AT397092B - Verfahren zur herstellung von neuen mitosan-derivaten - Google Patents

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AT397092B
AT397092B AT0076288A AT76288A AT397092B AT 397092 B AT397092 B AT 397092B AT 0076288 A AT0076288 A AT 0076288A AT 76288 A AT76288 A AT 76288A AT 397092 B AT397092 B AT 397092B
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AT 397 092 B
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines neuen 7-substituierten Amino-9a-methoxymitosans der allgemeinen Formel ΠΙ
in welcher primäres oder sekundäres Cj-jg-Alkyl, Cj-jg-Hydroxylalkyl oder Benzylthioalkyl darstellt und R* Wasserstoff oder Niederalkyl bedeutet
Diese Verbindungen sind mit dem Mitomydn C verwandt und können als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer Mitomycin-Derivate Verwendung finden. Sie haben aber auch selbst eine überraschend hohe Antitumorwirksamkeit insbesondere wenn sie eine Amidingruppe in der 7 Stellung enthalten.
Gemäß "Chemical Abstracts" ist der systematische Name für Mitomydn C: [laR-(laa, 8ß, 8aa, 8ba)]-6-Amino-8 {[(aminocarbonyl)oxy] -methyl} -1, la, 2,8,8a, 8b-hexahydro-8a-methoxy-5-methyl-azirino-[2,3,3,4] -pyrrolo [1,2-a] indol-4,7-dion, gemäß welchem das Azirinopyrroloindolring-System wie folgt numeriert wird; 65
83a
NH la
Chemical Abstracts
Ein trivales Nomenklatursystem, welches in der Mhomycin-Literatur weiterverbreitete Anwendung gefunden hat identifiziert das vorhergehende Ringsystem einschließlich mehrere charakteristischer Substituenten des Mitomycins als Mitosan.
Dieses System ist zweckmäßig und genügt für eine Anzahl von einfachen Derivaten, wie jenen, die N-Substimenten an dem Stickstoffatom des Azirinaringes oder in den 7- oder 9a-Stellungen tragen, trotz bestimmter -2-
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Mehrdeutigkeiten und Mängel für die allgemeine Anwendung. Was die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen betrifft, von welchen einige sowohl am Azirinoring-Stickstoffatom als auch am Seitenketten-Carbamoyl-Stickstoffatom Substituenten aufweisen, gibt es keine konventionelle Numerierung, um diese Stellungen zu unterscheiden. Man hat sich daher hier dafür entschieden, unter Anwendung des Mitosan-Nomenklatursystems das 5 Azirino-Stickstoffatom als Nla und das Carbamoyl-Stickstoffatom als N10 zu bezeichnen. Was die stereomechanische Konfiguration der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen betrifft, so soll, wenn sie mit dem Grundnamen "Mitosan" oder durch Strukturformeln bezeichnet werden, ihre stereochemische Konfiguration in gleicher Weise wie jene des Mitomycins C identifiziert werden.
Mitomycin C ist ein Antibiotikum, welches durch Fermentation hergestellt wird und derzeit von der "Food and 10 Drug Administration" zur Therapie von verbreiteten Adenocarcinomen des Magens oder der Bauchspeicheldrüse in erprobten Kombinationen mit anderen bewährten chemotherapeutischen Mitteln und zur palliativen Behandlung vertrieben werden, wenn andere Anwendungen versagt haben (Mutamycin®, Bristol Laboratories, Syrakus, New York 13201, Physicians' Desk Reference, 35. Ausgabe, 1981, S. 717 und 718). Mitomycin C und seine Herstellung durch Fermentation ist der Gegenstand des US-PS 3 660 578, patentiert am 2. Mai 1972 unter Beanspruchung von 15 Prioritäten früherer Anmeldungen, einschließlich einer japanischen Anmeldung, die am 6. April 1957 in Japan angemeldet wurde.
Die Strukturen der Mitomycine A, B und C und von Porfiromycin wurden zuerst von J. S. Webb et al, Iderle Laboratories Division American Cyanamid Company, J. Amer. Chem. Soc. 84,3185 - 3187 (1962), veröffentlicht. £ine dieser chemischen Umwandlungen, die in diesen Strukturstudien angewendet wurden, um Mitomycin A und 20 MitomycinCmiteinanderinBeziehungzubringen,wardieÜberprüfungdesersteren,7-9a-Dimethoxymitosan,durch
Reaktion mit Ammoniak in das letztere, 7-Amino-9<x-methoxymitosan. Verdrängung der 7-Methoxygruppe des Mitomycins A hat bewiesen, daß sie eine Reaktion von besonderem Interesse bei der Herstellung von Antitumoraktiven Derivaten des Mitomycins C ist. Die folgenden Artikel und Patente befassen sich jedes mit der Überführung von Mitomycin A in ein 7-substituiertes Amino-mitomycin C-Derivat mit Antitumor-Wirksamkeit. Ziel der 25 Erfindung ist es, Derivate herzustellen, die wirksamer sind und die insbesondere weniger toxisch sindals Mitomycin C:
Matsui et al. "The Journal of Antibiotics”, XXI, 189 -198 (1968).
Kinoshita et al. "J. Med. Chem." 14.103 -109 (1971). 30 Iyengar et al MJ. Med. Chem." 24,975 - 981 (1981).
Iyengar, Sami, Remers, and Bradner, Abstracts of Papers Annual Meeting of the American Chemical Society, Las Vegas, Nevada, March 1982, Abstract No. MEDI72.
Die folgenden Patentschriften behandeln die Herstellung γοη 7-substituierten Aminomitosan-derivaten durch 35 Umsetzung von Mitomycin A, Mitomycin B oder einem N^a-substituierten Derivat hievon mit einem primären oder sekundären Amin:
Cosulich et al., US-PS 3,332,944, paL am 25. Juli 1967.
Matsui et al., US-PS 3,420,846, paL am 7. Jänner 1969. 40 Matsui et al., US-PS 3,450,750, paL am 17. Juni 1969.
Matsui et al., US-PS 3,514,452, paL am 26. Mai 1970.
Nakano et al., US-PS 4,231,936, paL am 4. November 1980.
Remers, US-PS 4,268,676, paL am 19. Mai 1981. 45 Mitomycin C-Derivate, welche einen substituierten Aminosubstituenten in der 7-Stellung aufweisen, wurden durch direkte Biosynthese ebenfalls hergestelU, d. h. durch Zusatz einer Reihe von primären Aminen zur Gärbrühe und Durchführung der herkömmlichen Mitomydn-Fermentation (C. A. Claridge et al. AbsL od the Annual Metting of Amer. Soc. forMicrobiology 1982, Abs. 128).
Mitomycin C ist das hauptsächliche durch Fermentation hergestellte Mitomycin und stellt die im Handel 50 verfügbare Form dar. Die derzeit übliche Technologie für die Umwandlung von Mitomycin C in Mitomycin A zur Anwendung bei der Herstellung der semisynthetischen substituierten Aminoanaloga von Mitomycin C, die in den vorhergehendenPublikationen beschrieben werden, umfaßtdie Hydrolyse von Mitomycin C zu dem entsprechenden 7-Hydroxymitosan, einer in hohem Maße instabilen Verbindung, und die daraus folgende Methylierung dieser Substanz mit Diazomethan, welches eine sehr gefährliche Substanz darstellL Ein Versuch, die Verwendung von 55 Diazomethan zur Methylierung des 7-O-Demethyl-mitocyn A, welches durch Hydrolyse von Mitomycin C gebildet wird, zu vermeiden, umfaßt die Verwendung von 7-Acyloxymitosanen (Kyowa Hakko Kogyo Jap. PS J5 6073-085, Farmdoc. Nr. 56227 D/31).
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Die eingangs genannten Verbindungen der allgemeinen Formel ΙΠ werden erfindungsgemäß hergestellt, indem eine Verbindung der allgemeinen Formel
(ID (IV) in welcher A oder sowohl A als auch B für die Amidinogruppe der Formel R2
I r3r4n-c=n- in welcher o R Wasserstoff, Niederalkyl oder Diniederalkylamino bedeutet, R3 Niederalkyl, Niederalkoxy oderBenzyloxy darstellt oder gemeinsam mitR4 und dem Stickstoff, an welches sie gebunden sind, einen Pyrrolidin-, Piperidin- oder Morpholinring bildet, R4 Niederalkyl bedeutet oder gemeinsam mit R3 und dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Pyrrolidin-, Piperidin- oder Moiphoinring bildet, steht, B für den Fall, daß es nicht die Amidinogruppe bedeutet, eine Aminogruppe darstellt und R ^ die oben genannte Bedeutung hat, wobei jede der obgenannten Niedrigalkyl- oder Niedrigalkoxygruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, mit einem primären Amin der Formel r5nh2 worin R^ die oben genannte Bedeutung hat, in einem wasserfreien, reaktionsinerten, flüssigen organischen Medium bei einer Temperatur von -15 °C bis +50 °C umgesetzt wird.
Die Reaktion mit dem primären Amin ergibt eine Spaltung des N^-Aminomethylen-Substituentsn, falls dieser vorhanden ist, und bewirkt eine Verdrängung der Amidinogruppe in der 7-Stellung und den Ersatz derselben durch einen Aminosubsdtuenten entsprechend der Reaktionskomponente.
In Abänderung dieses Verfahrens kann zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel IV,
in welcher R*, R2, R3 und R4 die oben genannte Bedeutung hat, eine Verbindung der allgemeinen Formel Π,
-4- 5
AT 397 092 B worin R* bis r5 die oben genannte Bedeutung haben, mit mehr als einem Molanteil von Aminodiphenylmethan, Trifluorethylamin, tert.-Butylamin, Methoxyamin oder O-Benzylhydroxylamin bei 20 °C bis 60 °C behandelt Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch folgendes Reaktionsschema wiedergegeben: 10 15 20 25 30
R^, das den Stickstoffsubstituenten von verschiedenen bekannten und neuen 7-substituierten Amino-Mitomycin C-Verbindungen, die hier beschrieben werden, und von den primären aminen, welche imstande sind, die 7-Amidino-35 gruppe der allgemeinen Formel Π zu verdrängen, darstellt, wird aus primären oder sekundärem Cj-jg-Alkyl, Cns-Hydroxyalkyl oder Benzylthioalkyl ausgewählt. R^, das den Stickstoffsubstituenten der primären Amine, die imstande sind, nur den N^-Amidinosubstituenten zu spalten, darstellt, ist der Rest eines sehr schwach basischen aliphatischen Amins oder eines in hohem Maße 40 gehinderten Alkylamins oder Aralkylamins. Beispiele hiefür sind Trifluoräthylenamin, Benzhydrylamin (d. i. Aminodiphenylmethan), tert. Butylamin oder Methoxyamin.
Das Amin R^NH^ stellt ein solches primäres Amin dar, bei dem das die Aminogruppe tragende Kohlenstoffatom zumindest ein Wasserstoffatom und höchstens eine Arylgruppe trägt.
Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen können ihrerseits wieder in Mitomycin C-Analoga mit 45 Amidingrüppe an der 7-Stellung bzw. am N-^-Stickstoff umgewandelt werden, indem sie mit Amidacetalen der Formel 50
R (V)
1 8 N-C-OR
η n A worin R , RJ und R die bereits genannte Bedeutung haben, zur Reaktion gebracht werden. 55 Als Reaktionsmedium für das erfindungsgemäße Verfahren wird eine wasserfreie flüssige organische Verbin dung verwendet, und es kann jede derartige Substanz eingesetzt werden, solange sie mit den Reaktionsbedingungen verträglich ist und an der Reaktion nicht in schädlicher Weise teilnimmt. Im allgemeinen wird ein Überschuß an der -5-
AT 397 092 B primären Amin-Reaktionskomponente auf molekularer Basis verwendet. Eine Reaktions temperatur im Bereich von etwa -15° bis +50 °C wird bevorzugt. Das bei dieser Reaktion entstandene Produkt ist ein 7-substituiertes Amino-9a-methoxymitosan, nämlich ein Mitomycin C-Derivat, welches einen Substituenten, wie er fürR^ definiert wurde, an der 7-Aminogruppe trägt Von derartigen Verbindungen ist es bekannt daß sie einen beträchtlichen Grad an 5 Antitumor-Wirksamkeit bei Tierversuchen auf weisen.
Es wurde gefunden, daß manche primären Amine, die mit der allgemeinen Formel bezeichnet weiden, nicht imstande sind, die 7-Amidinogruppe gemäß dem im vorhergehenden Absatz beschriebenen Verfahren zu verdrängen. Diese Amine sind geeignet eine Verbindung der allgemeinen Formel I, in welcher sowohl A als auch B diese Amidinogruppe der allgemeinen Formel r3r4n-c=n- 15 darstellen, in eine Verbindung der allgemeinen Formel I, in welcher nur A diese Amidinogruppe darstellt, umzuwandeln. Während diesen Aminen die Eignung fehlt, die 7-Amidinogruppe zu verdrängen, haben sie nichtsdestoweniger die Fähigkeit die mit B bezeichnete Amidinogruppe zu NH2 zu spalten unter Bildung der Carbamidofunktion, die für die unsubstituierten Mitosane charakteristisch ist. Als Reaktionsmedium kann das Amin selbst dienen, oder es kann ein Lösungsmittelsystem, wie es in dem vorhergehenden Absatz definiert wurde, 20 verwendet werden. Das Verfahren wird vorzugsweise in dem Reaktionsbereich von 20° bis 60 °C durchgeführt
Schmelzpunkte werden auf einem Thomas-Hoover-Kapillar-SchmelzpunktapparatbestimmtundsindunkorrigierL Temperaturen werden in °C angegeben. Kemmagnetische Protonen-Resonanzspektren (NMR) werden auf einem Varian XL 100-Spektrometer in Pyridin-dg bestimmt, wenn nicht anders angegeben. Infrarotspektren (IR) werden mit einem Beckman 4240-Spektrophotometer erhalten, und die Probe wird mit Kaliumbromid zu einer Pastille 25 gepreßt Die IR-Werte sind vmax in cm**. Die UV-sichtbaren Spektren werden auf einem Varian-Cary 219-Spektrophotometer bestimmt
Die Dünnschichtchromatographie (DSC) wird auf vorüberzogenen 0,25 mm-Silikagelplatten unter Verwendung von UV-Licht als Mittel zur Sichtbarmachung durchgefiihrt Flash-Chromatographie wird unter Verwendung von Silica Woelm (32 - 63 |im) durchgefiihrt Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck und unterhalb von 50 °C 30 abgedampft
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert
Beispiel 1: Verbindung XIX 7-n>imethvlaminomethvlenMmino-9a-methoxvmitosan. 35 Zu 600 mg (135 mM) der Veibindung
40 45 die in 10 ml Methanol gelöst ist, werden 2,2 ml (10,8 mM) Aminodiphenylmethan hinzugeführt, und die erhaltene Lösung wird 4 Stunden bei 54 °C gerührt. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch DSC (Methylenchlorid/ Methanol 90:10) überwacht. Am Ende der 4 Stunden war das Ausgangsmaterial (Rf - 035) verschwunden und 50 stattdessen erschien eine neue grüne Hauptzone (Rf = 0,29). Die Lösung wird bei vermindertem Druck eingedampft und der erhaltene Sirup wird unter Verwendung von Methylenchlorid/Methanol 20:1 als Eluierungsmittel flash-chromatogiaphiert (25 g Silikagel). Fraktionen, die die grüne Komponente (Rf = 0,29) enthalten, werden vereinigt überNa2S04 getrocknet und eingedampft Man erhält die Verbindung XIX als amorphen Feststoff (215 mg, 41 %). 55 NHR (Pyridin äg, $): 2.18 (s, 3H), 2.70 (bs, 1H), 2.80 (s, 3H), 2.88 (s, 3H), 3.08 (bs, 1H), 3.24 (s, 3H), 3.56 (bd, 1H, J=12Hz), 4.00 (dd, lH),4.44(d, 1H, J=12Hz),5.06(t 1H, J=10Hz),5.56(dd, 1H, J=10,4Hz), 7.58 (bs, 2H), 7.88 (s, 1H). -6-
AT 397 092 B IR (KBr) vmax, cm'1:3300 - 3450,2960 - 2910,1715,1620,1535,1050 UV (H20) λη,3χ, nm: 390 und 226
Analyse: Ber.fürCioI^N^: C55,48; H5,91; N 17,98
Gef.: C 54,83; H5,67; N 16,90
Beispiel 2: Verbindung XX 7-(DimethvlaminomethvlenMmino-9a-methoxv-N -methylmitosan. 1 g (2,18 mM) 7-[(Dimethylamino)methylen]imino-Nlu-(dimethylamino)methylen-9a-methoxy-N*a-methylmitosan wird in 20 ml Methanol gelöst, 3,5 ml (17,18 mM) Aminodiphenylmethan werden hinzugefügt, und die erhaltene Lösung wird 5 Stunden bei Zimmertemperatur und 5 Stunden bei 40 °C gerührt, Dünnschichtchromatographie (CHjC^/MeOH 90:10) der Reaktionsmischung zeigt daß nahezu das gesamte Ausgangsmaterial (Rf = 0,55) verbraucht worden war und daß eine neue grüne Hauptzone (Rf = 0,48) aufgetreten ist Eine Aufarbeitung ähnlich der in Beispiel 8 beschriebenen liefert die Verbindung XX in Form eines amorphen Feststoffes (350 mg). Eine weitere Reinigung wird durch Flash-chromatographie (7 g Silikagel) unter Verwendung von CH2Cl2/MeOH (250 ml, 96/4 Vol/Vol) und Ausfällen des erhaltenen Feststoffes (Rf=0,48) aus 5 mM Methylenchlorid und 50 ml Hexan erreicht, wobei analytisch reine Verbindung XX (314 mg, 35,7 %) in Form eines Feststoffes erhalten wird. NMR (CDC13, δ): 1.93 (s, 3H), 2.26 (bs, 1H), 2.26 (s, 3H), 3.06 (s, 3H), 3.08 (bs, 1H), 3.10 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.46 (bd, 1H, J=12,lHz), 3.58 (dd, 1H, J=4,10Hz), 4.17 (d, 1H, J=12Hz), 4.38 (t 1H, J=10Hz), 4.68 (m, 2H), 4.76 (dd, 1H, J=4,10Hz), 7.72 (s, 1H). IR (KBr) vmax, cm'1:3440,3350,3190,3020,2940,2910,1725,1630,1550,1055. UV (MeOH) Xmax, nm: 386 und 231.
Analyse: Ber. fürCinH^cNcOc: C 56,53; H6,20; N 17,36
Gef.: C 53,90; H5,13; N 15,81.
Beispiel 3: Verbindung XI 7-Cn-Propvl')amino-9a-methoxvmitosan 330 mg (0,74 mM) Verbindung V werden in wasserfreiem Methanol (10 ml) gelöst und 1,0 ml n-Propylamin werden hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird 6 Stunden bei Zimmertemperatur und 16 Stunden bei etwa 0 - 4 °C gerührt. Das Lösungsmittel und das überschüssige Reaktionsmittel werden unter vermindertem Druck abgedampft, und der Rückstand wird unter Verwendung von Silikagel als Adsorbens flash-chromatographiert Die blaue Komponente (Rf = 0,40), die durch Eluieren mit Methylenchlorid/Methanol 30:1 erhalten wird, wird aus Methylenchlorid mit Hexan neuerlich ausgefällt wobei die Verbindung XI in Form eines amorphen grauen Pulvers (125 mg, 44,5 %) erhalten wird. NMR (Pyridin £5,8): 0.80 (t 3H), 1.42 (m, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.74 (bs, 1H), 3.12 (bs, 1H), 3.22 (s, 3H), 3.36 (q, 2H),3.60(d, 1H, J=12Hz),3.96 (dd, lH,J=llHz,4Hz),4.54(d, lH,J=12Hz),5.00(m,3H),536(dd, lH,J=ll,4Hz), 6.90 (tlH). IR (KBr) Vj^. cm-1:3440,3300,2960,2940,1715,1630,1600,1550,1510,1220,1060. UV (H20) Xmax· nm: 372 and 222
Analyse: Ber.fÜrCjoH^N^: C 57,40; H6,38; N 14,88;
Gef.: C 57,28; H6,41; N 14,08.
Beispiel 4: Verbindung XII 7-(2-HvdroxväthvDamino-9a-methoxvmitosan 330 mg (0,74 mM) Verbindung V worden in 5 ml wasserfreiem Methanol gelöst und 2 ml Äthanolamin werden hinzugefugt Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und sodann mit 50 ml Wasser verdunntund fünfmal mit je 60 ml Äthylacetat extrahiert Die vereinigten Äthylacetat-Extrakte werden über Na^C^ getrocknet und zu einem bläulich-puipurfafbenen Rückstand eingeengt, welcher nach Säulenchromatographie unter -7-
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Verwendung von 10 % Methanol in Methylchlorid und Einengen da- vereinigten, die blaue Verbindung enthaltenden Fraktionen 105 mg (37 %) der Verbindung ΧΠ in Form eines amorphen Feststoffes ergibt. NMR (Pyridin^, δ): 2.14 (s, 3H), 2.81 (bs, 1H), 3.18 (d, 1H, J=4Hz), 3.24 (s, 3H), 3.65 (dd, 1H, J=2,12Hz), 3.70 5 - 4.20 (m, 5H), 4.52 (d, 1H, J=13Hz), 4.96 (t, 1H, J=12Hz), 7.38 (t, 1H), 7.58 (bs). IR (KBr)vmaT. cm-1:3300 - 3500,2930,1710,1630,1600,1540,1510,1200,1055. UV (H20) Xmax. nm: 371 and 221 10
Analyse: Ber.fiirCj^H^N^Og: C 53,92; H5.82; N 14,80
Gef.: C 51,30; H5,88; N 14,80.
Beispiel 5: Verbindung ΧΙΠ 15 7-r2-Benzvlthioäthvllamino-9a-methoxvmitosan 200mg (0,45 mM) Verbindung V werden in 2 ml Methanol gelöst, 04 ml S-Benzyl-2-aminoäthanthiol werden hinzugefügt, unddieLösungwirdl6StundenbeiZimmertemperatur gerührt. Der beim Abdampfen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird flash-chromatographiert (40 g Silikagel) unter Verwendung von 400ml 6 %igem Methanol/Methylenchlorid als EluierungsmitteL Die blaue Komponente (Rf etwa 0,5 in 10 %igem 20 MeOH/GB^C^) wird in Form eines amorphen Feststoffes (65 mg, 29,8 %) isoliert Seine Spektralwerte (NMR, IR, UV und Massenspektrum) stimmen mit seiner ihm zugeordneten Struktur überein.
Analyse: BenfurC^^N^S: C 59,49; H 5,82; N 11,56
Gef.: C 59,72; H 5,94; N 11,08. 25
Beispiel 6: Verbindung XXIV 7-ri-fDimethvlamino~>äthvlidenimino1-9a-methoxvmitosan
30 35 40 45 50
EineLösungvonl00mg(0,21mMol)7-[l-(Dimethylamino)äthyliden)imino-N10-[l-(dimethylamino)äthyliden]-9a-methoxymitosan (Verbindung ΧΧΙΠ) in 2 ml Chloroform wird zu 2 ml Aminodiphenylmethan gegeben, und die Lösung wird 24 Stunden bei etwa55 - 60 ®C erhitzt In dieser Stufe verbleiben Spuren der Verbindung ΧΧΙΠ in dem Reaktionsgemisch; es wird jedoch dessen ungeachtet eingeengt und der Rückstand wird über neutralem Aluminiumoxyd Chromatographien unter Anwendung einer allmählichen Eluierung, beginnend mit Methylenchlorid und abschließend mit Methanol/Methylenchlorid 2,5:1. Die grüne Hauptzone wird in Form eines amorphen grünen Feststoffes mit einem Gewicht von 25 mg (29,4 Ausbeute) isoliert. Dieses Material wird gereinigt, indem es in Aceton gelöst wird und zu der Acetonlösung Hexan hinzugefügt wird, bis ein Ausfällen erfolgt Das Produkt wird durch Filtrieren gesammelt und getrocknet
Analyse: Ber. für C25H32N605: C 56,58; H6,20; N 17,37
Gef.: C 55,71; H6,34; N 15,23. UV (H20) λ^, nm: 374,230 (Schulter) IR (KBr) vmax. cm*1; 3420,3350,3280,2920,1710,1610,1540,1300,1050.
Das % N. M. R.-Spektrum in Pyridin dg stimmt mit der Struktur überein. -8- 55
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Beispiel 7: 7-rn-Metvl-2-nvrrolidinvliden>aminol-9a-methoxvmitosan
Eine Lösung von 80 mg (0,16 mMol) 7-[(l-Methyl-2-pyrrolidinyliden)imino]-N^-[(l-methyl-2-pynolidinyliden)amino]-9a-methoxymitosan (Verbindung XXV) und 0,48 ml t-Butylamin in 15 ml Chloroform wird 48 Stunden unter Rückflußkühlung erhitzt. DSC (Methanol/Methylenchlorid, 2 % auf Aluminiumoxyd) zeigt einen gößeren grünen Fleck und einen kleinen anführenden blauen Fleck und einen kleinen nachschleppenden roten Fleck, welche alle dem Ausgangsmaterial nachfolgen. Eine Säule, die 50 g Aluminiumoxyd enthält, wird mit der Reaktionslösung beladen und mit 200 ml von 1 % Methanol in Methylenchlorid und danach mit 400 ml von 2 % Methanol in Methylenchlorid eluiert. Jene Fraktionen, welche eine einzige größere grüne Komponente »ithalten, wie mittels DSC gezeigt wurde, werden vereinigt und zu einem Rückstand des gewünschten Produktes, welches 24 mg wiegt, eingeengt NMR (Pyridin ä5, δ): 1.72 (q, 2H), 2.04 (s, 3H), 2.16 (q, 2H), 2.72 (bs, 1H), 2.84 (s, 3H), 3.12 (m, 3H), 3.24 (s, 3H), 3.60 (dd, 1H, J=14,2Hz), 4.00 (dd, 1H, J=12,6Hz), 4.40 (d, 1H, J=14Hz), 5.04 (t, 1H, J=14Hz), 5.38 (dd, 1H, J=12,6Hz), 7.48 (bs, 2H).
Wirksamkeit gegen P-388 Murih-Lenkämie;
Tabelle I enthält die Ergebnisse der Laboratoriumtests mit CDF^-weiblichen Mäusen, welchen intraperitoneal ein Tumor-Impfstoff von 10® Ascites-Zellen von P-388 Murin-Leukämie implaniert wurde und welche mit verschiedenen Dosen von entweder einer Testverbindung der allgemeinen Formel I oder von Mitomycin C behandelt wurden. Die Verbindungen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht Für jede Dosierungsmenge wurden Gruppen von sechs Mäusen verwendet und sie wurden mit einer einzigen Dosis der Verbindung an nur einem Tag behandelLln jede Versuchsreihe wurdeeineGruppevonlOmitSalzlösungbehandeltenKontrollmäuseneingebracht Die mit Mitomycin C behandelten Gruppen wurden als sichere Kontrolle eingebracht Es wurde ein 30 Tage-Protokoll verwendet, in welchem die mittlere Überlebenszeit in Tagen, die für jede Gruppe von Mausen bestimmt wurde, und die Anzahl der Überlebenden am Ende der 30 Tage-Periode notiert wurden. Die Mäuse wurden vor der Behandlung und wiederum am Tage 6 gewogen. Die Massenveränderung wurde als Maß für die Toxizität der Droge genommen. Es wurden Mäuse mit je 20 Gramm Masse verwendet, und ein Missenverlust bis zu etwa2 g wurde nicht als übermäßig angesehen. Die Ergebnisse wurden in Werten von % T/C bestimmt welches das Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Gruppe zu der mittleren Überlebenszeit der mit Salzlösung behandelten Kontrollgruppen mal 100 darstellt. Die mit Salzlösung behandelten Kontrolltiere starben im allgemeinen innerhalb von neun Tagen. Die "maximale Wirkung" in der folgenden Tabelle wird ausgedrückt als % T/C, und es wird die Dosis angegeben, die diese Wirkung ergibt. Die Werte in Klammer sind die Werte, die mit Mitomycin C als tatsächlicher Kontrollprobe bei dem gleichen Versuch erhalten wurden. Es kann so ein Maß für die Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestelltenSubstanzenimVergleichzuMitomycinCgeschätztwerden.Eine minimaleWirkung in Werten von % T/C wird mit 125 angenommen. Die minimal wirksame Dosis, die in der folgenden Tabelle angegeben wird, ist jene Dosis, die ein % T/C von etwa 125 ergibt. Diebeiden Werte, die in jedemFall in der Kolonne der "durchschnittlichen Massenänderung" angegeben werden, sind die durchschnittliche Massenveränderung pro Maus bei der maximalen wirksamen Dosis, bzw. bei der minimalen wirksamen Dosis. -9-
AT 397 092 B Tabelle T
Hemmung derP-388 Murin-T^enlcämie 5 Maximale Wirkung 10 Verbindung (Beispiel Nr.) %T/C Dosis1 Minimale wirksameDosis Durchschnittl. Massenverlust2 ΧΠΙ(5) 161 (211) 12.8 (3.2) 3 2 -0.3, +0.2 XIX (1) 333 (294) 1.6 (3.2) <0.2 -1.9, +1.6 15 200 (239) 0.8 (3.2) <0.2 -2.7, -1.8 XX (2) 333 (294) 3.2 (3.2) <0.2 -2.7, +3.2 20 XXVI (8) 183 (239) 0.4 (3.2) <0.025 -3.1, -2.3 XXVü(9) 144 (239) 0.2 (3.2) 0.025 -1.3, -0.9 XXIV (6) 313 (319) 6.4 (3.2) <0.1 -2.8, +0.3 1 mg/kg Körpermasse 2 Gramm pro Maus, Tage 1 - 6, bei den maximalen und bei den minimalen wirksamen Dosen. 30
Die Verbindungen XIX und XX sind von außergewöhnlichem Interesse, da ihre Wirksamkeit jene von Mitomycin C eindeutig undklar überschreitet, u. zw. sowohl in Bezug auf die Werte der maximalen Wirkung als auch der Milligramm-Wirksamkeit (vergleichende Dosiswerte für äquivalente Wirkungen). Jede dieser Verbindungen ist einer Verbindung der allgemeinen Formel I, in welcher A die Amidinogruppe und B die Gruppe -NH2 sind, oder, mit anderen Worten, sie sind Mitomycin C-Derivate, die bei N2 durch eine Aminomethylengruppe der allgemeinen Formel 35 R3R4N-C=, 40
Λ Ο A worin R , RJ und R die obige Bedeutung haben, substituiert sind. 45 50
Die Tabelle Π enthält die Ergebnisse der Anti-Tumor-Tests unter Verwendung des B 16-Melanoma-Wachstums bei Mäusen. Es wurden BDFj-Mäuse verwendet und mit dem Tumor-Implantat intraperitoneal beimpft. Es wurde ein 60-Tage-Protokoll verwendet. Für jede dieser untersuchten Dosierungsmenge wurden Gruppen zu 10 Mäusen verwendet, und es wurde die mittlere Überlebenszeit für jede Gruppe bestimmt. Kontrolltiere, die in gleicher Weise wie die Testtiere mit dem Injektionsträger und ohne Droge beimpft und behandelt wurden, zeigten eine mittlere Überlebenszeit von 21 Tagen. DieÜberlebenszeit in Bezug auf jene der Kontrolltiere (% T/C) wurde als Maß für die Wirksamkeit verwendet, und es wurden die maximale wirksame Dosis und die minimale wirksame Dosis für jede Testverbindung bestimmt. Die minimale wirksame Dosis wird als jene Dosis definiert, die einen % T/C-Wert von 125 aufweist. Für jede Dosismenge wurden die Testtiere mit der Testverbindung an den Tagen 1, 5 und 9 auf intraperitonealem Wege behandelt. Die durchschnittliche Massenänderung an jenem Tag, an welchem die maximale wirksame Dosis auftritt, und die minimale wirksame Dosis auftritt, wurde als Maß für die Toxizität verwendet. Ein Massenverlust von 2 g für eine Maus mit einer Masse von 20 g war nicht übermäßig. 55

Claims (3)

  1. AT 397 092 B Tabellen Hemmung von B 16-Melanoma 5 Maximale Wirkung Durchschnittl. 10 Verbindung Nr. (Beispiel) % T/C Dosis Minimale wirksame Dosis Gew. veränd. (Tag) XX (2) 262 (198) 0.8 (3.0) <0.2 -2.6, -1.6(6) 15 XIX (1) <235 (165) 1.2 (3.0) <0.5 +0.6, +0.8(5) x Die Werte in Klammem sind Mitomycin C-Kontrollwerte. Bei einem kurzen toxikologischen Protokoll unter Verwendung von fünf männlichen BDFj-Mäusen pro Dosis, 20 die in Form einer einzigen intraperitonealen Dosis der Verbindung XIX verabreicht wurde, trat keine merkliche Herabsetzung in der Lymphocytenzählung bei der optimal wirksamen Dosis dieser Verbindung (1,6 mg/kg i.p.) auf. Bei dieser Dosis erfolgte keine beträchtliche Erhöhung des Blutharnstoff-Stickstoffs (BHN) oder der Serum-Glutaminphosphor-Transfeiase (SGPT), wodurch keine nachteilige Wirkung auf die Nieren- oder Leberfunktion oder die Unterdrückung der lymphocytischen Wirksamkeit angezeigt wird. 25 PATENTANSPRÜCHE 30 1. Verfahren zur Herstellung eines neuen 7-substituierten Amino-9a-methoxymitosans der allgemeinen Formel III, 35 40
    (ΠΙ) in welcher 45 primäres oder sekundäres Cj-jg-Alkyl, C^-^g-Hydroxyalkyl oder Benzylthioalkyl darstellt und R1 Wasserstoff oder Niederalkyl bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen Formel (Π) bzw. (IV), 50 55
    (Π) (IV) -11- 5 AT 397 092 B' in welcher A oder sowohl A als auch B für die Amidinogruppe der Formel R2 R3R1N-C=N- in welcher 10 15 R^ Wasserstoff, Niederalkyl oder Diniederalkylamino bedeutet, R·2 Niederalkyl, Niederalkoxy oder Benzyloxy darstellt oder gemeinsam mitR1 und dem Stickstoff, an welches Siegebunden sind, einen Pyrrolidin-, Piperidinoder Morpholinring bildet, R1 Niederalkyl bedeutet oder gemeinsam mit R3 und dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Pyrrolidin-, Piperidin oder Morpholinring bildet, steht, B für den Fall, daß es nicht die Amidinogruppe bedeutet, eine Aminogruppe darstelltundR^dieobengenannteBedeutunghat, wobei jedederobgenanntenNiedrigalkyl-oder Niedrigalkoxygruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, mit einem primären Amin der Formel 20 r2nh2, worinR3 dieoben genannte Bedeutung hat, in einem wasserfreien, reaktionsinerten, flüssigen organischen Medium bei einer Temperatur von -15 °C bis +50 °C umgesetzt wird.
  2. 2. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Herstellung einer neuen Verbindung der allgemeinen Formel IV, 25 30 35
    Verbindung der allgemeinen Formel Π,
    (Π) worin R* bis R1 die im Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, mit mehr als einem Molanteil von Amino-50 diphenylmethan, Trifluorethylamin, tert-Butylamin, Methoxyamin oder O-Benzylhydroxylamin bei 20 °C bis 60 °C behandelt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsmedium ein solches verwendet, das Methanol, Chloroform, Methylenchlorid oder ein anderes Nieder-Halogenalken enthält -12- 1 Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß 7-[(Dimethylamino)methylen]imino-N^- 2 (dimethylamino)methylen-9a-methoxymitosan mit Aminodiphenylmethan umgesetzt wird.
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