KR20040062942A

KR20040062942A - 파종성혈관내응고를 치료하기 위한 펩티드 아르기날 및 방법

Info

Publication number: KR20040062942A
Application number: KR10-2004-7002553A
Authority: KR
Inventors: 버유스선도르
Original assignee: 아이박스 드럭 리서치 인스티튜트 리미티드
Priority date: 2001-08-21
Filing date: 2002-08-21
Publication date: 2004-07-09
Also published as: AU2002331654B2; CN1302776C; SK1112004A3; MXPA04001534A; WO2003016273A2; PL368464A1; CN1607949A; IL160488A0; CA2457436A1; CZ2004265A3; EP1425009A4; BR0212122A; JP4230908B2; EP1425009A2; HUP0401312A2; RU2312856C2; JP2005502657A; US20050070480A1; NZ531315A; HUP0401312A3

Abstract

본 발명은 파종성혈관내응고(DIC)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 파종성혈관내응고에 대한 의학적 중재에 관한 것이다. 본 발명은 DIC 를 치료하기 위한 신규한 펩티드 아르기날, 신규하고 우수한 화합물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 화합물 및 방법은 응괴 - 결합 트롬빈 및 Xa 인자에 저해 작용을 가지며, 또한 플라스민과 플라스미노겐 활성화인자에 대해서도 저해적이다.

Description

파종성혈관내응고를 치료하기 위한 펩티드 아르기날 및 방법{PEPTIDE ARGINALS AND METHODS FOR TREATING DISSEMINATED INTRAVASCULAR COAGULATION}

기술분야

본 발명은 파종성혈관내응고에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 파종성혈관내응고에 대한 의학적 중재에 관한 것이다.

관련 분야의 요약

파종성혈관내응고(이하에서는 DIC 라고 명명함)는 2 차 질환이며 다수의 1 차 질환 중 하나의 결과이다[Bick, Disseminated Intravascular Coagulation 및 Related Syndromes, CRC Press, Boca Raton,(1983) 참조하라]. 이것의 특징 중 하나는 혈액 응고의 체계적인 활성이고, 상기 혈액 응고로 인해 피브린이 생성 및 침착되고, 여러 기관에 미소혈관계 혈전이 유도되며 여러 기관의 파손의 발생을 야기한다. Bick 등의 Clin. Appl Thrombosis Hemostasis 1 : 3 - 23(1995) 문헌에는, DIC 의 또다른 특징으로서 전신성 순환 플라스민이 있으며, 다양한 혈장 단백질(인자, 호르몬등)을 생분해할 수 있고 피브리노겐/피브린 분해 산물을 수득하기 위해 피브리노겐/피브린을 분열시킬 수 있는 전체적인 단백질가수분해효소에 관해 기재되어 있다. 이러한 산물은 지혈을 악화시키고 출혈을 야기한다.

DIC 의 가장 심각한 임상형태로는 응고 단백질의 광범위한 소비, 피브린의 현저한 침착 및 출혈이 특징적이다.

외상 환자들은 DIC 에 대한 위험에 노출되어 있으며, 특히 조직 손상(특히 뇌)의 영역이 광범위하고 패혈증 및 다발성 기관 파손(multiple organ failure)의 경우에 DIC 의 증가된 위험에 노출된다. 뇌의 높은 트롬보플라스틴 함량과 총 체표면적에 대하여 비례적으로 머리 표면적의 증가된 비율때문에 유아 및 아동들에게 있어 머리 손상은 특히 DIC 의 주요 원인이 된다.

패혈증은 모든 외상 환자들 중 약 40 % 에서 발생하고 모든 환자들에서 DIC 의 중요한 1 차 원인이 된다. 임상적 증상은 2 차 피브린용해에 의해 더 악화되어 정상의 피브린 형성 및 혈소판 기능을 방해하는 "D - 이량체" 또는 FDP's(피브리노겐/피브린 분해 산물)의 형성을 초래한다.

DIC 에서 피브린 침착은 또다른 기관의 기능부전을 초래할 수 있다. DIC 는 급성 신부전의 주요 원인이며 또한 다발성계 기관 파손의 원인이기도 하다. 손상된 기관이 DIC 의 원인이 되는 역 또한 성립한다.

현재 DIC 에 유일하게 허용되는 치료는 1 차 장애를 경감시키려는 시도에 국한되어 있다. 치료의 형태가 출혈이나 혈전 문제를 고치는데 주력한다 하더라도 이를 억제하지 않는다면, DIC 는 계속 진행될 것이다. 상당한 출혈이 존재하는 몇몇 경우에서, 1 차 문제가 억제될때까지 치료를 대신하여 냉동된 신선한 혈장, 혈장 성분(예를 들어, 항트롬빈 Ⅲ) 냉동침강물 및/또는 혈소판 농축물은 유용할 것이나, 이러한 치료는 엄청난 비용이 든다. DIC 에서 헤파린 사용은 상당한 논쟁의 여지가 존재하며 외상의 문제가 있는 환자에게 일반적으로 사용하지 않는다.

그러므로, DIC 를 치료하기 위한 신규하고 우수한 화합물 및 방법이 필요하다[또한, 예를 들어, de Jonge 등의 Drugs 55 : 767 - 777(1998) 및 Levi 등의 Thrombosis 및 Haemostasis 82 : 695(1999) 참조하라].

발명의 간단한 요약

본 발명은 DIC 를 치료하기 위한 신규하고 우수한 화합물 및 방법을 제공한다. 놀랍게도 유리(free) 및 응괴 - 결합 트롬빈 및 Xa 인자에 저해 작용을 가지며, 또한 플라스민과 플라스미노겐 활성화인자에 대하여 저해적인 이러한 항응고성 화합물이 DIC 치료에 유용하다는 것이 밝혀졌다.

첫 번째 양상에서, 본 발명은 다음 화학식 Ⅰ 의 펩티딜 아르기날(peptidyl arginal) 및 유기산 또는 무기산으로 형성된 이의 산 - 부가 염을 포함하는 물질로 이루어진 조성물을 제공한다.

Xaa - Xbb - Arg - H

이 식에서, Xaa 는 다음 화학식 Ⅱ 의 α - 치환된 탄산 잔기를 나타내고,

Q - CH(R) - CO

이 식에서, Q 는 C_1-3알킬옥시카르보닐아미노기, 메틸아미노기, 또는히드록시기를 나타내고,

R 은 C_7-9시클로알킬메틸기, 또는 C_5-7시클로알킬기, 또는 1 - 아다만틸메틸기를 나타내며,

Xbb 는 L - 프롤린 또는 L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산 잔기를 나타낸다.

특별히 바람직한 실시형태에서, 상기 화합물은 다음의 화학식을 갖는다 :1(에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드, Eoc - D - cHpa - Pro - Arg - H), 또는2(N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드, N - Me - D - cHpa - Pro - Arg - H), 또는3(D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드, D - cHpl - Pro - Arg - H), 또는4(N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드, N - Me - D- Chg - Aze - Arg - H), 이러한 화학식은 화학식 Ⅰ 과 상응하며 화학식 Ⅰ 에서, Xaa 는 화학식 Ⅱ 의 α - 치환된 알킬 탄산 잔기를 나타내고, 화학식 Ⅱ 에서 R 은 시클로헵틸메틸과 시클로헥실기를 각각 나타내며, Q 는 에톡시카르보닐아미노, 메틸아미노 및 히드록시기를 각각 나타내고 Xbb 는 L - 프롤린 및 L - 아제티딘일 - 2 - 카르복시산 각각을 나타낸다.

두 번째 양상에서, 본 발명은 항응고성 펩티딜 아르기날 또는 본 발명의 첫 번째 양상에 따른 약학적으로 용인가능한 이의 염 및 약학적으로 용인가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

세 번째 양상에서, 본 발명은 파종성혈관내응고를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 화학식 Ⅰ 에 상당하는 항응고성 펩티딜 아르기날 또는 약학적으로 용인가능한 이의 산 - 부가 염을 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함한다 :

화학식 Ⅰ

Xaa - Xbb - Arg - H

화학식 Ⅱ

Q - CH(R) - CO

이 식에서, Q 는 C_1-3알킬옥시카르보닐아미노기, 메틸아미노기, 또는 히드록시기를 나타내고,

R 은 C_7-9시클로알킬메틸기, 또는 1 - 아다만틸메틸기, 또는 C_5-7시클로알킬기를 나타내며,

Xbb 는 L - 프롤린 또는 아제티딘 - 2 - 카르복시산 잔기를 나타낸다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 화합물은 다음의 화학식을 갖는다 :1(에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드, Eoc - D - cHpa - Pro - Arg - H), 또는2(N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드, N - Me - D - cHpa - Pro - Arg - H), 또는3(D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드, D - cHpl - Pro - Arg - H), 또는4(N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드, N - Me - D- Chg - Aze - Arg - H). 이러한 화학식은 화학식 Ⅰ 과 상응하며 화학식 Ⅰ 에서, Xaa 는 화학식 Ⅱ 의 α - 치환된 알킬 탄산 잔기를 나타내고, 화학식 Ⅱ 에서 R 은 시클로헵틸메틸과 시클로헥실기를 각각 나타내며, Q 는 에톡시카르보닐아미노, 메틸아미노 및 히드록시기를 각각 나타내고, Xbb 는 L - 프롤린 및 L - 아제티딘일 - 2 - 카르복시산 각각을 나타낸다.

화학식 1

화학식 2

화학식 3

화학식 4

본 발명은 파종성혈관내응고에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 파종성혈관내응고에 대한 의학적 중재에 관한 것이다. 본 발명은 DIC 를 치료하기 위한 신규하고 우수한 화합물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 화합물은 플라스민과 플라스미노겐 활성화인자 뿐만 아니라 유리 및 응괴 - 결합 트롬빈 및 Xa 인자에 대하여 저해 작용을 갖는다.

본원에 인용되어 있는 특허 문헌 및 공개 문헌은 본 분야의 지식을 반영하며 이들 전부를 본원에서 참고문헌으로 인용하였다. 이들 특허 문헌과 공개 문헌 및 본 발명의 출원서 사이의 모든 불일치는 본 출원서를 위하여 설명되어야 한다.

첫 번째 양상에서, 본 발명은 다음 화학식 Ⅰ 의 펩티딜 아르기날 및 유기산 또는 무기산으로 형성된 이의 산 - 부가 염을 포함하는 물질로 이루어진 조성물을 제공한다 :

화학식 Ⅰ

Xaa - Xbb - Arg - H

화학식 Ⅱ

Q - CH(R) - CO

R 은 C_7-9시클로알킬메틸기, 1 - 아다만틸메틸기, 또는 C_5-7시클로알킬기를 나타내며,

Xbb 는 L - 프롤린 또는 L - 아제티딘일 - 2 - 카르복시산 잔기를 나타낸다.

본 발명의 이러한 양상에 따른 바람직한 실시형태는 특히 다음 화학식 1 과 상응한다(에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L -아르기닌 알데히드, Eoc - D - cHpa - Pro - Arg - H).

화학식 1

특히 본 발명의 이러한 양상에 따른 다른 바람직한 실시형태는 특히 다음 화학식 2 와 상응한다(N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드, N - Me - D - cHpa - Pro - Arg - H).

화학식 2

특히 본 발명의 이러한 양상에 따른 또다른 바람직한 실시형태는 다음 화학식 3 과 상응한다(D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드, D - Hpl - Pro - Arg - H).

화학식 3

특히 본 발명의 이러한 양상에 따른 다른 바람직한 실시형태는 다음 화학식 4 와 상응한다(N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드, N - Me - D - Chg - Aze - Arg - H).

화학식 4

화학식 1, 2, 3 및 4 에 따른 화합물을, 예를 들어 L - 아르기닌 락탐으로 N 또는 O - 보호된 2 - 잔기 산 성분(N or O - protected 2 - residue acid component)을 축합시키고 ; 벤질옥시카르보닐기로 구아니디노기에서 보호되고 ; 보호된 트리펩티드 알데히드에 대하여 수득한 트리펩티드 락탐을 환원시키며 ; 아르기닌의 구아니디노기 및 화학식 Ⅱ 에서 Q = 메틸아미노 또는 히드록시인 경우, 말단의 메틸아미노 또는 히드록시기로부터 보호기를 제거하며 ; 유기산 또는 무기산으로 형성된 부가 염(addition salt)을 형성하였을 때 화학식 Ⅰ 의 펩티드 유도체를 분리시킴으로써 제조하였다.

화학식 Ⅰ 로 표현된 화합물을 제조하였고 염 형태의 대단한 안정성으로 인해 산 - 부가 염(acid - addition salt) 형태로 사용하였다. 화학식 Ⅰ 의 화합물의 산 - 부가 염에서, 치료학적 목적으로 약학적으로 용인가능한 산 - 부가 염을 사용하는 것이 바람직할지라도 염기와 산에서 활성 잔기는 덜 중요하다. 이러한 적절한 산의 예로는 다음을 포함한다 : (a) 무기산 - 염산, 브롬화수소산, 인산, 메타인산 및 황산, (b) 유기산 - 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산, 파모산(pamoic acid) 및 아릴 - 술폰산(예를 들어, p - 톨루엔술폰산).

산 - 부가 염은 예를 들어, 산으로 화학식 Ⅰ 의 화합물의 유리 염 형태를 중화시키는 통상적인 방법으로 제조하였다.

두 잔여 산 성분은(two residue acid component)은 D - Xaa - Xbb 로 나타낼 수 있고, 여기에서 Xaa 는 화학식 Q - CH(R) -CO 의 α - 치환된카르복시산 잔기를 나타내며, 이 식에서 Q 는 C_1-3알콕시카르보닐아미노기를 의미하고, R 은 상기 규정된 의미를 나타내며, Xbb 는 L - 프롤린 또는 L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산 잔기를 나타낸다. Xaa, α - 치환된 알킬산이 α - 메틸아미노 또는 α - 히드록시산인 경우, 즉 Q 가 메틸아미노 또는 히드록시기를 나타낼 경우에, 두 잔여 산 성분은 P - D - Xaa - Xbb 로 나타낼 수 있고, 여기에서 P 는 벤질옥시카르보닐(Z) 또는 3 차 - 부톡시카르보닐(Boc)기 또는 O - 보호기, 바람직하게 테트라히드로피란일(THP)기와 같은 N - 보호기를 나타낸다.

α - 아미노산 또는 α - 메틸아미노산 잔기 - 함유 화합물에 대한 출발 물질로 사용된 아실 디펩티드는, C_1-3알콕시카르보닐아미노산 및 벤질옥시카르보닐아미노산을 수득하기 위해 상당하는 클로로포름산 에스테르와 α - 아미노산을 아실화반응시킴으로써 제조하였고, 필요로하는 P - D - Xaa - Xbb 를 수득하기 위해 N - 메틸화된 Z - 아미노아실 Xbb 및 D - Xaa - Xbb 를 수득하도록 L - 프롤린이나 L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산에 상기 화합물을 결합시켰다.

Xbb 에 결합하는데 필요한 D - Xaa 는 라세미 DL - Xaa 화합물을 아세틸화반응시키고, DL - 아세틸아미노산을 그것의 메틸 에스테르로 전환시키며 효소적으로 아세틸 - DL - Xaa - OMe 라세미 에스테르를 분해시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 따라서 수득한 아세틸 - D - Xaa - OMe 를 에스테르가수분해시키고 아세틸기 이탈반응시킨 다음 필요로하는 N - 보호 D - 아미노산으로 전환시켰다.

얻고자하는 D - α - 히드록시산을 상당하는 D - α - 아미노산으로부터 용이하게 수득할 수 있다. 그리고나서 그것의 O - 보호 형태로 전환되고 Xbb 에 결합되어 P - D - Xaa - Xbb 를 수득하였다.

두 번째 양상에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 양상에 따른 펩티딜 아르기날 및 약학적으로 용인가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

약학적 제형은 화학식 Ⅰ 의 화합물의 유효량 또는 약학적으로 용인가능한 이의 염 및 공지된 약학적으로 용인가능한 담체, 충전 물질(filling material), 희석제 및/또는 그밖의 다른 약학적 부형제를 포함한다.

상기 담체, 희석제 또는 충전 물질은 물, 알콜, 겔라틴, 락토스, 사카로스, 전분, 펙틴, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 활석, 다양한 동물성유 또는 식물성유, 또한 글리콜(예를 들어, 프로필렌 글리콜이나 폴리에틸렌 글리콜)이다.

약학적 부형제로는 방부제, 다양한 천연 또는 합성 에멀게이터(emulgeator), 분산제 또는 침윤제, 착색 물질, 향미료, 완충용액, 붕해성을 증진시키는 물질 및 유효 성분의 생체내이용효율을 증진시키는 그밖의 다른 물질이다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구용 조성물(주사, 주입, 좌약, 플라스터(plaster) 또는 연고와 같은 위장계를 회피함으로써 투여된 약물) 뿐만 아니라 경구용 조성물(정제, 캡슐, 분말, 환제, 당제 또는 과립과 같이 입을 통해 투여됨)과 같은 통상적인 제제형으로 제조될 수 있다.

세 번째 양상에서, 본 발명은 화학식 I 의 Xaa - Xbb - Arg - H(Xaa 및 Xbb 는 상기에 기재되어 있음)에 해당하는 펩티딜 아르기날 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 산 - 부가 염을 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는, 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 펩티딜 아르기날은 또한 펩티딜 아르기닌 알데히드 유도체로도 언급된다.

본 발명의 이러한 양상에 따라, 본 발명은 본 발명의 펩티딜 아르기날을 인체 환자를 포함하는 동물 환자에게 투여함을 포함하는, 파종성혈관내응고를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양상에 따른 방법에 있어서, 본 발명의 치료학적 유효량의 펩티딜 아르기날을 신체에 파종성혈관내응고를 나타내는 인체를 포함하는 동물에게 치료학적으로 효과적인 기간 동안 투여하였다. 바람직하게, 정맥내 또는 피하에 투여하는 것이 바람직하며, 정맥내에 투여하는 것이 더 바람직하다. DIC 의 대체 표지자(surrogate markers) 또는 증후를 경감시키기에 효과적인 기간 동안 효과적인 투여량으로 공지된 방법을 통해 치료학적 조성물을 투여할 수 있다. 전신적으로 투여하였을 때, 치료학적 조성물은 펩티딜 아르기날의 혈중 농도가 약 6 μM 내지 약 100 μM 에 도달하도록 충분한 투여량으로 투여하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 총 투여량의 범위는 1 일에 체중 당 약 0.1 ㎎ 내지 약 50 ㎎ 의 펩티딜 아르기날일 것이다. 단일 치료 에피소드로서 개인에게 본 발명의 치료학적 조성물의 하나 또는 그 이상의 치료학적 유효량을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것이 바람직할 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 특히 바람직한 특정 실시형태를 자세히 설명하고자 하는 의도이며 본 발명의 범주를 제한하려는 의도는 아니다. 다른 식으로 언급되는 경우를 제외하고는, 하기 실험에서 인체 트롬빈(3,000 NIH U/㎎), 인체 알부민 및 인체 피브리노겐은 시그마 알드리치 케이에프티.(헝가리 부다페스트에 소재함)에서 입수한 것이며 인체 Xa 인자(8 ㎍/U)는 엔자임 리서치 라보라토리스(영국 스완시에 소재함)에서 입수한 것이다. APTT 시약은 리날(헝가리 부다페스트에 소재함)에서 입수하였으며 PT 시약 및 심플라스틴 D 는 오르가논, 테크니카(독일 에펠헤임에 소재)에서 구입하였다.

아미노산, 펩티드, 치환기 및 시약의 약자는 IUPAC - IUB 협약에 따른 것이다. 본 출원에 기재된 이러한 약자는 다음과 같다. Arg=L-아르기닌, Boc = 3차 - 부톡시 - 카르보닐, Bzl - 벤질, Chg = L - 시클로헥실글리신, DCHA = 디시클로헥실아민, DHP = 디히드로피란, Eoc = 에톡시카르보닐, Gly = 글리신, Me = 메틸, MePhe = N - 메틸 - L - 페닐알라닌, Moc = 메톡시카르보닐, Pro = L - 프롤린, pNA = p - 니트로아닐리노, TFA = 트리플루오로아세트산, THP = 테트라히드로피란일, Tos = p - 톨루엔술포닐, Z = 벤질옥시카르보닐, RT = 실온. 본 출원에 사용된 특이 아미노산의 약자는 Ada = 아다만틸 - L - 알라닌, Aze = L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산, N - Me - D -cHpa = N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닌, D - cHpa = D - 시클로헵틸알라닌 또는 (R) - 2 - 아미노 - 3 - 시클로헵틸프로피온산, D - Hla = D - 시클로 - 헵틸락트산 또는 (R) - 2 - 히드록시 - 3 - 시클로헵틸프로피온산.

실시예에 기재된 R_f값은 흡착제로 실리카겔(DC - 알루포리엔 키에셀겔 60 F₂₅₄, 다름슈타트 소재의 머크에서 입수)을 사용한 박층 크로마토그래피로 하기 전개 시스템에서 결정된 것이다. 시스템의 번호는 약자 R_f뒤에 괄호안에 기재될 것이다.

1. 아세트산 에틸

2. 아세트산 에틸 - n - 헥산 (1:4)

3. 아세트산 에틸 - n - 헥산 (1:1)

4. 아세트산 에틸 - 시클로헥산 (15:85)

5. 클로로포름 - 아세톤 (95:5)

6. 아세트산 에틸 - 피리딘 - 아세트산 - 물 (960:20:6:11)

7. 아세트산 에틸 - 피리딘 - 아세트산 - 물 (480:20:6:11)

8. 아세트산 에틸 - 피리딘 - 아세트산 - 물 (240:20:6:11)

9. 아세트산 에틸 - 피리딘 - 아세트산 - 물 (120:20:6:11)

10. 아세트산 에틸 - 피리딘 - 아세트산 - 물 (90:20:6:11)

11. 아세트산 에틸 - 피리딘 - 아세트산 - 물 (60:20:6:11)

12. 아세트산 에틸 - 피리딘 - 아세트산 - 물 (45:20:6:11)

13. 아세트산 에틸 - 피리딘 - 아세트산 - 물 (30:20:6:11)

실시예에 명시된 용량 인자(capacity facor, k')는 다음과 같은 "파마시아 LKB 분석적 HPLC 시스템 2" 장치로 결정하였다 :

컬럼 : LiChrospher RP - 18 : 12 ㎛ 240 × 4 ㎜

컬럼 온도 : 주위 온도

용출액 : 용매 A, 0.1 % TFA/물 ; 용매 B, 0.1 % TFA/아세토니트릴

밀도 구배 프로필 : 0→15 분 30→60 % B, 그 후 등용매(isocratic) 60 % B

용매 유속 : 1 ㎖/분

검출기 : LKB 2141 UV 모니터 ; 파장 : 214 nm

주입기 : 레오다인 7125

시료 루프 : 100 μL

펌프 : 2 LKB 2148 형

제어 시스템 : LKB HPLC 매니저

시료 농도 : 용매 A 내에 1 ㎎/㎖, 주입 부피 25 μL

분석 시간 : 40 분

아실 - 아르기닌 알데히드는 평형 구조, 즉, 알데히드, 알데히드 수화물 및 두 아미노시클올 형태로 나타내었다. HPLC 분석하는 동안, 알데히드 수화물 및 하나 또는 두 아미노시클올 형태가 2 개 또는 3 개의 분리된 피크로 나타났다. 실시예에 기재된 아실아르기닌 알데히드는 2 개 또는 3 개의 k' 값으로 명시되었다.

질량 분석법. FAB 양성 이온화 측정을 핀니간 MAT 8430 장치로 실행하였다. 시료를 m - 니트로벤질 알콜(NBA) 매트릭스에 용해시키고 이온원에 직접적으로 첨가하였다. 펩티딜 - 아르기닌 알데히드의 스펙트럼에서, 부가적인 분자 이온을 검출할 수 있었으며 부가 화합물의 분자 이온은 NBA 로 형성되었다 : [M + H]⁺및 [M + H + NBA]⁺. 실시예에서, FAB 스펙트럼 데이터는 적절하게 기재되었다. ESI 양성 이온화 측정을 VG 쿠아트로(피손스) 장치로 실행하였다. 시료를 1 %(v/v)의 포름산을 함유하는 아세토니트릴 - 물(1:1) 혼합물에 용해시키고 이온원에 15-25 ㎖/분의 유속으로 10 ㎖ 시료 - 루프를 첨가하였다.

실시예 1

에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드 헤미설페이트

제 1 단계 : 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐

3 차 - 부틸옥시카르보닐 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐[Bajusz 등의 J. Med. Chem. 33, 1729(1990)] 7.85 g(20.1 mM)을 20 ㎖ 의 클로로포름에 현탁한 후 HCl 가스(0.11-0.15 g/㎖)로 포화된 20 ㎖ 의 아세트산 에틸을 얼음으로 냉각시키고 교반시키면서 첨가하였다. Boc 기의 절단을 박층 크로마토그래피로 확인하였다[R_f(11) = 0.5(유리 화합물) ; 1.0(Boc - 화합물)]. 반응의 마지막에서, 현탁액을 40 ㎖ 의 디에틸 에테르로 희석시켰으며 형성된 결정 덩어리를 여과한 후 10 ㎖ 의 아세톤 및 10 ㎖ 의 디에틸 에테르로 세척하고 환산 압력(reduced pressure)하에서 KOH 로 건조시켰다. 결과적으로 생성된 N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐 히드로클로라이드를 20 ㎖ 의 디메틸포름아미드에 용해시키고 -20 ℃ 까지 냉각시킨 후 하기 혼합된 무수물에 첨가하였다.

7.12 g(20.1 mM)의 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린(실시예 1 의 단계 J)을 20 ㎖ 의 디메틸포름아미드에 용해시키고 -15 ℃ 까지 냉각시킨 후 2.23 ㎖(20.1 mM)의 N - 메틸 - 몰포린 및 2.65 ㎖(20.1 mM)의 클로로포름산 이소부틸을 교반시키면서 첨가하였다. 10 분간 교반한 후, 상기 N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐의 디메틸포름아미드 용액을 첨가한 후 트리에틸아민을 첨가하여 반응 혼합물의 pH 가 8 이되도록 조절하였다(약 2.8 ㎖ 가 필요함). 반응 혼합물을 -10 ℃ 에서 30 분간 교반한 다음 0 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 그 후에, 염을 여과시켜 제거하고 여과물을 100 ㎖ 의 아세트산 에틸로 희석시켰다. 결과적으로 생성된 용액을 25 ㎖ 의 물 및 10 ㎖ 의 1 M KHSO₄로 3 회 세척하고 10 ㎖ 의 물로 3 회 세척한 후 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 수득한 산물을 흡착제로 200 g 의 키에셀겔 60(0.040 - 0.063 ㎜)을 사용하고 용출액으로 아세트산 에틸을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하였다. 순수한 산물[R_f(1) = 0.60]만을 함유하는 분획을 모아서 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 증발시킨 잔여물을 디이소프로필 에테르로부터 결정화하였다.

수득량 10.84 g(86.1 %), R_f(1) = 0.55 - 0.65.

FAB 질량 스펙트럼(627[M + H]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

제 2 단계 : 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드

8.02 g(12.8 mM)의 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐(실시예 1 의 제 1 단계)을 15 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해시킨 후 -50 ℃ 를 넘지 않는 온도에서 교반시키면서 테트라히드로푸란에 용해된 3.6 mM 의 LiAlH₄용액을 첨가하였다. 환원의 진행을 전개 용매로 용매 7 을 사용한 박층 크로마토그래피로 확인하였으며 필요하다면 약간의 LiAlH₄를 첨가하였다. 이 반응 혼합물에 pH 3 이 될 때까지 0.5 M 의 KHSO₄를 일정하게 교반시키고 냉각하면서 점적하여 첨가하였으며 그런 다음 35 ㎖ 의 물을 첨가하였다. 결과적으로 생성된 용액을 15 ㎖ 의 헥산으로 2 회 추출한 뒤 20 ㎖ 의 디클로로메탄으로 3 회 추출하였다. 디클로로메탄 추출물을 모은 뒤 15 ㎖ 의 물 및 15 ㎖ 의 차가운 5 % 탄산수소나트륨 용액으로 3 회 세척한 후 15 ㎖ 의 물로 다시 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 증발 잔여물을 디이소프로필 에테르로 처리하고 여과한 후 환산 압력 하에서 건조시켰다.

수득량 7.08 g(88 %), R_f(8) = 0.40 - 0.50.

FAB 질량 스펙트럼(629[M + H⁺], 782[M + H + NBA]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

제 3 단계 : 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드 헤미설페이트

6.91 g(11.0 mM)의 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드(실시예 1 의 제 2 단계)를 85 ㎖ 의 에탄올 및 11.25 ㎖ 의 0.5 M 황산에 용해시킨 후 14 ㎖ 의 물에 현탁된 0.7 g 의 Pd-C 촉매를 첨가하고 이 혼합물을 약 10 ℃ 에서 수소화시켰다. 반응의 경과를 박층 크로마토그래피로 확인하였다. 반응이 완결된 후(약 15 분), 촉매를 여과시키고 여과물을 2.0 - 2.5 kPa 에서 약 7 - 9 ㎖ 로 농축시켰다. 잔여물을 80 ㎖ 의 물로 희석시키고 15 ㎖ 의 디클로로메탄으로 4 회 추출한 뒤 수용액을 20 - 22 ℃ 에서 24 시간 동안 그대로 두었다. 용액을 15 ㎖ 의 디클로로메탄으로 다시 3 회 추출하고 이온 - 교환 수지 두웩스(Dowex) AG 1 - X8(HO^-) 로 pH 를 3.5 로 조절한 후 용액을 동결건조시켰다.

수득량 4.90 g(82 %), R_f(11) = 0.35 - 0.45. [α]_D ²⁰= -77.6°(C = 1.018 ; 물).

HPLC : k' = 1.695 및 2.328.

FAB 질량 스펙트럼(495[M + H⁺], 648[M + H + NBA]⁺)]으로 가정구조식을 확인하였다.

출발물질의 합성 :

에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린

단계 A : 1 - 시클로헵틸아세틸 - 2,5 - 디메틸피라졸

58.6 g(375 mM)의 시클로헵틸아세트산[Protiva 등의 Collect. Czech., Chem., Commun., 55 : 1278 - 1289(1990)]을 375 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해시키고 -15 ℃ 까지 냉각시킨 다음 41.3 ㎖(375 mM)의 N - 메틸몰포린몰포린 및 49.50 ㎖(375 mM)의 클로로포름산 이소부틸을 교반시키면서 첨가하고 10 분간 교반시킨 후 -10 ℃ 에서 300 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해된 37.85 g(393.75 mM)의 3,5 - 디메틸푸라졸 용액을 첨가하였다. -10 ℃ 에서 30 분 동안, 0 ℃ 에서 1 시간 동안 및 실온에서 3 시간 동안 계속 교반시켰다. 그런 다음, 염을 여과시켜 제거하고 여과물을 환산 압력 하에서 증발시킨 후 잔여물을 900 ㎖ 의 아세트산 에틸에 용해시켰다. 결과적으로 생성된 용액을 80 ㎖ 의 1 M NaOH 및 89 ㎖ 의 물로 3 회, 80 ㎖ 의 1 M HCl 로 3 회 및 물로 연속적으로 세척하여 중성이되도록 하였다(기본 세척액은 ~ 5.8 g, 37.1 mM 의 시클로헵틸아세트산을 재생시키기 위해 혼합되고 산성화된 것이다). 아세트산 에틸 용액을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 결과적으로 생성된 유성 산물을 340 mM 1 - 시클로헵틸아세틸 - 2,5 - 디메틸피라졸로 간주되었으며 더이상의 정제없이 다음 단계에 사용하였다. R_f(2) = 0.8 - 0.9(산 : 0.3 - 0.4).

단계 B : 1 - 시클로헵틸아세트알데히드

-30 ℃ 로 냉각시킨 350 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 12.83 g(338 mM)의 LiAlH₄를 첨가하였다. 그런 다음, 250 ㎖ 의 차가운 테트라히드로푸란에 용해된 유성 산물(실시예 1 의 단계 A) 용액을 -25 ℃ 에서 교반시키면서 점적하여 첨가하였다. 반응물을 TLC 로 확인하였다. 만일 필요하다면 테트라히드로푸란(3 g/100 ㎖)에 용해된 LiAlH₄의 용액 30 - 40 ㎖ 를 첨가하였다. 환원이 완료된 후, 차가운 혼합물을 6 M HCl 로 산성화시키고 아세트산 에틸(500 ㎖)로 희석시켰다. 수상(aqueous phase)을 아세트산 에틸로 추출하고 유기 용액을 혼합하고 물로 세척하여 중화시켰으며 무수 Na₄SO₄로 건조시킨 후 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다.결과적으로 생성된 유성 산물이 2,5 - 디메틸피라졸(DMP)로 오염된 가공하지 않은 1 - 시클로헵틸아세트알데히드이다. R_f(2) = 0.7 - 0.8(DMP : 0.25 - 0.35).

350 ㎖ 의 메탄올에 용해된 결과적으로 생성된 유성 산물(62.6 g)에 70 ㎖ 의 물에 용해된 36.4 g 의 NaHSO₃용액을 교반시키면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 냉장고에 밤새 두었다. 침전된 물질을 여과하여 제거하고 35 ㎖ 의 메탄올 및 7 ㎖ 의 물의 차가운 혼합물로 세척한 뒤 디에틸 에스테르로 세척하고 건조시켰다. 고형 물질은 아황산수소나트륨 부가물[(73.87 g, 302.38 mM), R_f(14) = 0.55 - 0.65]이며 이를 47.7 g(450 mM)의 Na₂CO₃를 함유하는 450 ㎖ 의 염화 메틸렌 및 450 ㎖ 의 물에 용해된 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반시켰다. 2 개의 상으로 분리되었으며 유기상을 염화 메틸렌으로 세척하였다(100 ㎖ 씩 2 회). 혼합된 유기층을 물로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 결과적으로 생성된 유성 산물(36.97 g, 263.64 mM)은 순수한 1 - 시클로헵틸 - 아세트알데히드이며 이를 다음 반응에 바로 사용하였다. R_f(2) = 0.7 - 0.8.

단계 C : 5 - 시클로헵틸메틸히단토인

50 % 수성 에탄올(857 ㎖ ; 3.25 ㎖/mM)에 용해된 알데히드(실시예 1 의 단계 B) 용액에 15.5 g(290 mM ; 1.1 당량)의 염화 암모늄, 27.87 g(659 mM ; 2.5 당량)의 탄산 암모늄 및 18.9 g(290 mM ; 1.1 당량)의 시안화 칼륨을 50 - 55 ℃ 에서 교반하면서 첨가하고 50 ℃ 에서 48 시간 동안 계속 교반하였다. 침전된 물질을 여과하여 제거하고 50 % 에탄올(100 ㎖)로 세척한 후 진공 건조기내에서 건조시켰다. 최초 생산물처럼, 42.26 g(206.97 mM)의 물질을 수득하였다. 모액에서 에탄올을 증류하여 제거하고 잔여물을 아세트산 에틸로 추출한 뒤(250 ㎖ 로 1 회, 100 ㎖ 로 2 회) 유기 용액을 혼합하고 물로 세척하고(50 ㎖ 씩 3 회) 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 잔여물을 디이소프로필 에테르와 함께 분쇄하고 여과하고 건조시켰다. 두 번째 생산물과 같이, 3.6 g(17.12 mM)의 물질을 수득하였으며 ; 총 수득량 45.86 g(218 mM, 82.5 %)의 5 - 시클로헵티메틸히단토인을 수득하였다. Mp : 240.9 ℃. R_f(6) = 0.73 - 0.78.

C₁₁H₁₈N₂O₂(210.28)에 대한 분석. 계산치 : C % = 62.83 ; H % = 8.63 ; N % = 13.32. 분석치 : C % = 63.09 ; H % = 8.67 ; N % = 13.25.

단계 D : DL - 시클로헵틸알라닌 히드로클로라이드

87 g(1.55 M)의 KOH 를 435 ㎖ 의 n - 부탄올에 교반시키고 가온하면서 용해시키고 45.71 g(217.4 mM)의 5 - 시클로헵티메틸히단토인(실시예 1 의 단계 C)을 첨가하였다. 수득된 용액을 72 시간 동안 환류시킨 후 물로 희석시키고 환산 압력 하에서 증발시켰다. 잔여물을 220 ㎖ 의 물에 용해시키고 cc HCl(~ 130 ㎖)을 사용하여 pH 2 로 산성화시킨 후 밤새 냉장고에 보관하였다. 침전된 물질을 여과하여 제거하고 50 ㎖ 의 물로 세척한 후 진공 건조기에서 건조시켰다. 이렇게 얻어진 산물(106.5 g)이 217 mM 의 DL - 시클로헵틸알라닌이며 더이상 반응시키지 않고 사용하였다. R_f(11) = 0.2 - 0.3.

단계 E : DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드

23.65 ㎖(325.25 mM)의 SOCl₂를 0 ℃ 내지 5 ℃ 사이에서 교반시키면서 217 ㎖ 의 메탄올에 점적하여 첨가하였다. 그런 다음, DL - 시클로헵틸알라닌(실시예 1 의 단계 D, 217 mM)을 첨가하고 24 시간 동안 교반하였다. 전환이 완료된 후 TLC 하였다[R_f(11) = 0.75 - 0.85(에스테르), 0.3 - 0.4(산)]. 반응하지 않은 아미노산이 검출될수 있을 때, 반응 혼합물을 -5 ℃ 까지 냉각시키고 11.8 ㎖ 의 SOCl₂를 점적하여 첨가한 후 반응 혼합물을 24 시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 용해되지 않은 염을 여과하여 제거하고 메탄올로 세척하고(50 ㎖ 씩 2 회)혼합된 메탄올 용액을 증발시켰다. 잔여물을 메탄올에 재용해시키고 다시 증발시켰다. 마지막으로, 잔여물을 디이소프로필 에테르와 함께 분쇄하고 여과하여 제거한 후 디이소프로필 에테르로 세척하고 진공 건조기내에서 KOH 및 P₂O₅로 건조시켰다. 33.68 g(142.85 mM)의 DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드를 수득하였다. R_f(11) = 0.5 - 0.6. Mp. 95.4 - 96.5 ℃.

단계 F : 아세틸 - DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르

140 ㎖ 의 피리딘에 용해된 33.68 g(142.85 mM)의 DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드(실시예 1 의 단계 E) 용액에 무수아세트산(16.2 ㎖, 171.43 mM)을 얼음물 수조에서 냉각시키고 교반하면서 1 시간 동안 점적하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 주변 온도에서 24 시간 동안 교반한 후 환산 압력 하에서 증발시켰다. 잔여물을 300 ㎖ 의 아세트산 에틸에 용해시키고 1 M KHSO₄(50 ㎖ 씩 3 회) 및 물(50 ㎖ 씩3 회)로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 결과적으로 생성된 유성 산물을 디이소프로필 에테르와 함께 분쇄하여 고형 물질로 만들고 여과하여 제거하고 디이소프로필 에테르로 세척한 후 물로 세척하고 건조기에서 건조시켰다. 24.36 g(100.94 mM, 70.4 %)의 메틸 아세틸 - DL - 시클로헵틸알라니네이트(아세틸 - DL - 에스테르)를 수득하였다. R_f(1) = 0.55 - 0.65. Mp. : 69 - 71 ℃.

C₁₃H₂₃NO₃(241.332)에 대한 분석. 계산치 : C % = 64.70 ; H % = 9.61 ; N % = 5.80. 분석치 : C % = 64.75 ; H % = 9.76 ; N % = 5.85.

단계 G : 아세틸 - D - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르(아세틸 - DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르의 효소적 분해)

36 ㎖ 의 톨루엔에 용해된 8.69 g(360 mM)의 아세틸 - DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르인 아세틸 - DL - 에스테르(실시예 1 의 단계 F)에 72 ㎖ 의 물 및 36 ㎎ 의 서브틸리신 칼스버그(제 Ⅷ 형 단백질분해효소, 시그마에서 입수)를 첨가하였다. L - 거울상이성질체인 아세틸 - L - 에스테르의 효소적 가수분해는 pH 7.0 에서 진행되고 자동적정에 의해 유지되며 3 M NaOH 를 채워넣었다. NaOH 의 소비가 끝났을 때(5.8 ㎖, 17.4 mM), 반응 혼합물을 36 ㎖ 의 톨루엔으로 희석시켰으며 2 개의 층으로 분리되었다. 수상을 30 ㎖ 의 톨루엔으로 2 회 세척하였다. 혼합된 툴루엔 용액은 아세틸 - D - 에스테르를 함유하며 혼합된 수용액은 아세틸 - L - 산의 나트륨 염을 함유한다.

무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 혼합된 톨루엔 용액을 환산 압력 하에서 증발시켜 3.8 g(15.75 mM)의 아세틸 - D - 에스테르[R_f(1)=0.55 - 0.65]를 수득하였으며 이를 다음 단계에 바로 사용하였다.

혼합된 수용액을 산성화시키고 30 ㎖ 의 아세트산 에틸로 3 회 추출하였다. 혼합된 아세트산 에틸 용액을 물로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 환산 압력 하에서 증발시켜 4.0 g(17.6 mM)의 아세틸 - L - 산을 수득하였다. R_f(7) = 0.38 - 0.42.

9.65 g(40 mM)의 아세틸 - DL - 에스테르(실시예 1 의 단계 F)로부터 출발한 유사 제조로 4.6 g(19.06 mM)의 아세틸 - D - 에스테르 및 4.44 g(19.55 mM)의 아세틸 - L - 산을 수득하였다.

단계 H : D - 시클로헵틸알라닌 히드로클로라이드

7.24 g(30 mM)의 아세틸 - D - 에스테르(실시예 1 의 단계 G)를 120 ㎖ 의 6 M HCl 에 현탁시키고 3 시간 동안 환류시켰다. 유리 아미노산이 결정 형태로 분리되었다. 반응 혼합물을 냉각시키고 밤새 냉장고에 보관한 뒤 여과하고 차가운 물 및 에테르로 세척한 후 진공 건조기에서 건조시켰다. 5.9 g(26.69 mM, 89 %)의 D - 시클로헵틸알라닌 히드로클로라이드를 수득하였다. R_f(12) = 0.10 - 0.15. [α]_D ²⁰= -11 ℃(c = 0.4 ; 1 M HCl).

C₁₀H₁₉NO₂.HCl(221.728)에 대한 분석. 계산치 : C % = 54.17 ; H % = 9.09 ; N % = 6.32 % ; Cl % = 15.99. 분석치 : C % = 54.27 ; H % = 9.27 ; N % = 6.30 ; Cl % = 16.2.

단계 I : 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닌

20 ㎖ 의 디메틸포름아미드에 용해된 4.43 g(20 mM)의 D - 시클로헵틸알라닌 히드로클로라이드(실시예 1 의 단계 H) 용액에 5.6 ㎖(40 mM)의 트리에틸아민 및 3.95 g(21 mM)의 (N - 히드록시숙신이미딜) - 에틸 카르보네이트를첨가하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반한 뒤, 반응 혼합물을 증발시키고 40 ㎖ 의 아세트산 에틸에 용해시킨 잔여물을 30 ㎖ 의 1 M KHSO₄로 3 회 세척하고 물로 세척하여 중성이 되도록 하였다. 그런 다음, 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 결과적으로 생성된 유성 산물(4.47 g, ~ 17 mM)은 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닌[R_f(7) = 0.85 - 0.90]이며 이는 다음 단계에 바로 사용였다. [α]_D ²⁰= + 6.3^。(c = 1, 메탄올).

(N - 히드록시숙신이미딜) - 에틸 - 카르보네이트의 제조

11.5 g(100 mM)의 N - 히드록시숙신이미드를 100 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해시키고 -10 ℃ 로 냉각시킨 후 15.4 ㎖(110 mM)의 트리에틸아민 및 10.45 ㎖(110 mM)의 에틸 클로로카보네이트를 교반시키면서 첨가하였다. 실온에서 2 시간 동안 교반시킨 후, 혼합물을 여과하고 여과물을 환산 압력 하에서 증발시켰다. 유성 잔여물을 냉각하여 결정화시켰다. 결정화된 물질을 휘발유 에테르에 현탁하고 여과시켜 제거한 뒤 진공 건조기에서 건조시켰다. 수득량은 12.78 g 이며 Mp. 는 39.4 - 39.7 ℃ 이다.

C₇H₉NO₅(187.15)에 대한 분석. 계산치 : C, 44.92 ; H, 4.85 ; N, 7.48. 분석치 : C % = 44.67 ; H % = 4.81 ; N % = 7.27.

단계 J : 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L -프롤린

17 ㎖ 의 THF 에 용해시킨 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닌(~ 17 mM, 실시예 1 의 단계 Ⅰ) 용액에 3.74 g(20 mM)의 N - 히드록시숙신이미드를 혼합하고 10 ℃ 로 냉각시킨 후 약 20 ㎖ 의 THF 에 용해된 4.12 g(20 M)의 1, 3 - 디시클로헥실카르보디이미드 용액과 혼합하였다. 활성 에스테르의 형성을 TLC 로 완전히 확인한 후에 22 ℃ 에서 5 시간 동안 혼합물을 교반하였다.

L - 프롤린(1.95 g, 17 mM)을 교반시킨 반응 혼합물에 첨가한 뒤 2.3 ㎖(17 mM) 의 트리에틸아민을 첨가하였다. 활성 에스테르를 소비하였음을 TLC 로 완전히 확인한 후에 22 ℃ 에서 약 15 시간 동안 반응 혼합물을 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고 여과박을 10 ㎖ 의 THF 로 세척한 뒤 여과물을 증발시켰다. 잔여물을 30 ㎖ 의 아세트산 에틸 및 30 ㎖ 의 물에 용해시켰다. 수상을 20 ㎖ 의 아세트산 에틸로 2 회 세척하고 20 ㎖ 의 1 M KHSO₄로 산성화시킨 후 20 ㎖ 의 아세트산 에틸로 3 회 추출하였다. 혼합된 아세트산 에틸 용액을 물로 세척하여 중성이 되도록 하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 2.0 - 2.5 kPa 에서 건조시켰다. 디이소프로필 에테르와 분쇄시, 잔여물은 결정화되었다. 이 결정 현탁액을 냉장고에서 냉각시키고 휘발유 에테르와 함께 여과한 뒤 진공 건조기에서 건조시켰다. 4.2 g(11.85 mM, 70 %)의 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린을 수득하였다. R_f(7) = 0.45 - 0.55.

C₁₈H₃₀N₂O₄(354.45)에 대한 분석. 계산치 : C, 60.99 ; H, 8.53 ; N, 7.90. 분석치 : C % = 60.14 ; H % = 8.55 ; N % = 7.38.

FAB 질량 스펙트럼(355[M + H⁺]으로 가정구조식을 확인하였다.

실시예 2

N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드 설페이트의 합성

제 1 단계 : 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질 - 옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐

3.93 g(10 mM)의 3 차 - 부틸옥시카르보닐 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐[(Bajusz 등의 J. Med. Chem., 33, 1729(1990)]을 10 ㎖ 의 클로로포름에 현탁한 후 HCl 가스(0.11 - 0.15 g/㎖)로 포화된 10 ㎖ 의 아세트산 에틸을 교반시키고 얼음으로 냉각시키면서 첨가하였다. Boc 기의 절단을 박층 크로마토그래피로 확인하였다[R_f(11) = 0.5(유리 화합물) ; 1.0(Boc - 화합물)]. 반응의 마지막에서, 현탁액을 20 ㎖ 의 디에틸 에테르로 희석시키고 형성된 결정 덩어리를 여과하고 5 ㎖ 의 아세톤 및 5 ㎖ 의 디에틸 에테르로 세척한 뒤 환산 압력에서 KOH 로 건조시켰다. 결과적으로 생성된 N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐 히드로클로라이드를 10 ㎖ 의 디메틸포름아미드에 용해시키고 -20 ℃ 로 냉각시킨 후 하기의 혼합된 무수물에 첨가하였다.

4.32 g(10 mM)의 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린(실시예 2 의 단계 C)을 10 ㎖ 의 디메틸포름아미드에 용해시키고 -15 ℃ 로 냉각시킨 후 1.12 ㎖(10.1 mM)의 N - 메틸 - 몰포린 및 1.33㎖(10.1 mM)의 클로로포름산 이소부틸을 교반시키면서 첨가하였다. 10 분간 교반한 후에, N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐의 디메틸포름아미드 용액을 첨가하고 반응 혼합물의 pH 를 8 로 조절하기 위해 트리에틸아민을 첨가하였다(약 1.4 ㎖ 가 필요함). 반응 혼합물을 -10 ℃ 에서 30 분간 교반한 후 0 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 염을 여과하여 제거하고 여과물을 제거하고 여과물을 100 ㎖ 아세트산 에틸에 희석시켰다. 결과적으로 생성된 용액을 15 ㎖ 의 물 및 6 ㎖ 의 1 M KHSO₄로 3 회 세척하고 6 ㎖ 의 물로 3 회 세척한 뒤 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 수득한 산물을 흡착제로 100 g 의 키에셀겔 60(0.040 - 0.063 mm), 용출액으로 아세트산 에틸을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하였다. 순수한 산물[R_f(1) = 0.70]만을 함유하는 분획을 모은 뒤 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 증발 잔여물을 디이소프로필 에테르로부터 결정화시켰다.

수득량 6.0 g(85 %), R_f(1) = 0.65 - 0.75.

FAB 질량 스펙트럼(703[M + H⁺])으로 가정구조식을 확인하였다.

제 2 단계 : 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드

벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐(실시예 2 의 제 1 단계) 5.62 g(8 mM)을 테트라히드로푸란 10 ㎖ 에 용해시킨 다음, 이를 함께 교반시켰으며 -50 ℃ 를 넘지 않는 온도에서 테트라히드로푸란에 용해된 2.25 mM 의 LiAlH₄용액을 첨가하였다. 전개 용매로서 용매 7 를 사용한 박층 크로마토그래피로 환원 과정을 관찰하였으며, 필요에 따라 약간의 LiAlH₄을 추가로 첨가하였다. pH 가 3 이 될때까지 이 반응 혼합물에 0.5 M 의 KHSO₄을 점적함과 동시에 이를 일정하게 교반 및 냉각시킨 다음, 물 25 ㎖ 을 첨가하였다. 결과적으로 생성된 용액을 헥산 2 × 10 ㎖ 로 추출한 다음, 디클로로메탄 3 × 15 ㎖ 로 추출하였다. 추출물 디클로로메탄을 모아서, 물 3 × 15 ㎖ 및 찬 5 % 의 NaHCO₃용액 15 ㎖ 로 세척하고, 다시 물 15 ㎖ 로 세척하였으며, 무수 Na₂SO₄로 건조시켜 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 증발 잔여물을 디이소프로필 에테르로 처리하여 여과시키고 환산 압력 하에서 건조시켰다.

수득량 4.95 g(88 %), R_f(1) = 0.20 - 0.25.

FAB 질량 스펙트럼(705[M + H]⁺, 858[M + H + NBA]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

제 3 단계 : N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드 설페이트

벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드(실시예 2 의 제 2 단계) 4.6 g(6.5 mM)을 에탄올 65 ㎖ 및 0.5 M 의 황산 13.5 ㎖ 에 용해시킨 다음, 물 10 ㎖ 에 현탁시킨 촉매제 Pd - C 0.4 g 을 첨가하고 이 혼합물을 약 10 ℃ 에서 수소화 반응시켰다. 박층 크로마토그래피로 반응 과정을 관찰하였다. 반응이 완료된 후(약 15 분), 촉매제를 여과시키고 2.0 - 2.5 kPa 에서 약 5 - 7 ㎖ 로 농축시켰다. 잔여물을 물 50 ㎖ 로 희석시켰으며, 디클로로메탄 4 × 10 ㎖ 로 추출하고 이 수상을 20 - 22 ℃ 에서 24 시간 동안 두었다. 용액을 디클로로메탄 3 × 10 ㎖ 로 다시 추출하였으며 이온 - 교환 수지 두웩스 AG - 1 - X8(HO^-)로 pH 를 3.5 로 맞춘 다음, 이 용액을 동결 - 건조시켰다.

수득량 2.85 g (82%), R_f(9) = 0.35 - 0.45. [α]_D ²⁰= -79.6°(c = 1 ; 물).

FAB 질량 스펙트럼(437[M + H]⁺, 590[M + H + NBA]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

출발물질 합성

벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린

단계 A : N - 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닌 합성

D - 시클로헵틸알라닌 히드로클로라이드(실시예 1 의 단계 H)(11.09 g, 50 mM)을 0 ℃ 에서 THF 40 ㎖ 및 물 40 ㎖ 와 혼합시켰다. 5 M 의 NaOH 용액을 첨가하여, 교반시킨 혼합물의 pH 를 약 10 으로 맞추었다. 온도를 약 3 ℃ 로 유지시키면서 반응 혼합물에 클로로포름산 벤질(8.22 ㎖, 55.4 mM)을 첨가하였으며, 필요에 따라 5 M 의 NaOH 를 첨가하여 pH 를 약 10 으로 유지시켰다. 클로로포름산 벤질이 완성됨에 따라 추가로, 반응 혼합물을 0 ℃ 에서 1 시간 동안 교반시켰으며 pH 를 약 10 으로 유지시켰다. 실온에서 밤새 계속해서 교반시켰으며, 반응이 완료되었음을 TLC(7)으로 확인하였다. 필요에 따라, 온도를 약 3 ℃ 로 유지시키면서 추가 분량의 클로로포름산 벤질(1 - 2 × 0.75 ㎖, 5 mM)을 반응 혼합물에 첨가하고 5 M 의 NaOH 를 첨가하여 pH 를 약 10 으로 유지시켰다. t - 부틸 메틸 에테르(25 ㎖)를 첨가하고, 교반시킨 혼합물을 22 ℃ 로 가온시켰다. 수상을 분리시키고 2 차분의 t - 부틸 메틸 에테르 25 ㎖ 로 세척하였다. 유기상의 함량을 TLC 로 측정하였으며 필요에 따라, 유기상을 물 25 ㎖ 로 역 - 추출하였다. 수상 및 아세트산 에틸 25 ㎖ 을 혼합하고, 농축시킨 HCl 로 pH 를 2 로 맞추었다. 상을 분리시켰으며, 수상을 2 차분의 아세트산 에틸 25 ㎖ 로 추출하였다. 혼합시킨 유기상을 1M 의 KHSO₄20 ㎖ 및 물 2 × 30 ㎖ 로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시켰으며 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 증발 잔여물을 THF 45 ㎖ 에 용해시켰으며 이 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닌 용액을 다음 단계에 사용하기 위해 추가로 정제함없이 그대로 유지시켰다.

단계 B : 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린

실시예 2 의 단계 A 에서 획득한 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닌의 TFA 용액을 N-히드록시숙신이미드 5.9 g (51.24 mM)과 혼합시켜 10 ℃ 로 냉각시켰으며 약 25 ㎖ 의 THF 에서 1, 3 - 디시클로헥실카르보디 - 이미드 11 g (53.3 mM)의 용액과 혼합시켰다. 혼합물을 22 ℃ 에서 약 4.5시간 동안 교반시킨 후, 활성 에스테르의 완전한 형성을 TLC 로 판단하였다.

교반시킨 반응 혼합물에 L - 프롤린 (5.9 g, 51.24 mM)을 첨가한 다음 트리에틸아민 7.2 ㎖ (51.24 mM)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 22 ℃ 에서 약 15 시간 동안 교반시킨 후, 활성 에스데르의 완전한 소비를 TLC 로 측정하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 이 여과박을 THF 25 ㎖ 로 세척하였으며 이 여과액을 증발시켰다. 잔여물을 아세트산 에틸 50 ㎖ 및 물 50 ㎖ 에 용해시켰다. 수상을 아세트산 에틸 2 × 20 ㎖ 로 세척하고 1M 의 KHSO₄20 ㎖ 로 산성화시켰으며 아세트산 에틸 3 × 40 ㎖ 로 추출하였다. 혼합시킨 아세트산 에틸 용액을 중성화시키기 위해 물로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 다음 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 잔여물인 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린을 THF 60 ㎖ 에 용해시켰으며, 추가로 정제함 없이 다음 단계에 사용하였다.

단계 C : 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린

요도메탄 (17.95 ㎖, 288 mM)을 실시예 2 의 단계 B 의 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린의 THF 용액에 첨가하였다. 이 용액을 8 ℃ 로 냉가시키고 온도를 13 ℃ 이하로 유지시키면서 THF 세척액 20 ㎖ 와 함께 THF 35 ㎖ 에 용해시킨 60 % 의 수산화나트륨 4.75 g (119 mM)의 교반된 슬러리로 옮겼다. 반응 혼합물을 11 ℃ 에서 24 시간 동안 교반시켰다. 온도를 13 ℃ 로 유지시키고 발포를 조절하면서 반응 혼합물에 물 1.6 ㎖ 을 조심스럽게 첨가함으로써 잉여 수산화나트륨을 분해시켰다. 반응이 중단된 반응 혼합물을 22 ℃ 에서 약 20 분간 교반시킨 다음 30 ℃ 이하의 환산 압력 하에서 약 40 ㎖ 로 농축시켰다. 물 (70 ㎖)을 잔여물에 첨가한 다음 t - 부틸 메틸 에테르 30 ㎖ 를 첨가하였다. 상을 분리시켰으며, 수상을 다시 t - 부틸 메틸 에테르 30 ㎖ 로 세척하였다. 수상 산물을 아세트산 에틸 40 ㎖ 와 혼합시키고 3 M 의 황산 용액으로 pH 를 2.2 로 맞추었다. 상을 분리시켰으며, 수상을 아세트산 에틸 40 ㎖ 로 역 - 추출하였다. 혼합시킨 유기상을 5 % 의 티오황산나트륨 용액 70 ㎖ 로 세척하였다. 상을 분리시켰으며, 온도를 50 ℃ 이하로 유지시키면서 유기상을 진공의 환산 압력 (33 - 45 kPa)하에서 소용량으로 농축시켰다. 잔여물을 THF 18.6 ㎖ 및 물 100 ㎖ 와 혼합시켰으며 시클로헥실아민으로 pH 를 8.5 로 맞추었다. 결과적으로 생성된 슬러리를 25 ℃ 내지 55 ℃ 의 환산 압력(9 - 33 kPa)하에서 100 ㎖ 로 농축시키고, 25 ℃ 로 조절하였으며 물71.5 ㎖ 로 희석시켜 약 10.5 시간 동안 교반시켰다. 슬러리를 여과하여 물로 세척하고 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤린 시클로헥실아민염(D - 시클로헵틸알라닐으로부터 63 % 수득함) 16.72 g 을 산출하기 위해 45 ℃ 에서 공기로 건조시켰다. R_f(8) = 0.55 - 0.65.

실시예 3

D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤릴 - L - 아르기닌 알데히드 헤미설페이트

제 1 단계 : 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐

3 차 - 부틸옥시카르보닐 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐 5.08 g (13 mM) [(Bajusz 등의 J. Med. Chem.33, 1729 (1990) 참조]을 클로로포름 13 ㎖ 에 현탁시킨 후, HCl 가스(0.11 - 0.15 g/㎖)로 포화된 아세트산 에틸 13 ㎖ 를 교반 및 빙냉시키면서 첨가하였다. 박층 크로마토그래피로 Boc 기가 절단됨을 측정하였다[R_f(11) = 0.5 (유리 화합물) ; Boc - 화합물)]. 반응이 끝나기 전에 현탁액을 디에틸 에테르 25 ㎖ 로 희석시켰으며, 형성된 결정 물질을 여과하여 아세톤 7 ㎖ 및 디에틸 에테르 7 ㎖ 로 세척하고 환산 압력에서 수산화칼륨으로 건조시켰다. 최종 N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐 히드로클로라이드를 디메틸포름아미드 13 ㎖ 로 용해시키고 -20 ℃ 로 냉각시킨 다음 혼합 무수물에 첨가하였다.

실시예 3 의 제 I 단계에서 획득한 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤린 트리에틸 - 암모늄염 (12 mM)을 -20 ℃ 로 냉각시킨 후 클로로포름산 이소부틸 1.6 ㎖ (12 mM)을 교반하면서 첨가하였다. 상기 N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐의 디메틸포름아미드 용액을 교반하면서 첨가한지 10 분 후에, 반응 혼합물의 pH 를 8 로 맞추기 위한 분량의 트리에틸아민 (약 1.8 ㎖ 가 요구됨)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 - 10 ℃ 에서 30 분간 교반시킨 후, O ℃ 에서 1 시간 동안 교반시켰다. 그 후에, 염을 여과시켜 제거하였으며 이 여과물을 아세트산 에틸 65 ㎖ 로 희석시켰다. 결과적으로 생성된 용액을 물 3 × 25 ㎖, 1M 의 황산수소칼륨 7 ㎖ 및 물 3 × 7 ㎖ 로 세척하였으며, 무수 Na₂SO₄로 건조시켜 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 흡착제로서 130 g 의 키에셀겔 60 (Kieselgel 60)(0.040 - 0.063 mm) 및 용출액으로서 아세트산 에틸을 사용하여, 획득한 산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피하였다. 오직 순수한 산물 [(R_f(1) = 0.60)]만을 함유한 분획들을 모아서 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 증발 잔여물을 디이소프로필 에테르로 결정화시켰다.

수득량 5.0 g (7.8 mM, 64 %), R_f(1) = 0.6.

FAB 질량 스펙트럼 (640[M + H⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

제 2 단계 : 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드

테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐 (실시예 3 의 제 1 단계) 4.8 g (7.51 mM)을 테트라히드로푸란 15 ㎖ 에 용해시킨 후, -50 ℃ 를 넘지 않는 온도에서 테트라히드로푸란에 용해시킨 3.6 mM 의 수소화 알루미늄 리튬 용액을 교반하면서 첨가하였다. 제 8 번 전개용매로 전개하는 박층 크로마토그래피로 환원과정을 관찰하였으며, 필요에 따라 약간의 수소화 알루미늄 리튬을 추가로 첨가하였다. 이 반응 혼합물이 pH 3 이 될 때까지 0.5 M 의 황산을 점적함과 동시에 이를 일정하게 교반 및 냉각시킨 다음, 물35 ㎖ 를 첨가하였다. 결과적으로 생성된 용액을 헥산 2 × 15 ㎖ 로 추출한 다음, 디클로로메탄 3 × 20 ㎖ 로 추출하였다. 디클로로메탄 추출물을 모아서, 물 3 × 15 ㎖ 및 찬 5 % 탄산수소나트륨 용액 15 ㎖ 로 세척하고, 다시 물 15 ㎖ 로 세척하였으며 무수 황산나트륨으로 건조시켜 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다.

수득량 3.9 g (6.07 mM, 81 %), R_f(8) = 0.40. [α]_D ²⁰= + 16.0 °(c = 1, 테트라히드로푸란).

FAB 질량 스펙트럼 (642[M + H⁺, 795[M + H + NBA]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

제 3 단계 : D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤린 - L - 아르기닌 알데히드 헤미설페이트

테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드 (실시예 3 의 제 2 단계) 3.21 g (5 mM)을 에탄올 40 ㎖ 및 0.5 M 의 숙신산 5 ㎖ 에 용해시킨 다음, 물 6 ㎖ 에 현탁시킨 촉매제 Pd - C 0.3 g 을 첨가하고, 이 혼합물을 약 10 ℃ 에서 수소화 반응시켰다. 반응 과정을 박층 크로마토그래피로 관찰하였다. 반응이 완료된 후 (약 15 분)에, 촉매제를 여과시켜 제거하였으며 이 여과물을 2.0 - 2.5 kPa 에서 약 4 - 6 ㎖ 로 농축시켰다. 잔여물을 물 40 ㎖ 로 희석시켰으며 디클로로메탄 4 × 7 ㎖ 로 추출하여 20 - 22 ℃ 에서 24 시간 동안 그대로 두었다. 용액을 디클로로메탄 3 × 15 ㎖ 로 다시 추출하고, 이온 - 교환 수지 두웩스 AG 1 - X8 (HO^-)로 pH 를 3.5 로 맞춘 다음, 이 용액을 동결 - 건조시켰다.

수득량 1.65 g (3.5 mM, 70 %), [α]_D ²⁰= - 94.7 °(c = 1, 물), HPLC : k′= 2.702 및 3.010.

FAB 질량 스펙트럼 (424 [M + H]⁺, 557 [M + H + NBA]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

출발물질의 합성

테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤린 트리에틸암모늄 염

단계 A : 클로로아세틸 - DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르

디클로로메탄 65 ㎖ 에 용해시킨 DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드 15.2 g ( 65 mM) 용액에 트리에틸아민 9.1 ㎖ (65 mM) 및 (N - 히드록시숙신이미딜) - 클로로아세트산^*14.9 g (78 mM)을 첨가하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄 65 ㎖ 로 희석시키고 계속해서 물 3 × 30 ㎖, 1 M 의 KHSO₄, 물 및 5 % 의 NaHCO₃로 세척하였으며 마지막으로 중성화시키기 위해 물로 세척하였다. 그 후에, 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 다음, 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 결과적으로 생성된 유성 산물을 휘발유 에테르로 분쇄시켰다. 고체 물질을 여과시켜 제거하고 휘발유 에테르로 세척하여 진공 건조기에서 건조시켰다. 클로로아세틸 - DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르 17.54 g (63.6 mM, ~ 98 %)을 획득하였으며, 바로 다음 반응에 사용하였다. R_f(7) = 0.73 - 0.83 이고 Mp. : 78 - 80 ℃ 이다.

C₁₃H₂₂NO₃Cl (275.777)에 대한 분석. 계산치 : C % = 56.62 ; H % = 8.04 ; N % = 5.08 ; Cl % = 12.86. 분석치 : C % = 55.65 ; H % = 7.93 ; N % = 5.06 ; Cl % = 12.72.

(N - 히드록시숙신이미딜) 클로로아세테이트의 제조

클로로아세틸 클로라이드 32 ㎖ (450 mM)을 N - 히드록시숙신이미드 23 g (200 mM)에 첨가하고 이 혼합물을 10 분 동안 환류시킨 후, 쇄빙상에 붓고 여과시켰으며 찬물로 세척하여 진공 건조기에서 건조시켰다. 20.23 g (105.9 mM, 53 %)을 수득하였으며, Mp. : 113.3 - 113.7 ℃ 이다.

C₆H₆NO₄ClC₇H₉NO₅(191.55)에 대한 분석. 계산치 : C % = 37.62 ; H % = 3.16 ; N % = 7.31 ; Cl % = 18.51. 분석치 : C % = 37.37 ; H % = 3.16 ; N % = 7.23 ; Cl % = 18.35.

단계 B : 클로로아세틸 - D - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르 (클로로아세틸 - DL - 시클로헵틸알라닌 메틸 에스테르의 효소적 분리)

톨루엔 30 ㎖ 에 용해시킨 DL - 에스테르, 클로로아세틸 - DL - 클로로헵틸알라닌 메틸 에스테르 8.71 g (31.6 mole) 용액에 물 70 ㎖ 및 서브틸리신 칼스버그(Subtilisin Carlsberg)(단백질분해효소 Ⅷ 형, 시그마) 50 ㎎ 을 첨가하였다. pH 7 에서 L - 에스테르인 L - 거울상이성질체를 효소적으로 가수분해시켰으며, 자동적정으로 유지시키고 3 M 의 NaOH 로 채워 넣었다. NaOH 의 소비가 멈추면 (5.522 ㎖, 16.57 mM), 이 반응 혼합물을 톨루엔 30 ㎖ 로 희석시키고 2 개의 층으로 분리시켰다. 수상을 톨루엔 2 × 20 ㎖ 로 세척하였다. 혼합된 톨루엔 용액은 D - 에스테르를 포함하며, 혼합된 수상은 L - 산의 나트륨염을 포함한다.

무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 4.18 g (15.16 mM)의 D - 에스테르를 수득하기 위해 환산 압력 하에서 증발시켰다. R_f(7) = 0.73 - 0.83 이며, 바로 D - 시클로헵틸알라닌을 제조하는데 사용하였다.

혼합된 수용액을 산성화시켰으며 아세트산 에틸 3 × 30 ㎖ 로 추출하였다. 혼합된 아세트산 에틸 용액을 물로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시켰으며, L - 산 [R_f(7) = 0.45 - 0.50] 3.46 g (13.22 mM)을 수득하기 위해 환산 압력 하에서 증발시키고 이를 바로 L - 시클로헵틸알라닌 제조에 사용하였다.

유사 제제인 D - 에스테르 4.08 g (14.79 mM) 및 L - 산 3.23 g (12.34 mM)을 DL - 에스테르 (실시예 2 의 단계 A) 8.25 g (30 mM)로부터 수득하였다.

단계 C : D - 시클로헵틸알라닌 히드로클로라이드

D - 에스테르 (실시예 3 의 단계 B) 8.27 g (30 mM)을 6 M 의 HCl 120 ㎖ 에 현탁시켜 3 시간 동안 환류시켰다. 유리 아미노산을 결정으로 분리시켰다. 반응 혼합물을 냉각시켜 밤새도록 냉각장치에 보관하고 여과시켰으며 찬물 및 에테르로 세척한 다음, 진공 건조기에서 건조시켰다. D - 시클로헵틸알라닌 히드로클로라이드 5.9 g (26.69 mM, 89 %)을 획득하였다. R_f(12) = 0.10 - 0.15 이고 [α]_D ²⁰= -11°(c = 0.4 ; 1M HCl)이다.

C₁₀H₁₉NO₂HCl (221.728)에 대한 분석. 계산치 : C % = 54.17 ; H % = 9.09 ; N % = 6.32 ; Cl % = 15.99. 분석치 : C % = 54.27 ; H % = 9.27 ; N % = 6.30 ; Cl % = 16.2.

단계 D : D - 시클로헵틸락트산 디시클로헥실암모늄염

D - 시클로헵틸알라닌 히드로클로라이드 (실시예 3 의 단계 C) 5.78 g (26.15 mM)을 물 26 ㎖ 에 용해시키고 물 105 ㎖ 및 빙초산 52.5 ㎖ 로 희석시켜 5 ℃ 로 냉각시켰다. 물 30 ㎖ 에 용해시킨 NaNo₂18.0 g (261 mM)의 용액을 이 혼합물에 교반 및 냉각시키면서 점적시켰다. 5 ℃ 에서 1 시간 동안 계속해서 교반시키고 밤새 실온에서 교반시켰다. 다음날, 반응 혼합물을 교반시킴과 동시에 cc HCl 25 ㎖ 로 산성화시켰다. 그 후에, 혼합물을 50 ℃ 의 환산 압력 하에서 건조시키기 위해 증발시켰다. 잔여물을 물 100 ㎖ 에 용해시키고 유사하게 증발시켜 톨루엔으로 환류시켰으며 이를 다시 증발시켰다. 결과적으로 생성된 잔여물을 아세트산 에틸 50 ㎖ 및 물 50 ㎖ 로 용해시켰다. 수상을 아세트산 에틸로 세척하였으며, 혼합된 아세트산 에틸 용액을 중성화시키기 위해 물로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시켜 환산 압력 하에서 증발시켰다. 그 다음 고체를 디이소프로필 에테르 20 ㎖ 에 용해시켰다. 이 용액에 디시클로헥실아민 5 ㎖ (25 mM)를 첨가하고 결정성 염을 분리시켰다. 결정을 냉각시킨 후에 여과시켜 제거하였으며, 찬 에테르로 세척하고 D - 시클로헵틸락트산 디시클로헥실아민염인 D - cHla. DCHA 5.5 g (14.96 mM, 57.2 %)을 수득하기 위해 진공 건조기에서 건조시켰다. R_f(7) = 0.53 - 0.60 이고 [α]_D ²⁰= +19.5°(c = 1 ; 메탄올)이며 Mp. : 147 - 150 ℃ 이다.

C₁₀H₁₈O₃(C₂₂H₄₁NO₃)에 대한 분석. 계산치 : C % = 71.89 ; H % = 11.24 ; N % = 3.81. 분석치 : C % = 71.57 ; H % = 11.34 ; N % = 3.83

D - cHla. DCHA 0.35 g (1 mM)의 유리 α- 히드록시산으로의 전환으로D - cHla 0.15 g (0.8 mM)을 수득하였으며, [α]_D ²⁰= + 10.1° (c = 1 ; 메탄올) ; mp. : 125 - 127 ℃ 이다.

C₁₀H₁₈O₃(186.252)에 대한 분석. 계산치 : C % = 64.48 ; H % = 9.74. 분석치 : C % = 64.54 ; H % = 9.86.

단계 E : D - 시클로헵틸락트산 벤질 에스테르

디메틸포름아미드 30 ㎖ 에 용해시킨 D - 시클로헵틸락트산 디시클로헥실암모늄염 (실시예 3 의 단계 D) 11.21 g (30.5 mM)의 용액에 브롬화벤질 3.57 ㎖ (30 mM)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 교반시킨 다음 여과시키고 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 잔여물을 0.5 M 의 탄산수소칼륨 20 ㎖ 및 디에틸 에테르 60 ㎖ 에 용해시켰다. 유기상을 계속해서 물 20 ㎖, 0.5 M 의 KHSO₄및 물로 세척한 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고 환산 압력 하에서 증발시켰다. 유성 잔여물은 8.3 g 의 D - 시클로헵틸락트산 벤질 에스테르 [R_f(3) = 0.2 - 0.3]이며, 이를 직접 단계 F 에 사용하였다.

단계 F : 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락트산 벤질 에스테르

디클로로메탄 30 ㎖ 에 용해시킨 D - 시클로헵틸락트산 벤질 에스테르 (실시예 3 의 단계 E) 8.29 g (30 mM)의 용액에 아세트산 에틸에 용해시킨 ~ 3 M 의 HCl 0.3 ㎖ 및 3.4 - 디히드로 - 2H - 피란 3.01 ㎖ (33 mM)을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 그대로 두었다. 그 후에, 반응 혼합물을 디클로로메탄 40 ㎖ 로 희석시키고 물 3 × 20 ㎖ 로 세척하였으며, 무수 황산나트륨으로 건조시켜 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 흡착제로 200 g 의 키에셀겔 60 (0.040 - 0.063 mm) 및 용출액으로 시클로헥산 및 아세트산 에틸이 85 : 15 인 혼합물을 사용하여 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피하였다. 오직 순수한 산물 [R_f(4) = 0.60 - 0.70]만을 함유한 분획들을 모아서 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 유성 잔여물은 7.9 g (21.9 mM, 73 %)의 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락트산 벤질 에스테르이며, 이를 바로 다음 단계에 사용하였다.

단계 G : 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락트산 트리에틸암모늄염

테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락트산 벤질 에스테르 (실시에 3 의단계 F) 7.21 g (20 mM)을 디메틸포름아미드 20 ㎖ 에 용해시켰으며, 트리에틸아민 2.8 ㎖ (20 mM)을 첨가하고 촉매제 Pd/C 0.1 g 으로 수소화 반응시켰다. 반응 과정을 박층 크로마토그래피로 관찰하였다 [R_f(1) = 0.30 (에스테르), 0.00(산)]. 반응이 완료된 후에, 촉매제를 여과시켜 제거하였으며 디메틸포름아미드 2 × 5 ㎖ 로 세척하였다. 여과물 및 세척액을 혼합시키고 20 mM 의 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락트산 트리에틸암모늄염으로 다음 단계에 사용하였다.

단계 H : 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤린 벤질 에스테르

실시예 3 의 단계 G 에서 획득한 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락트산 트리에틸암모늄염 용액(20 mM)을 +5 ℃ 로 냉각시키고 1 - 히드록시벤조트리아졸 2.7 g (20 mM), L - 프롤린 벤질 에스테르 히드로클로라이드 4.83 g (20 mM) 및 디시클로헥실카르보디이미드 4.12 g (20 mM)을 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 보관한 후, 여과시키고 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 잔여물을 아세트산 에틸 50 ㎖ 에 용해시켰으며 물 20 ㎖ 및 5 % 의 탄산수소나트륨으로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시켜 환산 압력 하에서 증발시켰다. 흡착제로 200 g 의 키에셀겔 60 (0.040 - 0.063 mm) 및 용출액으로 n - 헥산 및 아세트산 에틸이 1 : 1 인 혼합물을 사용하여 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피하였다. 오직 순수한 산물[R_f(3) = 0.3 - 0.4]만을 함유한 분획들을 모아서 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 유성 잔여물은 5.95 g (13 mM, 65 %)의 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤린 벤질 에스테르이며, 이를 바로 다음 단계에 사용하였다.

단계 I : 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤린 트리에틸암모늄염

테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤린 벤질 에스테르 (실시예 3 의 단계 H) 5.5 g 을 디메틸포름아미드 12 ㎖ 에 용해시켰으며, 트리에틸아민 1.68 ㎖ (12 mM)을 첨가하고 촉매제 Pb/C 0.1 g 으로 수소화 반응시켰다. 반응 과정을 박층 크로마토그래피로 관찰하였다 [R_f(1) = 0.30 (에스테르), 0.00 (산)]. 반응이 완료된 후에, 촉매제를 여과시켜 제거하였으며 디메틸포름아미드 2 × 2 ㎖ 로 세척하였다. 여과물 및 세척액을 혼합시키고 12 mM 의 테트라히드로피란일 - D - 시클로헵틸락틸 - L - 프롤린 트리에틸암모늄염을 함유하는 용액으로서 사용하였다.

실시예 4

N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드 헤미설페이트의 합성

단계 1 : 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐

3 차 - 부틸옥시카르보닐 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐 1.97 g (5 mM)[(Bajusz 등의 J. Med. Chem.33, 1729 (1990) 참조]을 5 ㎖ 의 클로로포름으로 현탁시킨 다음 HCl 가스 (0.11 - 0.15 g/㎖)로 포화시킨 아세트산 에틸 5 ㎖ 를 교반 및 빙냉시키면서 첨가하였다. Boc 기의 절단을 박층 크로마토그래피로 관찰하였다 [R_f(11) = 0.5 (유리 화합물) ; 1.0 (Boc - 화합물)]. 반응 마지막에 현탁액을 디에틸 에테르 10 ㎖ 로 희석시켰으며, 형성된 결정 물질을 여과시키고 아세톤 3 ㎖ 및 디에틸 에테르 3 ㎖ 로 세척하여 환산 압력 하에서 KOH 로 건조시켰다. 결과적으로 생성된 N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐 히드로클로라이드를 디메틸포름아미드 5 ㎖ 에 용해시켜 - 20 ℃ 로 냉각시켰으며 다음의 혼합 무수물에 첨가하였다.

1.95 g (5 mM)의 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산 (실시예 4, 단계 B)을 5 ㎖ 의 디메틸포름아미드에 용해시킨 다음 -15 ℃ 로 냉각시킨 후 교반시키면서 0.56 ㎖ (5.05 mM)의 N - 메틸 - 몰포린 및 0.665(5.05 mM)의 클로로포름산 이소부틸을 첨가하였다. 교반시킨지 10 분 후, N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐의 디메틸포름아미드 용액을 첨가한 다음 트리에틸아민으로 반응 혼합물의 pH 가 8 이 되도록 맞추었다(약 0.7 ㎖ 가 필요함). 반응 혼합물을 -10 ℃ 에서 30 분 동안 교반시킨 다음 0 ℃ 에서 1 시간 동안 교반시켰다. 그런 다음 염을 여과시켜 제거하고 여과물은 50 ㎖ 의 아세트산 에틸로 희석하였다. 결과적으로 생성된 용액을 3 × 7 ㎖ 의 물, 3 ㎖ 의 1 M KHSO₄및 3 × 3 ㎖ 의 물로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 다음 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 수득한 산물은 흡착제로 50 g 의 키에셀겔 60 (0.040 - 0.063 mm) 및 용출액으로 아세트산 에틸을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피하였다. 순수한 산물[R_f(1) = 0.70]만을 포함하는 분획을 모은 다음 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 증발 잔여물은 디이소프로필 에테르로부터 결정화하였다.

수득량 2.35 g (71 %), R_f(1) = 0.45 - 0.55.

FAB 질량 스펙트럼(661[M + H]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

제 2 단계 : 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드

2.15 g (3.25 mM)의 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 락탐 (실시예 4, 제 1 단계)을 5 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해시켜 교반시킨 다음 -50 ℃ 를 넘지않는 온도에서 테트라히드로푸란에 용해된 2.25 mM 의 LiAlH₄용액을 첨가하였다. 환원 과정을 박층 크로마토그래피 (전개용매로서의 용매 7)로 관찰하고 필요에 따라, 약간의 LiAlH₄를 추가로 첨가하였다. pH 가 3 이 될 때까지 일정하게 교반시키고 냉각시키면서 0.5 M 의 KHSO₄를 반응 혼합물에 점적하여 첨가한 다음 13 ㎖ 의 물을 첨가하였다. 결과적으로 생성된 용액은 2 × 5 ㎖ 의 헥산으로 추출한 다음 3 × 7 ㎖ 의 디클로로메탄으로 추출하였다. 디클로로메탄 추출물을 모은 다음 3 × 7 ㎖ 의 물, 7 ㎖ 의 차가운 5 % NaHCO₃용액으로 세척하고 7 ㎖ 의물로 다시 세척한 후 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 증발 잔여물은 디이소프로필 에테르로 처리하고 여과한 다음 환산 압력 하에서 건조시켰다.

수득량 1.6 g (74 %), R_f(7) = 0.33 - 0.43.

FAB 질량 스펙트럼 (663[M + H]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

제 3 단계 : N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드 설페이트

1.53 g (2.3 mM)의 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드 (실시예 4, 제 2 단계)를 23 ㎖ 의 에탄올 및 4.8 ㎖ 의 0.5 M 황산에 용해시킨 다음 3.5 ㎖ 의 물로 현탁시킨 0.15 g 의 Pd - C 결정을 첨가한 후 혼합물을 약 10 ℃ 에서 수소화반응시켰다. 반응 과정을 박층 크로마토그래피로 관찰하였다. 반응이 완료된 후에(약 15분), 결정을 여과시키고 여과물은 2.0 - 2.5 kPa 에서 약 2 -3 ㎖ 가 되도록 농축시켰다. 잔여물은 20 ㎖ 의 물로 세척한 다음 4 × 4 ㎖ 의 디클로로메탄으로 추출하고 수용액을 20 - 22 ℃ 에서 24 시간 동안 두었다. 용액을 3 × 4 ㎖ 의 디클로로메탄으로 다시 추출하고 이온 - 교환 수지 두웩스 에이쥐 1 - X 8 (HO^-)로 pH 를 3.5 가 되도록 맞춘 다음 동결 - 건조시켰다.

수득량 1.02 g (90 %), R_f(12) = 0.40.

FAB 질량 스펙트럼(395[M + H]⁺, 548[M + H]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

출발물질의 합성 :

벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산

단계 A : 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헥실글리신 2, 4, 5 - 트리클로로페닐 에스테르의 합성

50 ㎖ 의 디메틸포름아미드에 용해된 5.42 g (20 mM)의 D - 시클로헥실글리신 트리플루오르아세트산염 및 5.6 ㎖ (40 mM)의 트리에틸아민을 교반시킨 현탁액에 8.8 g(22 mM)의 벤질 - 펜타클로로페닐 카보네이트[Anteunis 등의 : Bul. Soc. Chim. Belg. 96, 775 (1987) 참조] 및 6.16 ㎖(44 mM)의 트리에틸아민을 첨가하였다. 교반시킨지 3 시간 후에, 반응 혼합물을 환산 압력 하에서 증발시키고 잔여물은 60 ㎖ 의 디에틸 에테르 및 60 ㎖ 의 물에 용해시켰다. 상을 분리한 다음, 유기상은 물로 세척하고 혼합된 수상은 디에틸 에테르로 세척한 후 1M KHSO₄로 pH 3 이 되도록 산성화한 다음 3 × 30 ㎖ 의 아세트산 에틸로 추출하였다. 유기상을 물로 세척하여 중화시키고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 다음 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다.

증발 잔여물은 20 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해시키고 4.54 g (22 mM)의 2, 4, 5 - 트리클로로 - 페놀 및 4.54 g (22 mM)의 디시클로헥실카르보디이미드를 혼합한 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헥실글리신이다. 3 시간 후에, 반응 혼합물을 여과시키고 여과물과 세척액을 혼합하여 환산 압력 하에서 증발시켰다. 고형 잔여물은 흡착제로서 140 g 의 키에셀겔 60 (0.040 - 0.063 mm) 및 용출액으로 클로로포름 및 아세톤의 95 : 5 혼합물을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 산물[R_f(5) = 0.7 - 0.8]만을 포함하는 분획을 모아 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다. 유성 잔여물은 디에틸 에테르와 함께 분쇄한 후 여과하고 디에틸 에테르로 세척한 다음 건조시켰다. 8.34 g (88.5 %)의 순수한 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헥실글리신 2, 4, 5 - 트리클로로페닐 에스테르를 수득하였다.

단계 B : 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산의 합성

10 ㎖ 의 피리딘에 용해시킨 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헥실글리신 2, 4, 5 - 트리클로로페닐 에스테르(5.18 g, 11 mM, 실시예 4 의 단계 A 산물) 용액에 L - 아제티딘 2 - 카르복시산(1.01 g, 10 mM) 및 트리에틸아민(1.4 ㎖, 10 mM)을 첨가하였다. 밤새 교반시킨 후, 반응 혼합물을 환산 압력 하에서 증발시키고 잔여물은 50 ㎖ 의 5 % NaHCO₃및 50 ㎖ 의 디에틸 에테르에 용해시켰다. 유기상은 물로 세척하고 혼합된 수상은 디에틸 에테르로 세척하고 pH 3 이 되도록 1M KHSO₄로 산성화시킨 다음 3 × 50 ㎖ 의 아세트산 에틸로 추출하였다. 아세트산 에틸 추출물을 혼합하고 물로 세척하여 중화시킨 다음 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 2.0 - 2.5 kPa 에서 증발시켰다.

증발 잔여물은 10 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해시키고 5.0 ㎖ (80 mM)의 요도메탄과 혼합한 후 0 ℃ 로 냉각시킨 벤질옥시카르보닐 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산이다. 이 용액에 1.2 g(30 mM)의 수소화나트륨 60 % 를 첨가하고 반응 혼합물은 실온에서 밤새 교반시켰다. 잉여 수소화나트륨은 0.4 ㎖ 의 물을 조심스럽게 첨가하면서 분해하였다. 반응이 중단된 반응 혼합물을 30 ℃ 이하의 온도, 환산 압력 하에서 약 10 ㎖ 가 되도록 농축시켰다. 잔여물을 15 ㎖ 의 물 및 10 ㎖ 의 t - 부틸 메틸 에테르로 희석하였다. 상을 분리한 후, 수상을 10 ㎖ 의 t - 부틸 메틸 에테르로 다시 세척하였다. 수상 산물은 15 ㎖ 의 아세트산 에틸과 혼합하고 3 M 황산 용액으로 pH 2.2 가 되도록 맞추었다. 혼합된 유기상은 15 ㎖ 의 5 % 티오황산 나트륨 용액으로 세척하였다. 상을 분리한 후, 수상을 10 ㎖ 의 아세트산 에틸로 역추출하였다. 상을 분리한 후, 유기상은 40 ℃ 이하에서 압력으로 증발시켰다. 유성 잔여물은 3.75 g 의 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산[9.65 mM, R_f(7) = 0.85 - 0.95]이며, 이를 9.65 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해시켜 실시예 4 의 제 1 단계에서 사용하였다.

FAB 질량 스펙트럼 (403[M + H]⁺)으로 가정구조식을 확인하였다.

실시예 5

펩티딜 아르기날에 의한 응괴 저해

원형질 응고에 대한 저해 효과는 기질로서 시트르산 인체 원형질을 사용하여 트롬빈 시간(TT), 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 및 프로트롬빈 시간(PT) 검정시 향상시킬 수 있다[Bagdy, D 등의 : Thromb. Haemostas. 67.325 (1992)를 참조하라]. TT 검정으로 단일 단계, 즉 외재성 트롬빈 작용으로 인한 피브리노겐의 응고가 저해됨을 평가한다(최종 농도는 2.5 NIH U/㎖). APTT 및 PT 검정시 원형질 응괴는 칼슘재침착에 의해 유도된다. 생성된 외재성 트롬빈은 이론적으로 50 NIH U/㎖ (APTT, PT) 만큼 높은 결과적으로 생성된 농도로 존재할 수 있다. 이러한 검정은 피브린 형성 및 트롬빈 생성에 관한 저해 작용을 검출하는 것이며, 이러한 작용은 트롬빈이나 다른 효소 (예를 들어, fXa)에 의해 조절되는 단백질분해작용을 포함한다. 항응고활성은 CT₂에서 나타나며, CT₂는 응혈시간을 배가시키는데 요구되는 농도(nM)이다.

이러한 여러 화합물은 응혈시간을 연장시키는 능력에 있어서 에페가트란 (C, D - MePhe - Pro - Arg - H, 모펩티드 아르기날)보다 우수하다 (표 1참조). 표 1 의 컬럼 A 는 항응고제로 공지되어 있는 에페가트란(C)[Bajusz, S. 등의 : J. Med. Chem. 33, 1729(1990) ; 미국 특허 번호 제 4,703,036 호(1982) ; Bagdy, D. 등의 : Thromb. Haemostas. 67, 357 및 68, 125(1992) ; Jackson, C.V. 등의 : Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis 2, 258(1996) 참조] 및 이외의 관련 펩티딜 아르기날(예를 들어, C1 및 C2) [Bajusz, S. 등의 : Bioorg. & Med. Chem. 3, 1079(1995) ; 미국 특허 번호 제 6,121,241 호(2000) ; PCT 공개 번호 제 WO 97/46576 호 참조]와 비교한 본 발명의 화학식(I)을 갖는 화합물(1 - 4)의 항응고 활성도를 나타낸다. TT 검정은 트롬빈 - 피브리노겐 반응을 저해하는데 있어서 에페가트란 만큼 효과적인 신규한 유사체를 나타낸다. 반면에 APTT 검정은 전술한 응고시 트롬빈 - 생성 단계를 저해하는데 있어서 에페가트란보다 더 효과적인 신규한 펩티드를 나타낸다.

실시예 6

트롬빈 및 Xa 인자의 저해

색소생산성 기질, 즉 트롬빈에 대한 Tos - Gly - Pro -Arg - pNA(S1) 및 Xa 인자에 대한 Moc - D - Chg - Gly - Arg - pNA(S2)(Bajusz, S. 등의 : PCT 공개 번호 제 WO 97/46576 호에 공개되어 있음)을 사용하여 혈소판 - 풍부 원형질 응고시 효소 저해를 시험하였다. 검정은 실온에서 유리관 및 96 - 웰 마이크로플레이트로 수행하였다.

(a) 용액.(i) 완충용액 A : 0.1 M 인산 나트륨/0.05 M NaCl (pH 8.5). (ii) 저해제 : 0.02 % 인체 알부민을 포함하는 완충용액 A 의 0.1, 1.0 및 10 ㎎/㎖ 용액. (iii) 기질 : 증류수에 용해시킨 1 mM 의 S1 및 2 mM 의 S2.

(b) 원형질 응괴 제조.유리관 내 혈소판 풍부 원형질 시료를 60 분 동안 80 ㎕ 40 mM CaCl₂와 함께 실온에서 항온하였다. 비결합효소를 제거하기 위해 응괴를 서서히 휘저으면서 생리식염수(0.9 % NaCl) 중 2 ㎖ 의 분취량으로 세척하였다. 성공적으로 세척된 경우에는, 세척제 및 S1 의 반응 혼합물의 최적 점도가 대조군보다 5 % 낮다. 따라서, 수득한 원형질 응괴는 사용할 때까지 튜브내 생리식염수에 저장하였다.

(C) 응고시 효소 저해의 평가.생리식염수를 제거한 후에, 원형질 응괴를 37 ℃ 에서 5 분 동안 400 ㎕ 의 저해제(또는 음성 대조로서 완충용액 A)와 함께 항온시키고 30 분 동안 100 ㎕ 의 기질 S1 또는 S3 와 함께 항온시킨 다음 100 ㎕ 의 50 % 아세트산으로 반응을 중단시켰다.반응 혼합물에서 150 ㎕ 를 취하여 마이크로플레이트의 웰에 넣고 405 nM 에서 흡광도를 측정하였다(엘라이자 리더 800, 미국 버몬트 위노스키에 소재하는 바이오 - 테크 인스트루먼츠 인코포레이티드에서 입수). 흡광 데이타로부터 IC₅₀값을 산출하였다.

결과를 표 1 의 컬럼 B 에 나타내었다. 화합물 1, 2, 3 및 4 는 응괴 - 결합 트롬빈 저해시 에페가트란보다 뛰어난 유사체이지만 응괴 - 결합 Xa 인자 저해시에도 각각의 유사체는 에페가트란보다 뛰어나다. 따라서 1, 2, 3 및 4 가 두 응괴 결합 효소에 대한 가장 뛰어난 저해제이다.

실시예 7

항섬유소용해 활성

조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA)와 같은 플라스미노겐(플로겐) 활성화인자 및 우로키나제(UK)에 의한 플라스민(PL) 및 플라스민 생성에 관한 본 발명의 화합물의 저해 효과를 피브린 플레이트 검정으로 시험하였다. 예를 들어, Bagdy, D., Barabas, E., Bajusz, S. 및 Szell, E., Thromb. Haemostas., 67 : 325-330(1992) ; Barabas, E. Szell, E. 및 Bajusz, S, BloodCoagulation and Fibrinolysis, 4 : 243(1993)을 참조하라. 결과를 표 1 의 컬럼 C 에 나타내었다. 몇몇을 제외하고는, 유사체는 세 섬유소용해성 효소에 대한 에페가트란보다 다소 뛰어난 저해제이다. 예외로는 PL 에 대한 C1 및 UK 에 대한 C1, C2 가 있으나, 반면에 3 은 UK 에 대한 에페가트란과 거의 동일한 활성을 갖는다.

실시예 8

분산된 정맥내 응고에 대한 토끼 모델

C3 뿐만 아니라 본 발명의 화합물 1 과 3 및 표 1 의 다른 펩티딜 아르기날을 Scherer, M. U. 등의 : Lab. Anim Sci. 45,538(1995)에 기재되어 있는 바와 같이 내독소(지질다당류, LPS) 처리 토끼에서 DIC - 저해 활성도에 대해 조사하였다. 검정 절차를 4 시간 동안 유지하였다. 내독소는 각각 0 및 120 분에 정맥내 대량주사로 80 및 40 ㎍/kg 의 투여량을 투여하였고, 반면에 펩티딜 아르기날 1, 3 및 C - C3 (0.25 및/또는 0.5 mg/kg/h)는 실험 전반에 걸쳐 주입하였다. 동물 대조군은 0.9 % 생리식염수로 처리하였다. 지혈 파라미터는 0, 120 및 240 분에 측정하였다.

조심스럽게 처리했음에도 불구하고, 토끼의 높은 내독소 - 감수성으로 인해 31 % 의 치사율을 나타냈다[Semerano, N. 등의 : Int. J. Clin. Lab. Res.21,214(1992)을 참조하라].

표 2 에 나타낸 데이타와 같이, 화합물 1 및 3 은 내독소 - 처리 토끼의 치사율을 현저하게 감소시키지만, 반면에 다른 항응고제는 치사율에 대해 효과를 나타내지 않거나(C1) 치사율을 증가시킨다. C3 의 경우 ~ 1.8 배 되어 가장 높은 값을 나타낸다. Xa 인자 뿐만 아니라 치사율을 감소시키는 1 및 3 이 응괴 - 결합 트롬빈에 대한 가장 뛰어난 저해제이며 또한 원형질 응고 및 플라스민과 플라스미노겐 활성화인자인 섬유소용해성 효소를 효과적으로 저해함은 표 1 의 데이타로부터 주목할 가치가 있는 것이다.

실시예 9

분산된 정맥내 응고에 대한 랫 모델

DIC 로 인한 가장 심각한 결과는 여러 기관에서의 피브린 침착, 혈소판 수의 감소와 같은 혈액세포 변화 및 피브린 분해 산물의 변화이다. 이러한 현상에 대한 본 발명의 화합물 1 및 에페가트란(C)과 헤파린(H)과 같은 두 조절 항응고제의 효과를 내독소 - 처리 랫에서 시험하였다[Ford, A.J. 및 Longridge, D.J. : Br. J. Pharmacol. 110, Suppl. 131P(1993) ; Hasegawa, N. 등의 : Am. J. Resp. Crit. Care Med. 153, 1831(1996) ; Dichneite, G. 등의 : Thromb. Res. 77, 357(1995)을 참조하라].

수컷 랫에서 10 ㎎/kg 의 내독소를 정맥내 대량주사하였다. 그런 다음 생리식염수 또는 시험 화합물을 4 시간 동안 정맥내 주입하였다. 0.25 ㎎/㎏ 의 화합물 1 및 3 을 초기 대량주사한 다음에0.25 ㎎/㎏/h 를 4 시간 동안 정맥내 주입하였다. 유사하게, 50 IU/㎏ 의 헤파린(H)을 초기 대량주사한 다음 50 IU/㎏/h 를 4 시간 동안 정맥내 주입하였다. 동물 대조군에는 0.9 % 생리식염수를 처리하였다.

¹²⁵I - 피브린의 침착을 선택된 기관(간 및 신장)에서 조사하였다. 내독소를 주사하기 30 분 전에¹²⁵I - 피브리노겐을 주사하였다. 조직 시료에서의 방사능을 감마 계측기(월락 위자드 1470)로 측정하였다. 기관내 마이크로트롬비 형성을 마이크로트롬비 지수로 정의된, 주사된 총¹²⁵I 활성도에 대한 기관¹²⁵I 활성도의 비율로 평가하였다. 이러한 파라미터의 변화는 생리식염수군에 대한 백분율로 나타낸다.

혈소판 수는 자동 장치(시스멕스 에프 - 800)로 결정하며, 이는 제어수치에 관한 것이다.

FDP(피브린 분해 산물)는 애그리스틴(리스토세틴) 침전 검정으로 측정한다.

분석치를 표 3 에 나타내었다.

표 3 의 데이타는 화합물 1 의 DIC - 저해 가능성이 헤파린 또는 에페가트란보다 뛰어남을 나타낸다.

실시예 10

랫 모델에서의 분산된 정맥내 응고에 대한 생존 시험

수컷 랫에게 30 ㎎/㎏ LPS(내독소)를 정맥내 대량주사하였다. 투여량 0.5 및/또는 0.75, 1.0 및 1.5 ㎎/㎏ 의 펩티드를 초기 대량주사한 다음 LPS 투여 직후에 8 시간 동안 주입하였다. LPS 투여 후 4, 5, 6, 7 및 8 시간에 사망률을 측정하였다.

표 4 의 데이타는 LPS 처리로 실험이 완료되었을 때(8 시간), 랫의 생존률이 20 % 로 감소됨을 나타낸다. 신규한 펩티딜 아르기날은 LPS 군에 비해 생존 기간을 연장시키고 사망률을 감소시킨다. 화합물 1, 2, 3 및 4 가 참조 화합물 C 보다 더 효과적이다.

Claims

다음 화학식 Ⅰ 의 화합물 및 유기산이나 무기산으로 형성된 이의 산 - 부가 염

화학식 Ⅰ

Xaa - Xbb - Arg - H

이 식에서, Xaa 는 다음 화학식 Ⅱ 의 α - 치환된 탄산 잔기를 나타내고,

화학식 Ⅱ

Q - CH(R) - CO

이 식에서, Q 는 C_1-3알킬옥시카르보닐아미노기, 메틸아미노기, 또는 히드록시기를 나타내고,

R 은 C_7-9시클로알킬메틸기, 1 - 아다만틸메틸기, 또는 C_5-7시클로알킬기를 나타내며,

Xbb 는 L - 프롤린 또는 L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산 잔기를 나타낸다.
다음 화학식 1 의 화합물 및 이의 산 - 부가 염.

화학식 1
다음 화학식 2 의 화합물 및 이의 산 - 부가 염.

화학식 2
다음 화학식 3 의 화합물 및 이의 산 - 부가 염.

화학식 3
다음 화학식 4 의 화합물 및 이의 산 - 부가 염.

화학식 4
제 1 항의 화합물을 포함하는 약학적 제형.
제 2 항의 화합물을 포함하는 약학적 제형.
제 3 항의 화합물을 포함하는 약학적 제형.
제 4 항의 화합물을 포함하는 약학적 제형.
제 5 항의 화합물을 포함하는 약학적 제형.
화합물 에톡시카르보닐 - D - 시클로헵틸알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드.
화합물 테트라히드록피란일 - D - 시클로헵틸 - 락틸 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드.
화합물 벤질옥시카르보닐 - N - 메틸 - D - 시클로헵틸 - 알라닐 - L - 프롤릴 - N^G- 벤질옥시카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드.
화합물 N - 메틸 - D - 시클로헥실글리실 - L - 아제티딘 - 2 - 카르보닐 - L - 아르기닌 알데히드.
제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 제형은 정제, 캡슐, 분말, 환제, 당제, 과립, 용액, 주입, 좌약, 플라스터 또는연고를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
응괴 결합 트롬빈, Xa 인자, 플라스민과 플라스미노겐 활성화인자에 저해 작용을 갖는 펩티딜 아르기날을 환자에게 투여함을 포함하는, 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
다음 화학식 Ⅰ 의 펩티딜 아르기날 또는 약학적으로 용인가능한 이의 산 - 부가 염을 환자에게 투여함을 포함하는, 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법

화학식 Ⅰ

Xaa - Xbb - Arg - H

이 식에서, Xaa 는 다음 화학식 Ⅱ 의 α - 치환된 탄산 잔기를 나타내고,

화학식 Ⅱ

Q - CH(R) - CO

이 식에서, Q 는 C_1-3알킬옥시카르보닐아미노기, 메틸아미노기 또는 히드록시기를 나타내고,

R 은 C_6-9시클로알킬메틸기, 1 - 아다만틸메틸기 또는 C_5-7시클로알킬기를 나타내며,

Xbb 는 L - 프롤린 또는 L - 아제티딘 - 2 - 카르복시산 잔기를 나타낸다.
다음 화학식 1 의 펩티딜 아르기날 또는 약학적으로 용인가능한 이의 산 - 부가 염을 환자에게 투여함을 포함하는, 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.

화학식 1
다음 화학식 2 의 펩티딜 아르기날 또는 약학적으로 용인가능한 이의 산 - 부가 염을 환자에게 투여함을 포함하는, 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.

화학식 2
다음 화학식 3 의 펩티딜 아르기날 또는 약학적으로 용인가능한 이의 산 - 부가 염을 환자에게 투여함을 포함하는, 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.

화학식 3
다음 화학식 4 의 펩티딜 아르기날 또는 약학적으로 용인가능한 이의 산 - 부가 염을 환자에게 투여함을 포함하는, 파종성혈관내응고를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.

화학식 4
제 1 항에 있어서, 환자 체중을 기초로 약 0.1 ㎎ 내지 약 50 ㎎/㎏ 의 펩티딜 아르기날을 환자에게 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 펩티딜 아르기날의 혈중 농도가 약 6μM 내지 약 100 μM 에 도달하도록 충분한 용량의 펩티딜 아르기날을 환자에게 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 펩티딜 아르기날을 동시에 또는 연속적으로 투여함을 특징으로 하는 방법.