KR20010012174A

KR20010012174A - 세린 프로테아제 억제제

Info

Publication number: KR20010012174A
Application number: KR19997010123A
Authority: KR
Inventors: 아당안톤에그베르트피터
Original assignee: 에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크; 악조 노벨 엔.브이.
Priority date: 1997-05-02
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2001-02-15
Also published as: CN1254345A; AR012631A1; RU2002104026A; PL336589A1; ES2218827T3; DE69823178D1; ZA983629B; HUP0002942A3; DE69823178T2; EP0979240B1; NO995316D0; CA2287569A1; ATE264339T1; AU7652098A; AU729910B2; TR199902692T2; BR9809342A; EP0979240A1; PT979240E; RU2183642C2

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물에 관한 것이다:

화학식 I

R¹SO₂-B-X-Z-C(0)-Y

상기 식 중,

B는 결합, 화학식 -NH-CH[(CH₂)_pC(O)OH]-C(O)-의 아미노산 또는 이것의 에스테르 유도체(여기서, p는 1, 2 또는 3임), Gly, D-1-Piq, D-3-Piq, D-1-Tiq, D-3-Tiq, D-Atc, Aic, 또는 소수성의 염기성 또는 중성 측쇄를 함유하고 있는 L-아미노산 또는 D-아미노산이고,

X는 소수성 측쇄를 함유한 아미노산, 글루타민, 세린, 트레오닌, N, O 또는 S 중에서 선택된 추가의 헤테로 원자를 임의로 함유하고, (C₁∼C₆)알킬, (C₁∼C₆)알콕시, 벤질옥시 또는 옥소에 의해 임의로 치환되는 시클릭 아미노산이거나, 또는 X는 2-아미노이소부티르산, -NR²-CH₂-C(O)- 또는 단편또는이며, 여기서 n은 2, 3 또는 4이고, W는 CH 또는 N이며, R³은 H, (C₁∼C₆)알킬 또는 페닐(이들 기는 히드록시, (C₁∼C₆)알콕시, COOH, COO(C₁∼C₆)알킬, CONH₂, 또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음)이고,

Z는 리신 또는 4-아미노시클로헥실글리신이다.

본 발명의 화합물은 항응고 활성을 가지고 있으므로, 트롬빈 관련 질환을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있다. 상기 식 중에서, 변수 R¹과 Y는 청구항 1에 정의된 바와 같다.

Description

세린 프로테아제 억제제{SERINE PROTEASE INHIBITORS}

세린 프로테아제는, 특히 혈액 응집 다단계에 중요한 역할을 하는 효소이다. 이러한 프로테아제 군에 속하는 것들의 예로는 트롬빈, 트립신, 인자 VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa 및 프로테인 C가 있다.

트롬빈은 응집 다단계에서 최종 단계를 조절하는 세린 프로테아제이다. 트롬빈의 주기능은 피브리노오겐을 분할하여 피브린 단량체 생성시키며, 이 단량체는 가교 결합에 의해 불용성 겔을 형성한다. 더구나, 트롬빈은 다단계 초기에 인자 V 및 VIII를 활성화시켜 자체 생산을 조절한다. 또한, 트롬빈은 세포 수준에서 중요한 작용, 즉 트롬빈이 특정 수용체에 작용하여 혈소판 응집, 상피 세포 활성 및 섬유아세포 증식을 발생시키는 작용을 한다. 따라서, 트롬빈은 지혈 및 혈전 형성에 중추적인 조절 역할을 한다. 트롬빈의 억제제는 광범위한 치료 용도를 가질수 있기 때문에, 이러한 분야에 대한 폭넓은 연구가 수행되고 있다.

세린 프로테아제, 보다 구체적으로 트롬빈의 합성 억제제의 개발 과정에서, 천연 기질에 대한 것과 유사한 방식으로 단백질 분해 효소에 의해 인지되는 저분자 합성 펩티드에 대한 관심이 증가하고 있다. 결과로서, 트롬빈의 전이 상태 억제제와 같은 신규한 펩티드류 억제제가 제조되었다.

보다 효과적이고 보다 선택적인 트롬빈 억제제에 대한 연구는 보다 낮은 투여량으로 투여할 수 있고 덜 심각한 부작용을 갖고 있는 트롬빈 억제제를 얻기 위해 부단히 계속되고 있다. 게다가, 특별히 경구 생체내 이용율에 대한 관심이 모아지고 있다. 효과적인 정맥내 트롬빈 억제제는 트롬빈 관련 질환의 치료가 요구되는 응급 처치에 임상적으로 효과적이다. 그러나, 심근 경색증, 혈전증 및 발작과 같은 트롬빈 관련 질환의 예방은 장기간 치료, 바람직하게는 항응고제를 경구 투여하여 장기간 치료하는 것이 필요하다.

선행 공개 문헌 상에 개시되어 있는 많은 펩티드류 세린 프로테아제 억제제, 특히 트롬빈 억제제는 서열 -D-Phe-Pro-Arg-를 주성분으로 한다{예를 들면, 브레디 등의 문헌[Bioorganic ＆ Medical Chemistry, 3(1995), 1063-78]과 미국 특허 제597,804호에 개시된 바와 같은 화합물 참조}. 또한, 상기 브레디 등의 문헌, 루이스 등의 문헌[Thrombosis and Haemostasis, 74(4)(1995), 1107-12] 및 추가로 조네스 등의 문헌[J. Enzyme Inhibition, 9(1995), 43-60]에 개시된 기타 트롬빈 억제제와 같은 트롬빈 억제제는 아기닌 대신에 리신 측쇄를 함유할 수도 있다. 상기 마지막 공개 문헌에는 α-케토 메틸 에스테르 작용기를 함유하는 트리펩티드가 반응성 화합물이어서 트롬빈 억제제로서 추가 개발하기에는 바람직하지 못하다고 보고되어 있다. 또한, 리신 또는 아기닌 측쇄 대신에 아미노시클로헥실 부위를 함유하고 있는 트롬빈 억제제는 문헌 WO 94/25051호에 기재되어 있다. 또한, 이들 참고 문헌 및 기타 참고 문헌[예, 미국 특허 제5,525,308호]에서도 이들 펩티드류 트롬빈 억제제의 C 말단에 존재하는 다수의 변형기가 알려져 있다. 이런 분야의 개발에서는 이러한 유형의 트롬빈 억제제의 생리학적 특성을 어떻게 조절할 수 있는지에 관한 방법의 이해가 이미 진전되어 있다. 그러나, 우수한 경구 생체내 이용율을 갖고 있는 선택적인 트롬빈 억제제를 발견하기 위해 많은 노력을 기울이고 있는데도, 아직까지 트롬빈 억제제의 필수 요건을 충족시키는 해당 기술 분야에 알려진 전이 상태 트롬빈 억제제는 몇개 밖에 없다.

본 발명은 신규한 세린 프로테아제 억제제, 이것을 함유하는 약학 조성물, 및 트롬빈 관련 질환을 치료하고 예방하기 위한 의약품을 제조하는데 상기 억제제를 사용하는 방법에 관한 것이다.

놀랍게도, 본 발명자들은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 전구 물질 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염이 유효하고 선택적인 세린 프로테아제 억제제임을 발견하게 되었다.

R¹SO₂-B-X-Z-C(0)-Y

상기 식 중,

R¹은 R²OOC-(CHR²)_m- 또는 R²NH-C0-(CHR²)_m- 이거나, (C₁∼C₁₂)알킬, (C₂∼C₁₂)알케닐(이들 기는 (C₃∼C₁₂)시클로알킬, (C₁∼C₆)알콕시, OH, COOR², CF₃또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음) 중에서, 그리고 (C₆∼C₁₄)아릴, (C₇∼C₁₅)아르아릴 및 (C₈∼C₁₆)아르알케닐(이들 중 아릴기는 (C₁∼C₆)알킬, (C₃∼C₈)시클로알킬, (C₁∼C₆)알콕시, OH, COOH, CF₃또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음) 중에서 선택되며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고, R²는 각각 H, (C₁∼C₁₂)알킬, (C₃∼C₈)시클로알킬, (C₆∼C₁₄)아릴 또는 (C₇∼C₁₅)아르알킬(이들 중 아릴기는 (C₁∼C₆)알킬, (C₁∼C₆)알콕시 또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음)이며,

X는 소수성 측쇄를 함유한 아미노산, 글루타민, 세린, 트레오닌, N, O 또는 S 중에서 선택된 추가 헤테로 원자를 임의로 함유하고, (C₁∼C₆)알킬, (C₁∼C₆)알콕시, 벤질옥시 또는 옥소에 의해 임의로 치환되는 시클릭 아미노산이거나, 또는 X는 2-아미노-이소부티르산, -NR²-CH₂-C(O)- 또는 단편또는이며, 여기서 n은 2, 3 또는 4이고, W는 CH 또는 N이며, R³은 H, (C₁∼C₆)알킬 또는 페닐(이들 기는 히드록시, (C₁∼C₆)알콕시, COOH, COO(C₁∼C₆)알킬, CONH₂, 또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음)이고,

Z는 리신 또는 4-아미노시클로헥실글리신이며,

Y는 -NH-(C₁∼C₆)알킬렌-C₆H₅(여기서, 페닐기는 (C₁∼C₆)알킬, (C₁∼C₆)알콕시 또는 할로겐에 의해 치환될 수 있음)이거나, 또는 Y는 -OR⁴또는 -NR⁵R⁶(여기서, R⁴는 H, (C₂∼C₆)알킬 또는 벤질이고, R⁵와 R⁶은 각각 H, (C₁∼C₆)알콕시, 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 (C₁∼C₆)알킬이거나, 또는 R⁵과 R⁶은 함께 (C₃∼C₆)알킬렌을 형성하거나, 또는 R⁵과 R⁶은 질소 원자와 함께 결합하여(여기서, V는 0, S 또는 SO₂임) 형성한다. 특히, 본 발명의 화합물은 트롬빈의 억제제, 인자 VIIa/조직 인자의 억제제 및 인자 Xa의 억제제이다. 본 발명의 화합물은 개선된 약력학, 특히 경구 투여 후 우수한 생체내 이용율을 나타낸다. 본 발명의 일부인 α-(C₂∼C₆)케토 에스테르 화합물은 종래의 보고된 반응성 α-케토 메틸 에스테르 화합물이 지닌 단점들을 나타내지 않는다.

본 발명의 화합물은 트롬빈 매개 질환 및 트롬빈 관련 질환을 치료하고 예방하는데 유용하다. 이러한 질환은 심정맥 혈전증, 폐색전증, 혈전성 정맥염, 혈전증과 색전증에 의한 동맥 폐색증, 혈관 성형 또는 혈전 용해 동안 또는 이후의 동맥 재폐색증, 동맥 손상 또는 침입성 심장병학적 처치에 따른 재발협착증, 수술후 정맥성 혈전증 또는 색전증, 급성 또는 만성 죽상 동맥 경화증, 발작, 심근 경색, 암과 전이, 및 신경변성 질환을 비롯하여 응집 다단계가 활성화되는 다수의 트롬보 상태 및 프로트롬보 상태를 포함하는데, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화합물은 투석 및 외과 수술에서 절대적으로 필요한 바와 같이 체외 혈액 순환에서 항응고제로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 시험관내 항응고제로 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 바람직한 세린 프로타아제 억제제는 Z가 리신인 화합물이다. 보다 바람직한 화합물은 X가 시클릭 아미노산, 소수성 측쇄를 함유하는 아미노산, 글루타민, 세린, 트레오닌, -NR²-CH₂-C(O)-, 또는 단편또는(여기서, R³은 H, (C₁∼C₆)알킬 또는 페닐임)인 화합물이다.

특히 바람직한 화합물은 X가 프롤린, 류신, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, -NR²-CH₂-C(O)-{식 중, R²는 메틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실, 또는 단편또는(여기서, R³은 H 또는 메틸임)임}인 화합물이다.

기타 바람직한 화합물은 B가 결합이거나, 소수성 또는 중성 측쇄를 함유하는 D-아미노산인 화합물이다. 본 발명의 가장 바람직한 화합물은 R¹이 (C₁∼C₆)알킬 또는 벤질인 화합물이다. Y의 정의 중 R⁴는 (C₂∼C₆)알킬 또는 벤질인 것이 바람직하다. Y가 -OCH(CH₃)₂인 화합물이 특히 바람직하다. 또한, Y가 NH₂인 화합물도 바람직하다.

(C₁∼C₁₂)알킬이라는 용어는 메틸, 에틸, t-부틸, 이소펜틸, 헵틸, 도데실 등과 같이 탄소 원자 수가 1 내지 12인 분지쇄형 또는 비분지쇄형 알킬을 의미한다. 바람직한 알킬기는 탄소 원자 수가 1 내지 6인 (C₁∼C₆)알킬기이다.

(C₂∼C₁₂)알케닐이라는 용어는 탄소 원자 수가 2 내지 12인 분지쇄형 또는 비분지쇄형 불포화 탄화수소기를 의미한다. (C₂∼C₆)알케닐기가 바람직하다. 예로는 에테닐, 프로페닐, 알릴 등이 있다.

(C₁∼C₆)알킬렌 이라는 용어는 -(CH₂)_s-(여기서, s는 1 내지 6임), -CH(CH₃)-, -CH(CH₃)-(CH₂)- 등과 같이 탄소 원자 수가 1 내지 6인 분지쇄형 또는 비분지쇄형 알킬렌기를 의미한다. Y의 정의에서 알킬렌기는 에틸렌 및 메틸렌인 것이 바람직하다.

(C₁∼C₆)알콕시라는 용어는 탄소 원자 수가 1 내지 6인 알콕시기를 의미하며, 여기서 알킬 부위는 앞서 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.

(C₃∼C₁₂)시클로알킬이라는 용어는 탄소 원자 수가 3 내지 12인 모노시클로알킬기 또는 디시클로알킬기를 의미하며, 이 시클로알킬기는 옥소기에 의해 임의로 치환될 수 있다. 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등과 같은 (C₃∼C₈)시클로알킬이 바람직하다. 시클로펜틸 및 시클로헥실은 훨씬 더 바람직한 시클로알킬기이다. R¹의 정의에서 바람직한 시클로알킬 치환된 알킬기는 캄포기이다.

(C₆∼C₁₄)아릴기는 탄소 원자 수가 6 내지 14인 방향족 부위이다. 이 아릴기는 N, S 또는 O와 같은 하나 이상의 헤테로 원자를 더 함유할 수도 있다. 아릴기의 예로는 페닐, 나프틸, (이소)퀴놀릴, 인다닐 등이 있다.

(C₇∼C₁₅)아르알킬기와 (C₈∼C₁₆)아르알케닐기는 각각 하나 이상의 아릴기에 의해 치환되고 각각 전체 탄소 원자 수가 7 내지 15와 8 내지 16인 알킬기 및 알케닐기이다.

할로겐이라는 용어는 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.

에스테르 유도체라는 용어는 임의의 적당한 유도체, 바람직하게는 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 또는 t-부틸 에스테르와 같은 (C₁∼C₄)알킬 에스테르를 의미한다.

Atc라는 용어는 2-아미노테트랄린-2-카르복실산이고, Aic라는 용어는 아미노 인단 카르복실산을 의미한다. 1-Tiq와 3-Tiq라는 용어는 각각 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-1-카르복실산과 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산을 의미하고, 1-Piq와 3-Piq라는 용어는 각각 퍼히드로이소퀴놀린-1-카르복실산과 퍼히드로이소퀴놀린-3-카르복실산을 의미한다.

소수성 측쇄를 함유하는 아미노산이라는 용어는 측쇄가 (C₃∼C₈)시클로알킬, (C₆∼C₁₄)아릴 또는 (C₁∼C₆)알킬인 아미노산을 의미하며, 여기서 알킬기는 하나 이상의 (C₃∼C₈)시클로알킬 또는 (C₆∼C₁₄)아릴에 의해 임의로 치환될 수 있다. 이 소수성 측쇄는 히드록시, 할로겐, 트리플루오로메틸, -OSO₂CF₃, (C₁∼C₄)알킬(예, 메틸 또는 에틸), (C₁∼C₄)알콕시(예, 메톡시), 페닐옥시, 벤질옥시 등과 같은 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다. 소수성 측쇄를 함유하는 바람직한 아미노산으로는 류신, 발린, 시클로헥실알라닌, 4-메톡시-시클로헥실알라린, 시클로-옥틸알라닌, 페닐알라닌, D-나프틸알라닌, 티로신, O-메틸 티로신(또는 p-메톡시-페닐알라닌), 3,3-디페닐알라닌, 노르류신 및 류신이 있다.

염기성 측쇄를 함유하는 아미노산의 예로는 아기닌과 리신, 바람직하게는 아기닌이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

중성 측쇄를 함유하는 아미노산이라는 용어는 글루타민(Gln), 메티오닌 설폰, 아스파라긴(Asn) 등과 같은 아미노산을 언급한 것이다. Gln 또는 Asn이 바람직하다.

시클릭 아미노산의 예로는 2-아제티딘 카르복실산, 프롤린, 피페콜산, 1-아미노-1-카르복시-(C₃∼C₈)시클로알칸(바람직하게는 C₄, C₅또는 C₆), 4-피페리딘 카르복실산, 4-티아졸리딘 카르복실산, 3,4-데히드로-프롤린, 아자프롤린, 2-옥타히드로인돌 카르복실산 등이 있다. 2-아제티딘 카르복실산, 프롤린, 피페콜산, 4-티아졸리딘 카르복실산, 3,4-데히디로-프롤린 및 2-옥타히드로인돌 카르복실산이 바람직하다.

정의에 있어서, "치환된"이라는 용어는 하나 이상의 치환체에 의해 치환된다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 투여 후에 활성 화합물로 물질 대사되는 화학식 I로 표시된 화합물의 전구 물질도 포함한다. 적당한 전구 물질의 예로는 N-알콕시카르보닐(바람직하게는 N-에톡시카르보닐) 보호된 화학식 I로 표시되는 화합물의 유도체가 있다.

또한, 본 발명은 적당하게 보호된 아미노산 도는 아미노산 유사체를 커플링시킨 다음, 보호기를 제거하는 단계를 포함하여 화학식 I로 표시되는 화합물을 제조하는 방법을 포함한다.

화학식 I에 따른 화합물은 이러한 화합물에 대한 종래의 방식으로 제조할 수 있다. 이러한 목적을 위해서는, 적당하게 Nα보호된(그리고, 반응성 측쇄가 존재할 경우에는 반응 측쇄 보호된) 아미노산 유도체 또는 펩티드를 활성화시켜 용액 중에 또는 고체 지지체 상에서 적당하게 카르복실 보호된 아미노산 또는 펩티드 유도체에 커플링시킨다. α아미노 작용기의 보호는 일반적으로 산 반응성 t-부톡시카르보닐(Boc)기, 벤질옥시카르보닐(Cbz)기 및 치환된 유사기 또는 염기 반응성 9-플루오레닐-메틸옥시카르보닐(Fomc)기와 같은 우레탄 작용기에 의해 일어난다. 또한, Cbz기는 접촉 수소 첨가에 의해 제거될 수도 있다. 기타 적당한 아미노 보호기로는 Nps, Bpoc, Msc 등을 들 수 있다. 아미노 보호기에 대한 만족할 만한 개관은 이. 그로스와 제이. 미엔호퍼 편저의 문헌[The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, 뉴욕 소재의 아카데믹 프레스(1981)]에 기재되어 있다. 카르복실기의 보호는 에스테르 형성, 예를 들어 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르와 같은 염기 반응성 에스테르, t-부틸에스테르와 같은 산 반응성 에스테르, 또는 벤질에스테르와 같은 가수소 분해 반응성 에스테르에 의해 일어날 수 있다. 리신 또는 4-아미노시클로헥실글리신의 측쇄 작용기의 보호는 앞서 언급한 기들을 사용하여 달성할 수 있다. 적당하게 보호된 아미노산 또는 펩티드의 카르복실기의 활성화는, 특히 1-히드록시벤조트리아졸, N-히드록시숙신이미드, 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아졸, N-히드록시-5-노보넨-2,3-디카르복시미드와 같은 촉매 활성 및 라세미화 억제 화합물을 첨가하면서 아지드, 혼합된 무수물, 활성 에스테르, 또는 카보디이미드 수단에 의해 일어날 수 있다{문헌[The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology(상기 문헌)]과 [Pure and Applied Chem. 59(3), 331-344(1987)] 참조}.

유리 염기의 형태로 존재할 수 있는 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 반응 혼합물로부터 분리할 수 있다. 또한, 이 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 I의 유리 염기를 유기산 또는 무기산, 예를 들면 염화수소, 브롬화수소, 요오드화수소, 황산, 인산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 말레이산, 말론산, 메탄설폰산, 푸마르산, 숙신산, 타르타르산, 구연산, 벤조산, 및 아스코브산으로 처리함으로써 얻을 수도 있다.

본 발명의 화합물은 하나 이상의 키랄성 탄소를 함유하고 있으므로, 순수한 거울상 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물, 또는 부분입체 이성질체를 함유하는 혼합물로서 얻어질 수 있다. 순수한 거울상 이성질체를 얻는 방법은 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 그러한 방법의 예로는 광학 활성 산과 라세믹 혼합물로부터 얻어지는 염의 결정화법 또는 키랄성 컬럼을 사용한 크로마토그래피법이 있다. 부분입체 이성질체인 경우에는 직상 컬럼과 역상 컬럼을 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 사람인 경우 1일 투여량을 0.001∼100 mg/kg(체중), 바람직하게는 0.01∼10 mg/kg(체중)으로 하여 소장내로 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은, 예를 들면 표준적인 참고 문헌인 겐나로 등의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18판, 맥크 퍼블리싱 컴파니(1990), 특히 '제8장 : Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture'을 참조)]에 설명되어 있는 바와 같이, 약학적으로 적당한 보조제와 혼합하여 고체 투여 단위(예, 환약, 정제)로 압착시키거나, 또는 캡슐 또는 좌약으로 가공 처리할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은, 약학적으로 적당한 액체에 의해, 예를 들면 주사 제제로 사용하는 경우 용액, 현탁액, 유화액의 형태로 도포하거나, 비강내 스프레이로 사용하는 경우 스프레이의 형태로 도포할 수 있다.

투여 단위, 예를 들면 정제를 제조하는 경우에는 충전제, 착색제, 중합체 결합제 등과 같은 통상적인 첨가제를 사용한다. 일반적으로는, 활성 화합물의 작용을 방해하지 않은 임의의 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 사용할 수 있다.

조성물과 함께 투여할 수 있는 적당한 담체로는 적당량으로 사용되는 락토오스, 전분, 셀룰로오스 유도체 등, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

이하, 실시예를 참고하여 본 발명을 더 설명한다.

포괄적인 약어

Et = 에틸 Bzl = 벤질

Boc = t-부틸옥시카르보닐 Cbz = 벤질옥시카르보닐

Cha = 시클로헥실알라닐 Pro = 프롤릴

Lys = 리실 Acg = 4-아미노시클로헥실 글리실

THF = 트리플루오로 아세트산 Pac = 페닐아세틸

Nps = 니트로페닐설포닐 Bpoc = 2-p-비페닐이소프로필옥시카르보닐

Asp = 아스파틸 Glu = 글루타밀

Dpa = 디페닐알라닐 H-Aad-OH = 아미노-아디프산

Tyr(Me) = (O-메틸)-티로실 Phe = 페닐알라닐

Nal = 나프틸렌-2-일-알라니닐

H-3-Tiq-OH = 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산

Msc = 메틸설포닐에틸옥시카르보닐

Teoc = 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐

norLeu(시클로)-Gly-OH = (S)-3-아미노-2-옥소-헥사히드로-1-아제핀아세트산

norVal(시클로)-Gly-OH = (S)-3-아미노-2-옥소-1-피페리딘아세트산

포괄적인 실험

HPLC에 사용된 용매 시스템은, A: 0.5M 인산염 완충제 pH = 2.1, B: 물, C: 아세토니트릴/물 3/2 v/v이었다.

다른 특별한 언급이 없는 한, 보유 시간(Rt(LC))은 분석용 HPLC Supelcosil LC-18-DB 컬럼(5 ㎛ 입자, 250 ×2.1 mm) 상에서 측정하였는데, 이 컬럼에서는 용매 시스템 A, B, C의 구배(특정되어 있음)를 사용하여 35℃에서 유속 0.25 mL/분으로 용출시켰다.

실시예 1

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-NHBzl

(a) Cbz-Lys(Boc)-OMe

디클로로메탄/메탄올(9/1 v/v, 500 mL) 중의 Cbz-Lys(Boc)-OH(28 g) 용액에 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(23. 6 g)을 첨가하고, 이 용액을, 트리에틸아민을 첨가하여 pH 8.0으로 조정하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 차가운 1N 염산, 물, 5% 탄산수소나트륨 및 물 순으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과액을 증발시키고, 잔류물을, 에틸 아세테이트/헵탄(1/4 v/v)을 용출제로 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 정제하였다. Cbz-Lys(Boc)-OMe를 함유하는 분류들을 모아 증발시켰다.

생성량 : 29.1 g

TLC: Rf = 0.85(실리카 상에서 에틸 아세테이트/헵탄 =3/1 v/v를 사용함)

(b) Cbz-Lys(B0c)Ψ[시아노아세테이트]

무수 디클로로메탄(800 mL) 중의 Cbz-Lys(Boc)-OMe(29.1 g) 차가운(-78℃) 용액에 반응 온도를 -70℃ 이하로 유지하면서 디이소부틸알루미늄 히드라이드(헥산 중의 1M 용액 222 mL)을 적가하였다. 형성된 용액을 1 시간 동안 -78℃에서 교반하고, 이 반응 혼합물에 5% 구연산 수용액(600 mL)을 첨가하였다. 2 층 혼합물을 실온에서 10 분 동안 교반하고, 층들을 분리한 다음, 수층을 디클로메탄으로 2회 추출시켰다. 합한 디클로로메탄 층을 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과시켰다. 여과액을 질소 대기 하에 교반하고, 빙조에서 냉각시켰다. 수(600 mL)중의 나트륨 시아나이드(36. 3 g)와 벤질트리에틸 암모늄 클로라이드(4.2 g) 용액을 첨가하였다. 강렬한 교반 하에 아세트산 무수물을 부분적으로 나누어(2 ×9 mL) 30 분에 걸쳐 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수층을 디클로로메탄으로 2회 추출시켰다. 합한 디클로로메탄 층을 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 진공 하에 건조시켰다. 잔류물을 실리카(용출제: 헵탄/에틸 아세테이트 = 1/1 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 Cbz-Lys(Boc)Ψ[시아노아세테이트](26.3 g)을 생성시켰다.

TLC : Rf = 0.60(실리카 상에서 디클로로메탄/에틸 아세테이트 = 7/3 v/v를 사용함)

(c) Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOCHO]-OMe

디에틸에테르/메탄올 = 3/1 v/v(600 mL) 중의 Cbz-Lys(Boc)Ψ[시아노아세테이트](26. 3 g) 용액을 질소 대기 하에 -20℃로 냉각시키고, 온도를 -5℃ 이하로 유지하면서 기체상 염화수소 66 g을 유입시켰다. 이 반응 혼합물을 4℃로 밤새 유지시켰다. 온도를 5℃ 이하로 유지하면서 상기 반응 혼합물에 물(100 mL)을 적가하였다. 실온에서 16 시간 동안 교반한 후, 유기층을 분리하고, 물로 세척하였다. 수층을 염화나트륨으로 포화시키고, sec-부탄올/디클로로메탄 = 3/2 v/v로 추출시켰다. 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 진공 하에 건조시켜 미정제 아민 25.4 g을 생성시켰다. 잔류물을 N,N-디메틸포름아미드(400 mL) 중에 습윤시키고, 디-tert-부틸 중탄산염(16 g)을 첨가한 다음, 트리에틸아민을 사용하여 pH 8로 조정하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발로 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 물과 염수 순으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 진공 하에 증발시켰다. 잔류물은 실리카(용출제: 에틸 아세테이트/헵탄 = 4/6 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe(15. 8 g) 을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.75(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 = 63/20/26/11 v/v/v/v 사용함).

(d) Cbz-Lys(Boc)Ψ[CH0HCO]-OH

디옥산/물 = 7/3 v/v(50 mL) 중의 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe(2.0 g) 교반 용액을, 실온에서 2 M 수산화나트륨 용액(2.36 mL)을 부분적으로 나누어 처리하였다. 1 시간 후 반응 혼합물을 물(100 mL)로 희석시키고, 2 M 염산을 pH가 2.0일 될 때까지 첨가한 다음, 디클로로메탄으로 추출시켰다. 합한 유기상을 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 진공 하에 농축시켜 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH(1.85 g)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.65(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 = 63/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(e) Cbz-Lys(Boc)Ψ[CH0HCO]-NHBzl

N,N-디메틸포름아미드(10 mL) 중의 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH(0.90 g) 교반된 용액에 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 444 mg), N-메틸모르폴린(0.5 mL), 벤질아민(282 mg) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(EDCI, 462 mg)을 첨가하였다. 실온에서 16 시간 동안 교반한 후, 이 반응 혼합물을 수중에 부어 넣고, 이 수성 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출시켰다. 이 에틸 아세테이트 추출물을 1N 염산, 물, 5% 탄산수소나트륨 및 물 순으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 진공 하에 농축시켜 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl(1.0 g)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.81(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 = 163/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(f) H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl.HCl

메탄올(25 mL) 중의 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCHO]-NHBzl(1.0 g) 용액에 활성탄 상의 10% 팔라듐(100 mg)과 2M 염산(1 mL)을 첨가하고, 이 현탁액을 대기압 하에 실온에서 1 시간 동안 수소 첨가하였다. 팔라듐 촉매를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 진공 하에 농축시켜 H-Lys(Boc)Ψ[CHPHCO]-NHBzl(0.87 g)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.15(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 = 163/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(g) N-Boc-L-α-아미노-ε-카프로락탐

디옥산/물(2/1 v/v)(30 mL) 중의 L-α-아미노-ε-카프로락톤(10 g)의 교반 용액에 1N 수산화나트륨 용액(7.8 mL)을 첨가한 다음, 디-t-부틸 중탄산나트륨(18.8 g)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 물과 염수로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후 진공 하에 증발시켰다. 미정제 물질을 헥산으로 분쇄시키고, 여과한 다음, 진공 하에 건조시켜 N-Boc-L-α-아미노-ε-카프로락톤(16 g)을 생성시켰다.

TLC: Rf =0.85(실리콘 상에서 에틸 아세테이트/헥산 1/1 v/v를 사용함)

(h) Boc-norLeu(시클로)-Gly-OMe

N-Boc-L-α-아미노-ε-카프로락탐(10 g)을 디클로로메탄(100 mL) 중에 용해시켰다. -20℃에서 테트라히드로푸란/시클로헥산 1/1 v/v(1 당량) 중의 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드 1M 용액을 서시히 첨가하고, 이 혼합물을 30 분 동안 교반하였다. 이어서, 메틸 브로모아세테이트(4 mL)를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 테트라히드로푸란/시클로헥산 1/1 v/v 중의 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드를 더 첨가하여 반응을 완결시켰다. 이 혼합물을 디클로로메탄으로 희석시키고, 0.1N 염산, 물, 5% 탄산수소나트륨 수용액 및 염수로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카(용출제: 헵탄/에틸 아세테이트 6/4 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 Boc-norLeu(시클로)-Gly-OMe 12 g을 생성시켰다.

TLC: Rf =0.55(실리카 상에서 에틸 아세테이트/헵탄 6/4 v/v를 사용함)

(i) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OMe

Boc-norLeu(시클로)-Gly-OMe(3 g)을 TFA/디클로로메탄 1/1 v/v(30 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(25 mL) 중에 용해시키고, 디클로로메탄(10 mL) 중의 벤질설포닐클로라이드(2.25 g) 용액을 0℃에서 서서히 첨가하였다. 트리에틸아민을 첨가하여 반응 동안 pH를 8로 유지시켰다. 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 물 및 염수로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카(용출제: 디클로로메탄/에틸 아세테이트 95/5 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OMe(3.9 g)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.40(실리카 상에서 디클로로메탄/에틸 아세테이트 9/1 v/v를 사용함)

(j) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OH

디옥산/물 9/1 v/v(100 mL) 중의 BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OMe(3.9 g) 용액을 충분한 1N 수산화나트륨으로 처리하여 2 시간 동안 pH를 13으로 유지시켰다. 산성화시킨 후, 이 혼합물을 수 중에 부어 넣고, 디클로로메탄으로 추출시켰다. 유기층을 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과액을 농축시켜 표제 화합물 3.6 g을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.60(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 63/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(k) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lyc(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl

N,N-디메틸포름아미드(10 mL) 중의 BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OH(340 mg)의 차가운(0℃) 용액에 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 203 mg)과 디시클로헥실카보디이미드(DCC, 217 mg)를 연속하여 첨가하였다. 0℃에서 30 분 동안 교반한 후, 상기 (f)에 설명된 바와 같이 제조한 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl.HCl(402 mg)과 트리에틸아민(0.15 mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 밤새 실온으로 유지시켰다. 이 혼합물을 -20℃로 냉각시키고, 디시클로헥실우레아를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 증발 건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 1M 염산, 물, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 물 및 염수 순으로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lyc(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl(690 mg)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.75(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 63/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(l) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lyc(Boc)Ψ[COCO]-NHBzl

무수 디클로로메탄(20 mL) 중의 BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lyc(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl(680 mg) 용액에 페리오디난(데스 마틴 시약) 424 mg을 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 2% 티오황산나트륨 수용액(20 mL)과 5% 탄산수소나트륨 수용액(20 mL)을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고, 물로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 진공 하에 증발시켜 미정제 BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lyc(Boc)Ψ[COCO]-NHBzl(561 mg)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.85(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 63/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(m) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LycΨ[COCO]-NHBzl

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lyc(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl(560 mg, 미정제)를 트리플루오로아세트산(10 mL)으로 처리하고, 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 수중에 용해시킨 다음, 예비용 HPLC 델타파크 RP-C₁₈컬럼 상에 직접 충전시킨 후, 20% A/80% B에서 20% A/45% B/35% C에 이르는 구배의 용출 시스템을 사용하여 45 분에 걸쳐 유속 80 mL/분으로 용출시켰다.

생성량 : BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LycΨ[COCO]-OH 287 mg

Rt(LC): 23.8 분(30 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 2

에틸SO₂-D-Cha-Pro(시클로)-LycΨ[COCO]-OH

(a) Boc-D-Cha-Pro-OPac

N,N-디메틸포름아미드(143 mL) 중의 Boc-D-Cha-OH.H₂O(21.5 g) 용액에 0℃에서 히드록시벤조트리아졸(HOBt)(13.7 g)과 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(15

.7 g)를 첨가하고, 0℃에서 30 분 동안 교반하였다. H-Pro-Opac. TFA(20 g)을 N,N-디메틸포름아미드 50 mL 중에 용해시키고, 트리에틸아민을 사용하여 pH를 8로 조정한 다음, 이 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 이것을 16 시간 동안 계속 유지시키고, 그 동안 온도는 실온으로 증가시켰다. 혼합물을 여과하고, 진공 하에 농축시킨 다음, 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 1N 염산, 물, 5% 탄산수소나트륨 수용액 및 염수로 세척한 후, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 다음 진공 하에 증발시켰다.

생성량: 28 g

TLC: Rf = 0.5(실리카 상에서 디클로로메탄/메탄올 95/5 v/v를 사용함)

(b) 에틸SO₂-D-Cha-Pro(시클로)-OPac

Boc-D-Cha-Pro-OPac(3.8 g)을 TFA/디클로로메탄 1/1 v/v(25 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 진공 하에 증발시켰다. 미정제 아민을 디클로로메탄(50 mL) 중에 용해시키고, 에탄설포닐 클로라이드(0.8 mL)를 -78℃에서 첨가하였다. 트리에틸아민을 첨가하여 반응하는 동안 pH를 8로 유지시켰다. 이 반응 혼합물을 3 시간 동안 0℃에서 교반한 후, 물(25 mL)를 첨가하였다. 실온에서 30 분 더 교반한 후, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르 중에 용해시키고, 1N 염산, 물, 5% 탄산수소나트륨 수용액 및 물로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후 진공 하에 증발시켰다. 미정제 물질을 메탄올로 분쇄하여 에틸SO₂-D-Cha-Pro-OPac(3.0 g)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.6(실리카 상에서 디클로로메탄/메탄올 95/5 v/v를 사용함)

(c) 에틸SO₂-D-Cha-Pro-OH

테트라히드로푸란(250 mL) 중의 에틸SO₂-D-Cha-Pro-OPac(10 g) 용액에 테트라히드로푸란(84 mL) 중의 테트라부틸암모늄 플루오라이드 1M 용액을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하고, 물(1 L) 중에 부어 넣었다. 이 수용액을 에틸 아세테이트로 추출시켰다. 합한 유기층을 1M 염산과 물 순으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을, 에틸 아세테이트/디이소프로필에테르를 사용한 결정화법으로 정제하여 에틸SO₂-D-Cha-Pro-OH(6.0 g)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.2(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 = 163/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(d) 에틸SO₂-D-Cha-Pro(시클로)-LycΨ[COCO]-OH

에틸SO₂-D-Cha-Pro-OH와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe.HCl 간의 DCC/HOBt-커플링, 비누화, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 1에 설명된 바와 같은 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 163 mg

Rt(LC): 36.35 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 3

BlzSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-OEt

(a) Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OEt

Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe(751 mg)을 3N HCl/에탄올 용액 25 mL 중에 용해시키고, 실온에서 4.5 시간 동안 교반하였다. 이 반응 용액을 증발 건조시키고, 에탄올을 사용하여 3회 동시 증발시켜 Cbz-LysΨ[CHOHCO]-OEt(691 mg)을 생성시켰다. 이 생성물을 무수 디클로로메탄 10 mL 중에 용해시키고, 디-t-부틸 디카보네이트(425 mg)을 첨가하였다. 이 용액의 pH을 트리에틸아민에 의해 8로 조정하여 유지시키고, 반응물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고, 유기층을 세척한 다음, 건조시켜 소정의 생성물 782 mg을 생성시켰다. 헵탄/에틸 아세테이트 2/3 v/v를 사용하여 실리카 상에서 정제한 후, 최종 생성량 696 mg을 얻었다.

TLC: Rf = 0.95(에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 232/31/18/7 v/v/v/v를 사용함)

(b) H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OEt.HCl

에탄올(25 mL) 중의 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OEt(696 mg) 용액에 활성탄 상의 10% 팔라듐(100 mg)과 2N 염산(0.8 mL)을 첨가하고, 이 현탁액을 대기압 하에 실온에서 50 분 동안 수소 첨가하였다. 팔라듐 촉매를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 진공 하에 농축시켜 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OEt.HCl(525 mg)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.17(에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 232/31/18/7 v/v/v/v를 사용함)

(c) BlzSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-OEt

BlzSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OH와의 커플링, 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 186 mg

Rt(LC): 32.46 분(40 분 이내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 4

BlzSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-NH₂

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OH와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NH₂.HCl 간의 커플링, 이에 연속적인 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물(103 mg)을 생성시켰다.

Rt(LC): 27.50 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 5

에틸SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-OEt

에틸SO₂-D-Cha-Pro-OH(270 mg)와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OEt.HCl(268 mg) 간의 DCC/HOBt-커플링, 데스 마틴 산화, 트리플루오로아세트산을 사용한 탈보호 및 정제는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 41 mg

Rt(LC): 40.7 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용한 후, 이 용출제의 혼합물을 10 분 동안 더 사용함)

실시예 6

에틸SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-NHBzl

에틸SO₂-D-Cha-Pro-OH(250 mg)와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl.HCl(611 mg) 간의 DCC/HOBt-커플링, 데스 마틴 산화, 트리플루오로아세트산을 사용한 탈보호 및 정제는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 208 mg

Rt(LC): 28.7 분(30 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 7

에틸SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-NH₂

실시예 1에 설명된 절차를 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NH₂.HCl(0.84 g)은 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl.HCl에 대해 설명한 바와 같이 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH(0.95 g)로부터 제조하였다. 이어서, 에틸SO₂-D-Cha-Pro-OH(189 mg)와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NH₂.HCl(179 mg) 간의 DCC/HOBt-커플링, 데스 마틴 산화, 트리플루오로아세트산을 사용한 탈보호 및 정제를 수행하여 표제 화합물 126 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 36.3 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 8

BzlSO-norVal(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-OH

(a) (S)-3-((벤질옥시카르보닐)아미노)-2-옥소-피페리딘

Cbz-오르니틴-OH.HCl(25 g)를 N,N-디메틸 포름아미드 2 L 중에 용해시키고, 트리에틸아민 12 mL를 첨가하여 pH를 8.5로 만들었다. N,N-디메틸 포름아미드 250 mL 중의 2-(1H-벤조트라아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라에틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU, 26.5 g)를 강력한 교반 하에 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 반응시키고, 계속하여 트리에틸 아민을 사용하여 pH를 8.5로 조정하였다. 이 반응 혼합물을 농축하여 건조시키고, 에틸 아세테이트 중에 용해시킨 다음, 1N 염산, 물, 5% 탄산수소나트륨, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 후, 여과하고 증발시켜 표제 화합물 11.7 g을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.80(에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 63/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(b) Cbz-norVal(시클로)-Gly-OMe

(S)-3-((벤질옥시카르보닐)아미노)-2-옥소-피페리딘(5 g)을 디클로로메탄(50 mL) 중에 용해시켰다. -20℃에서 테트라히드로푸란/시클로헥산 1/1 v/v(20 mL, 1 당량) 중의 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드 1M 용액을 서서히 첨가하고, 이 혼합물을 30 분 동안 교반하였다. 이어서, 메틸 브로모아세테이트(1.9 mL)를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 염화암모늄 포화 수용액으로 급냉시켰다. 유기층을 물과 염수로 세척하고, 황산나크륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔(용출제: 디클로로메탄/메탄올 95/5 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 Cbz-norVal(시클로)-Gly-OMe 4.7 g을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.38(에틸 아세테이트/헵탄 3/1 v/v를 사용함)

(c) BzlSO₂-norVal(시클로)-Gly-OMe

Cbz-norVal(시클로)-Gly-OMe(4.7 g)을 메탄올 40 mL 중에 용해시키고, 활성탄 상이 10% 팔라듐 500 mg을 첨가한 다음, 2N 염산 7.4 mL를 첨가하고, 대기압 하에 실온에서 1 시간 동안 수소 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 여과하고, 진공 하에 증발시킨 직후에 다음 단계에서 H-norVal(시클로)-Gly-OMe.HCl로 사용하였다.

미정제 아민을 디클로로메탄(50 mL) 중에 용해시키고, 벤질설포닐클로라이드(2.82 g)을 0℃에서 서서히 첨가하였다. 트리에틸아민을 첨가하여 반응 동안 pH를 8로 조정하였다. 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 물과 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔(용출제: 디클로로메탄/메탄올 95/5 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 BzlSO₂-norVal(시클로)-Gly-OMe(2 g)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.87(에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 63/20/6/1 v/v/v/v를 사용함)

(d) BzlSO₂-norVal(시클로)-Gly-OH

BzlSO₂-norVal(시클로)-Gly-OMe(2 g)의 비누화는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 1.8 g

TLC: Rf = 0.40(에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 63/20/6/1 v/v/v/v를 사용함)

(e) BzlSO₂-norVal(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-OH

BzlSO₂-norVal(시클로)-Gly-OH와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe.HCl 간의 커플링, 비누화, 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 1에 설명된 절차를 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 107 mg

Rt(LC): 24.45 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 9

에틸SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i-프로필.HCl(0.32 g)은 실시예 3에서 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OEt.HCl에 대하여 설명된 절차를 이용하여 출발 물질인 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe(0.49 g)과 2-프로판올로부터 제조하였다. 에틸SO₂-D-Cha-Pro-OH(239 mg)와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i-프로필.HCl(316 mg) 간의 DCC/HOBt-커플링, 데스 마틴 산화, 트리플루오로아세트산을 사용한 탈보호 및 정제는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 123 mg

Rt(LC): 43.0 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용한 후, 이 용출제의 혼합물을 10 분 더 사용함)

실시예 10

BzlSO₂-norVal(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-아제티딘

실시예 1에 설명된 절차를 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-아제티딘(2.26 g)은 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NHBzl에 대하여 설명된 바와 같이 Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH(2.7 g)로부터 제조하였다. Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-아제티딘(269 mg)을 수소 첨가하여 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-아제티딘.HCl(214 mg)을 생성시켰다. 이어서, BzlSO₂-norVal(시클로)-Gly-OH(175 mg)와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-아제티딘.HCl(214 mg) 간의 DCC/HOBt-커플링, 데스 마틴 산화, 트리플루오로아세트산을 사용한 탈보호 및 정제를 수행하여 표제 화합물 84 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 27.8 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 11

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-아제티딘

Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-아제티딘은 실시예 10에서 설명된 절차에 따라 제조하였다. 또한, 수소 첨가, BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OH와의 커플링, 산화, 탈보호 및 정제도 실시예 1에 설명된 절차를 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 100 mg

Rt(LC): 33.61 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 12

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(에폭시카르보닐)Ψ[COCO]-아제티딘

(a) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[CHOHCO]-아제티딘.TFA

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-아제티딘(실시예 10에 설명된 절차에 따라 제조한 것임)(220 mg)을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산 1/1 v/v 10 mL 중에 용해시키고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 디에틸 에테르로 분쇄시켰다.

생성량: 267 mg

TLC: Rf = 0.57(에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 63/20/6/1 v/v/v/v를 사용함)

(b) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(에폭시카르보닐)Ψ[CHOHCO]-아제티딘

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[CHOHCO]-아제티딘.TFA(267 mg)을 N,N-디메틸포름아미드 10 mL 중에 용해시키고, 에틸클로로포름에이트 46 μL을 첨가한 후, 트리에틸아민 8.5 g을 사용하여 pH를 8.5로 조정하였다. 실온에서 16 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물, 5% 탄산수소나트륨, 2% 구연산 및 염수로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고 여과한 후, 증발 건조시켜 표제 화합물(150 mg)을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.53(실리카 상에서 디클로로메탄/메탄 91/1 v/v를 사용함)

(c) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(에폭시카르보닐)Ψ[COCO]-아제티딘

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(에폭시카르보닐)Ψ[CHOHCO]-아제티딘(150 mg)의 산화 및 정제는 실시예 1에 기재된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 25 mg

Rt(LC): 26.42 분(40 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 100% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 13

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-O-i프로필

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OH(실시예 1에 설명됨)와 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i-프로필.HCl(실시예 9에 설명됨) 간의 커플링, 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 400 mg

Rt(LC): 40 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 14

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-NH-i프로필

(a) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OH 1.96 g과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe.HCl 2.20 g 간의 DCC/HOBt 커플링, 생성물의 비누화는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 3.1 g

TLC: Rf = 0.4(에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 66/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(b) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-NH-i프로필

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 이소프로필아민 0.105 mL 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간 :19 시간)은 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 150 mg

Rt(LC): 34.01 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 15

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-NH-n프로필

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 프로필아민 0.101 mL 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간: 24 시간)은 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 144 mg

Rt(LC): 34.22 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 16

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-NH-메틸

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 메틸아민(N,N-디메틸포름아미드 중의 3M 용액 0.4 mL) 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간: 20 시간) 및 탈보호는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 127 mg

Rt(LC): 28.36 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 17

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-피롤리디닐

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 피롤리딘 0.102 mL 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간: 14 일) 및 탈보호는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 125 mg

Rt(LC): 36.87 분과 37.38 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 18

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-N-에틸

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 에틸아민(N,N-디메틸포름아미드 중의 0.7M 용액 1.78 mL) 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간: 20 시간) 및 탈보호는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 115 mg

Rt(LC): 31.30 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 19

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-모르폴린-4-일

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 모르폴린 0.107 mL 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간: 6.5 일) 및 탈보호는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 148 mg

Rt(LC): 33.73 분과 34.17 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 20

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-(1,1-디옥소)티오모르폴린-4-일

메탄올 25 mL 중의 티오모르폴린 2.47 g 용액에 디-t-부틸 디카보네이트 5.75 g과 트리에틸아민 4 mL를 첨가하였다. 실온에서 30 분 동안 교반한 후, 에틸아세테이트 50 mL를 첨가하고, 이 용액을 물로 세척한 다음, 염산에 의해 pH 3으로 조정하고, 물, 5% 탄산수소나트륨 수용액 및 염수로 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시키고 농축시켜 N-t-부틸옥시카르보닐 티오모르폴린을 얻었다. 이 잔류물(4.73 g)을 디클로로메탄 50 mL 중에 용해시키고, 물 50 mL를 첨가하였다. 이 교반된 혼합물에 반응 혼합물의 pH를 7로 유지하면서 3-클로로퍼옥시벤조산(80∼90% 순도) 11 g을 소량씩 첨가하였다. 실온에서 1 6 시간 동안 교반한 후, 수층을 분리하고, 유기층을 5% 티오황산나트륨 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액(3회) 및 염수로 세척한 후, 황산마그네슘으로 건조시켜 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔(용출제: 에틸 아세테이트/헵탄 2/3 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 N-t-부틸옥시카르보닐 티오모르폴린 1,1-디옥사이드 5.7 g을 얻었다. 이 설폰(0.625 g)을 디옥산 중의 3M 염화수소 용액 50 mL 중에 용해시키고, 실온에서 4 시간 동안 교반한 후, 이 반응 혼합물을 농축시켜 티오모르폴린 1,1-디옥사이드 히드로클로라이드 0.579 g을 얻었다.

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 티오모르폴린 1,1-디옥사이드 히드로클로라이드 0.21 g 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간: 3 일) 및 탈보호는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 180 mg

Rt(LC): 33.64 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 21

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-N(메틸)(메톡시)

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 N,O-디메틸히드록실아민 0.12 g 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간: 3.5 일) 및 탈보호는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 136 mg

Rt(LC): 33.80 분과 34.53 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 22

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-LysΨ[COCO]-(2-카르복사미드)아제티딘-1-일)

N-t-부틸옥시카르보닐-L-아제티딘-2-카르복실산 1.13 g과 염화암모늄 1.38 g 간의 DCC/HOBt 커플링은 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하여 N-t-부틸옥시카르보닐-L-아제티딘-2-카르복사미드 0.468 g을 얻었다. 이 아미드(0.224 g)를 디옥산 중의 3M 염화수소 용액 5 mL 중에 용해시켰다. 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축시켜 아제티딘-2-카르복사미드 히드로클로라이드 0.17 g을 얻었다.

0.4 mmol BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OH와 아제티딘-2-카르복사미드 히드로클로라이드 0.17 g 간의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화(반응 시간: 20 시간) 및 탈보호는 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 58 mg

Rt(LC): 26.43 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 23

n프로필SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

(a) Boc-D-Cha-Pro-OBzl

디클로로메탄 100 mL 중의 Boc-D-Cha-OH 11.64 g 교반 용액에 0℃에서 HOBt 6.36 g과 DCC 9.27 g을 첨가하였다. 20 분 후, N,N-디이소프로필 에틸아민에 의해 pH 8로 조정된 디클로로메탄 40 mL 중의 H-Pro-OBzl.HCl 10.35 g 용액을 첨가하였다. 16 시간 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 물, 0.1N 염산, 물, 5% 탄산수소나트륨 및 염수 순으로 세척하였다. 모든 수성 세척액을 에틸 아세테이트로 2회 추출시키고, 모든 유기 추출액을 합한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물에 에틸 아세테이트/헵탄 = 1/1(v/v)의 혼합물을 첨가하고, 형성된 현탁액을 여과한 다음, 여과액을 실리카 겔(용출제: 에틸 아세테이트/헵탄 =1/1 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 Boc-D-Cha-Pro-OBzl 19.34 g을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.8(디클로로메탄/메탄올 = 9/1 v/v를 사용함)

(b) n프로필SO₂-D-Cha-Pro-OBzl

Boc-D-Cha-Pro-OBzl(1.01 g)를 디옥산 중의 3M 염화수소 용액 42 mL 중에 용해시켰다. 실온에서 2 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 35 mL 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 이 교반된 용액에 1-프로판설포닐 클로라이드 0.22 mL를 첨가하여 pH를 8.5로 조정하였다. 실온에서 24 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 5% 탄산수소나트륨, 물, 5% 구연산 및 염수 순으로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조시키고 농축시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔(용출제: 에틸 아세테이트/헵탄 = 1/1 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 n프로필SO₂-D-Cha-Pro-OBzl 8.25 g을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.6(에틸 아세테이트/헵탄 1/1 v/v를 사용함)

(c) n프로필SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

n프로필SO₂-D-Cha-Pro-OBzl(0.85 g)을, 실시예 1에 설명된 절차를 사용하여 수소 첨가하여 n프로필SO₂-D-Cha-Pro-OH 0.54 g을 생성시켰다. n프로필SO₂-D-Cha-Pro-OH 225 mg과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필.HCl의 커플링과 데스 마틴 산화는 실시예 9에 설명된 절차를 사용하여 수행하였다. Boc기를, 전술한 바와 같이 디옥산 중의 3M 염화수소 용액을 사용하여 제거하고, 미정제 생성물을 실시예 1에 설명된 예비용 HPLC 방법을 이용하여 정제하였다.

생성량: 표제 화합물 47 mg

Rt(LC): 27.6 분(40 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용한 후, 10 분 내에 100% C의 구배를 사용함)

실시예 24

(10-캄포)SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

표제 화합물은 실시예 23에 설명된 절차를 사용하여 Boc-D-Cha-Pro-OBzl과 (-)-10-캄포설포닐 클로라이드로부터 제조하였다.

생성량: Boc-D-Cha-Pro-OBzl로부터 12%

Rt(LC): 33.6 분(30 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용한 후, 10 분 내에 100% C의 구배를 사용함)

실시예 25

페닐SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

표제 화합물은 실시예 23에 설명된 절차를 사용하여 Boc-D-Cha-Pro-OBzl과 벤젠설포닐 클로라이드로부터 제조하였다.

생성량: Boc-D-Cha-Pro-OBzl로부터 9%

Rt(LC): 29.3 분(30 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용한 후, 10 분 내에 100% C의 구배를 사용함)

실시예 26

메틸SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

표제 화합물은 실시예 23에 설명된 절차를 사용하여 Boc-D-Cha-Pro-OBzl과 메탄설포닐 클로라이드로부터 제조하였다.

생성량: Boc-D-Cha-Pro-OBzl로부터 18%

Rt(LC): 24.3 분(30 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용한 후, 10 분 내에 100% C의 구배를 사용함)

실시예 27

i프로필SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

표제 화합물은 실시예 23에 설명된 절차를 사용하여 Boc-D-Cha-Pro-OBzl과 이소프로필설포닐 클로라이드로부터 제조하였다.

생성량: Boc-D-Cha-Pro-OBzl로부터 2%

Rt(LC): 26.8 분(30 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용한 후, 10 분 내에 100% C의 구배를 사용함)

실시예 28

벤질SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

표제 화합물은 실시예 23에 설명된 절차를 사용하여 Boc-D-Cha-Pro-OBzl과 α-톨루엔설포닐 클로라이드로부터 제조하였다.

생성량: Boc-D-Cha-Pro-OBzl로부터 11%

Rt(LC): 30.4 분(30 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용한 후, 10 분 내에 100% C의 구배를 사용함)

실시예 29

n부틸SO₂-D-Cha-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

표제 화합물은 실시예 23에 설명된 절차를 사용하여 Boc-D-Cha-Pro-OBzl과 1-부탄설포닐 클로라이드로부터 제조하였다.

생성량: Boc-D-Cha-Pro-OBzl로부터 29%

실시예 30

[3-(벤질설포닐아미노)-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세틸-LysΨ[COCO]-O-i프로필

[3-(벤질설포닐아미노)-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세트산(WO 97/01228호) 151 mg과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필.HCl 205 mg의 DCC/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 9에 설명된 절차에 따라 표제 화합물 91 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 34.7 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 31

[3-(벤질설포닐아미노)-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세틸-LysΨ[COCO]-O-i프로필

[3-(벤질설포닐아미노)-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세트산(WO 97/46207호) 178 mg과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필.HCl과 DCC/HOBt 커플링 및 데스 마틴 산화는 실시예 9에 설명된 절차에 따라 수행하였다. 디옥산 중의 염화수소를 사용한 탈보호 및 정제는 실시예 23에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물 116 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 32.4 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 32

[3-(벤질설포닐아미노)-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세틸-LysΨ[COCO]-NH₂

[3-(벤질설포닐아미노)-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세트산(WO 97/01338호) 286 mg과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe.HCl의 DCC/HOBt 커플링은 실시예 1에 설명된 절차에 따라 수행하여 [3-(벤질설포닐아미노)-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세틸-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe 0.51 g을 생성시켰다. 이러한 메틸 에스테르의 비누화, 염화암노늄과의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 14에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물 76 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 26.9 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 33

BzlSO₂-Aad-Pro-LysΨ[COCO]-OH

(a) BzlS0₂-Aad(OtBu)-OH

1N 수산화나트륨 수용액 4.4 mL 중의 H-Aad(OtBu)-OH 0.5 g 교반 용액에 디옥산 2 mL 중의 벤질설포닐클로라이드 0.42 g을 첨가하였다. 실온에서 16 시간 후, 2N 수산화나트륨 수용액 1.4 mL, 디옥산 0.5 mL 및 벤질설포닐 클로라이드 0.09 g을 더 첨가하고, 이 반응 혼합물을 하루 더 교반하였다. 디옥산을 제거하고, 물을 첨가한 다음, 혼합물을 염산에 의해 산성(pH 3)으로 만들고, 디에틸 에테르로 2회 추출시켰다. 합한 에테르층을 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켜 BzlS0₂-Aad(OtBu)-OH 235 mg을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.7(실리카 상에서 디클로로메탄/메탄올/물 = 14/6/1 v/v/v를 사용함)

(b) BzlS0₂-Aad(OtBu)-Pro-OH

실시예 23에 설명된 바와 같이, BzlS0₂-Aad(OtBu)-OH 235 mg과 H-Pro-OBzl.HCl 168 mg의 DCC/HOBt를 커플링시킨 다음, 수소 첨가하여 표제 화합물 193 mg을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.6(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 = 163/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(c) BzlS0₂-Aad-Pro-Lys[COCO]-OH

BzlS0₂-Aad(OtBu)-Pro-OH 193 mg과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe.HCl의 DCC/HOBt 커플링, 비누화, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 32에 설명된 절차에 따라 제조하여 표제 화합물 85 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 26.1 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 34

BzlSO₂-Glu-Pro-LysΨ[COCO]-OH

H-Glu(OtBu)-OH를 출발 물질로 하여 실시예 33에 설명된 경로에 따라 제조하여 표제 화합물을 생성시켰다.

생성량: H-Glu(OtBu)-OH으로부터 13%

Rt(LC): 22.6 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 35

BzlSO₂-Asp-Pro-LysΨ[COCO]-OH

H-Asp(OtBu)-OH를 출발 물질로 하여 실시예 33에 설명된 경로에 따라 제조하여 표제 화합물을 생성시켰다.

생성량: H-Glu(OtBu)-OH으로부터 18%

Rt(LC): 21.9 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 36

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-LysΨ[COCO]-NH₂

(a) EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-OH

Boc-D-Tyr(Me)-OH 2.22 g과 H-Pro-OBzl.HCl 2.0 g의 DDC/HOBt 커플링, Boc 보호기의 제거, 에탄 설포닐 클로라이드를 사용한 설포닐화 및 벤질 에스테르의 수소 첨가는 실시예 23에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물 1.0 g을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.23(실리카 상에서 디클로로메탄/메탄올 = 95/5 v/v를 사용함)

(b) EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-LysΨ[COCO]-NH₂

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-OH 254 mg과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe.HCl의 DCC/HOBt 커플링, 비누화, 염화암모늄과의 EDCI/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 32에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물 83 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 28.0 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 37

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-LysΨ[COCO]-i프로필

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-OH 0.51 g과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-i프로필.HCl의 DCC/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 9에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물 223 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 36.5 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 38

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-LysΨ[COCO]-아제티딘

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-OH 307 mg과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-아제티딘.HCl의 DCC/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 10에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물 83 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 36.4 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 39

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-LysΨ[COCO]-N-(4-클로로프로필)

표제 화합물(43 mg)은 실시예 38의 정제에서 제2 생성물로 얻었다.

Rt(LC): 38.1 분(40 분 내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 40

BzlSO₂-D-Dpa-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

(a) BzlSO₂-D-Dpa-Pro-OH

Boc-D-Dpa-Pro-OBzl(WO 97/31937호) 1.5 g인 Boc기의 제거, 벤질설포닐 클로라이드와의 반응 및 벤질 에스테르의 제거는 실시예 23에 설명된 절차를 따라 수행함여 표제 화합물 1.0 g을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.63(실리카 상에서 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 = 163/20/6/11 v/v/v/v를 사용함)

(b) BzlSO₂-D-Dpa-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

BzlSO₂-D-Dpa-Pro-OH 0.31 g과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필.HCl의 DCC/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 9에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물 50 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 32.2 분(40 분 내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용한 후, 10 분 내에 100% C의 구배를 사용함)

실시예 41

EtSO₂-Leu-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

(a) EtSO₂-Leu-OMe

디클로로메탄 30 mL 중의 H-Leu-OMe.HCl 3.0 g 교반 용액을, 트리에탈아민을 사용하여 pH 8로 조정하고, 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 에탄설포닐 클로라이드 3.2 mL와 트리에틸아민 2.3 mL를 첨가하였다. 실온에서 16 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 0.5N 염산, 물 및 5% 탄산수소나트륨 순으로 세척하고, 농축시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔(용출제: 디클로로메탄/메탄올 = 9/1 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 EtSO₂-Leu-OMe(3.3 g)를 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.69(실리카 상에서 디클로로메탄/에틸 아세테이트 = 9/1 v/v를 사용함)

(b) EtSO₂-Leu-Pro-OH

EtSO₂-Leu-OMe(3.3 g)을 비누화시키고(실시예 1의 절차), H-Pro-OBzl와 커플링시킨 다음(실시예 23의 절차), 형성된 디펩티드를 지시된 절차에 따라 수소 첨가하여(실시예 23의 절차) 표제 화합물 3.4 g을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.11(실리카 상에서 디클로로메탄/에틸 아세테이트 = 9/1 v/v를 사용함)

(c) EtSO₂-Leu-Pro-LysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-Leu-Pro-OH 145 mg과 H-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필.HCl의 DCC/HOBt 커플링, 데스 마틴 산화, 탈보호 및 정제는 실시예 23에 설명된 절차에 따라 수행하여 표제 화합물 120 mg을 생성시켰다.

Rt(LC): 16.6 분(30 분내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 42

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-AcgΨ[COCO]-O-아제티딘

(a) H-Acg(Boc)[CHOHCO]-OMe.HCl

메탄올(100 mL) 중의 3-[4-(1,1-디메틸에톡시카르보닐아미노)시클로헥실]-2-히드록시-3-니트로-프로피온산 메틸 에스테르{라일 등의 문헌[Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 67-72(1997)]}(294 mg) 용액에 2N 염산(0.425 mL)과 활성탄 분말 상의 10% 팔라듐(0.45 g)을 첨가하고, 이 현탁액을 대기압 하에 실온에서 16 시간 동안 수소 첨가하였다. 팔라듐 촉매를 여과에 의해 제거하고, 용매를 감압 하에 증발시켜 제거함으로써 H-Acg(Boc)Ψ[CHOHCHO]-OMe.HCl(289 mg)을 부분입체 이성질체의 혼합물로 생성시켰다.

(b) BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-AcgΨ[COCO]-아제티딘

BzlSO₂-norLeu(시클로)-Gly-OH 0.27 g과 H-Acg(Boc)Ψ[CHOHCHO]-OMe.HCl 0.25 g의 DCC/HOBt 커플링, 비누화, 아제티딘 히드로클로라이드와의 EDCI/HOBt 케플링, 데스 마틴 산화 및 탈보호는 실시예 1에서 설명된 절차에 따라 수행하였다.

생성량: 표제 화합물 82 mg

Rt(LC): 34.8 분과 35.4 분(40 분내에 20% A/80% B에서 20% A/20% B/60 % C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 43

에틸SO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[CHOHCO]-O-i프로필

(a) Cbz-Acg(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe

아세토니트릴 10 mL와 N,N-디메틸포름아미드 10 mL 중의 H-Acg(Boc)Ψ[CHOHCO]-0Me.HCl 0.34 g 교반 용액을, N,N-디이소프로필에틸아민을 사용하여 pH 8로 조정하였다. 이 용액에 N-벤질옥시카르보닐옥시숙신이미드 0.24 g을 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 물과 염수로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔(용출제: 에틸 아세테이트/헵탄 2/3 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 Cbz-Acg(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe 0.287 mg을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.25(실리카 상에서 에틸 아세테이트/헵탄 1/1 v/v를 사용함)

(b) Cbz-Acg(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필

테트라히드로푸란 5 mL와 2-프로판올 1 mL의 교반 혼합물에 질소 대기 하에서 헥산 중의 1.6N 부틸리튬 용액 2.5 mL를 서서히 첨가하였다. 20 분 후, 2-프로판올 5 mL 중의 Cbz-Acg(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe 0.28 g 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, 아세트산 0.5 mL를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 물로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔(용출제: 에틸 아세테이트/헵탄 2/3 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 Cbz-Acg(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필 0.223 mg을 생성시켰다.

TLC: Rf = 0.25(실리카 상에서 에틸 아세테이트/헵탄 1/2 v/v를 사용함)

(c) 에틸SO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

N,N-디메틸포름아미드 중의 Cbz-Acg(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필 0.22 g 용액에 활성탄 상의 10% 팔라듐(80 mg)과 2M 염산(0.23 mL)을 첨가하고, 이 현탁액을 대기압 하에 1 시간 동안 실온에서 수소 첨가하였다. 팔라듐 촉매를 여과에 의해 제거하였다. 이 여과액은 실시예 1에 설명된 절차를 사용하여 에틸SO₂-D-Cha-Pro-OH 0.166 g과의 DCC/HOBt 커플링에 사용하였다. 생성물을, 데스 마틴 시약을 사용하여 산화시키고, Boc기를 제거한 다음, 실시예 1에 설명된 절차를 이용하여 정제하였다.

생성량: 표제 화합물 100 mg

Rt(LC): 30.0 분(30 분내에 20% A/60% B/20% C에서 20% A/80% C에 이르는 구배를 사용함)

실시예 44

고체 상에서 EtSO₂-B-X-LysΨ[COCO]-O-i프로필 유도체의 제조

(a) Teoc-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필

Cbz-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe(10 g)을 실시예 1f에 설명된 조건 하에 수소 첨가하여 정량적인 수율의 H-Lys(Bos)Ψ[CHOHCO]-OMe를 얻었다. 이 미정제 생성물을 N,N-디메틸포름아미드(100 mL) 중의 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐 히드록시-숙신아미드(6.7 g)으로 N,N-디이소프로필에틸아민(pH = 8)의 존재 하에 2 시간 동안 실온에서 처리하였다. 이 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 2% 구연산 수용액, 물, 5% 탄산수소나트륨 및 염수로 세척시켰다. 실리카 겔(용출제: 에틸 아세테이트/헵탄 = 1/1 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제한 후, 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 증발시켜 Teoc-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe(9.1 g)을 얻었다. 이어서, 이 Teoc-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-OMe(2.8 g)을, 이소프로필 알콜(5.4 mL), THF(27.1 mL) 및 헥산 중의 1.6M n-부틸 리튬(13.1 mL)의 교반된 혼합물에 실온에서 서서히 첨가하였다. 1 시간 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 빙초산(2.5 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 소량의 부피로 농축시키고, 에틸 아세테이트로 희석시킨 다음, 물(2×)로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과하고 용매를 진공 하에 제거하여 미정제 생성물을 생성시켰다. 실리카 겔(용출제: 에틸 아세테이트/헵탄 = 1/1 v/v) 상에서 크로마토그래피 정제하여 표제 화합물(2.9 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.53(실리카 상에서 헵탄/에틸 아세테이트 1/1 v/v를 사용함)

(b) Teoc-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필

Teoc-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필(2.8 g)을 디에틸 에테르(36 mL) 중에 용해시키고, 파라 톨루엔 설폰산(1.8 g)을 첨가하였다. 2 시간 후, 30℃에서 반응 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켜 Teoc-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필을 얻었다.

아세토니트릴/디클로로메탄(1/1 v/v) 50 mL와 트리에틸아민(1.81 mL) 중의 히드록시메틸 수지(바켐 제품, 1.02 mmol/g) 4.2 g 현탁액에 N,N-디숙신이미딜 카보네이트(3.36 g)을 첨가하였다. 이 현탁액을 2 시간 동안 주위 온도에서 회전식 교반기 상에서 진탕시켰다. 수지를 여과하고, 디클로로메탄, 아세토니트릴 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척한 다음, 건조시켰다. 상기 Teoc-Lys(Boc)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필을 아세토니트릴/디클로로메탄(1/1 v/v) 50 mL 중에 용해시켰다. 트리에틸아민을 사용하여 용액의 pH를 8로 조정하였다. 이 용액을 수지에 첨가하고, 현탁액을 실온에서 16 시간 동안 진탕시켰다. 용매를 여과에 의해 제거하고, 수지를 전술한 절차에 따라 세척하였다. 진공 하에 건조시킨 후, Teoc-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필 5.43 g을 얻었다.

(c) H-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필

트리플루오로아세트산/디클로로메탄(50 mL, 1/9 v/v) 중의 Teoc-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-Oi-프로필 2.5 g 현탁액을 실온에서 45 분 동안 진탕시켰다, 수지를 충분하게 디클로로메탄으로 세척시키고, 고진공 하에 건조시켜 H-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필(2.5 g)을 얻었다.

(d) Boc-X-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필

H-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필을, 4개의 반응기에 각각 500 mg을 일부씩 나누어 넣었다. 수지를 디클로로메탄/N,N-디메틸포름아미드(3/2 v/v) 중의 N,N-디이소프로필에틸아민 1% 용액과 디클로로메탄으로 세척시켰다(각각 3회). 다음, 디클로로메탄/N,N-디메틸포름아미드(3/2 v/v) 10 mL를 수지에 첨가하여 블럭 Boc-X-OH(Boc-D-Leu-OH 139 mg, Boc-Leu-OH 139 mg, Boc-Gln-OH 148 mg 및 Boc-phe-OH 159 mg), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU, 193 mg) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(105 μL)을 형성시켰다. 이 현탁액을 실온에서 90 분 동안 진탕시킨 후, 용매를 여과에 의해 제거하였다. 수지를 디클로로메탄/N,N-디메틸포름아미드(3/2 v/v), N,N-디메틸포름아미드 및 디클로로메탄(각각 3회)으로 세척하고 건조시켰다.

(e) H-X-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필

4개의 상이한 X 블럭의 Boc기를, Teoc기의 탈보호(실시예 44 c 참조)에 대하여 설명하고 있는 바와 같이 동일 조건 하에 제거하여 H-X-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필 500 mg을 4회에 걸쳐 얻었다. 이 수지(500 mg)를 5 개의 반응 용기에 분배하였다.

(f) EtSO₂-B-X-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필

제2 블럭 EtSO₂-B-OH(EtSO₂-Asn-OH 27.0 mg, EtSO₂-D-Leu-OH 26.8 mg, EtSO₂-D-Phe-OH 30.8 mg, EtSO₂-Nal-OH 36.8 mg, EtSO₂-D-3-Tiq-OH 32.4 mg, 이들은 실시예 41에서 설명된 바와 같은 방법으로 제조함)을 형성시키는 커플링은 절차(d)에서 설명된 바와 같이 동일한 조건 하에 수지 100 mg에 대하여 수행하였다. 작업을 완료한 후, 20 개의 반응 용기(이는 4개의 상이한 X 블럭과 5개의 상이한 B 블럭에 기인한 것임)을 진공 하에 건조시켰다.

(g) EtSO₂-B-X-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-B-X-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[CHOHCO]-O-i프로필(100 mg)을 디메틸설폭사이드(2 mL)과 디클로로메탄(2 mL) 중의 1-히드록시-1,2-벤지오독솔-3-(1H)-온-1-옥사이드(0.18 M) 용액 중에 증량시켰다. 이 반응 혼합물을 실온에서 밤새 진탕시킨 후, 용매를 여과에 의해 제거하였다. 이어서, 디메틸설폭사이드와 디클로로메탄(각각 3회)로 세척하고, 건조시켜 EtSO₂-B-X-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[COCO]-O-i프로필을 얻었다.

(h) EtSO₂-B-X-LysΨ[COCO]-O-i프로필

트리플루오로아세트산/티오아니솔(2 mL, 10/1 v/v) 용액을, EtSO₂-B-X-Lys(CO-O-메틸-수지)Ψ[COCO]-O-i프로필(100 mg)에 첨가하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과시키고, 트리플루오로아세트산(3회)로 세척시킨 후, 여과액을 진공 하에 증발 건조시켰다. 잔류물을 헵탄(2 mL)으로 세척하고, 강력하게 교반한 후, 헵탄층을 경사 분리하였다. 이러한 절차를 2회 반복하였다. 미정제 생성물을 건조시키고, 정제하기 위한 예비용 Supelcosil C18DB 컬럼(21 ×250 mm)에 직접 가하였다(컬럼 조작 조건: 유속: 20 mL/분; 완충제 A: 수성 트리플루오로아세트산 0.1M, B: 물, C: 아세토니트릴/물 6/4 v/v; 구배(생성물의 극성에 따라 좌우됨): 40 분 내에 3% A/67% B/30% C에서 3% A/52% B/45% C에 이르는 구배. UV 검출: 210 nm). 소정의 화합물에 상응하는 주요 피이크를 분리하여 동결 건조시켜 하기 표 44에 기재되어 있는 바와 같은 정제된 최종 생성물을 얻었다.

히드록시메틸 수지 상에서 제조된 EtSO₂-B-X-LysΨ[CHOHCO]-O-i프로필의 특성(역상 HPLC에서의 보유 시간과 전자주사 질량 분광분석기에서의 M+H 피이크). HPLC 조건: 유속: 1.0 mL/분; 완충제 A: 물, B: 아세토니트릴/물(6/4 v/v), C: 0.5M 인산염 완충제 pH = 2.1; 구배: 0→45 분 이내에 65% A/15% B/20% C→0% A/80% B/20% C에 이르는 구배. UV 검출: 210 nm.

	B
	Asn	D-Leu	D-Phe	Nal	D-3-Tiq
EtSO₂-B-D-Leu-D/L-Lys[COCO]-O-i프로필	Rt = 17.07 분M+H =536.4	Rt = 27.20 분M+H =535.6	Rt = 30.89 분M+H =569.4	Rt = 38.17 분M+H =619.6	Rt = 33.54 분M+H =581.4
EtSO₂-B-Leu-D/L-Lys[COCO]-O-i프로필	Rt = 17.17 분M+H =536.4	Rt = 30.78 분M+H =535.6	Rt = 32.89 분M+H =569.4	Rt = 37.79 분M+H =619.6	Rt = 33.60 분M+H =581.4
EtSO₂-B-Gln-D/L-Lys[COCO]-O-i프로필	Rt = 5.40 분M+H =551.2	Rt = 15.74 분M+H =550.4	Rt = 18.05 분M+H =584.4	Rt = 28.44 분M+H =634.4	Rt = 21.27 분M+H =596.4
EtSO₂-B-Phe-D/L-Lys[COCO]-0-i프로필	Rt = 20.75 분M+H =570.4	Rt = 33.33 분M+H =569.4	Rt = 35.18 분M+H =603.4	Rt = 39.47 분M+H =653.6	Rt = 35.92 분M+H =615.6

실시예 45

본 발명의 방법을 사용하여 하기 열거하는 화합물들을 제조하였다.

CF₃SO₂-D-Cha-Pro-lysΨ[COCO]-O-i프로필

MeSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-lysΨ[COCO]-O-i프로필

n-부틸SO₂-D-Tyr(Me)-Pro-lysΨ[COCO]-O-i프로필

CF₃SO₂-D-Tyr(Me)-Pro-lysΨ[COCO]-O-i프로필

BzlSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-lysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-(p-OEt-Phe)-Pro-lysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Nle-Pro-lysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-Azt-lysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-(N-시클로펜틸-Gly)-lysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-Val-lysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-Pec-lysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-(3,4-데히드로-Pro)-lysΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-Pro-lysΨ[COCO]-아제티딘

MeSO₂-D-Cha-Pro-lysΨ[COCO]-아제티딘

n-부틸SO₂-D-Cha-Pro-lysΨ[COCO]-아제티딘

CF₃SO₂-D-Cha-Pro-lysΨ[COCO]-아제티딘

BzlSO₂-D-Cha-Pro-lysΨ[COCO]-아제티딘

[3-(BzlSO₂아미노)-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세틸-lysΨ[COCO]-아제티딘

[3-(BzlSO₂아미노)-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리디닐]-아세틸-lysΨ[COCO]-아제티딘

MeSO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

n-부틸SO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

CF₃SO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

BzlSO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

MeSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

n-부틸SO₂-D-Tyr(Me)-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

CF₃SO₂-D-Tyr(Me)-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

BzlSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Tyr(Et)-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Nle-Pro-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-Azt-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-(N-시클로펜틸-Gly)-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-Val-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-Pec-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-(3,4-데히드로-Pro)-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

EtSO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-아제티딘

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-AcgΨ[COCO]-아제티딘

EtSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-AcgΨ[COCO]-NH₂

MeSO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-아제티딘

n-부틸SO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-아제티딘

CF₃SO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-아제티딘

BzlSO₂-D-Cha-Pro-AcgΨ[COCO]-아제티딘

3-(BzlSO₂아미노)-1-카르복시메틸-피리딘-2-온-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

3-(BzlSO₂아미노)-1-카르복시메틸-피리딘-2-온-AcgΨ[COCO]-아제티딘

3-(BzlSO₂아미노)-1-카르복시메틸-6-메틸-피리딘-2-온-AcgΨ[COCO]-O-i프로필

3-(BzlSO₂아미노)-1-카르복시메틸-6-메틸-피리딘-2-온-AcgΨ[COCO]-아제티딘

본 발명 화합물의 생리학적 활성을 하기 시험 방법으로 측정하였다.

I. 항트롬빈 분석 시험

트롬빈(인자 IIa)는 응집 다단계에 존재하는 인자이다.

본 발명 화합물의 항트롬빈 활성을, 트롬빈에 의해 영향을 받는 색소 생산성 기질 s-2238의 가수 분해 속도를 분광학적으로 측정하여 평가하였다. 완충제 시스템에서 항트롬빈 활성에 대한 이런 분석 시험을 사용하여 시험 화합물의 IC₅₀수치를 평가하였다.

시험 배지: 트로메타민-NaCl-폴리에틸렌 글리콜 6000(TNP) 완충제

기준 화합물: I2581(카비 제품)

부형제: TNP 완충제

가용화는 최종 반응 혼합물 중에 최대 2.5 중량%의 농도로 존재하며 악영향을 미치지 않는 디메틸설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 또는 t-부틸 알콜에 의해 용이하게 수행할 수 있다.

기법:

시약^*

1. 트로메타민-NaCl(TN) 완충제

완충제의 조성: 트로메타민(Tris) 6.057 g(50 mmol), NaCl 5.844 g(100 mmol), 물 잔량(합계 1 L). 이 용액의 pH를, HCl(10 mmolㆍL^-1)를 사용하여 37℃에서 7.4로 조정하였다.

2. TNP 완충제

폴리에틸렌 글리콜 6000을 TN 완충제 중에 용해시켜 농도 3 gㆍL^-1를 얻었다.

3. S-2238 용액

한 개의 바이알 S-2238(25 mg; 카비 디아그노스트리카 제품, 스웨덴)을 TN 완충제 20 mL 중에 용해시켜 농도 1.25 mgㆍmL^-1(2 mmolㆍL^-1)를 얻었다.

4. 트롬빈 용액

휴먼 트롬빈(16 000 nKatㆍvial^-1, 센트랄 레보레이토륨 부어 블로에드트란스푸지에 제품, 네덜란드 암스테르담 소재)을 TNP 완충제에 용해시켜 저장 용액 835 nKatㆍmL^-1를 얻었다. 사용하기 직전, 이 용액을 TNP 완충제로 희석시켜 농도 3.34 nKatㆍmL^-1를 얻었다.

* - 사용된 모든 원료는 분석 등급에 속한다.

- 수용액인 경우에는, 초순도 물(Milli-Q 품질)을 사용한다.

시험 화합물 및 기준 화합물 용액의 제조

시험 화합물 및 기준 화합물을 Milli-Q 물에 용해시켜 저장 농도 10^-2molㆍL^-1를 얻었다. 각각의 농도를, 부형제를 사용하여 단계적으로 희석시켜 농도 10^-3molㆍL^-1, 10^-4molㆍL^-1및 10^-5molㆍL^-1를 얻었다. 저장 용액을 비롯하여 이들 희석액을 분석 시험에 사용하였다(각 반응 혼합물의 최종 농도: 3ㆍ10^-3molㆍL^-1, 10^-3molㆍL^-1, 3ㆍ10^-4molㆍL^-1, 10^-4molㆍL^-1, 3ㆍ10^-5molㆍL^-1, 10^-5molㆍL^-1, 3ㆍ10^-6molㆍL^-1및 10^-6molㆍL^-1)

절차

실온에서 0.075 mL 및 0.025 mL의 시험 화합물 또는 기준 화합물 용액 또는 부형제를 교대로 미량 역가판의 웰 내로 피펫에 의해 적가하고, 이 용액을 TNP 완충제 0.115 mL와 0.0165 mL로 각각 희석시켰다. S-2283 용액의 부분 표본 0.030 mL를 각 웰에 첨가하고, 평판을 예열 처리하여 37℃에서 10 분 동안 배양기(아머샴 제품)에서 흔들어 주면서 예비 배양시켰다. 예비 배양시킨 후, 각각의 웰에 트롬빈 용액 0.030 mL를 첨가하여 S-2238를 가수 분해시키기 시작하였다. 평판을 37℃에서 배양(30 초 동안 흔들어 주면서)시켰다. 배양 1 분이 경과한 후, 405 nm에서 각 샘플의 흡광도를, 속도론적 미량 역가판 판독기(트윈리더 플러스, 플로우 래보레이토리스 제품)를 사용하여 90 분 동안 2 분마다 측정하였다.

모든 데이타를, LOTUS-MEASURE를 사용하여 IBM 퍼스날 컴퓨터에 수집하였다. 각 화합물의 농도(molㆍL^-1로 표시되는 반응 혼합물의 농도) 및 블랭크에 대한 흡광도를 반응 시간(분)에 대하여 그래프로 나타내었다.

반응의 평가:

각각의 최종 농도에 대한 최대 흡광도를 분석 평가 그래프로부터 계산하였다. IC₅₀수치(최종 농도, μmolㆍL^-1표시됨, 이것은 블랭크의 최대 흡광도의 50% 억제를 발생시킨 것임)를, 하프너 등의 문헌[Arzneim-Forsch./Drug Res. 1997; 27(II): 1871-3]에 따라 로짓 변환 분석법을 사용하여 계산하였다.

본 발명 화합물의 IC₅₀수치를 하기 표 1에 기재된 바와 같이 얻었다.

항트롬빈 활성
실시예	IC₅₀(μmolㆍL^-1)
4	0.09
24	0.01
38	0.11
40	0.02

II. 항 인자 Xa 분석 시험

활성화된 인자 X(Xa)는 응집 다단계에 존재하는 인자이다. 본 발명 화합물의 항 Xa 활성을, Xa에 의해 영향을 받는 색소 생산성 기질 s-2222의 가수 분해를 분광학적으로 측정하여 평가하였다. 완충제 시스템에서 항 Xa 활성에 대한 이런 분석 시험을 사용하여 시험 화합물의 IC₅₀수치를 평가하였다.

일반적으로, 하기 시험 절차 및 시험 조건은 전술한 바와 같은 항트롬빈 분석 시험의 경우와 동일하게 하였다. 다만, 상이한 것은 다음과 같이 하였다.

기준 화합물: 벤즈아미딘

부형제: TNP 완충제

가용화는 최종 반응 혼합물 중에 최대 1%(DMSO인 경우)와 최대 2.5%(기타 용매인 경우)의 농도로 존재하며 악영향을 미치지 않는 디메틸설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 또는 t-부틸 알콜에 의해 용이하게 수행할 수 있다.

기법:

시약^*

3. S-2222 용액

한 개의 바이알 S-2222(15 mg; 카비 디아그노스트리카 제품, 스웨덴)을 물 10 mL 중에 용해시켜 농도 1.5 mgㆍmL^-1(2 mmolㆍL^-1)를 얻었다.

4. Xa 용액

보빈 팩터 Xa 휴먼(17 nKatㆍvial^-1, 카비 디아그노스트리카 제품)을 TNP 완충제 10 mL에 용해시킨 후, TNP 완충제 30 mL로 더 희석시켜 저장 용액 1.77 nKatㆍmL^-1를 얻었다. 이 희석액은 새롭게 제조해야 한다.

절차

S-2238 용액(항트롬빈 분석 시험의 경우) 대신, 상기 S-2222 용액을 본 분석 시험에서 각 웰에 첨가하였다.

반응의 평가:

항 Xa 활성
실시예	IC₅₀(μmolㆍL^-1)
1	0.64
5	0.28
28	0.02

III. 항 인자 VIIa/조직 인자 분석 시험

혈관 손상은 일련의 효소 생성 반응을 개시시켜 궁극적으로 손상 부위에 피브린 겔의 형성을 유도한다. 주요한 효소 생성 반응은 전효소 인자 VII로부터 활성화된 인자 VII(VIIa)의 생성 반응이다. 이러한 활성화 반응은 아직까지 알려지지 않은 메카니즘에 의해 일어난다. 한가지 가설은 혈장내에 존재하는 소량의 인자 Xa가 막 결합된 단백질 조직 인자(TF), 즉 정상적으로는 혈액과 접촉하지 않지만 손상에 의해서는 혈액에 노출하게 되는 단백질에 결합하고, 또한 이 막 결합된 TF와 인자 Xa의 복합체가 인자 VII(참고 번호 1)를 활성화시킨다는 입장을 취하고 있다. 이어서, 또한 활성화된 인자 VII는 막 결합된 TF에도 결합하고, 이후 이러한 고유 테나아제(tenase) 복합체는 인자 X를 인자 Xa로 전환시킨다.

혈전증은 응집 반응의 불충분한 조절이 존재할 경우 발전된다. 이러한 조절을 회복시킬 수 있는 한가지 방식은, 실예로 막 결합된 TF와 인자 VIIa의 복합체와 같은 필수적인 응집 효소를 억제하는 것이다. 또한, VIIa 또는 VIIa/TF 복합체의 억제제가 테나아제 복합체도 억제하기 매우 쉽기 때문에, 또한 상기 테나아제 복합체의 억제제는 시험 화합물에 의한 VIIa 또는 VIIa/TF 복합체의 억제를 측정할 경우 발견될 수도 있다. 또다른 방식은, VIIa/TF 복합체에 대한 화합물의 억제 효능을 달성시키는 것이다. 시험 화합물을 다양한 농도로 인자 Xa 및 TF와, 유리 VIIa보다 TF 결합된 VIIa에 의해 휠씬 더 우수하게 분리 가능한 것으로 알려진 색소 생산성 기질과 혼합한다. 발생하는 아미돌 반응(amidolytic reaction)을 미량 역가판 판독기에서 계속 관측한다. 연구 조사한 화합물의 억제 효능을 IC₅₀로 나타내며, 이 때 IC₅₀은 반응을 개시한지 90 분이 경과한 후, 아미돌 반응의 50% 억제를 생성시키는 화합물의 농도로 정의한다.

시약:

헤페스 완충제

CaCl₂.2H₂O 29.40 g, 헤페스 47.66 g, NaCl 87.66 g 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)(MW = 6000) 30.00 g을 증류수 1000 mL 중에 용해시켜 10배 농축된 헤페스 완충제를 제조하였다. 이 용액을 37℃로 가열한 후, 10 몰 NaOH를 사용하여 완충제 pH를 7.40으로 조정하였다. 이 농축된 완충 용액을 4℃에 보관하였는데, 이러한 조건 하에서는 적어도 2 개월 동안 안정하였다. 사용하기 전에 완충제를 증류수 1 mL 내지 8 mL로 희석시켜 20 mM CaCl₂, 20 mM 헤페스, 150 mM NaCl 및 0.3% PEF6000로 된 웰내 최종 농도(시험 절차를 참조)를 얻었다. 화합물을 증류수 또는 또다른 부형제 중에 용해시키고 희석시키는 경우에는, 불충분한 용해도 때문에 헤페스 완충제를 시험에서 동일한 이온 세기를 보존시키기 위해 1 mL 내지 6 mL로 희석시켰다.

재조합 사람 인자 VIIa

재조합 사람 인자 VIIa를 코네티컷주 그린위치에 소재하는 어메리카 디아그노스트카 인코포레이티드에서 구입하였다. 각 바이알은 재조합 사람 인자 VIIa 1.2 mg를 함유하고 있었는데, 이것를 10 mM 글리실글리신, 50 mM NaCl, 100 mM CaCl₂, 30 mg/mL 만니톨, 0.1% 트윈, pH 5.5로 구성된 완충제 2 mL로 동결 건조시켰다. 이들 바이알의 각 내용물을 제조 업자가 지시한 바대로 증류수 2 mL로 재구성하였다. 이와 같이 하여 얻어진 1.2*10^-5M 저장 용액 2 mL를 보다 작은 분획물로 분할하고, 이것을 -30℃에 저장하였다. 이러한 조건에서는 이들 VIIa 샘플이 적어도 6 개월 동안 안정하였다.

재조합 사람 조직 인자

재조합 사람 조직 인자를 코네티컷주 그린위치에 소재하는 어메리카 디아그노스티카 인코포레이티드로부터 구입하였다. 각 바이알은 재조합 사람 조직 인자(비지질화된 것임; MW 35000 달톤) 25 ㎍을 함유하고 있었는데, 이것을 150 mM NaCl, 200 mM 만니톨 및 10 mM CHAPS(막 단백질을 가용화시키는데 사용되는 스테로이드 유도체, 머크 인덱스 참조)로 구성된 Tris/HCl(pH 8.0) 1 mL로 동결 건조시켰다. 이들 바이알의 각 내용물을 제조 업자가 지시한 바대로 증류수 1 mL로 재구성하였다. 이와 같이 하여 얻어진 7.14 ×10^-7M 저장 용액 1 mL를 소량의 분획물로 분할하고, 이것을 -30℃에서 보관하였다. 이와같이 저장된 이들 VIIa 샘플은 적어도 67 개월 동안 안정하였다.

페파크로 VIIa

페파크롬(pefachrome) VIIa, 즉 CH₃SO₂-D-Cha-but-Arg-pNa.AcOH(MW 670.8)를, 스위스 바젤에 소재하는 펜타파마 리미티드로부터 구입하였는데, 각 바이알은 상기 색소 생산성 기질 10 μmol를 함유하고 있었다. 실험 당일에는 바이알의 내용물을 증류수 8.33 mL 중에 용해시켜 1.2 mM 페파크롬 VIIa 용액을 생성시켰다. 이 용액 나머지를 -30℃에 저장하였는데, 이러한 조건에서는 적어도 6 개월 동안 안정하였다.

재조합 TF/재조합 VIIa 용액

실험 당일에는 1.2*10^-5M 재조합 VIIa의 심냉동 샘플과 7.14*10^-7M 재조합 조직 인자의 심냉동 샘플을 해동시켰다. 이 해동된 재조합 사람 TF의 7.14*10^-7M용액을 희석시켜 4*10^-7M로 만들고, 이 용액 30 ㎕를 해동된 1.2*10^-5M 재조합 VIIa 용액 1 ㎕ 및 헤페스 완충제 449 ㎕와 혼합시켜 25 nM 재조합 VIIa과 25 nM 재조합 TF를 함유하는 헤페스 완충제를 생성시켰다. TF/VIIa 용액 480 ㎕의 양은 한 개의 시험 화합물에 대한 8개 용액의 억제를 검토하는데 충분하였다. 이러한 양은 N개 시험 화합물에 대한 IC₅₀를 달성시키는데 N회가 필요하였다.

시험 화합물의 제조

시험 화합물을 헤페스 용액 중에 용해시켜 5*10^-3M 저장 용액(A)을 얻었다. 이 용액으로부터 1.67*10^-3M(B), 5.56*10^-4M(C), 1.85*10^-4M(D), 6.17*10^-5M(E), 2.06*10^-5M(G), 6.86*10^-6M(G) 및 2.29*10^-6M(H)의 농도로 구성된 7개의 추가 용액을, 전술한 이들 각각의 용액을 헤페스 완충제 중의 상기 3가지 인자로 희석시킴으로써 제조하였다. 이러한 일련의 용액을, 기준 화합물 Org 34593과 또한 각 N-1 개 시험 화합물인 경우에도 제조하였다. 보다 간편하게 할 경우, 상이한 화합물의 농도를 가진 기타 일련의 용액을 제조할 수 있었다.

절차

화합물을 미량 역가판 위에 위치한 컬럼에 순차적으로 분배시키고, 8개의 웰로 이루어진 한 개의 컬럼을 일련의 미억제된 반응을 위해 예비로 남겨 두었다. 수백 ㎕의 헤페스 완충제를 8개의 체널 피펫으로 모든 (N+1)*8 개의 웰에 넣었다. 여기서, N은 기준 화합물 Org 34593을 비롯하여 상이한 시험 화합물의 수를 나타낸 것이다. 이후, 1.2 mM 페파크롬 VIIa 용액 50 ㎕를 8개의 채널 피펫으로 화합물 시험 및 블랭크 반응을 위해 예비로 남겨둔 웰(N+1)*8개의 모든 웰 내의 헤페스 완충제 100 ㎕에 첨가하였다.

이어서, 제1, 제2, 제3에서 제N에 이르는 화합물의 각 8개의 용액 50 ㎕를, 컬럼 당 최고치에서 최저치에 이르기까지 감소하는 화합물 농도의 크기로 분배 컬럼 당 하나의 화합물을 얻기 위하여, 1, 2, 3, 최대 N개인 각 컬럼의 8개 웰(H) 중에 감소하는 농도의 크기로 제1(A)의 내용물과 혼합시켰다. 최종적으로, 헤페스 완충제 50 ㎕를 일련의 블랭크를 위한 예비로 남겨둔 제 N+1 컬럼의 8개의 웰에 첨가하였다.

전체 평판을 제조한 후, 이 평판을 미량 역가판 진탕기/배양기(아머샴 제품)에서 1 분 동안 진탕시키고, 상기 평판을 동일한 기기에서 10 분 동안 배양시켜 상기 용액을 37℃로 만들었다.

반응을, 37℃에서 예열시킨 25 nM VIIa/25 nM TF 용액 50 ㎕를 각 (N+1)*8 개의 웰에 8개 채널 피펫으로 첨가하므로써 개시시켰다. 평판을 30 초 동안 진탕시킨 후, 평판을 항온 조절된 미량 역가판 판독기에 배치하고, 405 nm에서의 흡광도를 90 분 동안 1 분 간격으로 각 웰에 대하여 판독하였다. 흡광도는 LOTOUS 1.2.3에 수집하여 속도론적 판독기에 연결된 PC 내로 로딩하였다.

평가:

90 분에 측정된 (최종) 흡광도를, 반응 개시한 후 1 분에 측정된 제1 흡광도 수치를 빼줌으로써 시험 초기의 블랭크 흡광도에 대하여 보정하였다. 시험 화합물의 (Abs[I]) 존재와 (Abs[O]) 부재 하에서 보정된 최종 흡광도를 시험 화합물의 각 농도[I]에 대하여 +log((Ab[O]/Abs[I]-1))을 계산함으로써 로짓 값으로 전환시켰다. 이들 로짓 값을 시험 화합물 농도의 -로그에 대하여 그래프로 나타내었다. 이러한 로짓 그래프는 최종 흡광도의 20% 내지 80% 억제의 선형 관계식을 나타내었다.

pIC₅₀수치는 로짓 값이 0인 시험 화합물의 -log(농도 M)로서 정의된다. 이러한 수치를 로짓 대 -log[I]의 관계식(로짓 값이 0에 가까운 것이 바람직함)의 선형 회귀 분석법으로 계산하였다. 시험하고자 하는 화합물이 VIIa/TF에 대하여 매우 활성적이어서 pIC₅₀를 내삽법 보다는 외삽법에 의해 계산해야 할 경우에는, 본 발명의 시험 화합물에 대한 일련의 추가 희석액을 제조하여 분석 시험을 다시 수행하는 것이 최선의 방법이다. pIC₅₀수치를 측정하는 이러한 방법은 하프너 등의 문헌[참고 2]에 기재되어 있다. 해당 IC₅₀을 10^-pIC50로 계산하여 몰로 나타내었다.

필요량:

시험 화합물의 약 IC₅₀을 분석 시험하는데 약 1 mg이 필요하였다.

기준 화합물

기준 화합물로 Org 34593(PPACK)을 사용할 수 있다. 이런 화합물인 경우에는 3*10^-7M가 IC₅₀을 달성시켰다.

참고 문헌:

(1) 에징톤 티 에스 등의 문헌[The structural biology of expression and function of Tissue Factor; Thrombosis and Haemostasis 66(1), 67-79(1991)]

(2) 하프너 등의 문헌[Mathematical analysis of concentration response relationships: Arzneim. Forsch./Drug Research 27, 1871-1873(1997)]

본 발명 화합물의 항 인자 VIIa/조직 인자 활성을 측정하는 단일 점 측정법으로서, 농도 1×10^-5M에서의 억제율(%)을 하기 표 3에 기재하였다. %의 측정을 위해서 전술한 바와 같은 절차를 사용하였다.

항 인자 VIIa/조직 인자 활성[농도 1 ×10^_5M에서의 억제율(%)]
샘플	억제율(%)
44) EtSO₂-D-Phe-Leu-LysΨ[COCO]-O-i프로필	98
44) EtSO₂-Asn-Leu-LysΨ[COCO]-O-i프로필	56
44) EtSO₂-D-3-Tiq-Phe-LysΨ[COCO]-O-i프로필	91
44) EtSO₂-D-Leu-Gln-LysΨ[COCO]-O-i프로필	94

Claims

하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 전구 물질 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염:

화학식 I

R¹SO₂-B-X-Z-C(0)-Y

상기 식 중,

R¹은 R²OOC-(CHR²)_m- 또는 R²NH-C0-(CHR²)_m- 이거나, 또는 (C₁∼C₁₂)알킬, (C₂∼C₁₂)알케닐(이들 기는 (C₃∼C₁₂)시클로알킬, (C₁∼C₆)알콕시, OH, COOR², CF₃또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음) 중에서, 그리고 (C₆∼C₁₄)아릴, (C₇∼C₁₅)아르아릴 및 (C₈∼C₁₆)아르알케닐(이들 중 아릴기는 (C₁∼C₆)알킬, (C₃∼C₈)시클로알킬, (C₁∼C₆)알콕시, OH, COOH, CF₃또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음) 중에서 선택되며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고, R²는 각각 H, (C₁∼C₁₂)알킬, (C₃∼C₈)시클로알킬, (C₆∼C₁₄)아릴 또는 (C₇∼C₁₅)아르알킬(이들 중 아릴기는 (C₁∼C₆)알킬, (C₁∼C₆)알콕시 또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음)이며,

B는 결합, 화학식 -NH-CH[(CH₂)_pC(O)OH]-C(O)-의 아미노산 또는 이것의 에스테르 유도체(여기서, p는 1, 2 또는 3임), Gly, D-1-Piq, D-3-Piq, D-1-Tiq, D-3-Tiq, D-Atc, Aic, 또는 소수성의 염기성 또는 중성 측쇄를 함유하고있는 L-아미노산 또는 D-아미노산이고,

X는 소수성 측쇄를 함유한 아미노산, 글루타민, 세린, 트레오닌, N, O 또는 S 중에서 선택된 추가의 헤테로 원자를 임의로 함유하고, (C₁∼C₆)알킬, (C₁∼C₆)알콕시, 벤질옥시 또는 옥소에 의해 임의로 치환되는 시클릭 아미노산이거나, 또는 X는 2-아미노-이소부티르산, -NR²-CH₂-C(O)- 또는 단편또는이며, 여기서 n은 2, 3 또는 4이고, W는 CH 또는 N이며, R³은 H, (C₁∼C₆)알킬 또는 페닐(이들 기는 히드록시, (C₁∼C₆)알콕시, COOH, COO(C₁∼C₆)알킬, CONH₂, 또는 할로겐에 의해 임의로 치환될 수 있음)이고,

Z는 리신 또는 4-아미노시클로헥실글리신이며,

Y는 -NH-(C₁∼C₆)알킬렌-C₆H₅(여기서, 페닐기는 (C₁∼C₆)알킬, (C₁∼C₆)알콕시 또는 할로겐에 의해 치환될 수 있음)이거나, 또는 Y는 -OR⁴또는 -NR⁵R⁶(여기서, R⁴는 H, (C₂∼C₆)알킬 또는 벤질이고, R⁵와 R⁶은 각각 H, (C₁∼C₆)알콕시, 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 (C₁∼C₆)알킬이거나, 또는 R⁵과 R⁶은 함께 (C₃∼C₆)알킬렌을 형성하거나, 또는 R⁵과 R⁶은 질소 원자와 함께 결합하여(여기서, V는 0, S 또는 SO₂임) 형성한다.
제1항에 있어서, 상기 Z가 리신인 것인 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, X가 시클릭 아미노산, 소수성 측쇄를 함유하는 아미노산, 글루타민, 세린, 트레오닌, -NR²-CH₂-C(O)-, 또는 단편또는(여기서, R³은 H, (C₁∼C₆)알킬 또는 페닐임)인 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, X가 프롤린, 류신, 글루타민, 트레오닌, 페닐알라닌, -NR²-CH₂-C(O)-{식 중, R²는 메틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실, 또는 단편또는(여기서, R³은 H 또는 메틸임)임}인 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, B가 결합이거나 소수성 또는 중성 측쇄를 함유하는 D-아미노산인 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, R¹이 (C₁∼C₆)알킬 또는 벤질인 화합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, Y가 -OCH(CH₃)₂인 화합물.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 화합물과 약학적으로 적당한 보조제를 포함하는 약학 조성물.
치료 용도로 사용하는 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 화합물.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 임의의 화합물을 트롬빈 관련 질환을 치료하거나 예방하기 위한 의약품을 제조하는데 사용하는 방법.