SK1112004A3 - Peptide arginals and methods for treating disseminated intra-vascular coagulation - Google Patents
Peptide arginals and methods for treating disseminated intra-vascular coagulation Download PDFInfo
- Publication number
- SK1112004A3 SK1112004A3 SK111-2004A SK1112004A SK1112004A3 SK 1112004 A3 SK1112004 A3 SK 1112004A3 SK 1112004 A SK1112004 A SK 1112004A SK 1112004 A3 SK1112004 A3 SK 1112004A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- patient
- compound
- water
- benzyloxycarbonyl
- acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Predložený vynález sa týka roztrúsenej intravaskulárnej koagulácie. Predložený vynález sa predovšetkým týka lekárskej intervencie, pokiaľ ide o roztrúsenú intravaskulárnu koaguláciu.
Doterajší stav techniky
Roztrúsená intravaskulárna koagulácia (disseminated intravascular coagulation, DIC) je sekundárne ochorenie a môže byť dôsledkom niektorého z celého radu primárnych ochorení. (Pozri Bick, Disseminated Intravascular
Boca Raton (1983).) Spomedzi charakteristických znakov je to systematická aktivácia koagulácie krvi, ktorá spôsobuje tvorbu a depozíciu fibrínu, čo vedie k mikrovaskulárnym krvným zrazeninám v rozličných orgánoch a prispieva k multiorgánovému zlyhaniu. Blick a kol., Clin. Appl. Thrombosis Hemostatis 1, 3-23 (1995) uvádzajú, že ďalším charakteristickým znakom DIC je systémová cirkulácia plazmínu, globálneho proteolytického enzýmu, ktorý môže biodegradovať rozličné proteíny plazmy (faktory, hormóny a podobne) a môže štiepiť fibrinogén/fibrin na degradačné produkty fibrinogénu/fibrínu. Tieto produkty zhoršujú hemostázu a vedú k hemorágii.
Najzávažnejšia klinická forma DIC sa vyznačuje extenzívnou konzumpciou koagulačných proteínov, signifikantnou depozíciou fibrínu a krvácaním.
U pacientov po úraze je zvýšené riziko DIC, predovšetkým ak sú tu rozsiahle oblasti poškodenia tkaniva (najmä mozgu), sepsa a multiorgánové zlyhanie. Často je to predovšetkým poranenie hlavy, ktoré spôsobuje DIC u dojčiat a detí, z dôvodu vysokého obsahu tromboplastínu v mozgu a proporčne zvýšeného pomeru oblasti povrchu hlavy k celkovému povrchu celého tela.
Sepsa sa môže vyskytovať u približne 40 % pacientov s úrazom a je významnou primárnou príčinou DIC u všetkých pacientov. Klinický stav sa zhoršuje vplyvom sekundárnej fibrinolýzy, čo má za následok vznik degradačných produktov
- 2 fibrinogénu/fibrínu (fibrinogen/fibrin degradation products FDP's) alebo “Ddimérov”, ktoré interferujú s normálnou tvorbou fibrínu alebo funkciou krvných doštičiek.
Depozícia fibrínu pri DIC môže viesť k ďalšej dysfunkcii orgánov. DIC je hlavnou príčinou akútneho zlyhania obličiek a prispieva tiež k systémovému multiorgánovému zlyhaniu. Platí to aj naopak, poškodené orgány prispievajú k DIC.
V súčasnosti jediné prijateľné liečenie DIC je obmedzené na snahu zmierniť primárne ochorenie. Bez regulovania bude DIC pokračovať napriek formám liečby zameranej na skorigovanie krvácania alebo trombotických problémov. V niektorých prípadoch, pri ktorých sa vyskytuje značné krvácanie, môže pomôcť náhradná terapia s čerstvou zmrazenou plazmou, kryoprecipitátom zložiek plazmy (ako je napríklad antitrombín III) a/alebo koncentrátov krvných doštičiek, pokým sa nezvládne primárny problém, avšak tieto terapie sú neúmerne drahé. Použitie heparínu pri DIC je veľmi kontroverzné a vo všeobecnosti sa nepoužíva u pacientov so základným problémom traumy.
Jestvuje tu preto potreba nájsť nové a lepšie zlúčeniny a spôsoby liečenia DIC [pozri tiež napríklad de Jonge a koľ, Drugs 55, 767-777 (1998) a Leví a kol., Thrombosis and Homeostasis 82, 695 (1999)].
Podstata vynálezu
Predložený vynález poskytuje nové a lepšie zlúčeniny a spôsoby liečenia DIC. Prekvapujúco sa zistilo, že tie antikoagulačné zlúčeniny, ktoré majú inhibičný účinok ako na voľný tak aj na zrazeninou viazaný trombín a faktor Xa a tiež pôsobia inhibične voči plazmínu a aktivátorom plazminogénu, sa môžu využiť pri liečení DIC.
Podľa prvého aspektu, predložený vynález poskytuje kompozíciu látok obsahujúcu peptidylarginal všeobecného vzorca I
Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde Xaa znamená zvyšok alfa-substituovanej karbónovej kyseliny vzorca II (II)
- 3 Q-CH(R)-CO kde Q predstavuje alkoxykarbonylaminoskupinu obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, metylaminoskupinu alebo hydroxylovú skupinu a R znamená cykloalkylmetylovú skupinu obsahujúcu 7 až 9 atómov uhlíka alebo cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 5 až 7 atómov uhlíka alebo 1-adamantylmetylovú skupinu a Xbb predstavuje Lprolín alebo zvyšok L-azetidín-2-karboxylovej kyseliny, a jeho kyslé adičné soli pripravené s organickými alebo anorganickými kyselinami.
V predovšetkým výhodných uskutočneniach môžu mať takéto zlúčeniny nasledujúce štruktúry: 1 (etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-arginínaldehyd, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H) alebo 2 (N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-Larginínaldehyd, N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H) alebo 3 (D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-Larginínaldehyd, D-cHpl-Pro-Arg-H) alebo 4 (N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidín2-karbonyl-L-arginínaldehyd, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H), čo zodpovedá vzorcu I, kde Xaa predstavuje zvyšok alfa-substituovanej karbónovej kyseliny vzorca II, pričom R znamená cykloheptylmetylovú alebo cyklohexylovú skupinu, Q znamená etoxykarbonylaminoskupinu, metylaminoakupinu alebo hydroxylovú skupinu a Xbb predstavuje L-prolín alebo zvyšok L-azetidinyl-2-karboxylovej kyseliny.
Podľa druhého aspektu, predložený vynález ďalej poskytuje farmaceutickú kompozíciu, ktorá obsahuje antikoagulačný peptidylarginal alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ, podľa prvého aspektu vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič, pomocnú látku alebo riedidlo.
Podľa tretieho aspektu, predložený vynález poskytuje spôsob liečenia roztrúsenej intravaskulárnej koagulácie, pričom tento spôsob zahrňuje podávanie pacientovi, s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou, antikoagulačného činidla peptidylarginalu, zodpovedajúceho vzorcu I
Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde Xaa znamená zvyšok alfa-substituovanej karbónovej kyseliny vzorca II
Q-CH(R)-CO (II) kde Q predstavuje alkoxykarbonylaminoskupinu obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, metylaminoskupinu alebo hydroxylovú skupinu a R znamená cykloalkylmetylovú skupinu obsahujúcu 7 až 9 atómov uhlíka alebo 1-adamantylmetylovú skupinu
- 5 alebo cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 5 až 7 atómov uhlíka a Xbb predstavuje Lprolin alebo zvyšok L-azetidín-2-karboxylovej kyseliny, alebo jeho kyslej adičnej soli. V predovšetkým výhodných uskutočneniach môžu mať takéto zlúčeniny nasledujúce štruktúry: 1 (etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-arginínaldehyd, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H) alebo 2 (N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-Largininaldehyd, N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H) alebo 3 (D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-Larginínaldehyd, D-cHpl-Pro-Arg-H) alebo 4 (N-metyl-D-cyklohexylglycyl-Ľ-azetidín2-karbonyl4_-argininaldehyd, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H), čo zodpovedá vzorcu I, kde Xaa predstavuje zvyšok alfa-substituovanej karbónovej kyseliny vzorca II, pričom R znamená cykloheptylmetylovú alebo cyklohexylovú skupinu, Q znamená etoxykarbonylaminoskupinu, metylaminoskupinu alebo hydroxylovú skupinu a Xbb predstavuje L-prolín alebo zvyšok L-azetidinyl-2-karboxylovej kyseliny.
N H
( 4)
Podrobný opis vynálezu
Predložený vynález sa týka roztrúsenej intravaskulárnej koagulácie. Vynález sa týka predovšetkým lekárskej intervencie, v súvislosti s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou. Vynález poskytuje nové a lepšie zlúčeniny a spôsob liečenia DIC. Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu majú inhibičný účinok ako na voľný aj na zrazeninou viazaný trombín a faktor Xa ako aj na plazmin a aktivátory plazminogénu.
Tu citované patentové dokumenty a publikácie predstavujú poznatky z doterajšieho stavu techniky a týmto sú v celom rozsahu zahrnuté formou odkazu. Akékoľvek nezrovnalosti medzi týmito patentovými dokumentmi a publikáciami a zverejneným patentom budú rozhodnuté v prospech predloženého vynálezu.
Podľa prvého aspektu, predložený vynález poskytuje kompozíciu látok obsahujúcich peptidylarginal, všeobecného vzorca I
Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde Xaa znamená zvyšok alfa-substituovanej karbónovej kyseliny vzorca II
Q-CH(R)-CO (II) kde Q predstavuje alkoxykarbonylaminoskupinu obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, metylaminoskupinu alebo hydroxylovú skupinu a P\ znamená cykloalkylmetylovú skupinu obsahujúcu 7 až 9 atómov uhlíka, 1-adamantylmetylovú skupinu alebo cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 5 až 7 atómov uhlíka a Xbb predstavuje L-pro!ín alebo zvyšok L-azetidinyl-2-karboxylovej kyseliny, a jeho kyslé adičné soli pripravené s organickými alebo anorganickými kyselinami.
-7 Predovšetkým výhodné uskutočnenie podľa tohto aspektu vynálezu zodpovedá štruktúre 1 (etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-arginínaldehyd, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H):
Ďalšie predovšetkým výhodné uskutočnenie podľa tohto aspektu vynálezu zodpovedá štruktúre 2 (N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-arginínaldehyd, NMe-D-cHpa-Pro-Arg-H):
Ďalšie predovšetkým výhodné uskutočnenie podľa tohto aspektu vynálezu zodpovedá štruktúre 3 (D-cykloheptylIaktyl-L-prolyl-L-arginínaldehyd, D-cHpl-ProArg-H):
- 8 A dokonca ďalšie predovšetkým výhodné uskutočnenie podľa tohto aspektu vynálezu zodpovedá štruktúre 4 (N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidín-2-karbonylL-argininaldehyd, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H):
Zlúčeniny podľa vzorca 1, 2, 3 a 4 sa pripravia napríklad kondenzovaním Nalebo O-chráneného 2-zvyšku kyslej zložky s L-arginínlaktámom, chráneným na guanidínovej skupine benzylkarbonylovou skupinou a redukciou získaného tripeptid-laktámu na chránený tripeptid-aldehyd, odstránením chrániacej skupiny z guanidínovej skupiny arginínu a v prípade, že Q = metylaminoskupina alebo hydroxylová skupina vzorca II, tiež z koncovej metylaminoskupiny alebo hydroxylovej skupiny, a izolovaním peptidového derivátu vzorca I vo forme jej adičnej soli pripravenej s organickou alebo anorganickou kyselinou.
Zlúčeniny reprezentované vzorcom I sa pripravia a používajú vo forme kyslých adičných solí z dôvodu vyššej stability týchto foriem solí. V kyslých adičných soliach zlúčenín vzorca I aktivita spočíva v zásade a kyselina je menej významná, hoci pre terapeutické účely je výhodné použitie farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí. Príklady takýchto vhodných kyselín zahrňujú (a) minerálne kyseliny: kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina fosforečná, kyselina metafosforečná a kyselina sírová, (b) organické kyseliny: kyselina vínna, kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina jablčná, kyselina mliečna, kyselina fumarová, kyselina benzoová, kyselina glykolová, kyselina glukonová, kyselina jantárová, kyselina pamoová a kyseliny arylsulfónové, napríklad kyselina p-toluénsufónová. Výhodnou kyslou adičnou soľou je sulfátová soľ, predovšetkým hemisulfátová soľ.
-9Kyslé adičné soli sa pripravia konvenčným spôsobom, napríklad neutralizáciou voľnej zásaditej formy zlúčeniny vzorca I s kyselinou.
Dve reziduálne kyslé zložky sa môžu znázorniť ako D-Xaa-Xbb, kde Xaa znamená zvyšok α-substituovanej karboxylovej kyseliny vzorca Q-CH(R)-CO, kde Q znamená alkoxykarbonylaminoskupinu obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, R má vyššie definovaný význam a Xbb predstavuje L-prolín alebo zvyšok L-azetidín-2karboxylovej kyseliny. Ak Xaa, o-substituovaná alkylová kyselina, znamená a metylamino- alebo cthydroxy-kyselinu, t.j. Q znamená metylaminoskupinu alebo hydroxylovú skupinu, dve reziduálne kyslé zložky sa môžu znázorniť ako P-D-XaaXbb, kde P znamená N-chrániacu skupinu, ako je benzyloxykarbonylová (Z) alebo ŕerc-butoxykarbonylová (Boe) skupina, výhodne tetrahydropyranylová (THP) skupina.
Acyldipeptid použitý ako východiskový materiál pre zlúčeniny obsahujúce kyselinový zvyšok ctaminoskupinu alebo cemetylaminoskupinu, sa pripraví acyláciou aaminokyseliny so zodpovedajúcim esterom kyseliny chlórmravčej, za vzniku alkylkarbonylaminokyseliny, obsahujúcej 1 až 3 atómy uhlíka, a benzyloxykarbonylaminokyseliny, ktoré sa potom viažu k L-prolínu alebo ku L-azetidín-2karboxylovej kyseline, pričom sa získa D-Xaa-Xbb a Z-aminoacyl Xbb, ktorý sa Nmetyluje za vzniku požadovanej P-D-Xaa-Xbb.
D-Xaa, požadované na viazane k Xbb, sa môže výhodne pripraviť acetyláciou racemickej DL-Xaa zlúčeniny, konvertovaním DL-acetylaminokyseliny na jej metylester a enzymatickým štiepením acetyl-DĽ-Xaa-OMe racemického esteru. Takto získaný acetyl-D-Xaa-OMe sa potom saponifikuje a deacetyluje, následne sa konvertuje na požadovanú N-chránenú D-aminokyselinu.
Požadovaná D-cthydroxykyselina sa výhodne môže získať zo zodpovedajúcej D-a-aminokyseliny. Potom sa konvertuje svoju O-chránenú formu a viaže sa k Xbb, za vzniku požadovanej P-D-Xaa-Xbb.
Podľa druhého aspektu, predložený vynález sa týka farmaceutickej kompozície, obsahujúcej peptidylarginal podľa prvého aspektu vynálezu, a farmaceutický prijateľný nosič, pomocnú látku alebo riedidlo.
- 10Farmaceutické prípravky obsahujú účinné množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca I, alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, a známe farmaceutický prijateľné nosiče, plnidlá, riedidlá a/alebo ďalšie farmaceutické pomocné látky.
Vyššie uvedenými nosičmi, riedidlami alebo plnidlami môžu byť voda, alkoholy, želatína, laktóza, sacharóza, škrob, pektín, stearát horečnatý, kyselina stearová, mastenec, rozličné oleje živočíšneho alebo rastlinného pôvodu, ďalej tiež glykoly, ako je napríklad propylénglykol alebo polyetylénglykol.
Farmaceutickými pomocnými látkami môžu byť konzervačné látky, rozličné prírodné alebo syntetické emulgátory, dispergačné látky alebo zmáčacie činidlá, farbiace látky, aromatické činidlá, pufrovacie činidlá, látky podporujúce dezintegráciu a ďalšie materiály zlepšujúce biologickú dostupnosť účinnej zložky.
Farmaceutické kompozície podľa predloženého vynálezu sa môžu pripraviť vo forme zvyčajných prípravkov, ako sú orálne kompozície (podávané cez ústa ako tablety, kapsule, prášky, pilulky, dražé alebo granuláty) ako aj parenterálne kompozície (liečivá podávané s vylúčením gastrointestinálneho systému, ako sú injekcie, infúzie, čipky, náplaste alebo masti).
Podľa tretieho aspektu, predložený vynález sa týka spôsobu liečenia pacienta s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou, pričom tento spôsob zahrňuje podávanie pacientovi s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou peptidylarginalu, zodpovedajúceho vzorcu Xaa-Xbb-Arg-H (vzorec I), kde Xaa a Xbb majú vyššie definované významy, alebo podávanie jeho farmaceutický prijateľnej kyslej adičnej soli. Peptidylarginaly sa tiež označujú ako deriváty peptidylarginínaldehydu.
Podľa tohto aspektu vynálezu, sa predložený vynález týka spôsobu liečenia roztrúsenej intravaskulámej koagulácie, pričom tento spôsob zahrňuje podávanie živočíšnemu pacientovi, vrátane humánneho pacienta, peptidylarginalov podľa tohto vynálezu. Pri spôsobe podľa tohto aspektu vynálezu sa terapeuticky účinné množstvo peptidylarginalu podľa tohto vynálezu podáva počas terapeuticky účinného časového obdobia živočíchovi, vrátane človeka, ktorý má v tele roztrúsenú intravaskulárnu koaguláciu. Takýmto podávaním môže byť výhodne intravenózne alebo subkutánne podávanie, predovšetkým výhodne intravenózne
-11 podávanie. Podávanie terapeutických kompozícií sa môžu uskutočňovať s použitím známych postupov a dávok a počas časového obdobia účinného na zníženie symptómov alebo znakov príznačných pre DIC. Pri systémovom podávaní sa terapeutická kompozícia výhodne podáva v dávke, ktorá je postačujúca na dosiahnutie hladín peptidylarginalov v krvi v množstve približne 6 μΜ až približne 100 μΜ. Celková dávka bude výhodne v rozsahu od približne 0,1 mg do približne 50 mg peptidylarginalu na kilogram telesnej hmotnosti a deň. Môže byť potrebné, aby sa jedincovi v prípade jednorazovej liečby podávalo simultánne alebo následné terapeuticky účinné množstvo jednej alebo viacerých terapeutických kompozícií podľa vynálezu.
Nasledujúce príklady sú určené na ďalšie ilustrovanie určitých, predovšetkým výhodných uskutočnení vynálezu a nie sú v žiadnom prípade mienené ako obmedzenie rozsahu tohto vynálezu. Ak nie je uvedené inak, v nasledujúcich experimentoch sa ľudský trombín (3 000 NIH U/mg), ľudský albumín a ľudský fibrinogén získali od spoločnosti Sigma Aldrich Kft. (Budapešť, Maďarsko) a ľudský faktor Xa (8 pg/U) od spoločnosti Enzýme Research Laboratories (Swansea, Spojené Kráľovstvo). Činidlo APTT bolo od spoločnosti REANAL (Budapešť, Maďarsko) a činidlo PT, Simplastin D bolo zakúpené od spoločnosti ORGANON, TEKNIKA (Eppelheim, Nemecko).
Skratky pre aminokyseliny, peptidy, substituenty a reagenty sa použili v súlade s dohodami IUPAC-IUB. Takýmito skratkami, ktoré sa vyskytujú v tejto prihláške, sú nasledujúce: Arg = L-arginin, Boe = terc-butoxykarbonyl, Bzl = benzyl, Chg = L-cyklohexylglycín, DCHA = dicyklohexylamin, DHP = dihydropyrán, Eoc etoxykarbonyl, Gly - glycín, Me = metyl, MePhe = N-metyl-L-fenylalanín, Moc = metoxykarbonyl, Pro = L-prolín, pNA = p-nitroanilino, TFA = kyselina trifluóroctová, THP = tetrahydropyranyl, Tos = p-toluénsulfonyl, Z = benzyloxykarbonyl. Skratky kyselín, ktoré nie sú obvyklé a sú použité v tejto prihláške, sú Ada = adamantyl-Lalanín, Aze = kyselina L-azetidín-2-karboxyiová, N-Me-D-cHpa = N-metyl-D-cykloheptylalanín, D-cHpa = D-cykloheptylalanín alebo kyselina (R)-2-amino-3-cykloheptylpropiónová, D-Hla = kyselina D-cykloheptyl-mliečna alebo kyselina (R)-2hydroxy-3-cykloheptylpropiónová.
- 12 V príkladoch zaznamenané hodnoty Rf sa stanovili pomocou chromatografie na tenkej vrstve s použitím silikagélu ako adsobenta (DG-Alufolien Kieselgel 60 F254, Merck, Darmstadt), v nasledujúcich vyvolávacích systémoch. Čísla systémov sú uvedené v zátvorkách po skratke Rf.
1. etylacetát
2. etylacetát - n-hexán (1:4)
3. etylacetát - n-hexán (1:1)
4. etylacetát - cyklohexán (15:85)
5. chloroform - acetón (95:5)
6. etylacetát - pyridín - kyselina octová - voda (960:20:6:11)
7. etylacetát - pyridín - kyselina octová - voda (480:20:6:11)
8. etylacetát - pyridín - kyselina octová - voda (240:20:6:11)
9. etylacetát - pyridín - kyselina octová - voda (120:20:6:11)
10. etylacetát - pyridín - kyselina octová - voda (90:20:6:11)
11. etylacetát - pyridín - kyselina octová - voda (60:20:6:11)
12. etylacetát - pyridín - kyselina octová - voda (45:20:6:11)
13. etylacetát - pyridín - kyselina octová - voda (30:20:6:11)
Faktory kapacity (k'), špecifikované v príkladoch, sa stanovili s použitím zariadenia “Pharmacia LKB Analytical HPLC Systém Two”, nasledovne:
Kolóna: LiChrospher RP-18: 12 μιη, 240 x 4 mm.
Teplota kolóny: teplota prostredia.
Elučné činidlá: Rozpúšťadlo A, 0,1 % TFA/voda; rozpúšťadlo B, 0,1 % TFA/acetonitril.
Profil gradientu: 0 -> 15 minút, 30 60 % B, potom izokraticky 60 % B.
Rýchlosť prietoku rozpúšťadla: 1 ml/minútu.
Detektor: LKB 2141 UV Monitgor; vlnová dĺžka: 214 nm.
Injektor: Rheodyne 7125, dávkovacia slučka: 100 μΙ.
Čerpadlá: 2 LKB, typ 2148. Kontrolný systém: LKB HPLC Manager.
Koncentrácia vzorky: 1 mg/ml v rozpúšťadle A, injektovaný objem 25 μΙ. Čas analýzy: 40 minút.
Acyl-arginínaldehydy sú prítomné v rovnovážnych štruktúrach, t.j. ako aldehyd, hydrát aldehydu a dve aminocyklolové formy. V priebehu HPLC analýzy
- 13sa hydrát aldehydu a jedna alebo obidve aminocyklolové formy objavia ako dva alebo tri separátne piky. Acyl-arginínaldehydy, opísané v príkladoch, sú určené dvomi alebo tromi k' hodnotami.
Hmotnostné spektrometria. Merania FAB pozitívnej ionizácie sa uskutočnili v zariadení Finnigan MAT 8430. Vzorky sa rozpustili v základnom materiále, mnitrobenzylalkohole (NBA), a zaviedli sa priamo do iónového zdroja. V spektre peptidyl-arginínaldehydov bolo možné detegovať ďalšiu molekulu, a to molekulu vedľajšej zlúčeniny vytvorenej s NBA: [M+H]+ a [M+H+NBA]+. V príkladoch sa údaje FAB spektra špecifikovali v súlade s uvedeným. Merania ESI pozitívnej ionizácie sa uskutočnili v zariadení VG Quatro (Fisons). Vzorky sa rozpustili v zmesi acetonitril - voda (1:1) obsahujúcej 1% (obj./obj.) kyseliny mravčej a zaviedli sa s 10 ml dávkovacou slučkou do iónového zdroja s rýchlosťou prietoku 15 až 25 ml/minútu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Syntéza hemisulfátu etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-arginínaldehydu Krok 1: Etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktám
7,85 g (20,1 mM) ferc-butoxykarbonyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu [(Bajusz a kol., J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] sa suspendovalo v 20 ml chloroformu, potom sa za miešania a chladenia ľadom pridalo 20 ml etylacetátu nasýteného s plynným HCI (0,11 až 0,15 g/ml). Odštiepenie Boe skupiny sa monitorovalo pomocou chromatografie na tenkej vrstve [Rf (11) = 0,5 (voľná zlúčenina); 1,0 (Boc-zlúčenina)j. Na konci reakcie sa suspenzia zriedila so 40 ml dietyléteru, vytvorená kryštalická hmota sa odfiltrovala, premyla sa s 10 ml acetónu a 10 ml dietyléteru a vysušila sa pri zníženom tlaku nad KOH. Výsledný hydrochlorid NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu sa rozpustil v 20 ml dimetylformamidu, ochladil sa na teplotu -20 °C a pridal sa k nasledujúcemu zmesnému anhydridu.
- 14 7,12 g (20,1 mM) etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolínu (príklad 1, krok 1) sa rozpustilo v 20 ml dimetylformamidu, zmes sa ochladila na-15 °C, potom sa za miešania pridalo 2,23 ml (20,1 mM) N-metylmorfolínu a 2,65 ml (20,1 mM) izobutylchlórmravčanu. Po 10 minútach miešania sa pridal vyššie uvedený dimetylformamidový roztok NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu a potom sa pridal trietylamín v množstve postačujúcom na úpravu pH reakčnej zmesi na hodnotu 8 (potrebných približne 2,8 ml). Reakčná zmes sa miešala pri-10°C počas 30 minút, potom pri teplote 0 °C počas jednej hodiny. Soli sa následne odfiltrovali a filtrát sa zriedil so 100 ml etylacetátu. Výsledný roztok sa premyl s 3 x 25 ml vody, 10 ml 1 M KHSO4 a 3 x 10 ml vody, vysušil sa nad bezvodým Na2SO4 a odparil sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Získaný produkt sa podrobil chromatografii na silikagélovej kolóne, pričom sa ako adsorbent použilo 200 g Kieselgelu 60 (0,040 až 0,063 mm) a ako elučné činidlo sa použil etylacetát. Frakcie obsahujúce výhradne čistý produkt [Rf (1) = 0,60] sa spojili a odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok po odparení sa kryštalizoval z diizopropyléteru.
Výťažok 10,84 g (86,1 %), Rf (1) = 0,55 až 0,65.
FAB hmotnostné spektrum (627 [M+H]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Krok 2: Etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbor>yl-L-arginínaldehyd
8,02 g (12,8 mM) etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu (príklad 1, krok 1) sa rozpustilo v 15 ml tetrahydrofuránu a potom sa za miešania a pri teplote neprevyšujúcej -50 °C pridal roztok 3,6 mM LiAIH4 rozpustený v tetrahydrofuráne. Postup redukcie sa monitoroval pomocou chromatografie na tenkej vrstve (rozpúšťadlo 7) ako vyvíjacim rozpúšťadlom a v prípade potreby sa pridal ďalší podiel LiAIH4. K tejto reakčnej zmesi sa po kvapkách za konštantného miešania a chladenia pridával 0,5 M KHSO4, až do dosiahnutia pH hodnoty 3, potom sa pridalo 35 ml vody. Výsledný roztok sa extrahoval s 2 x 15 ml hexánu potom s 3 x 20 ml dichlórmetánu. Dichlórmetánové extrakty sa spojili, premyli sa s 3 x 15 ml vody, 15 ml chladného 5 %-ného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a znova s 15 ml vody, vysušili sa nad bezvodým
- 15 Na2SO4 a odparili sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok po odparení sa spracoval s diizopropyléterom, prefiltroval sa a vysušil pri zníženom tlaku.
Výťažok 7,08 g (88 %), Rf (8) - 0,40 až 0,50.
FAB hmotnostné spektrum (629 [M+H]+, 782 [M+H+NBAf) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Krok 3: Hemisulfát etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydu
6,91 g (11,0 mM) etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínaldehydu (príklad 1, krok 2) sa rozpustilo v 85 ml etanolu a pridalo sa 11,25 ml 0,5 M kyseliny sírovej a potom 0,7 g Pd-C katalyzátora suspendovaného v 14 ml vody a zmes sa hydrogenovala pri teplote približne 10 °C. Postup reakcie sa monitoroval s použitím chromatografie na tenkej vrstve. Po ukončení reakcie (približne 15 minút) sa katalyzátor odfiltroval a filtrát sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa zahustil na približne 7 až 9 ml. Zvyšok sa zriedil s 80 ml vody, extrahoval sa so 4 x 15 ml dichlórmetánu a vodný roztok sa nechal stáť pri teplote 20 až 22 °C počas 24 hodín. Roztok sa potom znova extrahoval s 3 x 15 ml dichlórmetánu a pH sa upravilo na hodnotu 3,5 s použitím iónomeničovej živice Dowex AG 1-X8 (HO), roztok sa potom vysušil vymrazenim.
Výťažok 4,90 g (82 %), Rf (11) = 0,35 až 0,45. [α]0 2° = -77,6 ° (c = 1,018; voda).
HPLC: k'= 1,695 a 2,328.
FAB hmotnostné spektrum (495 [M+H]+, 648 [M+H+NBA]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Syntéza východiskových materiálov
Etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolin
Krok A: 1-cykloheptylacetyl-2,5-dimetylpyrazol
58,6 g (375 mM) kyseliny cykloheptyloctovej [Protiva a kol., Collect. Czech., Chem., Commun., 55, 1278-1289 (1990)] sa rozpustilo v 375 ml tetrahydrofuránu,
- 16zmes sa ochladila na teplotu -15 °C, potom sa miešania pridalo 41,3 ml (375 mM) N-metylmorfolínu, 49,50 ml (375 mM) izobutylchlórmravčanu a, po 10 minútach miešania pri teplote -10 °C, sa pri teplote -10 °C pridal roztok 37,85 g (393,75 mM) 3,5-dimetylpyrazolu v 300 ml tetrahydrofuránu. V miešaní sa pokračovalo pri teplote -10 °C počas 30 minút, pri teplote 0 °C počas jednej hodiny a pri laboratórnej teplote počas 3 hodín. Soli sa potom odfiltrovali, filtrát sa odparil pri zníženom tlaku a zvyšok sa rozpustil v 900 ml etylacetátu. Zostávajúci roztok sa potom premyl s 3 x 80 ml 1 M NaOH, 89 ml vody, 3 x 80 ml 1 M HCI a vodou až do neutrálnej reakcie. (Zásadité premývacie roztoky sa spojili a okyslili sa, čím sa pripravilo približne 5,8 g, 37,1 mM, kyseliny cykloheptyloctovej.) Roztok etylacetátu sa vysušil nad bezvodým Na2SO4, potom sa odparil pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Výsledný olejový produkt sa nechal reagovať s 340 mM 1-cykloheptylacetyl-2,5dimetylpyrazolom a použil sa v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia. Rf (2) = 0,8 až 0,9 (kyselina: 0,3 až 0,4).
Krok B: 1-cykloheptylaldehyd
K 350 ml tetrahydrofuránu ochladenému na teplotu -30 °C sa pridalo 12,83 g (338 mM) LiAIH4. Potom sa po kvapkách za miešania pri teplote -25 °C pridal roztok olejového produktu (príklad 1, krok A) v 250 ml chladného tetrahydrofuránu. Reakcia sa monitorovala pomocou chromatografie na tenkej vrstve. V prípade potreby sa pridalo 30 až 40 ml roztoku LiAIH4 v tetrahydrofuráne (3 g/100 ml). Po ukončení redukcie sa chladná zmes okyslila so 6 M HCI a zriedila sa s etylacetátom (500 ml). Vodná fáza sa extrahovala s etylacetátom, organické roztoky sa spojili, premyli sa vodou do neutrálnej reakcie, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4 a potom sa odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Výsledným olejovým produktom bol surový 1-cykloheptylaldehyd znečistený 2,5-dimetylpyrazolom (DMP). Rf (2) = 0,7 až 0,8 (DMP: 0,25 až 0,35).
K výslednému olejovému produktu (62,6 g) rozpustenému v 350 ml metanolu sa za miešania pridal roztok 36,4 g NaHSO3 v 70 ml vody. Reakčná zmes sa uchovávala cez noc v chladničke. Vyzrážaný materiál sa odfiltroval, premyl sa chladnou zmesou 35 ml metanolu a 7 ml vody, potom s dietyléterom a vysušil sa. Pevným materiálom je adukt bisulfitu sodného (73,87 g, 302,38 mM), (Rf (14) = 0,55 až 0,65), ktorý sa pridal k zmesi v 450 ml metylénchloridu a 450 ml
- 17 vody obsahujúcej 47,7 g (450 mM) Na2CO3. Reakčná zmes sa miešala cez noc. Dve fázy sa oddelili, organická fáza sa premyla vodou, vysušila sa nad bezvodým Na2SO4, potom sa odparila pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Výsledným olejovým produktom (36,97 g, 263,64 mM) bol čistý 1-cykloheptylacetaldehyd, ktorý sa priamo použil v nasledujúcej reakcii. Rf (2) = 0,7 až 0,8.
Krok C: 5-cykloheptylmetylhydantoín
K roztoku aldehydu (príklad 1, krok B) v 50 %-nom vodnom etanole (857 ml; 3,25 ml/mM)sa za miešania pri teplote 50 až 55 °C pridalo 15,5 g (290 mM; 1,1 ekv.) chloridu amónneho, 27,87 g (659 mM; 2,5 ekv.) uhličitanu amónneho a 18,9 g (290 mM; 1,1 ekv.) kyanidu draselného a v miešaní sa pri teplote 50 °C pokračovalo počas 48 hodín. Vyzrážaný materiál sa odfiltroval, premyl sa s 50 %ným etanolom (100 ml) a vysušil sa vo vákuovom exsikátore. Ako prvý výťažok sa získalo 42,26 g (206,97 mM) materiálu. Z matečného lúhu sa oddestiloval etanol, zvyšok sa extrahoval s etylacetátom (1 x 250 ml a 2 x 100 ml), organické roztoky sa spojili, premyli sa vodou (3 x 50 ml), vysušili sa nad bezvodým Na2SO4, potom sa odparili pri tlaku 2,0 až 2,05 kPa. Zvyšok sa trituroval s diizopropyléterom, prefiltroval sa a vysušil. Ako druhý výťažok sa získalo 3,6 g (17,12 mM) materiálu; celkový výťažok predstavoval 45,86 g (218 mM, 82,5 %) 5-cykloheptylmetylhydantoínu. Teplota topenia: 240,9 °C. Rf (6) = 0,73 až 0,78.
Analýza pre CnH18N2O2 (210,28). Vypočítané: C = 62,83 %; H - 8,63 %; N = 13,32 %. Nájdené: C = 63,09 %; H = 8,67 %; N = 13,25 %.
Krok D: hydrochlorid DL-cykloheptylalanínu g (1,55 M) KOH sa za miešania a zahrievania rozpustilo v 435 ml nbutanolu a pridalo sa 45,71 g (217,4 mM) 5-cykloheptylmetylhydantoínu (príklad 1, krok C). Takto získaný roztok sa refluxoval počas 72 hodín, potom sa zriedil vodou a odparil sa pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v 220 ml vody, okyslil sa na pH hodnotu 2 s cc. HCI (približne 130 ml) a uchovával sa cez noc v chladničke. Vyzrážaný materiál sa odfiltroval, premyl sa s 50 ml vody a vysušil sa vo vákuovom exsikátore. Takto získaný produkt (106,5 g) sa považoval za 217 mM DLcykloheptylalanínu a použil sa v ďalších reakciách. Rf (11) = 0,2 až 0,3.
- 18Krok E: hydrochlorid metylesteru DL-cykloheptylalanínu
23,65 ml (325,25 mM) SOCI2 sa za miešania pri teplote medzi 0°C a-5 °C nakvapkalo do 217 ml metanolu. Potom sa pridal DL-cykloheptylalanín (217 mM z príkladu 1, krok D) a zmes sa miešala počas 24 hodín. Konverzia sa monitorovala pomocou TLC, Rf (11) = 0,75 až 0,85 (ester), 0,3 až 0,4 (kyselina). V prípade stanovenia nezreagovanej aminokyseliny sa reakčná zmes ochladila na -5 °C, prikvapkalo sa 118 ml SOCI2 a reakčná zmes sa miešala počas ďalších 24 hodín. Nerozpustené soli sa potom odfiltrovali, premyli sa metanolom (2 x 50 ml) a spojené metanolové roztoky sa odparili. Zvyšok sa znova rozpustil v metanole a opäť sa odparil. Napokon sa zvyšok trituroval s diizopropyléterom, prefiltroval sa, premyl s diizopropyléterom a vysušil vo vákuovom exsikátore nad KOH a P2Os. Získalo sa 33,68 g (142,85 mM) hydrochloridu metylesteru DL-cykloheptylalanínu. Rf (11) = 0,5 až 0,6. Teplota topenia: 95,4 až 96,5 °C.
Krok F: Metylester acetyl-DL-cykloheptylalanínu
K roztoku 33,68 g (142,85 mM) hydrochloridu metylesteru DL-cykloheptylalanínu (príklad 1, krok E) v 140 ml pyridínu sa po kvapkách v priebehu jednej hodiny za miešania a chladenia ľadovým kúpeľom pridal anhydrid kyseliny octovej (16,2 ml, 171,43 mM). Reakčná zmes sa miešala počas 24 hodín pri teplote prostredia a potom sa odparila pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v 300 ml etylacetátu, premyl sa s 1 M KHSO4 (3 x 50 ml) a vodou (3 x 50 ml), vysušil sa nad bezvodým Na2SC>4 a potom sa odparil pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Výsledný olejový produkt sa trituroval s diizopropyléterom na pevnú látku, ktorá sa odfiltrovala, premyla sa s diizopropyléterom a potom vodou a vysušila sa v exsikátore. Získalo sa 24,36 g (100,94 mM, 70,4%) metylesteru acetyl-DL-cykloheptylalaninátu (acetyl-DL-esteru). Rf (1) = 0,55 až 0,65. Teplota topenia: 69 až 71 °C.
Analýza pre C13H23NO3 (241,332). Vypočítané: C = 64,70 %; H = 9,61 %; N = 5,80 %. Nájdené: C = 64,75 %; H - 9,76 %: N - 5,85 %.
Krok G: Metylester acetyl-D-cykloheptylalanínu (enzymatické štiepenie metylesteru acetyl-DL-cykloheptylalanínu)
-19K roztoku 8,69 g (36 mM) metylesteru acetyl-DL-cykloheptylalanínu, acetylDL-esteru, (príklad 1, krok F) v 36 ml toluénu sa pridalo 72 ml vody a 36 ml Subtilisin Carlsberg (proteáza typ VIII, Sigma). Enzymatická hydrolýza Lenantioméru, acetyl-L-esteru, sa uskutočňovala pri hodnote pH 7,0, ktoré sa udržiavalo pomocou autotitrátora, naplneného s 3 M NaOH. Keď sa spotreba NaOH zastavila (pri 5,8 ml, 17,4 mM), reakčná zmes sa zriedila s 36 ml toluénu a oddelili sa dve vrstvy. Vodná fáza sa premyla s 2 x 30 ml toluénu. Spojené toluénové roztoky obsahovali acetyl-D-ester a spojené vodné roztoky obsahovali sodnú soľ acetyl-L-kyseliny.
Po vysušení nad bezvodým Na2SO4 sa spojené toluénové roztoky odparili pri zníženom tlaku, pričom sa získalo 3,8 g (15,75 mM) acetyl-D-esteru, Rf (1) = 0,55 až 0,65, ktorý sa priamo použil v nasledujúcom kroku.
Spojené vodné roztoky sa okyslili a extrahovali sa s 3 x 30 ml etylacetátu. Spojené etylacetátové roztoky sa premyli vodou, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4 a odparili sa pri zníženom tlaku, pričom sa získalo 4,0 g (17,6 mM) acetyl-Lkyseliny, Rf (7) = 0,38 až 0,42.
Podobným spôsobom sa z východiskových 9,65 g (40 mM) acetyl-DL-esteru (príklad 1, krok F) pripravilo 4,6 g (19,06 mM) acetyl-D-esteru a 4,44 g (19,55 mM) acetyl-L-kyseliny.
Krok H: Hydrochlorid D-cykloheptylalanínu
7,24 g (30 mM) acetyl-D-esteru (príklad 1, krok G) sa suspendovalo v 120 ml 6 M HCI a zmes sa refluxovala počas 3 hodín. Voľná aminokyselina sa oddelila vo forme kryštálov. Reakčná zmes sa ochladila, uchovávala sa v chladničke cez noc, prefiltrovala sa, premyla sa chladnou vodou a éterom a potom sa vysušila vo vákuovom exsikátore. Získalo sa 5,9 g (26,69 mM, 89%) hydrochloridu Dcykloheptylalanínu. Rf (12) = 0,10 až 0,15. [cžJd2° = -11 ° (c = 0,4; 1 M HCI).
Analýza pre C10Hi9NO2 . HCI (221,728). Vypočítané: C = 54,17 %; H = 9,09 %; N = 6,32 %; Cl = 15,99 %. Nájdené: C = 54,27 %; H = 9,27 %; N = 6,30 %; Cl = 16,2 %.
-20Krok i: Etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanín
K roztoku 4,43 g (20 mM) hydrochloridu D-cykloheptylalanínu (príklad 1, krok
H) v 20 ml dimetylformamidu sa pridalo 5,6 ml (40 mM) trietylamínu a 3,95 g (21 mM) (N-hydroxysukcínimidyl)etylkarbonátu*. Po miešaní pri laboratórnej teplote počas 3 hodín sa reakčná zmes odparila, zvyšok rozpustený v 40 ml etylacetátu sa premyl s 2 x 30 ml 1 M KHSO4 a vodou až do neutrálnej reakcie. Organická vrstva sa potom vysušila nad bezvodým Na2SO4 a následne sa odparila pri tlaku 2,0 až
2,5 kPa. Výsledný olejový produkt (4,47 g, približne 17 mM) bol etoxykarbonyl-Dcykloheptylalanín [Rf (7) = 0,85 až 0,90], ktorý sa priamo použil v nasledujúcom kroku. [ajD 20 = +6,3 0 (c = 1; metanol).
‘Príprava (N-hydroxysukcínimidyl)etylkarbonátu
11,5 g (100 mM) N-hydroxysukcínimidu sa rozpustilo v 100 ml tetrahydrofuránu, zmes sa ochladila na teplotu -10 °C, potom sa za miešania pridalo 15,4 ml (110 mM) trietylamínu a 10,45 ml (110 mM) etylchlórkarbonátu. Po dvoch hodinách miešania pri laboratórnej teplote sa zmes prefiltrovala a fíltrát sa odparil pri zníženom tlaku. Olejový zvyšok sa kryštalizoval za chladenia. Kryštalický materiál sa suspendoval v ľahkom petrolétere, prefiltroval sa a vysušil vo vákuovom exsikátore. Výťažok: 12,78 g (68,3 %). Teplota topenia: 39,4 až 39,7 °C.
Analýza pre C7H9NO5 (187,15). Vypočítané: C = 44,92 %; H = 4,85 %; N = 7,48 %. Nájdené: C = 44,67 %; H = 4,81 %; N = 7,27 %.
Krok J: Etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-Lprolin
Roztok etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanínu (približne 17 mM, príklad 1, krok
I) v 17 ml THF sa spojil s 3,74 g (20 mM) N-hydroxysukcinimidu, ochladil sa na teplotu -10 °C a spojil sa s roztokom 4,12 g (20 molov) 1,3-dicyklohexylkarbodiimidu v približne 20 ml THF. Zmes sa miešala počas 5 hodín pri teplote 22 °C, po tejto dobe sa pomocou chromatografie na tenkej vrstve stanovilo ukončenie tvorby aktívneho esteru.
K miešanej reakčnej zmesi sa pridal L-prolín (1,95 g, 17 mM) a následne sa pridalo 2,3 ml (17 mM) trietylamínu. Reakčná zmes sa miešala pri teplote 22 °C
-21 počas približne 15 hodín, po tejto dobe sa pomocou chromatografie na tenkej vrstve stanovilo ukončenie spotreby aktívneho esteru. Reakčná zmes sa prefiltrovala, filtračný koláč sa premyl s 10 ml THF a filtrát sa odparil. Zvyšok sa rozpustil v 30 ml etylacetátu a 30 ml vody. Vodná fáza sa premyla s 2 x 20 ml etylacetátu, okyslila sa s 20 ml 1 M KHSO4 a extrahovala sa s 3 x 20 ml etylacetátu. Spojené etylacetátové roztoky sa premyli vodou do neutrálnej reakcie, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4 a potom sa odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Po triturovaní s diizopropyléterom sa zvyšok kryštalizoval. Táto kryštalická suspenzia sa ochladila v chladničke, prefiltrovala sa s ľahkým petroléterom a vysušila sa vo vákuovom exsikátore. Získalo sa 4,2 g (11,85 mM, 70%) etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolinu. Rf (7) = 0,45 až 0,55.
Analýza pre Ci8H3oN204 (354,45). Vypočítané: C = 60,99 %; H = 8,53 %; N = 7,90 %. Nájdené: C = 60,14 %; H = 8,55 %; N = 7,38 %.
FAB hmotnostné spektrum (355 [M+H]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Príklad 2
Syntéza sulfátu N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-arginínaldehydu
Krok 1: Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktám
3,93 g (10 mM) ŕerc-butyloxykarbonyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu [(Bajusz a kol., J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] sa suspendovalo v 10 ml chloroformu, potom sa za miešania a chladenia ľadom pridalo 10 ml etylacetátu nasýteného s plynným HCI (0,11 až 0,15 g/ml). Odštiepenie Boe skupiny sa monitorovalo pomocou chromatografie na tenkej vrstve [Rf (11) = 0,5 (voľná zlúčenina); 1,0 (Boc-zlúčenina)]. Na konci reakcie sa suspenzia zriedila s 20 ml dietyléteru, vytvorená kryštalická hmota sa odfiltrovala, premyla sa s 5 ml acetónu a 5 ml dietyléteru a vysušila sa pri zníženom tlaku nad KOH. Výsledný hydrochlorid NG-benzyloxykarbonyl-L·argininlaktámu sa rozpustil v 10 ml dimetyiformamidu, ochladil sa na teplotu -20 °C a pridal sa k nasledujúcemu zmesnému anhydridu.
-224,32 g (10 mM) benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolín (príklad 2, krok C) sa rozpustil v 10 ml dimetylformamidu, ochladil sa na -15 °C, potom sa za miešania pridalo 1,12 ml (10,1 mM) N-metylmorfolínu a 1,33 ml (10,1 mM) izobutylchlórmravčanu. Po 10 minútach miešania sa pridal vyššie uvedený dimetylformamidový roztok NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu a potom sa pridal trietylamín v množstve postačujúcom na úpravu pH reakčnej zmesi na hodnotu 8 (potrebných približne 1,4 ml). Reakčná zmes sa miešala pri teplote -10 °C počas 30 minút, potom pri teplote 0 °C počas jednej hodiny. Soli sa následne odfiltrovali a filtrát sa zriedil so 100 ml etylacetátu. Výsledný roztok sa premyl s 3 x 15 ml vody, 6 ml 1 M KHSO4 a 3 x 6 ml vody, vysušil sa nad bezvodým Na2SC>4 a odparil sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Získaný produkt sa podrobil chromatografii na silikagélovej kolóne, pričom sa ako adsorbent použilo 100 g Kieselgelu 60 (0,040 až 0,063 mm) a ako elučné činidlo sa použil etylacetát. Frakcie obsahujúce výhradne čistý produkt [Rf (1) = 0,70] sa spojili a odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok po odparení sa kryštalizoval z diizopropyléteru.
Výťažok 6,0 g (85 %), Rf (1) = 0,65 až 0,75.
FAB hmotnostné spektrum (703 [M+H]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Krok 2: Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-pro!yl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginín-aldehyd
5,62 g (8 mM) benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NGbenzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu (príklad 2, krok 1) sa rozpustilo v 10 ml tetrahydrofuránu a potom sa za miešania pri teplote neprevyšujúcej -50 °C pridal roztok 2,25 mM LiAIH4, rozpusteného v tetrahydrofuráne. Postup redukcie sa monitoroval pomocou chrómatografie na tenkej vrstve (rozpúšťadlo 7 ako vyvíjacie rozpúšťadlo) a v prípade potreby sa pridal ďalší podiel LiAIH4. K tejto reakčnej zmesi sa po kvapkách za konštantného miešania a chladenia pridával 0,5 M KHSO4, až kým sa nedosiahla hodnota pH 3, potom sa pridalo 25 ml vody. Výsledný roztok sa extrahoval s 2 x 10 ml hexánu, potom s 3 x 15 ml dichlórmetánu. Dichlórmetánové extrakty sa spojili, premyli sa s 3 x 15 ml vody, 15 ml chladného roztoku NaHCOs a znova s 15 ml vody, vysušili sa nad bezvodým
-23Na2SC>4 a odparili sa pri tlaku 2,0 až 2,05 kPa. Zvyšok po odparení sa spracoval s diizopropyléterom, prefiltroval sa a vysušil pri zníženom tlaku.
Výťažok 4,95 g (88 %), Rf (1) = 0,20 až 0,25.
FAB hmotnostné spektrum (705 [M+H]+, 858 [M+H+NBA]*) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Krok 3: Sulfát N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-arginínaldehydu
4,6 g (6,5 mM) benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NGbenzyloxykarbonyl-L-arginínaldehydu (príklad 2, krok 2) sa rozpustilo v 65 ml etanolu a pridalo sa 13,5 ml 0,5 M kyseliny sírovej a potom sa pridalo 0,4 g Pd-C katalyzátora suspendovaného v 10 ml vody; reakčná zmes sa hydrogenovala pri teplote približne 10 °C. Postup reakcie sa monitoroval pomocou chromatografie na tenkej vrstve. Po ukončení reakcie (približne 15 minút) sa katalyzátor odfiltroval a filtrát sa zahustil na objem približne 5 až 7 ml pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok sa zriedil s 50 ml vody, extrahoval sa so 4 x 10 ml dichlórmetánu a vodný roztok sa nechal stáť pri teplote 20 až 22 °C počas 24 hodín. Roztok sa znova extrahoval s3x10ml dichlórmetánu a pH roztoku sa upravilo na hodnotu 3,5 s použitím iónomeničovej živice Dowex AG 1-X8, potom sa roztok vysušil vymrazením.
Výťažok 2,85 g (82 %), Rf (9) = 0,35 až 0,45. [φ2° = -79,6 0 (c = 1; voda).
FAB hmotnostné spektrum (437 [M+H]+, 590 [M+H+NBA]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Syntéza východiskových materiálov
Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolín
Krok A: Syntéza N-benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalanínu
Hydrochlorid D-cykloheptylalanínu (príklad 1, krok H) (11,09 g, 50 mM) sa pri teplote 0 °C spojil so 40 ml THF a 40 ml vody. Roztok sa za miešania upravil na hodnotu pH 10 pridaním 5 M roztoku NaOH. K reakčnej zmesi sa pridal benzylchlórmravčan (8,22 ml, 55,4 mM), pričom teplota sa udržiavala na približne 3 °C a pH sa udržiavalo na hodnote približne 10, pridávaním 5 M NaOH podľa potreby.
-24 Po ukončení pridávania benzylchlórmravčanu sa reakčná zmes miešala počas jednej hodiny pri teplote 0 °C a pH sa udržiavalo na hodnote približne 10. V miešaní sa pokračovalo cez noc pri laboratórnej teplote a ukončenie reakcie sa monitorovalo pomocou TLC (7). V prípade potreby sa k reakčnej zmesi pridalo ďalšie množstvo benzylchlórmravčanu (1 až 2-krát 0,75 ml, 5 mM), pričom teplota sa udržiavala na približne 3 °C a pH sa udržiavalo na hodnote približne 10, pridávaním 5 M NaOH. Pridal sa ŕerc-butylmetyléter (25 ml) a zmes sa za miešania zahriala na teplotu 22 °C. Vodná fáza sa oddelila a premyla sa druhým podielom 25 ml terc-butylmetyléteru. Obsah organickej fázy sa skontroloval pomocou chromatografie na tenkej vrstve a v prípade potreby sa organická fázy spätne extrahovala s 25 ml vody. Vodná fáza a 25 ml etylacetátu sa spojili a pH sa nastavilo na hodnotu 2 s použitím koncentrovanej HCI. Fázy sa oddelili a vodná fáza sa extrahovala s druhým podielom 25 ml etylacetátu. Spojené organické fázy sa premyli s 20 ml 1 M KHSO4 a 2 x 30 ml vody, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4 a odparili sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok po odparení sa rozpustil v 45 ml THF a tento roztok benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalanínu sa uchoval na použitie v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.
Krok B: Benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolín
Benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalanín (pripravený v príklade 2, krok A) v roztoku TFA sa spojil s 5,9 g (51,24 mM) N-hydroxysukcínimidu, ochladil sa na teplotu 10 °C a pridal sa roztok 11 g (53,3 mM) 1,3-dicyklohexylkarbodiimidu v približne 25 ml THF. Zmes sa miešala počas približne 4,5 hodín pri teplote 22 °C, pričom sa ukončenie tvorby aktívneho esteru stanovilo pomocou chromatografie na tenkej vrstve.
K reakčnej zmesi sa za miešania pridal L-prolín (5,9 g, 51,24 mM) a potom sa pridalo 7,2 ml (51,24 mM) trietylamínu. Reakčná zmes sa miešala pri teplote 22 °C počas približne 15 hodín, pričom spotreba aktívneho esteru sa monitorovala pomocou chromatografie na tenkej vrstve. Reakčná zmes sa prefiltrovala, filtračný koláč sa premyl s 25 ml THF a filtrát sa odparil. Zvyšok sa rozpustil v 50 ml etylacetátu a 50 ml vody. Vodná fáza sa premyla s 2 x 20 ml etylacetátu, okyslila sa s 20 ml 1 M KHSO4 a extrahovala sa s 3 x 40 ml etylacetátu. Spojené etylacetátové roztoky sa premyli vodou do neutrálnej reakcie, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4
-25 a potom sa odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok, benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolín, sa rozpustil v 60 ml THF a použil sa v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.
Krok C: BenzyloKykarbonyl-N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolín
Jódmetán (17,95 ml, 288 mM) sa pridal k THF roztoku benzyloxykarbonyl-Dcykloheptylalanyl-L-prolínu z príkladu 2, krok B. Tento roztok sa ochladil na teplotu 8 °C a preniesol sa spolu s 20 ml THF, použitým na opláchnutie, do miešanej suspenzie 4,75 g (119 mM) 60 %-ného hydridu sodného v 35 ml THF, pričom sa udržiavala teplota pod 13 °C. Reakčná zmes sa miešala pri teplote 11 °C počas 24 hodín. Nadbytočný hydrid sodný sa rozložil tak, že sa k reakčnej zmesi opatrne pridalo 1,6 ml vody, pričom teplota sa udržiavala pod 13 °C a regulovalo sa penenie. Rýchlo schladená reakčná zmes sa miešala približne 12 minút pri teplote 22 °C a potom sa zahustila na objem asi 40 ml pri zníženom tlaku a teplote pod 30 °C. Ku zvyšku sa pridala voda (70 ml) a následne sa pridalo 30 ml tercbutylmetyéteru. Fázy sa oddelili a vodná fáza sa znova premyla s 30 ml tercbutylmetyéteru. Vodná fáza produktu sa spojila so 40 ml etylacetátu a pH sa upravilo na hodnotu 2,2 s použitím 3 M roztoku kyseliny sírovej. Fázy sa oddelili a vodná fáza sa spätne extrahovala so 40 ml etylacetátu. Spojené organické fázy sa premyli so 70 ml 5 %-ného roztoku tiosiranu sodného. Fázy sa oddelili a organická fáza sa pri zníženom tlaku (33 až 45 kPa) zahustila na malý objem, pričom sa teplota udržiavala pod 50 °C. Zvyšok sa spojil s 18,6 ml THF a 100 ml vody a pH sa upravilo na hodnotu 8,5 s cyklohexylaminom. Výsledná suspenzia sa zahustila na objem 100 ml pri zníženom tlaku (9 až 33 kPa) a pri teplote 25 až 55 °C, zriedila sa so 71,5 ml vody a miešala sa počas približne 10,5 hodín. Suspenzia sa prefiltrovala, premyla sa vodou a vysušila vzduchom pri teplote 45 °C, pričom sa získalo 16,72 g cyklohexylamínovej soli benzyloxykarbonyl-Nmetyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolínu (výťažok 63 %, vztiahnuté na D-cykloheptylalanin). Rf (8) = 0,55 až 0,65.
Príklad 3
Syntéza hemisulfátu D-cykloheptylIaktyl-L-prolyl-L-arginínaldehydu
-26Krok 1: Tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-Larginínlaktám
5,08 g (13 mM) ferc-butyloxykarbonyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktámu [(Bajusz a kol., J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] sa suspendovalo v 13 ml chloroformu, potom sa za miešania a chladenia ľadom pridalo 13 ml etylacetátu nasýteného plynným HCI (0,11 až 0,15 g/ml). Odštiepenie Boe skupiny sa monitorovalo pomocou chromatografie na tenkej vrstve [Rf (11) = 0,5 (voľná zlúčenina); 1,0 (Boc-zlúčenina)]. Na konci reakcie sa suspenzia zriedila s 25 ml dietyléteru, vytvorená kryštalická hmota sa odfiltrovala, premyla sa so 7 ml acetónu a 7 ml dietyléteru a vysušila sa pri zníženom tlaku nad hydroxidom draselným. Výsledný hydrochlorid NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu sa rozpustil v 13 ml dimetylformamidu, ochladil sa na tepiotu -20 CC a pridal sa k nasledujúcemu zmesnému anhydridu.
Roztok trietylamónnej soli tetrahydropyranyl-D-cykloheptylIaktyl-L-prolínu z príkladu 3, krok I, (12 mM) sa ochladil na teplotu -20 °C a potom sa za miešania pridalo 1,6 ml (12 mM) izobutylchlórmravčanu. Po 10 minútach miešania sa pridal vyššie uvedený roztok NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu v dimetylformamide, potom sa pridal trietylamín v množstve postačujúcom na upravenie pH reakčnej zmesi na hodnotu 8 (potrebných približne 1,8 ml). Reakčná zmes sa miešala pri teplote -10 °C počas 30 minút, potom pri 0 °C počas jednej hodiny. Následne sa soli odfiltrovali a filtrát sa zriedil so 65 ml etylacetátu. Výsledný roztok sa premyl s 3 x 25 ml vody, 7 ml 1 M hydrogensíranu draselného a 3 x 7 ml vody, vysušil sa nad bezvodým Na2SO4 a odparil sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Získaný produkt sa podrobil chromatografii na silkagélovej kolóne s použitím 130 g Kieselgel 60 (0,040 až 0,063 mm) ako adsorbentom a etylacetátom ako elučným činidlom. Frakcie obsahujúce výhradne čistý produkt [Rf (1) = 0,60] sa spojili a odparili sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok po odparení sa kryštalizoval z diizopropyléteru.
Výťažok 5,0 g (7,8 mM, 64 %), Rf (1) = 0,6.
FAB hmotnostné spektrum (640 [M+H]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
-27 Krok 2: Tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-Larginínaldehyd
4,8 g (7,51 mM) tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu (príklad 3, krok 1) sa rozpustilo v 15 ml tetrahydrofuránu, potom sa za miešania pri teplote neprevyšujúcej -50 °C pridal roztok 3,6 mM tetrahydridohlinitanu lítneho rozpusteného v tetrahydrofuráne. Postup redukcie sa monitoroval pomocou chromatografie na tenkej vrstve s vyvíjacim rozpúšťadlom číslo 8 a v prípade potreby sa pridal ďalší podiel tetrahydridohlinitanu lítneho. K reakčnej zmesi sa po kvapkách za konštantného miešania a chladenia pridávala
0,5 M kyselina sírová až pokým sa nedosiahla hodnota pH 3, potom sa pridalo ml vody. Výsledný roztok sa extrahoval s 2 x 15 ml hexánu, potom s 3 x 20 ml dichlórmetánu. Dichlórmetánové extrakty sa spojil
ml chladného 5 %-ného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a znova s 15 ml vody, vysušili sa nad bezvodým síranom sodným a odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa.
Zvyšok po odparení sa spracoval s diizopropyléterom, prefiltroval sa a vysušil pri zníženom tlaku.
Výťažok 3,9 g (6,07 mM, 81 %), Rf (8) = 0,40. [ajD 20 = +16,0 ° (c = 1; tetrahydrofurán).
FAB hmotnostné spektrum (642 [M+H]+, 795 [M+H+NBA]*) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Krok 3: Hemisulfát D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-L-arginínaldehydu
3,21 g (5 mM) tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínaldehydu (príklad 3, krok 2) sa rozpustilo v 40 ml etanolu a pridalo sa 5 ml 0,5 M kyseliny sírovej a potom sa pridalo 0,3 g Pd-C katalyzátora suspendovaného v 6 ml vody a zmes sa hydrogenovala pri teplote približne 10 °C. Postup reakcie sa monitoroval s použitím chromatografie na tenkej vrstve. Po ukončení reakcie (približne 15 minút) sa katalyzátor odfiltroval a filtrát sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa zahustil na objem približne 4 až 6 ml. Zvyšok sa zriedil so 40 ml vody, extrahoval sa so 4 x 7 ml dichlórmetánu a vodný roztok sa nechal stáť pri teplote 20 až 22 °C počas 24 hodín. Roztok sa potom znova extrahoval s 3 x 15 ml
-28dichlórmetánu a pH sa upravilo na hodnotu 3,5 s použitím iónomeničovej živice Dowex AG 1-X8 (HO), roztok sa potom vysušil vymrazením.
Výťažok 1,65 g (3,5 mM, 70 %) [q]D 20 = -94,7 0 (c = 1, voda).
HPLC: k'= 2,702 a 3,010.
FAB hmotnostné spektrum (424 [M+H]+, 577 [M+H+NBA]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Syntéza východiskových materiálov
Trietyiamónna soľ tetrahydropyranyl-D-cykloheptylIaktyl-L-prolínu
K roztoku 15,2 g (65 mM) hydrochloridu metylesteru DL-cykloheptylalanínu (príklad 1, krok E) v 65 ml dichlórmetánu sa pridalo 9,1 ml (65 mM) trietylamínu a 14,9 g (78 mM) (N-hydroxysukcínimidyl)chlóracetátu*. Po miešaní pri laboratórnej teplote počas 3 hodín sa reakčná zmes zriedila so 65 ml dichlórmetánu a následne sa premyla s 3 x 30 ml vody, 1 M KHSO4, vodou, 5 % NaHCO3 a napokon vodou až do neutrálnej reakcie. Organická vrstva sa následne vysušila nad bezvodým Na2SO4 a potom sa odparila pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Výsledný olejový produkt sa trituroval s ľahkým petroléterom. Pevný materiál sa odfiltroval, premyl sa s ľahkým petroléterom a vysušil sa vo vákuovom exsikátore. Získalo sa 17,54 g (63,6 mM, približne 98 %) metylesteru chlóracetyl-DL-cykloheptylalanínu, ktorý sa priamo použil v nasledujúcej reakcii. Rf (7) = 0,73 až 0,83. Teplota topenia. 78 až 80 °C.
Analýza pre C13H22NO3CI (275,777). Vypočítané: C = 56,62 %; H = 8,04 %;
N = 5,08 %; Cl = 12,86 %. Nájdené: C = 55,65 %; H = 7,93 %; N = 5,06; Cl = 12,72 %.
‘Príprava (N-hydroxysukcínimidyl)chlóracetátu ml (450 mM) chlóracetylchloridu sa pridalo k 23 g (200 mM) N-hydroxysukcínimidu a zmes sa refluxovala počas 10 minút, potom sa vyliala na rozdrvený ľad, prefiltrovala sa, premyla chladnou vodou a vysušila sa vo vákuovom
-29 exsikátore. Výťažok: 20,23 g (105,9 mM, 53 %). Teplota topenia: 113,3 až 113,7 °C.
Analýza pre C6H6NO4CI C7H8NO5 (191,55). Vypočítané: C = 37,62 %; H = 3,16 %; N = 7,31 %; Cl = 18,51 %. Nájdené: C = 37,37 %; H = 3,16 %; N = 7,23 %; Cl = 18,35 %.
Krok B: Metylester chlóracetyl-D-cykloheptylalanínu (enzymatické štiepenie metylesteru chlóracetyl-DL-cykloheptylalanínu)
K roztoku 8,71 g (31,6 mM) metylesteru chlóracetyl-DL-cykloheptylalanínu, DL-esteru, (príklad 3, krok A) v 30 ml toluénu sa pridalo 70 ml vody a 50 ml Subtilisin Carlsberg (proteáza typ VIII, Sigma). Enzymatická hydrolýza Lenantioméru, L-esteru sa uskutočňovala pri hodnote pH 7,0, ktoré sa udržiavalo pomocou autotitrátora, naplneného s 3 M NaOH. Keď sa spotreba NaOH zastavila (pri 5,522 ml, 16,57 mM), reakčná zmes sa zriedila s 30 ml toluénu a oddelili sa dve vrstvy. Vodná fáza sa premyla s 2 x 20 ml toluénu. Spojené toluénové roztoky obsahovali D-estera spojené vodné roztoky obsahovali sodnú soľ L-kyseliny.
Po vysušení nad bezvodým Na2SO4 sa spojené toluénové roztoky odparili pri zníženom tlaku, pričom sa získalo 4,18 g (15,16 mM) D-esteru, Rf (7) = 0,73 až 0,83, ktorý sa priamo použil na prípravu D-cykloheptylalanínu.
Spojené vodné roztoky sa okyslili a extrahovali sa s 3 x 30 ml etylacetátu. Spojené etylacetátové roztoky sa premyli vodou, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4 a odparili sa pri zníženom tlaku, pričom sa získalo 3,46 g (13,22 mM) L-kyseliny, [Rf (7) = 0,45 až 0,50], ktorá sa priamo použila na prípravu L-cykloheptylalaninu.
Podobným spôsobom sa z východiskových 8,25 g (30 mM) DL-esteru (príklad 2, krok A) pripravilo 4,08 g (14,79 mM) D-esteru a 3,23 g (12,34 mM) Lkyseliny.
Krok C: Hydrochlorid D-cykloheptylalanínu
8,27 g (30 mM) D-esteru (príklad 3, krok B) sa suspendovalo v 120 ml 6 M HCI a zmes sa refluxovala počas 3 hodín. Voľná aminokyselina sa oddelila vo forme kryštálov. Reakčná zmes sa ochladila, uchovávala sa v chladničke cez noc,
-30prefiltrovala sa, premyla sa chladnou vodou a éterom a potom sa vysušila vo vákuovom exsikátore. Získalo sa 5,9 g (26,69 mM, 89 %) hydrochloridu Dcykloheptylalanínu. Rf (12) = 0,10 až 0,15. [o]d20 = -11 ° (c = 0,4; 1 M HCI).
Analýza pre CioHigN02 . HCI (221,728). Vypočítané: C = 54,17 %; H = 9,09 %; N = 6,32 %; Cl = 15,99 %. Nájdené: C = 54,27 %; H = 9,27 %; N = 6,30 %; Cl = 16,2 %.
Krok D: Dicyklohexylamónna soľ kyseliny D-cykloheptylmliečnej
5,78 g (26,15 mM) hydrochloridu D-cykloheptylalanínu (príklad 3, krok C) sa rozpustilo v 26 ml vody, zriedilo so 105 ml vody a 52,5 ml ľadovej kyseliny octovej a zmes sa ochladila na teplotu 5 °C. K tejto zmesi sa za miešania a chladenia prikvapkai roztok 18,0 g (261 mM) NaNO2 v 30 ml vody. V miešaní sa pokračovalo pri teplote 5 °C počas jednej hodiny a pri laboratórnej teplote cez noc. Na nasledujúci deň sa reakčná zmes za miešania okyslila s 25 ml cc. HCI. Zmes sa potom odparila do sucha pri teplote 50 °C a zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustil v 100 ml vody a rovnako sa odparil, trituroval sa s toluénom a znova sa odparil. Finálny zvyšok sa rozpustil v 50 ml etylacetátu a 50 ml vody. Vodná fáza sa premyla s etylacetátom a spojené etylacetátové roztoky sa premyli vodou až do neutrálnej reakcie, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4 a odparili sa pri zníženom tlaku. Vzniknutá pevná látka sa rozpustila v 20 ml diizopropyléteru. K tomuto roztoku sa pridalo 5 ml (25 mM) dicyklohexylamínu a kryštalická soľ sa následne oddelila. Po ochladení sa kryštály odfiltrovali, premyli sa chladným éterom a vysušili sa vo vákuovom exsikátore, pričom sa získalo 5,5 g (14,96 mM, 57,2 %) dicyklohexylamínovej soli kyseliny D-cykloheptylmliečnej, D-cHla.DCHA. Rf (7) 0,53 až 0,60. [o]D 20 = +19,5 0 (c = 1; metanol). Teplota topenia: 147 až 150 °C.
Analýza pre CioH1803 (C22H41NO3). Vypočítané: C = 71,89 %; H = 11,24 %; N = 3,81 %. Nájdené: C = 71,57 %; H = 11,34 %; N = 3,83 %.
Konverzia 0,35 g (1 mM) D-cHla.DCHA na voľnú o-hydroxykyselinu poskytla 0,15 g (0,8 mM) D-cHla, [q]D 20 = +10,1 0 (c = 1; metanol). Teplota topenia: 125 až
127 °C.
-31 Analýza pre Ci0Hi8O3 (186,252). Vypočítané: C = 64,48 %; H = 9,74%. Nájdené: C = 64,54 %; H = 9,86 %.
Krok E: Benzylester kyseliny D-cykloheptylmliečnej
K roztoku 11,21 g (30,5 mM) dicyklohexylamínovej soli kyseliny D-cykloheptylmliečnej (príklad 3, krok D) v 30 ml formaldehydu sa pridalo 3,57 ml (30 mM) benzylbromidu. Zmes sa miešala pri laboratórnej teplote počas 24 hodín, potom sa prefiltrovala a odparila pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok sa rozpustil v 20 ml 0,5 M hydrogenuhličitanu draselného a 60 ml dietyléteru. Organická fáza sa následne premyla s 20 ml vody, 0,5 M KHSO4 a vodou a potom sa vysušila nad bezvodým síranom sodným a odparila pri zníženom tlaku. Olejový zvyšok predstavoval 8,3 g (približne 30 mM) benzylesteru kyseliny D-cykloheptylmliečnej [Rf (3) = 0,2 až 0,3], ktorý sa priamo použil v nasledujúcom kroku F.
Krok F: Benzylester kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmliečnej
K roztoku 8,29 g (30 mM) benzylesteru kyseliny D-cykloheptylmliečnej (príklad 3, krok E) v 30 ml dichlórmetánu sa pridalo 3,01 ml (33 mM) 3,4-dihydro2H-pyránu a 0,3 ml približne 3 M HCI v etylacetáte a zmes sa nechala stáť pri laboratórnej teplote počas 16 hodín. Reakčná zmes sa potom zriedila so 40 ml dichlórmetánu, premyla sa s 3 x 20 ml vody, vysušila sa nad bezvodým síranom sodným a odparila pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok sa podrobil chromatografii na silikagélovej kolóne, pričom sa ako adsorbent použilo 200 g Kieselgelu 60 (0,040 až 0,063 mm) a ako elučné činidlo sa použila zmes cyklohexánu a etyiacetátu v pomere 85 : 15. Frakcie obsahujúce výhradne čistý produkt [Rf (4) = 0,60 až 0,70] sa spojili a odparili sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Olejovým zvyškom bolo 7,9 g (21,9 mM, 73 %) benzylesteru kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmliečnej, ktorý sa priamo použil v nasledujúcom kroku.
Krok G: Trietylamónna soľ kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmliečnej
7,21 g (20 mM) benzylesteru kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmliečnej (príklad 3, krok F) sa rozpustilo v 20 ml dimetylformamidu, pridalo sa 2,8 ml (20 mM) trietylamínu a zmes sa hydrogenovala v prítomnosti 0,1 g Pd/C katalyzátora. Postup reakcie sa monitoroval pomocou chromatografie na tenkej
- 32 vrstve [Rf (1) = 0,30 (ester), 0,00 (kyselina)]. Po ukončení reakcie sa katalyzátor odfiltroval a premyl s 2 x 5 ml dimetylformamidu. Filtrát a výplachy sa spojili a použili sa v nasledujúcom kroku ako roztok 20 mM trietylamónnej soli kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmliečnej.
Krok H: Benzylester tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolínu
Roztok trietylamónnej soli kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmliečnej pripravený v príklade 3, krok G (20 mM) sa ochladil na teplotu +5 °C a za miešania sa pridalo 2,7 g (20 mM) 1-hydroxybenzotriazolu, 4,83 g (20 mM) hydrochloridu benzylesteru L-prolínu a 4,12 g (20 mM) dicyklohexylkarbodiimidu. Reakčná zmes sa udržiavala pri laboratórnej teplote cez noc, potom sa prefiltrovala a odparila pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok sa rozpustil v 50 ml etylacetátu a premyl sa s 20 ml vody a 5 % hydrogenuhličitanu sodného, vysušil sa nad bezvodýmNa2SO4 a odparil sa pri zníženom tlaku. Zvyšok sa podrobil chromatografii na silikagélovej kolóne, pričom sa ako adsorbent použilo 200 g Kieselgelu 60 (0,040 až 0,063 mm) a ako elučné činidlo sa použila zmes n-hexánu a etylacetátu v pomere 1:1. Frakcie obsahujúce výhradne čistý produkt [Rf (3) = 0,3 až 0,4] sa spojili a odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Olejovým zvyškom bolo 5,95 g (13 mM, 65%) benzylesteru tetrahydropyranyl-D-cykloheptylIaktyl-L-prolínu, ktorý sa použil v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.
Krok I: Trietylamónna soľ tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolínu
5,5 g (12 mM) benzylesteru tetrahydropyranyl-D-cykloheptylIaktyl-L-prolínu (príklad 3, krok H) sa rozpustilo v 12 ml dimetylformamidu, pridalo sa 1,68 ml (12 mM) trietylamínu a zmes sa hydrogenovala v prítomnosti 0,1 g katalyzátora Pd/C. Postup reakcie sa monitoroval pomocou chromatografie na tenkej vrstve [Rf (1) = 0,30 (ester), 0,00 (kyselina)]. Po ukončení reakcie sa katalyzátor odfiltroval a premyl sa s 2 x 2 ml dimetylformamidu. Filtrát s výplachy sa spojili a použili sa ako roztok obsahujúci 12 mM trietylamónnej soli tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolínu.
Príklad 4
-33Syntéza hemisulfátu N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidín-2-karbonyl-L-arginínaldehydu
Krok 1: Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidín-2-karbonyl-NGbenzyloxykarbonyl-L-arginínlaktám
1,97 g (5 mM) ferc-butoxykarbonyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu [(Bajusz a kol., J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] sa suspendovalo v 5 ml chloroformu, potom sa za miešania a chladenia ľadom pridalo 5 ml etylacetátu nasýteného plynným HCI (0,11 až 0,15 g/ml). Odštiepenie Boe skupiny sa monitorovalo pomocou chromatografie na tenkej vrstve [Rf (11) = 0,5 (voľná zlúčenina); 1,0 (Boc-zlúčenina)]. Na konci reakcie sa suspenzia zriedila s 10 ml dietyléteru, vytvorená kryštalická hmota sa odfiltrovala, premyla sa s 3 ml acetónu a 3 ml dietyléteru a vysušila sa pri zníženom tlaku nad KOH. Výsledný hydrochlorid NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu sa rozpustil v 5 ml dimetylformamidu, ochladil sa na teplotu -20 °C a pridal sa k nasledujúcemu zmesnému anhydridu.
1,95 g (5 mM) kyseliny benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cyklohexylglycyl-Lazetidín-2-karboxylovej (príklad 4, krok B) sa rozpustil v 5 ml dimetylformamidu, ochladil sa na teplotu -15 °C, potom sa za miešania pridalo 0,56 ml (5,05 mM) Nmetylmorfolínu a 0,665 ml (5,05 mM) izobutylchlórmravčanu. Po 10 minútach miešania sa pridal vyššie uvedený dimetylformamidový roztok NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu a potom sa pridal trietylamín v množstve postačujúcom na úpravu pH reakčnej zmesi na hodnotu 8 (potrebných približne 0,7 ml). Reakčná zmes sa miešala pri teplote -10 °C počas 30 minút, potom pri teplote 0 °C počas jednej hodiny. Soli sa následne odfiltrovali a filtrát sa zriedil s 50 ml etylacetátu. Výsledný roztok sa premyl s 3 x 7 ml vody, 3 ml 1 M KHSO4 a 3 x 3 ml vody, vysušil sa nad bezvodým Na2SO4 a odparil sa pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Získaný produkt sa podrobil chromatografii na silikagélovej kolóne, pričom sa ako adsorbent použilo 50 g Kieselgelu 60 (0,040 až 0,063 mm) a ako elučné činidlo sa použil etylacetát. Frakcie obsahujúce výhradne čistý produkt [Rf (1) = 0,70] sa spojili a odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok po odparení sa kryštalizoval z diizopropyléteru.
Výťažok 2,35 g (71 %), Rf (1) = 0,45 až 0,55.
- 34FAB hmotnostné spektrum (661 [M+H]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Krok 2: Benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cyklohexyglycyl-L-azetidín-2-karbonyl-NGbenzyloxykarbonyl-L-arginínaldehyd
2,15 g (3,25 mM) benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidín2-karbonyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínlaktámu (príklad 4, krok 1) sa rozpustilo v 5 ml tetrahydrofuránu a potom sa za miešania a pri teplote neprevyšujúcej -50 °C pridal roztok 2,25 mM LiAIH4 rozpustený v tetrahydrofuráne. Postup redukcie sa monitoroval pomocou chromatografie na tenkej vrstve (rozpúšťadlo 7) ako vyvíjacím rozpúšťadlom a v prípade potreby sa pridal ďalší podiel LiAIH4. K tejto reakčnej zmesi sa po kvapkách za konštantného miešania a chladenia pridával 0,5 M KHSO4, až do dosiahnutia pH hodnoty 3, potom sa pridalo 13 ml vody. Výsledný roztok sa extrahoval s 2 x 5 ml hexánu potom s 3 x 7 ml dichlórmetánu. Dichlórmetánové extrakty sa spojili, premyli sa s 3 x 7 ml vody, 7 ml chladného 5 %-ného roztoku NaHCO3 a znova so 7 ml vody, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4 a odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok po odparení sa spracoval s diizopropyléterom, prefiltroval sa a vysušil pri zníženom tlaku.
Výťažok 1,6 g (74 %), Rf (7) = 0,33 až 0,43.
FAB hmotnostné spektrum (663 [M+H]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Krok 3: Suifát N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidin-2-karbonyl-L-arginínaldehydu
1,53 g (2,3 mM) benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidín-2karbonyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínaldehydu (príklad 4, krok 2) sa rozpustilo v 23 ml etanolu a pridalo sa 4,8 ml 0,5 M kyseliny sírovej a potom pridalo 0,15 g Pd-C katalyzátora suspendovaného v 3,5 ml vody a zmes sa hydrogenovala pri teplote približne 10 °C. Postup reakcie sa monitoroval s použitím chromatografie na tenkej vrstve. Po ukončení reakcie (približne 15 minút) sa katalyzátor odfiltroval a filtrát sa zahustil na objem približne 2 až 3 mi pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Zvyšok sa zriedil s 20 ml vody, extrahoval sa so 4 x 4 ml dichlórmetánu a vodný roztok sa nechal stáť pri teplote 20 až 22 °C počas 24 hodín. Roztok sa potom znova extrahoval s 3 x 4 ml dichlórmetánu a pH sa upravilo na hodnotu 3,5 s použitím iónomeničovej živice Dowex AG 1-X8 (HO), roztok sa potom vysušil vymrazením.
- 35 Výťažok 1,02 g (90 %), Rf (12) = 0,40.
FAB hmotnostné spektrum (395 [M+H]+, 548 [M+H+NBA]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Syntéza východiskových materiálov
Kyselina benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L·azetidin-2-karboxylová
Krok A: Syntéza 2,4,5-trichlórfenylesteru benzyloxykarbonyl-D-cyklohexylglycínu
K miešanej suspenzii 5,42 g (20 mM) trifluóroctovej soli D-cyklohexylglycínu a 5,6 ml (40 mM) trietylamínu v 50 ml dimetylformamidu sa pridalo 8,8 g (22 mM) benzyl-pentachlórfenylkarbonátu [Anteunis a kol., Bul. Soc. Chim. Belg. 96, 775 (1987)] a pridalo sa 6,16 ml (44 mM) trietylamínu. Po 3 hodinách miešania sa reakčná zmes odparila pri zníženom tlaku, zvyšok sa rozpustil v 60 ml dietyléteru a 60 ml vody. Fázy sa oddelili, organická fáza sa premyla vodou a spojené vodné fázy sa premyli s dietyléterom, okyslili sa s 1 M KHSO4 na hodnotu pH 3 a potom sa extrahovali s 3 x 30 ml etylacetátu. Organická fáza sa premyla vodou až do neutrálnej reakcie, vysušila sa nad bezvodým Na2SO4 a odparila sa pri tlaku 2,0 až
2,5 kPa.
Zvyškom po odparení je benzyloxykarbonyl-D-cyklohexylglycín, ktorý sa rozpustil v 20 ml tetrahydrofuránu a spojil sa so 4,54 g (22 mM) 2,4,5-trichlórfenolu a 4,54 g (22 mM) dicyklohexylkarbodiimidu. Otri hodiny neskôr sa reakčná zmes prefiltrovala, filtrát a výplachy sa spojili a odparili pri zníženom tlaku. Pevný zvyšok sa prečistil pomocou chromatografie na silikagélovej kolóne, pričom sa ako adsorbent použilo 140 g Kieselgelu 60 (0,040 až 0,063 mm) a ako elučné činidlo sa použila zmes chloroformu a acetónu v pomere 95 : 5. Frakcie obsahujúce výhradne čistý produkt [Rf (5) = 0,7 až 0,8] sa spojili a odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa. Olejový zvyšok sa trituroval s dietyléterom, prefiltroval sa, premyl s dietyléterom a vysušil. Výťažok: 8,34 g (88,5 %) čistého 2,4,5-trichlórfenylesteru benzyioxykarbonyl-D-cyklohexylglycinu.
Krok B: Syntéza kyseliny benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidin2-karboxylovej
-36Kyselina L-azetidin-2-karboxylová (1,01 g, 10 mM) atrietylamin (1,4 ml, 10 mM) sa pridali k roztoku 2,4,5-trichlórfenylesteru benzyloxykarbonyl-D-cyklohexylglycínu (5,18 g, 11 mM, z príkladu 4, krok A) v 10 ml pyridínu. Po miešaní cez noc sa reakčná zmes odparila pri zníženom tlaku a zvyšok sa rozpustil v 50 ml 5 % NaHCO3 a 50 ml dietyléteru. Organická fáza sa premyla vodou a spojené vodné fázy sa premyli s dietyléterom, okyslili sa s 1 M KHSO4 na hodnotu pH 3, potom sa extrahovali s 3 x 50 ml etylacetátu. Etylacetátové extrakty sa spojili, premyli sa vodou do neutrálnej reakcie, vysušili sa nad bezvodým Na2SO4 a odparili pri tlaku 2,0 až 2,5 kPa.
Zvyškom po odparení je kyselina benzyloxykarbonyl-D-cyklohexylglycyl-Lazetidín-2-karboxylová, ktorá sa rozpustila v 10 ml tetrahydrofuránu a pridala sa k 5,0 ml (80 mM) jódmetánu a zmes sa ochladila na teplotu 0 °C. K tomuto roztoku sa pridalo 1,02 g (30 mM) hydridu sodného 60 %, a reakčná zmes sa miešala pri laboratórnej teplote cez noc. Nadbytok hydridu sodného sa rozložil opatrným pridávaním 0,4 ml vody. Rýchle zriedená reakčná zmes sa zahustila na približne 10 ml pri zníženom tlaku a teplote pod 30 °C. Zvyšok sa zriedil s 15 ml vody a 10 ml terc-butylmetyléteru. Fázy sa oddelili a vodná fáza sa znova premyla s 10 ml terc-butylmetyléteru. Vodná fáza obsahujúca produkt sa spojila s 15 ml etylacetátu a pH sa upravilo na hodnotu 2,2 s 3 M roztokom kyseliny sírovej. Fázy sa oddelili a vodná fáza sa spätne extrahovala s 10 ml etylacetátu. Spojená organická fáza sa premyla s 15 ml 5 % roztoku tiosíranu sodného. Fázy sa oddelili a organická fáza sa odparila za tlaku pri teplote pod 40 °C. Olejovým zvyškom je 3,75 g benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidín-2-karboxylovej kyseliny (9,65 mM, Rf (7) = 0,85 až 0,95), ktorá sa rozpustila v 9,65 ml tetrahydrofuránu a nechala sa na použitie v kroku 1 príkladu 4.
FAB hmotnostné spektrum (403 [M+H]+) potvrdilo predpokladanú štruktúru.
Príklad 5
Inhibícia koagulácie pomocou peptidylarginalov
Inhibičný účinok na koaguláciu plazmy sa vyhodnotil vo vzorkách trombínovej doby (thrombin tíme, TT), vo vzorkách aktivovanej parciálnej trombínovej doby (activated partial thrombin tíme, APTT) a vo vzorkách
-37protombínovej doby (prothrombin tíme, PT), pričom sa ako substrát použila citrátovaná ľudská plazma [Bagdy, D. a kol., Thromb. Haemostas. 67, 325 (1992)]. TT vzorka meria inhibiciu jedného kroku, koaguláciu fibrinogénu na účinok exogénneho trombínu (finálna koncentrácia 2,5 NIH U/ml). Koagulácia plazmy vAPTT a v PT vzorkách sa vyvolala rekalcifikáciou. Endogénny generovaný trombín by mohol byť teoreticky prítomný vo finálnej koncentrácii v množstve 50 NIH U/ml (APTT, PT). Tieto vzorky detegovali sumu inhibičných účinkov na tvorbu fibrínu a na generáciu trombínu, čo zahrňuje niekoľko proteolytických reakcií sprostredkovaných buď trombínom alebo inými enzýmami, ako je napríklad fXa. Antikoagulačná aktivita je vyjadrená v CT2, čo znamená koncentráciu (nM) požadovanú na dvojnásobnú dobu koagulácie.
Tabuľka 1
Inhibičné aktivity zlúčenín vzorca I podľa vynálezu (1 až 4), materskej zlúčeniny, Efegatranu (C) a ďalších príbuzných peptidylarginalov (C1, C2) na koaguláciu plazmy (stĺpec A), zrazeninou viazaný trombín a faktor Xa (stĺpec B) a fibrinolytické enzýmy (stĺpec C)
Peptidylarginaly: Xaa-Xbb-Arg-Ha | A CT2 (nM)b | B IC50 (nM) | C LA50, μΜ | ||||||
Č. | Xaa-Xbb | TT | APTT | PT | Trombín | Faktor Xa | PL | tPA | UK |
1 | Eoc-D-cHpa- Pro | 147 | 331 | 1839 | 103 | 118 | 18 | 10 | 14 |
2 | N-Me-DcHpa-Pro | 118 | 315 | 876 | 93 | 102 | 16 | 14 | 18 |
3 | D-cHla-Pro | 86 | 281 | 1082 | 95 | 117 | 21 | 10 | 85 |
4 | N-Me-D- Chg-Aze | 101 | 677 | 2921 | 245 | 457 | 32 | 12 | 16 |
C | D-MePhe- Pro | 87 | 622 | 2915 | 375 | 1000 | 54 | 132 | 82 |
C1 | D-cHga-Pro | 120 | 333 | 1254 | 524 | 200 | 83 | 74 | 120 |
C2 | Foc-D-Cba- Pro | 114 | 349 | 1148 | 390 | 702 | 27 | 27 | 120 |
aSkratky: Eoc = etoxykarbonyl; cHpa = cykloheptylalanyl; cHla = cykloheptylaktyl; MePhe = N-metylfenylalanyl; cHga = cykloheptylglykolyl; Chg = cyklohexylglycyl.
bCT2 = koncentrácia požadovaná na dvojnásobnú dobu koagulácie vTT vzorkách (trombínová doba), APTT vzorkách (aktivovaná parciálna trombínová doba) a PT vzorkách (protrombínová doba).
cLA5o = koncentrácia požadovaná na zníženie lýzovanej plochy na 50 % kontroly vo vzorke fibrínovej doštičky; Pl = plazmín; tPA = tkanivový plazminogénny aktivátor; UK = urokináza.
Niektoré z týchto zlúčenín boli lepšie ako Efegatran (C, D-MePhe-Pro-Arg-H, materský arginal peptidu), pokiaľ išlo o ich schopnosť predlžovať dogu koagulácie (pozri tabuľka 1). Kolóna A z tabuľky 1 znázorňuje antikoagulačné aktivity zlúčenín vzorca I podľa vynálezu (1 až 4) v porovnaní s antikoagulačnou aktivitou Efegatranu (C), známeho antikoagulačného činidla [Bajusz, S. a kol., J. Med. Chem. 33, 1729 (1990); americký patent US 4,703,036 (1982); Bagdy D. a koľ, Thromb. Haemostas. 67, 357 a 68, 125 (1992); Jackson, C. V. a koľ, Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis 2, 258 (1996)] a ďalších príbuzných peptidylarginalov [Bajusz, S. a koľ, Bioorg. & Med. Chem. 3, 1079 (1995); americký patent US 6,121,241 (2000); publikovaná medzinárodná prihláška WO 97/46576], TT vzorka ukázala nové analógy, ktoré sú pri inhibícii trombín-fibrinogénnej reakcie takmer tak účinné rovnako ako Efegatran. Na druhej strane, APTT naznačuje, že nové peptidy sú účinnejšie ako Efegatran pri inhibícii trombín-generujúcich krokov, ktoré predchádzajú koagulácii.
Príklad 6
Inhibícia trombínu a faktoru Xa
-39Inhibícia enzýmu sa skúmala v zrazenine plazmy bohatej na doštičky, s použitím chromatografických substrátov, t.j. Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (S1) pre trombín a Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA (S2) pre faktor Xa, ako bolo publikované. [Bajusz, S. a kol.: publikovaná medzinárodná prihláška WO 97/46576]. Skúšky sa uskutočnili pri laboratórnej teplote v sklenených skúmavkách a 96-jamkových mikrotitračných platničkách.
Roztoky: (i) Tlmivý roztok A: 0,1 M fosforečnan sodný/0,05 M NaCI (pH 8,5). (ii) Inhibítory: Roztoky 0,1, 1,0 a 10 ,g/ml v tlmivom roztoku A obsahujúcom 0,02 % ľudského albumínu, (iii) Substráty: 1 mM S1 a 2 mM S2 v destilovanej vode.
(b) Príprava zrazenín plazmy. Vzorky plazmy bohatej na doštičky (200 μΙ) sa umiestnili do sklenených skúmaviek a temperovali sa počas 60 minút pri teplote miestnosti s 80 μΙ 40 mM CaCI2. Zrazeniny sa premyli s 2 ml alikvotných podielov fyziologického roztoku (0,9 % NaCI), za mierneho pretrepávania, aby sa odstránili neviazané enzýmy. V prípade úspešného vymytia optická hustota reakčnej zmesi vymývacej vody a S1 predstavuje menej ako 5 % kontroly. Takto získaná zrazenina plazmy sa uchovávala pod fyziologickým roztokom v skúmavke až do použitia.
(c) Vyhodnotenie inhibície enzýmov v zrazeninách. Po odstránení fyziologického roztoku sa zrazenina plazmy temperovala počas 5 minút pri teplote 37 °C so 400 μΙ inhibítora (alebo tlmivého roztoku A ako negatívnej kontroly) a počas 30 minút so 100 μΙ substrátu S1 alebo S3, reakcia sa potom zastavila pridaním 100 μΙ 50 %-nej kyseliny octovej. Podiely s objemom 150 μΙ reakčnej zmesi sa umiestnili do jamiek mikrotitračnej platničky a čítali sa pri vlnovej dĺžke 405 nm (čítacie zariadenie: ELISA READER 800, Bio-Tek Instruments Inc. Winooski, VT, USA). Hodnoty IC50 sa generovali graficky z údajov extinkcie.
Výsledky sú znázornené v stĺpci B tabuľky 1. Zlúčeniny 1, 2, 3 a 4 sú jediné analógy, ktoré môžu predstihnúť Efegatran, pokiaľ ide o inhibíciu zrazeninou viazaného trombínu, ale pri inhibícii zrazeninou viazaného faktora Xa je každý analóg lepší ako Efegatran. Zlúčeniny 1, 2, 3 a 4 teda vykazujú najvyššiu inhibíciu pre obidva zrazeninou viazané enzýmy.
Príklad 7
-40 Antifibrinolytická aktivita
Inhibičné účinky zlúčenín podľa vynálezu na plazmín (PL) a na tvorbu plazmínu prostredníctvom aktivátorov plazminogénu (Plogen), ako je tkanivový aktivátor plazminogénu (tPA) a urokináza (UK) sa vyšetrovali pomocou skúšky fibrínových doštičiek. (Potri napríklad Badgy, D., Barabás, E., Bajusz, S. a Szell, E., Thromb. Haemostas. 67, 325 -330 (1992); Barabás, E., Szell, E. a Bajusz, S. Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4, 243 (1993)). Výsledky sú zosumarizované v tabuľke 1, stĺpec C. Až na niekoľko výnimiek, analógy vykazujú voči trom fibrinolytickým enzýmom o niečo lepšiu inhibíciu ako Efegatran. Výnimkami sú C1 voči PL aC1, C2 voči UK, pričom 3 je voči UK takmer rovnako účinný ako Efegatran.
Príklad 8
Roztrúsená intravaskulárna koagulácia na modele králikov
Zlúčeniny 1 a 3 podľa vynálezu a ďalšie peptidylarginaly z tabuľky 1 ako aj C3 sa skúmali na ich DIC-inhibičnú aktivitu na králikoch, ktorým sa podal endotoxín (lipopolysacharid, LPS), ako je opísané v literatúre [Scherer, M. U. a kol., Lab. Anim. Sci. 45, 538 (1995)]. Skúšobný postup trval 4 štyri hodiny. Endotoxín sa podával v intravenóznej bolusovej injekcii, v dávkach 80 pg/kg pri 0 minút a 40 pg/kg pri 120 minút, pričom peptidylarginaly 1, 3 a C až C3 (0,25 mg/kg/hod. a/alebo 0,5 mg/kg/hod.) sa podávali v priebehu celého experimentu. Kontrolnej skupine zvierat sa podal 0,9 %-ný fyziologický roztok. Hemostatické parametre sa stanovili pri 0, 120 a 240 minútach.
Napriek opatrnému režimu letalita predstavovala 31 %, pravdepodobne z dôvodu vysokej citlivosti králikov na endotoxín [Semerano, N. a kol., Int. J. Clin. Lab. Res. 21, 214(1992)].
Tabuľka 2
Účinok zlúčenín 1 a 3 podľa vynálezu, východiskovej zlúčeniny Efegatranu (C), ďalších arginalov (C1 a C2) a heparinu (H) na letalitu králikov, ktorým sa podal endotoxín
Činidlo a | Letalita počet uhynutých/ošetrených zvierat a % | |||
2 hodiny | 4 hodiny | |||
Počet | % | Počet | % | |
Salsol (0,9 % NaCI) | 0/10 | 0 | 0/10 | 0 |
Endotoxín | 0/13 | 0 | 4/13 | 31 |
+ 1,0,5 mg/kg/h | 0/12 | 0 | 2/12 | 17 |
+ 1, 0,25 mg/kg/h | 0/19 | 0 | 3/19 | 16 |
+ 3, 0,25 mg/kg/h | 0/22 | 0 | 4/22 | 18 |
+ C, 0,5 mg/kg/h | 1/15 | 7 | 6/15 | 40 |
+ C, 0,25 mg/kg/h | 1/14 | 7 | 5/14 | 36 |
+ C1, 0,5 mg/kg/h | 0/16 | 0 | 5/16 | 31 |
+ C2, 0,5 mg/kg/h | 0/12 | 0 | 5/12 | 42 |
+ C3, 0,5 mg/kg/h | 1/18 | 6 | 10/18 | 56 |
+ H, 100 U/kg/h | 0/19 | 0 | 7/19 | 37 |
+ H, 50 U/kg/h | 0/17 | 0 | 6/17 | 35 |
sPre štruktúry peptidylarginalov, 1, 3, C, C1 a C2 pozri tabuľku 1; C3 = hPla-ProArg-H, kde hPla = kyselina 2-hydroxy-4-fenylbutánová
Ako ukazujú údaje z tabuľky 2, zlúčeniny 1 a 3 signifikantne znižujú letalitu u králikov, ktorým sa podal endotoxín, zatiaľ čo ostatné antikoagulačné činidlá nemajú žiadny vplyv na letalitu (C1) alebo spôsobujú určité zvýšenie letality, najvyššie hodnota, približne 1,8-násobok, sa dosiahla s C3. Z údajov z tabuľky 1 stojí za zmienku, že zlúčeniny 1 a 3, ktoré znižujú letalitu, sú najlepšími inhibítormi proti zrazeninou viazanému trombínu ako aj faktoru Xa a taktiež účinne inhibujú koaguláciu plazmy ako aj fibrinolytické enzýmy, plazmín a aktivátory plazminogénu.
Príklad 9
Roztrúsená intravaskulárna koagulácia na modele potkanov
Medzi najzávažnejšie následky DIC patrí depozícia fibrínu v rozličných orgánoch, zmeny krviniek, ako je napríklad zníženie počtu krvných doštičiek, a zmeny degradačných produktov fibrínu. Účinky zlúčeniny 1 podľa vynálezu
-42 a dvoch kontrolných antikoagulačných činidiel, Efegatranu (C) a heparínu (H) na takýto fenomén sa skúmali na potkanoch, ktorým sa podával endotoxín [Ford, A. J. a Longridge, D. J.: Br. J. Pharmacol. 110, suppl. 131P (1993); Hasegawa, N. a koľ: Am. J. Resp. Crit. Čare Med. 153, 1831 (1996); Dichneite, G. a koľ, Thromb. Res. 77, 357 (1995)].
Samcom potkanov sa podala intravenózna bolusová injekcia 10 mg/kg endotoxínu. Následne sa počas štyroch hodín podávala intravenózna infúzia fyziologického roztoku alebo testovanej zlúčeniny. Zo zlúčenín 1 a 3 sa podalo 0,25 mg/kg ako počiatočná bolusová injekcia a potom sa počas štyroch hodín podávala intravenózna infúzia 0,25 mg/kg/hod. Heparín (H) sa aplikoval podobne, 50 lU/kg ako počiatočná bolusová injekcia a následne sa počas štyroch hodín podávala intravenózna infúzia 50 lU/kg/hod. Kontrolnej skupine zvierat sa podalo 0,9 % fyziologického roztoku.
Depozícia 125l-fibrinu sa skúmala vo zvolených orgánoch (pečeň a obličky). 17R l-fibrinogén sa injekčné podal 30 minút pred injekciou endotoxínu. Rádioaktivita vo vzorkách tkanív sa merala v gamma-čítači (Wallac.Wizard 1470). Tvorba mikrotrombov v orgánoch sa vyhodnotila pomocou pomeru 125l aktivity v orgáne ku celkovej 125l-aktivite, definovanom ako mikrotrombinový index. Zmeny v tomto parametre sa vyjadrili ako percentuálne porovnanie so skupinou, ktorej sa podával fyziologický roztok.
Počet krvných doštičiek sa stanovil v automatickom zariadení (Sysmex F800) a vzťahoval sa ku kontrolným hodnotám.
Stanovenie FDP (degradačných produktov fibrínu, fibrín degradation products, FDP) pomocou Aggristininovej (Ristocetínovej) skúšky vyzrážania. Zvieratá sa usmrtili štyri hodiny po podaní endotoxínu.
Závery sú zosumarizované v tabuľke 3.
Tabuľka 3
-43Účinky zlúčeniny 1 podľa vynálezu, materského peptidu, Efegatranu (C) a heparinu (H) na depozíciu 125l-fibrínu a na zmeny počtu krvných doštičiek a degradačné produkty fibrínu (FDP) u potkanov, ktorým sa podal endotoxín
Činidlo | Depozícia 1Zi3l-fibrinu | Zmena počtu krvných doštičiek | Zmena FDP | |
Pečeň | Obličky | |||
Endotoxín, 10 mg/kga | 36 % | 36 % | 62 % | 2,56 |
+ 1, 0,25 mg/kg/hb | 13 % | 26 % | 48 % | 1,66 |
+ C, 0,25 mg/kg/hb | 30 % | 33 % | 52 % | 1,94 |
+ H, 50 NIH U/kg/hb | 22 % | 28 % | 43 % | 2,37 |
intravenózna bolusová injekcia, intravenózna bolusová injekcia + intravenózna infúzia.
Údaje z tabuľky 3 naznačujú, že DIG-inhibičný potenciál zlúčeniny 1 bol výraznejší ako inhibičný potenciál heparinu alebo Efegatranu.
Príklad 10
Výskum prežitia v modeli potkanov s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou
Samcom potkanov sa intravenózne podával bolus 30 mg/kg LPS (endotoxín). Peptidy v dávkach 0,5 mg/kg a/alebo 0,75 mg/kg, 1,0 mg/kg a
1,5 mg/kg sa podávali ako počiatočná injekcia bolusu a následne sa, bezprostredne po podaní LPS, podávala infúzia počas 8 hodín. Mortalita sa zaznamenala po 4, 5, 6, 7 a 8 hodinách po podaní LPS.
Údaje z tabuľky 4 naznačujú, že ošetrenie s LPS znižovalo na konci experimentu (8 hodín) pomer prežitia potkanov na 20 %. Všetky skúmané nové peptidylarginaly predlžovali dobu prežitia a znižovali mortalitu v porovnaní so skupinou LPS. Zlúčeniny 1,2, 3 a 4 boli účinnejšie ako porovnávacia zlúčenina C.
Účinky zlúčenín 1, 2, 3 a 4 podľa vynálezu a materskej zlúčeniny C na letalitu potkanov, ktorým sa podal LPS
n x~ | 100 | 100 | I 100 | 100 | 100 | 100 | ||
CD | ||||||||
0,75 | ||||||||
O) E | 100 | 100 | o o | 100 | 92 | 85 | ||
LO | o | CO | r- | r- | > | O | ||
o | CD | CO | 00 | oo | oo | |||
LO | o | O | o | o | o | 92 | ||
o | O | o | o | o | ||||
V | X“ | x— | ||||||
CD | ||||||||
Jxí | in | |||||||
γ- | O | o | o | O | o | 92 | ||
E CO | 0,7 | O V” | o x— | o x~ | O | o X~ | ||
LO | o | o | o | O | o | |||
o | o X” | o X~ | o T“ | o | o x— | 00 | ||
LO | o | o | o | o | o | o | ||
sp | o | o | o | o | o | o | ||
o^· | T“ | X“ | ||||||
>N | CD | |||||||
(D | ||||||||
u. d ‘O | mg/ | O | 100 | o o | 100 | 100 | 06 | 06 |
u_ | ||||||||
o | OJ | |||||||
s | ||||||||
4—« | LO | o | CD | oo | O | |||
U. (D | θ' | x— | CO | r- | LO | LO | LO | |
> | ||||||||
N | ||||||||
Φ | in | o | o | o | O | O | o | |
>o | o | o | o | o | o | o | ||
o | χ | X“ | x— | V“ | T— | x— | χ— | |
Q- | ||||||||
CD | ||||||||
ľZ | ||||||||
mg/ | o χ— | 100 | 100 | 100 | 100 | 06 | 06 | |
n | o | o | o | o | f—\ | |||
O | O | O | O | CD | ||||
o | X~ | x— | ||||||
LO | o o | o o | o o | O O | 92 | 92 | ||
CD | x— | T” | X“ | |||||
CD | o | o | CO | CO | CO | co | o | |
E O | X“ | CO | CO | CD | m | LO | ||
to fs» | o | CO | CO | h- | CO | n- | ||
CD | r- | CD | co | CM | ||||
o | ||||||||
ro | ||||||||
o | o | CD | CXJ | r- | o | |||
Έ | o | o | r- | r- | co | C\l | CM | |
o | ||||||||
y | ||||||||
ra jz | o | XT | lo | CD | I·- | 00 | ||
>o — |
</>
Claims (24)
1. Zlúčenina všeobecného vzorca I
Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde Xaa znamená zvyšok alfa-substituovanej karbónovej kyseliny vzorca II
Q-CH(R)-CO (H) kde Q predstavuje alkoxykarbonylaminoskupinu obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, metylaminoskupinu alebo hydroxylovú skupinu a R znamená cykloalkylmetylovú skupinu obsahujúcu 7 až 9 atómov uhlíka, 1- adamantylmetylovú skupinu alebo cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 5 až 7 atómov uhlíka, a Xbb predstavuje Lprolín alebo zvyšok L-azetidín-2-karboxylovej kyseliny, a jej kyslé adičné soli pripravené s organickými alebo anorganickými kyselinami.
2. Zlúčenina štruktúry 1
3. Zlúčenina štruktúry 2
C2)
-46a jej kyslé adičné soli.
4. Zlúčenina štruktúry 3 a jej kyslé adičné soli.
5. Zlúčenina štruktúry 4 a jej kyslé adičné soli.
6. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 1.
7. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 2.
8. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 3.
9. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podlá nároku 4.
10. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 5.
11. Zlúčenina etoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-Larginínaldehyd.
12. Zlúčenina tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonylL-arginínaldehyd.
13. Zlúčenina benzyloxykarbonyl-N-metyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxykarbonyl-L-arginínaldehyd.
14. Zlúčenina N-metyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidín-2-karbonyl-L-argininaldehyd.
15. Farmaceutický prípravok podľa niektorého z nárokov 6 až 10, vyznačujúci sa tým, že prípravok zahrňuje tablety, kapsule, prášky, pilulky, dražé, granuláty, roztoky, infúzie, čipky, náplaste alebo masti.
16. Spôsob liečenia pacienta s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie pacientovi peptidylarginalu, ktorý má inhibičný účinok na zrazeninou viazaný trombín, faktor Xa, plazmin a aktivátory plazminogénu.
17. Spôsob liečenia pacienta s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie pacientovi peptidylarginalu vzorca I
Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde Xaa znamená zvyšok alfa-substituovanej karbónovej kyseliny vzorca II
Q-CH(R)-CO (II) kde Q predstavuje alkoxykarbonylaminoskupinu obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, metylaminoskupinu alebo hydroxylovú skupinu a R znamená cykloalkylmetylovú skupinu obsahujúcu 6 až 9 atómov uhlíka, 1- adamantylmetylovú skupinu alebo cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 5 až 7 atómov
-48uhlíka, a Xbb predstavuje L-prolín alebo zvyšok L-azetidín-2-karboxylovej kyseliny, alebo jeho farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí.
18. Spôsob liečenia pacienta s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie pacientovi peptidylarginalu štruktúry 1 alebo jeho farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí.
19. Spôsob liečenia pacienta s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou, vyznačujúci sa tým, že tento spôsob zahrňuje podávanie pacientovi peptidylarginalu štruktúry 2 alebo jeho farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí.
20. Spôsob liečenia pacienta s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie pacientovi peptidylarginalu štruktúry 3 alebo jeho farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí.
21. Spôsob liečenia pacienta s roztrúsenou intravaskulárnou koaguláciou, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie pacientovi peptidylarginalu štruktúry 4 alebo jeho farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí.
22. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pacientovi sa podáva od približne 0,1 mg do asi 50 mg/kg peptidylarginalu, vztiahnuté na telesnú hmotnosť pacienta.
23. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pacientovi sa podáva peptidyiarginal v dávke postačujúcej na dosiahnutie krvných hladín peptidylarginalu od približne 6 μΜ do asi 100 μΜ.
24. Spôsob podľa nároku 7 alebo 8, vyznačujúci sa tým, že podávanie peptidylarginalov sa uskutočňuje súčasne alebo následne.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US31390101P | 2001-08-21 | 2001-08-21 | |
US31385001P | 2001-08-21 | 2001-08-21 | |
PCT/US2002/026564 WO2003016273A2 (en) | 2001-08-21 | 2002-08-21 | Peptide arginals and methods for treating disseminated intravascular coagulation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK1112004A3 true SK1112004A3 (en) | 2004-12-01 |
Family
ID=26979079
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK111-2004A SK1112004A3 (en) | 2001-08-21 | 2002-08-21 | Peptide arginals and methods for treating disseminated intra-vascular coagulation |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050070480A1 (sk) |
EP (1) | EP1425009A4 (sk) |
JP (1) | JP4230908B2 (sk) |
KR (1) | KR20040062942A (sk) |
CN (1) | CN1302776C (sk) |
AU (1) | AU2002331654B2 (sk) |
BR (1) | BR0212122A (sk) |
CA (1) | CA2457436A1 (sk) |
CZ (1) | CZ2004265A3 (sk) |
HU (1) | HUP0401312A3 (sk) |
IL (1) | IL160488A0 (sk) |
MX (1) | MXPA04001534A (sk) |
NO (1) | NO20040820L (sk) |
NZ (1) | NZ531315A (sk) |
PL (1) | PL368464A1 (sk) |
RU (1) | RU2312856C2 (sk) |
SK (1) | SK1112004A3 (sk) |
WO (1) | WO2003016273A2 (sk) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2062909A1 (en) * | 2007-11-21 | 2009-05-27 | SOLVAY (Société Anonyme) | Peptide production and purification process |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU192646B (en) * | 1984-12-21 | 1987-06-29 | Gyogyszerkutato Intezet | Process for preparing new n-alkyl-peptide aldehydes |
IL99527A (en) * | 1990-09-28 | 1997-08-14 | Lilly Co Eli | Tripeptide antithrombotic agents |
US5252566A (en) * | 1991-11-12 | 1993-10-12 | Eli Lilly And Company | Antithrombotic agents |
WO1995014788A1 (en) * | 1993-11-24 | 1995-06-01 | University Of Washington | Blood coagulation retardants and devices |
US5484772A (en) * | 1994-03-04 | 1996-01-16 | Eli Lilly And Company | Antithrombotic agents |
ZA951618B (en) * | 1994-03-04 | 1996-08-27 | Lilly Co Eli | Antithrombotic agents |
JPH09509943A (ja) * | 1994-03-04 | 1997-10-07 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 抗血栓剤 |
US5436229A (en) * | 1994-03-04 | 1995-07-25 | Eli Lilly And Company | Bisulfite adducts of arginine aldehydes |
HU222199B1 (hu) * | 1996-06-05 | 2003-05-28 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Véralvadásgátló hatású peptid-aldehid-származékok és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények |
-
2002
- 2002-08-21 CA CA002457436A patent/CA2457436A1/en not_active Abandoned
- 2002-08-21 PL PL02368464A patent/PL368464A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-08-21 NZ NZ531315A patent/NZ531315A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-08-21 HU HU0401312A patent/HUP0401312A3/hu unknown
- 2002-08-21 SK SK111-2004A patent/SK1112004A3/sk unknown
- 2002-08-21 RU RU2004108117/04A patent/RU2312856C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-08-21 IL IL16048802A patent/IL160488A0/xx unknown
- 2002-08-21 BR BR0212122-0A patent/BR0212122A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-08-21 MX MXPA04001534A patent/MXPA04001534A/es active IP Right Grant
- 2002-08-21 AU AU2002331654A patent/AU2002331654B2/en not_active Ceased
- 2002-08-21 JP JP2003521200A patent/JP4230908B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-21 WO PCT/US2002/026564 patent/WO2003016273A2/en active Application Filing
- 2002-08-21 KR KR10-2004-7002553A patent/KR20040062942A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-08-21 US US10/487,465 patent/US20050070480A1/en not_active Abandoned
- 2002-08-21 CZ CZ2004265A patent/CZ2004265A3/cs unknown
- 2002-08-21 EP EP02768632A patent/EP1425009A4/en not_active Withdrawn
- 2002-08-21 CN CNB028200314A patent/CN1302776C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-02-20 NO NO20040820A patent/NO20040820L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2003016273A3 (en) | 2003-06-12 |
HUP0401312A3 (en) | 2010-04-28 |
BR0212122A (pt) | 2004-07-20 |
NO20040820L (no) | 2004-05-14 |
CN1302776C (zh) | 2007-03-07 |
EP1425009A2 (en) | 2004-06-09 |
NZ531315A (en) | 2005-08-26 |
RU2312856C2 (ru) | 2007-12-20 |
CA2457436A1 (en) | 2003-02-27 |
HUP0401312A2 (hu) | 2005-02-28 |
MXPA04001534A (es) | 2004-11-22 |
CN1607949A (zh) | 2005-04-20 |
AU2002331654B2 (en) | 2007-11-08 |
WO2003016273A2 (en) | 2003-02-27 |
JP2005502657A (ja) | 2005-01-27 |
JP4230908B2 (ja) | 2009-02-25 |
KR20040062942A (ko) | 2004-07-09 |
IL160488A0 (en) | 2004-07-25 |
CZ2004265A3 (cs) | 2004-08-18 |
EP1425009A4 (en) | 2006-10-25 |
PL368464A1 (en) | 2005-04-04 |
RU2004108117A (ru) | 2005-04-10 |
US20050070480A1 (en) | 2005-03-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6432922B1 (en) | Inhibitors of urokinase and blood vessel formation | |
EP1808440B1 (en) | Non-covalent inhibitors of urokinase and blood vessel formation | |
US5883077A (en) | Inhibitors of factor Xa | |
US5597804A (en) | N-sulfonylarginine keto-amide compounds | |
US5023236A (en) | Factor VII/VIIA active site inhibitors | |
AU2006235835B2 (en) | Non-covalent inhibitors of urokinase and blood vessel formation | |
JP2001226397A (ja) | トロンビンの阻害剤および基質 | |
JPH04330094A (ja) | 有機化学における改良 | |
CZ277998A3 (cs) | Inhibitory serinproteázy a farmaceutický prostředek | |
EP0922054B1 (en) | Anticoagulant peptidyl-arginine aldehyde derivatives | |
US5955576A (en) | Inhibitors of thrombosis | |
SK1112004A3 (en) | Peptide arginals and methods for treating disseminated intra-vascular coagulation | |
AU2002331654A1 (en) | Peptide arginals and methods for treating disseminated intravascular coagulation | |
WO2003048127A1 (en) | Aromatic heterocyclic non-covalent inhibitors of urokinase and blood vessel formation | |
UA77428C2 (en) | Peptides arginals and a method for the treatment of disseminated intravascular coagulation | |
NO300504B1 (no) | Forbindelse og terapeutisk preparat omfattende denne |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FD9A | Suspended procedure due to non-payment of fee |