CZ9903880A3 - Inhibitory serinové proteázy - Google Patents

Abstract

Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I, R'SO2-B-XZ-C(O)-Y, kde jednotlivé symboly mají specifický význam, jsou látky, které je možno použít k léčení nebo prevenci chorob, souvisejících s thrombinem, zejména k léčení a prevenci infarktu myokardu, thrombózy a mozkové mrtvice ve formě farmaceutického prostředku, který rovněž tvoří součást řešení. Použití těchto látek pro výrobu farmaceutických prostředků se zmíněným účinkem

Description

Vynález se vztahuje na nové inhibitory serinové proteázy; farmaceutické prostředky, obsahující zmíněné inhibitory; stejně jako na použití zmíněných inhibitorů pro výrobu léčiv; určených pro léčbu,, a prevenci nemocí,, souvisejících s throm·^ binem*

IJ_a_s_a_y_a_d_n_í.___3_í_s_y___t_s_£h_n_i_k_y

Serinové proteázy jsou enzymy,, které mimo jiné hrají významnou roli v kaskádě krevní koagulace*. Do této skupiny proteáz patří na příklad thrombin; trypsin; faktory VHeJ IXa;, Xa; Xla;. XIlaj, a protein C*

Thrombin je serinové proteáza,, která reguluje poslední stupeň: koagulační kaskády. Hlavní funkce thrombinu spočívá ve štěpení fibrinogenu, za tvorby fibrinových monomerů, které vytvářejí křížovými vazbami nerozpustný gel* Kromě toho throm’ bin reguluje na začátku kaskády svoji vlastní produkci aktiva» cí faktoru VJ, a Vili; a vykazuje také důležité působení na buněčné úrovni_r kde působí na specifické receptory; a vyvolává agregaci destiček;, aktivsci buněk endothelu; a prolifersci fibroblastů*

Thrombin vykazuje také centrální regulační funkci při tvorbě hemostáze ( zástava krvácení);, a tvorbě thrombů. Vzhledáme ktomu_r že inhibitory thrombinu mohou vykazovat široký roz· sah therapeutických aplikací,, je v této oblasti prováděn rozsáhlý výzkume*

Při vývoji synthetických inhibitorů serinových proteáz; a mnohem specifičtěji- thrombinu; zvýšil se zájem o malé synthe tické peptidy, které lze identifikovat pomocí proteolytických enzymů podobným způsobem,, jako u přirozených substrátů. Výsledkem byla příprava nových, peptidům podobných inhibitorů,, jako na příklad inhibitorů transicitního stavu thrombinu.

Výzkum mnohem účinějších_P a mnohem selektivnějších inhibitorů pokračuje ve stále nezmenšené míře_p a cílem získat inhibitory thrombinu,, které lze aplikovat při nižším dávkování, a které mají menší počet a méně závažných vedlejších účinků.

Zvláštní pozornost je dále věnována orální biologické dostupnosti. Účinné,, intravenózně aplikované inhibitory thrombinu, jsou klinicky účinné v případech potřeby akutní péče, vyžadující léčbu onemocnění, souvisejících s thrombinem, ale zvláště při prevenci s thrombinem souvisejících onemocnění, jakými jsou na příklad infarkt myokardu; thrombóza; a mrtvičné záchvaty,, vyžadující dlouhodobou léčbu,, výhodně s orálně aplikovanými dávkami entikoagul8ncií.

Mnohé,, peptidům podobná inhibitory serinové proteázy, zejména inhibitory thrombinu,, popsané v dřívějších publikacích, jsou založeny na sekvenci -D-Phe-Pro-Arg-; ( viz na příklad sloučeniny popsané v odborném časopise Bioorganic and Sfedical ChemistryJ 3J 1063 - 1078J/1995/J autor Brady se sp.; a v rámci US patentu číslo 5,,597.804.

Inhibitory thrombinu mohou také obsahovat místo ergininu; lysinové postranní řetězce, jako na příklad jiné inhibitory; popsané v odborném časopise Thrombosis and HaemostasisJ 74(4);

1107 - 1012J./1995/í autoři Brady se sp.J a Lewis se sp.J a další v časopise J,Enzyme Inhibition·;· 9; 43 - 60J /1995/J autor Jones se sp,; ve kterém je oznámeno, že tripetidové slouče• ·

* niny} obsahující funkce alfa-ketomethyl esteru, jsou sloučeny labilní,, a proto jsou nevýhodné pro další vývoj thrombinových inhibitorů.

Z mezinárodní patentové přihlášky WQ 94/25X35;} jsou znáíjpy také thrombinové inhibitorymající místo lysinového, nebo argininového postranního řetězce,, aminoeyklohexylový podíl.

Na základě zmíněných,, a také jiných odkazů} ( na příklad US patent číslo 5,523.308 )} je známa řada variací C-zakončení těchto,, peptidům podobných, thrombinových inhibitorů. Vývoj v této oblasti už přispěl ku zlepšenému poznání, jak modulovat biologické vlastnosti tohoto typu thrombinových inhibitosů

Ačkoliv je vynakládáno značné úsilí na nalezení selektivních thrombinových inhibitorů^ vykazujících dobrou orální biologickou dostupnost_r existuje dosud jen málo inhibitorů transi citního stavu thrombinu, známých v odborných kruzích, zabývajících se touto problematikou.

P_2_Ů_s_í:_s_i_š.___Y_Z_S_éLÍ_£_z_u

Podstatu vynálezu tvoří inhibitory serinové proteázy_r obecného vzorce}

R¹so₂-B-x-z-c(a)-r; (i) ve kterém,,

R¹ = R²00£-(CHR² nebo R²NH-CO-(GHR²)_m-} skupina,, nebo je vybrána z (1-12C)alkylové skupiny} (2-12G)-alkenylové skupiny, které mohou být po případě substituovány s (3-1 2G)-cykloalkylovou} (1-6C)alkoxylovou skupinou, s OH} coos²; ce₃;

nebo hálogenem,, a ze} • φ ···· ·· φ φ • · φ · · φ · • φ φ φ φ φ · (6-14C)arylové skupiny; (7-15&)aralkylové skupiny * a (8-16aralkenylové skupiny, kde’, arylóvé skuliny mohou být po případě substituovány s (1 -6C)alkylovou; (3-8C)-cykloalkylovou; (1-6C)-alkoxylovou skupinou; s OH; COOH; GFp nebo halogenem» m = i; 2f nebo 3J každá R² skupina je nezávisle HJ (1-12C)alkylová;(3-8C) cykloalkylováj (6-14d)arylováJ nebo (7-15C)-aralkylováJ jejichž arylové skupiny mohou být substituovány s-(1-6C) alkylovou; (1-6G)alkoxylovou skupinou;, nebo halogenem.

B = vazba; aminokyselina dle vzorce -NH-CH-/(CH ) C(0)OH/-C(0);

Ir nebo z něho odvozeného esteru; kdej p = 1,,2,, nebo 3J GlyJ D-1-PiqJ D-3-Piqí D-1-TiqJ B-3-Tiq*,

D-AícJ Aic; nebo L-; nebo B-sminokyselina_r mající hydrofóbní;, bazický;, nebo neutrální postranní řetězec..

X = aminokyselina; s hydrofobním postranním řetězcem; glutamin; serinj threoninij cyklická aminokyselina, obsahující po případě další heteroatom,. vybraný z N; OJ nebo s; a po případě substituovaný s (1-6G)alkylovouj (1-6C)alkoxylovou skupinou;benzyloxy-skupinou; nebo s oxo skupinou;

neboj

X = 2-amino-isomáselná kyselina;( 2-methylalanin); -NE^-CH^-GÍO)-; nebo fragment;

• · • ·

^(CH₂)_n^

-NH-CH N-CH₂-C(O)-NH

N-CH₂-C(O)nebo ve kterém^ n = 2; 3J nebo 4j

W = CHJ nebo N; a g3> _ (1-6C)alkylová, nebo fenylová skupina; přičemž tyto skupiny mohou být po případě substituovány s hydroxylem*,.

(1 -6C)alkoxylovou skupinou;-COOH; C00(1-6C)alkylovou skupinou; s CONH ; nebo halagenemj

Z - lysin;, nebo 4-aminocvklohexylglycin;

Y = -NH-(1-6Gů-alkylen-C^H^- skupina; fenylová skupina,která může být substituována s (1-6C)alkylovou;(1-6C)alkoxylovou skupinou; nebo halogenem;

neboj γζ = -OS^; nebo -NR^R^; kde R^ je H; (2-6C)alkylová; nebo benzylová skupina; a R^^; a R^ jsou nezávisle HJ. (1-6£)alkoxylováj nebo (1-6C)alkylová skupina,, po případě substituovaná s halogenem; nebo R^ a R^ jsou zároveň (3-6C)elkyleno vá skupina*,, nebo R⁵ a R⁶; spolu s dusíkovým atomem, ku kterému jsou vázány, jsou kde

V = o; s; nebo S0’₂;

• · · ·

nebo , _p proléčivo z nich vyrobené; nebo farmaceuticky vhodná sůl; z nich vyrobená.

Tyto látky jsou účinné a selektivní inhibitory serinové proteázy.

Specificky jsou tyto látky, uvedené v předloženém vynálezu, inhibitory thrombinuj faktoru VII/'tkáňového faktoru,, a faktoru Xa.

Sloučeniny,, uvedené v předloženém vynálezu, vykazují zlepšenou farmakokinetiku; a zejména dobrou biologickou dostupnost po orální aplikaci,

Alfa-(2-6C)ketoesterové sloučeniny, které jsou součástí předloženého vynálezu, nevykazují nevýhody už dříve oznámených; labilních alfa-ketomethylesterových sloučenin.

Sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu, jsou použitelné pro léčbu a prevenci 3 thrombinem zprostředkovanými, nebo s thrombinem spojenými nemocemi,, které zahrnují několik thrombotických a prothrombotických stavů,, v rámci kterých je aktivována koagulační kaskáda,, a které zahrnují, ale nejsou limitovány, jen na hluboké, žilní thrombáy; plicní embolie; thromboflebitidy, ( zánět žil provázený srážením krve); arteriální okluze v důsledku thrombózy nebo embolie; vznik arteriálních okluzí v průběhu nebo po angioplastice; nebo thrombolýze,, restenóze po arteriálním poranění_P nebo invazivních kardiologických zákrocích; pooperativní žilní thrombózy nebo embolie; akutní nebo chronickou atherosklerozu; mrtvičný záchvat; infarkt myokardu; rakovinu a metastázy; a neurodegenerativní onemocnění.

Sloučeniny, uvedené ve vynálezu,, mohou být také použity jako antikoagulanci8 při mimotělním oběhuj v případě potřeby i při dialýze a chirurgických zákrocích.

Ί -

Sloučeniny,, uvedené ve vynálezu, mohou být také použity jsko antikoagulancia in vitro.

Výhodné inhibitory aerinové proteázy, uvedené v předloženém vynálezu, jsou sloučeniny, kde Z - lysin;

Výhodnější jaou ty sloučeniny,, kde g - cyklická aminokyselina\ aminokyselina a hydrofóbním postranním řetězcem; glutamin’,; serinj . thereoninj ,

-NR²-CH₂-C(O'(-skupin?· _t nebo fragment.

kde *, r3= hJ, (1-6C)alkylová,, nebo fenylová skupina \

Zvláště výhodné jsou sloučeniny; -kde X“ = přolinj, leucin*,, glutamin*,, threonin; fénylalsninj

-NR²-CH₂-C (0?) -skupina J kde

R.² = methyl,, cyklopentyl; nebo cyklohexyl; nebo fragment;

-NH-CH ^(ch₂)₄^ ,N-CH₂-C(O)-

O nebo — 8 — • · · · · · «· ··

kde;

r3- = η* nebo methyl;

Ostatní výhodné sloučeniny jsou takové, u kterých K - vazba,,, nebo D-aminokyselina_r mající hydrofobní,, nebo neutrální postranní řetězec.,

Nejvýhodnější sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu jsou takové,, kde g = (1-6C)alkylováJ nebo benzylová skupina.

Ve formulacích Yf = výhodnější, když = (2-6C)alkylová;. nebo benzylová skupi ba.

Zvláště výhodné jsou takové sloučeniny_r kde τ = -och(gh₃,)₂-;

Výhodné jsou také sloučeniny,, kde~ γ/ = nh₂;

Výraz (1-12C)alkylová skupina, označuje rozvětvenou, nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu; mající 1 až 12 uhlíkových ato mů,. jako na příklad methyl; ethyl; t-butyi; isopentyl; heptyi; dodecylj- a podobně.

Výhodné alkylové skupiny jsou (1-60)alkylové skupiny; mající 1 až 6 uhlíkových 8tomů.Alkenylová (2-120)skupina, je buď rozvětvená, nebo nerozvětvená; nenasycená uhlovodíková akupina;, mající 2 sž 12 uhlíkových atomů.

:ι <

- 9 ·· · ·

Výhodné jsou (2-6C)alkenylové skupihy. Jako příklady jsou uvedeny ethenylj propany!; allyj 8 podobně.

Výraz (1 -60 siky len;, označuje rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylenovou skupinu;., mající 1 až 6 uhlíkových atomů, jako na příklad -(CH^)^^ a

g = 1 až 6J, -GH(CH₃3-; · . . -CH(CH₃)-(CH₂); atd.

Ve formulacích γ jsou výhodné alky lenové skupiny;, ethylen;, a methylem*

Výraz (1-6C.) alkoxy; označuje alkoxylovou skupinu, mající 1 až 6 atomů uhlíkuj, přičemž význam alkylového podílu byl definován už dříve*

Výraz (3-12C)cykloalkyl označuje mono-J nebo bieykloalkylovou skupinu,, mající 3 až 12 uhlíkových atomů, přičemž cykloalkylová skupina může být po případě substituována s oxo-skupinou.

Výhodné jsou (3-8)cvkloalkylové skupiny;, na příklad cyklopropyi; cyklobutylj cyklopentyl;, cyklohexyi; cvkloheptylj cyklooktyl·.^ atd*

Ještě výhodnější cykloalkylové skupiny jsou i cvklopentylová^ a cyklohexylová skupina.

Výhodná cykloalkylová substituovaná alkylová skupina při definování R¹ je skupina kafru*

Aromatický podíl se 6 až 14 atomy uhlíku je (6-14&)arylová skupina., Arylová skupina může dále obsahovat jeden nebo více heteroatomů;, jako na příklad NJ. Sj; nebo O*

Příkladem arylových skupin jsou fenyl; naftyl; (iso—chinolyi; indanyl; a podobně.

10?‘ Alkylové,, respektive alkenylové skupiny, jsou (7-150srslkylové skupiny’,, a (8-16C)aralkenylově skupiny; substituované s jednou,, nebo s více arylovými skupinami.; přičemž celkový pcrčet uhlíkových atomů;, je 7 až 15;, respektive 8 až 16, •·»« ·· · * · · ·· « · · · « * · • · · · « · « • · · · ·»

Výraz halogen označuje fluor;, chlor; hrom;, nebo jod.

Výraz esterový derivát označuje nějaký vhodný esterový derivát,, výhodně (1-4G)-alkylestery_r jako na příklad methyl; ethyl-J nebo t-butylestery,

Výraz Atc označuje 2-aminotetralin-2-karboxylovou kyselinu; a Aic označuje aminoindan-karboxylovou kyselinu.

Výrazy 1-J a 3-Tiq označují 1 „2,,3_ř4-tetrahydroisochinolin-1-; respektive 3-karboxylovou kyselinu;

⁸ a

3-Piq je perhydrca.sochinolin-1-; respektive 3-karboxylová kyselina·.

Výraz aminokyselina, mající postranní hydrofobní řetězec,, označuje aminokyselinu, mající postranní řetězec s (3-8C)cykloalkylovou; (6-14CÚarylovou; nebo (1-6GJalkylovou skupinou, přičemž alkylová skupina může být po případě substitupvána s jednou; nebo více (3-8C)-cykloalkylovými skupinami;, nebo se (6-l4C)arylovými skupinami,

Hydrofobní postranní řetězec může být po případě substituován s jedním; nebo s více substituenty,, jako ne příklad s hydroxylovou skupinou; halogenem, trifluormethylevou skupinou;

11' -

• « « · · 9 9 9	99 9 9	9999 9	99 99 : : i :
• ·	9 9	9	9 9 9 9
• 99 9	9·	•	9 9 99

-OSQgCFyJ (1-4G;)elk.ylovou skupinou} ( na příklad methylovou, nebo ethylovou skupinou )}(1-4C)alkoxy1ovou skupinou} ( na příklad s methoxylovou skupinou )} fenyloxy-} benzyloxyskupinou}, a podobně·

Výhodné aminokyseliny,, s hydrofóbním postranním řetězcem,, jsou leucin}, valin}, cyklohexylalanim}. 4-methoxy-cyklohexylalanin}, cyklooktylalanin}, fenylalanin} D-naftylalanin} tyrosinj, O-me thy ltyr osin}, ( nebo p-methoxy-f enylalanin)}, 3,3dif enylalanin}. norleucin} a leucine

Aminokyseliny,, mající bazický postranní řetězec,, jsou uvedeny jako příklad, nejsou ale omezeny jen na arginin; a lysin, výhodně arginin»

Výraz aminokyseliny,, mající neutrální postranní řetězec, ozhačuje aminokyseliny, jako na příklad glutamin, ( Gin)} methionin sulfon} aspařagin}( Asn)J a podobně.

Výhodné jsou Gin; a Asn.»

Cyklické aminokyseliny jsou na příklad 2-azetidin-karboxylová kyselina} prolin} pipekolinová kyselina} 1-amino-Γ-karboxy- (3-8G)-cykloalkán} ( výhodně 4CJ 5C} nebo 6C )} 4-piperidinkarboxylová kyselina}, 4-thiazolidin-karboxylová kyselina} 3,4dehydrcr>-prolim}, azaprolin}, 2-oktahydroindol-karboxylová kyselina} § podoftftě»

Výhodné jsou 2-azetidin-karboxylová kyeelinaj prolin} pipe kolinová kyselina}. 4-thiazolidin-karboxylová kyselina} 3,4-dehydro-prolin,, a 2-oktahydroindol-karboxylová kyselina»

Výraz substituovaný označuje:

Substituci s jedním, nebo s více substituenty» • ··*« 94 ·#·· ·4 44

4 4 4 i 4 4 4 · « 9 4 4 4 4 9 4 4

4 4 4 4 4 9 9 4 4 4

4 4 4 9 9 9 4 4

944 4 94 4 44 ··

-)2Vynález také zahrnuje ,„proléčiva sloučenin dle vzor- ce (l)J, která jsou po aplikaci metabolizována na účinné složky.

Vhodná ,„proléčiva jsou na příklad Ní-alkoxykarbonylové,.

chráněné deriváty;. ( výhodně N-ethoxykarbony1-); sloučenin,, dle vzorae (I)·

Vynález dále zahrnuje postup pro přípravu sloučeniny dle vzorce (l)j obsahující kuplování vhodně chráněných aminokyselin,. nebo analog aminokyselin;, a následné odstranění chránících skupin·.

Sloučeniny dle vzorce (I);, mohou být připraveny běžným kon venčním postupem, známým u tohoto typu sloučenin. Ku konci Haifa chráněné ( a chráněný postranní řetězec v případě_r že jsou přítomny reaktivní postranní řetězce) deriváty aminokyselin,, nebo peptidů,, jsou aktivovány 8 kuplovány,, na vhodně karboxylem chráněné aminokyseliny,, nebo deriváty peptidů,, bučí v roztoku;, nebo na pevném nosiči·

Chránění alfá-amino funkcí se provádí obecně působením urethanů,, jako na příklad vůči kyselinám labilní terč..butyloxykarbony lovou skupinou (Boc);. benzvloxykarbonylovou skupinou; (Gbz)J a substituovanými analogy,, nebo bazicky labilní 9-fluorenyl-methoxykarbonylovou (Fmoc);, skupinou.

Cbz skupina může být také odstraněna katalytickou hydrogenací· Ostatní vhodné,, amino-chránící skupiny; zahrnují Nps; BpocJ, MSC; atd·

Dobrý přehled amino-chrámících skupin: je uveden v odborné publikaci The Pe ptide a ;,Analysis;-Synthe sis, Biology; Vol.3J autoři E..,Gross„ a <F.Meienhofer; (Academie Press; New York* /1981/

Chránění karboxylových skupin může se provést pomocí přípravy esterů; na př, alkalicky labilních esterů ( jako jsou na přiklad methyl-J nebo ethylesteryj vůči kyselinám labilní • » • · • ft ·

• ft ·

• · * ft ftft • · estery; podobně jako terc.-butylestery;, nebo labilní estery vůči hydogenlytickému působení, jako na příklad benzylestery,

Chránění funkcí postranního řetězce lysinu; nebo A-aminocyklohexylglycinuj. může být provedeno za použití výše zmíněných skupin.. Aktivace karboxylové skupiny vhodně chráněných aminokyselin, nebo peptidů, můjže být provedeno s azidyj. smíšenými anhydridyj aktivními estery, nebo karbodiimidovým postupem,, zejména za přídavku katalytických,, nebo racemizaci potlačujících sloučeninvj jako jsou l-hydroxybenztriazoi; HhydroxysukcinimidJ 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazinj. N-hydroxy^'5-norbornen-2,3*’dÍk8rboxiimidj.,

Viz na příklad publikaci The Peptides,, Analysis,, Synthesis _ř BiologyJ ( citace uvedena výše); a Pure and Applied Chem.; 59(3);, 331 - 344J( 1987 )»

Sloučeniny uvedené v předloženém vynálezu, které se mohou vyskytovat ve formě volné base, mohou být izolovány z reakční směsi ve formě farmaceuticky vhodných solí.

Farmaceuticky vhodné sole lze také získat zpracováním volné base dle vzorce (I); s organickou, nebo anorganickou kyselinou,, jako je na příklad chlorovodík;, bromovodík; jodovodík; kyselina sírová; kyseline fosforečná; kyselina octová;, kyselina propionová;. kyselina glykolováj (2-hvdroxyethanová kyselina); maleinová kyselina = (Z)-butandiová kyselina;, malonová kyselina = propandiová kyselina; methansulfonová kyšeA lina; fumarová kyselina = (E)-butendiová kyselina; jantarová kyselina = butandiová kyselina;, vinná kyselina = 2,3-dihydroxybutandioyolová kyselinaJ citrónová kyselina = 2-hydroxypropan-1,2,3-trikarboxvlová kyselina;, benzoová kyselina;, a kyselina askorbová» »999 99 9999 99 99

9 99 9 999·

9 999 999«

9 9999 99 99 9

999 99·· • 99 9 99 9 9* 99

Η Sloučeniny, uvedené v předloženém vynálezu,, obsahují jeden,, nebo více chirálních uhlíkových atomů,, a mohou být tedy získány ve formě čistého enantiomerů, nabo jako směs enantiomerů,. nebo jako směs obsahující diastereoizomery.

Postupy, použitelné pro získáni čistých enantiomerů, jsou velmi dobře známy odborníkům v příslušné oblasti, jako je na příklad krystalizace solí,, které lze získat z opticky aktivních kyselinJ a racemických směsí,, nebo chromatografii_t za použití chirálních sloupců.·

Pro diastereoizoraery mohou být použity sloupce s přímou; nebo reverzní fází»

Sloučeniny, uvedené ve vynálezu, mohou být aplikovány bu3 enterálně ( střevní cestou); nebo parenterálně; 8 v humánní medicině výhodně v denní dávce v rozmezí od 0,001 do 100,0 mg na 1 kg tělesné hmostnostij

Výhodně v rozmezí od 0,01 do 10,0 mg na 1 kg tělesné hmotnosti.

Po smíchání s farmaceuticky vhodnými pomocnými látkami, popsanými na příklad ve standardních odkazech;, t.j. v publikaci Remingtons Pharmaceutical Sciences;(18th ed.J Mack Publishing CompanyJ/199/; specielně viz část 8; Pharmaceutical Preparations and Their Menufacture = Příprava farmaceutických prostředků a jejich výroba); mohou být sloučeniny liso vány do pevných lékových forem, jakou jsou na příklad pilulky; tablety; nebo mohou být zpracovány do kapslí;aebo čípků..

Pomocí farmaceuticky vhodných tekutin mohou být sloučeniny aplikovány také ve formě roztoku; suspenze;, emulze; na příklad pro použití ve formě injekčních prostředků, nebo jako spraye^ na příklad pro použití ve formě nosních( nasálních) sprayů.

frfrfr* frfr frfrfr· frfr frfr frfr frfrfr frfr··» • fr frfrfr · « fr · • · frfrfrfr frfrfr# · fr fr fr frfr frfrfr· frfrfr · frfr fr fr* fr*

Pro výrobu lékových forem, jako na příklad tablet„ lze uvažovat s použitím konvenčních pomocných látek,, jako na příklad plnidelj barviv;. polymerních pojidel;. 8 podobně..

Obecně mohou být použity jakékoliv farmaceuticky vhodné pomocné látky, které neinterferují a působením účinných sloučenin.

Vhodné nosiče, jejichž směsi mohou být použity„ zahrnují laktosuj, škrobJ deriváty celulosy,. a podobně, nebo jejich směsi; použité ve vhodném množství.

• *4 · 4 4 4 4 4 · 4 • 4 4 « · 4

4 4 4 4 • 4 «4

4 4

4 4 ___Ε_ϊ_2_Υ_£_^_θ_ΰ_ί___

4 4 4 4

444 4 44 4 • 4 4

44

Vynález je dále objasněn odkazy na následující_f názorné Příklady:

»

Obecné údaje ~

Et = ethyl

Boc = terč.-butyloxykarbonyl ©ha = cyklďhexylalanyl

Lys - lyayl

TPA'. = trifluoroctová kyselina aspartyl

Asp =

Dpa =

Tyr (Mé) = Hfel = H-J-Tiq-Offi řfec =

Teoa? = difenylalanyl (O-tns thyl) -tyroay 1 naftylen-2-yl-filaninyl _r2,3 jA—tetrahydroiaochinoliEt-l-lfearboxylová kyselina me thy Isulf onyle thy loxykarbony1

2—( trimethylsilyl)-ethoxykarbonyl norLeuCcyklol-Gly-OH = (S)-3-amino-2-oxo>-hexahydro-V-azepin octová kyselina norVal(cyklcc) —Gly—OH (££)—3-8niino—2*-oxo'—1 —piperidinoctová kyselina • · • ·«*· · »* · · • · · • · · · • · · • · · · ·

- 17 • · · ♦ • · · · • · * · • « · «

9· ··

Szl	= benzyl
Cbz	=	benzyloxykarbonyl
Pro-	=	probyl
Acg	s	4-aminocvklohexy 1-gly cy 1
Pac	=	fenylacetyl
fipoc	s	2-p-bi fe ny lis opr opy 1 oxy ka rb ony 1
Glu	-	glutemyl
ffi-Aad-0		kyselina aminoadipová
Phe	-	fenylalanyl

Experimentální podmínky z

Systémy rozpouštědel použitých při vysokovýkonné kapalinové chromátograflij (HPCIL) s

A·.· O',.5B fosfátový pufxr; pH’= 2,.10^,

S* voda

0.» směs acetonitril/voda v poměru 3 2J( objemové poměry)J

Pokud nebylo uvedeno jinak,. byly retenční časy (Rt(LC))^ stanoveny pomocí vysokovýkonné kapalinové. chromatografie, pro analytické účelyJ(HPCL)J

Sloupec Supercosil EC-18-DSý(' částice 5 yum ý 250' x 2,1 mmj který byl eluován gradientovým ( dle specifikace) systémem rozpouštědel AJ BJ. a CJ. při rychlosti průtoku 0,25 ml/min. a při teplotě 35»0°G.

-* 18 ·· ·· 99 • · · * • · · « * · 9 ·

9 9 9

9· 9· ? ? ί k 1 s i 1 )

Příprava BzlSO^-norLeu(cykla)-Gly-Lys-psí-/G.OOO/-NHBzl

S t u p e ň a)

Příprava Cbz-Lys(Boc)-CMě

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 28_rO g*_r Cbz-Lys-(Boc)OH-J ve 5ΟΌ',.0' ml směsi dichlormethanu a methanolu;, v poměru 9,0 x 1 ,o;, bylo přidáno 23,60 g;, 2-(1H-benzotriazol-l-yl)-1,H, ,3-tetramě thyluronium tetraf luorborátu; a pH-vzniklé reakční směsi- bylo poté upraveno pomocí triethylaminu na hodnotu

8,,0.

Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 2,.O hodinJ, a následně byla postupně a intenzivně promyta s vychlazeným 1K roztokem kyseliny chlorovodíkové;, poté s vodou;, a 5%ní® roztokem hydrogenuhličitabu sodného;, a nakonec s vodouj, a poté byla vysušena se síranem sodným.

Po zfiltrování byl filtrát odpařen.; a vzniklý zbytek byl chromatografován na silikagelu, za použití směsi ethylacetát : heptan; ( v poměru 1,0 x 4,OJ. objemové poměry); jako elučního činidla.

Frakce obsahující žádaný Cbz-Lys(Boc)-OMě byly spojeny, a odpařeny.

Bylo získáno 29,10 gj, žádaného Cbz-Lys-(Bac)-OW.

TECJÁ chromatografie na tenké vrstvě)::

R_f = 0,,85/, ( směs ethylacetát x heptan; (3 - 1 ,0; objemové ( poměry); na oxidu křemičitém.

- 19 « φφφφ ·· ·♦«· »» «e ·· φφφ · φ φ · φ φ φ φφφ φφφφ ·· φφφφ φφφ·· φφ φφφ φφφφ φφφφ φφ · φ · φφ

S t u ρ e ňi b)

Příprava Cbz-Lys(Boe)-psi-/kyanacetótu/

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 29*10?g* Cbz-IysBoc:)-OMeJ. ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně a)J ve 800,0 ml vysušeného dichlormethanu; a vychlazenému na teplotu minus 78_r0°c;, bylo přidáno po kapkách,, za stálého chlazení na teplotu nižší než minus 70,0°C; 222_řQ) mlj 1ff roztoku diisobutylaluminiumhydridu v hexanuj. a výsledná reakční směs byla míchána při teplotě minus 78,0°C; po dobu 1„0 hodiny»

Poté bylo' ku reakční směsi přidáno 600,0 mi; 5%ního vodného roztoku kyseliny citrónové; ( kyselina 2-hydroxypropan-1, 2,

3-trikarboxylová ). Vzniklá dvoufázová reakční směs bvla poté míchána při teplotě místnosti po dobu 10,0; minut; a po oddělení vodné a organické fáze, byla vodná vrstva extrahována 2x s dichlormethanem» Spojené dichlormethanové vrstvy byly promyty s vodouj, a pa; vysušení se síranem sodným, byly zfiltrovány.

Filtrát byl poté míchán v atmosféře dusíku, a pomocí lázně s ledovou vodou byl vychlazen,, a byl k němu přidán roztoky připravený rozpuštěním 36,30 g* kyanidu sodného; a 4,.20 g*_r benzyltriethylamoniumchloridu; v 600,0 ml vody»

Poté, co.byla tato reakční směs intenzivně míchána , byl k ní přidán během 30,0 minut;, po částech; ( 2 x 9,0 ml}* acetanhydrid» Po oddělení organické a vodné fáze,, byla vodná vrstva extrahována 2x s dichlormethanem. Spojené dichlormethanové extrakty byly poté promyty s vodou,, vysušeny,, se síranem sodným;, a po zfiltrování byly za vakua odpařeny.

Vzniklý zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém* za použití směsi, haptam ethylacetát; ( v poměru 1,0 :: objemové poměry )»

Bylo získáno 26,30 g žádaného* v nadpise uvedeného CbzLys- (Bos) -psi -/ky ana ce tátu/»

20’ • ·«·· ·» frfrfrfr frfr frfr frfr · · · frfr frfr · fr · frfr· frfrfr* • « · · frfr frfr frfr fr • fr · * · frfrfrfr frfrfrfr frfr · ·· frfr

TLC;( chromátografie na tenké vrstvě ):

Ef

0,60; ( směs dichlormethan :: ethylacetát; (7,0 ( objemové poměry); na oxidu křemičitém.

3, o;

Stupeň η)

Příprava Cbz-Lys (BoG.)-psi/CHOHCO/-OMě

Do roztoku, připraveného rozpuštěním 26,30 gj C;bz-Lys(Boc)psi-/kyanacetátu/ý ( získaného v rámci pžedcházejícího, výše popsaného Stupně b); v 600,0 mi; směsi diethyletheru a methanolu;, ( v poměrech 2,0 :: 1,0; objemové poměry); a vychlazenému v stmosfeře dusíku na teplotu minus 20,0°C;, bylo zavedeno při teplotě nižší než minus 5,0°c; 66,,0 g plynného chlorovodíku; a vzniklá reakční směs byla ponechána přes noc v klidu;, při teplotě 4,0°C.

Poté bylo ku reakční směsi přidáno při teplotě nižší než 55,0°c; po kapkách; 100,0 ml vody; a poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 16 hodin.Poté, po oddělení organické a vodné fáze,, byla organická vrstva promyta s vodou* 8 vodná vrstva byla nasycena s přidaným chloridem sodným; a poté byla extrahována se směsí sekundární-butsnol : dichlormethan;, ( v poměrech 3,0 :: 2,OJ objemové poměry).

Po oddělení organické a vodné fáze* byla organická vrstva promyta se solankou;, a vysušena se síranem sodným; a po zfiltrování* byla za vakua odpařena.

Bylo získáno 25,40' g surového aminu* ve formě zbytku, který byl vyjmut do 400,0 mi; N,N-dimethylformamidu. Ku vzniklému roztoku bylo přidáno 16,0 g* di-terc,-tíutyldikarbonátuj a pH reakční směsi bylo upraveno pomocí triethylaminu na hodnotu 8*0).

'99

- 211 « ·<··· 99 ·ΦΦ· « » * · Φ · • ♦ 9 9 9

9999 99 9

Tato reakční smě® byla poté míchána při teplotě místnosti přes’ nor; a následně bylo rozpouštědlo^ za sníženého tlaku odstraněno;.

Získaný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu; a vzniklý roztok: byl postupně promyt s vodou,, a se solankou; a po vysušení se síranem sodným,, a zfiltrování,,. byl za vakua vysušen.

Zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém, za použití směsi ethylacetát heptan_P (4,0 s objemové poměry).

Bylo získáno 15,80) gj žádaného, v nadpise uvedeného Cbz-Lys(Bon)-psi/CHOHGO/-OMe.

TEC;,( chromátografie na tenké vrstvě ):

R^ = 0,75; ( směs ethylacetát s pyridin kyselina octová ( : voda; ( 63 s 20 ; 6 11,0 ; objemové poměry);

( na oxidu křemičitém:.

Stupeň d)

Příprava Cbz-Lys(Boc)-psi/CH0HC0/-0H

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 2,0 gj Cbz-Lys(Boc)psi/CH0HC0/-0Me; ( získaného v rámci předcháze jícího,, výše ρσpsaného Stupně c)J v 50,0 ml směsi dioxanu a vody;(7,0 ; 3.0); objemové poměry);, bylo přidáno za stálého míchání,, a při teplotě místnosti, po částech, 2,36 ml; 2M roztoku hydroxidu sodného.

Po uplynutí 1,0 hodiny, byla vzniklá reakční směs neředěna se 100,0 mi; vody; 8 po přidání takového množství 2M roztoku kyseliny chlorovodíkové,, kterým bylo upraveno pH na hodnotu 2,-0 J, byla reakční směs extrahována s dichlormethanem:.

• ···		···«	99	··
·· *	•	9 9	9		•	9	9
• *	•	9 9	•		•	9	9
							9
9 «	9	• ·	•		«	9	9
··♦ ·	• ·	•		»«		99

Po oddělení organické a vodné fáze, byly organické vrstvy spojeny,, a po promytí s vodou byly vysušeny se síranem sodným; zfiltrovány; a za vakua byly zahuštěny»

Bylo získá&o 1,85 gj žádaného, v nadpise uvedeného CbzLys (Bo<r)-psi/CHOHG.O/-OH.

TEC;( chromatografie na tenké vrstvě ):

= 0,65; ( směs ethylscetát :: pyridin :: kyselina octová ( : voda; (63 : 20 :: 6 11 ,0; objemové poměry;

( na oxidu křemičitém»

Stupene)

Příprava Cbz-Lys(Boc)-psi/CHOHCQ/-NHBzl

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,90 gj, Cbz-Lys(Boc)-psi-/CHOHGO/-OH; ( získaného v rámci předcházejíčího,výše popsaného Stupně d)J ve 10,0 mlj Ν,Ν-dimethylformamidu, bylo postupně přidáno za stálého míchání 444,0 mg; 1-hydroxybenzotriazoluj(HOBt ); 0,50 ml N-methylmorfolinu; 282,0 mgj. benzylaminuj a 462,0 mgj. 1-(3-dimethvlaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu» hydrochloridu;( EDC1 ); a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin»

Poté byla reakční směs nalita do vody, a tato vodná směs byla extrahována s ethylacetátem. Získaný ethyláce tátový extrakt byl postupně promyt s 1N' roztokem kyseliny chlorovodíkové,, s vodou, 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, a nakonec ještě s vodou; a po vysušení se síranem sodným byl zfiltrován, a za vakua byl zahuštěni»

Bylo získán' 1 ,0 gj žádaného,, v nadpise uvedeného? CbzLys (Boc)-psi-/CHOHGO/-NHBzl.

- 23. -

• 9999		9·	9999	99			99
99 ·	•		9 9	9	9	9	9
• ·	9		9 9	9	9	9	9
							9
• 9	•		9 9	9	9	9	9
999 9		• 9	9	99			99

TLG.; ( chromatografie na tenké vrstvě ):

R^ = 0,81;( směs ethylacetát : pyridin :: kyselina octová ( : vodaj (163 :: 20 :: 6 : 1 1 ,OJ objemové poměry; ( na oxidu křemičitém.

S t u p e ň f)

Příprava H-Lys(Boc)-psi-/CHOHGO/-NHBzl.. HCl

Ku roztoku,., připravenému rozpuštěním 1,0 gj Gbz-Lys (Boc )psi/CHOHCO/-NHBtzi; ( získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně e)J ve 25,,0 ml; methanolu; bylo přidáno 100,0 mg 10%ního palladia na aktivním uhlí; a 1,0 mi; 2M roztoku kyseliny chlorovodíkové; a vzniklá suspenze byla hydrogenována za atmosferického tlaku, při teplotě místnosti, po dobu 1,0 hodiny.

Poté byl palladiový katalyzátor odstraněn filtrací„ a získaný filtrát byl za vakua zahuštěni.

Bylo získáno 0,87 gj žádaného, v nadpise uvedeného H-Lys (Boc)-psi-/CH0HC0/-NHBzl.HGl.

TLG; ( chromatografie na tenké vrstvě ):

= 0,15;,( směs ethylacetát :: pyridin : kyselina octová ( : vodaj ( 163 : 20 6 : 11,OJ objemové poměry;

( na oxidu křemičitém.

Stupeň; g)

Příprava řfa-Bbc-L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 10,0 gj L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu; ve 30,0 mi; dioxanu a vody; (2,0 t 1 ,0; objemové poměry ); bylo přidáno za stálého míchání 7,80 mlj 1 Ni roztoku hydroxidu sodného, a poté ještě 18,80 gj di-tbutyldikar&onátu;. a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin; a poté byla za vakua zahuštěna .

Vzniklý zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu;. a získaný roztok byl promyt s vodou;, a se solankou,, a po vysušení se síranem sodným byl zfiltrován, a za vakua byl odpařena Surový materiál byl vyjmut a mechanicky zpracován s hexanem , zfiltrován,. a nakonec byl za vakua vysušenu

Bylo získáno 16,0 gj žádaného, v nadpise uvedeného N-BocL-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu.

TLC;.( chrómetografie na tenké vrstvě):

= 0,85;, ( směs ethylacetát : heptan; 1,0 : 1,.0:, obje( mové poměry, ); na oxidu křemičitém·.

Stupeň h)

Příprava Boc-norLeu(cyklo)-Gly-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 10,0 gj N-Boc-L-alfa amino-epsilon-kaprolaktamu;( získanému v rámci předcházejícího,, výše popsaného sXupn^é^ ίνθ’ vy^?S.8zenlmu⁸na*’teplotu minus 20,0°c; byl přidán pomalu 1K roztok lithium-bis-( trimethylsilyl) -amidu; ve směsi tetrahydrofuranu a cyklohexanu;(1,0 :: 1,0 objemové poměry)*, 1,0 ekvivalent); a vzniklá reakční směs ···· ··

byla míchána po dobu 30,0 minut.

Poté, co byly ku směsi přidány 4,0 mi; me thyIbromace tátu,, byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin. Poté, byl ku směsi přidán? další roztok lithium-bis-( trimethylsilyl)smidu,. ve směsi tetrahydrofuranu a cyklohexanuj,( 1,0 : 1,0; objemové poměry) za účelem dokončení reakce..

Následně byla reakční směs zředěna s dichlormethanem, a promyta postupně s 0,1N roztokem kyseliny chlorovodíkové; s vodouj 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a na konec se solankou. Po vysušení se síranem sodným; š zfiltrování, byla směs za vakua odpařena.

Vzniklý zbytek byl přečištěn chromatografii na silikagelu; za použití směsi heptan ; ethylacetát; ( 6,0 : 4,.O; objemové poměry).

Bylo získáno 12,0 gj žádaného, v nadpise uvedeného BocnorLeu(c,yklo)-Gly-OMe.

TLO;( chromátografie na tenké vrstvě):

- 0,55; C směs ethylacetát z heptan; 6,0 : 4,OJ obje( mové poměry,, na oxidu křemičitém.

Stupe i)

Příprava BzlS0₂-norLeu(cy klo)-Gly-OMě

Roztok, připravený rozpuštěním 3,0 gj Boc-norLeu(cyklo) Gly-OMe-J ( získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně h); ve 30,0 mi; směsi kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu; ( 1,0 : 1 ,,o; objemové poměry); byl míchán při teplotě místnosti po dobu 1,0 hpdiny.

• · · ·

Poté byla vzniklá reakční směs zs vakua zahuštěna, a vzni klý zbytek byl rozpuštěn ve 25,0 mi;. dichlormethanu, a ku získanému roztoku byl přidán pomalu,, a při teplotě 0°c; roztok, získaný rozpuštěním 2,25 gj benzylsulf onylchloridu,, ve 10,0 mlj dichlormethanu. Ku směsi byl přidán triethylamin tak, aby se během reakce udržovalo pH ηβ hodnotě 8,,0* Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny, a poté byla za vakua zahuštěna*

Vzniklý zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, a získaný roztok byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou, a se solankou,, a po následném vysušení se síranem sodným,, byl zfiltrován,' a za vakua odpařeni*

Zbytek byl přečištěn chromatografií na silikagelu; zspoužití směsi dichlormethan :: ethylacetát; ( 95 : 5,0, objemové poměry)*

Bylo získáno 3,90 gj žádaného, v nadpise uvedeného BzlSO^ norLeu(cyklo)-Gly-OMfe.

TLO;,( chromátografie na tenké vrstvě):

r = 0,4Q.;.( směs dichlormethan :: ethylacetát; 9,0 t 1,0' ( objemové poměry); na oxidu křemičitém.

Stupeň; j)

Příprava B z1S 0₂-norLe u(cyklo)-Gly-OHI

Ku roztoku 3_r9O gj. BzlSO₂-nOrLeu(cyklo)-Gly-0Me;(získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně i); ve směsi dioxanu a vody; ( 9,0 : 1,0); ( 100,0 ml ); bylo přidáno takové množství 1N- roztoku hydroxidu sodného, aby pH roztoku se udržovalo na hodnotě 13„0; po dobu 2,0 hodin* « ·

Po následném okyselení, byla reakční směs nalita do vody,, a poté byla extrahována s dichlormethanem. Po oddálení organické a vodné fáze,, byla organická vrstva promyte s vodou; a vysušena se síranem sodným’. Filtrát byl zahuštěn·.

Bylo získáno 3,60 g; žádané, v nadpise uvedené sloučeniny, t.j. BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-0H.

TECJ.Í chromátografie na tenké vrstvě )::

= 0,60;,( směs ethylacetát :: pyridin : kyselina octová, ( : vodaj 63 :: 20 :: 6,0 : 11 \ objemové poměry;

( na oxidu křemičitém.

S t u p e ň k)

Příprava BzlS0₂~norLeu(cyklo)-Gly-Lys (Boc)-psi-/CHOHCO/-NHBzl

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 340,0 mgj BzlSO^-nor Leu(cyklo)-Gly-0Hí; ( získanému v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně j);. v 10,0 mi; Ν,Ν-dimethylformamidu, a vychlazenému na teplotu 0°C; bylo postupně přidáno 203,0 mg; 1hydroxybenzotriazolu*, (HOBt ); a 217,0 mg;, dicyklohexylkarbodiimiduj( DBG);

Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě 0°C; po dobu 30,0 minut, bylo k ní přidáno 402,0 mg; H-Lys(Boc)-psi/CHOHG,O/-NHBzl.HCi; ( připraveného postupem, popsaným výše v rámci Stupně f); a 0,15 mi; triethylaminu, a tato reakční/směs byla míchána při teplotě 0°C,. po dobu 1,0 hodiny, a poté byle ponechána při teplotě místnosti v klidu přes noc.

Poté byla reakční směs ochlazena na teplotu minus 20,0°G; dicyklohexylmočovina byla odstraněna filtrací. Získaný filtrát byl odpařen do suchs,, a vzniklý zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, a roztok byl postupně promyt s 1M roztokem kyseliny chlorovodíkové; s vodou; s vodným 5%ním roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou, a nakonec se solankou. Po vysušení se síranem sodným byl roztok za vakua zahuštěn.

Bylo získáno 690,0 mg; žádaného, v nadpise uvedeného

BzlSO^-norLeuí cyklo)-Gly-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-NHBzl.

TLG; ( chromatografie na tenké vrstvě ):

R^. = 0,75;( směs ethylacetát : pyridin : kyselins octová ( : vodaj 163 : 20 : 6 11; objemové poměry;

( na oxidu křemičitém*

Stupeň 1)

Příprava BzlS0₂~norLeu(cyklo)-Gly-Lys(Boc)-psi/COCO/-NHBzl

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 680,0 mgj BzlSO -nor Leu(cyklo)-Gly-Lya(Boc)-psi/CHOHCO/-NHRzi; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně k); ve 20,0 mi; vysušeného dichlormethanu; bylo přidáno 424,0 mgj perjodnanuj ( Dess-Martinovo re8gens).

Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny, bylo k ní přidáno 20,0 mlj, 2%ního roztoku thiosíranu sodného; a 20,0 mi;. 5%ního vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného; a tato reakční směs byla mícháne při teplotě místnosti, po dobu 30,0 minut* Po oddělení organické a vodné fáze, byla organická vrstva promyta s vodou; vysušena se síranem sodným; a po zfiltrování byla za vakua odpařena.

Bylo získáno 561,0 mgj žádaného, v nadpise uvedeného, surového BzlSO^-norLeuí cyklo )-Gly-L,ys (Boc )-psi/COCO/-NHBzl.

TLG.; (chromatografie na tenké vrstvě):

• ·

-r 29 = 0,85} ( směs ethylacetat : pyridin : kyselina octová, ( : voda} 163 : 20 : 6,0 : 11,0} objemové po( měry} na oxidu křemičitém^· • · · · · · · ···· ·· * · · · ♦ 9 · · · · • · · · · ····

Stupeň, m)

Příprava BzlSQ^-norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi/C0C0/-NHBzl

Směs, připravená smícháním 560,0 mg} surového BzlSO₂-nor Leu (cyklo)-Gly-Ly s (Boc)-psi-/COCO/-NHBzl} ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně 1)} s 10,0 ml} kyseliny trifluoroctové} byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny.

Poté byla vzniklý reakční směs za vakua zahuštěna, a zbytek byl rozpuštěn ve vodě_r a poté přímo nanesen na sloupec DeltaPak RP-C_lg,, preparativní vysokovýkonné kapalinové chromatografie} který byl následně eluován za použití gradientového elučního systému 20% A}/80%B až 20%A}/45,0% B/35% 0} po dobu 45 minut,, při průtoku o rychlosti 80,0 ml/mim»

Bylo získáno 287,0 mg} BzlSO^-nor-^euícyklo)-Gly-Lys-psi/C0G0/-0H.

Rf( LC = kapalinová chrométogrsfie):

23,80 minut} 20%A/60% B/20.%G až 20%A/80%G} ve 30,-0 minutách.

Příklad 2)

Přípravě e thyISO^-E-Cha-Pro-tys-psi/COCO/-OH

Stupeň e)

Příprava Boc-E-Cha-Pro-QPao

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 21,50 gj Boc-D-GhaOH. HgOJ ve 143,0 mlj N,N-dime thy lf ormamidu; a vychlazenému na teplotu 0°c; bylo postupně přidáno 13,70 gj hydroxybenzotriazolu;(HOBt ); a 15,70 gj dicyklohexylkarbodiimiduj(DD£.); a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut.

Poté byl připraven rozpuštěním 20,0 gj H-Pro-OPac.TFA v 50,0 mlj N,N-dimethylformamidu roztok, který byl po úpravě pH na hodnotu 8,0 s triethylaminem, přidán ku reakční směsi* jejíž příprava je popsána výše. Tato reakční směs byla poté míchána ještě po dobu 16,0 hodin,, během kterých teplote směsi se zvýšila až na teplotu místnosti.

Poté byl8 reakční směs zfiltrována, zahuštěna za vakua, zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, a tento roztok byl promyt postupně s 1N roztokem kyseliny chlorovodíkové; s vodou, s 5%ním roztokem hydrogenuhličitanu sodného,, a nakonec se solankou, 8 po vysušení se síranem sodným byl zfiltrován,. a za vakua odpařen.

Bylo získáno 28,0 gj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. Boc-D-Cha-Pro-0P8c.

TLG.;( chromá tografie ne tenké vrstvě):

Rf. = 0,50;,(směs dichlormethanu a methanolu; 95 : 5,0;

objemové poměry; na oxidu křemičitémJ.;

- iv • ···· ·φ ·«·· ·· ·· • · · · » · * · « · • · ·♦· ·«·· • · · · · · • ♦ · 9 9 99

Stupeň b)

Příprsva e thy 1 SC>2 -D-Cha -Pro-QPa c

Roztok, připravený rozpuštěním 3,80 g’, Boc-B-Cha-Pro-OPsc;

( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně a); v 25,,0 mlj, směsi kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu; (1,0: 1 _rQ'J objemové poměry ); byl míchán při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut.

Yzniklá reakční směs byla poté za vakua odpařena, a .zbylý surový amin byl rozpuštěn v 50,0 ml, dichlormethanu.Ku získanému roztoku bylo poté přidáno při teplotě minus 78,0°C ; 01,80 mi;, ethansulfonylchloridu, a tolik triethylaminu,, aby pH reakční směsi se udržovalo během reakce na hodnotě 8,0.

Poté, co byla tato reakční směs míchána při teplotě Q°g; po dobu 3,0 hodin,, bylo k ní přidáno 25,0 mi; vody, a směs byla míchána při teplotě místnosti ještě 30,0 minuty a následné byla za vakua zahuštěna.Vzniklý zbytek byl rozpuštěn v diethyletheru,, a získaný roztok byl promyt postupně s 1 Ni roztokem kyseliny chlorovodíkové, s vodou, 5%ním roztokem hydrogenuhličitanu sodného*, a se solankou; a po vysušení se síranem sodným byl zfiltrován, a za vakua odpařen.

Poté byl surový materiál mechanicky zpracován a vyjmut s methanolem,. a byly získány 3,0 gj žádaného, v nadpise uvedeného ethylS0₂-D-Ch8-Pro-0Pac.

TLS:;, ( chromatograf ie na tenké vrstvě):

^Rf ~ směs dichlormethan : methanoi; 95 5,0; obje( mové poměry, na oxidu křemičitém!»

Stupeň o)

- 32 • · · · 9 9 9*9* • · · · · · · « · • · #··· ····« ·· · · · 9··· ··· · 99 · «9 «φ

- Příprava ethylSOg-D-Chs-Pro-OH

Ku roztoku* připravenému rozpuštěním 10,0 g* ethylSO^-DCha-Pro-OPac; ( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně b); ve 250,0 ml* tetrahydrofuranu; bylo přidáno 84,,0 ml* ŤM tetrabutylamonium-fluoridu, v tetrahydrofuranu; a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut* a následně byla nalita do 1 ,0 litru vody·

Vzniklý vodný roztok byl extrahován s ethylacetátem, a po oddělení organické a vodné fáze,, byly spojené organické vrstvy postupně promyty s 1N routokem kyseliny chlorovodíkové,, a s vodou,, a po vysušení se síranem sodným byly za vakua vysušeny·

Vzniklý zbytek byl přečištěn krystalizací ze směsi ethylacetátu a diisopropyletheru, a bylo získáno 6,0 gj žádaného, v načoise uvedeného etř^rlSO^-D-Cha-Pro-OH.

TLC;.( chromatografie na tenké vrstvě ):

R^ = 0,20;.( směs ethylacetát : pyridin : kyselina octová :

( vodaj 163 ~ 20: - 6 : 11,OJ objemové poměry;

( na oxidu křemičitém·

Stupeň ds)

Příprava e t hy 1S 0 ₂ -D-Ch a - Pr o - Ly s - p s i / C OC 0./ - OH

Analogickým postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo provedeno DCC/HOBt-zkuplování mezi ethylS0₂-D-Cha-Pro-0H; ( získaného v rámci předcházejícího* výše popsaného Stupně c); a H-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-OMe.HCi; zmýdelnění; Dess-Msrtinova oxidace; sejmutí chránící skupiny; a přečištění.

····

Bylo získáno 163,0 mg;, žádaného,, v nadpise uvedeného e thylSO^-D-Cha-Pro-Lys-psi/COCO/-OH.

Rt( kapalinová chromatografieJ(LC):

36,35 min.;, 20,0%A; 80,0%B. až 20%A72Q%B/60,0#C ve 40 minutách

Příklad 3)

Příprava BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi/COCO/-OEt

Stupene)

Příprava Cbz-Lys(Boc)-psi/CHQHCQ/-OEt

Roztok,, připravený rozpuštěním 751,0 mg; Cbz-Lys(Boc)psi/CH0BGG/-0Me J. ( získaného v rámci Příkladu 1); Stupeň e)J popsaného výše); ve 25,0 mi; 3N ethapolického roztoku chlorovodíku, byl míchán při teplotě místnosti po dobu 4,50 hodiny.

Poté byla vzniklá reakční směs odpařena do sucha, a následně ještě 3x s ethanolem.a bylo získáno 691,0 mg CEřz-Lyspsi/CHQHC0/-0Et«.

V předcházející operaci připravený produkt byl rozpuštěn, v 10,0 mi;, vysušeného dichlormethanu;, a ku vzniklému roztoku bylo přidáno 425,0 mg di-tera.-butyldikarbonátu. Poté, co bylo pH reakční směsi upraveno pomocí triethylaminu na hodnotu 8,,o; byla směs míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin»

- 34 • 9999 ·· ···· ·· ··

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 999 9999

Po přidání vody byla organická vrstva promyta a následně byla vysušena,, a bylo získáno 782,0 mg; žádaného produktu,, který byl přečištěn na oxidu křemičitém, za použiti směsi heptanu a ethylacetátu, ( v poměru 2 :: 3,0),, jako elučního činidla.

Bylo získáno 696,0 mgj žádaného, v nadpise uvedeného Qbz-Eys(Boc)-psi/G.HOHCO/-OEt«

TLC;( chromatografie na tenké vrstvě ):

R^ = O',955 ( směs ethylacetát :: pyridin :: kyselina octová :

( voda; 232 :: 31 r. 18 s 7,OJ objemové poměry;

( na oxidu křemičitém.

S tupen b)

Příprava H-Lys-(Boc)-psi/CHQHCO/-OEt. HCl

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 696,0 mg;. Cbz-Lys(Boc)-psi/GHQHGO/-OEt; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsanéhp Stupně a); ve 25,0 ml; ethanolu, bylo přidáno 100,0 mgj 10^ního palladia na aktivním/uhlí;, a 0,80 mi; 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové; a vzniklá suspenze byla hydrogenávána za atmosferického tlaku, při teplotě místnosti; po dobu 50,0 minut.

Poté byl palladiový katalyzátor filtrací odstraněn;, 8 filtrát byl za vakua zahuštěn.

Bylo získáno 525,0 mg; žádaného, v nadpise uvedeného

H-Lys-(Boc)-psi/CHOHGO/-OEt. HCl.

TEC^( chromatografie na tenké vrstvě ):

R^ = 0,17’ ( směs ethylacetát :: pyridin : kyselina octová ( voda; 232 : 31 :: 18 :: 17;. objemové poměry;

( na oxidu křemičitém.

- 35 Stupem c)

Příprava BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi/COCQ/-OEt

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo zkuplováním s BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-OH; oxidací* sejmutím ochřanné skupiny, a přečištěním,získáno 186,0 mg, žádané, v nadpise uvedené sloučeniny* t.j. BzlS0₂-norLeu(cyklo)Gly-Lys-psi/ G.OGQ/- OE.t.

Rt( kapalinová chromatografie):

32,46 min.* 20%A/80%B; až 20%A/20%B/60%C ve 40 minutách.

Příklad 4)

Příprava BzlSO₂-norLeu(cyklo)-Gly-Eys-psi/COC0/-NH₂

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo zkuplováním mezi BzlSO -norLeu(cyklo)-Gly-0H* (získaného v rámci Příkladu 1); Stupeň j); popsaného výše); a H-Lys(Boc) psi/CHOHCO/-NH₂.HCl* a následnou oxidací, sejmutím chránící skupiny; ^přečištěním, získáno 103*0 mg; žádané, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi /cooo/-nh₂.

Rt(LG)( kapalinová chromatografie):

27,50 min.** 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C; ve 40 minutách

- 36 ♦ »«♦· ·· ···· »· ·· ·· * · * · «··· • · · · · · · · · » · ···· · · · · · • 9 · · · · · · φ •·· · ·· » *·

Příkladě)

Příprava e t hy 1S 0½-D-C ha-Pro-Ey s-p a i/C OGO /-OE t

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1);. bylo zkuplováním DDGL/HOBt mezi ethylSQ^-D-Cha-Pro-OH; (získaného v rámci Stupně c)J Příklad 2), popsaného výše); (270,0 mg); a 268,0 mgj H-Lys(Boc)-psi/CH0HC0/-0Et. HGi; Dess-Martinovou oxidací;, sejmutím chránící skupiny, ze použití kyseliny trifluoroctové; a přečištěním,, získáno 41,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny, t.j. ethylSO^-D-Cha-Pro-Lys-psi /COCQ/-’OEt.

Rt(LC;( kapalinová chromatografie):

40,70 min.;, 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C ve 40,0 minutách, 8 udržování této směsi eluentů po dobu dalších 10 minut.

Pří k I a d. 6)

Pří pra va e thy 1S O^-B-Cha -Pr o-Ly s -p s i /C OC 0/-NHB z 1

Analogickým postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo zkuplováním DCC/HOBt mezi 250,0 mg;, ethylSO^-D-Gha-Pro-OH; ( získaného v rámci Stupně c)JŘríklad 2), popsaného výše )‘, a 611,0 mgj, H-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-NHBzl. HCi; Dess-Martinovou ocidací, sejmutím chránící skupiny, za použití kyseliny trifluoroctové, a přečištěním, získáno 208,0 mgj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny, t.j. ethylS02-D-Gha-Pro-Lys-psi/C0G0/NHBzl.

9 9f ··			• 9
• · 9	• · a	9	9	9	9
• 9	« 9 a	9	9	9	9
					9
• ·	á a ·	9	9	9	9
99 · »	• 9 C	9 9		99

Rt;(LC, kapalinová chromatografie ):

28,70 min. ;, 20%A/60'%B/20%C až 20%A/J 80%C_P ve 30,0 minutách.

Příklad 7)

Příprava ethylSO₂-H— Cha-Pro-Lys-psi/COCOZ-NH^

Pro přípravu v nadpise uvedené sloučeniny byly použity analogické postupy, popsané výše v rámci Příkladu 1).

Analogickým postupem, použitým pro přípravu H-Lys(BOc)psi/CHOHCQ/-NHBzl. HCi; bylo připraveno z 0,95 gj Cbz-Lys(Boc)psi/CHOHCOZ-OH·; celkem 0,84 g_p H-Lys (Boc )-psi/CHOHCO/-NH₂.HGl.

Zkuplováním LCC/HOBt; mezi 189,0 mgj ethylSO^-D-Ghe-ProOH;. a 179,0 mg; H-Lys (BOc )-psi/CHOHCO/-NH₂.HCi; Dess-Martinovou oxidací, sejmutím chtánící skupiny za použití kyseliny trifluoiroctové, a přečištěním, bylo získáno 126,,0 mg žádané,, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j.. ethylSO^-D-Gha-Pro-Lys-psi /cogq/-nh₂..

Rt(LC),( kapalinová chromatograf ie ):

36,30 min.;, 20%A/80%B až 20%A/20%B/6CW ve 40,0 minutách.

Příklad 8)

Příprava Bz IS 0 ₂ -n o r V.a 1 (cy klo) -Gly -Ly s -p s i /0 OC 0/-0H;

• ••ft •ft ftftftft • ftft

- 38 • ftft ft ftft ft ftftft • ftft ft ftft • ft ftft • · ft 9 · • ftftftft • ftft ftft · • ft ft · ft ft ftft ftft

Stupem a)

Příprava (S)-3-( Cfaenzyloxykarbonyl)-amino)-2-oxo-piperidinu

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 25,0 gj Cbz-ornithinOH, HGlJ ve 2,0 litrech N,N-dimethylformamidu, bylo přidáno 12,0 ml triethylaminu, tak aby pH reakční směsi bylo upraveno na hodnotu 8,50»

Poté,, za intemzivního míchání, bvlo přidáno ku reakční směsi 26,50 gj 2-(1H-benzotrÍ8zol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborátuj(TBTU); ve 250,0 mlj Ν,Ν-dimethy1formamidu tak:, aby zmíněný roztok byl přidáván po kapkách.

Poté byla směs ponechána reagovat při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin, během kterých bylo pH reakční směsi upravováno průběžně s triethylaminem,. na hodnotu 8,-50»

Poté byla reakční směs zahuštěna až do sucha, a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu. Získaný roztok byl promyt postupně s 1N roztokem kyseliny chlorovodíkové;.s vodou; s 5%ním roztokem hydrogenuhličitanu sodného, s vodou a se solankou. Po vysušení se síranem hodným, byl zmíněný roztok zfiltrován,, a odpařen do sucha.

Bylo získáno 11,70 g*_r žádaného, v nadpise uvedeného (S)-3-( benzyloxykarbonyl)-amino)-2-oxo-piperidinu.

TLCJ, ( chromatografie na tenké vrstvě ):

= 0,80;.(směs ethylacetát : pyridin : kyselina octová t ( voda; 63 :·· 20· : 6,0 r. 11 ,o;,objemové poměry;

( na oxidu křemičitém»

Stupeň b)

Příprava CBz-norVál(cyklo)-Gly-OMe • · • · • · • · ·

- 39 • · ··

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 5,0 gj (S)-3-((benzylkarbonyl)-amino)-2-oxo-piperidinu, v 50,0 mlj dichlormethanu, byl přidán pomalu , při teplotě minus 20°c; 11'roztok bis( trimethylsilyl)amidu ve směsi tetrahydrof uran : cyklohexanj ( 1,0 :: 1 ,,0J, objemové poměry); ( 20,0 mi; 1 ekvivalent), a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut*

Poté bylo ku reakční směsi přidáno 1,90 mlj mezhylbromacetátu, a směs byla následně míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut,, 8 poté, po neředění s ethylacetátem,, byla smíchána s nasyceným vodným roztokem chloridu amonného. Po, oddělení organické a vodné fáze, byla organická vrstva postupně promyta s vodou, a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, a zfiltrován!, byla za vakua odpařena.

Vzniklý zbytek: byl přečištěni chromatografií na silikagelu,, za použití směsi dichlormethan: :: methanol;,( 95 :: 5,OJ objemové poměry),* jako elučního činidla.

Bylo získáno 4,70 gj, žádaného, v nadpise uvedeného Cbz-norVal(cyklo)-Gly-OMe.

β

TLC^( chromatografie na tenké vrstvě 5t

B ~ θ»38;,( směs ethylacetát :: heptan; 3,0 : 1,0J objemové ( poměryJ na oxidu křemičitém.

Stupeň c.)

Příprava BzlSO₂-norVal(cyklo)-Gly-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 4,70 gj. Cbz-norVal(cyklo)-Gly-OMe;, ( získanému v rámci předcházejícího, výše po psaného Stupně b)’, ve 40,0 mi; methanolu, bylo přidáno 500,0)

-40)-

mgj lodního palladia na aktivním uhlí; a 7,40 mi;, 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové; a vzniklá směs byla hydrogenována za atmosferického tlaku;, a při teplotě místnosti; po dobu 1 ,.0 hodiny ·. Poté byla reakční směs zfiltrována, a po odpaření za vakua byl zbytek ve formě H-norVsl(cyklo)-Gly-OMé,HCI, použit betprostředně v následující operaci..

Ku roztoku surového aminu,, rozpuštěnému v 50,0 ml, dichlor methanu, bylo přidáno pomalu, při teplotě 0°C; 2,82 gj. benzvlsulfonylchloridu, a ku vzniklé reakční směsi bylo přidáno tolik triethylaminu, aby pH směsi bylo během reakce udržováno na hodnotě 8„0» Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny,, a poté byla promyta s vodou a solankou, a po vysušení se síranem sodným,, a zfiltrování, byla za vakua odpařena„

Vzniklý zbytek byl přečištěn chromatografií na silikagelu;, za použití směsi dichlormethan : methanol; (95 : 5,0,, objemové poměry).

Byly získány 2,0 gj, žádaného, v nadpise uvedeného BzlSO^norVal(cyklo)-Gly-OMe·

TLC;,( chromátografie na tenké vrstvě):

= 0,87J,( směs ethylacetát r. pyridin : kyselina octová :

( vodaj 63 : 20 6,0 1 1 ,0; objemové poměry;

( ηβ oxidu křemičitém,.

S t u p e ň d)

Příprava BzlS0₂-norVsl(cyklo)-Gly-OH

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); byly zm^delněny 2,,0 gj BzlSO-norVel(cyklo)-Gly-0Me; (získaného • · • ·· · • · • · · · • ·

v rámci předcházejícího, výše popsaného' Stupně c); a. bylo připraveno 1 ;,80 gj, žádaného, v nadpise uvedeného BzlSO^-norVal (cyklo)-Gly-OH.

TLC;( chromátografie na tenké vrstvě):

= 0.,40;( směs ethylacetát : pyridin : kyselins octová :

( vodaj 63 :: 20 r 6,0 x 11, OJ objemové poměryj ( na oxidu křemičitém.

Stupene)

Příprava BzlSO^-norVal(cvklo)-Gly-Lys-psi/GOC.O/-OH

Analogickým; postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1¹)*, byl zkuplován BzlSO₂-nořVal(cyklo)-Gly-OH* ( získaný v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně d)J s H-Lys(Boc)-psi/GHQHC.Oy-OMe.HCi; a po následném zmýdelnění_r oxidaci, sejmutí chránící skupiny,, a přečištění,, bylo připraveno 107,0’mg; žádaného,, v nadpise uvedeného BzlSO^-norValťcykloO-Gly-Lys-psi /CQGO/-OH.

Rt,LC;( kapalinová chromátografie):

24,,45 min.; 20%A/80%B až 2O?éA'/2O%B/6O?éC;, ve 40,0 minutách.

Příklad, 9)

Příprava e thylSOL-B-Ghs-Pro-Lys-psi/COCU/-Q’~iPropyl

- 42 Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 3)J týkajícím se přípravy H-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-OEt.HGi; bylo ze

0,49 gj, Cbz-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-OMe; a 2-propanolu;. připraveno 0,332 g*„ H-Lys(Boc)-psi/CHQHCO/-0-i-Propyl.HCI.

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1);. bylo s DSC/HOBt-zkuplováním 239,0 mg; ethylSOg-D-Cha-Pro-OH;

( získaného v rámci Stupně c),Příklad 2); popsaného výše); 8 316,0 mg;, H-Lys (Boc )psi/CH0HC0/-0-i-Prop,yl.HCI; (připraveného v rámci výše popsané operace); Dess-Martinov.ou oxidací, sejmutím chránící skupiny za použití kyseliny trifluoroctové, a přečištěním¹,, získáno 123,0 mg; žádaného, v nadpise uvedeného e íhvlSO^-L-Ohs-Pro-Lys-psi/COGQ/-Q-iPropylu,

Rt,,LC.;( kapalinová chromatografie)::

43,0 min.; 20%A-/80%B až 20%A/20%B/60%C,, ve 40 minutách; a udržování této směsi eluentů po dobu dalších 10 minut.

Příklad 1Ό)

Příprava BzlSQV>-norVal(cyklo)-Gly-Lys-psi/COCO/-azetidinu

Pro přípravu v nadpise uvedené sloučeniny byly použity postupy, popsané výše v rámci Příkladu V).

Postupem, popsaným pro přípravu Cbz-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/NHBži; bylo připraveno ze 2,70 gj Cbz-Lys (Boc )-psi/CH0HC0/-0H; celkem 2,26 gj, Cbz-Lys(Boe)-psi/CH0H0,a/-azetidinu.

Hydrogenací 269,-0 mg;, Cbz-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-azetidinuj ( získaného v rámci výše popsané operace), bylo připraveno 214,0 mg H-Lys(Boc)-pai/CHQHCO/-azetidinu HG1, • 9 • 9

- 43: —

Poté a DGG/HOBt-zkuplováním mezi 175,-0 mg}. BzlSO -norWl ( cykl.o)-Gly-QH} θ 214,0 mg}H-Lys(Boc.)-psi/CHOHCO/-azetidinu, HC1}( připraveného v rámci výše popsané operace), Dess-^Martinovou oxidací, sejmutím chránící skupiny za použití kyseliny trifluoroctové; a přečištěním, bylo získáno 84,0 mg} žádaného, v nadpise uvedeného BzlS0₂-norVal(cyklo)-Gly-Lys-psi/COCQ/-aze tidinu.

Rt}LC( kapalinová chromatografie):

27,80 min.}- 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C_r ve 40 minutách.

Příklad. 11)

Příprava BzlSO^-norLeuícyklo )-Gl.y-Lys-psi/COCO/-aze tidinu

Analogickými postupy, popsanými v rámci Příkladu 10)} byl připraven Cbz-Eys (Boc )-psi/CHOHCLO/-azetidin.

Analogickými postupy popsanými výše v rámci Příkladu 1)} bylo hydrogenaci} zkuplováním Cbz-Lys(Boc)-psi/CH0HC0/-azetidinu} '(připraveného v rámci výše popsané operace)} a BzlSO^norLeu(cyklo)-Gly-OH} ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 1)} Stupeň j)} oxidací; sejmutím chránící skupiny} a pře čištěním, získáno 100,0 mg} žádaného, v nadpise uvedeného BzlS0₂-nor Leu(cyklo)-Gly-Lys-psi/COCO/-azetidinu»

RtJLC, ( kapalinová chromatografie):

33,61 min.}, 20%A/80%B sž 20%A/20%B/60%G, ve 40 minutách.

Příklad 12)

Příprava BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-Lyg( ethoxykarbonyl)-psi /G.OGO/-a ze tidinu

Stupeň a)

Příprava BzlSQg-norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi/CHOHCO/-azetidin.TFA

Roztok,, připravený rozpuštěním BzlSO^nor^euí cyklo ^GlyLys (BoCL')-psi/CHOH©Q/-azetidinu; ( připraveného analogickým postupem popsaného v rámci Příkladu 10) výše )J 220,0 mg ); v 10,0 mi;, směsi dichlormethanu a kyseliny trifluoroctové;( 1,0 1,0; objemové poměry); b/l míchán při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin*

Po odstranění rozpouštědel odpařením, byl vzniklý zbytek mechanicky zpracován a vyjmut s diethyletherem.

Bylo získáno 267,0 mgj žádaného, v nadpise uvedeného Bzl S0₂~norLeu( cyklo )-Gly-Lys-psi/CHOHCO/-a ze tidinu. ΤΡΆ'.

TL©; ( chromatografie na tenké vrstvě):

- O,57J.( směs ethylacetát :. pyridin : kyselina octová r ( vodaj 63 : 20 : 6,0 : 11,0; objemové poměry;

( na oxidu křemičitém.

Stupem b)

Příorava BzlSCL-norLeu(cyklo)-Gly-Lys( ethoxyksrbonyl)-psii * 2 /CH0HC0/-8ze tidinu ·· 9 9 9 9

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 267,0 mg;, BzlSO^norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi/CHOHCO/-azetidinu.TPA; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně a); v 10,0 mi; Ν,Ν-dime thylf ormamidu; nylo přidáno 46,0 ^ul ethylchloorf ormiátu, a pH reakční směsi bylo upraveno pomocí triethylaminu, na hodnotu 8,5QX

Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin, byla zředěna s ethylacetátem, a promyta postupně s vodou; 5%ním roztokem hydrogenuhličitanu sodného;, 2&ním roztokem kyseliny citrónové;( kyselina 2-hydroxypropan1,2,3-trikarboxylová)a se solankou; a po vysušení se síranem sodným, a zfiltrování, byla vysušena do sucha.

Bylo získáno 150,0 mg*, žádaného, v nadpise uvedeného BzlSQ^-norLeuCcyklo)-Gly-Lys Ce thoxy karbonyl )-psi/GHOHGO/-azetidinu.

TLC;( chromatografie na tenké vrstvě )::

R^ - O,53;-(směs dichlormethan z methanol; 9,0 : 1 ,CX>;. objemové poměry*, na oxidu křemičitém..

Stupeň cr)

Příprava BzlSG^-norLeuCcyklo^Gly-Lys ( ethoxyksrbonyl)-psi/COGO/-azetidinu

Oxidací a přečištěním 1150,0 mg; BzlSO^-norLeuícykloí-GlyLys (( ethoxy karbony l)-p3Í/CH0HCO/-a ze tidinu; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně b); bylo připraveno 25,0 mg; žádaného,, v nadpise uvedeného produktu, za použití analogických postupů, popsaných výše v rámci Příkladu 1)» ·· ···· • ·

Rt,LC;( kapalinová chromátografie Ϊ:

26,,42 mize.; 20M/60%B/20%G· až 100,0%C; ve 40 minutách.

Příklad. 13)

Příprava B:zlSQ?₂-norLeu(cyklo)~Gly-Lys-psi/COCO/-0-iPropylu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1);, bylo zkuplovánínr BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-0H:; ( získaného v rámci Stupně j); Příkladu 1l); popsaného výše) ; a H-L.ys(Boc)psi/GHOHG0/-0-iPropyl.HCI; ( příprava popsána v rámci Příkladu 9) výše); oxidaci; sejmutím chránící skupiny a přečištěním,, připraveno 400,0 mg;, žádaného, v.nadpise uvedenoho BzlS0₂-nor Leuícyklo )-Gly-Lys-psi/COCQ/-0-iPropylu.

B.tjLCJÍ kapalinová chromatograf ie );

40,0 min.; 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C_ř ve 40,0 minutách, .

Příklad 14)

Příprava BzlSO^norLeuícyklo )-Gly-Lys-psi/GOGO/-NH-iPropylu

Stupeň a) » t · · ·· ···· • · * · • · · « ··

Příprava BzlSQ₂-norííeu( cyklo )-Gly-Lys (Boc )-psi/CHOHGO/-OEE

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu bylo ELC./HOBt-zkuplováním 1,96 gj BzlSOg-nor-^eu (cyklo)-Gly-OH;

( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 1); Stupeň j); 8 2,20 gj H-Lys(Boc)-psi/CHOHGQ/-OHe.HCIJ. a následným zmýdelněním produktu, připraveno 3,10 gj, žádané’,.„v nadpise uvedené sloučeniny;, t.j. BzlS0₂-norLeu( cyklo)-Gly-Lys(Boc)-psi/CH0HC0/ 0H« ve formě surového) produktu.

TLG j ( chromatografie na tenké vrstvě):

R_f = 0,4-0; ( si^ěs ethylacetát :: pyridin :; kyselina octová x ( vodaj 66 : 20 i 6,0 :: 1 1,0; objemové poměry;

( na oxidu křemičitém.

Stupeň b)

Příprava BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-Lys(Boc)-psi/CHOHGO/-NH-iPropyiu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Přikladu 1); bylo s EDCl/HOBt-zkuplováním 0,.40 mmolu BzlS0₂~norLeu(cyklo)ffily-Lys (Boc )-psi/CHQHGO/-OH; ( získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně a); a 0,105 mi; i s opr opy laminu*, následnou Dess-Bfertinovou oxidací( průběh reakce.po dobu 19,0 hodin); a sejmutím chránící skupiny; připraveno 150,0 mg, žádané v nadpise uvedené sloučeniny, t.j. BzlSO^-norLeuícyklo)Gly-Lys (Boc )-psi/CHOHGO/-NIL-iPropyl.

Rt;,Lc( kapalinová chromatografie):

34,01 min.; 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C; ve 40,0 minutách.

• frfr fr • frfrfr • » · frfr · ♦ fr frfr • frfr · • frfr · • frfr · • frfr · frfr frfr

Příklad 15)

Příprava BzlS0₂-norLeu(cvklo)-Gly-lys-psi/C0C0/-NH-nPropylu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 1')J bylo s EDGl/HOBt-zkuplov-áním 0,40 mmolu BzlSO^-norLeuícyklo)Gly-Lys(Boc)-psi/CH0HG0/-0H* ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 14 )J Stupeň a); a 0,101 mlj propylaminuj a následnou Dess-Martinovou oxidací; ( průběh reakce po dobu 24,0 hodin); a sejmutím chránící skupiny, připraveno 144,0 mg, žádané* v nadpise uvedené sloučeniny^ t.j. BzlSO -norLeu(cyklo)Gly-Ly s-p s i/0 QG0/-NH-nPropy1.

RtJIiS; ( kapalinová chromatograf ie ):

34,22 min. J 20%A/80%B; až 20%A/20%B/60%CJ ve 40 minutách.

Příklad 16)

Příprava BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi/COCO/-NH-methylu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 1)*, bylo s EDCl/HOBt-zkuplováním 0,40 mmoluj BzlS0₂~norLez(cyklo)Gly-Lys(Boc)-psi/CH0HG0/-0H; ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 14), Stupeň a); a methylaminu(0,40 ml$ 3M roztoku v N, Ni-dime thy lf ormamidu) J a následnou Dess-Martinovou oxidací, ( průběh reakce po dobu 20,0 hodin); a sejmutím chránící skupiny* připraveno 127,0 mgj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny* t.j. BzlS0₂“norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi/GOCO/-NH-methyl. RtjLG( kapalinová chromatografie):

28*36 min.;, 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C; ve 40,0 minutách. :

• ·· · • · · · « a

Přikladl?)

Příprava BzlSO.'^-norLeu( cyklo)-Gly-Lys-psi/COCO/-pyrrolidinylu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1)} bylo s EDCl/HOBt-zkupl ováním 0,40 mmolu BzlSO^-norLeuícyklo)Gly-Lys(Boc)-psi-/CHOHCO/-OH} ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 14)}, Stupeň a)} a 0,102 ml}, pyrrolidinu} Dess-Martinovou oxidací}( průběh reakce po dobu 14 dní )} a sejmutím chránící skupiny,, připraveno 125,0 mg}, žádané,, v nadpise uvedené sloučeniny} t.j. BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-Lys-psi/C0C0/-pyrrolidinylu.

Rt},LC( kapalinová chromatografie)::

36,,87 a 37,38 min:.}, 20%A/80%B až 20%A/2Q%B/60%G_ř ve 40,0 minutách.

P ř í k 1 a d. 18)

Příprava BzlSO^-norLeu( cyklo )-Gly-Lys-psi/GQCO/-N-e thy lu

Analogickým postupem:, popsaným výše v rámci Příkladu 1)} bylo s EB£l/HQBt-zkuplováním 0,.40 mmolu BzlSO^-norLeu(cyklo)Gly-Lys (Boc )-psi/G.HOHCO/-OH} ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 14)}_; Stupeň a)} a T,.78 ml} O,70M roztoku ethylaminu v Ν,Ν-dimethylf ormamidu}. Dess-^artinovou oxidací}( průběh reakce po dobu 20,0 hodin )} a sejmutím chránící skupiny, připraveno 115,0 mg} žádané, v nadpise uvedené sloučeniny,, t.j. BzlSO/,n or Le u ('cy kl o) -Gly - Ly s -p s i /C OC O/- N- e t hy 1.

Rt}LG.}( kapalinová chromatografie):

31,,30 min.}, 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%G } ve 40,0 minutách.

• 99 ·

9999

• 9 • 9

PříkladU)

Příprava Βζ130·₂-ηοΓΕβυ(αγ^ο)-Οΐ7-]1γ3-ρ3Ϊ/0000/-πιθΓίolin-4-ylu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1)* bylo s EELCl/HOBt-zkuplováním Q*4Q mmolu BzlSO^-norLeuCcyklo)Gly-lys(Boc )-psi/GHQHGO/-QH; ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 14); Stupeň a); a 0*107 ml; morfolinuj Dess-Martinovou oxidací; ( průběh reakce po dobu 6,5 dne ); a sejmutím chránící skupiny, připraveno 148,0 mg; žádané* v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. BzlS0₂-norLeu(cvklo)-Gly-Lys-psi/C0C0/-morfolin-4-yl»

Rt**EO;,( kapalinová chromatografie)::

33*73 a 34,17 min.J, 20%A/8Q%B až 20%A/20%B/60$C; ve 40,0 minutách.

Příklad 20.)

Příprava BzlSO^-norLeuícyklo)-Gly-Lys-psi/000,0/-( 1 ,.1-dioxo)thiomorfolin-4-ylu

Ku roztoku* připravenému rozpuštěním 2,47 g* thiomorfolinu ve 25*0 mi; methanolu; bylo přidáno 5*75 gj di-terc.-butyldikarbonátu a 4,0 mlj triethylaminu; a vzniklá reakční směs by la míchána při teplotě místnosti po dobu 3,0 hodin.

Poté bylo ku reakční směsi přidáno 50,0 mi; ethylacetátu; a vzniklá směs byla postupně promyta s vodou, upravenou na pH^J 3,0 s kyselinou chlorovodíkovou; dále s vodou; a 5$ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a se solankou, a po následném vysušení se síranem hořečnatým , byla zahuštěna, a bylo získáno 4,73 gj. N-terc.-butyloxykarbony l-thiomorfolinuj.kt®¹'^ • · · · ·· ···«

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

99

- 51 • ♦ ·

9 9

9 9

9 9

9

b.yl rozpuštěn ve 50,0 mlj, dichlormethanu.

Ku vzniklému roztoku bylo přidáno 50,0 mi; vody, a ku získané směsi bylo přidáno po malých částech,, za stálého míchání, a při udržování pH reakční směsi na hodnotách 7,0; 11,0 g*, kyseliny 3-chlorperoxybenzoovéJ( čistota 80,0 - 90,0%).

Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin,, b^le vodná vrstva odstraněna; a organická vrstva byla postupně promyta s 5%ním vodným roztokem thiosíranu sodnéhoj 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; (3x)*, a se solankou, a následně, po vysušení se síranem hořečnatým*, byle zahuštěna.

Vzniklý zbytek byl přečištěn chromatografií ne silikagelu; za použití směsi ethylacetát : heptsnyj( 2,0 : 3,OJ objemové poměry); jako elučního Činidla, a bvlo získáno 5,70 g; N-terc.butyloxykarbonyl-thiomorfolin-1 ,1-dioxidu.

V předcházející operaci připravený sulfon (0,625 g)J byl rozpuštěn v 50,0 mlj 3W roztoku chlorovodíku v dioxanu, a poté,, co byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 4,0 hodin,, byla zahuštěna,* a bylo získáno 0,579 gj- thiomorfolin-1,1dioxidu. hydrochloridu.·

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo s EDGl/HOBt-zkuplováním, 0,40 mmolu*, BzlS0'₂-norLeu(cyklo)Gly-Lys(Boc)-psi/GH0HG0/-0H; ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 14); Stupeň a); β 0,21 gj thiomorfolin-1,1-dioxidu. hydrochloridu; ( připraveného v rámci výše popsané operace); Dessfiftartinovou oxidací ( průběh reakce po dobu 3 dnů ); a sejmutím chránící skupiny; získáno 180,.0 mg*, žádené, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. BzlSO₂-norLeu(cyklo)-Gly-Ijys-psi/COC;0/-( 1 ,1dioxo)-thiomorfolin-4-yl.

Rt;,LC;.( kapalinová chromátografie):

33,.64 min.; 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C; ve 40,0 minutách.

·«· · ·· ·*·*

99

9 9 9

9 9 9

9 · 4 9

9 9 9

99 • · ♦

9 ·

- 52 Příklad 21)

Příprava BzlS0₂-norLeu(cyklo)-Gly-Eys-psi/C0C0/-N- (methyl )( me thoxy)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo s EDCl/HOBt-zkuplováním; 0,40 mmolu BzlSO'₂-norLeu(cyklo)Gly-Lys(Boc)-psi/CHOHOO/-OH; ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 14)J Stupeň a)J a 0,12 gj N,O-dimethylhydroxylaminu;, Dess-Martinovou oxidaci ( průběh reakce po dobu 3,5 dne); a sejmutím chránící skupiny; připraveno 136,0 mgj žádané,, v nadpise uvedené sloučeniny;, t.j. BzlSO^-norLeuícyklo)-Gly-Lyspsi/COCO./-N(me thyl) (me thoxy).

RtJLC;( kapalinová chromatografie):

33,,80 a 34,-53 min.; 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C; ve 40,0 minutách.

Příklad. 22)

Příprava BzlSO^-norLeuícyklo )-Gly-lys-psi/C0C0/-(2-(karboxamid )azetidin-1-ylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo s DGC/HOBt-zkuplovánímJ 1,.13 gj kyseliny řfc-terc.-buty loxykarbonyl-l>-azetidin-2-ksrboxylové; a 1,38 gj, chloridu amonného; připraveno 0,468 gj, N-terc. -buty loxy karbony 1-L-a ze tidiífr-2-karboxamiduj ze kterého bylo odebráno o,224 gj a rozpuštěno ve 5,0 mlj 3M roztoku chlorovodíku v dioxanu.

Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 3,0 hodin,, byla zahuštěna^ a bylo získáno

ΦΦ *·-·· ·· φφ • φ φ φ φ φ φ φ φ · » » φ φ φ · φφ φφ

- 53 • φφφφ ·» φ · φ • φ φ φ φ

0,17 gj azetidin-2-karbox8midu.,hydrochloridu»

Analogickým postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo s EDGl/HOBt-zkuplováním, 0,40 mmolu, BzlSO^-norLeuCcyklo)Gly-lys(Boc)-psi/CHQHCO/-OH; ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 14) J Stupeň a); a 0,17 g* azetidin-2-karboxamid.hydrochloridu* ( připraveného v ráíŘci výše popsané operace )J Dess-Martinovou oxidacíJ ( průběh reakce po dobu 20,0 hodin); a sejmutím chránící skupiny; získáno 58,0 mg* žádané, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. BzlS0₂-nor-^L'eu(cyklo)-Gly-Lys-psi /0000/-(2-(kqrboxamid)-azetidin-1-yl).

RtJLCjC kapalinová chromatografie):

26*43 min.; 20%A/80%B až 20$A/20$B/60%C; ve 40,0 minutách.

Příklad 23)

Příprava nPropylS0₂-I)-Gh8-Pro-Lys-psi/G0G.0/-0-iPropylu

Stupeň a)

Příprava Bnc-D-Cha-Pro-OBzl

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 1 1 ,64 gj Boc-D-C.ha-OH; ve 100,0 ml* dichlormethanu; bylo za stálého míchání, a při teplotě 0°c; přidáno 6*36 g HOBt; a 9,72 g', DDCJ a po uplynutí 20,0 minut, ještě roztok, připravený rozpuštěním 10,35 g\ H-Pro-OBzl.HCi; ve 40,0 ml; dichlormethanu; a upravený s

- 54 ** »<·» 4« ·· • · » · 4 « f • · · « ♦ 4 * • » · · · 4 t · • * * 4 · 4 · ** 4 ·« 4*

N,N-diisopropyl-ethyl8minem; na pH 8,0» Po uplynutí 16,0 hodin, byla reakční směs zfiltrována, a filtrát byl postupně promyt s vodouj s 0,1N roztokem kyseliny chlorovodíkové; opět s vodou,, s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a se solankou.

Všechny vodné promývací roztoky; ( všetně vody); byly 2x extrahovány s ethylacetátem,. a poté byly spojené organické extrakty vysušeny se síranem sodným;, a zahuštěny»

Vzniklý zbytek byl vyjmut do směsi ethylacetát : heptany; (1,0: 1,o; objemové poměry); a výsledná suspenze byla zfiltro vána,, a filtrát byl přečištěn chromatografií na silikagelujze použití směsi ethylacetát : heptany;(1,0 : 1,0; objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 19,34 g*, žádaného, v nadppise uvedeného Boc-D-Gha-Pro-OBzl.

TLC.; ( chromatografie na tenké vrtsvě):

R^ = 0,80;( směs dichlormethan :: methanol; 9,0 . 1,0J obje0 mové poměry; na oxidu křemičitém.

Stupeň b)

Příprava nPropylSO^-D-Gha-Pro-GBzl

Roztok,., připravený rozpuštěním 1 ,.01 gj, Boc-D-Oha-Pro-OBzi; ( získaného v rámci výše popsaného, předcházejícího Stupně a); ve 42,0 mi;, 3W roztoku chlorovodíku v dioxanu; byl míchán po dobu 2,0 hodin při teplotě místnosti; a poté byl zahuštěn»

Vzniklý zbytek byl rozpuštěn ve 35,0 ml',, dichlormethanu; a získaný roztok byl vychlazen na teplotu 0°c;. a za stálého míchání bylo k němu přidáno 0,22 ml’, 1-propansulfonylchloridu, a PH vzniklé reakční směsi bylo upraveno na hodnotu 8,50» • 0··· • 0 0 •0 ·««·

00

- 55 • 0 0 0

0

000 0 • 0 0 0 • 0 0

0 »· •

0 0

0 0

0 0 • 0 0

0 0

Poté, co bvls reakční směs míchána při teplotě méstnosti po dobu 24,0 hodin, byla zahuštěna,, a vzniklý zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, a získaný roztok byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou; s 5%ním vodným roztokem kyseliny citrónové;( kyselina 2-hydroxypropan-1,2,3-trikarboxylová )}s se solankou;, a po vysušení se síranem hořečnatým, byla zahuštěna.

Surový produkt byl přečištěn chromatografií na silikagelu; za použití směsi ethylacetát : heptakyj( 1,0 : 1 ,0J. objemové poměry),’, jako elučního činidla.

Bylo získáno 0,85 gj Žádaného,, v nadpise uvedeného nPropyl S 0 2-B-Oha-Pr o -OBz1.

TLO;,( chromatografie na tenké vrstvě ):

= 0,.60;.Í’jsměs ethylacetát :: heptanyj, 1,0 : 1,0; objemo( bé poměryj na oxidu křemičitém.

Stupeň cT

Příprava nPropylS0₂-D-Ch8-Pro-Bys-psi/C0C0/-0-iPropylu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo hydrogenováno 0,85 gj nPropylSQ^-B-Gha-Pro-CBzi; ( získaného v rámci výše popsaného,, předcházejícího Stupně b); a bylo získáno 0,54 g;,nPropylS0^-Dj-Gh8-Pro-G5£.

Analogickým postupem,, popsaným býše v rámci Příkladu 9); bylo s BCC/HOBt-zkuplováno 225,0 mg; nPropylSO^B-Gha-Pro-OH;

( připraveného v rámci předcházející, výše popsané operace) \ a H-3kys(Bba)-psi/CHQHGO/-a-iPropyl.HCIJ a Dess-Martinovou osidacíj B.oc-chránící skupina byla odstraněna pomocí 3M⁷ roztoku chlorovodíku v dioxanu,. jak bylo popsáno už výše; 8 získaný

- 56 surový produkt byl přečištěn za použití preparativní vysokovýkonné kapalinové chromatografie;(HPCL); analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1),

Bylo získáno 47,0 mg; žádané, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. nPropylS0₂-n-Cha-Pro-Kys-psi/C0C0/-0-iPropyl.

BtJLCjí kapalinová chromatografie):

27,60 min.; 20%A/60%B/20%C až 20%A/80%C;. ve 30,0 minutách; a po té ještě 100% c; v 10,0 minutách*

Přiklaď 24)

Příprava (10-kafr)S0₂-D-Cha-Pro-Iys-psi/C0C0/-0-iPropylu

Analogickým postupy, popsanými výše v rámci předcházejícího Příkladu 23)*,. byl' z Boc-B-Cha-Fro-OBzl*, í získaného v rám· ci výše popsaného Příkladu 23); Stupeň a); a (-)-1O-kafrsulfonylchloridu; připraven.- ve 12%ním výtěžku;,( vztaženo na Boc-ΠGha-Pro-OBzl ); žádaný_r v nadpise uvedený (10-kafr)S0 -D-ChaPro-Lys-psi/C0C0/-0-iPropyl.

Rt^LC^( kapalinová chromatografie):

33,60 min.;,20%A/60W20%C až 20%A/S0%C ve 30,0 minutách* a poté až 100,0%C,*. v 10,0 minutách.

Přiklaď 25)

- 57 • 9 99 9 99 • ·

Příprava EenylSO^-B—Cha-Pro^Eys-psi/COCQ/-0-iPropylu

Analogickými postupy,, popsanými výše v rámci Příklau 23 )ý byl z Boc-D-Cha-Pro-OBzi; ( získsného v rámci výše popsaného Příkladu 23); Stupeň a); a -hennensulfonylchloridu*, připraven v 9%ním výtěžku; 0 vztaženo na Boc-D-Cha-Pro-OBzl ); žádaný,. v nadpise uvedený f βηγ13θ2-Η*-ΟΗ8-Ρηο-Εγ3-ρ3Ϊ/0000/—O-iPropyl. Rt;.(C); ( kapalinová chromatografie ):

29,30 mim.; 20%A/60%B/20%C až 20%A/80%Q, ve 30,0 minutách, a po té ještě až 100SC; v 10 minutách.

p ř í k: 1 e ď 26)

Příprava me thy lSO^-B-Cha-Pro-Ly s-psi/C0C0/-0-iPropylu

Analogickýmy postupyJ popsanými výše v rámci Příkladu 23); byl z Bou-n-Cha-Pro-OBzi; ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 23)^, Stupeň a); a methansulfohylchloridu; připraven v I8%ním výtěžku;. ( vztaženo na Boc-D-Cha-Pro-OBzl); žádaný, v nadpise uvedený methylS02-D>Cha-Pro-Lys-psi/COCQ/-O-iPropyl» St;.LC;.( kapalinová chromatografie ):

24,30 min-.;. 20%A'/60%B/20%C až 20M/80%CJ ve 30,0 minutách; a poté až 100:%C„ v 10,0 minutách.

- 58 • ·

Příklad 27)

Příprava i Pr o py ISO ₂ -B-Che -Pr o -Ly s -p s i /C OC O/- O-i Pr o py lu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 23); byl z Boc-D-Cha-Pro-OBzi; ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 23)J, Stupeň a)J a isopropylsulfonylchloriduj připraven ve 2%ním výtěžkuj ( vztaženo na Soe-D-Gha-Pro-OBzl ); žádaný, v nadpise uvedený iPrópylSQ₂-B-Gha-Pror*-Iys-psi/COCO/-0 iPropyl.

RtJLC; ( kapalinová chromátografie ):

26,..80 min.;. 20%A/60%B/20%G. až 20?éA/80%c; ve 30,,0 minutách,, a po té až 100.%C,J v 10,0 minutách.

Příklad., 28)

Příprava &enzylS0^-D-Cha-Pro-Lys-psi/C0G0/-0-iPropylu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 23); byl z Boc-B-Cha-Pro-OBizi; ( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 23); Stupeň a)J. a alfs-toluensulfonvlchloridu; připraven v 11,O/níffi výtěžkuj( vztaženo na Boc-B-Gha-Pro-OBzl )J žádaný _p v nadpise uvedený benzylS'Q₂-B-Cha-I^:’ro-Lys-psi/C0C0/-0i Propyl.·

RtJ-LC; ( kapalinová chromá tografie ):

30,40 min.;. 20%A/60%B/20%C až 20%A/80%CJ ve 30,0 minutách, a po té až 10Q%eJ, v 10,0 minutách.

• ·

Příklad 29.) >ř í pra va nBu ty 1S 0'₂ -Π-Cha -Pr o -Ly s -p s i /COC 0/- Q-i Pr opy lu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 23); byl z Boc-D-Gha-Pro-OBzi; ( získaného v rámci výše popsaného ^říkladu 23); Stupeň; a); a 1-butansulfonylchloridu; připraven ve 29%ním výtěžku; ( vztaženo na Boc-B-Pro-OBzi ); žádaný_r v nadpise uve de ný nButy1SQ₂ -B.-Cha - Pr o -Ly s - p s i /C 0G0/-0-iPr o py1. Pt;.LC;( kapalinová chromatografie ):

29,30 min.;. 20%A/60%B/20%C až 20%A/S0%C; ve 30,0 minutách, a po té až 100.^;,0%G_r v 10,0 minutách.

Příklad 3,09

Příprava /3-(( benzy Isulf ony lamino)-6-me thy l-2-oxo-1,2-dihydro pyridinyl/-acetyl-Lys-psi/GQ£0/-G^iPropylu

Analogickým postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 9); bylo s DGG/HOBt-zkuplováním ; 151,0 mg; /3-( benzylsulfonylsmino)-6-methyl-2-oxo-1 ,2-dihydropyridinyl/-octové kyseliny;

( viz Mezinárodní patentová přihláška WO 97/01338 )’, 8 205,0 mg; H-Lys (Boc)-psi/GHOHC0/-0-iPropyl.HCl; dále Dess-Mertinovou oxidací, sejmutím chránící skupiny, a přečištěním; získáno 91,0 mgj žádané,, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. /3-( benzylsulf ony lamino)-6-me thy l-2-oxo-1 ,.2-dihydropyridinyl/-acetylLys-psi/G0C0/-0-iPropyl.

pt;LG;( kapalinová chromatografie ):

34,70 mini..;, 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%c; ve 40,0 minutách.

• · · · • ·

- 60 Příklad 31)

Příprava /3-(benzylsulfonylamino)-2-oxo-1 _r2-dihydropyridinyl/acetyl-Lys-psi/C0C0/-0-iPropylu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 9)J bylo s HCC/HOBt-zkuplováním, 178,0 mgj /3-(benzylsulfonylamino)2-oxo-l ,,2-dihydropyridinyl/-octové kyseliny;( viz Mezinárodní patentová přihláška,· WO 97/46207 )J a H-Lys(Boc)-psi/GHQHGO/0,-iPropylu»HOi; a Dess-^artinovou oxidací;, a následným sejmutím chránící skupiny, za použití roztoku chlorovodíku v dioxanu', a přečištěním, provedenými analogickým postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 9); připraveno 116,0 mgj žádaného, v nadpise uvedeného /3-( benzylsulfonylamino)-2-oxo-1,2-dihydropyridinyl/acetyl-Lys-psi/C0C0/-0-iPropylu.

Rt;.LC;( kapalinová chromatografie );

32,40 min.;, 20W80&B až' 20%A/2G%B/60%G; ve 40,0 minutách.

Příklad. 3:2)

Příprava /3-( benzylsulfonylamino)-6-raethyl-2-oxo-1 ,.2-dihydropyridinyl/-acetyl-Lys-psi/COCO/-NH₂

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 1); bylo s DEG/HOBi-zkupíováním; 286,0 mg;/3-0 benzylsulfonylamino)6-methyl-2-oxo-1 ,,2-dihydropyridinyl/-octové kyseliny; ( viz MezinároSní patentová přihláška JWO'97/01338 ); a H-Lys(Boc)-psi/CHOHGO/-OMe.HCi; získáno 0,.5,1 g*, /3-( benzylsulfonylamino)-6methyl-2-oxo-1,2-dihydropyridinyl/-acet.yl-Lys-psi/CH0HC0/-0Me; ze kterého bylo po zwýdelnění; a zpracování analogickým postupem, • ···· Φ· ···· φφ φφ φ φ φ φφ φ ···· φ · φφφ · · · · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φφφ φ φ φ φ •ΦΦΦ φφ · ·· φ· popsaným výše v rámci Příkladu 14) J, t.j. s EDCl/HOBt-zkuplováním s chloridem amonhýmj Dess-ftartinovou oxidací,., sejmutím chránící skupiny’,, a přečištěním, připraveno 76,0 mgj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny, t.j. /3-(benzylsulf onylemino)-6methy1-2-oxo-1 , 2-dihydropyridinyl/-acetyl-Eys-psi/COCO/-NH₂.. RtJLGJÍ kapalinová chromátografie ):

26,90 min.*_ř 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C’, ve 40,0 minutách.

Příklad. 33)

Příprava BzlS0₂-Aad-Pro-Eys-psi/C0C0/-0H

Stupeň, a)

Příprava BzlSOj-Aad(OtBu)-OH

Ku roztoků,, připravenému rozpuštěním 0,50 gj H-Aad(OtBu)OHj ve 4,40 mlj 1B vodného roztoku hydroxidu sodného, bylo přidáno za stálého míchání 0,42 gj benzensuldonylchloriduj ve 2,0 ιμΐ; dioxanu. Po uplynutí 16,0 hodin, kdy byla reakční směs ponechána při teplotě místnosti v kliduj bylo k ní přidáno dalčích 1,40 mlj 2N vodného roztoku hydroxidu sodného; 0,50 mi; dioxanuj a 0,,09 gj benzylsulfonylchloriduj a tato reakční směs byla míchána dále ještě po dobu jednoho dne.

Poté byl z reakční směsi odstraněn dioxan; a po přidání vody byla reakční směs pomocí kyseliny chlorovodíkové okyselena’,

p.H.. 3,,0. );,ha následně byla 2x extrahována s diethyletherem.

Spojené ethere ové extrakty byly vysušeny se síranem sodným,.

- 62 • ··· · ·♦ ···· • · » · · · • · · · · a zahuštěny.

Bylo získáno 235,0 mg žádáno; v nadpise uvedenoho BzlSO^

Aad(OtBu)-OH.

TLC} ( chromatografie na tenké vrstvě ):

= 0,70; ( směs-' dichlormethan : methanol voda} 14 :: 6 s ( 1,o; objemové poměry; na oxidu křemičitém.

Stupeň b)

Příprava BzlSOg—Aad(OtBu)—Pro—OH

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 23)} t.j. s DCC/HOBt-zkuplováním 235,-0 mg;. BzlSO^-Aad(OtBu)-OKJ ( získaného v rámci výše popsaného, předcházejícího Stupně a)}, a 168,0 mgj H-Pro-OBzl.HClJ, a následnou hydrogenaci_r bylo připraveno 193,0 mgj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny} t.j. BzlS0₂”Aad(OtBu)-Pro-OH.

TLC} ( chromatografie na tenké vrstvě):

R = 0,60}( směs ethylacetát : pyridin : kyselina oetová :

( voda} 163 ϊ 20 : 6,0 : 11 ,,0Jobjemové poměry} ( na oxidu křemičitém.

Stupeň; σ)

Příprava BzlS0₂-Aad-Pro-Lys-psi/C0C0/-0ffi

- 63 • 444 4 ·· ♦··· · · ·· ·· · · · · · ♦ e · • · ·· · ···« ··· ···· • 4 » · 4· * ·· ·»

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 32); bylo s DCG/HOBt-zkuplovaním; 193,0 mgj. BzlSO -Aad(OtBu)-Pro-OH; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně b)J a Η-Lys (Boc )-psi/GHQHCO/-OMe .HCi; zmýdelněním; Dess-martinovou oxidací; sejmutím chránící skupiny, a přečištěním, připraveno 85,0 mg; žádané, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. BzlSO₂-AadPro-Lys-psi/COCO/-OH.

Rt;LG;( kapalinová chromatografie ):

26,10 min.J 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C; ve 40,0 minutách.

Příklad 3:4)

Příprava BzlSO^-Glu-Pro-Ly3-psi/COCO/-OHI

Analogickými postupy, popsanými výše v předcházejícím Příkladě 33)J bvl při použití H-Glu(OtBu)-QH; jako výchozího materiálu,připraven ve 3%ním výtěžku; ( vztaženo na H-Glu(OtBu) OH); _ ’ v nadpise uvedený; žádaný BzlS0₂-Glu-Pro-Lyspsi/COGO/-OH.

Rt; LC;( kapalinová chromatografie ):

22,60 min:.;, 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%C; ve 40,0 minutách.

Příklad. 3.5)

Příprava Βζ13Ο₂-Α8ρ-Ρτο-1^3-ρ3ί/0000/-0Η

- 64 Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 33') byl p£i použití H-Asp(OtBu)-OH* jako výchozího materiálu; připraven v 18%ním výtěžku; ( vztaženo na H-Asp(OtBu)-OH ); v nadpise uvedený,, žádaný BzlSQ₂~Asp-Pro-Lys-psi/COGO/-OH!,

Et;, LC;( kapalinová chromá tografie ):

21,90 min*; 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%G„ ve 40,0 minutách.

Příklad: 36) fríprava EtSO₂-B.-Tyr (Me )-Pro-Lys-psi/GOG.O/-NH₂

Stupeň. a)

Příprava EtSO₂-B-Tyr (Mě )-Pro-CJH

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 23) byl s BCG/HOBt-zkuplováním; 2,,22 gj Boc-B-Tyr(Me)-0H; a 2,0: g H-Pro-OEzl.HCi; sejmutím chránící Boc skupiny; sulfonylácí za použití ethansulfonylchloridu; a následnou hydrogenací benzylesteru; získán 1 ,0 gj žádaného*, v nadpise uvedeného EtSO'^

B-Tyr (Mé)-Ρτο-ΟΗζ

TLC;,( chromá tografie na tenké vrstvě ):

= 0,23; ( smrěs dichlormethan :· methanol; 95 : 5,0; obje( mové poměryj na oxidu křemičitém.

♦ ♦· · ·♦ ····

9· ··

Stupeň b)

Příprava EtS0₂-L-Tvr(Me )-Pro-Lys-psi/COCQ/-NH₂

Analogickým postupy, popsanými výše v rámci fříkladu 32)*, bylo s DCC/HOBt-zkuplovsním.; 254,0 mgj EtSQ₂-D.-Tyr (Me )-Pro-0H;

( získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně a); a H-Lys (Boc )-psi/CHOHGQ/-QMe .HCI*, zmýdelněním; s EDCl/HOBt-zkuplováním s chloridem amonným; Dess-Martinovou oxidací, sejmutím chránící skupiny; a přečištěním,, připraveno 83,0 mgj žádaného, v nadpise uvedeného EtSOg-D-Tyr (Mě )-Pro-Lys-psi/COCO/-NH^:2, Rt;LC;,( kapalinová chromatografie ):

28,0 min.;, 20%A/80%B až 20%A/20%B/60?éC;. ve 40,0 minutách..

Příklad; 3.7) fříprava EtSO^-L-Tyr (Me )-Pro-Lys-psi/C0C0/-0*-iPropylu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 9)J bylo s DDC/HOBt-zkuplováním; 0,51 g‘, EtSO^-D-Tyr(M'e)-Pro-0H;

( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 36); Stupeň a); a HULys (Boc )-’psi/CHOHQO/-O-iPropyl.HCi; Dess-Martinovou oxidací; sejmutím chránící skupiny; a přečištěním; připraveno

223,,0 mg* žádaného, v nadpise uvedeného EtSO -D-Tyr(tóá)-ProLys-psi/00C0/-0-iPropylu.

Rt;LC;( kapalinová chromatografie ):

36,50 min.; 20%A/80%B až 20%A/20%B/60%V, ve 40,0 minutách.

9 9 9 9 9

P ř í k 1 s d 3i8)

Příprava EtSO^-D-Tyr (3®e)-Pro-Lys-psi/COCO/-azetidinu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 10); bylo s nCC/HOBt-zkuplováním; 307,0 mg; EtSQp-D-Tyr(Me)-Pro-0H;

( získaného v rámci výše popsaného Příkladu 36), Stupeň a); a H-Iys(Boc)-psi/CHOHCO/-azetidinu»HCi; Dess-Martinovou oxidací; sejmutím chránící skupiny,, e přečištěním, připraveno 83,0 mg; žádaného, v nadpise uvedeného EtSO^-D-Tyr(Me)-Pro-Lys-psi/COCO/ 8zetidinu„

RtJLCjí kapalinová chromatografie ):

36,40 min.;, 20%A/80%B až 20%A/20W60%c; ve 40,0 minutách.

Příklad. 3.9)

Příprava EtSO^-D—Tvr (Me-)-Pro-Eys-psi/C0C0/-N-(4-chlorpropylu)

V nadpise uvedená sloučenina;( 43,0 mg); byla získána jako druhý produkt při čištění sloučeniny, připravované v rámci. Příkladu 38).

R-tJLC;/ kapalinová chromatografie ):

38,10 min.;. 20/A/80/B až 20%A/20%B/60%0; ve 40,0 minutách.

Příklad 40) • 9 · 9 9 9

- 67 Př íprsva BzlSO^-E-Dpa-Pro-Lys-psi/COC 0/-0-ÍPr opylu

Stupeň a)

Příprava BzlSO^-D—D.pe-Pro-OH'

Odstranění Boc chránící skupiny z 1,50 g* Boc-D-Dpa-ProOBzlJ ( Mezinárodní patentová přihláškaJWO 97/31.937); reakcí s benzylsulfonylchloridem; a odstraněním benzylesteru, analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 23 J bvl získán 1,0 gj žádané,, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j.. BzlSO -D-ΠρθPro-OH.

TLC;( chromatografie na tenké vrstvě ):

= 0,,63.,\( směs ethylacetát : pyridin : kyselina octová z ( vodaj 163 - 20? :: 6,,O s 11*0’ objemové poměry;

( na oxidu křeničitém.

Stupeň b)

Příprava BZlS0₂-D-Dpa-Pro-Lys-psi/C0GL0/-0-iPropylu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 9)* bylo s DDC/HOBt-zkuplováním* 0,31 gj BzlSO^-D-Dpa-Pro-QH; (získaného v ráw:i předcházejícího, výše popsaného Stupně a)’, a H-Lys (Boc )-psi/CH0HCO/-0-iPropyl-HCi;. Dess-^Martinovou oxidací,, a přečištěním, připraveno 50,0 mg; žádaného* v nadpise uvedeného BzlS0₂-E-Dpa-^ťno-Lys-psi/C0C0/-0-iPropylú.

« ·«» • · · *» ·

- 68 Rt*,LC; ( kapalinová chromatografie ):

32,20 min.; 20%A/60%B/20%C až 20%A/80%c; ve 30,0 minutách, s po té až 100,0%C,, v 10,0 minutách.

P ř í k, 1 a d 41 )

Příprava EtS0₂-Leu-Ero-Ikys-psi/C0C0/-0-iPropylp

Stupeň a)

Příprava EtSO^—^Lěu-0Me

Ku roztoku,připravenému rozpuštěním· 3,0 gj H-Leu-OMe.HG1J ve 30,0 mi; dichlormethanu; a upravenému zs stálého míchání s triethylaminem;, na pH 8,0, bylo po vychlazení na teplotu 0°C; přidáno 3,.20 mlj, ethansulfonylchloriduj a 2 „30 mlj. triethylaminu. Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě míst nosti po dobu 16,,0 hodin, byla postupně promyta s 0,5N, roztokem kyseliny chlorovodíkové; s vodou;, a s 5%ním roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a nakonec byla vysušena.

Zbylý surový produkt byl přečištěn chromatografií na silikagelu,. zapoužití směsi dichlormethan :: methanol; ( 9,0 :: 1,0; objemové poměry), jako elučního činidla.

Bylo získáno 3,30 gj. žádaného;, v nadpise uvedeného EtSO^Eeu-OMe·

TLC;( chromatografie na tenké vrstvě ):

R^,. = 0,69; ( směs dichlormethan :· ethylacetát; 9,0 1,0;

( objemové pomětyj na oxidu křemičitém.

- 69 S t u p e ň b)

Příprava EtSO^-Leu-Pro-OK

Analogický^- postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo zmýdelněno 3,30 gj EtSO^-Ěeu-OMe; ( získaného v rámci před cházejícího, výše popsaného Stupně a); a poté analogickým postu pemj popsaným výše v rámci Příkladu 23) J byl zkuplován s HPro-OBzlJ a výsledný dipeptid byl hydrogenován, analogickými postupy, popsanými v rámci Příkladu 23) výše); 8 bylo získáno

3,40 g; žádané,, v nadpise uvedené sloučeniny;, t.j.EtSO^-Leu-Pro OH.

TEC; ( chromatografie na tenké vrstvě )::

= 0,,1 1 ; ( směs dichlormethan :: ethylacetát;, 9.0 : 1,0;

( objemové poměryj na oxidu křemičitém.

St u p e ň c)

Příprava EtS0₂-Leu-Pro-Lys-psi/C0C0/-0-iPropylu

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Přikladu 23); bylo.s DCC/HOBt-zkuplováním; 145,0 mg; EtSO^-Leu-Pro-OH; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně b); 8 H-Lys(Boc)-psi/CHQHC0/-O-iPropylu.HCi; Dess-Msrtinovou oxidací, sejmutím chránící skupiny,, a přečištěním, připraveno 120,0 mgj žádaného,, v nadpise uvedeného EtSQ₂-Leu-Pro-Lys-psi-/COCO/-QiPřopylu.

RtJLC;( kapalinová chromatografie):

16,60 min.; 20%A/60%H„20%C. sž 20W603C; ve 30,0 miiautáeh.

··«· φφ ·*·«

Příklad 42)

Příprava Bzlsa^-norLeuC cyklo)-Gly-Acg-psi/C0C0/-8 ze tidinu

S t u p e ň a)

Příprava H-Acg(Boc )/CHOHGLO/—OMě. HCI

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 294,0 mg; methylesteru kyseliny 3-/4-( 1 ,_;1 -dimethylethoxykarbonylamino)-cyklohexyl/-2hydroxy-3-nitropropionové;( viz publikace v odborném časopise Bioorg.Med.Chem.LettJ7J 67 - 72J /19.97/; autor Lyle se sp. ); ve 100,0 mlj methanolu, bylo přidáno 0,425 mlj 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové; a 0,45 gj 10%ního palladia ne aktivním uhlí; a vzniklá suspenze byla hydrogenována za atmosferického tlaku; při teplotě místnosti; po dobu 16,0 hodin.

Pmté byl palladiový katalyzátor odstraněn filtrací; a rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením za sníženého tlaku.

Bylo získáno 289,0 mg; žádaného H-Acg(Boc)-psi/CHOHCO/OMé.- HGi; ve formě směsi diastereoizomerů.

TLC; ( chromatografie na tenké vrstvě ):

- = 0,26; ( silikagel; směs ethylacetát :: pyridin : kyselina ( octová vodaj 232 : 31 :: 18 r 7,0', objemové ( pooměry .

Stupeň b)

Příprava BzlSO₂~nori'eu(cyklo)-Gly-Acg-psi/GOCO/-ezetidinu

Analogickými postupy„ popsanými výše v rámci Příkladu í)} bylo s DCC/HOBt-zkuplováním} 0,27 g}, BzlS0₂-norLeu(cyklo)-GlyOHJ a 0,25 g}- H-Acg(Boc)-psi/CH0HC0/-0Me»HC1} zmýdelněním}, s ED.ClPHOBt-zkuplováním s azetidinem.hydrochloridem; Dess-Martinovou oxidací, a sejmutím chránící skupiny} připraveno 82,0 mgj žádaného,, v nadpise uvedeného BzlSO^-norLeuCcykloí-Gly-Acg-psi /C0C0/-8zetidinu»

Rt},(LCJ( kapalinová chromatografie):

34,80.8 35,,40 min.} 20%A/8Q%Baž 20%A/20%B/60%CJ ve 40,0 minutách.

Přiklaď 43,)

Př í pra va e thy IS 0'₂ -D -Cha -Pr o-Acg-psi/C OCO/- 0 i Pr o py lu

Stupe ň a)

Příprava Cbz-Acg(Boc)-psi/CH0HC0/-0Me

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,34 gj H-Acg(Boc)psii/CHOHCO/-OMé»HC1} v 10,0 ml} acetonitrilu, a 10,0 ml} N,řídíme thy Iformamidu, u kterého bylo upraveno za stálého míchání pH na hodnotu 8,O pomocí Ν,Ν-diisopropylethylaminuj, bylo přidáno 0,24 gj, N-benzyloxykarbonylsukcinimiduJ a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny , a poté byla zahuštěna.

Vzniklý zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu} a získaný »<♦· ·* ·*♦·

- 72 roztok byl promyt s vodou; a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byl zahuštěn.

Zbytek byl přečištěn chromatografií na silikagelu, za použití směsi ethylacetát : heptany; ( 2,0 : 3,OJ objemobé po měry ), jako elučního činidla.

Bylo získáno 0,287 mg$ žádaného, v nadpise uvedeného Cbz-Acg(Boc)-psi/CH0HC0/-0Me.

TLC'» ( chromatografie na tenké vrstvě ):

= O,25J ( směs ethylacetát : heptany; 1,0 : 1,0J objemové poměry; na oxidu křemičitém.

S t u p e ň b)

Příprava Cbz-Acg(Boc)-psi/CHQHCO/-QiPropylu

Ku směsi, připravené za stálého míchání v atmosdeře dusíku,smícháním 5,0 mi; tetrahydrofuranu, a 1,0 mi; 2-propanolu, bylo pomalu přidáno 2,50 mi; 1 ,βίί roztoku n-butyllithia|v hexanech, a po uplynutí 20,0 minut byl ku vzniklé reakční směsi přidán roztok, připravený rozpuštěním 0,28 gj Cbz-Acg(Boc)-psi /CH0HC0/-0Me; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně 8); ve 5,0 mi; 2-propanolu; a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin.

Poté bylo ku reakční směsi přidáno 0,50 mlj kyseliny octové, a směs byla zahuštěna. Vzniklý zbytek byl rozpuštěn v ethyl acetátu, a získaný roztok byl promyt s vodou,, a po vysušení se síranem sodným; byl zahuštěn.

Zbytek byl přečištěn chromatografií na silikagelu, za použití směsi ethylacdtát : heptany;( 2,0 : 3,0; objemové poměry); jsko elučního činidla.

ΦΦ ♦·

4 9 · · · · • · · 9 9 9 4

9 9 9 9 · · · ·· * • φ 9 9 9 9 9 9 4 • ΦΦ Φ ΦΦ Φ ·· ··

Τ 73 *·Φ-Φ ·· 994 Φ

Bylo získáno 0,223 mgj žádaného; v nadpise uvedeného CbzAcg(Boc )-psi/CH0HC0/-0iPropylu.

TLC*/ chromatografie na tenké vrstvě ):

Rf = O,25J ( směs ethylacetát : heptanyj 1,0 . 2,0; obje( mové poměryj na oxidu křemičitém.

Stupeň σ)

Příprava ethylS02-D-Cha-Pro-Acg-psi/C0C0/-0iPropylu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,22 g;Cbz-Acg(Boc)psi/CH0HC0/-0iPropylu; ( získanému yrámci předcházejícího, vý še popsaného Stupně b)J v Ν,Ν-dimethylformamidu, bylo přidáno 80,0 mg; 10%ního palladia na aktivním uhlí; a 0,23 mi; 2M roztoku kyseliny chlorovodíkové, a vzniklá suspenze byla hydrogenována za atmosferického tlaku; při teplotě místnosti; po dobu 1,0 hodiny.

Poté byl palladiový katalyzátor odstraněn filtrací, a získaný filtrát byl použit pro DCC/HOBt-zkuplování s 0,166 g; ethylSO2-D-Cha-Pro-OH; za použití analogického postupu, popsaného výše v rámci Příkladu 1).

Vzniklý produkt byl oxidován za použití Dess-^ertinova reagens, a po sejmutí chránící Boc-skupiny, a přečištění, anelogickým postupem popsaným výše v rámci Příkladu 1); bylo získáno 100,0 mgj žádaného, v nadpise uvedeného ethylSO^-D-ChaPro-Acg-psi/COCO/-OiPropylu.

Rt;LC;( kapalinová chromatografie):

30,0 min.J 20%A/60%B/20$C až 20%A;80%C; ve 30,0 minutách.

- 74 • ·* ··«· ·♦ * · · · • » ♦ * *

99 • 9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

99

Příklad 44)

Příprava EtS0₂-B-X-Lys-psi/C0C0/-0-iPropyl derivátů na pevné fázi

Stup e u a )

Příprava Te ooiys (Boc)-psi/CH0ffi2Q/-C—iPropylu

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1); Stupeň f)J bylo hydrogenováno 10,0 gj Cbz-Lys(Boc)-psi/CH0HC0/OMe ζ a byli získán ve kvantitativním výtěžku H-Lys(Boc)-psi/CH0HC0/-0Me.

Připravený surový produkt byl zpracován během 2,0 hodin, při teplotě místnosti, se 6,70 gj 2-( trimethylsilyl)-ethoxykarbonyl-hvdroxy-sukcinimidu; ve ΤΟΟ,Ο mlj Ν,Ν-dimethyIformamiduj za přítomnosti Ν,Ν-diisopropylethylaminu; ( pH = 8,00 ).

Poté byla reakční směs odpařena do sucha, a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, a získaný roztok byl promyt postupně s 2%ním vodným roztokem kyseliny citrónové; ( .kyselina 2-hydroxypropan-1,2,3-trikarboxylová ); s vodouj s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a se solankou.

Po vysušení se síranem sodným, a odpařením rozpouštědla, bylo po následné chromatografií na silikagelu, za použití směsi ethylacetát : heptany;( 1,0 : 1 ,OJ objemové poměry), získáno

9,10 g; Teoc-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-OMe.

Následná transesterifikace byla provedena přidáním ( po kapkách); 2,80 gj Teoc-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-OMeJ ( získaného v rámci předcházející, výše popsané operace); při teplotě místnosti do promíchávané směsi 5,$0 mi; isopropylalkoholu; 27,10 ml; tetrahydrofuranu; a 13,60 ml; 1 ,6M roztoku n-butylliťhia, ve hexanu. Po uplynutí 1,0 hodiny byla reakční směs ochlazena na teplotu 0°c; a po následném přidání 2,50 mlj ledové kyseliny

- 75 • «·»·

«. · · »

octové; byla reakční směs zahuštěna na malý objem; a po zředění s ethylacetátem,. byla 2x promyta s vodou,, a vysušena se síranem sodným. Po filtraci, a odstranění rozpouštědla za vakua, byl získán surový produkt, který byl chromatografován na silikagelu, za použití směsi ethylacetát : heptanj( 1,0 : 1,0J objemové poměry), jako ©iučaíha činidla.

Sylo získáno 2,90 gj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. Teoc-Lys(Boc)-psi/CHOHCO/-O-iPropyl.

TLC; ( chormatografie na tenké vrstvě ):

Rf - θ,53; ( směs heptan j ethylacetát; 1,0 : 1,0J objemo( vé poměry; na oxidu křemičitém.

Stupeň b)

Příprava Teoc-Lys(CO-O-methyl-pryskyřice)-psi/CHOHCO/-OiPropylu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 2,80 gj Teoc-Lys(Boc)-psi/CH0HC0/-0-iPropylu; ( získaného v rámci, předcházejícího, výše popsaného Stupně a); ve 36,0 ml; diethyletheru, bylo přidáno 1 ,80 gj kyseliny paratoluensulfonové. Poté, co byla vzniklá reakční směs ponechána při teplotě 30,S°C v klidu po dobu 2,0 hodin,, byla odpařena, a vzniklý zbytek byl vysušen za vakua; a byl získán Teoc-Lys-psi/CH0HC0/-0-iPropyl.

Ku suspenzi, připravené smícháním 4,20 gj hvdroxymethylově pryskyřice; (BachemJ 1,02 mmolu/g )J v 50,0 ml, směsi acetonitril : dichlormethan; ( 1,0 : 1,0J objemové poměry); a 1,81 mi; triethylaminu, bylo přidáno 3,36 gj N,N-disukcinimidvlkarbonátu; a tato suspenze byla míchána při teplotě místnosti;

• φ · · · ·

9 9 9 9 9

9 9 9 ^99

«* ·«· ha orbitální třepačce; po dobu 2,0 hodin.

Poté byla pryskyřice odfiltrována, a promyta postupně s dichlormethanem, aceionitrilem, a dichlormethanem; ( vždy 3x s každým z uvedených rozpouštědel); 8 následně byla vysušena.

V předcházející, výše popsané operaci_spřipravený TeocLys-psi/CH0HC0/-0-iPropyi;byl rozpuštěn v 50,0 ml, směsi acetonitril : dichlormethan;( 1,0 : 1,OJ objemové poměry); a pH vzniklého roztoku bylo upraveno pomocí triethylaminu na hodnotu 8,0. Tento roztok byl přidán ku pryskyřici; a vzniklá suspenze byla míchána při teplotě místnosti; po dobu 16,0 hodin.

Po následném odstranění rozpouštědle (filtrací, a promytí pryskyřice postupy, popsanými už výše,, byla za V8kua vysušena.

Sylo získáno 5,43 gj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny; t.j. Teoc-Lys(C0-0-methyl-pryskyřice)-psi-/CH0HC0/-0-iPropyl.

Stupene)

Příprava H-Lys (C0-0-methyl-pryskyřice )-psi/CH0HC0/-0-iPropylu

Suspenze, připravená smícháním 2,50 gj Teoc-Lys(C0-0methyl-pryskyřice)-psi/CH0HC0/-0-iPropylu; ( získaného v rámci přědcházejícího, výše popsaného Stupně b); ve směsi (50,0 ml); kyselina trifluoroctové : dichlormethan;( 1,0 : 9J objemové poměry); byla míchána při teplotě místnosti po dobu 45,0 minut.

Poté byla pryskyřice důkladně promyta s dichlormethanem, a za vysokého vakua byla vysušena.

Bylo získáno 2,50 gj žádaného, v nadpise uvedeného H-Lys (C0-0-me thyl-pryskyřice )-psi/CH0HC0/-0-iPropylu.

• 4

4 ··»·	4· 4···	• 4
• 4	4 4 4	• ♦ 4
• ·	4 4«	4 4 4
• ·	4 4 4	4 4 «
♦ 4 ·	»4 4	• 4

Stupeň d)

Příprava Boe-X-Lys (CO-O-qethyl-pryskyřice )-psi/COOHCO/-OiPropylu

V předcházejícím, výše popsaném Stupni c)J připravený H-Lys (CO—O-methyl—pryskyřice )-psi/CHOHCO/-0-iPropyi; byl rozdělen do 4 reakčních nádob; v dávkách po 500,0 mgj s pryskyřice byla poté promyta s 1%ním roztokem Ν,Ν-diisopropylethylaminuj ve směsi dichlormethan : N, N-dime thy lf ormamid; ( 3,0 : 3,0); a dichlormethanem; ( vždy 3x s každou z uvedených složek); a následně bylo přidáno ku pryskyřici 10,0 mi; směsi dichlormethan : N, N-dime thy lf ormamid; ( 3,0 2,0; objemové poměry); a poté stavební blokj Boc-X-0H;( 139,0 mgj, Boc-D-Leu-OH; 139,0 mg; Boc-Leu-OHJ 148,0 mg; Boc-Gln-0H; nebo 159,0 mgj Boc-Phe-OH); 193,0 mg; TBTU = 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethvluronium-tetrafluorboratu; a 105,0 ^uL ; Ν,Ν-diisopropylethy1aminu.

Vzniklá suspenze byla míchána při teplotě místnosti po dobu 90,0 minut; poté bylo rozpouštědlo filtrací odstraněno; a pryskyřice byla promyta se směsí dichlormethan : N,N-dimethylformamid; ( 3,0 : 2,0 ; objemové poměry ); poté s N,N-dimethylformamidem, a nakonec s dichlormethanem;( vždy 3x s každou z uvedených složek); a poté byla vysušena.

Stupeň e)

Příprava H-X-Lys( CO-O-methyl-pryskyřice)-psi/CHOHCO/-OiPropylu

Boc-chránící skupina, byla u 4 různých X-bloků odstraněna za analogických podmínek, popsaných výše v rámci Příkladu ·· • te »··· • · • · • · • ·

- 78 44)} Stupeň c)} pro sejmutí chránící Teoc-skupiny, a bylo získáno 4 x 500,0 mg} H-X-(Lys(CO-O-methyl-pryskyřice)-psi-/CHOHCO/0-iPropylu.

Tato pryskyřice byl8 rozedělena ( 500,0 mg)} do 5 reakčních nádob.

• tet*· ·· · • « • · • · «·· · • · • · • · · • · • t ··

Stupeň f)

Příprava EtSO^-B-X-Lys(CO-O-methyl-pryskyřice)-psi/CHOHCO/-OiPropylu

Zkuplování druhého stavebního bloku EtSO^-B-OH} 27,0 mg)} EtSO₂-Asn-0H} 26,80 mg EtS0₂-D-Leu-0H} 30,80 mg'} ETSO₂« D-Phe-OH} 36,80 mg.} EtSQ -BTals-OH; a 32,40 mg} EtSO₂-D-3-TiqOH} připraveného dle postupů, popsaných výše v rámci Příkladu 41)} byla provedena za stejných podmínek, popsaných výše v rám· ci Stupně d)}se 100,0 mg pryskyřice.

Po zpracování obsahu 20 reakčních nádob} ( získaného ze 4 různých X⁷ bloků·} a 5 růyných B' bloků )} byly příslušné dávky žádaného; v nadpise uvedenéh produktu, za vakua vysušeny.

Stupeň g)

Příprava EtS0₂~B-X-Lys (CO-O-methyl-pryskyřice )-psi/COCO/-OiPropylu

V roztoku, připraveného smícháním 0,18M roztoku 1-hydroxy 1,2-benz jodoxol-3 (1H)-on-1 -oxidu} ve 2,0 ml} dimethylsulf oxidu} a 0,20 ml} dichlormethanu, bylo ponecháno nabobtnat 100,0 mg*, ·· ·· ·· ···· ···· • · • · • ·

• · • · t · • · ··

EtSOg-B-X-Iys (CO-O-me thy 1-pryskyřice )-psi/CHOHCO/-O-iPropylu; a vzniklá reakční směs byla třepána při teplotě místnosti přes noc, a poté bylo rozpouštědlo filtrací odstraněno. Následným promytim s dimethylsulfoxidem, a dichlormethanem;( vždy 3x s každým rozpouštědlem⁵); byl po vysušení získán žádaný; v nadpise uvedený EtSO^-B-X-Lys(CO-O-methyl-pryakyřice)-psi/COGG/-QiPropyl.

Stupeň h)

Příprava EtS0₂-B-X-Lys-psi/C0C0/-0-iPropylu

Ku 100,0 mg; EtSOg-B-X-Lys(CO-O-methy1-pryskyřice5-psi/COCO/-iPropylu; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně g),‘ byl přidán roztok, připravený smícháním kyseliny trifluoroctové; a thioanisoluj ( 2,0 mlj 10,0 : 1 ,0; objemové poměry); a vzniklá reakční směs byla třepána při teplo tě místnosti po dobu 4,0 hodin.

Poté byla pryskyřice ze směsi odfiltrována, promyta 3X s kyselinou trifluoroctovou; a získaný filtrát byl za vakua odpafien do sucha.

Vzniklý zbytek byl propláchnut se 2,0 mi; heptanu; a intenzivně míchán, a poté bylauheptánovávvrstva dekantována. Zmíněná operace se provedla 2x; a surový produkt byl vysušen, a přímo nanesen na sloupec prepararativního Supercosilu C1SDB;

( 21 x 250 mm); za úželem přečištění; a za následujících podmínek

Průtok 20,0 ml/min.; pufr A : 0,1M vodný roztok kyseliny trifluoroctové; pufr B = voda; pufr C = směs acetonitrii : vodaj v poměru 6,0 : 4,OJ objemové poměry.

Gradient;( v závislosti na polaritě produktu):

• ···· ·· ···· ·· ·· · · · · · · ·

3%A - 67%B - 30%C až 3%A- 52%B - 45%CJ ve 40,0 minutách.

UV detekce při 210 nm.

Hlavním vrcholům; ( pikům), odpovídající, .žádaná sloučeniny, byly izolovány, a lyofilizovány,, a byly získány přečištěné finální produkty, jak je zobrazeno dále v Tabulce 44).

Tabulka 44)

Charakterizace; ( retenční čas na reverzní fáži vysokovýkonné kapalinové chromatografie (HPCL); a M+H vrchol; ( pík); hmotnostní spektrometrie;( elektrospray); EtSO^-B-X-Lys-psi/COCO/ 0-iPropylu; připraveného ns hydroxymethylové pryskyřici. Podmínky HPCL :

Průtok 1,0 ml/min.; pufr A : vodaj pufr B = směs acetonitril vodaj ( 6,0 : 4,OJ objemové poměry); pufr C = , 0,5M fosfátový pufr J pH 2,10.

Gradient :

0_>.45,0 min; 65%A/15%B/2O%G—>0%A/80%B/20%C.

UV-detekce při 210 nm.

V = psi;

Tabulka 44); publikována na další straně.

• · · · · · • ·

	B
Asn	D-Leu	D-Phe	Nal	D-3-Tiq
EtSO2-B-D-Leu- D/L- LysTlCOCOl-O- iPropyi	Rt = 17.07 min M+H = 536.4	Rt = 27.20 min M+H = 535.6	Rt = 30.89 min M+H = 569.4	Rt = 38.17 min M+H = 619.6	Rt = 33.54 min M+H = 581.4
EtSO2-B-Leu- D/L- LysTqCOCOJ-O- iPropyl	Rt = 17.17 min M+H = 536.4	Rt = 30.78 min M+H = 535.6	Rt = 32.89 min M+H = 569.4	Rt = 37.79 min M+H = 619.6	Rt = 33.60 min M+H = 581.4
EtSO2-B-Gln- D/L- LysT[COCO]-O- iPropyi	Rt - 5.40 min M+H = 551.2	Rt = 15.74 min M+H = 550.4	Rt = 18.05 min M+H = 584.4	Rt = 28.44 min M+H = 634.4	Rt = 21.27 min M+H = 596.4
EtSO2-B-Phe- D/L- LysTfCOCOJ-Oi Pro pyl	Rt = 20.75 min M+H = 570.4	Rt = 33.33 min M+H = 569.4	Rt = 35.18 min M+H = 603.4	Rt = 39.47 min M+H = 653.6	Rt = 35.92 min M+H = 615.6

Příklad 45)

Následující sloučeniny mohou být připraveny za použití postpů, uvedených v předloženém vynálezu ::

CF-jS0₂-D-Cha-Pr°-Lys-psi/C0C0/-0-iPr^opyl

Me SOg-B-Tyr(Me)-Pro-Lys-psi/COCO/-O-iPropy1 n-ButylSO₂-D-Tyr (Me )-Pro-lys-psi/COCO/-0-iPropyl

GF^SC^-D.-Tyr (Me )-Pro-Lys-psi/C0C0/-0-iPropyl

BzlSO₂-D-Tyr(Me)-Pro-Lys-psi/C0C0/-0-iPropyl

Pokračování na další straně.

• · · • · ·

- 82 EtS0₂~D-(p-0Et-Phe)-Pro-Lys-psi/C0C0/-0-iPropyl

EtS0_o-D>Nle-Pro-Iys,psi/C0C0/-iPropyl

EtSG₂-D-Cha-Azt-Lys-p3Í/C0C0/-0-iPropyl

EtS0₂-D-Gha-(N-cyklopentyl-Gly )-Lya-pai/C0C0/-0-iPropyl

EtS0₂-D-Cha-Val-Lya-psi/C0CO/-0-iPropyl

EtS0₂-D-Cha-Pec-Lys-psi/G0C0/-0-iPropyl

EtSO₂-D-Cha-(3,4-dehydro-Pro)-Lya-psi/COCO/-O-iPropyl

EtSG₂-D-Cha-Pro-Lys-psi/C0C0/-8zetidin

MeS0₂-D-Cha-Pro-Lys-psi/C0CO/-8zetidin n-ButylS0₂-I)-Cha-Pro-Lys-psi/C0C0/-azetidin

CF₃S0₂-D-Cha-Pro-Lys-psi/C0C0/-azetidin

BzlSO₂-D-Cha-Pro-Lys-pai/COCO/-a ze tidin /3-(BzlS0₉aniino )-2-oxo-1,2-dihydropyridinyl/-scetyl-Lya-psi/COCO/-azetidin /3- (BzlS0₂8mino )-6-me thyl-2-oxo-1,2-dihydropyridinyl/-ace tyl Ly3-psi/CeC0/-azetidin

MeSO₂-D-Cha-Pro-Acg-pai/C0CG/-0-iPropyl n-ButylS0₂-D-Cha-Pro-Acg-psi/COCO/-0-iPropyl

CP₃S0₂-D-Gha-Pro-Acg-pai/C0C0/-0-iPropyl

BzlS0₂-D-Cha-Pro-Acg-psi/C0C0/-0-iPropyl

E tSOg-D-Tyr(Me)-Pro-Acg-psi/C0V0/-0-iPropy1

MeS0₂-D-Tyr(Me)-Pro-Acg-psi/COCO/-0-iPropyl nButylSO₂-D-Tyr (Me )-Pro-Acg-psi/C0V0/-0-riPropyl

GF^SC^-D-Tyr(Me)-Pro-Acg-pai/COCO/-0-iPropy1

BzlSO₂-D-lýr(Me)-Pro-Acg-psi/COCO/-0-iPropyl

EtSO₂-D-Tyr(Et)-Pro-Acg-psi/COCQ/-0-iPropyl

EtS0₂-D-Nle-Pro-Acg-psi/C0C0/-0-iPropyl

EtS0₂-D-Cha-Azt-Acg-p3Í/C0C0/-0-iPropyl

EtS0₂-D-Cha-(N-cyklopentyl-Gly )-Acg-psi/C0C0/-0-iPropyl EtSO₂-D-Cha-Val-Acg-psi/COGO/-O-iPropyl EtSO₂-D-Cha-Pec-Acg-pai/COVO/-O-iPropyl EtSO₂~D-Gha-( 3y4-dehydro-Pro)-Acg-psi/C0C0/-O-iPropyl EtS0₂-D-Cha-Pro-Acg-psi/C0G0/-azetidin EtSO₂-D-Tyr (Me )-Pro-Acg-p3Í/COCO/-azetidin EtS0₂-D-Tyr(Me)-Pro-Acg-psi/COCO/-NH₂ MeS0₂-D-Chq-Pro-Acg-psi/COVQ/-azetidin n-ButylS0₂-D-Cha-Pro-Acg-psi/C0C0/-8 ze tidin CF₃S0₂-D-Ch8-Pro-Acg-psi/C0C0/-8 ze tidin BzlS0₂-D-Gha-Pro-Acg-psi/C0C0/-azetidin

3-(BzlS0₂-amino )-1 -karboxyme thyl-pyridin-2-on-Acg-psi/COCO/-O i-Propyl/

3-(BzlS0₂-smino)-1 -karboxyme thyl-pyridin-2-on-Acg-psi/COCO/ažetidin^

3- (BzlSOyamino) -1 -karboxyme thyl-6-me thyl-pyridin-2-on-Acg-psi /C0C0/-0-iPropyl

3-(BzlS0₂-8mino)-1 -karbixyme thyl-6-me thyl-pyridin-2-on-Acg-psi /COCO/-azetidin

Biologická působení sloučenin uvedených v předloženém vynále zu byla stanovena následujícími testovacími metodami :

• 999 9 99 9999 99 99

9 « 9« 9 9 « 9 · • 9 999 99«9 • 9 999 9999 • •99 99 9 99 99

I. Antithrombinové stanovení

Thrombin'. ( Faktor Ila), je faktor koagulační kaskády.

Antithrombinová účinnost sloučením uvedených v předloženém vynálezu byla stanovena spektrometrickým měřením rychlosti hydrolýzy chromogenického substrátu S-223Q*, vyvolané s thrombinem.

Tato metoda pro stanovení antithrombinové účinnosti v systému pufrů byla použita pro stanovení IC^-hodnoty testované sloučeniny.

Testovací prostředí ::

tromethamin-NaCl-polyethylenglykolový 6000 ( TNP) pufr;

Referenční sloučenina ::

125S1; ( Kabi )J

Mehikulum ::

TNP pufe·

Solubilizace může být docílena pomocí přidaného dimethylsulfoxiduj methanolu; ethanolu; acetonitrilu; nebo terc.-butyl alkoholu,, které nevykazuji v koncentracích do 2,,5%; ve finální reakční směsi; nežádoucí efekty.

Postup z

• χ)

Reagencie :

1, Tromethamin-NaCl (TN) pufr;

Složení pufru ::

Tromethamin ( Tria) Chlorid sodný vode až do množství pH roztoku se nastaví při chlorovodíkové ( 10 mmol”

6,.0.57 gj (5G mmolu )

5>, 844 g*, (100 mmolu )

1,0 litru teplotě 37,O°C; pomocí kyseliny ); na hodnotu 7,-401 . TNE. pufr

Polyethylenglykol 6000, je rozpuštěn v. TNI pufru, až do požadované koncentrace 3,0g.1¹

3. Roztok S-2238

Jedna ampule s obsahem 25,0 mg S-2238;.( Kabi Diagnostika;

Švédsko), se rozpustí ve 20,0 mi; TNI pufru tak, aby se socílila —1 —1 koncentrace 1,,25 mgj ml ; (( 2,,0 mmolu. 1 ).

4. Roztok thrombinu

Humánní thrombinj( 16.000 nKat-ampule”¹; Centraal Laboratorium voor Bloedstransfusie;.Amsterdam; Holandsko); se rozpustí v TNP pufru*, a získá se zásobní roztok o koncentraci 835 nKat.ml”¹.

Bezprostředně před použitím se tento roztok maředí s TNP pufrem na žádanou koncentraci 3,-34 nKat.ml”¹.

• · · · • · · · • · • * · » · 9 *

χ) = všechny použité složky jsou analytické kvality; pro vodné roztoky je použita ultračistá voda ( Milli-Qkvalita);

• · · • · · · • * ·

999 9 99

Příprava testovaných a referenčních roztoků sloučenin.

Testované, a referenční sloučeniny jsou rozpuštěny ve vodě ( Mill-Q ); s cílem připravit zásobní roztok o koncentraci 1 Cr“2 mol.l~\

Každá koncentrace je postupně naředěna s vehikulem na koncentrace ICf^j 1O~⁴; a 10^ mol.i“¹. ^aředěné roztoky, včet ně zásobního roztoku, jsou použity při stanovení ; ( finální koncentrace- v reakční směsi jsou případně 3x10 * 10 , x io⁴; io‘⁴; 3 x ίο’⁵;, 10“⁵; 3 χ ίο⁶ _a 10⁶ moi.i~¹.

Postup:

Do jamek mikrotitrační destičky se při teplotě místnosti alternativně napipetuje 0,075 mi; a 0,025 mi; roztoku testované; nebo referenční sloučeniny; a tyto roztoky se po případě naředí s 0,115 mi; a 0,0165 mi; TNP pufru.

Do každé jamky se přidá 0,030?ml roztoku S-2238; destička se předehřeje,, a předinkubuje za třepání v inkubátoru;

( Amersham); při teplotě 37,O°c; po dobu 10,0 minut.,

Následující předinkubace hydrolýzy S-2238 je nastartována přidáním 0,030 ml roztoku thrombinu do každé jamky. Destička je inkubována ( za třepání po dobu 30 sekund); při teplotě 37, ,0°C.

Po uplynutí 1,0 minuty inkubace, se každé 2,0 minuty změří absorbance ( extinkce), /.každého vzorku při vlnové délce 405 nmj v časovém období 90 minut;, za použití kinetického odečí• · ·

- 87 tacího zařízení mikrotitračních destiček ( Twinreaderrplusj ( Flow Laboratories ).

Všechny údaje jsou shromážděny v osobním počítači IBIVF; za použití systému LOTUS-ffiEASUSE. Pro každkou koncentraci sloučeniny ( vyjádřenou v mol.l’\ reakční směsi); a pro slepou absorbanci, je absorbance vynesena graficky v závislos ti na reakčním čase v minutách»

Zhodnocení výsledků.

Každá finální koncentrace maximální absorbance byla propočtena z grafického záznamu. Hodnota IO^q í ( finální končen trace vyjádřená v /umol.1“¹; vykazující 50%ní inhibici maxima absorbance slepého měření), byla vyhodnocena za použití logaritmické transformační analysi; dle Hafnera se sp.; (Arzneim. Forsch./Drug Res.; 27(IlP, 1871 - 1872*,/1977/.

IC^Q-hodnoty sloučenin uvedených v pžedloženém vynálezu jsou uvedeny v následující Tabulce:

Antithrombinová účinnost s

P ř í k. 1 a d. ::	£θΕ-/Ύ ( /Umol»1 )
4	0*09
24	0,01
38	0,11
40	0-,.02

• · · ♦ • · · ♦

EL. Stanovení účinnosti vůči Faktoru Xa

Aktivovaný Faktor x;(Xa)J je faktor, vyskytující se v koagulačni kaskádě.

Účinnost sloučenin,, uvedených v předloženém vynálezu, vůči působení Faktoru Xa, byla stanovena spektrometr!ckým měřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu S-2222J vyvolané s thrombinema.

Tato metoda pro stanovení účinnosti vůči působení Faktoru Xá,_; v systému pufrů, byla použita pro stanovení hodnoty testované sloučeniny.

Z obecného hlediska byl následující postup, a podmínky stanovení,, analogické s výše popsaným stanovením antithrombino vé aktivity. Rozdíly jsou uvedeny dále.

Referenční sloučenina ::

benzamidina

Véhikulum :

TNP pufr.

Solubilizace může být docílena pomocí přidaného dimethyl sulfoxiduj methanoluj ethanolu; acetonitrilu; nebo terč.-butyl alkoholuj bez výskytu nežádoucích efektů,, v koncentracích až do 1,0%; ( pro dimethylsulfoxid); a 2,50% ( pro ostatní rozpouštědla); ve finální reakční směsi.

Postup z

- 89 • ···♦ ·9 ···· «» *· 9 9 9 · · · * · « · · * · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 · · 9 · » • X)

Re a. gen c i e^A/:

3. Roztok S-2222

Jedna ampule a obsahem 15,0 mg·, S-2222J ( Kabi Diagnostice; Švédsko); se rozpustí v 10,0 mlj vody tak,, aby se docílila koncentrace 1,5 mgj ml ¹; ( 2,0 mmolu.1 ¹);

4. Roztok Xa

Hovězí Faktor Xa;( human); (71,0 nKat.ampule”¹J( Kabi Diagnostice )J se rozpustí v 10,0 mi; TNP pufru; a poté se ještě dále naředí se 30,0 mi; TNP pufru tak, aby se docílila koncentrace 1,77 nKat.ml”¹.

Naředěný roztok musí být čerstvě připraven.

Postup :

Místo roztoku S-2238;( stanovení antithrombinové účinnosti), se v rámci tohoto stanovení přidá výše zmíněný roztok do každé jamky.

Stanovení účinnosti vůči působení Faktoru Xa

Příklad :	XG50 ( umol.1”1)
1	0,64
5	0,28
28	0,02

• ·*·J *····· ·· φφ ♦ · « · * · φ · · * • · · * · φ 4 I I * φ · φ Φ · · · « » · * * · · · · · « · • · * · · · * » » 9 9

III» Stanovení účinnosti vůči působení Faktoru Vlla/tkáňovému faktoru

Vaskulární poškození vyvolává serie tvorby enzymatických budících reakcí, vedoucích bezpodmínečně ku vzniku fibrinového gelu v místě poškození. Prvotní enzamatická budící regkce zahrnuje tvorbu účinného Faktoru Vlijí VIIa)J z proenzymu Faktoru VII.

Tato aktivační reakce probíhá dle dosud neznámého mechanismu. Jedna z hypothes je stanovena na předpokladu, že malé množství Faktoru XaJ přítomná v plasmě, se vážou ku membránově vázanému proteinu, tkáňového faktoru (TF')J t.j. proteinu,který není normálně v kontaktu s krví, který s ní ale přichází do styku při poškození,,a tak tento komplex membránově vázaného tkáňového faktoruj a Faktoru XaJ aktivuje Faktor VII.( viz odkaz 1 ) »

Aktivovaný Faktor VII je rovněž vázán ku membránově vázanému faktoru, a tento vnitřní, tenázový komplex, následně konvertuje Factor XJ na Faktor Xa»

Thrombóza vzniká tam, kde je nedostatečná kontrola kosguleční reakce. Jeden ze spůsobů, jak obnovit kontrolu, spočívá v inhibici základních koagulačních enzymů, jako ns příklad komplex membránově vázaného tkáňového faktoruj a Faktoru Vila. Protože komplex inhibitorů VIlaJ nebo Vlla/tkáňového faktoru, bude mnohem pravděpodobněji inhibovat rovněž tenázový komplex,, mohou být inhibitory tohoto komplexu rovněž zjištěny jako determinující inhibici VIlaJ nebo VIIa/TFj testovanými sloučeninami.

Je popsán postup stanovení, kterým lze zjistit inhibiční účinnost sloučenin vůči působení komplexu VIIa/TF. Testované sloučeniny jsou smíchány v různých koncentracích s Faktorem VII©; a tkáňovým faktorem (TF)J a s chromogenním substrátem* o kterém je známo, že je štěpen mnohem lépe s TF-vázaným na VIlaJ než volným Vila.

• »««· 99 ΦΦΦΦ ΦΦ φφ

ΦΦ «ΦΦ **11* • φ φφ· « < 9 <

φ φ φφφφ · φ φ > φ • Φ 9 9 9 φφφφ

ΦΦΦΦ ΦΦ · φ>Φ 99

Probíhající amidolytická reakce je kontinuálně monitorována na odečítacím zařízení mikrotitračních destiček.

Inhibiční účinnost hodnocených sloučenin je vyjádřena v I©5Q>»ve formě koncentrace sloučenin, vykazujících po 90,0 minutách od nastartování reakce,* 50%ní inhibici amidolytické reakce.

Reagencie :

Hepes pufr

Desetkráte koncentrovaný Heps pufr .se připraví rozpuštěním 29,40 gj dihydrátu chloridu vápenatého; 47,66 gj Hepes =

4-(2-hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonová kyselina; 87,66 g'_t chloridu sodného; a 30,0 g; pólyethylenglykoluj( PEG); molekulová hmotnost = 6000; v 1.000 mi; dvakráte destilované vody.

$akto připravený roztok se zahřeje na teplotu 37,0°c; a pH pufru se nastaví pomocí 10 molárního roztoku hydroxidu sodného, na hodnotu 7,40.

Koncentrovaný roztok pufru se skladuje při teplotě 4,0°c; a za těchto podmínek je stálý po dobu nejméně 2 měsíců.

Před použitím je pufr naředěn dvakráte destilovanou vodou 1 až 8x tak, aby se získala v jamkách konečná koncentrace (viz postup stanovení), 20 mM chloridu vápenatého; 20 mM Hepes pufru,* 150 mM chloridu sodného; a 0,30% PEG 6000.

Jestliže jsou příslušné sloučeniny rozpuštěny a zředěny ve 2x destilované vodě; nebo v jiném vehikulu; může být v případě nedostatečné rozpustnosti Hepes pufr zředěn až 6x tak, aby při stanovení byla zachována stejná iontová síla.

- 92 • 9999 9* ···♦ ·· 9« *· · · 9 9 9999 • 9 9 9 9 9 9 9 « • 9 φ 9 9 9 99999

9 9 9 9999

9999 99 ♦ *9 99

Rekombinovaný humánní Faktor Vila

Rekombinovsný humánní Faktor Vila lze získat od firmy American Diagnostice} Inc»} Greenwich} CT.

každá ampulka obsahuje 1,20 mg} rekombinovaného humánního Faktoru Vila} který se lyofilizuje z pufru, složeného z 10,0 mM glycylglycinuj 50 mM' chloridu sočného} 10,0 mM chloridu vápenatého} 30,0 mg/ml} mannitoluj 0,1% TweenuJpH 5,50,

Obsahy každé z těchto ampulek se rozředí se 2,0 ml} 2x destilované vody, dle návodu výrobce. Takto získané 2,0 ml}

1,2 x 10 , zásobního roztoku, jsou rozděleny do menších βοάϊl£,j;teré jsou skladovány při teplotě minus 30,0°C.

Za těchto podmínek jsou vzorky Vila stálé po dobu nejméně 6 měsíců..

Rekombinovaný humánní tkáňový faktor .

Rekombinovsný humánní tkáňový faktor lze získat od firmy American Diagnostice Inc.} Greenwich} CT.

Každá ampulka obsahuje 25,0 /Ug} rekombinovsného humánního tkáňového faktoru ( nelipidovanéhoj molekulová hmotnost = 35.000 Daltonů)} který se lyofilizuje z 1,0 ml} pufru Tris/ kyselina chlorovodíková}( pH 8,0 )} složeném ze 150,0 mM chloridu sodného} 200,0 mM mannitoluj a 10,0 ml® CHAPSJ (steroidní derivát používaný pro solubilizaci membránových proteinů} viz Merck Index )►

Obsahy každé z ampulek jsou naředěny s 1,0 ml} 2x destilované vody, dle návodu výrobce. Takto získaný 1,0 ml} 7,14 x 1θ”^Μ, zásobního roztoku, se rozdělí do menších podílů, které jsou skladovány při teplotě minus 30,0°c.

Za těchto podmínek jsou vzorky Vila stálé po dobu nej. méně 6 měsíců.

- 93 ft ftftftft »* · · ft · ·· ftft *j .· í ; ; i í • · 4«·· #· ft·* ·· *·· ««ft· •«>4 «· » ··

Pefachrom Vila

Pefachrom Vila - CH^SO -D-Chs-but-Arg-pRš-AcOH; ( molekulová hmotnost 670,.80), se získá od firmy Pentapharm Ltd.; Basilej,, Švýcarsko; ve formě ampulí, obsahujících 10,0 ^umolu zmíněného chromogenního substrátu»

V den, kdy má být experiment prováděn, rozpustí se obsah ampulky ve 8,33 mlj 2x destilované vody,,a získá se 1,2 mlolární roztok Pefachromu Vile» Zbytek tohoto roztoku se skladuje při teplotě minus 40,0°c; a za uvedených podmínek je stálý nejméně po dobu 6 měsíců.

Roztok rekombinovaného tkáňového faktoru/TF/rekombinovaného Vila

V den, kdy má být experiment prováděn, se hluboce zmrazený vzorek 1,2 x 10“^M, roztoku rekombinovaného Vllaj a hluboce zmrazený vzorek rekombinovaného humánního tkáňového fakto—7 * *7 ruj ( 7,14 x 10 '); rozmrazí; a rozmražený 7,14 x 10 roztok rekombinovaného humánního tkáňového faktoru (TF) se zředí na koncentraci 4 x 1O⁷MJ a poté se 30,0 ,ul tohoto roztoku, smí^J t chá s 1,0 yul rozmraženého roztoku VIIaJ( 1,2 x 10 )J a se 449,0 /UlJ Hepes pufru. Získá se roztok Hepes pufru,, obsahující 25 ml, rekombinovaného Vila; a 25,0 nM, rekombinovaného tkáňového faktoru.

Množství 480,0 yul roztoku TF/VIIaJ postačuje pro stanovení inhibice 8 roztoků jedné testované sloučeniny.

N-násobek tohoto množství postačuje pro stanovení Ιδ^θ* N-počtu testovaných sloučenin.

- 94 • ·«·« 99 9999 99 99

9 9 9 9 9 » 9 · : .· ,: : .· .: :: :

• · 9 · · 9 9 9 ·

9 9 99 9 9 9 9 9

Příprava testovaných sloučenin

Zásobní roztok ( 5 x 10^); testovaných sloučeniny, se získá jejich rozpuštěním v Hepes pufruJ( roztok A).

Z tohoto roztoku se připraví 7 dalších roztoků v končen·?· tracích 1,67 x 10^MJ ( roztok B)J 5,56 x IO^SíJÍ roztok C, ); 1,85 x 10’⁴m; ( roztok L ); 6,17 x 10“^M^r; ( roztok E ); 2,06 x 1 0~⁵m;, ( roztok E ); 6,86 x 10⁶m;( roztok G ); a 2,29 x 10^⁶m; ( roztok H)J naředěním každého z výše zmíněných roztoků faktorem 3 v Hepes pufru.

Uvedená serie roztoků se připraví pro referenční sloučeninu Org-34..593J a rovněž pro každou z N-1 testovaných sloučenin.

Je-li uvažována mnohem výhodnější varianta, lze připravit další soubor roztoků s rozdílnými koncentracemi sloučenin.

Postup

Sloučeniny jsou rozdělovány sloupec po sloupci v mikrotitrační destičce, a jeden sloupec osmi jamek je rezervován pro serie neinhibičních reakcí. Lo všec£r C'N + 1) x 8 jamek se napipetuje 100,0 ^ul f|epes pufru, pomocí osmičlenné kalibrované pipety.. V tomto případě značí N- počet různých testovaných sloučenin,, včetně referenční sloučeniny Org-35.593.

Poté se do všech (N + 1 ) x 8 jamek; určených pro testovanou sloučeninu, a slepé';j?eakce; přidělí pomocí osmičlenné kalibrované pipety, ku předloženým 100,0 ^ul ^Hepes pufru;

50,0 _/Ui; roztoku 1,2M Pefachromu Vila.

Poté se 50,0 /Ul z každého a 8 roztoků prvé, druhé, třetí, až n-té sloučeniny, smísí v sestupném pořadí koncentrací s

- 95 • frfr·· ·· 9··9 99 ·· « 99 9 9*99 • · 999 9999 • · 9 · 9 9 99 99 9 ·· 999 9999 ··· * ·· 9 99 99 obsahem prvé, až osmé jamky (H)-sloupců 1, 2,3, po případě až N tak, aby v jednom sloupci byla umístěna jedna sloučenina v sestupném pořadí, od nejvyšší ao nejnižší koncentrace sloučeniny. Nakonec se do každé z 8 jamek; N+1 sloupce, určeného pro serie slepých testů, přidá 50*0 ^ul Hepes pufru.

Poté, co byla celá destička tímto způsobem připravena, třepe se po dobu 1,0 minuty v kombinované aparatuře, skládající se z třepačky mikrotitračních destiček, a inkubátoru; (Amersham); a roztoky se při inkubaci,, probíhající po dobu 10 minut; vyhřívají ve stejmém zařízení;.' na teplotu 37,O°C.

Reakce jsou nastartovány přídavkem 50,0/UlJ roztoku 25,0 nM VIIa;/25,O nM TFJ předehřátému na teplotu 37,θ°0, do každé z (N + 1) x 8 jamek* pomocí osmičlenné kalibrované pipety.

Poté, co je destička třepána po dobu 30 sekund* je přenesena do tepelně regulovaného odečítacího zařízení mikrotitračních destiček; a absorbance obsahu každé jamky se odečítá při 405 nmj v jednominutových časových intervalech, po dobu 90',0 minut·

Údaje o sbsorbanci jsou shromážděny v systému LOTUSU 2.3., vložené^ do osobního počítače; napojeného na kinetické odečítací zařízení.

Vyhodnoce mí ( Konečné) absorbance* měřené běhe® časového období 90 minut, jsou korigovány vzhledem ku slepým absorbancím, zjištěných na začátku testu odečtením příslušné prvé hodnoty absorbance; měřené 1,0 minutu po nastartování reakce.

Korigované konečné absorbance* odečtené za přítomnosti, ( Abs/I/); a absence (Abs/0/); testované sloučeniny* jsou převedeny na logaritmické hodnoty propočtením +log(Abs/0//Abs/I/)-1 *_t) ·· ♦ φ φφφφ • · · φ • φ φ φ

- 96 - ’·· *

Φ· φφ • φ Φ Φ

Φ · · Φ

Φ Φ φ · • Φ Φ Φ • Φ ΦΦ pro každou koncentraci (i) testované sloučeniny.

Tyto logaritmické hodnoty jsou graficky vyjádřeny ve srovnání s -logaritmickými koncentracemi testované sloučeniny.

Takový logaritmický graf obvykle vyjadřuje lineární vztah mezi 20% a 80% inhibice konečné absorbance.

Hodnota pI©₅₀ je definována jako -logaritmus ( koncentrace v Μ), testované sloučeniny,, pro kterou se logaritmická hodnota rovná nule* Tato hodnota je propočtena lineární regresí loga ritmu;, vs. vztahům -logaritmus(I)J výhodně kolem logaritmických hodnot nula*

V případě, že testovaná sloučenina je tak účinná vůči VIIa/TF; že ρΙΟ^θ musí být propočtena extrapolací, místo interpolací, poté je nejlépe připravit další soubor ředění testované sloučeniny,, a stanovení opakovat*

Toto stanovení výpočtu hodnot ρΙΟ^θ je popsáno Hafnerem se sp.J ( viz literární odkaz 2).

Příslušná ie_5Q je propočtena jako 10-P^Ie?0. _θ v molárních hodnotách*

Kvantitativní požadavky :

Pro stanovení ΙΟ^θ se vyžaduje cca 1,0 mg; testované sloučeniny

Referenční sloučenina:

Jako referenční sloučenina může být použita sloučenina, označená kódem Org-34.593‘,( PPACK). Pro uvedenou sloučeninu bylo stanoveno ⁼ 3 x 10 ^ř.

• φφφφ φφ φφφφ φφ φφ φ φ φ φ φ · φφφφ • φ φφφ φ φ · φ • φ φ φ φ φ φφφ»· .· φ φφφ · φ · φ φφφ ♦ «φ φ φφ φφ

Odkazy na odbornou literaturu :

1) Thrombosis and HaemostasisJ 66(1); str.67 - 79JO991 )J The structural biology of expression and function of Tissu FactorJ autor Edgington T.S.., se sp.

2) Arzneim^Forsch./Drug Research; 27J 1871 - 1873^(1977); Mathematical analysis of concentrati.on response relationshipsj autor Hafner D. se sp.

Jako jeden z hlavních ukazatelů hodnocení účinnosti vůči působení FaktorVIIa/ tkáňový faktor, u sloučenin, uvedených v pžedloženém vynálezu,jsou v následující Tabulce publikována —5 proceňte inhibice, při koncentraci 1 x 10

Pro stanovení následujícíh procentických obsahů, byly pou žity postupy, popsané výše.

Zmíněná Tabulka publikována na další straně »·»1

- 98 • 9 9 9 9 · 9 9 9 ♦ • 9 999 99*·

9 9999 9999 9

99 9 9999

999 9 999 99 99

Účinnost vůči působení Faktoru Vila/ tkáňovému faktoru c

( Procenta inhibice při koncentraci 1 χ 10³ M )

Příklad:	procenta inhibice (%)
44) EtSG^-D-Phe-Leu-Lys-psí/GOCQ/-O-ÍPropyl	98
44) EtSG^-Asn-Leu-Lys-psi/GQCO/-0-iPropyl	56
44) EtS02-D-2-Tiq-Phe-Lys-psi· /C OC O/-O-iPropy1	91i
44) EtSO2-D-Leu-Gln-Lys-psi/GOCO/-O-ÍPropyl	94

·· ···♦

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1.

   Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I

   R¹SO₂-B-X-Z-C(O)-Y kde

   R¹ znamená R²OOC-(CHR²)m- nebo R²NH-CO-(CHR²)m- nebo se volí ze skupiny C^^alkyl, C₂.₁₂alkenyl, přičemž tyto skupiny jsou popřípadě substituovány C₃.₁₂-cykloalkylovou skupinou, C^alkoxyskupinou, OH, COOR², CF₃ nebo halogenem, nebo C₆.₁₄aryl, C₇.₁₅aralkyl a C₈.₁₆aralkenyl, v nichž jsou arylové skupiny popřípadě substituovány C^alkylovou skupinou, C₃.₈cykloalkylovou skupinou, C,.₆alkoxyskupinou, OH, COOH, CF₃ nebo halogenem, m znamená celé číslo 1, 2 nebo 3,

   R² nezávisle znamenají vodík, C₁.₁₂alkyl, C₃.₈cykloalkyl, C₈.₁₄aryl nebo C₇.₁₅aralkyl, přičemž arylové skupiny jsou popřípadě substituovány C^alkylovými skupinami, C^galkoxyskupinami nebo atomy halogenu,

   B znamená chemickou vazbu, zbytek aminokyseliny obecného vzorce -NH-CH/(CH₂)_pC(O)OH/-C(O)- nebo jejího esteru beno derivátu, v němž p znamená celé číslo 1, 2 nebo 3, Gly, D-1-Piq, D-3-Piq, D-1-Tiq, D-3-Tiq, D-Atc, Aic nebo zbytek L- nebo Daminokyseliny s hydrofobním, bazickým nebo neutrálním postranním řetězcem,

   X znamená zbytek aminokyseliny s hydforobním postranním řetězcem, zbytek glutaminu, šeřinu, threoninu, cyklické aminokyseliny, popřípadě obsahující další heteroatom ze skupiny N, O nebo S a popřípadě substituovaný substituentem ze skupiny C^g. alkyl, C^.alkoxyskupina, benzyloxyskupina nebo oxoskupina, nebo znamená X kyselinu 2-aminoisomáselnou, -NR²-CH₂-C(O) nebo fragment obecného vzorce r \

   -NH-CH N-CH₂-C(O)-NH

   O

   100

   • »·♦· 9» 999» • 9 99 • 9 • 9 · 9 9 * 9 • 9 • 9 ♦ 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9· 9 99 99

   kde n znamená celé číslo 2, 3 nebo 4,

   W znamená CH nebo N a

   R³ znamená atom vodíku, C^alkyl nebo fenyl, tyto skupiny jsou popřípadě substituovány hydroxyskupinou, C.,.₆alkoxyskupinou COOH, COOC_V6alkylovou skupinou CONH₂ nebo halogenem,

   Z znamená zbytek lysinu nebo 4-aminocyklohexylglycinu,

   Y znamená -NH-C^galkylen-CgHg, kde fenylová skupina je popřípadě substituována C^galkylovými skupinami,

   C^galkoxyskupinami nebo atomy halogenu, nebo Y znamená -OR⁴ nebo -NR⁵R⁶, kde R⁴ znamená H, C²'⁶alkyl nebo benzyl a R⁵ a R⁶ nezávisle znamenají Η, Ο,.θ alkoxyskupinu nebo C^galkyl, popřípadě substituovaný atomem halogenu, nebo tvoří R⁵ a R⁶ společně C₃.₆alkylenovou skupinu nebo tvoří R⁵ a R⁶ spolu s atomem dusíku, na nějž jsou vázány cyklickou skupinu obecného vzorce kde

   V znamená O, S nebo SO₂, jakož i prekursory těchto látek a jejich farmaceuticky přijatelné soli.
2. 2. Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I podle nároku 1, v nichž Z znamená zbytek lysinu.
3. 3. Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, v nichž X znamená zbytek cyklické aminokyseliny, aminokyseliny s hydrofobním postranním řetězcem, zbytek glutaminu, šeřinu, threoninu, -NR²-CH₂-C(O)- nebo fragment obecného vzorce

   -NH-CH _z(CH₂)_n^

   N-CH₂-C(O)- kde R³ znamená atom vodíku, C^alkyl nebo fenyl.

   101

   β *999 •9 9999 99 99 • · 9 9 9 9 9 9 V • 9 • 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9» 9 99 99
4. 4. Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 3, v nichž X znamená zbytek prolinu, leucinu, glutaminu, threoninu, fenylalaninu, -NR²-CH₂-C(O)-, kde R² znamená methyl, cyklopentyl nebo cyklohexyl, nebo některý z fragmentů (CH₂)₄ .R³

   Z \

   -NH-CH N-CH,-C(O)-

   N-CH₂-C(O)kde R³ znamená H nebo methyl.

   10
5. 5. Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 4, v nichž B znamená chemickou vazbu nebo zbytek D-aminokyseliny s hydrofobním nebo neutrálním postranním řetězcem.

   15
6. 6. Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 5, v nichž R¹ znamená C^alkyl nebo benzyl.
7. 7. Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 6, v nichž Y znamená -OCH(CH₃)₂.
8. 8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje inhibitor serinové proteázy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 7 spolu s běžnými pomocnými látkami.
9. 9. Inhibitory serinové proteázy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 7 pro použití k léčebným účelům.
10. 10. Použití inhibitorů serinové proteázy obecného vzorce I podle 3q některého z nároků 1 až 7 pro výrobu farmaceutických prostředků pro léčení nebo prevenci chorob, souvisejících s thrombinem.