BRPI0810077B1 - Polipeptídeo da subunidade grande da acetohidroxiácido sintase, e, métodos para controlar ervas daninhas na adjacência de plantas cultivadas, para identificar ou selecionar uma célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma, e para combater vegetação indesejada - Google Patents

Polipeptídeo da subunidade grande da acetohidroxiácido sintase, e, métodos para controlar ervas daninhas na adjacência de plantas cultivadas, para identificar ou selecionar uma célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma, e para combater vegetação indesejada Download PDF

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(54) Título: POLIPEPTÍDEO DA SUBUNIDADE GRANDE DA ACETOHIDROXIÁCIDO SINTASE, E, MÉTODOS PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS NA ADJACÊNCIA DE PLANTAS CULTIVADAS, PARA IDENTIFICAR OU SELECIONAR UMA CÉLULA DE PLANTA TRANSFORMADA, TECIDO DE PLANTA, PLANTA OU PARTE DA MESMA, E PARA COMBATER VEGETAÇÃO INDESEJADA (51) Int.CI.: C12N 9/88; A01H 5/10; A01H 5/00; C12N 15/29; C12N 15/84 (30) Prioridade Unionista: 04/04/2007 US 60/910028 (73) Titular(es): BASF PLANT SCIENCE GMBH (72) Inventor(es): JOHN A. MCELVER; BIJAY K. SINGH
MANIFESTAÇÃO SOBRE O PARECER TÉCNICO NEGATIVO NO PEDIDO PI0810077-2 DE 03/04/2008 REQUERENTE: BASF PLANT SCIENCE GMBH TÍTULO: “POLIPEPTÍDEO DA SUBUNIDADE GRANDE DA ACETOHIDROXIÁCIDO SINTASE, E, MÉTODOS PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS NA ADJACÊNCIA DE PLANTAS CULTIVADAS, PARA IDENTIFICAR OU SELECIONAR UMA CÉLULA DE PLANTA TRANSFORMADA, TECIDO DE PLANTA, PLANTA OU PARTE DA MESMA, E PARA COMBATER
VEGETAÇÃO INDESEJADA”
R A Z Õ E S
I
A Requerente tomou ciência do parecer desfavorável publicado na Revista da Propriedade Industrial n° 2426, de 4 de julho de 2017, no qual a Digna Perícia considerou o presente pedido imprivilegiável devido à suposta falta de atividade inventiva à luz do estado da técnica.
Ademais, os artigos 18 (III), 22 e 25, da Lei 9.279/96 (LPI), também são citados como outros óbices à proteção requerida.
Entretanto, pelos motivos que passará a expor e pelas emendas ofertadas em anexo, a Requerente, respeitosamente, acredita que merecerá reforma a r. Decisão emanada desta Autarquia.
II
Documentos do Estado da Técnica Citados no Parecer Técnico
Desfavorável
Nas buscas realizadas pela Digna Perícia, os seguintes documentos do estado da técnica foram considerados relevantes:
D1 - US5853973, publicado em 29 de dezembro de 1998,
D2 - US5928937, publicado em 27 de julho de 1999,
D3 - US6576455, publicado em 10 de junho de 2003,
Petição 870170073273, de 28/09/2017, pág. 8/20
244). Herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia são amplamente usados na agricultura moderna devido a sua efetividade em taxas de aplicação muito baixas e relativa não-toxicidade em animais. Por meio da inibição da atividade de AHAS, estas famílias de herbicidas previnem o crescimento e o desenvolvimento adicional de plantas suscetíveis incluindo muitas espécies de ervas daninhas. Vários exemplos de herbicidas de imidazolinona comercialmente obteníveis são PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazaquina) e ARSENAL® (imazapir). Exemplos de herbicidas de sulfoniluréia são clorosulfuron, metsulfuron metila, sulfometuron metila, clorimuron etila, tifensulfuron metila, tribenuron metila, bensulfuron metila, nicosulfuron, etametsulfuron metila, rimsulfuron, triflusulfuron metila, triasulfuron, primisulfuron metila, cinosulfuron, amidosulfuon, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etila e halosulfuron.
Devido a sua elevada efetividade e baixa toxicidade, herbicidas de imidazolinona são preferidos para aplicação por meio de pulverização sobre o topo de uma ampla área de vegetação. A capacidade de pulverizar um herbicida sobre o topo de uma ampla faixa de vegetação diminui os custos associados com o estabelecimento e a manutenção de plantas, e diminui a necessidade de preparação de sítio antes do uso de referidos químicos. Pulverização sobre o topo de uma espécie tolerante desejada também resulta na capacidade de se obter potencial de rendimento máximo da espécie desejada devido à ausência de espécies competitivas. No entanto, a capacidade de se usar referidas técnicas de pulverização superior \spray-over\ depende da presença de espécies resistentes a imidazolinona da vegetação desejada na área de pulverização superior.
Entre as principais culturas agrícolas, algumas espécies leguminosas, como soja, são naturalmente resistentes a herbicidas de imidazolinona devido a sua capacidade de metabolizar rapidamente os compostos herbicidas (Shaner e Robinson (1985) Weed Sei. 33:469-471).
Outras culturas, como milho (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882886) e arroz (Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Herbicid.es, Academic Press, New York, pp. 195-220) são um tanto suscetíveis a herbicidas de imidazolinona. A sensibilidade diferencial aos herbicidas de imidazolinona é dependente da natureza química do herbicida particular e do metabolismo diferencial do composto de uma forma tóxica para uma não-tóxica em cada planta (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al. (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Outras diferenças fisiológicas de plantas, como absorção e translocação, também desempenham um papel importante sobre a sensibilidade (Shaner e Robinson (1985) Weed Sei. 33:469-471).
Plantas resistentes a imidazolinonas, sulfoniluréias, triazolopirimidinas, e pirimidiniloxibenzoatos foram produzidas com êxito mediante o uso de sementes, microesporos, pólen, e mutagênese de calos em Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (i.e., canola) Glycine max,
Nicotiana tabacum, beterraba açucareira (Beta vulgaris) e Oryza sativa (Sebastian et al. (1989) Crop Sei. 29:1403-1408; Swanson et al. 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:6570; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand et al. (1993) J. Heredity 84:91-96; Wright e Penner (1998) Theor. Appl. Genet.
96:612-620; Patente US n° 5.545.822). Em todos os casos, um único gene nuclear parcialmente dominante conferiu resistência. Quatro plantas de trigo resistentes à imidazolinona também foram isoladas previamente de acordo com mutagênese de sementes de Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886). Estudos de hereditariedade confirmaram que um único gene parcialmente dominante conferiu resistência. Com base em estudos alélicos, os autores concluíram que as mutações nas quatro linhas identificadas se localizaram no mesmo lócus. Um dos genes de resistência do cultivar Fidel foi denominado FS-4 (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886).
Modelagem feita em computador da conformação tridimensional do complexo AHAS-inibidor prediz vários aminoácidos no bolso de ligação do inibidor proposto como sítios em que mutações induzidas poderíam igualmente conferir resistência seletiva a imidazolinonas (Ott et al.
(1996) J. Mol. Biol. 263:359-368). Plantas de tabaco produzidas com algumas destas mutações projetadas racionalmente nos sítios de lítio propostos da enzima AHAS exibiram eficazmente resistência específica a uma única classe de herbicidas (Ott et al. (1996)7 Mol. Biol. 263:359-368).
A resistência de plantas a herbicidas de imidazolinona também 10 foi reportada em várias patentes, Patentes dos Estados Unidos nums. 4.761.373, 5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439 e 6.222.100 descrevem de uma maneira geral o uso de um gene de AHAS alterado para elicitar resistência a herbicidas em plantas, e revelam especificamente determinas linhas de milho resistentes a imidazolinona. A Patente US n°
5.013.659 revela plantas que apresentam resistência a herbicida devido a mutações em pelo menos um aminoácido em uma ou mais regiões conservadas. As mutações aqui descritas codificam, ou resistência cruzada a imidazolinonas e sulfoniluréias ou resistência específica a sulfoniluréia, mas a resistência específica a imidazolinona não é descrita. A Patente US n°
5.731.180 e a Patente US n° 5.767.361 discutem um gene isolado apresentando uma única substituição de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de AHAS de monocotiledôneas de tipo selvagem que resulta em resistência específica a imidazolinona. Adicionalmente, plantas de arroz que são resistentes a herbicidas que interferem com AHAS foram desenvolvidas por meio de cultivo de mutações e por seleção de culturas de tecidos. Ver Patentes US nums. 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796.
Em plantas, bem como em todos os outros organismos examinados, a enzima AHAS é constituída de duas subunidades: uma grande subunidade (papel catalítico) e uma pequena subunidade (papel regulador) (Duggleby e Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). A subunidade grande de AHAS (também referida aqui como AHASL) pode ser registrada por um único gene, como no caso de Arabidopsis, e da beterraba açucareira ou por meio de múltiplos membros da família de genes, como no milho, canola, e algodão. Substituições específicas de nucleotídeos simples na subunidade maior conferem à enzima um grau de insensibilidade a uma ou mais classes de herbicidas (Chang e Duggleby (1998) Biochem J. 333:765777).
Por exemplo, trigo para pão, Triticum aestivum L., contém três genes de subunidade grande homólogos de acetóxi-hidroxiácido sintase. Cada um dos genes apresenta significativa expressão herbicida com base na resposta a herbicidas e em dados bioquímicos de mutantes em cada um dos três genes (Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Espanha, Ref. No. SI0-17). As sequências codificantes de todos os três genes compartilham extensa homologia no nível dos nucletídeos (WO 03/014357). Por meio de sequenciamento dos genes de AHASL de diversas variedades de Triticum aestivum verificou-se que a base molecular da tolerância a herbicidas na maior parte de linhagens tolerantes a IMI (tolerantes a imidazolinona) é a mutação S653(/E)N, indicando uma substituição de serina por asparagina em uma posição equivalente à serina no aminoácido 653 em Arabidopsis thaliana (WO 03/014357). Esta mutação deve-se a um polimorfismo de nucleotídeo simples (“SNP”) na sequência de DNA que codifica a proteína AHASL.
Também sabe-se que múltiplos genes de AHASL também ocorrem em espécies de plantas dicotileôneas. Recentemente, Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) reportaram a identificação, clonagem, e sequenciamento para três genes de AHASL (AHASL 1, AELASL2, e AHASL3) de genótipos resistentes a herbicidas e de tipo selvagem de girassol (Helianthus annuus L.). Kolkman et al. reportaram que a resistência a herbicidas se devia, ou à substituição de Prol97Leu (usando a nomenclatura de posicionamento de aminoácidos de Arabidopsis AHASL) ou à substituição de Ala205Val na proteína AHASL 1, e que cada uma destas substituições proporcionou resistência a herbicidas, tanto imidazolinona como sulfoniluréia.
Conhece-se uma quantidade de mutações simples na subunidade grande de AHAS que resulta em tolerância ou resistência a herbicidas (Duggleby et al. (2000) Journal ofBiochem and Mol. Bio. 33:1-36; Jander et al. (2003) Plant Physiology 131:139-146). Por exemplo, uma substituição de alanina por valina na posição 122 de AHASL de Arabidopsis (ou uma substituição de alanina por treonina na posição correspondente 100 da AHASL do xântio) confere resistência a imidazolinona e sulfoniluréias. Uma substituição de metionina por ácido glutâmico ou isoleucina na posição 124 de AHASL de Arabidopsis confere resistência a imidazolinonas e sulfoniluréias. Uma substituição de prolina por serina na posição 197 de AHASL de Arabidopsis (ou uma substituição de prolina por alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, ou tirosina na posição correspondente 192 de AHASL de levedura) confere resistência a imidazolinonas, sulfoniluréias, e triazolopirimidina. Uma substituição de arginina por alanina ou ácido glutâmico na posição 199 de AHASL de Arabidopsis confere resistência a imidazolinona. Uma substituição de alanina por valina na posição 205 da AHASL de Arabidopsis (ou uma substituição de alanina por cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, treonina, triptofano ou tirosina na posição correspondente 200 de AHASL de levedura) confere resistência a imidazolinonas e sulfoniluréias. Uma substituição de quase qualquer aminoácido pelo o triptofano na posição 574 de AHASL de Arabidopsis, correspondendo à posição 586 de AHASL de levedura, confere resistência a imidazolinonas, sulfoniluréias, triazolopirimidina, e oxibenzoatos de pirimidila. Uma substituição de serina por fenilalanina, asparagina, ou treonina na posição 653 of AHASL de Arabidopsis confere resistência a imidazolinonas e oxibenzoatos de pirimidila.
As Patentes US nums. 5.853.973; 5.928.937; e 6.576.455 revelam métodos de modelagem baseados-em-estrutura para a preparação de variantes de AHAS que incluem substituições de aminoácidos em posições específicas que diferem das posições descritas acima. Em Mourad et al. (1992) Planta 188;491-497, mostrou-se que linhagens mutantes resistentes a sulfoniluréias são resistentes de forma cruzada à triazolopirimidina, e linhagens mutantes a imidazolinonas são resistentes de forma cruzada a oxibenzoatos de pirimidila.
A Patente US n° 5.859.348 revela uma subunidade grande de AHAS de beterraba açucareira mutante dupla apresentando uma substituição de alanina por treonina no aminoácido 113 e uma substituição de prolina por serina no aminoácido 188. Plantas de beterraba açucareira contendo a proteína AHAS mutante dupla como descritas são resistentes tanto a imidazolinona como a sulfoniluréia.
Mourad et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 242:178-184, revela um mutante duplo de AHAS de Arabidopsis denominado csrl-4. O AHAS mutante Ãcsrl-4 continha uma substituição do nucleotídeo C por T na posição 589 (correspondendo a uma substituição de prolina por serina no aminoácido 197 de AHASL de Arabidopsis) e uma substituição do nucleotídeo G por A na posição 1958 (correspondendo a uma substituição de serina por treonina no aminoácido 653 de AHASL de Arabidopsis).
Lee et al. (1988) EMBO Journal 7:1241-1248, revela um mutante duplo de AHAS do tabaco denominado S4-Hra, que inclui uma substituição Pro-Ala no aminoácido 196 (correspondendo ao aminoácido 197 de AHASL de Arabidopsis) e uma substituição Trp-Leu no aminoácido 573 (correspondendo ao aminoácido 574 de AHASL de Arabidopsis). Linhagens transgênicas portando o gene mutante duplo mostram resistência ao herbicida sulfoniluréia.
A Patente US n° 7.119.256 revela uma subunidade grande de AHAS de arroz mutante duplo apresentando uma substituição de triptofano por leucina no aminoácido 548 e uma substituição de serina por isoleucina no aminoácido 627. Plantas de arroz transgênicas expressando um polinucleotídeo codificando esta proteína AHAS mutante dupla foram reportadas como apresentando resistência ao herbicida de pirimidinil carbóxi, bispiribac-sódio.
Dada sua alta efetividade e baixa toxicidade, herbicidas de imidazolinona são preferidos para uso agrícola. No entanto, a capacidade de usar herbicidas de imidazolinona em um sistema de produção de cultura particular depende da disponibilidade de variedades resistentes a imidazolinona da planta cultivada de interesse. Para produzir referidas variedades resistentes a imidazolinona, permanece uma necessidade de plantas cultivadas compreendendo polipeptídios de AHAS mutantes que conferem demonstradamente maior tolerância a imidazolinonas e/ou outros herbicidas inibidores de AHAS quando comparado com plantas cultivadas com mutantes de AHAS existentes.
Embora alguns mutantes de AHAS tenham sido caracterizados, permanece uma necessidade de polipeptídios de AHAS mutantes que confiram, quando expressos em uma planta cultivada de interesse, demonstrada tolerância incrementada a herbicidas contra uma ou mais classes de herbicidas contendo AHAS quando comparados com mutantes de AHAS existentes em plantas cultivadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a novos polipeptídios de AHAS mutantes que demonstram tolerância a um herbicida, em particular, um herbicida de imidazolinona, ou herbicida de sulfoniluréia, ou uma mistura dos mesmos. Em concretizações preferidas, a tolerância a herbicida conferida pelos mutantes da invenção é aperfeiçoada e/ou incrementada relativamente àquela obtida usando-se mutantes de AHAS conhecidos. Os mutantes da invenção compreendem pelo menos duas substituições de aminoácidos no polipeptídio de subunidade grande de AHAS.
Em uma concretização, a invenção proporciona um polipeptídio isolado codificando um polipeptídio mutante duplo de subunidade grande de AHAS selecionado do grupo que consiste de um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO: 1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 139 da SEQ ID NO:1 ou posição 107 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma histidina em uma posição correspondente à posição 269 da SEQ ID NO:1 ou posição 237 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma metionina em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 426 da SEQ ID NO:1 ou posição 394 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma valina em uma posição correspondente à posição 430 da SEQ ID NO:1 ou posição 398 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 442 da SEQ ID NO:1 ou posição 410 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina ou ácido aspártico em uma posição correspondente à posição 445 da SEQ ID NO:1 ou posição 413 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 580 da SEQ ID NO:1 ou posição 548 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando a serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e a fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma asparagina em uma posição correspondente à posição 375 da SEQ ID NO:1 ou posição 343 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um polipeptídio apresentando uma valina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, treonina, triptofano, ou tirosina em uma posição correspondente à posição 205 da SEQ ID NO:1 ou posição 173 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2.
Em outra concretização, a invenção proporciona um polipeptídio isolado codificando um polipeptídio mutante triplo de subunidade grande de AHAS selecionado do grupo que consiste de um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição
621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da
SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição
199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma arginina em uma posição correspondente à posição 57 da
SEQ ID NO: 1 e uma leucina em uma posição correspondente à posição 398 da SEQ ID NO:1 ou posição 366 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma leucina em uma posição correspondente à posição 95 da SEQ ID NO:1 ou posição 63 da SEQ ID NO:2, um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2, uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e qualquer aminoácido em uma posição correspondente à posição 574 da SEQ ID NO:1 ou posição 542 da SEQ ID NO:2.
A invenção refere-se também a polipeptídios de AHASL compreendendo os mutantes duplos e triplos descritos acima, vetores de expressão compreendendo os polinucleotídeos codificando os mutantes duplos e triplos de AHASL descritos acima, células compreendendo os polinucleotídeos codificando os mutantes duplos e triplos de AHASL descritos acima, plantas transgênicas compreendendo os polinucleotídeos e polipeptídios descritos acima e métodos de preparar e usar plantas transgênicas compreendendo os polinucleotídeos codificando os mutantes duplos e triplos de AHASL descritos acima.
A invenção refere-se adicionalmente a plantas transgênicas e não-transgênicas compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo duas ou mais mutações. Em uma concretização, as plantas da invenção compreendem um primeiro polinucleotídeo codificando um primeiro polipeptídio mutante simples de AHASL e um segundo polinucleotídeo codificando um segundo polipeptídio mutante simples de AHASL, ou um polinucleotídeo codificando AHASL compreendendo duas mutações que resultam nas mutações de aminoácidos do primeiro e segundo polipeptídios mutantes simples de AHASL, sendo que referido primeiro e segundo polipeptídio mutante simples de AHASL são selecionados do grupo que consiste de: um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio que apresenta uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio que apresenta uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO: 1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 139 da SEQ ID NO: 1 ou posição 107 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma histidina em uma posição correspondente à posição 269 da SEQ ID NO:1 ou posição 237 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma metionina em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 426 da SEQ ID NO:1 ou posição 394 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisterna, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma valina em uma posição correspondente à posição 430 da SEQ ID NO:1 ou posição 398 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 442 da SEQ ID NO:1 ou posição 410 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma isoleucina ou ácido aspártico em uma posição correspondente à posição 445 da SEQ ID NO:1 ou posição 413 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 580 da SEQ ID NO:1 ou posição
548 da SEQ ID NO:2; um primeiro ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da
SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando a serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma asparagina em uma posição correspondente à posição 375 da SEQ ID NO:1 ou posição 343 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ
ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, treonina, triptofano, ou tirosina em uma posição correspondente à posição 205 da SEQ ID NO:1 ou posição 173 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2.
Em outra concretização, a invenção proporciona plantas transgênicas e não-transgênicas compreendendo um primeiro polinucleotídeo codificando um primeiro polipeptídio mutante simples de AHASL, um segundo polinucleotídeo codificando um segundo polipeptídio mutante simples de AHASL, e um terceiro polinucleotídeo codificando um terceiro polipeptídio mutante simples de AHASL; ou um polinucleotídeo codificando AHASL compreendendo três mutações, sendo que as três mutações de nucleotídeos resultam nas mutações de aminoácidos correspondentes às mutações de referidos primeiro, segundo e terceiro polipeptídio mutante simples de AHASL; ou um polinucleotídeo codificando AHASL compreendendo uma mutação simples e um polinucleotídeo codificando AHASL compreendendo uma [] duplas mutações, sendo que as mutações de nucleotídeos resultam nas mutações de aminoácidos correspondentes às mutações de aminoácidos de referidos primeiro, segundo e terceiro polipeptídio mutante simples de AHASL, sendo que referido primeiro, segundo, e terceiro polipeptídio mutante simples de AHASL são selecionados do grupo que consiste de: um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, um segundo polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e um terceiro polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, um segundo polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um terceiro polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ
ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, um segundo polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um terceiro polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, um segundo polipeptídio apresentando uma arginina em uma posição correspondente à posição 57 da SEQ ID NO:1 e um terceiro polipeptídio apresentando uma leucina em uma posição correspondente à posição 398 da SEQ ID NO:1 ou posição 366 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2, um segundo polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um terceiro polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma leucina em uma posição correspondente à posição 95 da SEQ ID NO:1 ou posição 63 da SEQ ID NO:2, um segundo polipeptídio apresentando um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da
SEQ ID NO:2 e um terceiro polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um primeiro polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2, um segundo polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e um terceiro polipeptídio apresentando qualquer aminoácido em uma posição correspondente à posição 574 da SEQ ID NO: 1 ou posição 542 da SEQ ID NO:2.
A presente invenção proporciona um método para controlar ervas daninhas nas imediações das plantas transgênicas e não-transgênicas da invenção. Referidas plantas compreendem resistência incrementada a herbicidas relativamente a uma planta de tipo selvagem. O método compreende aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de AHAS nas ervas daninhas e na planta da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 apresenta a sequência de comprimento pleno da proteína de subunidade grande de AHAS de Arabidopsis (sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1; sequência de ácido nucléico SEQ ID NO: 31) com tradução putativa apresentando posições de mutações indicadas em negrito e sublinhado. A numeração do DNA fica à esquerda, e a numeração de aminoácidos à direita.
A Figura 2 apresenta a sequência da proteína de subunidade grande de AHAS do milho (sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2; sequência de ácido nucléico SEQ ID NO: 32) com aminoácidos nas posições de mutações reivindicadas indicadas em negrito e sublinhado. A numeração do DNA encontra-se à esquerda, e a numeração de aminoácidos à direita.
A figura 3 é um alinhamento das posições de correspondência da proteína de subunidade grande de AHAS de Arabidopsis (AtAHASL, SEQ ID NO: 1) com a proteína de subunidade grande de AHAS de uma quantidade de espécies em que as mutações duplas e triplas da invenção podem ser realizadas mostrando a posição de substitutições que correspondem às posições de substituição na SEQ ID NO: 1: Amaranthus sp. (AsAHASL SEQ ID NO:9), Brassica napus (BnAHASLIA SEQ ID NO:3, BnAHASLIC SEQ ID NO: 10, BnAHASL2A SEQ ID NO: 11), Camelina microcarpa (CmAHASLl SEQ ID NO:12, CmAHASL2 SEQ ID NO: 13), Solanum tuberosum (StAHASLl SEQ ID NO: 16, StAHASL2 SEQ ID NO: 17), Oryza sativa (OsAHASL SEQ ID NO:4), Lolium multiflorum (LmAHASL SEQ ID NO:20), Solanum ptychanthum (SpAHASL SEQ ID NO: 14), Sorghum bicolor (SbAHASL SEQ ID NO: 15), Glycinae max (GmAHASL SEQ ID NO: 18), Helianthus annuus (HaAHASLl SEQ ID NO:5, HaAHASL2 SEQ ID NO:6, HaAHASL3 SEQ ID NO:7), Triticum aestivum (TaAHASLIA SEQ ID NO:21, TaAHASLIB SEQ ID NO:22, TaAHASLID SEQ ID NO:23), Xanthium sp. (XsAHASL SEQ ID NO: 19), Zea mays (ZmAHASLl SEQ ID NO:8, ZmAHASL2 SEQ ID NO:2), Gossypium hirsutum (GhAHASA5 SEQ ID NO:24, GhAHASA19 SEQ ID NO:25), e E.coli (ilvB SEQ ID NO:26, ilvG SEQ ID NO:27, ilvl SEQ ID NO:28).
A Figura 4 é um mapa do vetor à base de AE usado para a construção de mutantes de AHASL de Arabidopsis AE2-AE8 em E. coli, indicando-se posições relativas de mutações em AHASL de Arabidopsis.
A Figura 5 é um mapa-de-vetor de vetor de base AP de transformação de planta usado para a construção de vetores AP2-AP5, que diferem apenas quanto às mutações indicadas na Tabela 1.
A Figura 6 é um mapa de vetor de base ZE usado para estudar mutantes de AHASL de milho ZE2, ZE5, ZE6, e ZE7 em E. coli, indicando22 se posições relativas de mutações.
A Figura 7 é um mapa de vetor de transformação de planta ZP usado como um vetor de base para a construção de vetores ZP2-ZP10.
A Figura 8 é uma tabela apresentando as posições de aminoácidos concordantes de genes de AHASL derivados de espécies diferentes.
A Figura 9 é uma tabela apresentando o percentual de identidade de proteína dos genes de AHASL derivados de espécies diferentes. A análise foi realizada com o pacote de programas [software] Vector NTI (penalidade de abertura de intervalo =10, penalidade de extensão de intervalo = 0,05, penalidade de separação de intervalo = 8, matriz blosum 62MT2).
A Figura 10 apresenta os resultados de um ensaio de crescimento em placa vertical de sementes de diversas linhagens de Arabidopsis plaqueadas sobre meio com 37,5 micromoles de imazetapir. As sementes usadas foram: 1) ecotipo Columbia 2 de tipo selvagem; 2) o mutante csrl-2 (homozigótico para a mutação S653N de AtAHASL na cópia genômica do gene de subunidade grande de AHAS); 3) Columbia 2 transformada com AP1; 4) Columbia 2 transformada com AP7; e 5) Columbia 2 transformada com AP2.
A Figura 11 é um mapa-de-vetor de vetor de base ALP de transformação de planta usado para a construção de vetores AUP2 e AUP, que diferem apenas quanto às mutações indicadas na Tabela 3.
A Figura 12 é um mapa-de-vetor de vetor de transformação de planta BAP1, que compreende a sequência codificante para uma AtAHASL com a mutação S653N.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção proporciona polinucleotídeos codificando AHASL com pelo menos duas mutações, por exemplo, mutantes duplos e triplos, que demonstram tolerância a herbicidas, em particular, a herbicidas de imidazolinona e opcionalmente, a sulfoniluréia, triazolopirimidina sulfoanilida, e/ou herbicidas de pirimidil oxibenzoato. Os mutantes de AHASL da invenção podem ser usados para criar plantas transgênicas que demonstram níveis de resistência a herbicidas suficientes para conferir níveis comerciais de tolerância a herbicida quando presentes em apenas um parental de um cruzamento híbrido ou sobre um genoma de uma planta poliplóide. Os polinucleotídeos da invenção também podem ser usados como marcadores selecionáveis para a transformação de genes ligados codificando outras características, como apresentado na Patente US n° 6.025.541.
Embora as proteínas de AHASL de várias espécies difiram em termos de comprimento quanto a alguns aminoácidos, as posições relativas de radicais sujeitos a modificação de acordo com a presente invenção são conservadas (Figura 8). Assim, as mutações aqui descritas são expressas em termos de posições correspondentes ao número de radicais de aminoácidos do polipeptídio de AHASL de Arabidopsis (SEQ ID NO: 1, Figura 1, Figura 8) exceto se indicado de outra forma ou perceptível do contexto. Por exemplo, o resíduo 122 da AHASL de Arabidopsis corresponde ao radical 90 da AHASL de milho, resíduo 104 de AHASL IA de Brassica napus, radical 107 de AHASL IC de B. napus, radical 96 de AHASL de O. sativa, radical 113 de AHASL de Amaranthus, radical 26 de Escherichia coli ilvG, radical 117 de AHASL de Saccharomyces cercvisiae, radical 113 de beterraba açucareira, radical 111 do algodão, radical 120 de AHASL 1 de Camelina microcarpa, radical 117 de AHASL2 de Camelina microcarpa, radical 109 de AHASL 1 de Solanum tuberosum, radical 111 de AHASL2 de Solanum tuberosum, radical 92 de Lolium multiflorum, radical 27 de Solanum ptychanthum, radical 93 de Sorghum bicolor, radical 103 de Glycine max, radical 107 de AHASL 1 de Helianthus annuus, radical 101 de AHASL2 de Helianthus annuus, radical 97 de AHASL3 de Helianthus annuus, radical 59 de Triticum acstivum, e radical 100 de Xanthium sp. Estas correspondências são bem conhecidas por aqueles com prática na arte. Com base nessa correspondência, as posições correspondentes em sequências de subunidade grande de AHAS não reveladas especificamente aqui poderíam ser facilmente determinadas pela pessoa versada na arte. Regiões exemplares específicas de correspondência relevantes para a presente invenção são apresentadas na Figura 3.
Em uma concretização preferida, a invenção proporciona um polipeptídio isolado codificando um mutante duplo de AHASL de Arabidopsis selecionado do grupo que consiste de um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da •SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ
ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 139 da SEQ ID NO:1 ou posição 107 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma histidina em uma posição correspondente à posição 269 da SEQ ID NO:1 ou posição 237 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e a metionina em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 426 da SEQ ID NO:1 ou posição 394 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e a valina em uma posição correspondente à posição 430 da SEQ ID NO:1 ou posição 398 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 442 da SEQ ID NO:1 ou posição 410 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina ou ácido aspártico em uma posição correspondente à posição 445 da SEQ ID NO:1 ou posição 413 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e a ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 580 da SEQ ID NO:1 ou posição 548 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma asparagina em uma posição correspondente à posição 375 da SEQ ID NO:1 ou posição 343 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e a fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um polipeptídio apresentando uma valina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, treonina, triptofano, ou tirosina em uma posição correspondente à posição 205 da SEQ ID NO:1 ou posição 173 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2.
Em outra concretização preferida, a invenção proporciona um polipeptídio isolado codificando um polipeptídio mutante triplo de subunidade grande de AHAS de Arabidopsis selecionado do grupo que consiste de: um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição
199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma arginina em uma posição correspondente à posição 57 da SEQ ID NO:1 e uma leucina em uma posição correspondente à posição 398 da SEQ ID NO:1 ou posição 366 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando a leucina em uma posição correspondente à posição 95 da SEQ ID NO:1 ou posição 63 da SEQ ID NO:2, um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2, uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e qualquer aminoácido em uma posição correspondente à posição 574 da SEQ ID NO:1 ou posição 542 da SEQ ID NO:2.
Outras concretizações preferidas incluem mutantes duplos e triplos de AHASL de outras espécies, sendo que as mutações duplas e triplas ocorrem nas posições correspondentes àquelas dos mutantes de milho e Arabidopsis específicos descritos acima e na tabela mostrada na Figura 8. Por exemplo, mutantes duplos e triplos correspondentes de AHASL de microorganismos, como E. coli, S. cerevisiac, Salmonella, Synichocystis’, e de plantas, como trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, sorgo, mileto, beterraba açucareira, cana-de-açúcar, soja, amendoim, algodão, colza, canola, espécies de Brassica, mandioca, melão, abóbora, pimenta, girassol, tagetes, plantas solanáceas, batata, batata doce, tabaco, berinjela, tomate, espécies de Vicia, ervilha, alfalfa, café, cacau também encontram-se no escopo da presente invenção. Referidos mutantes duplos e triplos podem ser preparados usando-se métodos conhecidos, por exemplo, in vitro usando-se mutagênese direcionada para sítio, ou in vivo usando-se mutagênese objetivada ou técnicas similares, como descrito nas Patentes dos Estados Unidos nums. 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972 e 5.871.984.
Os polinucleotídeos da invenção são proporcionados em cassetes de expressão para a expressão na planta de interesse. O cassete incluirá sequências reguladoras ligadas operacionalmente a uma sequência de polinucleotídeo de AHASL da invenção. O termo “elemento regulador” como usado aqui refere-se a um polinucleotídeo que é capaz de regular a transcrição de um polinucleotídeo ligado operacionalmente. Ele inclui, embora sem limitação, promotores, acentuadores, íntrons, UTRs a 5’ e UTRs a 3’. Por ligado operacionalmente compreende-se uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, sendo que a sequência promotora inicia e média a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. De uma maneira geral, 'ligado operacionalmente' significa que as sequências de ácido nucleico ligadas são contíguas e, onde necessário, conjugam duas regiões codificantes de proteína, contíguas e na mesma matriz de leitura. O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional pode ser proporcionado em múltiplos cassetes de expressão.
Um cassete de expressão do tipo referido é proporcionado com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da sequência de polinucleotídeos de AHASL que se encontra sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis.
O cassete de expressão incluirá na direção 5'-3' de transcrição, uma região de início transcricional e de tradução (i.e., um promotor), uma sequência de polinucleotídeos de AHASL da invenção, e uma região de terminação transcricional e de tradução (i.e., região de terminação) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranho ou heterológo, para o hospedeiro de planta e/ou a sequência de polinucleotídeos de AHASL da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. Onde o promotor é estranho ou heterológo para o hospedeiro da planta, compreende-se que o promotor não é encontrado na planta nativa em que o promotor é introduzido. Onde o promotor é estranho ou heterológo para a sequência de polinucleotídeos de AHASL da invenção, compreende-se que o promotor não é o promotor nativo ou naturalmente ocorrente para a sequência de polinucleotídeos de AHASL ligado operacionalmente da invenção. Como usado aqui, uma gene quimérico compreende uma sequência codificante ligada operacionalmente a uma região de início de transcrição que é heterológo para a sequência codificante.
Embora seja preferível expressar os polinucleotídeos de AHASL da invenção usando-se promotores heterólogos, é possível usar as sequências promotoras nativas. Referidas construções poderíam alterar níveis de expressão da proteína AHASL na planta ou célula de planta. Assim, o fenótipo da planta ou célula de planta é alterado.
A região de terminação pode ser nativa com a região de início de transcrição, pode ser nativa com a sequência de AHASL ligada operacionalmente que é de interesse, pode ser nativa com o hospedeiro de planta, ou pode ser derivada de outras fonte (i.e., estranha ou heteróloga para o promotor, a sequência de polinucleotídeos de AHASL de interesse, o hospedeiro de planta, ou qualquer combinação dos mesmos). Regiões de terminação vantajosas podem ser obtidas do plasmídio Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.
Onde apropriado, o(s) gene(s) pode ser otimizado para expressão incrementada na planta transformada. Ou seja, os genes podem ser sintetizados usando-se códons preferidos para planta para expressão aperfeiçoada. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso de códon preferido pelo hospedeiro. Há métodos na arte para sintetizar genes preferidos para plantas. Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nums. 5.380.831, e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas aqui por referência.
Conhece-se modificações de sequência adicionais para incrementar a expressão gênica em um hospedeiro celular. Estas incluem a eliminação de sequências codificando sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítio de recomposição éxon-íntron, repetições similares a transpóson, e outras sequências bem caracterizadas do tipo referido que podem ser deletérias à expressão gênica. O teor de G-C da sequência pode ser ajustado a níveis médios para um dado hospedeiro celular, como calculado com referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias de grampo-de-cabelo \hairpin\ preditas.
Sequências de nucleotídeos para acentuar a expressão gênica também podem ser usadas nos vetores de expressão de planta. Estas incluem os íntrons do Adhl de milho, gene intronl (Callis et al. Genes and Development 1:1183-1200, 1987), e sequências-líder, (sequência W) do vírus do mosaico do tabaco, TMV, virus do mosqueado clorótico do milho e vírus do mosaico da alfafa (Gallie et al. Nucleic Acids Res. 15:8693-8711, 1987 e Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). Mostrou-se que o primeiro íntron do lócus shrunkenA do milho, aumenta a expressão de genes em construções de genes quiméricas. As Patentes dos Estados Unidos nums. 5.424.412 e 5.593.874 revelam o uso de íntrons específicos em construções de expressão gênica, e Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) também mostraram que íntrons são úteis para regular a expressão gênica numa base específica para tecido. Para incrementar adicionalmente, ou para otimizar a expressão gênica de subunidade grande de AHAS, os vetores de expressão de planta da invenção também podem conter sequências de DNA contendo regiões de ligação de matriz (MARs). Células de plantas transformadas com referidos sistemas de expressão modificados podem apresentar então a superexpressão ou a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos da invenção.
Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências-líder a 5' na construção de cassete de expressão. Referidas sequências-líder podem atuar para incrementar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na arte e incluem: líderes de picomavírus, por exemplo, EMCV leader (região não codificante a 5' da Encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, por exemplo, líder do vírus etch do tabaco (TEV, Tobacco Etch Virus) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder do vírus do mosaico do nanismo do milho (MDMV), e proteína de ligação de cadeia pesada da imunoglublina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não-traduzido do mRNA da proteína do revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV, alfafa mosaic virus - RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); vírus do mosaico do tabaco, (TMV) (Gallie et al. (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder do vírus das pintas cloróticas do milho (MCMV, Maize Chlorotic Mottle Virus) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Também é possível usar outros métodos conhecidos para incrementar a tradução, por exemplo, íntrons, e análogos.
Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação apropriada e, conforme apropriado, na matriz de leitura apropriada. Para este fim, é possível usar adaptadores ou ligantes para conjugar os fragmentos de DNA ou é possível envolver outras manipulações para proporcionar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição, ou análogos. Para este fim, é possível envolver mutagênese in vitro, reparo de iniciador, restrição, recombinação, ressubstituições, p. ex., transições e transversões.
E possível usar uma quantidade de promotores na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucléicos podem ser combinados com [promotores constitutivos, preferidos para tecido, ou outros promotores para expressão em plantas.
Referidos promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no WO 99/43838 e Patente US n° 6.072.050; o promotor CaMV 35S de núcleo (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina do arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente US n° 5.659.026), e análogos. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nums. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463;
5.608.142; e 6.177.611.
E possível usar promotores preferidos para tecido para objetivar expressão incrementada de AHASL em um tecido de planta particular. Referidos promotores preferidos para tecido incluem, embora sem limitação, promotores preferidos para folhas, promotores preferidos para raízes, promotores preferidos para sementes, e promotores preferidos para caule. Promotores preferidos para tecido incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansene/aZ. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331 -1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Referidos promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.
Em uma concretização, os ácidos nucleicos de interesse são objetivados ao cloroplasto para expressão. Desta maneira, onde o ácido nucléico de interesse não está inserido diretamente no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente uma sequência de objetivação de cloroplastos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto para dirigir o produto gênico de interesse aos cloroplastos. Referidos peptídeos de transito são conhecidos na arte. Com relação a sequências de objetivação de cloroplastos, ligado operacionalmente significa que a sequência de ácido nucléico que codifica um peptídeo de trânsito {i.e., a sequência de objetivação de cloroplastos) é ligada ao polinucleotídeo de AHASL da invenção de tal forma que as duas sequências sejam contíguas e na mesma matriz de leitura. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:14141421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Embora as proteínas de AHASL da invenção incluam um peptídio de transito de cloroplasto nativo, qualquer peptídio de transito de cloroplasto conhecido na arte pode ser fundido à sequência de aminoácidos de uma proteína de AHASL madura da invenção por meio de ligação operacional de uma sequência de objetivação de cloroplastos na ponta 5' de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de AHASL madura da invenção.
Sequências de objetivação de cloroplastos são conhecidas na arte e incluem a subunidade pequena de cloroplasto da ribulose-l,5-bisfosfato carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5(enolpiruvil)shikimate-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); triptofano sintase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); corismato sintase (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); e proteína de ligação a/b da clorofila colheitadora de luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:1499614999). Ver também Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:10436
126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
Métodos para a transformação de cloroplastos são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método baseia-se no fornecimento, por meio de canhão de partículas, de DNA contendo um marcador selecionável e objetivação do DNA ao genoma de plastídeo por meio de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação de plastídeos pode ser realizada por meio de transativação de um transgene portado por plastídeo silente mediante a expressão preferida para tecido de uma RNA polimerase codificada para nuclear e dirigida para plastídeo. Um sistema do tipo referido foi reportado por McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305.
Os ácidos nucléicos de interesse a serem objetivados no cloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto de forma a contribuírem para diferenças no uso de códon entre o núcleo da planta e esta organela. Desta maneira, os ácidos nucléicos de interesse podem ser sintetizados usando-se códons preferidos para cloroplastos. Ver, por exemplo, a Patente US n° 5.380.831, incorporada aqui por referência.
Em particular, a presente invenção descreve o uso de polinucleotídeos codificando polipeptídios de AHASL mutante compreendendo pelo menos duas mutações para manipular plantas que são tolerantes a herbicida. Esta estratégica foi demonstrada aqui usando-se AHASL de Arabidopsis mutantes em Arabidopsis thaliana e mutantes de AHASL2 de maiz no milho, mas sua aplicação não se restringe a estes genes ou a estas plantas. Em concretizações preferidas, o herbicida é imidazolinona e/ou sulfoniluréia. Em outras concretizações preferidas, a tolerância a herbicida é aperfeiçoada e/ou incrementada em comparação com plantas de tipo selvagem e com AHAS mutantes conhecidos.
A invenção também proporciona um método de produzir uma planta cultivada transgênica contendo ácido nucléico codificando AHASL mutante compreendendo pelo menos duas mutações, sendo que a expressão do(s) ácido(s) nucleico(s) na planta resulta em tolerância a herbicida em comparação com plantas de tipo selvagem ou com plantas de tipo AHAS mutante compreendendo: (a) introduzir em uma célula de planta um vetor de expressão compreendendo ácido nucléico codificando uma AHASL mutante com pelo menos duas mutações, e (b) gerar a célula de planta uma planta transgênica que é tolerante a herbicida. A célula de planta inclui, embora sem limitação, um protoplasto, célula produtora de gameta, e uma célula que se regenera a uma planta inteira. Como usado aqui, o termo “transgênico” referese a qualquer planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte de planta que contém todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante é integrada de forma estável em um cromossomo ou elemento extracromossômico estável, de forma que é passado para sucessivas gerações.
Em outra concretização, a invenção refere-se ao uso de polipeptídios de AHASL mutante da invenção como marcadores selecionáveis. A invenção proporciona um método de identificar ou selecionar uma célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma compreendendo a) proporcionar uma célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma, sendo que referido célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma compreende um ácido nucléico isolado codificando um polipeptídio mutante duplo de subunidade grande de AHASda invenção como descrito acima, sendo que o polipeptídio é usado como um marcador de seleção, e sendo que referida célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma pode compreender opcionalmente um ácido nucléico isolado de interesse adicional; b) contactar a célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma com pelo menos um inibidor de AHAS ou composto inibidor de AHAS; c) determinar se a célula de planta, tecido de planta, planta ou parte da mesma é afetada pelo inibidor ou composto inibidor; e d) identificar ou selecionar a célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma.
A invenção também é concretizada em proteínas de AHASL purificadas que contêm as mutações duplas e triplas descritas aqui, o que é útil em estudos de modelagem molecular para projetar aperfeiçoamentos adicionais na tolerância a herbicida. Métodos de purificação de proteína são bem conhecidos, e podem ser realizados facilmente usando produtos comercialmente obteníveis ou métodos especialmente projetados, como apresentado, por exemplo, em Protein Biotechnology, Walsh e Headon (Wiley, 1994).
A invenção proporciona adicionalmente plantas tolerantes a herbicida não-transgênicas e transgênicas compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídio de AHASL mutante duplo, ou dois polinucleotídeos codificando Polipeptídios de AHASL mutantes simples. Plantas não-transgênicas geradas dos mesmos podem ser produzidas por meio de polinização cruzada de uma primeira planta com uma segunda planta e deixando-se a planta receptora de pólen (pode ser a primeira ou a segunda planta) produzir sementes desta polinização cruzada. Sementes e plantas de progênie geradas das mesmas podem apresentar mutações duplas cruzadas sobre um alelo simples ou dois alelos. A planta receptora de pólen pode ser a primeira planta ou a segunda planta. A primeira planta compreende um primeiro polinucleotídeo codificando um primeiro polipeptídio mutante simples de AHASL. A segunda planta compreende um segundo polinucleotídeo codificando um segundo polipeptídio mutante simples de
AHASL. O primeiro e segundo polipeptídios mutantes simples de AHASL compreendem uma substituição de aminoácido simples diferente relativamente a um polipeptídio de AHASL de tipo selvagem. Sementes ou plantas de progênie provenientes das mesmas que compreendem um polinucleotídeo que codifica o polipeptídio de AHASL mutante duplo ou dois polinucleotídeos codificando os dois polipeptídios de AHASL mutantes simples podem ser selecionadas. As plantas de progênie selecionadas apresentam um nível inesperadamente maior de tolerância a um herbicida inibidor de AHAS, por exemplo, um herbicida de imidazolinona ou herbicida de sulfoniluréia, do que é predito a partir da combinação dos dois polipeptídios de AHASL mutantes simples em uma planta simples. As plantas de progênie apresentam uma sinergia com relação à tolerância a herbicida, sendo que o nível de tolerância a herbicida nas plantas de progênie compreendendo a primeira e segunda mutações das plantas parentais é maior do que a tolerância a herbicida de uma planta compreendendo duas cópias do primeiro polinucleotídeo ou duas cópias do segundo polinucleotídeo.
Quando a primeira e segunda plantas são homozigótias para o primeiro e segundo polinucleotídeos, respectivamente, sendo que cada uma das plantas de progênie resultantes compreende uma cópia de cada um dos primeiro e segundo polinucleotídeos e a etapa de seleção pode ser omitida. Quando pelo menos uma das primeira e segunda plantas é heterozigótica, é possível selecionar plantas de progênie compreendendo tanto polinucleotídeos, por exemplo, por meio de análise do DNA de plantas de progênie para identificar plantas de progênie compreendendo tanto o primeiro e segundo polinucleotídeos, ou por teste das plantas de progênie para determinação da tolerância a herbicida. As plantas de progênie que compreendem tanto o primeiro e segundo polinucleotídeos apresentam um nível de tolerância a herbicida que é maior do que a tolerância a herbicida de uma planta compreendendo duas cópias do primeiro polipeptídio ou duas cópias do segundo polipeptídio.
Em uma concretização, as plantas da invenção compreendem um primeiro polinucleotídeo codificando um primeiro polipeptídio mutante simples de AHASL e um segundo polinucleotídeo codificando um segundo polipeptídio mutante simples de AHASL, ou um polinucleotídeo codificando AHASL compreendendo duas mutações de nucleotídeos que resultam nas mutações de aminoácidos correspondentes às mutações de aminoácidos de referido primeiro e segundo polipeptídios mutantes simples de AHASL, sendo que referido primeiro e referido segundo polipeptídios mutantes simples de AHASL são selecionados do grupo que consiste de: um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição
122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando um valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 139 da SEQ ID NO:1 ou posição 107 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma histidina em uma posição correspondente à posição 269 da SEQ ID NO:1 ou posição 237 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma metionina em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 426 da SEQ ID NO:1 ou posição 394 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição
122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma valina em uma posição correspondente à posição 430 da SEQ ID NO:1 ou posição 398 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 442 da SEQ ID NO:1 ou posição 410 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma isoleucina ou ácido aspártico em uma posição correspondente à posição 445 da SEQ ID NO:1 ou posição 413 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 580 da SEQ ID NO:1 ou posição 548 da SEQ ID NO:2; um primeiro ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO: 1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma asparagina em uma posição correspondente à posição 375 da SEQ ID NO:1 ou posição 343 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina,' fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um primeiro polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID
NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um primeiro polipeptídio apresentando uma valina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, treonina, triptofano, ou tirosina em uma posição correspondente à posição 205 da SEQ ID NO:1 ou posição 173 da SEQ ID NO:2 e um segundo polipeptídio apresentando uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2. Plantas nãotransgênicas compreendendo as duplas mutações de polinucleotídeos de
AHASL podem ser produzidas por meio de métodos diferentes da polinização cruzada descrita acima, como, por exemplo, embora sem limitação, mutagênese objetivada in vivo como descrito em Kochevenko et al. (Plant Phys. 132:174-184, 2003). As duplas mutações podem ser localizadas em um alelo simples, ou dois alelos de um genoma de planta.
Outra concretização da invenção refere-se a uma planta transgênica transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado, sendo que o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídio mutante duplo de subunidade grande de acetóxi-hidroxiácido sintase (AHASL) selecionado do grupo que consiste de: um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO: 1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 139 da SEQ ID NO:1 ou posição 107 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma histidina em uma posição correspondente à posição 269 da SEQ ID NO:1 ou posição 237 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma metionina em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 426 da SEQ ID NO:1 ou posição 394 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma valina em uma posição correspondente à posição 430 da SEQ ID NO:1 ou posição 398 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina em uma posição correspondente à posição 442 da SEQ ID NO:1 ou posição 410 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e uma isoleucina ou ácido aspártico em uma posição correspondente à posição 445 da SEQ ID NO:1 ou posição 413 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2 e um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 580 da SEQ ID NO:1 ou posição 548 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO: 1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma asparagina em uma posição correspondente à posição 375 da SEQ ID NO:1 ou posição 343 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um polipeptídio apresentando uma valina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, treonina, triptofano, ou tirosina em uma posição correspondente à posição 205 da SEQ ID NO:1 ou posição 173 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2.
A invenção proporciona adicionalmente plantas nãotransgênicas e transgênicas tolerantes a herbicidas compreendendo um polinucleotídeo codificando umpolipeptídio de AHASL triplo mutante, ou um ou mais polinucleotídeos codificando AHASL compreendendo três mutações.
Para a produção de uma planta não-transgênica com um ou mais polinucleotídeos compreendendo três mutações, uma planta de progênie compreendendo um ou dois polinucleotídeos compreendendo referida primeira e referida segunda mutações descritas acima, é polinizada de forma cruzada com terceira planta que compreende um terceiro polinucleotídeo codificando um terceiro polipeptídio mutante simples de AHASL. O terceiro polipeptídio mutante simples de AHASL compreende uma substituição de aminoácido simples diferente relativa a um polipeptídio de AHASL de tipo selvagem do que o primeiro ou o segundo polipeptídios mutantes simples de
AHASL. Sementes ou plantas de progênie que compreendem um ou mais polinucleotídeos compreendendo as três mutações são selecionados como descrito acima. As plantas de progênie selecionadas compreendem um nível de tolerância a herbicida que é maior do que o efeito aditivo de se combinar os três polipeptídios de AHASL mutantes simples em uma única planta.
Plantas não-transgênicas compreendendo as mutações triplas ou múltiplas de polinucleotídeos de AHASL podem ser produzidas por meio de métodos diferentes da polinização cruzada descrita acima, como, por exemplo, mas sem limitação, mutagênese objetivada in vivo como descrito acima. As mutações múltiplas podem ser localizadas em um alelo simples, ou alelos múltiplos de um genoma de planta.
Em uma concretização, plantas da invenção compreendem um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídio mutante simples de AHASL, um segundo polinucleotídeo codificando um segundo polipeptídio mutante simples de AHASL, e um terceiro polinucleotídeo codificando um terceiro polipeptídio mutante simples de AHASL. Em outra concretização, plantas da invenção compreendem um polinucleotídeo codificando AHASL compreendendo três mutações, sendo que as três mutações de nucleotídeos resultam nas mutações de aminoácidos correspondentes às mutações do referido primeira, referido segunda e referido terceiro polipeptídio mutante simples de AHASL. Em outra concretização adicional, plantas da invenção compreendem um polinucleotídeo codificando AHASL compreendendo uma mutação simples e um polinucleotídeo compreendendo uma mutação dupla, sendo que as mutações de nucleotídeos resultam nas mutações de aminoácidos correspondentes às mutações do primeiro, segundo e terceiro polipeptídios mutantes simples de AHASL previamente indicados, sendo que referido primeira, segunda, e terceiro polipeptídios mutante simples de AHASL são selecionado do grupo que consiste de: um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO.T ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma arginina em uma posição correspondente à posição 57 da SEQ ID NO:1 e uma leucina em uma posição correspondente à posição 398 da SEQ ID NO:1 ou posição 366 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma leucina em uma posição correspondente à posição 95 da SEQ ID NO: 1 ou posição 63 da SEQ ID NO:2, um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2, uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e qualquer aminoácido em uma posição correspondente à posição 574 da SEQ ID NO:1 ou posição 542 da SEQ ID NO:2.
Altemativamente, plantas compreendendo um ou mais polinucleotídeos codificando polipeptídios de AHASL mutante simples são produzidos transformando-se uma planta com dois ou mais de referidos polinucleotídeos ou transformando uma primeira planta com um primeiro polinucleotídeo codificando um primeiro polipeptídio mutante simples de
AHASL e realizando polinização cruzada da primeira planta com uma segunda planta compreendendo um segundo polinucleotídeo codificando um segundo polipeptídio mutante simples de AHASL. A segunda planta compreende um segundo polinucleotídeo compreendendo segundo polipeptídio mutante simples de AHASL que é endógena ou que foi introduzido via transformação. O primeira e segundo polipeptídios mutantes simples de AHASL compreendem uma substituição de aminoácido simples diferente relativamente a um polipeptídio de AHASL de tipo selvagem AHASL. Conforme necessário, sementes ou plantas de progênie compreendendo tanto o primeiro e o segundo polinucleotídeos são selecionadas como descrito acima.
Outra concretização adicional da invenção refere-se a uma planta transgênica transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado, sendo que o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídio mutante triplo de subunidade grande de acetóxi-hidroxiácido sintase (AHASL) selecionado do grupo que consiste de: um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ
ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma valina, treonina, glutamina, cisteína, ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 ou posição 90 da SEQ ID NO:2, uma arginina em uma posição correspondente à posição 57 da SEQ ID NO:1 e uma leucina em uma posição correspondente à posição 398 da SEQ ID NO:1 ou posição 366 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando um ácido glutâmico, isoleucina, leucina, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 124 da SEQ ID NO:1 ou posição 92 da SEQ ID NO:2, uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2 e uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2; um polipeptídio apresentando uma leucina em uma posição correspondente à posição 95 da SEQ ID NO:1 ou posição 63 da SEQ ID NO:2, um ácido glutâmico em uma posição correspondente à posição 416 da SEQ ID NO:1 ou posição 384 da SEQ ID NO:2 e uma fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou posição 621 da SEQ ID NO:2; e um polipeptídio apresentando uma serina, alanina, ácido glutâmico, leucina, glutamina, arginina, valina, triptofano, tirosina, ou isoleucina em uma posição correspondente à posição 197 da SEQ ID NO:1 ou posição 165 da SEQ ID NO:2, uma alanina, ácido glutâmico, serina, fenilalanina, treonina, ácido aspártico, cisteína, ou asparagina em uma posição correspondente à posição 199 da SEQ ID NO:1 ou posição 167 da SEQ ID NO:2 e qualquer aminoácido em uma posição correspondente à posição 574 da SEQ ID NO:1 ou posição 542 da SEQ ID NO:2.
A presente invenção proporciona plantas tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida compreendendo uma proteína de AIIASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida incluindo, embora sem limitação, polipeptídios de AHASL mutantes simples e polipeptídios de AHASL duplos e triplos mutantes que são codificados pelos polinucleotídeos da presente invenção. Por uma planta tolerante a herbicida ou resistente a herbicida, compreende-se que uma planta que é tolerante ou resistente a pelo menos um herbicida em um nível que normalmente poderia matar, ou inibir o crescimento de, uma planta normal ou de tipo selvagem. Por proteína de AHASL tolerante a herbicida ou proteína de AHASL resistente a herbicida, compreende-se que uma proteína de AHASL do tipo referido apresenta maior atividade de AHAS, relativamente à atividade de AHAS de uma proteína de AHASL de tipo selvagem, quando na presença de pelo menos um herbicida que é conhecido por interferir com a atividade de AHAS e a uma concentração ou nível do herbicida que é conhecido por inibir a atividade de AHAS da proteína de AHASL de tipo selvagem. Adicionalmente, a atividade de AHAS de uma proteína de AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida do tipo referido pode ser referida aqui como atividade de AHAS tolerante a herbicida ou resistente a herbicida.
Para a presente invenção, os termos tolerante a herbicida e resistente a herbicida são usados de forma intercambiável e devem ter significado equivalente e um escopo equivalente. De maneira análoga, os termos herbicida-tolerância e herbicida-resistência são usados de forma intercambiável e devem possuir um significado equivalente e um escopo equivalente. De maneira análoga, os termos resistente a imidazolinona e resistência a imidazolinona são usados de forma intercambiável e devem ter significado equivalente um escopo equivalente aos termos tolerante a imidazolinona e tolerância a imidazolinona, respectivamente.
A invenção compreende polinucleotídeos de AHASL resistentes a herbicida e proteínas de AHASL resistentes a herbicidas. Por polinucleotídeo de AHASL resistente a herbicida compreende-se um polinucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida. Por proteína de AHASL resistente a herbicida compreende-se uma proteína ou polipeptídio que compreende uma proteína ou polipeptídio que compreende atividade de AHAS resistente a herbicida.
Adicionalmente, reconhece-se que uma proteína de AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ser introduzido em uma planta por meio de transferência de uma planta ou ancestral da mesma com uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida. Referidas proteínas de AHASL tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida são codificadas pelos polinucleotídeos de AHASL tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida. Alternativamente, uma proteína de AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida, como, por exemplo, um polipeptídio de AHASL de mutação simples como revelado aqui pode ocorrer em uma planta como um resultado de uma mutação naturalmente ocorrente ou induzida em um gene de AHASL endógeno no genoma de uma planta ou progenitor da mesma.
A presente invenção proporciona plantas, tecido de plantas, células de plantas, e células hospedeiras com resistência ou tolerância incrementada a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou herbicida de sulfoniluréia. A quantidade ou concentração preferida do herbicida é uma quantidade eficaz ou concentração eficaz. Por quantidade eficaz e concentração eficaz compreende-se uma quantidade e concentração, respectivamente, que é suficiente para matar ou inibir o crescimento de uma planta, tecido de planta, célula de planta, ou célula hospedeira similar de tipo selvagem, mas que referida quantidade não mata ou inibe tão severamente o crescimento das plantas, tecidos de plantas, células de plantas e células hospedeiras, resistentes a herbicida, da presente invenção. Tipicamente, a quantidade eficaz de um herbicida é uma quantidade que é usada rotineiramente em sistemas de produção agrícolas para matar ervas daninhas de interesse. Uma quantidade do tipo referido é conhecida por aqueles com prática ordinária na arte.
Por planta, tecido de planta, célula de planta ou célula hospedeira similar, de tipo selvagem compreende-se uma planta, tecido de planta, célula de planta, ou célula hospedeira, respectivamente, que carece de características de resistência a herbicida e/ou polinucleotídeo particulares da invenção que são revelados aqui. O uso do termo tipo selvagem não se destina, portanto, a implicar que uma planta, tecido de planta, célula de planta, ou outra célula hospedeira carece de DNA recombinante em seu genoma, e/ou não possui características de resistência a herbicida que são diferentes daquelas divulgadas aqui.
Como usado aqui, exceto se indicado claramente de outra forma, o termo planta deve significar uma planta em qualquer estágio desenvolvimental, e também qualquer parte ou partes de uma planta que pode ser ligada a, ou separada, de uma planta intacta inteira. Referidas partes de uma planta incluem, embora sem limitação, órgãos, tecidos, e células de uma planta. Exemplos de partes particulares de plantas incluem um caule, uma folha, uma raiz, uma inflorescência, uma flor, uma flor pequena, uma fruta, um pedículo, um pedúnculo, um estame, uma antera, um estigma, um estilete, um ovário, uma pétala, uma sépala, um carpelo, uma ponta de raiz, uma coifa de raiz, um pelo de raiz, um pelo de folha, um pelo de semente, um grão de pólen, um microesporo, um cotilédone, um hipocotilédone, um epicótilo, xilema, floema, parênquima, endosperma, uma célula acompanhante, uma célula de guarda, e quaisquer outros órgãos, tecidos e células conhecidos de uma planta. Adicionalmente, reconhece-se que uma semente é uma planta.
As plantas da presente invenção incluem tanto plantas nãotransgênicas e plantas transgênicas. Por planta não-transgênica compreendese uma planta que não apresenta DNA recombinante em seu genoma. Por planta transgênica compreende-se uma planta que compreende DNA recombinante em seu genoma. Uma planta transgênica do tipo referido pode ser produzida introduzindo-se DNA recombinante no genoma da planta. Quando referido DNA recombinante é incorporado no genoma da planta transgênica, a progênie da planta também pode compreender o DNA recombinante. Uma planta de progênie que compreende pelo menos uma porção do DNA recombinante de pelo menos uma planta transgênica progenitora também é uma planta transgênica.
Em determinadas concretizações, a presente invenção envolve plantas resistentes a herbicidas que são produzidos por meio de cruzamento de mutações. Referidas plantas compreendem um polinucleotídeo que codifica um peptídio de AHAS mutante simples de subunidade grande e são tolerantes a um ou mias herbicidas inibidores de AHAS. Referidos métodos podem envolver, por exemplo, expor as plantas ou sementes a um mutágeno, particularmente um mutágeno químico, como, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS) e selecionar plantas que apresentam tolerância incrementada a pelo menos um herbicida inibidor de AHAS, particularmente um herbicida de imidazolinona ou herbicida de sulfoniluréia. No entanto, a presente invenção não é limitada a plantas tolerantes a herbicida que são produzidas por meio de um método de mutagênese envolvendo o mutágeno químico EMS. E possível usar qualquer método de mutagênese conhecido na arte para produzir as plantas resistentes a herbicida da presente invenção. Referidos métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, o uso de qualquer um mais dos seguintes mutágenos: radiação, como raios-X, raios Gama (p. ex., cobalto 60 ou césio 137), nêutrons, (p. ex., produto de fissão nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação Beta (p. ex., emitida de radioisótopos, como fósforo 32 ou carbono 14), e radiação ultravioleta (de preferência, de 2500 a 2900 nm), e mutágenos químicos, como análogos de base (p. ex., 5-bromouracila), compostos relacionados (p. ex., 8-etóxi cafeína), antibióticos (p. ex., estreptonigrina), agentes alquiladores (p. ex., mostardas de enxofre, mostardas de nitrogênio, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso, ou acridinas. Plantas resistentes a herbicida também podem ser produzidas por meio do uso de métodos de cultura de tecidos para selecionar células de plantas compreendendo mutações resistentes a herbicida e, depois, regenerar plantas resistentes a herbicida a partir das mesmas. Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nums. 5.773.702 e 5.859.348, sendo que ambas são incorporadas aqui integralmente por referência. Adicionalmente, é possível encontrar detalhes de cruzamento de mutações em “Principais of Cultivar Development” Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, cuja revelação é incorporada aqui por referência.
A presente invenção proporciona métodos para incrementar a tolerância ou resistência de uma planta, tecido de planta, célula de planta, ou outra célula hospedeira a pelo menos um herbicida que interfere com a atividade da enzima AHAS. De preferência, um herbicida do tipo referido é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona, ou mistura dos mesmos. Mais preferivelmente, um herbicida do tipo referido é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, ou mistura dos mesmos. Para a presente invenção, o herbicida de imidazolinonas incluem, embora sem limitação, PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquina), ASSERT® (imazetabenzo), ARSENAL® (imazapir), um derivado de qualquer um dos herbicidas previamente indicados, e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas previamente indicados, por exemplo, imazapir/imazamox (ODYSSEY®). Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode ser selecionado dentre, mas sem limitação, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin2-il)-nicotínico, ácido [2- (4-isopropil)-4-] [metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3quinolinocarboxílico], ácido [5-etil-2- (4-isopropil-] 4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin2-il)-5- (metoximetil)-nicotínico, ácido [2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-] imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de [6- (4-isopropil-4-] metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metila e [2- (4-isopropil-4-metil5-] oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metila. O uso de ácido 5-etil-2- (4isopropil-4-metil-5-oxo- 2-imidazolin-2-il)-nicotínico e ácido [2- (4-isopropil4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-] il)-5- (metoximetil)-nicotmico é preferido. O uso de ácido [2- (4-isopropil-4-J metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5(metoximetil)-nicotínico é particularmente preferido.
Para a presente invenção, os herbicidas de sulfoniluréia incluem, embora sem limitação, clorosulfuron, metsulfuron metila, sulfometuron metila, clorimuron etila, tifensulfuron metila, tribenuron metila, bensulfuron metila, nicosulfuron, etametsulfuron metila, rimsulfuron, triflusulfuron metila, triasulfuron, primisulfuron metila, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etila, halosulfuron, azimsulfuron, ciclosulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron metila, foramsulfuron, iodosulfuron, oxasulfuron, mesosulfuron, prosulfuron, sulfosulfuron, trifloxisulfuron, tritosulfuron, um derivado de qualquer um dos herbicidas previamente indicados, e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas previamente indicados. O herbicida de triazolopirimidinas da invenção incluem, embora sem limitação, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, e penoxsulam. Os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato (ou pirimidinil carbóxi) da invenção incluem, embora sem limitação, bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxima e piriftalida. Os herbicidas de sulfonilamino10 carboniltriazolinona incluem, embora sem limitação, flucarbazona e propoxicarbazona.
Reconhece-se que herbicidas de pirimidiniloxibenzoato estão estreitamente relacionados com os herbicidas de pirimidiniltiobenzoato e são generalizados sob o cabeçalho do último nome pela Weed Science Society of
America. Assim, os herbicidas da presente invenção incluem adicionalmente herbicidas de pirimidiniltiobenzoato, incluindo, embora sem limitação, os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato descritos acima.
A presente invenção proporciona métodos para incrementar a atividade de AHAS em uma planta compreendendo transformar uma planta com uma construção de polinucleotídeo compreendendo um promotor ligado operacionalmente a uma sequência de nucleotídeos AHASL da invenção. Os métodos envolvem introduzir uma construção de polinucleotídeo da invenção em pelo menos uma célula de planta e regenerar uma planta transformada a partir das mesmas. Os métodos envolvem o uso de um promotor que é capaz de impelir a expressão gênica em uma célula de planta. De preferência, um promotor do tipo referido é um promotor constitutivo ou um promotor preferido para tecido. Os métodos são usados on incremento ou no aumento da resistência de uma planta a pelo menos um herbicida que interfere com a atividade catalítica da enzima AHAS, particularmente um herbicida de imidazolinona.
A presente invenção proporciono cassetes de expressão para expressar os polinucleotídeos da invenção em plantas, tecido de plantas, células de plantas, e outras células hospedeiras. Os cassetes de expressão compreendem um promotor expressável na planta, tecido de planta, célula de planta, ou outras células hospedeiras de interesse ligadas operacionalmente a um polinucleotídeo da invenção que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica, ou uma proteína de AHASL de comprimento pleno {i.e. incluindo o peptítio de trânsito de cloroplasto) ou madura {i.e. sem o peptídio de trânsito de cloroplasto). Se a expressão for desejada nos plastídios ou cloroplastos de plantas ou células de plantas, o cassete de expressão também pode compreender uma sequência objetivadora de cloroplastos ligada opercionalmente que codifica um peptídio de trânsito de cloroplasto.
Os cassetes de expressão da invenção são usados em um método para incrementar a tolerância a herbicida de uma planta ou de uma célula hospedeira. O método envolve transformar a planta ou célula hospedeira com um cassete de expressão da invenção, sendo que o cassete de expressão compreende um promotor que é expressável na planta ou célula hospedeira de interesse e o promotor é ligado operacionalmente a um polinucleotídeo da invenção que compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de AHASL resistente a imidazolinona da invenção.
O uso do termo construção de polinucleotídeo aqui não deve limitar a presente invenção a construções de polinucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles com prática ordinária na arte reconhecerão que construções de polinucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos, constituídas de ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos também podem ser usadas nos métodos revelados aqui. Assim, as construções de polinucleotídeos da presente invenção compreendem todas as construções de polinucleotídeos que podem ser empregadas nos métodos da presente invenção para transformar plantas incluindo, embora sem limitação, aquelas constituídas de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e combinações dos mesmos. Referidos desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas naturalmente ocorrentes e análogos sintéticos. As construções de polinucleotídeos da invenção também compreendem todas as formas de construções de polinucleotídeos incluindo, embora sem limitação, formas de filamento simples, formas de filamento duplo, grampos-de-cabelo, estruturas de haste-e-alça, e análogos. Adicionalmente, aqueles com prática ordinária na arte compreendem que cada uma das sequências de nucleotídeos reveladas aqui também compreende o complemento daquela sequência de nucleotídeos exemplificada.
Adicionalmente, reconhece-se que, para a expressão de um polinucleotídeo da invenção em uma célula hospedeira de interesse, tipicamente o polinucleotídeo é ligado operacionalmente a um promotor que é capaz de impelir a expressão gênica na célula hospedeira de interesse. Os métodos da invenção para expressão dos polinucleotídeos em células hospedeiras não dependem de promotor particular. Os métodos compreendem o uso de qualquer promotor que é conhecido na arte e que é capaz de impelir a expressão gênica na célula hospedeira de interesse.
A presente invenção compreende moléculas de polinucleotídeo de AHASL e fragmentos e variantes dos mesmos. Moléculas de polinucleotídeo que são fragmentos destas sequências de nucleotídeos também são compreendidas pela presente invenção. Por fragmento compreende-se uma porção da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de AHASL da invenção. De preferência, um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de AHASL da invenção codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína de AHASL. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína de AHASL pode ser preparada isolando-se uma porção de uma das sequências de nucleotídeos de AHASL da invenção, expressando a porção codificada da proteína de AHASL (p. ex., por meio de expressão recombinante in vitro), e avaliando-se a atividade da porção codificada da proteína de AHASL. Moléculas de polinucleotídeo que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos de AHASL e codificam porções biologicamente ativas de proteínas de AHASL compreendem pelo menos cerca de 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ou 2000 nucleotídeos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos de comprimento pleno revelada aqui (por exemplo, 2013 nucleotídeos para a SEQ ID NO: 30) dependendo do uso desejado.
Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de AHASL que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína de AHASL da invenção codificará pelo menos cerca de 200, 300, 400, 500, 550, 650, ou 650 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína de AHASL de comprimento pleno da invenção (por exemplo, 670 aminoácidos para a SEQ ID NO: 1).
Moléculas de polinucleotídeo compreendendo sequências de nucleotídeos que são variantes das sequências de nucleotídeos reveladas aqui também são compreendidas pela presente invenção. Variantes das sequências de nucleotídeos de AHASL da invenção incluem aquelas sequências que codificam os polipeptídios de AHASL mutante revelados aqui, mas que diferem conservativamente devido à degeneração do código genético. Estas variantes alélicas naturalmente ocorrentes podem ser identificadas com o uso de técnicas bem conhecidas da biologia molecular, como reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como indicado abaixo. Sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos derivadas sinteticamente que foram geradas, por exemplo, com o uso de mutagênese direcionada para sítio, mas que ainda codificam a proteína de AHASL revelada na presente invenção como discutido abaixo. De uma maneira geral, variantes de sequências de polinucleotídeos da invenção apresentarão pelo menos cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % de identidade com uma sequência de nucleotídeos particular revelada aqui. Uma sequência de polinucleotídeos de AHASL variante codificará um polipeptídio de AHASL mutante, respectivamente, que apresenta uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de um polipeptídio de AHASL revelado aqui.
Adicionalmente, a pessoa versada na arte perceberá adicionalmente que é possível introduzir alterações por meio de mutação nas sequências de polinucleotídeos, levando com isto a alterações na sequência de aminoácidos dos polipeptídios de AHASL duplos e triplos mutantes codificados, sem alterar a atividade biológica dos polipeptídios mutantes duplos e triplos. Assim, uma molécula de polipeptídio isoladoa codificando um polipeptídio de AHASL duplo e triplo mutante apresentando uma sequência que diferir das sequências duplas e triplas mutantes apresentadas nas Figuras 1 e 2 podem ser criadas por meio de introdução de uma ou mais substituições, adições, ou deleções de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos correspondente revelada aqui, de tal forma que uma ou mais substituições de aminoácidos, adições ou deleções são introduzidas na proteína codificada. É possível introduzir mutações por meio de técnicas convencionais, como mutagênese direcionada para sítio e mutagênese mediada com PCR. Referidas sequências de nucleotídeos variantes também são compreendidas pela presente invenção.
Por exemplo, de preferência, é possível realizar substituições de aminoácidos conservativas em um ou mais radicais de aminoácidos nãoessenciais, de preferência, preditos. Um radical de aminoácido nãoessencial é um radical que pode ser alterado da sequência de tipo selvagem de uma proteína de AHASL (p. ex., a seqüência da SEQ ID NO: 1) sem alterar a atividade biológica, enquanto que um radical de aminoácido essencial é requerido para atividade biológica. Uma substituição conservativa de aminoácido é uma em que o radical de aminoácido é substituída por um radical de aminoácido apresentando uma cadeia lateral similar. Famílias de radicais de aminoácidos apresentando cadeias laterais similares foram definidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (p. ex., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (p. ex., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares nãocarregadas (p. ex., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (p. ex., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas em beta (p. ex., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (p. ex., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Referidas substitutições não poderíam ser feitas para radicais de aminoácidos conservados, ou para radicais de aminoácidos que residem em uma unidade repetitiva conservada.
As proteínas da invenção podem ser alteradas de diversas maneiras incluindo substituições de aminoácidos, deleções, truncações, e inserções. Métodos para referidas manipulações são geralmente conhecidas na arte. Por exemplo, variantes de sequências de aminoácidos das proteínas de AHASL podem ser preparadas por meio de mutações no DNA. Métodos para mutagênese e alterações de sequências de nucleotídeos são bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente US n° 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) e as referências ali indicadas. Orientação relativa às substituições apropriadas de aminoácidos que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporada aqui por referência. Substituições conservativas, como troca de um aminoácido por outro apresentando propriedades similares, podem ser preferíveis.
Reconhece-se que as moléculas de polinucleotídeo e polipeptídios da invenção compreendem polipeptídios e moléculas de polinucleotídeos compreendendo um nucleotídeo ou uma sequência de aminoácidos que é suficientemente idêntica às sequências de nucleotídeos duplas ou triplas apresentadas nas Figuras 1 e 2, ou às sequências de aminoácidos apresentadas nas Figuras 1 e 2. O termo suficientemente idêntica é usado aqui para referir a uma primeira sequência de aminoácidos ou nucleotídeos que contém um número suficiente ou mínimo de radicais de aminoácidos ou nucleotídeos idêntico ou equivalente (p. ex., com uma cadeia lateral similar) a uma segunda sequência de aminoácidos ou nucleotídeos de tal forma que a primeira e segunda sequências de aminoácidos ou nucleotídeos apresentam um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, sequências de aminoácidos ou nucleotídeos que contêm um domínio estrutural comum apresentando pelo menos cerca de 80 % de identidade, de preferência, 85 % de identidade, mais preferivelmente
90 %, 95 %, ou 98 % de identidade são definidas aqui como suficiente idênticas.
Para determinar o percentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótimos. O percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (i.e., percentual de identidade = número de posições idênticas/número total de posições (p. ex., posições superpostas) x 100). Em uma concretização, as duas sequências têm o mesmo comprimento. O percentual de identidade entre duas sequências pode ser determinado usando65 se técnicas similares àquelas descritas abaixo, permitindo ou não intervalos. No cálculo do percentual de identidade, encontra-se tipicamente pareamentos exatos.
A determinação do percentual de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando-se um algoritmo matemático. Um exemplo não-limitante preferido de um algoritmo matemático usado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Um algoritmo do tipo referido é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Buscas de nucleotídeos com BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, comprimento de palavra = 12, para se obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de polinucleotídeos da invenção. Buscas de proteína com BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra = 3, para se obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para se obter alinhamentos intervalados [gapped\ para fins de comparação, é possível usar GLAST intervalado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, é possível usar PSI-Blast para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Quando se usa programas BLAST, BLAST intervalado, e PSI-Blast, é possível usar os parâmetros default dos respectivos programas (p. ex., XBLAST e NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo não-limitante preferido de um algoritmo matemático usado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Um algoritmo do tipo referido é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do pacote de programas de alinhamento de sequências GCG. Quando se usa o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, é possível usar uma tabela de resíduos em peso PAM120, uma penalidade para comprimento de espaço de 12, e uma penalidade para espaços de 4. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por meio de inspeção.
Exceto se indicado de outra forma, valores de identidade de 5 sequências/similaridade fornecidos aqui referem-se a um valor obtido usandose as sequências de comprimento pleno da invenção e usando alinhamento múltiplo por meio do algoritmo Clustal W (Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680, 1994) usando o programa AlignX incluído no pacote de programas Vector NTI Suite versão 9 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave.,
Carlsbad, CA 92008) usando-se os parâmetros default; ou qualquer programa equivalente dos mesmos. Por programa equivalente compreende-se qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento apresentando pareamentos idênticos de radicais de nucleotídeos ou aminoácidos e um percentual idêntico de identidade de sequências quando comparado com o alinhamento correspondente gerado por AlignX no pacote de programas Vector NTI Suite versão 9.
Não se espera que as deleções, inserções, e substituições das sequências de proteínas compreendidas produzem alterações radicais nas características da proteína. No entanto, quando é difícil predizer o efeito exato da substituição, deleção, ou inserção antes de se realizar a mesma, alguém com prática na arte perceberá que o efeito será avaliado por meio de ensaios de seleção rotineiros. Ou seja, a atividade pode ser avaliada por meio de ensaios de atividade de AHAS. Ver, por exemplo, Singh et al. (1988) Anal.
Biochem. 171:173-179, incorporado aqui por referência.
Como discutido aqui, os polinucleotídeos da invenção são usados para aumentar a tolerância a herbicida por parte de plantas que compreendem em seus genomas um gene que codifica uma proteína de AHASL tolerante a herbicida. Um gene do tipo referido pode ser um gene endógeno ou um transgene. Adicionalmente, em determinadas concretizações, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeos de interesse para criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotídeos codificando polipeptídios apresentando atividade praguicida e/ou inseticida, como, por exemplo, as proteínas da toxina de Bacillus thuringíensis (descrita nas Patentes dos Estados Unidos nums. 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109). As combinações geradas também podem incluir cópias múltiplas de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.
Embora os polinucleotídeos da invenção possam ser usados como genes marcadores selecionáveis para transformação de plantas, os cassetes de expressão da invenção podem incluir outro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da presente invenção, são usados para a seleção de células ou tecidos transformados. Genes marcadores incluem, embora sem limitação, genes codificando resistência a antibióticos, como aqueles codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), e também genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como glufosinato amônio, bromoxoinila, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver, de uma forma geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell Ί\:63-Ί2.; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science
248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:50725076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; HillenandWissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agentes Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Bíochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agentes Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Referidas revelações são incorporadas aqui por referência.
A lista acima de genes marcadores selecionáveis não deve ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção.
As moléculas de polinucleotídeo isoladas compreendendo sequência de nucleotídeos que codificam as proteínas de AHASL da invenção podem ser usadas em vetores para transformar plantas para que as plantas criadas apresentem resistência incrementada a herbicidas, particularmente um herbicida de imidazolinona ou herbicida de sulfoniluréia. As moléculas de polinucleotídeo de AHASL isoladas da invenção podem ser usadas em vetores apenas, ou em combinação com uma sequência de nucleotídeos codificando a subunidade pequena da enzima AHAS (AHASS) conferindo resistência a herbicida em plantas. Ver, Patente US n° 6.348.643; que é incorporada aqui por referência.
A invenção também se refere-se a um vetor de expressão de planta compreendendo um promotor que impele a expressão em uma planta ligada opercionalmente a um polipeptídio isolado molécula da invenção. A molécula de polinucleotídeo isolada compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de AHASL da invenção, ou uma variante e fragmento funcional da mesma. O vetor de expressão de planta da invenção não depende de um promotor particular, mas um promotor do tipo referido só é capaz de impelir a expressão gênica em uma célula de planta. Promotores preferidos incluem promotores constitutivos e promotores preferidos para tecidos.
Os vetores de transformação da invenção podem ser usados para produzir plantas transformadas com um gene de interesse. O vetor de transformação compreenderá um gene marcador selecionável da invenção e um gene de interesse a ser introduzido e expresso tipicamente na planta transformada. Um gene marcador selecionável do tipo referido compreende um polinucleotídeo da invenção que codifica um polipeptídio de AHASL mutante duplo ou triplo, sendo que o polinucleotídeo é ligado operacionalmente a um promotor que impele a expressão em uma célula hospedeira. Para uso em plantas e células de plantas, o vetor de transformação compreende um gene marcador selecionável compreendendo um polinucleotídeo da invenção que codifica um polipeptídio de AHASL mutante duplo ou triplo ligado operacionalmente a um promotor que impele a expressão em uma célula de planta.
Os genes de interesse da invenção variam dependendo do resultado desejado. Por exemplo, diversas alterações no fenótipo podem ser de interesse, incluindo a modificação da composição de ácidos graxos em uma planta, alterando o teor de aminoácidos de uma planta, alterando mecanismos de defesa de um patógeno e/ou inseto de uma planta, e análogos. Estes resultados podem ser obtidos proporcionando expressão de produtos heterólogos, ou expressão incrementada de produtos endógenos em plantas. Altemativamente, os resultados podem ser obtidos proporcionando uma redução da expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou cofatores na planta. Estas alterações resultam em uma alteração no fenótipo da planta transformada.
Em uma concretização da invenção, os genes de interesse incluem genes de resistência a insetos, como, por exemplo, genes da proteína da toxina de Bacillus thuringiensis (Patentes dos Estados Unidos nums. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109).
As proteínas ou polipeptídios de AHASL da invenção podem ser purificadas de, por exemplo, plantas de girassol, e podem ser usadas em composições. Também é possível usar um polipeptídio isolado molécula codificando uma proteína de AHASL da invenção para expressar uma proteína de AHASL da invenção em um micróbio, como E. coli ou uma levedura. A proteína de AHASL expressa pode ser purificada de extratos de E. coli ou levedura por meio de qualquer método conhecido por aqueles com prática ordinária na arte.
Os polinucleotídeos da invenção são usados em métodos para incrementar a resistência de plantas tolerantes a herbicida. Em uma concretização da invenção, as plantas tolerantes a herbicida que compreendem um polinucleotídeo da invenção que codifica um polipeptídio de AHASL mutante duplo ou triplo. A invenção proporciona adicionalmente plantas tolerantes a herbicida que compreendem dois ou mais polinucleotídeos codificando polipeptídios de AHASL mutantes simples. Polinucleotídeos que codificam proteínas de AHASL tolerantes a herbicida e plantas tolerantes a herbicida compreendendo um gene endógeno que codifica uma proteína de AHASL tolerante a herbicida incluem os polinucleotídeos e plantas da presente invenção e aqueles que são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nums. 5.013.659, 5.731.180, 5.767.361, 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796; todas as quais são incorporadas aqui por referência. Referidos métodos para incrementar a resistência de plantas tolerantes a herbicida compreendem transformar uma planta tolerante a herbicida com pelo menos uma construção de polinucleotídeo compreendendo um promotor que impele a expressão em uma célula de planta que é ligada operacionalmente a um polinucleotídeo da invenção.
Numerosos vetores de transformação de plantas e métodos para transformar plantas encontram-se disponíveis. Ver, por exemplo, An, G. et al. (1986) Plant Physiol., 81:301-305; Fry, J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.16'.161-1T4', Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp.2Q32\2, 203-212; Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. e Slightom, J. L. (1992) GeneA 18:255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Bíotechnol. 10:239-246; D'Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sei. USA 90:1121211216; Christou, P. (1993) in vitro Cell. Dev. Biol.-Plant', 29P:119-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. e Mchughen, A. (1993) Plant Sei. 91:139-148; Franklin, C. I. e Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sei. 90:41-52; Guo Chin Sei. Bull. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. e Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sei. 13:219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; e Wan, Y. C. e Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748.
Os métodos da invenção envolvem introduzir uma construção de polinucleotídeo em uma planta. Por introduzir compreende-se apresentar à planta a construção de polinucleotídeo de tal modo que a construção obtém acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir uma construção de polinucleotídeo a uma planta, apenas que a construção de polinucleotídeo obtém acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir construções de polinucleotídeos em plantas são conhecidos na arte incluindo, embora sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por vírus.
Por transformação estável compreende-se que a construção de polinucleotídeo introduzida em uma planta integra-se no genoma da planta e é capaz de ser herdada pela progênie da mesma. Por transformação transiente compreende-se que uma construção de polinucleotídeo introduzida em uma planta não se integra no genoma da planta.
Para a transformação de plantas e células de plantas, as sequências de nucleotídeos da invenção são inseridas usando-se técnicas convencionais em qualquer vetor conhecido na arte que é vantajoso para a expressão das sequências de nucleotídeos em uma planta ou célula de planta. A seleção do vetor depende da técnica de transformação preferida e da espécie de planta-alvo a ser transformada. Em uma concretização da invenção, uma sequência de nucleotídeos de AHASL é ligada operacionalmente a um promotor de planta que é conhecido pela expressão de alto nível em uma célula de planta, e esta construção é então introduzido em uma planta que é suscetível a um herbicida de imidazolinona ou de sulfoniluréia e uma planta transformada é regenerada. A planta transformada é tolerante à exposição a um nível de um herbicida de imidazolinona ou herbicida de sulfoniluréia que poderia matar ou lesionar significantemente uma planta não-transformada. Este método pode ser aplicado a qualquer espécie de planta; no entanto, ele é o mais benéfico quando aplicado a plantas cultivadas.
Metodologias para construir cassetes de expressão de planta e introduzir ácidos nucléicos estranhos em plantas são geralmente conhecidos na arte e foram descritos previamente. Por exemplo, é possível introduzir DNA estranho em plantas, usando-se vetores de plamsídeo indutor de tumor (Ti). Técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium são bem conhecidas na arte. A cepa de Agrobacterium (p. ex., Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenesj compreende um plasmídio (plasmídeio Ti ou Ri) e um elemento de T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobacterium. O T-DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula de planta. O T-DNA pode ser localizado no plasmídeo Ri ou Ti ou é constituída separadamente em um assim-chamado vetor binário. Métodos para a transformação mediada com Agrobacterium encontram-se descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229f. A transformação mediada por Agrobacterium pode ser usada tanto em plantas dicotiledôneas como em plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobacteria é descrita em White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225. Outros métodos usados para o fornecimento de DNA estranho envolvem o uso de transformação de protoplastos mediada com PEG, eletroporação, cristais filamentosos para microinjeção, e biolística ou bombardeio com microprojéteis para absorção direta de DNA. Referidos métodos são conhecidos na arte. (Patente US n° 5.405.765 para Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.
(1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach e Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). O método de transformação depende da célula de planta a ser transformada, da estabilidade de vetores usados, do nível de expressão de produtos gênicos e de outros parâmetros.
Outros métodos apropriados para a introdução de sequências de nucleotídeos em células de plantas e a subsequente inserção no genoma da planta incluem microinjeção como em Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334, eletroporação como descrito por Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium como descrito por Townsend et al. Patente US n° 5.563.055, Zhao et al. Patente US n° 5.981.840, dirigem a transferência de genes como descrito por
Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722, e aceleração balística de partículas como descrito em, por exemplo, Sanford et al. Patente US n° 4.945.050; Tomes et al. Patente US n° 5.879.918; Tomes et al. Patente US n° 5.886.244; Bidney et al. Patente US n° 5.932.782; Tomes et al. (1995) Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, em
Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação de Lecl (WO 00/28058). Ver também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (onion); Christou et al. (1988)
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6:559-563 (maize); Tomes, Patente US n° 5.240.855; Buising et al. Patentes dos Estados Unidos nums. 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al. (1995) Direct DNA Transfer into Intact Plant cells via Microprojectile Bombardment, em Plant cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (milho); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al. Patente US n° 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The
Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada com cristais filamentosos); D'Halluin et al. (1992) Planta cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant cell Reports
12:250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz);
Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho via Agrobacteríum turnefaciens)', todas as quais são incorporadas aqui por referência.
Os polinucleotídeos da invenção podem ser introduzidos em plantas por meio de contato das plantas com um vírus ou ácidos nucléicos virais. De uma maneira geral, referidos métodos envolvem incorporar uma construção de polinucleotídeo da invenção em uma molécula de RNA ou DNA viral. Reconhece-se que a proteína de AHASL da invenção pode ser sintetizada inicialmente como parte de uma poliproteína viral, que, mais tarde, pode ser processada por meio de proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Adicionalmente, reconhece-se que promotores da invenção também compreendem promotores usados para a transcrição por RNA polimerases virais. Métodos para introduzir construções de polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada ali, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nums. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931; incorporadas aqui por referência.
A células que foram transformadas podem ser desenvolvidas em plantas de acordo com vias convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser desenvolvidas e polinizadas com a mesma cepa ou com cepas diferentes, e o híbrido resultante apresentando expressão constitutiva das características fenotípicas desejadas é identificado. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para assegurar que a expressão das características fenotípicas desejadas seja mantida de forma estável e herdada e, então, sementes foram colhidas para assegurar que a expressão das características fenotípicas desejadas pudesse ser alcançada. Desta maneira, a presente invenção proporciona sementes transformadas (também referidas como “sementes transgênicas”) apresentando uma construção de polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporada estavelmente em seu genoma.
A presente invenção pode ser usada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, embora sem limitação, monocotilédones e dicotilédones. Exemplos de espécies de plantas de interesse incluem, embora sem limitação, milho ou maiz (Zea mays), Brassica sp. (p. ex., B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de sementes, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorgo bicolor, Sorgo vulgare), mileto (p. ex., mileto pérola (Pennisetum glaucum), mileto proso (Panicum miliaceum), mileto rabo-de-raposa (Setaria italica), mileto dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), açafrão (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachís hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacau), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajavá), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba açucareira (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveias, cevada, hortaliças, ornamentais, e coníferas. De preferência, plantas da presente invenção são plantas cultivadas (por exemplo, girassol, Brassica sp., algodão, beterraba açucareira, soja, amendoim, alfalfa, açafrão, tabaco, milho, arroz, trigo, centeio, cevada triticale, sorgo, mileto, etc.).
As plantas da invenção são plantas resistentes a herbicida e assim, são usadas em métodos para controlar ervas daninhas que envolvem a aplicação de um herbicida. Assim, a presente invenção proporciona adicionalmente um método para controlar ervas daninhas na adjacência de uma planta resistente a herbicida da invenção. O método compreende aplicando-se uma quantidade eficaz de um herbicida nas ervas daninhas e na planta resistente a herbicida, sendo que a planta apresenta resistência incrementada a pelo menos um herbicida inibidor de AHAS, particülarmente um herbicida de imidazolinona ou herbicida de sulfoniluréia, quando comparado com uma planta de tipo selvagem. Em um método de controle de ervas daninhas do tipo referido, as plantas resistentes a herbicida da invenção são, de preferência, plantas cultivadas, incluindo, embora sem limitação, girassol, alfalfa, Brassica sp., soja, algodão, açafrão, amendoim, tabaco, tomate, batata, trigo, arroz, milho, sorgo, cevada, centeio, mileto, e sorgo.
Ao proporcionar plantas apresentando resistência incrementada a herbicidas, particülarmente herbicidas de imidazolinona e de sulfoniluréia, é possível usar uma ampla variedade de formulações para proteger plantas contra ervas daninhas, de forma a incrementar o crescimento de plantas e reduzir a competição por nutrientes. Um herbicida pode ser usado sozinho para o controle de pré-emergência, pós-emergência, pré-plantio e durante o plantio de ervas daninhas em áreas que circundam as plantas descritas aqui, ou é possível usar uma formulação de herbicida de imidazolinona que contém outros aditivos. O herbicida também pode ser usado como um tratamento de sementes. Aditivos encontrados em um herbicida de herbicida de imidazolinona ou herbicida de sulfoniluréia formulação incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes adesivos, agentes estabilizantes, ou análogos. A formulação herbicida pode ser uma preparação úmida ou seca, e pode incluir, mas sem limitação, pós de fluxo livre, concentrados emulsificáveis e concentrados líquidos. Os herbicidas e formulações herbicidas podem ser aplicados de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por meio de pulverização, irrigação, polvilhamento, ou análogos.
A presente invenção proporciona plantas e sementes nãotransgênicas e transgênicas com tolerância incrementada a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida inibidor de AHAS, mais particularmente herbicidas de imidazolinona e de sulfoniluréia, sendo o mais particular herbicidas de imidazolinona. Em concretização preferida da invenção, as plantas e sementes da invenção apresentam um nível maior de tolerância a herbicida do que plantas similares que compreendem apenas um polipeptídio de AHASL mutante simples. Referidas plantas e sementes da invenção podem ser usadas em métodos aperfeiçoados para controlar ervas daninhas que permitem a aplicação de um herbicida sobre as ervas daninhas e na planta resistente a herbicida em uma quantidade eficaz que compreende uma maior taxa ou concentração herbicida do que pode ser usada com plantas similares que compreendem apenas um polipeptídio de AHASL mutante
Ί9 simples. Assim, referidos métodos aperfeiçoados proporcionam controle superior de sementes quando comparado com métodos existentes envolvendo plantas compreendendo apenas um polipeptídio de AHASL mutante simples e a aplicação de uma menor taxa ou concentração herbicida.
A presente invenção proporciona plantas resistentes a herbicida compreendendo polinucleotídeos codificando polipeptídios de AHASL mutantes duplos ou triplos e plantas resistentes a herbicida compreendendo dois ou mais polinucleotídeos codificando polipeptídios de AHASL mutantes simples. Estas plantas resistentes a herbicida da presente invenção podem ser usadas em métodos para produzir plantas resistentes a herbicida por meio de cruzamento convencional de plantas envolvendo reprodução sexual. Os métodos compreendem cruzar uma primeira planta que é uma planta resistente a herbicida da invenção com uma segunda planta que não é resistente ao herbicida. A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzir plantas de progênie viáveis (i.e., sementes) quando cruzada com a primeira planta. Tipicamente, mas não necessariamente, a primeira e segunda plantas são da mesma espécie. Os métodos podem envolver opcionalmente selecionar plantas de progênie que compreendem o polinucleotídeo que codifica o polipeptídio de AHASL mutante ou os dois ou mais polinucleotídeos que codificam polipeptídios de AHASL mutantes simples da primeira planta. Os métodos da invenção podem envolver adicionalmente uma ou mais gerações de retro-cruzamentos das plantas de progênie do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linha ou genótipo que a primeira ou a segunda planta. Altemativamente, a progênie do primeiro cruzamento ou de qualquer cruzamento subsequente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linha ou genótipo diferente da primeira ou segunda planta.
As plantas resistentes a herbicida da invenção que compreendem polinucleotídeos que codificam polipeptídios de AHASL mutantes duplos ou triplos e plantas resistentes a herbicida compreendendo dois ou mais polinucleotídeos que codificam polipeptídios de AHASL mutantes simples também podem ser usadas em métodos para incrementar a resistência a herbicida de uma planta por meio de criação convencional de plantas envolvendo reprodução sexual. Os métodos compreendem cruzar uma primeira planta que é uma planta resistente a herbicida da invenção com uma segunda planta que pode ou não ser resistente ao mesmo herbicida ou herbicidas que a primeira planta, ou pode ser resistente a herbicida ou herbicidas diferentes que a primeira planta. A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzir plantas de progênie viáveis (i.e., sementes) quando cruzadas com a primeira planta. Tipicamente, mas não necessariamente, a primeira e a segunda plantas são da mesma espécie. Os métodos podem envolver opcionalmente selecionar plantas de progênie que compreendem o polinucleotídeo que codifica o polipeptídio de AHASL mutante ou os dois ou mais polinucleotídeos que codificam polipeptídios de AHASL mutantes simples da primeira planta e as características de resistência a herbicida da segunda planta. As plantas de progênie produzidas por meio deste método da presente invenção apresentam resistência incrementada a um herbicida quando comparadas com a primeira ou a segunda planta, ou com ambas. Quando a primeira e a segunda plantas são resistentes a herbicidas diferentes, as plantas de progênie apresentarão características combinadas de tolerância a herbicida da primeira e segunda plantas. Os métodos da invenção podem envolver adicionalmente uma ou mais gerações de retro-cruzamentos das plantas de progênie do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linha ou genótipo que a primeira ou segunda planta. Altemativamente, a progênie do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subsequente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linha ou genótipo diferente da primeira ou segunda planta.
A presente invenção também proporciona plantas, órgãos de plantas, tecidos de plantas, células de plantas, sementes, e células hospedeiras não-humanas que são transformadas com a pelo menos uma molécula de polinucleotídeo, cassete de expressão, ou vetor de transformação da invenção. Referidas plantas transformadas, órgãos de plantas, tecidos de plantas, células de plantas, sementes, e células hospedeiras não-humanas transformadas apresentam tolerância ou resistência incrementada pelo menos um herbicida, em níveis do herbicida que matarão ou inibirão o crescimento de uma planta não-transformada, tecido de planta, célula de planta, ou célula hospedeira não-humana e não-transformada, respectivamente. De preferência, as plantas transformadas, tecidos de plantas, células de plantas, e sementes transformadas da invenção são Arabídopsis thaliana e plantas cultivadas.
A presente invenção proporciona métodos que envolvem o uso de pelo menos um herbicida inibidor de AHAS selecionado do grupo que consiste de herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfoniluréia, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato, herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona, e misturas dos mesmos. Nestes métodos, o Herbicida inibidor de AHAS pode ser aplicado por meio de qualquer método conhecido na arte incluindo, embora sem limitação, tratamento de sementes, tratamento do solo, e tratamento foliar.
Antes da aplicação, o herbicida inibidor de AHAS pode ser convertido às formulações usuais,, por exemplo, soluções, emulsões, suspensões, produtos para pulverização, pós, pastas e grânulos. A forma de uso depende da finalidade particular desejada; em cada caso, ela deveria assegurar uma distribuição fina e homogênea do composto de acordo com a invenção.
As formulações são preparadas de uma maneira conhecida (ver, p. ex., para uma revisão US 3.060.084, EP-A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, ”Agglomeration”, Chemical Engineering, 4 de dezembro de 1967, 147-48, Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 4a
Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, páginas 8-57 e ss. WO 91/13546, US 4.172.714, US 4.144.050, US 3.920.442, US 5.180.587, US 5.232.701, US 5.208.030, GB 2.095.558, US 3.299.566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley e Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al. Weed Control Handbook, 8a Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 e Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Alemanha), 2001, 2, D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), por exemplo, por meio de extensão do composto ativo com auxiliares apropriados para a formulação de agroquímicos, como solventes e/ou veículos, se desejado emulsificantes, tensoativos e dispersantes, conservantes, agentes antiespumantes, agentes anticongelantes, para o tratamento de sementes formulação também, opcionalmente, colorantes e/ou ligantes e/ou agentes gelificantes.
Exemplos de solventes vantajosos são água, solventes aromáticos (por exemplo, produtos Solvesso, xileno), parafinas (por exemplo, frações de óleo mineral), alcoóis (por exemplo, metanol, butanol, pentanol, álcool benzílico), cetonas (por exemplo, cicloexanona, gama-butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP), acetatos (diacetato de glicol), glicóis, dimetilamidas de ácido graxo, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo. Em princípio, também é possível usar misturas de solventes.
Exemplos de veículos vantajosos são minerais naturais moídos (por exemplo, caulins, argilas, talco, greda) e minerais sintéticos moídos (por exemplo, sílica altamente dispersa, silicatos).
Emulsificantes vantajosos são emulsificantes não-iônicos e aniônico (por exemplo, éteres de álcool graxo de polioxietileno, alquilsulfonatos e arilsulfonatos).
Exemplos de dispersantes são licores residuais de sulfito de lignino e metilcelulose.
Tensoativos vantajosos usados são sais de metal alcalino, metal alcalino-terroso e de amônio do ácido lignossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido fenolsulfônico, ácido dibutilnaftalenossulfônico, alquilarilsulfonatos, sulfatos de alquila, alquilsulfonatos, sulfatos de álcool graxo, ácidos graxos e glicol éteres de álcool graxo sulfatado, adicionalmente condensados de derivados de naftaleno e naftaleno sulfonado com formaldeído, condensados de naftaleno ou de ácido naftalenossulfônico com fenol e formaldeído, polioxietileno octilfenol éter, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, poliglicol éteres de alquilfenol, poliglicol éter de tributilfenila, poliglicol éter de triestearilfenila, alcoóis de poliéter de alquilarila, condensados de álcool e óxido de etileno álcool graxo, óleo de mamona etoxilado, alquil éteres de polioxietileno, polioxipropileno etoxilado, poliglicol éter acetal de álcool de laurila, ésteres de sorbitol, licores residuais de lignossulfito e metilcelulose.
Substâncias que são vantajosas para a preparação de soluções diretamente pulverizáveis, emulsões, pastas ou dispersões em óleo são frações de óleo mineral com ponto de ebulição de médio a alto, como querosene ou óleo diesel, adicionalmente óleos de alcatrão e óleos de origem vegetal ou animal, hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos e aromáticos, por exemplo, tolueno, xileno, parafina, tetraidronaftaleno, naftalenos alquilados ou seus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, cicloexanol, cicloexanona, isoforona, solventes altamente polares, por exemplo, sulfóxido de dimetila, Nmetilpirrolidona ou água.
Também é possível adicionar à formulação agentes anticongelantes, como glicerina, etileno glicol, propileno glicol e bactericidas.
Agentes antiespumantes vantajosos são, por exemplo, agentes antiespumantes à base de silício ou estearato de magnésio.
Conservantes vantajosos são, por exemplo, diclorofenol e semiformaldeído de álcool benzílico.
Formulações para o tratamento de sementes podem compreender adicionalmente ligantes e opcionalmente colorantes.
É possível adicionar ligantes para aperfeiçoar a adesão dos materiais ativos sobre as sementes após tratamento. Ligantes vantajosos são tensoativos de copolímeros em blocos de EO/PO, mas também alcoóis de polivinila, polivinilpirrolidonas, poliacrilates, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietilenoaminas, polietilenoamidas, polietilenoiminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanas, acetato de polivinila, tilose e copolímeros derivados destes polímeros.
Opcionalmente, também se inclui corantes na formulação. Corantes ou colorantes vantajosos para formulações para o tratamento de sementes são Rhodamin B, C.I. Pigment red 112, C.I. Solvent red 1, Pigment blue 15:4, Pigment blue 15:3, Pigment blue 15:2, Pigment blue 15:1, Pigment blue 80, Pigment yellow 1, Pigment yellow 13, Pigment red 112, Pigment red 48:2, Pigment red 48:1, Pigment red 57:1, Pigment red 53:1, Pigment orange 43, Pigment orange 34, Pigment orange 5, Pigment green 36, Pigment green 7, Pigment white 6, Pigment brown 25, Basic violet 10, Basic violet 49, Acid red 51, Acid red 52, Acid red 14, Acid blue 9, Acid yellow 23, Basic red 10, Basic red 108.
Um exemplo de um agente gelificante vantajoso é carragenano (Satiagel®).
Pós, materiais para espalhamento, e produtos pulverizáveis podem ser preparados por meio de misturação ou de moagem concomitante das substâncias ativas substâncias ativas com um veículo sólido.
Grânulos, por exemplo, grânulos revestidos, grânulos impregnados e grânulos homogêneos, podem ser preparados por meio de ligação dos compostos ativos a veículos sólidos. Exemplos de veículos sólidos são terras minerais, como sílica-géis, silicatos, talco, caulim, argila attaclay, calcário, cal, greda, bolus, loesse, argila, dolomito, terra de diatomáceas, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio, materiais sintéticos moídos, fertilizantes, como, por exemplo, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, uréias, e produtos de origem vegetal, como farinha de cereais, farinha de cascas de árvores, farinha de madeira e farinha de cascas de nozes, pós de celulose e outros veículos sólidos.
De uma forma geral, as formulações compreendem de 0,01 a 95 % em peso, de preferência, de 0,1 a 90 % em peso, do herbicida inibidor de AHAS. Neste caso, os herbicidas inibidores de AHAS são usados numa pureza de 90 % a 100 % em peso, de preferência, de 95 % a 100 % em peso (de acordo com espectro de RMN). Para fins de tratamento de sementes, formulações respectivas podem ser diluídas de 2 a 10 vezes levando a concentrações de nas preparações de pronto-emprego de 0,01 a 60 % em peso de composto ativo em peso, de preferência, de 0,1 a 40 % em peso.
O herbicida inibidor de AHAS pode ser usado tal qual, em forma de suas formulações ou das formas de uso preparadas a partir das mesmas, por exemplo, em forma de soluções diretamente pulverizáveis, pós, suspensões ou dispersões, emulsões, dispersões em óleo, pastas, produtos pulverizáveis, materiais para espalhamento, ou grânulos, por meio de pulverização, atomização, polvilhamento, espalhamento ou rega. As formas de uso dependem inteiramente dos fins desejados; elas devem assegurar, em cada caso, a distribuição mais fina possível do herbicida inibidor de AHAS de acordo com a invenção.
Formas de uso aquosas podem ser preparadas a partir de concentrados de emulsão, pastas ou pós umectáveis (pós pulverizáveis, dispersões em óleo) por meio de adição de água. Para preparar emulsões, pastas ou dispersões em óleo, as substâncias, tais quais ou dissolvidos em um óleo ou solvente, podem ser homogeneizados em água por meio de um umectante, promotor de aderência, dispersante ou emulsificante. No entanto, também é possível preparar concentrados constituídos de substância ativa, umectante, promotor de aderência, dispersante ou emulsificante e, se apropriado, solvente ou óleo, e referidos concentrados são vantajosos para diluição com água.
As concentrações de composto ativo nas preparações de pronto-emprego podem ser variadas dentro de faixas relativamente amplas. De uma forma geral, elas são de 0,0001 a 10 %, de preferência, de 0,01 a 1 % em peso.
O herbicida inibidor de AHAS também pode ser usado com êxito no processo de volume ultra-baixo (ULV), sendo possível aplicar formulações compreendendo acima de 95 % em peso de composto ativo, ou mesmo aplicar o composto ativo sem aditivos.
A seguir encontram-se exemplos de formulações:
1. Produtos para diluição com água para aplicações foliares. Para fins de tratamento de sementes, referidos produtos podem ser aplicados nas sementes diluídos ou não-diluídos.
A) Concentrados solúveis em água (SL, LS)
Dez partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 90 partes em peso de água ou um solvente solúvel em água. Como uma alternativa, adiciona-se umectantes ou outros auxiliares. O herbicida inibidor de AHAS dissolve-se ao ser diluído com água, com o que se obtém uma formulação com 10 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS.
B) Concentrados dispersáveis (DC)
Vinte partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 70 partes em peso de cicloexanona com adição de 10 partes em peso de um dispersante, por exemplo, polivinilpirrolidona. Diluição com água dá uma dispersão, com o que se obtém uma formulação com 20 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS.
C) Concentrados emulsificáveis (EC)
Quinze partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são dissolvidos em 7 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenosulfonato de cálcio e etoxilado de óleo de mamona (em cada caso 5 partes em peso). Diluição com água dá uma emulsão, com o que se obtém uma formulação com 15 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS.
D) Emulsões (EW, EO, ES)
Vinte e cinco partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 35 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenosulfonato de cálcio e etoxilado de óleo de mamona (em cada caso 5 partes em peso). Esta mistura é introduzida em 30 partes em peso de água por meio de uma máquina emulsificadora (p. ex., Ultraturrax) e tomada numa emulsão homogênea. Diluição com água dá uma emulsão, com o que se obtém uma formulação com 25 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS.
E) Suspensões (SC, OD, FS)
Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são cominuídas com a adição de 10 partes em peso de dispersantes, umectantes e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico dando uma fina suspensão de herbicida inibidor de AHAS. Diluição com água dá uma suspensão estável do herbicida inibidor de AHAS, com o que se obtém uma formulação com 20 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS.
F) Grânulos dispersáveis em água e grânulos solúveis em água (WG, SG)
Cinquenta partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são moídas finamente com a adição de 50 partes em peso de dispersantes e umectantes e preparadas como dispersáveis em água ou grânulos solúveis em água por meio de dispositivos técnicos (por exemplo, extrusão, torre de pulverização, leito fluidizado). Diluição com água dá uma solução ou dispersão estável do herbicida inibidor de AHAS, com o que se obtém uma formulação com 50 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS.
G) Pós dispersáveis em água e pós solúveis em água (WP, SP,
SS, WS)
Setenta e cinco partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são moídas em um moinho de rotor-estator com a adição de 25 partes em peso de dispersantes, umectantes e sílica-gel. Diluição com água dá uma solução ou dispersão estável do herbicida inibidor de AHAS, com o que se obtém uma formulação com 75 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS.
H) Formulação em gel (GF)
Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são cominuídas com a adição de 10 partes em peso de dispersantes, 1 parte em peso de um agente gelificante umectantes e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico dando uma fina suspensão do herbicida inibidor de AHAS. Diluição com água dá uma suspensão estável do herbicida inibidor de AHAS, com o que se obtém uma formulação com 20 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS. Esta formulação em gel é vantajosa para nós como um tratamento de sementes.
2. Produtos a serem aplicados não-diluídos para aplicações foliares. Para fins de tratamento de sementes, referidos produtos podem ser aplicados nas sementes em forma diluída.
A) Pós pulverizáveis (DP, DS)
Cinco partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são moídas finamente e misturadas intimamente com 95 partes em peso de caulim finamente dividido. Isto dá um produto pulverizável apresentando 5 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS.
B) Grânulos (GR, FG, GG, MG)
Meia parte em peso do herbicida inibidor de AHAS é moída finamente e associada com 95,5 partes em peso de veículos, com o que se obtém uma formulação com 0,5 % (peso/peso) de herbicida inibidor de AHAS. Métodos correntes compreendem extrusão, secagem por pulverização ou o leito fluidizado. Isto dá grânulos a serem aplicados não-diluídos para uso foliar.
Formulações convencionais para o tratamento de sementes incluem por exemplo, concentrados de fluxo livre FS, soluções LS, pós para tratamento seco DS, pós dispersáveis em água para tratamento em calda WS, pós solúveis em água SS e emulsão ES e EC e formulação em gel GF. Estas formulações podem ser aplicadas nas sementes diluídas ou não-diluídas. A aplicação nas sementes é realizada antes da semeadura, ou então diretamente sobre as sementes.
Em uma concretização preferida usa-se uma formulação FS para tratamento de sementes. Tipicamente, uma formulação FS pode compreender de 1 a 800 g/l de ingrediente ativo, de 1 a 200 g/l de tensoativo, de 0 a 200 g/l de agente anticongelamento, de 0 a 400 g/l de ligante, de 0 a 200 g/l de um pigmento e até 1 litro de um solvente, de preferência, água.
Para o tratamento de sementes, sementes das plantas resistentes a herbicida de acordo com a presente invenção são tratadas com herbicidas, de preferência, herbicidas selecionados do grupo que consiste de herbicidas inibidores de AHAS, como amidosulfúron, azimsulfuron, bensulfúron, clorimuron, clorosulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfüron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid, piritiobac, e misturas dos mesmos, ou com uma formulação compreendendo um herbicida inibidor de AHAS.
O termo tratamento de sementes compreende todos as técnicas vantajosas de tratamento de sementes conhecidas na arte, como revestimento de sementes, recobrimento de sementes, polvilhamento de sementes, intumescimento de sementes, e pelotização de sementes.
De acordo com um variante da presente invenção, um sujeito 10 adicional da invenção é um método de tratar o solo por meio da aplicação, em particular com o plantador de sementes: seja de uma formulação granular contendo o herbicida inibidor de AHAS como uma composição/formulação (p. ex., uma formulação granulada, com opcionalmente um ou mais sólidos ou líquidos, veículos agricolamente aceitáveis e/ou opcionalmente com um ou mais tensoativos agricolamente aceitáveis. Este método é usado vantajosamente, por exemplo, em camas de sementes de cereais, milho, algodão, e girassol.
A presente invenção também compreende sementes revestidas com ou contendo uma formulação para o tratamento de sementes compreendendo pelo menos um herbicida inibidor de AHAS selecionado do grupo que consiste de amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorosulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, thifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid e piritiobac.
O termo semente abrange sementes e propágulos de plantas de todos os tipos incluindo, embora sem limitação, sementes verdadeiras, pedaços de sementes, brotos secundários, cormos, bulbos, frutas, tubérculos, grãos, enxertos, brotos de enxertos e análogos, e significa, em uma concretização preferida, sementes verdadeiras.
O termo “revestido com e/ou contendo” significa geralmente que o ingrediente ativo encontra-se, em sua maior parte, sobre a superfície do produto de propagação no momento da aplicação, embora uma parte maior ou menor do ingrediente possa penetrar no produto de propagação, dependendo do método de aplicação. Quando o referido produto de propagação é (re)plantado, ele pode absorver o ingrediente ativo.
A aplicação de tratamento de sementes com o herbicida inibidor de AHAS ou com uma formulação compreendendo o herbicida inibidor de AHAS é realizada por meio de pulverização ou polvilhamento das sementes antes da semeadura das plantas e antes da emergência das plantas.
No tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas por meio de tratar das sementes com uma quantidade eficaz do herbicida inibidor de AHAS ou uma formulação compreendendo o herbicida inibidor de AHAS. Aqui, as taxas de aplicação são geralmente de 0,1 g a 10 kg do ingrediente ativo (ou da mistura de ingrediente ativo ou da formulação) por 100 kg de sementes, de preferência, de 1 g a 5 kg por 100 kg de sementes, em particular de 1 g a 2,5 kg por 100 kg de sementes. Para culturas específicas, como alface, a taxa pode ser maior.
A presente invenção proporciona um método para controlar a vegetação indesejada ou controlar ervas daninhas compreendendo contactar as sementes das plantas resistentes de acordo com a presente invenção antes da semeadura e/ou após a pré-germinação com um herbicida inibidor de AHAS. O método pode compreender adicionalmente a semeadura das sementes, por exemplo, em solo num campo, ou em um meio de envasamento em um viveiro. O método é usado particularmente no controle de vegetação indesejada ou no controle de ervas daninhas na adjacência imediatas das sementes.
O controle da vegetação indesejada é compreendido como significando a eliminação de ervas daninhas e/ou, de outra forma, retardar ou inibir o crescimento normal das ervas daninhas. Ervas daninhas, no sentido mais amplo, são compreendidas como significando todas aquelas plantas que crescem em locais onde elas são indesejadas.
As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. Ervas daninhas dicotiledôneas incluem, embora sem limitação, ervas daninhas dos gêneros: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindemia, Lamium, Verônica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, e Taraxacum. Ervas daninhas monocotiledôneas incluem, embora sem limitação, ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, e Apera.
Adicionalmente, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas cultivadas que estão crescendo em um local indesejado. Por exemplo, uma planta de milho voluntária, que se encontra em um campo que compreende predominantemente plantas de soja, pode ser considerada uma erva daninha, se a planta de milho for indesejada no campo de plantas de soja.
Os artigos o/a e um/uma são usados aqui para referir a um ou mais de um (i.e., a pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. A título de exemplo, um elemento significa um ou mais elementos.
Como usado aqui, a expressão compreendendo, ou variações, como compreende ou compreendendo, será compreendida como implicando a inclusão de um elemento indicado, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.
Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não como limitação. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorrem à pessoa versada na arte devem enquadrar-se no escopo da presente invenção.
Exemplo 1
Vetores contendo genes mutantes de AHASL de Arabidopsis
Todo o fragmento Xbal de DNA genômico de Arabidopsis thaliana que contém todo o gene de subunidade grande de AHAS com algum DNA adicional, inclusive dos sítios Xbal nas pontas 5' e 3' é apresentado na SEQ ID NO: 34 (AtAHASL). Bases de 2484 a 4496 da SEQ ID NO: 34 compreendem a sequência codificante do gene de subunidade grande de AHAS de Arabidopsis thaliana serina 653 para o alelo mutante de treonina, inclusive do códon de interrupção mostrado na SEQ ID NO: 30. Um fragmento genômico menor do gene de subunidade grande de AHAS de Arabidopsis thaliana serina 653 para o alelo mutante de treonina mostrado na SEQ ID NO: 33, compreendido nas bases de 2484 a 5717 da SEQ ID NO: 34, inclui a sequência codificante e, na ponta 3', até, e incluindo, o sítio Xbal na ponta 3', sendo que as primeiras duas bases do sítio Ncol encontradas no códon de partida de AtAHASL são omitidas para maior clareza.
O fragmento de DNA da SEQ ID NO: 33 codificando a mutação simples de comprimento pleno de AHASL de Arabidopsis S653N e a região não-traduzida em 3' foi clonada no pKK233-2 dando o vetor denominado AE1 para expressão e testes em E. coli. (pKK233-2, vetor de expressão bacteriana, Pharmacia, número de acesso GenBank n° X70478). Os vetores de AE2 até AE9 foram gerados a partir de AE1 por meio de mutagênese e procedimentos convencionais de clonagem. A Figura 4 mostra o mapa do vetor de base AE1, com indicação das posições de mutações.
O vetor AP1 (Figura 5) é um vetor de transformação de planta que inclui um fragemento genômico do DNA de Arabidopsis thaliana que inclui o gene AtAHASL com a mutação simples S653N (SEQ ID NO:34). O fragmento de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 34 foi cionado em AP1 na orientação invertida de complemento. Os vetores de AP2 a AP7 foram gerados a partir de AP1 e dos plasmídios AE usando-se procedimentos convencionais de clonagem e diferem apenas em mutações como indicado na Tabela 1. Para facilidade de clonagem, usou-se fragmentos diferentes para gerar AP6 e AP7, em comparação com AP2-AP5. Assim, AP6 e AP7 são 47 pares de bases mais curtos do que AP1-AP5. Esta diferença encontra-se na espinha dorsal do plasmídeo e não no fragmento genômico de Arabidopsis thaliana.
Os vetores de AE10 até AE24 foram preparados como a seguir. O gene de subunidade grande de AHAS de Arabidopsis thaliana de tipo selvagem foi amplificado em condições mutagênicas usando-se o kit de mutagênese randômica Genemorph II (Stratagene, La Jolla, Califórnia), resultando em fragmentos de DNA amplificados mutagenizados randomicamente deste gene. Este DNA mutante foi então cionado de volta em AE7, substituindo o gene de subunidade grande de A. thaliana de tipo selvagem (entre os sítios únicos SacII e Agel em AE7) com as formas mutagenizadas. Este DNA foi transformado na cepa de E. coli TOP 10 e selecionado sobre meio de agar LB de tal modo a apresentar um grande número de transformantes únicos, cada um com genes de AHAS mutagenizados independentes. Estas colônias foram raspadas conjuntamente e preparou-se DNA plasmídico a partir desta biblioteca primária inteira. Este DNA foi transformado em AHAS menos E. coli e novamente selecionado sobre meio de agar LB com carbenicilina. Colônias positivas para plasmídeo desta etapa foram replicados usando-se velveteen [n.t.: tipo de algodão semelhante a veludo] sobre meio de agar mínimo sem aminoácidos de cadeia ramificada e contendo imazetapir a 30 micromoles. Aquelas colônias que cresceram neste meio seletivo apresentaram um gene mutante de AHAS de A.
thaliana funcional que também tolerante para imidazolinona.
A sequência de DNA do gene de subunidade grande de AHAS de A. thaliana foi determinada para cada uma das colônias positivas para crescimento. Não foi realizado qualquer esforço para determinar a seqüência dos genes de subunidade grande de AHAS de A. thaliana que não conferiram crescimento sobre o meio seletivo. Porque a função de AHAS e a seleção da tolerância a imidazolinona se encontrava em uma biblioteca secundária, encontrou-se réplicas das mesmas mutações, como determinado por meio de análise de sequência de DNA. Apenas um clone de cada foi levado a testes para determinação de concentrações crescentes de imidazolinona e inclusão na Tabelai.
Tabela 1
Plasmídio de E. coli Vetor de transformação de Arabidopsis* Mutações* Escore de tolerância de E. coli ao Imazetapir Tolerância de plantas transgênicas: melhoramento de X vezes sobre APl@(aproximado)
AE1 AP1 S653N + n.d.
AE2 AP2 A122T & S653N ++ 16
AE3 AP3 P197S & S653N + 2
AE4 AP8 A122T, R199A, &S653N n.d. 16
AE5 AP4 R199A, & S653N +++ 1,5
AE6 AP5 A122T, P197S, & S653N n.d. 8
AE7 Tipo selvagem -(IN) n.d.
AE8 AP6 A122T e R199A +++ 2
AE9 AP7 A122TeP197S n.d. 8
AE10 A122T, S57ReS398L +++ n.d.
AE11 A122T e V139I ++ n.d.
AE12 A122TeQ269H + n.d.
AE13 A122TeK416M ++ n.d.
AE14 A122TeL426I +++ n.d.
AE15 A122T e A430V +++ n.d.
AE16 A122TeN442I ++ n.d.
AE17 A122TeN445I d—h n.d.
AE18 A122TeN445D +++ n.d.
AE19 A122T e K580E +++ n.d.
AE20 A122T, V439G, D595G, e S653N + n.d.
AE21 P197SeD375N +++ n.d.
AE22 D375N não testado1^ n.d.
AE23 D375N, K83R, V254I, M277I, eD315Y + n.d.
AE24 Q95L, K416E, e S653N + n.d.
* Lista de vetores para a expressão de AtAHASL2 em E. coli (plasmídios de AE) e para plasmídios de transformação de planta (plasmídios de AP). Mutações em cada vetor são indicados relativamente à SEQ ID NO:
1.
* *
Um sistema simplificado de sinal compreendendo simples, duplo ou triplo, +, ++, ou +++ para, respectivamente, tamanho crescente das colônias, foi usado para classificar visualmente a tolerância da função de AHAS de Arabidopsis em AHAS minus E. coli contendo os plasmídios de AE na presença do inibidor de AHAS imazetapir. Um indica que não houve crescimento, significando que a combinação de mutação causou uma proteína inativa ou que não houve tolerância para imazetapir na taxa selecionada. IN significativa proteína inativa, enquanto que NT não tolerante à imidazolinona. n.d. significa que não há dados disponíveis (não testado).
t Não testado em comparação com S653N, fato de tolerância determinado com protocolo de seleção.
® Para plantas transgênicas compreendendo o vetor AP1, 18,75 μΜ imazetapir foi a maior concentração que permitiu bom crescimento das plantas nas placas de formato de microtitulação. Esta concentração foi usada como a base para determinar o múltiplo de aperfeiçoamento relativamente a AP1.
Exemplo 2
Vetores contendo gentes mutantes de AHASL de Zea mays
O gene AHASL2 de Zea mays (SEQ ID NO: 29) foi clonada no vetor de expressão bacteriana pTrcHis A (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), fundido ao vetor tag e sítio de início de tradução, começando com a base 160 da SEQ ID NO: 29. Usou-se procedimentos de subclonagem e mutagênese para criar vetores ZE2, ZE5, ZE6, e ZE7 usando ZE1 como um vetor de base. Usou-se procedimentos de subclonagem para preparar ZE3 a partir de ZE1, que é o gene AHASL2 de milho fundido ao marcador de vetor e sítio de início de tradução de pTrcHis A, começando com a base 121 da SEQ ID NO: 29. Como não se observou diferença funcional em E. coli entre ZE1 ou ZE3, usou-se procedimentos convencionais de mutagênese e subclonagem para criar vetores ZE4 e ZE8 até ZE22 usando ZE3 como um vetor de base.
Um vetor de transformação de planta com um cassete de expressão compreendendo o promotor ubiquitina do milho em combinação com um polinucleotídeo codificando o mutante S653N de AHASL2 de milho foi preparado usando-se métodos convencionais e denominado ZP1 (Figura 7). Para produzir vetores de transformação de planta para a expressão dos outros mutantes de AHASL, usou-se técnicas de clonagem para substituir segmentos de polinucleotídeo de ZP1 com fragmentos de polinucleotídeo dos vetores ZE codificando as mutações.
Os vetores de ZE23 até ZE38 foram preparados como a seguir. O vetor ZE3 foi submetido a mutagênese sítio-direcionada com saturação usando-se o kit de mutagênese multi sítio-direcionada QuikChange® Multi Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, Califórnia) de acordo com o protocolo do anexo General Guidelines for Creating Engineered Mutant Clone™ Collections [Diretrizes gerais para criar coleções de mutantes manipulados Clone™]. Oligonucleotídeos mutagênicos que poderíam gerar todos os códons possíveis nos sítios críticos da subunidade grande de AHAS do milho foram usados em diversas combinações para criar uma coleção de mutantes com substituições nos radicais A90, M92, P165, R167, S621, e G622. Os plasmídios de coleção de mutantes foram transformados em E. coli com deficiência de AHAS e plaqueados sobre meio de agar LB suplementado com 100 ug por litro de carbenicilina. Colônias disto foram pontilhadas em sais M9 a uma concentração de lx (para um tamponador isotônico) em placas de microtitulação e, depois, replicados em meio agar mínimo sem aminoácidos de cadeia ramificada e contendo imazetapir 150 micromolar. Aquelas colônias que cresceram neste meio seletivo apresentaram um gene mutante de AHAS de milho funcional que também foi tolerante à imidazolinona.
A sequência de DNA do gene de subunidade grande de AHAS do milho foi determinada para cada uma das colônias de crescimento positivo. Não se realizou qualquer esforço para determinar a sequência dos genes de subunidade grande de AHAS do milho que não conferiram crescimento sobre o meio seletivo.
Tabela 2
Plasmídeo de E. coli Vetor de transformação do milho Mutações* Escore de tolerância de E. coli à imidazolinona Escore de tolerância da planta de milho integral @
ZE1 - S621N + n.d.
ZE2 - tipo selvagem - (NT) n.d.
ZE3 - tipo selvagem -(NT) n.d.
ZE4 ZP1 S621N + +
ZE5 - W542L, S621N -(IN) n.d.
ZE6 ZP4 P165S, S621N + +
ZE7 - W542L -(NT) n.d.
ZE8 - M92E, S621N -(IN) n.d.
ZE9 ZP5 R167S, S621N +++ +++
ZE10 ZP2 A90T,S621N +++ +++
ZE11 ZP3 A90T, R167S, S621N +++ +++
ZE12 ZP9 M92I, S621N +++ +++
ZE13 - R167A, S621N n.d. n.d.
ZE14 - A173V, S621N ++ n.d.
ZE15 ZP8 A90T, M92I +++ +++
ZE16 ZP10 A90T, M92E n.d. n.d.
ZE17 ZP6 A90T, R167A +++ +++
ZE18 P165S - (NT) n.d.
ZE19 - P165S, R167A -(NT) n.d.
ZE20 - T171I, S621N + n.d.
ZE21 ZP7 A90T ++ +++
ZE22 - A90T, P165S +++ n.d.
ZE23 ZP11 A90Q +++ +++
ZE24 ZP12 A90Q, M92L ++ +++
ZE25 - A90Q, M92I +++ n.d.
ZE26 - A90C ++ n.d.
ZE27 - A90M, M92I + n.d.
ZE28 - P165E, R167F - (NT) n.d.
ZE29 - P165V, R167A -(NT) n.d.
ZE30 - P165E, R167T + +
ZE31 - PI651, R167D -(IN) n.d.
ZE32 - P165I, R167E + n.d.
ZE33 - M92I, P165E, R167A - (NT) n.d.
ZE34 - A90M, P165R, R167C -(IN) n.d.
ZE35 - M92N, S621G +++ n.d.
ZE36 - P165S, R167N, S621V, G622D +++ n.d.
ZE37 - S621W +++ n.d.
ZE38 - P165S, R167C, W542M +++ n.d.
* Lista de vetores para a expressão de ZmAHASL2 em E. coli (plasmídios de ZE) e para plasmídios de transformação de planta (plasmídios de ZP). Mutações em cada vetor são indicadas relativa à SEQ ID NO: 2.
Φ *
Um sistema simplificado de sinal simples, duplo ou triplo, +, ++, ou +++ para, respectivamente, tamanho crescente das colônias, foi usado para classificar visualmente a tolerância da função de AHAS no milho em AHAS minus E. coli contendo os plasmídios de ZE na presença do inibidor de AHAS imazetapir. Um indica que não houve crescimento, significando que a combinação de mutações causou uma proteína inativa ou que não houve tolerância para imazetapir na taxa selecionada. IN significa proteína inativa, enquanto que NT significa não tolerante à imidazolinona. n.d. significa dados não disponíveis (não testado).
® Os escores de tolerância da planta de milho integral baseiam-se em resultados combinados de testes conduzidos no viveiro e em múltiplos sítios no campo ao longo de várias estações de crescimento. O sistema de classificação para a tolerância da planta de milho integral foi o mesmo descrito acima para a tolerância de E. coli à imidazolinona. Note-se que todas as construções de ZP com escores +++ são tolerantes a mais de
100 trezentas gramas de imazamox por hectare, o que representa a maior taxa de pulverização testada.
Exemplo 3
Ensaio de complementação de E. coli
A cepa de E. coli JMC1 (genótipo \ilvB1201 ilvHI2202 rbs221 ara thi delta(pro-lac) recA56 srlC300::Tnl0\, DE(hsdR)::Cat) é um knockout [inibido] para todas as cópias de ilvG do gene de AHASL de E. coli nativao. Esta cepa só pode crescer em meio de crescimento mínimo que não apresenta leucina, isoleucina, e valina se AHASL for complementado por um gene de AHASL exógeno (ver Singh, et al. (1992) Plant Physiol. 99, 812816; Smith, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 4179-4183). Este ensaio de complementação de E. coli foi usado para selecionar a atividade da enzima AHASL e a tolerância a herbicida codificada pelos vetores AE e ZE na ausência e na presença do herbicida de imidazolinona Pursuit® (imazetapir, BASF Corporation, Florham Park, NJ).
Exemplo 4
Caracterização bioquímica
Com base no crescimento durante testes de complementação ou de testes de atividade simples, determinados dos vetores de série ZE foram usados para testes de inibição de ensaio bioquímicos de AHAS em lisados brutos de E. coli. Uma cultura de 2 a 4 ml de LB contendo 50 pg/ml de carbenicilina (LB-carb) foi inoculados com uma colônia simples de JMC1 transformada com o vetor ZE a ser testado, e incubados de um dia para o outro a 37°C com agitação. No dia seguinte, usou-se de 0,5 a 1 ml de uma cultura preparada de um dia para o outro para inocular 20 ml de LB-carb, que foi incubada a 37°C com agitação até que a densidade óptica (OD) da cultura a 600 nm fosse de aproximadamente 0,6 a 0,8 unidades de OD. Adicionou-se isopropil-l-tio-beta D-galactopiranosida (IPTG) a uma concentração de 0,1 mM e as culturas foram incubadas com agitação durante de 1 a 1,5 horas. A
101 cultura foi centrifugada para pelotizar as células e o sobrenadante foi descartado. O pellet de células foi lisado com tamponador de ensaio de AHAS (como em Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171:173-179) suplementado com 10 mg/ml de lisozima e submetido a breve sonicação. A fração insolúvel foi pelotizada por meio de centrifugação e o sobrenadante usado em um ensaio para determinação da atividade de AHAS. Em cada concentração do inibidor de imazetapir usado, a atividade foi comparada com um controle não inibidor do mesmo mutante de ZE. Isto resulta em uma medição de percentual de controle.
Exemplo 5
Transformação de planta
Os vetores de AP foram transformados em A. thaliana ecotipo Col-2. As sementes TI foram selecionadas para transformação em placas com 100 nM de Pursuit® como o agente seletivo. Sementes T2 de aproximadamente vinte eventos (linhagens) de transformação independentes foram plaqueadas sobre agar MS com concentrações crescentes de Pursuit®, para se classificar aumentos de tolerância em comparação com AP1. Os vetores foram classificados por meio de comparação das maiores concentrações de Pursuit® apresentando crescimento desinibido de mudas através de exame visual. Os resultados dos experimentos de transformação de Arabidopsis são conhecidos na Tabela 1.
Sementes de diversas linhagens de Arabidopsis foram testadas com um ensaio de crescimento em placa vertical. Um placa com meio semisólido padrão Murashige e Skoog contendo 37,5 micromoles de Pursuit (imazetapir) foram pontilhadas com várias sementes em agarose a 0,1 %. A placa foi mantida verticalmente, de tal forma que as raízes pudessem crescer ao longo da superfície de agar. As sementes usadas foram: 1) ecotipo Columbia 2 de tipo selvagem; 2) o mutante csrl-2 (homozigótico para a mutação S653N de AtAHASL na cópia genômica do gene de subunidade
102 grande de AHAS); 3) Columbia 2 transformada com AP1; 4) Columbia 2 transformada com AP7; 5) Columbia 2 transformada com AP2. Note-se que os números 2 e 3 são aproximadamente equivalentes em termos de tolerância provável, porque as plantas AP1 são transformadas com um clone do fragmento de Xbal genômico de csrl-2 (SEQ ID NO: 34). A esta concentração de imazetapir, as mudas de tipo selvagem falharam em germinar, as plantas mutantes simples (transformantes csrl-2 e AP1) quase não germinaram. AP7 e AP2 produziram bom crescimento tolerante, embora as plantas AP7 pareçam apresentar ligeiramente menos crescimento de raízes. Note-se que todas as linhagens germinaram e cresceram bem sobre meio sem imazetapir. Os resultados do ensaio de crescimento em placa vertical são ilustrados na Figura 10.
Construções de ZP foram introduzidas em embriões imaturos de milho via transformação mediada com Agrobacterium. Células transformadas foram selecionadas sobre meio de seleção suplementado com 0,75 μΜ de Pursuit® durante de 3 a 4 semanas. Plantinhas transgênicas foram regeneradas sobre meio de regeneração de planta suplementado com 0,75 μΜ de Pursuit®. Plantinhas transgênicas foram enraizadas na presença de 0,5 μΜ de Pursuit®. Plantas transgênicas foram submetidas a análise TaqMan quanto à presença do transgene antes de serem transplantadas para mistura de envasamento e desenvolvidas até a maturidade em viveiro. Os resultados dos experimentos de transformação de milho são mostrados na Tabela 2. Plantas de milho transformadas com as construções ZP foram pulverizadas com taxas variadas de imazamox, em vários locais no campo e no viveiro. As classificações relativas dos dados de testes de plantas integrais de construções ZP encontram-se resumidas na Tabela 2.
Exemplo 6
Expressão de genes mutantes de AtAHASL na soja
Vetores foram preparados para expressão dos genes de
103
AtAHASL em plantas de soja transformadas. Vetores AUP2 e AUP3 foram preparados por meio de clonagem de um produto de reação em cadeia de polimerase do promotor ubiquitina de salsinha, amplificados para incorporar sítios para as enzimas de restrição Asp718 e Ncol, digeridos e ligados nos mesmos sítios de AP2 e AP3 por meio de técnicas de clonagem convencionais (ver, Figuras lie 12). AUP2 codifica uma proteína de AtAHASL com as mutações A122T e S653N, e AUP3 codifica uma proteína de AtAHASL com as mutações A122T e S653N. O vetor BAP1 foi preparado por meio de clonagem de todo o promotor, sequência codificante e sequência de região não-traduzida a 3' de AP1 em uma espinha dorsal de transformação de dicotiledôneo convencional contendo o cassete de expressão do marcador selecionável BAR, por meio de técnicas de clonagem de ponta rombuda convencionais.
Construções AP2, AUP2, e AUP3 foram introduzidas em células de meristema axilares de soja no nódulo primário de explantes de mudas via transformação mediada com Agrobacterium. Após a inoculação e o co-cultivo com Agrobacteria, os explantes foram transferidos para meio de indução de brotos sem seleção durante uma semana. Os explantes foram transferidos subsequentemente para um meio de indução de brotos com 5 μΜ de imazapir (Arsenal) durante 3 semanas para selecionar células transformadas. Explantes com leitos de brotos/calos saudáveis no nódulo primário foram transferidos então para meio de alongamento de brotos contendo 3 μΜ de imazapir até que um broto alongasse ou o explante morresse. Plantinhas transgênicas foram deixadas enraizar, transplantadas para mistura de envasamento, submetidas a análise TaqMan quanto à presença do trangene, e então desenvolvidas à maturidade em viveiro. Usouse a construção BAP1 para produzir plantas de soja transformadas de maneira similar, exceto que o agente de seleção foi BASTA.
As plantas de soja transformadas foram testadas para
104 tolerância a herbicida tanto em estudos realizados em viveiro e no campo. Para o estudo no campo, aplicou-se imazapir a uma taxa de 300 g i.a./ha no estágio V3. Para o estudo no viveiro, aplicou-se imazapir aproximadamente no estágio V2. Os resultados destes estudos encontram-se resumidos na Tabela 3.
Tabela 3
Vetor de transformação, promotor de Arabidopsis nativo Vetor de transformação, promotor ubiquitina de salsinha Mutações Tolerância máxima no viveiro (gramas de Imazapir por hectare) Tolerância máxima no campo (gramas de Imazapir por hectare)
BAP1* S653N 500 n.d.
AP2 AUP2 A122T & S653N AP2- 1000, AUP2- 1500 AP2 - n.d. AUP2 - 300
- AUP3 P197S & S653N n.d. 300**
BAP1 (figura 12) foi transformado usando-se o gene BAR para a seleção, porque a seleção de imazapir em sojas apenas com a mutação S653N não foi otimizada.
** Alguma lesão em comparação com AUP2
Exemplo 7
Seleção de transformantes
Os polinucleotídeos gerados pela invenção podem ser usados como marcadores selecionáveis para transformação de plantas. Os polinucleotídeos gerados pela invenção podem ser usados como marcadores selecionáveis para identificar e/ou selecionar plantas transformadas que podem compreendem genes de interesse adicionais. Plantas ou células de plantas transformadas com vetores contendo as formas mutantes múltiplas dos genes de subunidade grande de AHAS podem ser selecionadas dentre plantas não-transformadas ou células de plantas por meio de plaqueamento em meio mínimo, como meio MS, incorporando inibidores de AHAS ou herbicidas inibidores de AHAS, como imidazolinonas. Os tecidos ou plantas transformadas serão capazes de continuar a crescer na presença destes
105 inibidores, enquanto que tecidos ou plantas não-transformadas virão a morrer. No caso de tecidos transformados, como os tecidos não-transformados podem receber aminoácidos de cadeia ramificada dos tecidos transformados, os tecidos de crescimento ativo são removidos dos tecidos de crescimento mais lento ou em vias de morrer, e replaqueados sobre meio seletivo.
Plantas inteiras também podem ser selecionadas por meio de plantio das sementes e espera pela germinação e crescimento de mudas, seguido de pulverização das mudas com inibidores de AHAS ou herbicidas inibidores de AHAS, como imidazolinonas. As plantas transformadas sobreviverão, enquanto que as plantas não-transformadas virão a morrer.
Exemplo 8
Ensaios de campo com milho transformado
Realizou-se ensaios de campo para avaliar se plantas de milho transformadas com um dos vetores compreendendo mutantes duplos e triplos de AHASL apresentaram ou não quaisquer efeitos fisiológicos ou reprodutivos, com e sem uma aplicação de imazamox.
Materiais e Métodos
Fonte do material de teste
O organismo geneticamente modificado foi produzido transformando-se milho congênito J553. Sementes híbridas F1 de construções de vetor 8 foram produzidas usando TR5753 como um testador masculino congênito. As construções de vetores são descritas na Tabela 4. Sementes do ensaio foram produzidas em um bloco de cruzamento isolado na ilha de Kauai, Hawaii, E.U.A. durante a contra-estação de 2006-2007. Sub-amostras de cada híbrido F1 produzido foram analisadas quanto à presença da construção de vetor correta e à ausência de presença adventícia de outras construções de AHASL.
Híbridos comerciais não-transformados foram adquiridos de empresas de sementes de milho do meio-oeste dos Estados Unidos e
106 analisados para confirmar a ausência de qualquer presença adventícia de outras construções de AHASL.
Tabela 4
Construção pZm UBI + mutações I::c-ZmAHAS L2::t-ZmAHAS L2 (na designação)
1 P197S
2 A122T, R199A
3 A122T
4 A122T, M124I
5 ML24I, S653N
6 A122T, S653N
7 A122T, R199S, S653N
8 S653N
Metodologia de ensaio
O projeto do ensaio foi um Canteiro Dividido em um Projeto de Bloco Completo Randomizado, sendo que o canteiro principal compreende um tratamento com herbicida, e o sub-canteiro é uma entrada de híbrido F1. Os tratamentos com herbicida tratamentos incluíram 1) não-tratados e 2) imazamox aplicado a 150 gai/ha. As entradas de híbrido Ff incluíram 29 eventos de construções de vetor 8 e 4 híbridos comerciais não-transformados (3395IR da Pioneer Hi-Bred International, Inc, Johnston, IA, E.U.A.; e 8342GLS/IT, 8546IT, e 8590IT da Garst Seed Co., Inc., Slater, IA. E.U.A.). O tamanho do canteiro foi de 2 leiras; largura da leira, 2,5 pés (76 cm); comprimento da leira, 20 pés (609 cm). Cada combinação de tratamento apresentou 4 replicações. O ensaio foi plantado em três locais. Estes locais foram: Ames, IA, E.U.A.; Estherville, IA, E.U.A.; e York, NE, E.U.A.. Todos os ensaios foram plantados durante maio de 2007.
Condições locais
O sítio em Ames, IA foi em uma rotação milho-após-milho
107 que pode ter exercido algum impacto sobre a uniformidade da emergência e o crescimento precoce porque estavam presentes quantidades significativas de resíduo de milho durante o plantio. Não se observou influências importantes sobre a lavoura devido ao tempo, doença ou insetos. O sítio em Estherville, IA recebeu chuva pesada impelida por rajadas de vento a 70 mph [112 km/h] e ventos sustentados em tomo de 40 mph [64 km/h] em 16 de julho. Observou-se lançamento das raízes substancialmente em cada canteiro. Não se observou influências importantes sobre a lavoura devido a doença ou insetos. O sítio em York, NE recebeu chuvas acima do normal em maio, julho e agosto, e não se observou problemas importantes por insetos ou doença. Resultados e discussão
Análises de dados combinadas sobre três sítios resultaram em uma construção de vetor com uma significativa diminuição de rendimento (p < 0,05) quando se compara o rendimento com ou sem a aplicação do herbicida imazamox (Tabela 5). Uma construção de vetor apresentou um aumento significativo de rendimento quanto tratada com a aplicação de imazamox. Outras características agronômicas também foram recolhidas dos três sítios de ensaio, e não se detectou diferenças significativas em uma construção quando tratadas ou não-tratadas com imazamox para as características de altura da planta, altura da orelha, lançamento do fiiste e lançamento das raízes (dados não mostrados).
O objetivo do ensaio foi o de identificar se uma aplicação herbicida de imazamox aplicada em construções de vetor que haviam sido otimizadas proporcionando tolerância incrementada ao herbicida imazamox poderia resultar em efeitos fisiológicos ou reprodutivos óbvios, primariamente o rendimento. Apenas uma construção de vetor (construção 1, mutante simples P197L) apresentou uma resposta negativa significativa (p < 0,05) para o rendimento de grãos quando tratada com imazamox. As sete construções de vetor remanescentes não apresentaram efeitos fisiológicos ou
108 reprodutivos adversos na presença ou ausência do herbicida imazamox. Os resultados destes ensaios de campo demonstram que o excelente potencial agronômico de plantas de milho transformadas com um vetor compreendendo um mutante de AHASL duplo ou triplo.
Tabela 5
Rendimento (bu/A
Descrição Herbicida (H) Não-herbicida (NH) (H/NH) % valor p
Construção # Evento Média a = 0,05 Média α = 0,05
1 4 160,68 B 175,58 BC 91,51 0,003
2 4 176,72 AB 177,05 ABC 99,81 0,94
3 4 180,59 A 179,02 AB 100,87 0,74
4 4 173.57 AB 163,79 C 105,97 0,11
5 4 173.87 AB 180,84 AB 96,14 0,10
6 4 188,02 A 178,65 AB 105,24 0,04
7 1 187.45 AB 189,03 AB 99,16 0,88
8 4 183.14 A 177,54 ABC 103,15 0,27
3395IR 168,03 AB 176,89 ABC 94,99 0,09
8590IT 181.92 AB 197,57 A 92,08 0,04
G8546IT 174.94 AB 186,74 AB 93,68 0,40
G8342GLS/IT 180,14 AB 177,53 ABC 101,47 0,84
Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados na descrição são indicativos do nível daqueles versados na arte a que esta invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patentes são incorporados aqui por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual houvesse sido indicado especificamente e individualmente como incorporado por referência.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e de exemplo para fins de clareza de compreensão, ficará óbvio que determinadas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (28)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Polípeptídeo da subunidade grande da acetohidroxiácido sintase (AHASL), caracterizado pelo fato de que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 e contém ambos (i) uma valina, treonina,
    5 glutamina, cisteína ou metionina em uma posição correspondente à posição 122 da SEQ ID NO:1 e (ii) fenilalanina, asparagina, treonina, glicina, valina, isoleucina ou triptofano em uma posição correspondente à posição 653 da SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma de outra espécie, por meio da qual uma célula ou planta contendo o referido polipeptídeo AHASL possui
    10 tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona, em que a referida sequência de aminoácidos é uma sequência mutagenizada.
  2. 2. Polipeptídeo AHASL de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo AHASL contém ambos (i) a referida treonina e (ii) a referida asparagina.
    15 3. Polipeptídeo AHASL de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo AHASL é purificado.
    4. Polipeptídeo AHASL de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo AHASL é derivado de uma planta.
    20 5. Polipeptídeo AHASL de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que, a planta é selecionada do grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, sorgo, mileto, beterraba açucareira, cana-de-açúcar, soja, amendoim, algodão, colza, canola, espécies de Brassica, mandioca, melão, abóbora, pimenta,
    25 girassol, tagetes, plantas solanáceas, batata, batata doce, tabaco, berinjela, tomate, espécies de Vicia, ervilha, alfalfa, café, cacau, chá, espécies de Salix, palmeira oleaginosa, coco, capim perene e culturas forrageiras.
    6. Método para controlar ervas daninhas na adjacência de plantas cultivadas, caracterizado pelo fato de que compreende:
    Petição 870170073273, de 28/09/2017, pág. 15/20
    i) plantar em um campo sementes compreendendo o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicaçõesl a 5; e crescer plantas cultivadas das mesmas; e ii) aplicar uma quantidade nociva a ervas daninhas de uma 5 herbicida de imidazolinona nas ervas daninhas e nas plantas cultivadas no campo para controlar as ervas daninhas.
    7. Método para identificar ou selecionar uma célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende:
    10 i) proporcionar uma célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma, em que referida célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5;
    ii) contatar a célula de planta transformada, tecido de planta,
    15 planta ou parte da mesma com pelo menos um herbicida de imidazolinona;
    iii) determinar se a célula de planta, tecido de planta, planta ou parte da mesma é afetada pelo herbicida, e iv) identificar ou selecionar a célula de planta transformada, tecido de planta, planta ou parte da mesma.
    20 8. Método para combater vegetação indesejada, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma semente compreendendo o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 com um herbicida de imidazolinona antes da semeadura e/ou após a prégerminação.
    25 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a
    8, caracterizado pelo fato de que a planta é uma árvore ou a semente é uma semente de árvore.
    10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a árvore é selecionada do grupo consistindo de: amendoeira,
    Petição 870170073273, de 28/09/2017, pág. 16/20 abacateiro, bananeira, cajueiro, árvore de citrinos, cacaueiro, coqueiro, cafezeiro, conífera, figueira, goiabeira, macadâmia, mangueira, oliveira, ornamental, mamoeiro, palmeira de óleo e árvores de chá.
    11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6
    5 a 8, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de cultura ou a semente é uma semente de cultura.
    12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a cultura é selecionada do grupo consistindo de: cevada, milho, mileto, aveia, arroz, centeio, sorgo, triticale, trigo, canola, colza, outras
    10 espécies de Brassica, algodão, cártamo, girassol, tabaco, alfafa, ervilha, amendoim, soja, espécies de Vicia, mandioca, melão, abacaxi, beterraba açucareira, cana-de-açúcar, abóbora, batata doce, batata, pimenta, berinjela, tomate, outras plantas solanáceas, outros vegetais, tagetes, Arabidopsis, manihot, espécies Salix, capim perene, culturas forrageiras e outras plantas
    15 ornamentais.
    Petição 870170073273, de 28/09/2017, pág. 17/20
    1/23
    FIGURA 1
    AHAS de Arabidopsis de comprimento pleno com tradução conceituai e aminoácidos relevantes realçados, numeração de DNA à esquerda, numeração de aminoácidos à direita.
    MetAlaAlaAlaTh rThrThrThrThrTh rSerSerSerlleSe rPheSerThrLysPr OSerProSerSerS er 25 1 ATGGCGGCGGCAAC AACAACAACAACAAC ATCTTCTTCGATCTC CTTCTCCACCAAACC ATCTCCTTCCTCCTC C
    LysSerProLeuPr OIleSerArgPheSe rLeuProPheSerLe UAsnProAsnLysSe rSerSerSerSerAr g 50 76 AAATCACCATTACC AATCTCCAGATTCTC CCTCCCATTCTCCCT AAACCCCAACAAATC ATCCTCCTCCTCCC GC
    ArgArgGlylleLy sSerSerSerProSe rSerlleSerAlaVa lLeuAsnThrThrTh rAsnValThrThrTh r 75 151 CGCCGCGGTATCAA ATCCAGCTCTCCCTC CTCCATCTCCGCCGT GCTCAACACAACCAC CAATGTCACAACCAC T
    ProSerProThrLy sProThrLys ProGl UThrPhelleSerAr qPheAlaProAspG lnProArqLysGlyA la 100 226 CCCTCTCCAACCAA ACCTACCAAACCCGAAACATTCATCTCCCG ATTCGCTCCAGATC AACCCCGCAAAGGCG CT
    K83 Q9 5
    AspIleLeuValGl UAlaLeuGluArgGl nGlyValGluThrVa lPheAlaTyrProGl yGlyAlaSerMetGlu 125 301 GATATCCTCGTCGA AGCTTTAGAACGTCA AGGCGTAGAAACCGT ATTCGCTTACCCTGG AGGTGCATCAATGGAG
    A122 M124
    IleHisGlnAlaLe UThrArgSerSerSe rIleArgAsnVal LeuProArqHisGIuG InGlyGlyValPheA la 150 376 ATTCACCAAGCCT TAACCCGCTCTTCCT CAATCCGTAAC GTCCTTCCTCGTCACGAAC AAGGAGGTGTATTCG CA
    V139
    AlaGluGlyTyrAl aArgSerSerGlyLy sProGlylleCysIl eAlaThrSerGlyPr OGlyAlaThrAsnLe u 175 4 51 GCAGAAGGATACGC TCGATCCTCAGGTAA ACCAGGTATCTGTA TAGCCACTTCAGGTC CCGGAGCTACAAATC TC
    ValSerGlyLeuAl aAspAlaLeuLeuAs pSerValProLeuVa lAlalleThrGlyGl nVa 1 ProArqArgMet 200 526 GTTAGCGGATTAGC CGATGCGTTGTTAGA TAGTGTTCCTCTTGT AGCAATCACAGGACA AGTCCCTCGTCGTATG
    P197 R199
    IleGlyThrAspAlaPheGlnGluThrP rolleValGluVaiThrArgSerlleThrL ysHisAsnTyrLeuV al 225 601 ATTGGTACAGAT GCGTTTCAAGAGACTC CGATTGTTGAGGTAA CGCGTTCGATTACGA AGCATAACTATCTTG TG
    MetAspValGluAs pIleProArgllell eGluGluAlaPhePh eLeuAlaThrSerGl yArgProGlyProVa 1 250 676 ATGGATGTTGAAGA TATCCCTAGGATTAT TGAGGAAGCTTTCTT TTTAGCTACTTCTGG TAGACCTGGACCTGT T
    LeuValAspVal ProLysAspIleGlnG InGInLeuAlalleP roAsnTrpGluGln AlaMetArgLeuProG ly 275 751 TTGGTTG AT GTTCCTAAAGATATTCAAC AACAGCTTGCGATTC CTAATTGGGAA CAGGCTATGAGATTACCTG GT
    V254 Q269
    TyrMetSerArqMe tProLysProProGl uAspSerHisLeuGl uGlnlleValAxgLe UIleSerGluSerLy s 300 826 TATATGTCTAGGATGCCTAAACCTCCGGA AGATTCTCATTTGGA GCAGATTGTTAGGT TG ATTTCTG AGTCTA AG
    M277
    LysProValLeuTy rValGlyGlyGlyCy sLeuAsnSerSerAsgGluLeuGlyArgPheValGluLeuThrG ly 325 901 AAGCCTGTGTTGTA TGTTGGTGGTGGTTG TTTGAATTCTAGC GATGAATTGGGTAGGT TTGTTGAGCTTACGG GG
    D3 15
    IleProValAlaSe rThrLeuMetGlyLe uGlySerTyrProCy sAspAspGluLeuSe rLeuHisMetLeuGl y 350 976 ATCCCTGTTGCGAG TACGTTGATGGGGCT GGGATCTTATCCTTG TGATGATGAGTTGTC GTTACATATGCTTGG A
    MetHisGlyThrVa lTyrAlaAsnTyrAl aValGluHisSerAs pLeuLeuLeuAlaPh eGlyValArgPheAsg 375 1051 ATGCATGGG ACTGT GTATGC AAATTACG C TGTGGAGCATAGTGA TTTGTTGTTGGCGTT TGGGGTAAGGTTT GAT
    D37 5
    AspArgValThrGl yLysLeuGluAlaPh eAlaSerArgAlaLy sIleValHisIleAs pIleAspSerAlaGlu 400 1126 GATCGTGTCACGGG TAAGCTTGAGGCTTT TGCTAGTAGGGCTAA GATTGTTCATATTGA TATTGAC TCGGCTGAG
    S398
    IleGlyLysAsnLy SThrProHisValSe rValCysGlyAspVa lLysLeuAlaLeuG InGlyMetAsnLysVal 425 1201 ATTGGGAAGAATA AGACTCCTCATGTGT CTGTGTGTGGTGATG TTAAGCTGGCTTTGC AAGGGATGAATAAGG TT
    K416
    2/23
    FIGURA 1
    LeuGIuAsnArqAlaGluGluLeuLysL euAspPheGlyValTrpArqABnGluLeuAsnValGlnLysGlnL ys 1276 CTTG AGAACCGA GCGGAGGAGCTTAAGC TTGATTTTGGA GTTTGGAGGAATGAGTTGAACGTACAGAAACAGA AG
    L426 A43 0 V439 N442 N44 5
    PheProLeuSerPh eLysThrPheGlyGl uAlalleProProGl nTyrAlalleLysVa ILeuAspGluLeuTh r 1351 TTTCCGTTGAGCTT TAAGACGTTTGGGG AAGCTATTCCTCCAC AGTATGCGATTAAGG TCCTTGATGAGTTGA CT
    AspGlyLysAlall elleSerThrGlyVa lGlyGlnHisGlnMe tTrpAlaAlaGlnPh eTyrAsnTyrLysLy s 1426 GATGGAAAAGCCAT AATAAGTACTGGTGT CGGGCAACATCAAAT GTGGGCGGCGCAGTT CTACAATTACAAGAA A
    ProArgGlnTrpLe uSerSerGlyGlyL euGlyAlaMetGlyP heGlyLeuProAlaA lalleGlyAlaSerVal 1501 CCAAGGCAGTGGCT ATCATCAGGAGGCCT TGGAGCTATGGGATT TGGACTTCCTGCTGC GATTGGAGCGTCTGT T
    AlaAsnProAspAl alleValValAspll eAspGlyAspGlySe rPhelleMetAsnVa lGlnGluLeuAlaTh r 1576 GCTAACCCTGATGC GATAGTTGTGGATA TTGACGGAGATGGAA GCTTTATAATGAATG TGCAAGAGCTAGCCA CT
    IleArgValGluAs nLeuProValLysVa lLeuLeuLeuAsnAs nGlnHisLeuGlyMe tValMetGlnTrpGlu 1651 ATTCGTGTAGAGAA TCTTCCAGTGAAGGT ACTTTTATTAAACAA CCAGCATCTTGGCAT GGTTATGCAATGGG AA
    W574
    AspArqPheTyrLysAlaAsnArgAlaH isThrPheLeuGlyA spProAlaGlnGluA spGluIlePheProAsn 1726 GATCGGTTCTACA AAGCTAACCGAGCTC ACACATTTCTCGGGG ATCCGGCTCAGGAGG ACGAGATATTCCCGA AC
    K58 0 D59 5
    MetLeuLeuPheAl aAlaAlaCysGlyll eProAlaAlaArgVa lThrLysLysAlaAs pLeuArgGluAlall e 1801 ATGTTGCTGTTTGC AGCAGCTTGCGGGAT TCCAGCGGCGAGGGT GACAAAGAAAGCAGA TCTCCGAGAAGCTAT T
    GlnThrMetLeuAs pThrProGlyProTy rLeuLeuAspValIl eCysProHisGlnGl uHisValLeuProMe t 1876 CAGACAATGCTGGA TACACCAGGACCTTA CCTGTTGGATGTGAT TTGTCCGCACCAAGA ACATGTGTTGCCGAT G
    IleProSerGlyGlyThrPheAsnAspV alIleThrGluGlyA spGlyArglleLysT yr***
    1951 ATCCCG AGTGGTGGCACTTTCAACGATG TCATAACGGAAGGAG ATGGCCGGATTAAAT ACTGA
    S653/G654
    670
  3. 3/23
    FIGURA 2
    AHAS de milho de comprimento pleno com tradução conceituai e aminoácidos relevantes realçados, numeração de DNA à esquerda, numeração de aminoácidos à direita.
    Me tAlaThrAlaAlaAl aAlaSerThrAlaLe UThrGlyAlaThrTh rAlaAlaProLysAl aArgArgArgAla ATGGCCACCGCCGCCGC CGCGTCTACCGCGCT CACTGGCGCCACTAC CGCTGCGCCCAAGGC GAGGCGCCGGGCG
    Ki SLeuLeuAlaThrAr gArgAlaLeuAlaAl aProIleArgCysSe rAlaAlaSerProAl aMetProMetAla CACCTCCTGGCCACCCG CCGCGCCCTCGCCGC GCCCATCAGGTGCTC AGCGGCGTCACCCGC CATGCCGATGGCT
    EroProAlaThrProLe uArgProTrpGlyPr OThrAspProArqLysGIyAlaAspIleLe UValGluSerLeu CCCCCGGCCACCCCGCT CCGGCCGTGGGGCCC CACCGATCCCCGCAA GGGCGCCGACATCCT CGTCGAGTCCCTC P51 D63
    GluArgCysGlyValAr gAspValPheAlaTy rProGlyGlyAlaSe rMetGluIleHisGl nAlaLeuThrArg GAGCGCTGCGGCGTCCG CGACGTCTTCGCCTA CCCCGGCGGCGCGTC CATGGAGATCCACCA GGCACTCACCCGC
    A90 M92
    SerProValIleAlaAs nHisT.euPhe Ar qHi SGluGlnGlyGluAl aPheAlaAlaSerGl yTyrAlaArgSer TCCCCCGTCATCGCCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAAGGGGAGGC CTTTGCGGCCTCCGG CTACGCGCGCTCC
    H107
    SerGlyArgValGlyVa lCysIleAlaThrSe rGlyProGlyAlaTh rAsnLeuValSerAl aLeuAlaAspAla TC GGGCCGCGTCGGCGT CTGCATCGCCACCTC CGGCCCCGGCGCCAC CAACCTTGTCTCCGC GCTCGCCGACGCG
    LeuLeuAspSerValPr OMetValAlalleTh rGlyGlnValProAr gArgMetlleGlyTh rAspAlaPheGln CTGCTCGATTCCGTCCC CATGGTCGCCATCAC GGGACAGGTGCCGCG ACGCATGATTGGCAC CGACGCCTTCCAG
    P165 RI67 Al73
    G1 UThrProIleValGl uValThrArgSerll eThrLysHisAsnTy rLeuValLeuAspVa lAspAspIlePro GAGACGCCCATCGTCGA GGTCACCCGCTCCAT GACCAAGCACAACTA CCTGGTCCTCGACGT CGACGACATCCCC
    ArgValValGlnGluAl aPhePheLeuAlaSe rSerGlyArgProGl yProValLeuValAs pileProLysAsp CG CGTCGTGCAGGAGGC TTTCTTCCTCGCCTC CTCTGGTCGACCGGG GCCGGTGCTTGTCGA CATCCCCAAGGAC
    1222
    IleGlnGlnGlnMetAl aValProValTrpAs pLy3ProMetSerLe uProGlyTyrIle AlaArgLeuProLys ATCCAGCAGCAGATGGCGGTGCCTGTCTGGGACAAGCCCATGAGTCTGCCTGGGTACATTGCGCGCCTTCCCAAG
    K237 1245
    ProProAlaThrGluLe ULeuGluGlnValLe uArgLeuValGlyGl uSerArgArgProVa lLeuTyrValGly CC CCCTGCGACTGAGTT GCTTGAGCAGGTGCT GCGTCTTGTTGGTGA ATCCCGGCGCCCTGT TCTTTATGTTGGC
    G1 yGlyCysAlaAlaSe rGlyGluGluLeuArgArgPheValGluLe UThrGlylleProVa lThrThrThrLeu GGTGGCTGCGCAGCATC TGGT GAGGAGTTGCG ACGCTTTGTGGAGCT GACTGGAATCCCGGT CACAACTACTCTT
    E283
    MetGlyLeuGlyAsnPh eProSerAspAspPr oLeuSerLeuArgMe tLeuGlyMetHisGl yThrValTyrAla ATGGGCCTCGGCAACTT CCCCAGCGACGACCC ACTGTCTCTGCGCAT GCTAGGTATGCATGG CACGGTGTATGCA
    AsnTyrAlaValAspLys AlaAspLeuLeuLeu AlaLeuGlyValArg PheAspAspArgVa lThrGlyLysIle AATTATGCAGTGGATAAGGCCGATCTGTTGCTTGCACTTGGTGTGCG GTTTGATGATCGTGTGACAGGGAAGATT
    D343
    GluAlaPheAlaSerAr gAlaLysIleValHi SValAspIleAspProAlaGluIleGlyLy sAsnLysGlnPro GAGGCTTTTGCAAGCAG GGCTAAGATTGTGCA CGTTGATATTGAT CCGGCTGAGATTGGCAA GAACAAGCAGCCA
    P36 6
    Hi sValSerlleCysAl aAspValLys LeuAlaLeuGlnGlyMetÃsn AlaLeuLeuGluGlySerThrSerLys CATGTGTCCATCTGTGC AGATGTTAAGCTTGCTTTGCAGGGCATGAAT GCTCTTCTTGAAGGAAGCACATCAAAG
    K384 L394 T398
    LysSerPheAspPheGl ySerTrpAsnAspGluLeuAspGlnGlnLysArqGluPheProLe UGlyTyrLysThr AAGAGCTTTGACTTTGG CTCATGGAACGATGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAATTCCCCCT TGGGTATAAAACA
    S407 D410 D413
  4. 4/23
    FIGURA 2
    SerAsnGluGluIleGl nProGlnTyrAlall eGlnValLeuAspGl ULeuThrLysGlyGl uAlallelleGly 4 SO 1276 TCTAATGAGGAG ATCCAGCCACAATAT GCTATTCAGGTTCTT GATGAGCTGACGAAAGGCGAGGCCATCATC GGC
    ThrGlyValGlyGlnHi sGlnMetTrpAlaAl aGlnTyrTyrThrTy rLysArgProArgGl nTrpLeuSerSer 4 75
    13 51 ACAGGTGTTGGGCAGCA CCAGATGTGGGCGGC ACAGTACTACACTTA CAAGCGGCCAAGGCA GTGGTTGTCTTCA
    AlaGlyLeuGlyAlaMe tGlyPheGlyLeuPr OAlaAlaAlaGlyAl aSerValAlaAsnPr oGlyValThrVal 5 00
    14 26 GCTGGTCTTGGGGCTAT GGGATTTGGTTTGCC GGCTGCTGCTGGTGC TTCTGTGGCCAACCC AGGTGTTACTGTT
    ValAspIleAspGlyAs pGlySerPheLeuMe tAsnValGlnGluLe uAlaMetlleArgll eGluAsnLeuPro 5 25 1501 GTTGACATCGATGGAGA TGGTAGCTTTCTCAT GAACGTTCAGGAGCT AGCTATGATCCGAAT TGAGAACCTCCCG
    Va lLysValPheValLe UAsnAsnGlnHisLe uGlyMetValValGl nTrpGluÃspArgPh eTyrLysAlaAsn 5 50 1576 GTGAAGGTCTTTGTGCT AAACAACCAGCACCT GGGGATGGTGGTGCA GTGGGAGGACAGGTT CTATAAGGCCAAC
    W542 K548
    ArgAlaHisThrTyrLeuGlyAsnProGluAs nGluSerGluIleTyrProAspPheValThrlleAlaLysGly 5 75 1651 AG AGCGCACACATACTT GGGAAACCCAGAGAA TGAAAGTGAGATATA TCCAGATTTCGTGAC G ATCGCCAAAGGG
    S563
    PheAsnlleProAlaVa lArgValThrLysLy sAsnGluValArgAl aAlalleLysLysMe tLeuGluThrPro 6 00 1726 TTCAACATTCCAGCGGT CCGTGTGACAAAGAA GAACGAAGTCCGCGC AGCGATAAAGAAGAT GCTCGAGACTCCA
    GI yProTyrLeuLeuAs pIlelleValProHi SGlnGluHisValLeu ProMetlleProSerGlyGlyAlaPhe 6 25 1801 GG GCCGTACCTCTTGGA TATAATCGTCCCACA CCAGGAGCATGTGTT GCCTATGATCCCTAG TGGTGGGGCTTTC
    S62 1/G622
    IjysAspMetlleljeuAs pGlyAspGlyArgTh rValTyr***
    1876 AAGGATATGATCCTGGA TGGTGATGGCAGGAC TGTGTACTGA
  5. 5/23
    FIGURA 3
    1-AtAHASL
    2-ZmAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
  6. 6- HaAHASL2
  7. 7- HaAHASL3
  8. 8- ZmAHASLl
  9. 9-AsAHASL
  10. 10- BnAHASLlC
  11. 11- BnAHASL2A
  12. 12— CmAHASLl
  13. 13- CmAHASL2
  14. 14- SpAHASL
  15. 15- SbAHASL
  16. 16- StAHASLl
  17. 17- StAHASL2
  18. 18- GmAHASL
  19. 19- XsAHASL
  20. 20- LmAHASL
  21. 21- TaAHASLlA
  22. 22- TaAHASLlB
  23. 23- TaAHASLlD
  24. 24-GHAHASA5
  25. 25-GHAHASA19
  26. 26- IlvB
  27. 27- IlvG
  28. 28- IlvI
    .......MAA
    .........M
    ........MA
    ........MA
    ......MAA1
    .........M
    .........M
    MVTLNHISSF
    .........M
    .........M
    ATTTTTTSSS
    ATAAAASTAL •MAAATSSSP
    TTAAAAAAAL
    APPNPSISFK
    HPPHPS1TAK
    AVPLTFXSGK
    ATAATAAAAL
    TKPNKTYLQS .MAAATSSSP
    ......MASF
    AAATTTSSSS
    AAATTTSSSS
    ISFSTKPSPS TGATTAAP. ISLTAKPS. SAAATAKTG PPSPAAALP PPPSSAAA PPFSATPS TGATTATP SIYAIPFS ISLTAKPS SFFGTIPS IPFSTKHS IPFSTKPS
    SSKSPLPISR
    SKSPLPISR
    PRSAFLPR ..VALPPH ...QLTTN
    ..NSLKPT SKSPLPISR ..SPTKASV SSKSPLPISR SSKSPLPISR
    FSLPFSLNPN .KARRRAHLL FSLPFSLTPQ RKNHQRHHVL FALPITSTTQ FAFSITSTSH LSLPLTLLPI •KSRRRAHHL SSSSILAALF FSLPFSLTPQ FSLPVSVTTL FTLPFSLNPN FTLPFSLNPN
    ........MA
    .......MAA
    ......MAAA
    ......MAAI
    .........M
    TTAAAAAAAL ASPSPCFSKN ASPSPCFSKT ..MAATASRT PHTNPSXTTK ATATSTAVAF
    AGATTAAP
    LPPSSSKS
    LPPSSSKS
    TRFSSSSS
    PPSSPPRP
    SGATATLP
    ....SILLPK ....STILPR HPTFPKRITR .....TFLAR .KARRRAHLL
    STFTFHNHPK
    STFPFHNHPQ
    STLPLSHQTL
    FTFPITSTSH
    KPRTLPRHLL
    .......... MAAATAHSAL PKLSTLTS
    .......... MAAATSNSAL PKLSTLTS
    SFKSSIPISK SSLPFSTTPQ SFKSSIPISK SSLPFSTTPQ
    1-ÁtAHASL
    2-ZmAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    KSSSSS.RRR GIKSSSPSSI SAVLNTTTNV TTT.PSPT..
    ATR..............RAL AAPIRCSAAS PAMP......
    KPSS........RLHRPLAI SAVLNSPVNV AP.......E
    PARG.............RVG AAAVRCSAVS PVTPP.....
    KRHR..........LHISNV LSDSK....S TTTTT.TTTQ
    KRHR..........LHISNV LSDST. . . .T TTGAT.....
    IPSK..........THVSKH LIITN....A IAKHS.....
    ATR..............RAL AAPIRCSALS RATP......
    KSHH..........LLLQSP KPKPP....S ATITQSPSSL
    KDSS...... ..RLHRPLAI SAVLNSPVNV APP.SP...E
    PSFP.........RRRATRV SVSANSKKDQ DRT.AS....
    KSSSSSSRRR GIKSTALS.I SAVLNTTTNV STT.TPQSKP KSSS...RRR GIKSTSLS.I SAVLNTTTNV STT.TPPSKP kpiHpètfis •MAPPATPLR KTE KIKTFIS SPAPPATPLR RPIP VQPFVS •TIHPPPFVS .HSHKAFWS .TÃPPATPLR
    KPSSFVS K1KTFVS RRE SPSTFSS TKPEKKKFVS TKP EKKKFVS
    TDE
    KTE
    AAR.
    KTSP
    KASP
    TKPN
    KRHR
    PSSR
    KPTP
    KPTP
    .............RAL
    ..........LHLTHT
    ..........LHLTHT
    ...........HALKI
    ..........LHISNV
    .............RAL
    ..............LP
    ..............LP
    ..............LP
    ..........YRSFDV
    ..........YRSFDV
    AAPIRC.....SAAPPATLT
    QHHSR.FTVS NVILSTTTHN HHHRRGFAVS NVVISTTTHN
    KCSIS.....KPPTAAPFTK
    LSDSK..........PTITH
    AAPIRC.......SAVSPSP
    ARWRC......CAASPAAT
    ARI VRC......CAAS PAAT
    ARI VRC......CAAS PAAT
    SCSLSHASSN PRSAATSVTP SCSLSHASSN PRNPAASVTQ
    VTA|
    DV;
    DV,
    EA1
    SPIÍ
    SP.
    S,
    S S KN. KT.
    PJPATPLR EIFVS ETFVS EPFVS
    PfTESFIS PATALR PATALR PATALR PATALR PHDFIS PHYFIS MASSG sep:
    SEP
    ΡΙΓ
    ΆΡ
    SAAP
    SAAP
    SAAP
    IAP
    ΆΡ
    6/23
    FIGURA 3
    1-AtAHASL
    2-ZmAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    RFAP PWGPU RYAP PWGPf RYAPt RYAPC RFGPI PWGPK RFSPE RYAPC KYAPK V RFAPE Q RFAPEQ
    PWGP1
    RFAPE
    RFAPE
    RFASG
    RYAPC
    PWGPS
    PWGPS
    PWGP
    PWGP,
    RYADE
    RYADE
    TTSTF ?RKG ?RKG ?RKG ?RKG Q?RKG Q?RKG E?RKG E ?RKG E?RKG E ?RKG ?RSG ?RKG ?RKG RKG DPRKG E?RKG E?RKG ?RKG ?RKG ?RKG ?RKG ?RKG ?RKG ?RKG ?RKG 1FTG MNG 4LSG
    ME
    122 124 ADILVEALER ADILVESLER ADILVEALER ADILVEALER ADVLVEALER ADVLVEALER SDVLVEALER SDILVEALER CDVLVEALER ADILVEALER ADILVEALER ADILVEALER ADILVEALER CDVLVEALER ADILVEALER CDVLVEALER CDVLVEALER ADILVEALER ADVLVEALER ADILVEALER ADILVEALER ADILVEALER ADILVEALER ADILVEALVR ADILVEALER AEFIVHFLEQ AQWWHALRA AEMVVRSLID
    139
    QGVETVFAYP
    CGVRDVFAYP
    QGVETVFAYP
    CGVSDVFAYP
    EGVTDVFAYP
    EGVTDVFAYP
    EGVTNVFAYP
    CGVRDVFAYP
    EGVTDVFAYP
    QGVETVFAYP
    QGVDWFAYP
    QGVETAFAYP
    QGVETVFAYP
    EGVTDVFAYP
    CGVRDVFAYP
    EGVKDVFAYP
    EGVTDVFAYP
    QGVTTVFAYP
    EGVTDVFAYP
    CGISDVFAYP
    CGIVDVFAYP
    CGIVDVFAYP
    CGIVDVFAYP
    EGVKDVFAYP
    EGVKDVFAYP
    QGIKIVTGIP
    QGVNTVFGYP
    QGVKQVFGYP
    GdÃJSSsiHQA a;
    £
    A: A: AI GCA:
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    CAE
    Gl
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    GC
    A:
    A:
    A:
    TE
    ΑΞ
    ΑΞ
    AE
    AEM
    AEM
    AEM
    AEM
    AEM
    AEM
    AEM
    EM
    LTRSSSIRKV LTRSPVIAKH LTRSSTIRNV LTRSPVITKH LTRSSTIRK V LTRSNTIRK V LTRSTIIRKI LTRSPVIAK H LTRSNIIRKV LTRSSTIRKV LTRSNTIRK V LTRSSSIRKV LTRSSSIRKV LTRSNIIRKV LTRSPVIAKH LTRSNIIRKV LTRSNIIRKV LTRSAAIRKV LTRSTTIRKV LTSSPLITKH LTRSPVITK H LTRSPVITKH LTRSPVITK H LTRSKIIRKV LTRSKIIRKV LSQSTQIREI LYDGG.VEFL LHTVGGID1V
    MSIHQA MplHQA IHQA IHQA IHQA LfelHQA MSIHQA MSIHQA MSIHQA MSIHQA M SIHQA MSIHQA IHQA IHQA 3 IHQA 3 IHQA IHQA IHQA SIHQA IHQA SIHQA IHQA IHQA SIHQA ?VYDA ?VYDA 3IYDA
    IL
    AI
    1-AtAHASL 2-ZmAHASL2 3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    LPRHEQGGVF
    LFRHEQGEAF
    LPRHEQGGVF
    LFRHEQGEAF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LFRHEQGEAF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGIF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LFRHEQGEAF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LFRHEQGEAF
    LFRHEQGEAF
    LFRHEQGEAF
    LFRHEQGEAF
    LPRHEQGGVF
    LPRHEQGGVF
    LARHEQGAGF
    LCRHEQGAAM
    LVRHEQAAVH
    AAEGYARSSG
    AASGYARSSG
    AAEGYARSSG
    AASGYARASG
    AAEGYARASG
    AAEGYARASG
    AAEGYARASG
    AASAYARSSG
    AAQGYARATG
    AAEGYARSSG
    AAEGYARSSG
    AAEGYARSTG
    AAEGYARSTG
    AAEGYARATG
    AASGFARSSG
    AAEGYARATG
    AAEGYARATG
    AAEGYARSSG
    AAEGYARASG
    AASGYARASG
    AASGYARASG
    AASGYARASG
    AASGYARASG
    AAEGYARSSG
    AAEGYARSSG
    IAQGMARTDG
    AAIGYARATG
    MADGLARATG
    KPGICIATSG
    RVGVCIATSG
    KPGICIATSG
    RVGVCVATSG
    LPGVCIATSG
    VPGVCIATSG
    LTGVCISTSG
    RVGVCIATSG
    RVGVCIATSG
    KPGICIATSG
    KPGICIATSG
    KPGICIATSG
    KPGICIATSG
    FPGVCIATSG
    RVGVCVATSG
    FPGVCIATSG
    FPGVCIATSG
    LPGVCIATSG
    LPGVCIATSG
    RVGVCVATSG
    RVGVCVATSG
    RVGVCVATSG
    RVGVCVATSG
    IPGVCIATSG
    ISGVCIATSG
    KPAVCMACSG
    KTGVCIATSG
    EVGVVLVTSG
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSAL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSAL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSAL
    PGATNLVSGF
    PGATNLVSGL
    PGAMNLVSGL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSAL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSGL
    PGATNLVSAL
    PGATNLVSAL
    PGATNLVSAL
    PGATNLVSAL
    PGATNLVSGL
    PGRTNLVSGL
    PGATNLVTAI
    PGATNLITGL
    PGATNAITGI
    ADALLDSVPL
    ADALLDSVPM
    ADAMLDSVPL
    ADALLDSVPM
    ADALLDSVPM
    ADALLDSVPM
    ADALLDSVPI
    ADALLDSVPM
    ADALLDSVPL
    ADAMLDSVPL
    ADALFDSVPL
    ADALLDSVPL
    ADALLDSVPL
    ADALLDSIPI
    ADALLDSVPM
    ADALLDSIPI
    ADALLDSIPI
    ADALMDSVPV
    ADALLDSVPM
    ADALLDSIPM
    ADALLDSIPM
    ADALLDSIPM
    ADALLDSIPM
    ADAMLDSIPL
    ADAMLDSIPL
    ADARLDSIPL
    ADALLDSIPV
    ATAYMDSIPL
    7/23
    FIGURA 3
    197 199 205
    1-AtAHASL 2-ZmAHASL2 3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLIA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    VAITGqUpHÃ
    P3R
    VAITGQV
    VAITGQV
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    VAITGQV
    VAITGQV
    VAITGQV
    VAITGQV
    VAITGQV
    VAITGQV
    IAITGQV
    VAITGQV
    VAITGQV
    VAITGQV
    VAITGQV P
    VAITGQV P
    VAITGQV P
    R PfeR 3R ?R
    3N
    P’R
    P?R
    P!R
    P’R ’R
    P3R
    P?R
    3R
    3R
    ÍR
    VAITGQVP3R
    VAITGQV P VAITGQV VAITGQV P VAITGQVP VAITGQVP VAITGQV VAITGQV ICITGQV VAITGQV
    S %
    VVLSGQV a[S
    MIGTEA ?QET MIGTEÃ 'QET MIGTEA'QET MIGTIA 'QET MIGTI A 'QET MIGTEA'QET MIGTIA 'QET MIGTCA: MIGTIa· MIGTIa· MIGTK a! MIGTIa MIGTIa· MIGTIa! migtia; MIGTIa! migtia MIGTIa! migtiaί
    QET QET QET 'QET QET QET QET 'QET QET •QET QET 'QET MIGTÜAlTQET
    ΌΕΤ
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    QET pQET 'QET •QEV
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    MIGTIa migtia migtia migtia migtia migtia figtia
    LIGYIA'QEC
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVSRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PVVEVTRTIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVSRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
    PIVEVTRSIT
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    DMVGISRPW
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    KHNYLVLDVE
    KHNYLVMDVD
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    KHNYLVMDVE
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    KHNYLILDVD
    KHNYLVLDVE
    KHNYLVLDVE
    KHNYLVLDVE
    KHNYLVLDVE
    KHNYLVLDVE
    KHNYLVLDVD
    KHNYLVLDVD
    KHNYLVRHIE
    KHSFLVQSLE
    KHSFLVKQTE
    DIPRIIEEAF
    DIPRVVQEAF
    DIPRIVQEAF
    DIPRVIQEAF
    DIPRIVREAF
    DIPRIVREAF
    DIPRIVHEAF
    DIPRVVQEAF
    DIPRIVREAF
    DIPRIVQEAF
    DIPRIVREAF
    DIPRIVEEAF
    DIPRIVEEAF
    DIPRIVREAF
    DIPRVVQEAF
    DIPRWREAF
    DIPRVVREAF
    DIPRVVAEAF
    DIPRIVREAF
    DIPRVIQEAF
    DIPRVIQEAF
    DIPRVIQEAF
    DIPRVIQEAF
    DIPRIVSEAF
    DIPRIVSEAF
    ELPQVMSDAF
    ELPRIMAEAF
    DIPQVLKKAF
    1-AtAHASL
    2-ZmAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASL1
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLIB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    FLATSGRPGP
    FLASSGRPGP
    FLATSGRPGP
    FLASSGRPGP
    YLASSGRPGP
    YLASSGRPGP
    FLASSGRPGP
    FLASSGRPGP
    FLANSGRPGP
    FLATSGRPGP
    FLATSVRPGP
    FLATSGRPGP
    FLATSGRPGP
    FLAKSGRPGP
    FLASSGRPGP
    FLAKSGRPGP
    FLAKSGRPGP
    FVATSGRPGP
    YLASSGRPGP
    FLASSGRPGP
    FLASSGRPGP
    FLaSSGRPGP
    FLASSGRPGP
    FLASSGRPGP
    FLASSGRPGP
    RIAQSGRPGP
    DVACSGRPGP
    WLAASGRPGP
    VLVE
    VLVE
    VLVI
    VLIE
    254
    VLVljybKDIQ I?KDIQ V?KDIQ I?KDIQ V ?KDIQ
    VLIE V ?KDIQ
    VLIE
    VLVE
    VLIE
    VLVE
    VLIE
    VLVE
    VLIE
    VLVEI VLVE 1 VLVEI VLIE V; VLIEV:
    : I?KDIQ I?KDIQ I?KDIQ VLVE V ?KDIQ VLIE V?KDVQ VLVE V ?KDIQ :V ?KDIQ :v?kdiq :i?kdiq :v?kdiq VLIEV?KDIQ VLIEI?KDVQ VLIEV?KDIQ VLVEI?KDIQ I?KDIQ I?KDIQ IpKDIQ PKDIQ PKDIQ VHiqiPKDVQ
    VLVE
    VWE
    I PKDIQ L PKDIL
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    .....PAM
    .......T . . ..WPES
    I \RLPKPPA. 3RLPQPPE. \RLPKPPA.
    L3RMPKPQY. L 3RMPKPQY. I3RLPKPPN. IVRLPKPPA.
    3RLPKPTFS M3RLPQPPE. 3TMPKPPK. 3RMPKPPE. 3RMPKPPE. M3RLPKLPN. IRLPKPPA. 3RLPKLPN. 3RLPKLPN. L\RLPRPPA. 3RLPKTEN. \RLPKPPA. 1RLPKPPS. 1RLPKPPS. IRLPKPPS. 3RLPKAPG. 3RLPKAPA. A 3KAAAPAFS V 2NEVTFPHA 3MRSYNPTT
    8/23
    FIGURA 3
    1-AtAHASL
    2-ZmAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLIA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI . ..DSHLEQI . ..TELLEQV . ..VSQLGQI . ..TELLEQV ...DGHLEQI . ..DGHLEQI . . .ETHLRQI ...TEFLEQV ANEEGLLDQI ...VSQLGQI ...VSHLEQI ...DSHLEQI ...DSHLEQI ...EMLLEQI ...TELLEQV ...EMLLEQI ...EMLLEQI ...EAQLEHI ...NGQLEHI ...TELLEQV ...TESLEQV ...TESLEQV ...TESLEQV ...EAHLEQI ...EAHLEQI ...EESIRDA
    .....EVEQA
    TGHKGQIKRA
    1-AtAHASL
    2-ZmAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    TLMGLGSYPC
    TLMGLGNFPS
    TLMGLGSYPC
    TLMGLGNFPS
    TLMGLGAYPA
    TLMGLGAYPÁ
    TLMGLGTYPG
    TLMGLGNFPS
    TLMGLGAFPC
    TLMGLGSYPC
    TFMGLGSYPC
    TLMGLGAYPC
    TLMGLGAYPC
    TLMGLGAFPT
    TLMGLGNFPG
    TLMGLGAFPV
    TLMGLGAFPT
    TLMGLGTFPI
    TLMGLGAYPA
    TLMGLGNFPS
    TLMGLGNFPS
    TLMGLGNFPS
    TLMGLGNFPS
    TLMGLGAFPI
    TLMGLGAFPI
    TLMALGMLPK
    TLKGLGAVEA
    SLMGLGAFPA
    VRLISESKKP
    LRLVGESRRP
    VRLISESKRP
    LRLVGESRRP
    VRLVGEAKRP
    VRLVGEAKRP
    VRFIKESKRP
    LRLVGESRRP
    VRLVGESKRP
    VRLISESKRP
    LRLVSESKRP
    VRLISESKKP
    VRLISESKKP
    VRLISESKKP
    LRLVGESRRP
    VRLISESKKP
    IRLISESKKP
    VRLIMEAQKP
    VRLVSEAKRP
    LRLVGEERRP
    LRLVGESRRP
    LRLVGESRRP
    LRLVGESRRP
    VRLVSESKKP
    VRLVSESKKP
    AAMINAAKRP
    RQMLAKAQKP
    LQTLVAAKKP
    D.DELSLHML D.DPLSLRML N.DELSLQML D.DPLSLRML S.SDLSLHML S.SDLSLHML
    S. HDLSLHML D.DPLSLRML
    T. DDLSLQML N.DELSLQML DDEEFSLQML D.DELSLHML D.DELSLHML G.DELSLQML D.DPLSLRML G.DELSLQML G.DELSLQML G.DEYSLQML S.SDLSLHML D.DPLSLRML D.DPLSLRML D.DPLSLRML D.DPLSLRML S.DDLSLQML
    S. DELSLQML A.HPLSLGML D.YPYYLGML
    T. HRQALGML
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    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGTVYANY
    GMHGVRSTNY
    GMHGTKAANF
    GMHGTYEANM
    315 lnssE AASCÊ LNSEE SASCD LNSED LNSED MNSED AASGE LNSSE LNSEE LNSEE LNSSE LNSS E SQSS E AASC E
    LGRF
    LRRF
    LGRF
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    LGRF iLRRF iLRRF
    TQSS E 3LRRF LQSS E 3LRRF LNSS A 3LRRF LNSG D CLRRF
    3VRRF
    LRRF
    LRRF
    LRRF
    LKRF
    LKRF
    SASCE
    AASGE
    AASGE
    AASGE
    LNSSE
    LNSSE
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    AVEHSDLLLA
    AVDKADLLLA
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    AVDKADLLLA
    AVDKSDLLLA
    AVDKSDLLLA
    AIDKSDLLLA
    AVDKADLLLA
    AVDKADLLLA
    AVEHSDLLLA
    AVEYSDLLLA
    SVEHSDLLLA
    SVEHSDLLLA
    AVDSSDLLLA
    AVDKADLLLA
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    AVDGSDLLLA
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    AVDKSDLLLA
    AVDKADLLLA
    AVDKADLLLA
    AVDKADLLLA
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    AVDKSDLLLA
    AVDKSDLLLA
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    VELTGIPVAS
    VELTGIPVAS
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    VELTGIPVTT
    VELTGIPVAS
    VELTGIPVAS
    VELTGIPVAS
    VELTGIPVAS
    VELTGIPVAS
    VELTGIPVAS
    VEMTGIPVTT
    VELTGIPVAS
    VELTGISVAS
    VELTGIPVAS
    VELTGIPVAS
    VELTGIPVTT
    VELTGIPVTT
    VELTGIPVTT
    VELTGIPVTT
    VELTGIPVAS
    VELTGIPVAS
    AEKAQLPTTM
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    VEALNLPWC
    375
    FGVREÍÕbRVT
    D JRVT D3RVT D5RVT 3RVT DIRVT 3RVT 3RVT 5RVT IRVT 3RVT IRVT IRVT 3RVT }RVT 5RVT 3RVT 5RVT 3RVT D5RVT D5RVT 3RVT IRVT 3RVT DRVT IRAI 3RVT 3RTT
    LGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE FGVRE LGARE VGARE VGVRE D
    9/23
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    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    GKLEAFASRA
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    GKLEAFASRA
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    GKLEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKIEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKLEAFASRA
    GKIEAFASRS
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    GKIEAFASRS
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    GKLEAFASRA
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    398
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    KIVHIDIC KIVHVDIC KIVHIDIC KIVHIDIC KIVHIDIC KIVHIDIC KIVHIDIC KIVHIDIC KIVHIDIC KIVHIDIC KIVHIDIÍ KIVHIDIÍ KIVHIDIÍ KIVHIDIÍ KIVHIDIÍ KIVHIDIÍ KIVHIDIÍ KIVHIDIÍ KIVHIDIÍ KIVHIDIC KIVHIDIC KIVHIDIC P KIVHIDIC P. KIVHIDICS KIVHIDICS KIIHVDICRh SVIHMDICP1 TVLHIDICP
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    EIGKNKTPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHF
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKTPHV
    EIGKNKTPHV
    EIGKNKTPHV
    EIGKNKTPHV
    EIGKNKLPHA
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQAHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHV
    EIGKNKQPHM
    ELGKIKQPHV
    EMNKLRQAHV
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    416
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    SVCADI K LAL SICGD3 K /AL SICAD1 K SICAD1 K SICADIK SICADÍK SVCSDli K SVCSDVK
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    LAL
    LAL
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    426
    NR GS NR LpQS EK EK LÈRG
    QGMNK1 QGMNAI QGMNKD QGLNAI QGLNKI QGLNKI QGLNKI
    QGMNTI L|2GS QGLNKI QGMNK1L QGMNE1Í L QGMNK1L QGMNKV QGLNS1 QGMNAI QGLNS1 QGLNS1 KGINM1 QGLNKI QGLNAI QGLNAI QGLNAI QGLNDI QGINK1 QGINK3 AQLIPI PALQQE
    PSR
    NR
    NR
    2NR
    2NR
    SGK
    SGS
    SGK
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    4- OsAHASL
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    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IIvI
    430 fySELKLDFG. KKSFDFG. ELKLDFG. TKTSSDFS. 3VTNLDFS. ..SLDFS. DLDFDFS. KKSFDFG. KLKLDFS. ELKLDFG. ..DVLDFG. ELKLDFG. ELKLDFG. KLKLDFS. 3KKSFDFG. □KLKLDFS. □KLKLDFS. /EGKFDLG. VTNLDFS. DKSFDFA. 1QQGLDFG. 1QQGLDFG. 1QQGLDFG. KLNLDYS. 1KLNLDYS. I......A.
    439 442 445
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    K 33
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    QKFPLSFKTF
    REFPLGYKTF
    MKFPLSFKTF
    VKFPLSFKTF
    ASNPLSYKTF
    REFPLGYKIF
    KKFPLSFKSF
    QKFPLSFKTF
    LKFPLRYKTF
    QKFPLSFKTF
    QKFPLSFKTF
    VKYPLNFKTF
    REFPLGYKTF
    VKYPLNYKTF
    VKYPLSFKTF
    HKFPLGYKTF
    VKYPLSFKTF
    REFPLGYKTF
    REFPLGFKTF
    REFPLGFKTF
    REFPLGFKTF
    LKFPLSYKTF
    LKFPLSYKTF
    REFPCPIPKA
    DEHSWRYDHP
    ARQCLKYDTH
    GEAIPPQYAI NEEIQPQYAI GEAIPPQYAI GEEIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GDAIPPQYAI NEEIQPQYAI GDAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEEIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI DDEIQPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI QDAISPQHAI. GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI CDPLSHYGLI GDAIYAPLLL SEKIKPQAVI
    KVLDELTDGK
    QVLDELTKGE
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    QVLDELTKGE
    QVLDELTGGN
    HVLDELTGGN
    QVLNEVTGGN
    QVLDELTKGE
    QVLDELTLGD
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    QVLDELTDGR
    QVLDELTDGK
    QVLDELTNGN
    QVLDELTKGE
    QVLDELTNGN
    QVLDELTNGN
    EVLDELTNGD
    QVLDELTGGN
    QVLDELTKGE
    QVLDELTKGE
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    QVLDELTGGN
    NAVAACVDDN
    KQLSDRKPAD
    ETLWRLTKGD
    10/23
    FIGURA 3
    1-AtAHASL 2-ZmAHASL2 3-BnAHASLIA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
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    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    AIISTGVGQH
    AIIGTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIIATGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIITTGVGQH
    AIIATGVGQH
    AIVSTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIITTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIIATGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIVSTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIIATGVGQH
    AIIATGVGQH
    AIIATGVGQH
    AIIATGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIISTGVGQH
    AIITTDVGQH
    CWTTDVGQH
    AYVTSDVGQH
    QMWAAQFYNY
    QMWAAQYYTY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQYYTY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQFYKY
    QMWSAQFYKY
    QMWAAQYYTY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQFYRF
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQYYTY
    QMWAAQYYKY
    QMWAAQYYKY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQYYTY
    QMWAAQYYTY
    QMWAAQYYTY
    QMWAAQYYTY
    QMWAAQFYKY
    QMWAAQFYKY
    QMWTAQAYPL
    QMWAAQHIAH
    QMFAALYYPF
    KKPRQWLSSG
    KRPRQWLSSA
    RKPRQWLSSS
    KRPRQWLSSA
    NKPRQWLTSG
    NKPRQWLTSG
    NRPRQWLTSA
    KRPRQWLSSA
    RNPRQWLTSG
    RKPRQWLSSS
    KKPRQWLSSG
    KRPRQWLSSA
    KRPRQWLSSA
    KKPRQWLTSG
    KRPRQWLSSA
    KKPRQWLTSG
    KKPRQWLTSG
    KRPRQWLTSG
    NKPRQWLTSG
    KRPRQVLSSA
    KRPRQWLSSS
    KRPRQWLSSS
    KRPRQWLSSS
    KKPRQWLTSG
    KKPRQWLTSG
    NRPRQWLTSG
    TRPENFITSS
    DKPRRWINSG
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGAMGFGLP
    GLGTMGFGLP
    GLGTMGFGLP
    GLGTMGFGLP
    AAIGASVANP
    AAAGASVANP
    AAIGASVANP
    AAAGASVANP
    AAIGAAVARP
    AAIGAAVARP
    AAIGAAVARP
    AAAGAAVANP
    ACYGAAVARP
    AAIGASVANP
    AAMGAAIANP
    AAIGASVANP
    AAIGASVANP
    AAMGAAVGRP
    AAAGAAVANP
    AAIGAAVGRP
    AAIGAAVGRP
    AAIGAAVANP
    AAIGAAVARP
    AAAGTAVANP
    AAAGAAVANP
    AAAGAAVANP
    AAAGAAVANP
    AAIGAAVANP
    AAIGAAVANP
    AAIGAALANP
    AAVGAQVARP
    AALGVKMALP
    1-AtAHASL
    2-ZmAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- XlvI
    DAIWDIDGD GVTWDIDGD DAIWDIDGD GVTWDIDGD DAVWDIDGD DAVWDIDGD DAVWDIDGD GVTWDIDGD DAVWDIDGD DAIWDIDGD GAWVDIDGD DSIWDÍDGD DAWVDIDGD GEIWDIDGD GITVVDIDGD GEIWDIDGD GEIWDIDGD GAWVDIDGD DAWVDIDGD GVTWDIDGD GVTWDIDGD GVTWDIDGD GVTWDI DGD EAVWDIDGD EAVWDIDGD DRKVLCFSGD NDTWCISGD EETWCVTGD
    GSFIMNVQEL
    GSFLMNVQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFLMNIQEL
    GSFMMNVQEL
    GSFMMNVQEL
    GSFMMNVQEL
    GSFLMNIQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFIMNIQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFMMNVQEL
    GSFLMNIQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFIMSVQEL
    GSFLMNIQEL
    GSFLMNIQEL
    GSFLMNIQEL
    GSFLMNIQEL
    GSFIMNVQEL
    GSFIMNVQEL
    GSLMMNIQEM
    GSFMMNVQEL
    GSIQMNIQEL
    ATIRVENLPV
    AMIRIENLPV
    ATIRVENLPV
    ALIRIENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    AMIRIENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    AMIRIENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ALIRIENLPV
    ALIRIENLPV
    ALIRIENLPV
    ALIRIENLPV
    ATIRVENLPV
    ATIRVENLPV
    ATASENQLDV
    GTVKRKQLPL
    STALQYELPV
    KVLLLNNQHL
    KVFVLNNQHL
    KILLLNNQHL
    KVMVLNNQHL
    KILLLNNQHL
    KILLLNNQHL
    KMMVLNNQHL
    KVFVLNNQHL
    KIMLLNNQHL
    KILLLNNQHL
    KVLLINNQHL
    KILILNNQHL
    KILILNNQHL
    KIMLLNNQHL
    KVFVLNNQHL
    KIMLLNNQHL
    KIMLLNNQHL
    KILLLNNQHL
    KILLLNNQHL
    KVMILNNQHL
    KVMILNNQHL
    KVMILNNQHL
    KVMILNNQHL
    KILLLNNQHL
    KILLLNNQHL
    KIILMNNEAL
    KIVLLDNQRL
    LWNLNNRYL
    574
    GMVMçJwEDRF GMWÇW GMVMÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇ W GMVVÇL GMVMÇW GMVLÇW
    3DRF
    DRF
    DRF
    DRF
    DRF |3DRF
    DRF
    DRF
    DRF
    DHF
    GMVMÇ W 3DRF
    DRF DRF DRF DRF DRF [3 DRF DRF DRF DRF DRF [3DRF DRF DRF 2SLF 2QLF
    GMVMÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇL GMWÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇW GMWÇ W GMWÇW GLVHÇ Q GMVRÇW
    GMVKÇJWQDMI
    11/23
    FIGURA 3
    1-AtAHASL
    2-ZraAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- SÍAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- IlvI
    580
    595
    K
    K
    K
    K
    K
    K
    K
    K
    K
    1ÍA
    I
    7K
    1K
    1K
    E
    EQ
    IS
    l.NRAHTF \.NRAHTY 1.NRAHTY \.NRAHTY \.NRAHTY 1.NRAHTY 1.NRAHTY l.NRAHTF 1.NRAHTY 1.NRAHTY liNRADSF 1.NRAHTY 1.NRAHTY 1.NRAHTY 1. NRAHTY NRAHTY 1.NRAHTY 3.NRAHTY 1.NRAHTY 1.NRAHTY 1.NRAHTY 1.NRAHTY NRAHTY 1.NRAHTY 1.NRAHTY 2GVFAATY GRYSETTL l.RHSQSY
    LGDPAQI LGNPENh LGDPARI LGNPECI LGNPSKI LGNPSKI LGNPTNI LGNPENí LGNPSNÍ LGDPARI LGDPANI LGNPAEI LGNPATí LGDPANI LGNPENí LGDPANI LGDPANI LGDPSSI LGNPSKIS LGNPENE S LGNPENE S LGNPENE X LGNPENE S LGDPSNE S lgdpsneJs
    PG.
    TDN MQS
    Bl
    I
    I
    I
    I
    Bi i
    w
    X
    I
    I
    I
    I
    Bi
    I
    I
    I
    I
    I
    FPNMLLFAAA YPDFVTIAKG FPNMLQFAGA YPDFVTIAKG FPNMVKFAEA FPNMLKFAEA FPNMLKFAEA YPDFVAIAKG FPDMLKFAEA FPNMLQFAGA FPDMLLFAAS FPNMLQFASA FPNMLQFASA FPNMLKFAEA YPDFVTIAKG FPNMLKFAEA FPNMLKFAEA FPNMLKFADA FPNMLKFAEA YPDFVTIAKG YPDFVTIAKG YPDFVTIAKG YPDFVTIAKG FPNMLKFAEA FPNMLKFAEA KINFMQIAAG .PDFLMLASA LPDFVRLAEA
    CGIPAARVTK
    FNIPAVRVTK
    CGIPAARVTK
    FNIPAVRVTK
    CDIPAARVTQ
    CDIPAARVTR
    CDIPAARVTK
    FNIPAVRVTK
    CDIPAARVTK
    CGIPAARVTK
    CGIPAARVTR
    CGIPAARVTK
    CGIPSARVTK
    CGVPAARVTH
    FNIPAVRVTK
    CGVPAARVSH
    CGVPAARVSH
    CGIPAARVTK
    CDIPAARVTR
    FNVPAVRVTK
    FNVPAVRVTK
    FNVPAVRVTK
    FNVPAVRVTK
    CGIPAARVTK
    CGIPAARVTK
    FGLETCDLNN
    FGIHGQHITR
    YGHVGIQISH
    KADLREAIQT
    KNEVRAAIKK
    KEELREAIQT
    KSEVRAAIKK
    KADLRAAIQK
    KGDLRAAIQK
    KGDVRTAIQK
    KSEVHAAIKK
    VSDLRAAIQT
    KEELREAIQT
    REDLREAIQT
    IAELREAIQK
    KAELREAIQK
    RDELRAAIQK
    KSEVHAAIKK
    RDDLRAAIQK
    RDDLRAAIQK
    KEELRAAIQR
    KADLRAAIQK
    RSEVRAAIKK
    KSEVTAAIKK
    KSEVTAAIKK
    KSEVTAAIKK
    KEDLKAAMQK
    KEDLKAAIQK
    EADPQASLQE
    KDQVEAALDT
    PHELESKLSE
    1-AtAHASL
    2-ZmAHASL2
    3-BnAHASLlA
    4- OsAHASL
    5- HaAHASLl
    6- HaAHASL2
    7- HaAHASL3
    8- ZmAHASLl
    9-AsAHASL
    10- BnAHASLlC
    11- BnAHASL2A
    12- CmAHASLl
    13- CmAHASL2
    14- SpAHASL
    15- SbAHASL
    16- StAHASLl
    17- StAHASL2
    18- GmAHASL
    19- XsAHASL
    20- LmAHASL
    21- TaAHASLlA
    22- TaAHASLlB
    23- TaAHASLlD 24-GHAHASA5
    25-GHAHASA19
    26- IlvB
    27- IlvG
    28- llvI
    MLDTPGP. . . MLETPGP... MLDTPGP.. . MLETPGP... MLDTPGP.. . MLDTPGP. . . MLDTPGP. . . MLEAPGP... MLDTPGP. . . MLDTPGP.. . MLDTPGP.. . MLDTPGP... MLDTPGP.. . MLDTPGP.. . MLETPGP.. . MLDTPGP. . . MLDTPGP.. . MLDTPGP.. . MLDTPGP.. . MLETPGP.. . MLETPGP.. . MLETPGP. . . MLETPGP. . . MLDTPGP. . . MLDTPGP. . . IINRPGP.. . MLNSDGP... ALEQVRNNRL
    YLLDVICPHQ
    YLLDIIVPHQ
    YLLDVICPHQ
    YLLDIIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDIIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDVICPHQ
    FLLDWCPHQ
    YLLDVICPHQ
    YLLDVICPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDIIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDIIVPHQ
    YLLDIIVPHQ
    YLLDIIVPHQ
    YLLDIIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    YLLDVIVPHQ
    ALIHVRIDAE
    YLLHVSIDEL
    VFVDVTVDGS
    EHVLPMIE!
    EHVLPMIE!
    EHVLPMIF
    EHVLPMII
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    DHVLPLIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMIE
    EHVLPMII
    EHVLPMII
    EKVYPMVE
    ENVWPLVE
    EHVYPMQI
    653/654
    GTFNDVITEG GAFKDMILDG GTFKDVITEG GAFKDMILDG GGFSDVITEG GGFSDVITEG GGFNDIITDG GAFKDMILDG AAFKDTITEG GTFKDVITEG GTFKDIIV.. GTFNDVITEG GTFNDVITEG GAFKDVIT.. GAFKDMILDG GAFKDVITEG GAFKDVITEG GSFKDVITEG GGFMDVITEG GAFKDIIMEG GAFKDMIMEG GAFKDMIMEG GAFKDMIMEG GAFKDVITEG GAFKDVITEG AANTEMVGE. ASNSEMLEKL GGMDEMWLSK
    DGRIKY
    DGRTVY
    DGRTKY
    DGRTVY
    DGRTKY
    DGRMKY
    DGRTQ.
    DGRTVY
    DGRRAY
    DGRTKY
    DGRTKY
    DGRTKY
    DGRTVY
    DGRRSY
    DGRRSY
    DGRTRY
    DGRMKY
    DGRISY
    DGRTSY
    DGRTSY
    DGRTSY
    DGRTQY
    DGRTQY
    S----TERT.
    12/23
    FIGURA 4
    M124 V139 A122 origem de replicaçãode E. coli marcador selecionável de E. coli promotor de E. coli
    P197
    R199
    3' UTR
    A205 V254
    Q269 M277 D315
    AtAHASL
    13/23
    FIGURA 5
    Borda esquerda \
    Sequência codificante de AtAHASL Promotor de AtAHASL
    Borda direita t-DNA de vetor de base de AP
    14/23
    FIGURA 6
    Origem de replicação de E. coli
    Marcador selecionável de E. coli
    15/23
    FIGURA 7
    Borda esquerda novo mapa de t-DNA de vetor de base de ZP5417 bp (pares de bases)
    16/23
    FIGURA 8
    SeqlD AHAS específica _Radicais de AHAS
    1 AtAHASL K83 Q95 A122 M124 V139 P197 R199 2 ZmAHASL2 P51 D63 A90 M92 H107 P165 R167 3 BnAHASLIA K65 E77 A104 M106 V121 P179 R181 4 OsAHASL P57 E69 A96 M98 H113 P171 R173 5 HaAHASLI P68 Q80 A107 M109 V124 P182 R184 6 HaAHASL2 H62 Q74 A101 M103 V118 P176 R178 Ί HaAHASL3 H58 E70 A97 L99 1114 P172 N174 8 ZmAHASLI P51 E63 A9O M92 H107 P165 R167 g As AHASL K74 E86 A113 M115 V130 P188 R190 19 BnAHASLIC K68 E80 A107 M109 VI24 P182 R184 11 BnAHASL2A N59 V71 A98 M100 V115 P173 R175 12 CmAHASLI E81 Q93 A120 M122 V137 P195 R197 13 CmAHASL2 E78 Q90 Al 17 Ml 19 V134 P192 R194 14 SpAHASL parcial ? ? A27 M29 V44 P102 R104 15 SbAHASL P54 D66 A93 M95 H110 P168 R170 1® StAHASLI E70 E82 A109 Mlll V126 P184 R186 17 StAHASL2 E72 E84 Alll M113 V128 P186 R188 18 GmAHASL T64 E76 A103 M1O5 V120 P178 R180 19 XsAHASL P61 Q73 AlOO M102 V117 P175 R177 20 LmAHASL P53 E65 A92 M94 H109 P167 R169 21 TaAHASL 1A parcial P20 E32 A59 M61 H76 P134 R136 22 TaAHASL 1B parcial P20 E32 A59 M61 H76 P134 R136 23 TaAHASL 1D parcial P20 E32 A59 M61 H76 P134 R136 24 GHAHASA5 P72 E84 Alll M113 V128 P186 R188 25 GHAHASA19 P72 E84 Alll M113 V128 P186 R188 26 llvB nd Kll S38 L40 155 P113 S115 27 HvG nd - A26 M28 L42 S100 P102 28 llvl nd E2- A29 L31 V46 S104 S106
    17/23
    FIGURA 8
    SeqlD AHAS específica 1 AtAHASL 2 ZmAHASL2 3 BnAHASLIA 4 OsAHASL 5 HaAHASLI 6 HaAHASL2 7 HaAHASL3 8 ZmAHASLI 9 As AHASL 10 BnAHASLIC 11 BnAHASL2A 12 CmAHASLI 13 CmAHASL2 14 SpAHASL parcial 15 SbAHASL 16 StAHASLI 17 StAHASL2 18 GmAHASL 19 XsAHASL 20 LmAHASL 21 TaAHASL 1A parcial 22 TaAHASL 1B parcial 23 TaAHASL 1D parcial 24 GHAHASA5 25 GHAHASA19 26 llvB 27 IlvG 28 llvl
    Radicais de AHAS
    A205 V254 Q269 M277 D315 D375 S398 A173 1222 K237 1245 E283 D343 P366 A187 V236 Q251 M259 E297 D357 S380 A179 1228 T243 1251 D289 D349 P372 A190 V239 E254 L262 D300 D360 P383 A184 V233 E248 L256 D294 D354 P377 A180 1229 Q247 1255 D293 D353 P376 A173 1222 T237 1245 E283 D343 P366 A196 1245 Q260 L268 E310 D370 S393 A190 V239 Q254 M262 E300 D360 S383 A181 V23O Q245 M253 E291 D352 S375 A203 V252 Q267 M275 E313 D373 S396 A200 V249 Q264 M272 E310 D370 S393 A110 V159 Q174 M182 E220 D280 S303 A176 1225 T240 1248 E286 D346 P369 A192 V241 Q256 M264 E302 D362 S385 A194 V243 Q258 M266 E304 D364 S387 A186 1235 E250 L258 A296 D356 S379 A183 V232 E247 L255 D293 D353 S376 A175 1224 A239 1247 E285 D345 P368 A142 1191 T206 1214 E252 D312 P335 A142 1191 T206 1214 E252 D312 P335 A142 1191 T2O6 1214 E252 D312 P335 A194 V243 H258 L266 E304 D364 S387 A194 V243 H258 L266 E304 D364 S387 A121 1170 nd A188 A227 D287 R310 A108 1157 nd V175 P214 D274 P297 A112 L161 nd V180 Q224 D284 P307
    18/23
    FIGURA 8
    Radicais de AHAS
    AHAS específica
    1 AtAHASL K416 L426 A430 V439 N442 N445 W574 2 ZmAHASL2 K384 L394 T398 S407 D410 D413 W542 3 BnAHASLIA K398 L408 A412 V421 S424 S427 W556 4 OsAHASL K390 L400 T404 A413 N416 D419 W548 5 HaAHASL.1 K401 L411 N415 T424 K427 D430 W559 6 HaAHASL2 K395 L405 N409 N415 K418 D421 W550 7 HaAHASL3 K394 L404 E408 P416 E419 M422 W551 8 ZmAHASL.1 K384 L394 T398 S407 D410 D413 W542 9 AsAHASL K411 L421 K425 N434 E437 N440 W569 10 BnAHASLIC K401 L411 A415 V424 S427 S430 W559 11 BnAHASL2A Q393 L403 R407 E414 C417 N420 W549 12 CmAHASLI K414 L424 A428 V437 S440 N443 W572 13 CmAHASL2 K411 L421 G425 V434 S437 N440 W569 14 SpAHASL parcial K321 L331 E335 A344 Q347 N350 W479 15 SbAHASL K387 L397 T401 S410 A413 D416 W545 16 StAHASLI K403 L413 E417 A426 Q429 T432 W561 17 SIAHASL2 K405 L415 E419 A428 Q431 T434 W563 18 GmAHASL K397 L407 G411 G420 E423 N426 W555 19 XsAHASL K394 L404 N408 N417 K420 D423 W552 20 LmAHASL K386 L396 K400 S409 D412 E415 W544 21 Ta AHASL 1A parcial K353 L363 K367 T376 K379 D382 W511 22 TaAHASL 1B parcial K353 L363 K367 T376 K379 D382 W511 23 TaAHASL 1D parcial K353 L363 K367 T376 K379 D382 W511 24 GHAHASA5 K405 L415 V419 E428 Q431 N434 W563 25 GHAHASA19 K405 L415 G419 E428 Q431 N434 W563 26 livB D 328 V338 P342 E349 Q348 A351 Q480 27 HvG N315 L325 Y328 D349 Q332 A332 W464 28 llvl R325 L335 S339 E345 Q352 E355 W484
    19/23
    FIGURA 8
    eqL D AHAS específica 1 AtAHASL 2 ZmAHASL2 3 BnAHASLIA 4 OsAHASL 5 HaAHASLI 6 HaAHASL2 7 HaAHASL3 8 ZmAHASLI 9 AsAHASL 10 BnAHASLIC 11 BnAHASL2A 12 CmAHASLI 13 CmAHASL2 14 SpAHASL parcial 15 SbAHASL 16 StAHASLI 17 StAHASL2 18 GmAHASL 19 XsAHASL 20 LmAHASL 21 TaAHASL 1A parcial 22 TaAHASL 1B parcial 23 TaAHASL 1D parcial 24 GHAHASA5 25 GHAHASA19 26 HvB 27 HvG 28 llvl
    Radicais de AHAS
    K580 D595 S653 G654 K548 S563 S621 G622 K562 N577 S635 G635 K554 S569 S627 G628 K565 S580 A638 G638 K556 S571 A629 G630 K557 S572 A630 G631 K548 S563 S621 G622 K575 S590 S648 G649 K565 N580 S638 G638 A555 E570 S628 G629 K578 D593 S651 G652 K575 D590 S648 G649 K485 E500 S558 G559 K551 S566 S624 G625 K567 E582 S640 G641 K569 E584 S642 G642 K561 S576 S634 N635 K558 S573 A631 G632 K550 S565 S623 G632 K517 S532 S590 G591 K517 S532 S590 G591 K5I7 S532 S590 G591 K569 S584 S642 G643 K569 S584 S642 G643 E486 nd P552 G553 Q470 nd P536 G537 S490 nd R559 G560
    20/23
    FIGURA 9
    LU
    W
    CO to o €0 o oo o> oo Γ5 CD co 00 CD CD 05 C5 05 on on on 0 ID ID ID on on b CM o CM CO M1 CO M co CO CO Μ- CO CO co CO CO M* M- CO co co co Μ- ’Μ· M- co co ID 0 X“ b CD M- CO CM CO CM CO o o x— 05 O M- CO x— <0 CM CO OO CO 00 0 Γ5 ID O CM CO M- M M M M- M- M- M“ CO M ID Μ M- M- M M Μ- M· M- to x— CD CO CO O CM CM CM CO O O on O> x— CO X- O x~ CM CO CO OO OO O O O CM CO Μ- M Μ- M M- Μ- M* M M- M co CO ID M M Μ Μ- Μ- Μ- Μ- Μ- M* M* X“ m 00 X— O O> tD x— IO x- CO 00 o CD Γ5 05 05 05 O O C5 O on O CM b b 00 b 00 b b b b C0 b b 00 b b 00 b b b b b b b 05 x~ M- oo x- O O 05 ID X CO x— CO 05 o CO r> Γ5 05 Γ5 O O O O 0 CM b b 00 b CO b b b b CO b b oo b b 00 CO b OO b b b b x— CO b IO o> b o O CO CD 05 O> in b on CD b 0 O 05 0 05 O O O CM CO OO (O CO b b CO 00 CO CO CO CO co b CO b b CO b OO 2 X— CM b to CD b o O CO ID oo O> ID b on CD b 0 O on Γ5 05 05 0 CM u> oo U> co b b CO eo CO CO <o CO co b 00 b b co b CO 05 X“ b to O> b o o 00 CO 05 O> in b 00 CD b C5 O 05 O 05 O CM CO 00 CO 00 b b CO 00 <O CO co co CO b 00 b b CO b 00 X“ O CO b OO 00 o O) 05 b 00 00 M· b 00 O on O O on O O CM to 00 CO 00 b CO CO 00 CO CD CD co co b 00 b b CO b x— CD to 05 CO O> CO 00 OO CD O> ID co fc o O O ID O b CO b CO 05 05 b co b b CO b b b GO 00 b V“ CO M* 05 b 00 CO to CM 05 CO b o> M· ID M* o <0 CD 0 b CO b CO b b b CD b b co b b b b b b b CO O b o O o tD 05 CO b o CD jEJ M· 05 co O X- b b b b CO oo b CO b b b 00 CO 05 CO CD o CO o 05 Γ5 (D CD 00 CD o CD b LD O O X“ b b b b b 00 b CD b b b b b 00 b x— to b M· 05 o O r> 05 CO oo 05 ID b oo O o CO 05 CO 05 b b CO O> CO CO CO CO CO b X“ M· CM O CO O CD b M- O ID tD CM M- M* O *” b b b b b b b b b b b b b CO CM 00 00 00 b CD CO 00 CO co tD 00 O x— CD CO oo CO b b b CD b co b 05 CM CM oo 00 b CO ID CM b CM oo M- O X“ 05 CO 00 CO b b b CO b 00 b 2 CO to b tf) o O CD CD b b O x- b CO b CO b b CD CO CO b o 00 o O) 05 b CD CO O) CO o x·— 00 b 05 (O b b b CO b σ> CM 00 CO OO oo 00 CO b o b (O b CO b b b CO oo b to O o o O o o CO 05 b 05 b b b X“ CM 05 CO O> 05 05 o b CO b CO b b ° CO CD CD x— CO O b b b b o> to 76 LpI b b X~ b o o x— M· 89 o 05 05 CO 100 CO 00 00 70 O O T— CM b CO O o o T- o X- CD õ c Φ - ã-C Φ 2 Sê Ss E a o * S tAHASL (SEQ ID N0:1) mAHASL2 (SEQ ID N0:2) CO õ Z Q σ LU 2 < v> < X í õ z Q σ UI 2 σ> 2 $ aAHASLI (SEQ ID N0:5) aAHASL2 (SEQ ID N0:6) aAHASL3 (SEQ ID N0:7) mAHASLI (SEQ ID N0:8) 05 õ z O σ UI 2 -J < 5 m nAHASLIC (SEQ ID NO:10) nAHASL2A(SEQ ID N0:11) mAHASLI (SEQ ID N0:12) mAHASL2 (SEQ ID N0:13) pAHASL (SEQ ID N0:14) | bAHASL (SEQ ID N0:15) I IAHASL1 (SEQ ID N0:16) | IAHASL2 (SEQ ID N0:17) I mAHASL (SEQ ID N0:18) I sAHASL (SEQ ID N0:19) I mAHASL (SEQ ID NO:20) I aAHASLIA (SEQ ID N0:21) I aAHASLI B (SEQ ID NO:22) I aAHASLI D (SEQ ID NO:23) 1 HAHASA5 (SEQ ID NO:24) 1 HAHASA19 (SEQ ID NO:25) I <O CM Õ z Q σ LD 2 çp b CM Õ z 0 σ UJ 2 4 (SEQ ID NO:28) I CÜ o X X X N CO CO o o w w w ω O X -J 1- 1“ O O =
    21/23
    FIGURA 10
    1 2 3 4 5
    1 - Tipo selvagem
    2 - csrl-2
    3 - AP1
    4- AP7
    5- AP2
    37,5 μΜ de Pursuit (imazetapir)
    22/23
    FIGURA 11
    M277
    Borda esquerda \
    Q269
    V254
    A205 T203 R199 P197 V139 M124 A122 Q95
    Sequência codificante de AtAHASL
    Região transcrita em 5'
    Borda direita
    Intron* Promotor de ubiquitina* de Petroselinum crispum (salsinha) t-DNA de vetor de base de AP
    23/23
    FIGURA 12 (salsinha)
    BAP1 T-DNA
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