DK161023B - Mitosanderivater - Google Patents

Description

i

DK 161023 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte mitosanderivater.

Disse forbindelser er mitomycin C-derivater, hvori enten 7-aminogruppen eller carbamido-nitrogenatomet, eller begge, er indbygget i en amidino-substituent. Disse forbindelser er nyttige mellemprodukter til frem- 5 stilling af andre mitosanderivater, der er aktive antitumormidler i eksperimentelle animalske tumorer.

Nomenklatur - Det systematiske navn for mitomycin C er, ifølge Chemical Abstracts: [laR-(laa,8/J,8aa,8ba)]-6-ami no-8-[((ami nocarbonyl)oxyjmethyl]- 10 -1,la,2,8,8a,8b-hexahydro-8a-methoxy-5-methyl-azirino[2',3',3, 4]-pyrrolo[l,2-aJ-indol-4,7-dion, i henhold til hvilket azirinopyrroloindol-ringsystemet nummereres som følger: ‘ :0¾ 2 la1 20 Chemical Abstracts

Et trivielt nomenklatursystem, der har fundet udstrakt anvendelse inden for mitomycin-litteraturen, identificerer det foregående ringsystem inklusive flere af de karakteristiske substituenter for 25 mitomycinerne som mitosan.

30 ^ s«ry 3 2

Mi tosan 35 Selv om dette system er bekvemt og hensigtsmæssigt for en række simple derivater, såsom de, der bærer N-substituenter på azirino-ring-nitrogenatomet eller i 7- eller 9a-stillingerne, lider det af visse tvetydigheder og mangler til almen brug. I henseende til forbinde!-

DK 161023 B

2 serne ifølge den foreliggende opfindelse, hvoraf nogle har substitu-enter på både azirinoringnitrogenatomet og på sidekæde-carbamoyl-nitrogenatomet, er der ingen konventionel nummerering, som kan skelne disse stillinger. I den foreliggende beskrivelse er det derfor la 5 blevet valgt at referere til azirinonitrogenatomet som N og carbamoyl nitrogenatomet som ved brugen af mitosan-nomenklatursyste- met. Med hensyn til de omhandlede forbindelsers stereokemiske konfiguration er det hensigten, når de identificeres ved grundnavnet "mitosan" eller ved en strukturformel, at identificere den som den 10 stereokemiske konfiguration af mitomycin C.

Mitomycin C er et antibiotikum, som fremstilles ved fermentering, og som allerede forhandles med godkendelse af "Food and Drug Administration" i terapien af disseminerede adenocarcinorner i mave eller pancreas i efterprøvede kombinationer med andre god-15 kendte kemoterapeutiske midler og til palliativ behandling, når andre muligheder har fejlet (Mutamycin®, Bristol Laboratories, Syracuse,

New Yor, 13201, Physicians' Desk Reference 35th Edition, 1981, pp.

717 og 718). Mitomycin C og fremstillingen deraf ved fermentering er genstand for USA patentskrift nr. 3.660.578, udstedt 2. maj 1972 20 under påberåbelse af prioritet fra tidligere ansøgninger, herunder en ansøgning indleveret i Japan den 6. april 1957.

Strukturerne af mitomyciner A, B, C og af porfiromycin blev først publiceret af J.S. Webb, et al. fra Lederle Laboratories Division American Cyanamid Company, J. Amer. Chem. Soc. 84, 25 3185-3187 (1962). 'En af de kemiske transformationer, som blev anvendt i dette strukturstudium for at relatere mitomycin A og mitomycin C, var omdannelsen af førstnævnte 7-9a-dimethoxymitosan ved omsætning med ammoniak til sidstnævnte 7-amino-9a-methoxymitosan.

Udbytning af 7-methoxygruppen i mitomycin A har vist sig at være 30 en reaktion af betydelig interesse ved fremstillingen af antitumoraktive derivater af mitomycin C. De følgende artikler og patentskrifter omhandler alle omdannelsen af mitomycin A til et 7-substitueret amino-mitomycin C-derivat med antitumoraktivitet. Formålet med dette forskningsarbejde var at fremstille derivater, som var mere 35 aktive, og især som var mindre toxiske end mitomycin C.

Matsui et al., "The Journal of Antibiotics", XXI, 189-198 (1968).

DK 161023 B

3

Kinoshita et al., "J. Med. Chem.\ 14, 103-109 (1971).

Iyengar et al., "J. Med. Chem.", 24, 975-981 (1981).

Iyengar, Sami, Remers og Bradner, Abstracts of Papers Annual Meeting of the American Chemical Society, Las Vegas, 5 Nevada, marts 1982, sammendrag nr. MEDI 72.

De følgende patentskrifter omhandler fremstillingen af 7-sub- stituerede aminomitosan-derivater ved omsætning af mitomycin A, la mitomycin B eller et N -substitueret derivat deraf med en primær 10 eller sekundær amin:

Cosulich et al., USA patentskrift nr. 3.332.944, udstedt 25. juli 1967.

Matsui et al., USA patentskrift nr. 3.420.846, udstedt 15 7. januar 1969.

Matsui et al., USA patentskrift nr. 3.450.705, udstedt 17. juni 1969.

Matsui et al., USA patentskrift nr. 3.514.452, udstedt 26. maj 1970.

20 Nakano et al., USA patentskrift nr. 4.231.936, udstedt 4. november 1980.

Remers, USA patentskrift nr. 4.268.676, udstedt 19. maj 1981.

Mitomycin C derivater med en substitueret aminosubstituent i 25 7-sti11 ingen er også blevet fremstillet ved direkte biosyntese, dvs. ved at tilsætte en række primære aminer til fermenteringssubstrater og udføre den konventionelle mitomycinfermentering (C.A. Claridge et al., Abst. of the Annual Meeting of Amer. Soc. for Microbiology 1982. Sammendrag 028).

30 Mitomycin C er den primære mitomycin, som fremstilles ved fermentering, og den er den kommercielt tilgængelige form. Den nuværende teknologi for omdannelse af mitomycin C til mitomycin A til brug ved fremstillingen af de semisyntetiske substituerede amino-analoge af mitomycin C, hvortil der er henvist i de ovennævnte 35 publikationer, involverer hydrolyse af mitomycin C til den tilsvarende 7-hydroxymitosan, en højst ustabil forbindelse, og dernæst methylering af dette stof med diazomethan, som er et meget farligt stof at håndtere. Et forsøg på at undgå anvendelsen af diazomethan

DK 161023B

4 til methylering af 7-0-demethyl-mitomycin A, som fremstilles ved hydrolyse af mitomycin C, involverer anvendelsen af 7-acyloxymitosaner (Kyowa Hakko Kogyo KK, japansk patentskrift nr. J5 6073-085,

Farmdoc nr. 56227 D/31).

5 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt gruppe af monoguanidino-, eller mono- og bis-amidino-analoge af mitomycin C, hvori enten 7-aminonitrogenatomet eller N*® carbamoyl-nitrogenatomet for mitomycin C, eller begge, er del af en amino-substituent, eller 7-aminonitrogenet er del af en guanidinogruppe.

10 Tilsvarende analoge af mitomycin A med methoxygruppen i 7-stillingen og amidinogruppen i N^-sti 11 ingen er også omfattede. De omhandlede forbindelser svarer til følgende strukturformel: . 'WS.

hvori A er amino, methoxy, hydroxy, (1-lavere alkyl-2(lH)-pyridinyli-den)amino, eller en gruppe med formlen 25 R2 H R2 R2R5 (CH-)_ 3 4 I 3 I I 3 I I / \n RRrø-, R'-Χ-ΟΪΖ-, R-N=C-N-, / R2 ΰΪ>η β11βΓ f li 17 N- r7

30 H2N-C=N-, HH=C-N-, . R

R2 34 ' B er amino eller amidinogruppen med formlen R R N-C=N-, idet mindst den ene af A og B er én af de angivne grupper, som 35 er forskellig fra amino, methoxy eller hydroxy, n er nul eller et helt tal 1, 2 eller 3, R* er hydrogen, lavere al kyl, lavere alkanoyl, benzoyl eller substitueret benzoyl, hvori substituenten er lavere al kyl, lavere

DK 161023 B

5 alkoxy, halogen, amino eller nitro, R er hydrogen, lavere al kyl, phenyl, lavere al kylphenyl, lavere alkoxyphenyl, halogenphenyl, aminophenyl, nitrophenyl, thienyl, furyl, cyano, di lavere al kyl amino, lavere alkoxy eller 5 lavere al kyl thi o, øs a R15 er lavere al kyl, lavere alkoxy, eller danner sammen med R^ og nitrogenatomet, hvortil de er bundne, pyrrolidin, 2- eller 3- lavere al kyl pyrrol idin, piperidin, 2-, 3- eller 4-lavere al kyl -piperidin, 2,6-dilavere al kylpiperidin, piperazin, 4-substitueret 10 piperazin (hvori 4-substituenten er al kyl, eller carbalkoxy med hver 1 til 8 carbonatomer, phenyl, methyl phenyl, methoxyphe-nyl, halogenphenyl, nitrophenyl eller benzyl), azepin, 2-, 3-, 4- eller 5-lavere alkylazepin, morpholin, thiomorpholin, thio-morpholin-l-oxid eller thiomorpholin-l,l-dioxid, 15 R^ er lavere alkyl eller danner sammen med R15 og nitrogenatomet, hvortil de er bundne, pyrrolidin, 2- eller 3-lavere alkylpyrro-lidin, piperidin, 2-, 3- eller 4-lavere al kyl piperidin, 2,6-dilavere al kylpiperidin, piperazin, 4-substitueret piperazin (hvori 4- substituenten er alkyl, eller carbalkoxy med hver 1 til 8 20 carbonatomer, phenyl, methyl phenyl, methoxyphenyl, halogenphenyl, nitrophenyl eller benzyl), azepin, 2-, 3-, 4- eller 5- lavere alkylazepin, morpholin, thiomorpholin, thiomorpholin-1--oxid eller thiomorpholin-l,l-dioxid, R® er udvalgt blandt C118-alkyl, bortset fra tert-alkyl, Cj jg-25 -alkenyl, Cjjg-alkynyl, Cj_18-halogenalkyl, Cj_18-hydroxy- alkyl, C^ g-cykloalkyl, eller aryl eller lavere aralkyl med hver indtil 12 carbonatomer eller en heteroalicyklisk eller hetero-aromatisk gruppe med fra 3 til 8 ringatomer, hvoraf mindst to er carbonatomer, 30 R7 og R9 er uafhængigt H eller lavere al kyl, hvori hver af de førnævnte lavere al kyl-, lavere alkanoyl- og lavere alkoxygrupper indeholder 1 til 6 carbonatomer.

Fagmanden vil kunne indse, at tautomere former af nogle af de foregående amidinogrupper eksisterer. Sådanne skal også være omfattede af de foranstående formler og af den foreliggende opfindelse.

35

DK 161023 B

6

De ovennævnte forbindelser med formel (I) er nyttige som mellemprodukter til fremstilling af andre forbindelser med antitumoraktivitet i dyr. I det følgende beskrives såvel fremgangsmåder til fremstilling af de førnævnte forbindelser som deres omdannelse til 5 andre værdifulde forbindelser med antitumoraktivitet i forsøgsdyr.

Hellemproukterne ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til fremstilling af forbindelser med antitumoraktivitet i dyr, ved en fremgangsmåde, der involverer omsætning af en forbindelse med formel (I), hvori A eller både 10 A og B er amidinogruppen, med en primær amin, hvilket resulterer I i spaltning af N^-aminomethylensubstituenten, når den er til stede, med omdannelse deraf til NHg-gruppen, som er til stede i mitomycin A og mitomycin C. De primære aminer reagerer med visse undtagelser også i stilling 7 ved fjernelse af amidinogruppen og erstatning 15 deraf med aminosubstituenten svarende til reaktanten. Disse fremgangsmåder er belyst i de følgende reaktionsligninger.

20 2 R3 r2 q i? f r3 ^ Λ o § ca/jJ |p u-r1 s iVXcc, 25 3 .0 I-1** £>02, (¾

0 I

Formel (II) * /Formel (III) R3 f O |}· '’-Ψ&

Formel (IV) DK 161023 B j 7 !l c R , som betegner nitrogensubstituenten af forskellige kendte og ukendte 7-substituerede amino-mitomycin C forbindelser, som beskrevet her, og af de primære aminer, som er i stand til at udskifte 7-amidinogruppen i forbindelsen med formel (II), er udvalgt 5 blandt Cj jg-alkyl, bortset fra tert-alkyl, Cjjg-alkoxy, Cjjg--alkenyl, Cjjg-alkynyl, Cj_1Q-halogenal kyl, Cjjg-hydroxyalkyl, C4_g-cykl°alkyl, aryl eller lavere aralkyl eller lavere aralkoxy med hver indtil 12 carbonatomer, eller en heteroalicyklisk eller hetero-aromatisk gruppe med fra 3 til 8 ringatomer, hvoraf mindst to er 10 carbonatomer. R6, som betegner nitrogensubstituenten af de primære aminer, der kun er i stand til at spalte N^-amidinosubstituen-ten, er resten af en meget svagt basisk al ifati sk amin eller en stærkt hindret al kylamin eller aral kylamin. Eksempler er trifluor-ethylamin, benzhydrylamin (dvs. aminodiphenylmethan) eller tert-15 -butylamin.

Forbindelserne med formel (I) fremstilles ved omsætning af mitomycin C, 7-hydroxy-9a-methoxymitosan, eller mitomycin A eller 13 en N -substitueret analog af enhver af de foregående, med en amid-acetal. De forbindelser med formel (I), hvori A, men ikke B, 20 er amidinogruppen, kan også fremstilles ved omsætning af mitomycin C eller en N -substitueret analog deraf med en stærk base til dan- 7 nel se af en anion ved N , efterfulgt af omsætning af anionen med et reagens, der er i stand til at danne aminomethylengruppen, såsom et halogenmethy1 en i mi n i umsalt.

25 De foretrukne forbindelser, som kan fremstilles ved hjælp af mitosanderivaterne ifølge opfindelsen, er mitomycin C analoge, hvori 7-aminogruppen er indbygget i en substitueret eller usubstitueret amidinogruppe. De har stærk antitumorvirkning over for eksperimentelle animalske tumorer. Disse forbindelser fremstilles ved omsætning af 30 mitomycin C med et reagens, der er i stand til at omdanne 7-aminogruppen til en 7-amidinogruppe. Foretrukne reagenser til dette formål er amid-acetalerne, der reagerer i godt udbytte og under milde betingelser med mitomycin C (eksempler 1-5 og 18). En anden gruppe amidin-dannende reagenser er imidoylhalogeniderne (eksempel 17), halogenmethylen-35 iminiumsaltene (eksempel 15), 2-halogen-l-alkylpyridiniumhalogeni-derne (eksempel 16) og iminoethrene eller iminothioethrene (eksempel 13 og 14), der reagerer med den anioniske form af mitomycin C,

DK 161023B

8 som dannes ved deprotonisering af 7-aminogruppen deraf ved behandling med stærk base. Betingelser for deprotonisering af mitomycin C involverer behandling af mitomycin C i dimethyl formamid--opløsning med cirka 1,5 mol dele natriumhydrid ved stuetemperatur.

5 Omsætning af den således dannede anioniske form med ét eller flere af de foregående reagenser gør fortrinsvis brug af 1 til 1,5 mol dele deraf i forhold til mitomycin C, ved en temperatur fra stuetemperatur til cirka -60°C. Aprote polære organiske opløsningsmidler, såsom dimethyl formamid, hexamethylphosphoramid, dimethyl sulfoxid eller 10 pyridin, anvendes som reaktionsmedium. Fremgangsmåden er imidlertid ikke begrænset til dannelse af anionisk mitomycin C på denne specifikke måde, eftersom modifikationer vil kunne indses af fagmanden.

Den foretrukne fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne 15 med formel (I), hvori B eller både A og B er amidinogruppen med R2 3 4 1 formlen R R N-C=N-, består i omsætning af mitomycin C eller mitomycin A eller et N*a-substitueret derivat af en af disse med en amidacetal med formlen 20 R3 f ‘'v I a

^N-C-OR

T&y * 8 R OR° Formel (V)

A Λ J Q

25 hvori R , R"5 og R^ har de ovenfor angivne betydninger, og R° er lavere al kyl eller cykloal kyl med indtil 6 carbonatomer, eller de to R -grupper er forbundne som en alkylenkæde, der med de to oxygenatomer og det mellemliggende carbonatom danner en cyklisk struktur med 5 eller 6 ringatomer. Omsætningen af sådanne amid-30 acetaler med primære aminer er ganske velkendt i teknikken, og fagmanden vil vide, hvorledes omsætningen skal udføres med mito- la mycin Cr mitomycin A eller N -alkylderivaterne deraf. Der refereres f.eks. til H.E. Winberg, USA patentskrift nr. 3.121.084 (11. februar 1964) og til R.F. Abdulla et al., "The Chemistry of Form-35 amide Acetals", Tetrahedron, Vol. 35, pp. 1720-24 (1979).

Det foretrækkes at udføre omsætningen i et flydende vandfrit reaktionsmedium, hvori diluenten er en væske, der er forenelig med reaktionsbetingelserne. Fortrinsvis er sidstnævnte et lavere halo-

DK 161023 B

9 generet al i fati sk carbonhydrid eller en lavere al kano! eller gerne en blanding af de to. Chloroform og methanol og blandinger deraf er ganske velegnede. Omsætningen udføres ved en temperatur fra 40°C til 65°C i et tilstrækkeligt tidsrum til, at reaktionen forløber til 5 afslutning.

Når et stort overskud (ca. 60 gange) af acetal en anvendes, er det dominerende dannede produkt bis-amidinoforbindelsen, dvs. de forbindelser med formel (I), hvori både A og B udgør amidinogrup-la pen. N -formyl derivatet dannes undertiden som et biprodukt. Når 10 imidlertid en begrænset mængde (ca. 10 gange) af acetal en anvendes, dannes, foruden bis-amidinoforbindelsen, også en mono-amidino-forbindelse, dvs. en forbindelse med formel (I), hvori A er amino-gruppen og B er amidinogruppen. Blandinger af de foran nævnte reaktionsprodukter adskilles let ved kromatografering, som beskre-15 vet i de følgende eksempler.

Nogle kommercielt tilgængelige amidacetaler, som kan anvendes ved denne fremgangsmåde, er angivet i tabel I, som er taget fra den ovennævnte artikel af Abdulla, et al., p. 1685.

20 Tabel I

Nogle kommercielt tilgængelige amidacetaler

Acetal _Struktur_ A (CH3)2NCH(0CH3)2 25 B (CH3)2NCH(OCH2CH3)2 ch3 C (CH3)2NCH(OCH2-C-CH3)2

Ch3 D (CH3)2NC(CH3)(OCH3)2 30 ^ 0-CH2

E (ch3)2nch!^ I

0-ch2 ^"CH3 F (CH,)«NCH(0-CHCT )o 35

10 DK 161023 B

Tabel I (fortsat)

Acetal Struktur_ ! s (ch3)2nch(och2ch2ch3)2 5 H (CH3)2NCH(0-/ \ )2 o

Forbindelserne med formel (I), hvori R er cyano, dilavere alkylamino, lavere alkoxy eller lavere alkylthio, fremstilles ved at 10 anvende de følgende orthocarbonatderivater i stedet for amidaceta-lerne ved den foran nævnte fremgangsmåde.

CN /n(ch3)2 (ch3)2n-c-(oc2h5)2 (c2h5o)2c 15 ^N(CH3)2

Formel (VI) Formel (VII) 20 (c2h5o)3c-n(ch3)2 (c2h5s)3c-n(ch3)2

Formel (VIII) Formel (IX)

Disse reagenser er let tilgængelige fra følgende kilder: 25

Formel (VI) Kanthlehner, et al., Liebigs Ann.

Chem., 1981, 70-84.

Formel (VII), (VIII) H. Meerwein, et al., Liebigs Ann.

og (IX) Chem. 641, 1 (1961).

30 R2 3 *

Amidi noderivaterne med formel (I), hvori A er R NHC=N- eller R2 R5 3 1 / R N=C-N-, fremstilles ud fra den anioniske form af mitomycin C eller et N^-substitueret derivat deraf, som beskrevet ovenfor.

35 Egnede halogenmethyleniminiumsalte til anvendelse ved denne fremgangsmåde er beskrevet i litteraturen. Repræsentative er de, som ; er anført af W. Kantlehner i "Advances in Organic Chemistry", vol.

i 9, del 2, Wiley Interscience, 1979, pp. 81 og 82. Tabel II nedenfor DK 161023 B π er taget fra Kantlehners sammendrag.

Tabel II

Halogenmethylen i mi n i umsalte 5 Λ R2-C.Ø P xnr3r4

R2 R3 R4 X Y Smp., °C

10 H CH3 CH3 Cl Cl 140-145 H CH3 CH3 Br Br 156-158 H CH3 CH3 I I 110 H -(CH2)g- Cl Cl 58-66 H CH3 C6H5 Cl Cl olie 15 CH3 CH3 CH3 Cl Cl 150-120 C2H5 CH3 CH3 Cl Cl 68-70 c2h5 -(¾½- C1 C1 82-85 n-C3Hy CH3 CH3 Cl Cl 82-84 n-C3H7 C2H5 C2H5 Cl Cl ' 20 20 i-C3H7 C2H5 C2H5 Cl Cl ' 20 n-C4Hg CH3 CH3 Cl Cl 50-55 -(CH2)3- CH3 Cl Cl 75-79 C6H5 CH3 H Cl Cl 93-95 C6H5 CH3 H Cl Br 115-117 25 C6H5 CH3 D Cl Br 115-118 C6H5 CH3 CH3 Cl Cl 95-96 c6h5 -(¾½- C1 C1 136-140

CgHg -(CH2)4- Br Br3 64 C6H5 -(¾) 5- Br Br3 97 30 C6H5 -CH-(CH2)4-CH- Br Br3 125 -ch3 \h3

CgH5 -CH-(CH2)3-CH- Br Br3 124 -ch3 \h3

CgHg CH3 CH3 Br Br 120 (dekomp.) 35 CgHg -(CH2)4- Br Br 178 (dekomp.)

CgHg -(CH2)g- Br Br 195 (dekomp.)

CgHg -CH-(CH2)4- Br Br 160 ch3

DK 161023B

12

Tabel II (fortsat)

R2 R3 R4 X Y Snip., °C

! 5 CgHg -CH-(CH2)3-CH- Br Br _ CH3 XCH3

CgHg -CH-(CH2)4- Br Br 85-95 n_C3H7 p-0CH3C6H4 -(CH2)g- Cl Cl 85 10 p-N02-CgH4 CH3 CH3 Cl Cl 90 (dekomp.) p-N02-CgH4- -(CHgJg- Cl Cl 117-119 /T\ CH3 H Cl Cl 103-104 \0A CH3 H Cl Br 132-134 (dekomp.) 15 CH3 D Cl Cl 103-105 CH3 D Cl Br 133-134 (dekomp.) C2H5 H Cl Cl 93-94 C2H5 H Cl Br 151-152 20 CH3 CH3 Cl Cl 181-182 C2H5 C2H5 Cl Cl 99-103 Når der anvendes et halogenmethyleniminiumsalt som reaktant, 25 som illustreret i tabel II, er det undertiden hensigtsmæssigt at anvende det tilsvarende amid som opløsningsmiddel, dvs. amidet, i hvorfra iminiumsaltet blev fremstillet. I tilfælde, hvor de tilsvarende amider er faste, kan anvendes hexamethylphosphoramid eller pyridin.

Dette er belyst i eksempel 17 og 18 nedenfor.

30 De af N-substituerede formamider afledte imidoylchlorider er også hensigtsmæssige reaktanter til dette formål. Deres fremstilling er velkendt for fagmanden, som belyst i tabel III, der er taget fra H. Ulrich i "The Chemistry of Imidoyl Halides", Plenum Press, New York, 1968, pp. 74-76. Deres omsætning med aminer til dannelse af 35 amidiner er også velkendt, som belyst af S.R. Sandler og W. Karo i "Organic Chemistry", vol. 12-III, A.T. Blomquist og H. Wasserman, udgivere, Academic Press, New York, 1972, p. 227.

! i

DK 161023 B

13

Tabel III Imidoylchlorider R2-C=NR3 i 5 Cl R2 R3 Kogepunkt, °C/mm (Snip., °C) 10 CH3 CgHjj 45-56/0,04 C6H5 (118-120) 2-CH3CgH4 60/0,1 2-FC6H4 70/0,25 2-ClCgH4 111-114/14 15 2-BrCgH4 142-143/12 C2H5 CgHjj 43-44/0,02 CH3CH2CC12 C2Hg 72-75/14 (CH3)2CH CgHn 40-41/0,001 2-CH3CgH4 67/0,3 20 4-CH3C6H4 80-85/0,8 4-CH30CgH4 93-94/0,25 n-C4Hg(C2H5)CH n-C4Hg 72-76/0,7 (CH3)3C CgHn 104-106/20

CgH10Cl C2H5 102/3 25 CgHg CH3 46-47/2 90-92/13 C2H5 47-48/1 1- C3H7 52-54/1 n-C4Hg 85-86/1 30 CgHn 110-112/1 (66-67) CH2CgHg 128-130/1

CgHg 175-176/12 (40-41) 35 2,6-(CH3)2CgH3 153-156/1 2- CH3OCgH4 188-190/6

DK 161023 B

14

Tabel III (fortsat) i R2 R3 Kogepunkt, °C/mm I (Smp., °C) I 5 -_ I 4-CH30C6H4 198-200/20 ! (61-63) 2,4-(02N)2C6H3 (122-124) 2-CH3C6H4 C6H5 174-177/10 10 4-CH3C6H4 CgHg 141-144/1 (40-41) 4-ClCgH4 C6H5 (66-67) 4-BrC6H4 4-BrC6H4 (93-94) 4-CH30C6H4 C6H5 183-185/3 15 (73-76) 4-02NC6H4 C6Hn (40-42)

CgHg (137-138) 4-02NCgH4 (132-134) 3,5-(02N)2CgH3 CgHjj (86-87) 20 2,4,6-(CH3)3C6H2 CgHg 164-165/1 (60-62)

Forbindelserne med formel (I), hvori A er den nitrogen-usub- R2 R2 R5 i i / 25 stituerede amidinogruppe, H2N-C=N- eller HN=C-N-, fremstilles ved omsætning af en aminobeskyttet iminoether med mitomycin C, et 7 la N -substitueret derivat deraf eller et N -lavere alkyl-derivat af én i i af disse på den anioniske form, som beskrevet ovenfor. Den beskyt- J tende gruppe fjernes dernæst på konventionel måde. Isopropyl formi- 30 midat, hvori aminogruppen er beskyttet af Ø-trimethylsilylethoxy-carbonylgruppen, er en egnet reaktant (eksempel 13).

ClC02CH2CH2Si(CH3)3 (CH3)2CH0CH=NH.HC1 -> 35 (CH3)2CH0CH=NC02CH2CH2Si(CH3)3 j i

DK 161023 B

15 Når A er (1-lavere alkyl-2(lH)-pyridinyliden)amino eller gruppen med formlen (CHOn c?” - r y ti k7 10 involverer fremstillingerne omsætning af den anioniske form af mitomycin C med cykliske halogenmethyleniminiumsalte eller imidoylhalo- R7 R2 2 3 i I / genider, hvori R og R med formlen R -N-C»N- er forbundne til dannelse af en ring. Egnede reagenser til omsætning med mitomycin 15 C anionen er 2-chlor-l-methylpyridiniumiodid (eksempel 16), 2-chlor--4,5-dihydro-l-methyl-l(3H)-pyrrolidiniumchlorid (tabel II), N,N'-dimethyl-NjN'-trimethylenchlorformamidimiumchlorid (eksempel 28) og andre cykliske imidoylhalogenider, som afledes af 2-azetidinoner, 2-pyrrolidinoner, 2-piperidinoner og 2-azepinoner. Igen anvendes, 20 når R eller R i slutproduktet er hydrogen, en beskyttende gruppe, såsom ovenfor, i det cykliske halogenmethyleniminiumsalt-mellemprodukt.

Forbindelserne med formel (I), hvori A eller både A og B er R2 3 a 1 25 en amidinogruppe med formlen R R N-C=N-, reagerer med primære 5 5 aminer med formlen R NH, hvori R er udvalgt blandt Cllg-alkyl, bortset fra tert-alkyl, Cj_jg-alkenyl, Cj_jg-alkynyl, Cj_lg-halogen-alkyl, Cj_lg-hydroxyal kyl, C^_g-cykloalkyl eller aryl eller lavere aralkyl med hver indtil 12 carbonatomer eller en heteroalicyklisk 30 eller heteroaromatisk gruppe med fra 3 til 8 ringatomer, hvoraf mindst to er carbonatomer. Den eneste begrænsning på valget af primær amin, bortset fra fraværet af funktionelle grupper, som er uforenelige med reaktionsbetingelserne, er, at aminonitrogenatomet er bundet til et carbonatom, som bærer mindst ét hydrogenatom og 35 mindre end to arylgrupper. En vandfri, flydende organisk forbindelse anvendes som reaktionsmedium, og ethvert sådant stof kan anvendes, så længe det er foreneligt med reaktionsbetingelserne og ikke deltager i reaktionen på skadelig måde. Et overskud af den

DK 161023 B

16 ! ! i I primære aminreaktant, på molbasis, anvendes i almindelighed. En reaktionstemperatur i intervallet fra cirka -15°C til +15°C foretrækkes. Det resulterende produkt fra denne omsætning er en 7-sub-stitueret amino-9a-methoxymitosan, nemlig et mitomycin C-derivat 5 med en substituent som defineret for R® på 7-aminogruppen. Sådan-' ne forbindelser vides fra den kendte teknik at besidde en væsentlig grad af antitumoraktivitet i forsøgsdyr.

6

Nogle primære aminer, betegnet ved formlen R NH^, har vist sig at være ude af stand til at fjerne 7-amidinogruppen ved den i 10 foregående afsnit beskrevne fremgangsmåde. R® er alkyl, cykloalkyl, cykl oal kyl al kyl, aralkyl eller heteroalicyklisk med fra 4 til 18 carbon-atomer, hvori carbonatomet, som bærer aminogruppen, er et tertiært carbonatom eller et sekundært carbonatom, som bærer 2 arylgrupper.

Visse andre svagt basiske alifatiske aminer, såsom trifluorethylamin, 15 kan heller ikke fjerne 7-amidinogruppen. Disse aminer er nyttige til omdannelse af en forbindelse med formel (I), hvori både A og B er R2 3 4 * den nævnte amidinogruppe med formlen R R N-C=N-, til en forbindelse med formel (I), hvori kun A er amidinogruppen. Selv om disse 20 aminer mangler evnen til at fjerne 7-amidinogruppen, er de alligevel i stand til at spalte den med B betegnede amidinogruppe til NH2 til dannelse af den carbamidofunktion, som er karakteristisk for de usubstituerede mitosaner. Selve aminen kan tjene som reaktionsmedium, eller et opløsningsmiddel system som defineret i foregående 25 afsnit kan anvendes. Denne fremgangsmåde udføres fortrinsvis i området fra 20°C til 60°C.

Opfindelsen beskrives nærmere i de følgende eksempler. Smeltepunkter blev bestemt på et Thomas-Hoover kapillær-smeltepunkts-apparat og er ukorrigerede. Temperaturerne er udtrykt i °C. De 30 kernemagnetiske resonansspektre (NMR) blev registreret på et Varian XL100 spektrometer i pyridin-dg, med mindre andet er anført. De infrarøde spektre (IR) blev opnået med et Beckman 4240 spektrofotometer, og prøven blev presset til en pille med kalium-bromid. IR-tallene er ^max i cnf*. De synlige UV-spektre blev 35 registreret på et Varian-Cary 219 spektrofotometer.

Tyndtlagskromatografi (tic) blev udført på 0,25 mm præ--coatede si li kagel pi ader under anvendelse af UV-lys som visualiserende middel. Flash-kromatografi blev udført under anvendelse af

DK 161023 B

17

Silica Woelm (32-63 μχα). Opløsningsmidler inddampedes under reduceret tryk og under 50°C.

Eksempel 1 5 Forbindelse (V) 7-[(dimethyl ami nojmethylen]ami no-N*®-(dimethyl ami nojmethylen-9a--methoxymitosan

Forbindelse (VI) 10 7-[(dimethylamino)methylen]amino-N10-(dimethylamino)methylen-Nla--formyl-9a-methoxymitosan

O

15 I ] l'0^ “»Yd> (CH302)CHN(CH3)2 20

Mitomycin C ^ 0 o o CH203i=CHN(CH3)2 (0¾) qyjOKMUoy 2 3 o _J> O I_D"» v vi 30 Til en suspension af 500 mg (1,50 mM) mitomycin C i 25 ml chloroform sattes i alt 9,6 ml (2,4 ml portioner efter 0, 18, 21 og 23 timer) Ν,Ν-dimethylformamid-dimethylacetal, og suspensionen omrørtes ved ca. 50° i 41 timer. Ved inddampning af opløsningsmidlet og overskydende reagens under reduceret tryk opnåedes en 35 mørkegrøn remanens; tic (methylenchlorid/methanol 20:1) viste fraværet af mitomycin C og tilstedeværelsen af to nye grønne komponenter (Rf = 0,16 og 0,22). Hovedkomponenten (Rf = 0,16) isoleredes ved flash-kromatografi under anvendelse af methylenchlorid/-

I DK 161023 B

18 methanol 20:1 som elueringsmiddel, som et grønt, fast stof (340 mg 51,5%), der ved opløsning i diethylether efterfulgt af tilsætning af hexan gav forbindelse (V) som et mørkegrønt, amorft pulver.

NMR (pyridin dg, S): 2,18 (s, 3H), 2,70 (bs, IH), 2,76 (s, 5 3H), 2,82 (s, 3H), 2,86 (s, 6H), 3,22 (s, 3H), 3,30 (bs, IH), 3,60 (d, J=12 Hz), 4,12 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 4,43 (d, IH, J=12 ! Hz), 4,90 (bs, IH), 5,10 (t, IH, J=10 Hz), 5,52 (dd, IH, J=1Q, 4

Hz), 7,85 (s, IH), 8,64 (s, IH).

IR (KBr) V. cm'1: 3300, 2930, 1675, 1620, 1545, 1230, max 10 1060.

UV (H20) Amax' nm: 390 09 244‘

Analyse beregnet for C21H28N6°5: C’ 56,71; Η» 6,08; N» 18>90·

Fundet: C, 56,20; H, 6,28; N, 17,88.

Den mindre komponent (Rf = 0,22), der isoleredes (180 mg, 15 25,35%) som et amorft, fast stof ved fældning fra diethyl ether og hexan, identificeredes som forbindelse (VI).

NMR (pyridin dg, 6): 2,20 (s, 3H), 2,60-3,00 (3 singletter, 12H), 3,2 (s, 3H), 3,65 (m, 2H), 4,04 (d, IH, J=4 Hz), 4,16 (dd, IH, J=12, 4 Hz), 4,60 (d, IH, J=13 Hz), 4,86 (t, IH, J=12 Hz), 20 4,90 (s, IH), 5,48 (dd, IH, J=12, 4 Hz), 7,90 (s, IH), 8,64 (s, IH), 9,06 (s, IH).

IR (KBr) v t cm'1: 2490, 2860, 1698, 1630, 1600, 1540, max 1250, 1060.

UV (H20)> \iax' nm: 390 09 244 ‘ 25 Analyse beregnet for ^22^28^6®6: C, 55,89; H, 5,93; N, 17,78.

I Fundet: C, 55,41; H, 5,96; N, 16,99.

Opløsninger af (V) og (VI) i enten ethylacetat eller N,N-di-methylformamid-dimethylacetal viste ved tic, ved henstand ved stue-30 temperatur i mere end 10 timer, at forbindelse (VI) (Rf = 0,22) omdannedes til forbindelse (V) (Rf = 0,16) til dannelse af en opløsning, som var stærkt beriget med sidstnævnte.

Eksempel 2-7 udførtes i henhold til fremgangsmåden i eksempel 1 med de nedenfor angivne modifikationer til dannelsen af forskel-35 lige yderligere forbindelser ifølge opfindelsen.

i i

DK 161023 B

19

Eksempel 2 Forbindelse (VII) 7-[(di i sopropylami no)methylen]ami no-N10-(di isopropylami nojmethylen--9a-methoxymitosan 5

En suspension af mitomycin C (200 mg, 0,6 mM) i N,N-di isopropyl formamid-diethyl acetal (3 ml) opvarmedes under omrøring ved 53°C i 15 timer. Reaktionsblandingen hældtes i 50 ml vand og eks-traheredes med ethyl acetat (3 x 30 ml). Den kombinerede organiske 10 ekstrakt tørredes (NagSO^) og inddampedes til dannelse af en mørkegrøn sirup, tic (methylenchlorid/methanol 10:1) viste en grøn hovedkomponent ved Rf - 0,43 med hurtigere bevægende (Rf * 0,45-0,50) urenheder. Hovedkomponenten (VII) isoleredes som et mørkegrønt, fast stof (156 mg, 46,8%) ved to flash-kromatografi -15 procedurer under anvendelse af methylenchlorid/methanol 20:1 som eluerende opløsningsmiddel.

NMR (CDC13, δ): 1,10-1,50 (5 singletter, 24H), 1,94 (s, 3H), 2,78 (dd, IH, J=4, 2 Hz), 3,05 (d, IH, J=4 Hz), 3,22 (s, 3H), 3,60 (m, 5H), 3,75 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 4,24 (d, IH, J=12 Hz), 20 4,56 (t, IH), J=10 Hz), 4,88 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 7,83 (s, IH), 8,67 (s, IH).

IR (KBr), V f cm'1: 3320, 2990, 2940, 1680, 1630, 1600, 1500, 1235, 1060.

UV (MeOH) Amav, nm: 246 og 393. max 25 Analyse beregnet for C29^44N6°5; C, 62,55; H, 7,91; N, 15,10.

Fundet: C, 62,03; H, 7,80; N, 14,60.

Eksempel 3 30 Forbindelse (XIV) 7-[(dimethylamino)methylen]amino-N10-(dimethylamino)methylen-9a-la -methoxy-N -methylmitosan la I dette eksempel anvendtes i stedet porfiromycin (N -methyl 35 mitomycin C), 130 mg (0,37 mM) som udgangsmateriale til omsætning med 0,8 ml (1,5 mM) Ν,Ν-dimethylformamid-dimethylacetal under anvendelse af 10 ml chloroform og 2 ml methanol som reaktionsopløsningsmiddel og en reaktionstid på 5.0 minutter ved 50°C. Forbindelse i

DK 161023 B

20 ningsmiddel og en reaktionstid på 50 minutter ved 50°C. Forbindelse (XIV) opnåedes som en sirup efter inddampning af reaktionsopiøs-j ningsmidlet, og rensedes ved flash-kromatografi under anvendelse | af 20 g sili kagel og methylenchlorid/methanol (20:1) som eluerende 5 opløsningsmiddel.

! NMR (pyridin d5, 8)i 2,22 (bs, 4H), 2,28 (s, 3H), 2,70 (d, i IH, 0=4 Hz), 2,80 (s, 3H), 2,84 (s, 3H), 2,90 (s, 6H), 3,20 (s, ! 3H), 3,52 (dd, IH, J=2, 12 Hz), 4,10 (dd, IH, 0=4, 11 Hz), 4,38 (d, IH, 0=12 Hz), 4,92 (t, IH, 0=11 Hz), 4,96 (bs, IH), 5,46 (dd, 10 IH, 0=4, 11 Hz), 7,86 (s, IH), 8,70 (s, IH).

Rf = 0,53, tyndtlagskromatografi med 9:1 methylenchlorid/-methanol.

IR (KBr) v. cm'1: 2930, 1680, 1620, 1545, 1230, 1115.

UV (MeOH) λ__ν, nm: 386 og 243.

ΙπαΧ 15 Analyse beregnet for C22^30*W C, 57,60; H, 6,55; N, 18,33.

Fundet: C, 57,11; H, 6,11; N, 17,99.

Denne fremgangsmåde dannede forbindelse (XV), 7-amino-N10- la -dimethylaminomethylen-9a-methoxy-N -methylmi tosan, som et bi-20 produkt i 30% udbytte, tic Rf = 0,40 (methylenchlorid/methanol 9:1).

NMR (pyridin dg, δ): 2,02 (s, 3H), 2,16 (dd, IH, 0=2, 5 Hz), 2,25 (s, 3H), 2,66 (d, IH, 0=5 Hz), 2,76 (s, 3H), 2,86 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 3,51 (dd, IH, 0=2, 12 Hz), 4,08 (dd, IH, 0=4, 10

Hz), 4,50 (d, IH, 0=10 Hz), 4,90 (t, IH, 0=10 Hz), 5,05 (bs), 25 5,43 (dd, IH, 0=4, 10 Hz), 8,70 (s, IH).

I IR (KBr) vmx, cm'1: 3430, 3330, 3270, 2940, 2960, 1690, j 1625, 1553, 1230, 1125.

UV (MeOH) Xmax/ nm: 358, 244 og 216.

Analyse beregnet for CjgHggNgOg: 30 C, 56,53; H, 6,20; N, 17,38.

Fundet: C, 54,68; H, 6,13; N, 16,59.

j 5

DK 161023 B

21

Eksempel 4 Forbindelse (IX) 9a-methoxy-7-[l-piperidinylmethylen]amino-N10-(l-piperidi- nylmethylen)mitosan N-(diethoxymethyl)piperidin, 3 ml, og mitomycin C, 200 mg, fik lov at reagere ved 60°C i 2,5 time i chloroform opløsning (3 ml). Produktet opnåedes i et udbytte på 27,6%, tlf Rf = 0,20 (methylenchlorid/methanol 20:1).

10 NMR (pyridin dg, S): 1,38 (bs, 12H), 2,20 (s, 3H), 2,80 (bs, IH), 3,24 (s, 3H), 3,00-3,40 (m, 5H), 3,40-3,80 (m, 5H), 4,13 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 4,45 (d, IH, J=12 Hz), 4,90 (bs, 2H), 5,12 (t, IH, J*10 Hz), 5,56 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 7,87 (s, IH), 8,70 (s, IH).

15 IR (KBr) vm. cm"1: 3300, 2950, 2870, 1680, 1630, 1610, max 1550, 1200, 1070.

UV (H,0) Amav, nm: 394 og 246.

ά ΙΪΙαΧ

Analyse beregnet for C27^36*W* C, 61,79; H, 6,87; N, 16,02.

20 Fundet: C, 61,01; H, 6,85; N, 15,34.

13 N -formylderivatet af den foregående forbindelse, forbindelse (VIII), Nla-formyl-9a-methoxy-7-[l-piperidinylmethylen]-amino-N^-il-piperidinylmethylenJmitosan opnåedes som en hovedkom-25 ponent, 43% udbytte, tlf Rf = 0,25 (methylenchlorid/methanol 20:1).

NMR (pyridin d5, i): 1,38 (bs, 12H), 2,23 (s, 3H), 3,00-3,40 (m, 4H), 3,23 (s, 3H), 3,40-3,90 (m, 6H), 4,07 (d, IH, J=4 Hz), 4,18 (dd, IH, J=ll, 4 Hz), 4,63 (d, IH), 4,90 (t, IH, J=ll Hz), 4,94 (bs, IH), 5,54 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 7,94 (s, IH), 8,71 (s, 30 IH), 9,08 (s, IH).

IR (KBr) v i cm'1: 2490, 2860, 1698, 1630, 1600, 1540, 1250, 1060.

UV (H20) Amax, nm: 394 og 247.

Analyse beregnet for C28^36^6°6: 35 C, 60,08; H, 6,52; N, 15,21.

Fundet: C, 59,99; H, 6,17, N, 15,07.

DK 161023 B

22

Eksempel 5 Forbindelse (X) 9a-methoxy-7-[(l-morpholino)methyl en]amino-N^-(l-morpholino--methylen)mitosan 5

En omrørt suspension af mitomycin C (220 mg, 0,6 mM) i chloroform (10 ml) og N-diethoxymethylmorpholin (4 ml) opvarmedes ved ca. 53°C i 42 timer. Reaktionsblandingen koncentreredes til en sirup under højt vakuum. En rå adskillelse ved flash-kromatografi 10 (methylenchlorid/methanol 25:1) foretoges til isolering af de grøn-farvede komponenter fra overskuddet af reagenser. De forenede grønne komponenter opløstes i 20 ml ethyl acetat og vaskedes med vand (3 x 20 ml). De kombinerede vaskevæsker gen-ekstraheredes med ethyl acetat (3 x 15 ml). Alle ethyl acetatfraktioner forenedes, 15 tørredes (Na2S04) og inddampedes til en mørkegrøn sirup, tic (methylenchlorid/methanol 10:1) deraf viste en særskilt grøn komponent ved Rf = 0,33 med adskillige grønne urenheder (Rf 0,35--0,40). Ved flash-kromatografi isoleredes komponenten ved Rf 0,33 (130 mg, 56,8%) som et mørkegrønt, amorft, fast stof, der karakte-20 ri seredes som forbindelse (X).

NMR (CDCL3, S): 1,91 (s, 3H), 2,80 (bs, IH), 3,13 (d, IH, J=2 Hz), 3,22 (s, 3H), 3,30-3,94 (m, 18H), 4,20 (d, IH, J=12 Hz), 4,40 (bs, IH), 4,54 (t, IH, J=10 Hz), 4,88 (dd, IH, J=10 Hz, 4 Hz), 7,74 (s, IH), 8,51 (s, IH).

25 IR (KBr) v. cm'1: 3300, 2970, 2920, 1680, 1625, 1550,

i lUuX

1235, 1070.

UV (MeOH) X, nm: 386 og 244.

ΠιαΧ

Analyse beregnet for C25H32N6°7: C, 56,78; H, 6,06; N, 15,90.

30 Fundet: C, 53,07; H, 6,03, N, 15,37.

j i i

DK 161023B

23

Eksempel 6 Forbindelse (XVI) 7-amino-N10-dimethylaminomethylen-9a-methoxymitosan 5 Mitomycin C (200 mg, 0,6 mM) opløstes i 10 ml chloroform og 2 ml methanol, Ν,Ν-dimethylformamid-dimethylacetal (0,64 ml, 4,8 mM) tilsattes, og opløsningen omrørtes ved ca. 50°C i 50 minutter. Tyndtlagskromatografi (methylenchlorid/methanol 90:10) viste spor af uomsat mitomycin C (Rf = 0,22) og to nye komponenter (Rf « 10 0,42 og 0,33, respektivt). Opløsningen koncentreredes under reduceret tryk til en sirup, der flash-kromatograferedes (25 g sil i kagel) under anvendelse af methylenchlorid/methanol (20:1) som eluerende opløsningsmiddel.

Den hurtigste komponent (Rf = 0,42) isoleredes som et grønt, 15 amorft, fast stof (60 mg, 22,5%) og identificeredes som forbindelse (V) ved dens NMR-spektrum (pyridin d5).

Den blå hovedkomponent (Rf = 0,33) isoleredes som et amorft, fast stof (148 mg, 63,3%) og karakteriseredes som forbindelse (XVI).

En analytisk prøve opnåedes ved fældning fra methylenchlorid og 20 n-pentan.

NMR (pyridin dg, S), 2,02 (s, 3H), 2,76 (bs, 4H), 2,86 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 3,28 (d, IH, J=4 Hz), 3,62 (dd, IH, J=2, 13 Hz), 3,94 (bs), 4,14 (dd, IH, J=4, 12 Hz), 4,56 (d, IH, J=13 Hz), 5,12 (t, IH, J=10 Hz), 5,52 (dd, IH, J=4, 10Hz).

25 IR (KBr) i/ , cm-1: 3430, 3320, 3280, 2930, 1675, 1615, 1650, 1230, 1115.

UV (H20) Amax, nm: 364, 244 og 219.

Analyse beregnet for cj8^23N5®5: C, 55,48; H, 5,91; N, 17,98.

30 Fundet: C, 54,70; H, 6,14; N, 17,95.

Eksempel 7 Forbindelse (XVII) 35 7,9a-dimethoxy-N10-dimethylaminomethylenmitosan

Mitomycin A (170 mg) anvendtes i stedet for mitomycin C i eksempel 1 og fik lov at reagere med N,N-dimethylformamid-di-

DK 161023 B

24 { methylacetal (0,6 ml) i chioroform/methanolopløsning (10:1) ved 50°C i 1 time. Det ønskede produkt opnåedes i 48% udbytte, tic Rf i =0,50 (methylenchlorid/methanol 9:1).

I NMR (pyridin dg, 8): 1,83 (s, 3H), 2,76 (bs, 4H), 2,86 (s, 5 3H), 3,22 (s, 3H), 3,28 (d, IH), 3,56 (dd, IH, J=2, 13 Hz), 4,02 (s, 3H), 4,10 (dd, IH, J= 4, 10 Hz), 4,24 (d, J=13 Hz), 5,10 (t, IH, J=I0 Hz), 5,50 (dd, IH, J=4, 10 Hz), 8,67 (s, IH).

IR (KBr) v . cm-1: 3300, 2930, 1675, 1655, 1625, 1500,

maX

1235, 1120.

10 UV (H20) Xmax, nm: 530, 316 og 244.

Analyse beregnet for cigH24N4°6: C, 56,39; H, 5,94; N, 13,85.

Fundet: C, 56,51; H, 5,92; N, 13,71.

Ta 15 N -formylderivatet af forbindelse (XVII) opnåedes som forbindelse (XVIII), 7,9a-dimethoxy-N10-dimethylaminomethylen-Nla-for-mylmitosan i 16,5% udbytte, tic Rf = 0,61 (methylenchlorid/methanol 9:1).

NMR (pyridin dg, 8): 1,88 (s, 3H), 2,76 (s, 3H), 2,85 (s, 20 3H), 3,54 (d, IH), 3,62 (bs, IH), 4,05 (s, 3H), 4,05 (s, 3H), 4,05 (bs, IH), 4,14 (dd, IH, J=4, 12 Hz), 4,40 (d, IH, J=13 Hz), 4,86 (t, IH, J=12 Hz), 5,42 (dd, IH, J=4, 12 Hz), 8,66 (s, IH), 9,08 (s, IH).

25 Eksempel 8

Forbindelse (XIX) 7-(dimethyl ami nomethyl en)ami no-9a-methoxymi tosan

Til forbindelse (V) (600 mg, 1,35 mM) opløst i methanol (10 30 ml) sattes aminodiphenylmethan (2,2 ml, 10,8 mM), og den resulterende opløsning omrørtes ved 54°C i 4 timer. Reaktionsforløbet måltes ved tic (methylenchlorid/methanol 90:10). Ved slutningen af de 4 timer var udgangsmaterialet (Rf = 0,35) forsvundet, og en ny grøn hovedzone (Rf = 0,29) forekom i stedet. Opløsningen koncen-35 treredes ved reduceret tryk, og den resulterende sirup flash-kroma-tograferedes (25 g sil i kagel) under anvendelse af methylenchlorid/-ethanol 20:2 som elueringsmiddel. Fraktioner indeholdende den grønne komponent (Rf = 0,29) samledes, tørredes (Na2S0^) og kon-

DK 161023B

25 centreredes. Forbindelse (XIX) opnåedes som et amorft, fast stof (215 mg, 41%).

NMR (pyridin dg, S): 2,18 (s, 3H), 2,70 (bs, IH), 2,80 (s, 3H), 2,88 (s, 3H), 3,08 (bs, IH), 3,24 (s, 3H), 3,56 (bd, IH, 5 J=12 Hz), 4,00 (dd, IH), 4,44 (d, IH, J=12 Hz), 5,06 (t, IH, J*10

Hz), 5,56 (dd, IH, J=10, 4 Hz), 7,58 (bs, 2H), 7,88 (s, IH).

IR (KBr) v. cm-1: 3300-3450, 2960-2910, 1715, 1620, 1535, ΥΠαΧ 1050.

UV (H20) W nm: 390 og 226· 10 Analyse beregnet for cj8^23N5°5: C, 55,48; H, 5,91; N, 17,98.

Fundet: C, 54,83; H, 5,67; N, 16,90. la Når N -formylderivatet, forbindelse (VI), substitueredes som 15 udgangsmateriale for forbindelse (V) i eksempel 8, men under anvendelse af stuetemperatur i 20 timer som reaktionsbetingelser, fremstilledes forbindelse (XIX) i det væsentlige på samme måde og med samme udbytte.

20 Eksempel 9

Forbindelse (XX) la 7-(dimethylaminomethylen)amino-9a-methoxy-N -methylmitosan

Forbindelse (XIV), 1 g, (2,18 mM) opløstes i methanol (20 ml), 25 aminodiphenylmethan (3,5 ml, 17,18 mM) tilsattes, og den resulterende opløsning omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer og ved 40°C i 5 timer. Tyndtlagskromatografi (CHgClg/MeOH 90:10) af reaktionsblandingen viste, at næsten al udgangsmaterialet (Rf = 0,55) var blevet forbrugt, og at en ny grøn hovedzone (Rf = 0,48) var kom-30 met frem. Oparbejdning på tilsvarende måde som i eksempel 8 gav forbindelse (XX) som et amorft, fast stof (350 mg). Yderligere rensning skete ved flash-kromatografi (7 g, sil i kagel) under anvendelse af CHgClj/MeOH (250 ml, 96/4 vol/vol) og bundfældning af det resulterende faste stof (Rf = 0,48) fra methylenchlorid (5 ml) 35 og hexan (50 ml), hvilket gav analytisk ren (XX) (314 mg, 35,7%) som et fast stof.

DK 161023 B

26 NMR (CDC13, 5): 1,93 (s, 3H), 2,26 (bs, IH), 2,26 (s, 3H),3,06 (s, 3H), 3,08 (bs, IH), 3,10 (s, 3H), 3,20 (s, 3H), 3,46 (bd, IH, J=12, 1 Hz), 3,58 (dd, IH, J=4, 10 Hz), 4,17 (d, IH, J=12 Hz), 4,38 (t, IH, J=10 Hz), 4,68 (m, 2H), 4,76 (dd, IH, J=4, 5 10 Hz), 7,72 (s, IH).

I IR (KBr) μη8χ/ cm-1: 3440, 3350, 3190, 3020, 2940, 2910, 1725, 1630, 1550, 1055.

UV (MeOH) Xmax, nm: 386 og 231.

Analyse beregnet for CigH25N505: 10 C, 56,53; H, 6,20; N, 17,36.

Fundet; C, 53,90; H, 5,13; N, 15,81.

Eksempel 10 15 Forbindelse (XI) 7-(n-propyl)ami no-9a-methoxymi tosan

Forbindelse (V) (330 mg, 0,74 mM) opløstes i vandfri methanol (10 ml), og n-propylamin (1,0 ml) tilsattes. Reaktionsblandingen 20 omrørtes i 6 timer ved stuetemperatur og i 16 timer ved 0°-4°. Opløsningsmidlet og overskydende reagens inddampedes under reduceret tryk, og remanensen flash-kromatograferedes under anvendelse af si li kagel som adsorbent. Den ved eluering med methylenchlorid/-methanol 30:1 opnåede blå komponent (Rf = 0,40) gen-fældedes fra 25 methylenchlorid med hexan til dannelse af forbindelse (XI) som et ; amorft, gråt pulver (125 mg, 44,5%).

NMR (pyridin d5, 8): 0,80 (t, 3H), 1,42 (m, 2H), 2,11 (s, 3H), 2,74 (bs, IH), 3,12 (bs, IH), 3,22 (s, 3H), 3,36 (q, 2H), 3,60 (d, IH, J=12 Hz), 3,96 (dd, IH, J-ll Hz, 4 Hz), 4,54 (d, 30 IH, J=12 Hz), 5,00 (m, 3H), 5,36 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 6,90 (t, IH).

IR (KBr) j/ , cm"1: 3440, 3300, 2960, 2940, 1715, 1630, 1600, 1550, 1510, 1220, 1060.

UV (H20) W nm: 372 og 222* 35 Analyse beregnet for CjgHg^Og: C, 57,40; H, 6,38; N, 14,88.

Fundet: C, 57,28; H, 6,41; N, 14,08.

5

DK 161023 B

27

Eksempel 11 Forbindelse (XII) 7-(2-hydroxyethyl)amino-9a-methoxymitosan

Forbindelse (V) (330 mg, 0,74 mM) opløstes i vandfri methanol (5 ml), og ethanolamin (2 ml) tilsattes. Reaktionsblandingen omrør-tes ved stuetemperatur i 2 timer og fortyndedes dernæst med vand (50 ml) og ekstraheredes med ethyl acetat (5 x 60 ml). De forenede 10 ethyl acetatekstrakter tørredes (Na2S04) og koncentreredes til en blålig-purpurfarvet remanens, der ved søjlekromatografi under anvendelse af 10% methanol i methylenchlorid og koncentrering af de samlede fraktioner indeholdende den blå forbindelse gav 105 mg (37%) af forbindelse (XII) som et amorft, fast stof.

15 NMR (pyridin d5, δ): 2,14 (s, 3H), 2,81 (bs, IH), 3,18 (d, IH, J-4 Hz), 3,24 (s, 3H), 3,65 (dd, IH, 0=2, 12 Hz), 3,70-4,20 (m, 5H), 4,52 (D, IH, J=13 Hz), 4,96 (t, IH, J=12 Hz), 7,38 (t, IH), 7,58 (bs).

IR (KBr) v / cm"1: 3300-3500, 2930, 1710, 1630, 1600, 1540, 20 1510, 1200, 1055.

UV (H20) Amax, nm: 371 og 221.

Analyse beregnet for ci7H22N4°6: C, 53,92; H, 5,82; N, 14,80.

Fundet: 25 C, 51,30; H, 5,88; N, 14,80.

Eksempel 12 Forbindelse (XIII) 7-[2-benzylthioethyl]amino-9a-methoxymitosan 30

Forbindelse (V) (200 mg, 0,45 mM) opløstes i methanol (2 ml), S-benzyl-2-aminoethanthiol (0,5 ml) tilsattes, og opløsningen omrør-tes ved stuetemperatur i 16 timer. Den ved afdampning af opløsningsmidlet ved reduceret tryk opnåede remanens flash-kromatogra-35 feredes (40 g, sil i kagel) under anvendelse af 6% methanol/methylen-chlorid (400 ml) som elueringsmiddel. Den blå komponent (Rf cirka 0,5 i 10% MeOH/CH2Cl2) isoleredes som et amorft, fast stof (65 mg, 29,8%). Dens spektraldata (NMR, IR, UV og massespek.) var i

DK 161023 B

28 overensstemmelse med den tildelte struktur.

Analyse beregn, for C24^28N4°5S: C, 59,49; H, 5,82; N, 11,56.

Fundet: 5 C, 59,72; H, 5,94; N, 11,08.

j

Eksempel 13

Fremstilling af 0 oconh-

Il ,J

10 m2 Y\ "Ο**! Ϊ »A.

O i_U® (A) Til en opløsning af isopropylformimidat-hydrochlorid (1 mmol) i 15 dimethyl formamid (DMF), 2 ml, sættes langsomt diisopropyl-ethylamin (2,1 mmol) ved 0°C under en nitrogenatmosfære. Til den resulterende opløsning sættes dråbevis Ø-trimethylsilyl-ethylchlorformiat ved 0°C. Den resulterende klare opløsning kaldes opløsning A.

20 (B) En opløsning af mitomycin C (1 mmol) i 5 ml DMF sættes til en suspension af natriumhydrid (1,5 mmol) i 3 ml DMF. Opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 20 minutter og afkøles til -40°^-50°C før tilsætning af opløsning A (ovenfor). Opløsningen holdes ved -40°C 1 time og henstår dernæst til opvarmning 25 til stuetemperatur. Efter henstand ved stuetemperatur i cirka i 6-18 timer fortyndes reaktionsblandingen med CHgCl2 og filtre res. Den efter inddampning af filtratet opnåede faste remanens kromatograferes på silikagel til isolering af den amidino-beskyt-tede titel forbindel se.

30 (C) Den amidino-beskyttende gruppe på det foregående mellemprodukt fjernes ved hjælp af den offentliggjorte procedure ifølge Carpino og Tsao (J. Chem. Soc. Chem. Comm. 358 (1978)) til dannelse af usubstitueret amidino-titelforbindel se.

DK 161023 B

29

Eksempel 14 Fremstilling af O °™2

Hs_M I

5 »«3 YV-p«3 o l_L-'-1® (A) Til en opløsning af isopropylformimidat-hydrochlorid (1 mmol) i 10 DMF (2 ml) sættes langsomt di isopropyl ethylamin (21 mmol) ved 0°C under en nitrogenatmosfære. Til den resulterende opløsning sættes methyl iodid ved 0°C. Den resulterende opløsning kaldes opløsning B.

(B) Den i eksempel 13(B) angivne procedure gentages under an-15 vendel se af opløsning B i stedet for opløsning A til opnåelse af ti telforbi ndel sen.

Eksempel 15 ?iCS3>2 . _ ”^j,·^· ...« /“vvc«», ^ e ’ 3 jj m (CH3)2N=CHC1C1

25 Mitcrnycin C

Forbindelse (XIX)

En 0,5 M opløsning af N,N-dimethylchlormethyleniminiumchlorid fremstilledes ved dråbevis tilsætning af oxalylchlorid (1,57 g, 12,5 mmol) ved 0°C til en opløsning af DMF (915 mg, 12,5 mmol) i 25 ml 30 CHC13 efterfulgt af omrøring ved stuetemperatur i 30 minutter.

Separat sattes en opløsning af mitomycin C (334 mg, 1 mmol) i 5 ml DMF til en suspension af NaH (36 mg, 1,5 mmol) i 3 ml DMF. Opløsningen omrørtes ved stuetemperatur i 20 minutter og afkøledes til -40°*/-50°C, og den ovennævnte opløsning af N,N-dimethylchlor-35 methyleniminiumchlorid (3 ml, 1,5 mmol) tilsattes dernæst. Yderligere NaH (18 mg, 0,75 mmol) tilsattes efter 10 minutters omrøring ved -40°C. Opløsningen holdtes ved -40°C i 1 time og fortyndedes dernæst med CH2C12 og filtreredes. Den efter inddampning af filtra- 30

DK 1 β1023 B

tet opnåede remanens kromatograferedes ved tyndtlagskromatografi (tic) på silikagel (10% CH30H-CH2C1 som elutant). Ekstraktion af det grønne hovedbånd gav 78 mg (43% baseret på den genvundne mitomycin C) af et amorft, fast stof, hvis NMR-spektrum og tlc-5 -opførsel var identiske med de for forbindelse (XIX) fremstillet i eksempel 8. Ekstraktion af det purpurfarvede bånd gav 150 mg mitomycin C.

Eksempel 16 10 7(l-methyl-2-(H)-pyridinyliden)amino-9a-methoxymitosan cx V 9 (11 μ H "vVC? ' IxSc -£—> >AV>.

A \a ~ 20

Til en blanding af miomycin C (242 mg, 0,725 mmol) og og NaH (43,5 mg, 1,81 mmol) sattes 4 ml DMF. Efter omrøring i 15 minutter i tilsattes 2-chlor-l-methylpyridiniumiodid (370 mg, 1,45 mmol) ved stuetemperatur. Opløsningen omrørtes i 1,5 time og fortyndedes 25 dernæst med ethyl acetat (EtOAc) og filtreredes. Den efter inddamp-ning af filtratet opnåede remanens kromatograferedes (tic) på silikagel (5% CH30H-CH2C1g som elutant). Det mindre produkt (12 mg) var forbindelse (XIX) (eksempel 8). Hovedproduktet (75 mg) rensedes yderligere ved hjælp af sil i kagel-tic (10% CH^OH-CHgCl2) til 30 dannel se af 6 mg (2%) af titel forbindel sen.

NMR (pyridin dg, S): 2,11 (s, 3H), 2,76 (bs, IH), 3,20 (m, IH), 3,26 (s, 3H), 3,49 (s, 3H), 3,63 (dd, IH, J=13, 1 Hz), 4,01 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 4,51 (d, IH, J=13 Hz), 5,10 (t, IH, J=10 Hz), 5,43 (dd, IH, 0=10, 4 Hz), 5,99 (dt, IH, 0-9, 35 2 Hz), 6,09 (dd, IH, J= 9, 1 Hz), 6,95 (dd, IH, J=9, 7, 2 Hz), 7,32 (dd, IH, 0=7, 1 Hz).

ί

DK 161023 B

31

Eksempel 17 7-[(methyl ami nomethylen)ami no]-9a-methoxymi tosan

CH NH

\=N fl /-°°°¾ 5hn f) (DU VYVM3 10 Natriumhydrid (12 mg, 0,5 mmol) sættes under en nitrogenatmosfære til en opløsning af mitomycin C (167 mg, 0,5 mmol) i 2 ml hexamethylphosphoramid. Til denne opløsning sættes N-methylformi-midoylchlorid (19 mg, 0,25 mmol, N.H. Bosshard og H. Zollinger,

Helv. Chim. Acta, 42, 1659 (1959)). Opløsningen omrøres ved stue-15 temperatur i 10 minutter, og dernæst tilsættes NaH (6 mg, 0,25 mmol) og N-methylformimidoylchlorid (9,5 mg, 0,13 mmol). Efter omrøring i 6-12 timer fortyndes opløsningen med ethylacetat og filtreres. Afdampning af opløsningsmidlet efterfulgt af kromatografisk rensning af remanensen giver titel forbinde!sen.

20

Eksempel 18 Forbindelse (XXI) 9a-methoxy-7-(1-morpholi nomethyl en)ami nomi tosan 25 \ 0 æoNHj C}' fe"1

O-7 ®3 ϋ I_[,'NH

30

Til mitomycin C (600 mg, 1,8 mM) suspenderet i chloroform (30 ml) sattes 4-diethoxymethylmorpholin (12,5 ml), og den resulterende suspension opvarmedes ved 58°C i 48 timer. Ved afslutningen af de 48 timer viste tic (20% MeOH i CHgCl2)* at reaktionen var ufuld-35 stændig. Opløsningen koncentreredes under reduceret tryk, og til den resulterende sirup sattes vand (100 ml). Efter omrøring i 20 minutter ekstraheredes den mørkegrønne opløsning med methylen-chlorid (5 x 50 ml), og den kombinerede ekstrakt tørredes og kon-

DK 161023B

32 centreredes til en sirup. Til denne sirup, i methanol (20 ml), sattes aminodiphenylmethan (6,5 ml), og den resulterende opløsning om-rørtes ved 30-35°C i 18 timer. Tyndtlagskromatografi (20% MeOH i CH2C12) viste én grøn hovedzone med en mindre, langsommere, 5 purpurfarvet zone. Opløsningen koncentreredes under reduceret tryk, og den resulterende sirup rensedes ved hjælp af den sædvan-i lige flash-kromatografi teknik til opnåelse af titel forbindel sen som et mørkegrønt, amorft, fast stof (75 mg, 10%). En analytisk prøve opnåedes ved udfældning fra en methylenchloridopiøsning med i 10 n-hexan.

I NMR (pyridin dg, 6): 2,16 (s, 3H), 2,76 (dd, IH, J=5 og 1

Hz), 3,16 (d, IH, J=5 Hz), 3,24 (s, 3H), 3,28-3,80 (m, 10H), 4,02 (dd, IH, J=10 og 4 Hz), 4,40 (d, IH, J=12 Hz), 5,06 (t, IH, 0=10 Hz), 5,46 (dd, IH, J=10 og 4 Hz), 7,90 (s, IH).

15 IR (KBr) y , cm"1: 3360, 3280, 2960, 2920, 1720, 1600, j 1520, 1230, 1050.

UV (MeOH) \mx: 384 og 234.

Analyse beregnet for C20H25N5°6: C, 55,64; H, 5,80; N, 16,23.

20 Fundet: C, 55,07; H, 5,55; N, 15,88.

i

Eksempel 19

Forbindelse (XXII) 7-(1-pyrrol i di nylmethyl en)ami no-9a-methoxymi tosan

DK 161023 B

33

. O

XX5c —> (2,r\© Λ o \J-m

o N— In =chci cjP

En 0,5 molær opløsning af pyrrolidinylchlormethyleniminium-chlorid fremstilledes ved dråbevis tilsætning af oxalylchlorid (3,17 15 g, 25 mmol) ved 0°C til en opløsning af 1-formylpyrrol idin (2,48 g, 25 mmol) i 50 ml CHClg, efterfulgt af omrøring ved stuetemperatur i 30 minutter. Natriumhydrid (24 mg, 1 mmol) tilsattes separat under nitrogenatmosfære til en opløsning af mitomycin C (334 mg, 1 mmol) i 3 ml 1-formylpyrrolidin. Efter omrøring i 20 minutter ved stue-20 temperatur afkøledes opløsningen til -40°/v-50°C, og den ovenfor fremstillede iminiumsaltopløsning (1 ml, 0,5 mmol) tilsattes. Til denne blanding sattes skiftevis, med 10 minutters intervaller, 12 mg (0,5 mmol) NaH, 0,5 ml (0,25 mmol) af iminiumsaltopløsningen, 6 mg (0,25 mmol) NaH, 0,25 ml (0,125 mmol) af iminiumsaltopløsningen, 25 og endelig 3 mg (0,125 mmol) NaH og 0,125 ml (0,063 mmol) af iminiumsaltopløsningen. Efter omrøring i 30 minutter ved -30°C opvarmedes blandingen til stuetemperatur. Den fortyndedes med ethyl acetat, og det uorganiske salt frafiltreredes. Den opnåede remanens kromatograferedes efter afdampning af opløsningsmidlet 30 ved tyndtlagskromatografi på silikagel (10% CHgOH-CH^l^). Ekstraktion af det grønne bånd gav 120 mg (15% udbytte) af titel -forbindelsen.

NMR (pyridin dg, S): 1,58 (m, 4H), 2,29 (s, 3H), 2,73 (m, IH), 3,06-3,50 (m, 8H), 3,59 (dd, IH, J=13, 1 Hz), 4,03 (dd, IH, 35 J=10, 4 Hz), 4,44 (d, IH, J=12 Hz), 5,05 (t, IH, J=10 Hz), 5,45 (dd, IH, J-10, 4 Hz), 8,04 (s, IH).

IR (KBr) V, cm"1: 3420, 3280, 2960-2870, 1715, 1625, 1560, ΠΙαΧ 1300, 1055.

Eksempel 20 7-[N-methyl-N-(methyliminojmethyl]amino-9a-methoxymitosan

DK 161023 B

34 O 0 5 ch o -ccrai, η ®3 ° /^0csh, ! HN-iTT V001! NaH ^ JOCH, lLsn'. -* 3 1 Γ)ν Μ N—l'1® (2) CH3N=Cæi qj /γ^Ν^,,ΝΙ^

3 O

10 Fremgangsmåden ifølge eksempel 17 gentages med anvendelse af 9a-methoxy-7-(N-methylamino)mitosan (Matsui et al., The Journal of Antibiotics, XXI, 189-198 (1968)) i stedet for mitomycin C i lignende molær mængde.

15 Eksempel 21

Forbindelse (XXIII) 7-[1-(dimethyl amino)ethyl iden]amino-N^-[l-(dimethylamino)ethyl i-den]-9a-methoxymitosan 9 /CH3

20 CH 0'KS=S

S—» fi J NN(CH3)2 .

i (CH-i.sK X/\_—rz Γχ°εΗ3

25 CH3 /|T^I|//| *'HH

o — 1«''

En suspension af 600 mg (1,79 mM) mitomycin C i 2 ml methanol fremstilledes og behandledes med 3 ml N,N-dimethylacetamid-30 dimethyl acetal. Suspensionen opvarmedes ved 75-80°C under omrøring i 2 timer. På dette trin viste tic (Cf^Clg/methanol 10:1), at næsten al mitomycin C var blevet konsumeret ved reaktionen. Produktet fremtrådte som en grøn zone. Opløsningsmidlet og flygtige materialer fjernedes ved koncentrering af reaktionsblandingen til 35 tørhed ved reduceret tryk, hvilket gav en sirup, der opløstes i methylenchlorid og fyldtes på en sili kagel søjle (40 g sil i kagel), og søjlen udvikledes med 1% methanol i methylenchlorid (200 ml), 2% methanol i methylenchlorid (200 ml) og 5% methanol i methylenchlorid i

35 DK 161023 B

(400 ml). Fraktionerne indeholdende den grønne zone, repræsenterende produktet, forenedes og koncentreredes til et amorft, fast stof, der vejede 110 mg (13% udbytte). Dette materiale opløstes i 2 ml acetone og bundfældedes fra opløsningen ved tilsætning af hexan.

5 Produktet opsamledes ved filtrering.

Analyse beregnet for ^jl^NgOg: C, 58,46; H, 6,83; N, 17,79.

Fundet: C, 58,89; H, 6,89; N, 17,64.

10 UV (MeOH) λ^, nm: 235, 364.

IR (KBr) μ , cm"1: 3440, 3295, 2925, 1770, 1660, 1620, 1580, 1550, 1300, 1055.

^ NMR-spektret i pyridin dg stemmer overens med strukturen af titel forbindel sen.

15

Eksempel 22 Forbindelse (XXIV) 7-[1-(d i methyl ami no)ethyli denami no)-9a-methoxymi tosan

20 0 O

Π U

ά=Ν II ,CH ocnh2 (CH-) 2n^ ^TTl--T ' x°CH3 25 «jwi ip«

En opløsning af 100 mg (0,21 mM) af forbindelse (XXIII) i 2 ml chloroform sattes til 2 ml ami nodiphenylmethan, og opløsningen opvarmedes ved ca. 55-60°C i 24 timer. På dette trin forblev spor-30 mængder af forbindelse (XXIII) i reaktionsblandingen, men den koncentreredes ikke desto mindre, og remanensen kromatograferedes over neutralt aluminiumoxid under anvendelse af gradienteluering begyndende med methylenchlorid og sluttende med methanol/methy-lenchlorid 2,5:1. Den grønne hovedzone i soleredes som et amorft, 35 grønt, fast stof, vægt 25 mg (29,4% udbytte). Dette materiale rensedes ved opløsning i acetone og tilsætning af hexan til acetoneopløsningen, indtil bundfældning forekom. Produktet opsamledes ved filtrering og tørredes.

DK 161023B

36

Analyse beregnet for C25H32N6°5: C, 56,58; H, 6,20; N, 17,37.

Fundet: C, 55,71; H, 6,34; N, 15,23.

5 UV (H20) Amax, nm: 374, 230 (skulder) IR (KBr) v / cm-1: 3420, 3350, 3280, 2920, 2710, 1610, 1540, 1300, 1050.

NMR-spektret i pyridin dg stemmer overens med strukturen.

10 Eksempel 23

Forbindelse (XXV) 7-[(l-methyl-2-pyrrolidiny1iden)amino]-N10-[(l-methyl-2-pyrrolidi nyli den) ami no]-9a-methoxymi tosan CH3 TjOCH3 CH3

' CH j['-NH

20 O L-^ 2,2-dimethoxy-l-methyl pyrrol idin (H. Eilingsfeld et al.,

Angew. Chem., 72, 836 (1960)), 1,5 g (10,3 mM) og 280 mg mitomycin C (0,34 mM) i 20 ml methanol opvarmedes ved 55° i fem timer.

25 Reaktionsblandingen afprøvedes ved tyndtlagskromatografi på en alumi niumoxidplade under anvendelse af methylenchlorid/methanol 97:3 som opløsningsmiddel, tic viste en stor grøn plet, der repræsenterede produktet, og en lille blå plet, der repræsenterede mitomycin C udgangsmateriale. Opløsningsmidlet fjernedes ved desti 11a- 30 tion i vakuum ved 40°C, og remanensen opløstes i methylenchlorid og fyldtes på en 4,5 cm søjle indeholdende 150 g aluminiumoxid.

Eluering med 50 ml methylenchlorid efterfulgtes af 600 ml 1% methanol i methylenchlorid. Store urenheder fjernedes, men ingen rene fraktioner i soleredes. Det kombinerede elueringsmiddel koncentrere- 35 des ved destillation ved 20°C til en olieagtig remanens, der tilsyneladende indeholdt noget 2,2-dimethoxy-l-methylpyrrolidin. Dette materiale kromatograferedes igen på en aluminiumoxidsøjle (25 g aluminiumoxid) under anvendelse af 200 ml methylenchlorid efter- j

DK 161023 B

37 fulgt af 100 ml 1% methanol i methylenchlorid. Dette resulterede i fjernelse af 2,2-dimethoxy-l-methylpyrrolidinen og resulterede i et antal fraktioner indeholdende mindre urenheder og adskillige rene fraktioner, der var bekræftet af tic (én grøn plet), og som ud-5 gjorde det ønskede produkt, udbytte 53 mg.

Analyse beregnet for C25H32N6°5'0,85 H20: C, 58,66; H, 6,64; N, 16,42.

Fundet: C, 58,63; H, 6,46; N, 16,50.

10 UV (MeOH) λ^, nm: 354, 239.

IR (KBr) 1/ , cm-1: 3300, 3220, 2940, 1660, 1620, 1550, 1290,

maX

1055.

^ NMR-spektret i pyridin d5 stemmer overens med strukturen af titel forbi ndel sen.

15

Eksempel 24 7-[(1-methyl-2-pyrroli di nyli den)ami no]-9a-methoxymi tosan 20 L Jl „ .CH2OCNH2 ca3 ' T^och3 CH3 25

En opløsning af 80 mg (0,16 mM) af forbindelse (XXV) og 0,48 ml n-butylamin i 15 ml chloroform opvarmedes under tilbagesvaling i 48 timer, tic (methanol/methylenchlorid, 2% på aluminiumoxid) udviste en stor, grøn plet og en lille, foranliggende blå plet samt en 30 lille, efterfølgende rød plet, der alle svarede til udgangsmaterialet. Reaktionsopløsningen fyldtes på en søjle indeholdende 50 g aluminiumoxid, og elueredes med 200 ml 1% methanol i methylenchlorid efterfulgt af 400 ml 2% methanol i methylenchlorid. De fraktioner, som indeholdt en enkelt stor grøn komponent, som vist ved tic, kombi-35 neredes og koncentreredes til en remanens af det ønskede produkt, vægt 24 mg.

38

DK 1610 2 3 B

NMR (pyridin dg, S): 1,72 (q, 2H), 2,04 (s, 3H), 2,16 (q, 2H), 2,72 (bs, IH), 2,84 (s, 3H), 3,12 (m, 3H), 3,24 (s, 3H), 3,60 (dd, IH, J=14, 2 Hz), 4,00 (dd, IH, J-12, 6 Hz), 4,40 (d, IH, J=14 Hz), 5,04 (t, IH, J=14 Hz), 5,38 (dd, IH, J=12, 6 Hz), I 5 7,48 (bs, 2H).

i

Eksempel 25 Forbindelse (XXVI) 7-[(methoxyamino)methylen]amino-9a-methoxymitosan 10 H n OCONH- >=* χ y CH-jONH ' f'l-x'

LixH3 1 r

15 CKL * fj „NH

w # O -^

En opløsning af forbindelse (XIX), 660 mg (1,7 mM), i 10 ml methanol fremstilledes, og 170 mg (2,0 mM) methoxyamin-hydrochlo-20 rid sattes dertil. Opløsningen omrørtes ved 10°C i 3 timer og ved stuetemperatur i 2 timer, tic viste kun et spor af uomsat forbindelse (XIX). Et sort bundfald, der var dannet under henstand, opsam-| ledes og vaskedes med acetone, udbytte af ønsket produkt 380 mg (57%).

25 Analyse beregnet for CjjHgjNgOg: C, 52,19; H, 5,40; N, 17,90.

Fundet: C, 51,64; H, 5,40; N, 17,83.

UV (MeOH) λ_. nm: 376, 242.

illaX -j 30 IR (KBr) vmx, cm"1: 3440, 3250, 3140, 2920, 1730, 1645, 1615, 1560, 1450, 1320, 1050.

^ NMR-spektret i pyridin dg er i overensstemmelse med strukturen af enten titel forbindel sen eller dens tautomer ved C-7, dvs.

35 >-N—I

ch3on X *

Eksempel 26

Forbindelse (XXVII) 7-[(benzyloxyamino)methyl en]amino-9a-methoxymitosan

DK 161023 B

39 H O OCCNH, 5 )=N fi J 2 C6H5CH20n/ Nfjj-T^cBj -'>ra 10 o -

En opløsning af forbindelse (XIX), 100 mg (0,26 mM) i 2 ml methanol indeholdende 0,5 ml triethylamin fremstilledes, og 400 mg (2,5 mM) 0-benzylhydroxylamin-hydrochlorid sattes dertil. Reaktionen tillodes at fortsætte i 2,5 timer ved stuetemperatur, tic 15 (CHgClg/methanol 10:1) viste en stor orangebrun zone før den grønne zone, idet den sidstnævnte svarede til forbindelse (XIX). Reaktionsblandingen koncentreredes til en remanens, der flash-kro-matograferedes over si 1 i kagel (20 g) under anvendelse af CH2C1^/-methanol 20:1 som det eluerende opløsningsmiddel. Den store brune 20 zone, der udgjorde det ønskede produkt, opsamledes som et amorft, fast stof, der vejede 80 mg (65,6% udbytte).

Analyse beregnet for ^23^*25^5^6: C, 59,10; H, 5,35; N, 14,97.

Fundet: 25 C, 58,43; H, 5,48; N, 14,62.

UV (MeOH λ__ν/ nm: 376, 245, 209.

ΠΙαΧ i IR (KBr) vmx, cm"1: 3460, 3300, 2945, 2920, 1745, 1720, 1570, 1275, 1220, 1060.

*H NMR-spektret i pyridin dg er i overensstemmel se med struk-30 turen af enten titel forbindel sen eller dens tautomer ved C-7, dvs.

VM

CgH5CH2ON

35 Uomsat udgangsmateriale, forbindelse (XIX), der vejede 10 mg, blev genvundet.

Eksempel 27

Forbindelse (XXVIII) 7-(l,3-dimethyl-2-imidazolidinyliden)-amino-9a-methoxymitosan

DK 161023 B

40 5 T*3 s l o n?h2ocnh2 L )=N\AX aOCH- • I Γ

Mitomycin C, 0,34 g (1 mmol) opløses i 5 ml l,3-dimethyl-2-imidazolidon, og 0,1 g natriumhydrid (50% i olie, 2,08 mmol) sættes dertil ved stuetemperatur. Blandingen holdes ved stuetemperatur i 15 20 minutter og afkøles dernæst i et is-salt bad (-15°C). Blandingen holdes i 10 minutter ved denne temperatur, og dernæst sættes 0,65 ' g (2 mmol) 2-chlor-l,3-dimethyl-4,5-dihydro-(3H)-imidazoliminium- chlorid dertil. Det holdes ved -15°C i 1 time og fortyndes dernæst med ethylacetat og kromatograferes på en aluminiumoxidsøjle. Søjlen 20. fortyndes med methylenchlorid, efterfulgt af methylenchlorid indeholdende 2% vol/vol methanol. En grøntfarvet fraktion opnås, der består af det ønskede produkt, som yderligere renses ved kromato- i grafi på aluminiumoxid under anvendelse af methylenchlorid indeholdende 10% vol/vol methanol, udbytte 20 mg (5%).

25 Analyse beregn, for ^O^WW1"2/4 H20: C, 53,03; H, 6,34; N, 18,55.

Fundet: C, 52,68; H, 6,21; N, 18,15.

NMR (pyridin-dg, δ): 2,32 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,59 (s, 3H), 2,74 (m, IH), 3,03-3,32 (m, 5H), 3,26 (s, 3H), 3,66 (bd, 30 IH, J=12 Hz), 4,02 (dd, IH, J=ll, 4 Hz), 4,75 (d, IH, J-12 Hz), 5,09 (bt, IH, J=ll Hz), 5,44 (dd, IH, J-ll, 4 Hz).

IR (KBr): 3400, 3280, 2930, 1700, 1610, 1480, 1330, 1055 cm'1.

UV (MeOH, Amax): 600, 375, 252 (sh), 222 nm.

2 i

DK 161023 B

41

Eksempel 28 Forbindelse (XXIX) 7-[(1,3-dimethyltetrahydropyrimidinyliden)amino]-9a-methoxymitosan

GH3 O

o M

d o v?h2ocsh2 ^Vvr·

Natriumhydrid (50% oliedispersion, 200 mg, 4,2 mmol) sattes under nitrogen til en opløsning af mitomycin C (680 mg, 2 mmol) i 8 ml l,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro(lH,3H)-2-pyrimidinon. Blandin-15 gen holdes i 20 minutter ved stuetemperatur og afkøles dernæst til 25°C. 2-chlor-l,3-dimethyl-2,3,4,5-tetrahydro-pyrimidiniumchlorid, 0,73 g (4 mmol) sattes dertil, og blandingen holdes dernæst ved -25°C i 3 timer. Den fortyndes dernæst med ethyl acetat og 2 ml methanol. Blandingen fyldes uden yderligere behandling på en tør 20 aluminiumoxid kromatografisk søjle og elueres først med methylen-chlorid og dernæst med 2% vol/vol methanol/methylenchlorid, hvilket giver det ønskede produkt, 0,35 g (39,5% udbytte), smp. 138-140°C.

Analyse beregnet for C21H27N6°5*H20: C, 54,65; H, 6,33; N, 18,21.

25 Fundet: C, 54,78; H, 6,18; N, 18,21.

NMR (pyridin-djj, S): 1,80 (m, 2H), 2,42 (s, 3H), 2,52 (s, 3H), 2,64 (s, 3H), 2,76 (m, IH), 2,90-3,30 (m, 5H), 3,26 (s, 3H), 3,74 (d, IH, J=12 Hz), 4,05 (dd, IH, J-ll, 4 Hz), 4,97 (d, IH, 30 J=12 Hz), 5,09 (t, IH, J=ll Hz), 5,41 (dd, IH, J-ll, 4 Hz).

IR (KBr): 3430, 3280, 2930, 1710, 1570, 1480, 1450, 1350, 1050 cm"*.

UV (MeOH, λ): 635, 377, 264 (sh), 223 nm. max

Eksempel 29

Forbindelse (XXX) 7-(tetramethyldi ami nomethyl en)ami no-9a-methoxymi tosan

DK 161023 B

42 c (CH '),N O ,-OCONH- 5 3 2 \ il / 2 /—

(CHJ-N

1 ,Vv;:· 10 ! Mitomycin C, 425 mg (1,42 mmol) blandes med en 50% disper sion i olie af natriumhydrid, 85,3 mg, og 4 ml dimethyl formamid sættes dertil. Blandingen omrøres ved stuetemperatur under en atmosfære af argon i 10 minutter og afkøles dernæst til -35°C.

15 Tetramethylchloroformamidimiumchlorid, 289 mg (2,13 mmol), tilsættes, og blandingen tillades at opvarme til 5°C gennem en periode på 2 timer. Knust tøris sættes dernæst til blandingen for at afkøle reaktionen, og opløsningsmidlet fjernes ved destillation under reduceret tryk. Remanensen kromatograferes på en aluminiumoxidsøjle j 20 (100 g) ved brug af 3% vol/vol methanol i methylenchlorid til elue- | ring. Dette materiale renses yderligere ved aluminiumoxid-ti c (5% I vol/vol methanol i methylenchlorid), hvilket giver to fraktioner på j 17 mg og 76 mg. Den sidstnævnte krystalliseres fra acetone-ether til frembringelse af det ønskede produkt, smp» 193-195°C (12% 25 udbytte).

Analyse beregnet for ^ø^gNgOg: C, 55,54; H, 6,53; N, 19,43.

Fundet: C, 54,92; H, 6,53; N, 19,29.

30 NMR (pyridin-dg, δ): 2,26 (s, 3H), 2,59 (s, 6H), 2,68 (s, 6H), 2,75 (m, IH), 3,15 (d, IH), 0=4 Hz), 3,26 (s, 3H), 3,65 (d, IH, J=12 Hz), 4,00 (dd, IH, J=ll, 5 Hz), 4,62 (d, IH, J=12 Hz), 5,04 (t, IH, J=ll Hz), 4,38 (dd, IH, J-ll, 5 Hz).

IR (KBr): 3430, 3280, 2920, 1710, 1610, 1495, 1335, 1055 cm’1.

35 UV (MeOH, Amav): 610, 380, 260, 220 nm.

(ΠαΧ

Eksempel 30

Forbindelse (XXXI) 7-(1-pi peri di nylmethylen)ami no-9a-methoxymi tosan

DK 161023B

43

O

5 \ „ S o?H20&raa <Γ~λΝ7 η Y%0CH3 10 0

En 0,5 M opløsning af piperidinylchlormethyleniminiumchlorid fremstilles ved dråbevis tilsætning af oxalylchlorid (380 mg, 3 mmol) til 6 ml chloroform indeholdende 0,34 g (3 mmol) 1-formylpiperidin.

Natriumhydrid (50% oliedispersion, 96 mg, 2 mmol) tilsættes separat 15 under nitrogen til en opløsning af mitomycin C (334 mg, 1 mmol) i 3 ml 1-formylpiperidin. Efter omrøring i 15 minutter ved stuetemperatur afkøles opløsningen til -25°C, og den ovenfor fremstillede imin-iumsaltopløsning (4 ml, 2 mmol) tilsættes. Reaktionsblandingen holdes ved -25°C i 1 time og afkøles ved tilsætning af tøris. Efter 20 tilsætning af methanol (1 ml) absorberes produktbi andingen på neutralt aluminiumoxid. Dette materiale placeres på en aluminiumoxid-søjle (30 g). Søjlen elueres først med methylenchlorid og dernæst med 3% vol/vol methanol i methylenchlorid, hvilket giver 360 mg (84%) af titelforbindelsen, smp. 68-70°C.

25 Analyse beregn, for C21H25N50g.1-1/4 HgO: C, 55,80; H, 6,58; N, 15,49.

Fundet: C, 55,57; H, 6,21; N, 15,91.

NMR (pyridin-dg, δ): 1,42 (bs, 6H), 2,19 (s, 3H), 2,72 (m, 30 IH), 3,06-3,30 (m, 3H), 3,25 (s, 3H), 3,48-3,70 (m, 2H), 3,57 (d, IH, J=13 Hz), 4,01 (dd, IH, J=ll, 4 Hz), 4,43 (d, IH, J=13 Hz), 5,02 (bt, IH, 3=11 Hz), 5,55 (dd, IH, J=ll, 4 Hz), 7,86 (s, IH).

IR (KBr): 3440, 3350, 3300, 2935, 2835, 1710, 1615, 1520, 1445, 1305, 1250, 1200, 1055 cm"1.

35 UV (MeOH, λ 1: 590, 389, 262 (sh), 234, 212 (sh) nm.

ΠΐαΧ

44 DK 161023 B

Eksempel 31 j 7-hydroxy-N10-dimethylami nomethylen-9a-methoxymi tosan j l > ! ‘ "νλ,·1 i U°gh3 ! I . !

CH / Π >H

o -l·' ! ίο ; ; Til en opløsning af 7-hydroxy-9a-methoxymitosan (20 mg) i j methylenchlorid (3 ml) sættes dimethylformamid-dimethyl acetal (1 j ml), og opløsningen omrøres ved ca. 65°C i 30 minutter. Reaktio- i i nens forløb følges ved tic (10:1 CHgClg/MeOH). Produktet udvindes i 15 ved at koncentrere blandingen under reduceret tryk, og remanen- j sen kromatograferes over silikagel, hvilket giver titel forbindel sen.

Aktivitet over for P-388 museleukæmi

Tabel IV indeholder resultaterne af laboratorieforsøg med CDF1 20 mus af hunkøn implanteret intraperitonealt med en tumor-indpodning

I C

af 10 ascites-celler af P-388 museleukæmi og behandlet med forskellige doser af enten et slutprodukt eller mytomycin C. Forbindelserne I administreredes ved intraperitoneal injektion.

i i Grupper af seks mus anvendtes for hvert dosisniveau, og de be- 25 handledes med en enkelt dosis af forbindelsen på dag ét alene. En gruppe på ti saltvandsbehandlede kontrolmus blev indbefattet i hver forsøgsserie. De med mitomycin C behandlede grupper blev medtaget som en positiv kontrol. En 30 dages protokol anvendtes, idet den gennemsnitlige overlevelsestid i dage blev bestemt for hver gruppe 30 af mus, og antallet af overlevende ved slutningen af 30 dages perioden blev noteret. Musene blev vejet før behandling og igen på dag seks. Vægtforandringen blev taget som et mål for lægemiddeltoxicitet.

Mus, der hver vejede 20 gram, blev anvendt, og et tab i vægt på indtil 2 gram blev ikke betragtet som for stort. Resultaterne blev 35 bestemt med hensyn til % T/C, der er forholdet mellem den gennemsnitlige overlevelsestid for den behandlede gruppe og den gennemsnitlige overlevelsestid for den med saltvand behandlede kontrolgruppe gange 100. De med saltvand behandlede kontrol dyr døde i

DK 161023 B

45 sædvanligvis inden for ni dage. Den "maksimale effekt" i den efterfølgende tabel er udtrykt som % T/C, og dosen, som giver denne virkning, er anført. Værdierne i parentes er de værdier, som blev opnået med mitomycin C som positiv kontrol i det samme forsøg. Et 5 mål for den relative aktivitet af de omhandlede forbindelser i forhold til mitomycin C kan derfor skønnes. En minimal effekt med hensyn til % T/C blev betragtet at være 125. Den minimale effektive dosis, som er angivet i den efterfølgende tabel, er den dosis, der giver en % T/C på cirka 125. De to værdier, som i hvert tilfælde er 10 angivet i "gennemsnitlig vægtforandring"-kolonnen, er henholdsvis den gennemsnitlige vægtforandring pr. mus ved den maksimale effektive dosis og ved den minimale effektive dosis.

Tabel IV

15 Inhibering af P-388 museleukæmi

Mini- Gennem- mål snitlig

Forbindelse Maksimal virkning effektiv vægtforan- 1 2 20 (eksempel nr.) % T/C dosis dosis dring V (1) 311 (244) 6,4 (3,2) <0,2 -1,9, -0,2 183 (272) 6,4 (3,2) 0,1 -1,0, +0,3 25 VI (1) 233 (244) 6,4 (3,2) <0,2 -0,1, +0,1 VII (2) 141 (224) 25,6 (3,2) 0,8 -1,2, +0,2 IX (4) 165 (224) 12,8 (3,2) 0,2 -0,7, +0,8 X (5) 300 (224) 12,8 (3,2) 0,2 -2,1, ingen XIII (12) 161 (211) 12,8 (3,2) 3,2 -0,3, +0,2 30 XIV (3) 233 (272) 12,8 (3,2) 0,2 -3,8, +0,7

46 DK 161023 B

Tabel IV (fortsat)

Mini- Gennem- mal snitlig

Forbindelse Maksimal virkning effektiv vægtforan- 1 2 5 (eksempel nr.) % T/C dosis dosis dring XV (3) 144 (272) 25,6 (3,2) 6,4 -1,4, +0,2 i XVI (6) 144 (272) 6,4 (3,2) 3,2 -0,4, -0,3 I XVII (7) 144 (272) 0,8 (3,2) 0,02 -0,2, -0,3 10 XVIII (7) 167 (272) 6,4 (3,2) 0,05 -1,0, +0,3 XIX (8) 333 (294) 1,6 (3,2) <0,2 -1,9,+1,6 I 200 (239) 0,8 (3,2) <0,2 -2,7, -1,8 XX (9) 333 (294) 3,2 (3,2) <0,2 -2,7, +3,2 XXI (18) 189 (183) 1,6 (3,2) 0,025 -0,5, -0,1 15 XXXI (30) 150 (144) 6,4 (4,8) 1,6 -1,6, -2,3 267 (267) 3,2 (4,8) <1,6 -2,3, -1,7 XXX (29) 206 (263) 3,2 (4,8) <3,2 -1,7, -1,7 XXVI (25) 183 (239) 0,4 (3,2) <0,025 -3,1, -2,3 XXVII (26) 144 (239) 0,2 (3,2) 0,025 -1,3, -0,9 20 XXIII (21) 194 (319) 12,8 (3,2) 0,2 -1,2, +0,2 i XXIV (22) 313 (319) 6,4 (3,2) <0,1 -2,8,+0,3 I XXV (23) 188 (331) 25,6 (4,8) 0,4 -2,2, +0,1 XXVIII (27) 119 (313) 3,2 (3,2) 3,2 +2,2, +2,2 XXIX (28) 331 (319) 25,6 (3,2) 0,4 -2,8, +0,6 25 1 mg/kg legemsvægt 2 gram pr. mus, dage 1-6, ved maksimale og minimale effektive doser 30 Forbindelser (XIX) og (XX) er af exceptionel interesse, da deres aktivitet klart er bedre end for mitomycin C, både med hensyn til maksimal effekt og mg styrke (sammenlignende dosisstørrelser for ækvivalente virkninger). De er begge forbindelser med formel (I), hvori A er amidinogruppen og B er -NH9, eller med andre 7 < 35 ord mitomycin C-derivater, der ved N er substitueret med en R2 3 4 I 2 3 4 aminomethylengruppe med formlen R R N-C=, hvori R , R og R er som defineret ovenfor.

DK 161023 B

47

De slutprodukter, som er bis-amidinoforbindelser, hvori både A og B er amidinogruppen, er også af væsentlig interesse som aktive antitumorforbindelser. Der henvises til resultaterne i tabellen for forbindelser (V), (VI), (VII), (IX), (X) og (XIV), der svarer 5 til dette strukturkrav.

Tabel V indeholder resultater af antitumorforsøg under anvendelse af B16 melanomer dyrket i mus. BDFj-mus anvendtes og podedes intraperitonealt med tumorimplantationen. En 60 dages protokol anvendtes. Grupper på ti mus blev anvendt for hver testet dosis-10 mængde, og den gennemsnitlige overlevelsestid for hver gruppe blev bestemt. Kontroldyr podedes på samme måde som forsøgsdyrene og behandledes med injektionsvehiklen uden lægemiddel, og de udviste en gennemsnitlig overlevelsestid på 21 dage. Overlevelsestiden i forhold til den for kontroldyrene (% T/C) blev anvendt som et mål 15 for effektivitet, og den maksimale effektive dosis og minimale effektive dosis for hver testforbindelse blev bestemt. Den minimale effektive dosis blev defineret som den dosis, der udviste en % T/C-værdi på 125. For hvert dosisniveau behandledes forsøgsdyrene med testforbindelsen på dage 1, 5 og 9 ad den intraperitoneale vej. Den 20 gennemsnitlige vægtforandring på den angivne dag ved den maksimale effektive dosis og den minimale effektive blev anvendt som et mål for toxicitet. Et vægttab på 2 g for en 20 g mus blev ikke betragtet som for højt.

25 Tabel V

Inhibering af B16 melanomer

Minimal Gennemsnitlig

Forbindelse Maksimale effekt effektiv vægtforan- 30 nr. (eks.) % T/C Dosis dosis dring (dag) V (1) >298 (256)* 0,8 (3,2)* <0,2 +0,5 -0,2 (5) X (5) >295 (198) 2,0 (3,0) <2,0 -0,4 -0,4 (6) XXI (18) >295 (198) 0,4 (3,0) <0,2 -0,2 -1,8 (6) XX (9) 262 (198) 0,8 (3,0) <0,2 -2,6 -1,6 (6) 35 XIX (8) >235 (165) 1,2 (3,0) <0,5 +0,6 +0,8 (5)

* Værdier i parentes er kontrolværdier for mitomycin C

DK 161023B

48

Forbindelse (XXX) (eksempel 29) og forbindelse (XXIX) (eksempel 28) testedes over for BI6 muse-melanomerne under anvendelse af subkutan tumorimplantation og intravenøs behandling med lægemidlet. Behandlingsskemaet og vurderingerne af overlevelsestid 5 (en 40 dages protokol anvendtes) blev bestemt som før. Vægtforandring på dag 12 blev målt. Den maksimale effektive dosis af forbindelse (XXX) var 1 mg pr. kg, som gav en % T/C på 156 og en : vægtforøgelse på 1,5 g. Grupper af seks dyr blev anvendt, og tre dyr overlevede hele 40 dages protokollen ved denne dosis. Den mini-10 male effektive dosis var 0,25 mg/kg, ved hvilken dosis 12 dages vægtforandring var 1,0 g. For forbindelse (XXIX) var den maksimale effektive dosis 8 mg/kg ved en % T/C på 177 og en vægtforandring på -0,6. Den minimale effektive dosis var 4 mg/kg med en vægtforandring på +0,8. I det samme forsøg var den maksimale 15 effektive dosis af mitomycin C 3 mg/kg ved en % T/C på 195 og en vægtforandring på -0,5. Den minimale effektive dosis af mitomycin C blev ikke bestemt.

Ved en kort toxikologi sk protokol under anvendelse af grupper på fem BDFj-mus af hankøn pr. dosis indgivet i en enkelt intraperi-20 toneal dosis af forbindelse (XIX) forekom ingen signifikant reduktion I i lymphocyt-tælning ved den optimalt effektive dosis af denne for bindelse (1,6 mg/kg i.p.). Ved denne dosis var der ingen signifi-! kant stigning i blodurinstofnitrogen (BUN) eller serum-glutamin- -phospho-transferase (SGPT), hvilket antyder, at der ikke var 25 nogen skadelig virkning på nyre- eller leverfunktion eller undertrykkelse af lymphocytisk aktivitet.

Claims (39)

1. Mitosanderivater med formlen c O

5. II VV_/2 /OOC3 pomei (i) .0 æ/T LJ>r1 hvori A er amino, methoxy, hydroxy, (1-lavere alkyl-2(lH)-pyridinyliden)-amino, eller en gruppe med formlen 15 R2 HR2 R2J^ R^Aj-lW-, R3-N-C=N-, R3-N=C-N-, I «fa>a / W 20 r2 AS UA ellel" l λ ( Il 17 N- nN/xR- h2n-c=s-, enc-n-, r Ij R2 3 4 25. er amino eller amidinogruppen med formlen R R N-C=N-, idet mindst den ene af A og B er én af de angivne grupper, som er forskellig fra amino, methoxy eller hydroxy, n er nul eller et helt tal 1, 2 eller 3, R1 er hydrogen, lavere al kyl, lavere alkanoyl, benzoyl eller substitu- 30 eret benzoyl, hvori substituenten er lavere al kyl, lavere alkoxy, halogen, amino eller nitro, o R er hydrogen, lavere al kyl, phenyl, lavere al kyl phenyl, lavere alko-xyphenyl, halogenphenyl, aminophenyl, nitrophenyl, thienyl, furyl, cyano, dilavere al kyl amino, lavere alkoxy eller lavere al kyl thio, 3 4 35. er lavere al kyl, lavere alkoxy, eller danner sammen med R og nitrogenatomet, hvortil de er bundne, pyrrolidin, 2- eller 3-lavere al kylpyrrolidin, piperidin, 2-, 3- eller 4-lavere alkylpiperidin, 2,6-dilavere alkylpiperidin, piperazin, 4-substitueret piperazin DK 161023B (hvori 4-substituenten er al kyl, eller carbalkoxy med hver 1 til 8 carbonatomer, phenyl, methyl phenyl, methoxyphenyl, halogenphenyl, nitrophenyl eller benzyl), azepin, 2-, 3-, 4- eller 5-lavere alkyl-azepin, morpholin, thiomorpholin, thiomorpholin-l-oxid eller thi οι 5 morpholin-l,l-dioxid, l 3 R ér lavere al kyl eller danner sammen med R og nitrogenatomet, hvortil de er bundne, pyrrolidin, 2- eller 3-lavere al kyl pyrrol idin, piperidin, 2-, 3- eller 4-lavere alkylpiperidin, 2,6-di-lavere al-kylpiperidin, piperazin, 4-substitueret piperazin (hvori 4-substi-10 tuenten er al kyl, eller carbalkoxy med hver 1 til 8 carbonatomer, phenyl, methyl phenyl, methoxyphenyl, halogenphenyl, nitrophenyl eller benzyl), azepin, 2-, 3-, 4- eller 5-lavere al kylazepin, morpholin, thiomorpholin, thiomorpholin-l-oxid eller thiomorpholin-1,1-dioxid, c 15. er udvalgt blandt Cjjg-alkyl, bortset fra tert-alkyl, Cj^g-alke-nyl, Cj jg-alkynyl, Cj_18-halogenalkyl, Cj jg-hydroxyalkyl, C4 g-cykloalkyl, eller aryl eller lavere aralkyl med hver indtil 12 carbonatomer eller en heteroalicyklisk eller heteroaromatisk gruppe med fra 3 til 8 ringatomer, hvoraf mindst to er carbonatomer, 7 9 20. og R er uafhængigt H eller lavere al kyl, hvori hver af de førnævnte lavere al kyl-, lavere alkanoyl- og lavere al-koxygrupper indeholder 1 til 6 carbonatomer.

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvori A og B uafhængigt betegner ami- 25 dinogruppen med formlen R2 rVn-Ln-, 30 1 2

3. Forbindelse ifølge krav 2, hvori R og R begge er hydrogen, og 3 4 R og R begge er methyl.

4. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(dimethylamino)methylen]-35 amino-N^-(dimethylamino)methylen-9a-methoxymitosan.

5. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(dimethylamino)methylen]-ami no-N10-(dimethylamino)methylen-Nla-formyl-9a-methoxymitosan. i DK 161023 B

6. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(di isopropylamino)methy-1en]ami no-N10-(di i sopropylami no)methylen-9a-methoxymi tosan.

7. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(dimethylamino)methylen]- amino-N^-(dimethyl amino)methylen-9a-methoxy-N*a-methylmitosan. 1 2

8. Forbindelse ifølge krav 2, hvori R og R begge er hydrogen, og 3 4 R og R sammen med nitrogenatomet, hvortil de er bundne, danner piperi-10 dinogruppen. 1 d

9. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig N -formyl-9a-methoxy-7-(l-pi-peridinylmethylen)amino-N^-(l-piperidinylmethylen)mitosan.

10. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 9a-.methoxy-7-(l-piperidinyl- methylen)amino-N*°-(l-piperidinylmethylenjmitosan. 1 2

11. Forbindelse ifølge krav 2, hvori R og R begge er hydrogen, og R3 og R4 sammen med nitrogenatomet, hvortil de er bundne, danner morpho- 20 linogruppen.

12. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 9a-methoxy-7-(l-morpholinol-methyl en) ami no-N^- (1 -morphol i no-methyl en)mi tosan.

13. Forbindelse ifølge krav 1, hvori A betegner amino og B betegner amidinogruppen med formlen R2

30 R3R4N-ON-. 3 4

14. Forbindelse ifølge krav 13, hvori R og R hver betegner methyl .

15. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-amino-N^-dimethylaminome- la thylen-9a-methoxy-N -methylmi tosan. DK 161023 B 1Λ !

16. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-amino-N -dimethylaminome- j thylen-9a-methoxymitosan.

17. Forbindelse ifølge krav 1, hvori A betegner methoxy og B beteg-5 ner amidinogruppen med formlen i r3r4n-c=n-. 10 3 4

18. Forbindelse ifølge krav 17, hvori R og R hver betegner methyl .

19. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7,9a-dimethoxy-N10-dimethyl-15 aminomethylenmitosan.

20. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7,9a-dimethoxy-N^-dimethyl- la aminomethylen-N -formylmitosan.

21. Forbindelse ifølge krav 1, hvori A betegner én af de nævnte amidinogrupper og B betegner amino.

22. Forbindelse ifølge krav 21, hvori A betegner amidinogruppen med formlen 25 R2 i r3r4n-on- 3 4 30 og R og R betegner methyl.

23. Forbi ndel se.i følge krav 1, nemlig 7-(dimethylaminomethylen)ami-no-9a-methoxymitosan.

24. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-(dimethylaminomethylen)ami- no-9a-methoxy-Nla-methylmitosan. DK 161023 B

25. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-(l-methyl-2(H)-pyridinyli -den)ami no-9a-methoxymi tosan.

26. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 9a-methoxy-7-(l-morpholino- 5 methyl en)aminomitosan.

27. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-(1-pyrrol idinylmethyl en)-ami no-9a-methoxymi tosan. 10 28. 7-[2-benzylthioethyl]amino-9a-methoxymitosan.

29. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[l-(dimethylamino)ethyli-den]amino-N10-[l-(dimethylamino)ethyliden]-9a-methoxymitosan.

30. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[l-(dimethylamino)ethyli- denami no]-9a-methoxymi tosan.

31. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(l-methyl-2-pyrrolidinyli-den) ami no]-N^-[(l -methyl-2-pyrrolidi nyl iden) ami no]-9a-methoxymi tosan. 20

32. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(l-methyl-2-pyrrolidinyli-den)amino]-9a-methoxymitosan.

33. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(methoxyamino)methyl en]- 25 amino-9a-methoxymitosan.

34. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(benzyloxyamino)methy-1 en]ami no-9a-methoxymi tosan.

35. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-(l,3-dimethyl-2-imidazoli- dyliden)-9a-methoxymitosan.

36. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-[(l,3-dimethyltetrahydropy-rimi di nyli den)ami no-9a-methoxymi tosan. 35

37. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-(tetramethyldiaminomethy-1en)ami no-9a-methoxymi tosan. DK 161023 B

38. Forbindelse ifølge krav 1, nemlig 7-(l-piperidinylmethylen)ami-no-9a-methoxymitosan. 5 10 i 15