CN1607949A - 治疗播散性血管内凝血的肽精氨醛和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及播散性血管内凝血。更确切地，本发明涉及播散性血管内凝血的医药干预。本发明提供新的肽基精氨醛、新的更好的治疗DIC的化合物和方法。根据本发明的化合物和方法对游离的与凝块－结合的凝血酶和Xa因子、以及对纤溶酶与纤溶酶原激活物都具有抑制作用。

Description

治疗播散性血管内凝血的肽精氨醛和方法
发明背景
发明领域
本发明涉及播散性血管内凝血。更确切地，本发明涉及播散性血管内凝血的医药干预。
相关技术概述
播散性血管内凝血(DIC)是一种继发的疾病，可以是任意大量原发性疾病的后果(Bick， Disseminated Intravascular Coagulation and Related Syndromes，CRC Press，Boca Raton，(1983))。其特征是血液凝固的全身性活化，导致纤维蛋白的生成和沉积，引起多个器官中的微血管血栓，促使多器官衰竭的形成。Bick等，Clin.Appl.ThrombosisHemostasis  1：3-23(1995)教导了DIC的进一步特征是全身循环的纤溶酶，它是一种综合的蛋白分解酶，能够生物降解多种血浆蛋白质(因子、激素等)，并且能够裂解纤维蛋白原/纤维蛋白，得到纤维蛋白原/纤维蛋白降解产物。这些产物削弱止血，引起出血。
最严重的临床DIC形式是以广泛的凝血蛋白质消耗、显著的纤维蛋白沉积和渗血为特征的。
创伤患者面临DIC的危险增加，尤其当存在大面积的组织损伤(特别是脑)、脓毒病和多器官衰竭时。头部创伤是婴儿与儿童特别常见的DIC原因，因为脑的凝血激酶含量高，头表面积与总的体表面积之比也成比例地增加。
脓毒病可以见于约40％的全部创伤患者中，是全部患者DIC的重要的原发性原因。临床状况因继发性纤维蛋白溶解而恶化，这导致FDP(纤维蛋白原/纤维蛋白降解产物)或“D-二聚物”的生成，它们干扰正常的纤维蛋白生成和血小板功能。
DIC中的纤维蛋白沉积可以引起进一步的器官功能障碍。DIC是急性肾衰的主要原因，也促使多系统器官衰竭。反之亦然，受损伤的器官促使DIC。
目前，唯一获得承认的DIC治疗仅限于尝试减轻原发性病症。若不加以控制，DIC将继续发展，而无视于针对纠正渗血或血栓形成问题的疗法形式。在有些存在显著渗血的情况下，采用新鲜冷冻血浆、血浆组分(例如抗凝血酶III)低温沉淀物和/或血小板浓缩物的替代疗法可以是有帮助的，直至原发性问题得以控制，但是这些疗法因费用高昂而受到限制。肝素在DIC中的用途是有激烈争议的，一般也不用于正在经历创伤问题的患者。
因此，需要新的、更好的治疗DIC的化合物和方法(例如另见de Jonge等人，Drugs  55：767-777(1998)；Levi等，Thrombosis andHaemostasis  82：695(1999))。
发明概述
本发明提供新的、更好的治疗DIC的化合物和方法。已经惊人地发现，对游离的与凝块-结合的凝血酶和Xa因子都具有抑制作用、而且对纤溶酶与纤溶酶原激活物也是抑制性的那些抗凝血化合物能够用于治疗DIC。
在第一方面，本发明提供组合物，包含式(I)肽基精氨醛
               Xaa-Xbb-Arg-H          (I)
其中Xaa代表式(II)α-取代的碳酸(carbonic acid)残基
              Q-CH(R)-CO              (II)
其中Q代表1-3个碳的烷氧基羰基氨基、甲氨基或羟基，R代表7-9个碳的环烷基甲基或5-7个碳的环烷基或1-金刚烷基甲基，
Xbb代表L-脯氨酸或L-氮杂环丁烷-2-羧酸残基，
及其与有机或无机酸所生成的酸加成盐。
在特别优选的实施方式中，这类化合物可以具有下列结构：1(乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H)或2(N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H)或3(D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，D-cHpl-Pro-Arg-H)或4(N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-L-精氨酸醛，N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H)，它们相当于在式(I)中，Xaa代表式(II)α-取代的烷基碳酸残基，其中R分别代表环庚基甲基和环已基，Q分别代表乙氧羰基氨基、甲氨基和羟基，Xbb分别代表L-脯氨酸和L-氮杂环丁烷-2-羧酸残基。
在第二方面，本发明提供药物组合物，包含根据本发明第一方面的抗凝血肽基精氨醛或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在第三方面，本发明提供治疗播散性血管内凝血的方法，该方法包含对患有播散性血管内凝血的患者给以相应于式(I)的抗凝血肽基精氨醛
              Xaa-Xbb-Arg-H          (I)
其中Xaa代表式(II)α-取代的碳酸残基
                Q-CH(R)-CO      (II)
其中Q代表1-3个碳的烷氧基羰基氨基、甲氨基或羟基，R代表7-9个碳的环烷基甲基或1-金刚烷基甲基或5-7个碳的环烷基，
Xbb代表L-脯氨酸或L-氮杂环丁烷-2-羧酸残基，
或其药学上可接受的酸加成盐。
在特别优选的实施方式中，这类化合物可以具有下列结构：1(乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H)或2(N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H)或3(D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，D-cHpl-Pro-Arg-H)或4(N-甲基-D-环已基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-L-精氨酸醛，N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H)，它们相当于在式(I)中，Xaa代表式(II)α-取代的烷基碳酸残基，其中R分别代表环庚基甲基和环己基，Q分别代表乙氧羰基氨基、甲氨基和羟基，Xbb分别代表L-脯氨酸和L-氮杂环丁烷-2-羧酸残基。
优选实施方式的详细说明
本发明涉及播散性血管内凝血。更确切地，本发明涉及播散性血管内凝血的医药干预。本发明提供新的、更好的治疗DIC的化合物和方法。根据本发明的化合物对游离的与凝块-结合的凝血酶和Xa因子、以及对纤溶酶与纤溶酶原激活物都具有抑制作用。
这里引用的专利和出版物反映技术现状，全文结合在此作为参考。这些专利和出版物与本文公开之间的任何不一致都应以有利于本文公开为原则。
在第一方面，本发明提供组合物，包含式(I)肽基精氨醛
              Xaa-Xbb-Arg-H      (I)
其中Xaa代表式(II)α-取代的碳酸残基
                Q-CH(R)-CO       (II)
其中Q代表1-3个碳的烷氧基羰基氨基、甲氨基或羟基，R代表7-9个碳的环烷基甲基、1-金刚烷基甲基或5-7个碳的环烷基，
Xbb代表L-脯氨酸或L-氮杂环丁烷-2-羧酸残基，
及其与有机或无机酸所生成的酸加成盐。
根据本发明这方面的特别优选的实施方式对应于结构1(乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H)：
根据本发明这方面的另一特别优选的实施方式对应于结构2(N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H)：
根据本发明这方面的又一特别优选的实施方式对应于结构3(D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛，D-Hpl-Pro-Arg-H)：
根据本发明这方面的进而再一特别优选的实施方式对应于结构4(N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-L-精氨酸醛，N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H)：
Figure A0282003100122
根据式1、2、3和4的化合物例如是这样制备的，缩合N-或O-保护的2-残基酸组分与L-精氨酸内酰胺，在胍基上用苄氧羰基保护，还原所得三肽内酰胺为被保护的三肽醛，从精氨酸的胍基上除去保护基团，在式(II)中Q＝甲氨基或羟基的情况下也从末端甲氨基或羟基上除去保护基团，分离式(I)肽衍生物，为其与有机或无机酸所生成的加成盐。
由式(I)代表的化合物是以酸加成盐的形式制备和使用的，因为盐形式的稳定性更大。在式(I)化合物的酸加成盐中，碱和酸中的活性是不太重要的，不过出于治疗的目的，优选的是使用药学上可接受的酸加成盐。这类适合的酸的实例包括(a)无机酸：盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸和硫酸，(b)有机酸：酒石酸、乙酸、枸橼酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、扑酸和芳基磺酸，例如对-甲苯磺酸。优选的酸加成盐是硫酸盐，尤其是半硫酸盐。
酸加成盐是按常规方式制备的，例如将式(I)化合物的游离碱形式用酸中和。
双残基酸组分可以表示为D-Xaa-Xbb，其中Xaa代表式Q-CH(R)-COα-取代的碳酸残基，其中Q表示1-3个碳的烷氧基羰基氨基，R是如上所定义的，Xbb代表L-脯氨酸或L-氮杂环丁烷-2-羧酸残基。当Xaa——α-取代的烷基酸——是α-甲氨基或α-羟基酸时，也就是说Q代表甲氨基或羟基，双残基酸组分可以表示为P-D-Xaa-Xbb，其中P代表N-保护基团，例如苄氧羰基(Z)或叔丁氧羰基(Boc)，或者O-保护基团，优选四氢吡喃基(THP)。
用作含有α-氨基或α-甲氨基酸残基的化合物原料的酰基二肽是这样制备的，将α-氨基酸用对应的氯甲酸酯酰化，得到1-3个碳的烷氧基羰基氨基和苄氧羰基氨基酸，然后与L-脯氨酸或L-氮杂环丁烷-2-羧酸偶联，得到D-Xaa-Xbb和Z-氨基酰基Xbb，其进行N-甲基化，得到所需的P-D-Xaa-Xbb。
与Xbb偶联所需的D-Xaa可以有利地这样制备，乙酰化外消旋DL-Xaa化合物，转化DL-乙酰氨基酸为它的甲基酯，再利用酶拆分乙酰基-DL-Xaa-OMe外消旋酯。然后将如此得到的乙酰基-D-Xaa-OMe皂化和脱乙酰化，再转化为所需的N-保护的D-氨基酸。
所需的D-α-羟基酸可以有利地从对应的D-α-氨基酸获得。然后将其转化为它的O-保护形式，再与Xbb偶联，得到所需的P-D-Xaa-Xbb。
在第二方面，本发明提供药物组合物，包含根据本发明第一方面的肽基精氨醛和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
药物制剂包含有效量的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐和已知的药学上可接受的载体、填充材料、稀释剂和/或其他药物赋形剂。
上述载体、稀释剂或填充材料可以是水、醇、明胶、乳糖、蔗糖、淀粉、果胶、硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、各种动物或植物来源的油，此外还有二醇，例如丙二醇或聚乙二醇。
药物赋形剂可以是防腐剂、各种天然或合成乳化剂、分散或湿润剂、着色材料、矫味剂、缓冲剂、促进崩解的材料和提高活性成分生物利用度的其他材料。
本发明的药物组合物可以制成通常的制剂，例如口服组合物(经口给药，例如片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、锭剂或颗粒剂)以及肠胃外组合物(避开胃肠系统给药的药物，例如注射剂、输注剂、栓剂、硬膏剂或软膏剂)。
在第三方面，本发明提供治疗患有播散性血管内凝血的患者的方法，该方法包含对患有播散性血管内凝血的患者给以相应于式Xaa-Xbb-Arg-H(I)的肽基精氨醛或其药学上可接受的酸加成盐，其中Xaa和Xbb是如上所定义的。肽基精氨醛也指肽基精氨酸醛衍生物。
按照这方面发明，本发明提供治疗播散性血管内凝血的方法，该方法包含对动物患者——包括人类患者——给以根据本发明的肽基精氨醛。在根据这方面发明的方法中，对体内患有播散性血管内凝血的动物——包括人类——给以治疗有效量的根据本发明的肽基精氨醛达治疗上有效的时间阶段。优选地，这类给药应当是静脉内或皮下方式，最优选静脉内方式。治疗组合物的给药可以利用已知的方法进行，剂量和时间阶段都有效减少DIC的症状或者替代DIC的指标。当全身给药时，治疗组合物的给药剂量优选地足以达到约6μM至约100μM的血液肽基精氨醛水平。优选地，总的剂量将从约0.1mg至约50mg肽基精氨醛每kg体重每天。可能可取的是对个体同时或先后给以治疗有效量的一种或多种本发明治疗组合物，作为单一的治疗方案。
下列实施例打算进一步阐述某些特别优选的发明实施方式，不打算限制发明的范围。除非另有陈述，就下列实验而言，人凝血酶(3,000NIH U/mg)、人白蛋白和人纤维蛋白原是从Sigma Aldrich Kft.(Budapest，Hungary)获得的，人Xa因子(8μg/U)是从Enzyme ResearchLaboratories(Swansea，UK)获得的。APTT试剂来自REANAL(Budapest，Hungary)，PT试剂Simplastin D是从ORGANON，TEKNIKA(Eppelheim，Germany)购买的。
按照IUPAC-IUB惯例使用氨基酸、肽、取代基和试剂的缩写。出现在本申请中的这类缩写如下。Arg＝L-精氨酸，Boc＝叔丁氧羰基，Bzl＝苄基，Chg＝L-环己基甘氨酸，DCHA＝二环己胺，DHP＝二氢吡喃，Eoc＝乙氧羰基，Gly＝甘氨酸，Me＝甲基，MePhe＝N-甲基-L-苯丙氨酸，Moc＝甲氧羰基，Pro＝L-脯氨酸，pNA＝对-硝基苯氨基，TFA＝三氟乙酸，THP＝四氢吡喃基，Tos＝对-甲苯磺酰基，Z＝苄氧羰基，RT＝室温。用在本申请中的不常用氨基酸的缩写有Ada＝金刚烷基-L-丙氨酸，Aze＝L-氮杂环丁烷-2-羧酸，N-Me-D-cHpa＝N-甲基-D-环庚基丙氨酸，D-cHpa＝D-环庚基丙氨酸或(R)-2-氨基-3-环庚基丙酸，D-Hla＝D-环庚基乳酸或(R)-2-羟基-3-环庚基丙酸。
实施例所记录的Rf值是借助薄层色谱法测定的，使用硅胶(DC-Alufolien Kieselgel 60 F254，Merck，Darmstadt)作为吸附剂，展开系统如下。所用系统的编号列在缩写Rf后的括号内。
1   乙酸乙酯
2   乙酸乙酯-正己烷(1∶4)
3   乙酸乙酯-正己烷(1∶1)
4   乙酸乙酯-环己烷(15∶85)
5   氯仿-丙酮(95∶5)
6   乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(960∶20∶6∶11)
7   乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(480∶20∶6∶11)
8   乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(240∶20∶6∶11)
9   乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(120∶20∶6∶11)
10  乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(90∶20∶6∶11)
11  乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(60∶20∶6∶11)
12  乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(45∶20∶6∶11)
13  乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(30∶20∶6∶11)
实施例所描述的容量因子(k’)是利用“Pharmacia LKB AnalyticalHPLC System Two”仪器如下测定的：
柱：LiChrospher RP-18：12μm240×4mm
柱温：环境温度
洗脱剂：溶剂A，0.1％TFA/水，溶剂B，0.1％TFA/乙腈
梯度：0→15min 30→60％B，然后等度的60％B
溶剂流速：1ml/min
检测器：LKB 2141 UV Monitor
波长：214nm
进样器：Rheodyne 7125
进样环管：100μl
泵：2LKB 2148型
控制系统：LKB HPLC Manager
样品浓度：1mg/ml溶剂A
进样体积：25μl
分析时间：40min
酰基精氨酸醛呈现平衡结构，即醛、水合醛和两种氨基环醇形式。在HPLC分析期间，水合醛和一种或两种氨基环醇形式出现两个或三个单独的峰。实施例所述酰基精氨酸醛被描述为两个或三个k’值。
质谱法。FAB正离子化测量是在Finnigan MAT 8430仪器中进行的。将样品溶于间-硝基苯甲醇(NBA)基质，直接引入到离子源中。在肽基精氨酸醛的光谱中，可检测到另外一个分子离子，它是与NBA生成的加成化合物：[M+H]+和[M+H+NBA]+。在实施例中相应地描述FAB光谱数据。ESI正离子化测量是在VG Quattro(Fisons)仪器中进行的。将样品溶于含有1％(v/v)甲酸的乙腈-水(1∶1)混合物，以10ml样品环管引入到离子源中，流速为15-25ml/min。
实施例1
乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛半硫酸盐的合 成
步骤1：乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
将7.85g(20.1mM)叔丁氧羰基-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺(Bajusz等，J.Med.Chem. 33，1729(1990))悬浮在20ml氯仿中，然后在搅拌和冰冷却下加入20ml用HCl气(0.11-0.15g/ml)饱和的乙酸乙酯。借助薄层色谱法监测Boc基团的裂解(Rf(11)＝0.5(游离化合物)；1.0(Boc-化合物))。在反应结束时，将悬液用40ml二乙醚稀释，过滤所生成的晶体，用10ml丙酮和10ml二乙醚洗涤，在减压下经KOH干燥。将所得NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺盐酸盐溶于20ml二甲基甲酰胺，冷却至-20℃，加入到下列混合酸酐中。
将7.12g(20.1mM)乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸(实施例1步骤1)溶于20ml二甲基甲酰胺，冷却至-15℃，然后在搅拌下加入2.23ml(20.1mM)N-甲基吗啉和2.65ml(20.1mM)氯甲酸异丁酯。搅拌10分钟后，加入上述NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺的二甲基甲酰胺溶液，然后加入一定量的三乙胺，以调节反应混合物的pH至8(需要约2.8ml)。将反应混合物在-10℃下搅拌30分钟，然后在0℃下搅拌1小时。然后滤出盐，将滤液用100ml乙酸乙酯稀释。将所得溶液用3×25ml水、10ml 1M KHSO4和3×10ml水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。所得产物经过硅胶柱色谱纯化，使用200gKieselgel 60(0.040-0.063mm)作为吸附剂，乙酸乙酯作为洗脱剂。汇集仅含有纯产物的部分(Rf(1)＝0.60)，在2.0-2.5kPa下蒸发。使蒸发残余物从二异丙醚中结晶。
收率10.84g(86.1％)，Rf(1)＝0.55-0.65
FAB质谱(627[M+H]+)确认了所假定的结构。
步骤2：乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛
将8.02g(12.8mM)乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺(实施例1步骤1)溶于15ml四氢呋喃，然后在搅拌和不超过-50℃的温度下，加入3.6mM LiAlH4的四氢呋喃溶液。借助薄层色谱监测还原的进程，使用溶剂7作为展开溶剂，如果需要的话，加入另一部分LiAlH4。在恒定搅拌和冷却下向该反应混合物滴加0.5M KHSO4，直至达到pH3，然后加入35ml水。所得溶液用2×15ml己烷萃取，然后用3×20ml二氯甲烷萃取。汇集二氯甲烷萃取液，用3×15ml水、15ml冷的5％碳酸氢钠溶液和15ml水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。将蒸发残余物用二异丙醚处理，过滤，在减压下干燥。
收率7.08g(88％)，Rf(8)＝0.40-0.50
FAB质谱(629[M+H]+，782[M+H+NBA]+)确认了所假定的结构。
步骤3：乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛半硫酸盐
将6.91g(11.0mM)乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛(实施例1步骤2)溶于85ml乙醇和11.25ml 0.5M硫酸，然后加入0.7g Pd-C催化剂的14ml水悬液，使混合物在约10℃下氢化。借助薄层色谱监测反应的进程。反应完成后(约15分钟)，过滤催化剂，将滤液在2.0-2.5kPa下浓缩至约7-9ml。将残余物用80ml水稀释，用4×15ml二氯甲烷萃取，将水溶液在20-22℃下放置24小时。将溶液再次用3×15ml二氯甲烷萃取，用离子交换树脂Dowex AG 1-X8(HO-)调节pH至3.5，然后将溶液冷冻干燥。
收率4.90g(82％)，Rf(11)＝0.35-0.45
[α]D 20＝-77.6°(c＝1.018；水)
HPLC：k’＝1.695和2.328
FAB质谱(495[M+H]+，648[M+H+NBA]+)确认了所假定的结构。
原料乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸的合成
步骤A：1-环庚基乙酰基-2，5-二甲基吡唑
将58.6g(375mM)环庚基乙酸[Protiva等人，Collect.Czech.Chem.Commun. 55：1278-1289(1990)]溶于375ml四氢呋喃，冷却至-15℃，然后在搅拌下加入41.3ml(375mM)N-甲基吗啉、49.50ml(375mM)氯甲酸异丁酯，在-10℃下搅拌10分钟后，在-10℃下加入37.85g(393.75mM)3，5-二甲基吡唑的300ml四氢呋喃溶液。继续在-10℃下搅拌30分钟，在0℃下搅拌1小时，在室温下搅拌3小时。然后滤出盐，在减压下蒸发滤液，将残余物溶于900ml乙酸乙酯。将所得溶液连续用3×80ml 1M NaOH、89ml水、3×80ml 1M HCl和水洗涤至中性(合并碱性洗液，酸化，再生出～5.8g，37.1mM环庚基乙酸)。乙酸乙酯溶液经无水Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。所得油性产物被视为340mM 1-环庚基乙酰基-2，5-二甲基吡唑，无需进一步纯化即可用于下一步。Rf(2)＝0.8-0.9(酸：0.3-0.4)。
步骤B：1-环庚基乙醛
向350ml冷却至-30℃的四氢呋喃加入12.83g(338mM)LiAlH4。然后在-25℃搅拌下滴加油性产物(实施例1步骤A)的250ml冷四氢呋喃溶液。借助TLC监测反应。如果需要的话，加入30-40mlLiAlH4的四氢呋喃溶液(3g/100ml)。还原完成后，将冷混合物用6MHCl酸化，用乙酸乙酯(500ml)稀释。水相用乙酸乙酯萃取，合并有机溶液，用水洗涤至中性，经无水Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。所得油性产物是粗的1-环庚基乙醛，含有2，5-二甲基吡唑(DMP)。Rf(2)＝0.7-0.8(DMP：0.25-0.35)。
在搅拌下，向所得油性产物(62.6g)的350ml甲醇溶液加入36.4gNaHSO3的70ml水溶液。将反应混合物在冰箱内保存过夜。滤出沉淀物，用35ml甲醇与7ml水的冷混合物洗涤，然后用二乙醚洗涤，干燥。固形物是亚硫酸氢钠加合物(73.87g，302.38mM，Rf(14)＝0.55-0.65)，将其加入到含有47.7g(450mM)Na2CO3的450ml二氯甲烷与450ml水混合物中。将反应混合物搅拌过夜。分离两相，有机相用二氯甲烷洗涤(2×100ml)。合并有机层，用水洗涤，经无水Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。所得油性产物(36.97g，263.64mM)是纯的1-环庚基乙醛，直接用于下面的反应。Rf(2)＝0.7-0.8。
步骤C：5-环庚基甲基乙内酰脲
在50-55℃搅拌下，向醛(实施例1步骤B)的50％含水乙醇溶液(857ml，3.25ml/mM)加入15.5g(290mM，1.1equiv.)氯化铵、27.87g(659mM，2.5equiv.)碳酸铵和18.9g(290mM，1.1equiv.)氰化钾，继续在50℃下搅拌48小时。滤出沉淀物，用50％乙醇(100ml)洗涤，在真空干燥器内干燥。作为第一批，得到42.26g(206.97mM)产物。从母液中蒸馏出乙醇，残余物用乙酸乙酯萃取(1×250ml，2×100ml)，合并有机溶液，用水洗涤(3×50ml)，经无水Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。将残余物用二异丙醚研制，过滤，干燥。作为第二批，得到3.6g(17.12mM)产物；总共得到45.86g(218mM，82.5％)5-环庚基甲基乙内酰脲。Mp：240.9℃；Rf(6)＝0.73-0.78。
C11H18N2O2分析(210.28)：计算值：C％＝62.83；H％＝8.63；N％＝13.32；实测值：C％＝63.09；H％＝8.67；N％＝13.25.
步骤D：DL-环庚基丙氨酸盐酸盐
在搅拌和温热下，将87g(1.55M)KOH溶于435ml正丁醇，加入45.71g(217.4mM)5-环庚基甲基乙内酰脲(实施例1步骤C)。将所得溶液回流72小时，然后用水稀释，在减压下蒸发。将残余物溶于220ml水，用ccHCl(～130ml)酸化至pH2，在冰箱内保存过夜。滤出沉淀物，用50ml水洗涤，在真空干燥器内干燥。所得产物(106.5g)被视为217mM DL-环庚基丙氨酸，用于进一步的反应。Rf(11)＝0.2-0.3。
步骤E：DL-环庚基丙氨酸甲酯盐酸盐
在0℃与-5℃之间，在搅拌下，将23.65ml(325.25mM)SOCl2滴入217ml甲醇中。然后加入DL-环庚基丙氨酸(217mM，实施例1步骤D)，搅拌24小时。借助TLC监测转化作用，Rf(11)＝0.75-0.85(酯)，0.3-0.4(酸)。当不能检测到未反应的氨基酸时，将反应混合物冷却至-5℃，滴入11.8ml SOCl2，将反应混合物搅拌另外24小时。然后滤出未溶解的盐，用甲醇洗涤(2×50ml)，合并甲醇溶液，蒸发。将残余物重新溶于甲醇，再次蒸发。最后，将残余物用二异丙醚研制，滤出，用二异丙醚洗涤，在真空干燥器内经KOH和P2O5干燥。得到33.68g(142.85mM)DL-环庚基丙氨酸甲酯盐酸盐。Rf(11)＝0.5-0.6；Mp：95.4-96.5℃。
步骤F：乙酰基-DL-环庚基丙氨酸甲酯
在搅拌和冰水浴冷却下，向33.68g(142.85mM)DL-环庚基丙氨酸甲酯盐酸盐(实施例1步骤E)的140ml吡啶溶液在1小时内滴加乙酸酐(16.2ml，171.43mM)。将反应混合物在环境温度下搅拌24小时，然后在减压下蒸发。将残余物溶于300ml乙酸乙酯，用1M KHSO4(3×50ml)和水(3×50ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。将所得油性产物用二异丙醚研制，得到固形物，滤出，用二异丙醚、再用水洗涤，在干燥器内干燥。得到24.36g(100.94mM，70.4％)乙酰基-DL-环庚基丙氨酸甲酯(乙酰基-DL-酯)。Rf(1)＝0.55-0.65；Mp：69-71℃。
C13H23NO3分析(241.332)：计算值：C％＝64.70；H％＝9.61；N％＝5.80；实测值：C％＝64.75；H％＝9.76；N％＝5.85.
步骤G：乙酰基-D-环庚基丙氨酸甲酯(乙酰基-DL-环庚基丙氨酸甲酯的酶拆分)
向8.69g(36mM)乙酰基-DL-环庚基丙氨酸甲酯(乙酰基-DL-酯)(实施例1步骤F)的36ml甲苯溶液加入72ml水和36mg Carlsberg枯草杆菌蛋白酶(VIII型蛋白酶，Sigma)。在pH7.0下进行L-对映体乙酰基-L-酯的酶水解，借助装有3M NaOH的自动滴定仪维持pH7.0。当NaOH的消耗停止时(5.8ml，17.4mM)，将反应混合物用36ml甲苯稀释，分离两层。水相用2×30ml甲苯洗涤。所合并的甲苯溶液含有乙酰基-D-酯，所合并的水溶液含有乙酰基-L-酸的钠盐。
经无水Na2SO4干燥后，在减压下蒸发所合并的甲苯溶液，得到3.8g(15.75mM)乙酰基-D-酯，Rf(1)＝0.55-0.65，直接用于下一步。
将所合并的水溶液酸化，用3×30ml乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯溶液，用水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在减压下蒸发，得到4.0g(17.6mM)乙酰基-L-酸。Rf(7)＝0.38-0.42。
从9.65g(40mM)乙酰基-DL-酯(实施例1步骤F)开始进行相似的制备，得到4.6g(19.06mM)乙酰基-D-酯和4.44g(19.55mM)乙酰基-L-酸。
步骤H：D-环庚基丙氨酸盐酸盐
将7.24g(30mM)乙酰基-D-酯(实施例1步骤G)悬浮在120ml 6MHCl中，回流3小时。分离游离的氨基酸，为晶体。将反应混合物冷却，在冰箱内保存过夜，过滤，用冷水和乙醚洗涤，然后在真空干燥器内干燥。得到5.9g(26.69mM，89％)D-环庚基丙氨酸盐酸盐。Rf(12)＝0.10-0.15；[α]D 20＝-11°(c＝0.4；1M HCl)。
C10H19NO2.HCl分析(221.728)：计算值：C％＝54.17；H％＝9.09；N％＝6.32；Cl％＝15.99；实测值：C％＝54.27；H％＝9.27；N％＝6.30；Cl％＝16.2.
步骤I：乙氧羰基-D-环庚基丙氨酸
向4.43g(20mM)D-环庚基丙氨酸盐酸盐(实施例1步骤H)的20ml二甲基甲酰胺溶液加入5.6ml(40mM)三乙胺和3.95g(21mM)(N-羟基琥珀酰亚氨基)乙基甲酸酯*。在室温下搅拌3小时后，蒸发反应混合物，将残余物溶于40ml乙酸乙酯，用2×30ml 1M KHSO4洗涤，用水洗涤至中性。然后，有机层经无水Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。所得油性产物(4.47g，～17mM)是乙氧羰基-D-环庚基丙氨酸，Rf(7)＝0.85-0.90，直接用于下一步。[α]D 20＝+6.3°(c＝1；甲醇)。
* (N-羟基琥珀酰亚氨基)乙基甲酸酯的制备
将11.5g(100mM)N-羟基琥珀酰亚胺溶于100ml四氢呋喃，冷却至-10℃，然后在搅拌下加入15.4ml(110mM)三乙胺和10.45ml(110mM)氯甲酸乙酯。在室温下搅拌2小时后，过滤混合物，在减压下蒸发滤液。油性残余物在冷却后结晶。将结晶物悬浮在轻质石油醚中，滤出，在真空干燥器内干燥。收率12.78g(68.3％)；Mp：39.4-39.7℃。
C7H9NO5分析(187.15)：计算值：C％＝44.92；H％＝4.85；N％＝7.48；实测值：C％＝44.67；H％＝4.81；N％＝7.27.
步骤J：乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸
将乙氧羰基-D-环庚基丙氨酸(～17mM，实施例1步骤I)的17mlTHF溶液与3.74g(20mM)N-羟基琥珀酰亚胺合并，冷却至10℃，与4.12g(20mol)1，3-二环己基碳二亚胺的约20ml THF溶液合并。将混合物在22℃下搅拌约5小时，然后借助TLC判断活性酯的生成是完全的。
将L-脯氨酸(1.95g，17mM)加入到搅拌着的反应混合物中，继之以加入2.3ml(17mM)三乙胺。将反应混合物在22℃下搅拌约15小时，然后借助TLC确定活性酯的消耗是完全的。过滤反应混合物，滤饼用10ml THF洗涤，蒸发滤液。将残余物溶于30ml乙酸乙酯和30ml水。将水相用2×20ml乙酸乙酯洗涤，用20ml 1M KHSO4酸化，用3×20ml乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯溶液，用水洗涤至中性，经无水Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。一旦用二异丙醚研制，残余物结晶。将该晶体悬液在冰箱内冷却，用轻质石油醚过滤，在真空干燥器内干燥。得到4.2g(11.85mM，70％)乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸。Rf(7)＝0.45-0.55。
C18H30N2O4分析(354.45)：计算值：C％＝60.99；H％＝8.53；N％＝7.90；实测值：C％＝60.14；H％＝8.55；N％＝7.38.
FAB质谱(355[M+H]+)确认了所假定的结构。
实施例2
N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛硫酸盐的合成
步骤1：苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
将3.93g(10mM)叔丁氧羰基-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺(Bajusz et al.，J.Med.Chem. 33，1729(1990))悬浮在10ml氯仿中，然后在搅拌和冰冷却下加入10ml用HCl气(0.11-0.15g/ml)饱和的乙酸乙酯。借助薄层色谱法监测Boc基团的裂解(Rf(11)＝0.5(游离化合物)；1.0(Boc-化合物))。在反应结束时，将悬液用20ml二乙醚稀释，过滤所生成的晶体，用5ml丙酮和5ml二乙醚洗涤，在减压下经KOH干燥。将所得NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺盐酸盐溶于10ml二甲基甲酰胺，冷却至-20℃，加入到下列混合酸酐中。
将4.32g(10mM)苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸(实施例2步骤C)溶于10ml二甲基甲酰胺，冷却至-15℃，然后在搅拌下加入1.12ml(10.1mM)N-甲基吗啉和1.33ml(10.1mM)氯甲酸异丁酯。搅拌10分钟后，加入上述NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺的二甲基甲酰胺溶液，然后加入一定量的三乙胺，以调节反应混合物的pH至8(需要约1.4ml)。将反应混合物在-10℃下搅拌30分钟，然后在0℃下搅拌1小时。然后滤出盐，将滤液用100ml乙酸乙酯稀释。将所得溶液用3×15ml水、6ml 1M KHSO4和3×6ml水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。所得产物经过硅胶柱色谱纯化，使用100g Kieselgel 60(0.040-0.063mm)作为吸附剂，乙酸乙酯作为洗脱剂。汇集仅含有纯产物的部分(Rf(1)＝0.70)，在2.0-2.5kPa下蒸发。使蒸发残余物从二异丙醚中结晶。
收率6.0g(85％)，Rf(1)＝0.65-0.75
FAB质谱(703[M+H]+)确认了所假定的结构。
步骤2：苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛
将5.62g(8mM)苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺(实施例2步骤1)溶于10ml四氢呋喃，然后在搅拌和不超过-50℃的温度下，加入2.25mM LiAlH4的四氢呋喃溶液。借助薄层色谱监测还原的进程，使用溶剂7作为展开溶剂，如果需要的话，加入另一部分LiAlH4。在恒定搅拌和冷却下向该反应混合物滴加0.5M KHSO4，直至达到pH3，然后加入25ml水。所得溶液用2×10ml己烷萃取，然后用3×15ml二氯甲烷萃取。汇集二氯甲烷萃取液，用3×15ml水、15ml冷的5％碳酸氢钠溶液和15ml水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。将蒸发残余物用二异丙醚处理，过滤，在减压下干燥。
收率4.95g(88％)，Rf(1)＝0.20-0.25
FAB质谱(705[M+H]+，858[M+H+NBA]+)确认了所假定的结构。
步骤3：N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛硫酸盐
将4.6g(6.5mM)苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛(实施例2步骤2)溶于65ml乙醇和13.5ml 0.5M硫酸，然后加入0.4g Pd-C催化剂的10ml水悬液，使混合物在约10℃下氢化。借助薄层色谱监测反应的进程。反应完成后(约15分钟)，过滤催化剂，将滤液在2.0-2.5kPa下浓缩至约5-7ml。将残余物用50ml水稀释，用4×10ml二氯甲烷萃取，将水溶液在20-22℃下放置24小时。将溶液再次用3×10ml二氯甲烷萃取，用离子交换树脂Dowex AG 1-X8(HO-)调节pH至3.5，然后将溶液冷冻干燥。
收率2.85g(82％)，Rf(9)＝0.35-0.45
[α]D 20＝-79.6°(c＝1；水)
FAB质谱(437[M+H]+，590[M+H+NBA]+)确认了所假定的结构。
原料苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸的合成
步骤A：N-苄氧羰基-D-环庚基丙氨酸的合成
在0℃下，将D-环庚基丙氨酸盐酸盐(实施例1步骤H)(11.09g，50mM)与40ml THF和40ml水合并。向搅拌着的混合物加入5MNaOH溶液，调至约pH10。向反应混合物加入氯甲酸苄基酯(8.22ml，55.4mM)，同时维持温度为约3℃，根据需要加入5M NaOH维持大约pH10。一旦完成氯甲酸苄基酯的加入，将反应混合物在0℃下搅拌1小时，维持在约pH10下。继续在RT下搅拌过夜，借助TLC(7)检查反应的完成。如果需要的话，向反应混合物加入更多量的氯甲酸苄基酯(1-2×0.75ml，5mM)，同时维持温度为约3℃，加入5M NaOH维持大约pH10。加入叔丁基甲基醚(25ml)，使搅拌着的混合物温热至22℃。分离水相，用第二部分25ml叔丁基甲基醚洗涤。借助TLC检查有机相的成分，如果需要的话将有机相用25ml水反萃取。将水相与25ml乙酸乙酯合并，用浓HCl调至pH2。分离各相，水相用第二部分25ml乙酸乙酯萃取。合并有机相，用20ml 1M KHSO4和2×30ml水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。将蒸发残余物溶于45ml THF，该苄氧羰基-D-环庚基丙氨酸溶液无需进一步纯化即可用于下一步。
步骤B：苄氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸
将实施例2步骤A所得苄氧羰基-D-环庚基丙氨酸的TFA溶液与5.9g(51.24mM)N-羟基琥珀酰亚胺合并，冷却至10℃，与11g(53.3mM)1，3-二环己基碳二亚胺的约25ml THF溶液合并。将混合物在22℃下搅拌约4.5小时，然后借助TLC判断活性酯的生成是完全的。
将L-脯氨酸(5.9g，51.24mM)加入到搅拌着的反应混合物中，继之以加入7.2ml(51.24mM)三乙胺。将反应混合物在22℃下搅拌约15小时，然后借助TLC确定活性酯的消耗是完全的。过滤反应混合物，滤饼用25ml THF洗涤，蒸发滤液。将残余物溶于50ml乙酸乙酯和50ml水。将水相用2×20ml乙酸乙酯洗涤，用20ml 1M KHSO4酸化，用3×40ml乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯溶液，用水洗涤至中性，经无水Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。将残余物苄氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸溶于60ml THF，无需进一步纯化即可用于下一步。
步骤C：苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸
将碘代甲烷(17.95ml，288mM)加入到来自实施例2步骤B的苄氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸的THF溶液中。将该溶液冷却至8℃，伴随着20ml THF冲洗一起转移至搅拌着的60％4.75g(119mM)氢化钠的35ml THF浆液中，同时维持温度低于13℃。将反应混合物在11℃下搅拌24小时。向反应混合物小心地加入1.6ml水，使过量氢化钠分解，同时维持温度低于13℃，控制发泡。将反应混合物猝灭，在22℃下搅拌约20分钟，然后在减压和低于30℃的温度下浓缩至约40ml。向残余物加入水(70ml)，继之以30ml叔丁基甲基醚。分离各相，水相再次用30ml叔丁基甲基醚洗涤。将水性产物相与40ml乙酸乙酯合并，用3M硫酸溶液调至pH2.2。分离各相，水相用40ml乙酸乙酯反萃取。合并有机相，用70ml 5％硫代硫酸钠溶液洗涤。分离各相，将有机相在减压真空下(33-45kPa)浓缩至小体积，同时维持温度低于50℃。将残余物与18.6ml THF和100ml水合并，用环己胺调至pH8.5。将所得浆液在减压(9-33kPa)和25至55℃下浓缩至100ml，调至25℃，用71.5ml水稀释，搅拌约10.5小时。过滤浆液，用水洗涤，在45℃下风干，得到16.72g苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酸环己胺盐(收率63％，从D-环庚基丙氨酸计算)。Rf(8)＝0.55-0.65。
实施例3
D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛半硫酸盐的合成
步骤1：四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
将5.08g(13mM)叔丁氧羰基-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺(Bajusz et al.，J.Med.Chem. 33，1729(1990))悬浮在13ml氯仿中，然后在搅拌和冰冷却下加入13ml用HCl气(0.11-0.15g/ml)饱和的乙酸乙酯。借助薄层色谱法监测Boc基团的裂解(Rf(11)＝0.5(游离化合物)；1.0(Boc-化合物))。在反应结束时，将悬液用25ml二乙醚稀释，过滤所生成的晶体，用7ml丙酮和7ml二乙醚洗涤，在减压下经氢氧化钾干燥。将所得NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺盐酸盐溶于13ml二甲基甲酰胺，冷却至-20℃，加入到下列混合酸酐中。
将实施例3步骤I所得四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酸三乙铵盐(12mM)的溶液冷却至-20℃，然后在搅拌下加入1.6ml(12mM)氯甲酸异丁酯。搅拌10分钟后，加入上述NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺的二甲基甲酰胺溶液，然后加入一定量的三乙胺，以调节反应混合物的pH至8(需要约1.8ml)。将反应混合物在-10℃下搅拌30分钟，然后在0℃下搅拌1小时。然后滤出盐，将滤液用65ml乙酸乙酯稀释。将所得溶液用3×25ml水、7ml 1M硫酸氢钾和3×7ml水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。所得产物经过硅胶柱色谱纯化，使用130g Kieselgel 60(0.040-0.063mm)作为吸附剂，乙酸乙酯作为洗脱剂。汇集仅含有纯产物的部分(Rf(1)＝0.60)，在2.0-2.5kPa下蒸发。使蒸发残余物从二异丙醚中结晶。
收率5.0g(7.8mM，64％)，Rf(1)＝0.6
FAB质谱(640[M+H]+)确认了所假定的结构。
步骤2：四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛
将4.8g(7.51mM)四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺(实施例3步骤1)溶于15ml四氢呋喃，然后在搅拌和不超过-50℃的温度下，加入3.6mM氢化铝锂的四氢呋喃溶液。借助薄层色谱和8号展开溶剂监测还原的进程，如果需要的话，加入另一部分氢化铝锂。在恒定搅拌和冷却下向该反应混合物滴加0.5M硫酸，直至达到pH3，然后加入35ml水。所得溶液用2×15ml己烷萃取，然后用3×20ml二氯甲烷萃取。汇集二氯甲烷萃取液，用3×15ml水、15ml冷的5％碳酸氢钠溶液和15ml水洗涤，经无水硫酸钠干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。将蒸发残余物用二异丙醚处理，过滤，在减压下干燥。
收率3.9g(6.07mM，81％)，Rf(8)＝0.40
[α]D 20＝+16.0°(c＝1，四氢呋喃)
FAB质谱(642[M+H]+，795[M+H+NBA]+)确认了所假定的结构。
步骤3：D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-L-精氨酸醛半硫酸盐
将3.21g(5mM)四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛(实施例3步骤2)溶于40ml乙醇和5ml 0.5M硫酸，然后加入0.3g Pd-C催化剂的6ml水悬液，使混合物在约10℃下氢化。借助薄层色谱监测反应的进程。反应完成后(约15分钟)，过滤催化剂，将滤液在2.0-2.5kPa下浓缩至约4-6ml。将残余物用40ml水稀释，用4×7ml二氯甲烷萃取，将水溶液在20-22℃下放置24小时。将溶液再次用3×15ml二氯甲烷萃取，用离子交换树脂Dowex AG1-X8(HO-)调节pH至3.5，然后将溶液冷冻干燥。
收率1.65g(3.5mM，70％)
[α]D 20＝-94.7℃(c＝1；水)
HPLC：k’＝2.702和3.010
FAB质谱(424[M+H]+，577[M+H+NBA]+)确认了所假定的结构。
原料四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酸三乙铵盐的合成
步骤A：氯乙酰基-DL-环庚基丙氨酸甲酯
向15.2g(65mM)DL-环庚基丙氨酸甲酯盐酸盐(实施例1步骤E)的65ml二氯甲烷溶液加入9.1ml(65mM)三乙胺和14.9g(78mM)(N-羟基琥珀酰亚氨基)氯乙酸酯*。在室温下搅拌3小时后，将反应混合物用65ml二氯甲烷稀释，连续用3×30ml水、1M KHSO4、水、5％NaHCO3洗涤，最后用水洗涤至中性。有机层然后经Na2SO4干燥，然后在2.0-2.5kPa下蒸发。所得油性产物用轻质石油醚研制。滤出固形物，用轻质石油醚洗涤，在真空干燥器内干燥。得到17.54g(63.6mM，～98％)氯乙酰基-DL-环庚基丙氨酸甲酯，直接用于下面的反应。Rf(7)＝0.73-0.83；Mp：78-80℃。
C13H22NO3Cl分析(275.777)：计算值：C％＝56.62；H％＝8.04；N％＝5.08；Cl％＝12.86；实测值：C％＝55.65；H％＝7.93；N％＝5.06；Cl％＝12.72.
*(N-羟基琥珀酰亚氨基)氯乙酸酯的制备
将32ml(450mM)氯乙酰氯加入到23g(200mM)N-羟基琥珀酰亚胺中，使混合物回流10分钟，然后倒在碎冰上，过滤，用冷水洗涤，在真空干燥器内干燥。收率20.23g(105.9mM，53％)；Mp：113.3-113.7℃。
C6H6NO4Cl C7H9NO5分析(191.55)：计算值：C％＝37.62；H％＝3.16；N％＝7.31；Cl％＝18.51；实测值：C％＝37.37；H％＝3.16；N％＝7.23；Cl％＝18.35.
步骤B：氯乙酰基-D-环庚基丙氨酸甲酯(氯乙酰基-DL-环庚基丙氨酸甲酯的酶拆分)
向8.71g(31.6mol)氯乙酰基-DL-环庚基丙氨酸甲酯(DL-酯)(实施例3步骤A)的30ml甲苯溶液加入70ml水和50mg Carlsberg枯草杆菌蛋白酶(VIII型蛋白酶，Sigma)。在pH7.0下进行L-对映体(L-酯)的酶水解，借助装有3M NaOH的自动滴定仪维持pH7.0。当NaOH的消耗停止时(5.522ml，16.57mM)，将反应混合物用30ml甲苯稀释，分离两层。水相用2×20ml甲苯洗涤。所合并的甲苯溶液含有D-酯，所合并的水溶液含有L-酸的钠盐。
经无水Na2SO4干燥后，在减压下蒸发所合并的甲苯溶液，得到4.18g(15.16mM)D-酯，Rf(7)＝0.73-0.83，直接用于D-环庚基丙氨酸的制备。
将所合并的水溶液酸化，用3×30ml乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯溶液，用水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在减压下蒸发，得到3.46g(13.22mM)L-酸。Rf(7)＝0.45-0.50，直接用于L-环庚基丙氨酸的制备。
从8.25g(30mM)DL-酯(实施例2步骤A)开始进行相似的制备，得到4.08g(14.79mM)D-酯和3.23g(12.34mM)L-酸。
步骤C：D-环庚基丙氨酸盐酸盐
将8.27g(30mM)D-酯(实施例3步骤B)悬浮在120ml 6M HCl中，回流3小时。分离游离的氨基酸，为晶体。将反应混合物冷却，在冰箱内保存过夜，过滤，用冷水和乙醚洗涤，然后在真空干燥器内干燥。得到5.9g(26.69mM，89％)D-环庚基丙氨酸盐酸盐。Rf(12)＝0.10-0.15；[α]D 20＝-11°(c＝0.4；1M HCl)。
C10H19NO2.HCl分析(221.728)：计算值：C％＝54.17；H％＝9.09；N％＝6.32；Cl％＝15.99；实测值：C％＝54.27；H％＝9.27；N％＝6.30；Cl％＝16.2.
步骤D：D-环庚基乳酸二环己铵盐
将5.78g(26.15mM)D-环庚基丙氨酸盐酸盐(实施例3步骤C)溶于26ml水，用105ml水和52.5ml冰乙酸稀释，冷却至5℃。在搅拌和冷却下，向该混合物滴入18.0g(261mM)NaNO2的30ml水溶液。继续在5℃下搅拌1小时，在室温下搅拌过夜。第二天，在搅拌下将反应混合物用25ml cc HCl酸化。然后将混合物在50℃减压下蒸发至干。将残余物溶于100ml水，类似地蒸发，用甲苯研制，再次蒸发。将最终的残余物溶于50ml乙酸乙酯和50ml水。水相用乙酸乙酯洗涤，合并乙酸乙酯溶液，用水洗涤至中性，经无水Na2SO4干燥，在减压下蒸发。将所得固体溶于20ml二异丙醚。向该溶液加入5ml(25mM)二环己胺，一旦加入立即分离结晶性盐。冷却后，滤出晶体，用冷乙醚洗涤，在真空干燥器内干燥，得到5.5g(14.96mM，57.2％)D-环庚基乳酸二环己铵盐D-cHla.DCHA。Rf(7)＝0.53-0.60；[α]D 20＝+19.5°(c＝1；甲醇)；Mp：147-150℃。
C10H18O3(C22H41NO3)分析：计算值：C％＝71.89；H％＝11.24；N％＝3.81；实测值：C％＝71.57；H％＝11.34；N％＝3.83.
0.35g(1mM)D-cHla.DCHA向游离α-羟基酸的转化得到0.15g(0.8mM)D-cHla；[α]D 20＝+10.1°(c＝1；甲醇)；Mp：125-127℃。
C10H18O3分析(186.252)：计算值：C％＝64.48；H％＝9.74；实测值：C％＝64.54；H％＝9.86.
步骤E：D-环庚基乳酸苄基酯
向11.21g(30.5mM)D-环庚基乳酸二环己铵盐(实施例3步骤D)的30ml二甲基甲酰胺溶液加入3.57ml(30mM)苄基溴。将混合物在室温下搅拌24小时，然后过滤，在2.0-2.5kPa下蒸发。将残余物溶于20ml 0.5M碳酸氢钾和60ml二乙醚。将有机相连续用20ml水、0.5MKHSO4和水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥，在减压下蒸发。油性残余物是8.3g(～30mM)D-环庚基乳酸苄基酯，Rf(3)＝0.2-0.3，直接用于步骤F。
步骤F：四氢吡喃基-D-环庚基乳酸苄基酯
向8.29g(30mM)D-环庚基乳酸苄基酯(实施例3步骤E)的30ml二氯甲烷溶液加入3.01ml(33mM)3，4-二氢-2H-吡喃与0.3ml～3MHCl的乙酸乙酯溶液，将混合物在室温下放置16小时。然后将反应混合物用40ml二氯甲烷稀释，用3×20ml水洗涤，经无水硫酸钠干燥，在2.0-25kPa下蒸发。残余物经过硅胶柱色谱纯化，使用200gKieselgel 60(0.040-0.063mm)作为吸附剂，环己烷与乙酸乙酯的85∶15混合物作为洗脱剂。汇集仅含有纯产物的部分(Rf(4)＝0.60-0.70)，在2.0-2.5kPa下蒸发。油性残余物是7.9g(21.9mM，73％)四氢吡喃基-D-环庚基乳酸苄基酯，直接用于下一步。
步骤G：四氢吡喃基-D-环庚基乳酸三乙铵盐
将7.21g(20mM)四氢吡喃基-D-环庚基乳酸苄基酯(实施例3步骤F)溶于20ml二甲基甲酰胺，加入2.8ml(20mM)三乙胺，在0.1g Pd/C催化剂的存在下氢化。借助薄层色谱法监测反应的进程(Rf(1)＝0.30(酯)，0.00(酸))。反应完成后，滤出催化剂，用2×5ml二甲基甲酰胺洗涤。合并滤液和洗液，用于下一步，为20mM四氢吡喃基-D-环庚基乳酸三乙铵盐的溶液。
步骤H：四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酸苄基酯
将实施例3步骤G所得四氢吡喃基-D-环庚基乳酸三乙铵盐溶液(20mM)冷却至+5℃，在搅拌下加入2.7g(20mM)1-羟基苯并三唑、4.83g(20mM)L-脯氨酸苄基酯盐酸盐和4.12g(20mM)二环己基碳二亚胺。将反应混合物在室温下保持过夜，然后过滤，在2.0-2.5kPa下蒸发。将残余物溶于50ml乙酸乙酯，用20ml水和5％碳酸氢钠洗涤，经无水Na2SO4干燥，在减压下蒸发。残余物经过硅胶柱色谱纯化，使用200g Kieselgel 60(0.040-0.063mm)作为吸附剂，正己烷与乙酸乙酯的1∶1混合物作为洗脱剂。汇集仅含有纯产物的部分(Rf(3)＝0.3-0.4)，在2.0-2.5kPa下蒸发。油性产物是5.95g(13mM，65％)四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酸苄基酯，直接用于下一步。
步骤I：四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酸三乙铵盐
将5.5g(12mM)四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酸苄基酯(实施例3步骤H)溶于12ml二甲基甲酰胺，加入1.68ml(12mM)三乙胺，在0.1g Pd/C催化剂的存在下氢化。借助薄层色谱法监测反应的进程(Rf(1)＝0.30(酯)，0.00(酸))。反应完成后，滤出催化剂，用2×2ml二甲基甲酰胺洗涤。合并滤液和洗液，以溶液的方式使用，其中含有12mM四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酸三乙铵盐。
实施例4
N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-L-精氨酸醛半硫 酸盐的合成
步骤1：苄氧羰基-N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺
将1.97g(5mM)叔丁氧羰基-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺(Bajusz等人，J.Med.Chem. 33，1729(1990))悬浮在5ml氯仿中，然后在搅拌和冰冷却下加入5ml用HCl气(0.11-0.15g/ml)饱和的乙酸乙酯。借助薄层色谱法监测Boc基团的裂解(Rf(11)＝0.5(游离化合物)；1.0(Boc-化合物))。在反应结束时，将悬液用10ml二乙醚稀释，过滤所生成的晶体，用3ml丙酮和3ml二乙醚洗涤，在减压下经KOH干燥。将所得NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺盐酸盐溶于5ml二甲基甲酰胺，冷却至-20℃，加入到下列混合酸酐中。
将1.95g(5mM)苄氧羰基-N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羧酸(实施例4步骤B)溶于5ml二甲基甲酰胺，冷却至-15℃，然后在搅拌下加入0.56ml(5.05mM)N-甲基吗啉和0.665ml(5.05mM)氯甲酸异丁酯。搅拌10分钟后，加入上述NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺的二甲基甲酰胺溶液，然后加入一定量的三乙胺，以调节反应混合物的pH至8(需要约0.7ml)。将反应混合物在-10℃下搅拌30分钟，然后在0℃下搅拌1小时。然后滤出盐，将滤液用50ml乙酸乙酯稀释。将所得溶液用3×7ml水、3ml 1M KHSO4和3×3ml水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。所得产物经过硅胶柱色谱纯化，使用50g Kieselgel 60(0.040-0.063mm)作为吸附剂，乙酸乙酯作为洗脱剂。汇集仅含有纯产物的部分(Rf(1)＝0.70)，在2.0-2.5kPa下蒸发。使蒸发残余物从二异丙醚中结晶。
收率2.35g(71％)，Rf(1)＝0.45-0.55
FAB质谱(661[M+H]+确认了所假定的结构。
步骤2：苄氧羰基-N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛
将2.15g(3.25mM)苄氧羰基-N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-NG-苄氧羰基-L-精氨酸内酰胺(实施例4步骤1)溶于5ml四氢呋喃，然后在搅拌和不超过-50℃的温度下，加入2.25mM LiAlH4的四氢呋喃溶液。借助薄层色谱监测还原的进程，使用溶剂7作为展开溶剂，如果需要的话，加入另一部分LiAlH4。在恒定搅拌和冷却下向该反应混合物滴加0.5M KHSO4，直至达到pH3，然后加入13ml水。所得溶液用2×5ml己烷萃取，然后用3×7ml二氯甲烷萃取。汇集二氯甲烷萃取液，用3×7ml水、7ml冷的5％NaHCO3溶液和7ml水洗涤，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。将蒸发残余物用二异丙醚处理，过滤，在减压下干燥。
收率1.6g(74％)，Rf(7)＝0.33-0.43
FAB质谱(663[M+H]+)确认了所假定的结构。
步骤3：N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-L-精氨酸醛硫酸盐
将1.53g(2.3mM)苄氧羰基-N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛(实施例4步骤2)溶于23ml乙醇和4.8ml 0.5M硫酸，然后加入0.15g Pd-C催化剂的3.5ml水悬液，使混合物在约10℃下氢化。借助薄层色谱监测反应的进程。反应完成后(约15分钟)，过滤催化剂，将滤液在2.0-2.5kPa下浓缩至约2-3ml。将残余物用20ml水稀释，用4×4ml二氯甲烷萃取，将水溶液在20-22℃下放置24小时。将溶液再次用3×4ml二氯甲烷萃取，用离子交换树脂Dowex AG 1-X8(HO-)调节pH至3.5，然后将溶液冷冻干燥。
收率1.02g(90％)，Rf(12)＝0.40
FAB质谱(395[M+H]+，548[M+H+NBA]+)确认了所假定的结构。
原料苄氧羰基-N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羧酸的合成
步骤A：苄氧羰基-D-环己基甘氨酸2，4，5-三氯苯基酯
向搅拌着的5.42g(20mM)D-环己基甘氨酸三氟乙酸盐与5.6ml(40mM)三乙胺的50ml二甲基甲酰胺悬液加入8.8g(22mM)五氯苯基甲酸苄基酯(Anteunis等人，Bul.Soc.Chim.Belg. 96，775(1987))和6.16ml(44mM)三乙胺。搅拌3小时后，在减压下蒸发反应混合物，将残余物溶于60ml二乙醚和60ml水。分离各相，有机相用水洗涤，合并水相，用二乙醚洗涤，用1M KHSO4酸化至pH3，然后用3×30ml乙酸乙酯萃取。将有机相用水洗涤至中性，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。
蒸发残余物是苄氧羰基-D-环己基甘氨酸，将其溶于20ml四氢呋喃，与4.54g(22mM)2，4，5-三氯苯酚和4.54g(22mM)二环己基碳二亚胺合并。3小时后过滤反应混合物，合并滤液和洗液，在减压下蒸发。固体残余物经过硅胶柱色谱纯化，使用140g Kieselgel(0.040-0.063mm)作为吸附剂，氯仿与丙酮的95∶5混合物作为洗脱剂。汇集仅含有纯产物的部分(Rf(5)＝0.7-0.8)，在2.0-2.5kPa下蒸发。将油性产物用二乙醚研制，过滤，用二乙醚洗涤，干燥。得到8.34g(88.5％)纯的苄氧羰基-D-环己基甘氨酸2，4，5-三氯苯基酯。
步骤B：苄氧羰基-N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羧酸的合成
将L-氮杂环丁烷-2-羧酸(1.01g，10mM)和三乙胺(1.4ml，10mM)加入到苄氧羰基-D-环己基甘氨酸2，4，5-三氯苯基酯(5.18g，11mM，实施例4步骤A)的10ml吡啶溶液中。搅拌过夜后，在减压下蒸发反应混合物，将残余物溶于50ml 5％NaHCO3和50ml二乙醚。有机相用水洗涤，合并水相，用二乙醚洗涤，用1M KHSO4酸化至pH3，然后用3×50ml乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯萃取液，用水洗涤至中性，经无水Na2SO4干燥，在2.0-2.5kPa下蒸发。
蒸发残余物是苄氧羰基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羧酸，将其溶于10ml四氢呋喃，与5.0ml(80mM)碘代甲烷合并，冷却至0℃。向该溶液加入60％1.2g(30mM)氢化钠，将反应混合物在RT下搅拌过夜。小心地加入0.4ml水，分解过量的氢化钠。猝灭反应混合物，在减压和低于30℃的温度下浓缩至约10ml。残余物用15ml水和10ml叔丁基甲基醚稀释。分离各相，水相再次用10ml叔丁基甲基醚洗涤。将水性产物相与15ml乙酸乙酯合并，用3M硫酸溶液调至pH2.2。分离各相，水相用10ml乙酸乙酯反萃取。合并有机相，用15ml 5％硫代硫酸钠溶液洗涤。分离各相，在减压和低于40℃的温度下蒸发有机相。油性残余物是3.75g苄氧羰基-N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羧酸(9.65mM，Rf(7)＝0.85-0.95)，将其溶于9.65ml四氢呋喃，用于实施例4步骤1a
FAB质谱(403[M+H]+)确认了所假定的结构。
                        实施例5
              肽基精氨醛对凝血的抑制作用
使用含枸橼酸盐的人血浆作为底物，在凝血酶时间(TT)、活化部分凝血激酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)测定法中评价对血浆凝固的抑制效果(Bagdy，D.等人，Thromb.Haemostas. 67，325(1992))。TT测定法测量单一步骤、纤维蛋白原因外源性凝血酶的作用而凝固的抑制作用(最终浓度2.5 NIH U/ml)。APTT和PT测定法中的血浆凝固是由再钙化作用诱发的。所产生的内源性凝血酶在理论上的最终浓度能够高达50 NIH U/ml(APTT，PT)。这些测定法检测对纤维蛋白生成和凝血酶产生的抑制作用总和，这包括若干蛋白分解反应，由凝血酶或其他酶所介导，例如Xa因子。抗凝活性以CT2表示，它是使凝血时间加倍所需的浓度(nM)。
表1
本发明式(I)化合物(1-4)、母体化合物efegatran(C)和其它相关的肽基精氨醛(C1，C2)对血浆凝固(A栏)、凝块-结合的凝血酶与Xa因子(B栏)和纤维蛋白分解酶(C栏)的抑制活性
   肽基精氨醛：          A              B                    C
 Xaa-Xbb-Arg-Ha      CT2(nM)b     IC50(nM)         LA50，μMc
No   Xaa-Xbb         TT  APT  PT    凝血酶   因子     PL   tPA   UK
                          T            n      Xa
1  Eoc-D-cHpa-      147  331  1839     103    118     18   10    14
      Pro
2 N-Me-D-cHpa-      118  315  876      93     102     16   14    18
      Pro
3 D-cHla-Pro        86   281  1082     95     117     21   10    85
4 N-Me-D-Chg-       101  677  2921     245    457     32   12    16
-------------------------------------------------------------------
C D-MePhe-Pro       87   622  2915     375    1000    54   132   82
-------------------------------------------------------------------
C1 D-cHga-Pro       120  333  1254     524    200     83   74    120
C2 Eoc-D-Cba-Pro    114  349  1148     390    702     27   27    120
缩写：
aEoc＝乙氧羰基；cHpa＝环庚基丙氨酰；cHla＝环庚基乳酰；MePhe＝N-甲基苯丙氨酰；cHga＝环庚基乙醇酰；Chg＝环己基甘氨酰
bCT2＝TT(凝血酶时间)，APTT(活化部分凝血激酶时间)和PT(凝血酶原时间)测定法中使凝血时间加倍所需的浓度
cLA50＝纤维蛋白平板测定法中溶解面积减少至对照的50％所需的浓度；PL＝纤溶酶；tPA＝组织纤溶酶原激活物；UK＝尿激酶
若干这些化合物在延长凝血时间的能力上优于efegatran(C，D-MePhe-Pro-Arg-H，母体肽精氨醛)(见表1)。表1A栏列出本发明式(I)化合物(1-4)与已知抗凝血剂efegatran(C)(Bajusz，S.等人，J.Med.Chem. 33，1729(1990)；U.S.Pat.No.4,703,036(1982)；Bagdy，D.等人，Thromb.Haemostas. 67，357&  68，125(1992)；Jackson，C.V.等，Clin.Appl.Thrombosis/Hemostasis  2，258(1996))和其它相关的肽基精氨醛(例如C1和C2)(Bajusz，S.等，Bioorg.&Med.Chem.3，1079(1995)；U.S.Pat.No.6,121,241(2000)；PCT Pub.No.WO 97/46576)的抗凝血活性对比。TT测定法显示在凝血酶-纤维蛋白原反应的抑制上，新颖的类似物与efegatran几乎同样有效。另一方面，APTT表明在在先的凝血过程产生凝血酶的步骤的抑制上，新颖的肽比efegatran更加有效。
                         实施例6
               对凝血酶和Xa因子的抑制作用
简而言之，如文献所公开的(Bajusz，S.等，PCT Pub.No.WO97/46576)，使用产色底物在富集血小板的血浆凝块中检查酶抑制作用，凝血酶的底物为Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(S1)，Xa因子的底物为Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA(S2)。测定是在室温下、在玻璃试管和96孔微量滴定板中进行的。
(a)溶液。(i)缓冲液A：0.1M磷酸钠/0.05M NaCl(pH8.5)。(ii)抑制剂：0.1、1.0和10mg/ml的缓冲液A溶液，含有0.02％人白蛋白。
(iii)底物：1mM S1和2mM S2的蒸馏水溶液。
(b)血浆凝块的制备。将富集血小板的血浆样本(200μl)置于玻璃试管内，在室温下与80μl 40mM CaCl2培育60分钟。将凝块用2ml等份盐水(0.9％NaCl)洗涤，小心地搅拌，以除去未结合的酶。在成功洗涤的情况下，洗液与S1的反应混合物的光密度小于对照的5％。将如此得到的血浆凝块保存在试管中盐水下备用。
(c)凝块中酶抑制作用的评估。除去盐水后，将血浆凝块在37℃下与400μl抑制剂(或缓冲液A，作为阴性对照)培育5分钟，与100μl底物S1或S3培育30分钟，然后用100μl 50％乙酸终止反应。取150μl反应混合物，置于微量滴定板的小孔中，在405nm下读数(ELISAREADER 800，Bio-Tek Instrumetns Inc.Winooski，VT，USA)。从消光数据图生成IC50值。
结果如表1B栏所示。化合物1、2、3和4是在凝块-结合的凝血酶抑制上唯一能够超越Efegatran的类似物，但是在凝块-结合的Xa因子抑制上，每种类似物都好于Efegatran。因而，1、2、3和4对两种凝块-结合的酶都是最具抑制性的。
                        实施例7
                  抗纤维蛋白分解活性
借助纤维蛋白平板测定法检查了本发明化合物对纤溶酶(PL)和由纤溶酶原(Plogen)激活物、例如组织纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶(UK)引起的纤溶酶生成的抑制效果(Bagdy，D.Barabás，E.，Bajusz，S.，Széll，E.，Thromb.Haemostas.， 67：325-330(1992)；Barabás，E.Széll，E.，Bajusz，S.，Blood Coagulation and Fibrinolysis， 4：243(1993))。结果如表1C栏所示。例外的是类似物对这三种纤维蛋白分解酶比Efegatran多少更具抑制性。例外是C1对PL，和C1、C2对UK，而3对UK几乎与Efegatran等效。
                     实施例8
            播散性血管内凝血的兔模型
研究了本发明化合物1与3和表1其他肽基精氨醛以及C3在内毒素(脂多糖，LPS)-处置的兔子中的DIC-抑制活性，如文献所述(Scherer，M.U.等，Lab.Anim.Sci. 45，538(1995))。测定方法持续4小时。分别在0和120分钟按80和40μg/kg i.v.药团注射剂量将内毒素给药，而伴随整个实验输注肽基精氨醛1、3和C-C3(0.25和/或0.5mg/kg/h)。将对照组动物用0.9％盐水处理。在0、120和240分钟测定止血参数。
尽管小心处理，致死率仍为31％，这很可能是因为兔子的内毒素敏感性高(Semerano，N.等，Int.J.Clin.Lab.Res. 21，214(1992))。
表2
本发明化合物1与3、母体化合物Efegatran(C)、其他精氨醛(C1和C2)和肝素(H)对内毒素-处置的兔子致死率的影响
                             死亡率
                        死亡/受处理动物数和％
试剂a                2hrs               4hrs
                    No.    ％          No.    ％
盐水(0.9％NaCl)     0/10   0           0/10   0
内毒素              0/13   0           4/13   31
----------------------------------------------------
+1，0.5mg/kg/h      0/12   0           2/12   17
+1，0.25mg/kg/h     0/19   0           3/19   16
+3，0.25mg/kg/h     0/22   0           4/22   18
----------------------------------------------------
+C， 0.5mg/kg/h     1/15   7           6/15   40
+C， 0.25mg/kg/h    1/14   7           5/14   36
+C1，0.5mg/kg/h     0/16   0           5/16   31
+C2，0.5mg/kg/h     0/12   0           5/12   42
+C3，0.5mg/kg/h     1/18   6           10/18  56
+H， 100U/kg/h      0/19   0           7/19   37
+H， 50U/kg/h       0/17   0           6/17   35
a见表1关于肽基精氨醛1、3、C、C1和C2的结构，C3＝hPla-Pro-Arg-H，其中hPla＝2-羟基-4-苯基丁酸。
如表2数据所示，化合物1和3显著降低内毒素-处置的兔子的致死率，而其他抗凝剂要么对致死率没有影响(C1)，要么导致致死率有一定的增加，C3的值最高，为～1.8倍。从表1数据中值得注意的是降低致死率的1和3对凝块-结合的凝血酶以及Xa因子最具抑制性，还有效地抑制血浆凝固和纤维蛋白分解酶、纤溶酶和纤溶酶原激活物。
                        实施例9
              播散性血管内凝血的大鼠模型
最严重的DIC后果是纤维蛋白沉积在各种器官中、血细胞改变(例如血小板数量减少)和纤维蛋白降解产物改变。在内毒素-处置的大鼠中检查了本发明化合物1和两种对照抗凝剂Efegatran(C)和肝素(H)对这些现象的影响(Ford，A.J.和Longridge，D.J.，Br.J.Pharmacol. 110，Suppl.131P(1993)；Hasegawa，N.，等，Am.J.Resp.Crit.Care Med. 153，1831(1996)；Dichneite，G等，Thromb.Res. 77，357(1995))。
将雄性大鼠用10mg/kg内毒素i.v.药团注射处理。继之以盐水或供试化合物的四小时i.v.输注。就化合物1和3而言，给以0.25mg/kg作为最初的药团注射，继之以四小时的0.25mg/kg/h i.v.输注。类似地施用肝素(H)，50 IU/kg为最初的药团注射，继之以四小时的50IU/kg/hi.v.输注。将对照组动物用0.9％盐水处理。
在所选择的器官(肝和肾)中研究125I-纤维蛋白的沉积。在内毒素注射之前30分钟注射125I-纤维蛋白原。在γ计数器(Wallac Wizard1470)中测量组织样本的放射性。利用器官125I活性与所注射的总125I活性之比评估器官中的微血栓形成，该比例被定义为微血栓指数。该参数的变化以相对于盐水组的百分率表示。
在自动仪器(Sysmex F-800)中测定血小板数量，与对照值对比。
借助Aggristin(Ristocetin)沉淀测定法测定FDP(纤维蛋白降解产物)。在内毒素给药后4小时处死动物。
各项发现总结在表3中。
                      表3
本发明化合物1、母体肽Efegatran(C)和肝素(H)对内毒素-处置的大鼠的125I-纤维蛋白沉积和血小板数量变化与纤维蛋白降解产物(FDP)变化的影响
                    125I-纤维蛋白沉积    血小板数量      FDP
试剂                肝           肾         变化         变化
内毒素，10mg/kga   36％         36％       62％         2.56
+1，0.25mg/kg/hb   13％         26％       48％         1.66
+C，0.25mg/kg/hb   30％         33％       52％         1.94
+H，50 NIH U/kg/hb 22％         28％       43％         2.37
aI.V药团注射；bI.V.药团注射+I.V.输注
表3数据表明1的DIC抑制潜力大大突出于肝素或Efegatran。
                    实施例10
    播散性血管内凝血的大鼠模型的存活率检查
将雄性大鼠用30mg/kg LPS(内毒素)的i.v.药团处理。将肽给药，剂量为0.5和/或0.75、1.0和1.5mg/kg，作为最初的药团注射，继之以在LPS给药之后立即进行的八小时输注。在LPS后4、5、6、7、8小时记录死亡率。
表4数据表明在实验结束时(8小时)，LPS处理降低大鼠存活率至20％。与LPS组相比，所有所研究的肽基精氨醛都延长存活时间，降低死亡率。化合物1、2、3和4比参照C更加有效。
表4
本发明化合物1、2、3与4和母体化合物C对LPS-处置大鼠致死率的影响
时间(小时)                                                                      存活率％
参照         C，mg/kg         1，mg/kg         2，mg/kg         3，mg/kg        4，mg/kg
  0   0.75   1.0   15   0.75   1.0   1.5   0.75   1.0   1.5   0.5   0.75   1.5   0.5   0.75   1.5
    045678   1007672372420   1009373673327   1008383665850   1001001001009292   1001001001009070   1001001001009090   100100100100100100   1008678575750   1001001001009090   100100100100100100   10010010010010080   10010010010010092   10010010010010092   1009387878780   1001001001009285   100100100100100100
将雄性大鼠用30mg/kg LPS的i.v.药团处理。给以供试化合物作为最初的药团，继之以在LPS给药之后立即进行的八小时i.v.输注。在LPS后4、5、6、7和8小时记录死亡率。

Claims (24)

1、式(I)化合物
               Xaa-Xbb-Arg-H        (I)
其中Xaa代表式(II)α-取代的碳酸残基
               Q-CH(R)-CO           (II)
其中Q代表1-3个碳的烷氧基羰基氨基、甲氨基或羟基，R代表7-9个碳的环烷基甲基、1-金刚烷基甲基或5-7个碳的环烷基，
Xbb代表L-脯氨酸或L-氮杂环丁烷-2-羧酸残基，
及其与有机或无机酸所生成的酸加成盐。
2、结构1化合物：
Figure A028200310002C1
及其酸加成盐。
3、结构2化合物：
Figure A028200310002C2
及其酸加成盐。
4、结构3化合物：
及其酸加成盐
5、结构4化合物：
Figure A028200310003C2
及其酸加成盐。
6、药物制剂，包含根据权利要求1的化合物。
7、药物制剂，包含根据权利要求2的化合物。
8、药物制剂，包含根据权利要求3的化合物。
9、药物制剂，包含根据权利要求4的化合物。
10、药物制剂，包含根据权利要求5的化合物。
11、化合物乙氧羰基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛。
12、化合物四氢吡喃基-D-环庚基乳酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛。
13、化合物苄氧羰基-N-甲基-D-环庚基丙氨酰-L-脯氨酰-NG-苄氧羰基-L-精氨酸醛。
14、化合物N-甲基-D-环己基甘氨酰-L-氮杂环丁烷-2-羰基-L-精氨酸醛。
15、任意权利要求6-10的药物制剂，其中所述制剂包含片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、锭剂、颗粒剂、溶液剂、输注剂、栓剂、硬膏剂或软膏剂。
16、治疗患有播散性血管内凝血的患者的方法，该方法包含对该患者给以对凝块-结合的凝血酶、Xa因子、纤溶酶和纤溶酶原激活物具有抑制作用的肽基精氨醛。
17、治疗患有播散性血管内凝血的患者的方法，该方法包含对该患者给以式(I)的肽基精氨醛
                Xaa-Xbb-Arg-H    (I)
其中Xaa代表式(II)α-取代的碳酸残基
                Q-CH(R)-CO       (II)
其中Q代表1-3个碳的烷氧基羰基氨基、甲氨基或羟基，R代表6-9个碳的环烷基甲基、1-金刚烷基甲基或5-7个碳的环烷基，
Xbb代表L-脯氨酸或L-氮杂环丁烷-2-羧酸残基，
或其药学上可接受的酸加成盐。
18、治疗患有播散性血管内凝血的患者的方法，该方法包含对该患者给以结构1的肽基精氨醛
或其药学上可接受的酸加成盐。
19、治疗患有播散性血管内凝血的患者的方法，该方法包含对该患者给以结构2的肽基精氨醛
或其药学上可接受的酸加成盐。
20、治疗患有播散性血管内凝血的患者的方法，该方法包含对该患者给以结构3的肽基精氨醛
或其药学上可接受的酸加成盐。
21、治疗患有播散性血管内凝血的患者的方法，该方法包含对该患者给以结构4的肽基精氨醛
Figure A028200310005C2
或其药学上可接受的酸加成盐。
22、根据权利要求1的方法，其中对该患者给以约0.1mg至约50mg/kg肽基精氨醛，基于患者体重而言。
23、根据权利要求1的方法，其中对该患者给以肽基精氨醛的剂量足以达到约6μM至约100μM的血液肽基精氨醛水平。
24、根据权利要求7或8的方法，其中该肽基精氨醛的给药是同时或先后进行的。
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