JP3486412B2

JP3486412B2 - トロンビン阻害剤

Info

Publication number: JP3486412B2
Application number: JP52446394A
Authority: JP
Inventors: ベバー，ダニエル・エフ; ルイス，エス・ドール; シエフアー，ジユールズ・エー; フエン，ドン−メイ; ナツト，ルース・エフ; ブラデイ，ステイーブン・エフ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-25
Publication date: 2004-01-13
Anticipated expiration: 2019-01-13
Also published as: EP0699074A4; AU6773894A; EP0699074A1; DE69431718D1; CA2159834A1; ATE227581T1; EP0699074B1; ES2184763T3; WO1994025051A1; AU670381B2; DE69431718T2; JPH08509735A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景トロンビンは、前駆体のプロトロンビンの形態で血漿
中に存在するセリンプロテアーゼである。トロンビン
は、溶液血漿タンパク質のフィブリノゲンを不溶性フィ
ブリンに変換するという凝血機構の中心的な役割を果た
す。

Edwards等,J.Amer.Chem.Soc.（1992）114巻,1854−63
ページは、セリンプロテアーゼヒト白血球エラスターゼ
及びブタ膵臓エラスターゼの可逆性阻害剤であるペプチ
ジルα−ケトベンゾオキサゾールを記載している。

ヨーロッパ特許出願公開第363 284号は、基質ペプチ
ドの容易に切断できるアミド基の窒素原子が水素又は置
換カルボニル部分で置換されているペプチダーゼ基質類
似体を記載している。

オーストラリア特許出願公開第86245677号は更に、フ
ルオロメチレンケトン又はα−ケトカルボキシル誘導体
のような活性化求電子ケトン部分を有するペプチダーゼ
阻害剤を記載している。

従来技術の文献に記載されているトロンビン阻害剤
は、アルギニン及びリシン側鎖を含んでいる。これらの
構造は、他のトリプシン様酵素に比べてトロンビンに対
する選択性が低い。これらのトロンビン阻害剤の幾つか
は低血圧毒性や肝臓毒性を示す。

本発明の化合物はアルギニン及びリシンをアミノシク
ロヘキシル部分で置換する。これらの化合物は、他のト
リプシン様酵素に比べてトロンビンに対する選択性を示
し、また経口利用性を有する。

発明の要約本発明は、トロンビン触媒部位阻害剤であり、抗凝血
剤として有用な４−置換シクロヘキシルアミン誘導体を
包含する。これらの化合物は、トリプシンや他のトリプ
シン様酵素に比べてトロンビンに対する選択性を示し、
また経口利用性を有する。トリプシン様酵素（例えばト
リプシン、トロンビン、因子xa、カリクレイン、プラス
ミン、ウロキナーゼ及びプラスミノゲン活性化因子）
は、アルギニル及びリシルペプチド結合での加水分解を
触媒するセリン依存性酵素である。

本発明は、医薬的に許容可能なキャリヤー中に本発明
の化合物を含んでなる、哺乳動物で血小板損失を阻害
し、血小板凝集物の形成を阻害し、フィブリン形成を阻
害し、血栓形成を阻害し、かつ塞栓形成を阻害するため
の組成物を包含する。これらの組成物は任意に、抗凝血
剤、抗血小板剤、及び血栓融解剤を含み得る。この組成
物を血液、血液製剤又は哺乳動物臓器に加えて、所望の
阻害作用を生起することができる。

本発明は更に、医薬的に許容可能なキャリヤー中に本
発明の化合物を含んでなる、哺乳動物で不安定アンギ
ナ、治療抵抗性アンギナ、心筋梗塞、一過性虚血性発
作、心房細動、血栓症発作、塞栓症発作、深静脈血栓
症、散在性血管内凝固、及び再形成された管の再閉塞又
は再発狭窄症を予防又は治療するための組成物を包含す
る。これらの組成物は任意に、抗凝血剤、抗血小板剤、
及び血栓融解剤を含み得る。

本発明は更に、哺乳動物の表面に本発明の化合物を共
有結合又は非共有結合により連結させて表面の凝塊形成
を抑制する方法を包含する。

発明の詳細な説明本発明は、式：（式中、ｍは０又は１であり；ｎは０、１又は２であり；ＸはＯ又はH₂であり；Ｒはアリールスルホニル、アミノアシル、アシルアミノ
アシル、Ｎ−C_1-3アルキルアミノアシル、アシル−Ｎ−
C_1-3アルキルアミノアシル、アリールアシル、アリール
C_1-3アルカノイル、ヒドロキシアシル、アリールオキシ
カルボニル、C_1-3アルキルオキシカルボニル、又はであり； R"はアリール、ヘテロアリール、C_5-11炭素単環、又は C_5-11炭素二環であり； R¹はＨ又はCH₃であり； R²はＨ又はCH₃であり； R³はＨ、C_1-3アルキル、ヒドロキシC_1-3アルキル、カル
ボキシC_1-3アルキル、アミノC_1-3アルキル、グアニドC
_1-3アルキル、アリールもしくは置換アリール、アリー
ルメチル、C_3-8シクロアルキルメチル、又はC_3-8シクロ
アルキルであり；ＹはCHO、COCF₃、BO₂R⁷R⁸、CO₂R⁴、COOH、CONR⁵R⁶、COC
O₂R⁴、COCO₂H、COCO−Ｑ、又はCO−Ｗであり；ここで、Ｑは天然アミノ酸、シクロヘキシルアミノ酸、NR⁵R⁶、
もしくは又はこれらの誘導体であり；Ｗは五〜十員複素環式基又は置換複素環式基（例えばテ
トラゾール、フラン、オキサゾール、ベンゾオキサゾー
ル、及びイミダゾールを含む）であり； R⁴はC_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであり； R⁵はＨ、C_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであ
り； R⁶はＨ、C_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであ
り； R⁷はＨ、C_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであ
り； R⁸はＨ、C_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであ
る）で表される化合物、及びその医薬的に許容可能な塩を包
含する。

本発明の化合物は好ましくは、式：（式中、ｎは０、１又は２であり；ｍは０又は１であり；ＲはＤ−フェニルアラニン、Ｄ−Nall、Ｄ−Nal2、Ｄ−
シクロヘキシルアラニン、Ｄ−チロシン、β−３−ベン
ゾチエニル−Ｄ−アラニンもしくはＤ−3,4−Cl₂−フェ
ニルアラニン、又はこれらのＮ−メチル誘導体である
か、であり； R¹はＨであり； R³はＨ又はシクロヘキシルであり；ＸはＯ又はH₂であり；ＹはCONH₂、COCO₂H、COCONHCH₃、COCONHCH₂Ph、である）及びその医薬的に許容可能な塩で表される。

本発明の化合物は更に好ましくは、式：（式中、ＲはＮ−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−メチル−
２−ナフチル−Ｄ−アラニン、Ｎ−メチル−１−ナフチ
ル−Ｄ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−シクロヘキシルア
ラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−3,4−Cl₂−Ｄ−フェニルアラ
ニン、又はであり； R¹はＨであり； R³はＨ、シクロヘキシルであり；ＹはCONH₂、COCO₂H、COCONHCH₃、である）及びその医薬的に許容可能な塩で表される。

本発明の好ましい実施態様を以下の表に示す。

プロテイナーゼ阻害を調べるためのアッセイヒトα−トロンビン及びウシトリプシンのアッセイ
を、0.05Mトリス緩衝液（pH7.4）、0.15M NaCl、0.1％
PEG中にて、25℃で実施した。トリプシンアッセイは更
に、1mM CaCl₂を含んでいた。

ｐ−ニトロアニリド（pna）基質の加水分解速度を調
べるアッセイでは、Thermomax 96−ウェルプレートリ
ーダーを使用して、ｐ−ニトロアニリンの時間依存的出
現を（405nmで）測定した。sar−PR−pnaを使用して、
ヒトα−トロンビン（K_m＝125μＭ）及びウシトリプシ
ン（K_m＝125μＭ）をアッセイした。8270cm^-1M^-1の吸光
係数を用いて342nmで吸光度を測定し、ｐ−ニトロアニ
リド基質濃度を調べた。

トロンビン阻害率の高い強力な阻害剤（Ki＜10nM）を
用いたある研究では、より高感度の活性アッセイを使用
した。このアッセイでは、７−アミノ−４−トリフルオ
ロメチルクマリンの産生に関係する500nmでの蛍光（400
nmでの励起）の増加から、フルオロゲニック（fluoroge
nic）基質Ｚ−GPR−afc（K_m＝27μＭ）のトロンビン触
媒加水分解速度を調べた。ストック溶液のアリコートを
トロンビンで完全に加水分解して生成した７−アミノ−
４−トリフルオロメチルクマリンの吸光度を380nmで測
定して、Ｚ−GPR−afcストック溶液の濃度を調べた。

酵素又は阻害剤で平衡化した酵素を含む溶液中に、基
質のストック溶液を少なくとも10倍に希釈して最終濃度
を0.1K_m以下として、活性アッセイを実施した。酵素と
阻害剤との間の平衡化に必要な時間を対照実験で調べ
た。阻害剤の不在下（Vo）又は存在下（Vi）での物質生
成の初期速度を測定した。競合阻害を仮定し、且つKm/
［Ｓ］、［Ｉ］/e、及び［Ｉ］/e（［Ｓ］、［Ｉ］及び
ｅはそれぞれ、基質、阻害剤及び酵素の総濃度を示す）
を比較したときの同一性は無視できるとすると、式1: Vo/Vi＝１＋［Ｉ］/Ki （１）に示すVo/Viの［Ｉ］との依存関係により、阻害剤を酵
素から解離するための平衡定数（Ki）を得ることができ
る。

このアッセイにより示される活性は、本発明の化合物
が、不安定なアンギナ、治療抵抗性アンギナ、心筋梗
塞、一過性虚血性発作、心房細動、血栓症発作、塞栓症
発作、深静脈血栓症、散在性血管内凝固、及び再形成さ
れた管の再閉塞又は再発狭窄症に罹患した患者の様々な
症状を治療するための療法として有用であることを示し
ている。処方及び投与手順は以下の実施例の項に記載す
る。

本発明のペプチド化合物を記載するために使用する命
名法は、ペプチドの各アミノ酸残基から見て、Ｎ末端の
アミノ基が左に、カルボキシ基が右にあるとする従来の
方式に従う。本発明の特定の実施態様を示す式では、ア
ミノ及びカルボキシ末端基はしばしば図示していない
が、特に明記しない限り、生理学的pH値での形態である
と考える。従って、生理学的pHでのＮ末端H⁺ ₂及びＣ末
端O^-は、必ずしも明記はしていないが、特定例又は一般
式には存在するものと考える。アミノ酸残基の側鎖の遊
離官能基を、アミド化、アシル化又は他の置換により変
えることもできる。この置換により、例えば、化合物の
活性に作用せずにその溶解度を変えることができる。

図示するペプチドでは、各残基は適当であれば、アミ
ノ酸の慣用名に相当する３文字記法で表す。天然アミノ
酸を示すために通常使用されている略称の他に、ナフチ
ルアラニンの略称Nal（例えばＤ−Nal1、Ｄ−Nal2）も
使用する。Nal1は、アラニンのβ炭素が１−ナフチル位
置に結合しているアミノ酸を示し、Nal2は、アラニンの
β炭素が２−ナフチル位置に結合しているアミノ酸を示
す。

本明細書に示す特定のペプチドでは、Ｄ形態であると
明示しない限り、光学異性体であるＬ形態の任意のアミ
ノ酸残基とする。

実施例１ Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−OBz（１−１）： Boc−NMe−Ｄ−Phe−OH（7.0g,25mmol）及びＨ−Pro
−OBzl・HCl（6.66g,27.5mmol）のDMF（200ml）溶液
に、4.6g（30mmol）のHOBt・H₂Oを添加し、溶液pHを８
（湿式狭幅（moist narrow）pH紙）に調整し、磁気撹拌
しながらEDC（6.47g,33.8mmol）を添加した。3.5時間
後、50mlの水を添加して反応を停止させた。この混合物
を室温で16時間維持した後に、減圧下で溶媒を蒸発さ
せ、残留物をEtOAc−H₂Oに溶解した。KHSO₄水溶液をこ
の二相混合物に添加し、層分離した。有機層をNaHCO₃、
飽和NaClで抽出し、MgSO₄で脱水した。溶媒を蒸発させ
て、生成物を白色固体として得た。それぞれ600gのシリ
カゲル60（E.Merck）を用いる２個のカラムを用い、EtO
Ac−ヘキサン（3:7）を溶離剤とするクロマトグラフィ
ーで、生成物を更に精製した。生成物を含む画分を合わ
せると、11.3g（収率97％）の１−１が得られた。

TLC:R_f＝0.65、シリカゲル、EtOAc−ヘキサン（2:3） Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−OH（１−２）： Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−OBz（１−１）（11.3g）の
95％EtOH（600ml）溶液をN₂で３度フラッシュし、1.8g
の10％Pd/CをN₂下で添加した。この混合物を排気し、H₂
を導入し、反応混合物をH₂雰囲気下（H₂を充填した気
球）で50分間維持した。混合物をN₂でパージし、セライ
トで濾過し、濾液を真空蒸発させた。粘性油状物をCHCl
₃で数回フラッシュすると、泡状白色固体１−２（9.13
g,収率10％）が得られた。

TLC:R_f＝０、シリカゲル、EtOAc−ヘキサン（2:3）;R_f
＝0.3、CHCl₃−MeOH−H₂O（90−10−１）以下の記述で“Acg"は４−アミノシクロヘキシルグリ
シンを意味する。

Boc−トランス−DL−Acg−OH（２−１）： Nutt等,Peptides:Structure and Function,Procee
d.of the 9th Amer.Pept.Symp.,C.Deber等編,Pierce
Chemical Co.Rockford,IL,441−444（1985）に従っ
て２−１を製造した。Banfi等,Syn.Commun.19（９＆1
0）,1787−1799（1989）も、保護していないアミノ酸ト
ランス−DL−Acg−OHの合成を記載している。

Boc−トランス−DL−Acg（Cbz）−OH（２−２）： Nutt等の手順に従って２−１をCbzで保護して、Boc−
トランス−DL−Acg（Cbz）−OH（２−２）を得た。

Boc−トランス−DL−Acg（Cbz）−NMeOMe（２−３）： Boc−トランス−Acg（Cbz）−OH（２−２）（794mg,
1.94mmol）のCH₂Cl₂（10ml）懸濁液に、Ｎ−メチルモル
ホリン（NMM,0.22ml）を添加した。15分間磁気撹拌した
後に、全ての出発材料は溶液と化した。温度を−15℃に
下げて、ｉ−ブチルクロロホルメート（0.25ml,0.27g）
を添加した。混合物を10分間撹拌し、予め乾燥したHNMe
OMe・HCl（0.22g）を添加し、次いでNMMを添加した（最
初に0.15ml、次に40分かけて少しずつ0.17ml）。反応混
合物を室温に暖め、18時間撹拌した。反応物に水を添加
し、30分撹拌した後に、CH₂Cl₂を添加し、有機層を１×
KHSO₄溶液、１×H₂O、１×NaHCO₃溶液及び２×50％飽和
NaClで洗浄した。有機層をNa₂SO₄で脱水し、濾過し、蒸
発させて２−３（746mg,収率85％）を得た。NaHCO₃抽出
物から、出発材料（101mg,12.7％）を回収した。

TLC:R_f＝0.75、シリカゲル、CHCl₃−MeOH−H₂O（95−５
−0.5） HPLC:保持時間＝19.43分（Vydac C₁₈、30分で95％A/B
→５％A/Bの勾配、Ａ＝0.1％TFA−H₂O,B＝0.1％TFA−CH
₃CN） NMR:CD₃OD,δ7.4（m,5）,5.1（s,2）,4.5（br m,1）,
3.0（s,3）,3.3（MeOH）,3.2（s,3）,1.95（m,2）,1.85
（m,1）,1.62（m,2）,1.45（s,9）,1.1−1.3（m,4）。

Boc−トランス−DL−Acg（Cbz）Ψ［CHO］（２−４）：機械撹拌機、温度計及び隔壁を備えた乾燥フラスコ
に、616mg（1.37mmol）のBoc−ｔ−Acg（Cbz）−NMeOMe
（２−３）、及び18mlの乾燥THFを添加した。この懸濁
液を−40℃に冷却し、反応温度を−30℃未満に維持する
ような速度で、LAH溶液（1M LAHのTHF溶液1.78ml）を
滴下した。得られた溶液を−５℃で50分間撹拌し、次い
で−35℃に冷却した。温度を−15℃に維持しながら、エ
ーテル（15ml）及びKHSO₄水溶液を添加した。この２層
混合物を室温で30分間撹拌し、層分離し、水性層をエー
テルで２度抽出した。合わせたエーテル層を1N冷HCl（3
ml）、５％冷NaHCO₃溶液（3ml）及びNaCl飽和溶液（3m
l）で１度抽出した。エーテル層を無水MgSO₄で脱水し、
濾過し、真空蒸発させて、477mg（収率89％）の（２−
４）を得た。

TLC:R_f＝0.7、シリカゲル、EtOAc−ヘキサン（3:2） HPLC:保持時間＝18.8分;C₁₈、30分で100％Ａ→70％A/
B、Ａ＝0.1％TFA−H₂O,B＝0.1％TFA−CH₃CN） NMR:CDCl₃,δ9.62（s,1）,7.4（m,5）,5.1（m,3）,4.58
（d,1）,4.25（t,1）,3.42（m,1）,2.1（m,2）,1.9（m,
2）,1.62（m,1）,1.58（幅広い,H₂O）,1.42（s,9）,1.2
5（m,2）.1.18（m,2）。

Boc−トランス−DL−Acg（Cbz）Ψ［CHOHC（SEt）_３］
（２−５）：温度計、磁気撹拌機、及び添加漏斗を備えた100mlの
三つ口乾燥フラスコに、N₂下で乾燥THF（15ml）中のト
リエチルチオオルトホルメート（1.65ml,8.43mmol）を
添加した。溶液を−65℃に冷却し、温度を−50℃未満に
維持するような速度でTHF中のBuLi（2.89ml,7.23mmol）
を滴下した。反応溶液を−60℃で30分間撹拌し、反応溶
液を−55℃に維持しながら、Boc−トランス−Acg（Cb
z）Ψ［CHO］（２−４）（470mg,1.2mmol）のTHF（4m
l）溶液を滴下した。添加漏斗を1mlのTHFで２度洗浄し
た。−40℃で２時間撹拌した後に、NH₄Cl（0.6g）のH₂O
（13.5ml）及びエーテル（27ml）溶液を添加し、反応混
合物を10℃に暖めた。２層を分離し、水性層をエーテル
で２度抽出した。合わせたエーテル層をNaCl飽和溶液で
１度洗浄し、Na₂SO₄で脱水し、濾過し、真空蒸発させ
て、油状残留物を得た。90gのシリカゲル（E.Merck 23
0−400メッシュ）及び溶離溶媒としてのEtOAc−ヘキサ
ン（3:9）を用いるクロマトグラフィーで、生成物を単
離した。生成物を含む画分（R_f＝0.3、EtOAc−ヘキサン
（3:7））を合わせ、溶媒を蒸発させて除去し、２−５
（317mg,収率45％）を得た。

TLC:R_f＝0.3、シリカゲル、EtOAc−ヘキサン（3:7） HPLC:保持時間＝25.25分及び25.72分；比率1:4（Vydac
C₁₈、30分で80％A/B→10％A/Bの勾配、Ａ＝0.1％TFA
−H₂O,B＝0.1％TFA−CH₃CN）保持時間＝26.95分及び27.36分；比率1:4（Vydac
C₁₈、30分で95％A/B→５％A/Bの勾配） Boc−トランス−DL−Acg（Cbz）Ψ［CHOHCO］−OMe（２
−６）： Boc−トランス−Acg（Cbz）Ψ［CHOHC（SEt）_３］
（２−５）（310mg,0.528mmol）のMeOH−H₂O（18ml,17:
1）溶液に、HgO（183mg,0.845mmol）及びHgCl₂（674mg,
2.48mmol）をN₂下で磁気撹拌しながら添加した。反応混
合物を室温で1.5時間、60℃で30分間撹拌した。室温に
冷却した後、反応混合物をセライトで濾過し、セライト
を1mlのMeOHで２度、5mlのCH₂Cl₂で３度洗浄した。H₂O
（20ml）及びCH₂Cl₂（10ml）を濾液に添加し、層分離
し、水性層をCH₂Cl₂（20ml）で２度抽出した。合わせた
有機層に、H₂O中70％NH₄OAcを添加し、CH₂Cl₂層を３相
混合物から除去し、残留混合物をCH₂Cl₂で２度抽出し、
合わせた有機層をNH₄Cl飽和溶液で１度洗浄し、MgSO₄で
脱水し、濾過し、真空蒸発させて、２−６（215mg,収率
90.4％）を得た。

TLC:R_f＝0.4（主）、0.35（副）、シリカゲル、EtOAc−
ヘキサン（1:1） HPLC:保持時間＝18.67分及び19.02分；比率1:4（Vydac
C₁₈、30分で95％A/B→５％A/Bの勾配、Ａ＝0.1％TFA
−H₂O,B＝0.1％TFA−CH₃CN） Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［CHOH
CO］−OMe（３−１）：ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［CHOHCO］−OMeのHCl塩の製
造:Boc−トランス−Acg（Cbz）Ψ［CHOHCO］−OMe（202
mg,0.448mmol）のEtOAc（20ml）溶液をN₂下で−25℃に
冷却し、反応温度を−５℃未満に維持しながら、飽和す
るまでHClガスを導入した。10分後に飽和すると、溶液
をN₂で45分間パージし、次いで過剰HCl及び溶媒を真空
蒸発させて除去し、油状HCl塩を得た。

Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［CH
OHCO］−OMe（３−１）の製造：脱保護を実施する一方
で、54μｌのNMMを添加したBoc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−O
H（１−２）（187mg,0.493mmol）のCH₂Cl₂（15ml）及び
EtOAc（3ml）溶液をN₂下で−15℃に冷却し、64μｌのｉ
−ブチルクロロホルメートで処理した。−15℃で10分の
後に、先に製造したHCl塩のCH₂Cl₂（4ml）溶液を数回に
分けて又はNMM（50μｌ）と共に添加し、次いでNMM（35
μｌ）を添加して、pHを７にした（湿式狭幅pH紙）。カ
ップリングの後に、TLC（85−15−1.5,CHCl₃−MeOH−H₂
O）で処理して、求核剤を消失せしめた。−10℃で２時
間の後に、H₂Oを添加し、混合物を１時間撹拌し、層分
離し、有機層を１×希KHSO₄溶液、１×H₂O、１×NaHCO₃
溶液及び２×50％飽和NaClで洗浄した。有機層をNa₂SO₄
で脱水し、濾過し、蒸発乾固した。粗組成物を、99−１
−0.1（CHCl₃−MeOH−H₂O）を溶離剤とするシリカゲル
のクロマトグラフィーで精製し、生成物を含む画分を合
わせて真空蒸発させ、３−１を白色固体として得た（27
5mg,収率87％）。

TLC:R_f＝0.45,0.5（異性体２種）、シリカゲル、CHCl₃
−MeOH−H₂O（95−５−0.5） HPLC:保持時間＝17.2分及び17.5分；比率46:43（Vydac
C₁₈、30分で75％A/B→20％A/Bの勾配、Ａ＝0.1％TFA
−H₂O,B＝0.1％TFA−CH₃CN） Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［CHOH
CO］−OH（３−２）： pHを12−13に維持しながら、17mlの1:1（v/v）THF/H₂
Oに溶解したBoc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−DL−Acg（Cb
z）Ψ［CHOHCO］−OMe（３−１）（270mg,0.38mmol）の
試料を、2.2N LiOH（0.22ml）で1.5時間かけて数回で
処理した。2.5時間後、反応溶液を希KHSO₄溶液でpH7に
調節した。50mlのEtOAcと25mlのH₂Oとを添加し、水性層
をKHSO₄溶液で更にpH2に調節した。有機層を分離し、50
％飽和NaCl溶液で２度洗浄し、Na₂SO₄で脱水し、真空蒸
発させて、３−２（251mg,収率95％）を得た。

TLC:R_f＝0.4、シリカゲル、EtOAc−AcOH−ｉ−オクタン
−H₂O（12−２−２−10）の上層以下の実施例４に記載の手順に従って３−２を酸化
し、脱保護して、３−３を得た。

Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［CHOH
CO］−NHMe（４−１）： Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［CH
OHCO］−OH（３−２）（125mg,0.18mmol）のジメチルア
セトアミド（6.5ml）溶液に、34mgの１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール水和物（HOBt）、35μｌのNMM及び29m
gのメチルアミン塩酸塩を添加し、この混合物を15分間
撹拌して、完全に溶解した。この溶液に１−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸
塩（EDC,51mg）を添加し、得られた混合物を20時間磁気
撹拌した。水（30ml）及びEtOAc（75ml）を添加し、有
機層を希KHSO₄溶液、H₂O、NaHCO₃溶液、及び50％飽和Na
Clで洗浄し、Na₂SO₄で脱水し、濾過し、真空蒸発させ
て、４−１（117mg,収率92％）を得た。

TLC:R_f＝0.3、シリカゲル、CHCl₃−MeOH−H₂O（95−５
−0.5） Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［COC
O］−NHMe（４−２）： Boc−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［CH
OHCO］−NHMe（４−１）（115mg,0.16mmol）のCH₂Cl
₂（9ml）溶液に、パーヨージナン（0.46g）（Dess−Mar
tin試薬）を磁気撹拌しながら添加した。１時間後、エ
ーテル（45ml）を添加し、次いでチオ硫酸ナトリウム溶
液（25mlの飽和NaHCO₃中2.0g）を強く撹拌しながら添加
した。５分後、両層は透明であり、エーテル層を分離
し、希NaHCO₃、50％飽和NaClで洗浄し、Na₂SO₄で脱水
し、真空蒸発させて、未精製のケトアミド４−２を得
た。

TLC:R_f＝0.50、シリカゲル、CHCl₃−MeOH−H₂O（95−５
−0.5）Ｈ−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−Ｄ−AcgΨ［COCO］−NHMe
（４−３）及びＨ−NMe−Ｄ−Phe−Pro−ｔ−Ｌ−AcgΨ
［COCO］−NHMe（４−４）： HF反応容器（Kel−Ｆ）中のBoc−NMe−Ｄ−Phe−Pro
−ｔ−DL−Acg（Cbz）Ψ［COCO］−NHMe（４−２）（12
5ml）のCH₂Cl₂（4ml）溶液をN₂パージして溶媒除去し、
1.2mlのアニソール中の残留物を排気して、残留CH₂Cl₂
を除去した。約12mlのHFを反応容器内にて−70℃で凝縮
させた。０〜５℃で1.25時間撹拌した後に、HFを真空除
去し、20mlのエーテル、次いで20mlの石油エーテルを残
留物に添加した。上清を焼結ガラス漏斗内にデカント
し、粘着性残留物を1:1（v/v）エーテル／石油エーテル
で３度洗浄し、それぞれ前述のようにデカントした。N₂
気流中で乾燥した後に、容器内の残留物を25mlのH₂Oに
溶解し、前記焼結漏斗に溶液を注入して、生成物を完全
に回収した。100％Ａ→60％A/Bの勾配溶離系を120分、8
0ml/分の流量で用いる分取HPLC Waters Prep−Pak C
₁₈カラムに２種のジアステレオマー生成物を含む濾液を
直接導入した。２種の異性体のうち、後に溶離する方の
ピークはより強いトロンビン阻害剤となり、Acg中心で
Ｌ配置（４−４）を有した。

HPLC:保持時間＝16.7分（Ｄ）及び18.5分（Ｌ）,Vydac
C₁₈,30分で100％Ａ→65％A/Bの勾配、Ａ＝0.1％TFA−
H₂O,B＝0.1％TFA−CH₃CN 両異性体のFABMS:472（Ｍ＋Ｈ）,504（Ｍ＋MeOH），分
子量計算値＝472。

トロンビン阻害剤−治療での使用様々な血栓症症状、特に冠状動脈や大脳血管の疾病の
治療や予防のために、抗凝血性治療が知られている。こ
の分野の専門家には抗凝血性治療を必要とする状況は容
易に分かる。本明細書で使用する“患者”という用語
は、霊長類（例えばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、
イヌ、ネコ、ラット及びマウス）のような哺乳動物を意
味するものとする。

トロンビン阻害は、血栓症症状を示す個体の抗凝血性
治療に有用であるだけでなく、保存全血の凝固防止や、
他の試験又は保存用生物試料の凝固防止のように凝血阻
止が必要なときはいつでも有用である。従って、例えば
哺乳動物血液を血管移植片、ステント、整形用プロテー
ゼ、人工心臓及び体外循環系からなる群の中から選択さ
れる物と接触させたときに凝血を阻止することが望まし
い、トロンビンを含むか又は含むと思われる媒質にトロ
ンビン阻害剤を添加するか、又はこれらを接触させるこ
とができる。

本発明のトロンビン阻害剤は、錠剤、カプセル剤（そ
れぞれ徐放剤又は速放剤を含んでいる）、ピル剤、粉
剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁液、シロッ
プ剤及び乳濁液のような経口形態で投与することができ
る。更には、静脈内（濃縮塊又は浸剤）、腹腔内、皮
下、又は筋肉内形態で投与してもよい。これらは全て、
医薬業界の当業者にはよく知られた形態を使用する。有
効ではあるが、無毒な量の所望化合物を抗凝血剤として
使用することができる。

トロンビン阻害剤を、活性成分を徐放させ得るように
処方できるデポ剤又は埋込剤の形態で投与することがで
きる。活性成分を圧縮して、埋込剤又は小型シリンダー
にして、デポ剤又は埋込剤として皮下又は筋肉内に移植
することができる。埋込剤は、生分解性ポリマー又は合
成シリコーン（例えばDow−Corning Corporaiont製のS
ilastic、シリコーンゴム又は他のポリマー）のような
不活性材料を使用し得る。

トロンビン阻害剤は、リポソーム送達系（例えば小単
層板状小胞、大単層板状小胞、及び多層板状小胞）の形
態で投与することもできる。リポソームは、様々なリン
脂質（例えばコレステロール、ステアリルアミン又はホ
スファチジルコリン）から生成され得る。

トロンビン阻害剤は更に、モノクローナル抗体を、化
合物分子と結合する個体キャリヤーとして使用して送達
され得る。トロンビン阻害剤を、標的指向性薬剤キャリ
ヤーとしての可溶性ポリマーと結合してもよい。このよ
うなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポ
リマー、ポリヒドロキシ−プロピル−メタクリルアミド
−フェノール、ポリヒドロキシエチル−アスパルトアミ
ド−フェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポ
リエチレンオキシド−ポリリシンが含まれ得る。更に
は、トロンビン阻害剤をドラッグの放出を調整するのに
有用なタイプの生分解性ポリマー（例えばポリ酢酸、ポ
リグリコール酸、ポリ酢酸とポリグリコール酸とのコポ
リマー、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪
酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒド
ロピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架
橋又は両親媒性ブロックコポリマー）と結合してもよ
い。

トロンビン阻害剤を使用する投与計画は、様々な要因
（例えば、患者の型、種、年齢、体重、性別及び医療状
態、治療すべき症状の重症度、投与経路、患者の腎肝機
能、並びに使用する特定化合物又はその塩）に応じて選
択する。当業界の医師又は獣医は、症状の進行を阻害、
阻止、又は停止させるのに必要な有効量のドラッグを容
易に決定して処方し得る。

所定の効果のために使用するときのトロンビン阻害剤
の経口用量は、約0.2mg〜約100mg/kg/日、好ましくは1.
0〜100mg/kg/日、最も好ましくは１〜20mg/kg/日であ
る。最も好ましい静脈内投与量は、一定速度の注入中で
約0.01〜約10mg/kg/分である。トロンビン阻害剤を１日
に２回、３回又は４回に分けて投与することが有利であ
り得る。更には、適切な鼻腔内ベヒクルを局所的に用い
て、又は当業者によく知られた経皮膚スキンパッチの形
態を用いる経皮膚経路で投与することができる。経皮膚
送達系の形態で投与される場合、薬剤投与は勿論投与計
画期間にわたり継続的であり、断続的ではない。

トロンビン阻害剤は通常、意図する投与形態（即ち経
口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤等）に
対して適切に選択され、かつ従来の医薬診療と相容れる
適切な医薬希釈剤、賦形剤又はキャリヤー（本明細書で
は“キャリヤー”材料と総称する）と混合した活性成分
として投与される。

例えば、錠剤又はカプセル剤形態の経口投与では、活
性薬剤成分を、医薬的に許容可能な無毒経口不活性キャ
リヤー（例えばラクトース、デンプン、スクロース、グ
ルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウ
ム、リン酸二カルシウム、硫酸ナトリウム、マンニトー
ル、ソルビトール等）と合わせることができ、液状形態
の経口投与では、経口薬剤成分を医薬的に許容可能な無
毒経口不活性キャリヤー（例えばエタノール、グリセロ
ール、水等）と合わせることができる。更には、所望と
あれば又は必要とあれば、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊
剤及び着色剤を混合物に取り込むこともできる。適切な
結合剤には、デンプン、ゼラチン、天然糖（例えばグル
コース又はβ−ラクトース）、トウモロコシ甘味剤、天
然及び合成ゴム（例えばアカシア、トラガカント又はア
ルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、
ポリエチレングリコール、ろう等が含まれる。これらの
剤形で使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、
ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、
安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム
等が含まれる。崩壊剤は非制限的ではあるが、デンプ
ン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタ
ンゴム等を含む。

トロンビン阻害剤は、様々なascular病理学の治療で
相乗効果を得るために、適切な抗凝血剤又は血栓融解剤
（例えばプラスミノゲン活性化因子又はストレプトキナ
ーゼ）と一緒に投与することもできる。例えば、トロン
ビン阻害剤は、組織プラスミノゲン活性化因子を媒介と
する血栓融解再潅流の効果を高める。血栓形成後にまず
トロンビン阻害剤を投与することができ、その後組織プ
ラスミノゲン活性剤又は他のプラスミノゲン活性化因子
を投与する。トロンビン阻害剤をヘパリン、アスピリン
又はワルファリンと合わせてもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ルイス，エス・ドールアメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 19446、ランスデール、ベローズ・ウエイ・117 (72)発明者シエフアー，ジユールズ・エーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 19437、グウイネツド・バレー、グウイネツド・バレー・ドライブ・440 (72)発明者フエン，ドン−メイアメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 19438、ハーレイスビル、サラトガ・レーン・50 (72)発明者ナツト，ルース・エフアメリカ合衆国、カリフオルニア・ 92122、サン・デイエゴ、シヨアライン・ドライブ・7160、アパートメント・ 4307 (72)発明者ブラデイ，ステイーブン・エフアメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 19118、フイラデルフイア、クレフエルド・ストリート・8803 (56)参考文献特開昭57−2253（ＪＰ，Ａ) 特表平５−504775（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/087 A61K 38/00 A61P 7/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式：（式中、ｍは０又は１であり；ｎは１であり；ＸはＯであり；Ｒはフェニルアラニル又はＮ−メチルフェニルアラニル
であり； R¹はＨであり； R²はＨ又はCH₃であり；ＹはCHO、COCF₃、BO₂R⁷R⁸、CO₂R⁴、COOH、CONR⁵R⁶、COC
O₂R⁴、COCO₂H、COCO−Ｑ、又はCO−Ｗであり；ここで、Ｑは天然アミノ酸、シクロヘキシルアミノ酸、NR⁵R⁶、
もしくは又はこれらの誘導体であり；Ｗは五〜十員複素環式であり； R⁴はC_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであり； R⁵はＨ、C_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであ
り； R⁶はＨ、C_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであ
り； R⁷はＨ、C_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであ
り； R⁸はＨ、C_1-3アルキル又はアリールC_1-3アルキルであ
る）で表される化合物、及びその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２】式：（式中、ｎは１であり；ｍは０又は１であり；Ｒはフェニルアラニン又はＮ−メチルフェニルアラニン
であり； R¹はＨであり； R²はＨ又はCH₃であり；ＸはＯであり；ＹはCONH₂、COCO₂H、COCONHCH₃、COCONHCH₂Ph、である）で表される請求項１に記載の化合物、及びその医薬的に
許容可能な塩。
【請求項３】式：（式中、Ｒはフェニルアラニン又はＮ−メチルフェニルアラニン
であり； R¹はＨであり；ＹはCONH₂、COCO₂H、COCONHCH₃、である）で表される請求項２に記載の化合物、及びその医薬的に
許容可能な塩。
【請求項４】からなる群の中から選択される化合物。
【請求項５】哺乳動物でトロンビン阻害又は血栓もしく
は塞栓形成阻止のために使用する請求項１に記載の化合
物。
【請求項６】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容可
能なキャリヤーとを含んでなる血液中のトロンビンを阻
害するための組成物。
【請求項７】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容可
能なキャリヤーとを含んでなる血液中での血小板損失を
阻害するための組成物。
【請求項８】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容可
能なキャリヤーとを含んでなる血液中での血小板凝集物
の形成を阻害するための組成物。
【請求項９】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容可
能なキャリヤーとを含んでなる血液中でのフィブリン形
成を阻害するための組成物。
【請求項１０】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容
可能なキャリヤーとを含んでなる血液中での血栓形成を
阻害するための組成物。
【請求項１１】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容
可能なキャリヤーとを含んでなる血液中での塞栓形成を
阻害するための組成物。
【請求項１２】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容
可能なキャリヤーとを含んでなる血液製剤中のトロンビ
ンを阻害するための組成物。
【請求項１３】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容
可能なキャリヤーとを含んでなる血液製剤中での血小板
損失を阻害するための組成物。
【請求項１４】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容
可能なキャリヤーとを含んでなる血液製剤中での血小板
凝集物の形成を阻害するための組成物。
【請求項１５】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容
可能なキャリヤーとを含んでなる血液製剤中でのフィブ
リン形成を阻害するための組成物。
【請求項１６】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容
可能なキャリヤーとを含んでなる血液製剤中での血栓形
成を阻害するための組成物。
【請求項１７】請求項１に記載の化合物と医薬的に許容
可能なキャリヤーとを含んでなる血液製剤中での塞栓形
成を阻害するための組成物。
【請求項１８】血液製剤に請求項12に記載の組成物を添
加することからなる血液製剤中のトロンビンを阻害する
ための方法。
【請求項１９】血液製剤に請求項13に記載の組成物を添
加することからなる血液製剤中での血小板損失を阻害す
るための方法。
【請求項２０】血液製剤に請求項14に記載の組成物を添
加することからなる血液製剤中での血小板凝集物の形成
を阻害するための方法。
【請求項２１】血液製剤に請求項15に記載の組成物を添
加することからなる血液製剤中でのフィブリン形成を阻
害するための方法。
【請求項２２】血液製剤に請求項16に記載の組成物を添
加することからなる血液製剤中での血栓形成を阻害する
ための方法。