DK162052B - D-2-aminoacyl-3-(z)-propenylcephalosporiner, fremgangsmaade til fremstilling deraf samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse - Google Patents

Description

i

DK 162052 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte D-2-aminoacyl-3-(Z)-propenylcephalosporiner, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt farmaceutiske præparater indeholdende disse cephalosporiner.

Cephalosporinerne er nyttige midler til bekæmplese af bakterielle 5 infektioner.

3-formylceph-3-em-forbindel ser, der benyttes som mellemprodukter ved en fremgangsmåde til fremstilling af de 3-substituerede vinyl -cephalosporiner ifølge den foreliggende opfindelse, kan fremstilles ved oxidation af de tilsvarende 3-hydroxymethylceph-3-emer, der fås ved 10 enzymatisk hydrolyse af de tilsvarende cephalosporiner. Denne fremgangsmåde er kendt fra Chamberlin, USA patentskrift nr. 3.351.596 (7. november 1967), der blandt andet omhandler forbindelserne (II) og (III).

15 s RC0NH_rt XCHO ® y-Ny 0 co2ch3 20 /VrH- O-ch,- 05 W~| nh2 (Π) 0Π) 25

Chamberlin (loc. cit.) beskrev derivater på 3-CHO-gruppen med carbonyl-reagenser, såsom senricarbazid og hydroxylamin, men der var ingen omtale af nogen carbonalkylering på 3-CHO-gruppen.

30 De tilsvarende sulfoxider er mere stabile og kan fremstilles i bedre udbytte (Webber, GB patentskrift nr. 1.341.712, publiceret 23. december 1973).

Den første omtale af 3-alkenyl-substituerede cephalosporiner var af Clark et al. i GB patentskrift nr. 1.342.241, publiceret 3. januar 1974 35 (svarende til USA patentskrifter nr. 3.769.277 og 3.994.884, udstedt henholdsvis 30. oktober 1973 og 30. november 1976). Forbindelserne (IV) og (V) er omtalt på side 25 og 29 i GB patentbeskrivelsen.

DK 162052 B .

2

OiHCONHTn;\-c„=cH, ov, nh2 J—'Νγ -

0 COiH

5 Ο-ΟΗ,ΟΟΝΗ-η-fN (V) J_N y-CH = CHCH3 1 y o ^ 1 co2h

Disse forbindelser blev fremstillet ved omsætning af den tilsvarende 10 3-triphenylphosphoniummethyl-cephalosporin med formaldehyd eller acetaldehyd. Den omvendte proces bestående af omsætning af et phosphoranyliden-derivat med formlen R3P=CR3R4 med en 3-CHO-cepha-losporin er også omtalt i nævnte patentbeskrivelse på side 5. I USA patentskrift nr. 4.107.431 anføres det, at forbindelsen (IV) absorberes 15 ved oral administrering.

En anden tidligere omtale af forbindelser af denne type var af Webber et al., J. Med. Chem. 18 (10) 986-992 (1975) og i USA patentskrift nr. 4.065.620, udstedt 27. december 1977, der i spalte 3, 4 og 5 omtaler stofgruppen, som de foreliggende forbindelser tilhører.

20 Specifikt omtalte forbindelser er vist i formel (VI).

s

Cj)—CHCONH—i-( 'i (VI)

I I_> J—CH = CHCOjH

25 NH* rf I (COjEt) c°2H (CN) 30 Andre variationer af denne type omtales i USA patentskrifterne nr. 4.094.978 (13. juni 1978) og nr. 4.112.087 (5. september 1978), hvor forbindelserne (VII) og (VIII) er omtalt.

35

DK 162052 B

3 H°-^ 'V—CHCONH i-( \ (vn) Λ-S i I J-ch=chch2oh ' Uj nh5 /-Νγ 0 co2h 5 US-PS 40 94 978, Spalte 44 HO—^V-CHCONH—|-/ ^ {νΐΠ) Λ—^ I I J-ch=chch2och3 *vju; nh, J—Kr „ , O I (trans)

υ C02H

10 US-PS 41 12 087, Spalte 31

Andre substituerede 3-alkenyl-cephalosporiner er omtalt i føl -• gende patentpublikationer.

USA nr. 3.830.700, O'Callaghan et al. (20. april 1974) 15 3-(nitrostyryl)cephalexin-analoger, USA nr. 3.983.113, Beeby (28. september 1976), USA nr. 4.049.806, Beeby (20. september 1977) og USA nr. 4.139.618, Beeby (13. februar 1979) 3-(heterocycloth i o)propenyl-cephalospori ner, 20 USA nr. 4.147.863, Miyadera et al. (3. april 1979) 3-(1-methyl-5-tetrazolyl)vi nyl-cephalospori ner, DE-OS nr. 3.019.445 (december 1980) 3-(sulfonyloxy)vi nyl-cephalospori ner,

Fr. nr. 2.460.302 (23. januar 1981) 25 3-(dimethylamino)vinyl-cephalexin-analoger,

Eu nr. 30.630 (24. juni 1981) 7- [ (3-methansul fonamidophenyl) -o'-aminoacetamido] -3-vi nylceph-3-em-4-carboxylsyre, USA nr. 4.255.423, Beattie et al. (10. marts 1981) 30 USA nr. 4.390.693, Beattie et al. (28. juni 1983) 7-(2-thienyl)acetamido-3-(3-acetoxy-l-propenyl) og -3-(heterocyclovi nyl)ceph-3-em-4-carboxyl syrer, og 7a-methoxy-analoge.

De vigtigste kommercielt tilgængelige, oralt aktive cephalospo-35 riner, der har den samme anvendelse, som forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er beregnet til, er cephalexin, cefadroxil, cephradin og cefachlor. Disse forbindelser har formlerne (IX), (X), (XI) og (XII).

DK 162052B

4 S /—\ s R—é \—CHCONH—i-f V \ CHCONH i-f ^ 0 co2h co2h R = H Cephalexin (IX) Cefaclor (XI) R = OH Cefadroxil (X) 10 /—v s <f >— CHCONH—,-( \ TV"

0 C02H

Cephradin (XII) 15

Disse forbindelser er genstand for følgende patenter.

Cephalexin: USA patentskrift nr.. 3.507.861 (21. april 1970) 20 Cefadroxil: USA patentskrift nr. 3.489.752 (13. januar 1970) (Re 29.164)

Cefachlor: USA patentskrift nr. 3.925.372 (9. dec. 1975)

Cephradin : USA patentskrift nr. 3.485.819 (23. dec. 1969).

Beslægtede forbindelser, som er blevet beskrevet, er 3-.chlor-25 cefadroxil og 3-hydroxycefadroxil, henholdsvis i USA patentskrift nr. 3.489.751 (13. januar 1970) og GB patentbeskrivelse nr. 1.472.174 (publiceret 4: maj 1977).

Genstand for opfindelsen er D-2-aminoacyl-3-(Z)-propenylcepha-losporiner med den almene formel (I) 30 s R2-/ %—CHCONH i-( \ m I J—Nx/"CH*CH“CHj

R1 NHi T

35 COaH

DK 162052 B

5 hvori R1 er hydrogen, OH, Cj_4-alkoxy eller chlor, R^ er hydrogen eller hydroxy, såvel som derivaterne deraf, hvori amino, carboxy og/eller hydroxy er 5 beskyttet med konventionelle beskyttelsesgrupper og de farmaceutisk acceptable salte deraf.

Forbindelserne ifølge opfindelsen er interessante som oralt effektive cephalosporin-antibiotika med en stærk aktivitet over for gram--positive bakterier og et forbedret aktivitetsspektrum over for gram-10 -negative bakterier, forskellige "kræsne" bakterier og anaerober i forhold til cephalexin, cefadroxil, cefachlor og cephradin. De giver en højere antibiotikum-koncentration i blodbanen ved oral administrering og er egnede til administrering til mennesker én eller to gange dagligt. Som sådan administreres de i doser på 100-5.000 mg 15 pr. dag afhængigt af patientens størrelse og sygdomstilstanden. De kan administreres parenteralt i tilsvarende doseringsmængder.

Forbindelserne ifølge opfindelsen er nyttige i behandlingen af bakterieinfektioner, der skyldes følsomme organismer i pattedyr, herunder mennesket. Til dette formål administreres de oralt eller 20 parenteralt i antibakterielt effektive, non-toxiske doser eller i form af deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte, farmaceutisk acceptable metal- eller aminsalte eller som en farmaceutisk acceptabel ester.

De farmaceutisk acceptable syreadditionsal te er sådanne, hvor 25 anionen ikke bidrager signifikant til saltets toxicitet, og som er forenelige med de sædvanlige farmaceutiske bærere og tilpasset til oral eller parenteral administrering. De omfatter saltene af de omhandlede forbindelser med den almene formel (I) med mineralsyrer, såsom saltsyre, brombrintesyre, phosphorsyre og svovlsyre, med organiske carboxylsyrer 30 eller organiske sulfonsyrer, såsom eddikesyre, citronsyre, maleinsyre, ravsyre, benzoesyre, vinsyre, fumarsyre, mandelsyre, ascorbinsyre, æblesyre, methansulfonsyre, p-toluensul fonsyre, og andre syrer der er kendte og benyttede i penicillin- og cephalosporin-kemien. Fremstillingen af disse salte sker i overensstemmelse med den konventionelle 35 teknik ved omsætning af en af forbindelserne med den almene formel (I) med en i alt væsentlig ækvivalent mængde af syren.

Farmaceutisk acceptable metal- og aminsalte er tilsvarende de salte af forbindelserne med den almene formel (I), som er stabile i det

DK 162052B

6- omgivende miljø, og i hvilke kationen ikke bidrager signifikant til saltets toxicitet eller biologiske aktivitet. Egnede metalsalte omfatter natrium-, kali-um-, barium-, zink- og alummiurasaltene. Natrium- og. kaliumsaltene foretrækkes. Aminsalte fremstillet ud fra aminer, der for 5 eksempel bruges sammen med benzyl penicillin, som er i stand til at danne stabile salte med den sure carboxyl gruppe, omfatter tri al kyl aminer, såsom triethylamin, prokain,. di benzyl amin, N-benzyl-/3-phenethylamin, 1-epehenamin, N,Ν'-di benzyl ethyl endiamin, dehydroabiethylamin, N-ethylpiperidin, benzylamin og dicyclohexylamin.

10 Farmaceutisk acceptable estere omfatter de estere, som er aktive i sig selv, eller tjener som præ-lægemidl er ved at blive hydrolyseret i kroppen, og herved giver de antibiotika i sig selv. Egnede estere af den sidstnævnte type er phenacyl, acetoxymethyl, pivaloyloxymethyl, a-acet-oxyethyl, a-acetoxybenzyl, α-pivaloyloxyethyl, 3-phthalidyl» 5-indanyl, 15 methoxymethyl, benzoyloxymethyl, ar-ethyl butyryl oxymethyl, propionyloxy-methyl, valeryloxymethyl, isobutyryloxymethyl, giycyloxymethyl og andre, der kendes fra penicillin- og cephalosporinkemien.

Forbindelserne med den almene formel (I) og deres salte, som er defineret ovenfor, kan formuleres til oral eller parenteral brug på 20 almen vis, idet man benytter farmaceutiske bærere og exeipienter, og de kan fremstilles som enhedsdoser eller i pakker med flere doser. Præparaterne kan være i form af tabletter, kapsler, opløsninger, suspensioner eller emulsioner. Disse præparater kan også formuleres som suppositorier, idet man benytter en konventionel supposi.toriebasis, 25 såsom cacaosmør eller andre fedtholdige materialer. Disse forbindelser kan, om ønsket, administreres i kombination med andre antibiotika, inklusive cephalosporiner, penicilliner og aminoglycosider.

Tabel I indeholder en oversigt over strukturerne af de forbindelser, som omtales i eksemplerne.

30

DK 162052 B

7

TABEL I

Forbindelser omtalt i eksemplerne 5 CHCONH-J—Y '|_CH=CHCH) (1) JT i«, /-γ

Forbindelse nr. R1 R2 R3 (konfiguration) 10 8 (BMY-28100) H OH -CH3 (Z) 12 (BBS-1065) Η H -CH3 (Z) 17 (BMY-28060) Cl OH -CH3 (Z) 22 (BHY-28068) HO OH -CH3 (Z) 27 (BMY-28097) CH3O OH -CH3 (Z) 15

Tabel II giver en oversigt over den in vitro anti bakterielle aktivitet af de omhandlede forbindelser. De minimale inhibitoriske koncentrationer bestemt ved agar-fortyndingsteknikken for tre grupper af organismer betegnet ved Gp-Ia, Gp-Ib og Gn-Ia er anført. Hver af disse 20 grupper af organismer består af fem individuelle stammer af mikroorganismer, der er beskrevet i en fodnote til tabellen. Gp-Ia-organismerne er gram-positive staphylococcer, der er følsomme over for penicillin. Gp-Ib-organismerne er gram-positive staphylococcer, der er resistente over for penicillin og producerer penicillinase. Gn-Ia-organismerne er 25 gram-negative bakterier, der er følsomme over for ampicillin og cephalo-thin. De foreliggende forbindelser har generelt lav aktivitet over for ampicillin- og cephalothin-resistente gram-negative bakterier. De følgende konklusioner kan drages ud fra tabel II om disses forbindelsers in vitro antibakterielle aktivitet.

30 Alle forbindelserne har god aktivitet over for penicillin-følsomme staphylococcer (Gp-Ia). De er generelt mindre aktive over for de penicillin-resistente staphylococcer (Gp-Ib) med en faktor tre eller mere. I hvert tilfælde er forbindelserne imidlertid flere gange mere aktive end cephalexin og cefadroxil.

35 Forbindelserne har en god aktivitet over for de gram-negative bak terier (Gn-Ia). Ringsubstitution er på ingen måde ugunstig for den anti-bakterielle aktivitet. Se forbindelserne nr. 8, 12, 17 og 24. Forbindelse nr. 22 ser ud til at være en undtagelse til alle de ovenstående

DK 162052B

8 konklusioner, men faktisk er det en stærkt aktiv forbindelse over for både gram-positive og gram-negative bakterier, som det vil kunne ses i tabel III.

5 TABEL II

Agar-fortyndingsteknik (Mueller-Hinton agar)

Minimal inhibitorisk koncentration (Mg/ml)

Gp la3 Gp Ib3 Gn la3 10 E?rblndelse_nr.___l_______2_________1_________2_______.......2__ 8 (BMY-28100) 0,23 0,35 0,92 0,8 0,8 0,7 12 (BBS-1065) 0,23 0,3 0,92 0,92 0,8 0,8 17 (BMY-28060) 0,13 0,53 1,1 15 22 (BMY-28068) 6,30 7,2 6,3 27 (BMY-28097) 0,354 1,24 0,534

Cephalexin 1,2 0,70 4,1 3,6 6,2 4,1

Cefadroxil 1,2 1,10 3,6 4,1 8,3 8,3 20 1. Kolonne 1 og 2 angiver separate testforsøg.

2 Π II Π II II

3. Gennemsnit af fem organismer hver gruppe -

Gp la gram-positive staphylococci; penicillin-følsom; intet penicillinase fremstillet.

25 S. aureus Smith A9537 S. aureus A9497 S. aureus Terajima S. aureus A9534 S. aureus A9601 30

Gp Ib gram-positive staphylococci; penicillin-resistent; peni ci11 i nase-producenter.

S. aureus 193 S. aureus BX-1633-2 A9606 35 S. aureus A15092 S. aureus Russell S. aureus A9602

DK 162052B

9

Gn la gram-negative bakterier; ampicillin- og cephalothin-føl som.

E. coli Juhl A15119 E. coli A9660 5 K. pneumoni ae Dll P. mirabilis A9554 P. mirabilis A9900 4. Ikke del af forsøg 1; separat forsøg.

10

Tabel III indeholder sammenlignende data for den in vitro anti-bakterielle aktivitet over for samme organismer som i tabel II, idet man har benyttet to forskellige bakteriologiske dyrkningsmedier.

Mueller-Hinton agar er det standardmedium, der benyttedes i forsøgene 15 refereret i tabel II. Tabel III indeholder en sammenligning af de minimale inhibitoriske koncentrationer af tre af testforbindelserne bestemt først i Mueller-Hinton medium og så i en næringsagar. Forbindelse nr. 8, der indeholder en 4-hydroxy-substitution i phenylringen, og forbindelse nr. 27, der indeholder 3-methoxy-4-hydroxy-substitution i 20 phenylringen, reflekterer kun moderat mediumeffekt. Med dette menes, at forskellen i minimal inhibitorisk koncentration er mindre end en faktor tre. Forbindelse nr. 22, den 3,4-dihydroxyphenyl-substituerede forbindelse, reflekterer forskelle i aktiviteten mellem de to medier på fra 6-12 gange, idet de minimale inhibitoriske koncentrationer i næringsagar 25 er meget lavere end dem, der er bestemt på Mueller-Hinton agar. I overensstemmelse hermed konkluderes det, at forbindelse 22 var sammenlignelig i antibakteriel effekt med de andre cephalosporiner, der har cis-propenyl-gruppen i 3-stillingen, hvilket der er vist i tabel II. Dette fænomen, hvorved et antibiotikum viser større aktivitet i én slags 30 næringsmedium end i et andet, er blevet rapporteret og studeret tidligere. Se T.A. Pursiano et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 3, nr. 1, pp. 33-39 (1973).

DK 162052 B

10 . .

/

TABEL III

Testmedium sammenligning Agar fortyndingsteknik 5 Minimal inhibitorisk koncentration (jig/ml) 2 2 2 Forbindelse nr. Gp la Gp Ib Gn la 8 (BMY-28100) Aj 0,23 0,92 0,70 10 B 0,17 0,35 0,70 22 (BMY-28068) A 4,8 6,3 5,5 B 0,40 0,61 0,92 15 27 (BMY-28097) A 0,35 1,2 0,53 B 0,23 0,40 0,40 *A Mueller-Hinton agar 20 B Næringsagar 2

Gennemsnitlige værdier for de samme grupper af organismer som i tabel II.

25 Strukturaktivitets-korrelationerne, som kan udledes af de oven stående in vitro studier, genfindes i in vivo studier på mus. Tabel IV er en tabellering af den beskyttende dosis for mus inficeret med letalt inoculum af en bakterie. To forskellige bakterier benyttedes i studierne, en gram-positiv organisme og en gram-negativ organisme. Den beskyt-30 tende dosis (PD50) er den dosis, der, når den administreres til en gruppe inficerede mus, resulterer i en 50% overlevelse efter fem dage.

Normalt dør ubehandlede mus inden for tre dage efter injektionen af det letale inoculum.

35

TABEL IV

11

DK 162052 B

Beskyttende dosis1) for mus inficeret med letalt inoculum

Oral behandling 5

Forbindelse nr. S. aureus Smith E. col i Juhl 8 (BMY-28100) 0,14 (0,31}2 1,2 (8,4)2 12 (BBS-1065) 0,18 (0,27) 1,5 (8,2) 17 (BMY-28060) 0,17 (0,22) 3,04 (8,4) 10 22 (BMY-28068) 0,13 (0,27) 0,44 (8,2) 27 (BMY-28097) 0,093 ^osis i mg/kg, der forhindrer dødens indtræffen i 5 dage i 50% af 15 dyrene i grupper på 5 mus, der er behandlet med forskellige doser af testforbindelsen på infektionsdagen; bestemt ved interpolation fra dosen/responskurven; ubehandlede dyr dør inden for 3 dage.

2 Værdier i parenteser er angivet for cephalexin i det samme 20 forsøg.

3 I dette forsøg opnåedes en værdi på 0,16 mg/kg for BMY-28100; kontrolværdier for cephalexin eller cefadroxil forefindes ikke.

25 Dataene i tabel IV er uddraget fra mange forskellige eksperimenter.

I disse eksperimenter blev cephalexin brugt til kontrol behandling. PD5Q-værdierne bestemt for cephalexin i det samme eksperiment står i parenteser ved siden af PD^Q-værdierne for testforbindelserne. Det er klart, at hver af cephalosporinerne besidder god aktivitet over for den gram-30 positive Staphylococcus aureus-infektion, og at forbindelserne med cis-propenylgruppen i 3-stillingen er mere aktiv over for den gram-negative infektion, jfr. forbindelserne 9, 24 og 37.

Tabel V indeholder sammenlignende bl odspejls-data for mus behandlet oralt eller intramuskulært med testforbindelserne anført i tabel I. Det 35 fremgår at alle forbindelserne udviser ensartet god oral absorption. Forbindelse nr. 22 viser exceptionelt høje koncentrationer i blodet på musene ved oral administrering. Det er blevet vist, at denne forbindelse metaboliseres til forbindelse nr. 27 i rotter. Se eksempel 28. Forbin- 5 12

DK 162052B

del se nr. 22 er 3,4-dihydroxyphenyl-derivatet, og forbindelse nr. 27 er det tilsvarende 3-methoxy-4-hydroxyphenyl-derivat. Det er blevet vist, at det sidstnævnte derivat har en høj in vitro og in vivo aktivitet.

DK 162052 B

13

g fH

•s Μ -ri jj S n »o rr m rn :··'η η .h · r-l r-l r-l r—l'^r^ Π C4

*- < (N

bi U t n Λ D 3- \ C — $? , æ O o ro CO CO CO r~ S cn g in rr m o· in v Μ n o^+i o Ooo ooor4d cm E-ι —'

** i—I

m >-l VD *H ,-t ID r-4 ID O

» 3 ϋί “^rsrM ο,ΜΓΜοη O S3.

ο υ — ° 5 • 3 vn in -c cd n m η o ή 0- \ y-o *—Ir—Ir—I I—I t—il—I O)

-!-> ™ · CN

*· X

bi u O1

V D OL

\ i< ^ σ\ tn η n n r- vd r- r-ι vd

^ f^ i—i t—i i—( r-i o .-4 tn rW

O >H -P

cm EH "— .· ri ® ^ tn S r- h n mcnr^coco -η X \ “3 r—i »H ih m r-l cn id Cn O S 3- 0 0-- O . 5

• S

tøl O ' \ Ό· f- Γ0 ID VD Γ- VD Γ~ 3 43 Jr co m O oo-^rmioio i ' · s ^ ^ h bi u b « -¾ 5 C \ ^ c σ' ^ S · 5-1 O _ h n rn r-ι r- in in (VO\r-^ ... .....

,rjOH4J ^ r-f 1—( <N r4 f-( r-4 CN r—I ^ Π3 -Η EH — ·©.

54-3; cn « " d 5h > \ ,° ij cn id tr in o r- vd r4 m in o r-i ^ —i S g ? g rr ^ m ID n n æ in -r- c3 1=: 3 tn «Η m Φ O U w Q . 44 w }_i cd

•O C

O ^ -r4 H tu o — O 00 r£j cq in O- tn <3 m to vd ·.

w Γ-Ι 2 ID « r—I VD 0 O 3 .. „I _J 3 OCr—ICNCOOCOCOi—I lp 1" ^ H -S 3 N ri N IN ·4 i>

> i x κ Γη I < I J X <H

CQ >4 542 0 «5? iS O t »S-W

0 0—'r-4CNg'Q,°c0CNr-CN^«s

S3 OOcO ^H^S^ Η H CN O

14

DK 162052 B

Tabel VI indeholder yderligere in vivo data for forbindelse nr. 8 over for fire andre organismer sammenlignet med cephalexin, cefachlor og cefadroxil. Tabel VII og VIII indeholder sammenlignende in vitro data for forbindelse nr. 8 versus cephalexin, cefadroxil og cefachlor med 5 hensyn til et antal Streptococcer, Neisseria', Haemophilis og forskellige anaerober.

I rotteurin-genvindingseksperimenter er 24 timers genvindel sesraten af forbindelse nr. 8 i urin for rotter behandlet oralt, sammenligneligt med cephalexin og cefadroxil og større end cefachlor-gen-10 vindel sesraten. Stabilitetsstudier, der sammenligner forbindelse nr.

8 med cephalexin og cefachlor i opløsning i phosphatbuffer med pH 6,5 og pH 7,0, humant serum (pH 6,8), hesteserum (pH 7,6) og kalveserum (pH 8,2) som bæremidler, har afsløret, at forbindelse nr. 8 er bemærkelsesværdigt mere stabil end cefachlor og sammenlignelig med cephalexin.

15 TABEL VI.

Beskyttende dosis PD^q for mus inficeret med letalt inoculum

Oral behandling 20 Organisme 8 (BMY-28100) Cephalexin Cefachlor Cefadroxil S. aureus 2,2 17 2,2 7,2 BX-1633 25 S. pyogenes 0,11 0,74 0,14 0,25 A20201 H. influenza 1,8 18 1,6 25 A9729 30 P. mirabilis 1,8 12,5 1,8 14 A9554 35 15

DK 162052 B

u w o

-p r-l Ol Ol Ol O) O) O) \S> \D \Σ> O f*) O O O O O

rp U ·····*· · · 1 * · • •vi' · I * · . · ._i O OOOOOO fI I «—( O <—I O I O O O o f s S ! Q) ^ *2 o O1 o OOOOOO ID O VØ O ID ΙΓ> Π O r"> (-1 n r—, O 1-1 ...... ...... ......

Ό OOOOOO «—i «—< (*—!«—( »—( o o o o o u rt ,<5 ri ^ P β cu w

IQ

CO

•H

(D _ s Ξ

^ - Λ- O

- CJ oooooo r-i —i r-1 r-t .-( r-ι onnomo •H i-H ··♦*·· ·····♦ ·««««« • n /3 oooooo m n r*> r-> n r-> \r> vp o o vr> o g t - ' Η φ 8 - u P ~ :

Pj H 0) S

P \ _ P tn , oi · ω 3. i — ™ >i O ·Η C, p So-P n in in in in tn o -o

O CJ Q 1—I p OOOOOO N Π N O) Ol O) OOOOOO

M|H —Ό [rt...... ...... ......

pS; P, O OOOOO OOOOOO oooooo !> o P · .

. o N-.N n >e m ino in o ^ *r -«r m un

«0· VD «C O O, ·—( r-l r-l r-l r—I

•τ' ooold in in ^ in o o o o ^ > l£> O in ^ Or-j^ 1-(0)010101¾

•P ση οι i—( P ^ ΛΞ P ^ ^ ^ ^ ^ P

P < < < ft) · « fe .

Ai > > > (0 r-ι J. 1—I r-! m (U M LJ Φ 0 o S γ0μη,ηγΡ - P I Ό H M W Ό -¾ p -h 5¾ X $P 'H - * g s 3 * £ £ £ * - H O p I p g · 'd 8 4J c p J= p M £ Q> 0 Q) P α H ft) g c gy C - > OP o O o 0' tu £ . . . . <d R .... o g &rrr.0 C----U £ * ' * ‘ ^ S m t/)

DK 162052 B

16 S-ι ^

O

r-( VD

u CO '7CO-fvCD CD CD CO COCDDCOCirr^'VO

(0 · ·' · » * **'*·*·· 11)11

tu O O O O O O OOOOOOOO I I II I

ΰ r—( O m ) m m ro n ror-ioronrinn nnn^··—i jj . . i , . . . ........ .....

Ό vD VD VD VD VD VDVDVDVOVDVOVDVD VD VD VD © <"D

ro tu <3 ' “ c ,η rninn n o. roronnrororor·) ·—< »—i ·—i o t—< 5 vo * VD VD VD VD vdvovdvdvdvcvdvd n co o o fi *2,

«S

I c? >H O '

QH +> O O

C, pj M CO I CO CO CO CO OCDOCDCDCDCDCD VD VD VD Ή (N

ck <"Ί q o 0000 oooocooe r-< o o o c\ ‘ r'· vd Γ" r- n ro η γμ ,η ^ 'T'ccoDtDv Dvf^ofvjncoco. in cd cn © m O O rr rr -η in ·Η —i lo ro rr »c· -h «Η «e* <« n r»· O O Η Η H rrt Γ'ΟΟ'—ICDDJCvlO (N <N ΓΜ © ©

2N IN N N u DNNfN'mNNiH N N N N N

_ < < < < g <<<<< •p S *> ·> <0 “ H ^ CO ^ m _w

” S $ S

Li Φ rrt *0 ° B1 Μ -Η 'ύ ^0¾ S ro s ro ro “il ro v ro ro H ** »s 2 S $ £ h g' -H § u 5 ro i > *h Hi? H 3 & 5 , c +Jtu ni tu 6 ro

Jr* Steesro Cssecrca CssS,£

Ή h g *H 5 -H Qu CL

CQ O 0 3 * ro · ro

g 2 $ = U2WW

DK 162052 B

17

TABEL VIII

In vitro aktivitet over for anaerober 5 MIK (jtg/ml) /Mac 8 (BMY- Cepha- Cefa-

Organisme tamase 28100) lexin chlor

Gn, stave B. fragilis A20928-1 (-) 0,8 12,5 3,1 10 " " A21900 (-)* 50 12,5 5,3 " " A20935 (-) 0,8 6,3 3,1

Geometrisk middel 3,2 9,9 3,9 15 Gn, stave B. fragil i s A22053 (+) 50 25 100 " " A22021 (+) >100 100 >100 " " A22693 (+) >100 >100 >100

Geometrisk middel >100 >75 >100 20 B. fragil is A22695 (+) >100 100 100 " " A22533 (+) >100 >100 >100

Geometrisk middel >100 >100 >100 25

Gp, stave C. difficile A21675 * 6,3 100 25 C. perfringens A9645 0,4 12,5 1,6

Gp, cocci P. aenes A21933 0,4 1,6 0,8 P. anaerobius A21905 0,8 6,3 0,4 30 Geometrisk middel 0,95 11 * Cl indamycin-resi stent DK 162052® 18 I følgende tabel IX og X er de minimale i nhi bitori ske koncentrationer for de nedenfor anførte forbindelser sammenstillet.

s 5 R2—^ —CHCONH—i-( 'j yu o - co,h 10 1 o o

Undersøgte cephalosporiner R R R

Forbindelser ifølge opfindelsen (1) 1065 (eksempel 12) Η H CH3(Z) 15 (2) 28060 (eksempel 17) Cl OH CH^(Z) (3) 28097 (eksempel 27) OCf^ OH CH3(Z) (4) 28100 (eksempel 8) H OH CH3(Z)

Teknikkens stade (GB-PS 1.342.241):

20 (5) 28086 Η Η H

Alle forbindelserne besad D-konfiguration

DK 162052 B

19

Tabel IX

Gram-negative bakterier

Geometrisk middelværdi af minimale inhibitoriske koncentrationer (øg/ml) 5 Mueller-Hinton-agar

Organismer Forb. iflg. opfindelsen Forb. tilh. tekn. stade (1) (2) (3) (4) (5/4)*) (5) (6) (7) 1065 28060 28097 28100 28086 Cepha- Cefa- 10 lexin droxil E 1,1 1,6 1,6 1,1 5,7 6,3 3,1 6,3 F 0,8 0,8 0,8 0,8 3,9 3,1 3,1 6,3 G 1,6 1,1 1,6 0,8 3,9 3,1 12,5 12,5 15 H 0,53 0,61 0,35 0,61 4,4 2,7 3,4 5,3 I 0,8 1,6 0,35 0,8 3,9 3,1 3,7 6,1 J 0,8 1,6 0,4 0,8 3,9 3,1 3,7 6,4 *) Virkningforhold mellem forbindelsen 28100 og forbindelsen 28086 20 tilhørende teknikkens stade E: Escherichia col i, 2 stammer sensitive over for ampicillin og cephalothin F: Klebsiella pneumonia, Dll, enkelt stamme G: Proteus mirabilis, 2 stammer sensitive over for ampicillin og 25 cephalothin H: Neisseria gonorrheae, 5 stammer (Ng-1,3,4,5 og 17) I: Neisseria meningitidis, 5 stammer (Nm-1,2,3,4 og 5) J: Hemophilus influenzae, 7 stammer (Hi-2,5,8,13,16,27 og 28).

20

DK 162Q52B

Tabel X

Gram-positive bakterier

Geometrisk middelværdi af minimale inhibitoriske koncentrationer (m/ml) 5 Mueller-Hinton-aqar

Organismer Forb. iflg. opfindelsen Forb. tilh. tekn. stade (1) (2) (3) (4) (5/4)*) (5) (6) (7) 1065 28060 28097 28100 28086 Cepha- Cefa- 10 lexin droxil A 0,4 0,1 0,5 0,.8 2 0,6β 1,2 1,2 B 1,2 0,4 1,6 0,7 3 2,1 4,1 4,1 C 0,16 0,025 <0,0063 0,05 4 0,2 0,61 0,25 15 D 0,28 0,18 0,012 0,14 4,5 0,63 2,4 1,2 ' Virkningforhold mellem forbindelsen 28100 og forbindelsen 28086 tilhørende teknikkens stade A: Staphylococcus aureus, Penicillinase neg., 5 stammer 20 B: Staphylococcus aureus, Penicillinase-producerende, 5 stammer C: Streptococcus pyogenes, 6 stammer (Sp-1,2,3,4,5 og 7) D: Streptococcus pneumonia, 6 stammer (Dp-1,2,3,4,5 og 7).

Tabel XI

25 Geometrisk middelværdi af minimale inhibitoriske koncentrationer (uq/ml) *1

Organismer ' Forbindelser ifølge Forbindelse tilhørende opfindelsen teknikkens stade 1058 1076 28086 30 .........................................................—-.......

Gram+ A 0,3 0,2 0,6 B 0,8 0,7 2,1 C 0,1 0,2 0,2 35 D 0,8 0,23 0,63 ;De anvendte organismer er identificeret i tabel X.

DK 162052 B

21

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles ved anvendelsen af den syntetiske vej, der er omtalt i GB patentbeskrivelse nr. 1.342.241, USA patentskrift nr. 3.994.884 og USA patentskrift nr. 4.107.431, der er citeret ovenfor, med hensigtsmæssigt udvalgte udgangs-5 materialer. Essentielt involverer indføringen af propenylgruppen i 3-sti11 ingen i forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse en omsætning af en halogenidreaktant med et triarylphosphin, hvilket giver et phosphoniumsalt, der ved behandling med base giver et phosphoranyl-mellemprodukt. Sidstnævnte behandles så med en carbonyl reaktant, hvilket 10 giver en forbindelse ifølge opfindelsen. Enten indeholder halogenidreak-tanten eller carbonyl reaktanten cephalosporinkernen. Dette illustreres i de følgende reaktionsskemaer.

15

Carbonvl-

Halogenid- Phosphoranyl- reaktant reaktant mellerrprodukt qch2x (C6Hs)i^ [QCH=P(C4H5)3] c=o

Base / 20 \R!

Reaktionsskema 1 \.

tei*tiDnss*™ 2 gCH-CHR' Γ" l/ 25 \hx (C<h-^ \=P(C4Hs)3 qch=o / Base /

R' LRJ

QCH—CHR3 1^^ «-te-dtamr 30 3 I de ovenstående reaktionsskemaer er R en methylgruppe. Symbolet Q betegner 7-amino-3-cephem-3-yl-4-carboxylsyrekernen, hvori amino- og 35 carboxyl syregrupperne kan bære beskyttelsesgrupper, såsom silylgrupper eller andre grupper, der er velkendte for fagmanden i beta-lactam-anti-biotika-kemien, eller Q kan være 7-acylamino-3-cephem-3-yl-4-carboxyl-syrekernen, hvor 7-acylaminogruppen kan være én, der almindeligvis

DK 162052B

22 optræder i cephalosporin-antibiotika inklusive den a-amino-a-substi-tuerede phenylacetamidogruppe ifølge den foreliggende opfindelse,, som defineret i den almene formel (I). Specifikt kan Q have én af de følgende formler: 5 (O), «j»» io plNHi—Λ H°-C^fCONH-pYS)_ 0 COjP2 0 CO^P1 (0)n (Ot s s

15 AcNH—-/ N B=N—i-{ 'S

J-y J-y ° COjP2 0 CO2P2* 20 hvori R* har samme betydning som tidligere, n er 0 eller det hele tal 1, refererende til det antal oxygen-atomer, der er bundet til svovl,

Ac betyder en acylgruppe af den type, der normalt findes i 7-acyl- 25 amino-cephalosporiner, såsom phenyl acetyl, phenoxyacetyl, og B er en al kyl iden- eller aral kyl iden-beskyttende gruppe afledt af en aldehyd eller keton, såsom benzyl idengruppen, der let fjernes på et senere trin ved for eksempel en hydrolyse med Girard's Reagent T.

1 2' 3 P , P og P er hydrogenatomer eller beskyttelsesgrupper af den 30 slags, der almindeligvis benyttes i cephalosporin-kemien på aminogrup-per, hydroxygrupper og carboxylgruppen.

2

Egnede carbonyl beskyttende grupper (P ) omfatter aral kylgrupper, såsom benzyl, p-methoxybenzyl, p-nitrobenzyl og diphenylmethyl-(benz-hydryl)-al kyl grupper, såsom tertiær butyl; halogenal kylgrupper, såsom 35 2,2,2-trichlorethyl, og andre carboxyl beskyttende grupper, der er beskrevet i litteraturen, for eksempel i GB patentskrift nr. 1.399.086.

Det foretrækkes at benytte carboxyl beskyttende grupper, der let kan fjernes ved behandling med syre, særligt benzhydryl eller tertiær butyl.

DK 162052 B

23 1 3

Amino- og hydroxybeskyttende grupper (P og P ) er velkendte inden for faget og omfatter trityl- og acylgrupper, såsom chloracetyl, formyl, trichlorethoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, carbobenzyloxy, etc. Igen foretrækkes aminobeskyttende grupper, der let kan fjernes ved behandling 5 med syre, specielt t-butoxycarbonyl-gruppen.

I reaktionsskemaerne 1 og 2, hvor cephalosporinkernen Q benyttes i form af dens 1-oxid (n=l), fremstilles oxiderne ved kendte fremgangsmåder, såsom ved oxidation af den tilsvarende cephalosporin (n=0) med m-chlorperbenzoesyre eller pereddikesyre. På et senere trin i syntesen 10 reduceres 1-oxidet ved kendte fremgangsmåder, f.eks. ved reduktion med iodidioner i et vandigt medium.

Omdannelse af halogenidreaktanten med formlen QCHgX ifølge skema 1 . til phosphoranyl-mellemproduktet sker fortrinsvis ved at benytte en halogenidreaktant, hvori X er iodid. Hvis en chlor eller brom-halogenid-15 reaktant benyttes, skal den først omdannes til iodidet ved behandling med natriumiodid i dimethyl formamid eller acetoneopløsning. lodreaktanten reagerer let med en triarylphosphin, såsom tri phenylphosphin i organisk flydende medium, der er inert over for reaktanterne ved reaktionsbetingelserne. Stuetemperatur i en kort periode op til mange timer 20 udgør passende betingelser. Egnede triarylphosphiner omfatter, ud over triphenylphosphin, let tilgængelige arylforbi ndel ser, der er forenelige ved reaktionen, såsom substituerede phenyler, f.eks. tolyl, naphthyl, substitueret naphthyl og heteroaromatiske eller substituerede hetero-aromatiske grupper. Det første trin i reaktionen involverer dannelsen af 25 det triarylphosphoniumsalt, der normalt bundfælder i opløsningen og opsamles på et filter. Triarylphosphoniumsaltet opløses så i et passende flydende organisk opløsningsmiddel, der er ikke-blandbart med vand og inert ved reaktionsbetingelserne, såsom chloroform, trichlorethyl en eller andre polychlorerede eller bromerede methaner eller ethaner.

30 Phosphoranyl-mellemproduktet fremstilles så in situ ved behandling af opløsningen med vandigt alkalimetal-carbonat, -bicarbonat eller -hydroxid ved stuetemperatur. Den organiske fase, der indeholder phosphoranyl-mellemproduktet, fraskilles, vaskes med vand og tørres på den sædvanlige måde. Carbonyl reaktanten, der er vist i reaktionsskemaet, 35 sættes herefter til den tørre opløsning af phosphoranyl-mellemproduktet, og det sidste trin af reaktionen sker dernæst igen ved stuetemperatur inden for en relativt kort reaktionstid på ca. 2-20 timer. Det ønskede 3 produkt, beskrevet af formlen QCH=CHR , udvindes ved metoder kendt for

DK 162052B

24 fagmanden i organisk-kemiske laboratorieprocedurer, såsom kromatografi på en sil icagelkolonne.

Hal ogenidreaktanterne med formlen QCHgX i skema 1 fremstilles ud fra det tilsvarende 7-amino- eller 7-acylamino-3-hydroxymethyl-ceph-3-5 em-4-carboxylsyre-derivater ved fremgangsmåder, der i princippet er kendt.

Omdannelse af halogenidreaktanten med formlen R CHgX ifølge skema 2 til phosphoranyl-mel!emproduktet kan ske med enten chlorid, bromid eller iodid (X-Cl, Br eller I). Hvis det ønskes, kan chlorid eller bromid 10 ombyttes med iod/id, som. ovenfor nævnt,, men. dette er ikke nødvendigt. Reaktionen med triarylhposphin, såsom triphenylphosphin, sker enten uden opløsningsmiddel eller i et organisk flydende medium, der er inert ved reaktionsbetingelserne. Stuetemperatur eller øget temperatur (20-150°C) i fra 1 til· 24 timer kan benyttes. TriarylphosphoniumsafHet bundfælder 15 normalt og opsamles på et filter. Det opløses derefter i et egnet flydende organisk opløsningsmiddel, såsom dimethyl sul foxid, eller i ét, der ikke er blandbart med vand, såsom ether eller tetrahydrofuran, og behandles med en base, såsom lithiumbutyl, lithiumphenyl, natrium-methoxid eller natriumhydrid i en periode på fra flere minutter til 20 flere timer ved en temperatur i området mellem -40°C og +50°C. Carbonyl -reaktanten sættes herefter til den tørre reaktionsopløsning, og reaktionen sker ved mellem -40°C og +50°C i løbet af én til flere timer. Det ønskede produkt betegnet med formlen

25 ^ H

QCH=Q

\r3 udvindes som før.

30 Skema 1 er bekvemt ved fremstilling af forbindelserne ifølge opfindelsen. Ifølge en variation af skema 1, som der herefter refereres til som metode A, benyttes 7/3-[a-(N-t-butoxy-carbonylamino)-a-(p-hydroxy-phenyljacetamido]-3-chlormethyl-3-cephem-4-carboxylsyre-benzhydrylester som hal ogenidreaktant. Dette illustreres i eksempel 4, 5 og 6 senere.

35 En yderligere variation af skema 1 kaldes metode B. I denne variant fremstilles 7-amino-3-chlormethyl-3-cephem-4-carboxylsyre-benzhydryl-esteren som før, og 7-aminogruppen beskyttes ved en reaktion med benz-aldehyd, hvilket giver benzyliden-beskyttelsesgruppen.

DK 162052 B

25

Den sidstnævnte behandles herefter med triphenylphosphin, hvilket giver phosphoniumsaltet, der så omdannes ved hjælp af base til phosphoranyl-mel!emproduktet, og sidstnævnte behandles med en aldehyd, hvilket giver den 3-substituerede vinyl-7-aminocephalosporansyre, der 5 herefter kan acyleres for at indføre den ønskede acylgruppe i 7-stillingen.

To variationer af skema 2 foreslås. I den første, metode C, fremstilles 3-hydroxymethyl-7-phenylacetamido-3-cephem-4-carboxylsyre, som beskrevet ovenfor, i hvilken carboxylsyren er beskyttet som benzhydryl-10 esteren, og den omdannes til den tilsvarende 3-formyl-forbi ndel se. Den sidstnævnte tillades så at reagere med phosphoranyl-mellemproduktet af 3 halogenidet med formlen R CHgX, som vist i skema 2, og den ønskede 7-. acylaminogruppe indføres ved acylombytning.

Metode D er en yderligere variation af reaktionsskema 2, i hvilken 15 beskyttet 7-p-hydroxyphenylglycylamido-3-formyl-3-cephem-4-carboxylsyre benyttes som carbonyl reaktant.

7-phenylacetamidocephalosporansyre er et bekvemt udgangsstof i betragtning af dets nemme tilgængelighed. Acetoxygruppen heri kan let hydrolyseres enzymatisk ved at benytte hvedeklid som enzymkilde, og det 20 giver 7-phenylacetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carboxylsyre.

Carboxyl syregruppen kan beskyttes ved omdannelse til benzhydrylesteren ved behandling af syren med diphenyldiazomethan. Esteren behandles herefter med phosphorpentachlorid ved kendte betingelser, hvilket resulterer i fraspaltning af 7-phenylacetyl-gruppen og omdannelse af 3-25 hydroxymethylgruppen til en 3-chlormethylgruppe. Fremstilling af 7-amino-3-chlormethyl-3-cephem-4-carboxylsyre-benzhydrylester ved disse fremgangsmåder illustreres i eksempel 1 og 2.

Alternativt kan 7-phenylacetamido-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carboxylsyre omdannes til 3-halogenmethyl-forbindelsen og derfra til 30 phosphoranyl-mellemproduktet, efterfulgt af reaktion med en aldehyd til fremstilling af den substituerede 3-vinyl-cephalosporin ifølge én af variationerne af reaktionsskema 1.

Cephalosporin-3-carboxaldehyd betegnet ved formlen QCH=0 i de ovenstående reaktionsskemaer, der tjener som carbonyl reaktant i reaktions-35 skema 2, fremstilles ved oxidation af en 7-acylamino-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carboxylsyreester, som beskrevet i USA patentskrift nr.

3.351.596 citeret ovenfor. Reaktionsskema 2 er den mindst foretrukne af de to viste veje.

DK 162052B

26

Eksempel I

Benzhydryl -3-h.ydroxymethyl -7j3-phenyl acetamido-3-cephem-4-carboxy1 at (forbindelse 1)

Til en suspension af phosphatbuffer (pH 7, 162,5 ml) og hvedeklid 5 (20 g, tør) ved stuetemperatur sattes 7-phenylacetamidocephalosporin- syre-natriumsalt (5 g, 12,1 mmol) ad én gang. Reaktionens fremskriden kontrolleredes ved HPLC, indtil hydrolysen var tilendebragt (5 timer). Suspensionen filtreredes til fjernelse af hvedeklidet og afkøledes til 5 til 10°C til ekstraktionsforestring. Til den afkølede opløsning sattes 10 methylenchlorid (32 ml) efterfulgt af en 0,5M opløsning af diphenyl-diazomethan i methylenchlorid (24 ml). Herefter justeredes pH til 3,0 med 28% phosphorsyre. Efter 1 time fik reaktionsblandingens temperatur lov til at stige til 20°C. Heptan (56 ml) tilsattes langsomt, og det resulterende krystallinske titelprodukt udvandtes ved filtrering.

15 Udbytte af produktet var 3,0 g (50%).

Eksempel 2

Benzhydryl-7/l-amino-3-chlormethy1-3-cephem-4-carboxylat (forbindelse 2) 20 s H2N-r-Y > 25 0 COOCH(Ph)2 30 Til en opslæmning af PCI5 (8,3 g, 40 mmol) i CH2C12 (1000 ml) sattes pyridin (3,2 g, 40 mmol), og blandingen omrørtes i 20 minutter ved 20°C. Til blandingen sattes benzhydryl-3-hydroxymethyl-7-phenyl-acetamido-3-cephem-4-carboxylat (1), (5,1 g, 10 mmol) ad én gang under omrøring ved -40°C. Blandingen omrørtes i 15 minutter ved -10°C og 35 henstod ved -10eC til -15eC i 7 timer. Til den afkølede opløsning (1 til 20eC) sattes propan-l,3-diol (10 ml), og blandingen henstod i 16 timer ved -20°C og derefter i 20 minutter ved stuetemperatur under omrøring.

Den resulterende opløsning vaskedes med isvand (2 x 20 ml) og mættet

DK 162052B

27 vandig NaCl (10 ml) , tørredes over MgS04 og koncentreredes i vakuum.

Den gummiagtige remanens (12 g) opløstes i en blanding af CHC13 og n-hexan (2:1), og underkastedes kromatografi under anvendelse af en s i1 i -cagelkolonne (200 g) og det samme opløsningsmiddel som eluant. Frak-5 tioner, der indeholdt titel forbindelsen, inddampedes i vakuum, og remanensen tritureredes med n-hexan til dannelse af 2 (2,1 g, 51%), smeltepunkt 110°C (dek.).

IR: i/KBr: 3400, 2800, 1785, 1725 cm"1.

UV· \^t0H 1% icn\ *65 ™ (El« } jq max lem NMR: 5DMS0-dg + CDC13 ppm: 3,69 (2H, s), 4,43 (2H, s), 5,09 (IH, d, J = 4,5Hz), 5,24 (IH, d, J - 4,5Hz), 6,87 (IH,s), 7,3 (10H, m).

Eksempel 3 15 Benzh.ydr.yl-7fl-rD-2-(t-butox.ycarbonyl amino)-2-(p-h.ydroxyphenyl)-acet-amidol-3-chlormethyl-3-cephem-4-carboxylat (forbindelse 3) HO-< V-CHCONH-,-( > TV™ I ° COiCHCCtHsh C02C(CH3)3

Til en blanding af 20,7 g (0,05 mol) benzhydryl-7-amino-3-chlor-25 methyl-3-cephem-4-carboxylat (2) og 20 g (0,075 mol) D-2-(t-butoxy-carbonylamin)-2-(p-hydroxyphenyl)-eddikesyre i 500 ml tør tetrahydro-furan (THF) sattes 15,45 g (0,075 mol) N,N'-dicyclohexylcarbodiimid (DCC), og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer og inddampedes til tørhed. Remanensen opløstes i 1 1 ethyl acetat (AcOEt), og det 30 uopløselige dicyclohexyluri nstof fjernedes ved filtrering. Filtratet vaskedes med en vandig natriumbicarbonatopløsning, vand og mættet vandig NaCl opløsning, tørredes over vandfri natriumsulfat og inddampedes til tørhed. Den olieagtige remanens kromatograferedes på en sil icagelkolonne (Wakogel C-100, 500 g) ved eluering med 4 1 chloroform og 6 1 1% chloro-35 form-methanol. De ønskede fraktioner kombineredes og inddampedes til tørhed. Den olieagtige remanens tritureredes med ether-isopropyl ether til dannelse af 30,6 g (92%) af 3.

DK 162052B

28 IR: nKBr cm"1: 1790, 1710, 1670, 1500, 1360, 1230, 1150. max NMR: 6CDC13 ppm: 1,45 (9H, s, C-CH3), 3,4 (2H, br-s, 2-H), 4,28 (2H, s, CH2C1), 4,86 (IH, d, 4,5 Hz, 6-H), 5,12 (IH, d, 6Hz, CH-CO), 5 5,68 (IH, dd, 8 & 4,5 Hz, 7-H), 6,63 (2H, d, 9Hz, phenyl-H), 6,93 (IH, s, CH-Ph2), 7,08 (2H, d, 9Hz, phenyl-H), 7,0-7,5 (10H, m, phenyl-H).

Den olieagtige remanens kan benyttes i eksempel 4 uden kromatografisk oprensning.

10

Eksempel 4

Benzh.ydr,yl-7/?-rD-2-(t-butoxycarbony1 amino)-2-(p-h.ydroxyphenyl)acet-amidol-3-iodmeth.yl-3-cephem-4-carbox.ylat (forbindelse 4)

En blanding af 26,6 g (0,04 mol) af 3 og 18 g (0,12 mol) natrium-15 iodid i 400 ml acetone omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer og inddampedes til tørhed. Remanensen ekstraheredes med 400 ml ethylacetat, og ektraktet vaskedes med en vandig Na2S203 opløsning, vand, og en mættet vandig NaCl opløsning. Efter inddampning af opløsningsmidlet tritureredes med ether-isopropyl ether til dannelse af 27 g (89%) af 20 titel produktet. Ethylacetatopløsnignen kan om ønsket anvendes direkte i næste trin (forbindelse 5) uden isolering af forbindelse 4.

IR: j/KBr cm'1: 1790, 1710, 1670, 1500, 1360, 1220, 1150. max NMR: 5CDC13 ppm: 1,47 (9H, s, C-CH3), 3,3-3,6 (2H, m, 2-H), 25 4,20 (2H, s, CH2), 4,89 (IH, d, 4,5 Hz, 6-H), 5,12 (IH, d, 6Hz, CH-CO), 5,68 (IH, dd, 8 & 4,5 Hz, 7-H), 6,62 (2H, d, 9Hz, phenyl-H), 6,92 (IH, s, CHPh2), 7,08 (2H, d, 9Hz, phenyl-H), 7-7,5 (10H, m, phenyl-H).

30 35

DK 162052B

29

Eksempel 5

Benzhydryl-7jg-rD-2-(t-butoxycarbonylamino)-2-(p-hydrox,yphenyl)acet-anridol-3-(triphenylphosphonio)methyl-3-cephem-4-carboxylatiodid (forbindelse 5) 5

y-. S

HO V- CHCONH—,-{ \ φ N=/ I _i J-CH2P(C6HS), ιθ

Ah /~τ

10 I C02CH(C4HA

C02C(CHj)j 15 En blanding af 15,1 g (0,02 mol) af 4 og 15,7 g (0,06 mol) tri- phenylphosphin i 200 ml ethyl acetat omrørtes ved stuetemperatur i 1 time. Det resulterende udfældningsprodukt opsamledes ved filtrering til dannelse af 17,4 g (85,5%) af 5, som smelter ved 170 til 180eC. Filtratet koncentreredes til 100 ml, og koncentratet fortyndedes med 500 ml 20 ether til dannelse af den anden høst (1,1 g) af 5. Det samlede udbytte var 18,5 g (91%). Det totale udbytte af 5 fra 2 er 74,5%. Dette kan forøges til 87,5% ved udeladelse af oprensningen og isolationstrinnene angivet ovenfor.

IRi/KBr cm*1: 1780, 1670, 1490, 1420, 1350, 1240, 1150, 1090.

25 max HNR: δ CDC13 ppm: 1,42 (9H, s, C-CH3), 3,45 (2H, br-s, 2-H), 5- 5,4 (3H, m, 3-H & 6-H), 5,7 (IH, m, 7-H), 6,63 (2H, d, 9Hz, phenyl-H), 7,1-7,45 (12H, m, phenyl-H), 7,5-7,9 (15H, m, phenyl-H).

Analyse. Beregnet for C52H49N307SPI: C, 61,36; H, 4,85; 30 N, 4,13; S, 3,15, Fundet: C, 61,26; H, 4,82; N, 4,11; S, 3,92.

35

DK 162052B

30

Eksempel 6

Benzhydryl-7/H'D-2-(t-butoxycarbonvlamino)-2-(p-hydroxyphenyl)acet-amidol-3-r(Z)-l-propen-l-yllceph-3-em-4-carboxylat (forbindelse 6) 5

y-v S

HO-< V-CHCONH—i-( \ I I I, J-ch=chch3

NH Ci T

I υ C02CH(C6Hs)2 C02C(CH3), 10

Til en opløsning af 1,8 g (1,77 mmol) af 5 i 100 ml chloroform sattes 100 ml vand indeholdende 2 ml (2 mmol) IN natriumhydroxid, og blandingen rystedes i 5 minutter. Den organiske fase adskiltes, vaskedes 15 med vand og tørredes over vandfri natriumsulfat. Idet chloroformopløsningen filtreredes, koncentreredes filtratet til 50 ml under reduceret tryk. Til koncentratet sattes 1 g acetaldehyd, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer og inddampedes til tørhed. Den olieagtige remanens kromatograferedes på en sil icagelkolonne (Wakogel C-200, 50 g) 20 ved eluering med chloroform og chloroform-methanol (99:1) De ønskede fraktioner opsamledes og inddampedes til dannelse af 318 mg (28%) af produktet 6, smeltepunkt 120 til 130eC (dek.).

IR: vKBr cm'1: 1780, 1670, 1710, 1490, 1360, 1210, 1150. max 25 NMR: 8 CDC13 ppm: 1,3-1,5 (I2H, m, C-CH3), 3,22 (2H, br-s, 2-H), 4,90 (IH, d, 4,5Hz, 6-H), 5,15 (IH, br-d, CH-CO), 5,5-6,1 (3H, m, CH=CH & 7-H), 6,63 (2H, d, 9Hz, phenyl-H), 6,91 (IH, s, CH-Ph), 7,09 (2H, d, 9Hz, phenyl-H), 7,2-7,5 (10H, m, phenyl-H).

30 Eksempel 7

Natrium-7ff-rD-2-amino-2-(p-hvdroxyphenyl)acetamidol-3-r(Z)-l-propen-l-vl1-3-ceph-em-4-carboxylat (forbindelse 7, BMY-28100 natriumsalt) __ s HO—f >-CHCONH—-( \ 35 I t J—C H=CHCHj (cis) NH, /-Nf Π '

υ COOH

DK 162052 B

31

En blanding af 318 mg (0,48 mmol) af 6 og 2,5 ml trifluoreddike-syre (TFA) omrørtes ved stuetemperatur i 1 time og fortyndedes dernæst med 50 ml ether og 50 ml isopropyl ether. Det udskilte bundfald opsamledes ved hjælp af filtrering og vaskedes med ether til dannelse af 188 mg 5 (77%) af trifluoracetatet af 7, der opløstes i 2 ml methanol (MeOH). Til opløsningen sattes 2 ml (2 mmol) natrium-2-ethylhexanoat (SEH) opløst i ethylacetat, og blandingen fortyndedes med 30 ml ethylacetat til udskillelse af bundfaldet, som opsamledes ved filtrering, vaskedes med ether og tørredes i vakuum over P20s til dannelse af 144 mg (73% fra 6) rå 10 7. Det rå produkt (135 mg) opløstes i 10 ml vand og opløsningen kromato-graferedes på en kolonne (25 mm x 100 mm) under anvendelse af ca. 20 ml af pakningen i PrepPak-500/Cie (Waters). Kolonnen elueredes med vand, og eluatet, der indeholdt det ønskede produkt, koncentreredes til 5 ml og lyofiliseredes til dannelse af 93 mg (69%) af 7. Smeltepunkt 15 200°C (gradvis dek.). Skønnet renhed 60% (ved HPLC).

IR: /Br cm'1; 1760, 1660, 1590, 1400, 1360, 1250.

max UV: phosphatbuffer (pH 7) n7 (11300}) 280 (8200).

max 20 NMR: SDfl ppm: 1,65 (3H, d, 6Hz, -C-CH3), 3,21 (IH, d, 18Hz, 2-H), 3,52 (IH, d, 18Hz, 2-H), 5,12 (IH, d, 4,5Hz, 6-H), 5,68 (IH, d, 4,5Hz, 7-H), 5,5-5,9 (IH, m, vinyl-H), 5,95 (IH, d, 11,5Hz, vinyl-H), 6,94 (2H, d, 8Hz, phenyl-H), 7,36 (2H, d, 8Hz, phenyl-H).

Det rå produkt fremstillet i eksempel 7, rå 7 før kromatografisk 25 oprensning (11,9 g), opløstes i 50 ml 0,01M phosphatbuffer (pH 7,2) -methanol (85:15), og opløsningens pH justeredes til 6 med 6N saltsyre.

Denne opløsning underkastedes preparativ højeffektiv væskekromatografi (HPLC) (PrepPAK-500/C18, system 500, Waters) ved eluering med 0,01M phosphatbuffer (pH 7,2) indeholdende 15% methanol. Eluatet undersøgtes 30 ved hjælp af analytisk HPLC og det konstateredes, at den første 4 liters fraktion indeholdt cis-isomer (BMY-28100). Den anden 1 liters fraktion, som indeholdt trans-isomeren, opsamledes og koncentreredes til 500 ml. Koncentratet justeredes til en pH på 3 med fortyndet saltsyre og kroma-tograferedes på en HP-20 kolonne (100 ml) ved eluering med 1 1 af hen-35 holdsvis vand og 30% methanol. Det sidstnævnte eluat, med et volumen på ca. 300 ml, koncentreredes til 10 ml og lyofiliseredes til dannelse af 290 mg af den rå trans-isomer (55% rent). Dette materiale opløstes i 100 ml 50% methanol og behandledes med aktivt kul. Filtratet koncentreredes

DK 162052B

32 til et volumen på 20 ml og henstod natten over ved 5°C. Produktet krystalliseredes som farveløse prismer, som opsamledes ved filtrering og tørredes i vakuum, 129 mg, smeltepunkt 230*C (dek.). Det drejede sig om E-propenylforbi ndel sen.

5

Eksempel 8

Krystallinsk 7g-rD-2-amino-(p-h.ydrox.yphenyl)acetamidol-3-r(Z)-l-Dropen- l-.yn-3-cephem-4-carboxyls.yre (forbindelse 9, BMY-28100)

Den første 4 liters fraktion, som opnåedes ved den ovenfor 10 beskrevne preparative HPLC-fremgangsmåde, og som indeholdt cis-isomeren (BMY-28100), koncentreredes til et volumen på 2 1, og koncentratet justeredes til pH 3 med fortyndet saltsyre. Opløsningen overførtes til en kolonne indeholdende HP-20 (11), og kolonnen vaskedes med 6 1 vand, indtil effluentets pH var 7. Kolonnen elueredes dernæst med 4 1 30% 15 vandig methanol. Eluatopløsningen undersøgtes ved HPLC, og de passende fraktioner kombineredes (ca. 2,5 1) og koncentreredes til 50 ml ved en temperatur på mindre end 40eC ved reduceret tryk. Et krystallinsk udfældningsprodukt dannedes. Koncentratet afkøledes ved 0eC i 2 timer, og det krystallinske bundfald opsamledes ved filtrering, vaskedes med 20 80% vandig acetone, derefter med 100% acetone, og tørredes dernæst i vakuum over P205, hvilket gav et udbytte på 4,09 g af det ønskede rå krystallinske produkt, smeltepunkt 218 til 220*C (dek.), farveløse prismer med en renhed på 95% som bestemt ved HPLC analyse.

IR: vKBr cm'1: 1750, 1680, 1560, 1520, 1460, 1390, 1350, 1270, 1235 25 max uv. Aphosphatpuffer (pH 7) 228 (12300), 279 (9800).

max NMR: 5D20+NaHC03 ppm: 1,71 (3H, d, 6Hz, C-CH3), 3,27 (IH, d, 18Hz, 2-H), 3,59 (IH, d, I8Hz, 2-H), 5,18 (IH, d, 4,5Hz, 6-H), 5,22 (IH, 30 s, CHC0), 5,73 (IH, d, 4,5Hz, 7-H), 5,5-6,0 (IH, m, CH=C), 6,02 (IH, d, 11Hz, CH=C), 6,98 (2H, d, 9Hz, phenyl-H), 7,41 (2H, d, 9Hz, phenyl-H).

Analyse. Beregnet for C18HigN305S-l/2H20: C, 54,26; H, 5,06; N, 10,55; S, 8,05. Fundet: C, 54,15, 54,19; H, 5,13, 5,08; 35 N, 10,30, 10,42; S, 8,38, 8,04.

Moderluden fra den foregående krystallisering koncentreredes til et volumen på 10 ml og behandledes med 20 ml acetone. Efter henstand af

DK 162052 B

33 opløsningen i køleskab natten over havde der dannet sig et krystallinsk bundfald, som opsamledes ved filtrering og tørredes i vakuum over P205, vægt 670 mg (90% rent ifølge HPLC). En del af dette materiale (560 mg) opløstes i 200 ml 50% vandig methanol, og opløsningen behand-5 ledes med 0,5 g aktivt kul og filtreredes. Filtratet koncentreredes ved reduceret tryk og 40eC til et volumen på 20 ml og henstod derefter i 5 timer ved 5"C. Produktet udkrystalliserede og opsamledes ved filtrering, vaskedes med acetone og tørredes i vakuum over P205, hvilket gav et udbytte på 227 mg krystallinsk BMY-28100 (98% rent ifølge HPLC). Lyofi-10 lisering af moderluden gav et udbytte på 181 mg BMY-28100, som havde en renhed på 95% (HPLC).

Eksempel 9

Benzhydryl-7β-ΓΡ-2-(t-butoxycarbonylamino)-2-phenylacetamidol-3-(tri -15 phenylphosphonio)methyl-3-cephem-4-carboxy1atiodid (forbindelse 9)

En blanding af 14,5 g (0,0196 mmol) benzhydryl-7-[D-(-)-a-(t-butoxycarbonylami no)-α-phenylacetami do]-3-i odmethyl-3-cephem-4-carb-oxylat og 5,24 g (0,02 mol) triphenylphosphin i 300 ml ethylacetat omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer. Til reaktionsblandingen sattes 20 200 ml ether til dannelse af bundfald, som opsamledes ved filtrering og vaskedes med ether til dannelse af 14,3 g (73%) af titel forbindelsen.

Filtratet koncentreredes til 50 ml, og koncentratet fortyndedes med ether til dannelse af 2,4 g af mere af produktet. Samlet udbytte 16,7 g (85%).

25 IR: i/KBr cm"1: 1780, 1690, 1480, 1420, 1350, 1240, 1150. max

Eksempel 10

Benzhydryl-7β-ΓΡ-2-(t-butoxycarbonylamino)-2-phenylacetamidol-3-Γ(Z)-1-30 propen-l-vn-3-cephem-4-carboxylat (forbindelse 10)

Til en opløsning af 5 g (5 mmol) af 9 i 200 ml chloroform sattes en blanding af 100 ml vand og 5 ml (5 mmol) IN natriumhydroxid, og blandingen rystedes i 3 minutter. Den fraskilte organiske fase vaskedes med vand og en mættet NaCl opløsning og tørredes over vandfri magnesium-35 sulfat. Idet chloroformopløsningen filtreredes, koncentreredes filtratet til 100 ml under reduceret tryk. Til koncentratet sattes 3 ml acetalde-hyd, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1\ time og inddampedes til tørhed. Den olieagtige remanens kromatograferedes på en silica-

DK 162052B

34 kolonne (kieselgel 60, 50 g) ved eluering med chloroform. De ønskede fraktioner opsamledes og inddampedes til tørhed, og remanensen tritureredes med n-hexan til dannelse af 990 mg (31%) af titel forbindel sen (10).

5 IR: i/mKBr cm"1 1780, 1710, 1660, 1510, 1490, 1360, 1240, 1210, max 1150.

NMR: 6CDC13 ppm: 1,3-1,5 (12H, m, -C-CH3), 3,22 (2H, s, 2-H), 4,93 (IH, d, 4,5Hz, 6-H), 5,23 (IH, d, 8Hz, CH-C0), 5,5-6,2 (3H, m, 7-H & vinyl-H), 6,94 (IH, s, CHPh), 7,2-7,5 (15H, m, phenyl-H).

10

Eksempel 11

Natrium-7l-rD-2-amino-2-pheny1acetamido1-3-r(Z)-l-propenyl]-3-cephem-4-carboxylat (forbindelse 11, BB-S1065)

En blanding af 0,94 g (1,47 mmol) af 10 og 3 ml TFA omrørtes ved 15 stuetemperatur i 30 minutter og fortyndedes dernæst med 50 ml af en 1:1 blanding af ether-isopropyl ether til udskillelse af 800 mg bundfald, som opsamledes ved filtrering og opløstes i 3 ml methanol. Til opløsningen sattes 4,5 ml (4,5 mmol) 1M natrium-2-ethylhexanoat (SEH) i ethylacetat, og blandingen fortyndedes med 50 ml ether og dernæst med 50 ml iso-20 propylether. Bundfaldet opsamledes ved filtrering til dannelse af 710 mg af det rå produkt 11, som opløstes i 20 ml vand og kromatograferedes på en kolonne under anvendelse af 50 ml af pakningen i en PrepPAK/C18 patron (Waters). Kolonnen elueredes med vand og 10% methanol. De fraktioner, der indeholdt det ønskede produkt, opsamledes ved overvågning af 25 HPLC og koncentreredes til 5 ml og lyofiliseredes til dannelse af 182 mg (31%) af det ønskede produkt, smeltepunkt ved 200°C. Skønnet renhed 50% ved HPLC.

IR: /Br cm"1: 1760, 1660, 1600, 1400, 1180, 1100. max 30 UV: xphosphatbuffer (pH 7) >»"(0 : 282 (5500).

max NMR: 6D2Q ppm: 1,60 (3H, d, 6Hz, -C-CH3), 3,12 (IH, d, 18Hz, 2-H), 3,48 (IH, d, 18Hz, 2-H), 5,03 (IH, d, 4,5Hz, 6-H), 5,62 (IH, d, 4,5Hz, 7-H), 5,93 (IH, d, 10Hz, vinyl-H), 5,2-5,8 (IH, m, vinyl-H), 7,41 35 (5H, s, phenyl-H).

DK 162052B

35

Eksempel 12 7β-(D-(-)-2-Amino-2-phenylacetamido)-3-Γ(Z)-1-propen-1-yl1-3-cephem-4-carboxylsyre (forbindelse 24, BB-S1065 zwitterionform) 5

/""V-CHCONH-n-( N

I I J—CH=CHCHj (Z) nh, 7-Νγ 0 co2h 10

Di phenylmethyl-7>S-[D-2-(t-butoxycarbonylami no)-2-phenylacetami do]- 3-(l-propenyl)-3-cephem-4-carboxylat (forbindelse 10) 1,5 g, (2,34 mmol) behandledes med 3 ml tri fluoreddikesyre, og blandingen omrørtes ved 15 stuetemperatur i 20 minutter og fortyndedes med 100 ml ether til dannelse af 1,15 g (96%) af det rå tri fluoracetat af BB-S1065.

IR: /Br cm'1: 1760, 1670, 1200, 1130. max UV; ^phosphatbuffer (pH 7) m{(). m (8300) 2q max

Tri fluoracetatet (1,1 g, 2,25 mmol) opløstes i 20 ml vand, og opløsningen kromatograferedes på en kolonne under anvendelse af 100 ml af pakningen opnået fra PrepPAK/C18 patron (Waters). Kolonnen elueredes med vand, 10% methanol og 30% methanol. Eluatet med 30% 25 methanol koncentreredes til 10 ml. Det krystallinske produkt fraskiltes. Produktet opsamledes og vaskedes med acetone og tørredes i vakuum over P205 til dannelse af 505 mg (46%) rent BB-S1065 (zwitterionform), som smelter ved 180 til 183eC (dek.). Skønnet renhed 95%.

IR: i/KBr cm'1: 1750, 1690, 1590, 1400, 1350.

30 maX

UV: Aphosphatbuffer (pH 7) nm(£). 282 ^8800). max NMR: 5D20+NaHC03 ppm: 1,58 (3H, d, J = 6Hz, C-CH3), 3,3 (2H, d, 2-H), 5,03 (IH, d, 0 = 4,5Hz, 6-H), 5,20 (IH, s, CH-C0)p, 35 5,8 (IH, m, CH=C), 5,63 (IH, d, J = 4,5Hz, 7-H), 5,92 (IH, d, J = 12Hz, CH=C), 7,4 (5H, s, phenyl-H).

DK 162052 B

36

Eksempel 13 D-(-)-2-(t-Butoxycarbonylamino)-2-(3-chlor-4-h.ydroxyphen.yl)-eddi kesyre (forbindelse 13)

En blanding af 6 g (0,03 mol) 3-chlor-4-hydroxyphenylglycin og 5 9,8 g (0,045 mol) di-t-butyl-dicarbonat i 120 ml af en 50% vandig tetra- hydrofuran (THF) opløsning indeholdende 10 ml (0,071 mol) triethylamin omrørtes ved stuetemperatur i 3 timer. Blandingen koncentreredes til 60 ml, og koncentratet vaskedes med ether. Den vandige fase gjordes sur med 6N saltsyre og ekstraheredes med 200 ml ether. Ekstraktet vaskedes med 10 vand og en mættet NaCl opløsning, tørredes over MgS04 og inddampedes til tørhed til dannelse af 10 g af en olieagtig remanens, som ikke størknede ved forsøg på triturering med ether-n-hexan.

Eksempel 14 15 Benzhydryl -7/?- ΓΡ-2-(t-butoxycarbonyl ami no) -2- (3-chl or-4-hydroxyphenyl) -acetamidol-3-chlormethyl-3-cephem-4-carboxylat (forbinde!se 14) s HO-A —CHCONH i—( ''i 2o I ~Oy-cH’ci

Cl NH ff T

I ° C02CH(C4Hs)2 C02C(CH3)j 25 Til en opløsning af 6,2 g (0,015 mol) af forbindelse 2 og 5,4 g (0,018 mol) af forbindelse 13 i 150 ml tør THF sattes 3,7 g (0,018 mol) DCC, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time. Dicyclohexyl-urinstof, som udskiltes under omrøring, fjernedes ved filtrering, og filtratet inddampedes til tørhed. Remanensen ekstraheredes med 200 ml 30 ethylacetat, ekstraktet vaskedes med en vandig NaHC03 opløsning, vand og en mættet NaCl opløsning og tørredes med Mg$04. Filtratet inddampedes til tørhed, og den olieagtige remanens kromatograferedes på en sil icage!kolonne (Wakogel C-200, 140 g) ved eluering med toluen-ethyl-acetat (10:1). De ønskede fraktioner opsamledes og inddampedes til 35 tørhed til dannelse af produktet 14.

IR: i/KBr cm'1: 1790, 1720, 1680, 1500, 1370, 1240, 1160. max

DK 162052 B

37

Eksempel 15

Benzhydryl-7fl-rD-2-(t-butoxycarbonylamino)-2-(3-chlor-4-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(tri phenylphosphoniolmeth.yl-3-cephem-4-carboxylatiodid (forbindelse 15) 5 »0^>-fC0NHTlVcHif(C4HA I0 10 Cl ^ 0 CO,CH(C,Hi).

COiC(CHj)i

Til en opløsning af 10 g (0,0143 mol) af forbindelse 14 i 100 ml 15 acetone sattes 11,2 g (0,075 mol) natriumiodid, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 30 minutter. Blandingen koncentreredes til 30 ml.

Til koncentratet sattes 200 ml ethyl acetat, og blandingen vaskedes med en vandig Na2S203 opløsning, vand og en mættet NaCl opløsning og tørredes med MgS04. Ethyl acetatopløsningen filtreredes, og filtratet 20 koncentreredes til det halve volumen. Til koncentratet sattes 3,9 g (0,015 mol) triphenylphosphin, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer. Til opløsningen sattes 300 ml ether til udskillelse af et bundfald, som opsamledes ved filtrering og tørredes til dannelse af 9,2 g phosphoniumiodidet 15.

25 IR: vKBr cm'1: 1780, 1680, 1490, 1350, 1240, 1150. max

Eksempel 16

Benzhydr.yl-7jg-[D-2-(t-butoxycarbon.ylamino)-2-(3-chlor-4-hydroxyphenyl)-30 acetamidol-3-r(Z)-l-propen-l-yn-3-cephem-4-carbox.y1at (forbindelse 16) s ho-^Vchconh-,-( \ y-r I J_,1, J-CH=CHCH3 (Z)

35 ci NH * T

I ϋ CC^CHtCA), C02C(CH3)3

DK 162052B

38

En opløsning af 9,5 g (9 mmol) af forbindelse 15 i 200 ml chloroform sattes til en blanding af vand (100 ml) og IN NaOH (10 ml), og blandingen rystedes i 3 minutter. Den organiske fase vaskedes med vand og en mættet NaCl opløsning, tørredes med MgS04 og koncentreredes til 5 ca. det halve volumen. Til koncentratet sattes 20 ml 90% acetaldehyd, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i ca. 3 timer, behandledes med vandfri MgS04 og filtreredes. Filtratet inddampedes til tørhed, og remanensen kromatograferedes på Kieselgel 60 (Merck, 120 g) ved eluéring med toluen-ethylacetat (4:1). De ønskede fraktioner opsamledes og 10 inddampedes til tørhed, og remanensen tritureredes med en blanding af ether, isopropylether og n-hexan til dannelse af 1,33 g af det blokerede produkt 16.

IR: /Br 1770, 1700, 1660, 1480, 1350, 1210, 1150. max 15

Eksempel 17 7jg-rD-2-amino-2-(3-chlor-4-h.ydroxvphen.yl)acetamidol-3-r(Z)-l-propen-l-yn-3-cephem-4-carboxy1syre (forbindelse 17, BMY-28060) 20 H0^^HC0NHTli i-CH=CHCH3 (Z) c 0 co2h 25

En blanding af 1,33 g (1,93 mmol) af forbindelse 16 og 3 ml tri -fluoreddikesyre omrørtes ved stuetemperatur i 30 minutter, og blandin-30 gen fortyndedes med 50 ml ether-isopropylether (1:1) til dannelse af 1,072 g af det rå trifluoracetat af 17, som kromatograferedes på en kolonne pakket med pakningen af en PrépPAK/C18 patron (Waters) (80 ml). Kolonnen elueredes med vand og 10% methanol. Eluatet med 10% methanol koncentreredes til 10 ml af volumenet til udskillelse af et 35 krystallinsk bundfald, som opsamledes ved filtrering og vaskedes med acetone og tørredes i vakuum over P205 til dannelse af 238 mg af 17 (95% rent), som smelter ved 180 til 185eC (gradvis dek.). Filtratet koncentreredes til 5 ml og lyofili seredes til dannelse af 154 mg af en

DK 162052 B

39 anden fraktion, som havde en renhed på 80% ifølge HPLC.

IR: i/KBr cm-1: 1760, 1680, 1570, 1410, 1390, 1350, 1290, 1270. max . u « , u 7Λ nm(e): 232 (10000), 280 (10500).

uv. ^hosphatbuffer (pH 7) % ' U max NMR: 5D20+NaHC03 ppm: 1,68 (3H, d, J - 6Hz, C=C-CH3), 3,25 (IH, d, J = 18Hz, 2-H), 3,57 (IH, d, J = 18Hz, 2-H), 4,90 (IH, s, CH-CO), 5,18 (IH, d, J = 4,5Hz, 6-H), 5,72 (IH, d, J = 4,5Hz, 7-H), 5,5-5,9 (IH, m, CH=C), 5,97 (IH, d, J = 12Hz, CH«C), 7,02 (IH, d, J = 8Hz, phenyl-H), 10 7,30 (IH, d-d, J = 8 & 1,5 Hz, phenyl-H), 7,50 (IH, d, J = 1,5Hz, phenyl-H).

Eksempel 18 D-(-)-2-(t-Butoxycarbonylamino)-2-(3,4-di hydroxyphenyl)-eddikesyre (18a) 15 blandet med dets 3-(oq 4-)mono-0-butoxycarbonyl-derivater (18b)

En blanding af 3,66 g (0,02 mol) af 3,4-dihydroxyphenylglycin og 9,24 g (0,04 mol) di-t-butyl-dicarbonat i 120 ml af en 50% vandig THF opløsning indeholdende 10 ml (0,071 mol) triethylamin omrørtes ved stuetemperatur i 16 timer, og blandingen koncentreredes til 60 ml.

20 Koncentratet vaskedes med 100 ml ether, gjordes sur med IN saltsyre og ekstraheredes med ether (100 x 2 ml). De kombinerede ekstrakter vaskedes med vand og en mættet NaCl opløsning, tørredes med MgS04 og inddampedes til tørhed til dannelse af 8 g af en olieagtig remanens, som var en blanding af det ønskede 3,4-dihydroxyphenylderivat og de 3- og 4-25 mono-O-BOC-beskyttede derivater (BOC betyder t-butoxy-carbonyl).

Eksempel 19

Benzhydryl-7β-ΓΡ-(-)-2-(t-butoxycarbonylamino)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-acetamidol-3-chlormethyl-3-cephem-4-carboxylat (19a) i blanding med dets 30 3-(og 4-)mono-0-butoxycarbony1derivater (19b)

HO NH r" T

35 I ° C02CH(CtH5)2 C02C(CH3)j

DK 162052 B

40

En blanding af 8 g (0,0193 mol) af forbindelse 2, 8 g af det blandede produkt ifølge eksempel 18 og 4,12 g (0,02 mol) DCC i 200 ml tør THF omrørtes ved stuetemperatur i 1 time. Reaktionsblandingen inddampedes til tørhed. Remanensen opløstes i 200 ml ethyl acetat, og 5 uopløseligt materiale (dicyclohexylurinstof) fjernedes ved filtrering. Filtratet vaskedes med en vandig NaHC03 opløsning, vand og en mættet NaCl opløsning, tørredes med MgS04 og inddampedes til tørhed under reduceret tryk. Den olieagtige remanens kromatograferedes på en silicagelkolonne (Kieselgel 60, 130 g) ved eluering med toluen-ethyl-10 acetat (5:1) og toluen-ethylacetat (2:1). Eluatet med toluen-ethylacetat (5:1) opsamledes og inddampedes til tørhed til dannelse af 9,5 g af en blanding af mono-0-B0C-N-B0C-afbeskyttede derivater (19b). Eluatet med toluen-ethylacetat (2:1) opsamledes og inddampedes til tørhed til dannelse af 3 g af 3,4-dihydroxyphenylderivatet (19a).

15

Forbindelse 19a IR. „KBr 1770, 1720, 1690, 1500, 1370, 1240, 1150. max NMR: 6CDC13 ppm: 1,42 (9H, s, C-CH3), 3,4 (2H, br-s, 2-H), 4,30 20 (2H, br-s, CH2-C1), 4,85 (IH, d, J = 4,5Hz, 6-H), 5,07 (IH, d, J = 6Hz, CH-NH), 5,74 (IH, d-d, J = 9 & 4,5 Hz, 7-H), 6,6-6,9 (3H, m, phenyl-H), 6,93 (IH, s, CHPh), 7,3 (10H, s, phenyl-H).

Blanding 19b 25 IR: i/KBr: 1770, 1720, 1690, 1500, 1370, 1240, 1150. max NMR: SCDClj ppm: 1,42 (9H, s, C-CH3), 1,55 (9H, s, C-CH3), 3,4 (2H, br-s, 2-H), 4,35 (2H, br-s, CH2-C1), 6,9-7,1 (4H, m, CHPh & phenyl-H), 7,3 (10H, s, phenyl-H).

30 35 5

DK 162052 B

41

Eksempel 20

Benzhydryl-70-ΓΡ-(-)-2-(t-butoxycarbonylamino)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-acetamidol-3-triphenylphosphoniomethyl-3-cephem-4-carboxylatiodid (20a) 1,0 I” 0 COiCH(CtHi)i 10 COjC(CH3),

En blanding af 3 g (4,4 mmol) af 19a og 3,3 g (22 mmol) natrium-iodid i 50 ml acetone omrørtes ved stuetemperatur i 30 minutter, og blandingen koncentreredes til tørhed. Remanensen ekstraheredes med 100 15 ml ethyl acetat, og ekstraktet vaskedes med en vandig Na2S203 opløsning, vand og en mættet NaCl opløsning. Efter tørring med MgS04 koncentreredes ekstraktet til 60 ml. Til koncentratet sattes 1,4 g (5,3 mmol) triphenylphosphin, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time. Til blandingen sattes 100 ml ether til udskillelse af bundfaldet, 20 som opsamledes ved filtrering og vaskedes med ether til dannelse af 3,2 g (70%) af phosphoniumiodidet (20a).

IR: i/KBr 1780, 1680, 1480, 1430, 1360, 1240, 1150. max På lignende måde fik 9,5 g (12 mmol) af blandingen af mono-O-BOC-25 beskyttede derivater (19b) lov til at reagere med natri umi odid og derefter med triphenylphosphin til dannelse af 10,7 g (77%) af en blanding af de tilsvarende mono-O-BOC-N-BOC-triphenylphosphoniomethyl-derivater (20b).

IR: i/KBr 1770, 1720, 1680, 1480, 1430, 1360, 1240, 1140.

30 max 35

DK 162052 B

42

Eksempel 21

Benzh.ydryl-7β-fD-(-) -2-(t-butoxycarbonyl ami no) -2-(3,4-dihydroxyphenyl) -acetafflido1-3-r(Z)“l-propen*l-yl1-3-cephem-4-carbox.ylat (forbindelse 21a) 5 _ s HO-<r^y-CHCONH—I-( \ I I_jjj J-CH=CHCH, (Z) HO NH c/ 1 I U C02CH(C6H5)2 C02C(CH3)j 10

Til en omrørt opløsning af 3,15 g (3 mmol) af forbindelse 20a og 10 ml acetaldehyd i 50 ml chloroform sattes dråbevis 8 ml (4 mmol) 0,5N natriumhydroxid over et tidsrum på 10 minutter, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time. Reaktionsblandingen vaskedes med 15 vand og en mættet NaCl opløsning, tørredes med MgS04 og inddampedes under reduceret tryk. Den olieagtige remanens kromatograferedes på en sil i cage!kolonne (Wakogel C-200, 60 g), som elueredes med chloroform (2 1) og 2% methanol i chloroform i forbindelse med undersøgelse ved TLC [chloroform-methanol (10:1)]. De ønskede fraktioner fra 2% methanol-20 eluatet opsamledes og inddampedes til tørhed til dannelse af 0,8 g (40%) af propenylderivatet 21a.

NMR: 6CDC13 ppm: 1,28 (3H, d, J = 6Hz, C-CH3), 1,42 (9H, s, C-CH3), 3,25 (2H, s, 2-H), 4,92 (IH, d, J = 4,5Hz, 6-H), 5,08 (IH, d, J = 6Hz, CH-NH), 5,3-5,8 (IH, m, CH=C), 5,80 (IH, d, J = 4,5Hz, 7-H), 25 6,04 (IH, d, J = 11Hz, CH=C), 6,70 (2H, s, phenyl-H), 6,82 (IH, s, phenyl-H), 6,92 (IH, s, CHPh), 7,3 (10H, s, phenyl-H).

På lignende måde som beskrevet ovenfor fik 10,5 g (9,3 mmol) af blandingen af de 3- og 4-O-BOC-N-BOC-afbeskyttede derivater 20b lov at reagere med acetaldehyd til dannelse af 3,3 g (46%) af det ti 1 -30 svarende 3-propenylderi vat 21b.

IR: i/KBr 1770, 1700, 1500, 1370, 1240, 1150. max NMR: 6CDC13 ppm: 1,4 (9H, s, C-CH3), 1,55 (9H, s, C-CH3), 3,25 (2H, s, 2-H), 6,07 (IH, d, J = 11Hz, CH=C), 6,9-7,1 (4H, m, CH-Ph & 35 phenyl-H), 7,3-7,5 (10H, m, phenyl-H).

5 43

DK 162052 B

Eksempel 22 7j8-rD-(-)-2-Amino-2-(3,4-dih.Ydroxyphen,y1)acetamido1-3-f(Z)-l-propen-l-yH-3-cephem-4-carboxy1syre (forbindelse 22, BMY-28068)

S

i-CH-CHCH, (Z, „f 0>~τ

U COjH

10

En blanding af 0,8 g (1,2 mmol) af forbindelse 21a, 0,8 ml anisol og 3 ml trifluoreddikesyre omrørtes ved stuetemperatur i 5 minutter og fortyndedes med 25 ml ether og 25 ml isopropyl ether. Det resulterende bundfald opsamledes ved filtrering og vaskedes med isopropylether til 15 dannelse af 557 mg af det rå trifluoracetatsalt af forbindelse 22. En opløsning af det rå produkt i 10 ml vand rensedes ved kolonnekromatografi under anvendelse af 100 ml af pakningen af en PrepPAK-C18 patron (Waters), og kolonnen elueredes med vand og dernæst med 5% methanol. 5% methanol eluatet indeholdende det ønskede produkt koncen- 20 treredes til 5 ml og lyofiliseredes til dannelse af 231 mg (47%) af forbindelse 22 (zwitterionform, 90% rent). Smeltepunkt 200°C (gradvis dek.).

IR: i/KBr 1760, 1690, 1580, 1530, 1400, 1360, 1290, 1270. max 25 UV: APhosphatbuffer (pH 7) 233 i920o), 281 (11000).

max NMR: 6D20 ppm: 1,68 (3H, d, J = 6Hz, C-CH3), 3,26 (IH, d, J = 18Hz, 2-H), 3,58 (IH, d, J - 18Hz, 2-H), 5,18 (IH, s, CHNH), 5,22 (IH, d, J - 4,5Hz, 6-H), 5,5-5,9 (2H, m, CH=C & 7-H), 5,97 (IH, d, J = 30 11Hz, CH=C), 7,05 (3H, m, phenyl-H).

På lignende måde gav 3,3 g (4,3 mmol) af den N,0-di-t-BOC-beskytte-de derivatblanding 21b 1,3 g (75%) af forbindelse 22 som zwitterion-formen (90% rent), hvilket gav spektraldata, som var identiske med de ovenfor angivne.

35 5

DK 162052 B

44

Eksempel 23 D-(-)-2-(t-Butoxycarbonylamino)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)eddlkesyre (forbindelse 23)

HO——CHC02H

i ch3o ™ C02C(CHj)j 10

En blanding af 2,96 g (0,015 mol) D-(-)-2-amino-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)eddikesyre og 3,6 g (0,0165 mol ) di-t-butyl-dicarbonat i 100 ml 50% vandig THF indeholdende 4,2 ml (0,03 mol) triethylamin omrør-tes ved stuetemperatur i 16 timer, og reaktionsblandingen koncentreredes 15 til 50 ml. Koncentratet vaskedes med 50 ml ether, gjordes sur med IN saltsyre og ekstraheredes to gange med ether (2 x 100 ml). De kombinerede ekstrakter vaskedes med vand og en mættet NaCl opløsning. De tørrede ekstrakter inddampedes til tørhed til dannelse af 4,38 g af forbindelse 23 som et skumagtigt fast stof.

20 NMR: 5CDC13 ppm: 1,4 (9H, s, -C-CH3), 3,8 (3H, s, 0CH3), 5,15 (IH, d, J = 6Hz, CH-NH), 6,85 (3H, s, phenyl-H).

Eksempel 24

Benzh.ydr,vl-78-rD-(-)-2-(t-butoxycarbony1amino)-2-(4-hydrox,v-3-methox,y-25 phenyl)-acetamido1-3-ch1ormeth.yl-3-cephem-4-carboxylat (forbindelse 24) HO—^V-CHCONH-,-( \ h3co nh * i 30 I COjCHiCiHsh COjC(CH3)j.

En blanding af 4,3 g af forbindelse 23, 5 g (0,012 mol) af for-35 bindelse 2 og 3 g (0,015 mol) DCC i 150 ml tør THF omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer. Det udfældede urinstof fjernedes ved filtrering, og filtratet inddampedes til tørhed. En opløsning af remanensen i 200 ml ethyl acetat vaskedes med en vandig NaHC03 opløsning, vand og en mættet

DK 162052 B

45

NaCl opløsning, tørredes med MgS04 og inddampedes til tørhed. Den olieagtige remanens kromatograferedes på en sil icage!kolonne (Kieselgel 60, 100 g), som elueredes med toluen-ethylacetat (4:1) under analyseringen med TLC [toluen-ethylacetat (1:1) eller chloroform-methanol 5 (50:1)]. De ønskede fraktioner opsamledes og inddampedes til tørhed til dannelse af 7 g af det ønskede 3-chlormethyl-cephem, forbindelse 24, som et skumagtigt fast stof.

NMR: S ppm: 1,4 (9H, s, C-CH3), 3,45 (2H, br-s, 2-H), 3,83 (3H, s, 0CH3), 4,32 (2H, s, -CH2C1), 4,92 (IH, d, J = 4,5Hz, 6-H), 5,13 10 (IH, d, J = 6Hz, CH-NH), 5,65 (IH, d, J = 6Hz, NH), 5,80 (IH, d-d, J = 8 & 4,5 Hz, 7-H), 6,85 (3H, s, phenyl-H), 6,95 (IH, s, CH-Ph), 7,2-7,5 (10-H, m, phenyl-H).

Eksempel 25 15 Benzhydryl-7jS- ΓΡ- (-) -2-(t-butoxycarbonyl ami no) -2- (4-hydroxy^3-methoxy-phenyl)acetamido1-3-triphenylphosphoniomethyl-3-cephem-4-carboxy1atiodid (forbindelse 25) /=\ s 20 HO-4 J—CHCONH—,-( \ ® -y-|

HjCO NH nf T

I 0 C02CH(C6H5)2 C02C(CHj)3 25

En blanding af 7 g (0,01 mol) af forbindelse 24 og 7,5 g (0,05 mol) natriumiodid i 100 ml acetone omrørtes ved stuetemperatur i 30 minutter og inddampedes til tørhed. En opløsning af remanensen i 200 ml ethyl acetat vaskedes med en vandig Na2S203 opløsning, vand 30 og en mættet NaCl opløsning, tørredes med MgS04 og koncentreredes til 100 ml. Til koncentratet sattes 3,1 g (0,012 mol) tri phenylphosphin, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time. Til reaktionsblandingen sattes 100 ml ether, og det udskilte faste stof opsamledes ved filtrering, vaskedes med ether og tørredes til dannelse af 5,8 g af triphenyl-35 phosphoniumderivatet, forbindelse 25. Det etheriske filtrat koncentreredes til 10 ml og til koncentratet sattes 300 ml ether til dannelse af 0,9 g af produktet som en anden høst. Det samlede udbytte var 6,7 g.

DK 162052B

46

Eksempel 26

Benzhydryl - 7β- ΓΡ-Μ-2- (t-butoxycarbonyl ami no)-2-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)acetamidol-3-Γ(Z)-1-propen-l-yll-3-cephem-4-carboxylat (forbindelse 26) 5 __ s HO-< >-CHCONH-|-( 'Ί I 1 I J—CH=CHCH3 (Z)

HjCO NH T

I υ ΟΟίΟΗίΟ,ΗΛ 10 C02C(CH3)j

Til en omrørt blanding af 5,8 g (5,5 mmol) af forbindelse 25 og 10 ml 90% acetaldehyd i 100 ml chloroform sattes dråbevis 11 ml (5,5 mmol) 0,5N natriumhydroxid i løbet af 25 minutter, og blandingen 15 omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer. Reaktionsblandingen vaskedes med vand, derefter med mættet NaCl opløsning, tørredes med MgS04 og inddampedes til tørhed. Den olieagtige remanens kromatograferedes på en sil i cage!kolonne (Kieselgel 60, 130 g) ved eluering med en blanding af toluen og ethylacetat [forholdet ændredes trinvis: 4:1 (1,3 1), 3:1 (1,1 20 1), 2:1 (1,0 1], og eluatet opsamledes i 20 ml fraktioner. Fraktion nr.

26 til 59 kombineredes og inddampedes til tørhed til dannelse af 830 mg af det ønskede 3-propenylderivat, forbindelse 26, som et skumagtigt fast stof.

NMR: 5CDC13 ppm: 1.35 (3H, d, =CH-CH3), 1,4 (9H, s, C-CH3), 25 3,85 (3H, s, 0-CH3), 6,07 (IH, d, J = 11Hz, -CH=C).

Eksempel 27 7β-ΓΡ-(-)-2-Ami no-2-(4-hydroxy-3-methoxypheny1)acetamidol-3-Γ(Z)-1-propen-l-.yll-3-cephem-4-carboxylsyre (forbindelse 27, BMY-28097) 30 HO—^ ^—CHC°NH—i-( \ \-y I _I >-ch==chch3 (Z) H.CO NH, υ co2h 35

En blanding af 830 mg (1,2 mmol) af forbindelse 26, 0,5 ml ani sol og 2 ml tri fluoreddikesyre omrørtes ved stuetemperatur i 5 minutter, og

DK 162052B

47 blandingen fortyndedes med 30 ml ether og 30 ml isopropyl ether. Det resulterende bundfald opsamledes ved filtrering, vaskedes med isopropyl -ether og tørredes til dannelse af 437 mg af det rå trifluoracetat af forbindelse 27. Det rå produkt kromatograferedes på en kolonne pakket 5 med 100 ml af pakningen af en PrepPAK-C18 patron kolonne (Waters), som elueredes med vand og 5% methanol. Eluatet med 5% methanol koncentreredes til 5 ml og lyofili seredes til dannelse af 225 mg af forbindelse 27 (zwitterion, 90% rent). Smeltepunkt 176 til 180eC (dek.).

IR: vmx cm"1: 1760, 1690> 1590> 1530> 1400> 1360» 128°* 10 UV; Aphosphatbuffer (pH 7) m^y 23g (10000)f 280 (11000).

max NMR: iD20 ppm: 1,68 (3H, d, J = 6Hz, C-CH3), 3,25 (IH, d, J = 18Hz, 2-H), 3,57 (IH, d, J = 18Hz, 2-H), 4,01 (3H, s, 0CH3), 5,10 15 (IH, s, CH-C0), 5,19 (IH, d, J = 4,5Hz, 6-H), 5,78 (IH, d, J = 4,5Hz, 7-H), 5,5-5,9 (IH, m, CH=C), 5,98 (IH, d, J = 11Hz, CH=C), 7,07 (2H, s, phenyl-H), 7,17 (IH, br-s, phenyl-H).

HPLC: retentionstid 9,3 minutter (0,02M acetatbuffer (pH 4) indeholdende 15% acetonitril).

20

Eksempel 28

Isolering af forbindelse 27 fra urinen fra rotter behandlet med forbindelse 22 6 Wister rotter af hankøn (400 til 600 g) anbragtes i metaboliske 25 bure i stål efter oral administrering af forbindelse 22 i en dosis på 100 mg/kg, og urin opsamledes i løbet af 24 timer. Rotterne blev fodret med deres sædvanlige kost og fik vand under forsøget. Den følgende tabel viser volumenet af urin opsamlet i intervaller.

0-2 t 2-4 t 4-6 t 6-24 t I alt 30 Urinvolumen (ml) 18 19,5 13 42 92,5

Urinen (ca. 90 ml) justeredes til pH 3 med IN saltsyre og filtreredes for at fjerne bundfaldet. Filtratet kromatograferedes på en kolonne pakket med 300 ml HP-20 ved eluering med 2 1 vand og 2 1 30% 35 methanol under analysering med HPLC. De fraktioner, som indeholdt de bioaktive komponenter, af 30% methanol-eluatet, opsamledes, koncentreredes til 10 ml og lyofili seredes til dannelse af 390 mg brunt fast stof. En opløsning af det faste stof i 20 ml vand kromatograferedes på

DK 162052B

48 en kolonne pakket med 200 ml af pakningen af en PrepPAK/C18 patron (Waters) ved eluering med vand, 5% methanol og derefter med 10% methanol. Den første halvdel af 5% methanol eluatet koncentreredes til 5 ml og lyofiliseredes til dannelse af 44 mg af forbindelse 22 (70% rent) 5 indeholdende urenheder, der stammede fra urin. Den anden halvdel af 5% methanoleluatet koncentreredes til 5 ml og lyofiliseredes til dannelse af 36 mg produkt, som var en blanding af forbindelse 22, forbindelse 27 og urenheder, der stammede fra urin. Eluatet med 10% methanol (ca. 600 ml) koncentreredes til 5 ml og lyofiliseredes til dannelse af 38 mg af 10 forbindelse 27 (70% rent ifølge HPLC), som rekromatograferedes på en kolonne af den samme pakning som ovenfor (40 ml) ved eluering med vand, 5% methanol og 10% methanol. De ønskede fraktioner, som var elueret med 10% methanol, kombineredes og koncentreredes til 5 ml og lyofiliseredes til dannelse af 16 mg af forbindelse 27, som havde en renhed på 90% ved 15 HPLC [0,02M acetatbuffer (pH 4) -acetonitril (85:15)]. Smeltepunkt 180°C (gradvis dek.).

IR: vKBr 1760, 1690, 1590, 1530, 1400, 1360, 1280. max UV: >phosPhatbuffer (pH 7) nm(e): 233 (8200), 280 (8800).

2ø max NMR: $D20 ppm: 1,68 (3H, d, J = 6Hz, -C-CH3), 3,26 (IH, d, J = 18Hz, 2-H), 3,58 (IH, d, J = 18Hz, 2-H), 4,01 (3H, s, 0CH3), 5,12 (IH, s, CH-C0), 5,21 (IH, d, J = 4,5Hz, 6-H), 5,78 (IH, d, J = 4,5Hz, 7-H), 5,5-5,9 (IH, m, CH=C-), 5,98 (IH, d, J = 11Hz, CH=C-), 7,07 (2H, 25 s, phenyl-H), 7,17 (IH, br-s, phenyl-H).

Metabolittens struktur blev bestemt til at være 7/J-[D-(-)-2- amino-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acetamido]-3-[(Z)-l-propen-l-yl]-3- cephem-4-carboxylsyre ved sammenligning (NMR, IR, UV, HPLC) med forbindelse 27 fremstillet efter eksempel 23 til 27.

30

Claims (4)

1. D-2-aminoacyl-3-(Z)-propenylcephalosporin med den almene formel 5 R2—^ %—CHCONH—-{ \ >=/ I M J—CH=CH— CHj (I) Γ \ ϋ COjH 10 hvori R1 er hydrogen, OH, Cj^-alkoxy eller chlor, R2 er hydrogen eller hydroxy, 15 såvel som derivaterne deraf, hvori amino, carboxy og/eller hydroxy er beskyttet med konventionelle beskyttelsesgrupper og de farmaceutisk acceptable salte deraf.

2. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den er 7j8-[D-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)acetamido]-3-[(Z)-l-propen-l-yl]- 20 3-cephem-4-carboxyl syre, 70-[D-2-amino-2-phenylacetamido]-3-[(Z)-l-propen-l-yl]-3-cephem-4- carboxylsyre, 7/?-[D-2-amino-2-(3-chlor-4-hydroxyphenyl)acetamido]-3-[(Z)-l-propen-l-yl]-3-cephem-4-carboxylsyre, 25 7^-[D-2-amino-2-(3,4-dihydroxyphenyl)acetamido]-3-[(Z)-l-propen-l-yl]-3-cephem-4-carboxylsyre, el1 er 7j8-[D-2-ami no-2-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)acetamido]-3-[(Z)-1-propen-l-yl]-3-cephem-4-carboxylsyre, eller et salt deraf.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at man på i og for sig kendt måde A) i et reaktions-inert organisk, flydende vehikel ved 20-150°C omsætter en hal ogenidreaktant med formlen QCH2X eller CH3CH2X, hvor X er Cl, Br eller I, med en triarylphosphin til dannelse af et phosphonium- 35 salt, B) omdanner sidstnævnte i et med vand ublandbart flydende organisk opløsningsmiddel med en vandig base til et phosphoranylmel!emprodukt med formlen QCH=PAr3 eller CH3CH=PAr3, DK 162052B C) omsætter en forbindelse med den almene formel QCH=PAr3 under vandfrie betingelser ved -40°C til +50°C i det med vand ublandbare flydende, organiske opløsningsmiddel med acetaldehyd eller under samme reaktionsbetingelser omsætter en forbindelse med den almene formel

5 CHgCH=PArg med en carbonyl forbindel se med den almene formel QCHO, hvor Q er udvalgt blandt 10 rø>. «j»- S S PJNH—i-( \ HO~\ V-CHCONH-,-{ \ py- y i- py

0 COiP1 ° ΟΟ,Ρ2 15 (01 (O). I i s s AcNH—-S N B—N—i-/ \

20. COzP2 0 ΟΟ,Ρ2 25 hvori R1 har den i krav 1 angivne betydning, 12 3 P , P og P betegner konventionelle beskyttelsesgrupper, n er 1, Ac betegner en inden for cephalosporinkemi en konventionelt anvendt 30 acylgruppe, og B er en al kyl iden- eller aral kyliden-beskyttelsesgruppe, og D) i den således opnåede 3-substituerede 7-aminoceph-3-em-forbinde! se, om ønsket efter fjernelse af én eller flere af beskyttelsesgrup- 12 3 perne P , P , P , Ac og B eller efter reduktion af S-oxidet, indfører 7-35 acylgruppen med den almene formel DK 162052 B T7 NHi

5 R' hvori 1 2 R og R har den ovenfor anførte betydning, og E) eventuelt omdanner den således opnåede forbindelse til et syre-10 additions- eller metalsalt deraf.

4. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, at det mindst indeholder én forbindelse ifølge krav 1 eller 2, eventuelt sammen med farmaceutisk acceptable bærere og diluenter. 15 20 25