FI85980C

FI85980C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara peptidaldehyder.

Info

Publication number: FI85980C
Application number: FI855118A
Authority: FI
Inventors: Joszt Eva Tomori; Sandor Bajusz; Hasenoehrl Erzsebet Szell; Daniel Bagdy; Eva Barabas; Marianne Dioszegi; Zsuzsa Fittler; Ferencz Jozsa; Gyula Horvath
Original assignee: Gyogyszerkutato Intezet
Priority date: 1984-12-21
Filing date: 1985-12-20
Publication date: 1992-06-25
Also published as: HU192646B; ES550296A0; PT81746B; DK171403B1; DK596385A; AU5155385A; EP0185390A3; EP0185390B1; PT81746A; ZA859756B; DK596385D0; CN85109736A; US4703036A; AU585561B2; AR241710A1; SU1384203A3; EP0185390A2; CA1261547A; FI855118A; GR853121B

Description

85380

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidi-aldehydien valmistamiseksi Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidialdehydien valmistamiseksi.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan aikaan uusia yleisen kaavan (I) NXxx - Pro - Yyy - H · (HA)2 «2 mukaisia peptidialdehydijohdannaisia, jossa kaavassa edustaa vetyä tai Ci_5-alkyyliryhmää, R2 merkitsee Ci-g-alkyyliryhmää, edelleen R^ ja R2 ovat sitoutuneet Xxx-alfa-aminohapon aminoryhmään,

Xxx edustaa D-fenyylialaniini- tai D-alloisoleusiinitähdettä, Pro merkitsee L-proliini-tähdettä,

Yyy merkitsee L-, D- tai DL-arginiini-tähdettä ja A edustaa happotähdettä.

Edellä esitetyssä määritelmässä käsite "Ci_6-alkyyli" kattaa suoraketjuiset tai haarautuneet alkyyliryhmät, esim. metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, isobutyyli, n-heksyyli jne.

Yleisen kaavan (I) mukaisten yhdisteiden edullisia edustajia ovat esimerkeissä mainitut.

Erityisen edullisia keksinnön mukaisten yhdisteiden edustajia ovat seuraavat johdannaiset: N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydi-sulfaatti, N,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-propyyli-L-arginiini-alde-hydisulfaatti, N-etyyli-D-fenyylialanyyli-L-propyyli-L-arginiini-aldehydi-sulfaatti, N-isobutyyli-D-fenyylialanyyli-L-propyyli-L-arginiini-alde- 2 85980 N-metyyli-D-alloisoleusyyli-L-propyyli-L-arginiini-aldehy-disulfaatti ja N-n-heksyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-alde-hydisulfaatti.

On tunnettua, että sekä veren hyytymisprosessi ja verihyyty-mien hajoaminen ovat tuloksia proteolyyttisestä reaktiosta, veren hyytymisprosessissa trombiini-fibrinogeeni-reaktio edustaa avainvaihetta, jossa veriplasmaan liuennut fibrino-geeni, muuntuu liukenemattomaksi fibriinipolymeeriksi, kun taas hajoamisprosessissa fibriinipolymeeri lohkaistaan liukeneviksi fragmenteiksi plasmiinin proteolyyttisen toiminnan johdosta. Hyvien terapiaan sopivien antikoagulanttien odotetaan estävän veren hyytymisprosessi samalla, kun ne sallivat plasmiini-fibriini-reaktion (hyytymien hajoamisen) etenemisen. Rakenteen D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydi vapaat tripeptidi-aldehydisuolat (HU-patenttijul-kaisu 169.870 ja BE-patenttijulkaisu 891.708) ovat tällaisia ominaisuuksia omaavia antikoagulantteja. Näillä yhdisteillä ei ole vaikutusta plasmiini-fibriini-reaktioon. Niiden läsnäollessa niiden konsentraation mukaan joko mitään fibriini-hyytymää ei muodostu tai vain irtonainen liukenee helposti plasmiinin johdosta. Kuitenkin on myös tunnettua, että vapaan aminopääteryhmän sisältävät tripeptidi-aldehydit ovat melko epästabiileja ja menettävät nopeasti alkuperäisen korkean entsyymiä estävän aktiivisuutensa. Ainoastaan D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydisulfaatilla, joka on esitetty BE-patenttijulkaisussa 891.708, on merkittävä stabiilisuus ja se säilyttää alkuaktiivisuutensa viileässä liuoksessa (5eC) pitkään.

Kokeiltaessa D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-alde-hydisulfaatin stabiiliutta korkeammissa lämpötiloissa todettiin, että vesipitoisessa liuoksessa 80 - 100*C:ssa se muuntuu muutaman tunnin sisällä, kun taas 37 - 40*C:ssa 10 - 14 päivän sisällä täysin stabiiliksi trisykliseksi yhdisteeksi, jolla ei ole entsyymiä estävää vaikutusta. Tämän yhdisteen 3 85980 [1,2,4,5,6,6a-heksahydro-l-bentsyyli-2-okso-8-(4'-guanidi-no)-butyyli-pyrrolo[1,2-a]imidatsolo[2,1-c]pyratsiinin] rakenne vahvistettiin massaspektrillä ja NMR-spektroskopialla. Vaikka todettiin, että vastaavissa asyyli-tripeptidi-aldehy-deissä ei tapahdu samanlaista muuntoa, siitä huolimatta, että asyylijohdannaiset, s.o. t-butyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydi-hemisulfaatti, estävät sekä trombiini-fibrinogeeni- että plasmiini-fibrii-ni-reaktion [BE-patenttijulkaisu 891.708 ja S. Bajusz et ai., Peptides, Synthesis-Structure-Function (julk.: H.D.

Rich ja E. Gross) Pierce Chem. Co., Rockford, Illinois, USA, s. 817], ne ovat vähemmän sopivia antikoagulanttiterapiassa.

Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan uusia peptidi-aldehydejä, joilla on D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiinialdehydi-sulfaatin selektiivinen antikoagulanttinen vaikutus, mutta ovat vakaampia eikä niillä ole taipumusta syklisoitua palautumattomasti.

Yllättäen on todettu, että aminopääteryhmissään alkyloidut tripeptidi-aldehydit s.o. N-metyyli-, N-etyyli- tai N-isobutyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydi-sulfaatit, eivät muunnu palautumattomasti yllä mainituiksi trisyklisiksi yhdisteiksi. Stabilisuuskokeissa D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydi-sulfaatin samoin kuin vastaavien N-alkyylijohdannaisten vesipitoisia liuoksia, joiden konsentraatio oli 10 mg/ml (pH = 6,0), varastoitiin 40eC:ssa 5 päivän ajan. Liuoksissa tapahtuvia transformaatioita tutkittiin kromatografiällä ja antitrom-biiniaktiivisuus määritettiin.

D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydisulfaatin ohutkerroskromatografia silikalevyillä käyttämällä kehitys-liuoksena etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi-seosta (30:20:6:11) osoitti muuntoprosessin: tripeptidi-aldehydi-täplä (Rf = 0,40) pieneni asteittain trisyklistä yhdistettä vastaavan täplän (Rf = 0,6) kasvaessa samanaikaisesti, kun taas N-metyyli-, N-etyyli-, N-isobutyyli- ja N,N-dimetyyli- 4 85980 johdannaisten kromatogrammeissa ei havaittu tällaista muuntoa, nähtiin ainoastaan täplät, jotka vastasivat ehjiä peptidejä (Rf = 0,43, 0,50, 0,64 ja vastaavasti 0,37).

Edelleen todettiin myös, että N-alkyylitripeptidi-aldehy-dien muut eri suolat, s.o. asetaatit, eivät myöskään muunnu vastaaviksi trisyklisiksi yhdisteiksi, kun taas D-fenyyli-alanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydiasetaatti on erittäin herkkä transformoitumaan.

Antitrombiini-aktiivisuudet analysoitiin seuraavia komponentteja sisältävällä järjestelmällä: 0,2 ml 0,5 %:sta naudan fibrinogeeniä natriumkloridin 0,9 %:sessa liuoksessa, 0,1 ml tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridi-kloori-vetyhappopuskuria (pH = 7,2), joka sisälsi peptidi- liuoksen ja 0,1 ml US-standardin mukaista ihmisen trombiinia (NIH,

Bethesda, Maryland, USA), 10 yksikköä/ml:n liuos.

Peptidivapaan järjestelmän hyytymisaika on 15 sek. mitattuna Schnither-Gross-koagulometrillä. Tripeptidi-aldehydisulfaat-tien alkuaktiivisuus asetettiin mielivaltaisesti moolikon-sentraatioksi, joka sai aikaan hyytymisajan viisinkertaisen pidentymisen järjestelmässä verrattuna kontrolliin (iQQ-arvo). Peptidien aktiivisuus liuoksissa analysoituna 1., 3. ja 5. päivänä ilmaistiin alkuaktiivisuuden (0. päivä) prosenttimääränä. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

Tarkkailujakson aikana D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argi-niini-aldehydisulfaatti menetti yli 50 % alkuaktiivisuudes-taan, kun taas N-metyylijohdannainen säilytti alkutehokkuu-tensa ja N-etyyli- ja N-isobutyylijohdannaisen aktiivisuus väheni myös vain 15-20 %:lla. Käytetyissä koeolosuhteissa osittainen rasemisoituminen L-arginiini-aldehydi-pääteosassa on mitä mahdollisin, aktiivisuuden pieni väheneminen voidaan lukea tämän ilmiön syyksi.

5 85980

:cfl C

> CT) •M Ό :n) cfl

^ CX CO

O LO O OP

w . o co co s CO x- >, co o n >> 3 >, CO -'CT) x: P >

> P CC

P :ctJ tr) P

P O. CT) •'-C

P O O LO O di P

C di · O O CO LO Ρ P

CU <C C\J χ- r- Π) O

O C

CO CT) P

•'—I cfl C

O :cfl CO O

P > di ·(—I *rH Cfl o. :cfl di cfl

p Q, O C

CO O O O O Ό 3

0) · O O O OP

> T , * < X— - p cfl cfl e -p e e 11) O -Γ-t e p - -p ω <v P lO :(fl P > p p> o cfl II -M p p p ρ O :cfl

cfl co :(fl %« S* e« W B CO

<P X DO, 3^ CO

P O, 3 O O O O :cfl

3 'p CO· O O O O O S

CO p O x— x~ r— x— p P

x- P CO > P ^ --- ^ --- P CD

Ό O -r-l Cfl P

O >. P p* cfl co

hd X) 3 P Σ C CD

hd Cl) 3 -Is: 3. P <-> o X) E cfl cc J P 3 - ΙΟ x- <— LO CD XT) oeöc di o cnj c\j on c\j co -p

< I 0) H OD - - - - C

Ρ Ρ Ό =fl M O O O O OC

T) 3 di CD

p 3 I P CO

P CO II I P Ό P

Ο, *Ή *r-l | *rH I I | ·ι—I *rH 2 <D> I Ό J Ό >> Pp P>>

Q.P P >i l>> >> PP Q. P

P P rlfl ή£ C >5 Cfl Φ C

CP >, CD P CD CO >> Cfl O, Cfl P di >,3 >xT3 P Pii T3

cfl p CP >xP cfll OP CP

CP Ό CflCfl CCfl PP C 3 CUO

0) C >, Pl Cfll PC OCO CO

•p P X) Cfl P P P >, P I P xc e 3 P 0) PC cflC >iP JO OO) P JO Ό Pp pp CC I >x 0)C0

p S i—I ·,-! i—I P 0) P P *,-1 XO CO P

OO Cfl >,C >xC O-ι hOP P 0) O Cfl PC I Cp >>p I C P >x Ό pp

CO P P CD bO C h) Q Cfl Cfl >, P PC

cfl P Ό Cu e <1)C llcflccfl X J) CP P I Cfl CPn) P J Cu Cfl I (O-*

CflC P Q I II Ρ I Ρ Ρ ρ p (Dl

>cfl O IJ O J >> p 3 CflCP K LO

CD ·Ή I ·χΗ I *rH rH CO ·Ή Ρ Ρ

Cfl C Ο-, Γ—I Ρ -P ’X"C *^C -P P ϊ>1 ’Ή I 1 *«H I—I 4c

CO CD >iPP PPP 3 >i Ό >>CO

COP >1>1CTJ >·> >i Cfl jO P >> >> p C

• •co p>,cfl >x>>co oox: c bop

Ο Ο CD I—I C Ρ P Cm COCO) (DCC

o 3 SOP (DOP ρ Q. Ό h-ι (fl O

OP I C 3 I C 3 IIP I I X

^p 2 aco 2 an zJco Q j ^ 6 85980

Samoin tutkittiin N-alkyylitripeptidi-aldehydien vaikutusta plasmiini-fibriini-reaktioon ja se osoitettiin käyttämällä esimerkin omaisesti N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydisulfaatti seuraavassa järjestelmässä: 0,2 ml 0,5 %:sta naudan fibrinogeeniä natriumkloridin 0,9 %:sessa liuoksessa, 0,1 ml tris(hydroksimetyyli)-aminometaanihydrokloridi-kloo-rivetypuskuria (pH = 7,2), joka sisälsi peptidin, 0,1 ml 0,1 U plasmiinia, joka oli liuotettu puskuriliuokseen (KABI, Tukholma, Ruotsi) ja 0,1 ml US-standardin mukaista ihmisen trombiinia (NIH, Bet-hesda, Maryland, USA) 10 U/ml:n liuos.

Peptidi-vapaassa järjestelmässä muodostuneen fibriinigeelin hajoamisaika on 10 minuuttia.

Vertailuaineina käytettiin D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydisulfaattia ja yllä mainittua t-butyyli-oksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydihemisulfaattia. Tulokset on esitetty taulukossa 2.

Arvot osoittavat, että N-alkyylitripeptidi-aldehydien ominaisuudet ovat samanlaisia kuin vastaavien, vapaan amino-pääteryhmän sisältävien analogien. Peptidien pienien määrien läsnäollessa muodostunut hyytymä liukeni kontrollijakson aikana, kun taas suurempien määrien läsnäollessa muodostui joko vain melko löyhän rakenteen omaava geeli tai hyytymää ei muodostunut ollenkaan. Kuitenkin fibriinihyytymän plas-miinin hajoamisaika kasvoi annoksen mukaan asyylitripeptidi-aldehydihemisulfaattien johdosta.

7 85980 c

CO

S

>> p >1 >4 * s.: co o ex C ·*—I :cO :cö ή rt · ‘td *rt

•Ή co c s S

s_ ·—« *-« σ>κ>> >> ooo c x to e «— * p p «— cm -r-( aj

O >4 >> >1 B P

Clj l—1 >4 >4 CO

x x o o

«- X

•H »H X

0) CD CO

O 'X

m c CO :rt CO S CD >i co p co .x >4 13 O >,

•-I 3 3 X

Tl CO o

••—4 -M I—1C

C P O S COcD OJ OOvX CM OO MO cm cd o o. p 3_ co r- «- m t— <- co>- to co 0 (D *^-4 ·- ^ * ·*·**» ·.·." CO o

*•—4 CL.Q. OOO OOO OOO COCD

p rt P

-X CO c CO O. O)

φ I CO -X

C oi > <0

O C O I C

C o Ό o :c0

o o >4 X X

o ex: o >> e o <D P :θ xi ta x i o* * i

•H C i—1 X o CD

CM O <0 rt IP o. o

1 1 (op -X

O O X O I—I rt fö r—I

e I C >-> CO -X CD

bti o o o >4 U-t o a

I—4 Ή r—I »*H C lX CO

xa >> e CO 3 COCO

O CO >4 O 4—I CO "M C0 a: rt x ta co ή co ex

Xi—i o e o a >4 o Q. C CO X CD X rt a i >4 x w CO 1 X >» I Co 3 X I CO o co P I o CD X X >4

3 O X O >, CD X

-X X >, IX CD

o >, >, Q (D ta rt rt t>4 i—i it o rt > o e O o X C > x rt e x rt o cd C>4 X 0.^4 >4 I ox

CD X CO I o >4 0 CO

O φ o XX CC X

XX X IX O O o rt

>4 X >4 o o O X o Cm CO

Xrt >) p xc cc co

CD I CP >4P rt o CO

xo (Deo >4C -X ta <d> XX e rt CO o C CDrt rt o i e rt-x cort cp

I P Q X ΧΌ JX I 1-4 3 P

o Q. 13 C0 0X0 PcO

X CD o CO O o O X CO P

O CL, .—I *rH i—| 4_J rH ·Ή |—4 O ·Ή p >, x >4 p >4 x o x a

Q. >4 >4 >4C0 >4 >4 C O

ai p x crt p >> p 3 o

ex CDCD 0) (M 3 X C Σ W

o B X Uh X X O O

C IX 13 I C ex * H S rt Q co P Cu H * * β 85980

Yllä mainitut kokeet osoittavat selvästi, että uudet N-aminopääteryhmässään alkyloidut tripeptidialdehydit ovat huomattavasti vakaampia kuin tunnettu D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydisulfaatti. Ne ovat hyviä selektiivisiä antikoagulantteja, jotka estävät trombiini-fibrinogeeni-reaktion, mutta eivät häiritse plasmiini-fibriini-reaktiota.

Uusilla yleisen kaavan (I) mukaisilla N-alkyylitripeptidi-aldehydeillä on merkittävä antikoagulanttinen aktiivisuus myös In vivo. isotoniseen suolaliuokseen liuotettuja peptidejä annettiin suun kautta tai laskimon sisään koiraspuoli-sille New Zealand-kaneille, jotka painoivat 2-3 kg. Suonensisäisesti annettiin 0,5 - 2,0 mg/kg/h:n infuusioita 6 ml/h:n nopeudella 3 tunnin ajan. Suun kautta annettiin 20 - 30 mg/kg:n annoksia peptidejä 2 ml:n määrinä. Tämän jälkeen otettiin verinäytteitä 30 minuutin jaksoissa kanien korvalaskimosta ja koko veren hyytymisaika analysoitiin tromboelastografilla [H. Harter: Zeitschrift filr klinische Medizin, 153, 423 (1955)], samanaikaisesti mitattiin myös plasman trombiiniaika [R.T.S. Jim: J. Lab. elin. Med. 50, 45 (1957)]. Alhaisimmat annokset, jotka vaadittiin terapeuttisen vaikutuksen aikaansaamiseksi (M. Verstraete ja R. Ver-wilghen, Drug Treatment, 2. painos, julk.: G.S. Avery, Churchill Livingstone, Edinburgh-Lontoo, 1980, s. 919) esitetään taulukossa 3, jossa D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydisulfaatti toimii vertailuaineena.

Arvot osoittavat, että N-alkyylitripeptidi-aldehydien tehokkuus on samantapainen tai identtinen vertailuaineen kanssa.

9 85980

TD

c 3 I—4 as as

CM

-C

5 \ a> bo oooooo is O'c cm c\j cm m m cm n o.p as o ho

to c E

co c •ή as to P co <—I as

O

3 O

D. Si co 3 as p si e. \

•Ή C bO

o p j* LomLnoom -ii co>\

p p bo O O O C\J *- O

co a) a 3 £

p ρ I

3 <C I p

JxC PC

p C P

aS 1 p p I

> p I P C P

C p C P c C p c p bo p 0) p P bo C p C C p t. nj c

P p C 3 I P

P bo p I —J bo P bO P I £-,

mc as e I p aS

as I aS p p I I

OP _J I p >» J P

Ni 3 I J >> >> I C

bo P I >ί I—I p p o aJ p p I—I o <—e p

_] O >> P O C >i C

o xe >>>>£« a >, p

ρ I—I >1 CX I '—I bO

E—* P O P I ι-J O C

C C Ο P I £- as

3 CX C I P Ο. I

I CX P P ( o 0 P I P >1 P I -p

> I P >> >1 I p P

P p I >» C P '—I '—I

> I—) P C 3 I—I ·—I

>, P 3 P >> >> O

C >,>iP3>>P£i

p p c >» 3 p to O P

Ό 3CPP3LC

c >, Ρ3Ρ>>α>ο.ο as p 3 p >> p i xe ή 3 Ή 3 bi C O 3 w

Ό d P P C 3 CO I

I—I S>> p (—I P 3 P Oh p p p p p

p 3 >iP >, P <P P IP OPPP

3 I CP >i P IPQPPP >i P

d p 33C3Q3 I 3 P 3 >> 3 p d <P 3 3 3 13 p 3 3 3 C 3 3 p I Cp (h <w p 0-, P Cm I P 3 Ci-t

1 P Q P I P P P 5"> ·—IQi—I 1—I <—I

p a I3Q3>>3>13 13 33

d 3 P If) IW>iCOPtOPCOPCQ

P 3 CX I—I P P P P P 3 P t—I P *—I P

p 3 p >> d p 3 3-d ex) >id >>d an c >, >> >, >, j3 >» p >» >> >i >i >i

3 p E-ι PP >1JC O-Cd-CP-C CjC

a3 33P3nas 133333 pc ΕΌ 3 d p d z d Bdepd

J- 3 li—I IP IP -1—I IP It—I

PXC 513 Z 3 Z 3 Z 3 2 3 Ω3 10 85980

Suonensisäisten infuusiokokeiden perusteella kaneilla saatiin ihmisen suonensisäisen infuusion annokseksi 1-2 mg/kg/h.

Yleisen kaavan (I) mukaiset N-alkyylitripeptidi-aldehydit voidaan valmistaa asyloimalla guanidinoryhmässään suojattu arginiini-laktaami käyttämällä asyylikomponenttina dipeptidi-osaa, jossa on N-pääteryhmä, muodostunut tripeptidi-laktaami pelkistetään suojatuksi tripeptidi-aldehydiksi, suojaryh-mä(t) poistetaan ja N-alkyylitripeptidi-aldehydi eristetään suolan muodossa.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan siten aikaan menetelmä uusien yleisen kaavan (I) mukaisten tripeptidi-aldehydien valmistamiseksi, jossa kaavan , R2, Xxx, Pro, Yyy ja A merkitsevät samaa kuin yllä, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että kondensoidaan peptidikemiassa tunnetulla menetelmällä guanidinoryhmässään suojattu arginiini-laktami N-suojautun N-monoalkyyli-Xxx-Pro-OH- tai N,N-dialkyyli-Xxx-Pro-OH-dipeptidin kanssa, pelkistetään muodostunut suojattu tripeptidi-laktaami suojatuksi tripeptidi-aldehydiksi, poistetaan suojaryhmä(t) ja eristetään muodostuva N-alkyyli- tai Ν,Ν-dialkyyli-tripeptidi-aldehydi suolan muodossa.

Lähtöaineina käytetyt N-monoalkyyli- tai N,N-dialkyyli-Xxx-Pro-OH-dipeptidit ovat myös uusia.

Lähtöaineina käytetyt uudet N-monoalkyyli- tai Ν,Ν-dial-kyyli-Xxx-Pro-OH-dipeptidit valmistetaan kondensoimalla peptidikemiassa tunnetulla menetelmällä N-aminopääteryh-mässään suojattu Xxx-aminohappo L-proliinin kanssa ja alky-loimalla muodostuva suojattu dipeptidi, tai mono- tai dial-kyloimalla Xxx-Pro-OH-dipeptidi, jossa on vapaa aminopääte-ryhmä, tai kondensoimalla Xxx-aminohappo, joka on monoalky-loitu ja suojattu tai dialkyloitu aminoryhmässään, peptidikemiassa tunnetulla menetelmällä L-proliinin kanssa.

11 85980

Keksinnön mukaisen menetelmän erään edullisen sovellutusmuo-don mukaisesti D-fenyylialanyyli-L-proliinin N-bentsyylioksi-karbonyyli-johdannainen metyloidaan natriumhydridin läsnäollessa metyylijodidin kanssa, saatu N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-proliini kondensoidaan seka-anhydridimenetelmällä L-arginiini-laktaamiksi, muodostuva suojattu tripeptidi-laktaami pelkistetään litiumaluminium-hydridillä N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyli-alanyyli-L-prolyyli-Nu-bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-aldehydiksi. Suojaryhmät poistetaan hydrogenolyysillä rikkihapon läsnäollessa ja muodostuva N-metyyli-D-fenyyli-alanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydisulfaatti eristetään.

Keksinnön mukaisen menetelmän erään toisen edullisen sovel-lutusmuodon mukaisesti D-fenyylialanyyli-L-proliini alistetaan hydrogenolyysiin formaldehydin läsnäollessa. Muodostunut N,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-proliini kondensoidaan seka-anhydridi-menetelmällä Nw-bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamin kanssa, muodostuva suojattu tripeptidi-laktaami pelkistetään litiumaluminiumhydridillä N,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydiksi, suoja-ryhmät poistetaan hydrogenolyysillä rikkihapon läsnäollessa ja lopuksi eristetään N,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-pro-lyyli-L-arginiini-aldehydisulfaatti.

Tämän keksinnön erään sovellutusmuodon mukaisesti D-fenyyli-alaniini alistetaan hydrogenolyysiin asetaldehydin läsnäollessa, muodostuva N-etyyli-D-fenyylialaniini varustetaan bentsyylioksikarbonyyli-suojaryhmällä, muodostetaan sen 2,4,5-trikloorifenyyliesteri, sitten se kondensoidaan L-pro-liinin kanssa. Saatu N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyylialanyyli-L-proliini liitetään seka-anhydridi-menetel-mällä Nw-bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamiin.

Saatu suojattu tripeptidi-laktaami pelkistetään litiumalu-miniumhydridillä N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fe-nyylialanyyli-L-prolyyli-N^bentsyylioksikarbonyyli-L-argi-niini-aldehydiksi, poistetaan suojaryhmät hydrogenolyysillä rikkihapon läsnäollessa ja eristetään muodostuva N-etyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydisulfaatti.

i2 85 980

Yllä esitetyllä tavalla valmistetut D,L,L-konfiguraation omaavat tuotteet voivat mahdollisesti sisältää määrätyn määrän D,L,D-konfiguraation omaavaa tuotetta, mikä ei kuitenkaan vaikuta haitallisesti niiden terapeuttiseen käyttöön.

Yleisen kaavan (I) mukaisten peptidien ja niiden johdannaisten happoadditiosuoloissa aktiivisuus perustuu emäkseen ja happo on vähemmän tärkeä, vaikkakin terapeuttiseen tarkoitukseen se on sopivimmin farmakologisesti ja farmaseuttisesti sopiva vastaanottajalle. Esimerkkeinä sopivista hapoista mainittakoon a) mineraalihapot: kloorivety-, bromivety-, fosfori-, metafosfori-, typpi- ja rikkihappo, b) orgaaniset hapot: viini-, etikka-, sitruuna-, omena-, maito-, fumaari-, bentsoe-, glykoli-, glukoni-, guloni-, meripihka- ja aryyli-sulfoni-, esim. p-tolueenisulfonihappo. Farmaseuttisesti ja farmakologisesti sopivia happoadditiosuoloja yhdessä niiden suolojen kanssa, jotka eivät ole sopivia (esimerkiksi fluo-rivety- ja perkloorihappo), voidaan käyttää emästen eristämiseen ja puhdistamiseen ja tietenkin sopimattomat suolat ovat myös arvokkaita sopivien suolojen valmistamiseksi tekniikan tasolla hyvin tunnetuilla menetelmillä. Ne peptidit ja niiden johdannaiset, jotka sisältävät useita vapaita ami-noryhmiä, voidaan saada mono- tai poly-happoadditiosuolojen muodossa tai useiden happojen sekasuoloina.

Keksinnön mukaan valmistettavista yhdisteistä voidaan muodostaa uusia farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät aktiivisena aineosana vähintään yhtä yleisen kaavan (I) mukaista yhdistettä yhdessä yhden tai useamman farmaseuttisen kantoaineen, laimentimen ja/tai apuaineen kanssa.

Farmaseuttiset koostumukset voidaan valmistaa yleisesti farmaseuttisessa teollisuudessa käytetyillä menetelmillä.

Keksintöä havainnollistetaan yksityiskohtaisesti seuraavien ei-rajoittavien esimerkkien avulla.

Esimerkkien Rf-arvot on määritelty silikageeli-ohutkerros-kromatografiällä (Kieselgel G, Reanal, Budapest) seuraavissa ,3 85980 kehitys järjestelmissä: 1. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 960:20:6:11 2. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 480:20:6:11 3. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 240:20:6:11 4. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 120:20:6:11 5. etyy.1 iasetaat t i-pyr idi in i-et i kkahappo-ves i 60:20:6:1 1 6. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 30:20:6:11

Esimerkki 1 N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arRini ini-aldehy-di-sulfaatt i

Vaihe 1: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-prolyyli-N ω-bentsyylioksikarbonyyli-L-ar-gini ini-laktaami 42,95 g (0,11 mmoolia) N-t-butyylioksikarbonyyli-Nw -bentsyy-lioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamia suspendoidaan 110 ml:aan vedetöntä kloroformia, sitten lisätään vakiossa sekoituksessa 275 ml kloorivetyhapon etyyliasetaatissa (0,11 -0,15 g/ml) olevaa liuosta. Sekoitetaan 3 tunnin ajan, minkä jälkeen reaktioseos laimennetaan 400 ml:lla dietyylieette-riä, saostuneet kiteet suodatetaan, pestään kaksi kertaa 100 ml :1a dietyylieetteriä ja kaksi kertaa 50 ml:lla asetonia, sitten tuote kuivataan tyhjöeksikkaattorissa fosforipentok-sidin ja kaliumhydroksidin läsnäollessa. Kuivatetaan noin tunnin ajan, minkä jälkeen kiteet liuotetaan 100 ral:aan dimetyyliformamidia, jäähdytetään -15°C:seen ja lisätään tässä lämpötilassa ja sekoittaen ensin 20 ml, sitten vielä 10 - 15 ml trietyyliamiinia emäksen havaittavan ylimäärän : varmistamiseksi kaasumaisessa faasissa. Muodostuvat suspen sio lisätään seuraavaan seka-anhydridiin.

50,9 g (0,1 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-proli ini-sykloheksyyliammoniumsuolaa liuotetaan 200 ml:aan dietyylieetteriä ja 120 ml:aan N rikkihappoa. Dietyylieetterikerros pestään kolme kertaa 30 ml :11a vettä, kuivataan natriumsulfaatin päällä ja liuotin haihdu- 14 85980 tetaan 40°Crn vesihauteesta 25 - 30 millibaarin paineessa. Jäännös, yhdessä N-raetyylimorfoliinin (11,2 ml, 0,1 moolia) kanssa, liuotetaan 70 ml:aan diraetyyliformamidia, jäähdytetään -15°C:seen, sitten lisätään tässä lämpötilassa 13,2 ml (0,1 moolia) isobutyylioksikarbonyylikloridia. Lisäyksen jälkeen sekoittamista jatketaan 5 minuutin ajan, sitten yllä oleva dimetyyliformamidissa oleva suspensio lisätään muodostuneeseen seka-anhydridiin. Reaktioseosta sekoitetaan tunnin ajan -15°C:ssa, sitten tunnin ajan 0°C.ssa, minkä jälkeen se laimennetaan 200 mlrlla bentseeniä ja saostuneet suolat suodatetaan. 150 ml vettä lisätään bentseeni-dimetyyliformami-di-suodokseen ja kerrokset erotetaan. Alempi vesipitoinen dimetyyliformamidi-suodos uutetaan kolme kertaa 50 mlrlla bentseeniä. Yhdistetyt bentseeniuutteet pestään kolme kertaa 30 mlrlla vettä, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan 40°Crn vesihauteesta 20 - 25 milli-baarin paineessa, öljyinen jäännös liuotetaan 60 mlraan bentseenin ja tetrahydrofuraanin 8:2-seosta ja kroraatogra-foidaan pylväällä, joka on valmistettu 750 grsta Kieselgel-60:ä bentseenin ja tetrahydrofuraanin liuotinseoksessa. Fraktioitumista seurataan silikageeli-ohutkerroskromatogra-fialla kehitysliuottimella etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi (480r20r6r11), tuotteen Rf-arvo on 0,70 - 0,76. Puhtaan tuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja konsentroidaan vesihauteessa 40°C:n lämpötilassa 20 - 25 millibaarissa 100 mlraan. Tämä jäännös sekoitetaan petroli-eetterin (500 ml) kanssa, muodostuva suspensio suodatetaan, pestään kaksi kertaa 100 mlrlla petrolieetteriä ja kuivataan tyhjöeksikkaattorissa rikkihapon ja parafiinilastujen läsnäollessa. Saanto 45 g (65 t).

[ a]20d = +13,5° (c=1, tetrahydrofuraani).

R2f = 0,70 - 0,76.

Analyysi yhdisteelle C37Hn207N6 (682,75)r laskettur C 65,08, H 6,20, N 12,31 % löydettyr C 65,4, H 6,4, N 12,1 %

Vaihe 2r N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-prolyyli-N ω -bentsyylioksikarbonyyli-L-ar- is 85980 gini ini-aldehydi 34,15 g (0,05 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N ω -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamia (esimerkki 1, vaihe 1) liuotetaan 150 mlraan tetrahydrofuraania, liuos jäähdytetään -20°C:seen ja sekoittaen vakiosti lisätään 0,0375 moolia litiumaluminium-hydridiä, joka on liuotettu tetrahydrofuraaniin. Pelkistyksen edistymistä seurataan ohutkerroskromatografiällä kehitys liuotinjärjestelmässä etyyliasetaatti-pyridiini-etikka-happo-vesi (240:20:6:11) (laktaamin ja aldehydin Rf-arvo on n. 0,8 ja vastaavasti 0,5). Tarvittaessa lisätään lisää litiumaluminiumhydridiä, sitten reaktioseos tehdään happamaksi N rikkihapolla pH-arvoon 2 jäähdyttäen ja sekoittaen. Liuos laimennetaan vedellä (n. 300 ml), kunnes siitä tulee läpinäkymätön sitten sitä uutetaan kaksi kertaa 100 ml:lla n-heksaania. Tämän jälkeen vesipitoinen tetrahydrofuraani-kerros uutetaan kaksi kertaa 250 ml:lla metyleenikloridia. Yhdistetyt metyleenikloridiuutteet pestään kaksi kertaa 50 ml:lla vettä, kaksi kertaa 50 ral:lla 5 t:sta natriumvety-karbonaattiliuosta, sitten jälleen kaksi kertaa 50 ml:lla vettä, lopuksi liuos kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroidaan 50 - 60 ml:aan korkeintaan 40°C:sen vesihauteen päällä 20 - 25 millibaarissa. Sitten lisätään jäännökseen 100 ml bentseeniä ja konsentrointi suoritetaan uudelleen samalla tavalla. Konsentraatti laimennetaan 100 ml:lla sykloheksaania. Muodostunut sakka suodatetaan, pestään kaksi kertaa 30 ml:lla sykloheksaania ja kuivataan tyh-jöeksikkaattorissa parafiinilastujen päällä. Saanto 27 g (70 %), joka sisältää yhden moolin sykloheksaania analyysiarvo-jen mukaisesti.

R3F = 0,52 - 0,62 [a ]2®d = +16,8° (c=1, tetrahydrofuraani)

Analyysi yhdisteelle 0378440785.058-12 (768,93): laskettu: C 67,16, 8 7,34, N 10,93 % löydetty: C 66,6, H 7,2, N 10,4 % 16 85980

Vaihe 3: N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginii-ni-aldehydi-sulfaatti 23,1 g (0,03 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-raetyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-Nw -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-aldehydiä (esimerkki 1, vaihe 2) liuotetaan 150 ml:aan etanolia, lisätään 50 ml deionoitua vettä ja 48 ml N rikkihappoa ja seos alistetaan hydrogenolyysiin 10 t:sen Pd/C-katalysaattorin (3 g) läsnäollessa. Hydrogenolyysin kehittymistä seurataan ohutkerroskromatografiällä kehitys-1iuottimessa etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 30:20:6:11 (lähtöaineen, välituotteen ja lopullisen tuotteen Rp-arvot 0,9, 0,7 ja vast. 0,4). Reaktion loputtua katalysaattori suodatetaan pois ja pestään kolme kertaa 30 ml:lla deionoitua vettä. Suodos ja pesut yhdistetään ja konsentroidaan n. 100 mlraan kiertohaihduttimessa. Vesipitoinen jäännös laimennetaan n. 200 ml:lla deionoitua vettä ja sen pH tarkastetaan. Jos se ei ole 6,0 - 6,5, niin se säädetään 0,1 N rikkihapolla tai ioninvaihtohartsilla OH"-syklissä (s.o.

AG 1X8), sitten liuos jäädytyskuivatetaan.

Saanto 12,4 g (75 %).

R6F = 0,39 - 0,47.

[ a ]20D = -131° (c=1, vesi).

Analyysi yhdisteelle C21^32^3^6 *(H2S0^).2,5 (H2O) (547,37): laskettu: C 46,07, H 7,13, N 15,35, S 5,12 % löydetty: C 46,4, H 7,2, N 15,05, S 5,0 % Lähtöaineet voidaan valmistaa seuraavan menetelmän mukaisesti : N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-pro- liini

Vaihe A: Bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyylialaniini-2,4,5-trikloorifenyyliesteri 60,0 g (0,2 moolia) bentsyy1ioksikarbonyy1i-D-fenyylialanii-niä [H. Yajima ja K. Kubo: J. Am. Chem. Soc. 87, 2039-2044 17 85980 ( 1965)] ja 39,^ g (0,2 moolia) 2,4,5-trikloori fenolia liuotetaan 200 ml:aan tetrahydrofuraania, liuos jäähdytetään 5 -10°:seen, sitten lisätään sekoittaen 41,2 g (0,2 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä n. 30 minuutin kuluessa. Reak-tioseosta sekoitetaan 6 tunnin ajan jäähdyttämättä. Saostunut disykloheksyyliurea suodatetaan, pestään kolme kertaa 50 ml:lla tetrahydrofuraan ia ja yhdistetyt tetrahydrofuraani-liuokset haihdutetaan alennetussa paineessa. Jäännös kiteytetään 300 ml:s ta kuumaa etanolia, suodatetaan, pestään kaksi kertaa 50 ml:lla etanolia, jonka lämpötila on 5 - 10°C, sitten kiteet kuivataan tyhjöeksikkaattorissa. Saanto 72 g (75 *). Sp.: 139-141°C.

[ a]20^ = +37° (c=1, dimetyyliformamidi)

Analyysi yhdisteelle C23H-1 gO/jNCl^ (478,75 ): laskettu: C 57,70, H 3,79, N 2,92, Cl 22,22 t löydetty: C 57,5, H 3,9, N 3,0, Cl 22,2 %

Vaihe B: Bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-pro- liini 71,8 g (0,15 moolia) bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyyliala-niini-2,4,5-trikloorifenyyliesteriä (esimerkki 1, vaihe A) liuotetaan sekoittaen ja huoneenlämpötilassa 180 ml:aan vedetöntä pyridiiniä, sitten lisätään 17,3 g (0,15 moolia) L-proliiniä ja 21,0 ml (0,15 moolia) trietyyliamiinia. Sekoittamista jatketaan, kunnes proliini on liuennut, sitten reak-tioseos jätetään seisomaan 4-6 tunniksi. Tämän jälkeen se konsentroidaan 80 - 100 ml:aan 40°C:n vesihauteen päällä 13 - 20 millibaarissa ja jäännös liuotetaan seokseen, jossa on 250 ml vettä ja 90 ml dietyylieetteriä. Vesipitoinen kerros pestään kaksi kertaa 30 ml:lla dietyylieetteriä, yhdistetyt eetteri faasit pestään kaksi kertaa 30 ml:lla 5 i:sta nat-riumvetykarbonaattiliuosta, sitten yhdistetyt vesipitoiset kerrokset tehdään happamiksi 3 N kloorivetyhapolla pH-arvoon 2. Erottunut öljy uutetaan kolme kertaa 120 ml :11a etyyliasetaattia, yhdistetyt etyyliasetaattikerrokset pestään kolme kertaa 40 ml:lla vettä, kuivataan vedettömän natriumsul- 18 85980 faatin päällä ja konsentroidaan tämän jälkeen 50 - 100 ml:aan 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa. Jäännös kiteytetään 200 ml:sta eetteriä. Kiteet suodatetaan, pestään kaksi kertaa 40 ml:lla eetteriä.

Saanto 50,4 g (85 t).

Sp.: 1 32 - 1 33°C.

[a ]20q = -46,4° (c=2, dimetyyliformamidi) R = 0,5

Analyysi yhdisteelle C22H24^5^2 (396,43): laskettu: C 66,65, H 6,10, N 7,07 % löydetty: C 66,4, H 6,25, N 7,2 %

Vaihe C: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-proliini-sykloheksyyli ammon i umsuola 39,6 g (0,1 moolia) bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyy-li-L-proliinia (esimerkki 1, vaihe B) ja 50 ml (0,8 moolia) metyylijodidia liuotetaan 300 ml:aan vedetöntä tetrahydrofu-raania. Tähän liuokseen, joka on jäähdytetty 0°C:seen, lisätään 13,2 g (0,3 moolia) natriumhydridisuspensiota 8-10 erässä sekoittaen vakiosti ja sekoittamista jatketaan kahden tunnin ajan. Tämän jälkeen lisätään 500 ml etyyliasetaattia reaktioseokseen muodostuneen natriumhydroksidin hajottamiseksi, sitten lisätään hyvin varovasti 10 ml vettä ylimääräisen natriumhydridin hajottamiseksi, lopuksi liuos haihdutetaan 40°C:n vesihauteesta 15 - 20 millibaarissa. Jäännös liuotetaan seokseen, jossa on 250 ml vettä ja 100 ml dietyy-lieetteriä. Vesipitoinen kerros pestään 100 mltlla dietyyli-eetteriä ja yhdistetyt dietyylieetterifaasit pestään 50 mlrlla 5 i:sta natriumvetykarbonaatti1iuosta. Vetykarbonaat-ti ja vesipitoiset kerrokset yhdistetään, tehdään happamaksi kaliumvetysulfaati11a pH-arvoon 2 ja uutetaan kaksi kertaa 150 ml:lla etyyliasetaattia. Yhdistetyt etyyliasetaattifaa-sit pestään tämän jälkeen 100 ml:lla vettä, 50 ml:lla 10 $:sta natriumtiosulfaatin liuosta ja 100 ml:lla vettä, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan maks. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa. Jäännös liuotetaan 600 ml:aan bentseeniä, lisätään 12 ml (0,105 19 85980 moolia) sykloheksyyliamiinia ja liuoksen annettiin seistä huoneenlämpötilassa. Muodostuneet kiteet suodatetaan, pestään kaksi kertaa 200 ral:lla bentseeniä ja kuivataan tyhjö-eksikkaattorissa parafiinilastujen päällä.

Saanto 38,2 g (75 %) R3p = 0,53-0,60 (ja sykloheksyyliamiini: 0,01-0,05)

Sp.: 160 - 163°C [ cx]20d = +12,1° (c = 1, metanoli)

Analyysi yhdisteelle ¢23826^5^2^6^13^ (509,83): laskettu: C 68,34, H 7,71, N 8,25 * löydetty: C 68,5, H 7,8, N 8,3 %

Na -t-butyylioksikarbonyyli-Na) -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaami

Vaihe D: Na -t-butyylioksikarbonyyli-Nω -bentsyylioksikar-bonyyli-L-argini ini-hydraatti 65,8 g (0,2 moolia) t-butyylioksikarbonyyli-L-arginiini-hydrokloridihydraattia [D. Yamashiro et ai: J. Am. Chem.

Soc. 94, 2855-2859 (1972)] liuotetaan 100 ml:aan 4 N nat-riumhydroksidia, jäähdytetään 5 - 10°C:seen, sitten lisätään sekoittaen vakiosti 80 ml (0,5 moolia) bentsyylioksikarbo-nyylikloridia ja n. 150 ml M N natriumhydroksidia nopeudella, joka varmistaa, että reaktioseoksen pH on aina yli 12. Tämän jälkeen reaktioseosta sekoitetaan vielä 3-4 tunnin ajan, laimennetaan 150 ml:lla vettä ja uutetaan 100 ml:lla dietyylieetteriä. Järjestelmä eroaa kolmeen faasiin. Alemmat kaksi faasia pestään toistetusti kaksi kertaa 100 ml:lla dietyylieetteriä, sitten lisätään 300 - 400 ml metanolia homogeenisen liuoksen saamiseksi ja pH säädetään tarvittaessa 4 N natriumhydroksidilla arvoon 12. Liuosta varastoidaan 6-8 tunnin ajan, minkä jälkeen se uutetaan kaksi kertaa 100 ml:lla petrolieetterin ja dietyylieetterin 1:1-seoksella, pH säädetään arvoon 6-7 jääetikalla (tarvitaan n. 50 ml). Sitten liuos uutetaan kolme kertaa 140 ml:lla metyleenikloridia, metyleenikloridiliuokset yhdistetään, pestään kaksi kertaa 60 ml:lla vettä ja haihdutetaan 40°C:n vesihauteesta 20 85980 25 - 30 millibaarissa. Jäännökseen lisätään 300 ml bentsee-niä ja 600 ml vettä, sekoitetaan 2-3 tunnin ajan 20°C:ssa, sitten sen annetaan seistä 10°C:ssa yön yli. Muodostuneet kiteet suodatetaan, pestään 300 ml:lla vettä ja 300 mlrlla bentseeniä ja kuivataan tyhjöeksikkaattorissa fosforipentok-sidin ja parafiinilastujen läsnäollessa.

Saanto 60 g (70 %).

Sp.: 122 - 124°C.

[ ot ] 2 0 D _ -20,7° (c = 1, pyridiini).

Analyysi yhdisteelle C i * ^20 (426,-46) : laskettu: C 53,51, H 7,09, N 13,14 % löydetty: C 53,35, H 7,2, N 13,1 %

Vaihe E: Na -t-butyylioksikarbonyy1i-N ω-bentsyylioksikar-bonyyli-L-argini ini-laktaami 59,7 g (0,14 moolia) Na -t-butyylioksikarbonyyli-Nu -bent-syylioksikarbonyyli-L-arginiinihydraattia (esimerkki 1, vaihe D) ja 19,6 g (0,14 moolia) trietyyliamiin ia liuotetaan 200 ml:aan tetrahydrofuraania. Liuos jäähdytetään -10°C:seen ja tässä lämpötilassa ja sekoittaen lisätään 18,5 ml (0,14 moolia) isobutyylioksikarbonyy1ikloridia, sitten 10 minuutin kuluttua 19,6 ml (0,14 moolia) trietyyliamiinia. Sekoittamista jatketaan vielä tunnin ajan 0°C:ssa ja tunnin ajan jäähdyttämättä, sitten seos kaadetaan 1000 ml:aan jäävettä. Muodostuneet kiteet suodatetaan, pestään kaksi kertaa 100 ml :11a jäävettä, sitten ne liuotetaan 280 ml:aan kloroformia. Kloroformi liuos pestään kaksi kertaa 100 ral:lla jäävettä, kuivataan vedettömän kalsiumkloridin päällä ja haihdutetaan maks. 40°C:n vesihauteen päällä 20 - 25 mi lii baarissa. Kiteinen jäännös suspendoidaan 70 ml:aan petrolieetteriä, suodatetaan, pestään kaksi kertaa 30 ml :11a petrolieetteriä ja kuivataan tyhjoeksikkaattorissa fosforipentoksidin läsnäollessa .

Saanto 44 g (81 %).

Sp.: 164 - 166°C.

[ a]20d = -24° (c=1, tetrahydrofuraani).

Analyysi yhdisteelle (390,43): 21 85980 laskettu: C 58,44, H 6,71, N 14,35 * löydetty: C 58,7, H 6,8, N 14,1 %

Esimerkki 2 N,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-al-dehydi-sulfaatti

Vaihe 1: N,N-diraetyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N

bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamihydro- kloridi 4,3 g (0,011 moolia) N α -t-butyylioksikarbonyyli-N10 -bent-syylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamia (esimerkki 1, vaihe E) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 1 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä liuottimia ja reagensseja. Muodostuva suspensio lisätään seuraavaan seka-anhydridi in.

3,26 g (0,01 moolia) N,Ν-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-pro-li inihydraattia ja 2,2 ml (0,02 moolia) N-metyyli-morfolii-niä liuotetaan seokseen, jossa on 50 ml bentseeniä ja 5 ml etanolia. Seos konsentroidaan· 10 - 15 ml:aan maks. 40°C:n vesihauteen päällä 40 - 50 millibaarissa, tämän jälkeen tislataan pois neljä kertaa 40 ml:n erät bentseeniä seoksesta, joka haihdutetaan lopuksi kuiviin. Jäännös liuotetaan 10 ml:aan dimetyyliformamidia, jäähdytetään -15°C:seen, tässä lämpötilassa lisätään 1,32 ml (0,01 moolia) isobutyylioksi-karbonyylikloridia ja 5 minuutin kuluttua yllä oleva dime-tyyliformamidissa oleva suspensio. Reaktioseosta sekoitetaan tunnin ajan -15°C:ssa ja vielä tunnin ajan 0°C:ssa, sitten lisätään 40 ml etyyliasetaattia ja saostuneet suolat suodatetaan. 20 ml vettä kaadetaan suodokseen ja muodostuneet kerrokset erotetaan. Vesipitoinen dimetyyliformamidikerros uutetaan kolme kertaa 5 ml:lla etyyliasetaattia. Yhdistetyt etyyliasetaattiliuokset pestään kaksi kertaa 15 ml:lla vettä, kaksi kertaa 15 ml:lla 5 i:sta natriumvetykarbonaatin liuosta, sitten jälleen kaksi kertaa 15 ml:lla vettä, uute kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroi- 22 85980 daan 10 - 15 ml:aan 40°C:n vesihauteen päällä 20 - 25 milli-baarissa. Sitten lisätään kloorivetyhappo-etyyliasetaattia jäljellä olevaan liuokseen varmistamalla, että kaasumainen faasi on hapan, ja liuos laimennetaan 30 - 40 ml:lla dietyy-lieetteriä. Muodostunut sakka suodatetaan, pestään dietyyli-eetterillä ja kuivataan rikkihapon ja kaliumhydroksidin läsnäollessa tyhjoeksikkaattorissa. Saanto 2,7 g (45 %).

R^p = 0,43 [ a ]20d = -56,0° (c=1, kloroformi)

Analyysi yhdisteelle 030^38^5^6*^^^ HCI.2H2O (666,13): laskettu: C 54,09, H 6,90, N 12,62, Cl 9,58 * löydetty: C 54,0, H 7,0, N 12,6, Cl 9,8 %

Vaihe 2: N,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-Nw - bentsyylioksikarbonyyli-L-argini ini-aldehydi-sul-faatti 2,4 g (0,004 moolia) N,N-dimetyyli-D-fenyylalanyyli-L-pro-lyyli-N ω -bentsyylioks ikarbonyyli-L-arginiini-laktaamihyd-rokloridia (esimerkki 2, vaihe 1) liuotetaan 15 ml:aan tet-rahydrofuraania, jäähdytetään -20°C:seen ja sekoittaen vakiosti lisätään 0,003 moolia tetrahydrofuraanissa olevaa li-tiumaluminiumhydridisuspensiota. Pelkistyksen etenemistä tarkkaillaan ohutkerroskromatografiällä kehitysjärjestelmässä etyyli asetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 60:20:6:11 (laktaamin ja aldehydin Rp-arvo on n. 0,35 ja vastaavasti 0,2). Tarvittaessa lisätään lisää litiumalurainiumhydridiä, sitten reaktioseos tehdään happamaksi pH-arvoon 5 N rikkihapolla jäähdyttäen ja sekoittaen (n. 30 ml) ja uutetaan kaksi kertaa 15 ml :11a kloroformia. Vesipitoista tetrahydro-furaanikerrosta uutetaan kolme kertaa 20 ml:ll n-butanolia. Yhdistetyt butanoli-uutteet pestään 10 ml:lla vettä, joka on kyllästetty n-butanolilla, ja liuos konsentroidaan 5-10 ml:aan maks. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaaris-sa. Jäännös laimennetan 30 ral:lla eetteriä, muodostunut sakka suodatetaan, pestään kaksi kertaa 10 ml:lla dietyylieet-teriä ja kaksi kertaa 10 ml:lla petrolieetteriä, sitten se liuotetaan seokseen, jossa on 20 ml kloroformia ja 5 ml me- 23 85980 tanolia. Liukenematon jäännös suodatetaan ja suodos haihdutetaan yllä esitetyn menetelmän mukaisesti.

öljyinen jäännös sekoitetaan dietyylieetterin (30 ml) kanssa, muodostunut sakka suodatetaan, pestään kaksi kertaa 20 mlrlla dietyylieetteriä ja kaksi kertaa 20 ml:lla petroli-eetteriä, sitten se kuivataan tyhjöeksikkaattorissa parafii-nilastujen, rikkihapon ja kaliumhydroksidin läsnäollessa. Saanto 2,25 g (85 %). r5f = 0,48 - 0,54

Analyysi yhdisteelle 0308380585.8220^ (660,73): laskettu: C 54,53, 8 6,10, N 12,72, S 4,84 t löydetty: C 55,0, H 6,5, N 12,1, S 4,7 <

Vaihe 3: N,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argi-niini-aldehydi-sulfaatti I, 32 g (0,002 moolia) N,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-pro-lyyli-Νω -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-aldehydi-sul-faattia (esimerkki 2, vaihe 2) liuotetaan seokseen, jossa on 5 ml deionoitua vettä ja 15 ml etanolia, ja hydrataan 10 t:sen Pd/C-katalysaattorin (0,2 g) läsnäollessa. Katalysaattori suodatetaan ja pestään kaksi kertaa 10 ml:lla deionoitua vettä. Yhdistetty suodos ja pesut konsentroidaan 5 - 10 ml:aan maks. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 milli-baarissa, sitten liuos laimennetaan 20 ml:lla deionoitua vettä. Tarvittaessa pH säädetään joko 0,1 N rikkihapolla tai ioninvaihtohartsilla (s.o. AG 1X8) OH“-syklissä arvoon 6,0 - 6,5, sitten liuos pakastekuivataan.

Saanto 0,85 g (80 %) R6f = 0,35 - 0,39

Analyysi yhdisteelle C22^34®3N6*^2^®4·^^2®^ (566,67): laskettu: C 46,60, H 7,47, N 14,82, S 5,66 % löydetty: C 45,5, H 7,4, N 14,3, S 5,2 * Lähtöaine N ,N-dimetyyli-D-fenyylialanyyli-L-proli ini-hyd-raatti voidaan valmistaa seuraavan menetelmän mukaisesti: II, 9 g (0,03 moolia) bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-proliinia (esimerkki 1, vaihe B) liuotetaan 200 24 85980 mlraan 50 %:sta vesipitoista raetanolia ja hydrataan formaldehydin uoksen (9,7 ml, n. 0,12 moolia) ja 10 i:sen Pd/C-ka-talysaattorin (6 g) läsnäollessa. Reaktion edistymistä valvotaan ohutkerroskromatografiällä kehitysliuottimessa etyy-liasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 30:20:6:11 (lähtöaineen ja lopputuotteen Rp-arvo on 0,95 ja vastaavasti 0,45). Reaktion päätyttyä katalysaattori suodatetaan, pestään kaksi kertaa 50 ml:lla vesipitoista metanolia ja yhdistetyt suodos ja pesut haihdutetaan 40°C:n vesihauteen päällä 20 - 25 mil-libaarissa. Jäännös liuotetaan 60 ml:aan etyyliasetaattia, lisätään 0,5 ml vettä ja liuos jätetään seisomaan 5 -10°C:ssa yön yli. Muodostuneet kiteet suodatetaan, pestään kaksi kertaa 15 ml:lla etyyliasetaattia, jonka lämpötila on 5 - 10°C, ja kuivataan tyhjöeksikkaattorissa parafiinilastujen, rikkihapon ja kaliumhydroksidin päällä.

Saanto 6,5 g (67 $)

Sp.: 228 - 229°C [ a ]20D = -159° (esi, vesi)

Laskettu yhdisteelle C16^22^3^2'^2® (308,37): laskettu: C 62,31, H 7,85, N 9,08 % löydetty: C 62,5, H 8,0, N 8,95 *

Esimerkki 3 N-etyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argini ini-aldehydi-sulfaatti

Vaihe 1: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyyliala- nyyli-L-prolyyli-Nw -bentsyylioksikarbonyyli-L-ar-gini ini-laktaami 2,1 g (0,005 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyylialanyyli-L-proliinia ja 2,15 g (0,0055 moolia) N t-butyylioksikarbonyyli-N10 -bentsyylioksikarbonyyli-L-argi-niini-laktaamia (esimerkki 1, vaihe E) muunnetaan ja vast, kondensoidaan esimerkin 1 vaiheessa 1 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia. Kuitenkin reaktioseoksen käsittelyn ja pylväs-kromatografian aikana tuotepitoi suutta valvotaan ohutkerros- 25 85980 kromatografiällä kehitys järjestelmässä bentseeni-tetrahydro-furaani 8:2. Puhtaan päätuotteen sisältävät fraktiot (Rp = 0,4 - 0,5) yhdistetään ja haihdutetaan 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa. Jäännös viimeistellään di-iso-propyylieetterillä, suodatetaan, pestään di-isopropyylieet-terillä ja kuivataan tyhjöeksikkaattorissa rikkihapon ja parafiini lastujen läsnäollessa.

Saanto 1,9 g (54 %) R2f = 0,75 - 0,85

Vaihe 2: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyylialanyy-li-L-prolyyli-Na3 - bents yylioksikar bonyyli-L-argi-ni ini-aldehydi 1,4 g (0,002 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyylialanyli-L-prolyyli-Na) -bentsyylioksikarbonyyli-L-ar-gini ini-laktaamia (esimerkki 3, vaihe 1) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 2 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 1,15 g (72 %), joka sisältää analyysin mukaisesti yhden moolin sykloheksaania.

R3F = 0,55 - 0,65

Analyysi yhdistee lie C38Hii50yNg.CgH12 (782,95): laskettu: C 67,49, H 7,47, N 10,73 * löydetty: C 67,6, H 7,5, N 10,5 %

Vaihe 3= N-etyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydi -sulfaatti 0,78 g (0,001 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-Nω -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-aldehydiä (esimerkki 3, vaihe 2) muunnetaan esimerkin 1 vaiheen 3 menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 0,75 * (70 %) R6F 0,4 - 0,5

Analyysi yhdisteelle 022^340385.5/6(8280^).3.5(820) (575,27): 26 85980 laskettu: C 45,93, H 7,48, N 14,61, S 4,64 t löydetty: C 46,1, H 7,6, N 14,2, S 4,6 % Lähtöaine N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyyljalani ini-L-proli ini voidaan valmistaa seuraavasti:

Vaihe A: N-etyyli-D-fenyylialaniini 8,28 g (0,05 moolia) D-fenyylialaniinia liuotetaan 100 ml:aan 20 irsta vesipitoista etanolia ja hydrataan asetalde-hydin (5,65 ml, 0,1 moolia) ja 10 t:sen Pd/C-katalysaattorin (2 g) läsnäollessa kahden päivän ajan. Katalysaattori suodatetaan, pestään 60 ml:lla 2 N kloorivetyhappoa ja yhdistettyjen vesipitoisten liuosten pH säädetään 4 N natriumhydrok-sidilla arvoon 7. Muodostunut sakka suodatetaan, pestään kolme kertaa 20 ml:lla vettä ja kuivataan tyhjöeksikkaatto-rissa vedettömän kalsiumkloridin päällä.

Saanto 4,85 g (50 %) [ α = -53° (c=1, 0,1 N natriumhydroksidi)

Analyysi yhdisteelle C11H-j5O2N (193,24): laskettu: C 68,37, H 7,82, N 7,25 % löydetty: C 68,5, H 7,65, N 7,2 %

Vaihe B: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyyliala-ni ini 2,9 g (0,015 moolia) N-etyyli-D-fenyylialaniinia (esimerkki 3, vaihe A) liuotetaan 22,5 ml:aan 2 N natriumhydroksidia, lisätään 10 ml dioksaania, seos jäähdytetään 5 - 10°C:seen, sitten lisätään 2,5 ml (n. 0,017 moolia) bentsyylioksikarbo-nyyliä ja reaktioseosta sekoitetaan 3 tunnin ajan jäähdyttäen. Tämän jälkeen se laimennetaan 40 ml:lla vettä ja uutetaan 30 ml:lla dietyylieetterin ja petrolieetterin 1:1-seos-ta, kun kolmifaasijärjestelmä muodostuu. Kaksi alempaa faasia uutetaan jälleen 30 mlrlla dietyylieetteriä, sitten yhdistetyt dietyylieetterikerrokset pestään 20 mlrlla vettä. Vesipitoiset kerrokset yhdistetään ja tehdään happamaksi N rikkihapolla pH-arvoon 2. Eronnut tuote uutetaan kolme kertaa 30 mlrlla etyyliasetaattia. Etyyliasetaattikerrokset yh- ' 27 85980 distetään, pestään kaksi kertaa 20 mlrlla vettä, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan maks. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa.

Saanto 2,7 g (55 %) öljyä.

R2f = 0,5 - 0,6

Vaihe C: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-proli ini 2,6 g (0,008 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-etyyli-D-fenyylialaniinia (esimerkki 3> vaihe 2) liuotetaan 10 ml:aan tetrahydrofuraania ja lisätään 0°C:ssa 1,6 g (0,008 moolia) 2,4,5-trikloorifenolia ja 1,65 g (0,008 moolia) disyklohek-syylikarbodi-imidiä, sitten seos jätetään seisomaan huoneenlämpötilassa 4 tunnin ajaksi. Jäännös liuotetaan 40 mlraan bentseeniä, pestään kaksi kertaa 20 ml:lla 5 irsta natrium-vetykarbonaatin liuosta, kaksi kertaa 20 ml:lla vettä, sitten se kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan n. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa. Jäljelle jäävä öljy liuotetaan 10 mlraan pyridiiniä, lisätään 0,92 g (0,008 moolia) L-proliinia ja 1,12 ml (0,008 moolia) trietyyliamiinia ja seosta sekoitetaan huoneenlämpö-tilassa, kunnes proliini on liuennut. Sitten liuos jätetään seisomaan 4-5 tunnin ajaksi, sitten se haihdutetaan n. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa. Jäännös liuotetaan seokseen, jossa on 25 ml vettä ja 10 ml dietyyli-eetteriä. Vesipitoinen kerros pestään kaksi kertaa 10 mlrlla dietyylieetteriä ja yhdistetyt eetteriuutteet pestään 10 mlrlla 5 irsta natriumvetykarbonaatin liuosta. Vesipitoiset kerrokset yhdistetään ja tehdään happamaksi pH-arvoon 2 3 N kloorivetyhapolla. Eronnut tuote uutetaan kolme kertaa 15 mlrlla bentseeniä, bentseenikerrokset yhdistetään, pestään kolme kertaa 5 mlrlla vettä, kuivataan vedettömän natrium-sulfaatin päällä ja haihdutetaan n. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa.

Saanto 2,2 g (64 %) öljyä.

r5f = 0,5 - 0,6 28 85980

Esimerkki 4 N-isobutyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argini ini-alde-dehydi-sulfaatti

Vaihe 1: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyyli-D-fenyyli-alanyyli-L-prolyyli-Nw -bentsyylioksi karbonyyli-L-argini ini-laktaami 2,26 g (0,005 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyy-li-D-fenyylialanyyli-L-proliinia ja 2,15 g (0,0055 moolia)

Na -t-butyylioksikarbonyyli-Nw -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamia (esimerkki 1, vaihe E) muunnetaan ja vastaavasti kondensoidaan esimerkin 1 vaiheessa 1 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia. Reaktioseoksen käsittelyn ja pylväskromatografiän aikana fraktioiden tuotepitoisuutta valvotaan ohutkerroskromatografiällä kehitysliuotinjärjestelmässä etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 480:20:6:11. Puhtaan tuotteen fraktiot (R^p = 0,75 - 0,80) yhdistetään, haihdutetaan n. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaa-rissa, jäännös käsitellään petrolieetterillä, suodatetaan, pestään petrolieetterillä ja kuivataan tyhjöeksikkaattorissa parafiinilastujen päällä.

Saanto 2,7 g (75 *) R2f = 0,75 - 0,85 [ a ]20^ = -5,8° (c = 1, tetrahydrofuraani)

Analyysi yhdisteelle C4oH48®7N6·2/3(C^HqO) (772,90): laskettu: C 66,30, H 6,95, N 10,87 * löydetty: C 65,0, H 6,8, N 10,80 %

Vaihe 2: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyyli-D-fenyyli-alanyyli-L-prolyyli-Nω -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-aldehydi 1,45 g (0,002 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyy-1 i -D-fenyyl ialanyyli-L-prolyyli -N·^ -bentsyylioks ikarbonyy-li-L-arginiini-laktaamia (esimerkki 4, vaihe 1) pelkistetään esimerkin 1 vaiheessa 2 esitetyn menetelmän mukaisesti 29 85980 käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia. Saanto 1,0 g (62 %) R3F = 0,24 [a = +2,3° (c = 1, tetrahydrofuraani )

Analyysi yhdisteelle 040^5007^6^ l/MCgH·^) (7^7,89): laskettu: C 66,64, H 7,14, N 11,24 % löydetty: C 66,3» H 7,1» N 11,2 %

Vaihe 3: N-isobutyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argi- niini-aldehydi-sulfaatti 0,81 g (0,001 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyy-li-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-Nw -bentsyylioks ikarbonyy-L-arginiini-aldehydiä (esimerkki 4, vaihe 2) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 3 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 0,45 g (80 %) R6f = 0,64

Analyysi yhdisteelle C24H38O3N5.H2SO4. ^(^O) (628,74): laskettu: C 45,84, H 7,69, N 13,36, S 5,1 % löydetty: C 45,8, H 7,2, N 13,4, S 4,9 % Lähtöaine N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyyli-D-fenyyli-alanyyli-L-proliini voidaan valmistaa seuraavasti:

Vaihe A: N-isobutyyli-D-fenyylialaniini Lähtemällä 8,25 g:sta (0,05 moolia) D-fenyylialaniinia ja käyttämällä esimerkin 3 vaiheessa A esitettyä menetelmää paitsi, että käytetään 9,1 ml (0,1 moolia) isobutyraldehydiä asetaldehydin sijasta, saadaan 8,7 g (70 %) tuotetta.

[a ]20^ = -29,9° (c = 1, 0,1 N natriumhydroksidissa)

Analyysi yhdisteelle Ci 3H19O2N. 1/2(^0) (230,30): laskettu: C 67,79, H 8,75, N 6,08 % löydetty: C 67,2, H 8,9, N 6,15 *

Vaihe B: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyyli-D-fenyyli-alani ini 30 8 5 9 8 0 3i32 g (0,015 moolia) N-isobutyyii-£)_fenyylialaniinia (esimerkki 4, vaihe A) muunnetaan esimerkin 3 vaiheessa B esitetyn menetelmän mukaisesti.

Saanto 3,2 g (60 %) öljyä.

R4F = 0,6 - 0,7

Vaihe C: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyyli-D-fenyyli-alanyyli-L-proliini 2,85 g (0,008 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-isobutyy-li-D-fenyylialaniinia (esimerkki 4, vaihe B) muunnetaan esimerkin 3 vaiheessa C esitetyn menetelmän mukaisesti.

Saanto 2,45 g (67 %) öljyä. r5f = 0,65 - 0,70

Esimerkki 5 N-metyyli-D-allo isoleusyyli-L-prolyyli-L-argi niini-aldehy-di-sulfaatti

Vaihe 1: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-alloisoleu-syyli-L-prolyyli-N ω -bentsyylioksi karbonyyli-L-ar-gini in i-laktaami 4,3 g (0,011 moolia) Na -t-butyylioksikarbonyyli-N ω-bentsyylioksi karbonyyli-L-arginiini-laktaamia (esimerkki 1, vaihe E) ja 4,8 g (0,01 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-alloisoleusyyli-L-proli ini-sykloheksyyliammoni um-suolaa muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 1 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia. Pylväskromatografian aikana tuotteen sisältävät fraktiot, joiden R2f = 0,74 - 0,80, yhdistetään, haihdutetaan ja saatu jäännös käsitellään 40 mlrlla di-isopropyy-lieetteriä, sakka suodatetaan, pestään kaksi kertaa 20 mlrlla di-isopropyylieetteriä ja kuivataan tyhjöeksikkaatto-rissa rikkihapon ja parafiinilastujen päällä.

Saanto 4,3 g (66 %) R2f = 0,74 - 0,80

Analyysi yhdisteelle C314H^γΝ5 (648,74): laskettu: C 62,94, H 6,84, N 12,96 % löydetty: C 6 3 > 1 » H 6,9, N 12,7 % 31 85980

Vaihe 2: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-alloisoleu-syyli-L-prolyyli-N10 -bentsyylioksikarbonyyli-L-ar-gini ini-aldehydi 3,25 g (0,005 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-alloisoleusyyli-L-prolyyli-N10 -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamia (esimerkki 5, vaihe 1) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 2 esitetyn menetelmän mukaisesti käyt-• tämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 2,5 g (66 %) tuotetta, joka sisältää alkuaineanalyysin mukaisesti yhden moolin sykloheksaania.

R3F = 0,55

Analyysi yhdisteelle . C^Hi ^ (734,91): laskettu: C 65,37, H 7,95, N 11,43 % löydetty: C 65,0, H 7,8, N 11,6 %

Vaihe 3: N-metyyli-D-alloisoleusyyli-L-prolyyli-L-arginii-ni-aldehydi-sulfaatti 1,47 g (0,002 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-alloisoleusyyli-L-prolyyli-Nw -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-aldehydiä (esimerkki 5, vaihe 2) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 3 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 0,85 g (87 ί) R6F = 0,4

Analyysi yhdisteelle Ci 8834^3^6 4(^0) (552,65): laskettu: C 39,12, H 8,02, N 15,21, S 5,80 % löydetty: C 39,2, H 7,70, N 15,1, S 5,7 % Lähtöaine N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-alloisoleu-syyli-L-proli ini-sykloheksyyliammoni umsuola voidaan valmistaa seuraavan menetelmän mukaisesti:

Vaihe A: N-bentsyylioksikarbonyyli-D-alloisoleusyyli-L-pro-li ini-sykloheksyyliammoniumsuola 13,3 g (0,05 moolia) bentsyylioksikarbonyyli-D-alloisoleu-siinia [M. Winitz et ai: J. Am. Chem. Soc. 98., 2423-2430 32 85 980 (1956)] ja 9,9 g (0,05 moolia) 2,4,5-trikloorifenolia liuotetaan 50 ml:aan etyyliasetaattia, lisätään 10,2 g (0,05 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä ja seos jätetään seisomaan yön yli. Saostunut disykloheksyyliurea suodatetaan ja suodos haihdutetaan n. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa. Jäännös liuotetaan 100 mlraan n-heksaania, uutetaan 20 ml:lla 1 N natriumhydroksidia ja kaksi kertaa 20 ml:lla vettä, sitten uute kuivataan vedettömän natriumsul-faatin päällä ja haihdutetaan yllä esitetyn menetelmän mukaisesti. Jäännös liuotetaan 50 ml:aan pyridiiniä, lisätään 5,7 g (0,05 moolia) L-proliinia ja 7,0 ml (0,05 moolia) tri-etyyliamiinia, seosta sekoitetaan, kunnes L-proliini on liuennut ja jätetään seisomaan yön yli. Sitten seos haihdutetaan n. 40°C:n vesihauteen päällä 15 - 20 millibaarissa. Jäännös liuotetaan 50 mitään 5 %:sta natriumvetykarbonaatti-liuosta ja 50 raitaan dietyylieetteriä. Vesipitoinen kerros pestään kaksi kertaa 30 mltlla eetteriä, sitten se tehdään happamaksi 3 N kloorivetyhapolla pH-arvoon 3. Eronnut tuote uutetaan kolme kertaa 30 mltlla etyyliasetaattia, etyyliasetaatti uutteet yhdistetään, pestään kolme kertaa 30 mltlla vettä, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan yllä esitetyn menetelmän mukaisesti. Jäännös liuotetaan 100 mitään di-isopropyylieetteriä, lisätään 6,0 ml (0,052 moolia) sykloheksyyliamiin ia ja liuoksen annetaan seistä 4-5 tunnin ajan. Muodostuneet kiteet suodatetaan, pestään kolme kertaa 30 mltlla di-isopropyylieetteriä ja kuivataan tyhjöeksikkaattorissa rikkihapon ja kaiiumhydrok-sidin päällä. Saanto 14,5 g (62 %).

Sp.: 138 - 140°C

R3F = 0.35 - 0,40 [ a]20D = -30,7° (o=1, metanoli)

Analyysi yhdisteelle Cigi^Oc^.CgHi (461,59): laskettu: C 65,05, H 8,52, N 9,10 % löydetty: C 65,4, H 8,5, N 9,05 %

Vaihe B: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-alloisoleu-syyli-L-proli ini-sykloheksyyliammoniumsuola 33 85980 9,25 g (0,02 moolia) bentsyylioksikarbonyyli-D-alloisoleu-syyli-L-proliini-sykloheksyyliammoniumsuolaa (esimerkki 5, vaihe A) liuotetaan 50 ml:aan dietyylieetteriä ja 50 mlraan 0,5 N rikkihappoa. Vesipitoista kerrosta uutetaan 20 mlrlla dietyylieetteriä ja yhdistetyt eetterikerrokset pestään kolme kertaa 30 ml:lla vettä, sitten uute kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan n. 40°C:n vesihauteen päällä 20 - 30 mi 11ibaarissa. Haihdutus jäännös, N-bent-syylioksikarbonyyli-D-alloisoleusyyli-L-proliini, muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 3 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia. Saanto 8,1 g (85 Ϊ)

Sp.: 120 - 123° R3F = 0,55 - 0,60 [a ]20β = +43,8° (c=1, metanoli)

Analyysi yhdisteelle 020^28^5^2*^6^13^ ^^75,61): laskettu: C 65,65, H 8,69, N 8,83 % löydetty: C 65,6, H 8,7, N 8,75 t

Esimerkki 6 N-n-heksyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argini ini-alde-hydisulfaatti

Vaihe 1: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-n-heksyyli-D-fenyyli-alanyyli-L-prolyyli-Nω -bentsyylioksikarbonyyli-L-argini ini-aldehydi 3,5 g (0,01 moolia) N-n-heksyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolii-nia (vaihe A) liuotetaan seokseen, jossa on 10 ml dioksaania ja 14 ml 2 N natriumhydroksidia, sitten lisätään 2,1 ml (0,028 moolia) bentsyylioksikarbonyylikloridia 5 - 10°C:ssa ja seosta sekoitetaan 4 tunnin ajan. Tämän jälkeen reaktio-seos laimennetaan 30 ml:11a vettä ja uutetaan kaksi kertaa 20 ml:lla petrolieetteriä. Vesipitoinen kerros tehdään happamaksi 1 N rikkihapolla pH-arvoon 2 - 3 ja uutetaan kolme kertaa 20 ml:lla etyyliasetaattia. Yhdistetyt etyyliasetaat-tikerrokset pestään kolme kertaa 10 ml :11a vettä, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan 20 - 25 milli baarin paineessa.

34 85980

Saanto 2,9 g (60 %) öljyä, R^p = 0,48.

Tämä tuote ja 2,58 g (0,0066 moolia) N° -t-butyylioksikar-bonyyli-N10 -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiini-laktaamia (esimerkki 1, vaihe E) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 1 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia. Pylväskromatografiän jälkeen puhtaan päätuotteen sisältävät fraktiot (R^p = 0,68) yhdistetään ja haihdutetaan 20 - 25 millibaarissa.

Saanto 2,7 g (60 %) öljyistä tuotetta, R^p = 0,68.

Tämä tuote muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 2 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 2,2 g (80 %) R^p = 0,53

Analyysi yhdisteelle 0142^54^7^5 (699,82): laskettu: C 66,82, H 7,21, N 11,13 % löydetty: C 66,5, H 7,4, N 11 ,4 %

Vaihe 2: N-n-heksyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argi-niini-aldehydi-sulfaatti 0,74 g (0,001 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-n-heksyy-li-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-Nw -bentsyylioksikarbonyy-1i-L-arginiini-aldehydiä (esimerkki 6, vaihe 1) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 3 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

R6p = 0.75

Analyysi yhdisteelle C26^42®3N6'^2^^4*^^2^^ (656,79): laskettu: C 47,54, H 7,98, N 12,80, S 4,88 % löydetty: C 47,6, H 8,1, N 12,7, S 4,8 % Lähtöaine N-n-heksyyli-D-fenyylialanyyli-L-proliini voidaan valmistaa seuraavan menetelmän mukaisesti: 7,9 g (0,02 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-proliinia (esimerkki 1, vaihe B) ja 4,9 ml (0,04 moolia) kapryylialdehydiä liuotetaan 100 ral:aan 80- %:sta t: 35 8 5 9 8 0 etanolia ja liuos alistetaan hydrogenolyysiin 10- %:sen Pd/C-katalysaattorin (6 g) läsnäollessa. Reaktion lopussa katalysaattori suodatetaan ja suodos haihdutetaan. Kiteinen jäännös suspendoidaan 20 ml:aan vettä, suodatetaan ja pestään kaksi kertaa vedellä, sitten se kuivataan fosforipent-oksidin päällä tyhjoeksikkaattorissa.

Saanto 3,0 g (60 %) R5F = 0,6 [a ]2% = -97,3° (esi , 0,1 N natriumhydroksidi )

Analyysi yhdisteelle 020^30^3^2 (346,45): laskettu: C 69,33, H 8,73, N 8,08 % löydetty: C 68,9, H 8,8, N 8,0 %

Esimerkki 7 N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-D-argini ini-aldehy-di-sulfaatti

Vaihe 1: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-prolyyli-Nω -bentsyylioksikarbonyyli-D-ar-gini ini-laktaarni M,3 g (0,011 moolia) Nα -t-butyylioksikarbonyyli-Nω -bent-syylioksikarbonyyli-D-arginiini-laktaamia ja 5,09 g (0,01 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-proliini-sykloheksyyliammoniumsuolaa (esimerkki 1, vaihe C) muunnetaan ja kondensoidaan esimerkin 1 vaiheessa 1 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 4,5 g (65 %) [ a ]20jj = +28,3° (c = 1, tetrahydrofuraani ) RF = 0,55 - 0,65 (etyyliasetaatti), Rp = 0,7 - 0,8 (D,L,L-muoto)

Analyysi yhdisteelle C37H2J2O7N6 (682,75): laskettu: C 65,08, H 6,20, N 12,31 * löydetty: C 65,2, H 6,3, N 12,2 %

Vaihe 2: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-prolyyli-N1*1 -bentsyylioksikarbonyyli-D-ar-giniini-aldehydi 36 85980 3,41 g (0,005 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-Nw -bentsyylioksikarbonyyli-D-arginiini-laktaamia (esimerkki 7, vaihe 1) pelkistetään esimerkin 1 vaiheessa 2 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollis ia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 2,7 g (70 %) tuotetta, joka sisältää alkuaineanalyysin mukaisesti yhden moolin sykloheksaania.

R3F = 0,57 - 0,67 [a +45,5° (c=1, tetrahydrofuraani)

Analyysi yhdisteelle (^γΗ^ΟγΝ^.C^H-|2 (768,93): laskettu: C 67,16, H 7,34, N 10,93 % löydetty: C 66,8, H 7,1, N 10,8 %

Vaihe 3: N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-D-arginii-ni-aidehydi-sulfaatti 2,31 g (0,003 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-Nu> -bentsyylioksikarbonyyli-D-arginiini-aldehydiä (esimerkki 7, vaihe 2) alistetaan hydro-genolyysiin esimerkin 1 vaiheessa 3 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 1,24 g (75 %) R6f = 0,39 - 0,47 [ et ]20d = -75° (o = 1 , vesi) Lähtöaine Na -t-butyylioksikarbonyyli-Νω -bentsyylioksikar-bonyyli-D-argini ini-laktaarni voidaan valmistaa seuraavan menetelmän mukaisesti: 5,97 g (0,014 moolia) Na -t-butyylioks ikarbonyyli-N(J -bent-syylioksikarbonyyli-D-arginiini-hydraattia, joka on valmistettu esimerkin 1 vaiheessa D esitetyn menetelmän mukaisesti, paitsi, että t-butyylioksikarbonyyli-D-arginiini-hydro-kloridihydraattia käytetään lähtöaineena, muunnetaan esimerkin vaiheessa E esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia.

Saanto 40 g (73 Ϊ) 37 85980

Sp.: 155 - 156°C

[ a ]20^ = +24° (c = 1, tetrahydrofuraani )

Esimerkki 8 N-metyyli-D-f enyylialanyyli-L-prolyyli-DL-arginiini-alde- hydi-sulfaatti

Vaihe 1: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-prolyyli-N03 -bentsyy 1 ioksikarbonyyli-DL-argini ini-laktaami 4,3 g (0,011 moolia) Να -t-butyylioksikarbonyyli-N1*5 -bent-syylioksikarbonyyli-DL-arginiini-laktaamia ja 5,09 g (0,010 moolia ) N-bentsyyli oksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-nyyli-L-proliini-sykloheksyyliammoniumsuolaa (esimerkki 1, vaihe C) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 1 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagens-seja ja liuottimia.

Saanto 4,0 g (60 %) [a ]20j) = +21° (c=1, tetrahydrof uraani)

Rp = 0,55 - 0,65 (D,L,D-muoto) ja Rp = 0,7 - 0,8 (D,L,L-rauo-to) (etyyliasetaatti)

Vaihe 2: N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyyliala-- ’ nyyli-L-prolyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-DL- arginiini-aldehydi 3,41 g (0,005 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N ω -bentsyylioksikarbonyyli-DL-arginiini-laktaamia (esimerkki 8, vaihe 1) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 2 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia. Saanto 2,9 g (75 %) tuotetta, joka sisältää yhden moolin syk-loheksaania. r3f = 0,52 - 0,67 [a ]2% = +32,5° (c=1, tetrahydrofuraani)

Vaihe 3: N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-DL-arginii-ni-aldehydi-sulfaatti 38 85980 2,31 g (0,003 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-Nω -bentsyylioksikarbonyyli-DL-arginiini-aldehydiä (esimerkki 8, vaihe 2) muunnetaan esimerkin 1 vaiheessa 3 esitetyn menetelmän mukaisesti käyttämällä verrannollisia määriä reagensseja ja liuottimia. Saanto 1,15 g (70 Ϊ) R6F = 0,39 - 0,47 [a ]20p = -109° (c=1, vesi)

Esimerkki 9

Farmaseuttisten koostumusten valmistus 2 ampullin valmiste, joka sopii 6 ja 12 tunnin intravenöösi-seen infuusioon, valmistetaan seuraavasti: N-metyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argini ini-aldehydi-sulfaattia (420 - 840 mg) ja ihmisen albumiinia (40 - 80 mg) saatetaan liittymään jäädytyskuivattaen. Pakastekuivatun ampullin sisältö liuotetaan ennen käyttöä steriiliin, toisen ampullin mikrobi-vapaaseen isotoniseen suolaliuokseen (100 -200 ml).

Claims

39 85930 Patenttivaatimus: Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten yleiskaavan (I) Rlx NXxx - Pro - Yyy - H · (HA)2 *2 mukaisten peptidialdehydien valmistamiseksi, jossa kaavassa Rl edustaa vetyä tai Ci-g-alkyyliryhmää, R2 merkitsee Ci_g-alkyyliryhmää, edelleen R^ ja R2 ovat sitoutuneet Xxx-alfa-aminohapon aminoryhmään, Xxx edustaa D-fenyylialaniini- tai D-alloisoleusiinitähdettä, Pro merkitsee L-proliini-tähdettä, Yyy merkitsee L-, D- tai DL-arginiini-tähdettä ja A edustaa happotähdettä, tunnettu siitä, että kondensoidaan peptidikemiassa tunnetulla menetelmällä guanidino-ryhmässään suojattu arginiinilaktaami N-suojatun N-monoalkyyli-Xxx-Pro-OH- tai N,N-dialkyyli-Xxx-Pro-OH-dipeptidin kanssa, pelkistetään näin saatu suojattu tripeptidilaktaami suojatuksi tripeptidi-aldehydiksi, poistetaan suojaryhmä(t) ja eristetään muodostuva N-alkyyli- tai Ν,Ν-dialkyylitripeptidialdehydi suolan muodossa. -«o 859S0 Förfarande för framställning av terapeutiskt användbara peptidaldehyder med den allmänna formeln (I) R1 NXxx - Pro - Yyy - H · (HA)2 / r2 väri star för väte eller en C^-g-alkylgrupp, R2 representerar en Ci_6~alkylgrupp, vidare är Rj och R2 bundna tili aminogruppen i Xxx-alfa-aminosyran, Xxx representerar en D-fenylalanin- eller en D-alloiso-leucinrest, Pro betyder en L-prolinrest, Yyy representerar en L-, D- eller DL-argininrest och A representerar en syrarest, kännetecknat av att man kondenserar medelst ett i peptidkemin känt förfarande en argininlaktam uppvisande en skyddad guanidinogrupp med en N-skyddad N-monoalkyl-Xxx-Pro-OH- eller N,N-dialkyl-Xxx-Pro-OH-dipeptid, man reducerar den sälunda erhällna tripeptidlaktamen tili en skyddad tripeptidaldehyd, man avlägsnar skyddsgruppen (-grupperna) och isolerar den bildade N-alkyl- eller N,N-dialkyltri-peptidaldehyden i formen av ett sait.