EA003297B1

EA003297B1 - Линия клеток растения сахарной свеклы и растение сахарной свеклы, устойчивые к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, семена указанного растения, способы получения указанной клеточной линии и гибридных растений свеклы, устойчивых к данным гербицидам, и применение имидазолинонового гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с указанными растениями сахарной свеклы

Info

Publication number: EA003297B1
Application number: EA199900123A
Authority: EA
Inventors: Доналд Пеннер; Терри Р. Райт
Original assignee: Мишиген Стейт Юниверсити
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-08
Publication date: 2003-04-24
Also published as: TR199900115T2; BG103177A; CN1230217A; WO1998002527A1; SK4399A3; EP0960190A4; EP0960190A1; ES2274546T3; JP3842299B2; JPH11513895A; SK286030B6; PL331175A1; BG65035B1; EP0960190B1; CZ14599A3; DE69736841D1; PL191812B1; AU3596697A; DE69736841T2; EA199900123A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к линии клеток растения сахарной свеклы и растению сахарной свеклы, которые являются устойчивыми как к имидазолиноновым, так и сульфонилмочевинным гербицидам, применяемым для борьбы с сорными растениями, вследствие мутаций в гене ацетолактатсинтазы, заключающихся в замещении цитозина на тимин в положении 562 и в замещении гуанина на аденин в положении 337 указанного гена, а также к семенам указанного растения. В изобретении также предложены способы получения указанной клеточной линии и гибридных растений свеклы, устойчивых к данным гербицидам, из клеток сахарной свеклы, обладающих устойчивостью к сульфонилмочевинным гербицидам и не обладающих устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам, путем отбора мутированных клеток с устойчивостью к обоим гербицидам и кроссбридинга регенерированного устойчивого растения с растением, чувствительным к указанным гербицидам. Эти устойчивые растения можно выращивать на полях, где имидазолиноны и сульфонилмочевины применяются для борьбы с сорными растениями.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается получения растений сахарной свеклы (Ве1а уи1даЙ8 Ь), которые являются устойчивыми как к имидазолиноновым, так и к сульфонилмочевинным гербицидам, применяемым для борьбы с сорными растениями. В частности, настоящее изобретение относится к растениям сахарной свеклы, полученным из чувствительной сахарной свеклы посредством селекции на мутацию гена, кодирующего ацетолактатсинтазу (АЬ8), известную также как синтазу ацетооксикислоты (АНА8). с применением гербицидов последовательно на клетках в культуральной среде.

Предшествующий уровень техники

В данной области ранее описано генетическое изменение гена ацетолактатсинтазы посредством рекомбинантных методов, как показано в патентах США № 5013659, 5141870 и 5378824. Данный тип модификации у растений сахарной свеклы показан на примере IV патента '824. Результаты являлись менее чем удовлетворительными при получении растений, которые давали потомство, действительно устойчивое к гербициду.

Заиибетк е1 а1. в (Сгор 8с1еисе 32: 13571360 (1992)) также описывают получение растения сахарной свеклы (СКТ-В), которое является устойчивым к сульфонилмочевинам, из чувствительного автофертильного клона (КЕЬ-1) посредством селекции на мутантные клетки в культуральной среде, содержащей гербицид. Различные устойчивые растения получали и подвергали кроссбридингу. Най е1 а1. (ЭДееб 8с1еисе 40378-383 (1992) и 41: 317-324 (1993)) далее охарактеризовали устойчивую линию и определили, что устойчивость являлась следствием измененной АЬ8 активности и не проявляла перекрестной устойчивости к другим АЬ8ингибирующим гербицидам, и что она кодируется единственным полудоминантным геном.

Не имеется публикаций, описывающих имидазолиноновую устойчивость, полученную посредством модифицирования АЬ8 у растений сахарной свеклы. В литературе отсутствует описание растений, которые являются устойчивыми к обоим гербицидам, имидазолиноновым и сульфонилмочевинным. Различные линии зерновых культур с устойчивостью к имидазолинону разработаны, как описано №\\1юи5е е1 а1., Тйеотебса1 апб Аррйеб Сепебск 83: 65-70 (1991).

Коммерческим путем защиты культур является применение используемых на практике средств обеспечения безопасности, таких, как описаны в Европейском Патенте N 375875. При данном способе вводят другое химическое вещество в почву. Предпочтительный способ представляет собой создание растений сахарной свеклы, которые являются устойчивыми к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения, таким образом, является разработка способа сообщения растениям сахарной свеклы устойчивости как к имидазолиноновым, так и и сульфонилмочевинным гербицидам посредством селекции мутации гена ацетолактатсинтазы, которая приводит к данной устойчивости. Кроме того, задачей настоящего изобретения является получение растений сахарной свеклы, которые являются устойчивыми к данным гербицидам.

Поставленная задача решается тем, что предложена линия клеток растения сахарной свеклы с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 562 цитозин замещен на тимин и в положении 337 гуанин замещен на аденин, устойчивая к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, способная регенерировать в растение сахарной свеклы, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге регенерированных растений с растениями, чувствительными к данным гербицидам.

Предпочтительным воплощением изобретения является линия указанных клеток, которая получена из клеток родительского растения сахарной свеклы, обозначенных как СК.1-В и депонированных под номером АТСС 97961, обладающих устойчивостью к сульфонилмочевинным гербицидам и не обладающих устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам, посредством культивирования указанных клеток в культуральной среде с имидазолиноновым гербицидом для селекции мутированных клеток, депонированная под номером АТСС 97535 (93К.30В).

Поставленная задача решается также тем, что предложено растение сахарной свеклы, содержащее клетки с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 562 цитозин замещен на тимин и в положении 337 гуанин замещен на аденин, обладающее устойчивостью как к имидазолиноновым, так и к сульфонилмочевинным гербицидам, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге этого растения, предпочтительно растение, которое регенерировано из линии клеток, депонированной под номером АТСС 97535.

Для решения указанной задачи предложены также семена растения сахарной свеклы по изобретению.

Поставленная задача решается также тем, что предложен способ получения линии клеток сахарной свеклы по изобретению, заключающийся в том, что клетки родительского растения сахарной свеклы, обладающие устойчивостью к сульфонилмочевинным гербицидам и не обладающие устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам, культивируют в питательной среде с имидазолиноновым гербицидом и отбирают мутированные клетки, обладающие устойчиво3 стью как к имидазолиноновым, так и сульфонилмочевинным гербицидам.

В предпочтительном воплощении этого способа культивируют клетки, полученные из родительского растения сахарной свеклы, обозначенные как 93В30 (8иг8иг) и депонированные под номером АТСС 97961, и получают линию, депонированную по номером АТСС 97535 (93В30В).

Предложен также способ получения гибридного растения сахарной свеклы, устойчивого как к имидазолиноновым, так и к сульфонилмочевинным гербицидам, заключающийся в том, что регенерируют растение из линии клеток сахарной свеклы по изобретению и осуществляют кроссбридинг регенерированного растения с растением сахарной свеклы, чувствительным к указанным гербицидам, с получением гибридного растения, которое устойчиво как к имидазолиноновым, так и к сульфонилмочевинным гербицидам.

Предложен, кроме того, способ получения гибридного растения свеклы, за исключением сахарной свеклы, устойчивого к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, заключающийся в том, что регенерируют растение из линии клеток сахарной свеклы по изобретению, полученной способом по изобретению, и осуществляют кроссбридинг регенерированного растения с растением свеклы, за исключением сахарной свеклы, чувствительным к указанным гербицидам, с получением гибридного растения, которое устойчиво к имидазолиноновому и сульфонилмочевинному гербицидам.

В рамках решения поставленной задачи предложено также применение имидазолинонового гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с растениями сахарной свеклы по изобретению.

Растение сахарной свеклы ВЕБ-1 (Рсдспсгабид, Еай Ьап81пд-1) было выделено в 1987 и может быть получено от Ότ. 1о5ср11 8аиибег5, Рс5саге11 Сеиебе181 (и.8. Перайшеи! о£ Адпеи11иге, Еай Ьаи81ид, МкЫдаи). Его можно получить бесплатно. КЕЬ-1 является чувствительным (8) к имидазолиноновым (1М-8), сульфонилмочевинным (8И-8) и триазолпиримидинсульфонанилидным (ТР-8) гербицидам, как показано на фиг. 1.

С использованием каллусов и суспензионных культур была разработана линия, которая являлась гетерозиготной по имидазолиноновой и сульфонилмочевинной устойчивости (1М-В и 8И-В). Данная клеточная линия была депонирована в Ашепеаи Туре СиНиге Собеебои как АТСС 97535 6 мая 1996 под Вибарей Тгеа1у, и на нее здесь ссылаются как на 93В30В. Данную клеточную линию можно получить по запросу на название и номер. Посредством скрещивания с элитными линиями растений сахарной свеклы, в частности, Ве!а уи1дап8 Ь., можно получить особенно коммерчески полезные устойчивые растения сахарной свеклы.

Растения сахарной свеклы, устойчивые к имидазолиноновым гербицидам, конкретно к имазетапиру, и сульфонилмочевинным гербицидам (хлорсульфурону) решают проблему почвенных остатков от применения таких гербицидов в областях выращивания сахарной свеклы. В настоящее время существует 40-месячный период ожидания между применением данных гербицидов и будущим использованием данного поля для выращивания растений сахарной свеклы. Во-вторых, высокий уровень имидазолиноновой и сульфонилмочевинной устойчивости позволяет применять имидазолиноновые гербициды для борьбы с сорными растениями у сахарной свеклы.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение способа по настоящему изобретению для получения растений сахарной свеклы, устойчивых к имидазолинону и сульфонилмочевине, 93В30А или В. В = устойчивый; 1М = имидазолинон; 8 = чувствительный; 8и = сульфонилмочевина; 8иг = АЬ8 аллель, доминантная для 8И-В, ТР-В и 1М-8; 8В = АЬ8 аллель, доминантная для 8И-В, ТР-В и 1М-В; ТР = триазолпиримидин. 93В30В является 8И-В и 1М-В и ТР-В. 93В30 (не 93В30В) является гомозиготным по 8иг аллели (8И-В, 1М-8). Данные материалы являлись исходными для получения имидазолиноновой устойчивости.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму технологического процесса, показывающую детализированные стадии получения мутантного растения сахарной свеклы.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий АЬ8 анализ на устойчивость 93В30В к имазетапиру.

Фиг. 4 представляет собой схему, показывающую аминокислотные замены, обнаруженные у трех мутантов сахарной свеклы (8ίτ-13, 8иг и 8В), ио сравнению с диким типом (χνΐ) и соответствующую гербицидную устойчивость. Включены только аминокислотные остатки, которые, как сообщалось в литературе, отвечают за гербицидную устойчивость у растений. Однобуквенные аминокислотные коды обозначают следующее: А = аланин, Р = пролин, ГС = триптофан, 8 = серин, и Т = треонин. Буквы в прямоугольниках показывают изменения по отношению к последовательности дикого типа.

Фиг. с 5А по 5Г представляют собой фотографии, показывающие ответ целого растения сахарной свеклы на имазетапир, примененный в послевсходовый период.

Фиг. с 6А по 6Г представляют собой фотографии, показывающие ответ целого растения сахарной свеклы на АС 299263, примененный в послевсходовый период.

Фиг. 7 представляет собой фотографию, показывающую ответ фермента АЬЗ на имазетапир ίη νίίτο.

Фиг. 8 представляет собой фотографию, показывающую ответ фермента АЬЗ на флуметсулам ίη νίίτο.

Фиг. с 9А по 9Г представляют собой фотографии, показывающие ответ целого растения сахарной свеклы на хлорсульфурон, примененный в послевсходовый период.

Фиг. 10 представляет собой фотографию, показывающую ответ фермента АЬЗ на хлорсульфурон ίη νίίτο.

Следующие примеры показывают выделение и размножение нового растения сахарной свеклы 93К30В, как иллюстрируется на фиг. 1.

Пример 1.

1. Селекция сахарной свеклы, устойчивой к имидазолинону и сульфонилмочевине, вариант 93К30В.

Описание материалов

Ке1-1. (Кедепегайпд Еак! Ьапктд-1) представляет собой высокорегенерируемую линию сахарной свеклы с мужской фертильностью, используемую для начальной клеточной селекции на мутант, гербицидо-устойчивый к сульфонилмочевинам, и применяется в качестве чувствительного контроля для большинства экспериментов.

СР.1-В. Данный изолят сахарной свеклы был разработан посредством высева клеток Ке11 на хлорсульфуронсодержащую среду. Данный вариант является устойчивым к сульфонилмочевине с умеренной устойчивостью к триазолпиримидиновому гербициду, флуметсуламу, но без имидазолиноновой устойчивости. Данный вариант был описан Заипбегк е! а1. (Сгор 8сг 32: 1357-1360) и Наг! е! а1. (А ееб 8с1. 40: 378-383 и 41: 317-324). Ген 8И устойчивости отмечен как 8ит.

93К30В. Данный изолят был разработан посредством высева клеток высоко регенерируемого 8ит гомозиготного растения сахарной свеклы (происходящего от СК.1-В) на среды, содержащую имазетапир.

ЕЬ-49. Еак! Ьапктд 49, выделенный υδΌΑ в 1993. Линия сахарной свеклы, гомозиготная по Зиг гену, применяемая для сульфонилмочевина-устойчивого, имазетапир-чувствительного контроля.

а. Растения селекционировали как исходные материалы для соматоклональной селекции, основанной на их способности образовывать каллус в условиях высокого содержания цитокининов (в средах В1) и регенерировать побеги из каллуса.

Протокол для сред В1:

30-г-л^-1сахарозы;

100 мг-л^-1 мио-инозитола;

1,65 г-л^-1 \11А1О_; ;

1,90г-л^-1 КЫО₃ ;

0,44 г-л^-1 СаС1₂-2Н₂О;

0,37 г-л^-1 МдЗО₄-7Н₂О;

0,17 г-л^-1 КН₂РО₄ ;

6,2 мг-л^-1 Н₃ВО₃ ;

16.8 мг-л^-1 МпЗО₄-Н₂О;

10,6мг-л^-1 2п8О₄-7Н₂О;

0,88 мг-л^-1 ΚΙ;

0,25 мг-л^-1 Ыа₂МоО₄-2Н₂О;

0,025 мг-л^-1 Си8О₄-5Н₂О;

0,025 мг-л^-1 СоС12-6Н2О;

37,3 мг-л^-1 Ха-ЭДТА;

27.8 мг-л^-1 Ее8О₄-7Н₂О;

мг- л^-1 тиамина;

0,5 мг-л^-1 пиридоксина;

0,5 мг-л^-1 никотиновой кислоты;

мг- л^-1 бензиламинопурина;

рН 5,95.

Твердую среду В1 автоклавировали с 9 г- л^-1 растительного культурального агара и модифицировали стерилизованными фильтрованием исходными растворами для разведения, как требуется по схеме селекции. Среды с агаром заливали в одноразовые пластмассовые чашки Петри 15x100 мм.

Жидкую среду В1 добавляли 40 мл аликвотами в 125 мл колбы Эрленмейера и автоклавировали для использования для жидких суспензионных культур.

Для селекции имидазолинон-устойчивого варианта 93К30В исходным материалом являлся 93Κ30 (Зиг гомозиготный, производный от СК1В).

В частности:

1. Клетки от Ке1-1 (δυ-8, ΙΜ-δ, ΤΡ-З) помещали в культуру, где клетки селекционировали по их способности расти на хлорсульфуроне, и регенерировали растение СК1-В (описанное Запбегк е! а1., Сгор Зсг, 32: 1357-1360(1992)).

2. СК1-В скрещивали с 293 (более типичной свеклой), Е1 подвергали самоопылению и идентифицировали растения, гомозиготные по δυ-Κ, ΙΜ-δ, ΤΡ-Κ. Растение, известное как ЕЬ49, встречающееся в данном описании, было выделено в 1993 Заипбегк (ген был назван Зиг, и растение являлось гомозиготным по нему).

3. В последнюю очередь потомков от СР.1В, гомозиготных по Зиг, селекционировали по их способности регенерировать растения в культуре. Они затем служили в качестве исходного материала (например 93Κ30) для селекции на имазетапир в культуре.

4. В результате вышеописанной селекции получали изоляты, известные как 93Κ30Α и 93К30В, и регенерировали растения. Они обладали характеристиками СК1-В плюс ΙΜ-Κ. Оказалось, что ген, ответственный за ΙΜ-Κ, является измененной формой Зиг, и была установлена его идентичность ЗВ.

Эксплантаты листовых дисков получали из быстро растущих листьев исходного растения (93Κ30). Поверхность листьев стерилизовали (стадия 1) посредством двух последовательных 20-минутных промывок 15%-ой коммерческой хлорной известью плюс 0,025%-м Тритон Х-100 (Т-9280, §1дта Сйет. Со., δΐ. Ьошк, МО). Листья дважды ополаскивали стерильной деионизированной водой. Листовые диски вырезали с использованием стерилизованного в пламени сверла для пробок #3.

Листовые диски помещали асептически на твердые среды В1 (стадия 2). Диски инкубировали в темноте при 30°С в течение 4-8 недель до пролиферации рыхлой белой каллусной ткани из листового диска. Каллусную ткань отделяли механически с использованием пинцета и последовательно переносили в 125 мл колбы Эрленмейера (стадия 3), содержащие по 40 мл жидкой среды В1. Колбы помещали на вращательную качалку при 50 Гц под флуоресцентным освещением низкой интенсивности (30 мкЭ/м²с). Жидкие культуры субкультивировали в свежих средах В1 через 1 неделю.

Через две недели после инициации жидкой культуры колонии клеток разделяли с использованием сита для диссоциации клеток (8щта СЬ-1) с экраном 60 меш. Примерно две трети объема жидких сред удаляли после седиментации клеток. На стадии 4 клетки ресуспендировали в оставшихся средах, и 1 мл аликвоты равномерно распределяли на твердых средах В1, содержащих 50 нМ гербицида имазетапира (Ρυκδυϊτ, Атепсаη Суапапйб. ЭДаупе, N1). Чашки заворачивали и инкубировали в неярком флуоресцентном свете (5-10 мкЭ/м²с) в течение 8-12 недель.

в. При концентрации имазетапира 50 нМ все чувствительные клетки погибали. Колонии клеток, которые выжили и выросли при данной концентрации, идентифицировали как возможные устойчивые варианты. На стадии 5 эти колонии клеток (1-3 мм в диаметре) переносили на свежие твердые среды В1 без гербицида и позволяли им расти при низкоинтенсивном свете (10-20 мкЭ/м²с). Каждый предполагаемый устойчивый вариант индивидуально идентифицировали и поддерживали отдельно.

г. На стадии 6 белый рыхлый каллус подразделяли каждые 4-6 недель на свежие твердые среды В1, пока из каллуса не вырастал индивидуальный побег (побеги). Эти побеги переносили на среды для поддержания побегов (М20), такие как следующие:

Протокол для М20 сред:

г· л^-1 сахарозы;

100 мгл^-1 миоинозитола;

1,65гщ^-1 М^Оз ;

1,90г-л’¹ КЪЮ₃ ;

0,44 гщ^-1 СаСЦ2ШО;

0,37 г· л^-1 Μ§δΟ₄·7Η₂Ο;

0,17рл^-1КН₂РО₄ ;

6,2 мгл^-1 Н₃ВО₃ ;

16,8 мгл^-1 ΜηδΟ₄·Η₂Ο;

10,6 мгл^-12ЮО.г7Н_;О;

0,88 мгщ^-1 ΚΙ;

0,25 мгл^-1 Να₂ΜοΟ₄·2Η₂Ο;

0,025 мгщ^-1 С^^НО;

0,025 мгщ^-1 СоСЦ6Н₂О;

37,3 мгщ^-1 №ьЭДТА;

27,8 мгщ^-1 ΡеδΟ₄·7Η₂Ο;

мг· л^-1 тиамина;

0,5 мгл^-1 пиридоксина;

0,5 мгл^-1 никотиновой кислоты;

0,25 мгл^-1 бензиламинопурина;

рН 5,95.

Твердую среду М20 автоклавировали с 9 г· л^-1 растительного культурального агара и модифицировали стерилизованными фильтрованием исходными растворами гербицидов для разведения, как требовалось по схеме селекции. Среды с агаром заливали в одноразовые пластмассовые чашки Петри 20x100 мм.

Культуры побегов поддерживали при флуоресцентном освещении 10-20 мкЭ/м²с и размножали посредством разрезания культур побегов с использованием лезвия скальпеля. Кандидаты культур побегов размножали и оценивали на уровень устойчивости, как описано ниже.

2. Уровень имидазолиноновой, сульфонилмочевинной и триазолпиримидинсульфонанилидной устойчивости в культуре побегов.

На стадии 7 культуры побегов оценивали на гербицидную устойчивость посредством помещения трех маленьких срезов побегов последовательных размеров на каждую из чашек со средой М20, содержащей логарифмически возрастающие концентрации имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевины или триазолпиримидинсульфонанилида, находящиеся в пределах от 1 нМ до 0,1 мМ. Ответы культуры 93Р30 сравнивали с ответами культур побегов чувствительного контроля (Ре1-1) и хлорсульфуронустойчивого, имидазолинон-чувствительного контроля (ЕЬ-49). Культуры побегов поддерживали при интенсивности света 20 мкЭ/м²с при 25°С в течение 3 недель. Ответ культуры побегов определяли посредством оценки повреждения побега и массы сырой ткани через 3 недели после переноса на селективные среды. Величину гербицидной устойчивости определяли как отношение величины Ι₅₀ (концентрация гербицида, вызывающая 50-процентное повреждение) устойчивого варианта к величине Ι₅₀ чувствительного варианта.

Характеристики перекрестной устойчивости каждого варианта определяли вышеописанным способом посредством замены гербицида, используемого в средах. В культуре побегов 93К.30В проявил 3600-кратный уровень устойчивости к имазетапиру, 10000-кратный уровень устойчивости к хлорсульфурону и 60-кратную перекрестную устойчивость к триазолпиримидинсульфонанилидному гербициду, флуметсу9 ламу, как показано в табл. 1. Для сравнения ЕЬ- вости к имазетапиру.

проявил только 3-кратный уровень устойчиТаблица 1 Величина устойчивости и перекрестной устойчивости культуры побегов

Гербицид	Семейство гербицидов⁶	Ке1-1	93К30В	ЕЬ-49
		Ι₅₀ ⁵ ДмкМ)	Ι₅₀ (мкМ)	К/8⁴	Ι₅₀ (мкМ)	К/8
Имазетапир	ΙΜ	0,018	64	3600х	0,053	3х
Имазаметабензметил	ΙΜ	0,80	>100	>125х	20	25х
Имазахин	ΙΜ	0,040	16	400х	0,040	1х
АС299263¹	ΙΜ	0,030	40	1400х	0,070	3х
Хлорсульфурон²	8И	0,0025	25	10000х	25	10000х
Флуметсулам³	ТР	0,028	1,7	60х	1,1	40х

¹ - Имадазолинон Κ.ΆΡΤΘΚ. (Атепсаи Суаиатй, \Уаупс. N1);

² - сульфонилмочевина - ΟΕΕΑΝ (ΌιιροηΙ. \νί1ιηίπ§1οη. ΌΕ);

³ - триазолпиримидинсульфонанилид (ΒΚΌΑΌδΤΚΙΚΕ, Όο\ν Е1апсо< Ιηάίαηαροΐίδ. ΙΝ);

⁴ - К/8 = отношение величины Ι₅₀ устойчивого варианта к величине Ι₅₀ чувствительного контроля для конкретного гербицида. который тестировали;

⁵ - Ι₅₀ представляет собой концентрацию гербицида, требующуюся, чтобы вызвать 50% повреждение культуры побегов;

⁶ - классификации семейства гербицидов: ΙΜ, имидазолинон; 8ϋ, сульфонилмочевина; и ТР, триазолпиримидин сульфонанилид.

3. Регенерация растений и размножение.

На стадии 8 культуры побегов 93К30В регенерировали до целых растений подобным способом. Через две недели после предшествующего субкультивирования культуры побегов побеги 93К30В переносили в 125 мл колбы Эрленмейера, содержащие 40 мл среды для укоренения N3.

Протокол для среды N3:

г· л^-1 сахарозы;

100 мгл^-1 мио-инозитола;

1,65 г· л^-1 Ν^ΝΘβ ;

1,90 г· л^-1 ΕΝΘ3 ;

0,44 г· л^-1 СаС1₂^2Н₂О;

0,37 га^-1 Μ§8Ο₄·7Η₂Ο;

0,17гл^-1 КН₂РО₄;

6,2 мгл^-1 Н₃ВО₃

16.8 мгл^-1 Μη8Ο₄·Η₂Ο;

10,6 мгл^-1 Ζη8Ο₄·7Η₂Ο;

0,88 мгл^-1 ΚΙ;

0,25 мгл^-1 №₂ΜοΟ₄·2Η₂Ο;

0,025 мгл^-1 ί’ιι8Ο.·|·5Η₂Ο;

0,025 мгл^-1 СоС1^6Н₂О;

37,3 мгл^-1 №ьЭДТА;

27.8 мгл^-1 Εе8Ο₄·7Η₂Ο;

мг· л^-1 тиамина;

0,5 мгл^-1 пиридоксина;

0,5 мгл^-1 никотиновой кислоты;

мгл^-1 нафталинуксусной кислоты;

рН 5,95.

Среду N3 добавляли 40 мл аликвотами в 125 мл колбы Эрленмейера, в каждую колбу добавляли 9 г· л^-1 агара и автоклавировали для использования для укоренения культур побегов.

Затем культуры переносили на 24 ч на дневной свет при средней интенсивности света (40-60 мкЭ/м²с) при 25°С. Как правило, корни образовывались через 6-8 недель.

На стадии 9 укорененные побеги (поколение К.₀) затем переносили в вегетационную смесь ВассЮ (ΜκΗί^η Реа! Со., ΗουδΙοη, ΤΧ) в теплице. На стадии 10 растения К.₀ регенератов 93К30В скрещивали с гладкокорневой сахарной свеклой, названной 293, или с КЕЬ-1. Из семян Г₁ от этих скрещиваний в результате самоопыления получали семена Е₂. Предполагалось, что имидазолиноновая устойчивость является доминантным или полудоминантным моногенным признаком. Растения поколения Е₂, полученные от самоопыления растений Е₁, устойчивых к имидазолинону и сульфонилмочевине, должны расщепляться в соотношении 1 гомозиготное устойчивое: 2 гетерозиготных устойчивых: 1 гомозиготное чувствительное по обеим устойчивостям, к имидазолинону и к сульфонилмочевине.

Существуют основания предполагать, что имидазолиноновая устойчивость является доминантным признаком у 93К30В. Этот вывод сделан на основании анализа потомства Е₁ от скрещиваний между 93К30В и чувствительными к гербициду линиями сахарной свеклы с мужской фертильностью 293 или Ке1-1, которые дают расщепление типа 1:1 на ΙΜ-К или ΙΜ-8. Подобным образом, во всех растениях Е₂ или растениях от обратного скрещивания (ВС₁), тестированных к настоящему времени, ΙΜ-К и 8ИК расщепляются совместно. Это позволяет предположить, что эти две устойчивости сцеплены и являются следствием разных изменений одной и той же АЬ8 аллели. Устойчивость или чувствительность растений Е₁ к имазетапиру и хлорсульфурону определяли с использованием недеструктивного теста на рост листовых дисков.

Протокол анализа

Данный протокол представляет собой недеструктивный тест, предназначенный для раннего скрининга растений свеклы, расщепляющихся по гербицидной устойчивости, чтобы определить их состояние как устойчивое или чувствительное без необходимости опрыскивания растений свеклы в послевсходовый период в теплице.

1) Вновь вырастающий лист отрезали от растения (по меньшей мере, 4-й настоящий лист).

2) Поверхность листа стерилизовали двумя 20-минутными промывками 15%-ой коммерческой хлорной известью + 0,025%-ым Тритон Х100, затем ополаскивали дважды стерильной дистиллированной водой.

3) Эксплантаты листовых дисков вырезали с использованием стерилизованного в пламени сверла для пробок #3.

4) Листовые диски переносили на среды В1, не содержащие гербицида, содержащие 100 нМ имазетапира или содержащие 100 нМ хлорсульфурона. Чашки делили на четыре секции, чтобы четыре образца можно было анализировать на одной чашке. На каждую чашку для каждого образца добавляли от четырех до пяти листовых дисков.

5) Чашки заворачивали и инкубировали при 25°С в течение 4-7 дней при низкой интенсивности света (примерно 10 мкЭ/м²с).

6) Устойчивые образцы идентифицировали по их способности жить и расти на селективной среде. Чувствительные образцы не должны расти и должны становиться от желтых до коричневых. Эффекты сравнивали с ростом листовых дисков, помещенных на среды без гербицида, чтобы гарантировать точное определение ожидаемого уровня роста дисков.

4. Ферментативный ответ АЬЗ мишени на имазетапир Стандартные методики использовали для частичной очистки АЬЗ из быстро растущих листьев растений сахарной свеклы, растущих в теплице (Най е! а1., Ассб Зс1епсе 40: 378-383 (1992)). Экстракты из гетерозиготных растений Ρ₁ 93В30В и семена Ве1-1 З₁ анализировали на активность АЬЗ в присутствии логарифмически возрастающих концентраций имазетапира. Активность АЬЗ определяли в экстрактах из листьев линий сахарной свеклы КЕЬ1 и 93В30В. Растения выращивали в теплице, как описано выше, до стадии от четырех до шести листьев. Активность АЬЗ из свежих экстрактов определяли в присутствии имазетапира и хлорсульфурона при логарифмически возрастающих концентрациях. Применяемые способы и методики модифицировали из описанных Вау (Р1ап! РЬ.у8ю1. 75: 827-831 (1984)) и Зйапет е! а1. (Р1ап! РЬ.у8ю1. 76: 545-546 (1984)). Десять г листьев сахарной свеклы гомогенизировали в 40 мл холодного буфера для гомогенизации (0,1М К₂НРО₄, рН 7,5, 1 мМ пируват натрия, 0,5 мМ МдС1₂, 0,5 мМ тиаминпирофосфат, 10 мкМ флавинадениндинуклеотида, 10% об./об. глицерина) плюс 2,5 г поливинилпирролидона. Гомогенат фильтровали через восемь слоев марли и центрифугировали при 27000 д в течение 20 мин. Супернатант отбирали и подвергали 50% насыщению (НН₄)₂ЗО₄. Данный раствор хранили при 0°С в течение 1 ч, затем центрифугировали при 18000 д в течение 15 мин, остаток вновь растворяли в 1 мл буфера для ресуспендирования (0,1 М К₂НРО₄, рН 7,5, 20 мМ пируват натрия, 0,5 мМ МдС12) и обессоливали на колонке с Зерйабех 6-25 РЭ-10⁵. Экстракты фермента анализировали немедленно.

Активность АЬЗ измеряли посредством добавления 0,2 мл препарата фермента (разбавленного 3:1 буфером для ресуспендирования) к 1,3 мл реакционного буфера (25 мМ К2НРО4, рН 7,0, 0,625 мМ МдС12, 25 мМ пируват натрия, 0,625 мМ тиаминпирофосфат, 1,25 мкМ флавинадениндинуклеотид) и инкубации при 35°С в течение 1 ч. Реакционные смеси содержали конечную концентрацию 0, 4, 40, 400, 4000, 40000, 400000 или 4000000 нМ имазетапира или 0, 0,9, 9, 90, 900, 9000, 90000 нМ хлорсульфурона. Реакцию останавливали посредством добавления 50 мкл 6 н. Н2ЗО4 и инкубации при 60°С в течение 15 минут. Данная процедура, как описано Ае81етйе1б (1. Βΐο1. Сйеш. 16: 495-502 (1945)) также декарбоксилирует продукт АЬЗ фермента, ацетолактат, с образованием ацетоина. Окрашенный ацетоиновый комплекс образовывали посредством добавления 1 мл 2,5% мас./мас. αнафтола и 0,25% мас./мас. креатина в 2,5н. №1ОН и инкубации при 60°С в течение 15 мин.

Покупной ацетоин использовали в качестве стандарта для колориметрической реакции. Концентрации ацетоина определяли посредством измерения абсорбции реакционного раствора при 530 нм. Эксперименты с каждым гербицидом повторяли с тремя повторениями для каждого. Концентрации белка в экстрактах определяли посредством метода Брэдфорда (Апа1. Вюсйеш. 72: 248-254 (1976)) с использованием бычьего сывороточного альбумина для построения стандартной кривой.

Эксперименты проводили дважды, и обработки повторяли три раза. На фиг. 3 показан ответ АЬЗ экстрактов из 93В30В и чувствительного Ве1-1. 93В30В проявляет 1750-кратный уровень устойчивости к имазетапиру на уровне фермента (как определили по отношению величин 1₅₀ устойчивой и чувствительной линии).

5. Число копий АЬЗ гена.

Чтобы определить число копий АЬЗ гена, присутствующих у чувствительной сахарной свеклы, проводили Саузерн-блот анализ. Геномную ДНК выделяли из чувствительных растений Р₃, происходящих от исходного мутанта

86-13, и анализировали с использованием обычно практикуемых методик (Сиггеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг В1о1оду, I. ЭДбеу апб 8опк, №\ν Уогк (1991)). Подобным образом анализировали геномную ДНК из коммерческого сорта сахарной свеклы. В обоих линиях сахарной свеклы определили одну копию АЙ8 гена. Эти данные должны указывать на то, что вся ферментативная активность АЙ8 у гомозиготного мутанта сахарной свеклы должна состоять из устойчивой формы фермента. Это также подтверждает мнение, что 8В замена, обнаруженная у изолята 93К30В, является измененной формой 8ИК аллели АЬ8. Это было подтверждено, как описано ниже.

6. Мутация АЬ8 гена.

Чтобы определить молекулярную основу устойчивости АЬ8 фермента, использовали стандартные методики для секвенирования (определения последовательности) двух районов АЬ8 гена, где встречались все описанные ранее мутации устойчивости к гербицидам (СиггегИ Ргоксоб ίη Мо1еси1аг Вю1оду, I. ЭДйеу апб 8опк, №\ν Уогк (1991)). Последовательность АЬ8 гена сахарной свеклы была определена ранее (Патент США 5378824), и были сконструированы праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации двух районов гена, ответственных за ранее описанные случаи устойчивости к гербицидам у растений. Сравнение данных последовательности из 8И-К 1М-8 ТР-К (8иг), 8И-К 1М-К ТР-К (8В) и чувствительной (Ке1-1) сахарной свеклы указывает на то, что признаки устойчивости к гербицидам у 93К30В являлись следствием двух независимых мутаций в АЬ8 гене.

Мутация, вызывающая 8И-К 1М-8 ТР-К (8иг), является результатом одиночной замены нуклеотида цитозина на тимин в положении 562 в нуклеотидной последовательности, которая приводит к замене серина на пролин в положении 188 аминокислотной последовательности АЬ8 сахарной свеклы. Ранее было показано, что данный сайт вовлечен в устойчивость к сульфонилмочевине у АгаЫборкк ШаПапа (Наидй е! а1., Мо1еси1аг апб Сепега1 Сепебск 211: 266-271 (1988)), табака (I .ее е1 а1., ЕМВО I., 7: 1241-1248 (1988)) и у дрожжей (Патент США 5378824). Других замен оснований в двух изученных районах АЬ8 гена по сравнению с последовательностью дикого типа не наблюдалось.

Мутация, вызывающая 8И-К 1М-К ТР-К (8В), является результатом двух независимых мутаций в нуклеотидной последовательности АЕ8, приводящих к двум различным заменам в аминокислотной последовательности. Первая замена является идентичной 8иг мутации, описанной выше. Данное наблюдение являлось ожидаемым, поскольку в качестве исходного материала для 1М-К селекции служило растение сахарной свеклы (93К30). Кроме данной точечной мутации, наблюдалась дополнительная одиночная замена нуклеотида гуанина на аденин в положении 337. Эта вторая мутация приводит к замене треонина на аланин в положении 113 аминокислотной последовательности АЕ8 сахарной свеклы. Ранее было показано, что данный сайт вовлечен в устойчивость к имидазолинону у дурнишника (Вегпаксош е! а1., Е Вю1. Сйет. 270: 17381-17385 (1995)) и в устойчивость к сульфонилмочевине у дрожжей (Патент США 5378824). Других замен оснований в двух изученных районах АБ8 гена по сравнению с последовательностью дикого типа не наблюдалось.

Следующая информация показывает синергизм гербицидной устойчивости возможных мутаций А1ацз->Тйг и Ргоц₈->8ег.

Двойная мутация в АЕ8 гене у сахарной свеклы 8В обеспечивает устойчивость к комбинации гербицидов двух химических семейств, к которым несет устойчивость каждый из одиночных мутантов сахарной свеклы индивидуально (то есть, 8иг и 86-13). На фиг. 4 показаны характеристики перекрестной устойчивости к основным семействам двух одиночных мутантов (8иг и 8ΪΓ-13) и двойного мутанта (8В). Аминокислоты, изображенные на фиг. 4, представляют 5 строго консервативных остатков, которые, как сообщалось в литературе, вовлечены в Ай 8-ингибирующую устойчивость к гербицидам у растений. Взаимодействие независимых мутаций внутри двойного мутантного фермента (и соответствующих растений) является уникальным. Комбинация 1М-специфичной устойчивости, наблюдаемой при аминокислотной замене у 86-13 (А1ац₃->Тйг) и 8И- и ТРустойчивость, наблюдаемая при замене у 8иг (Рго1₈₈->8ег) приводит в результате к сахарной свекле 93Р30В (8В), устойчивой ко всем трем классам химии гербицидов.

Устойчивости, однако, не являются аддитивными. Вместо этого эти мутации проявляют синергизм в отношении устойчивости к имидазолиноновым гербицидам имазетапиру и АС 299263. Данное явление можно наблюдать визуально на фиг. 5 и 6 и количественно в табл. 2.

Таблица 2. Ответ целого растения сахарной свеклы в послевсходовый период на АЬ8-ингибирующие гербициды

	Линия сахарной свеклы
Ре1-1	81Г-13	8иг	93Р30В
Гербицид	Класс	150(гта¹)	К/8	К/8	К/8
Имазетапир	1М1	0,5	100х	3х	300х
АС 299263	1М1	1,1	130х	4х	>250х
Хлорсульфурон	8и	0,07	1х	>1000х	20х
Сульфометурон	8и	0,2	1х	23х	4х

Сахарная свекла с одиночной мутацией,

8иг и 81Г-13, проявляет 3 и 100-кратную устойчивость к имазетапиру, тогда как двойной мутант, 8В, является 300-кратно устойчивым к гербициду при его применении в послевсходовый период на целых растениях. Подтверждение этого синергизма обеспечивается посредством наблюдаемого ответа АЬ8 фермента из каждого из мутантов на имазетапир (фиг. 7). Снова наблюдается синергизм устойчивости к гербициду у двойного мутанта, 8В (>1000х) по сравнению с одиночными мутантами, 8иг (1х) и 8ίτ-13 (40х) в отдельности.

Подобный синергизм очевиден для ТР класса гербицидов. Устойчивость побегов для одиночных мутантов 8иг и 8ίτ-13 является 40х и 1х, соответственно, и 60х для двойного мутанта, 8В. Это явление синергизма подтверждается данными по ЛЬ8 ферменту - 50х и 3х устойчивостью к флуметсуламу для одиночных мутантов, 8иг и 8ΪΓ-13, соответственно, и 200х устойчивостью для двойного мутанта, 8В (фиг. 8). Вторая мутация, обнаруживаемая у 8В, фактически снижает устойчивость к хлорсульфурону (гербициду 8и класса), наблюдаемую на уровне целого растения (фиг. 9). Для хлорсульфурона устойчивость целого растения у двойного мутанта 8В (20х) снижается более чем в 50 раз посредством добавления мутации, эквивалентной 8ΪΓ-13 (Л1ацз->Тйг) (1х устойчивость) в ген 8И-устойчивости, 8иг (Рго₁₈₈->8ег) (>1000х устойчивость) (табл. 2). Случай антагонизма между одиночным мутантом 8иг и двойным мутантом 8В еще неизвестен. На уровне ЛЬ8 фермента также наблюдается синергизм устойчивости при использовании хлорсульфурона (фиг. 10).

Следует принимать во внимание, что в первую очередь можно проводить селекцию на имидазолиноновую устойчивость, а затем проводить селекцию на сульфонилмочевинную устойчивость.

Рекомендуется, чтобы приведенное выше описание являлось только иллюстративным для настоящего изобретения, и чтобы настоящее изобретение не было ограничено только прилагаемой ниже формулой. Аминокислотные последовательности фиг. 4 показаны в 8ЕО ГО N08: 1, 2, 3 и 4.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (ί) ЗАЯВИТЕЛЬ: Эопа1б Реппег, Теггу В. ГСгщЫ (ίί) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Сахарная свекла, устойчивая к имидазолиноновому гербициду (111) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4 (ίν) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ:

(A) АДРЕСАТ: 1ап С. МсЬеоб (B) УЛИЦА: 2190 Сошшопк Ратк^ау (C) ГОРОД: 0кеток (Ό) ШТАТ: МкЫдап (Е) СТРАНА: И8А (Е) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС (ΖΙΡ): 48864 (ν) КОМПЬЮТЕРИЗИРОВАННАЯ ФОРМА (А) ТИП НОСИТЕЛЯ: дискета, 5,25 дюйма, объем памяти 360 Кбайт (B) КОМПЬЮТЕР: 1ВМ-совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: М8Ό08 (Ό) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: ГСогбРегГес! 5.1 (νί) ДАННЫЕ ТЕКУЩЕЙ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ:

(B) ДАТА ПОДАЧИ:

(C) КЛАССИФИКАЦИЯ:

(νίί) ДАННЫЕ ПРИОРИТЕТНОЙ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ: 08/683533 (B) ДАТА ПОДАЧИ: 17 июля 1996 (νίίί) ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ (A) ИМЯ: 1ап С. МсЬеоб (B) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: 20931 (C) НОМЕР ДЕЛА: М8И 4.1-344 (1х) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

(A) ТЕЛЕФОН: (517) 347-4100 (B) ТЕЛЕФАКС: (517) 347-4103 (C) ТЕЛЕКС: нет (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8ЕО ГО N0: 1:

(ί) характеристики последовательности:

(A) длина: 5 (B) тип: аминокислоты (C) количество нитей: однонитевая (Ό) топология: линейная (и) тип молекулы:

(А) Описание: пептид (ΐϊϊ) гипотетическая: нет (ίν) антисмысловая: нет (νί) источник происхождения:

(A) организм: сахарная свекла (B) линия: дикий тип (C) индивидуальный изолят:

(Ό) тип клеток: Ν/А (1х) Признаки:

(A) имя/ключ:

(B) локализация:

(C) способ идентификации: секвенирование (О) другая информация:

(х1) Описание последовательности: 8Е0 ГО N0: 1:

А1а Рго А1а Тгр 8ег (3) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8ЕО ГО N0: 2:

(ί) характеристики последовательности:

(A) длина: 5 (B) тип: аминокислоты (C) количество нитей: однонитевая (О)топология: линейная (ίί) тип молекулы:

(A) организм: сахарная свекла (B) линия: 8ΪΓ-13 (C) индивидуальный изолят: МА (Ό) тип клеток: МА (ίχ) Признаки:

(A) имя/ключ:

(B) локализация:

(C) способ идентификации: секвенирование (Ό) другая информация:

(χί) Описание последовательности: 8ЕО ГО

N0: 2:

ТЬг Рго А1а Тгр 8ег (4) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8Ер ГО N0: 3:

(ί) характеристики последовательности:

(A) длина: 5 (B) тип: аминокислоты (C) количество нитей: однонитевая (Ό) топология: линейная (ίί) тип молекулы:

(А) Описание: пептид (ίίί) гипотетическая: нет (ίν) антисмысловая: нет (νί) источник происхождения:

(A) организм: сахарная свекла (B) линия: 8иг (C) индивидуальный изолят: Ν/Α (Ό) тип клеток: Ν/Α (ίχ) Признаки:

(A) имя/ключ:

(B) локализация:

(χί) Описание последовательности: 8Е0 ГО

N0: 3:

А1а 8ег А1а Тгр 8ег (5) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8ЕО ГО N0: 4:

(ί) характеристики последовательности:

(A) организм: сахарная свекла (B) линия: 93К30В (C) индивидуальный изолят: МА (Ό) тип клеток: МА (ίχ) Признаки:

(A) имя/ключ:

(B) локализация:

(χί) Описание последовательности: 8Е0 ГО

N0: 4:

Тйг 8ег А1а Тгр 8ег

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Линия клеток растения сахарной свеклы с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 562 цитозин замещен на тимин и в положении 337 гуанин замещен на аденин, устойчивая к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, способная регенерировать в растение сахарной свеклы, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге регенерированных растений с растениями, чувствительными к данным гербицидам.
2. Линия клеток по п.1, которая получена из клеток родительского растения сахарной свеклы, обозначенных как СКТ-В и депонированных под номером АТСС 97961, обладающих устойчивостью к сульфонилмочевинным гербицидам и не обладающих устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам, посредством культивирования указанных клеток в культуральной среде с имидазолиноновым гербицидом для селекции мутированных клеток, депонированная под номером АТСС 97535 (93В30В).
3. Растение сахарной свеклы, содержащее клетки с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 562 цитозин замещен на тимин и в положении 337 гуанин замещен на аденин, обладающее устойчивостью как к имидазолиноновым, так и к сульфонилмочевинным гербицидам, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге этого растения.
4. Растение по п.3, которое регенерировано из линии клеток по п.2.
5. Семена растения сахарной свеклы по любому из пп.3-4.
6. Способ получения линии клеток сахарной свеклы по п.1, заключающийся в том, что клетки родительского растения сахарной свеклы, обладающие устойчивостью к сульфонилмочевинным гербицидам и не обладающие устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам, культивируют в питательной среде с имидазолиноновым гербицидом и отбирают мутированные клетки, обладающие устойчивостью как к имидазолиноновым, так и сульфонилмочевинным гербицидам.
7. Способ по п.6, при котором культивируют клетки, полученные из родительского растения сахарной свеклы, обозначенные как 93К30 (8иг8иг) и депонированные под номером АТСС 97961, и получают линию, депонированную по номером АТСС 97535 (93В30В).
8. Способ получения гибридного растения сахарной свеклы, устойчивого как к имидазолиноновым, так и к сульфонилмочевинным гербицидам, заключающийся в том, что регенерируют растение из линии клеток сахарной свеклы по любому из пп.1-2 формулы и осуществляют кроссбридинг регенерированного растения с растением сахарной свеклы, чувствительным к указанным гербицидам, с получением гибридного растения, которое устойчиво как к имидазолиноновым, так и к сульфонилмочевинным гербицидам.
9. Способ получения гибридного растения свеклы, за исключением сахарной свеклы, устойчивого к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, заключающийся в том, что регенерируют растение из линии клеток сахарной свеклы по п.1 формулы, полученной в соответствии со способом по п.6, и осу ществляют кроссбридинг регенерированного растения с растением свеклы, за исключением сахарной свеклы, чувствительным к указанным гербицидам, с получением гибридного растения, которое устойчиво к имидазолиноновому и сульфонилмочевинному гербицидам.
10. Применение имидазолинонового гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с растениями сахарной свеклы по любому из пп.3-4 формулы.