AT397091B - Verfahren zur herstellung von neuen mitosan-derivaten - Google Patents

Description

5 AT397091B

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Verbindung der allgemeinen Formel I

10 in welcher A für (l-Niederalkyl-2(lH)-pyridinyliden)-imino oder eine Gruppe da- allgemeinen Formeln: 15

25 steht, worin n für Null oder 1 steht

Rl Wasserstoff oder Niederalkyl bedeutet,

Wasserstoff, Niederalkyl oder Diniederalkylamino darstellt, R^ Niederalkyl, Niederalkoxy oder Benzyloxy darstellt oder gemeinsam mit R^ und dm Stickstoff, an welches 30 sie gebunden sind, einen Pyrrolidin-, Piperidin-oder Morpholinring bildet, R^ Niederalkyl bedeutet oder gemeinsam mit R^ und dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Pyrrolidin-, Piperidin- oder Morpholinring bildet, R^ und R^ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Niedrigalkyl stehen, wobei jede der obgenannten Niedrigalkyl- oder Niedrigalkoxygruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. 35 Die neuen Verbindungen sind wertvolle Antitumor-Mittel, deren Wirkung z. T. die des bekannten Mitomycin C übertrifft. Außerdem können die neuen Verbindungen auch als Zwischenverbindungen zur Herstellung anderer Mitomycin C-Derivate verwendet werden.

Gemäß „Chemical Abstracts“ ist der systematische Name für Mitomycin C: [laR-(laa,8ß,8aa,8ba)]-6-Amino-8-{[(aminocarbonyl)oxy]-methyl}-l,la,2,8,8a,8b-hexyhydro-8a-methoxy- 40 5-methyl-azirino-[2,,3'3,4]-pyirolo[l^-a]indol-4,7-dion, gemäß welchem das Azirinopyrroloindolringsystem wie folgt numeriert wird: 7

Chemical Abstracts

Ein triviales Nomenklatursystem, welches in der Mitomycin-Literatur weitverbreitete Anwendung gefunden hat, identifiziert das vorhergehendeRingsystem einschließlich mehrerer charakteristischer Substituenten des Mitomycins als Mitosan. -2-

AT397091B

IS Dieses System ist zweckmäßig und genügt für eine Anzahl von einfachen Derivaten, wie jenen, die N-

Substituenten an dem Stickstoffatom des Azinoringes oder in den 7- oder 9a-Stellungen tragen, trotz bestimmt» Mehrdeutigkeiten und Mängel für die allgemeine Anwendung. Was die erfindungsgemäß hergestellten Verbindun-gen betrifft, von weichen einige sowohl am Azinoring-S tickstoffatom als auch am Seiienketten-Carbamoyl-Stickstoff Substituenten aufweisen, gibt es keinekonventionelle Numerierung, um diese Stellungen zu unterscheiden. Man hat 20 sich daher hier dafür entschieden, unter Anwendung des Mitosan-Nomenklatursystems das Azirino-Stickstoffatom als N*a und das Carbamoyl-Stickstoffatom als zu bezeichnen. Was die stereochemische Konfiguration der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen betrifft, so soll, wenn sie mit dem Grundnamen „Mitosan“ oder durch Strukturformeln bezeichnet werden, ihre stereochemische Konfiguration in gleicher Weise wie jene des Mitomycins C identifiziert werden. 25 Mitomycin C ist ein Antibiotikum, welches durch Fermentation hergestellt wird und derzeit von der „Food and

Drug Administration“ zur Therapie von verbreiteten Adenocarcinomen des Magens oder der Bauchspeicheldrüse in erprobten Kombinationen mit anderen bewährten chemotherapeutischen Mitteln und zur palliativen Behandlung vertrieben werden, wenn andere Anwendungen versagt haben (Mutamycin®, Bristol Laboratories, Syrakus, New York 13201, Physicians’ Desk Reference, 35. Ausgabe, 1981, S. 717 und 718). 30 Mitomycin C und seine Herstellung durch Fermentation ist der Gegenstand des US-PS 3 660 578, patentiert am 2. Mai 1972 unter Beanspruchung von Prioritäten früherer Anmeldungen, einschließlich einer japanischen Anmeldung, die am 6. April 1957 in Japan angemeldet wurde.

Die Strukturen der Mitomycine A, B und C und von Porfiromycin wurden zuerst von J. S. Webb et al, Iderle Laboratories Division American Cyanamid Company, J. Amer. Chem. Soc. 84,3185 - 3187 (1962), veröffentlicht. 35 Eine dieser chemischen Umwandlungen, die in diesen Strukturstudien angewendet wurden, um Mitomycin A und Mitomycin C miteinander in Beziehung zu bringen, war die Überführung des ersteren, 7,9a-Dimethoxymitosan, durch Reaktion mit Ammoniak in das letztere, 7-Amino-9a-methoxymitosan. Verdrängung der 7-Methoxygruppe des Mitomycins A hat bewiesen, daß sie eineReaktion von besonderem Interesse bei der Herstellung von Antitumoraktiven Derivaten des Mitomycins C ist Die folgenden Artikel und Patente befassen sich jedes mit der Überführung 40 von Mitomycin A in ein 7-substituiertes Amino-mitomycin C-Derivat mit Antitumor-Wirksamkeit. Ziel der Erfindung ist es, Derivate herzustellen, die wirksamer sind und die insbesondere weniger toxisch sind als Mitomycin C:

Matsui et al. „The Journal of Antibiotics“, XXI, 189 -198 (1968). 45 Kinoshita et al. „ J. Med. Chem.“ 14,103 -109 (1971).

Iyengar et al. J. Med. Chem.“ 24,975 - 981 (1981). lyengar, Sami, Remers, and Bradner, Abstracts of Papers Annual Meeting of the American Chemical Society, Las Vegas,

Nevada, March 1982, Abstract No. MEDI72. 50

Die folgenden Patentschriften behandeln die Herstellung von 7-substituierten Aminomitosan-derivaten durch Umsetzung von Mitomycin A, Mitomycin B oder einem N^-substituierten Derivat hievon mit einem primären oder sekundären Amin: 55 Cosulich et al. US-PS 3,332,944, PaL am 25. Juli 1967.

Matsui et al., US-PS 3,420,846, Pat. am 7. Jänner 1969 Matsui et al., US-PS 3,450,705, paL am 17. Juni 1969. -3-

AT397 091B

Matsui et al., ÜS-PS 3,514,452, paL am 26. Mai 1970.

Nakano et al., US-PS 4,231,936, pat. am 4. November 1980.

Remers, US-PS 4,268,676, paL am 19. Mai 1981. 5 Mitomycin C-Derivate, welche einen substituierten Aminosubstituenten in der 7-Stellung aufweisen, wurden durch direkte Biosynthese ebenfalls hergestellt, d. h. durch Zusatz einer Reihe von primären Aminen zur Gärbrühe und Durchführung der herkömmlichen Mitomycin-Permentation (C. A. Claridge et al. Abst. of die Annual Metting of Amer. Soc. for Microbiology 1982, Abs. 028).

Mytomicin C ist das hauptsächliche durch Fermentation hergestellte Mitomycin und stellt die im Handel 10 verfügbare Form dar. Die derzeit übliche Technologie für die Umwandlung von Mitomycin C in Mitomycin A zur

Anwendung bei der Herstellung der semisynthetischen substituierten Aminoanaloga von Mitomycin C, die in den vorhergehendenPublikationen beschrieben werden, umfaßtdieHydrolysevon Mitomycin C zudem entsprechenden 7-Hydroxymitosan, einer in hohem Maße instabilen Verbindung, und die darauf folgende Methylierung dieser Substanz mit Diazomethan, welches eine sehr gefährlich zu handhabende Substanz darstellt Ein Versuch, die 15 Verwendung von Diazomethan zur Methylierung des 7-O-Demethyl-mitocyn A, welches durch Hydrolyse von Mitomycin C gebildet wird, zu vermeiden, umfaßt die Verwendung von 7-Acyl-oxymitosanen (Kyowa Hakko Kogyo KK Jap. PS J5 6073 - 085, Farmdoc. Nr. 56227 D/31).

Die Erfindung betrifft die Herstellung einer neuen Gruppe von Mitomycin-Analoga, bei welcher das 7-AminostickstoffatomdesMitomycinCinsbesondereTeü eines Amidinosubstituentenbildetoderder7-AminostickstofF 20 Teil einer Guanidinogruppe ist

Die neuen Verbindungen werden erfindungsgemäß dadurch hergestellt daß man eine Lösung von Mitomycin C

35 40

Mitomycin C oder ein N^a-Niederalkylderivat desselben in Dimethylformamid (oder einem anderen verträglichen Lösungsmittel) mit 1,0 - 1,5-molaren Anteilen von Natriumhydrid umsetzt wodurch eine anionische Form von Mitomycin C entsteht, und diese anionische Form mit einem Imino-geschützten Iminoether der allgemeinen Formel ROCH2 = NR’, worin R für eine Isoalkylgruppe und R’ für eine Imino-Schutzgruppe steht, einem Halogenmethyleniminiumhalogenid der allgemeinen Formel 45 R - X I c % wNN+R3R4y" oder einem Imidoylhalogenid der allgemeinen Formel 50 R2-C = NR3,

I

X worin X und Y Halogen bedeuten und R2, R3 und R^ die oben genannte Bedeutung besitzen, umsetzt und die Schutzgruppen für die Iminogruppierungen wieder entfernt

Der Fachmann wird feststellen, daß tautomere Formen von einigen der oben angegebenen Amidinogruppen -4- 55

AT397 091B existieren. Diese weiden von den oben angegebenen Formeln ebenfalls umfaßtund liegen im Rahmen der Erfindung. Die Amidinoderivate der allgemeinen

I 5 Formel I, in welcher A für R3NHC=N- steht, werden aus der anionischen Form von Mitomycin C oder einem N7- substituierten Derivathievon durch Umsetzung miteinem Halogenmethyleniminiumsalz hergestellt. Zur Verwendung bei diesem Verfahren geeignete Halogenmethyleniminiumsalze wurden in der Literatur beschrieben. Repräsentativ sind jene, welche von W. Kantlehner in „Advances in Organic Chemistry“, Bd. 9, Teil 2, Wiley Interscience, 1979, S. 81 und 82, aufgezählt werden. Die folgende Tabelle I ist dieser Aufzählung entnommen. 10

Tabelle I

Halogenmethyleniminiumsalze 15 20 R2 R3 R4 X Y Fp.,°C H CH3 ch3 CI CI 140-145 H ch3 ch3 Br Br 156-158 25 H ch3 ch3 I I 110 H -(CH2)5- CI CI 58-66 H ch3 C6H5 CI CI Oil ch3 ch3 ch3 α CI 150-120 C2H5 ch3 ch3 CI CI 68-70 30 C2H5 -(CH2)5- α CI 82-85 n-C3H7 ch3 ch3 CI CI 82-84 n-C3H7 C2H5 C2H5 CI CI '20 i-C3H7 C2H5 C2H5 CI CI '20 n-C4H9 ch3 ch3 CI CI 50-55 35 -(CH2)3- ch3 CI CI 75-79 C6H5 ch3 H CI CI 93-95 C6H5 ch3 H CI Br 115-117 C6H5 ch3 D CI Br 115-118 C6H5 ch3 ch3 CI CI 95-96 40 C6H5 -(CH2)5- CI CI 136-140 C6H5 -(CH2)4- Br Br3 64 C6H5 -(CH2)5- Br Br3 97 C6H5 Λ -CH-(CH2)4-CH- I | Br Br3 125 45 ch3 ch3 0>η5 -CH-(CH2)3-CH- 1 I Br Br3 124 ch3 ch3 C6H5 ch3 ch3 Br Br 120 (Zers.) 50 C6H5 -(CH2)4- Br Br 178 (Zers.) C6H5 -(CH2)6- Br Br 195 (Zers.) C6H5 -CH-(CH2)4" 1 Br Br 160 ch3 55 C6H5 -CH-(CH2)3-CH-1 | Br Br - ch3- ch3 -5 AT397 091B Tabelle I (Fortsetzung) R2 R3 R4 X Y Fp.,°C C6H5 -CH-(CH2)4- 1 Br Br 85-95 n-C3H7 P-OCH3-C6H4 -(CH2)5- CI CI 85 P-NO2-C6H4 ch3 ch3 CI CI 90 (Zers.) P-NO2-C6H4 -(CH2)5- CI CI 117-119 im ch3 H CI CI 103-104 ch3 H CI Br 132-134 (Zers.) J\ ch3 D CI CI 103 -105 0 ' ch3 D CI Br 133-134 (Zers.) C2H5 H CI CI 93-94 C2H5 H CI Br 151 -152 ch3 ch3 CI CI 181 -182 C2H5 C2H5 CI CI 99-103

Bei Verwendung eines Halogenmethyleniminiumsalzes als Reaktionsmittel, wie sie in Tabelle I angegeben weiden, ist es manchmal zweckmäßig, das entsprechende Amin, d. i. das Amid, aus welchem das Iminiumsalz hergestellt wurde, als Lösungsmittel zu verwenden. In Fällen, in welchen die entsprechenden Amide fest sind, kann Hexamethylphosphoramid oder Pyridin verwendet weiden. Dies wird in dem folgenden Beispiel 5 beschrieben.

Die Imidoylchloride, die sich von N-substituierten Formamiden ableiten, sind ebenfalls für diesen Zweck geeignete Reaktionskomponenten. Ihre Herstellung ist wohlbekannt, und sie weiden in Tabellen angeführt, welche H. Ulrich, „The Chemistry of Imidoyl Halides“, Plenum Press, New York, 1968, S. 74 - 76, entnommen ist. Ihre Reaktion mit Aminen unter Bildung von Amidinen ist ebenso bekannt und wird von S. R. Sandler und W. Karo in „Organic Chemistry; Bd. 12 - ΙΠ, A. T. Blomquist und H. Wasserman, Herausgeber, Academic Press, New York, 1972, S. 227, beschrieben.

Tabellen

Imidoylchloride R2-C=NR3

CI R2 R3 Kp„°C/Pa (Schmp. °C) ch3 CöHll 45 - 56/5,3 C6H5 (118-120) 2-CH3C6H4 60/133 2-FC6H4 70/33,3 2-QC6H4 111 -114/1862 2-BrQjH4 142-143/1596 C2H5 C6H11 43-44/2,7 CH3CH2CC12 C2H5 72-75/1862 (CH3)2CH CöHn 40-41/0,133 2-CH3CöH4 67/39,9 4-CH3C6H4 80 - 85/106,4 4-CH3OC6H4 93-94/33,3 n-C4H9(C2Hs)CH n-C4H9 72 - 76/93,1 (CH3)3C C6H11 104 -106/2660 C6H10CI C2H5 102/399 -6-

AT397 091B

Tabelle Π (Fortsetzung! R2 R3 Kp., °C/Pa (Schmp. °C) 5 C6H5 CH3 46-47/266 90-92/1729 C2H5 47-48/133 1C3H7 52 - 54/133 10 n-C4H9 85-86/133 C6H11 110-112/133 (66 - 67) CH2C6H5 128-130/133 C6H5 175 -176/1596 15 2,6-(CH3)2C6H3 (40-41) 153 -156/133 2-CH3OC6H4 188-190/798 4CH3OC6H4 198 - 200/2660 (61-63) 20 2,4-(02N)2C6H3 (122-124) 2-CH3C6H4 C6H5 174-177/1330 4-CH3C6H4 C6H5 141 -144/133 (40-41) 4-CIC6H4 C6H5 (66 - 67) 25 4-BrC6H4 4-BrC6H4 (93 - 94) 4-CH3OC6H4 C6H5 183-185/399 (73-76) 4-O2NC6H4 C6H11 (40-42) C6H5 (137-138) 30 4-02NC6H4 (132-134) 3,5-(02N)2C6H3 C6Hn (86 - 87) 2,4,6-(CH3)3C6H2 C6H5 164-165/133 (60 - 62) 35

Die Substanzen der allgemeinen Formel I, in welcher A eine am Stickstoff unsubstituierte Amidinogruppe R2 H2N-C=N- 40 45 ist, werden durch Umsetzung eines Imino-geschützten Iminoäthers mit Mitomycin C, einem N^-substituierten Derivat hievon oder einem N^-Niederalkylderivat von einem der beiden in der anionischen Form in der oben beschriebenen Weise hergestellt. Die Schutzgruppe wird sodann in herkömmlicher Weise entfernt. Isopropylformamidat, in welchem die Aminogruppe durch die ß-Trimethylsilyläthoxycarbonylgruppe geschützt ist, ist ein geeignetes Reaktionsmittel (Beispiel 1).

ClC02CH2CH2Si(CH3)3 (CH3)2CHOCH=NH. HCl-(CH3)2CH0CH=NC02CH2CH2Si(CH3)3 50 Wenn A für (l-Niederalkyl-2(lH)-pyridinyliden)amino oder die Gruppe der allgemeinen Formel

-7 5

AT397 091B steht, umfassen die präparativen Verfahren die Umsetzung der anionischen Form des Mitomycin C mit cyclischen Halogenmethyleniminiumsalzen oder Imidoylhalogeniden, in welchen R2 und R3 der allgemeinen Formel

R7R2 I I R3-N-C=N- 10 unter Bildung eines Ringes miteinander verbunden sind. Zur Reaktion mit dem Mitomycin C-Anion geeignete Reagenzien sind 2-Chlor-l-methylpyridiniumjodid (Beispiel 4), 2-Chlor-4,5*dihydro-l-methyl-l(3H)-pynolidiniumchloridCTabelleI),NJN’-Dimethyl-N^’-trimethylen-chlorofonnami(liniumchloridundanderecyclische Imidoylhalogenide, die sich von 2-Pyrrolidinonen und 2-Piperidinonen ableiten. Wenn R7 und R^ des Endproduktes jeweils für Wasserstoff stehen, wird wiederum eine Schutzgruppe wie oben angegeben in dem cyclischen Halogenmethyleniminiumsalz-Zwischenprodukt verwendet. 15

Schmelzpunkte werden auf einem Thomas-Hoover-Kapillar-Schmelzpunktsapparat bestimmt und sind unkorrigiert Temperaturen werden in °C angegeben. KemmagnetischeProtonen-Resonanzspektren (NMR) werden auf einem Varian XLIOO-Spektrometer in Pyridin-d5 bestimmt, wenn nichtanders angegeben. Infrarotspektren (IR) weiden mit einem Beckman 4240-Spektrophotometer erhalten, und die Probe wird mit Kaliumbromid zu einer Pastille gepreßt. Die IR-Werte sind vmax in cm'1. Die UV-sichtbaren Spektren werden auf einem Varian-Cary 219 Spektrophotometer bestimmt. 20

DieDiinnschichtchromatographie (DSC) wird auf vorüberzogenen 0,25 mm-Silikagelplatten unter Verwendung von UV-Licht als Mittel zur Sichtbarmachung durchgeführt. Flash-Chromatographie wird unter Verwendung von Silica Woelm (32 - 63 pm) durchgeführt. Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck und unterhalb von 50 °C abgedampft.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert. 25

Beispiel 1:

Herstellung von 30 35

40 45 50 (A) Zu einer Lösung von 1 mMol Isopropylformimidat-Hydrochlorid in 2 ml Dimethylformamid (DMF) gibt man in einer Stickstoffatmosphäre bei 0 °C langsam 2,1 mMol Diisopropyläthylamin. Zu der erhaltenen Lösung gibt man bei 0 °C tropfenweise ß-Trimethylsilyläthyl-chlorformiat Die erhaltene klare Lösung wird als Lösung A bezeichnet (B) EineLösung von 1 mMol Mitomycin C in 5 ml DMF wird zu einer Suspension von 15 mMol Natriumhydrid in 3 ml DMF gegeben. Die Lösung wird 20 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und auf -40 °C bis -50 °C gekühlt, bevor die obige Lösung A hinzugefügt wird. Die Lösung wird 1 Stunde bei -40 °C gehalten und sodann auf Zimmertemperatur sich erwärmen gelassen. Nach etwa 6- bis 18-stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird das Reaktionsgemisch mit CH2CI2 verdünnt und filtriert Der nach dem Eindampfen des Filtrates erhaltene feste Rückstand wird auf Silikagel Chromatographien um die Amidino-geschützte Titel Verbindung zu isolieren. "(Q Die Amidino-Schutzgruppe der obigen Zwischenverbindung wird nach dem von Caipino und Tsao veröffentlichten Verfahren (J. Chem. Soc. Chem. Comm. 358 (1978)) entfernt, wobei die unsubstituierte Amidino-Titelverbindung erhalten wird.

Beispiel 2: Herstellung von

-8- 55

AT397091B (A) Zu einer Lösung von 1 mMol Isopropylformimidat-Hydrochlorid in 2 ml DMF gibt man in einer Stickstoffatmosphäre bei 0 °C langsam 21 mMol Diisopropyläthylamin. Zu der erhaltenen Lösung wird bei 0 °C Methyljodid hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wird als Lösung B bezeichnet. (B) Das in Beispiel 1*(B) beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Lösung A die 5 Lösung b verwendet wird unter Herstellung der Titelverbindung.

Beispiel 3: 10 15

(1) NaH £MP -> {2) φ Θ

Mitomycin C

Verbindung XIX 20

Es wird eine 0,5 M-Lösung von Ν,Ν-Dimethylchlormethyleniminium-chlorid hergestellt, indem 1,57 g (12,5 mMol) Oxalylchlorid bei 0 °C tropfenweise zu einer Lösung von 915 mg (12,5 mMol) DMF in 25 ml CHCI3 hinzugefügt wird und daraufhin 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt wird. Gesondert wird eine Lösung von 25 334 mg (1 mMol) Mitomycin C in 5 ml DMF zu einer Suspension von 36 mg (13 mMol) NaH in 3 ml DMF hinzugefügt. Die Lösung wird 20 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und auf -40 °C bis -50 °C gekühlt, worauf 3 ml (1,5 mMol) der obigen Lösung von NN-Dimethylchlonnethyleniminiumchlorid hinzugefügt werden. Nach 10 Minuten Rühren bei -40 °C wird weiteres NaH (18 mg, 0,75 mMol) hinzugegeben. Die Lösung wird 1 Stunde bei -4Q °C stehen gelassen, sodann mit CH2CI2 verdünnt und filtriert. Der nach dem Eindampfen des Filtrates erhaltene 30 Rückstand wird mittels Dünnschichtchiomatographie (DSC) auf Silikagel (10 % CH3OH-CH2CI als Eluierungsmittel)

Chromatographien. Extraktion des grünen Hauptbandes ergibt 78 mg (43 %, bezogen auf das rückgewonnene Mytomicin C) eines amorphen Feststoffes. NMR (Pyridin d5, δ): 2.18 (s, 3H), 2.70 (bs, 1H), 2.80 (s, 3H), 2.88 (s, 3H), 3.08 (bs, 1H), 3.24 (s, 3H) 3.56 (bd, 1H, J=12 Hz), 4.00 (dd, lH),4.44(d, lH,J=12Hz),5.06(t, lH,J=10Hz),5.56(dd, lH,J=10,4Hz),7.58(bs,2H), 35 7.88 (s,lH).

Extraktion des Purpurbandes ergibt 150 mg Mitomycin C.

Beispiel 4: 7-(l-Methyl-2-(H)-pyridinyliden)imino-9a-methoxymitosan 40

45 50

Zu einer Mischung von 242 mg (0,725 mMol) Mitomycin C und 43,5 g (1,81 mMol) NaH gibt man 4 ml DMF. Nach 15 Minuten dauerndem Rühren werden 370 mg (1,45 mMol) 2-Chlor-l-methyl-pyridinium-jodid bei 55 Zimmertemperatur hinzugefügt. DieLösung wird 1,5 Stunden gerührt und sodann mit Äthylacetat (ÄtOAc) verdünnt und filtriert. Der nach dem Eindampfen des Filtrates erhaltene Rückstand wird auf Silikagel chromatographiert (DSQ(5%CH30H-CH2Cl2alsEluierungsmittel).DasgeringereProdukt(12mg)istdas7-(Dimethylaminomethylen) -9-

AT397 091B amino-9a-methoxymitosan. Das größere Produkt (75 mg) wird weiter mittels Silikagel-DSC (10 % CH3OH-CH2CI2) gereinigt und ergibt 6 mg (2 %) der Titelverbindung: NMR (Pyridin &, 8) 2.11 (s, 3H), 2.76 (bs, 1H), 3.20 (m, 1H), 3.26 (s, 3H), 3.49 (s, 3H), 3.63 (dd, 1H, J=13, 1 Hz),4.01 (dd, 1H, J=ll, 4 Hz), 4.51 (d, 1H.J-13 Hz), 5.10 (t, 1H, J=10Hz), 5.43 (dd, 1H, J=10,4 Hz),5.99 (dt, 1H, J=9,2 Hz), 6.09 (dd, 1H, j=9,1 Hz), 6.95 (dd, 1H, J=9,7,2 Hz), 7.32 (dd, 1H, J=7,1 Hz).

Beispiel 5: 7-[(Methylaminomethylen)imino]-9a-methoxymitosan

12 mg (0,5 mMol) Natriumhydrid werden in einer Stickstoffatmosphäre zu einer Lösung von 167 mg (0,5 mMol) Mitomycin C in 2 ml Hexamethylphosphoramid gegeben. Zu dieser Lösung gibt man 19 mg (0,25 mMol) N-Methyiformimidoyl-chlorid (N. H. Bosshard und H. Zollinger, HoIy. Chim. Acta42,1659 (1959)). Die Lösung wird 10 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, und sodann werden 6 mg (0,25 mMol) NaH und 9,5 mg (0,13 mMol) N-Methylformimidoyl-chlorid hinzugefügt. Nach 6 bis 12 Stunden dauerndem Rühren wirddieLösung mit Äthylacetat verdünnt und filtriert. Beim Abdampfen des Lösungsmittels und darauffolgender chromatographischer Reinigung des Rückstandes erhält man die Titelverbindung.

Beispiel 6: Verbindung ΧΧΠ 7-(l-Pyrrolidinylmethylen)imino-9a-methoxymitosan

Es wird eine 0,5 molare Lösung von Pyrrolidinylchlormethyleniminium-chlorid hergestellt, indem 3,17 g (25 mMol) Oxalylchlorid bei 0 °C tropfenweise zu einer Lösung von 2,48 g (25 mMol) 1-Formylpyrrolidin in 50 ml CHCI3 hinzugefügt werden und danach 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt wird. Gesondert werden 24 mg (1 mMol) Natriumhydrid unter Stickstoff zu einer Lösung von 334 mg (1 mMol) Mitomycin C in 3 ml 1-Formylpyrrolidin gegeben. Nach 20 Minuten dauerndem Rühren bei Zimmertemperatur wird die Lösung auf -40 °Cbis -50 °C gekühlt und die oben hergestellte Iminiumsalzlösung (1 ml, 0,5 mMol) wird hinzugefügt. Zu dieser Mischung gibt man abwechselnd in Abständen von 10 Minuten 12 mg (0,5 mMol) NaH, 0,5 ml (0,25 mMol) der Iminiumsalzlösung, 6 mg (0,25 mMol) NaH, 0,25 ml (0,125 mMol) der Iminiumsalzlösung und schließlich 3 mg (0,125 mMol) NaH und 0,125 ml (0,063 mMol) der Iminiumsalzlösung. Nach 30 Minuten dauerndem Rühren bei -30 °C wird die Mischung auf Zimmertemperatur aufgewännt. Sie wird mit Äthylacetat verdünnt, und das anorganische Salz wird abfiltriert. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird mittels Dünnschichtchromatographie auf Silikagel (10 % CH3OH/CH2CI2) chromatographiert. Extraktion des grünen Bandes ergibt 120 mg (15 % Ausbeute) der Titelverbindung: NMR (Pyridin £5,8) 1.58 (m, 4H), 2.29 (s, 3H), 2.73 (m, 1H), 3.06 - 3.50 (m, 8H), 3.59 (dd, 1H, J=13,1 Hz), 4.03 (dd, 1H, J=10,4 Hz), 4.44 (d, 1H, J=12 Hz), 5.05 (t, 1H, J=10 Hz), 5.45 (dd, 1H, J=10,4 Hz), 8.04 (s, 1H) IR (KBr) Vmax, cm'1:3420,3280,2960 - 2870,1715,1625,1560,1300,1055. -10-

AT397 091B

Beispiel 7: 7-[N-Methyl-N-(methylimino)methyl]imino-9a-methoxymitosan

15

Das Verfahren desBeispiels5wird wiederholt, wobeiMitomycinCdurch9a-Methoxy-7-(N-methylamino)mitosan (Matsui et al., The Journal of Antibiotics, XXI, 189 -198 (1968)) in gleicher molekularer Menge ersetzt wird.

20 Beispiel 8: Verbindung XXVIII 7-(l,3-Dimethyl-2-imindazolidinyliden-imino-)-9a-methoxymitosan

35 0,34 g (1 mMol) Mitomycin C werden in 5 ml 1,3-Dimethyl-2-imidazolidon gelöst und 0,1 g Natriumhydrid (50 % in Öl, 2,08 mMol) werden bei Zimmertemperatur hinzugefügt. Die Mischung wird 20 Minuten bei Zimmer-40 temperatur stehen gelassen und sodann in einem Eis-Salz-Bad (-15 °C) abgeschreckt. Die Mischung wird 10 Minuten beidieserTemperatur belassen,worauf0,65g(2mMol)2-Chlor-l,3-dimethyl-4,5-dihydro-(3H)-imidazoliniumchlorid hinzugefügt werden. Sie wird 1 Stunde bei -15 °C stehen gelassen und sodann mit Äthylaeetat verdünnt und auf einer Aluminiumoxyd-Säule chromatographiert. Die Säule wird mit Methylenchlorid und daraufhin mit Methylenchlorid, das 2 Vol% Methanol enthält, eluiert. Man erhält eine grün gefärbte Fraktion, welche aus dem gewünschten Produkt 45 besteht und durch Chromatographie auf Aluminiumoxyd unter Verwendung von Methylenchlorid, das 10 Vol% Methanol enthält, weiter gereinigt wird; Ausbeute 20 mg (5 %).

Analyse: Ber. für C20H26N6O5·1 -1/4 H20: C 53,03; H 6,34; N 18,55 50 Gef: C 52,68; H 6,21; N 18,15. NMR (Pyridin -ds, 5) 2.32 (s, 3H), 2.47 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 2.74 (m, 1H), 3.03 - 3.32 (m, 5H), 3.26 (s, 3H), 3.66 (bd, 1H, J=12Hz),4.02 (dd, lH,J=ll,4Hz),4.75(d, lH,J=12Hz),5.09(bt, 1H, J=llHz),5.44(dd, lH,J=U,4Hz). IR (KBr) 3400,3280,2930,1700,1610,1480,1330,1055 cm'1. UV (MeOH, ^max) 600,375,252 (sh), 222 nm. -11-

AT397 091B

Beispiel 9: Verbindung XXIX 7-[(l,3-Diemthyltetrahydro-pyriinidinyliden)imino-9a-methoxymitosan

Natriumhydrid (50 % Öldispersion, 200 mg, 4,2 mMol) wird unter Stickstoff zu einer Lösung von 680 mg (2 mMol) Mitomycin C in 8 ml 13-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro (1H, 3H)-2-pyrimidinon gegeben. Die Mischung wird 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen und sodann auf -25 °C gekühlt Es werden 0,73 g (4 mMol) 2-Chlor-l,3-dimethyl-23,43-tetrahydro-pyrimidinium-chlorid hinzugefügt, und die Mischung wird sodann 3 Stunden bei -25 °C stehen gelassen. Sodann wild sie mit Äthylacetat und 2 ml Methanol verdünnt Mit der Mischung wird ohne weitere Behandlung eine trockene Aluminiumoxyd-Chromatographiersäule beladen und zuerst mit Methylenchlorid und dann mit 2 Völligem Methanol/Methylenchlorid eluiert, wobei 0,35 g (39,5 % Ausbeute) des gewünschten Produktes, Fp. 138 -140 °C, erhalten werden.

Analyse; Ber. für C21H27N6O5: C 54,65; H 633; N 18,21

Gef.: C 54,78; H 6,18; N 18,21. NMR (Pyridin -ds, 5) 1.80 (m, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.52 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.76 (m, 1H), 2.90 - 3.30 (m, 5H), 3.26 (s,3H), 3.74 (d, lH,J=12Hz),4.05 (dd, lH,J=ll,4Hz),4.97(d, 1H, J=12Hz),5.09 (t, lH,J=UHz),5.41 (dd, 1H, J=ll,4Hz). IR (KBr) 3430,3280,2930,1710,1570,1480,1450,1350,1050 cm’1. UV (MeOH, *max) 635,377,264 (sH), 223 nm.

Beispiel 10: Verbindung XXX 7-(Tetramethyldiaminomethylen)imino-9a-methoxymitosan

425 mg (1,42 mMol) Mitomycin C werden mit 85,3 nig einer 50 %igen Dispersion von Natriumhydrid in Öl gemischtund4mlDimethylformamid werdenhinzugefügtDieMischung wird lOMinuten in einer Argonatmosphäre beiZinunertemperaturgerührtundsodannauf-350C gekühlt289mg (2,13 mMol) Tetramethylchloroformaimdinium-chlorid werden hinzugefügt unddieMischung wird während eines Zeitraumes von2Stundenauf5°C sicherwärmen gelassen. Zerkleinertes Trockeneis wird sodann zu der Mischung hinzugefügt um die Reaktion abzuschrecken, und das Lösungsmittel wird durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird auf einer Aluminiumoxydsäule (100 g) unter Verwendung von 3 Vol% Methanol in Methylenchlorid zur Eluierung -12-

AT397091B

Chromatographien. Dieses Material wird durch Aluminiumoxyd-DSC (5 Vol% Methanol in Methylenchlorid) weiter gereinigt, wobei zwei Fraktionen von 17 mg und 76 mg erhalten werden. Die letztere wird aus Aceton-Äther umkristallisiert, wobei das gewünschte Produkt, Fp. 193 -195 °C, erhalten wird (12 % Ausbeute).

Analyse: Ber. für C20H28N6O5: C 55,54; H 6,53; N 19,43

Gef.: C 54,92; H 6,53; N 19,29. NMR (Pyridine-d5,6) 2.26 (s, 3H), 2.59 (s, 6H), 2.68 (s, 6H), 2.75 (m, 1H, 3.15 (d, 1H), J=4 Hz), 3.26 (s, 3H), 3.65 (d, 1H, J=12 Hz), 4.00 (dd, 1H, J=11,5 Hz), 4.62 (d, 1H, J=12 Hz), 5.04 (t, 1H, J=11 Hz), 4.38 (dd, 1H, J-l 1, 5 Hz). IR (KBr) 3430,3280,2920,1710,1610,1495,1335,1055 cm’1. UV (MeOH, ^max) 610,380,260,220 nm.

Beispiel 11: Verbindung XXXI 7-(l-Piperidinylmethylen)imino-9a-methoxymitosan

Es wird eine 0,5 m-Lösung von Piperidinylchlormethyleniminiumchlorid hergestellt, indem 380 mg (3 mMol) Oxalylchloridzu6ml Chloroform,dasO,34g(3mMol)l-Formylpiperidin enthält tropfenweise hinzugefügt werden. Gesondert wirdNatriumhydrid (50 %ige Öldispersion, 96 mg, 2 mMol) unter Stickstoff zu einer Lösung von 334 mg (1 mMol) Mitomycin C in 3 ml 1-Formylpiperidin hinzugefügt. Nach 15-minütigem Rühren bei Zimmertemperatur wird die Lösung auf -25 °C gekühlt und die oben hergestellte Iminiumsalzlösung (4 ml, 2 mMol) wird zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei -25 °C stehen gelassen und durch Zugabe von Trockeneis abgeschreckt. Nach Zugabe von 1 ml Methanol wird die Mischung auf neutralem Aluminiumoxyd absorbiert. Dieses Material wird auf eine Aluminiumoxydsäule (30 g) gegeben. Die Säule wird zuerst mit Methylenchlorid und dann mit 3 Vol% Methanol in Methylenchlorid eluiert, wobei 360 mg (84 %) der Titelverbindung, Fp. 68 - 70 °C, erhalten werden.

Analyse: Ber. für C21H25N5O6.I -1/4 H2O: C 55,80; H 6,58; N 15,49

Gef.: C 55,57; H 6,21; N 15,91. NMR (Pyridin -d5, d) 1.42 (bs, 6H), 2.19 (s, 3H), 2.72 (m, 1H), 3.06 - 3.30 (m, 3H), 3.25 (s, 3H), 3.48 - 3.70 (m, 2H),3.57 (d, 1H,J=13 Hz),4.01 (dd, 1H, J=ll,4 Hz),4.43 (d, 1H, J=13 Hz), 5.02 (bt, 1H, 3=11 Hz), 5.55 (dd, 1H, J=11,4 Hz), 7.86 (s, 1H). IR (KBr) 3440,3350,3300,2935,2835,1710,1615,1520,1445,1305,1250,1200,1055 cm'1. UV (MeOH, *max) 590,389,262 (sh), 234,212 (sh) nm.

Wirksamkeit gegen P-388 Murin-Lenkämie:

Tabelle ΙΠ enthält die Ergebnisse der Laboratoriumtests mitCDFi-weiblichen Mäusen, welchen intraperitoneal ein Tumor-Impfstoff von 10^ Ascites-Zellen von P-388 Murin-Leukämie implantiert wurde und welche mit verschiedenen Dosen entweder einer Testverbindung der allgemeinen Formel I oder von Mitomycin C behandelt wurden. Die Verbindungen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Für jede Dosierungsmenge wurden Gruppen von sechs Mäusen verwendet und sie wurden mit einer einzigen Dosis der Verbindung an nur einem Tag behandelt. In jede Versuchsreihe wurde eine Gruppe von 10 mit Salzlösung behandelten Kontrollmäusen eingebracht. Die mit Mitomycin C behandelten Gruppen wurden als sichere Kontrolle eingebracht. Es wurde ein 30 Tage-Protokoll verwendet, in welchem die mittlere Überlebenszeit in Tagen, die für jede Gruppe von Mäusen bestimmt wurde, und die Anzahl der Überlebenden am Ende der 30 Tage-Periode notiert wurden. Die Mäuse wurden vor der Behandlung und wiederum am Tage 6 gewogen. Die Massenveränderung wurde als Maß für die Toxizität -13-

AT397 091B der Droge genommen. Es wurden Mäuse mit je 20 Gramm Masse verwendet, und ein Massenverlust bis zu etwa 2 g wurde nicht als übermäßig angesehen. Die Ergebnisse wurden in Werten von % T/C bestimmt, welches das Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Gruppe zu der mittleren Überlebenszeit der mit Salzlösung behandelten Kontrollgruppen mal 100 darstellt. Die mit Salzlösung behandelten Kontrolltiere starben im allgemei-S nen innerhalb von neun Tagen. Die „maximale Wirkung“ in der folgenden Tabelle wird ausgedruckt als % T/C, und es wird die Dosis angegeben, die diese Wirkung ergibt. Die Werte in Klammer sind die Werte, die mit Mitomycin Cals tatsächlicher Kontrollprobe bei dem gleichen Versuch erhalten wurden.Es kann soein Maß für die Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten Substanzen im Vergleich zu Mitomycin C geschätzt werden. Eine minimale Wirkung in Werten von % T/C wird mit 125 angenommen. Die minimal wirksame Dosis, die in der folgenden Tabelle 10 angegeben wird, ist jene Dosis, die ein % T/C von etwa 125 ergibt Diebeiden Werte, die in jedem Fall in der Kolonne der „durchschnittlichen Massenänderung“ angegeben weiden, sind die durchschnittliche Massenveränderung pro Maus bei der maximalen wirksamen Dosis, bzw. bei der minimalen wirksamen Dosis. 20 25

Tabelle IV 15 Hemmung der P-388 Munn-Leukämie Verbindung (Beispiel Nr) Maximale Wirkung Minimale wirksame Dosis Durchschnitt Massenverlust 2 %T/C Dosis1 XXXI (11) 150(144) 6.4 (4.8) 1.6 -1.6,-2.3 267(267) 3.2(4.8) <1.6 -2.3,-1.7 xxvm(8) 119(313) 3.2(3.2) 3 2 +2.2,+2.2 XXIX (9) 331 (319) 25.6(3.2) 0.4 -2.8,+0.6 XXX (10) 2.6(263) 3.2(4.8) <3.2 -1.7,-1.7 1 mg^cg Körpermasse 2 Gramm pro Maus, Tage 1 - 6, bei den maximalen und bei den minimalen wirksamen Dosen. 30

Die Verbindung XXX (Beispiel 10) und die Verbindung XXIX (Beispiel 9) wurde gegen das B16-Murin-Melanom getestet unter Anwendung der subkutanen Tumor-Implantation und der intravenösen Drogenbehandlung. Der Behandlungsplan und die Bewertung der Überlebenszeit (es wurde ein 40 Tage-Protokoll verwendet) wurden 35 wie oben angegeben bestimmt Es wurde die Massenveränderung am Tag 12 gemessen. Die maximale wirksame Dosis der Verbindung XXX betrug 1 mg pro kg und ergab ein % T/C von 156 und eine Massenzunahme von 15 g. Es wurden Gruppen zu 6 Tieren verwendet, und 3 Tiere überlebten das gesamte 40 Tage-Protokoll bei dieser Dosis. Die minimale wirksame Dosis betrug 0,25 mg/kg, bei welcher Dosis die 12 Tag-Massenveränderung 1,0 g betrug. Für die Verbindung XXIX betrug die maximale wirksame Dosis 8 mg/kg bei einem % T/C von 177 und einer 40 Massenveränderung von -0,6. Dieminimale wirksame Dosis betrug4 mg/kg bei einer Massenveränderung von+0,8.

Bei dem gleichen Versuch betrug die maximale wirksame Dosis von Mitomycin C 3 mg/kg bei einem % T/C von 195 und einer Massenveränderung von -0,5. Die minimale wirksame Dosis von Mitomycin C wurde nicht bestimmt 45 50 -14- 55

Claims (1)

1. 5 10 25 30 35 40 45 50 AT397091B PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung einer neuen Verbindung der allgemeinen Formel (I)

   in welcher A für (l-Niederalkyl-2(lH)-pyridinyliden)-imino oder eine Gruppe der allgemeinen Formeln:

   steht, worin n für Null oder 1 steht, Rl Wasserstoff oder Niederalkyl bedeutet, R2 Wasserstoff, Niederalkyl oder Diniederalkylamino darstellt, R3 ' Niederalkyl, Niederalkoxy oder Benzyloxy darstellt oder gemeinsam mit R4 und dem Stickstoff, an welches sie gebunden sind, einen Pyrrolidin-, Piperidin- oder Morpholinring bildet, R4 Niederalkyl bedeutet oder gemeinsam mit R3 und dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Pyrrolidin-, Piperidin- oder Morpholinring bildet, B? und R^ unabhängig von einander für Wasserstoff oder Niedrigalkyl stehen, wobei jede der obgenannten Niedrigalkyl- oder Niedrigalkoxygruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Mitomycin C

   -15- 55 AT397091B oder einN^a-Niederalkylderivat desselben in Dimethylformamid (oder einem anderen verträglichen Lösungsmittel) mit 1,0 - 1,5-molaren Anteilen von Natriumhydrid umsetzt, wodurch eine anionische Form von Mtomycin C entsteht, unddieseanionischeForm mit einem Imino-geschützten Iminoether der allgemeinen Formel ROCH2=Nr’, worinRfüreinelsoalkylgruppeundR’ fiireinelmino-Schutzgruppe steht, einem Halogenmethyleniminiumhalogenid 5 der allgemeinen Formel 10 R - X 1 c % >n+r3r4y" oder einem Imidoylhalogenid der allgemeinen Formel 15 R2-C = NR3, I X 20 worin X und Y Halogen bedeuten und R2, R3 und R^ die oben genannte Bedeutung besitzen, umsetzt und die Schutzgruppen für die Iminogruppierungen wieder entfernt. .25 30 35 40 45 50 -16- 55