DK162167B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af mitosanderivater - Google Patents

Description

i

DK 162167 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogi fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte mitosanderivater, som er mitomycinanaloge indeholdende én eller flere amidinogrupper. Disse forbindelser er mitomycin C derivater, hvori enten 7-aminogruppen eller carbamidonitrogenato-5 met, eller begge, er indbygget i en amidinosubstituent. Disse forbindelser er aktive antitumormidler i eksperimentelle animalske tumorer.

Nomenklatur - Det systematiske navn for mitomycin C er, ifølge Chemical Abstracts: [laR-(laa,8/i,8aaf,8ba!)]-6-anrino-8-[((aminocarbonyl)oxy)methyl]-10 l,la,2,8,8a,8b-hexahydro-8a-methoxy-5-methyl-azirino[2,,3',3,4]- pyrrolo[l,2-a]-indol-4,7-dion, i henhold til hvilket azirinopyrroloin-dolringsystemet nummereres som følger: 7 8 15 6ry~ia

4 J I ^ NH

I- 2 la x Chemical Abstracts 20

Et trivielt nomenklatursystem, der har fundet udstrakt anvendelse inden for mitomycinlitteraturen, identificerer det foregående ringsystem inklusive flere af de karakteristiske substituenter for mitomycinerne som mi tosan.

30 ra3 fi 4 1 1 jX11 3 2

Mi tosan

Selv om dette system er bekvemt og hensigtsmæssigt for en række 35 simple derivater, såsom de, der bærer N-substituenter på azirinoringni-trogenatomet eller i 7- eller 9a-stilli ngerne, lider det af visse tvetydigheder og mangler til almen brug. I henseende til forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse, hvoraf nogle har substituenter på både 2

DK 162167 B

azirinoringnitrogenatomet og på sidekædecarbamoylnitrogenatomet, er der ingen konventionel nummerering, som kan skelne disse stillinger. I den foreliggende beskrivelse er det derfor blevet valgt at referere til azi-rinonitrogenatomet som Nla og carbamoyl nitrogenatomet som N10 ved brugen 5 af mitosannomenklatursystemet. Med hensyn til de omhandlede forbindelsers stereokemiske konfiguration er det hensigten, når de identificeres ved grundnavnet "mitosan" eller ved en strukturformel, at identificere den som den stereokemiske konfiguration af mitomycin C.

Mitomycin C er et antibiotikum, som fremstilles ved fermentering, 10 og som allerede forhandles med godkendelse af "Food and Drug

Administration" i terapien af disseminerede adenocarcinorner i mave eller pancreas i efterprøvede kombinationer med andre godkendte kemoterapeuti-ske midler og til palliativ behandling, når andre muligheder har fejlet (Mutamycin®, Bristol Laboratories, Syracuse, New Yor, 13201, 15 Physicians' Desk Reference 35th Edition, 1981, pp. 717 og 718). Mitomycin C og fremstillingen deraf ved fermentering er genstand for USA patentskrift nr. 3.660.578, udstedt 2. maj 1972 under påberåbelse af prioritet fra tidligere ansøgninger, herunder en ansøgning indleveret i Japan den 6. april 1957.

20 Strukturerne af mitomyciner A, B, C og af porfiromycin blev først publiceret af J.S. Webb, et al. fra Lederle Laboratories Division American Cyanamid Company, J. Amer. Chem. Soc. 84, 3185-3187 (1962). En af de kemiske transformationer, som blev anvendt i dette strukturstudium for at relatere mitomycin A og mitomycin C, var omdannelsen af først-25 nævnte 7-9a-dimethoxymitosan ved omsætning med ammoniak til sidstnævnte 7-amino-9a-methoxymitosan. Udbytning af 7-methoxygruppen- i mitomycin A har vist sig at være en reaktion af betydelig interesse ved fremstillingen af antitumoraktive derivater af mitomycin C. De følgende artikler og patentskrifter omhandler alle omdannelsen af mitomycin A til et 7-30 substitueret aminomitomycin C derivat med antitumoraktivitet. Formålet med dette forskningsarbejde var at fremstille derivater, som var mere aktive, og især som var mindre toxiske end mitomycin C.

Matsui et al., "The Journal of Antibiotics", XXI, 189-198 (1968).

Kinoshita et al., "J. Med. Chem.", 14, 103-109 (1971).

35 Iyengar et al., "J. Med. Chem.", 24, 975-981 (1981).

Iyengar, Sami, Remers og Bradner, Abstracts of Papers, Annual Meeting of the American Chemical Society, Las Vegas, Nevada, marts 1982, sammendrag nr. MEDI 72.

3

DK 162167 B

De følgende patentskrifter omhandler fremstillingen af 7-substitue-rede aminomitosanderivater ved omsætning af mitomycin A, mitomycin B el- 1 a ler et N -substitueret derivat deraf med en primær eller sekundær amin: Cosulich et al., USA patentskrift nr. 3.332.944, udstedt 25. juli 5 1967.

Matsui et al., USA patentskrift nr. 3.420.846, udstedt 7. januar 1969.

Matsui et al., USA patentskrift nr. 3.450.705, udstedt 17. juni 1969.

10 Matsui et al., USA patentskrift nr. 3.514.452, udstedt 26. maj 1970.

Nakano et al., USA patentskrift nr. 4.231.936, udstedt 4. november 1980.

Remers, USA patentskrift nr. 4.268.676, udstedt 19. maj 1981.

15 Mitomycin C derivater med en substitueret aminosubstituent i 7- stillingen er også blevet fremstillet ved direkte biosyntese, dvs. ved at tilsætte en række primære aminer til fermenteringssubstrater og udføre den konventionelle mitomycinfermentering (C.A. Claridge et al., Abst. of the Annual Meeting of Amer. Soc. for Microbiology 1982. Sammendrag 20 028).

Mitomycin C er den primære mitomycin, som fremstilles ved fermentering, og den er den kommercielt tilgængelige form. Den nuværende teknologi for omdannelse af mitomycin C til mitomycin A til brug ved fremstillingen af de semisyntetiske substituerede aminoanaloge af mitomycin 25 C, hvortil der er henvist i de ovennævnte publikationer, involverer hydrolyse af mitomycin C til den tilsvarende 7-hydroxymitosan, en højst ustabil forbindelse, og dernæst methylering af dette stof med diazome-than, som er et meget farligt stof at håndtere. Et forsøg på at undgå anvendelsen af diazomethan til methylering af 7-0-demethylmitomycin A, 30 som fremstilles ved hydrolyse af mitomycin C, involverer anvendelsen af 7-acyloxymitosaner (Kyowa Hakko Kogyo KK, japansk patentskrift nr. J5 6073-085, Farmdoc nr. 56227 D/31).

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt gruppe af monoguanidino- eller mono- og bis-amidinoanaloge af mitomycin C, 35 hvori enten 7-aminonitrogenatomet eller N10 carbamoyl nitrogenatomet for mitomycin C, eller begge, er del af en aminosubstituent, eller 7-amino-nitrogenet er del af en guanidinogruppe. Tilsvarende analoge af mitomycin A med methoxygruppen i 7-stillingen og amidinogruppen i N10-stil- 4

DK 162167 B

lingen er også omfattede. Den foreliggende opfindelse angår en anal ogi -fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt mitosanderivat med strukturformel 5 s Ϊ \ 1 Al/"3 (Π

10 O [_1>-R

hvori A er amino, methoxy, hydroxy, (1-lavere al kyl-2(IH)-pyridinyliden)-amino, eller en gruppe med formlen 15 R2 H R2 R2R5 n R3R^bi-C=N-, R3-N-€=N-, R3-K=C-N-, / R9 20 , (CHj eller l k , 11 R2 R^R3 A 17

1 II /7 N- R

H-N-OtJ-, HN=C-N-, R _2

^ K

3 4 25 B er amino eller amidinogruppen med formlen S R N-C=N-, idet mindst den ene af A og B er én af de angivne grupper, som er forskellig fra amino, methoxy eller hydroxy, n er nul eller et helt tal 1, 2 eller 3, R* er hydrogen, lavere al kyl, lavere alkanoyl, benzoyl eller sub-30 stitueret benzoyl, hvori substituenten er lavere alkyl, lavere alkoy, halogen, amino eller nitro, 2 R er hydrogen, lavere al kyl, phenyl, lavere al kyl phenyl, lavere alkoxyphenyl, halogenphenyl, aminophenyl, nitrophenyl, thienyl, furyl, cyano, di lavere al kyl amino, lavere alkoxy eller lavere al kyl thi o, 3 4 35 R er lavere al kyl, lavere alkoxy, eller danner sammen med R og nitrogenatomet, hvortil de er bundne, pyrrolidin, 2- eller 3-lavere alkyl pyrrol i din, piperidin, 2-, 3- eller 4-lavere alkylpiperidin, 2,6-di-lavere alkylpiperidin, piperazin, 4-substitueret piperazin (hvori 4-sub- 5

DK 162167 B

stituenten er al kyl, eller carbalkoxy med hver 1 til 8 carbonatomer, phenyl, methyl phenyl, methoxyphenyl, halogenphenyl, nitrophenyl eller benzyl), azepin, 2-, 3-, 4- eller 5-lavere alkylazepin, morpholin, thio- morpholin, thiomorpholin-l-oxid eller thiomorpholin-l,l-dioxid, 4 3 5 R er lavere al kyl eller danner sammen med R og nitrogenatomet, hvortil de er bundne, pyrrolidin, 2- eller 3-lavere alkylpyrrolidin, pi-peridin, 2-, 3- eller 4-lavere al kylpiperidin, 2,6-dilavere al kyl pi peri-din, piperazin, 4-substitueret piperazin (hvori 4-substituenten er al-kyl, eller carbalkoxy med hver 1 til 8 carbonatomer, phenyl, methylphe-10 nyl, methoxyphenyl, halogenphenyl, nitrophenyl eller benzyl), azepin, 2-, 3-, 4- eller 5-lavere alkylazepin, morpholin, thiomorpholin, thiomorpholin-l-oxid eller thiomorpholin-l,l-dioxid, ς R er udvalgt blandt Cj_jgalkyl, bortset fra tert-alkyl, Cj ^alkenyl, C118alkynyl, Cj 18halogenalkyl, C118hydroxyalkyl, C4 8ykloalkyl, 15 eller aryl eller lavere aralkyl med hver indtil 12 carbonatomer eller en heteroalicyklisk eller heteroaromatisk gruppe med fra 3 til 8 ringatomer, hvoraf mindst to er carbonatomer, 7 9 R og R er uafhængigt H eller lavere alkyl, hvori hver af de førnævnte lavere al kyl-, lavere alkanoyl- og lave- 20 re alkoxygrupper indeholder 1 til 6 carbonatomer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er karakteriseret ved, at man a) omsætter en forbindelse udvalgt fra gruppen bestående af mitomycin C, la mitomycin A eller et N -substitueret derivat af en af disse, med en amidacetal med formlen 25 2

R3 R

'\n^:-or8 4 I g ^ OR Formel (V) 2 3 4 8 30 hvori R , R og R har de ovenfor angivne betydninger, og hver R uafhængigt betegner lavere alkyl eller cykloalkyl med indtil 6 carbonatomer, eller tilsammen er alkylen, som sammen med de tilknyttede oxygenatomer og det mellemliggende carbonatom danner en cyklisk struktur med 5 eller 6 ringatomer, i opløsning i et vandfrit, reaktionsforeneligt, fly-35 dende, organisk reaktionsmedium ved 40°C til 65°C, indtil der dannes et reaktionsprodukt, hvori B eller både A og B i formlen (I) er amidino-gruppen med formlen 6

DK 162167 B

R2 r3r4n-c=n-, 5 eller b) til fremstilling af en 7-substitueret amino-9a-methoxymitosan omsætter en forbindelse, hvori B eller både A og B er amidinogruppen med formlen R2

10 I

R3R4N-C=N-, med en al i fati sk, al i cykl i sk, aromatisk, heteroaromatisk eller hetero-ali cykl i sk primær amin, hvori det carbonatom, som bærer aminogruppen, 15 bærer mindst ét hydrogenatom og færre end to arylgrupper, i et vandfrit, reaktionsforeneligt, flydende, organisk reaktionsmedium ved en temperatur fra ca. —15°C til +50°C, eller c) fremstiller en forbindelse, hvori A er amidino og B er amino ved, at man behandler en forbindelse, hvori både A og B er amidinogruppen med formlen 20 R2 R3R4N-C=N-, 25 med mere end én mol del af en amin udvalgt fra gruppen bestående af ami-nodiphenylmethan, tri fluorethylamin og tert-butylamin ved fra 20°C til 60°C, eller d) fremstiller en forbindelse, hvori B er -NHg, A er (1-la-vere alkyl-2(lH)-pyridinyliden)amino eller en gruppe med formlen 30 (CH 2]n r2 Hf f Γ-Λ Γ V*9 r3r^n-c=n-, r^n-, h^-on- , k y. -Aj-

eller |7 R

35 og R*, R2, R3, R4, R^, R^ og n har de ovenfor anførte betydninger, ved, at man omsætter en opløsning af mitomycin C i dimethyl formamid (eller et andet forligeligt opløsningsmiddel) med fra 1,0 til 1,5 mol dele natrium-hydrid til dannelsen af en anionisk form af mitomycin C, og omsætter 7

DK 162167 B

denne anioniske form med et elektrofilt reagens, som er i stand til at danne amidinogruppen, udvalgt blandt en iminoether, en iminothioether, et halogenmethyleniminiumhalogenid og et iminohalogenidsalt.

Ved at anvende tilsvarende udgangsmaterialer fremstilles fortrins-5 vis 7-(dimethyl aminomethyl en)amino-9a-methoxymitosan. Fagmanden vil kunne indse, at tautomere former af nogle af de foregående amidinogrup-per eksisterer. Sådanne skal også være omfattede af de foranstående formler og af den foreliggende opfindelse.

De ovennævnte forbindelser med formel (I) har antitumoraktivitet i 10 forsøgsdyr.

Forbindelserne med formel (I) fremstilles ved omsætning af mitomy- la cin C, 7-hydroxy-9a~methoxymitosan, eller mitomycin A eller en N -substitueret analog af enhver af de foregående, med en amidacetal. De forbindelser med formel (I), hvori A, men ikke B, er amidinogruppen, kan la 15 også fremstilles ved omsætning af mitomycin C eller en N -substitueret 7 analog deraf med en stærk base til dannelse af en anion ved N , efterfulgt af omsætning af anionen med et reagens, der er i stand til at danne aminomethylengruppen, såsom et halogenmethyleniminiumsalt.

De foretrukne forbindelser, som fremstilles ifølge opfindelsen, er 20 mitomycin C analoge, hvori 7-aminogruppen er indbygget i en substitueret eller usubstitueret amidinogruppe. De har stærk antitumorvirkning over for eksperimentelle animalske tumorer. Disse forbindelser fremstilles ved omsætning af mitomycin C med et reagens, der er i stand til at omdanne 7-aminogruppen til en 7-amidinogruppe. Foretrukne reagenser til 25 dette formål er amidacetalerne, der reagerer i godt udbytte og under milde betingelser med mitomycin C (eksempler 1-5 og 18). En anden gruppe amidindannende reagenser er imidoylhalogeniderne (eksempel 17), halogen-methyleniminiumsaltene (eksempel 15), 2-halogen-l-alkylpyridiniumhaloge-niderne (eksempel 16) og iminoethrene eller iminothioethrene (eksempel 30 13 og 14), der reagerer med den anioniske form af mitomycin C, som dannes ved deprotoni sering af 7-aminogruppen deraf ved behandling med stærk base. Betingelser for deprotonisering af mitomycin C involverer behandling af mitomycin C i dimethylformamidopiøsning med cirka 1,5 moldele natriumhydrid ved stuetemperatur. Omsætning af den således dannede anio-35 niske form med ét eller flere af de foregående reagenser gør fortrinsvis brug af 1 til 1,5 moldele deraf i forhold til mitomycin C, ved en temperatur fra stuetemperatur til cirka -60°C. Aprote polære organiske opløsningsmidler, såsom dimethyl formamid, hexamethylphosphoramid, dimethyl- 8

DK 162167 B

sulfoxid eller pyridin, anvendes som reaktionsmedium. Fremgangsmåden er imidlertid ikke begrænset til dannelse af anionisk mitomycin C på denne specifikke måde, eftersom modifikationer vil kunne indses af fagmanden.

Den foretrukne fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne med 5 formel (I), hvori B eller både A og B er amidinogruppen med formlen R2 rVn-Ln-, 10 13.

består i omsætning af mitomycin C eller mitomycin A eller et N -substitueret derivat af en af disse med en amidacetal med formlen 3 p2 ir ^ 15 ^N-C-or8 R4 0r8 Formel (V) 2 3 4 8 hvori R , R og R har de ovenfor angivne betydninger, og R er lavere

O

al kyl eller cykloalkyl med indtil 6 carbonatomer, eller de to R -grupper 20 er forbundne som en alkylenkæde, der med de to oxygenatomer og det mellemliggende carbonatom danner en cyklisk struktur med 5 eller 6 ringatomer.

Omsætningen under a) ovenfor af sådanne amidacetaler med primære aminer er ganske velkendt i teknikken, og fagmanden vil vide, hvorledes la 25 omsætningen skal udføres med mitomycin C, mitomycin A eller N -alkylde-rivaterne deraf. Der refereres f.eks. til H.E. Winberg, USA patentskrift nr. 3.121.084 (11. februar 1964) og til R.F. Abdulla et al., "The Chemistry of Formamide Acetals", Tetrahedron, Vol. 35, pp. 1720-24 (1979).

30 Det foretrækkes at udføre omsætningen i et flydende vandfrit reaktionsmedium, hvori diluenten er en væske, der er forenelig med reaktionsbetingelserne. Fortrinsvis er sidstnævnte et lavere halogeneret al i fati sk carbonhydrid eller en lavere al kano! eller gerne en blanding af de to. Chloroform og methanol og blandinger deraf er ganske velegne-35 de. Omsætningen udføres ved en temperatur fra 40°C til 65°C i et tilstrækkeligt tidsrum til, at reaktionen forløber til afslutning.

Når et stort overskud (ca. 60 gange) af acetal en anvendes, er det dominerende dannede produkt bisamidinoforbindelsen, dvs. de forbindelser DK 162167 13 9 med formel (I), hvori bade A og B udgør amidinogruppen. N -formylderivatet dannes undertiden som et biprodukt. Når imidlertid en begrænset mængde (ca. 10 gange) af acetalen anvendes, dannes, foruden bis-amidino-forbindelsen, også en monoamidinoforbindelse, dvs. en forbindelse med 5 formel (I), hvori A er aminogruppen og B er amidinogruppen. Blandinger af de foran nævnte reaktionsprodukter adskilles let ved kromatografe-ring, som beskrevet i de følgende eksempler.

Nogle kommercielt tilgængelige amidacetaler, som kan anvendes ved denne fremgangsmåde, er angivet i tabel I, som er taget fra den oven-10 nævnte artikel af Abdulla, et al., p. 1685.

Tabel I

Nogle kommercielt tilgængelige amidacetaler 15 Acetal Struktur A (CH3)2NCH(0CH3)2 B (CH3)2NCH(0CH2CH3)2 CH,

20 I

c (ch3)2nch(och2-c-ch3)2 CH3 D (CH3)2NC(CH3)(0CH3)2 25 0-CH2

E (CH3)2NCH^ I

xo-ch2 zCH3 F (CH3)2NCH(0-CH^ )2 30 ch3 G (CH3)2NCH(0CH2CH2CH3)2 h (CH3)2NCH(0 35 _______ 2

Forbindelserne med formel (I), hvori R er cyano, di lavere al kyl-amino, lavere alkoxy eller lavere al kyl thi o, fremstilles ved at anvende 10

DK 162167 B

de følgende orthocarbonatderivater i stedet for amidaeetal erne ved den foran nævnte fremgangsmåde.

CN

5 I . N(CH3)2

(ch3)2n-c-(oc2h5)2 (c2h5o)2c CT

n(ch3)2

Formel (VI) Formel (VII) 10 (c2h5o)3c-n(ch3)2 (c2h5s)3c-n(ch3)2

Formel (VIII) Formel (IX) 15 Disse reagenser er let tilgængelige fra følgende kilder:

Formel (VI): Kanthlehner, et al., Liebigs Ann.

Chem., 1981, 70-84.

Formel (VII), (VIII) og (IX): H. Meerwein, et al., Liebigs Ann.

20 Chem. 641, 1 (1961).

R2 3

Amidinoderivaterne med formel (I), hvori A er R NHC=N- eller r2r5

25 M

3 R N=C-N-, fremstilles ud fra den anioniske form af mitomycin C eller et N^-substitueret derivat deraf, som beskrevet ovenfor. Egnede halogenme-thyl eniminiumsal te til anvendelse ved denne fremgangsmåde er beskrevet i litteraturen. Repræsentative er de, som er anført af W. Kantlehner i 30 "Advances in Organic Chemistry", vol. 9, del 2, Wiley Interscience, 1979, pp. 81 og 82. Tabel II nedenfor er taget fra Kantlehners sammendrag.

Tabel II

35 Halogenmethylenimini umsalte r2-c^© yO 'nr3r4 11

DK 162167 B

R2 R3 R4 X Y Smp., °C

H CH3 CH3 Cl Cl 140-145 5 H CH3 CH3 Br Br 156-158 H CH3 CH3 I I 110 H -(CH2)g- Cl Cl 58-66 H CH3 CgH5 Cl Cl olie CH3 CH3 CH3 Cl Cl 150-120 10 C2H5 CH3 CH3 Cl Cl 68-70 C2H5 -(CHgJg- Cl Cl 82-85 n-C3H7 CH3 CH3 Cl Cl 82-84 n-C3H? C2H5 C£H5 Cl Cl ' 20 i-C3H7 C2H5 C2H5 Cl Cl ' 20 15 n-C4Hg CH3 CH3 Cl Cl 50-55 -(CH2)3- CH3 Cl Cl 75-79

CgHg CH3 H Cl Cl 93-95

CgHg CH3 H Cl Br 115-117

CgHg CH3 D Cl Br 115-118 20 CgHg CH3 CH3 Cl Cl 95-96

CgHg -(ch2)5- C1 C1 136-140

CgHg -(CH2)4- Br Br3 64

CgH5 -(CH2)g- Br Br3 97

CgHg -CH-(CH2)4-CH- Br Br3 125

25 I I

-ch3 ch3

CgHg -CH-(CH2)3-CH- Br Br3 124 -ch3 ch3 30 CgHg CH3 CH3 Br Br 120 (dekomp.)

CgHg -(CH2)4- Br Br 178 (dekomp.)

CgHg -(CH2)g- Br Br 195 (dekomP·)

CgHg -CH-(CH2)4- Br Br 160 35 CH3

CgHg -CH-(CH2)3-CH- Br Br ch3 ch3 12

DK 162167 B

CgHg -CH-(CH2)4- Br Br 85-95 n_C3H7 p-0CH3C6H4 -(CH2V C1 C1 85 5 p-N02-C6H4 CH3 CH3 Cl Cl 90 (dekomp.) p-N02-C6H4- -(CH2)g- Cl Cl 117-119 ΙΓ\ CH3 H C1 C1 103-104 (dekomp.) (i \ CH3 H Cl Br 132-134 ° CH3 D Cl Cl- 103-105 10 CH3 D Cl Br 133-134 (dekomp.) C2H5 H Cl Cl 93-94 C2H5 H Cl Br 151-152 CH3 CH3 Cl Cl 181-182 C2H5 C2H5 Cl Cl 99-103 15 _ Når der anvendes et halogenmethyleniminiumsalt som reaktant, som illustreret i tabel II, er det undertiden hensigtsmæssigt at anvende det tilsvarende amid som opløsningsmiddel, dvs. amidet, hvorfra iminiumsal-20 tet blev fremstillet. I tilfælde, hvor de tilsvarende amider er faste, kan anvendes hexamethylphosphoramid eller pyridin. Dette er belyst i eksempel 17 og 18 nedenfor.

De af N-substituerede formamider afledte imidoylchlorider er også hensigtsmæssige reaktanter til dette formål. Deres fremstilling er vel-25 kendt for fagmanden, som belyst i tabel III, der er taget fra H. Ulrich i "The Chemistry of Imidoyl Halides", Plenum Press, New York, 1968, pp.

74-76. Deres omsætning med aminer til dannelse af amidiner er også velkendt, som belyst af S.R. Sandler og W. Karo i "Organic Chemistry", vol.

12-III, A.T. Blomquist og H. Wasserman, udgivere, Academic Press, New 30 York, 1972, p. 227.

Tabel III Imidoylchlorider 35 R2-C=NR3

Cl 13

DK 162167 B

R2 R3 Kogepunkt, °C/mm (Snip., °C) 5 CH3 C6Hu 45-56/0,04 C6H5 (118-120) 2-CH3C6H4 60/0,1 2-FC6H4 70/0,25 2-ClC6H4 111-114/14 10 2-BrCgH4 142-143/12 C2H5 C6Hu 43-44/0,02 CH3CH2CC12 C2H5 72-75/14 (CH3)2CH C6Hn 40-41/0,001 2-CH3CgH4 67/0,3 15 4'CH3C6H4 80-85/0,8 4-CH30C6H4 93-94/0,25 n-C4H9(C2H5)CH n-C4Hg 72-76/0,7 (CH3)3C CgHn 104-106/20 C6H10C1 C2H5 102/3 20 CgH5 CH3 46-47/2 90-92/13 C2H5 47-48/1 1- C3H7 52-54/1 n-C4Hg 85-86/1 25 C6Hn 110-112/1 (66-67) CH2C6H5 128-130/1 C6H5 175-176/12 (40-41) 30 2,6-(CH3)2C6H3 153-156/1 2- CH30CgH4 188-190/6 4-CH30CgH4 198-200/20 (61-63) 2,4-(02N)2CgH3 (122-124) 35 2-CH3CgH4 CgHg 174-177/10 4-CH3CgH4 CgHg 141-144/1 (40-41) 4-ClCgH4 CgHg (66-67) 14

DK 162167 B

4-BrCgH4 4-BrCgH4 (93-94) 4-CH30CgH4 CgHg 183-185/3 (73-76) 4-02NCgH4 CgHn (40-42) 5 CgHg (137-138) 4-02NCgH4 (132-134) 3,5-(02N)2CgH3 CgHjj (86-87) 2,4,6-(CH3)3CgH2 CgHg 164-165/1 (60-62) 10 _

Forbindelserne med formel (I), hvori A er den nitrogen-usub- R2 R2 R5

I I

15 stituerede amidinogruppe, H9N-C=N- eller HN=C-N-, fremstilles ved omsæt- ^ 7 ning af en aminobeskyttet iminoether med mitomycin C, et N -substitueret la derivat deraf eller et N -lavere al kyl-derivat af én af disse på den anioniske form, som beskrevet ovenfor. Den beskyttende gruppe fjernes dernæst på konventionel måde. Isopropyl formimidat, hvori aminogruppen er 20 beskyttet af β-trimethyl silylethoxycarbonylgruppen, er en egnet reaktant (eksempel 13).

ClC02CH2CH2Si(CH3)3 (CH3)2CH0CH=NH.HC1 ---------------------------------> 25 (CH3)2CH0CH=NC02CH2CH2Si(CH3)3 Når A er (1-lavere alkyl-2(lH)-pyridinyliden)amino eller gruppen med formlen 3° (oyn \ _9

—YA eller I NrR

k?7^v ‘ \νΛ R7 17

R

involverer fremstillingerne omsætning af den anioniske form af mitomycin C med cykliske halogenmethyleniminiumsalte eller imidoylhalogenider, 35 15

DK 162167 B

R7R2

2 3 3 M

hvori R og R med formlen R -N-C=N- er forbundne til dannelse af en ring. Egnede reagenser til omsætning med mitomycin C anionen er 2-chlor- 5 1-methylpyridiniumiodid (eksempel 16), 2-ch1or-4,5-dihydro-l-methyl- 1(3H)-pyrrolidiniumchlorid (tabel II), N,N'-dimethyl-N,N'-trimethylen- chlorformamidimiumchlorid (eksempel 28) og andre cykliske imidoylhaloge- nider, som afledes af 2-azetidinoner, 2-pyrrolidinoner, 2-piperidinoner 7 9 og 2-azepinoner. Igen anvendes, når R eller R i slutproduktet er hy-10 drogen, en beskyttende gruppe, såsom ovenfor, i det cykliske halogenme-thylen i mi n iumsaltmel 1 emprodukt.

Forbindelserne med formel (I), hvori A eller både A og B er en R2 3 4 ^ 15 amidinogruppe med formlen R R N-C=N-, reagerer med primære aminer med 5 5 formlen R NH, hvori R er udvalgt blandt Cj ^alkyl, bortset fra tert-alkyl, C118alkenyl, C118alkynyl, C118halogenalkyl, Cj_18hydroxyalkyl, C4-8cykl°alkyl eller aryl eller lavere aralkyl med hver indtil 12 car-bonatomer eller en heteroalicyklisk eller heteroaromatisk gruppe med fra 20 3 til 8 ringatomer, hvoraf mindst to er carbonatomer. Den eneste begrænsning på valget af primær amin, bortset fra fraværet af funktionelle grupper, som er uforenelige med reaktionsbetingelserne, er, at aminoni-trogenatomet er bundet til et carbonatom, som bærer mindst ét hydrogenatom og mindre end to arylgrupper. En vandfri, flydende organisk for-25 bi ndel se anvendes som reaktionsmedium, og ethvert sådant stof kan anvendes, så længe det ar foreneligt med reaktionsbetingelserne og ikke deltager i reaktionen på skadelig måde. Et overskud af den primære amin-reaktant, på molbasis, anvendes i almindelighed. En reaktionstemperatur i intervallet fra cirka -15°C til +15°C foretrækkes. Det resulterende 30 produkt fra denne omsætning er en 7-substitueret amino-9ft-methoxymitosan, nemlig et mitomycin C derivat med en substituent som defineret for R^ på 7-aminogruppen. Sådanne forbindelser vides fra den kendte teknik at besidde en væsentlig grad af antitumoraktivitet i forsøgsdyr.

Nogle primære aminer, betegnet ved formlen R^NHg, har vist sig at 35 være ude af stand til at fjerne 7-amidinogruppen ved den i foregående g afsnit beskrevne fremgangsmåde. R er alkyl, cykloalkyl, cykl oal kyl al-kyl, aralkyl eller heteroalicyklisk med fra 4 til 18 carbonatomer, hvori carbonatomet, som bærer aminogruppen, er et tertiært carbonatom eller et 16

DK 162167 B

sekundært carbonatom, som bærer 2 arylgrupper. Visse andre svagt basiske alifatiske aminer, såsom trifluorethylamin, kan heller ikke fjerne 7-amidinogruppen. Disse aminer er nyttige til omdannelse af en forbindelse med formel (I), hvori både A og B er den nævnte amidinogruppe med form-5 R2 34 ' len R R N-C=N-, til en forbindelse med formel (I), hvori kun A er amidi-nogruppen. Selv om disse aminer mangler evnen til at fjerne 7-amidino-gruppen, er de alligevel i stand til at spalte den med B betegnede ami-10 dinogruppe til NHg til dannelse af den carbamidofunktion, som er karakteristisk for de usubstituerede mitosaner. Selve aminen kan tjene som reaktionsmedium, eller et opløsningsmiddel system som defineret i foregående afsnit kan anvendes. Denne fremgangsmåde udføres fortrinsvis i området fra 20°C til 60°C.

15 Opfindelsen beskrives nærmere i de følgende eksempler. Smeltepunkter blev bestemt på et Thomas-Hoover kapi11ærsmeltepunktsapparat og er ukorrigerede. Temperaturerne er udtrykt i °C. De kernemagnetiske resonansspektre (NMR) blev registreret på et Varian XL100 spektrometer i pyri din-dg, med mindre andet er anført. De infrarøde spektre (IR) blev op-20 nået med et Beckman 4240 spektrofotometer, og prøven blev presset til en pille med kaliumbromid. IR-tallene er i/ v i cm"1. De synlige UV-spektre blev registreret på et Varian-Cary 219 spektrofotometer.

Tyndtlagskromatografi (tic) blev udført på 0,25 mm præ-coatede sili kagel pi ader under anvendelse af UV-lys som visualiserende middel.

25 Flash-kromatografi blev udført under anvendelse af Silica Woelm (32-63 fim). Opløsningsmidler inddampedes under reduceret tryk og under 50°C.

Eksempel 1 30 Forbindelse (V) 7-Γ (dimethyl amino)meth.y1 enlamino-N—-(dimethyl amino)methyl en-9a-methoxy-mitosan

Forbindelse (VI) 35 7- Γ (dimethyl amino) methyl en 1 ami no -N—- (d i methyl ami no) methyl en - N—- formyl -9a-methox.ymitosan 17

DK 162167 B

o HH-, X oym, I Η Ρ°™3 ffl.'jf' V '

3 11 [ _NH

5 ø w 1 -—*- (CH302)CHN(CH3)2

Mitomycin C v^/ 10 o o

O " . o II

lCH3)?NCH=Nv^J^ Qi2OQJ=CHN (CH3) 2 (CH^Na^N il ^004=0^(0^) -PWc· · ^Wv· 15 o j_o i_UNCH0 V vi

Til en suspension af 500 mg (1,50 mM) mitomycin C i 25 ml chloroform sattes i alt 9,6 ml (2,4 ml portioner efter 0, 18, 21 og 23 timer) Ν,Ν-dimethylformamid-dimethylacetal, og suspensionen omrørtes ved ca.

20 50° i 41 timer. Ved inddampning af opløsningsmidlet og overskydende reagens under reduceret tryk opnåedes en mørkegrøn remanens; tic (methylen-chlorid/methanol 20:1) viste fraværet af mitomycin C og tilstedeværelsen af to nye grønne komponenter (Rf = 0,16 og 0,22). Hovedkomponenten (Rf = 0,16) isoleredes ved flash-kromatografi under anvendelse af methylen-25 chlorid/methanol 20:1 som elueringsmiddel, som et grønt, fast stof (340 mg 51,5%), der ved opløsning i diethylether efterfulgt af tilsætning af hexan gav forbindelse (V) som et mørkegrønt, amorft pulver.

NMR (pyridin dg, S): 2,18 (s, 3H), 2,70 (bs, IH), 2,76 (s, 3H), 30 2,82 (s, 3H), 2,86 (s, 6H), 3,22 (s, 3H), 3,30 (bs, IH), 3,60 (d, J=12 Hz), 4,12 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 4,43 (d, IH, J=12 Hz), 4,90 (bs, IH), 5,10 (t, IH, J=10 Hz), 5,52 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 7,85 (s, IH), 8,64 (s, IH).

IR (KBr) vmx, cm-1: 3300, 2930, 1675, 1620, 1545, 1230, 1060.

35 UV (H20) Amax, nm: 390 og 244.

Analyse beregnet for ^21^28^6°5: C, 56,71; H, 6,08; N, 18,90.

Fundet: C, 56,20; H, 6,28; N, 17,88.

18

DK 162167 B

Den mindre komponent (Rf = 0,22), der i soleredes (180 mg, 25,35%) som et amorft, fast stof ved fældning fra diethylether og hexan, identificeredes som forbindelse (VI).

5 NMR (pyridin dg, δ): 2,20 (s, 3H), 2,60-3,00 (3 singletter, 12H), 3,2 (s, 3H), 3,65 (m, 2H), 4,04 (d, IH, J=4 Hz), 4,16 (dd, IH, J=12, 4 Hz), 4,60 (d, IH, J=13 Hz), 4,86 (t, IH, J=12 Hz), 4,90 (s, IH), 5,48 (dd, IH, J=12, 4 Hz), 7,90 (s, IH), 8,64 (s, IH), 9,06 (s, IH).

IR (KBr) v. cm'1: 2490, 2860, 1698, 1630, 1600, 1540, 1250,

UiclX

10 1060.

UV {H20)’ W nm: 390 09 244 *

Analyse beregnet for ^^gNgOg: 55,89; H, 5,93; N, 17,78.

Fundet: C, 55,41; H, 5,96; N, 16,99.

15 Opløsninger af (V) og (VI) i enten ethylacetat eller Ν,Ν-dimethyl-formamid-dimethylacetal viste ved tic, ved henstand ved stuetemperatur i mere end 10 timer, at forbindelse (VI) (Rf = 0,22) omdannedes til forbindelse (V) (Rf = 0,16) til dannelse af en opløsning, som var stærkt beriget med sidstnævnte.

20 Eksempel 2-7 udførtes i henhold til fremgangsmåden i eksempel 1 med de nedenfor angivne modifikationer til dannelsen af forskellige yderligere forbindelser ifølge opfindelsen.

Eksempel 2 25

Forbindelse (VII) 7-Γ(di i sopropylami no)methylenlami no-N—- (di i sopropylami no)methy!en-9a-methoxymitosan

En suspension af mitomycin C (200 mg, 0,6 mM) i N,N-di isopropylfor- 30 mamid-diethyl acetal (3 ml) opvarmedes under omrøring ved 53°C i 15 timer. Reaktionsblandingen hældtes i 50 ml vand og ekstraheredes med ethylacetat (3 x 30 ml). Den kombinerede organiske ekstrakt tørredes (Na2S04) og inddampedes til dannelse af en mørkegrøn sirup, tic (methy-lenchlorid/methanol 10:1) viste en grøn hovedkomponent ved Rf = 0,43 med 35 hurtigere bevægende (Rf = 0,45-0,50) urenheder. Hovedkomponenten (VII) i soleredes som et mørkegrønt, fast stof (156 mg, 46,8%) ved to flashkromatografi procedurer under anvendelse af methylenchlorid/methanol 20:1 som eluerende opløsningsmiddel.

19

DK 162167 B

NMR (CDC13, δ): 1,10-1,50 (5 singletter, 24H), 1,94 (s, 3H), 2,78 (dd, IH, J=4, 2 Hz), 3,05 (d, IH, J=4 Hz), 3,22 (s, 3H), 3,60 (m, 5H), 3,75 (dd, IH, J«10, 4 Hz), 4,24 (d, IH, J=12 Hz), 4,56 (t, IH), J=10 5 Hz), 4,88 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 7,83 (s, IH), 8,67 (s, IH).

IR (KBr), v. cm'1: 3320, 2990, 2940, 1680, 1630, 1600, 1500, 1235, 1060.

UV (MeOH) λ_,ν, nm: 246 og 393.

ιϊΙαΛ

Analyse beregnet for C29^44*W C’ 62,55; 7>91’> N, 15,10.

10 Fundet: C, 62,03; H, 7,80; N, 14,60.

Eksempel 3

Forbindelse (XIV) 15 7-f(dimethylamino)methylenlamino-N^-(dimethylamino)methylen-9a-methoxy-N—-methyl mi tosan la I dette eksempel anvendtes i stedet porfiromycin (N -methyl mitomycin C), 130 mg (0,37 mM) som udgangsmateriale til omsætning med 0,8 ml (1,5 mM) Ν,Ν-dimethylformamid-dimethylacetal under anvendelse af 10 ml 20 chloroform og 2 ml methanol som reaktionsopløsningsmiddel og en reaktionstid på 50 minutter ved 50°C. Forbindelse (XIV) opnåedes som en sirup efter inddampning af reaktionsopløsningsmidlet, og rensedes ved flash-kromatografi under anvendelse af 20 g silikagel og methylenchlo-rid/methanol (20:1) som eluerende opløsningsmiddel.

25 NMR (pyridin dg, δ): 2,22 (bs, 4H), 2,28 (s, 3H), 2,70 (d, IH, J=4 Hz), 2,80 (s, 3H), 2,84 (s, 3H), 2,90 (s, 6H), 3,20 (s, 3H), 3,52 (dd, IH, J=2, 12 Hz), 4,10 (dd, IH, J=4, 11 Hz), 4,38 (d, IH, J=12 Hz), 4,92 (t, IH, J-ll Hz), 4,96 (bs, IH), 5,46 (dd, IH, J-4, 11 Hz), 7,86 (s, 30 IH), 8,70 (s, IH).

Rf - 0,53, tyndt!agskromatografi med 9:1 methylenchlorid/methanol.

IR (KBr) vmax, cm'1: 2930, 1680, 1620, 1545, 1230, 1115.

UV (MeOH) Amax, nm: 386 og 243.

Analyse beregnet for C22H3oN605: c> 57»605 H, 6>55* 18,33.

35 Fundet: C, 57,11; H, 6,11; N, 17,99.

Denne fremgangsmåde dannede forbindelse (XV), 7-amino-N1®dimethyl- 1 a aminomethylen-9a-methoxy-N -methylmi tosan, som et biprodukt i 30% ud 20

DK 162167 B

bytte, tic Rf.= 0,4Q (methylenchlorid/methanol 9:1). * NMR (pyridin d&, 8): 2,02 (s, 3H), 2,16 (dd, IH, J=2, 5 Hz), 2,25 (s, 3H), 2,66 (d, IH, J=5 Hz), 2,76 (s, 3H), 2,86 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 5 3,51 (dd, IH, J=2, 12 Hz), 4,08 (dd, IH, 0=4, 10 Hz), 4\5ff (<f, IH, J=10

Hz), 4,90 (t, IH, J=10 Hz), 5,05 (bs), 5,43 (dd, IH, J=4, 10 Hz), 8,70 (s, IH).

IR (KBr) μ , cm"1: 3430, 3330, 3270, 2940, 2960, 1690, 1625, 1553, 1230, 1125.

10 UV (MeOH) λ^, nm: 358, 244 og 216.

Analyse beregnet for cigH25N5°5: 56>53’ Η, 6,20; N, 17,38.

Fundet: C, 54,68; H, 6,13; N, 16,59.

Eksempel 4 15

Forbindelse (IX) 9a-methox.y-7-ri-piperidiny1methylenlamino-N—-(l-piperidinylmethylen)mi-tosan N-(diethoxymethyl)piperidin, 3 ml, og mitomycin C, 200 mg, fik lov 20 at reagere ved 60°C i 2,5 time i chloroform opløsning (3 ml). Produktet opnåedes i et udbytte på 27,6%, tif Rf = 0,20 (methylenchlorid/methanol 20:1).

NMR (pyridin d5, 8): 1,38 (bs, 12H), 2,20 (s, 3H), 2,80 "(bs, IH), 25 3,24 (s, 3H), 3,00-3,40 (m, 5H), 3,40-3,80 (m, 5H), 4,13 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 4,45 (d, IH, J=12 Hz), 4,90 (bs, 2H), 5,12 (t, IH, J=10 Hz), 5,56 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 7,87 (s, IH), 8,70 (s, IH).

IR (KBr) v. cm-1: 3300, 2950, 2870, 1680, 1630, 1610, 1550, 1200, 1070.

30 UV (H20) Amax, nm: 394 og 246.

Analyse beregnet for C27H36N6°5: c> 61,79; H, 6,87; N, 16,02.

Fundet: C, 61,01; H, 6,85; N, 15,34.

la N -formylderivatet af den foregående forbindelse, forbindelse 35 (VIII), Nla-formyl-9a-methoxy-7-[l-piperidinylmethylen]amino-N10-(l-pi -peridinylmethylen)mitosan opnåedes som en hovedkomponent, 43% udbytte, tlf Rf = 0,25 (methylenchlorid/methanol 20:1).

21

DK 162167 B

NMR (pyridin dg, 5): 1,38 (bs, 12H), 2,23 (s, 3H), 3,00-3,40 (m, 4H), 3,23 (s, 3H), 3,40-3,90 (m, 6H), 4,07 (d, IH, J=4 Hz), 4,18 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 4,63 (d, IH), 4,90 (t, IH, J-ll Hz), 4,94 (bs, IH), 5,54 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 7,94 (s, IH), 8,71 (s, IH), 9,08 (s, IH).

5 IR (KBr) v. cm'1: 2490, 2860, 1698, 1630, 1600, 1540, 1250, (ΠαΧ 1060.

UV (H2°) Amax' nm: 394 09 247 ·

Analyse beregnet for CggHggNgOg: C, 60,08; H, 6,52; N, 15,21.

Fundet: C, 59,99; H, 6,17, N, 15,07.

10

Eksempel 5 Forbindelse (X) 9a-methoxy-7-Γ(1-morpholi no)methylen1ami no-N—-(1-morpholi no-methylen)-15 mitosan

En omrørt suspension af mitomycin C (220 mg, 0,6 mM) i chloroform (10 ml) og N-diethoxymethylmorpholin (4 ml) opvarmedes ved ca. 53°C i 42 timer. Reaktionsblandingen koncentreredes til en sirup under højt vakuum. En rå adskillelse ved flash-kromatografi (methylenchlorid/methanol 20 25:1) foretoges til isolering af de grønfarvede komponenter fra overskuddet af reagenser. De forenede grønne komponenter opløstes i 20 ml ethyl acetat og vaskedes med vand (3 x 20 ml). De kombinerede vaskevæsker gen-ekstraheredes med ethylacetat (3 x 15 ml). Alle ethyl acetatfraktioner forenedes, tørredes (^SO^) og inddampedes til en mørkegrøn sirup, 25 tic (methylenchlorid/methanol 10:1) deraf viste en særskilt grøn komponent ved Rf - 0,33 med adskillige grønne urenheder (Rf 0,35-0,40). Ved flash-kromatografi i soleredes komponenten ved Rf 0,33 (130 mg, 56,8%) som et mørkegrønt, amorft, fast stof, der karakteriseredes som forbindelse (X).

30 NMR (CDCL3, 6): 1,91 (s, 3H), 2,80 (bs, IH), 3,13 (d, IH, J=2 Hz), 3,22 (s, 3H), 3,30-3,94 (m, 18H), 4,20 (d, IH, J=12 Hz), 4,40 (bs, IH), 4,54 (t, IH, J-10 Hz), 4,88 (dd, IH, J=10 Hz, 4 Hz), 7,74 (s, IH), 8,51 (s, IH).

35 IR (KBr) , cm'1: 3300, 2970, 2920, 1680, 1625, 1550, 1235, ίΠαΧ UV (MeOH) λ , nm: 386 og 244.

iliaX

1070.

22

DK 162167 B

Analyse beregnet for ^25^32^71 C, 56,78; H, 6,06; N, 15,90.

Fundet: C, 53,07; H, 6,03, N, 15,37.

Eksempel 6 5

Forbindelse (XVI) 7-amino-N—-dimethyl aminomethylen-9a-methox.ymitosan

Mitomycin C (200 mg, 0,6 mM) opløstes i 10 ml chloroform og 2 ml methanol, Ν,Ν-dimethylformamid-dimethylacetal (0,64 ml, 4,8 mM) tilsat-10 tes, og opløsningen omrørtes ved ca. 50°C i 50 minutter. Tyndt!agskromatografi (methylenchlorid/methanol 90:10) viste spor af uomsat mitomycin C (Rf = 0,22) og to nye komponenter (Rf = 0,42 og 0,33, respektivt). Opløsningen koncentreredes under reduceret tryk til en sirup, der flash-kromatograferedes (25 g si li kagel) under anvendelse af methylenchlorid/-15 methanol (20:1) som eluerende opløsningsmiddel.

Den hurtigste komponent (Rf = 0,42) isoleredes som et grønt, amorft, fast stof (60 mg, 22,5%) og identificeredes som forbindelse (V) ved dens NMR-spektrum (pyridin dg).

Den blå hovedkomponent (Rf = 0,33) isoleredes som et amorft, fast 20 stof (148 mg, 63,3%) og karakteriseredes som forbindelse (XVI). En analytisk prøve opnåedes ved fældning fra methylenchlorid og n-pentan.

NMR (pyridin dg, 5), 2,02 (s, 3H), 2,76 (bs, 4H), 2,86 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 3,28 (d, IH, J-4 Hz), 3,62 (dd, IH, J=2, 13 Hz), 3-,94 25 (bs), 4,14 (dd, IH, J=4, 12 Hz), 4,56 (d, IH, J=13 Hz), 5,12 (t, IH, J=10 Hz), 5,52 (dd, IH, J=4, 10Hz).

IR (KBr) v. cm"1: 3430, 3320, 3280, 2930, 1675, 1615, 1650, ΠΙαΧ 1230, 1115.

UV (H20) Ama)(/ nm: 364, 244 og 219.

30 Analyse beregnet for C18N23Ng0g: C, 55,48; H, 5,91; N, 17,98.

Fundet: C, 54,70; H, 6,14; N, 17,95.

Eksempel 7 35 Forbindelse (XVII) 7,9a-dimethoxy-N—-dimethyl aminomethylenmitosan

Mitomycin A (170 mg) anvendtes i stedet for mitomycin C i eksempel 1 og fik lov at reagere med N,N-dimethylformamid-dimethylacetal (0,6 ml) 23

DK 162167 B

i chloroform/methanolopløsning (10:1) ved 50°C i 1 time. Det ønskede produkt opnåedes i 48% udbytte, tic Rf - 0,50 (methylenchlorid/methanol 9:1).

5 NMR (pyridin dg, δ): 1,83 (s, 3H), 2,76 (bs, 4H), 2,86 (s, 3H), 3,22 (s, 3H), 3,28 (d, IH), 3,56 (dd, IH, J-2, 13 Hz), 4,02 (s, 3H), 4,10 (dd, IH, J= 4, 10 Hz), 4,24 (d, J-13 Hz), 5,10 (t, IH, J-10 Hz), 5,50 (dd, IH, J-4, 10 Hz), 8,67 (s, IH).

IR (KBr) i/ , cm-1: 3300, 2930, 1675, 1655, 1625, 1500, 1235,

nlclX

10 1120.

UV (H20) Amax, nm: 530, 316 og 244.

Analyse beregnet for cigH24N4°6: C’ 5,94; N, 13,85.

Fundet: C, 56,51; H, 5,92; N, 13,71.

la 15 N -formyl derivatet af forbindelse (XVII) opnåedes som forbindelse (XVIII), 7,9a-dimethoxy-N10-dimethylaminomethylen-Nla-formylmitosan i 16,5% udbytte, tic Rf - 0,61 (methylenchlorid/methanol 9:1).

NMR (pyridin dg, 5): 1,88 (s, 3H), 2,76 (s, 3H), 2,85 (s, 3H), 3,54 20 (d, IH), 3,62 (bs, IH), 4,05 (s, 3H), 4,05 (s, 3H), 4,05 (bs, IH), 4,14 (dd, IH, J-4, 12 Hz), 4,40 (d, IH, J-13 Hz), 4,86 (t, IH, J-12 Hz), 5,42 (dd, IH, J-4, 12 Hz), 8,66 (s, IH), 9,08 (s, IH).

Eksempel 8 25

Forbindelse (XIX) 7-(dimethyl ami nomethyl en) ami no-9a-methoxymi tosan

Til forbindelse (V) (600 mg, 1,35 mM) opløst i methanol (10 ml) sattes aminodiphenylmethan (2,2 ml, 10,8 mM), og den resulterende opløs-30 ning omrørtes ved 54°C i 4 timer. Reaktionsforløbet måltes ved tic (methyl enchl ori d/methanol 90:10). Ved slutningen af de 4 timer var udgangsmaterialet (Rf - 0,35) forsvundet, og en ny grøn hovedzone (Rf = 0,29) forekom i stedet. Opløsningen koncentreredes ved reduceret tryk, og den resulterende sirup flash-kromatograferedes (25 g sil i kagel) under an-35 vendelse af methylenchlorid/ethanol 20:2 som elueringsmiddel. Fraktioner indeholdende den grønne komponent (Rf = 0,29) samledes, tørredes (Na2S04) og koncentreredes. Forbindelse (XIX) opnåedes som et amorft, fast stof (215 mg, 41%).

24

DK 162167 B

NMR (pyridin dg, 5): 2,18 (s, 3H), 2,70 (bs, IH), 2,80 (s, 3H), 2,88 (s, 3H), 3,08 (bs, IH), 3,24 (s, 3H), 3,56 (bd, IH, J=12 Hz), 4„00 (dd, IH), 4,44 (d, IH, J=12 Hz), 5,06 (t, IH, J=10 Hz), 5,56 (dd, IH, 5 J=10, 4 Hz), 7,58 (bs, 2H), 7,88 (s, IH).

IR (KBr) i/ , cm"1: 3300-3450, 2960-2910, 1715, 1620, 1535, ΠιαΧ 1050.

UV (H20) Ama)(/ nm: 390 og 226.

Analyse beregnet for CjgHgjN^Og: C, 55,48; H, 5,91; N, 17,98.

10 Fundet: C, 54,83; H, 5,67; N, 16,90.

1 <1

Nar N -formylderivatet, forbindelse (VI), substitueredes som udgangsmateriale for forbindelse (V) i eksempel 8, men under anvendelse af stuetemperatur i 20 timer som reaktionsbetingelser, fremstilledes for-15 bi ndel se (XIX) i det væsentlige på samme måde og med samme udbytte.

Eksempel 9

Forbindelse (XX) 20 7-(dimethylaminomethylen)amino-9a-methoxy-N—-methylmitosan

Forbindelse (XIV), 1 g, (2,18 mM) opløstes i methanol (20 ml), ami-nodiphenylmethan (3,5 ml, 17,18 mM) tilsattes, og den resulterende opløsning omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer og ved 40°C i 5 timer. Tyndtlagskromatografi (CHgC^/MeOH 90:10) af reaktionsblandingen viste, 25 at næsten al udgangsmaterialet (Rf = 0,55) var blevet forbrugt, og at en ny grøn hovedzone (Rf = 0,48) var kommet frem. Oparbejdning på tilsvarende måde som i eksempel 8 gav forbindelse (XX) som et amorft, fast stof (350 mg). Yderligere rensning skete ved flash-kromatografi (7 g, silikagel) under anvendelse af CHgClg/MeOH (250 ml, 96/4 vol/vol) og 30 bundfældning af det resulterende faste stof (Rf = 0,48) fra methylen-chlorid (5 ml) og hexan (50 ml), hvilket gav analytisk ren (XX) (314 mg, 35,7%) som et fast stof.

NMR (CDC13, S): 1,93 (s, 3H), 2,26 (bs, IH), 2,26 (s, 3H), 3,06 (s, 35 3H), 3,08 (bs, IH), 3,10 (s, 3H), 3,20 (s, 3H), 3,46 (bd, IH, J=12, 1 Hz), 3,58 (dd, IH, J=4, 10 Hz), 4,17 (d, IH, J=12 Hz), 4,38 (t, IH, J=10 Hz), 4,68 (m, 2H), 4,76 (dd, IH, J=4, 10 Hz), 7,72 (s, IH).

25

DK 162167 B

IR (KBr) v , cm"1: 3440, 3350, 3190, 3020, 2940, 2910, 1725, 1630, 1550, 1055.

UV (MeOH) Amax, nm: 386 og 231.

Analyse beregnet for CjgH25Ng0g: C, 56,53; H, 6,20; N, 17,36.

5 Fundet: C, 53,90; H, 5,13; N, 15,81.

Eksempel 10 Forbindelse (XI) 10 7-(n-propyl)amino-9a-methoxymitosan

Forbindelse (V) (330 mg, 0,74 mM) opløstes i vandfri methanol (10 ml), og n-propylamin (1,0 ml) tilsattes. Reaktionsblandingen omrørtes i 6 timer ved stuetemperatur og i 16 timer ved 0°-4°. Opløsningsmidlet og overskydende reagens inddampedes under reduceret tryk, og remanensen 15 flash-kromatograferedes under anvendelse af si 1 i kagel som adsorbent. Den ved eluering med methylenchlorid/methanol 30:1 opnåede blå komponent (Rf = 0,40) gen-fældedes fra methylenchlorid med hexan til dannelse af forbindelse (XI) som et amorft, gråt pulver (125 mg, 44,5%).

20 NMR (pyridin dg, 8): 0,80 (t, 3H), 1,42 (m, 2H), 2,11 (s, 3H), 2,74 (bs, IH), 3,12 (bs, IH), 3,22 (s, 3H), 3,36 (q, 2H), 3,60 (d, IH, J=12

Hz), 3,96 (dd, IH, J=ll Hz, 4 Hz), 4,54 (d, IH, 0-12 Hz), 5,00 (m, 3H), 5,36 (dd, IH, J=ll, 4 Hz), 6,90 (t, IH).

IR (KBr) v , cm"1: 3440, 3300, 2960, 2940, 1715, 1630, 1600, 25 1550, 1510, 1220, 1060.

uv (H*0) λ , nm: 372 og 222.

Analyse beregnet for CjgH^N^Og: C, 57,40; H, 6,38; N, 14,88.

Fundet: C, 57,28; H, 6,41; N, 14,08.

30 Eksempel 11

Forbindelse (XII) 7-(2-hydroxyeth,yl )amino-9a-methoxymi tosan

Forbindelse (V) (330 mg, 0,74 mM) opløstes i vandfri methanol (5 35 ml), og ethanolamin (2 ml) tilsattes. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer og fortyndedes dernæst med vand (50 ml) og eks-traheredes med ethyl acetat (5 x 60 ml). De forenede ethyl acetatekstrakter tørredes (NagSO^) og koncentreredes til en blålig-purpurfarvet rema 26

DK 162167 B

nens, der ved søjlekromatografi under anvendelse af 10% methanol i methyl enchl orid og koncentrering af de samlede fraktioner indeholdende den blå forbindelse gav 105 mg (37%) af forbindelse (XII) som et amorft, fast stof.

5 NMR (pyridin.dg, δ): 2,14 (s, 3H), 2,81 (.bs, IH), 3,18 (d, IH, J=4 Hz), 3,24 (s, 3H), 3,65 (dd, IH, J=2, 12 Hz), 3,70-4,20 (m, 5H), 4,52 (D, IH, J=13 Hz), 4,96 (t, IH, J=12 Hz), 7,38 (t, IH), 7,58 (bs).

IR (KBr) vmx, cm"1: 3300-3500, 2930, 1710, 1630, 1600, 1540, 10 1510, 1200, 1055.

UV {H20) Amax' nm: 371 09 221 *

Analyse beregnet for CjyH^I^Og: C, 53,92; H, 5,82; N, 14,80.

Fundet: C, 51,30; H, 5,88; N, 14,80.

15 Eksempel 12

Forbindelse (XIII) 7-[2-benzylthi oethyl1ami no-9a-methoxymi tosan

Forbindelse (V) (200 mg, 0,45 mM) opløstes i methanol (2 ml), S-20 benzyl-2-aminoethanthiol (0,5 ml) tilsattes, og opløsningen omrørtes ved stuetemperatur i 16 timer. Den ved afdampning af opløsningsmidlet ved reduceret tryk opnåede remanens flash-kromatograferedes (40 g, sil i kagel) under anvendelse af 6% methanol/methylenchlorid (400 ml) som elue-ringsmiddel. Den blå komponent (Rf cirka 0,5 i 10% MeOH/CH2Cl2) isolere-25 des som et amorft, fast stof (65 mg, 29,8%). Dens spektraldata (NMR, IR, UV og massespek.) var i overensstemmelse med den tildelte struktur.

Analyse beregn, for C24H28N4°5S: C, 59,49; H, 5,82; N, 11,56.

Fundet: C, 59,72; H, 5,94; N, 11,08.

30

Eksempel 13 Fremstilling af

lt O OCONH

35 i, j 2 o I_[,'-ΝΗ 27

DK 162167 B

(A) Til en opløsning af isopropylformimidat-hydrochlorid (1 mmol) i dimethyl formamid (DMF), 2 ml, sættes langsomt di isopropyl ethylamin (2,1 mmol) ved 0°C under en nitrogenatmosfære. Til den resulterende opløsning sættes dråbevis Ø-trimethylsilylethylchlorformiat ved 5 0°C. Den resulterende klare opløsning kaldes opløsning A.

(B) En opløsning af mitomycin C (1 mmol) i 5 ml DMF sættes til en suspension af natriumhydrid (1,5 mmol) i 3 ml DMF. Opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 20 minutter og afkøles til -40° -50°C før tilsætning af opløsning A (ovenfor). Opløsningen holdes ved -40°C 1 10 time og henstår dernæst til opvarmning til stuetemperatur. Efter henstand ved stuetemperatur i cirka 6-18 timer fortyndes reaktionsblandingen med CHgClg og filtreres. Den efter inddampning af filtratet opnåede faste remanens kromatograferes på si 1 i kagel til isolering af den amidino-beskyttede titel forbi ndel se.

15 (C) Den amidino-beskyttende gruppe på det foregående mellemprodukt fjernes ved hjælp af den offentliggjorte procedure ifølge Carpino og Tsao (J. Chem. Soc. Chem. Comm. 358 (1978)) til dannelse af usubstitueret amidino-titel forbindelse.

20 Eksempel 14

Fremstilling af H o occnh2 E;^NTjrt^3 o i_L-'*31

(A) Til en opløsning af isopropylformimidat-hydrochlorid (1 mmol) i DMF

30 (2 ml) sættes langsomt di isopropyl ethylamin (21 mmol) ved 0°C under en nitrogenatmosfære. Til den resulterende opløsning sættes methyl-iodid ved 0°C. Den resulterende opløsning kaldes opløsning B.

(B) Den i eksempel 13(B) angivne procedure gentages under anvendelse af opløsning B i stedet for opløsning A til opnåelse af titelforbind- 35 elsen.

Eksempel 15 28

DK 162167 B

Ν(α,3,2 ^iVSO W SS ί a,Ι0>'

(2) Θ Θ 3 O

5 3 Q \^>‘‘ (CH3)2N=CHC1C1

Mitomycin C Forbindelse (XIX)

En 0,5 M opløsning af Ν,Ν-dimethylchlormethyleniminiumchlorid frem-10 stilledes ved dråbevis tilsætning af oxalylchlorid (1,57 g, 12,5 mmol) ved 0°C til en opløsning af DMF (915 mg, 12,5 mmol) i 25 ml CHC13 efterfulgt af omrøring ved stuetemperatur i 30 minutter. Separat sattes en opløsning af mitomycin C (334 mg, 1 mmol) i 5 ml DMF til en suspension af NaH (36 mg, 1,5 mmol) i 3 ml DMF. Opløsningen omrørtes ved stuetempe-15 ratur i 20 minutter og afkøledes til -40° -50°C, og den ovennævnte opløsning af N,N-dimethylchlormethyleniminiumchlorid (3 ml, 1,5 mmol) tilsattes dernæst. Yderligere NaH (18 mg, 0,75 mmol) tilsattes efter 10 minutters omrøring ved -40°C. Opløsningen holdtes ved -40°C i 1 time og fortyndedes dernæst med CHgCl2 og filtreredes. Den efter inddampning af 20 filtratet opnåede remanens kromatograferedes ved tyndtlagskromatografi (tic) på silikagel (10% CH^OH-CHgCl som elutant). Ekstraktion af det grønne hovedbånd gav 78 mg (43% baseret på den genvundne mitomycin C) af et amorft, fast stof, hvis NMR-spektrum og tic-opførsel var identiske med de for forbindelse (XIX) fremstillet i eksempel 8. Ekstraktion af 25 det purpurfarvede bånd gav 150 mg mitomycin C.

Eksempel 16 7(l-meth.yl-2-(H)-pyridinv1iden)amino-9a-methox,vmi tosan 30 .fl /-00°¾ H i! il (1) NaH ΥΥ\Λ 3PS. =gr, 'Vfo·* . + I Cl ^ i 29

DK 162167 B

Til en blanding af miomycin C (242 mg, 0,725 mmol) og og NaH (43,5 mg, 1,81 mmol) sattes 4 ml DMF. Efter omrøring i 15 minutter tilsattes 2-chlor-l-methylpyridiniumiodid (370 mg, 1,45 mmol) ved stuetemperatur.

5 Opløsningen omrørtes i 1,5 time og fortyndedes dernæst med ethyl acetat (EtOAc) og filtreredes. Den efter inddampning af filtratet opnåede remanens kromatograferedes (tic) på silikagel (5% CHjOH-CHgClg som elutant).

Det mindre produkt (12 mg) var forbindelse (XIX) (eksempel 8). Hovedproduktet (75 mg) rensedes yderligere ved hjælp af sil i kagel-tic (10% 10 CH30H-CH2C1^) til dannelse af 6 mg (2%) af titel forbindel sen.

NMR (pyridin dg, 5): 2,11 (s, 3H), 2,76 (bs, IH), 3,20 (m, IH),3,26 (s, 3H), 3,49 (s, 3H), 3,63 (dd, IH, J=13, 1 Hz), 4,01 (dd, IH, J=ll, 4 Hz), 4,51 (d, IH, J=13 Hz), 5,10 (t, IH, J=10 Hz), 5,43 (dd, IH, J=10, 4 15 Hz), 5,99 (dt, IH, J=9, 2 Hz), 6,09 (dd, IH, J= 9, 1 Hz), 6,95 (dd, IH, J=9, 7, 2 Hz), 7,32 (dd, IH, J=7, 1 Hz).

Eksempel 17 20 7-[(methylaminomethylen)aminol-9a-methoxymitosan

CH3NH

V« n y000®* vvVv-,1 iu“ . xxSc1

Natriumhydrid (12 mg, 0,5 mmol) sættes under en nitrogenatmosfære til en opløsning af mitomycin C (167 mg, 0,5 mmol) i 2 ml hexamethyl-30 phosphoramid. Til denne opløsning sættes N-methylformimidoylchlorid (19 mg, 0,25 mmol, N.H. Bosshard og H. Zollinger, Helv. Chim. Acta, 42, 1659 (1959)). Opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 10 minutter, og dernæst tilsættes NaH (6 mg, 0,25 mmol) og N-methylformimidoylchlorid (9,5 mg, 0,13 mmol). Efter omrøring 35 i 6-12 timer fortyndes opløsningen med ethylacetat og filtreres. Afdampning af opløsningsmidlet efterfulgt af kromatografisk rensning af remanensen giver titel forbi ndel sen.

30

DK 162167 B

Eksempel 18 Forbindelse (XXI) 9a-methoxy-7-(1-morphol1nomethylen)ami nomi tosan 5 \ O 90°¾ 10 0-7 3 o j_f.™ ;

Til mitomycin C (600 mg, 1,8 mM) suspenderet i chloroform (30 ml) sattes 4-diethoxymethylmorpholin (12,5 ml), og den resulterende suspension opvarmedes ved 58°C i 48 timer. Ved afslutningen af de 48 timer vi-15 ste tic (20% MeOH i CHgClg)» at reaktionen var ufuldstændig. Opløsningen koncentreredes under reduceret tryk, og til den resulterende sirup sattes vand (100 ml). Efter omrøring i 20 minutter ekstraheredes den mørkegrønne opløsning med methylenchlorid (5 x 50 ml), og den kombinerede ekstrakt tørredes og koncentreredes til en sirup. Til denne sirup, i 20 methanol (20 ml), sattes ami nodiphenylmethan (6,5 ml), og den resulterende opløsning omrørtes ved 30-35°C i 18 timer. Tyndtlagskromatografi (20% MeOH i CHgClg) viste én grøn hovedzone med en mindre, langsommere, purpurfarvet zone. Opløsningen koncentreredes under reduceret tryk, og den resulterende sirup rensedes ved hjælp af den sædvanlige flash-kroma-25 tografi teknik til opnåelse af titel forbindel sen som et mørkegrønt, amorft, fast stof (75 mg, 10%). En analytisk prøve opnåedes ved udfældning fra en methylenchloridopløsning med n-hexan.

NMR (pyridin d5, 8): 2,16 (s, 3H), 2,76 (dd, IH, J=5 og 1 Hz), 3,16 30 (d, IH, J=5 Hz), 3,24 (s, 3H), 3,28-3,80 (m, 10H), 4,02 (dd, IH, J=10 og 4 Hz), 4,40 (d, IH, J=12 Hz), 5,06 (t, IH, J=10 Hz), 5,46 (dd, IH, J=10 og 4 Hz), 7,90 (s, IH).

IR (KBr) i/, cm"1: 3360, 3280, 2960, 2920, 1720, 1600, 1520,

maX

1230, 1050.

35 UV (MeOH) λ^: 384 og 234.

Analyse beregnet for kjøHggNgOg: C, 55,64; H, 5,80; N, 16,23.

Fundet: C, 55,07; H, 5,55; N, 15,88.

31

DK 162167 B

Eksempel 19 Forbindelse (XXII) 7-(1-pyrrol i di nylmethyl en)ami no-9a-methoxymi tosan %· „V?

En 0,5 molær opløsning af pyrrolidinylchlormethyleniminiumchlorid 15 fremstilledes ved dråbevis tilsætning af oxalylchlorid (3,17 g, 25 mmol) ved 0°C til en opløsning af 1-formyl pyrrol i din (2,48 g, 25 mmol) i 50 ml CHC13, efterfulgt af omrøring ved stuetemperatur i 30 minutter. Natrium-hydrid (24 mg, 1 mmol) tilsattes separat under nitrogenatmosfære til en opløsning af mitomycin C (334 mg, 1 mmol) i 3 ml 1-formyl pyrrol idin. Ef-20 ter omrøring i 20 minutter ved stuetemperatur afkøledes opløsningen til -40° -50°C, og den ovenfor fremstillede iminiumsaltopløsning (1 ml, 0,5 mmol) tilsattes. Til denne blanding sattes skiftevis, med 10 minutters intervaller, 12 mg (0,5 mmol) NaH, 0,5 ml (0,25 mmol) af iminiumsaltop-løsningen, 6 mg (0,25 mmol) NaH, 0,25 ml (0,125 mmol) af iminiumsaltop-25 løsningen, og endelig 3 mg (0,125 mmol) NaH og 0,125 ml (0,063 mmol) af i mi niumsaltopløsningen. Efter omrøring i 30 minutter ved -30°C opvarmedes blandingen til stuetemperatur. Den fortyndedes med ethylacetat, og det uorganiske salt frafiltreredes. Den opnåede remanens kromatografere-des efter afdampning af opløsningsmidlet ved tyndtlagskromatografi på 30 silikagel (10% CHjOH-CHgClg). Ekstraktion af det grønne bånd gav 120 mg (15% udbytte) af titelforbindelsen.

NMR (pyridin dg, 6): 1,58 (m, 4H), 2,29 (s, 3H), 2,73 (m, IH), 3,06-3,50 (m, 8H), 3,59 (dd, IH, J-13, 1 Hz), 4,03 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 35 4,44 (d, IH, J-12 Hz), 5,05 (t, IH, J-10 Hz), 5,45 (dd, IH, J-10, 4 Hz), 8,04 (s, IH).

IR (KBr) i/ , cm'1: 3420, 3280, 2960-2870, 1715, 1625, 1560, 1300, 1055.

32

DK 162167 B

Eksempel 20 7-ΓΝ-methyl-N-(methylimino)methyllamino-9a-methoxymitosan 5 2 Π s--U'*® (2) CH3N=CHC1 qj 10 3 o

Fremgangsmåden ifølge eksempel 17 gentages med anvendelse af 9a-methoxy-7-(N-methylamino)mitosan (Matsui et al., The Journal of Antibiotics, XXI, 189-198 (1968)) i stedet for mitomycin C i lignende molær mængde.

15

Eksempel 21 Forbindelse (XXIII) 7-Γ1-(dimethylamino)ethy1idenlamino-N—-Γ1-(dimethyl amino)ethyl iden1-9a-20 methoxymitosan ff /CH3 CH An_/ 25 L°CH3 ΑΛ,Α CH37 T 1 > o I_l' 30 En suspension af 600 mg (1,79 mM) mitomycin C i 2 ml methanol fremstilledes og behandledes med 3 ml Ν,Ν-dimethylacetamiddimethylacetal. Suspensionen opvarmedes ved 75-80°C under omrøring i 2 timer. På dette trin viste tic (CHgClg/methanol 10:1), at næsten al mitomycin C var blevet konsumeret ved reaktionen. Produktet fremtrådte som en grøn zone.

35 Opløsningsmidlet og flygtige materialer fjernedes ved koncentrering af reaktionsblandingen til tørhed ved reduceret tryk, hvilket gav en sirup, der opløstes i methylenchlorid og fyldtes på en si likagel søjle (40 g sili kagel), og søjlen udvikledes med 1% methanol i methylenchlorid (200 33

DK 162167 B

ml), 2% methanol i methylenchlorid (200 ml) og 5% methanol i methylen-chlorid (400 ml). Fraktionerne indeholdende den grønne zone, repræsenterende produktet, forenedes og koncentreredes til et amorft, fast stof, der vejede 110 mg (13% udbytte). Dette materiale opløstes i 2 ml acetone 5 og bundfældedes fra opløsningen ved tilsætning af hexan. Produktet opsaml edes ved filtrering.

Analyse beregnet for C23^32*W C, 58,46; H, 6,83; N, 17,79.

Fundet: C, 58,89; H, 6,89; N, 17,64.

10 UV (MeOH) Amav, nm: 235, 364.

fllaX i IR (KBr) vmx, cm'1: 3440, 3295, 2925, 1770, 1660, 1620, 1580, 1550, 1300, 1055.

*H NMR-spektret i pyridin dg stemmer overens med strukturen af titel forbi ndel sen.

15

Eksempel 22 Forbindelse (XXIV) 7-[1-(dimethyl ami no)ethyl i denami nol-9a-methoxymi tosan 20 CH,

I 3 0 U

=N Jl ^CH OCNH-

(CHOX

T^ch3 · 25

ch3 7 ]T

o -lr'

En opløsning af 100 mg (0,21 mM) af forbindelse (XXIII) i 2 ml chloroform sattes til 2 ml aminodiphenylmethan, og opløsningen opvarme-30 des ved ca. 55-60°C i 24 timer. På dette trin forblev spormængder af forbindelse (XXIII) i reaktionsblandingen, men den koncentreredes ikke desto mindre, og remanensen kromatograferedes over neutralt aluminiumoxid under anvendelse af gradienteluering begyndende med methylenchlorid og sluttende med methanol/methylenchlorid 2,5:1. Den grønne hovedzone 35 isoleredes som et amorft, grønt, fast stof, vægt 25 mg (29,4% udbytte).

Dette materiale rensedes ved opløsning i acetone og tilsætning af hexan til acetoneopløsningen, indtil bundfældning forekom. Produktet opsamledes ved filtrering og tørredes.

34 DK 162167B

Analyse beregnet for ^gH-^NgOg: C, 56,58; Η, 6,20; Ν, 17,37.

Fundet: C, 55,71; Η, 6,34; Ν, 15,23.

UV (Μ) λ__ν, nm: 374, 230 (skulder).

5 IR (KBr) v , cm"1: 3420, 3350, 3280, 2920, 2710, 1610, 1540, 1300, 1050.

*H NMR-spektret i pyridin dg stemmer overens med strukturen. Eksempel 23 10

Forbindelse (XXV) 7- Γ (1 -methyl -2 -pyrrol i di nyl i den) ami nol -Ν—- Γ (1 -methyl -2-p.yrrol idinyli-den)ami nol-9a-methox.ymi tosan v JL , -ch2°™==0 CH3 >jOCH3 CH3

20 CH3/VXLJ'->H

2,2-dimethoxy-l-methylpyrrolidin (H. Eilingsfeld et al., Angew. Chem., 72, 836 (1960)), 1,5 g (10,3 mM) og 280 mg mitomycin C (0,34 mM) i 20 ml methanol opvarmedes ved 55° i fem timer. Reaktionsblandingen af-25 prøvedes ved tyndtlagskromatografi på en al uminiumoxidpiade under anvendelse af methylenchlorid/methanol 97:3 som opløsningsmiddel, tic viste en stor grøn plet, der repræsenterede produktet, og en lille blå plet, der repræsenterede mitomycin C udgangsmateriale. Opløsningsmidlet fjernedes ved destillation i vakuum ved 40°C, og remanensen opløstes i 30 methylenchlorid og fyldtes på en 4,5 cm søjle indeholdende 150 g aluminiumoxid. Eluering med 50 ml methylenchlorid efterfulgtes af 600 ml 1% methanol i methylenchlorid. Store urenheder fjernedes, men ingen rene fraktioner i soleredes. Det kombinerede elueringsmiddel koncentreredes ved destillation ved 20°C til en olieagtig remanens, der tilsyneladende 35 indeholdt noget 2,2-dimethoxy-l-methylpyrrolidin. Dette materiale kroma-tograferedes igen på en aluminiumoxidsøjle (25 g aluminiumoxid) under anvendelse af 200 ml methylenchlorid efterfulgt af 100 ml 1% methanol i methylenchlorid. Dette resulterede i fjernelse af 2,2-dimethoxy-l-me- 35

DK 162167 B

thyl pyrrol idinen og resulterede i et antal fraktioner indeholdende mindre urenheder og adskillige rene fraktioner, der var bekræftet af tic (én grøn plet), og som udgjorde det ønskede produkt, udbytte 53 mg.

5 Analyse beregnet for ^^ΝρΟ^.Ο,δδ HgO: C, 58,66; H, 6,64; N, 16,42.

Fundet: C, 58,63; H, 6,46; N, 16,50.

UV (MeOH) \mx, nm: 354, 239.

10 IR (KBr) 1/ , cm'1: 3300, 3220, 2940, 1660, 1620, 1550, 1290,

HtdA

1055.

*H NMR-spéktret i pyridin dg stemmer overens med strukturen af titel forbi ndel sen.

15 Eksempel 24 7-r(l-meth.yl-2-p.yrrolidinyliden)amino]-9a-methoxymitosan 20 .CH2OCHH2 CH3 ^OCH3 “i'VYy.» o -'' 25

En opløsning af 80 mg (0,16 mM) af forbindelse (XXV) og 0,48 ml n-butylamin i 15 ml chloroform opvarmedes under tilbagesvaling i 48 timer, tic (methanol/methylenchlorid, 2% på aluminiumoxid) udviste en stor, grøn plet og en lille, foranliggende blå plet samt en lille, efterfølg-30 ende rød plet, der alle svarede til udgangsmaterialet. Reaktionsopløsningen fyldtes på en søjle indeholdende 50 g aluminiumoxid, og elueredes med 200 ml 1% methanol i methylenchlorid efterfulgt af 400 ml 2% methanol i methylenchlorid. De fraktioner, som indeholdt en enkelt stor grøn komponent, som vist ved tic, kombineredes og koncentreredes til en rema-35 nens af det ønskede produkt, vægt 24 mg.

NMR (pyridin dg, S): 1,72 (q, 2H), 2,04 (s, 3H), 2,16 (q, 2H), 2,72 (bs, IH), 2,84 (s, 3H), 3,12 (m, 3H), 3,24 (s, 3H), 3,60 (dd, IH, J-14, 36

DK 162167 B

2 Hz), 4,00 (dd, IH, J-12, 6 Hz), 4,40 (d, IH, J-14 Hz), 5,04 (t, IH, J=14 Hz), 5,38 (dd, IH, J-12, 6 Hz), 7,48 (bs, 2H).

Eksempel 25 5

Forbindelse (XXVI) 7-[(methoxyainino)methylen1amino-9a-methoxymitosan

H

\ O OCONH-

10 _ /C==N\ JL J

ch3°nh/ v/x J 1 o _l·' 15

En opløsning af forbindelse (XIX), 660 mg (1,7 mM), i 10 ml methanol fremstilledes, og 170 mg (2,0 mM) methoxyamin-hydrochlorid sattes dertil. Opløsningen omrørtes ved 10°C i 3 timer og ved stuetemperatur i 2 timer, tic viste kun et spor af uomsat forbindelse (XIX). Et sort 20 bundfald, der var dannet under henstand, opsamledes og vaskedes med acetone, udbytte af ønsket produkt 380 mg (57%).

Analyse beregnet for Cj^jNgOg: C, 52,19; H, 5,40; N, 17,90.

Fundet: C, 51,64; H, 5,40; N, 17,83.

25 UV (MeOH) λ. nm: 376, 242.

fltaX *| IR (KBr) v. cm"A: 3440, 3250, 3140, 2920, 1730, 1645, 1615, ΠΙαΧ 1560, 1450, 1320, 1050.

*H NMR-spektret i pyridin d5 er i overensstemmelse med strukturen af enten titel forbindel sen eller dens tautomer ved C-7, dvs.

30 VH i /fy N * j CILjOir (

Eksempel 26 35

Forbindelse (XXVII) 7-Γ(benzyloxyami no)methylen]ami no-9a-methoxymitosan 37

DK 162167 B

H 0 OCCNH,

)-vl J

C.HcCH0ONH Vf Y-f 6 5 1 JDCHs 5 CH3 o -Ir'

En opløsning af forbindelse (XIX), 100 mg (0,26 mM) i 2 ml methanol indeholdende 0,5 ml triethylamin fremstilledes, og 400 mg (2,5 mM) 0-benzylhydroxylamin-hydrochlorid sattes dertil. Reaktionen tillodes at 10 fortsætte i 2,5 timer ved stuetemperatur, tic (C^Clg/methanol 10:1) viste en stor orangebrun zone før den grønne zone, idet den sidstnævnte svarede til forbindelse (XIX). Reaktionsblandingen koncentreredes til en remanens, der flash-kromatograferedes over silikagel (20 g) under anvendelse af CHgC^/methanol 20:1 som det eluerende opløsningsmiddel. Den 15 store brune zone, der udgjorde det ønskede produkt, opsamledes som et amorft, fast stof, der vejede 80 mg (65,6% udbytte).

Analyse beregnet for C23^25^5°6: C> 59’10’ 5,35; N, 14,97.

Fundet: C, 58,43; H, 5,48; N, 14,62.

20 UV (MeOH Amax, nm: 376, 245, 209.

IR (KBr) v , cm'1: 3460, 3300, 2945, 2920, 1745, 1720, 1570, 1275, 1220, 1060.

^ NMR-spektret i pyridin d5 er i overensstemmelse med strukturen af enten titel forbinde!sen eller dens tautomer ved C-7, dvs.

25

Η H C

c6h5ch2on

Uomsat udgangsmateriale, forbindelse (XIX), der vejede 10 mg, blev 30 genvundet.

Eksempel 27

Forbindelse (XXVIII) 35 7-(l,3-dimethyl-2-imidazolidinyliden)-amino-9a-methoxymitosan

DK 162167 B

fb 38 o f\=N 1 ^PH2°"NH2 L / \A\ a0CHt f 3 Η,,ΛΑ>"

Mitomycin C, 0,34 g (1 mmol) opløses i 5 ml l,3-dimethyl-2-imidazo-lidon, og 0,1 g natriumhydrid (50% i olie, 2,08 mmol) sættes dertil ved stuetemperatur. Blandingen holdes ved stuetemperatur i 20 minutter og afkøles dernæst i et is-salt bad (-15°C). Blandingen holdes i 10 minut-10 ter ved denne temperatur, og dernæst sættes 0,65 g (2 mmol) 2-chlor-l,3-dimethyl-4,5-dihydro-(3H)-imidazoliminiumchlorid dertil. Det holdes ved -15°C i 1 time og fortyndes dernæst med ethyl acetat og kromatograferes på en aluminiumoxidsøjle. Søjlen fortyndes med methylenchlorid, efterfulgt af methylenchlorid indeholdende 2% vol/vol methanol. En grøntfar-15 vet fraktion opnås, der består af det ønskede produkt, som yderligere renses ved kromatografi på aluminiumoxid under anvendelse af methylen-chlorid indeholdende 10% vol/vol methanol, udbytte 20 mg (5%).

Analyse beregn, for CgQHgøNgOg.1-1/4 HgO: C, 53,03; H, 6,34; 20 N, 18,55.

Fundet: C, 52,68; H, 6,21; N, 18,15.

NMR (pyridin-dg, 5): 2,32 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,59 (s, 3H), 2,74 (m, IH), 3,03-3,32 (m, 5H), 3,26 (s, 3H), 3,66 (bd, IH, J=12 Hz), 4,02 25 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 4,75 (d, IH, J=12 Hz), 5,09 (bt, IH, J=ll Hz), 5,44 (dd, IH, J=ll, 4 Hz).

IR (KBr): 3400, 3280, 2930, 1700, 1610, 1480, 1330, 1055 cm-1.

UV (MeOH, Amax): 600, 375, 252 (sh), 222 nm.

30 Eksempel 28

Forbindelse (XXIX) 7-r(l»3-dimethyltetrahydropyrimidinyliden)amino1-9a-methoxymitosan

CH3 O

35 I . g /Ni O ch ocnh I Av ch3 / ch3 y X/' 39

DK 162167 B

Natriumhydrid (50% oliedispersion, 200 mg, 4,2 mmol) sattes under nitrogen til en opløsning af mitomycin C (680 mg, 2 mmol) i 8 ml 1,3-di-methyl-3,4,5,6-tetrahydro(lH,3H)-2-pyrimidinon. Blandingen holdes i 20 5 minutter ved stuetemperatur og afkøles dernæst til 25°C. 2-chlor-1,3-di-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-pyrimidiniumchlorid, 0,73 g (4 mmol) sattes dertil, og blandingen holdes dernæst ved -25°C i 3 timer. Den fortyndes dernæst med ethyl acetat og 2 ml methanol. Blandingen fyldes uden yderligere behandling på en tør aluminiumoxid kromatografisk søjle og elue-10 res først med methylenchlorid og dernæst med 2% vol/vol methanol/methy-lenchlorid, hvilket giver det ønskede produkt, 0,35 g (39,5% udbytte), snip. 138- 140°C.

Analyse beregnet for ^i^NgOg.HgO: C, 54,65; H, 6,33; 15 N, 18,21.

Fundet: C, 54,78; H, 6,18; N, 18,21.

NMR (pyridin-d5, S); 1,80 (m, 2H), 2,42 (s, 3H), 2,52 (s, 3H), 2,64 (s, 3H), 2,76 (m, IH), 2,90-3,30 (m, 5H), 3,26 (s, 3H), 3,74 (d, IH, 20 J=12 Hz), 4,05 (dd, IH, J=ll, 4 Hz), 4,97 (d, IH, J=12 Hz), 5,09 (t, IH, 0=11 Hz), 5,41 (dd, IH, J=ll, 4 Hz).

IR (KBr): 3430, 3280, 2930, 1710, 1570, 1480, 1450, 1350, 1050 -1 cm .

UV (MeOH, Amax): 635, 377, 264 (sh), 223 nm.

25

Eksempel 29 Forbindelse (XXX) 7-(tetramethyldiami nomethylen)ami no-9a-methoxymi tosan 30

(CH-)_N O. /-OCONH

3 2 X II 2 X ——N XL v /— r'^V^\/0CH3 (CH_)-N /X.

Λ/Χ pm 35 CH3 g \/

Mitomycin C, 425 mg (1,42 mmol) blandes med en 50% dispersion i olie af natriumhydrid, 85,3 mg, og 4 ml dimethyl formamid sættes dertil.

40

DK 162167 B

Blandingen omrøres ved stuetemperatur under en atmosfære af argon i 10 minutter og afkøles dernæst til -35°C. Tetramethylchloroformamidimium-chlorid, 289 mg (2,13 mmol), tilsættes, og blandingen tillades at opvarme til 5°C gennem en periode på 2 timer. Knust tøris sættes dernæst til 5 blandingen for at afkøle reaktionen, og opløsningsmidlet fjernes ved destillation under reduceret tryk. Remanensen kromatograferes på en al umi-niumoxidsøjle (100 g) ved brug af 3% vol/vol methanol i methylenchlorid til eluering. Dette materiale renses yderligere ved aluminiumoxid-tlc (5% vol/vol methanol i methylenchlorid), hvilket giver to fraktioner på 10 17 mg og 76 mg. Den sidstnævnte krystalliseres fra acetone-ether til frembringelse af det ønskede produkt, smp. 193-195°C (12% udbytte).

Analyse beregnet for C, 55,54; H, 6,53; N, 19,43.

Fundet: C, 54,92; H, 6,53; N, 19,29.

NMR (pyridin-dg, S): 2,26 (s, 3H), 2,59 (s, 6H), 2,68 (s, 6H), 2,75 15 (m, IH), 3,15 (d, IH), J=4 Hz), 3,26 (s, 3H), 3,65 (d, IH, 0=12 Hz), 4,00 (dd, IH, J=ll, 5 Hz), 4,62 (d, IH, J=12 Hz), 5,04 (t, IH, J=ll Hz), 4,38 (dd, IH, J=ll, 5 Hz).

IR (KBr): 3430, 3280, 2920, 1710, 1610, 1495, 1335, 1055 cm'1.

UV (MeOH, Amax): 610, 380, 260, 220 nm.

20

Eksempel 30 Forbindelse (XXXI) 7-(1-pi peri di nylmethyl en)ami no-9a-methoxymi tosan

25 O

H O II

\ ° ?H OCNH

czztn. oN 2 <TA7 V|k\<0CH3 '—/ AL J-kj/ f - -,nh 30 3 7 8^ \/

En 0,5 M opløsning af piperidinylchlormethyleniminiumchlorid fremstilles ved dråbevis tilsætning af oxalylchlorid (380 mg, 3 mmol) til 6 ml chloroform indeholdende 0,34 g (3 mmol) 1-formylpiperidin. Natriumhy-35 drid (50% oliedispersion, 96 mg, 2 mmol) tilsættes separat under nitrogen til en opløsning af mitomycin C (334 mg, 1 mmol) i 3 ml 1-formylpiperidin. Efter omrøring i 15 minutter ved stuetemperatur afkøles opløsningen til -25°C, og den ovenfor fremstillede iminiumsaltopløsning (4 41

DK 162167 B

ml, 2 mmol) tilsættes. Reaktionsblandingen holdes ved -25°C i 1 time og afkøles ved tilsætning af tøris. Efter tilsætning af methanol (1 ml) absorberes produktblandingen på neutralt aluminiumoxid. Dette materiale placeres på en al uminiumoxidsøjle (30 g). Søjlen elueres først med me-5 thylenchlorid og dernæst med 3% vol/vol methanol i methylenchlorid, hvilket giver 360 mg (84%) af titelforbindel sen, smp. 68-70°C.

Analyse beregn, for CZjH25N50g.1-1/4 HgO: C, 55,80; H, 6,58; N, 15,49.

10 Fundet: C, 55,57; H, 6,21; N, 15,91.

NMR (pyridin-djj, S): 1,42 (bs, 6H), 2,19 (s, 3H), 2,72 (m, IH), 3,06-3,30 (m, 3H), 3,25 (s, 3H), 3,48-3,70 (m, 2H), 3,57 (d, IH, J=13 Hz), 4,01 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 4,43 (d, IH, J=13 Hz), 5,02 (bt, IH, 15 3=11 Hz), 5,55 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 7,86 (s, IH).

IR (KBr): 3440, 3350, 3300, 2935, 2835, 1710, 1615, 1520, 1445, 1305, 1250, 1200, 1055 cm-1.

UV (MeOH, Xm): 590, 389, 262 (sh), 234, 212 (sh) nm.

max 20 Eksempel 31 7-h.ydroxy-N—-dimethyl aminometh,ylen-9a-methox.ymitosan 0 ? O 0^N=c^nm

VwJ

U>CH3 ^Af|f> 30 0 -^

Til en opløsning af 7-hydroxy-9a-methoxymitosan (20 mg) i methylen-chlorid (3 ml) sættes dimethylformamid-dimethyl acetal (1 ml), og opløsningen omrøres ved ca. 65°C i 30 minutter. Reaktionens forløb følges ved tic (10:1 CHgClg/MeOH). Produktet udvindes ved at koncentrere blandingen 35 under reduceret tryk, og remanensen kromatograferes over si 1 i kagel, hvilket giver titel forbi ndel sen.

42

DK 162167 B

Aktivitet over for P-388 museleukæmi

Tabel IV indeholder resultaterne af laboratorieforsøg med CDF, mus af hunkøn implanteret intraperitonealt med en tumor-indpodning af 10 ascites-celler af P-388 museleukæmi og behandlet med forskellige doser 5 af enten en testforbindelse med formel (I) eller mytomycin C. Forbindelserne administreredes ved intraperitoneal injektion. Grupper af seks mus anvendtes for hvert dosisniveau, og de behandledes med en enkelt dosis af forbindelsen på dag ét alene. En gruppe på ti saltvandsbehandlede kontrolmus blev indbefattet i hver forsøgsserie. De med mitomycin C be-10 handlede grupper blev medtaget som en positiv kontrol. En 30 dages protokol anvendtes, idet den gennemsnitlige overlevelsestid i dage blev bestemt for hver gruppe af mus, og antallet af overlevende ved slutningen af 30 dages perioden blev noteret. Musene blev vejet før behandling og igen på dag seks. Vægtforandringen blev taget som et mål for lægemiddel-15 toxicitet. Mus, der hver vejede 20 gram, blev anvendt, og et tab i vægt på indtil 2 gram blev ikke betragtet som for stort. Resultaterne blev bestemt med hensyn til % T/C, der er forholdet mellem den gennemsnitlige overlevelsestid for den behandlede gruppe og den gennemsnitlige overlevelsestid for den med saltvand behandlede kontrolgruppe gange 100. De 20 med saltvand behandlede kontroldyr døde sædvanligvis inden for ni dage.

Den "maksimale effekt" i den efterfølgende tabel er udtrykt som % T/C, og dosen, som giver denne virkning, er anført. Værdierne i parentes er de værdier, som blev opnået med mitomycin C som positiv kontrol i det samme forsøg. Et mål for den relative aktivitet af de omhandlede for-25 bindeiser i forhold til mitomycin C kan derfor skønnes. En minimal effekt med hensyn til % T/C blev betragtet at være 125. Den minimale effektive dosis, som er angivet i den efterfølgende tabel, er den dosis, der giver en % T/C på cirka 125. De to værdier, som i hvert tilfælde er angivet i "gennemsnitlig vægtforandring"-kolonnen, er henholdsvis den 30 gennemsnitlige vægtforandring pr. mus ved den maksimale effektive dosis og ved den minimale effektive dosis.

35 43

DK 162167 B

Tabel IV

Inhibering af P-388 rouseleukæmi

Minimal Gennemsnitlig 5 Forbindelse Maksimal virkning effektiv vægtforan- (eksempel nr.) % T/C dosis^ dosis dring* V (1) 311 (244) 6,4 (3,2) <0,2 -1,9, -0,2 183 (272) 6,4 (3,2) 0,1 -1,0, +0,3 10 VI (1) 233 (244) 6,4 (3,2) <0,2 -0,1, +0,1 VII (2) 141 (224) 25,6 (3,2) 0,8 -1,2, +0,2 IX (4) 165 (224) 12,8 (3,2) 0,2 -0,7, +0,8 X (5) 300 (224) 12,8 (3,2) 0,2 -2,1, ingen XIII (12) 161 (2.11) 12,8 (3,2) 3,2 -0,3, +0,2 15 XIV (3) 233 (272) 12,8 (3,2) 0,2 -3,8, +0,7 XV (3) 144 (272) 25,6 (3,2) 6,4 -1,4, +0,2 XVI (6) 144 (272) 6,4 (3,2) 3,2 -0,4, -0,3 XVII (7) 144 (272) 0,8 (3,2) 0,02 -0,2, -0,3 XVIII (7) 167 (272) 6,4 (3,2) 0,05 -1,0, +0,3 20 XIX (8) 333 (294) 1,6 (3,2) <0,2 -1,9, +1,6 200 (239) 0,8 (3,2) <0,2 ' -2,7, -1,8 XX (9) 333 (294) 3,2 (3,2) <0,2 -2,7, +3,2 XXI (18) 189 (183) 1,6 (3,2) 0,025 -0,5, -0,1 XXXI (30) 150 (144) 6,4 (4,8) 1,6 -1,6, -2,3 25 267 (267) 3,2 (4,8) <1,6 -2,3, -1,7 XXX (29) 206 (263) 3,2 (4,8) <3,2 -1,7, -1,7 XXVI (25) 183 (239) 0,4 (3,2) <0,025 -3,1, -2,3 XXVII (26) 144 (239) 0,2 (3,2) 0,025 -1,3, -0,9 XXIII (21) 194 (319) 12,8 (3,2) 0,2 -1,2, +0,2 30 XXIV (22) 313 (319) 6,4 (3,2) <0,1 -2,8, +0,3 XXV (23) 188 (331) 25,6 (4,8) 0,4 -2,2, +0,1 XXVIII (27) 119 (313) 3,2 (3,2) 3,2 +2,2, +2,2 XXIX (28) 331 (319) 25,6 (3,2) 0,4 -2,8, +0,6 35 1 mg/kg legemsvægt 2 gram pr. mus, dage 1-6, ved maksimale og minimale effektive doser

DK 162167B

44

Forbindelser (XIX) og (XX) er af exceptionel interesse, da deres aktivitet klart er bedre end for mitomycin C, både med hensyn til. maksimal effekt og mg styrke (sammenlignende dosisstørrelser for ækvivalente virkninger). De er begge forbindelser med formel (I), hvori A er amidi-5 nogruppen og B er -NHg, eller med andre ord mitomycin C-derivater, der R2 7 3 4^ ved N er substitueret med en aminomethylengruppe med formlen R R N-C=, 2 3 4 10 hvori R , R og R er som defineret ovenfor.

De omhandlede bis-amidinoforbindelser med formel (I), hvori både A og B er amidinogruppen, er også af væsentlig interesse som aktive antitumorforbindelser. Der henvises til resultaterne i tabellen for forbindelser (V), (VI), (VII), (IX), (X) og (XIV), der svarer til dette struk-15 turkrav.

Tabel V indeholder resultater af antitumorforsøg under anvendelse af B16 melanomer dyrket i mus. BDFj-mus anvendtes og podedes intraperi-tonealt med tumorimplantationen. En 60 dages protokol anvendtes. Grupper på ti mus blev anvendt for hver testet dosismængde, og den gennemsnitli-20 ge overlevelsestid for hver gruppe blev bestemt. Kontroldyr podedes på samme måde som forsøgsdyrene og behandledes med injektionsvehi kl en uden lægemiddel, og de udviste en gennemsnitlig overlevelsestid på 21 dage. Overlevelsestiden i forhold til den for kontrol dyrene (% T/C) blev anvendt som et mål for effektivitet, og den maksimale effektive dosis og 25 minimale effektive dosis for hver testforbindelse blev bestemt. Den minimale effektive dosis blev defineret som den dosis, der udviste en % T/C-værdi på 125. For hvert dosisniveau behandledes forsøgsdyrene med testforbindelsen på dage 1, 5 og 9 ad den intraperitoneale vej. Den gennemsnitlige vægtforandring på den angivne dag ved den maksimale effekti-30 ve dosis og den minimale effektive blev anvendt som et mål for toxici-tet. Et vægttab på 2 g for en 20 g mus blev ikke betragtet som for højt.

35 45

DK 162167 B

Tabel V

Inhiberinq af B16 melanomer

Minimal Gennemsnitlig 5 Forbindelse Maksimale effekt effektiv vægtfor- nr. (eks.) % T/C Dosis dosis andring (dag) V (1) >298 (256)* 0,8 (3,2)* <0,2 +0,5 -0,2 (5) X (5) >295 (198) 2,0 (3,0) <2,0 -0,4 -0,4 (6) 10 XXI (18) >295 (198) 0,4 (3,0) <0,2 -0,2 -1,8 (6) XX (9) 262 (198) 0,8 (3,0) <0,2 -2,6 -1,6 (6) XIX (8) >235 (165) 1,2 (3,0) <0,5 +0,6 +0,8 (5) * Værdier i parentes er kontrolværdier for mitomycin C 15

Forbindelse (XXX) (eksempel 29) og forbindelse (XXIX) (eksempel 28) testedes over for B16 muse-melanomerne under anvendelse af subkutan tumorimplantation og intravenøs behandling med lægemidlet. Behandlingsskemaet og vurderingerne af overlevelsestid (en 40 dages protokol anvendt-20 es) blev bestemt som før. Vægtforandring på dag 12 blev målt. Den maksimale effektive dosis af forbindelse (XXX) var 1 mg pr. kg, som gav en % T/C på 156 og en vægtforøgelse på 1,5 g. Grupper af seks dyr blev anvendt, og tre dyr overlevede hele 40 dages protokollen ved denne dosis.

Den minimale effektive dosis var 0,25 mg/kg, ved hvilken dosis 12 dages 25 vægtforandring var 1,0 g. For forbindelse (XXIX) var den maksimale effektive dosis 8 mg/kg ved en % T/C på 177 og en vægtforandring på -0,6.

Den minimale effektive dosis var 4 mg/kg med en vægtforandring på +0,8.

I det samme forsøg var den maksimale effektive dosis af mitomycin C 3 mg/kg ved en % T/C på 195 og en vægtforandring på -0,5. Den minimale ef-30 fektive dosis af mitomycin C blev ikke bestemt.

Ved en kort toxikologi sk protokol under anvendelse af grupper på fem BDFj-mus af hankøn pr. dosis indgivet i en enkelt intraperitoneal dosis af forbindelse (XIX) forekom ingen signifikant reduktion i lympho-cyt-tælning ved den optimalt effektive dosis af denne forbindelse (1,6 35 mg/kg i.p.). Ved denne dosis var der ingen signifikant stigning i blod-urinstofnitrogen (BUN) eller serum-glutamin-phospho-transferase (SGPT), hvilket antyder, at der ikke var nogen skadelig virkning på nyre- eller leverfunktion eller undertrykkelse af lymphocytisk aktivitet.

46

DK 162167 B

I betragtning af den enestående antitumoraktivitet, der iagttages i eksperimentelle animalske tumorer, og den formindskede toxicitet i forhold til mitomycin C, kan forbindelserne med formel (I) anvendes til i nhi bering af tumorer hos pattedyr. Til dette formål administreres de 5 systemisk til et pattedyr med en tumor i en i det væsentlige non-toxisk, antitumoreffektiv dosis.

Claims (6)

1. Anal ogi fremgangsmåde til fremstilling af et mitosanderivat med formlen 5 O O II A II CH„OC-B li il 1^3 il *L i/ Formel (I) 10 ® *( > , y i_l>r1 hvori A er amino, methoxy, hydroxy, (1-lavere al kyl-2(1H)-pyridinyliden)-15 amino, eller en gruppe med “formlen R2 h r2 r2r5 . R3rV(W-, R3-N-D=N-, R3-N=C-N-, / 2\n . 2° ---- x ( V-R9 [ T2;n eiier I R2 rV \n/\. I Il 17 N- l7 H0N-C=^-, KN=C-N-, R* R/ ώ o

25 I B er amino eller amidinogruppen med' formlen R3R4N-C=N-, idet mindst den ene af A og B er én af de angivne grupper, som er forskellig fra amino, methoxy eller hydroxy, n er nul eller et helt tal 1, 2 eller 3,

30 R1 er hydrogen, lavere al kyl, lavere alkanoyl, benzoyl eller substitueret benzoyl, hvori substituenten er lavere al kyl, lavere alkoxy, halogen, amino eller nitro, R er hydrogen, lavere al kyl, phenyl, lavere al kyl phenyl, lavere alkoxyphenyl, halogenphenyl, aminophenyl, nitrophenyl, thienyl, furyl, 35 cyano, dilavere alkylamino, lavere alkoxy eller lavere alkylthio, RJ er lavere al kyl, lavere alkoxy, eller danner sammen med R^ og nitrogenatomet, hvortil de er bundne, pyrrolidin, 2- eller 3-lavere alkyl pyrrol i din, piperidin, 2-, 3- eller 4-lavere al kylpiperidin, 2,6-di- DK 162167 B lavere alkylpiperidin, piperazin, 4-substitueret piperazin (hvori 4-sub-stituenten er alkyl, eller carbalkoxy med hver 1 til 8 carbonatomer, phenyl, methyl phenyl, methoxyphenyl, halogenphenyl, nitrophenyl eller benzyl), azepin, 2-, 3-, 4- eller 5-lavere alkylazepin, morpholin, thio- 5 morpholin, thiomorpholin-l-oxid eller thiomorpholin-I,l-dioxid, 4 3 R er lavere al kyl eller danner sammen med R og nitrogenatomet, hvortil de er bundne, pyrrolidin, 2- eller 3-lavere al kylpyrrol idin, pi-peridin, 2-, 3- eller 4-lavere alkylpiperidin, 2,6-dilavere alkylpiperidin, piperazin, 4-substitueret piperazin (hvori 4-substiuenten er alkyl, 10 eller carbalkoxy med hver 1 til 8 carbonatomer, phenyl, methylphenyl, methoxyphenyl, halogenphenyl, nitrophenyl eller benzyl), azepin, 2-, 3-, 4- eller 5-lavere alkylazepin, morpholin, thiomorpholin, thiomorpholin- l-oxid eller thiomorpholin-l,l-dioxid, 5 R er udvalgt blandt C118alkyl, bortset fra tert-alkyl, Cj_j8alke-15 nyl, Cj_lgalkynyl, Cj_18halogenalkyl, Cj_18hydroxyalkyl, C^ gcykloalkyl, eller aryl eller lavere aralkyl med hver indtil 12 carbonatomer eller en heteroalicyklisk eller heteroaromatisk gruppe med fra 3 til 8 ringatomer, hvoraf mindst to er carbonatomer, 7 9 R og R er uafhængigt H eller lavere al kyl, 20 hvori hver af de førnævnte lavere al kyl-, lavere alkanoyl- og lavere alkoxygrupper indeholder 1 til 6 carbonatomer, KENDETEGNET ved, AT man a) omsætter en forbindelse udvalgt fra gruppen bestående af mitomy- la cin C, mitomycin A eller et N -substitueret derivat af en af disse, med en amidacetal med formlen 25 3 2 r: r2 \ \ o /N-C-OFT 4/ / o R OR8 2 3 4 8 30 hvori R , R og R har de ovenfor angivne betydninger, og hver R uafhængigt betegner lavere al kyl eller cykl oal kyl med indtil 6 carbonatomer, eller tilsammen er alkylen, som sammen med de tilknyttede oxygenatomer og det mellemliggende carbonatom danner en cyklisk struktur med 5 eller 6 ringatomer, i opløsning i et vandfrit, reaktionsforeneligt, fly-35 dende, organisk reaktionsmedium ved 40°C til 65°C, indtil der dannes et reaktionsprodukt, hvori B eller både A og B i formlen (I) er amidino-gruppen med formlen DK 162167 B R2 r3r4n-c=n-, 5 eller b) til fremstilling af en 7-substitueret amino-9a-methoxymitosan omsætter en forbindelse, hvori B eller både A og B er amidinogruppen med formien R2

10 I r3r4n-c=n-, med en alifatisk, alicyklisk, aromatisk, heteroaromatisk eller hetero-alicyklisk primær amin, hvori det carbonatom, som bærer aminogruppen, 15 bærer mindst ét hydrogenatom og færre end to arylgrupper, i et vandfrit, reaktionsforeneligt, flydende, organisk reaktionsmedium ved en temperatur fra ca. —150C til +50°C, eller c) fremstiller en forbindelse, hvori A er amidino og B er amino ved, at man behandler en forbindelse, hvori både A og B er amidinogruppen med formlen 20 R2 R3R4N-C=N-, 25 med mere end én moldel af en amin udvalgt fra gruppen bestående af ami-nodiphenylmethan, tri fluorethylamin og tert-butylamin ved fra 20°C til 60°C, eller d) fremstiller en forbindelse, hvori B er A er (1-la-vere al kyl-2(1H)-pyridinyliden)amino eller en gruppe med formlen 30 / \ „9 9 9 2 r(GH?)n I NP R2 HR2 2 n II r3r4n-c=n-, r3n-c=n-, h9n-c=n- , k

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT det flydende organiske reaktionsmedium omfatter et lavere halogeneret al i fati sk car-bonhydrid, og AT mere end to moldele af amidacetalen anvendes i forhold til mitomycin C til dannelse af en forbindelse, hvori både A og B er amidinogruppen. 10

2 NN- eller , R 1 2 3 4 5 7 35 og R , R , R , R , R , R og n har de ovenfor anførte betydninger, ved, at man omsætter en opløsning af mitomycin C i dimethyl formamid (eller et andet forligeligt opløsningsmiddel) med fra 1,0 til 1,5 moldele natrium-hydrid til dannelsen af en anionisk form af mitomycin C, og omsætter DK 162167 B denne anioniske form med et elektrofilt reagens, som er i stand til at danne amidinogruppen, udvalgt blandt en iminoether, en iminothioether, . et halogenmethyleniminiumhalogenid og et iminohalogenidsalt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, AT reaktionsmediet er chloroform.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, AT reaktionsme- 15 diet er en blanding af et halogeneret lavere alifatisk carbonhydrid og en 1avere al kano!.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, AT reaktionsmediet er en blanding af chloroform og methanol. 20

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT der anvendes et vandfrit, reaktionsforeneligt, flydende, organisk reaktionsmedium omfattende methanol, chloroform, methylenchlorid eller en anden lavere halogenal kan. 25