AT396688B - Verfahren zur herstellung von kristallinem - Google Patents

Description

AT396688B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von kristallinem 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan, das sogar bei Temperaturen bis zu 100 °C stabil ist. Es handelt sich dabei tun eine neue kristalline Form.

Mitomycin C ist ein Antibiotikum, das durch Fermentation erhalten wird und das derzeit mit Genehmigung der 5 Food and Drug Administration für die Therapie disseminierter Adenokarzinome des Magens oder Pankreas zusammen mit anderen genehmigten chemotherapeutischen Wirkstoffen eingesetzt wird. Diese Verbindung dient auch zur palliativen Behandlung, wenn andere Maßnahmen nicht anschlagen (Mutamycin® Bristol Laboratories, Syracuse, New York 13201, Physicians' Desk Reference, 38. Auflage, 1984, Seite 750). Mitomycin C und dessen Herstellungdurch Fermentation ist Gegenstand der US-PS 3660578(patentiert am 2. Mai 1972), welche die Priorität 10 früherer Anmeldungen einschließlich einer inJapan am 6. April 1957eingereichten Anmeldung in Anspruch nimmt

Die Strukturen der Mitomycine A, B und C und von Porfiromycin wurden zuerst von J. S. Webb et al. von der LederleLaboratories Division of American Cyanamid Company veröffentlicht,!. Amer.Chem. Soc. 84,3185-3187 (1962). Eine bei dieser Strukturuntersuchung eingesetzte chemische Transformation, um die Beziehungen zwischen Mitomycin A und Mitomycin C festzustellen, war die Umwandlung der erstgenannten Verbindung, 7,9a-15 Dimethoxymitosan,durchUmsetzungmitAmmoniakzur letztgenannten Verbindung, 7-Amino-9a-methoxymitosan.

Es hat sich herausgestellt daß der Ersatz der 7-Methoxygruppe von Mitomycin A eine Reaktion darstellt, die für die HersteUungvonwirksamenAntitumorderiYatenvonMitomycmCvonbeträchdichemInteresseist.Dienachstehend aufgeführten Artikel und Patentschriften beschäftigen sich jeweils mit der Umwandlung von Mitomycin A zum in 7-Stellung substituierten Aminomitomycin C-Derivat mit Antitumoraktivität: Matsui et al. "The Journal of 20 Antibiotics", XXI, 189-198 (1968); Kinoshita et al. "J. Med. Chem." 14,103-109 (1971); Iyengar et al. "J. Med. Chem.” 24,975-981 (1981); Iyengar, Sami, Remers und Bradner, Abstract ofPapers - jährliche Zusammenkunft der American Chemical Society, Las Vegas, Nevada, März 1982, Abstract No. MEDI72; Sasaki et al. "Internat. J. Pharm.", 1983,15,49.

Die nachstehenden Patentschriften beschäftigen sich mit der Herstellung der in 7-Stellung substituierten 25 Aminomitosanderivate durch Umsetzung von Mitomycin A, Mitomycin B oder eines N*a-substituierten Derivats davon mit einem primären oder sekundären Amin; Cosulich et al., US-PS 3 332 944, patentiert am 25. Juli 1967; Matsui et al., US-PS 3 450 705, patentiert am 17. Juni 1969; Matsui et al., US-PS 3 514 452, patentiert am 26. Mai 1970; Nakano et al., US-PS4231936, patentiert am 4. Nov. 1980; Remers, US-PS 4268 676, patentiert am 19. Mai 1981; Matsui et al., US-PS 3 420 846, patentiert am 7. Jänner 1969. 30 Die Mitomycin C-Derivate, die in 7-Stellung einen substituierten Aminosubstituenten aufweisen, wurden auch mittels direkte? Biosynthese hergestellt. Dazu verleibt man Fermentationsbrühen verschiedene primäre Amine ein und führt die übliche Mitomycin C-Fermentation durch (C. A. Claridge et al., Abstract der jährlichen Zusammenkunft der American Society for Microbiology 1982, Abs. 028).

In der BE-PS 896 963, auf deren Offenbarung hiermit bezug genommen wird, wird eine neue Gruppe von 35 Monoguanidino- oder Mono- und Bisamidinoanaloga von Mitomycin C beschrieben, bei denen das 7-Aminostickstoffatom und/oderdasN -Caibamoylstickstoffatom von Mitomycin C Teil eines Amidinosubstituenten ist (sind) oder bei denen der 7-Amino-Stickstoff Teil einer Guanidinogruppe ist. Eine dieser Verbindungen, deren Herstellunginden Beispielen 8 und 15 der genannten Patentschrift beschrieben ist,ist7-(Dimethy]aminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan mit folgender Strukturformel: 40

Diese Verbindung, die als amorpher Feststoff erhalten wird, verfügt über eine hohe Aktivität gegenüber P-388 Leukämie bei Ratten und ist wirksamer sowohl hinsichtlich des maximalen Effekts als auch der in Milligramm ausgedrückten Wirksamkeit (Vergleichsdosisgrößen für äquivalente Wirkungen) als Mitomycin C. Diese Verbin-55 düng ist jedoch im allgemeinen bei 25 - 56 °C instabil.

Auch die DE-OS 33 19 992 beschäftigt sich mit Mitomycin-Verbindungen und ihrer Herstellung. Die Verbindungen werden jedoch stets in amorpher Form erhalten, in der sie eine geringere Stabilität als in kristalliner Form haben. -2-

AT396688B

Amorphes 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan stellt man nach den in den Beispielen 8 und IS dar BE-PS 896 963 beschriebenen Verfahren her. Diese Verfahren sind nachstehend näher erläutert

Die Verbindung 1,7-[(DimethyIamino)-methylen]-anüno-N*®-(dimethylamino)-methylen-9a-methoxymitosan stellt man gemäß dem Beispiel 8 der BE-PS 896 963 wie folgt hen 5 Zu einer Suspension von 300 mg (1,50 mM) Mitomycin C in 25 ml Chloroform gibt man insgesamt 9,6 ml (2,4 ml Portionen bei 0,18,21 und 23 h) von Ν,Ν-Dimethylformamiddimethylacetal. Anschließend erhitzt man die Suspension 41 h auf etwa 50 °C.

Nach Abziehen des Lösungsmittels und überschüssiger Reagentien bei vermindertem Druck erhält man einen dunkelgrünen Rückstand. Ein Dünnschichtchromatogramm (Methylenchlorid/Methanol 20:1) zeigt die Abwesen-10 heit von Mitomycin C und die Anwesenheit zweier neuer grüner Komponenten (Rf = 0,16 und 0,22). Die Hauptkomponente (Rf=0,16) isoliert man durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Methylenchlorid/ Methanol 20:1 als Eluierungsmittel. Man erhält einen grünen Feststoff (340 mg, 51,5 %). Nach Lösen dieses Feststoffs in Diethylether und anschließender Zugabe von Hexan erhält man die Verbindung I als dunkelgrünes amorphes Pulver. 15 NMR (Pyridin d5, δ): 2,18 (s, 3H); 2,70 (bs, 1H); 2,76 (s, 3H); 2JS2 (s, 3H); 2,86 (s, 6H); 3,22 (s, 3H); 3,30 (bs, 1H); 3,60 (d, J = 12 Hz); 4,12 (dd, 1H, J = 10,4 Hz); 4,43 (d, 1H, J = 12 Hz); 4,90 (bs, 1H); 5,10 (t, 1H, J = 10 Hz); 5,52 (dd, 1H, J = 10,4 Hz); 7,85 (s, 1H); 8,64 (s, 1H). 20 IR (KBr) vmax, cm-1:3300,2930,1675,1620,1545,1230,1060. UV (HjO) nm: 390 und 244.

Analyse für C21H28N6^5: C H N 25 ber.: 56,71 6,08 18,90 gef.: 5630 638 17,88 7-(Dimethylaminomethylen)-arnino-9a-methoxymitosan (0) stellt man wie folgt her Zur Verbindung I (600mg; 1,35 mM), die in 10 ml Methanol gelöst ist, gibt man Aminodiphenylmethan (2,2 ml; 30 10,8 mM) und rührt die erhaltene Lösung 4 h bei 54 °C. Den Reaktionsverlauf überwacht man dünnschichtchromato graphisch (Methylenchlorid/Methanol 90:10). Nach 4 h ist das Ausgangsmaterial (Rf =035) verschwunden. Dafür isteineneuegrüne Hauptzone (Rf=0,29) "aufgetauchf.Man engt dieLösung bei vermindertem Druck ein und flash-chromatographiert (25 g Silikagel) den erhaltenen Sirup unter Verwendung von Methylenchlorid/Methanol 20:1 als Eluierungsmittel. Man vereinigt die Fraktionen, welche die grüne Komponente (Rf=0,29) enthalten, trocknet über 35 Na2SC>4 und engt ein. Man erhält die Verbindung Π als amorphen Feststoff (215 mg; 41 %). NMR (Pyridin £5,δ): 2,18 (s, 3H); 2,70 (bs, 1H); 2,80 (s, 3H); 2,88 (s, 3H); 3,08 (bs, 1H); 334 (s, 3H);3,56(bd, 1H, J = 12 Hz); 4,00 (dd, 1H); 4,44 (d, 1H, J = 12 Hz); 5,06 (t, 1H, J = 10 Hz); 5,56 (dd, 1H, J * 10,4 Hz); 7,58 (bs, 2H); 7,88 (s, 1H). 40 IR (KBr) v,^, cm-1:3300-3450,2960-2910,1715,1620,1535,1050. UV (H20) λ^, nm: 390 und 226. 45 Analyse für Ct 0H23N5OC: C H N ber.: 55,48 5,91 17,98 gef.: 54,83 5,67 16,90

Nachstehend ist das in Beispiel 15 der BE-PS 896 963 beschriebene Verfahren näher erläutert: 50 Man stellt eine 03 M Lösung von NN.-Dimethylchlormethyleniminiumchlorid her, indem man Oxalylchlorid (137 g; 12,5 mMol) bei 0 °C zu einer Lösung von Dimethylformamid (915 mg; 123 mMol) in 25 ml CHClj zutropft und anschließend 30 min bei Raumtemperatur rührt.

Getrennt davon gibt man eine Lösung von Mitomycin C (334 mg; 1 mMol) in 5 ml Dimethylformamid zu einer Suspension von NaH (36 mg; 13 mMol) in 3 ml Dimethylformamid. Man rührt die Lösung 20 min bei 55 Raumtemperatur, kühlt auf -40 °C—50 °C ab und gibt dann die oben beschriebene Lösung νοηΝ,Ν-Dimethylchlor- methyleniminiumchlorid (3 ml; 13 mMol) zu. Nach 10-minütigem Rühren bei -40 °C gibt man weiteres NaH (18 mg; 0,75 mMol) zu. Man hält die Lösung 1 h bei -40 °C, verdünnt dann mit CH2CI2 und filtriert. Man -3-

AT 396 688 B chromatographiert den nach Einengen des Filtrats erhaltenen Rückstand dünnschichtchromatographisch (TLQ an Silikagel (10 % CH3OH-CH2CI als Eluierungsmittel). Nach Extraktion der grünen Hauptbande erhält man 78 mg (43 % auf Basis des zurückgewonnenen Mitomycin C) eines amorphen Feststoffs, dessen NMR-Spektrum und dessen dünnschichtchromatographisches Verhalten mit dem Spektrum bzw. Vorhalten der wie oben helgestellten 5 Verbindung II identisch sind.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von kristallinem 7-(Dimethylamino-methylen)-amino-9a-methoxymitosan, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man amorphes 7-(Dimetylamino-methylen)-amino-9a-methoxymitosan in Ethylether aufschlämmt und danach eine geringe Menge kristallines 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-Methoxymitsosan zugibt, um die Kristallisation des amorphen 10 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosans herbeizuführen.

DieseZugabe bewirkt dieUmwandlungdes amorphen 7-(Dimethylaminomethylen)-arnino-9a-methoxymitosans in die kristalline Form. Diese ist sogar bei Temperaturen von bis zu 100 °C sechs Tage und länger stabil. Das Infrarot-Spektrum dieser Verbindung istin derFig. 1 gezeigt Diese Verbindung ist wesentlich länger lagerstabil als amorphes 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan. 15 Das nachstehende Beiquel erläutert die Herstellung des kristallinen 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a- methoxymitosans.

Beispiel:

Man schlämmt 1,0 g amorphes 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan in Farn da freien Base 20 in 10 ml Ethylether auf. Man gibt eine kleine Menge kristallinen 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosans (in etwa 2 mg), zu der Mischung und schlämmt die Mischung in einem geschlossenen System 48hbei20-25°C auf. Anschließendentfemtmandieresultierendendunkel-grünenKristallemittels Vakuumfiltration. Man wäscht die Kristalle mit 10 ml Ether und 15 ml Skellysolve-B und trocknet 24 h bei 40 °C im Hochvakuum, Ausbeute: 0,75 g. Schmelzpunkt 170 -171 °C. 25 Zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Ausgangskristalle kann man rieh des folgenden Verfahrens bedienen:

Amorphes 7-(Dirnethylaminornethylen)-amino-9a-methoxymitosan wird in Aceton und/oderEthanol gelöst und diese Lösung zu Ether gegeben. Vorzugsweise vollzieht man die Zugabe der Lösung während eines längeren Zeitraums von beispielsweise 20 min. 30 Zur praktischen Durchführung wird folgende Vorschrift gegeben: 1,0 g amorphes 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan in Form der freien Base löst man in 10 ml Aceton. Man gibt die Acetonlösung während eines Zeitraums von 20 min unter heftigem Rühren zu 100 ml Ether. Man beobachtet die Bildung von Kristallen. Man schlämmt die kristalline Masse 24 h bei 20 - 25 °C in einem geschlossenen System auf. Man entfernt die dunkel-grünen Kristalle dann durch Vakuumfiltration, wäscht sie mit 35 10 ml Ether und 15 ml Skellysolve-B und trocknet 24 h bei 40 °C im Hochvakuum, Ausbeute: 0,75 g.

Analyse für ^3^3^()5: C H N ber.: 55,48 5,91 17,98 gef.: 55,11 5,88 17,6 40 Schmelzpunkt 170 -171 °C. 5537 5,93 17,7

Beide gewonnenen kristallinen Substanzen besitzen das in der Zeichnung gezeigte Infrarot-Spektrum. Dieses 45 Infrarot-Spektrum wurde miteinerProbeaufgenommen, diesich in einem KBr-Preßling befand. Daskemmagnetische

Resonanzspektrum (½ NMR; 90 MHz) zeigt die folgenden J-Werte: ppm5 Beschreibung Integral Zuordnung 1,86 Singulett 3 ch3-^ 2,73 Dublett von Dubletten 1 C2H (J = 1,8 Hz; 4,4 Hz) 2,83 Dublett 1 CjH (J=4,4 Hz) -4-

AT 396 688 B (Fortsetzung) ppmS Beschreibung Integral Zuordnung 5 2,97 Singulett 3 Singulett ) N(CH3)2 3,01 3 10 3,14 Singulett 3 OCH3 3,43 Dublett von Dubletten 1 C»H (J = 1,8 Hz; J = 12,8 Hz) 15 3,54 Dublett von Dubletten 1 C^H (J = 4,4Hz; J= 10,7 Hz) 4,10 Dublett 1 C,H (J = 12,8 Hz) 20 4,42 Triplett 1 * a = 10,7 Hz) 4,69 Dublett von Dubletten 1 ch2o (J=4,4 Hz; J = 10,7 Hz) 25 1 4,76 breites Singulett 2 nh2 7,21 breites Singulett 2 nh2 30 7,21 Lösungsmittelsingulett (CHC13) 7,62 Singulett 1 H-C=N 35 Ein für eine Lösung dieses Materials (0,01625gprolMethanol) aufgenommenes Ultraviolett-Spektrum zeigt die folgenden Charakteristika: 40 ^max (nm) Absorptions- molares Absorptions- Loga vermögen (a) vermögen (e) 45 232 47,8 18610 4,27 386 43,0 16740 4,22 SO Die Stabilität des kristallinen 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosans wurde nach folgendem

Verfahren bestimmt: Man gibt eine genau ausgewogene Menge 7-(Dimethyiaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan von etwa 5 - 25 mg in so viele "l-dramn-Vials mit Schraubkappe, wie dies erforderlich ist. Die erforderliche Zahl der Vialsmit Schraubkappe, welche das genau gewogene 7-(Dimethylaminomethylen)-anüno-9a-methoxymitosan «ithalten, stellt man in Behältnisse, die bei unterschiedlichen Temperaturen gehalten werden. 55 Bei jedem Zeit-Temperatur-Abschnitt untersucht man eine Vial, die das vorgewogene 7-(Dimethylaminomethylen> amino-9a-methoxymitosan enthält, mittels HPLC. Die Ergebnisse sind wiedergegeben in mcg/mg an 7-(Dimethylaminomethylen>amino-9a-methoxymitosan-Aktivität. Die Ergebnisse sind in der Tabelle Π zusammen- -5-

Claims (1)

1. AT 396 688 B gefaßt In dieser Tabelle bedeuten die in Klammem angegebenen Werte den in Prozent ausgedrückten Verlust in Form von amorphem 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan. Tabelle! Verlust (in %) Zeit - (Tage) 45 °C 56 °C 85 °C 100 °C 1 0-1 3 (93) 4 0 5 0(100) 6 3,2 7 0(14) 14 0(25) 2,8; 4,8; 9,7 30 0 0(41) PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von kristallinem 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan, dadurch gekennzeichnet, daß man amorphes 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosan in Ethylether aufschlämmt und danach eine geringe Menge kristallines 7-(Dimethylammomethylen)-amino-9a-methoxymitosan zugibt um die Kristallisation des amorphen 7-(Dimethylaminomethylen)-amino-9a-methoxymitosans herbeizuführen. Hiezu 1 Blatt Zeichnung -6-