JP3842299B2 - イミダゾリノン除草剤に耐性なサトウダイコン植物 - Google Patents

Description

関連出願に対するクロス−リファレンス
本出願は、１９９６年７月１７日に出願された出願第０８／６８３，５３３号の一部継続である。
発明の背景
（１）発明の概要
本発明は、雑草の防除に用いられるイミダゾリノン除草剤とスルホニル尿素除草剤の両方に耐性であるサトウダイコン植物（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）の作製方法に関する。特に、本発明は、培地中の細胞と共にこれらの除草剤を逐次用いて、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）としても知られるアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）をコードする遺伝子の突然変異によって、感受性サトウダイコンから誘導されるサトウダイコン植物に関する。
（２）関連技術の説明
先行技術は、米国特許第５，０１３，６５９号；第５，１４１，８７０号及び第５，３７８，８２４号に記載されているような組換え手段によるアセトラクテートシンターゼ遺伝子の遺伝的変化を述べている。サトウダイコン植物のこの種類の修飾は第５，３７８，８２４号特許の実施例ＩＶに示されている。結果は、除草剤耐性に関して正確に繁殖する植物の作製において決して満足できるものではなかった。
Ｓａｕｎｄｅｒｓ等も、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２：１３５７〜１３６０（１９９２）において、除草剤を含有する培地における突然変異細胞を選択することによる感受性の自家受精可能なクローン（ＲＥＬ−１）からの、スルホニル尿素に耐性であるサトウダイコン植物（ＣＲ１−Ｂ）の作製を述べている。種々な耐性植物が作製され、交雑されている。Ｈａｒｔ等（Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４０：３７８〜３８３（１９９２）；及びＷｅｅｄ Ｓｃｉ．４１：３１７〜３２４（１９９３））はさらに、耐性系統を特徴付けて、耐性が変化したＡＬＳ活性によるものであり、他のＡＬＳ阻害性除草剤に対する交差耐性を示さず、単一の半優生遺伝子によってコードされると結論した。
サトウダイコン植物におけるＡＬＳを修飾することによって得られるイミダゾリノン耐性を述べている刊行物は存在しない。この耐性を有する種々なトウモロコシ系統が、Ｎｅｗｈｏｕｓ等の，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８３：６５〜７０（１９９１）によって述べられているように、開発されている。
作物保護の商業的ルートは例えばヨーロッパ特許第３７５，８７５号に述べられているような、臨床的“安定剤(safener)”の使用である。この方法は他の化学物質(chemical)を土壌中に導入する。好ましい方法は、イミダゾリノン除草剤とスルホニル尿素除草剤とに耐性であるサトウダイコン植物を開発することである。
目的
それ故、サトウダイコン植物にイミダゾリノン除草剤とスルホニル尿素除草剤の両方に対する耐性を、この耐性をコードするアセトラクテートシンターゼ遺伝子の突然変異によって与える方法を提供することが、本発明の目的である。さらに、これらの除草剤に対して耐性であるサトウダイコン植物を提供することが、本発明の目的である。これらの目的及び他の目的は以下の説明と図面とを参照することによってますます明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、イミダゾリノン及びスルホニル尿素に耐性なサトウダイコン植物９３Ｒ３０Ａ又はＢを作製するための本発明の方法の概略図である。Ｒ＝耐性；ＩＭ＝イミダゾリノン；Ｓ＝感受性；ＳＵ＝スルホニル尿素；Ｓｕｒ＝ＳＵ−Ｒ、ＴＰ−Ｒ及びＩＭ−Ｓに関して優生なＡＬＳ対立遺伝子；ＳＢ＝ＳＵ−Ｒ、ＴＰ−Ｒ及びＩＭ−Ｒに関して優生なＡＬＳ対立遺伝子；ＴＰ＝トリアゾロピリミジン。９３Ｒ３０ＢはＳＵ−Ｒ及びＩＭ−Ｒ及びＴＰ−Ｒである。９３Ｒ３０（９３Ｒ３０Ｂではない）はＳｕｒ対立遺伝子（ＳＵ−Ｒ、ＩＭ−Ｓ）に関してホモ(homozygous)である。これはイミダゾリノン耐性を得るための出発物質であった。
図２は、突然変異サトウダイコン植物の作製における詳細な工程を示すフローダイヤグラムである。
図３は、イマゼタピル(imazethapyr)に対する９３Ｒ３０Ｂ耐性に関するＡＬＳアッセイを示すグラフである。
図４は、野生型（ｗｔ）の３種類の突然変異サトウダイコン（Ｓｉｒ−１３、Ｓｕｒ及びＳＢ）に関して観察されるアミノ酸置換と対応する除草剤耐性とを示すチャートである。植物における除草剤耐性の一因であると文献に報告されたアミノ酸残基のみを含める。一文字のアミノ酸コードは次の通りである：Ａ＝アラニン、Ｐ＝プロリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｓ＝セリン、及びＴ＝トレオニン。四角に囲まれた文字は野生型配列からの変化を意味した。
図５Ａ〜５Ｄは、発芽後に施用されたイマゼタピルに対するサトウダイコン植物全体の反応を示す写真である。
図６Ａ〜６Ｄは、発芽後に施用されたＡＣ２９９，２６３に対するサトウダイコン植物全体の反応を示す写真である。
図７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのイマゼタピルに対するＡＬＳ酵素の反応を示す写真である。
図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるフメツラム(fumetsulam)に対するＡＬＳ酵素の反応を示す写真である。
図９Ａ〜９Ｄは、発芽後に施用されたクロロスルフロンに対するサトウダイコン植物全体の反応を示す写真である。
図１０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるクロロスルフロンに対するＡＬＳ酵素の反応を示す写真である。
好ましい実施態様の説明
本発明は、シンターゼをコードする突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子を有する突然変異細胞から成るサトウダイコン植物材料であって、該突然変異細胞がイミダゾリノン除草剤とスルホニル尿素除草剤の両方に対する耐性を有し、該耐性が細胞から作製される植物の慣用的な交雑によって伝えられる上記サトウダイコン植物材料に関する。
さらに、本発明は、サトウダイコン植物に除草剤耐性を生じる方法であって、スルホニル尿素除草剤に対してホモ耐性(homozygous resistance)を有するサトウダイコンの第１細胞を培地中においてイミダゾリノン除草剤に暴露させる工程と；両方の除草剤に対する耐性を有する第２細胞を選択する工程とを含み、該耐性を第２細胞を含む植物の交雑によって伝えることができる上記方法に関する。
最後に、本発明は、サトウダイコン植物に除草剤耐性を与える方法であって、培地中のスルホニル尿素除草剤に対してホモ耐性を有するサトウダイコン植物の第１細胞を培地中においてイミダゾリノン除草剤に暴露させる工程と；両方の除草剤に対する耐性を有する第２細胞を選択する工程と；該第２細胞から、これらの除草剤に対する耐性を有する第１植物を生長させる工程と；第１植物を第２植物と交雑させて、これらの除草剤に対する耐性を有する交雑植物(crossed plant)を作製する工程とを含む上記方法に関する。
サトウダイコン植物ＲＥＬ−１（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ−１）は、Ｄｒ．Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，研究遺伝学者、合衆国農業省（ミシガン州，Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ）から入手可能であり、１９８７年に放出された。これは無料で入手可能である。ＲＥＬ−１は図１に示すようにイミダゾリノン（ＩＭ−Ｓ）、スルホニル尿素（ＳＵ−Ｓ）及びトリアゾロピリミジンスルホンアニリド（ＴＰ−Ｓ）除草剤に対して感受性（Ｓ）である。
カルス培養物と懸濁培養物とを用いて、イミダゾリノン耐性とスルホニル尿素耐性（ＩＭ−ＲとＳＵ−Ｒ）に関してヘテロ(heterozygous)であった系統を発生させた。この細胞系統（種子）はブタペスト条約の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９６年５月６日にＡＴＣＣ９７５３５として寄託されており、本明細書では９３Ｒ３０Ｂと呼ぶ。この細胞系統は名称と数によって請求すれば入手可能である。選りすぐったサトウダイコン植物系統、特にＢｅｔａ Ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．栽培することにより、特に商業的に有用な、耐性サトウダイコン植物を作製することができる。
イミダゾリノン除草剤（特にイマゼタピル）とスルホニル尿素除草剤（クロルスルフロン）とに耐性なサトウダイコン植物は、サトウダイコン栽培領域における除草剤の使用からの土壌残留物問題を解決する。現在、除草剤の使用とサトウダイコン植物を栽培するためのその畑の次の使用との間には、４０か月の待機期間が存在する。第二に、高レベルのイミダゾリノン及びスルホニル尿素耐性は、サトウダイコン中の雑草防除のためのイミダゾリノン除草剤の使用を可能にする。
下記実施例は、図１に説明したような、新規なサトウダイコン植物９３Ｒ３０Ｂの単離と栽培とを示す。
実施例１
１．イミダゾリノン及びスルホニル尿素耐性サトウダイコン変異体９３Ｒ３０Ｂの選択
材料の説明
Ｒｅｌ−１：（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ−１）は、スルホニル尿素に対する除草剤耐性な突然変異体に関して最初の細胞を選択するために用いられる、高度に再生可能な、雄性の繁殖可能な(male fertile)サトウダイコン系統であり、大抵の実験に感受性対照として用いられる。
ＣＲ１−Ｂ：このサトウダイコン単離物は、クロルスルフロン含有培地上でＲｅｌ−１細胞をプレーティング(plating)することによって、開発された。この変異体はトリアゾロピリミジン除草剤のフルツラムに対して普通に耐性であると共に、スルホニル尿素除草剤耐性であるが、イミダゾリノン耐性ではない。この変異体はＳａｕｎｄｅｒｓ等（Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３２：１３５７〜１３６０）とＨａｒｔ等（Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４０：３７８〜３８３と４１：３１７〜３２４）によって述べられている。このＳＵ耐性遺伝子はＳｕｒとラベルされている。
９３Ｒ３０Ｂ：この単離物は、高度に再生可能で、Ｓｕｒホモのサトウダイコン植物（ＣＲ１−Ｂの子孫）の細胞をイマゼタピル含有培地上でプレーティングすることによって開発された。
ＥＬ−４９：１９９３年にＵＳＤＡによって放出されたＥａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ ４９。スルホニル尿素耐性のイマゼタピル感受性対照として用いられた、Ｓｕｒ遺伝子に関してホモなサトウダイコン系統。
ａ．植物は、高いサイトキニン条件（Ｂ１培地中）下でカルスを形成し、カルスから苗条を再生する植物の能力に基づくソマクローナル(somaclonal)選択に関して、供給源材料として選択した。
Ｂ１培地のプロトコール
３０ｇ／ｌのスクロース
１００ｍｇ／ｌのｍｙｏ−イノシトール
１．６５ｇ／ｌのＮＨ₄ＮＯ₃
１．９０ｇ／ｌのＫＮＯ₃
０．４４ｇ／ｌのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ
０．３７ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．１７ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄
６．２ｍｇ／ｌのＨ₃ＢＯ₃
１６．８ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ
１０．６ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．８８ｍｇ／ｌのＫＩ
０．２５ｍｇ／ｌのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ
０．０２５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ
０．０２５ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ
３７．３ｍｇ／ｌのＮａ₂ＥＤＴＡ
２７．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
１ｍｇ／ｌのチアミン
０．５ｍｇ／ｌのピリドキシン
０．５ｍｇ／ｌのニコチン酸
１ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン
ｐＨ ５．９５
Ｂ１固体培地を９ｇ／ｌの植物培養寒天と共にオートクレーブ処理し、
選択スキームのための必要に応じて、フィルター滅菌した除草剤ストック溶液によって改変した。寒天培地を１５ｘ１００ｍｍ使い捨て式プラスチックペトリ皿に注入した。
Ｂ１液体培地を４０ｍｌアリコート中で、１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに加えて、液体懸濁培養に用いるためにオートクレーブ処理した。
イミダゾリノン耐性変異体、９３Ｒ３０Ｂを選択するための供給源材料は９３Ｒ３０（ＣＲ１−Ｂに由来するＳｕｒホモ接合体）であった。
特に：
１．クロルスルフロン上での生長能力に関して選択された、Ｒｅｌ−１からの細胞（ＳＵ−Ｓ、ＩＭ−Ｓ、ＴＰ−Ｓ）を培養に加え、植物を再生させた、ＣＲ１−Ｂ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ等，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３２：１３５７〜１３６０（１９９２）に記載）。
２．ＣＲ１−Ｂを２９３（より典型的なビート）と交雑させ、Ｆ１自己増殖した(F1 selfed)、ＳＵ−Ｒ、ＩＭ−Ｓ、ＴＰ−Ｒに関してホモの植物を同定した。この説明を満たすＥＬ−４９として知られる植物は１９９３年にＳａｕｎｄｅｒｓによって放出された（この遺伝子はＳｕｒと呼ばれ、これはこの遺伝子に関してホモであった）。
３．あとで、Ｓｕｒに関してホモの、ＣＲ１−Ｂの子孫をそれらが培養から植物を再生する能力に関して選択した。次に、これらを培養におけるイマゼタピル選択に関する供給源材料（例えば、９３Ｒ３０）として用いた。
４．上記選択から、９３Ｒ３０Ａ及び９３Ｒ３０Ｂとして知られる単離物を誘導し、植物を再生した。これらの植物はＣＲ１−ＢとＩＭ−Ｒとの特徴を有した。ＩＭ−Ｒの原因となる遺伝子はＳｕｒの変化形であるように思われ、ＳＢのアイデンティティ(identity)を与えられている。
供給源植物（９３Ｒ３０）の迅速に伸長する葉から、葉ディスク外植体を製造した。これらの葉を、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｔ−９２８０，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，ミズーリ州，セントルイス）を加えた１５％市販ブリーチによる連続２回の２０分間洗浄によって表面滅菌した（工程１）。葉を無菌脱イオン水によって２回すすぎ洗いした。葉ディスクを火炎滅菌した＃３コルク穴あけ器を用いて切断した。
葉ディスクを無菌で固体Ｂ１培地に載せた（工程２）。葉ディスクから砕けやすい白色カルス組織が増殖するまで、ディスクを暗所で３０℃において４〜８週間インキュベートした。カルス組織をピンセットで機械的に分離させ、次に、４０ｍｌの液体Ｂ１培地を含有する１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに移した（工程３）。低い強度の蛍光照明（３０μＥ／ｍ²ｓ）下で、フラスコを旋回運動シェーカー(gyratory shaker)に５０Ｈｚにおいて載せた。１週間後に、液体培養物を新たなＢ１培地によって継代培養した。
液体培養の開始後２週間目に、細胞塊を６０メッシュスクリーンを備えた細胞解離シーブ（Ｓｉｇｍａ ＣＤ−１）を用いて分離させた。細胞沈降後に液体培地の約２／３を除去した。工程４では、細胞を残留する培地中に再懸濁させ、１ｍｌのアリコートを５０ｎＭイマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ，ニュージャージー州，Ｗａｙｎｅ）除草剤を補充した固体Ｂ１培地上に均一に散布した。薄暗い蛍光（５〜１０μＥ／ｍ²ｓ）中で、プレートを覆って、８〜１２週間インキュベートした。
ｃ．５０ｎＭイマゼタピル濃度では、全ての感受性細胞は死亡した。この濃度において生存し、生長した細胞塊を可能な耐性変異体として同定した。工程５では、これらの細胞塊（直径１〜３ｍｍ）を除草剤を含まない新たなＢ１固体培地に移して、弱い光（１０〜２０μＥ／ｍ²ｓ）下で生長させた。各推定上の耐性変異体を個別に同定し、別々に維持した。
ｄ．工程６では、カルスから個々の苗条（単数又は複数）が生長するまで、白色の砕けやすいカルスを４〜６週間毎に新たなＢ１固体培地にさらに小分けした。これらの苗条を苗条維持培地（Ｍ２０）に次のように移した：
Ｍ２０培地のプロトコール
３０ｇ／ｌのスクロース
１００ｍｇ／ｌのｍｙｏ−イノシトール
１．６５ｇ／ｌのＮＨ₄ＮＯ₃
１．９０ｇ／ｌのＫＮＯ₃
０．４４ｇ／ｌのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ
０．３７ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．１７ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄
６．２ｍｇ／ｌのＨ₃ＢＯ₃
１６．８ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ
１０．６ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．８８ｍｇ／ｌのＫＩ
０．２５ｍｇ／ｌのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ
０．０２５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ
０．０２５ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ
３７．３ｍｇ／ｌのＮａ₂ＥＤＴＡ
２７．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
１ｍｇ／ｌのチアミン
０．５ｍｇ／ｌのピリドキシン
０．５ｍｇ／ｌのニコチン酸
０．２５ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン
ｐＨ ５．９５
Ｍ２０固体培地を９ｇ／ｌの植物培養寒天と共にオートクレーブ処理し、選択スキームのための必要に応じて、フィルター滅菌した除草剤ストック溶液によって改変した。寒天培地を２０ｘ１００ｍｍ使い捨て式プラスチックペトリ皿に注入した。
苗条培養物を１０〜２０μＥ／ｍ²ｓの蛍光照明下に維持し、外科用メスによって苗条培養物を切断することによって増殖させた。候補の苗条培養物を増殖させ、以下で述べるように耐性レベルに関して評価した。
２．苗条培養物におけるイミダゾリノン、スルホニル尿素及びトリアゾロピリミジンスルホンアニリド耐性のレベル
工程７では、１ｎＭ〜０．１ｍＭの範囲内の対数的に増加する濃度のイミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素又はトリアゾロピリミジンスルホンアニリドを補充したＭ２０培地の各プレート上に３個の小さい、一致したサイズの苗条切片(shoot cuttings)を載せることによって、苗条培養物を除草剤耐性に関して評価した。９３Ｒ３０培養物反応を感受性対照（Ｒｅｌ−１）及びクロルスルフロン耐性、イミダゾリノン感受性対照（ＥＬ−４９）の苗条培養物の反応と比較した。苗条培養物を２０μＥ／ｍ²ｓの照明強度に２５℃において３週間維持した。選択培地(selective media)に移した後３週間目に苗条損傷と新たな重量とを評価することによって、苗条培養物反応を測定した。耐性Ｉ₅₀値（５０％損傷を惹起する除草剤濃度）の感受性Ｉ₅₀値に対する比率によって、除草剤耐性の大きさを評価した。
各変異体の交差耐性特徴を上記方法で、培地に用いた除草剤を変えることによって測定した。苗条培養において、表１に示すように、９３Ｒ３０Ｂはイマゼタピルに対して３６００倍の耐性レベル、クロルスルフロンに対して１０，０００倍の耐性を示し、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド除草剤、フルツラムに対して６０倍の交差耐性を示した。比較のために、ＥＬ−４９はイマゼタピルに対して僅か３倍のみの耐性レベルを示した。

３．植物再生と栽培
工程８では、９３Ｒ３０Ｂの苗条培養物を同様な方法で完全な植物に再生させた。先行する苗条継代培養後２週間目に、９３Ｒ３０Ｂ苗条を、４０ｍｌのＮ３発根培地(rooting media)を含有する１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに移した。
Ｎ３培地のプロトコール
３０ｇ／ｌのスクロース
１００ｍｇ／ｌのｍｙｏ−イノシトール
１．６５ｇ／ｌのＮＨ₄ＮＯ₃
１．９０ｇ／ｌのＫＮＯ₃
０．４４ｇ／ｌのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ
０．３７ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．１７ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄
６．２ｍｇ／ｌのＨ₃ＢＯ₃
１６．８ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ
１０．６ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．８８ｍｇ／ｌのＫＩ
０．２５ｍｇ／ｌのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ
０．０２５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ
０．０２５ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ
３７．３ｍｇ／ｌのＮａ₂ＥＤＴＡ
２７．８ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
１ｍｇ／ｌのチアミン
０．５ｍｇ／ｌのピリドキシン
０．５ｍｇ／ｌのニコチン酸
３ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸
ｐＨ ５．９５
Ｎ３培地を４０ｍｌのアリコート中で１２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに加え、９ｇ／ｌの寒天（０．４５ｇ）を各フラスコに加え、苗条培養物の発根(rooting)に用いるためにオートクレーブ処理した。次に、培養物を２５℃における中程度光強度（４０〜６０μＥ／ｍ²ｓ）下の２４時間／日照明に移した。根は一般に６〜８週間後に形成された。
工程９では、発根した苗条（Ｒ₀世代）を次に温室内のＢａｃｃｔｏ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｐｅａｔ Ｃｏ．，テキサス州，ヒューストン）鉢植え用ミックス(potting mix)に移した。工程１０では、９３Ｒ３０Ｂ再生体のＲ₀植物を２９３と呼ばれる滑らかな根(smooth-root)のサトウダイコン又はＲＥＬ−１と交雑させた。これらの交雑からのＦ₁種子を自家受精させて、Ｆ₂種子を得た。イミダゾリノン耐性が優生又は半優生の単性特徴(monogenic trait)であることが推定された。イミダゾリノン及びスルホニル尿素耐性のＦ₁植物の自家受精から生じたＦ₂世代植物は、イミダゾリノン耐性とスルホニル尿素耐性の両方に関して、１ホモ耐性：２ヘテロ耐性：１ホモ感受性の比率で分離する筈である。
イミダゾリノン耐性が９３Ｒ３０Ｂにおける優生特徴であることを証拠が示唆している。この結論は、９３Ｒ３０Ｂと除草剤感受性の雄性繁殖性サトウダイコン系統２９３又はＲｅｌ−１との間の交雑のＦ₁子孫がＩＭ−Ｒ又はＩＭ−Ｓに関して１：１形式で分離することを調べた証拠に基づく。同様に、現在までに試験された全てのＦ₂又は戻し交雑(Backcross)（ＢＣ₁）植物では、ＩＭ−ＲとＳＵ−Ｒとが同時分離する(cosegregate)。このことは、これらの２つの耐性が、同じＡＬＳ対立遺伝子への分離変化のために、結合していることを示唆する。Ｆ₁植物がイマゼタピル又はクロルスルフロンに対して耐性であるか又は感受性であるかは、非破壊的葉ディスク伸長アッセイ(expansion assay)を用いて判定されている。アッセイプロトコール
このプロトコールは、温室内の発芽後のビートに噴霧する必要なく、ビートのステータス(status)を耐性又は感受性と早期に判定するために除草剤耐性に関してビート分離(beets segregating)をスクリーニングするように設計された非破壊試験である。
１．植物から新たに伸長した葉を切り取った（少なくとも第４真葉(the 4th true leaf)。
２．この葉を、１５％市販ブリーチ＋０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００による２回の２０分間洗浄によって表面滅菌し，次に、無菌蒸留水によって２回すすぎ洗いした。
３．葉ディスク外植体を火炎滅菌した＃３コルク穴あけ器を用いて切断した。
４．葉ディスクを除草剤を含まないＢ１培地、１００ｎＭイマゼタピルを含むＢ１培地又は１００ｎＭクロルスルフロンを含むＢ１培地に移した。単一プレートによって４サンプルが試験されるように、プレートを４区分に分割した。４〜５枚の葉ディスクを各サンプルの各プレートに加えた。
５．弱い光（約１０μＥ／ｍ²ｓ）下で、プレートを覆って、２５℃において４〜７日間インキュベートした。
６．耐性サンプルは、それらが選択培地上で生活し、伸長する能力によって同定した。感受性サンプルは伸長せず、黄色〜褐色に変化する。効果を無除草剤培地上に載せた葉ディスクの伸長に比較して、ディスク伸長の予想レベルの正確な測定を保証した。
４．イマゼタピルに対するＡＬＳターゲット酵素反応
温室栽培されたサトウダイコン植物の迅速に伸長する葉からＡＬＳを部分的に精製するために、標準方法を用いた（Ｈａｒｔ等，Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：３７８〜３８３（１９９２））。ヘテロ９３Ｒ３０ＢＦ₁植物と、Ｒｅｌ−１Ｓ₁種子とからの抽出物を、対数的に増加する濃度のイマゼタピルの存在下でのＡＬＳ活性に関して分析した。ＲＥＬ−１及び９３Ｒ３０Ｂのサトウダイコン系統の葉抽出物からＡＬＳ活性を測定した。植物を温室内で上述のように４〜６葉段階まで栽培した。新鮮な抽出物からのＡＬＳ活性を対数的に増加する濃度のイマゼタピルとクロルスルフロンの存在下で測定した。用いた方法と操作とは、Ｒａｙ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７５：８２７〜８３１（１９８４））とＳｈａｎｅｒ等（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７６：５４５〜５４６（１９８４））とが略述しているものから改変したものである。１０ｇのサトウダイコン葉を４０ｍｌの冷ホモジナイゼーション緩衝剤（０．１Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭチアミンピロホスフェート、１０μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド、１０容量％グリセロール）＋２．５ｇのポリビニルポリピロリドン中でホモジナイズした。ホモジネートを８層のチーズクロスに通して瀘過して、２７，０００ｇにおいて２０分間遠心分離した。上澄み液を取り出し、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄によって５０％飽和させた。この溶液を０℃に１時間維持してから、１８，０００ｇにおいて１５分間遠心分離し、ペレットを１ｍｌの再懸濁緩衝剤（０．１Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５、２０ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中に再溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＰＤ−１０⁵カラム上で脱塩した。この酵素抽出物を直ちに分析した。
０．２ｍｌの酵素標本(enzyme preparation)（再懸濁緩衝剤によって３：１に希釈したもの）を１．３ｍｌの反応緩衝剤（２５ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、０．６２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．６２５ｍＭチアミンピロホスフェート、１．２５μＭフラビンアデニンジヌクレオチド）に加えて、３５℃において１時間インキュベートすることによって、ＡＬＳ活性を測定した。反応混合物は最終濃度の０、４、４０、４００、４０００、４００００、４０００００若しくは４００００００ｎＭのイマゼタピル又は０、０．９、９、９０、９００、９０００、９００００ｎＭクロルスルフロンを含有した。５０μｌの６Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を加えて、６０℃において１５分間インキュベートすることによって、反応を停止させた。Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄが述べている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６：４９５〜５０２（１９４５））この操作はまた、ＡＬＳ酵素生成物、アセトラクテートを脱炭酸して、アセトインを形成する。２．５Ｎ ＮａＯＨ中の２．５重量％α−ナフトールと０．２５重量％のクレアチン，１ｍｌを加えて、６０℃において１５分間インキュベートすることによって、着色したアセトイン複合体が形成された。
購入したアセトインを比色反応の基準として用いた。５３０ｎｍにおける反応溶液の吸收を測定することによって、アセトイン濃度を決定した。各除草剤による実験を各々において３回の反復実験で繰り返した。抽出物のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４（１９７６））によって、標準曲線のためにウシ血清アルブミンを用いて測定した。
実験は２回行って、処置は３回繰り返した。図３は９３Ｒ３０Ｂと感受性Ｒｅｌ−１とからのＡＬＳ抽出物の反応を示す。９３Ｒ３０Ｂは酵素レベルのイマゼタピルに対して１７５０倍レベルの耐性を示す（耐性系統と感受性系統とのＩ₅₀の比率によって算出）。
５．ＡＬＳ遺伝子コピー数
サザン・ブロット分析を行って、感受性サトウダイコン中に存在するＡＬＳ遺伝子コピー数を測定した。ゲノムＤＮＡをオリジナルＳｉｒ−１３突然変異体に由来する感受性Ｆ₃植物から単離して、一般に行われる方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９１））を用いて分析した。同様に、市販のサトウダイコン系統(variety)からのゲノムＤＮＡを分析した。両方のサトウダイコン系統において、ＡＬＳ遺伝子の単一コピーが検出された。このデータは、ホモ突然変異体型サトウダイコンの全てのＡＬＳ酵素活性が耐性酵素形から成ることを実証すると考えられる。このことはまた、９３Ｒ３０Ｂ単離物中に観察されるＳＢ変化がＳｕｒ ＡＬＳ対立遺伝子の変化形であるという考えを支持する。このことは以下に述べるように立証された。
６．ＡＬＳ遺伝子突然変異
ＡＬＳ酵素耐性の分子的根拠を知るために、以前に報告された除草剤耐性突然変異の全てが生じている、ＡＬＳ遺伝子の２領域を配列決定するために、標準方法を用いた（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９１））。サトウダイコンＡＬＳ遺伝子は以前に配列決定されており（米国特許第５，３７８，８２４号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーは、植物除草剤耐性の以前に報告されたケースの原因である遺伝子の２領域を増幅するように設計した。ＳＵ−Ｒ ＩＭ−Ｓ ＴＰ−Ｒ（Ｓｕｒ）、ＳＵ−Ｒ ＩＭ−Ｒ ＴＰ−Ｒ（ＳＢ）及び感受性（Ｒｅｌ−１）サトウダイコンからの配列データの比較は、９３Ｒ３０Ｂの除草剤耐性特徴がＡＬＳ遺伝子における２つの独立した突然変異によるものであることを実証した。
ＳＵ−Ｒ ＩＭ−Ｓ ＴＰ−Ｒ（Ｓｕｒ）を惹起する突然変異は、ヌクレオチド配列の位置５６２におけるシトシンからチミンへの単一ヌクレオチド変化の結果であり、これはサトウダイコンＡＬＳアミノ酸配列の位置１８８におけるプロリンに代わるセリン置換を生じる。この部位は今までに、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｈａｕｇｈｎ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１１：２６６〜２７１（１９８８））、タバコ（Ｌｅｅ等，ＥＭＢＯ Ｊ．７：１２４１〜１２４８（１９８８））及び酵母（米国特許第５，３７８，８２４号）におけるスルホニル尿素耐性に関連づけられている。試験したＡＬＳ遺伝子の２領域における野生型ヌクレオチド配列からの他の塩基変化は観察されなかった。
ＳＵ−Ｒ ＩＭ−Ｓ ＴＰ−Ｒ（ＳＢ）を惹起する突然変異は、ＡＬＳヌクレオチド配列における２つの独立した突然変異の結果であり、これは２つの異なるアミノ酸変化をもたらす。第１変化は上記Ｓｕｒ突然変異と同じである。この観察は、サトウダイコン（９３Ｒ３０）がＩＭ−Ｒ選択のための出発物質として用いられたので、予想された。この点突然変異の他に、位置３７７におけるグアニンからアデニンへの付加的な単一ヌクレオチド変化が観察された。この第２突然変異はサトウダイコンＡＬＳアミノ酸配列の位置１１３におけるアラニンに代わるトレオニン置換を生じる。この部位は今までに、オナモミ(cocklebur)におけるイミダゾリノン耐性（Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１７３８１〜１７３８５（１９９５））と酵母におけるスルホニル尿素耐性（米国特許第５，３７８，８２４号）とに関連づけられている。試験したＡＬＳ遺伝子の２領域における野生型ヌクレオチド配列からの他の塩基変化は観察されなかった。
下記情報は、可能なＡｌａ₁₁₃→Ｔｈｒ突然変異とＰｒｏ₁₈₈→Ｓｅｒ突然変異との除草剤耐性相乗作用を示す。
ＳＢサトウダイコンＡＬＳ遺伝子二重突然変異は、単一突然変異体サトウダイコンの各々（即ち、ＳｕｒとＳｉｒ−１３）によって個別に与えられる、化学的ファミリー(chemical family)の組合せに対する除草剤耐性を生じる。図４は、２つの単一突然変異（ＳｕｒとＳｉｒ−１３）と二重突然変異体（ＳＢ）との基本的ファミリー交差耐性特徴(basic family cross resistance characteristics)を表示する。図４に示したアミノ酸は、植物のＡＬＳ阻害除草剤耐性に関与すると文献に報告された５つの絶対保存残基(strictly conserved residue)を表す。二重突然変異体酵素（及び対応植物）内の独立した突然変異の相互作用は特有(unique)である。Ｓｉｒ−１３アミノ酸置換（Ａｌａ₁₁₃→Ｔｈｒ）によって見られるＩＭ−特異的耐性と、Ｓｕｒ置換（Ｐｒｏ₁₈₈→Ｓｅｒ）によって観察されるＳＵ耐性及びＴＰ耐性との組合せは、３種類の全ての除草剤化学に耐性なサトウダイコン９３Ｒ３０Ｂ（ａ．ｋ．ａ．ＳＢ）を生ずる。
しかし、耐性は加算的ではない。その代わり、突然変異はイミダゾリノン除草剤のイマゼタピルとＡＣ２９９，２６３に対する耐性に関して相乗的である。この現象は図５と６では視覚によって、表２では量的に知ることができる。

単一突然変異サトウダイコン、ＳｕｒとＳｉｒ−１３は、イマゼタピルに対して３倍と１００倍の耐性を示す；これに対して、二重突然変異体、ＳＢは、完全植物に発芽後に施用したときに除草剤に対して３００倍の耐性を示す。この相乗作用のサポートは、突然変異体の各々からのＡＬＳ酵素のイマゼタピルに対する反応の観察によって与えられる（図７）。この場合にも、単一突然変異体、Ｓｕｒ（１Ｘ）とＳｉｒ−１３（４０Ｘ）単独に対して二重突然変異体、ＳＢ（＞１０００Ｘ）には、除草剤に対する相乗的耐性が存在する。
同様な相乗作用がＴＰクラスの除草剤に対しても見られる。単一突然変異体、ＳｕｒとＳｉｒ−１３の苗条耐性はそれぞれ４０Ｘと１Ｘであり、二重突然変異体、ＳＢの苗条耐性は６０Ｘである。ＡＬＳ酵素データは、単一突然変異体ＳｕｒとＳｉｒ−１３のフルメツラムに対するそれぞれ５０Ｘと３Ｘ耐性と、二重突然変異体、ＳＢの２００Ｘ耐性とによって、この相乗作用観察を支持する（図８）。ＳＢに観察された第２突然変異は実際には、完全植物レベルにおいて観察されたクロルスルフロン（ＳＵクラス除草剤）に対する耐性を弱める（図９）。クロルスルフロンに対して、ＳＢ二重突然変異体の完全植物耐性（２０Ｘ）は、ＳＵ耐性遺伝子、Ｓｕｒ（Ｐｒｏ₁₈₈→Ｓｅｒ）（＞１０００Ｘ耐性）に対するＳｉｒ−１３同等突然変異（Ａｌａ₁₁₃→Ｔｈｒ）（１Ｘ耐性）の付加によって５０分の１より更に減ぜられている（表２）。Ｓｕｒ単一突然変異体とＳＢ二重突然変異体との間の拮抗作用の原因は今のところ不明である。ＡＬＳ酵素レベルにおいて、相乗的耐性がクロルスルフロンによっても観察される（図１０）。
イミダゾリノン耐性に関する選択を最初に達成することができ、次にスルホニル尿素耐性を得ることができることが理解されるであろう。
上記説明が本発明の例示に過ぎないこと、及び本発明が以下の添付請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。図４のアミノ酸配列は配列番号：１、２、３及び４に示される。
付録Ｉ
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：Ｄｏｎａｌｄ Ｐｅｎｎｅｒ、Ｔｅｒｒｙ Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔ
（ii）発明の名称：イミダゾリノン除草剤に耐性なサトウダイコン
（iii）配列数：４
（iv）通信先住所：
（Ａ）宛先人：Ｉａｎ Ｃ．ＭｃＬｅｏｄ
（Ｂ）街：２１９０ Ｃｏｍｍｏｎｓ Ｐａｒｋｗａｙ
（Ｃ）市：Ｏｋｅｍｏｓ
（Ｄ）州：Ｍｉｃｈｉｇａｎ
（Ｅ）国：ＵＳＡ
（Ｆ）郵便番号：４８８６４
（ｖ）コンピューター読み取り形：
（Ａ）媒体型：Ｄｉｓｋｅｔｔｅ、５．２５インチ、３６０ｋｂストレージ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパーティブル
（Ｃ）操作系：ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：Ｗｏｒｄｐｅｒｆｅｃｔ ５．１
（vi）現在出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）先行出願データ：
（Ａ）出願番号：０８／６８３，５３３
（Ｂ）出願日：１９９６年７月１７日
（viii）代理人情報：
（Ａ）名称：Ｉａｎ Ｃ．ＭｃＬｅｏｄ
（Ｂ）登録番号：２０，９３１
（Ｃ）参照／文書番号：ＭＳＵ４．１−３４４
（ix）電信情報：
（Ａ）電話：（５１７）３４７−４１００
（Ｂ）ファックス：（５１７）３４７−４１０３
（Ｃ）テレックス：なし
（２）配列番号：１の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：５
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（Ａ）説明：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチ−センス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：サトウダイコン
（Ｂ）株名：ｗｔ
（Ｃ）個体・単離クローン名：
（Ｄ）細胞の種類：Ｎ／Ａ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：
（Ｂ）存在位置：
（Ｃ）同定方法：配列決定
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列：配列番号：１：

（３）配列番号：２の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：５
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（Ａ）説明：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチ−センス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：サトウダイコン
（Ｂ）株名：Ｓｉｒ−１３
（Ｃ）個体・単離クローン名：Ｎ／Ａ
（Ｄ）細胞の種類：Ｎ／Ａ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：
（Ｂ）存在位置：
（Ｃ）同定方法：配列決定
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列：配列番号：２：

（４）配列番号：３の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：５
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（Ａ）説明：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチ−センス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：サトウダイコン
（Ｂ）株名：Ｓｕｒ
（Ｃ）個体・単離クローン名：Ｎ／Ａ
（Ｄ）細胞の種類：Ｎ／Ａ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：
（Ｂ）存在位置：
（Ｃ）同定方法：配列決定
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列：配列番号：３：

（５）配列番号：４の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：５
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：
（Ａ）説明：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iv）アンチ−センス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：サトウダイコン
（Ｂ）株名：９３Ｒ３０Ｂ
（Ｃ）個体・単離クローン名：Ｎ／Ａ
（Ｄ）細胞の種類：Ｎ／Ａ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：
（Ｂ）存在位置：
（Ｃ）同定方法：配列決定
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列：配列番号：４：

Claims (14)

1. ヌクレオチドが位置５６２においてシトシンからチミンに、かつ位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されている突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子であって、該シンターゼをコードする上記遺伝子を有する突然変異細胞から成るサトウダイコン植物材料であって、該突然変異細胞がイミダゾリノン除草剤とスルホニル尿素除草剤の両方に対する耐性を有し、該耐性が再生可能な該突然変異細胞から作製された植物の慣用的な交雑によって伝えられる、上記サトウダイコン植物材料。
2. ＣＲ１−Ｂと名付けられた、スルホニル尿素除草剤に対する耐性を有するが、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を有さない親サトウダイコン植物の感受性細胞から、該感受性細胞をイミダゾリノン除草剤を含む培地中で培養して、突然変異細胞を選択することによって、誘導されたものである、請求項１記載の材料。
3. ＡＴＣＣ９７５３５（９３Ｒ３０Ｂ）と名付けられた種子として寄託されている、請求項１記載の材料。
4. 種子又は植物としての、請求項１又は２に記載の植物材料。
5. サトウダイコン植物に除草剤耐性を生じさせる方法であって、
   （ａ）ヌクレオチドが位置５６２においてシトシンからチミンに、かつ位置３３７においてグアニンからアデニンに修飾されている突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子であって該シンターゼをコードする上記遺伝子を有するサトウダイコン親細胞を培地中においてイミダゾリノン除草剤に暴露する工程であって、該親細胞が培地中のスルホニル尿素除草剤に対する耐性に関してホモ特徴を有する上記工程と；
   （ｂ）両方の除草剤に対する耐性を有する誘導細胞を選択する工程と
   を含み、該耐性が誘導細胞を含む植物の交雑によって伝えられることができる上記方法。
6. 誘導細胞が、９３Ｒ３０（ＳｕｒＳｕｒ）と名付けられたサトウダイコン植物の親細胞から、９３Ｒ３０の細胞をイミダゾリノン除草剤に暴露することによって誘導される、請求項５記載の方法。
7. 誘導細胞が、種子としてＡＴＣＣ９７５３５（９３Ｒ３０Ｂ）で寄託されたものにより代表される、請求項５記載の方法。
8. サトウダイコンに除草剤耐性を与える方法であって、
   （ａ）培地中のスルホニル尿素除草剤に対してホモ耐性を有する、サトウダイコン植物の第１細胞を培地中においてイミダゾリノン除草剤に暴露する工程と；
   （ｂ）両方の除草剤に対する耐性を有する第２細胞を選択する工程と；
   （ｃ）該第２細胞から第１植物を生長させる工程であって、該植物が、ヌクレオチドが位置５６２においてシトシンからチミンに、かつ位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されている突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子であって、該シンターゼをコードする上記遺伝子によって、これらの除草剤に対して耐性を有する上記工程と；
   （ｄ）第１植物を第２植物と交雑させて、これらの除草剤に対する耐性を有する交雑植物を作製する工程と
   を含む上記方法。
9. 他のビートに除草剤耐性を与える方法であって、
   （ａ）培地中のスルホニル尿素除草剤に対してホモ耐性を有する、サトウダイコン植物の第１細胞を培地中においてイミダゾリノン除草剤に暴露する工程と；
   （ｂ）両方の除草剤に対する耐性を有する第２細胞を選択する工程と；
   （ｃ）該第２細胞から第１植物を生長させる工程であって、該植物が、ヌクレオチドが位置５６２においてシトシンからチミンに、かつ位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されている突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子であって、該シンターゼをコードする上記遺伝子によって、これらの除草剤に対して耐性を有する上記工程と；
   （ｄ）第１植物を第２植物と交雑させて、これらの除草剤に対する耐性を有する交雑植物を作製する工程と
   を含む上記方法。
10. 工程（ａ）における第１細胞が、９３Ｒ３０と名付けられたサトウダイコンから、９３Ｒ３０の細胞をイミダゾリノン除草剤に暴露することによって誘導される、請求項８記載の方法。
11. 第２細胞が、種子としてＡＴＣＣ９７５３５（９３Ｒ３０Ｂ）で寄託されたものにより代表される、請求項８記載の方法。
12. サトウダイコン植物と共に生長する雑草を防除する方法であって、
    （ａ）ヌクレオチドが位置５６２においてシトシンからチミンに、かつ位置３３７においてグアニンからアデニンに変更されている突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子であって、該シンターゼをコードする上記遺伝子を有する細胞を含有するサトウダイコン種子を畑にまく工程であって、該突然変異細胞がイミダゾリノン除草剤とスルホニル尿素除草剤の両方に対する耐性を有し、該耐性が、サトウダイコン植物を作製するための、該細胞から作製された植物の慣用的な交雑によって伝えられる上記工程と；
    （ｂ）畑の植物に対してイミダゾリノン除草剤を用いて、雑草を防除する工程と
    を含む上記方法。
13. 植物が、ＣＲ１−Ｂと名付けられた、スルホニル尿素除草剤に対する耐性を有するが、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を有さない親サトウダイコン植物の感受性細胞から、該感受性細胞をイミダゾリノン除草剤を含む培地中で培養して、突然変異細胞を選択することによって、誘導される、請求項１２記載の方法。
14. 植物がＡＴＣＣ９７５３５（９３Ｒ３０Ｂ）として寄託された種子に由来する、請求項１２記載の方法。

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