50～100ml。残留物用200ml乙醚结晶，过滤结晶用40ml乙醚洗涤两次。
产量50.4g（85%）。M.P132-133℃;[α]20 D＝-46.4°（C＝2，二甲基甲酰胺）。R8 F＝0.5。
元素分析C22H24O5N2（396.43）
计算值：C    66.65%    H6.10%    N7.07%
实验值：C    66.4%    H6.25%    N7.2%
步骤C：N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸环己铵盐
39.6g（0.1摩尔）苄氧羰基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸（实例1，步骤B）和50ml（0.8摩尔）碘甲烷溶解于300ml无水四氢呋喃中。13.2g（0.3摩尔）的氢化钠悬浮液分成8～10份加到冷至0℃的上述的溶液中，加时要不停地搅拌。加完后再搅拌两小时。接着，加500ml乙酸乙酯到此反应混合物中，以分解生成的氢氧化钠，然后再非常小心地加10毫升水以分解过量的氢化钠。最后该溶液在40℃水浴上15～20毫巴压力下蒸发。残留物溶解于250ml水和100ml乙醚的混合物中。水层用100ml乙醚洗涤，合并乙醚相，用50ml5%碳酸氢钠溶液洗涤。该碳酸氢钠洗液和原水层合并，用硫酸氢钾酸化成pH2，以150ml乙酸乙酯提取两次。合并乙酸乙酯相，顺序用100ml水，50ml10%的硫代硫酸钠，100ml水洗涤，无水硫酸钠干燥。在不超过40℃的水浴上15～20毫巴压力下蒸发。残留物溶解于600ml苯中。加入12ml（0.105摩尔）的环己胺，室温放置。过滤生成的结晶，以200ml苯洗涤两次，并在有石蜡薄片的真空干燥器中干燥。
产量38.2g（75%）。;R3 F＝0.53～0.60（环己胺的RF值为0.01～0.05）;M.P：160-163℃
[α]20 D＝+12.1°（C＝1，甲醇）。
元素分析C23H26O5N2·C6H13N（509.83）
计算值：C    68.34%    H7.71%    N8.25%
实验值：C    68.5%    H7.8%    N8.3%
Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
步骤D：Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸水合物
65.8g（0.2摩尔）的特丁氧羰基-L-精氨酸盐酸盐水合物[D.Yamashiro等：J.Am.chem.Soc.942855-2859（1972）]溶解于100ml4N氢氧化钠中，冷却到5-10℃在不停搅拌下，加入80ml（0.5摩尔）苄氧羰基氯和大约150ml4N氢氧化钠溶液，加入的速度使反应混合物的pH值永远不超过12。然后反应混合物再搅拌3～4小时，用150ml水稀释，100ml乙醚提取。此时体系分成三相。下面的两相反复用100ml乙醚洗两次，然后加入300～400ml甲醇使成为均相溶液，必要时加入4N氢氧化钠，以调节pH成12。放置此溶液6-8小时，用100ml1∶1的石油醚-乙醚混合液提取两次，用冰醋酸调节pH到6～7（大约需50ml）。然后该溶液用140ml二氯甲烷提取3次，合并二氯甲烷溶液，用60ml水洗涤两次，在40℃水浴上25～30毫巴压力下蒸发，残留物中加入300ml苯和600ml水，并于20℃下搅拌2～3小时，10℃下放置过夜。过滤生成的结晶，用300ml水和300ml苯洗涤，在有五氧化二磷和石蜡薄片的真空干燥器中干燥。
产量60g（70%）;M.P122～124℃;[α]20 D＝-20.7°（C＝1，吡啶）。
元素分析C19H28O6N4·H2O（426.46）
计算值：C    53.51%    H7.09%    N13.14%
实验值：C    53.35%    H7.2%    N13.1%
步骤E：Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
59.7g（0.14摩尔）Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸水合物（实例1，步骤D）和19.6g（0.14摩尔）三乙胺溶解于200ml四氢呋喃中。将此溶液冷却到-10℃，并于此温度和搅拌下加入18.5ml （0.14摩尔）的异丁氧羰基氯，10分钟后加入19.6ml（0.14摩尔）三乙胺。于0℃下搅拌1小时，并再于室温下搅拌1小时。将混合物倾入1000ml冰水中。过滤生成的结晶，100ml冰水洗涤两次后，将结晶溶解于280ml氯仿中。氯仿溶液用100ml冰水洗涤两次，无水氯化钙干燥，于不超过40℃的水浴上20～25毫巴压力下蒸发，结晶性残留物悬浮于70ml石油醚中，过滤，以30ml石油醚洗涤两次，在有五氯化二磷的真空干燥器中干燥。
产量44g（81%），M.P：164～166℃，[α]20 D＝-24°（C＝1，四氢呋喃）。
元素分析C19H26O5N4·（390.43）
计算值：C    58.44%    H6.71%    N14.35%
实验值：C    58.7%    H6.8%    N14.1%
实例2
N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
第一步：N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺盐酸盐。
按照实例1步骤1中叙述的方法及比例量的溶剂和试剂，将4.3克（0.011摩尔的）的Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺（实例1，步骤E）转化。将所得的悬浮液加到下述混合酐中。
将3.26克（0.01摩尔）N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸水合物和2.2毫升（0.02摩尔）N-甲基-吗啉溶解于50毫升苯和5毫升乙醇的混合液中。在40～50毫巴下，在最高温度为40℃的水浴上，将此混合物浓缩至10～15毫升，接着，用苯萃取混合物四次，每次40毫升，最后将苯蒸发至干。将残余物溶解于10毫升二甲基甲酰胺中，冷至-15℃，加1.32毫升（0.01摩尔）异丁氧羰基氯，5分钟后将上述悬浮液加入此混合液中。此反应混合物于-15℃下搅拌1小时，并于0℃再搅拌1小时，然后加入40毫升乙酸乙酯，过滤出沉淀的盐。将20毫升水倒入滤液中，分层后分离。含水-二甲基甲酰胺层用乙酸乙酯萃取三次，每次5毫升。合并乙酸乙酯萃取液，水洗两次，每次15毫升，用5%碳酸氢钠溶液洗两次，每次15毫升，然后再用水洗两次，每次15毫升。此提取液用无水硫酸钠干燥，并在40℃水浴上，20～25毫巴下浓缩至10～15毫升。往残余液中加盐酸-乙酸乙酯，以确保残余液的气相为酸性，然后，用30～40毫升乙醚稀释此溶液。滤出生成的沉淀，用乙醚洗涤，在硫酸和氢氧化钾存在下在真空干燥器中干燥。
产量2.7克（45%）;R4 F＝0.43;[α]20 D＝-56.0（C＝1，氯仿）。
元素分析C30H38O5N6·9/5Hcl·2H2O（666.13）
计算值：C    54.0%    H6.90%    N12.62%    C19.58%
实测值：C    54.0%    H7.00%    N12.6%    C19.8%
第二步：N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛硫酸盐
将2.4克（0.004摩尔）N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺盐酸盐（实例2，第一步）溶解于15毫升四氢呋喃中，冷却至-20℃并在不断搅拌下加入0.003摩尔氢化铝锂的四氢呋喃悬浮液。还原反应的进展通过薄层色谱监测，展开剂为乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-（60∶20∶6∶11）（内酰胺和醛的RF值分别约为0.35和0.2）。如果需要，可以再加一些氢化铝锂，然后在冷却和搅拌条件下，用1N硫酸（约30毫升）酸化反应混合物至pH5，并用氯仿萃取两次，每次15毫升。含水-四氢呋喃层用正丁醇萃取三次，每次20毫升。合并丁醇萃取液并用以正丁醇饱和的10毫升水洗涤，在最高温度为40℃的水浴上和15～20毫巴下，将该溶液浓缩至5～10毫升。残余液用30毫升乙醚稀释，过滤出生成的沉淀，用乙醚洗两次，每次10毫升，再用石油醚洗两次，每次10毫升。然后将其溶解于20毫升氯仿和5毫升甲醇的混合液中。滤去不溶解的残余物，滤液按照上面的方法蒸发。
油状残余物与30毫升乙醚混合，滤出生成的沉淀，用乙醚洗两次，每次20毫升，石油醚洗两次，每次20毫升，然后在有石蜡薄片、硫酸和氢氧化钾的真空干燥器中干燥。
产量2.25克（85%）;R5 F＝0.48～0.54。
元素分析C30H38O5N6·H2SO4（660.73）
计算值：C    54.53%    H6.10%    N12.72%    S4.84%
实测值：C    55.0%    H6.5%    N12.1%    S4.7%
第三步：N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰 -L-精氨酸-醛硫酸盐
将1.32克（0.002摩尔）N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛硫酸盐（实例2，第二步）溶解于5毫升去离子水和15毫升乙醇的混合液中，并在0.2克10%钯/碳催化剂存在下氢化。滤去催化剂，用去离子水洗两次，每次10毫升。在最高温度为40℃水浴上和15-20毫巴下，将合并的滤液和洗涤液浓缩至5～10毫升。然后，用去离子水将该溶液稀释至20毫升。如果需要，或用0.1N的硫酸或用离子交换树脂（AG1×B）调节pH至6.0～6.5，然后将该溶液冷冻干燥。
产量0.85克（80%）;R6 F＝0.35～0.39。
元素分析C22H34O3N6·H2SO4·3（H2O）（566.67）
计算值：C    46.60%    H7.47%    N14.82%    S5.66%
实测值：C    45.5%    H7.4%    N14.3%    S5.2%
原料：N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸水合物的制备方法：
将11.9克（0.03摩尔）苄氧羰基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸（实例1，步骤B）溶解于200毫升50%甲醇水溶液中，在9.7毫升甲醛（0.12摩尔）溶液和6克10%钯/碳催化剂的存在下使其氢化。反应的进程用薄层层析监测，展开剂为乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水-（30∶20∶6∶11）（原料和最终产物的RF值分别为0.95和0.45）。反应完成后，滤去催化剂，用甲醇水溶液洗两次，每次50毫升。将滤液及洗涤液合并，于40℃水浴上，在20～25毫巴下蒸发。残留物溶解于60毫升乙酸乙酯中，加入0.5毫升水，在5～10℃下放置过夜。滤出生成的结晶，用5～10℃的乙酸乙酯洗两次，每次15毫升。结晶置于有石蜡薄片，硫酸和氢氧化钾的真空干燥器中干燥。
产量6.5克（67%）;熔点：228～229℃;[α]20 D＝-159°（C＝1，水）
元素分析C16H22O3N2·H2O（308.37）
计算值：C    62.31%    H7.85%    N9.08%
实验值：C    62.5%    H8.0%    N8.95%
实例3
N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
第一步：N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
按实例1第一步叙述的过程，用比例量的试剂和溶剂，将2.1克（0.005摩尔）N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸和2.15克（0.0055摩尔）Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺（实例1，步骤E）分别转化和缩合。无论是在反应混合物的处理期间还是在柱层析期间都要用薄层色谱监测产物的含量，展开剂为苯-四氢呋喃（8∶2）。将含纯的主产物的流份（RF＝0.4～0.5）合并，于40℃水浴上，在15～20毫巴下蒸发。残留物用二异丙醚处理，过滤，用二异丙醚洗涤，在有硫酸和石蜡薄片的真空干燥器中干燥。
产量：1.9克（54%）;R2 F＝0.75～0.85
第二步：N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-N-苄氧羰基-L-精氨酸-醛
按实例1第二步的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将1.4克（0.002摩尔）N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-N-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺转化。
产量：1.15克（72%），根据分析，产物含1摩尔环己烷;R3 F＝0.55～0.65。
元素分析C38H46O7N6·C6H12（782.95）
计算值：C    67.49%    H7.47%    N10.37%
实测值：C    67.6%    H7.5%    N10.5%
第三步：N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
按实例1，第三步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将0.78克（0.001摩尔）N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛（实例3，第二步）转化。
产量：0.75克（70%），R6 F＝0.4～0.5。
元素分析C22H34O3N6·5/6（H2SO4）·3.5（H2O）（575.27）
计算值：C    45.93%    H7.48%    N14.61%    S4.64%
实测值：C    46.1%    H7.6%    N14.2%    S4.6%
原料N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-精氨酸的制备方法如下：
步骤A：N-乙基-D-苯丙氨酸的制备将8.28克（0.05摩尔）D-苯丙氨酸溶解于100毫升20%乙醇水溶液中，在5.65毫升（0.1摩尔）乙醛和2克10%钯/碳催化剂存在下，氢化两天。滤出催化剂，用60毫升2N盐酸洗涤，将滤液及洗涤液合 并并用4N的氢氧化钠调节pH至7。滤出生成的沉淀并用水洗三次，每次20毫升，在有无水氯化钙的真空干燥器中干燥。
产量：4.85克（50%）;[α]20 D＝-53°（C＝1，0.1N氢氧化钠溶液）。
元素分析C11H15O2N（193.24）
计算值：C    68.37%    H7.82%    N7.25%
实测值：C    68.5%    H7.65%    N7.2%
步骤B：N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酸
将2.9克（0.015摩尔）N-乙基-D-苯丙氨酸（实例33，步骤A）溶解于22.5毫升2N氢氧化钠溶液中，加入10毫升二氧六环。将混合物冷至5-10℃，然后将2.5毫升（0.017摩尔）苄氧羰基氯加入。反应混合物在冷却条件下搅拌3小时。接着，用40毫升水稀释并用30毫升1∶1的乙醚-石油醚混合物萃取，形成三相体系。下面两相再用30毫升乙醚萃取一次，然后将乙醚层相合并并用20毫升水洗涤，将水溶液层合并并用1N硫酸将其酸化至pH2。分出的产物用乙酸乙酯萃取三次，每次30毫升。用水洗合并的乙酸乙酯层二次，每次20毫升，无水硫酸钠干燥，在温度不超过40℃的水浴上，在15～20毫巴下蒸发。
产量：2.7克（55%）为油状物;R2 F＝0.5～0.6。
步骤C：N-苄氧羰其-N-乙基-D-苯丙氨酰-L-精氨酸
将2.6克（0.008摩尔）N-苄氧羰基-N-乙基-D-苯丙氨酸（实例3，第二步）溶解于10毫升四氢呋喃中，在0℃下，将1.6克（0.008摩尔）2，4，5-三氯苯酚和1.65克（0.008摩尔）双环己基碳化二亚胺加入，混合物在室温下放置4小时。残留物溶解于40毫升苯中，用5%碳酸氢钠溶液洗两次，每次20毫升;用水洗两次，每次20毫升;无水硫酸钠干燥，并在约为40℃的水浴上和15～20毫巴下蒸发。将残留的油状物溶解于10毫升吡啶中，加入0.92克（0.008摩尔）L-精氨酸和1.12毫升（0.008摩尔）三乙胺，在室温下搅拌混合物直至精氨酸溶解为止。将该溶液静置4～5小时，接着，于约为40℃的水浴上，在15～20毫巴下蒸发。残留物溶解于25毫升水和10毫升乙醚的混合液中。水层用乙醚洗两次，每次10毫升，用10毫升5%碳酸氢钠溶液洗涤合并的乙醚萃取液。将水溶液层合并并用3N的盐酸调至pH2。分出的产物用苯萃取三次，每次15毫升，将苯层合并，用水洗三次，每次5毫升，无水硫酸钠干燥，并在约为40℃的水浴上，15～20毫巴下蒸发。
产量：2.2克（64%）为油状物;R5 F＝0.5～0.6。
实例4
N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
第一步：N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
按实例1，第一步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将2.26克（0.005摩尔）N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸和2.15克（0.0055摩尔）Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺（实例1，步骤E）分别转化和缩合。在反应混合物的处理期间和柱层析期间均用薄层色谱监测各流份中产物的含量，薄层展开剂为乙酸乙酯-吡啶-醋酸-水（480∶20∶6∶11）。收集含纯产物的流份（R2 F＝0.75～0.85），在15～20毫巴下，置于约40℃水浴上蒸发。残留物用石油醚处理，过滤，用石油醚洗涤，在有石腊屑的真空干燥器中干燥。
产量：2.7克（75%），R2 F＝0.75～0.85;[α]20 D＝-5.8°（C＝1，四氢呋喃）
元素分析C40H48O7N6·2/3（C4H8O）（772.90）
计算值：C    66.30%    H6.95%    N10.87%
实测值：C    65.0%    H6.8%    N10.80%
第二步：N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛
按实例1第二步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将1.45克（0.002摩尔）N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺（实例4，第一步）还原。
产量：1.0克（62%），R3 F＝0.24;[α]20 D＝+2.3（C＝1，四氢呋喃）
元素分析C40H50O7N6·1/4（C6H12）（747.89）
计算值：C    66.64%    H7.14%    N11.24%
实测值：C    66.3%    H7.1%    N11.2%
第三步：N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰 -L-精氨酸-醛硫酸盐
按实例1第三步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将0.81克（0.001摩尔）N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛（实例4，第二步）转化。
产量：0.45克（80%），R6 F＝0.64
元素分析C24H38O3N6·H2SO4·4（H2O）（628.74）
计算值：C    45.84%    H7.69%    N13.36%    S5.1%
实测值：C    45.8%    H7.2%    N13.4%    S4.9%
原料N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸可按下面方法制备：
步骤A：N-异丁基-D-苯丙氨酸
按照实例3步骤A叙述的操作步骤，从8.25克（0.05摩尔）D-苯丙氨酸开始，只要用9.1毫升（0.1摩尔）异丁醛代替乙醛即可。
产量：8.7克（70%），
[α]20 D＝-29.9°（C＝1，在0.1N氢氧化钠中）
元素分析C13H19O2N·1/2（H2O）（230.30）
计算值：C    67.79%    H8.75%    N6.08%
实测值：C    67.2%    H8.9%    N6.15%
步骤B：N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酸
按实例3步骤B叙述的操作步骤将3.32克（0.015摩尔）N-异丁基-D-苯丙氨酸（实例4，步骤A）转化。
产量：3.2克（60%）为油状物;R4 F＝0.6～0.7。
步骤C：N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸
按实例3步骤C叙述的操作步骤，将2.85克（0.008摩尔）N-苄氧羰基-N-异丁基-D-苯丙氨酸（实例4，步骤B）转化。
产量：2.45克（67%）为油状物;R5 F＝0.65～0.70。
实例5
N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
第一步：N-苄氧羰基-N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
按实例1第一步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将4.3克（0.011摩尔）Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺（实例1，步骤E）和4.8克（0.01摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酸环己基铵盐转化。在柱层析分离中，收集R2 F＝0.74～0.80范围含产物的流份。蒸去溶剂，残留物用40毫升二异丙醚处理，将沉淀滤出，用二异丙醚洗两次，每次20毫升，在有硫酸和石腊屑的真空干燥器内干燥。
产量：4.3克（66%），R2 F＝0.74～0.80。
元素分析C34H44O7N6（648.74）
计算值：C    62.94%    H6.84%    N12.96%
实测值：C    63.1%    H6.9%    N12.7%
第二步：N-苄氧羰基-N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酰-N-苄氧羰基-L-精氨酸-醛
按实例1第二步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将3.25克（0.005摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺（实例5，第一步）转化。
产量：2.5克（66%），根据元素分析产物中含有一摩尔的环己烷;R3 F＝0.55
元素分析C34H46O7N6·C6H12（734.91）
计算值：C    65.37%    H7.95%    N11.43%
实测值：C    65.0%    H7.8%    N11.6%
第三步：N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
按实例1第三步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将1.47克（0.002摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛（实例5，第二步）转化。
产量：0.85克（87%），R6 F＝0.4。
元素分析C18H34O3N6·H2SO4·4（H2O）（552.65）
计算值：C    39.12%    H8.02%    N15.21%    S5.80%
实测值：C    39.2%    H7.70%    N15.1%    S5.7%
原料N-苄氧羰基-N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酸环己铵盐可按下述方法制备：
步骤A：N-苄氧羰基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酸环己铵盐
将13.3克（0.05摩尔）苄氧羰基-D-别异亮氨酸[M.Winitz    etal：J.Am.Chem.Soc.982423-2430（1956）]和9.9克（0.05摩尔）2，4，5-三氯苯酚溶解在50毫升乙 酸乙酯中，加入10.2克（0.05摩尔）双环己基碳二亚胺，将混合物放置过夜。滤出沉淀出的双环己基脲，在15-20毫巴压力下，约40℃的水浴上使滤液蒸发。残留物溶解于100毫升正己烷中，用20毫升1N氢氧化钠溶液萃取，水洗两次，每次20毫升。萃取液以无水硫酸钠干燥并按上述方法蒸发。将残留物溶解于50毫升吡啶中，然后加入5.7克（0.05摩尔）L-脯氨酸和7.0毫升（0.05摩尔）三乙胺，搅拌此混合物直至L-脯氨酸溶解，放置过夜。在15～20毫巴压力下，约40℃的水浴上蒸发混合物。将残留物溶解于50毫升5%碳酸氢钠溶液和50毫升乙醚中。水层用乙醚洗两次，每次30毫升，然后，用3N盐酸酸化至pH3。分离出的产物用乙酸乙酯萃取三次，每次30毫升，合并乙酸乙酯萃取液，并用水洗三次，每次30毫升。无水硫酸钠干燥，按上述方法蒸发。将残留物溶解于100毫升二异丙醚中，加入60毫升（0.052摩尔）环己胺，静置4～5小时。滤出生成的结晶并用二异丙醚洗三次，每次30毫升，在有硫酸和氢氧化钾的真空干燥器中干燥。
产量：14.5克（62%），熔点：138～140℃ R3 F＝0.35～0.40，[α]20 D＝30.7°（C＝1，甲醇）
元素分析C19H26O5N2·C6H13N（461.59）
计算值：C    65.05%    H8.52%    N9.10%
实测值：C    65.4%    H8.5%    N9.05%
步骤B：N-苄氧羰基-N-甲基-D-别异亮胺酰-L-脯氨酸环己铵盐
将9.25克（0.02摩尔）苄氧羰基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酸环己铵盐（实例5，步骤A）溶解于50毫升乙醚和50毫升0.5N硫酸中。水层用20毫升乙醚萃取，并将合并的醚层用水洗三次，每次30毫升;萃取液以无水硫酸钠干燥，在20～30毫巴下于约440℃的水浴上蒸发。将残余物即N-苄氧羰基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酸，按实例1第三步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂进行转化。
产量：8.1克（85%），熔点：120～123℃
R3 F＝0.55～0.60;[α]20 D＝+43.8°（C＝1，甲醇）
元素分析C20H28O5N2·C6H13N（475.61）
计算值：C    65.65%    H8.69%    N8.83%
实测值：C    65.6%    H8.7%    N8.75%
实例6
N-正己基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
第一步：N-苄氧羰基-N-正己基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸-醛
将3.5克（0.01摩尔）N-正己基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸（步骤A）溶群于10毫升二氧六环和14毫升2N氢氧化钠混合物中，然后，在5-10℃下加入2.1毫升（0.028摩尔）苄氧羰基氯，将此混合物搅拌4小时，接着，用30毫升水稀释反应混合物，并用石油醚萃取两次，每次20毫升。水层用1N硫酸酸化至pH2-3，用乙酸乙酯萃取三次，每次20毫升。用水洗合并的乙酸乙酯层三次，每次10毫升，无水硫酸钠干燥，在20～25毫巴压力下蒸发。
产量：2.9克（60%）为油状物;R2 F＝0.48。
按实例1第一步所述操作步骤，用比例量的试剂和溶剂使上面的产物及2.58克（0.0066摩尔）Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺（实例1，步骤E）转化。用柱层析法收集含有纯的主产物（R2 F＝0.68）的流份，并在20～25毫巴下蒸发。
产量：2.7克（60%）为油状物，R2 F＝0.68
按实例1第二步所述操作步骤，用比例量的试剂和溶剂将该产物转化。
产量：2.2克（80%）;R2 F＝0.53
元素分析C42H54O7N6（699.82）
计算值：C    66.82%    H7.21%    N11.13%
实测值：C    66.5%    H7.4%    N11.4%
第二步：N-正己基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
按实例1第三步所述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将0.74克（0.001摩尔）N-苄氧羰基-N-正己基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-N∞-苄氧羰基-L-精氨酸-醛（实例6，第一步）转化。
R6 F＝0.75
元素分析C26H42O3N6·H2SO44（H2O）（656.79）
计算值：C    47.54%    H7.98%    N12.80%    S4.88%
实测值：C    47.6%    H8.1%    N12.7%    S4.8%
原料N-正己基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸可按 下述方法制备：
将7.9克（0.02摩尔）N-苄氧羰基-D-苯丙氨酰-L-精氨酸（实例1，步骤B）和4.9毫升（0.04摩尔）辛醛溶解于100毫升80%乙醇中，在6克10%钯/碳催化剂存在下，将该溶液氢化。反应终止后，滤去催化剂并将滤液蒸发。将晶状残余物悬浮于20毫升水中，过滤，水洗两次，然后，在有五氧化二磷的真空干燥器中干燥。
产量：3.0克（60%）;R5 F＝0.6。
[α]20 D＝-97.3°（C＝1，0.1N氢氧化钠）
元素分析C26H30O3N2（346.45）
计算值：C    69.33%    H8.73%    N8.08%
实测值：C    68.9%    H8.8%    N8.0%
实例7
N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酸-醛硫酸盐
第一步：N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-D-精氨酸内酰胺和5.09克（0.01摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-精氨酸环己铵盐（实例1，步骤C）转化和缩合。
产量：4.5克（65%）;[α]20 D＝+28.3°（C＝1，四氢呋喃）
RF＝0.55～0.65（乙酸乙酯）;RF＝0.7～0.8（D.L.L型）
元素分析C37H42O7N6（682.75）
计算值：C    65.08%    H6.20%    N12.31%
实测值：C    65.2%    H6.3%    N12.2%
第二步：N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-D-精氨酸-醛
按实例1第二步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将3.41克（0.005摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-D-精氨酸内酰胺（实例7，第一步）还原。
产量：2.7克（70%）根据元素分析产物中含有1摩尔的环己烷R3 F＝0.57～0.67
[α]20 D＝+45.5°（C＝1，四氢呋喃）
元素分析C37H44O7N6·C6H12（768.93）
计算值：C    67.16%    H7.34%    N10.93%
实测值：C    66.8%    H7.1%    N10.8%
第三步：N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酸-醛硫酸盐
按实例1第三步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将2.31克（0.003摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-D-精氨酸-醛（实例7，第二步）进行氢化。
产量：1.24克（75%），R6 F＝0.39～0.47[α]20 D＝-75°（C＝1，水）
原料Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-D-精氨酸内酰胺可按下述方法制备：
按实例1步骤E叙述的方法，用比例量的试剂和溶剂，把以特丁氧羰基-D-精氨酸盐酸盐为原料经实例1步骤D的方法制得的5.97克（0.014摩尔）Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-D-精氨酸水合物转化。
产量：40克（73%），熔点：155～156℃
[α]20 D＝+24°（C＝1，四氢呋喃）
实例8
N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-DL-精氨酸-醛硫酸盐
第一步：N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-DL-精氨酸内酰胺
按实例1第一步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将4.3克（0.011摩尔）Nα-特丁氧羰基-Nω-苄氧羰基-DL-精氨酸内酰胺和5.09克（0.010摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-精氨酸环己铵盐（实例1，步骤C）转化。
产量：4.0克（60%），[α]20＝+21°（C＝1，四氢呋喃）RF＝0.55～0.65（D，L，D型）和RF＝0.7～0.8（D，L，L型）（乙酸乙酯）
第二步;N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-DL-精氨酸-醛
按实例1第二步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将3.41克（0.005摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-DL-精氨酸内酰胺（实例8，第一步）转化。
产量：2.9克（75%），产物含有一摩尔的环己烷
R3 F＝0.52～0.67，[α]20 D＝+32.5°（C＝1，四氢呋喃）
第三步：N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-DL-精氨酸-醛硫酸盐
按照实例1第三步叙述的操作步骤，用比例量的试剂和溶剂，将2.31克（0.003摩尔）N-苄氧羰基-N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-Nω-苄氧羰基-DL-精氨酸-醛（实例8，第二步）转化。
产量：1.15克（70%），R6 F＝0.39～0.47
[α]20 D＝-109°（C＝1，水）
实例9
药用组合物的制备
适合于6小时和12小时的静脉内浸剂的两种安瓿制剂按下述方法制备：
将N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐（420～840毫克）和人白蛋白（40～80毫克）冷冻-干燥密封。使用前，将冷冻-干燥针剂的内容物溶解于消毒、无菌的等渗盐水溶液中（100～200毫升）。所用等渗盐水封于另一安瓿中。
表1三肽-醛硫酸盐水溶液（pH＝6.0）在40℃贮存时抗凝血酶活性的变化
肽-醛    初始活性    活性（%）
I80，μM°（零日）    第一日    第二日    第三日
N-甲基-D-苯丙氨酰-L-    0.25    （100%）    100    100    100
脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
N-乙基-D-苯丙氨酰-L-    0.21    （100%）    100    100    85
脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-    0.31    （100%）    100    85    80
脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐
D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-    0.25    （100%）    100    50    40
精氨酸-醛硫酸盐（对照）
＊与对照体系相比引起血凝块时间延长5倍时反应混合物中肽的微摩尔浓度
表2三肽-醛对血纤维蛋白溶酶-纤维蛋白反应的影响
纤维蛋白凝块的水
肽-醛    肽含量微摩尔
解时间＊（分钟）
N-甲基-D-苯丙氨酰-L-    0.18    10
脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐    0.36    ＊＊
0.72    无凝块形成
D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-    0.18    10
精氨酸-醛硫酸盐（对照）    0.36    ＊＊
0.72    无凝块形成
特丁基羰基-D-苯丙氨酰-L-    0.18    10
脯氨酰-L-精氨酸-醛半硫酸盐    0.36    20
（对照）    0.72    40
＊在无肽溶液中形成的纤维蛋白凝胶的水解时间是10分钟
＊＊由于凝块具有相当疏松的结构，测不出水解时间
表3三肽-醛对新西兰雄性家兔的体内抗凝作用
最低有效剂量    口服
三肽-醛
静脉注射mg/kg/h    mg/kg/h
N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐    0.5    20
N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐    0.5    20
N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐    0.5    20
N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐  2.0  30
N-甲基-D-别异亮氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐    1.0    30
D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐（对照）    0.5    20

Claims (10)

1、通式为(Ⅰ)的化合物的制备方法，
Figure 851097367_IMG2
式中
R1代表氢或C1-6烷基，
R2代表C1-6烷基，而且，R1和R2与XXXα-氨基酸的氨基相接，
XXX代表D-苯丙氨酸残基，
Pro代表L-脯氨酸残基，
Yyy代表L-精氨酸残基，
HA代表硫酸根，
该方法的特征是，按照肽化学中已知的方法，胍基被保护的精氨酸内酰胺与N-保护的N-单烷基-XXX-Pro-OH或N，N-二烷基-XXX-Pro-OH二肽缩合，所得保护的三肽内酰胺再还原为保护的三肽-醛，然后除去保护基，最后，以盐的形式分离出N-烷基或N，N-二烷基三肽-醛。
2、按照权利要求1规定的方法制备通式为（Ⅰ）的化合物，其中R1是氢，R2是甲基。
3、按照权利要求1规定的方法制备通式为（Ⅰ）的化合物，其中R1和R2是甲基。
4、按照权利要求1规定的方法制备通式为（Ⅰ）的化合物，其中Xxx是D-苯丙氨酸残基。
5、按照权利要求1规定的方法制备通式为（Ⅰ）的化合物，其中Yyy是L-精氨酸残基。
6、按照权利要求1规定的方法制备N-甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐。
7、按照权利要求1规定的方法制备N，N-二甲基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐。
8、按照权利要求1规定的方法制备N-乙基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐。
9、按照权利要求1规定的方法制备N-异丁基-D-苯丙氨酰-L-脯胺酰-L-精氨酸-醛硫酸盐。
10、按照权利要求1规定的方法制备N-正己基-D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-醛硫酸盐。
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