FI93646C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligopeptidien valmistamiseksi, joissa on proliinille analogisia syklisiä aminohappoja - Google Patents

Description

93646

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligopeptidien valmistamiseksi, joissa on proliinille analogisia syklisiä aminohappoj a 5 Keksintö koskee pyratsolidiini-oligopeptidien val mistamista, joissa on syklisiä, luonnossa esiintymättömiä aminohappoja ja jotka inhiboivat tehokkaasti prolyylihyd-roksylaasia.

2,3-disubstituoituja iso-oksatsolidiineja ja niiden 10 käyttö prolyylihydroksylaasin inhiboijina on kuvattu sak salaisessa hakemusjulkaisussa 3 643 012.

Julkaisussa J.C.S. Perkin I 2475 - 2481 (1972) kuvataan sellaisten polytripeptidien synteesiä, joissa pro-liini-heterosyklo on korvattu tiatsolidiini-, piperidiini-15 tai atsetidiini-heterosyklillä.

FI-patenttijulkaisussa 88 303 kuvataan tiettyjä 2,3-disubstituoituja iso-okatsasolidiinijohdannaisia sekä näiden valmistusta ja käyttöä prolyylihydroksylaasi-inhi-biittoreina.

20 US-patenttijulkaisussa 4 425 333 kuvataan tiatsoli diini- ja vastaavasti pyrrolidiinityyppiä olevia rikkiä sisältäviä asyyliaminohappoja sekä näiden valmistusta ja käyttöä ACE-inhibiittoreina.

EP-julkaisussa 254 354 kuvataan tietyllä tavalla 25 substituoituja tiatsolidiini-4-karboksyylihappojohdannai- sia sekä näiden valmistusta ja käyttöä kuumetta alentavina, tulehduksenvastaisina ja limaa irrottavina aineina sekä kipulääkkeinä.

Julkaisussa W0 86/2353 kuvataan tiatsolidiini-ren-30 gassysteemin omaavia dipeptidejä sekä näiden käyttöä sellaisten patologisten oireyhtymien hoidossa, jotka ilmenevät kehon glutationipitoisuuden pienenemisenä.

Mainitut julkaisut kuvaavat ainoastaan sellaisia yhdisteitä, jotka eroavat sekä heterosyklin että sivuket-35 jujen osalta keksinnön mukaisista pyratsolidiiniyhdisteis- 2 93646 tä. Julkaisuissa ei myöskään mainita tai ehdoteta pyratso-lidiinijohdannaisten käyttöä prolyylikarboksylaasi-inhi-biittoreina.

Keksinnön tarkoituksena on löytää uusia tehokkaita 5 prolyylihydroksylaasin inhibiittoreita, joiden proliini- tähde on korvattu syklisellä luonnossa esiintymättömällä aminohapolla.

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligopeptidien valmistamiseksi, joilla on 10 kaava I

A - Cyc - NH - CH - C - O - R4 (I) k8 a jossa A on (Cj.g)-alkoksikarbonyyli, jossa vetyatomi on 15 mahdollisesti korvattu (C6.12)-aryylillä, tai A on ryhmä, jolla on kaava Ha R1 - N - CH - C - (11a) k2 k3 ä 20 jossa R1 on (C6.12 )-aryyli-(C1.4 )-alkoksikarbonyyli, R2 on vety, R3 on (0Χ.4)-alkyyli, joka mahdollisesti on monosubs-tituoitu fenyylillä, ja Cyc vastaa seuraavaa heterosyklis-tä rakennetta 25 Γ"\ G~VV ' ' 0 jolloin G tarkoittaa vetyä tai (C1.6)-alkoksikarbonyyliä, 30 R4 on (C6.12)-aryyli-(C1.5)-alkyyli ja R8 on vety, jolloin (C6.12)-aryyli on fenyyli, naftyyli tai bifenyyli, sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi .

Alkyyli ja siitä johdetut ryhmät kuten alkoksi voi-35 vat olla suoraketjuisia tai haaroittuneita.

Il 93646 3

Kiraalikeskukset voivat olla R- tai S-konfiguraa-tiossa, jos ei ole toisin sanottu. Keksintö koskee optisesti puhtaita yhdisteitä sekä myös steroisomeeriseoksia, kuten enantiomeeriseoksia ja diastereomeeriseoksia.

5 Suoloina tulevat kyseeseen varsinkin alkali- ja maa-alkalisuolat, suolat fysiologisesti hyväksyttävien amiinien kanssa ja suolat epäorgaanisten ja orgaanisten happojen kanssa kuten esim. HCl:n, HBr:n H2S04:n, ma-leiinihapon ja fumaarihapon kanssa.

10 Menetelmälle kaavan I mukaisten yhdisteiden valmis tamiseksi on tunnusomaista, että yhdisteet muodostetaan tunnetulla tavalla fragmenteista esim. niiden kytkentä-reaktiolla, mahdollisesti poistetaan yksi tai useampi väliaikaisesti liitetty suojaryhmä, karbonyylifunktiot muu-15 tetaan mahdollisesti tia-analogeiksi ja mahdollisesti muutetaan näin saadut kaavat I mukaiset yhdisteet fysiologisesti hyväksyttäviksi suoloikseen.

Yllä mainituilla fragmenteilla tarkoitetaan tässä aminohappoja, useampia aminohappoja sisältäviä segment-20 tejä, aminohappojen johdannaisia, sellaisten peptidien johdannaisia, joissa on modifioituja peptidisidoksia samoin kuin eri tavoin substituoituja karboksyylihappoja, eri alkoholeja ja näiden johdannaisia.

Kytkentäreaktio voi tapahtua siten, että esim. kaa-25 van I mukaisen yhdisteen fragmentti, jossa on pääteryhmänä oleva karboksyyliryhmä tai reaktiivinen happojohdannainen, kondensoidaan inertissä liuottimessa vastaavan toisen fragmentin kanssa, joka sisältää esim. vapaan aminoryhmän, jolloin mahdollisesti läsnä olevat reaktioon osallistumat-30 tomat funktionaaliset ryhmät voivat olla mahdollisesti suojattuja, jolloin muodostuu amidisidos. Menetelmiä, jotka sopivat amidisidoksen muodostamiseen, on kuvattu teoksessa Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, osa 15/2.

35 Menetelmä suoritetaan edullisesti siten, että a) kaavan lii mukainen yhdiste kondensoidaan kaavan IIIb mukaisen yhdisteen kanssa 93646 4 A - X (Ilia) H - Cyc - NH - CH - C - 0 - R4 (Illb) A8 & 5 joissa A, Cyc, R4 ja R8 ovat edellä määritellyt, ja X on nukleofiilisesti poistettavissa oleva poistuva ryhmä kuten OH, Cl, Br, I, tosyyli, triflaatti tai, jos A on asyylira-dikaali, myös aktiivinen esteriryhmä, b) kaavan IVa mukainen yhdiste kondensoidaan kaavan 10 IVb mukaisen yhdisteen kanssa A - Cyo - X (IVa) H - NH - CH - C - 0 - R4 (IVb) A8 ä 15 joissa A, Cyc, R4 ja R8 ovat edellä määritellyt, ja X on nukleofiilisesti poistettavissa oleva poistuva ryhmä kuten OH, Cl, Br, I, tosyyli, triflaatti tai aktiivinen esteri-ryhmä, tai c) kaavan Va mukainen yhdiste kondensoidaan kaavan 20 Vb mukaisen yhdisteen kanssa, A - Cyc -NH-CH-C-X (va) H-O-R4 (Vb) A8 8 25 joissa A, Cyc, R4 ja R8 ovat edellä määritellyt, X on nukleof iilisesti poistettavissa oleva poistuva ryhmä kuten OH, Cl, Br, I, tosyyli, triflaatti tai aktiivinen esteri-ryhmä .

Kaavan lila, IVa tai Va mukaisen karboksyylihapon 30 reaktio vastaavan kaavan IIIb, IVb tai Vb mukaisen vapaan aminoryhmän sisältävän yhdisteen kanssa saatetaan tapahtumaan edullisesti peptidikemiassa yleisesti käytetyssä liuottimessa tai vesi-liuotinseoksissa sopivan kondensaa-tioapuaineen läsnäollessa kuten esim.

35 1. disykloheksyylikarbodi-imidi, jolloin samalla lisätään 1-hydroksibentsotriatsolia (DCC/HOBt-metodi, kirj.: Chem. Ber. 103(1970) 788) 93646 5 2. disykloheksyylikarbodi-imidi, jolloin samalla lisätään 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydro-l,2,3-bentsotriat-siinia (DCC/HOOBt-metodi; kirj.: Chem. Ber. 103 (1970) 2034) 5 3. disykloheksyylikarbodi-imidi, jolloin samalla lisätään N-hydroksisukkiini-imidiä (DCC/HONSu-metodi; kirj.: Z. Naturforsch. 21b (1966) 426) 4. alkaanifosfonihappoanhydridi kuten n-propyyli-fosfonihappoanhydridi (PPA-metodi; kirj.: Angew. Chemie.

10 Int. Ed. 19 (1989) 133) 5. dialkyylifosfiinihappoanhydridi kuten metyyli-etyylifosfiinihappoanhydridi (MEPA-metodi; kirj.: US-pa-tentti 4 426 325).

Sopivina liuottimina käytetään keksinnön mukaisessa 15 menetelmässä liukoisuuden takia useimmiten polaarisia liuottimia kuten esim. dimetyyliasetamidia, dimetyyliform-amidia, dimetyylisulfoksidia, fosforihappo-tris-(dimetyy-liamidia), N-metyylipyrrolidonia, vettä tai em. liuottimien vesiseoksia. Viimeksi mainittu sopii ennen kaikkea 20 MEPA-menetelmään. Myös kloroformia, metyleenikloridia tai etyyliesteriä voidaan kuitenkin myös käyttää. Synteesi voidaan suorittaa -10 °C:n ja n. 50 °C:n välillä, edullisesti -10 °C:n ja huoneen lämpötilan välillä. Yleensä aloitetaan n. 0 °C:ssa ja nostetaan lämpötila myöhemmin 25 huoneen lämpötilaan.

Kaavan IVa tai Va mukaisen karboksyylihapon konden-sointi kaavan IVb tai Vb mukaisen alkoholin kanssa kar-boksyylihappoesteriksi suoritetaan parhaiten disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC)-metodin mukaan - kuten on kuvattu 30 julkaisussa Angew. Chem. 90, 556 (1978) - inertissä liuot-timessa kuten DMF:ssä käyttäen katalyyttinä 4-dimetyyli-aminopyridiiniä lämpötila-alueella -20 °C:sta 40 °C:seen, edullisesti -20 °C:sta huoneen lämpötilaan.

Modifioidun peptidisidoksen valmistukseen sopivia 35 menetelmiä on kuvattu julkaisussa Janssen Chimica Acta,

Voi. 3, Nr. 2 (1985). Edullisina pidetään seuraavia metodeja: 93646 6

Pelkistettyjä peptidisidoksia sisältävien johdannaisten synteesi aldehydien pelkistävällä aminoinnilla aminohapon estereiden kanssa natriumsyaaniboorihydridin avulla (vrt. Borch et ai., J. Amer. Chem. Soc. 93 (1971) 5 2897; 91 (1969) 3996) tai N-alkyloinnilla amiineista tai aminohappojohdannaisista (vrt. Houben-Weyl, Methoden der Org. Chemie, Bd. 11/1), jolloin d) kaavan Via tai VIb mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan IIIb mukaisen yhdisteen kanssa 10 A' - CHO (Via) R1 - N - CH - C - H (VIb)

12 13 H

R R 0 H - Cyc - NH- CH - C - 0 - R4 (Illb) I 8 15 Rö 0 joissa Cyc, R1, R2, R3, R4 ja R8 ovat edellä määritellyt ja A' on (C^_g)-alkyyli, joka on mahdollisesti substituoitu fenyylillä.

20 Endotiopeptidejä saadaan edullisesti yleistä tyyp piä I olevien yhdisteiden reaktiosta Lawessonin reagenssin ( 2,4-bis-(4-metoksifenyyli)-l,3-ditia-2,4-difosfetaani- 2,4-disulfidin) kanssa (vrt. Synthesis 1979, 941).

Muiden funktionaalisten ryhmien tilapäiseen suo- 25 jaukseen soveltuvat suojaryhmät, jollaisia tavallisesti käytetään peptidisynteesissä ja joita on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Kontakte Merck 3/79, sivut 14 - 22 ja 1/80 sivut 23 - 35.

Aminohappofunktion uretaanisuojaryhmiä ovat esim.

30 Pyoc, Fmoc, Fcboc, Z, Boc, Ddz, Bpoc, Z-(N02), Dobz, Moc, Mboc, Iboc, Adoc, Adpoc, Msc tai Pioc; edullisia ovat Z tai Boc. Näiden suojaryhmien poisto suoritetaan hapoilla, emäksillä tai pelkistimillä.

Guanidinoryhmän suojaryhmiä ovat esim. N02, tosyy- 35 li, Boc, Z, mesityleeni-2-sulfonyyli (Mts) yms. Lohkaisu voidaan suorittaa hydrolyyttisesti tai hydrogenolyyttises-ti.

93646 7 COOH-sivuryhmät suojataan alkyyliestereinä, edullisesti metyylietyyli- tai tert-butyyliesterinä, tai bent-syyliesterinä tai modifioituna bentsyyliesterinä (p-N02), p-Cl, p-Br mm.)· Suojaus poistetaan alkalisella tai hap-5 painella saippuoinnilla tai hydrauksella.

Hydroksyylin suojaryhmiä ovat esim. tert.-butyyli tai bentsyyli.

Keksinnön mukaiset aineet ovat prolyylihydroksy-laasin estoaineita. Tämän takia ne estävät selektiivisesti 10 kollageenispesifisiä hydroksylointireaktioita, joissa pro teiinin sitoutunut proliini hydroksyloituu prolyylihyd-roksylaasientsyymin vaikutuksesta. Tämän reaktion estyessä inhibiittorin vaikutuksesta muodostuu toimintakyvytön ali-hydroksyloitu kollageenimolekyyli, jota voi poistua solus-15 ta solun ulkopuoliseen tilaan vain vähäisiä määriä. Ali-hydroksyloitu kollageeni ei sitä paitsi voi sitoutua rakenneosaksi kollageenimatriisiin ja se hajoaa hyvin helposti proteolyyttisesti. Tämän vaikutuksen seurauksena vähenee solun ulkopuolelle varastoidun kollageenin koko-20 naismäärä. Prolyylihydroksylaasin inhibiittorit ovat sen takia sopivia aineita sellaisten sairauksien hoidossa, joissa kollageenin varastoituminen on leimaa-antava sairauden kuvalle. Niihin kuuluvat mm. keuhkojen ja maksan fibroosi ja ihofibroosi (skleroderma) sekä ateroskleroosi. 25 Edelleen on tunnettua, että kollageenin muodostumi sen inhibiittoreilla on antituumori-ominaisuuksia. Pienentämällä kollageenisynteesiä ja -varastointia vaikutetaan kasvaimen kasvulle välttämättömään kudoksen muodostukseen (H: Dvorak, N. Engl. J. of Med. 315 (1986) 1650); ja pe-30 rusmembraanimuodostuksen inhibiittorit ovat sopivia erilaisten kasvaimien kasvun estäjiä (W. Klohs et ai. J. N. C. I. 75 (1985) 353).

Sitä paitsi on tunnettua, että prolyylihydroksylaasin inhibointi tunnetuilla inhibiittoreilla kuten a,a-35 dipyridyylillä johtaa makrofaagien Clq-biosynteesin estymiseen. (W. Miiller et ai., FEBS Lett. 90, 218 f (1978)).

93646 8

Siten komplementtiaktivoinnin klassinen tie jää pois. Pro-lyylihydroksylaasin inhibiittorit vaikuttavat tämän vuoksi myös immunosuppressiivisina aineina esim. immuunikomplek-sisairauksissa.

5 Keksinnön mukaisia aineita voidaan sen takia käyt tää fibrosuppressiivisina, immunosuppressiivisina ja anti-ateroskleroottisina aineina ja syövän hoidossa.

Estovaikutus voidaan määrittää entsyymitestissä, joka on analoginen menetelmälle, joka on kuvattu julkai-10 sussa B. Peterkofsky ja R. DiBlasio, Anal. Biochem. 66, 279 - 286 (1975). Tässä menetelmässä alihydroksiloitu kollageeni hydroksyloidaan entsymaattisesti prolyylihydroksi-laasilla rauta(II)ionien, α-ketoglutaraatin ja askorbaatin läsnä ollessa.

15 Irreversiibelin estotyypin määrittämiseksi entsyy miä esi-inkuboidaan rauta(II)ionien, α-ketoglutaraatin ja askorbaatin läsnäollessa estoaineiden kanssa eri pituisia ajanjaksoja ja sen jälkeen määritetään peptidisubstraatin läsnä ollessa entsyymin jäännösaktiivisuus. Aktiiviteet-20 timääritykseen voidaan käyttää yllä kuvatun Peterkofskyn ja DiBlasion metodin lisäksi myös muita menetelmiä kuten on kuvattu julkaisussa K.I. Kivirikko ja R. Myllylä, Meth. Enzym. 82, 245 - 304 (1982).

Estovaikutus voidaan määrittää myös solu- tai ku-25 dosviljelyissä. Siihen voidaan käyttää fibroplastia tai muita kollageenia tuottavia soluja tahi calvariaa tai muita kollageenia tuottavia elimiä. Aineiden vaikutus voidaan määrittää hydroksiproliini/proliini-osamäärien pienenemisestä lisäämällä 14C-proliinia.

30 Antifibroottinen vaikutus voidaan määrittää hiili- tetrakloridi-indusoidussa maksafibroosimallissa. Siihen käsitellään viikoittain kaksi kertaa rottia CCl4:lla (1 ml/kg), joka on liuotettu oliiviöljyyn. Koeainetta annetaan päivittäin, mahdollisesti kaksi kertaa päivässä 35 suun kautta tai vatsaonteloon, jolloin koeaine on liuotettu sopivaan liuottimeen. Maksafibroosin määrä määritetään g z < / c

S -J U1U

9 histologisesti; kollageenin määrä maksassa analysoidaan hydroksiproliinimäärityksellä kuten Kivirikko et ai. (Anal. Biochem. 19, 249 f, (1967)) ovat kuvanneet, fibrogeneesin aktiivisuus voidaan määrittää seerumissa 5 olevien kollageenifragmenttien ja prokollageenipeptidien radioimmunologisella määrityksellä. Keksinnön mukaiset yhdisteet on tässä mallissa tehokkaita konsentraatioina 1 - 100 mg/kg. Toinen malli antifibrioottisen vaikutuksen määrittämiseksi on bleomysiini-indusoidun keuhkofibroosin 10 malli kuten Kelley et ai. (J. Lab. Clin. Med. 96, 954, (1980)) ovat kuvanneet. Keksinnön mukaisten yhdisteiden vaikutus rakeiskudokseen voidaan määrittää vanutukkojy-väkasvainmallilla, kuten on kuvattu julkaisussa Meier et ai., Experientia 6, 469 (1950).

15 Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää pro- lyylihydroksylaasin inhibiittorina sekä lääkeaineena nisäkkäillä ja ihmisillä varsinkin fibrosuppressiivisena, immuunisuppressiivisena ja antiateroskleroottisena aineena syövän hoidossa.

20 Farmaseuttisia valmisteita, joissa on tehokas määrä kaavan I mukaista yhdistettä ja fysiologisesti vaaratonta kantajaa, voidaan valmistaa saattamalla vaikuttava aine sopivaan annostusmuotoon yhdessä kantajan ja mahdollisesti muiden apu- tai lisäaineiden kanssa. Vaikuttavan aineen 25 osuus näissä valmisteissa on tavallisesti 0,1 - 96 %.

Ainetta voidaan annostella nenään, poskeen, laskimon sisäisesti, ihon sisäisesti tai suun kautta. Vaikuttavan aineen annostus riippuu eläinlajista, painosta, iästä ja annostelutavasta.

30 Edellä olevan keksinnön mukaiset farmaseuttiset valmisteet valmistetaan sinänsä tunnetuilla liuotus-, sekoitus-, granulointi- tai rakeistusmenetelmillä.

Oraalista käyttömuotoa varten aktiiviset yhdisteet sekoitetaan tähän tarkoitukseen tavanomaisten lisäaineiden 35 kuten kantaja-aineiden, stabilisaattoreiden tai inerttien ohennusaineiden kanssa ja muutetaan tavanomaisilla mene- xo ?3646 telmillä sopivaan antomuotoon kuten tableteiksi, rakeiksi, kapseleiksi, vesi-, alkoholi- tai öljysuspensioiksi tai vesi-, alkoholi- tai öljyliuoksiksi. Inertteinä kantajina tulevat kysymykseen esim. arabikumi, magnesiumkarbonaatti, 5 kaliumfosfaatti, maitosokeri, glukoosi tai tärkkelys, var sinkin maissitärkkelys. Tällöin valmistus voi tapahtua niin kuiva- kuin kostearakeina. Öljymäisinä kantaja-aineina tai liuottimina tulevat kysymykseen esimerkiksi kasvi-tai eläinöljyt, kuten auringonkukkaöljy tai kalanmaksaöl-10 jy.

Laskimon tai ihon sisäistä annostusta varten aktii-viyhdiste tai niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat saatetaan liuokseen, suspensioon tai emulsioon haluttaessa tähän tarkoitukseen tavanomaisten aineiden kuten liukene-15 mistä edistävien tai muiden apuaineiden kanssa.

Tässä tulevat kysymykseen esim. vesi, fysiologinen keittosuolaliuos tai alkoholit, esim. etanoli, propanoli, glyseroli, niiden ohella myös sokeriliuokset kuten glukoosi- tai manteliliuokset tai mainittujen eri liuottimien 20 seokset.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat esillä olevaa keksintöä sen kuitenkaan rajoittumatta näihin.

Luettelo käytetyistä lyhenteistä: AA aminohappoanalyysi 25 Ac asetyyli

Boc tert-butoksikarbonyyli DC ohutkerroskromatografia DCC disykloheksyylikarbodi-imidi DCH disykloheksyyliurea 30 DMF dimetyyliformamidi DMSO dimetyylisulfoksidi EE etikkahapon etyyliesteri FAB nopea atomien pommitus

Fmoc 9-fluorenyy1imetyy1ioks ikarbonyy1i 35 HOBt 1-hydroksibentsotriatsoli HOSu 1-hydroksisukkiini-imidi >' 3646 11 HPhe homofenyylialaniini i.V. tyhjiössä M molekyylipiikki

MeOH metanoli 5 MS massaspektri CHN alkuaineanalyysi NEM N-etyylimorfoliini tBu tert-butyyli

Pht ftalyyli 10 Sp. sulamispiste THF tetrahydrofuraani Z bentsyylioksikarbonyyli h tunti min minuutti 15 RT huoneen lämpötila

Tic 1,2,3,4,-tetrahydroisokinoliini

Phg fenyyliglysiini

Muut aminohapoista ja suojaryhmistä käytetyt lyhenteet ovat peptidikemiassa yleisiä kirjainkoodeja kuten on 20 kuvattu esim. julkaisussa Europ. J. Biochem. 138, 9-37 (1984). Jos ei muuta ilmoitettu, on kyseessä aina L-kon-figuraation aminohapot.

Esimerkit A. 1 25 Boc

H

Z-Ph·- N^\ CO- Gly- OBzl A,1.1 l-tert-butoksikarbonwlipvratsolidiinikar-30 boksvvlihapon etvvliesteri Jäähdytetään 53,5 g Diazaldi^) 750 ml:ssa tert-bu-tyylieetterissä 0 °C:seen ja lisätään 16,5 KOH liuotettuna 25 ml:aan etanoli/vesiseosta (9:1). Lämmitetään huoneen lämpötilaan ja sekoitetaan huoneen lämpötilassa 1 h. 35 25,0 g (0,25 M) akryylihapon etyyliesteriä 20 ml:ssa tert- butyylimetyylieetteriä lisätään tipoittain 1,5 tunnin ku- 12 >'3646 luessa, jolloin lopuksi lisätään 40 ml vettä. Jatkokäsittelynä lisätään 800 ml dietyylieetteriä, orgaaninen faasi erotetaan, pestään kyllästetyllä NaCl-liuoksella ja kuivataan Na2S04:lla. Jäännös liuotetaan 500 ml:aan DMF:ä ja 5 lisätään 55 ml trietyyliamiinia 100 mg dimetyyliaminopy- ridiiniä ja 54 mg (0,25 M) pyrohiilihappoon di-tert-butyy-liesteriä. Silikageelilla suoritetun kromatografiän jälkeen saadaan 8 g A2-l-tert-butoksikarbonyylipyratsoliini- 3-karboksyylihapon etyyliesteriä. 6 g pyratsoliinin joh-10 dannaista liuotetaan 100 ml:aan etikkahappoa, lisätään 7 g sinkkipulveria ja sekoitetaan. Reaktioliuos suodatetaan 2 h:n jälkeen, suodos haihdutetaan tyhjiössä kiertohaih-duttimella ja jäännös kromatografoidaan silikageelillä. Saadaan 4,5 g l-tert-butoksikarbonyylipyratsolidiini-3-15 karboksyylihapon etyyliesteriä.

1H-NMR: 6 (TMS) = 1,3; 1,5; 2,0 - 2,5; 3,4 - 3,7; 3,9; 4,25 ppm.

MS (FAB) = 245 (M + H) A.1.2 20

Boc γ—\ Z - PK. - COOEt . 25 598 mg Z-Phe-0H:a 5 ml:ssa CH2C12 jäähdytetään * 0 °C:seen ja lisätään liuos, jossa on 420 mg DCC:a 1 ml:ssa CH2C12, sekoitetaan 30 min 0 °C:ssa ja vielä 30 min huoneen lämpötilassa. Urean suodatuksen jälkeen liuos haihdutetaan tyhjiössä ja jäännös kromatografoidaan 30 silikageelillä. Haluttua tuotetta saadaan 610 mg.

1H-NMR: δ (TMS) = 1,35 ja 1,5 CBU), 4,2 (0CH2) ppm MS (FAB) = 526 (M + H) A.1.3

Boc 35 n— z -pk. - CO-Gly-OBzl 13 93646 600 mg dipeptidiä saippuoidaan titraamalla 4 n NaOH:n dioksaani/metanoliliuoksella tymolftaliinia vasten. Sen jälkeen pH säädetään arvoon kaksi 1 n HClrllä, uutetaan EE:llä, orgaaninen faasi pestään kylläisellä NaCl-5 liuoksella ja kuivataan Na2S04:llä. Jäännös (550 mg) sekä 343 mg H-Gly-OBzl·tolueenisulfonihappoa liuotetaan 3 ml:aan CH2C12, jäähdytetään 0 °C:seen, ja lisätään liuos, jossa on 230 mg DCC:ä CH2Cl2:ssa, jolloin samalla lisätään 150 μΐ MEM:ä. Sekoitetaan 15 min 0 °C:ssa, 20 min huoneen 10 lämpötilassa, haihdutetaan liuotin pois kiertohaihdutti-mella tyhjiössä. Diastereomeerit erotetaan kromatografroimalla siligageelillä (etikkaesteri/petrolieetteri 2:1). Saadaan 50 mg R-konfiguraatiossa olevaa ja 130 mg S-konfi-guraatiossa olevaa pyratsolidiinijohdannaista.

15 1H-NMR: δ (TMS) = 1,35 ((RJ-'BU), 1,5 ((SJ^Bu) ppm.

MS (FAB) = 645 (M + H) A. 2

H

N—.

Z-Ph9 - fg \ 20 CO-Gly-OBil 120 mg kohdassa A.1.3 saatua Boc-suojattua pyratsolidiini johdannaista 4 ml:ssa 9 n HCl:n eetteriliuosta 25 sekoitetaan 45 min huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen se haihdutetaan tyhjiössä kiertohaihduttimella, otetaan uudelleen dietyylieetteriin ja haihdutetaan tyhjiössä kiertohaihduttimella. Saadaan 100 mg haluttua yhdistettä hydrokloridina.

30 MS (FAB) = 545 (M + H) B. 1 (ei keksinnön mukainen yhdiste Ζ-Ρ^·-»ϊ 1

V"S

C0-GIH-0Brl 35 93646 14 B.l.l Tlatsolldiini-2-karboksyyllhapon etyylies- terl 22,6 g merkaptoetyyliamiinihydrokloridia ja 20,4 g glyoksyylihapon etyyliesteriä lämmitetään vesihauteessa 5 45 min yhdessä 100 g:n kanssa molekyyliseulaa 3A. Suodate taan, haihdutetaan tyhjiössä, jäännös suodatetaan silika-geelin läpi ja kiteytetään metyleenikloridi/tert-butyyli-metyylieetteristä. Saadaan 27 g tiatsolidiinijohdannaista.

B.1.2 10 Z-Ph*-r/~~~j \<5 COOEi 15 1,98 g tiatsolidiini-2-karboksyylihapon etyyli esteriä, 2,99 g Z-Phe-OH Ja 1,35 g HOBt liuotetaan pieneen määrään DMF:ä, jäähdytetään 0 °C:seen ja lisätään peräkkäin 2,1 g DCC ja 1,28 ml NEM. Sekoitetaan 1 h 0 °C:ssa ja edelleen 10 h huoneen lämpötilassa. Urean suodatuksen 20 jälkeen haihdutetaan tyhjiössä kiertohalhduttimella, jäännös otetaan etikkaesteriin ja suodatetaan siligageelillä. Saadaan 4 g haluttua yhdistettä öljynä, joka jatkokäsitel-lään suoraan B.1.3:n mukaan.

B.1.3 25 Z-Ph·-^ 1

V-S

C00H

30 4 g kohdassa B.1.2 saatua reaktiotuotetta liuotetaan 20 ml:aan dioksaania ja 5 ml:aan vettä ja saippuoidaan 1 N NaOH-liuoksella titraamalla tymolftaleiinia vasten. Täydellisen reaktion jälkeen DC-kokeessa tehdään happameksi KHSO^-liuoksella ja vesifaasi uutetaan EE:llä. Orgaaninen 35 faasi pestään kylläisellä NaCl-liuoksella ja kuivataan 93646 15

Na2S0^:lla. Haihdutetaan tyhjiössä kiertohaihduttimellä, minkä jälkeen saadaan 3,6 g haluttua yhdistettä öljynä.

MS (FAB) - 415 (M + H) B.1.4.

5 ζ-ρκ·-ν ]

Vs CO-GlyOBzl 10 3,4 g kohdan B.1.3 reaktiotuotetta, 2,7 g H-Gly- 0Bzl:n tolueenisulfonihapposuolaa ja 1,1 g HOBt:a liuotetaan 8 ml:aan DMF:ä, jäähdytetään 0 eC:seen ja lisätään 1,7 g DCC:tä ja 1,1 ml NEM:a. Sekoitetaan 1 h 0 eC:ssa ja edelleen 10 h huoneen lämpötilassa. Urea suodatetaan, 15 haihdutetaan tyhjiössä kiertohaihduttimella, jäännös otetaan EE:iin, pestään KHSO^-liuoksella, KHCO^-liuoksella sekä NaCl-liuoksella, kuivataan Na2SO^:llä ja liuotin haihdutetaan tyhjiössä kiertohaihduttimella. Raakatuote puhdistetaan kromatografioimalla siligageelillä (dietyyli-20 eetteri). Saadaan 4 g haluttua yhdistettä.

1H-NMR: 6 (TMS) - 2,8 - 3,2, 3,6 - 5,6; 7,0 - 7,6 ppm MS (FAB) = 562 (M + H) B. 2 (ei keksinnön mukainen yhdiste) 25 Z-Ph.-l·/ 1 V'S->0 CO-GlyOBzl 1,4 g kohdassa B.1.4 saatua trlpeptidlä liuotetaan 30 5 ml:aan metanolia ja lisätään 0,35 ml 30-%:ista liuosta. Sekoitetaan 20 h huoneen lämpötilassa, haihdutetaan tyhjiössä melkein kuiviin ja jäännös kromatografoloaan siligageelillä (CH2C12/CH30H : 25/2). 150 mg (I) ja 200 mg (II) sulfoksldeja eristetään diastereomeerelnä.

35 I: 1H-NMR: 6 (TMS) - 2,9 - 3,2; 3,5; 3,85; 4,1; 4,35; 4,6; 5,0 - 5,2; 5,45; 7,1 - 7,5 ppm 93646 16 MS (FAB) = (M + H) II: 1H-NMR: 6 (TMS) - 2,8 - 3,2; 7,1 - 7,4 ppm MS (FAB) = 578 (M + H) C· 1 (ei keksinnön mukainen yhdiste) 5 ζ-ΡΗβ- / y CO-Gly-OB*l 10 C.l.l Morfollini-2-karboksyylihapon etyyliesteri

Synteesi julkaisun Y. Kogami, K. Okawa, Pept. Chemistry 1985, 153 - 156, mukaan.

C.1.2

15 z-PK.-rQ

COOM# 533 mg morfoliini-2-karboksyylihapon metyyliesteriä 20 ja 1090 mg Z-Phe-OH:a liuotetaan yhdessä 10 ml:aan CH^C^, liuos jäähdytetään 0 °C:seen ja lisätään 760 mg DCC:ä ja 0,45 ml NEM:a. Sekoitetaan 5 h huoneen lämpötilassa, urea suodatetaan pois ja liuotin haihdutetaan tyhjiössä. Jäännös otetaan EE:iin ja puhdistetaan kromatografioimalla si-25 ligageelillä (dietyylieetteri). Saadaan 600 mg haluttua yhdistettä.

MS (FAB) = 427 (M + H) 1H-NMR: δ (TMS) = 3,65 ja 3,8 (OCHg) ppm Cl. 3 30 Z-PK.-^3> CO-Gly-OBil 600 mg kohdan C.1.2 reaktiotuotetta saippuoidaan 35 kohdassa B.1.3 esitetyissä olosuhteissa. Saadaan 430 mg 93646 17 happoa, joka liuotetaan yhdessä 352 mg:n kanssa H-Gly-OBzl:n p-tolueenisulfonlhapposuolaa 5 ml:aan DMF:ä ja 5 ml:aan C^C^ia. Jäähdytetään 0 eC:seen ja lisätään 215 mg DCC:a ja 0,13 ml NEM:a. Lämmitetään huoneen lämpö-5 tilaan ja sekoitetaan 2 h. Kun DCH on suodatettu ja liuotin haihdutettu tyhjiössä, jäännös puhdistetaan kroma-tografioimalla siligageelillä (EE/n-heksaani : 2/1). Saadaan 400 mg haluttua yhdistettä.

1H-NMR: 6 (TMS) - 2,1; 3,0 - 3,2; 3,4; 3,65; 4,9 - 5,2; 10 5,45; 7,1 - 7,5 ppm MS (FAB) = 560 (M + H) D.1 (ei keksinnön mukainen yhdiste) Z-PK.-rY jl 15 V— C0-Gly-0Bil D.l.l 20 f l Z-Ph.-hi n

C00H

50 mg L-3,4-dihydroproliinia liuotetaan 0,44 ml:aan 25 IN NaoH:ta ja lisätään 2 ml etanolia, jossa on 175 mg Z-Phe-OSu:a. Sekoitetaan 2 h huoneen lämpötilassa, jolloin samalla pH pidetään jatkuvasti arvossa 9. Sen jälkeen säädetään HCl:n vesiliuoksella pH arvoon 2 ja uutetaan EE:llä. Kun orgaaninen faasi kuivataan 11a ja liuo- 30 tin haihdutetaan tyhjiössä, saadaan haluttu yhdiste raaka-tuotteena ja sitä käsitellään edelleen kohdan D.1.2 mukaan.

93646 18 D. 1.2 Ζ-ΡΚβ-hT^jj 5 C0-Gly-0B:1

Kohdassa D.l.l saatu raakatuote 150 mg H-Gly-OBzl:n p-tolueenlsulfonlhapposuolaa ja 60 mg H0Bt:tä liuotetaan yhdessä 5 ml:aan CH2C12, liuos jäähdytetään 0 °C:seen ja 10 lisätään 91 mg DCC:ä ja 56 μΐ NEM:ä. Sekoitetaan 1 h 0 °C:ssa ja 2 h huoneen lämpötilassa. DCH:n suodatuksen jälkeen liuotin haihdutetaan tyhjiössä ja jäännös kromato-grafioidaan siligageelillä. Saadaan 40 mg haluttua yhdistettä.

15 1H-NMR: (TMS) * 3,05 (CH2-Phe); 5,1 ja 5,2 (CH2-OCO) ppm. MS (FAB) - 542 (M + H) E·1 (ei keksinnön mukainen yhdiste) Z-Ph.-N > 20 C0-Gly-0Bil E. 1.1 25 /\

Z-PKe-N

C00H

500 mg L-atsetidiini-2-karboksyylihappoa liuotetaan 30 4,9 ml:aan 1 N NaOHra. Lisätään 4 ml etanolia ja 1,96 g Z-Phe-0Su:a ja sekoitetaan 2 h huoneen lämmössä. Sen jälkeen säädetään KHSO^-liuoksella pH arvoon 2 ja uutetaan useita kertoja EE:llä. Kuivataan Na2S0^:llä, minkä jälkeen jäännös saatetaan reagoimaan edelleen kohdan E.1.2 mukaan.

19 93646 E. 1.2 2-ΡΚ.-Ν^> g CO-Gly-OBzl

Kohdassa E.1.1 saatu raakatuote 1,68 g H-Gly-OBzl:n p-tolueenlsulfonlhapposuolaa, 675 mg HOBtrtä, 1,03 g DCC:tä ja 0,64 ml NEM liuotetaan yhdessä 15 ml:aan CHgC^sta ja sekoitetaan 4 h huoneen lämmössä. Urea suoda-10 tetaan, haihdutetaan tyhjiössä ja jäännös kiteytetään di-etyylieetteristä, mikä tuottaa 1,8 g tripeptidiä.

NMR: 2,3 - 2,5; 2,8 - 3,0; 3,3; 4,1; 4,4; 4,85; 5,1; 5,2; 5,5; 7,1 - 7,5 ppm MS (FAB): 530 (M + H)

Claims (2)

1. 93646 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligo-peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I 5 A - Cyc - NH - CH - C - 0 - R4 (I) k8 0 jossa A on (Ci.8)-alkoksikarbonyyli, jossa vetyatomi on 10 mahdollisesti korvattu (C6_12)-aryylillä, tai A on ryhmä, jolla on kaava Ha R1 - N - CH - C - ( Ha) k2 k3 s 15 jossa R1 on (C6_12)-aryyli-()-alkoksikarbonyyli, R2 on vety, R3 on (Cj_4 )-alkyyli, joka mahdollisesti on monosubs-tituoitu fenyylillä, ja Cyc vastaa seuraavaa heterosyklis-tä rakennetta I 0 25 jolloin G tarkoittaa vetyä tai (C1.6 )-alkoksikarbonyyliä, R4 on ( C6.12)-aryyli-( C:.5)-alkyyli ja R8 on vety, jolloin (C6.12-aryyli on fenyyli, naftyyli tai bifenyyli, sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdisteet muodostetaan 30 tunnetulla tavalla fragmenteista esimerkiksi kytkentäreak- tioilla, mahdollisesti poistetaan yksi tai useampia tilapäisiä suojaryhmiä, mahdollisesti muutetaan karbonyyliryh-mät tia-analogeiksi ja mahdollisesti muutetaan näin saadut kaavan I mukaiset yhdisteet niiden fysiologisesti hyväk-35 syttäviksi suoloiksi. 93646 Förfarande för framställning av terapeutiskt an-vändbara oligopeptider med formeln I 5 A - Cyc - NH - CH - C - 0 - R4 (I) k8 & där
2. 10 A är (Cj.g)-alkoxikarbonyl, där en väteatom even- tuellt ersatts med (C6.12)-aryl, eller A är en grupp med formeln Ha R1 - N - CH - C - (Ha) 15 t2 k3 ä där R1 är (C6.12)-aryl-(C1.4)-alkoxikarbonyl, R2 är väte, R3 är )-alkyl, som eventuellt är monosubstituerad med fe- 20 nyl, ooh Cyc motsvarar följande heterocykliska struktur 'Ov- . ' o 25 varvid G betecknar väte eller (C^)-alkoxikarbonyl, R4 är (C6-i2) ~aryl-( ci_5)-alkyl och R8 är väte, varvid (C6_12)-aryl är fenyl, naftyl eller bifenyl, samt fysiologiskt godtag-bara salter därav, kännetecknat därav, att 30 föreningarna bildas pä ett känt sätt frän gragment tili exempel medelst kopplingsreaktioner, en eller flera tempo-rära skyddsgrupper eventuellt avlägsnas, karbonylgrupperna eventuellt omvandlas tili tiaanaloger och de sä erhällna föreningarna med formeln I eventuellt omvandlas tili fy-35 siologiskt godtagbara salter därav.