DE69736841T2

DE69736841T2 - Imidazolinon-herbizid-resistente zuckerrüben-pflanzen

Info

Publication number: DE69736841T2
Application number: DE69736841T
Authority: DE
Inventors: Donald Williamston PENNER; R. Terry Lansing WRIGHT
Original assignee: Michigan State University MSU
Current assignee: Michigan State University MSU
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-08
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2017-07-09
Also published as: JPH11513895A; JP3842299B2; CZ295392B6; EA199900123A1; CZ14599A3; BG103177A; DK0960190T3; SK286030B6; EA003297B1; EP0960190A4; ES2274546T3; EP0960190A1; EP0960190B1; WO1998002527A1; TR199900115T2; AU3596697A; DE69736841D1; CN1230217A; SK4399A3; ATE342960T1

Description

Hintergrund der Erfindung
(1) Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen von Zuckerrüben-Pflanzen (Beta vulgaris L.), welche resistent sind sowohl gegen Imidazolinon als auch Sulfonylharnstoff-Herbizide, verwendet zum Eindämmen von Unkraut. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Zuckenüben-Pflanzen, abgeleitet von anfälligen Zuckerrüben durch Mutation eines Genes, welches für Acetolactat-Synthase (ALS), auch bekannt als Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS), codiert, unter Verwendung der Herbizide in sequenzieller Art und Weise mit Zellen in einem Kulturmedium.
(2) Beschreibung des Standes der Technik
Der Stand der Technik hat die genetische Veränderung von Acetolactat-Synthase-Genen durch rekombinante Mittel, wie gezeigt durch US-Patente Nr. 5,013,659; 5,141,870 und 5,378,824, beschrieben. Dieser Typus an Modifikation in Zuckerrüben-Pflanzen ist durch Beispiel IV des '824-Patentes gezeigt. Die Ergebnisse waren weniger als zufriedenstellend bei der Erzeugung von Pflanzen, welche normal gezüchtet wurden mit Hinblick auf Herbizid-Resistenz.
Saunders et al. in Crop Science 32:1357-1360 (1992) beschreiben auch die Erzeugung von Zuckerrüben-Pflanzen (CR1-B), welche resistent sind gegen Sulfonylharnstoffe, aus dem empfänglichen selbstfertilen Klon (REL-1) durch Auswählen auf Mutantzellen in einem Kulturmedium, enthaltend das Herbizid. Verschiedene resistente Pflanzen wurden erzeugt und kreuz-gezüchtet. Hart et al. (Weed Science 40378-383 (1992) und 41:317-324 (1993)) charakterisierten des Weiteren eine resistente Linie und bestimmten die Resistenz als vorliegend aufgrund der veränderten ALS-Aktivität und zeigten, dass keine Kreuz-Resistenz mit anderen ALS-inhibierenden Herbiziden bestand und dass sie durch ein einzelnes semidominantes Gen codiert wurde.
Es gibt keine Publikationen, welche Imidazolinonresistenz, erhalten durch Modifizieren von ALS in Zuckerrüben-Pflanzen, beschreiben. Es gibt keine Beschreibung in der Literatur von Pflanzen, welche resistent sowohl gegen Imidazolinon- als auch Sulfonylharnstoff-Herbizide sind. Verschiedene Getreidelinien mit Imidazolinon-Resistenz wurden entwickelt, wie z. B. beschrieben von Newhouse et al. Theoretical and Applied Genetics 83:65-70 (1991).
Ein kommerzieller Weg, zum Getreide-Schutz ist die Verwendung von klinisch "schützenden Substanzen", wie z. B. beschrieben im europäischen Patent Nr. 375,875. Dieses Verfahren fügt eine weitere Chemikalie in den Erdboden ein. Das bevorzugte Verfahren ist, Zuckerrüben-Pflanzen zu entwickeln, welche resistent sind gegen Imidazolinon sowie Sulfonylharnstoff-Herbizide.
Aufgaben
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen zum Verleihen von Resistenz sowohl gegen die Imidazolinon- als auch Sulfonylharnstoff-Herbizide in Zuckerrüben-Pflanzen und zwar durch Mutation eines Acetolactat-Synthasegens, codierend für diese Resistenz. Es ist des Weiteren eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zuckerrüben-Pflanzen zur Verfügung zu stellen, welche gegen diese Herbizide resistent sind. Diese und andere Aufgaben werden in zunehmendem Maße offensichtlich durch Verweis auf die folgende Beschreibung und die Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Ansicht des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zum Erzeugen von Imidazolinon und Sulfonylharnstoff-resistenten Zuckerrüben-Pflanzen 93R30A oder B.
R = Resistenz; IM = Imidazolinon; S = sensitive; SU = Sulfonylharnstoff (Sulfonylurea); Sur = ALS-Allel, dominant für SU-R, TP-R und IM-S; SB = ALS-Allel, dominant für SU-R, TP-R und IM-R; TP = Triazolopyrimidin. 93R30B ist SU-R und IM-R und TP-R. 93R30 (nicht 93R30B) ist homozygot für das Sur-Allel (SU-R, IM-S). Dies war das Ausgangsmaterial, um die Imadazolinon-Resistenz zu erhalten.
2 ist ein Flussdiagramm, welches die detaillierten Schritte bei der Erzeugung einer mutierten Zuckerrüben-Pflanze zeigt.
3 ist ein Graph, welcher einen ALS-Assay für die 93R30B-Resistenz gegen Imazethapyr zeigt.
4 ist ein Diagramm, welches Aminosäure-Substitionen, beobachtet für Wildtyp (wt), dreifach mutierte Zuckerrüben (Sir-13, sur und SB) sowie korrespondierende Herbidzid-Resistenz zeigt. Nur Aminosäurereste, berichtet in der Literatur, welche zur Herbizid-Resistenz in Pflanzen beitragen, sind eingeschlossen. Einbuchstabige Aminosäure-Codes sind wie folgt: A = Alanin, P = Prolin, W = Tryptophan, S-Serin und T = Threonin). Die mit Kästchen umrahmten Buchstaben deuten auf Veränderungen von der Wildtyp-Sequenz hin.
5A bis 5D sind Fotographien, welche die Antwort der ganzen Pflanze der Zuckerrübe auf Imazethapyr, angewandt nach Emergenz, zeigen.
6A bis 6D sind Fotographien, welche die Antwort der ganzen Zuckerrüben-Pflanze auf AC 299,263, angewandt nach Emergenz, zeigen.
7 ist eine Fotographie, welche die ALS-Enzym-Antwort auf Imazethapyr in vitro zeigt.
8 ist eine Fotographie, welche die ALS-Enzym-Antwort auf Fumetsulam in vitro zeigt.
9A bis 9D sind Fotographien, welche die Antwort der ganzen Zuckerrübenpflanze auf Chlorosulfuron, angewandt nach Emergenz, zeigen.
10 ist eine Fotographie, welche die ALS-Enzym-Antwort auf Chlorsulfuron in vitro zeigt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Ein Zuckerrüben-Pflanzen-Material bestehend aus mutierten Zellen mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen, codierend die Synthase, in welchem Nukleotide modifiziert sind von Cytosin nach Thymin an der Position 562 und Guanin nach Adenin an der Position 337, wobei die mutierten Zellen eine Resistenz sowohl gegen Imidazolinon als auch Sulfonylharnstoff-Herbizide aufweisen, und wobei die Resistenz übertragen wird durch konventionelles Kreuz-Züchten an Pflanzen, erzeugt aus den Zellen und die Zellen regenerierbar sind in eine Pflanze, wird bereitgestellt.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von einer Herbizidresistenz in einer Zuckerrüben-Pflanze, welches umfasst:

(a) Exponieren von ersten Zellen an Zuckerrüben mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen, codierend die Synthase, wobei Nukleotide modifiziert sind von Cytosin nach Thymin an Position 562, gegen ein Imidazolinon-Herbizid in einem Kulturmedium, wobei die ersten Zellen ein homozygotes Merkmal für Sulfonylharnstoff-Herbizid-Resistenz aufweisen; und
(b) Auswählen nach zweiten Zellen mit einer Resistenz gegen beide Herbizide, wobei die Resistenz übertragen werden kann durch Kreuz-Züchtung einer Pflanze, enthaltend die zweiten Zellen.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verleihen einer Herbizid-Resistenz in einer Zuckerrübe, welches umfasst:

(a) Exponieren von ersten Zellen in Zuckerrüben-Pflanzen gegen ein Imidazolinon-Herbizid in einem Kulturmedium, wobei die ersten Zellen ein homozygotes Merkmal für Sulfonylharnstoff-Herbizid-Resistenz in einem Kulturmedium aufweisen;
(b) Auswählen nach zweiten Zellen mit einer Resistenz für beide Herbizide;
(c) Kultivieren einer ersten Pflanze aus den zweiten Zellen, wobei die Pflanze die Resistenz gegen die Herbizide mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen, codie rend die Synthase aufweist, wobei die Nukleotide modifiziert sind von Cytosin nach Thymin nach Position 562 und Guanin nach Adenin an der Position 337; und
(d) Kreuz-Züchten der ersten Pflanze mit einer zweiten Pflanze, um eine gekreuzte Pflanze zu erzeugen, welche Resistenz gegen die Herbizide aufweist; und des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Verleihen von Herbizid-Resistenz gegen andere Pflanzen, welches umfasst: (a) Exponieren erster Zellen an Zuckerrüben-Pflanzen gegen ein Imidazolinon-Herbizid in einem Kulturmedium, wobei die ersten Zellen ein homozygotes Merkmal für Sulfonylharnstoff-Herbizid-Resistenz in einem Kulturmedium aufweisen; (b) Auswählen nach zweiten Zellen mit einer Resistenz für beide Herbizide; (c) Kultivieren einer ersten Pflanze aus den zweiten Zellen, wobei die Pflanze die Resistenz gegen Herbizide aufweist, mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen, codierend die Synthase, wobei die Nukleotide modifiziert sind von Cytosin nach Thymin an Position 562 und Guanin nach Adenin an Position 337; und (d) Kreuz-Züchten der ersten Pflanze mit einer zweiten Pflanze, um eine gekreuzte Pflanze zu erzeugen, welche die Resistenz gegen Herbizide aufweist.

Die Zuckerrübenpflanze REL-1 (Regenerating, East Lansing-1) ist verfügbar von Dr. Joseph Saunders, Research Geneticist, U.S. Department of Agriculture, East Lansing, Mich. und wurde in 1987 öffentlich zugänglich. Sie ist kostenfrei verfügbar. REL-1 ist sensitiv (S) auf Imidazolinon (IM-S), Sulfonylharnstoff (SU-S) sowie Triazolopyrimidinsulfonanilid (TP-S)-Herbizide, wie in 1 gezeigt.
Unter Verwendung von Kallus- und Suspensions-Kulturen wurde eine Linie entwickelt, welche heterozygot für Imidazolinon und Sulfonylharnstoff-Resistenz (IM-R und SU-R) war. Diese Zelllinie (Samen) wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection als ATCC 97535 am 6. Mai 1996 gemäß dem Budapester Vertrag und hier als 93R30B bezeichnet. Die Zelllinie ist verfügbar Verlangen durch Angabe von Name und Nummer.
Durch Züchten mit Elite-Zuckerrüben-Pflanzenlinien, insbesondere Beta vulgaris L., können spezielle kommerziell bedeutsame resistente Zuckenüben-Pflanzen erzeugt werden.
Zuckerrüben-Pflanzen-Resistenz gegen Imidazolinon-Herbizide, insbesondere Imazethapyr und Sulfonylharnstoff-Herbizide (Chlorsulfuron) lösen das Problem herrührend unter Verwendung dieser Herbizide in Regionen, wo Zuckerrübenpflanzen wachsen. Derzeit besteht eine Wartezeit von 40 Monaten zwischen der Anwendung dieser Herbizide und der weiteren Verwendung des Feldes zum Anbau von Zuckenüben-Pflanzen. Zum zweiten ermöglicht ein hohes Niveau von Imidazolinon und Sulfonylharnstoff-Resistenz die Verwendung von Imidazolinon-Herbiziden zur Schädlings-Bekämpfung in Zuckerrüben-Pflanzen.
Die folgenden Beispiele zeigen die Isolierung und das Züchten einer neuen Zuckerrübenpflanze 93R30B, wie in 1 illustriert.
Beispiel 1
1. Auswahl von Imidazolinon- und Sulfonylharnstoff resistenter Zuckerrüben-Variante 93R30B.
Beschreibung der Materialien

Rel-1

(Regenerating East Lansing-1) ist eine hochregenerierbare männlich-fertile Zuckerrübenlinie, verwendet zur ursprünglichen Zellauswahl für Herbizidresistente Mutanten gegen Sulfonylharnstoffe und wird verwendet als eine sensitive Kontrolle für die meisten Experimente

CR1-B

Dieses Zuckerrüben-Isolat wurde entwickelt durch Plattieren von Rel-1-Zellen auf Chlorsulforon enthaltenden Medien. Diese Variante ist Sulfonylharnstoffresistent mit mäßiger Resistenz gegen das Triazolopyrimidin-Herbizid Flumetsulam, jedoch nicht Imidazolinon-resistent. Diese Variante wurde beschrieben von Saunders et al. (Crop Sci. 32:1357-1360) und Hart et al. (Weed Sci. 40:378-383 und 41:317-324). Das SU-Resistenz-Gen wurde als Sur markiert.

93R30B

Dieses Isolat wurde entwickelt durch Plattieren von Zellen von einer hochregenerierbaren SUR-homozygoten Zuckerrüben-Pflanze (Abkömmling von CR1-B) auf Medien, enthaltend Imazethapyr.

EL-49

East Lansing 49, der Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt durch die USDA in 1993. Zuckerrübenlinie, homozygot für das SUR-Gen, verwendet als eine Sulfonylharnstoff-resistente, Imazethapyr-sensitive Kontrolle.

a. Pflanzen wurden ausgewählt als Ausgangs-Materialien für die somaklonale Selektion, basierend auf ihrer Fähigkeit, Kallus unter Hoch-Cytokin-Bedingungen zu generieren (in B1-Medien) und Sprosse aus Kallus zu regenerieren.

Protokoll für B1-Medien:

30 g L^–1 Saccharose
100 mg L^–1 Myo-inositol
1,65 g L^–1 NH₄NO₃
1,90 g L^–1 KNO₃
0,44 g L^–1 CaCl₂·2 H₂O
0,37 g L^–1 MgSO₄·7 H₂O
0,17 g L^–1 KH₂PO₄
6,2 mg L^–1 H₃BO₃
16,8 mg L^–1 MnSO₄·H₂O
10,6 mg L^–1 ZnSO₄·7 H₂O
0,88 mg L^–1 KI
0,25 mg L^–1 Na₂MoO₄·2 H₂O
0,025 mg L^–1 CuSO₄·5 H₂O
0,025 mg L^–1 CoCl₂·6 H₂O
37,3 mg L^–1 Na₂EDTA
27,8 mg L^–1 FeSO₄·7 H₂O
1 mg L^–1 Thiamin
0,5 mg L^–1 Pyridoxin
0,5 mg L^–1 Nicotinsäure
1 mgl ^–1 Benzylaminopurin
pH 5,95

Feste B1-Medien wurden autoklaviert mit 9 g L^–1 an Pflanzenkultur-Agar und modifiziert mit Filter-sterilizierten Herbizid-Stammlösungen, wie für das Selektions-Schema benötigt. Agar-Medium wurde in 15 × 100 mm wegwerfbare Plastik-Petri-Schalen gegossen.
B1-flüssiges Medium wurde in 40 ml Aliquots in 125 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und zur Anwendung in flüssigen Suspensions-Kulturen autoklaviert.
Zur Auswahl der Imidazolinon-resistenten Variante 93R30B war das Ausgangsmaterial 93R30 (eine Sur-homozygoter Nachkomme von CR1-B).
Insbesondere gilt Folgendes:

1. Zellen von Rel-1 (SU-S, IM-S, TP-S) wurden in Kultur platziert, wobei die Zellen ausgewählt wurden auf ihre Fähigkeit, auf Chlorsulfuron zu wachsen, und eine Pflanze wurde regeneriert, nämlich CR1-B (beschrieben von Saunders et al, Crop Sci, 32:1357-1360 (1992)).
2. CR1-B wurde gekreuzt mit 293 (ein typischere Rübe), die F1 selbst und die homozygoten Pflanzen für SU-R, IM-S, TP-R wurden identifiziert. Eine Pflanze, bekannt als EL-49, welche diese Erfordernisse erfüllte, wurde 1993 von Saunders der Öffentlichkeit zugänglich gemacht (das Gen wurde als Sur bezeichnet und diese war homozygot dafür).
3. Zu einem späteren Zeitpunkt wurden Nachkommen von CR1-B, homozygot für Sur, ausgewählt auf ihre Fähigkeit, Pflanzen aus der Kultur zu regenerieren. Sie dienten dann als Ausgangsmaterial (beispielsweise 93R30) zur Imazethapyr-Selektion in Kultur.
4. Aus der obigen Selektion wurden Isolate, bekannt als 93R30A und 93R30B abgeleitet und Pflanzen wurden regeneriert. Diese wiesen die Charakteristika von CR1-B plus IM-R auf. Das Gen, verantwortlich für IM-R scheint eine veränderte Form von Sur zu sein und ihm wurde die Identität von SB gegeben.

Blatt-Scheiben-Explantate wurden hergestellt aus schnell wachsenden Blättern der Ausgangspflanze (93R30). Die Blätter wurden auf der Oberfläche sterilisiert (Schritt 1) durch zwei nachfolgende 20-minütige Waschungen mit 15 %igem kommerziellen Bleichmittel plus 0,025 % Triton X-100 (T-9280, Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.). Die Blätter wurden zweimal mit sterilem, deionisiertem Wasser gespült. Blattscheiben wurden geschnitten unter Verwendung eines Flammen-sterilisierten #3 Korkbohrers.
Blatt-Scheiben wurden aseptisch auf feste B1-Medien platziert (Schritt 2). Die Scheiben wurden im Dunkeln inkubiert bei 30°C für 4–8 Wochen, bis sie brüchig waren, weißes Kallus-Gewebe hatte sich von dem Blatt-Scheiben proliferiert. Kallus-Gewebe wurde mechanisch mit Zangen abgetrennt und nachfolgend in 125 ml Erlenmeyerkolben (Schritt 3) transferiert, enthaltend 40 ml an flüssigem B1-Medium. Die Kolben wurden auf sich drehende Schüttler bei 50 Hz unter niedrig-intensivem Fluoreszenz-Bestrahlen (30 μE/m² s) platziert. Flüssige Kulturen wurden mit frischem B1-Medium nach einer Woche subkultiviert.
Zwei Wochen nach Beginn der flüssigen Kultur wurden Zellklumpen abgetrennt unter Verwendung eines Zelldissoziations-Siebs (Sigma CD-1) mit einem 60 Mesh Screen. Ungefähr zwei Drittel an Volumen des flüssigen Mediums wurde entfernt folgend auf die Zellsedimentation. Im Schritt 4 wurden die Zellen resuspendiert im verbleibenden Medium und 1 ml Aliquots wurden gleichmäßig über das feste B1-Medium, angereichert mit 50 nM Imazethapyr (PURSUIT, American Cyanamid, Wayne, NJ.)-Herbizid, versetzt. Die Platten wurden eingewickelt und in mattem fluoreszenten Licht (5–10 μE/m² s) für 8–12 Wochen inkubiert.

c. Bei 50 nM Imazethapyr-Konzentration starben alle sensitiven Zellen. Zellklumpen, welche überlebten und bei dieser Konzentration wuchsen, wurden als mögliche resistente Varianten identifiziert. Im Schritt 5 wurden diese Zellklumpen (1–3 mm im Durchmesser) auf frische B1-feste Medien transferiert, ohne Herbizid, und man ließ sie unter schwachem Licht wachsen (10–20 μE/m² s). Jede potenziell resistente Variante wurde individuell identifiziert und separat kultiviert.
d. Im Schritt 6 wurde weißes, brüchiges Kallus alle 4–6 Wochen unterteilt auf frische B1-feste Medien, bis ein individueller Spross (individuelle Sprossen) aus dem Kallus wuchsen. Diese Sprossen wurden in Sprossen-Kultivierungs-Medien (M20) wie folgt transferiert:

Protokoll für M20-Medien:

30 g L^–1 Saccharose
100 mg L^–1 Myo-inositol
1,65 g L^–1 NH₄NO₃
1,90 g L^–1 KNO₃
0,44 g L^–1 CaCl₂·2 H₂O
0,37 g L^–1 MgSO₄·7 H₂O
0,17 g L^–1 KH₂PO₄
6,2 mg L^–1 H₃BO₃
16,8 mg L^–1 MnSO₄·H₂O
10,6 mg L^–1 ZnSO₄·7 H₂O
0,88 mg L^–1 KI
0,25 mg L^–1 Na₂MoO₄·2 H₂O
0,025 mg L^–1 CuSO₄·5 H₂O
0,025 mg L^–1 CoCl₂·6 H₂O
37,3 mg L^–1 Na₂EDTA
27,8 mg L^–1 FeSO₄·7 H₂O
1 mg L^–1 Thiamin
0,5 mg L^–1 Pyridoxin
0,5 mg L^–1 Nicotinsäure
0,25 mg L^–1 Benzylaminopurin
pH 5,95

M20-festes Medium wurde autoklaviert mit 9 g L^–1-Pflanzenkultur-Agar und modifiziert mit Filter-sterilisierten Herbizid-Stammlösungen, wie für das Selektions-Schema benötigt. Agar wurde in 20 × 100 mm wegwerfbare Plastikpetri-Schalen gegossen.
Spross-Kulturen wurden kultiviert unter 10–20 μE/m² s-Fluoreszentlichtbestrahlung und propagiert durch Zerteilen von Spross-Kulturen mit einer Skalpell-Klinge. Kandidat-Spross-Kulturen wurden propagiert und je nach Grad der Resistenz, wie im Folgenden beschrieben, bewertet.
2. Grad der Imidazolinon-, Sulfonylharnstoff- und Triazolopyrimidin-Sulfonanilid-Restistenz in Spross-Kultur.
Im Schritt 7 wurden Spross-Kulturen auf Herbizidresistenz bewertet durch Platzieren von drei kleinen, in ihrer Größe konsistenten Spross-Schnitten auf jeder Platte von M20-Medien, angereichert mit logarithmisch steigenden Konzentrationen von Imidazolinon-Herbizid, Sulfonylharnstoff oder Triazolopyrimidinsulfonanilid, reichend von 1 nM bis 0,1 mM. 93R30-Kultur-Antworten wurden verglichen mit denjenigen von Spross-Kulturen einer sensitiven Kontrolle (Rel-1) und einer Chlorsulfuron-resistenten Imidazolinonsensitiven Kontrolle (EL-49). Spross-Kulturen wurden bei 20 μE/m² s Lichtintensität bei 25°C für 3 Wochen kultiviert. Spross-Kultur-Antworten wurden bestimmt durch klassifizieren von Spross-Verletzung und frischem Gewicht 3 Wochen nach Transfer in selektives Medium. Die Größe der Herbizid-Resistenz wurde bestimmt durch das Verhältnis von resistenten zu sensitiven I₅₀- (die Herbizid-Konzentration, welche 50 Prozent an Verletzung erzeugt) Werten.
Die Kreuz-Resistenz-Charakteristika einer jeden Variante wurden bestimmt in einer Art und Weise, wie oben erwähnt, durch Substituieren des Herbizids, verwendet in den Medien. In der Sprosskultur zeigte 93R30B ein 3600faches Niveau an Resistenz gegen Imazethapyr, eine 10000fache Resistenz gegen Chlorsulfuron und zeigte eine 60fache Kreuz-Resistenz gegen das Triazolopyrimidinsulfonanilid-Herbizid, Flumetsulam, wie in Tabelle 1 gezeigt. Zum Vergleich zeigte EL-49 nur ein 3faches Niveau der Resistenz gegen Imazethapyr.
3. Pflanzenregeneration und Kultivieren.
Im Schritt 8 wurden Spross-Kulturen von 93R30B in ganze Pflanzen in einer ähnlichen Art und Weise regeneriert. Zwei Wochen nach zuvor erfolgter Spross-Subkultur wurden 93R30B-Sprosssen in 125 ml Erlenmeyerkolben transferiert, enthaltend 40 ml N3-wurzelfassendes Medium.
Protokoll für N3-Medium:

30 g L^–1 Saccharose
100 mg L^–1 Myo-inositol
1,65 g L^–1 NH₄NO₃
1,90 g L^–1 KNO₃
0,44 g L^–1 CaCl₂·2 H₂O
0,37 g L^–1 MgSO₄·7 H₂O
0,17 g L^–1 KH₂PO₄
6,2 mg L^–1 H₃BO₃
16,8 mg L^–1 MnSO₄·H₂O
10,6 mg L^–1 ZnSO₄·7 H₂O
0,88 mg L^–1 KI
0,25 mg L^–1 Na₂MoO₄·2 H₂O
0,025 mg L^–1 CuSO₄·5 H₂O
0,025 mg L^–1 CoCl₂·6 H₂O
37,3 mg L^–1 Na₂EDTA
27,8 mg L^–1 FeSO₄·7 H₂O
1 mg L^–1 Thiamin
0,5 mg L^–1 Pyridoxin
0,5 mg L^–1 Nicotinsäure
3 mg L^–1 Naphthalenessigsäure
pH 5,95

N3-Medium wurde zugegeben in 40 ml Aliquots zu 125 ml Erlenmeyerkolben, 9 g L^–1 Agar (0,45 g) wurde hinzugegeben zu jedem Kolben und autoklaviert zur Anwendung in Verwurzelungen von Spross-Kulturen. Kulturen wurden dann transferiert, so dass sie 24 Stunden pro Tag Licht unter einer mittleren Lichtintensität bei 25°C ausgesetzt wurden (40–60 μE/m² s). Wurzeln formten sich im Allgemeinen 6–8 Wochen später.
Im Schritt 9 wurden die verwurzelten Sprossen (RO-Generation) anschließend in eine Baccto (Michigan Peat Co., Houston, TX)-Topf-Mischung im Gewächshaus transferiert. Im Schritt 10 wurden R0-Pflanzen von 93R30B-Regeneraten gekreuzt mit einer flachwurzligen Zuckerrübe, genannt 293, oder mit REL-1. F₁-Samen von diesen Kreuzungen wurde selbst befruchtet, um F₂-Samen zu ergeben. Es wurde angenommen, dass die Imidazolinon-Resistenz ein dominantes oder halb-dominantes monogenes Merkmal war. Die Pflanzen-F₂-Generation, resultierend aus der Selbstbefruchtung von Imidazolinon- und Sulfonylharnstoff-resistenten F₁-Pflanzen sollten sich in einem 1 (homozygote Resistenz) : 2 (heterozygote Resistenz) : 1 (homozygote Sensitivität)-Verhältnis sowohl für Imidazolinon- als auch Sulfonylharnstoff-Resistenzen absondern.
Der Nachweis legt nahe, dass die Imidazolinon-Resistenz ein dominantes Merkmal in 93R30B ist. Dieser Schluss wird erhalten aus dem Nachweis bei der Untersuchung von F₁-Nachkommen von Kreuzungen zwischen 93R30B und Herbizid-sensitiven männlichfertilen Zuckerrüben-Linien 293 oder Rel-1, welche sich in einer 1:1-Art und Weise für IM-R oder IM-S absondern. Dergleichen fallen in allen F₂- oder rückgekreuzten (BC₁, Backcross)-Pflanzen, welche bis zum heutigen Tage getestet wurden, IM-R und SU-R zusammen. Dies legt nahe, dass diese beiden Resistenzen verknüpft sind und von verschiedenen Veränderungen auf dem gleichen ALS-Allel herrühren. Die Resistenz oder Sensitivität von F₁-Pflanzen für Imazethapyr und Chlorsulfuron wurde bestimmt unter Verwendung eines nicht destruktiven Blatt-Scheiben-Expansions-Assays.
Assay-Protokoll:
Dieses Protokoll ist ein nicht destruktiver Test, konzipiert, um nach Rüben zu screenen, welche sich aufgrund ihrer Herbizidresistenz früh absondern, um ihren Status als resistent oder empfänglich zu bestimmen, ohne die Rüben nach Emmergenz im Gewächshaus zu besprühen.

1. Das neue expandierte Blatt wurde aus der Pflanze ausgeschnitten (zumindest das 4. wirkliche Blatt).
2. Das Blatt wurde auf der Oberfläche sterilisiert mit zwei 20-minütigen Waschungen von 15 %igem kommerziellen Bleichmittel +0,025 % Triton X-100, anschließend zweimal gespült mit sterilem destilliertem Wasser.
3. Blattscheiben-Explantate wurden mit Flammen-sterilisiertem #3-Korkbohrer geschnitten.
4. Blattscheiben wurden transferiert auf B1-Medien, enthaltend kein Herbizid, 100 nM Imazethapyr oder 100 nM Chlorsulfuron. Die Platten wurden in vier Abschnitte unterteilt, so dass vier Proben auf einer einzelnen Platte getestet werden können. Vier bis fünf Blattscheiben wurden zu jeder Platte für jede Probe hinzugegeben.
5. Die Platten wurden eingewickelt und bei 25°C für 4–7 Tage unter schwachem Licht inkubiert (ungefähr 10 μE/m² s).
6. Resistente Proben wurden identifiziert durch ihre Fähigkeit, zu überleben und sich auf selektiven Medien auszubreiten. Sensitive Proben werden sich nicht ausbreiten und werden gelb oder braun werden. Die Effekte wurden verglichen mit der Expansion von Blatt-Scheiben, platziert auf Nicht-Herbizid-Medien, um eine akkurate Bestimmung des erwarteten Niveaus an Blatt-Expansion sicherzustellen.

4. ALS-Ziel-Enzym-Anwort auf Imazethapyr
Standardprozeduren wurden eingesetzt, um teilweise ALS aus schnell expandierenden Blättern von Gewächshaus-gezüchteten Zuckerrübenpflanzen aufzureinigen (Hart, et al. Weed Science 40:378-383 (1992)). Extrakte aus heterozygoten 93R30B-F₁-Pflanzen und Rel-1 S₁-Samen wurden auf ALS-Aktivität in der Gegenwart von logarithmisch ansteigenden Konzentrationen an Imazethapyr geassayt. Die ALS-Aktivität wurde bestimmt aus Blatt-Extrakten von REL-1- und 93R30B-Zuckerrüben-Linien. Die Pflanzen wurden kultiviert im Gewächshaus, wie oben beschrieben, bis in das Stadium, wo sie vier bis sechs Blätter aufweisen. Die ALS-Aktivität aus den frischen Extrakten wurde bestimmt in der Gegenwart von Imazethapyr und Chlorsulfuron bei logarithmisch ansteigenden Konzentrationen. Die Verfahren und Prozeduren, welche eingesetzt wurden, wurden modifiziert aus denjenigen, dargestellt von Ray (Plant Physiol. 75:827-831 (1984)) und Shaner, et al. (Plant Physiol. 76:545-546 (1984)). 10 g an Zuckerrübenblättern wurden homogeni siert in einem kalten 40 ml Homogenisierungspuffer(0,1M K₂HPO₄, pH 7,5, 1 mM Natriumpyruvat, 0,5 mM MgCl₂, 0,5 mM Thiaminpyrophosphat, 10 μM Flavinadenindinucleotid, 10 Vol.-% Glycerol) plus 2,5 g Polyvinylpolypyrolidon. Das Homogenat wurde durch acht Schichten an Seihtuch filtriert und bei 27000 g für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und auf 50 % Sättigung mit (NH₄)₂SO₄ gebracht. Diese Lösung wurde bei 0°C für 1 Stunde gehalten, anschließend zentrifugiert bei 18000 g für 15 Minuten, der Niederschlag wurde anschließend wieder aufgenommen in 1 ml-Resuspensionspuffer (0,1 M K₂HPO₄, pH 7,5, 20 mM Natriumpyruvat, 0,5 mM MgCl₂) und entsalzt auf einer Sephadex G-25 PD-10⁵-Säule. die Enzymextrakte wurden unmittelbar dem Assay unterzogen.
Die ALS-Aktivität wird gemessen durch Zugabe von 0,2 ml an Enzym-Präparation (verdünnt 3:1 mit Resuspensions-Puffer) zu 1,3 ml an Reaktionspuffer (25 mM K₂HPO₄, pH 7,0, 0,625 mM MgCl₂, 25 mM Natriumpyruvat, 0,625 mM Thiaminpyrophosphat, 1,25 μM Flavinadenindinucleotid) und bei 35°C für 1 Stunde inkubiert. Reaktionsmischungen enthielten eine letztendliche Konzentration von 0, 4, 40, 400, 4000, 40000, 400000 oder 4000000 nM Imazethapyr oder 0, 0,9, 9, 90, 900, 9000, 90000 nM Chlorsulfuron. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 50 μl an 6N H₂SO₄ und Inkubieren bei 60°C für 15 Minuten. Diese Prozedur war wie beschrieben von Westerfield (J. Biol. Chem. 16:495-502 (1945)) und decarboxylierte auch das ALS-Enzym-Produkt Acetolactat, um Acetoin auszubilden. Ein farbiger Acetoin-Komplex wurde ausgebildet durch Zugabe von 1 ml 2,5 Gew.-% α-Naphthol und 0,25 Gew.-% Creatin in 2,5N NaOH und Inkubieren bei 60°C für 15 Minuten.
Käuflich erworbenes Acetoin wurde verwendet als Standard für die colorimetrische Reaktion. Acetoin-Konzentrationen wurde bestimmt durch Messen der Absorption der Reaktionslösung bei 530 nm. Die Experimente mit jedem Herbizid wurden wiederholt in jeweils dreifacher Ausfertigung. Protein-Konzentrationen der Extrakte wurden bestimmt durch das Verfahren von Bradford (Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)) unter Verwendung von Rinderserumalbumin für die Standardkurve.
Die Experimente wurden zweimal durchgeführt und die Behandlungen wurden dreifach wiederholt. 3 zeigt die Antwort von ALS-Extrakten von 93R30B und dem sensitiven Rel-1. 93R30B zeigt ein 1750-faches Niveau an Resistenz gegenüber Imazethapyr auf der Enzymebene (wie durch das Verhältnis von I₅₀-Werten von resistenten und sensitiven Linien bestimmt).
5. ALS-Gen-Kopie-Zahl
Southern-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um die Anzahl von ALS-Gen-Kopien, vorliegend in sensitiver Zuckerrübe, zu bestimmen. Die genomische DNA wurde aus den sensitiven F₃-Pflanzen, abgeleitet aus der ursprünglichen Sir-13-Mutante isoliert und analysiert unter Verwendung von herkömmlich eingesetzten Techniken (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley und Sons, New York (1991)). Dergleichen wurde genomische DNA aus einer kommerziellen Zuckerrüben-Variante analysiert. In beiden Zuckerrüben-Linien wurde eine einzelne Kopie des ALS-Gens bestimmt. Diese Daten würden zeigen, dass alle ALS-Enzym-Aktivität einer homozygoten Zuckerrübenpflanze vom Mutant-Typ aus der resistenten Enzym-Form bestehen würde. Dies stützt auch die Vermutung, dass die SB-Veränderung, beobachtet in dem 93R30B-Isolat eine veränderte Form des Sur-ALS-Allels ist. Dies wurde, wie unten beschrieben, bestätigt.
6. ALS-Gen-Mutation
Um die molekulare Basis für die ALS-Enzym-Resistenz zu bestimmen, wurden Standard-Techniken verwendet, um zwei Regionen des ALS-Gens zu sequenzieren, wo alle zuvor berichteten Herbizid-Resistenz-Mutationen aufgetreten sind (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York (1991)). Das Zuckerrüben-ALS-Gen wurde zuvor bereits sequenziert (US-Patent Nr. 5,378,824) und Polymerasekettenreaktion (PCR)-Primer wurden konzipiert, um die beiden Regionen des Gens zu amplifizieren, welche verantwortlich sind für die zuvor berichteten Fälle an Pflanzen-Herbizid-Resistenz. Vergleiche der Sequenzdaten aus SU-R IM-S TP-R (Sur), SU-R IM-R TP-R (SB) und sensitiven (Rel-1)-Zuckerrüben zeigten, dass die Herbizid-Resistenz-Merkmale von 93R30B von den unabhängigen Mutationen in dem ALS-Gen herrührten.
Die Mutation, welche SU-R IM-S TP-R (Sur) verursacht, ist das Ergebnis einer einzelnen Nukleotidveränderung von Cytosin zu Thymin an Position 562 in der Nukleotidsequenz, welche in einer Serin- anstelle von Prolin-Substitution an Position 188 in der ALS-Zuckerrüben-Aminosäure-Sequenz resultiert. Diese Stelle wurde zuvor impliziert in der Sulfonylharnstoff-Resistenz in Arabidopsis thaliana (Haughn et al., Molecular and Gene ral Genetics 211:266-271 (1988)), Tabak (Lee, et al., EMBO J. 7:1241-1248 (1988)) und in Hefe (US-Patent Nr. 5,378,824). Keine anderen Basen-Veränderungen wurden für die Wildtyp-Nukleotid-Sequenz in den beiden Regionen des untersuchten ALS-Gens beobachtet.
Die Mutation, welche das SU-R IM-R TP-R (SB) verursacht, ist das Ergebnis von zwei unabhängigen Mutationen in der ALS-Nukleotid-Sequenz, welche in den beiden unterschiedlichen Aminosäure-Veränderungen resultiert. Die erste Veränderung ist identisch zu der Sur-Mutation, wie oben beschrieben. Diese Beobachtung war zu erwarten, da eine Zuckerrüben-Pflanze (93R30) als Ausgangsmaterial für die IM-R-Selektion diente. Zusätzlich zu dieser Punktmutation wurde eine weitere Einzelnukleotid-Veränderung von Guanin nach Adenin an Position 337 beobachtet. Diese zweite Mutation resultiert in einer Substitution von Threonin anstelle von Alanin an Position 113 in der ALS-Zuckerrüben-Aminosäure-Sequenz. Diese Stelle wurde zuvor bereits impliziert in Imidazolinon-Resistenz in Kletten (Bernasconi et al., J. Biol. Chem. 270:17381-17385 (1995)) sowie der Sulfonylharnstoff-Resistenz in Hefe (US-Patent Nr. 5,378,824). Keine weiteren Basen-Veränderungen wurden beobachtet für die Wildtyp-Nukleotid-Sequenz in den beiden Regionen des untersuchten ALS-Gens.
Die folgende Information zeigt Herbizidresistenz-Synergismen von möglichen Ala₁₁₃ → Thr- und Pro₁₈₈ → Ser-Mutationen.
Die SB-Zuckerrüben-ALS-Gen-Doppel-Mutation liefert eine Herbizid-Resistenz für die Kombination von chemischen Familien, ermöglicht durch jede der einzeln mutierten Zuckerrüben in individueller Art und Weise (i.e., Sur und Sir-13). 4 zeigt die grundlegenden Familien-Kreuzungs-Resistenz-Charakteristika der beiden einzelnen Mutanten (Sur und Sir-13) und der Doppelmutanten (SB). Die Aminosäuren, dargestellt in 4, repräsentieren die 5 streng konservierten Reste, welche in der Literatur berichtet werden, als involviert in die ALS-inhibierende Herbizid-Resistenz in Pflanzen. Die Wechselwirkung der unabhängigen Mutationen innerhalb des Doppelmutanten-Enzyms (und korrespondierender Pflanzen) ist einzigartig. Die Kombination von IM-spezifischer Resistenz, welche sich mit der Sir-13-Aminosäure-Substitution (Ala₁₁₃ → Thr) zeigt und der SU- und TP-Resistenz, beobachtet für die Sur-Substitution (Pro₁₈₈ → Ser) resultiert in einer Zuckerrübe 93R30B (a.k.a. SB), welche resistent gegen alle drei Klassen von Herbizid-Chemie ist.
Resistenz ist jedoch nicht additiv. Stattdessen sind die Mutationen synergistisch mit Blick auf die Resistenz liegen die Imidazolinon-Herbizide Imazethapyr und AC 299,263. Dieses Phänomen kann visuell erfasst werden in den 5 und 6 und quantitativ in Tabelle 2.
Die einzeln mutierten Zuckerrüben, Sur und Sir-13, zeigen 3- bzw. 100-fache Resistenz gegen Imazethapyr; wohingegen die doppelte Mutante, SB, 300-fach resistent gegen das Herbizid ist, wenn es auf die ganze Pflanze post-emergent appliziert wird. Dieser Synergismus wird gestützt durch die beobachtete Antwort des ALS-Enzyms einer jeden der Mutanten für Imazethapyr (7). Wiederum ist eine synergistische Resistenz gegen das Herbizid in der doppelten Mutante, SB (>1000 ×), gegenüber den einfachen Mutanten, Sur (1 ×) und Sir-13 (40 ×), allein zu sehen.
Ein ähnlicher Synergismus ist offensichtlich für die TP-Klasse von Herbiziden. Spross-Resistenz für die einzelnen Mutanten Sur und Sir-13 sind 40 × und 1 × und 60-fach für die doppelte Mutante, SB. Die ALS-Enzym-Daten stützen diese Synergismus-Beobachtung mit 50 × und 3 × Resistenz gegen Flumetsulam für die einzelnen Mutanten Sur bzw. Sir-13, und 200 × Resistenz für die doppelte Mutante SB (8). Die zweite Mutation, beobachtet in SB reduziert tatsächlich die Resistenz gegen Chlorsulfuron (SU-Klasse-Herbizid), beobachtet auf dem Niveau der ganzen Pflanze (9). Für Chlorsulfuron wird die Resistenz der ganzen Pflanze der SB-Doppelmutante (20 ×) um mehr als 50-fach durch die Zugabe der Sir-13-äquivalente Mutation (Ala₁₁₃ → Thr) (1× Resistenz) zu dem SU-Resistenzgen, Sur(Pro₁₈₈ → Ser) (>1000 × Resistenz) (Tabelle 2) verstärkt. Die Ursache des Antagonismus zwischen der Sur-Einfachmutante und der SB-Doppelmutante sind bislang unbekannt. Auf der Ebene des ALS-Enzyms wird eine synergistische Resistenz auch mit Chlorsulfuron (10) beobachtet.
Es wird eingesehen werden, dass die Auswahl der Imidazolinon-Resistenz zuerst realisiert werden kann und anschließend die Sulfonylharnstoffresistenz realisiert werden kann.
Es ist beabsichtigt, dass die oben dargelegte Beschreibung nur illustrativ für die vorliegende Erfindung ist, und dass die vorliegende Erfindung nur durch die im Folgenden angefügten Ansprüche limitiert wird. Die Aminosäuresequenzen von 4 werden in SEQ ID NR. 1, 2, 3 und 4 dargestellt.
ANHANG 1 SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Zuckerrüben-Pflanzenmaterial, bestehend aus mutierten Zellen mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen, kodierend die Synthase, wobei Nukleotide modifiziert sind von Cytosin nach Thymin an Position 562 und Guanin nach Adenin an Position 337, wobei die mutierten Zellen eine Resistenz sowohl gegen Imidazolinon- als auch Sulfonylharnstoff-Herbizide aufweisen, und wobei die Resistenz übertragen wird durch konventionelles Kreuzungs-Züchten von Pflanzen, erzeugt aus den Zellen und die Zellen regenerierbar in eine Pflanze sind.
Das Material von Anspruch 1, welches abgeleitet worden ist aus sensitiven Zellen von Eltern-Zuckerrüben-Pflanzen, bezeichnet als CR1-B, hinterlegt als ATCC 97961, welche zugleich eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide und keine Resistenz gegen Imidazolinon-Herbizide aufweisen, durch Kultivierung der sensitiven Zellen in einem Kulturmedium mit dem Imidazolinon-Herbizid, um die mutierten Zellen auszuwählen.
Das Pflanzenmaterial gemäß irgend einem der Ansprüche 1 oder 2 als ein Samen- oder Ableger des Samens.
Ein Verfahren zum Erzeugen einer Herbizid-Resistenz in einer Zuckerrüben-Pflanze, welches folgendes umfasst: (a) Exponieren von ersten Zellen an Zuckerrüben-Pflanzen mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen kodierend die Synthase, wobei Nukleotide modifiziert sind vom Cytosin nach Thymin an Position 562, gegen ein Imidazolinon-Herbizid in einem Kulturmedium, wobei die ersten Zellen ein homozygotes Merkmal für die Sulfonylharnstoff-Herbizid-Resistenz aufweisen; und (b) Auswählen nach zweiten Zellen mit einer Resistenz gegen beide Herbizide, wobei die Resistenz übertragen werden kann durch Kreuzungs-Züchtung einer Pflanze enthaltend die zweiten Zellen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die zweiten Zellen abgeleitet werden aus den ersten Zellen einer Zuckerrüben-Pflanze bezeichnet als 93R30 (SurSur), welche ein homozygoter Nachkomme ist von CR1-B, und letztgenannter hinterlegt ist als ATCC 97961, durch Exponieren der Zellen von 93R30 gegen ein Imidazolinon-Herbizid.
Das Verfahren von Anspruch 4, wobei die zweiten Zellen in einer Hinterlegung eines Samens mit der Bezeichnung ATCC 97535 (93R30B) sind.
Ein Verfahren zum Verleihen einer Herbizid-Resistenz in einer Zuckerrübe, welches folgendes umfasst: (a) Exponieren von ersten Zellen an Zuckerrüben-Pflanzen gegen ein Imidazolinon-Herbizid in einem Kulturmedium, wobei die ersten Zellen eine homozygote Sulfonylharnstoff-Herbizid-Resistenz in einem Kulturmedium aufweisen; (b) Auswählen nach zweiten Zellen mit einer Resistenz für beide Herbizide; (c) Kultivieren einer ersten Pflanze aus den zweiten Zellen, wobei die Pflanze die Resistenz für die Herbizide mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen, kodierend die Synthase, aufweist, wobei Nukleotide modifiziert sind von Cytosin nach Thymin an Position 562 und Guanin nach Adenin an Position 337; und (d) Kreuzungs-Hybridisieren der ersten Pflanze mit einer zweiten Pflanze, um eine gekreuzte Pflanze zu erzeugen, welche die Resistenz gegen die Herbizide aufweist.
Ein Verfahren zum Verleihen von Herbizid-Resistenz auf andere Rüben, welches folgendes umfasst: (a) Exponieren von ersten Zellen an Zuckenüben-Pflanzen gegen ein Imidazolinon-Herbizid in einem Kulturmedium, wobei die ersten Zellen eine homozygote Sulfonylharnstoff-Herbizid-Resistenz in einem Kulturmedium aufweisen; (b) Auswählen nach zweiten Zellen mit einer Resistenz für beide Herbizide; (c) Kultivieren einer ersten Pflanze aus den zweiten Zellen, wobei die Pflanze die Resistenz für die Herbizide aufweist, mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen, kodierend die Synthase, wobei Nukleotide modifiziert sind von Cytosin nach Thymin an Position 562 und Guanin nach Adenin an Position 337; und (d) Kreuzungs-Züchtung der ersten Pflanze mit einer zweiten Pflanze, um eine gekreuzte Pflanze zu erzeugen, welche die Resistenz gegen die Herbizide aufweist.
Das Verfahren von Anspruch 7, wobei die ersten Zellen in Schritt (a) abgeleitet sind von einer Zuckerrübe, bezeichnet als 93R30, welche ein homozygoter Nachkomme ist von CR1-B, wobei letztgenannte hinterlegt wurde als ATCC 97961, durch Exponieren der Zellen von 93R30 gegen ein Imidazolinon-Herbizid.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die zweiten Zellen in einer Hinterlegung eines Samens bezeichnet als ATCC 97535 (93R30B) sind.
Ein Verfahren zum Eindämmen von Schädlingen, welche auf Zuckerrüben-Pflanzen wachsen, welches folgendes umfasst. (a) Pflanzen von Zuckerrüben-Samen in einem Feld, enthaltend Zellen mit einem mutierten Acetolactat-Synthase-Gen, kodierend die Synthase, wobei Nukleotide modifziert sind von Cytosin nach Thymin an Position 562 und Guanin nach Adenin an Position 337, wobei die mutierten Zellen eine Resistenz sowohl gegen Imidazolinon- als auch Sulfonylharnstoff-Herbizide aufweisen, und wobei die Resistenz übertragen wird durch konventionelles Kreuzungs-Hybridisieren von Pflanzen, erzeugt aus den Zellen, um Zuckerrüben-Pflanzen zu erzeugen; und (b) Verwenden eines Imidazolinon-Herbizids auf der Pflanze in dem Feld, um Schädlinge einzudämmen.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei die Pflanze abgeleitet ist aus sensitiven Zellen einer Eltern-Zuckerrüben-Pflanze, bezeichnet als CR1-B, hinterlegt als ATCC 97961, welche zugleich Resistenz gegen Sulfonylharnstoff Herbizide aufweist, und keine Resistenz gegen Imidazolinon-Herbizide, durch Kultivieren der sensitiven Zellen in einem Kulturmedium mit dem Imidazolinon-Herbizid, um nach mutierten Zellen auszuwählen.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei die Pflanze abgeleitet ist von einem Samen, hinterlegt als ATCC 97535 (93R30B).