SU1384203A3

SU1384203A3 - Способ получени сульфатов пептидил-аргининальдегидов

Info

Publication number: SU1384203A3
Application number: SU3992296A
Authority: SU
Inventors: Байус Шандор; Селл Эржебет; Багди Даниель; Барабаш Ева; Диосеги Марианн; Фиттлер Жужа; Йожа Ференц; Хорват Дьюла; Томори Ева
Original assignee: Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр Рт (Инопредприятие)
Priority date: 1984-12-21
Filing date: 1985-12-20
Publication date: 1988-03-23
Also published as: CN1025738C; HU192646B; IL77416A; FI85980C; DE3584281D1; ZA859756B; DK596385D0; US4703036A; EP0185390B1; DK596385A; PT81746B; ES550296A0; GR853121B; JPH0680078B2; ES8708237A1; CN85109736A; AU585561B2; DK171403B1; JPS61152699A; EP0185390A3

Abstract

Изобретение касаетс производных пептидов, в частности получени сульфатов пептидил-аргининальде- гида (СП). Цель - создание новых активных веществ пептидной природы с селективным торможением свертывани крови. Синтез СП общей ф-лы: ,,- -DPhe-Pro-A-H H,S04, где R, - Н; Rj - С,4 алкил; R и R присоединены к NH Tpynne D-фенилаланина; А - остаток L-аргинина, ведут конденсацией аргинин-лактама с защищенной гуанидиновой группой и защищенного по концевой аминогруппе дипептида N-моноалкил (С)-Ь-пролина. Полученный трипептидлактам восстанавливают до альдегида и после отщеплени защитных групп вьщел ют целевой продукт в виде сульфатной соли. Выход, %: брутто-ф-ла: а) 75; 0,39-0,47; (-131)&deg;; С х7/8 () 2,5(Н20); б) 70; 0,4- 0,5; нет; 5/6 (Н jSO ) х 3,5(Н20); в). 80; 0,64; нет; C2,H380,N,-H S04-4(); д) 67; 0,85- 0,7; нет. Новые СП про вл ют анти- тромбиновую активность (в сравнении с контролем в п ть раз увеличиваетс врем свертывани ), оказывают вли ние на плазминфибриновую реакцию , стабильны во времени, а их минимально активна доза 1-2 мг/кг. 3 табл. § САЭ 00 и 1чЭ

Description

Изобретение относитс к способу получени сульфатов пептидил-альде- гидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретени - создание новых соединений пептидной природы, обладающих селективным торможением свертывани крови, но более ста-.

бильных и не про вл ющих склонности к необратимой циклизации.

Rp-значени определ ют с помощью хроматографии в тонком слое на сили- кагеле (Kieselgel G Реанал, Буда- пешт) при применении в качестве элю- ирующего средства смеси растворителей . Этиловый эфир уксусной кислоты пиридин, уксусна кислота и вода при соотношени х (960:20:6:11);

(480:20:6:11); (240:20:6:11); (120: :20:6:11); (60:20 :6: 11); (30:20:6: :11).

Пример 1. Сульфат Ы-метил- -D-фенилала нин-L-np олил-L-apr инин- альдегида.

Стади 1. К-Бензилоксикарбонил- -Н-метил-В-фенилаланин-Ь-пролил-К - -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лак- там.

42,95 г (0,11 моль) N-трет-бути- локсикарбонил-N -бензилоксикарбо- нил-Ь-аргинин-лактама суспендируют в 110 мл безводного хлороформа, после чего суспензию при перемешивании смешивают с 275 мл раствора хлористго водорода в этиловом эфире уксусной кислоты (концентраци 0,11- 0,15 г/мл). После перемешивани в течение 3 ч реакционную смесь раз- бавл ют прибавлением 400 мл диэти- лового эфира, выделившуюс в осадок кристаллическую массу Отфильтровывают , два раза промывают осадок диэти ловым эфиром, примен каждый раз п 100 мл последнего, а затем промывают два раза ацетоном , примен каждый раз по 50 мл последнего. Затем продукт сушат в вакуумном эксикаторе над п тиокисью фосфора и гидроокисью , кали . После сушки приблизительно в течение 1 ч соединение расвор ют в 100 мл диметилформамида, приготовленный раствор охлаждают до -15 С, после чего при указанной тем пературе и при перемешивании прибав л ют в раствору сначала 20 мл, а затем 10-15 мл триэтиламина таким образом, чтобы в газовой фазе нельз

5

0

5 0 5 г

0

было обнаружить перетекание основани . Ссупензию прибавл ют к указанному ниже смешанному ангидриду.

50,9 г (0,1 моль) циклогексилам- монийной соли N-бензилоксикарбонил- -К-метил-В-фенилаланин-Ь-пролина раствор ют в 200 мл диэтилового эфира и 120 мл 1 н. раствора серной кислоты. Фазу диэтилового эфира три раза промывают водой, примен каждый раз по 30 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на вод ной бане при и давлении 25-30 мбар. Получен- ньш остаток и 11,2 мл (0,1 моль) N-метилморфолина раствор ют в 70 мл диметилформамида, раствор охлаждают до--15 С, после чего при указанной температуре смешивают с 13,2 мл (0,1 моль) изобутилоксикарбонилхло- рида. Затем (через 3-5 мин) смесь дополнительно перемешивают в течение 5 мин, после чего к полученному :смешанному альдегиду прибавл ют указанную суспензию в диметилформами- де. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при и в течение 1 ч при 0°С, затем смесь разбавл ют прибавлением 200 мл бензола, после чего вьщеливашийс в осадок кристаллический продукт отфильтровывают .

Раствор продукта в бензоле и ди- метилформамиде разбавл ют прибавлением 150 мл воды, после чего производ т разделение фаз. Нижнюю, содержащую воду,- диметилформамидную фазу три раза экстрагируют бензолом, примен каждый раз по 50 мл последнего . Объединенные бензольные растворы три раза промывают водой, примен каждый раз по 30 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием , а затем упаривают на вод ной бане при температуре, составл кщей максимум 40°С, и давлении 20-25 мбар.

Полученный маслообразный остаток раствор ют в 60 мл смеси, состо щей из бензола и тетрагидрофурана (8:2), после чего раствор хроматографиру- ют на колонке, заполненной 750 г силикагел -60, при применении в качестве элюирующего средства той же самой смеси растворителей. Фракции анализируют с помощью хроматографии в тонком слое на силикагеле при применении в качестве элюирующего средства смеси растворителей, состо ш;ей

из этилового эфира уксусной кислоты пиридина, уксусной кислоты и воды 480:20:6:11. Целевой продукт имеет Rp-значение 0,70-0,76. Фракции, в которых содержитс чистый основной продукт, объедин ют и упаривают на вод ной бане при температуре, сос- тавл ющей макс11мум 0°С, и давлении 20-25 мбар до объема 100 мл. Полученный концентрат смешивают с 500 м петролейного эфира. Образовавшуюс суспензию фильтруют, остаток на фильтре два раза промывают петролей ным эфиром, примен каждый раз по 100 мл последнего, и затем сушат в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и Парафиновыми стружками.

.Выход 45 г (65%). о +13,5 (с 1 , тетрагидрофуран) . ,70- О ,76.

Вычислено, %: С 65,08; Н 6,20; N 12,31.

C3,H,,0,N, (682,75)

Найдено, %: С 65,4; Н 6,4; N 12,1.

Стади 2. N-Бензилоксикарбонил- -Ы-метил-В-фенилаланин-Ь-пролил-М - -бензилоксикарбонил-Ь-аргининальде- гид,34 ,15 г (0,05 моль) N-бензилокси карбонил-К-метил-В-фенилаланин-Ь- -пролил-N -бензилоксикарбонил-Ъ-арг нин-лактама (пример 1, стади 1) раствор ют в 150 мл тетрагидрофура- на, после чего приготовленньш раствор при перемешивании смешивают с 0,0375 моль литийалюмннийгидрида в тетрагидрофуране. Процесс восстановлени контролируют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в. качестве элюирунлцего средства смеси растворителей, состо щей из этилового эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 240:20:6:11, (R р- значени дл лак тама и альдегида составл ют соответственно (-0,,5). В случае необходимости прибавл ют дополнительное количество литийалкминийгидрида. Затем при перемешивании и охлаждении рН реакционного раствора довод т до значени 2 посредством прибавлени 1 Н. раствора серной кислоты. Раствор разбавл ют водой до по влени опалесценции (приблизительно 300 мл), а затем два раза производ экстрагирование гексаном, примен каждый раз по 100 мл последнего. Со0

5

0

держащий воду, тетрагидрофурановый раствор два раза экстрагируют при применении 250 нп метиленхлори- да, объединенные метиленхлоридные э кстракты последовательно промывают два раза водой, примен каждый раз по 50 мл последней, два.раза 5%-ным раствором кислого углекислого натри , примен каждый раз по 60 мл этого раствора, и вновь два раза водой , примен каждый раз по 50 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на вод ной бане при температуре, составл ющей максимум , и давлении 20-25 мбар до объема 50-60 мл. Остаток смешивают со 100 мл бензола , а затем упаривают описанным способом. Полученный остаток разбавл ют прибавлением 100 мл циклогекса- на, образовавшийс осадок отфильтровывают , цромывают два раза циклогек- саном, примен каждый раз по 30 мл 5 .последнего, а затем сушат в вакуум- эксикаторе над парафиновыми стружками .

Выход 27 г (70%) продукта, который в соответствии с данными элементного анализа, содержит 1 моль циклогексана. R 0,52-0,62. +16,-8°(с 1, тетрагидрофуран ) .

Вычислено, %: С 67,16; Н 7,34; N 10,93.

С5,Н„О.К,-С,Н,г(768,93)

Найдено, %:С66,6;Н7,2; N 10,4.

Стади 3. Сульфат Ы-метил-В-фе- нилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальде- гида .

23,1 г (0,03 моль) N-бензилокси- карбрнил-Ы-метил-В-фенилаланин-Ь- -пролил-N -бензилоксикарбонил-L-ap- : гининальдегида (пример 1, стади 2) раствор ют в 150 мл этилового спирта . Приготовленный раствор смешивают с 50 мл обессоленной нонирова- нием воды, 48 мл 1 н. раствора сер ной кислоты и 3 г 10%-ного паллади на угле, применного в качестве катализатора , и производ т гидрирование,. Процесс гидрировани контролируют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в качестве элю- ирующего средства растворителей , состо щей из этчаового эфира уксусной кислоты, пирчцина, уксусной кислоты и воды в соотношении

0

5

0

5

0

5

30:20:6:11 (R - значени исходного соединени 0,9, промежуточного продукта 0,7 и конечного продукта 0,4) После завершени .реакции катализатор отфильтровывают и промывают его три раза обессоленной ионизированием водой, примен каждый раз по 30 мл последней. Объединенные фильтрат и полученную при промывке жидкость упаривают на роторном испарителе до объема 100 мл. Водный остаток разбавл ют обессоленной ионированием водой приблизительно до 200 мл. Если значение рН не находитс в пределах между 6jO и 6,5, то его привод т к этому пределу посредством прибавлени О, н. раствора серной кис- jiOTbi, ионообменника в ОН-форме (например , AG 1X8). Непосредственно после этого осуществл ют лиофилиза- цию.

выход 12,4 г (75%). 0,39- 0,47. -13Г (с 1, вода).

Вычислено, %: С 46,07| Н 7,13; N 15,35; S 5,12.

С,,Н520зНб 7/8 () - 2,5 () (547,37)

Найдено, %;С46,4;Н7,2; N 15,05; S 5,0. ,

Исходные вещества получают следующим образом,

Ы-Бензилоксикарбонил-К-метил-В- фенилаланин-Ь-пролин.

Стади А. 2,4,5-Трихлорфенило- вый эфир бензилоксикарбонил-В-фенил- аланина.

60,0 г (0,2 моль) бензилоксикар- бонил-В-фенилаланина и 39,4 г (0,2 моль) 2,4,5-трихлорфенола раствор ют в 200 мл тетрагидрофурана, раствор охлаждают до 5-10 С, после чего охлажденный раствор при перемешивании смещивают приблизительно в течение 30 мин с 41,2 г (0,2 моль) дициклогексилкарбодиимида, затем реакционную .перемешивают в течение 6 ч без охлаждени . Выделившийс в осадок дициклогексилкарба- мид отфильтровывают, три раза промывают его тетрагидрофураном, примен каждый раз по 50 мл последнего , и объединенные тетрагидрофура- новые растворы упаривают в вакууме. Полученный остаток перекристаллизо- вывают из гор чего этилового спирта кристаллический продукт отфильтровывают , два раза прбмывают при 5-10°С этиловым спиртом, примен каждый

0

5

0

5

0

5

0

5

0

139Д1 метил3 ,79;

раз по 50 мл последнего, и сушат в вакуум-эксикаторе.

Выход 72 г (75%) , т. пл. 141°С. +37° (с 1 формамид),

Вычислено, %: С 57,70; Н N 2,92; С1 22,22.

(478,75) Найдено, %: С 57,7; Н 3,9; N 3,0; С1 22,2.

Стади В. Бензилоксикарбонил-D- -фенилаланин-Ь-пролин.

71,8 г (0,15 моль) 2,4,5-трихлор- фенилового эфира бензилоксикарбо- нил-С-фенилаланина (пример 1, стади А) раствор ют при перемешивании и комнатной температуре в 180 мл безводного пиридина, а затем приготовленный раствор смешивают с 17,3 г (0,15 мо ль) L-пролина и 21,0 мл (0,15 моль)триэтиламина. Перемешивание продолжают до полного растворе-, ни L-пролина. Затем реакционную смесь вьздерживают в течение 4-6 ч, непосредственно после этого ее упаривают до объема 80-100 мл на вод ной бане при температуре, составл ющей максимум 40°С, и давлении 13- 20 мбар, после чего остаток смешивают с 250 мл воды и 90 мл диэтило- вого эфира. Водную фазу два раза экстрагируют диэтиловым эфиром, примен каждый раз по 30 мл последнего , объединенные эфирные растворы два раза промывают 5%-ным раствором кислого углекислого натри , приме- ; н каждый раз по 30 мл этого раствора , а затем объединенные водные . растворы подкисл ют до рН 2 посредством прибавлени 3 н. раствора сол ной кислоты. Выделившеес в осадок маслообразное вещество три раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, примен каждый раз -по 120 мл последнего, объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты три раза промывают водой, примен каждый раз по 40 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на вод ной бане до 50-100 мл при температуре, составл ющей максимум 40°С, и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток перекристаллизовыва 5 ют из 200 мл диэтилового эфира.

Кристаллический продукт отфильтро- Бывают, два раза промывают диэтиловым эфиром, примен каждый раз по

7

АО мл последнего, и сушат хе.

Выход 50,4.г (85%). Т. 133°C. -46,4 (с тилформамид). R р 0,5.

Вычислено, %: С 66,65; N 7,07

(396,43)

Найдено, %: С 66,4; Н 6,25, N 7,2.

Стади С. Циклоге ксиламмонийна соль К-бензилоксикарбонил-Н-метил- -В-фенилаланин-Ь-пролина.

39,6 г (0,1 моль) бензилоксикар- .бонил-В-фенилаланин-Ъ-пролина (пример 1, стади В) и 50 мл (0,8 моль) йодистого метила раствор ют в 300 мл безводного тетрагидро фурана. Приго- товленньш раствор охлаждают до О С, после чего при перемешивании при-, бавл ют к нему порци ми 13,2 г (0,3 моль) гидрида натри , причем количество порций составл ет 8-10, затем перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение 2 ч. Непосредственно после этого к реакционной смеси прибавл ют 500 мл этилового эфира уксусной кислоты с целью .разложени образовавшейс гидроокиси натри , и дополнительно осторожно прибавл ют еще 10 мл воды дл разложени избыточного количества гидрида натри . Затем раствор упаривают на вод ной бане при температуре составл ющей максимум 40°С, и давлении 15-20 мбар. Остаток раствор ют в 250 мл воды и 100 мл диэтилового эфира, водную фазу промывают 100 мл диэтилового эфира, после чего объединенные эфирные растворы промывают 50 мл 5%-ного раствора кислого углекислого натри . Раствор кислого углекислого натри и водную фазу объедин ют , подкисл ют прибавлением 5 н. раствора сернокислого кали до рН 2, а затем два раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, примен каждый раз по 150 мл последнего. Объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты поН следовательно промывают 100 мл воды, 50 мл 10%-ного раствора тиосульфата натри , повторно 100 мл воды, сушат органическую фазу над безводным сер нокислым натрием, а затем упаривают на вод ной бане при температуре, составл нщей максимум , и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток

5

0

5

раствор ют в 600 мл бензола, раствор смешивают с 12 мл (0,105 моль) цик- логексиламина, после чего смесь выдерживают в течение ночи при комнат- ной температуре, Выделившийс в осадок кристаллический продукт отфильтровывают , два раза промывают бензолом , примен каждый раз по 200 мл п последнего, и затем сушат в вакуум- эксикаторе над парафиновыми стружками .

Выход 38,2 г (75%). R 0,53- 0,60 (циклогексиламин 0,01-0,05). Т. пл. 160-163°С. Г«( 7д +12,1° (с 1., метиловый спирт) .

Вычислено, %: С 68,34; Н 7,71; N 8,25.

C23H2f05-N2-Cj,H,3N (509,63).

Найдено, %: С 68,5; Н 7,8; N 8,3..

N -трет-Бутилоксикарбонил-N -бен- зилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактам.

Стади Д. Гидрат N-трет-бутилок- сикарбонил-К -бензилоксикарбонил-Ь- аргинина,

65,8 г (0,2 моль) гидрата хлор- гидрата трет бутилоксик арбонил-Ь-аргинина раствор ют в 100 мл 4 н. раствора гидроокиси натри , приготовленный раствор охлаждают до 5- , затем при перемешивании его смешивают с 80 мл (0,5 моль) бензил- оксикарбонилхлорида и с мл 4 н, раствора гидроокиси натри так, чтобы значение рН раствора было выше 12. Непосредственно после этого ре акционную смесь дополнительно перемешивают в течение 3-4 ч, затем разбавл ют ее прибавлением 150 мл воды, после чего п эоизвод т экстрагирование 100 мл диэтилового эфира. Образовывалось три фазы. Две нижние фазы еще два раза промывают диэтиловым эфиром, примен каждый раз по 100 мл последнего, смешивают с 300- 400 мл метилового спирта дл того, чтобы гомогенизировать фазы, после чего значение рН раствора, если необходимо , довод т до 12 (прибавле- 0 .нием 4 н. раствора гидроокиси натри ) . Раствор выдерживают в течение 6-8 ч, а затем его два раза экстрагируют смесью диэтилового эфира уксусной кислоты и петролейного эфи- 5 ра, вз тых в соотношении 1:1, значение рН прибавлением лед ной уксусной кислоты довод т до 6-7 (прибли- ;зительно 50 мл), три раза производ т

0

5

0

5

экстрагирование хлористым метиленом, примен каждый раз по 140 мл последнего . Растворы продукта в хлористом метилене объедин ют, два раза промывают водой, примен каждый раз по 60 мл последней, а затем упаривают на вод ной бане при и- давлении 25-30 мбар. Полученный остаток смешивают с 300 мл бензола и.600 мл смесь в течение 2-3 ч переме20°С , затем вьщерживают в течение ночи при . Выделившийс в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, промывают последовательно 300 мл воды и 300 мл бензола , после чего сушат в вакуум-эксикаторе над п тиокисью фосфора и дарафиновыми стружками.

Выход 60 г (70%). Т. пл. 122- 124 С. -20 7° (с 1, пиридин ) . .

воды, шивают при

С 53,51; Н 7,09;

gH280 N4-H20 (426,46)

С 53,35; Н 7,2;

Вычислено, 13,14. С

IV.

Найдено, % 13,1.

Стади Е. N тpeт-Бyтилoкcикapбo- нил-lSn-бeнзилoкcикapбoнил-L-apгининлактам .

59,7 г ,( моль) гидрата N - трет-бутилоксикарбонил-Ы -бензилок сикарбонил-Ь-аргинина :(пример 1 , - стади Д) и 19,6 г (0,14 моль) три- этиламина раствор ют в 200 мл тетра- гидрофуран а. Приготовленный раствор охлаждают до -10°С, после чего при указанной температуре и при перемешивании его смешивают сначала с 18,5 мл (0,14 моль) изобутилокси- карбонилхлорнда, а затем через 10 мин с 19,6 мл (0,14 моль) три- .этиламина. Реакционную, сме.сь перемешивают в течение 1 ч при 0°С и еще в течение 1 ч без охлаждени , причем после завершени перемешивани смесь выливают в 1 л лед ной воды. Выделившийс в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают его лед ной водой , примен каждьш раз по 100 мл последней, и непосредственно после этого раствор ют в 280 мл хлороформ Хлороформный раст.вор промывают 100 мл лед ной воды, сушат над безводным кальцием и при температуре максимум 40°С и да влении 20-25 мбар упаривают -на вод ной бане. Кристал-

38420310

лический остаток суспендируют в 70 мл петролейного эфира, продукт отфильтровывают, два раза промывают петролейным эфиром, примен каждый раз по 30 мл последнего, и сушат в вакуум-эксикаторе над п тиокисью фосфора.

Выход 44 г (81%) . Т пл. 164- 166°С. -24° (с 1, тетра- гидрофуран).

%: С 58,44; Н .6,71;

10

15

20

25

30

40

35

45

50

55

N

. (390,43)

С 58,7; Н 6,8;

Вычислено, .14,45.

С„Нг,0,гМ.

Найдено,- %; 14,1.

Пример 2. Сульфат N-этил- -В-фёнилаланин-Ъ-пролил-Ь-аргинин- альдегида.

Стади 1. N-Бензилоксикарбонил- . -К-этил-Ь-фенилаланин-Ь-пролил-Н - -бензилоксикарбонил-Ъ-аргинин-лак- там. . .

2,1 г (0,005 моль) N-бензилокси- карбонил-Ы-этил-В-фенилаланин-Ь-про- лина и 2,15 г (0,0055 моль) N -трет- .-бутилоксикарбонил-N -бензилоксикар- бонил-Ъ-аргинин-лактама (пример 1, стади Е) ввод т во взаимодействие или в реакцию конденсации (по способу , описанному в примере I, стади 1) , при применении пропорциональных количеств реагента и растворителей; При обработке реакционной смеси и во врем хроматографии на колонке фракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое .при применении в качестве элюирующего средства смеси бензола и толуола (8:2). Фракции, которые содержат чистый основной продукт (Rр 0,4-0,5), объедин ют , упаривают на вод ной бане . при температуре 40 С и давлении 15- 20 мбар, остаток обрабатывают диизо- пропиловым эфиром, отфильтровывают, промьшают диизопропцловым эфиром и сушат в ваку ум-эксикаторе над серной кислотой и парафиновыми стружками.

Выход 1,9 г (54%). Rj. 0,75- 0,85.

Стади 2. N-Бензилоксикарбонил- К-этил-В-фенилаланин-Ь-пролил-К - -бензилоксикарбонил-Ь-аргининальде- гид. .

1,4 г (0,02 моль) N-бензилокси- карбонил-К-этил-В-фенилаланин-Ь-про- лил-к -б бнзилоксикарбонил-Ь-аргинин- лактама (пример 2, стади 1) ввод т во взаимодействие аналогично приме-

ру 1, стади 2, при применении пропорциональных количеств реагентов.

Выход 1,15 г (72%) продукта, который в соответствии ,с данными элементного анализа содержит 1 моль

циклогексана.

содержит RF

0,55-0,65. С 67,49; Н 7,47;

3,5 (Н)

10

25

30

Вычислено, N 10,73.

CjeH4607N6 CgH,2(782,95)

Найдено, %: С 67,6; Н 7,5; N 10,5.

Стади 3. Сульфат К-этил-В-фенил- аланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида.

0,78 г (0,001 моль) N-бензилокси- 15 карбонил-К-этил-В-фенилаланин-Ъ-про- лил-N -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин- альдегида (пример 2, стади 2) ввод т во взаимодействие аналогично примеру 1, стади 3, при применении 20 пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

Выход 0,75 г (70%). Rp 0,4-0,5.

Вычислено, %: С 45,93; Н 7,48; N 14,61; S 4,64. С25Нз40зНй- 5/6 () (573,27).

Найдено, %:С46,1;Н7,6; N 14,2; S 4,6.

Исходное соединение, а именно N-бeнзилoкcикapбoнил-N-этил-D-фeнил- аланин-Ь-пролин, может быть получено следующим образом. .

Стади А. К-этил-В-фенилаланин.

8,25 г (0,05 моль) D-фенилалани- на раствор ют в 100 мл 20%-ного водного этилового спирта. Приготовленный раствор смешивают с 5,65 мл (0,1 моль) уксусного альдегида и 2 г 10%-ного паллади на угле, примененного в качестве катализатора, после-чего в течение 2 дн. прои:зво- д т гидрирование. Затем катализатор отфильтровывают, промывают его 60.мл 2 Н, раствора сол ной кислоты, после чего рЛ водного раствора довод т до значени 7 посредством прибавле- ни 4 к. раствора гидроокиси натри , Бьщелившийс в осадок продукт отфильтровывают , три раза промывают, водой, примен каждый раз по 20 мл последней, и сушат в вакуум-эксикаторе над безводным хлористым кальцием .

Выход 4,85 г (50%). -53° (с 1,.0,1 Н. раствор гидроокиси натри ),

Вычислено, %: С 68,37; Н 7,82; N 7,25.

35

40

45

50

55

0

5

0

5 0

5

0

5

0

5

C,,H,,0,N (193,24)

Найдено, %: С 68,5; Н 7,65; N 7,2.

Стади В. N-Бензилоксикарбонил- -N-этил-D-фeнилaлaнин.

2,9 г (0,015 моль) Ы-этил-В-фе- нилаланина (пример 2, стади А) раствор ют в 22,5 мл 2 Н. раствора гидроокиси натри . Приготовленный раствор смешивают сначала с 10 мл диок- сана, а затем после охлаждени до 5-10°С с 2,5 мл (приблизительно 0,017 ) бензилоксикарбонилхлори- да, после чего реакционную смесь перемешивают при охлаждении в течение 3 ч. После этого реакционную смесь разбавл ют прибавлением 40 мл воды, а затем производ т экстрагирование 30 мл смеси, состо щей из диэтилово- го эфира и петролейного эфира в соотношении 1:1. В результате получают трехфазную систему. Две нижние фазы вновь экстрагируют 300 мл ди- этилового эфира, и объединенные водные фазы подкисл ют 1 н. раствором серной кислоты (рН 2). Выделившийс в осадок продукт три раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты , примен каждый раз по 30 мл последнего. Растворы продукта в этиловом эфире- уксусной кислоты объедин ют , два раза промывают водой, которую каждый раз берут в количестве 20 МЛ-, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают затем на вод ной бане при температуре, сос- .тавл ющей максимзад 40°С, и давлении 15-20 мбар.о

Выход 2,7 г (55%) маслообразного продукта. RP 0,5-0,6.

Стади С. N-бензилоксикарбонил- -N-этил-B-фeнилaлaнин-L-пpoлин.

2,6 г (0,008 моль) N-бензилокси- .карбонил -К-этил-В-фенила ланина (пример 2, стади 2) раствор ют в 10 мл тетрагидрофурана. Приготовленный раствор при 0°С смешивают с 1,6 г (0,008 моль) 2,4,5-трихлорфенола и 1,65 г (0,008 моль) дициклогексил- карбодиимида, после чего реакционную смесь выдерживают в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь фильтруют и фильтрат упаривают на вод ной бане при температуре максимум 40°С и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток раствор ют в 40 мл бензола, раствор промывают два раза 5%-ным раствором

15

20

кислого углекислого натри , примен каждый раз по 20 мл этого раствора, два раза водой, которую каждый раз берут в количестве 20 мл. Непосредственно после этого раствор сушат над сернокислым натрием и затем упаивают на вод ной бане при температуре максимум 40°С и давлении 15- 20 мбар. Маслообразный остаток раст- Q вор ют в 10 МП пиридина, раст- вор смешивают сначала с 0,92 г (0,008 моль) ,Ь-пролина, затем С; 1,12 МП (0,008 моль) триэтиламина,: после чего реакционную смесь перемеивают при комнатной температуре до олного растворени L-пролина. Раствор выдерживают JB течение 4-5 ч и непосредственно после этого упари- на, вод ной бане при температуре максимум и давлении 15- ;; 20 мбар. Полученный остаток раствор ют в 25 мл воды и 10 мл дизтилово- го эфира, водную фазу два раза промывают диэтиловым эфиром 5 примен 25 каждый раз по .10 мл последнего, а- объединённые эфирные-растворы два раза промывают 5%-ным раствором кислого углекислого натри , причем каждый раз примен ют по 10 мл этого раствора. Объединенные водные фазы подкисл ют до рН 2 посредством при- , бавлени 3 н. раствора сол ной кислоты . Выделившийс в осадок продукт три раза экстрагируют бензолом, примен каждый раз по 15.мл последне- го, объединенные бензольные экстракты трижды промывают водой, которую вс кий раз берут в количестве 5 мл, сушат над безводным сернокислым натрием и затем упаривают на вод ной бане при и давлении 15-20 мбар.

Выход 2,2 г (64%) маслообразного продукта. RP 0,5-0,6.

П р и м е р 3. Сульфат N-изобу- тил-В-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-арги- нинальдегида.

Стади 1, N-Бензилоксикарбонил- -Н-изобутил-В-фенилапанин-Ъ-пролил- -N -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин- . лактам. 2 ,26 г (0,005 моль) N-бензилок-; сикарбонил-К-изобутил-р-фенилала- нин-Ь-пролина и N -трет-бутил-окси- карбонил-N -бензилоксикарбонил-L-ap- гинин-лактама (пример 1, стади Е) 55 ввод т во взаимодействие или в реакцию конденсации аналогично примеру 1, при применении пропорциональных ко30

35

40

45

50

0

5

0

5

0

5

0

лич еств реагентов и растворителей. . При обработке реакционной смеси и в процессе хроматографии на колонке- фракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое в смеси растворителей , состо щей из ЭТИЛ.ОВОГО эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 480:20:6:11, и фракции, которые содержат чистый продукт с R p 0,75-0,85, объедин ют . Затем эти фракции упаривают на вод ной бане при 40°С и при давлении 15-20 мбар, полученный остаток . обрабатывают петролейным эфиром, отфильтровывают , .продукт промывают петролейным эфиром и сушат в вакуум- эксикаторе нал парафиновыми стружками .-.

Выход 2,7 г (75%). RP 0,75-0,85, J 5,8 (с , тетрагидро- фуран).

Вычислено, %: С 66,30; Н 6,95-; N 10,87.

C4oH4gO,N,-2/3 (C4HgO) (772,90)

Найдено, %: С 65,0; Н 6,8; N 10,80.

Стади 2. N-бензилоксикарбонил- -N-изоб утил-D-фенилаланин-L-пролил- -N -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин- альдегйд,

1,45 г (0,002 моль) N-бензилокси-, карбонил-Ы- изобутил-В- фенилаланин -L-nponkn-N -бензилоксикарбонил-Ь аргинйн лактама ; (пример 3, стади 1) ;восстанавливают аналогично примеру 1, стади 2, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

Выход 1,0 г (62%). RP 0,24. С.) +2,3° (с .Г, тетрагидрофуран) .

Вычислено, %: С 66,64; Н 7,14; N11,24.

C4flHj 0, () (747,89).

Найдено, %: С 66,3; Н 7,1; N 11,2.

Стади 3. Сульфат N-изoбyтил-D- фенилаланин Ь-пролил-Ь аргининаль- ; - дегида.

0,81 г (0,001 моль) N-бензилоксиг карбонил-Ы изобутил-В фенилаланин- -Ъ-пролил-к -бензилоксикарбонил-Ь- аргининальдегида (пример 3, стади 2) ввод т во взаимодействие ана- логично примеру 1, стади 3, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

Выход 0,45 г (80%), RF 1 0,64.

Вычислено, %: С 45,.84; Н 7,69; N 13,36; S 5,1.

Сз,НзвО,Ы, HjS04 4 СН,0) (628,74)

Найдено, %: С 45,8; Н 7,2; N 13,4; S 4,9.

Исходное соединение, а именно К-бензилоксикарбонил-К-изобутил-В- -фенилаланин Ь-пролин, может быть получено следующим образом.

Стади А. N-Изобутил-D-фенилала нин.

В качестве исходного вещества примен ют 8,25 г (0,05 моль) D-фе- нилаланина и осуществл ют способ аналогично примеру 2, стади А, с тем отличием, что вместо уксусного альдегида примен ют 9,1 мл (0,1 мол изомасл ного альдегида.

Выход 8,7 г (70%), -29,9° (с 1, 0,1 Н. раствор гидроокиси натри ).

Вычислено, N 6,08.

%: С 67,79; Н 8,75;

;,jH;,

N

1/2 () (230,30) %: С 67,2; Н 8,9;

Найдено, 6,15.

Стади В, Ы-Бензилоксикарбонил- . -N-и.зoбyтил-D-фeнилaлaнин.

3,32 г (0,015 моль) N-изобутил- П-фенилаланина (пример 3, стади А) ввод т во взаимодействие аналогично примеру 2, стади В.

Выход 3,2 г (60%) маслообразного продукта. RP 0,6-0,7. .

Стади С. N-Бензилоксикарбонил- -Ы-изобутил-В-фенилаланин-Ь пролин.

2,85 г (0,008 моль) N-бензилокси- кapбDншlN-изoбyтил-D-фeнилaлaнинa (пример 3, стади В) ввод т во взаимодействие аналогично примеру 2, стади С-.

Выход 2,45 г (67%) маслообразно- то продукта, RP 0,65-0,70.

Провод т биологические испытани производных пептидил-аргининальдеги- дов, полученных в услови х предлагаемого способа.

При проведении специальных исследований пептиды раствор ют в воде (рН 6,0) в концентраци х 10 мг/см, после чего растворы хран т при 40°С В течение 5 дн. наблюдают за изменением антитромбиновой активности растворенного вещества. Характеризующее активность значение определ ют в системе, котора состо ла из

следующих составных частей, см

3.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

0,5%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли 0,2; буферный раствор, содержащий трис-(оксиметил)-аминоме- тан и хлористый водород (значение рН 7,2), который также содержит раствор исследуемого пептида, 0,3; 5 ед./см раствора US Standard Human Thrombin (NIH, Бетезда, Мэриленд, CIUA) ,0,1.

Врем свертывани этой системы без добавки пептида составл ло в приборе Schnither Gross Coagulomefer 15 с.

Начальную- тормоз щую свертывание крови активность отдельных сульфатов трипептид-альдегидов обозначают такой мол рной концентрацией, котора в сравнений с контрольным опытом вызывает п тикратное удлинение . времени свертывани (1 д-значение) .

Измеренные на первые, третьи и п тые сутки антитромбиновой активности отдельных пептидов в водном растворе при рН 6,0 и -40°С от начальной активности (нулевые сутки) и приведены в табл. 1.

В течение периода наблюдени начальна активность сульфата D-фенил- аланин-Ь-пролилг-Ь-аргининальдегида уменьщаетс в два раза, в то врем как N-метильное производное сохран ет свою первоначальную активность, а активность N-этильного и N-изобу- тильного соединений уменьшаетс лишь

на 15-20%. В услови х проведени 1

опытов следует считатьс с частичной рецемизацией наход щегос на конце молекулы L-аргининальдегида. Именно этим может быть объ снено незначительное падение активности N-этильного или N-изобутильного про- изводного.

Действие N-алкилтрипептидапьдеги- дов на плазминфибриновую реакцию также исследуют и определ ют на примере сульфата Ы-метил-В-фенилала- нин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида в следующей системе, 0,05%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0, растворе поваренной соли ,0,2; содержащего трис-(оксиметил)- аминометан и хлористый водород буферного раствора (значение рН 7,2) ко- :торый также содержит исследуемый пептид 0,1; раствор US Standard Human Thrombin (NIH) Бетезда, Мэриленд , США/ 10 ед./см 0,1; 0,1 ед.

плазмина в 0,1 мл буферного раствора (KABI, Стокгольм, Швеци ).

Врем свертывани образовавшегос в системе фибринозного гел без добавлени пептида 10 мин,

В качестве контрольного соединени примен ют сульфат D-фенилала- нин-Ь-пролил-Ъ-аргининальдегида, а также гемисульфат трет-бутилокси- . карбонил-В-фенилаланин-Ь-пролил-Ь- -аргининапьдегида.

Действие трипептидальдегидов на плазминфибриновую реакцию показано в табл. 2 (врем растворени фибринозных сгустков без добавлени пептида 10 мин). ..

Из приведенных в табл. 2 данных видно, что N-алкилированный трипеп- тидальдегид ведет себ как известный , содержащий свободную расположенную на конце аминогруппу. При малых количествах образовавшиес сгустки раствор ютс в течение контрольного времени, при больших количествах сгустки либо вообще не образуютс , либо образуютс со слабой гелевой структурой. Одновременно гемисульфат ацилтрипептидапьдегида в зависимости от концентрации удлин ет врем гидролиза плазмина фибринозных сгустков.

Из описанных исследований следует , что новые трипептидальдегиды с апкилирова нными концевыми амйногруп пами обладают.значительно большей стабильностью, чем известный сульфат С-феншталанин-Ь-пролил-Ь-арги- нинальдегида, но одновременно они представл ют собой аналогичные селективные замедлители свертывани , поскольку они не оказывают вли ни на плазминфибриновую реакцию.

Новые N-алкилтрипептидальдегиды предлагаемой формулы обладают in vivo значительной тормоз щей свертывание крови активностью. При проведении исследований пептиды ввод т внутрь через рот или внутривенно новозеландским зайцам (вес 2-3 кг), причем пептиды ввод т в физиологическом растворе соли. При внутривенном введении, в течение 3 ч вливани с дозами 0,5-2,0 мг/кг/ч введени производ т со скоростью 6 мл/ Через рот ввод т внутрь 20-30 мг/кг пептида, растворенного в объеме ,2 мл. После введени с интервалами в 30 мин из каудальной вены отбира

ют пробы крови, после чего в тромбо- эластографе определ ют врем свертывани всей крови, одновременно также измер ют врем плазма-тромбиновой реакции.

Тормоз щее свертывание в живом организме действие. N-алкилтрипептидальдегидов в опытах на самцах новозеландского зайца показано в табл. 3. Приведенные в- табл. 3 данные показывают , что N-алкилтрипептидальдегиды обладают равной или близкой активностью по сравнению с веществом , примененным дл сравнени .

На основании исследований по внутривенному вливанию, осуществленных на зайцах, установлена доза дл человека при внутривенном введении, составл юща 1-2 мг/кг/ч.

Проведенные испытани показывают , что N-алкильные (С .,-04)-производные сульфатов пептидилальдеги- дов в течение периода наблюдени незначительно тер ют свою первоначальную активность (N-зтильные и N-изо- бутильные производные тер ют активность на 15-20%), в то врем как соединение сравнени дезактивируетс за этот период на 60%.

. Кроме того, новые трипептидальде- гиды с алкилированными концевыми аминогруппами более стабильны, чем известный сульфат В-фенилаланин-Ь- пролил-L-аргининальдегида, но одновременно они представл ют собой аналогичные селективные замедлители свертывани , поскольку при эффективном торможении тромбин-фибриногено- вой реакции они не оказывают вли ни на плазминфибриновую реакцию.

Claims

Формула изобретени

Способ получени сульфатов пеп- тидил-аргининальдегидов общей формулы

5

0

R

1

В

DPhe-ppo-A-H-HoSO,

2

где

R. R водород;

С,-С4 алкил, причем R., и R

присоединены к аминогруппе

D-фенилаланина; А - остаток L-аргинина, отличающийс тем, что аргинин-лактам с защищенной гуаниди- новой группой конденсируют с защищенным по концевой аминогруппе ди- пептидом К-моноалкил()-Ь-проли- ном, полученный защищенный трипеп- тидлактам восстанавливают до соответствующего трипептидальдегида и после отщеплени защитной группы целевые продукты выдел ют в виде соли.

Сульфат N мeтил-D- -фенилаланин-Ъ-про лил-Ь-аргининальдегида

Сульфат Ы-этил-В- -фенилаланин-Ь-пролил -L-аргининальдегида 0,21

Сульфат N-изобутил- -В-фенилаланин-Ь- -пролил-Ъ аргинин- альдегида

Сульфат D-фенилала- нин-Ь-пролил-Ь-арги- нинальдегида (вещество дл сравнени ) 0,35

Концентраци пептида в реакционной смеси ((UM) j котора в сравнении с контрольным опытом вызывает п тикратное удлинение времени свертывани .

Таблиц

0,25 100

100

100

100

100

100

100

85

0,31

100 100

85

80

100

100

50

40

Таблица 2

2,l-)

:I

Сульфат D-фенилаланин-

-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида

Гемисульфат трет-бутил оксикарбонил-В-фенилаланин-Ъ-пролил-Ь-аргинин-

альдегида

Врем растворени нельз слабую структуру

г

Т

Трипептидальдегид

Сульфат N-метил-D-фенилаланин-Ь-пролил-Ъ-аргининальдегида

Сульфат К-этил

-D-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-арги

нинальдегида

Сульфат N-изобутил-В-фенилаланин-Ъ-пролил-Ь-аргининальдегида

Сульфат D-фенилала- нин-Ь-пролил-Ь-арги нйнальдегида (вещество дл сравнени )