DE69434960T2 - Gentherapie für solide Tumoren, Papillome und Warzen - Google Patents

Gentherapie für solide Tumoren, Papillome und Warzen Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Gentherapie im allgemeinen. Im besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein neuartiges Gentherapieverfahren zur Behandlung von soliden Tumoren, Papillomen und Warzen unter Einsatz eines Adenovirusvektors, einer Kombination von Adenovirusvektoren, anderer Virusvektoren und nicht-viraler DNA-Transportersysteme.
  • Beschreibung des Stands der Technik
  • Die direkte Einführung von therapeutischen Genen in maligne Zellen unter in vivo-Bedingungen kann eine effiziente Behandlung für umschriebene Tumoren bieten. Vor kurzem wurden mehrere neuartige Behandlungsmodalitäten dieser Art ausprobiert. Eine dieser Behandlungen beinhaltet beispielsweise die Anlieferung von normalen Tumorsuppressorgenen und/oder Inhibitoren von aktivierten Onkogenen zu Tumorzellen. Eine zweite Behandlung beinhaltet die Verstärkung der Immunogenität der Tumorzellen unter in vivo-Bedingungen durch die Einführung von Zytokingenen. Eine dritte Behandlung beinhaltet die Einführung von Genen, die den Kode für Enzyme tragen, welche den Tumorzellen eine Empfindlichkeit gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen verleihen. Das Herpes simplex Virus-Thymidinkinase (HSV-TK)-Gen vermag auf eine spezifische Weise ein Nukleosidanalog (Ganciclovir) in ein toxisches Zwischenprodukt umzuwandeln und den Tod von sich teilenden Zellen zu verursachen. Vor kurzem berichteten Culver et al. (Science 256:1550–1552, 1992), daß eine Ganciclovirbehandlung im Anschluß an die Anlieferung des HSV-TK-Gens durch retrovirale Transduktion einen effektiven Rückgang von Hirntumoren bei Labortieren bewirkte. Eine attraktive Eigenschaft dieser Behandlungsmodalität für umschriebene Tumoren ist der sogenannte "Bystander-Effekt" (etwa Mitläufereffekt). Mit dem "Bystander-Effekt" ist gemeint, daß die HSV-TK-exprimierenden Tumorzellen in Gegenwart von Ganciclovir auch das Wachstum von benachbarten nicht-transduzierten Tumorzellen verhindern. Folglich muß nicht jede einzelne Tumorzelle HSV-TK exprimieren, damit die Krebsbehandlung effektiv ist.
  • Das von Culver et al. verwendete HSV-TK-Retrovirus unterlag jedoch der Einschränkung von niedrigen Virustitern. Daher war es zur effektiven Behandlung von Hirntumoren notwendig, die virusproduzierenden Zellen selbst, anstatt lediglich Virusisolate, zur Inokulation der Tiere zu verwenden. Außerdem wurde bei früheren Versuchen mit syngenen Ratten, die mit einem Retrovirus und Ganciclovir behandelt worden waren, festgestellt, daß Tumornekrose und Tumorinvasion durch Makrophagen und Lymphozyten vorlag. Im folgenden Beispiel 1 wurden thymuslose Mäuse verwendet und die Tumorzellen ohne offensichtliche Beeinträchtigung des zellulären Immunsystems zerstört.
  • In der WO 93 02556 werden Retrovirusvektoren offenbart, die den Kode für Suizidproteine und Zytokine zur Behandlung von Krebs oder virusinfizierten Zellen tragen. Weiterhin wird die Bildung von transgenen Krebszellen mit einer Kombination aus Suszeptibilitätsgenen und Zytokingenen offenbart.
  • Adenovirusvektoren für die Anlieferung von heterologen Genen, wie HSV-tk, sind in Y. Haj-Ahmad und F.L. Graham, 1986, J. VIROLOGY, 57:267–274 und in Berkner, KL., 1988, BIOTECHNIQUES, 6:616–629 offenbart.
  • Eine allgemeine Übersicht über Genanlieferungssysteme, wie Adenovirusvektoren, ist Mulligan, R.C., 1993, SCIENCE, Bd. 260:926–932 zu entnehmen.
  • Nach dem Stand der Technik gibt es bisher keine effiziente Gentherapietechnik für die Behandlung von soliden Tumoren.
  • Die Stammanmeldung, EP-A-0719147 , bezieht sich auf einen Adenovirusvektor und eine Zusammenstellung zur Behandlung von soliden Tumoren, Papillomen oder Warzen in einem nicht-menschlichen Tier oder einem Menschen.
  • Die vorliegende Ausscheidungsanmeldung bezieht sich auf ein DNA-Zufuhrsystem zur Verabreichung eines Suizidgens und eines oder mehrerer Zytokingene, die in der DNA enthalten sind, an ein Individuum zur Behandlung eines soliden Tumors, Papilloms oder einer Warze bei einem nicht-humanen Tier oder einem Menschen, wobei das DNA-Zufuhrsystem aus einem Virusvektor, einem Episomenvektor, einem Liposom, einem kationischen Lipid oder einem nicht-viralen Zufuhrsystem ausgewählt ist, bestehend aus der DNA oder RNA von Interesse, einer einen Zelloberflächenrezeptor oder -antigen erkennenden und an diesen bindenden Einheit, einer DNA-bindenden Einheit und einer Lyseeinheit, die den Transport eines Komplexes von der Zelloberfläche in das Zytoplasma ermöglicht; wobei das Suizidgen und das eine oder die mehreren Zytokingen(e) in der DNA oder RNA enthalten und exprimierbar sind, und wobei das Suizidgen so angepaßt ist, daß es den Kode für ein Protein enthält, das ein Prodrug, das dem Tier oder Menschen verabreicht wird, unter Invivo-Bedingungen enzymatisch in eine toxische Verbindung umwandeln kann.
  • Weitere Merkmale und Vorteile gehen aus der nachfolgenden Beschreibung der zur Zeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung hervor, die zum Zwecke der Offenbarung vorgestellt werden und in Verbindung mit den Begleitzeichnungen zu verstehen sind. Darin zeigen:
  • 1 die Konstruktion von rekombinanten Adenovirusvektoren, die das Herpes simplex Virus-Thymidinkinase (HSV-TK)-Gen enthalten, in schematischer Darstellung;
  • 2 die effiziente Transduktion von C6-Gliomzellen unter in vitro-Bedingungen unter Einsatz eines rekombinanten Adenovirusvektors, der das bakterielle β-Galaktosidase-Gen (β-gal) enthält. Tafel A: MOI = 0, Tafel B: MOI = 125, Tafel C: MOI = 500 und Tafel D: MOI = 2.0000;
  • 3 die HSV-TK-Enzymaktivität in C6-Gliomzellen nach der Transduktion mit einem rekombinanten Adenovirusvektor, der das HSV-TK-Gen enthält;
  • 4 die Suszeptibilität der Ad/RSV-Tk-transduzierten C6-Gliomzellen gegenüber der Toxizität von Ganciclovir unter in vitro-Bedingungen;
  • 5 die Strategie für die Gentherapie von Hirntumoren unter Einsatz von rekombinanten Adenovirusvektoren, die HSV-TK enthalten; und
  • 6 eine Strategie für die Gentherapie für einen generischen soliden Tumor.
  • 7 zeigt Versuchstiere 20 Tage nach der Inokulation von C6-Gliomzellen in das Hirn gefolgt von einer stereotaktischen Verabreichung von Ad/RSV-TK. Die Tiere links wurden mit PBS behandelt und die Tiere rechts wurden mit Ganciclovir behandelt.
  • 8 zeigt Ganzhirne von Mäusen gemäß der Beschreibung aus 7 nach einer Behandlung entweder mit PBS (links) oder Ganciclovir (rechts).
  • 9 zeigt den Effekt der Ganciclovirbehandlung und HSV-TK+-Brusttumor (MOD)-Regression in schematischer Darstellung.
  • 10 zeigt den Effekt der Ganciclovirbehandlung auf die Größe von HSV-TK+-Brusttumoren.
  • 11 zeigt den "Bystandereffekt", in schematischer Darstellung, wenn Brusttumor (MOD)-Elternzellen und Tumorzellen, die das HSV-TK-Gen enthalten, gemischt und Mäusen per subkutaner Injektion verabreicht wurden.
  • 12 zeigt den Effekt von PBS oder Ganciclovir auf die Tumorgröße bei Mäusen, die entweder mit 100% Tumor-Elternzellen, 100% HSV-TK-enthaltenden Tumorzellen, 90% Elternzellen/10% HSV-TK-Tumorzellen oder 50% Elternzellen/50% HSV-TK-Brusttumor (MOD)-Zellen behandelt worden waren.
  • 13 zeigt den Effekt der Ganciclovirdosis auf die Hirntumorgröße nach der Adenovirus-vermittelten Gentherapie. In manchen Hirnen von ADV/tk-behandelten Ratten, die weniger als 80 mg/kg Ganciclovir erhalten hatten, wurden kleinere Resttumoren festgestellt. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SA) an. Die Behandlungen, mittlere Tumorflächen ± SA und Probengrößen waren wie folgt: A: ADV-tk + PBS, 36,89 ± 6,73 mm2 (n = 3); B: ADV-βgal + 150 mg/kg Ganciclovir, 28,75 ± 0,55 mm2 (n = 4); C: ADV-tk + 150 mg/kg Ganciclovir, – 0 mm2 (n = 2); D: ADV-tk + 100 mg/kg Ganciclovir, 0 mm2 (n = 4); E: ADV-tk + 80 mg/kg Ganciclovir, 0 mm2 (n = 2); F: ADV-tk + 50 mg/kg Ganciclovir, 0,25 ± 0,29 mm2 (n = 4); G: ADV-tk + 20 mg/kg Ganciclovir, 1,79 ± 3,52 mm2 (n = 4); H: ADV-tk + 10 mg/kg Ganciclovir, 0,01 ± 0,004 mm2 (n = 4)
  • 14 erläutert die Ergebnisse einer Überlebensstudie bei Tieren, die entweder mit ADV-βgal oder ADV-tk und anschließend mit 50 mg/kg Ganciclovir zweimal täglich für eine Dauer von 6 Tagen behandelt wurden. A: die mit MW-βgal plus Ganciclovir behandelten Tiere verstarben innerhalb von 22 Tagen (––––, n = 7); B: die Tiere in der ersten Gruppe, die mit ADV-tk plus Ganciclovir behandelt wurden, waren nach 120 Tagen noch am Leben mit Ausnahme eines Tiers, das mit unbekannter Ursache nach 98 Tagen verstarb (........; n = 4); C: die Tiere in der zweiten Gruppe, die mit ADV-tk plus Ganciclovir behandelt worden waren, waren nach 80 Tagen noch am Leben (-----; n = 5).
  • 15 zeigt die Transduktion von humanen Plattenepithelkarzinomzellen des Typs HLaC-79 mit ADV/RSV-TK unter in vitro-Bedingungen gefolgt von der Behandlung entweder mit GCV 10 μg/ml (ausgefüllte Balken) oder PBS (gestreifte Balken). Das Überleben der Zellen wurde 68 Stunden nach der Transduktion sowohl für die GCV-Behandlung als auch für die PBS-Kontrollgruppe beurteilt. Die Behandlung mit GCV führte zu 85–90x Abtötung der Krebszellen bei einer sehr niedrigen MOI. Die nicht-transduzierten Kontrollen (MOI = 0) sowie die PBS-Kontrollen zeigten keine Toxizität bis zu einer MOI von 25.
  • 16 stellt den mittleren prozentualen Nekroseanteil bei Plattenepithelzelltumoren unter in vivo-Bedingungen für die einzelnen Versuchsgruppen dar. Ein deutlicher zytotoxischer Effekt (41% Nekrose) war nach der Adenovirustransduktion und Ganciclovirbehandlung (TK+ C+) im Vergleich zu den Kontrollen (0–2,2% Nekrose) zu erkennen. Statistische Signifikanz laut t-Testanalyse: p < 0,001.
  • 17 zeigt Tumorindexwerte (Punkte) zur Beschreibung der klinischen Gesamtantwort für die einzelnen Tiere der Versuchsgruppen. Datenpunkte an der horizontalen Linie oder darunter (entsprechend einem Tumorindex von 30 oder weniger) bedeuten eine nahezu vollständige Tumorregression. Die Balken geben die Medianwerte für die einzelnen Gruppen an. Eine klinische Antwort dramatischen Ausmaßes war bei den Tieren mit vollständiger Behandlung (TK+ G+) im Vergleich zu jeder einzelnen Kontrollgruppe zu verzeichnen (p < 0,001–0,02 laut Mann-Whitney-Analyse).
  • 18 zeigt die funktionelle Charakterisierung der rekombinanten Adenovirusvektoren: GCV-Suszeptibilität von ADV/RSV-tk-transduzierten MCA-26-Kolontumor-Zelllinien. MCA-26'-Zellen wurden mit ADV/RSV-tk bei verschiedenen Infektionsmultiplizitäten transduziert, gefolgt von einer Behandlung entweder mit PBS oder 10 μg/ml GCV 12 Stunden später. Nach 3 Tagen wurde die Anzahl von lebensfähigen Zellen mit Hilfe einer Trypanblau-Anfärbung ermittelt.
  • 19 zeigt die Ergebnisse eines Maus-IL2-Bioassays von konditionierten Kulturmedien von B16-Zellen, die mit ADV/RSV-mIL2 transduziert worden waren. Die konditionierten Kulturmedien wurden zu einer T-Zelllinie der Maus (CTLL-2) zugegeben und 20 Stunden inkubiert. Dann wurde für 4 Stunden 3H: Thymidin zugegeben und die Zellen unter Einsatz eines PHD-Zellsammlers gesammelt. Die eingebaute Menge an 3H-Thymidin wurde durch Messung der Flüssigkeitsszintillation gemessen und die mittleren Zählwerte (cpm) der Dreifachkulturen sind angegeben.
  • 20 demonstriert die Resttumorgrößen bei den Tieren nach verschiedenen gentherapeutischen Behandlungen. Die maximalen Tumor-Querschnittflächen wurden mittels einer rechnergestützten morphometrischen Analyse gemessen. Die Gesamtzahl der Tiere in den 5 Behandlungsgruppen in zwei getrennten Versuche lag bei 14 (βgal), 8 (mIL2), 7 (β-gal + mIL2), 12 (tk) und 10 (tk + mIL2). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen in den einzelnen Behandlungsgruppen an.
  • 21 zeigt die systemische Antitumorimmunität gegenüber Gaben von Eltern-Tumorzellen (Challenge) an distalen Stellen. Bei den Tieren aller fünf Behandlungsgruppen wurde eine subkutane Inokulation mit Tumorzellen vorgenommen. Dazu wurden einen Tag nach dem Abschluß einer GCV-Behandlung 1 × 105 MCA-26-Zellen in die rechte Körperflanke der Tiere und 2 × 106 MOD-Brusttumorzellen in die linke Körperflanke der Tiere injiziert. Dabei handelte es sich um die tumorigenen Dosen, die bei normalen BALB/c-Mäusen nach 7 Tagen erkennbare Tumore einer ähnlichen Größe erzeugten. Das Auftreten von subkutanen Tumoren bei den so behandelten Tieren wurde nach einer Woche visuell festgestellt. Insgesamt 6 Tiere in jeder Gruppe erhielten MCA-26 als Challenge und zwischen 2–4 pro Gruppe erhielten MOD.
  • 22 zeigt die zytotoxische T-Lymphozytenantwort bei Tieren nach verschiedenen gentherapeutischen Behandlungen. Bei Tieren der verschiedenen Behandlungsgruppen wurden Splenozyten 3 Tage nach Abschluß der Verabreichung von GCV isoliert. 6 × 106 Splenozyten wurden unter in vitro-Bedingungen stimuliert, indem sie zusammen mit 5 × 105 MCA-26-Zellen 5 Tage lang in Kultur gehalten wurden bevor die 51Cr-Freisetzungsassays durchgeführt wurden. Der Prozentsatz der MCA-26-Zielzelltage vor der 51Cr-Freisetzung wurde gegen verschiedene Effektor/Zielzell-Verhältnisse aufgetragen. Die Datenpunkte stellen die mittlere spezifische 51Cr-Freisetzung von Dreifachkulturen dar.
  • 23 zeigt die in vitro-Blockierung der CTL-Antwort durch monoklonale Antikörper gegen entweder CD4 oder CD8. Splenozyten von Tieren, die mit ADV/RSV-tk + ADV/RSV-mIL2 behandelt worden waren, wurden unter in vitro-Bedingungen auf die in der Bildlegende von 5A angegebene Weise stimuliert und die Effektorzellen wurden anschließend mit verschiedenen Konzentrationen von aufgereinigten, Natriumazid-freien Antikörpern (GKI.5., monoklonaler Antikörper gegen CD4 oder 2.43, monoklonaler Antikörper gegen CD8a, Pharmingen) bei –37°C für eine Dauer von 30 Minuten inkubiert. Der 51Cr-Freisetzungsassay wurde mit einem Effektor-zu-Zielzell-Verhältnis von 50/1 durchgeführt.
  • Die Zeichnungen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu. Gewisse erfindungsgemäße Merkmale können zum Zweck der Verständlichkeit und Prägnanz der Erläuterung maßstäblich übertrieben oder in schematischer Form dargestellt sein.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist es leicht ersichtlich, daß verschiedene Ersetzungen und Modifikationen bei der hierin offenbarten Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Gültigkeitsbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
  • Der Begriff "Vektor" bezieht sich bei seiner Verwendung in diesem Schriftstück auf ein aus genetischem Material bestehendes Konstrukt, das für die direkte Transformation einer Zielzelle vorgesehen ist. Ein Vektor enthält mehrere genetische Elemente, die in ihrer Stellung und Sequenz, d.h. operativ, mit anderen notwendigen Elementen verknüpft sind, so daß die Nukleinsäure in einer Nukleinsäurekassette transkribiert werden kann und bei Bedarf in den transfizierten Zellen im Sinne einer Translation ausgelesen werden kann. Bei der vorliegenden Erfindung umfaßt der bevorzugte Vektor die folgenden, operativ verknüpften Elemente für eine funktionstüchtige Expression: einen Promoter, eine 5'-mRNA-Leadersequenz, eine Initiationsstelle, eine Nukleinsäurekassette, die eine exprimierbare Sequenz enthält, eine 3'-untranslatierte Region und ein Polyadenylierungssignal.
  • Der Begriff "stabile Transformation" bezieht sich bei seiner Verwendung in diesem Schriftstück auf eine Transformation, bei der die eingeführte therapeutische Nukleinsäuresequenz (Suizidgen) oder die eingeführte therapeutische Nukleinsäuresequenz und die Zytokinsequenz in die Chromosomen der Ganzzelle inkorporiert ist/sind. Dies führt zu einer scheinbar stabilen Veränderung oder Transformation einer gegebenen Eigenschaft der Zelle.
  • Der Begriff "transformiert" bezieht sich bei seiner Verwendung in diesem Schriftstück auf einen Prozeß zur Hervorrufung oder Einführung einer stabilen Veränderung der Eigenschaften (exprimierter Phänotyp) einer Zelle durch einen Gentransfermechanismus, wobei DNA oder RNA in einer Form in eine Zelle eingeführt werden, in der sie zu einem bestimmten Genprodukt exprimiert wird oder eine Expression ändert oder endogene Genprodukte beeinträchtigt. Der Vektor kann mittels einer Reihe von Verfahren in die Zelle eingeführt werden, unter anderem durch Mikroinjektion, CaPO4-Präzipitation, Lipofektion (Liposomfusion), Einsatz einer "Genpistole" und durch DNA-Vektortransporter.
  • Rekombinante Adenoviren, die das HSV-TK-Gen enthalten, können von verschiedenen Promotoren gesteuert werden, unter anderem dem Promoter des Zytomegalievirus, dem LTR des Rouse-Sarkomvirus, LTR des Maus-Leukämievirus, Simianvirus 40 "early"- und "late"-Promoter und von endogenen HSV-TK-Genen. Die rekombinanten Adenoviren dienen zur effizienten Anlieferung des HSV-TK- Gens zu Tumoren. Adenovirusvektoren besitzen mehrere biologische Eigenschaften, aufgrund derer sie bei der somatischen Gentherapie von Hirntumoren effektiver als Retroviren sind. Adenovirusvektoren besitzen ein breites Wirts- und Zellspektrum, eine Mehrfachinfektion von Wirtszellen kann zu hohen Genexpressions-Spiegeln führen, die Infektion erfolgt episomal, so daß nur eine geringe Wahrscheinlichkeit für eine Insertionsmutation von Wirtsgenen besteht, und es können hohe Virustiter von bis zu 1 × 1011 Teilchen/ml produziert werden.
  • Ein breites Spektrum von Krebsarten, Papillomen und Warzen kann mit der selben therapeutischen Strategie behandelt werden. Repräsentative Beispiele sind unter anderem Kolonkarzinom, Prostatakrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Hautkrebs, Leberkrebs, Knochenkrebs, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hirnkarzinom, Kopf- und Nackenkarzinom, Lymphom und andere solide Tumoren. Repräsentative Beispiele für Papillome sind unter anderem Papillome der Plattenepithelzellen, des Plexus chorioideus und des Larynx. Repräsentative Beispiele für Warzenzustände sind unter anderem Genitalwarzen, Verruca plantaris, Epidermodysplasia verruciformis und maligne Warzen.
  • Der Begriff "Nukleinsäurekassette" bezieht sich bei seiner Verwendung in diesem Schriftstück auf das genetische Material von Interesse, das ein Protein, ein Peptid oder eine RNA exprimieren kann. Die Nukleinsäurekassette ist operativ verknüpft, d.h. in ihrer Stellung und Sequenz in einem Vektor orientiert, mit anderen notwendigen Elementen, so daß die Nukleinsäurekassette transkribiert und bei Bedarf im Sinne einer Translation ausgelesen werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Behandlung eines umschriebenen soliden Tumors, Papilloms oder einer Warze bei einem Tier oder Menschen, bestehend aus den Schritten: Einführung eines Adenovirusvektors unmittelbar in den besagten Tumor oder das Papillom, bestehend aus den folgenden Elementen in aufeinanderfolgender Verknüpfung in einem ge eigneten Abstand für die funktionelle Expression: einen Promoter, eine 5'-mRNA-Leadersequenz, eine Initiationsstelle, eine Nukleinsäurekassette, die die zu exprimierende Sequenz enthält, eine 3'-untranslatierte Region und ein Polyadenylierungssignal; und Verabreichung einer Arzneivorstufe (Prodrug) an Tier oder Mensch, wobei das Prodrug unter in vivo-Bedingungen in eine toxische Verbindung umgewandelt wird.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von soliden Tumoren, Papillomen und Warzen bei einem Tier oder Mensch, bestehend aus den Schritten: Einführung eines Adenovirusvektors unmittelbar in den soliden Tumor, wobei besagter Vektor die folgenden Elemente in aufeinanderfolgender Verknüpfung in einem geeigneten Abstand für die funktionelle Expression umfaßt: einen Promoter, eine 5'-mRNA-Leadersequenz, eine Initiationsstelle, eine Nukleinsäurekassette, die ein Suizidgen enthält, eine 3'- untranslatierte Region und ein Polyadenylierungssignal; und gleichzeitige Einführung eines zweiten Adenovirusvektors, wobei letzterer Vektor die folgenden Elemente in aufeinanderfolgender Verknüpfung in einem geeigneten Abstand für die funktionelle Expression umfaßt: einen Promoter, eine 5'-mRNA-Leadersequenz, eine Initiationsstelle, eine Nukleinsäurekassette, die ein Zytokingen enthält, eine 3'- untranslatierte Region und ein Polyadenylierungssignal; und Verabreichung einer Arzneivorstufe (Prodrug) an Tier oder Mensch, wobei das Prodrug unter in vivo-Bedingungen in eine toxische Verbindung umgewandelt wird.
  • Zusätzlich zu Adenovirusvektoren können auch andere Zufuhrsysteme verwendet werden, entweder virale oder nicht-virale. Ein gezieltes System für nicht-virale Formen von DNA oder RNA benötigt vier Komponenten: 1) die DNA oder RNA von Interesse, 2) einen Anteil, der einen Zelloberflächenrezeptor oder ein Antigen erkennt und daran bindet, 3) einen DNA-bindenden Anteil und 4) einen Lyseanteil, der den Transport des Komplexes von der Zelloberfläche zum Zytoplasma ermöglicht. Beispiele für solche nicht-virale Transfersysteme sind Smith and Woo, WO 93/18759 , eingereicht am 20. März 1992, zu entnehmen. Darüber hinaus können Liposome und kationische Lipide zur Zufuhr der therapeutischen Genkombinationen verwendet werden, um den selben Effekt zu erzielen. Bei potenziellen Virusvektoren handelt es sich u.a. um Expressionsvektoren, die sich von Viren, wie Vakziniavirus, Herpesvirus und Rinder-Papillomavirus, ableiten. Zusätzlich können episomale Vektoren eingesetzt werden. Andere DNA-Vektoren und Transportersysteme sind dem Stand der Technik bekannt. Zur Zeit sieht die bevorzugte Ausführungsform die Verwendung eines Adenovirussystems vor.
  • In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der therapeutischen Nukleinsäuresequenz oder dem "Suizidgen" um eine Nukleinsäure mit dem Kode für ein Produkt, wobei das Produkt entweder an sich oder in Gegenwart anderer Verbindungen den Zelltod verursacht. Ein repräsentatives Beispiel für eine solche therapeutische Nukleinsäure (Suizidgen) ist eine Nukleinsäure, die den Kode für die Thymidinkinase des Herpes simplex Virus trägt. Weitere Beispiele sind die Thymidinkinase des Varicella zoster Virus und das bakterielle Gen Zytosindeaminase, das 5-Fluorzytosin in die hochtoxische Verbindung 5-Fluoruracil umwandeln kann.
  • "Prodrug" bezieht sich bei seiner Verwendung in diesem Schriftstück auf jede beliebige, für die Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignete Verbindung, die in ein toxisches, d.h. toxisch für Tumorzellen, Produkt umgewandelt werden kann. Das Prodrug wird von dem Genprodukt der therapeutischen Nukleinsäuresequenz (Suizidgen) in dem für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten Vektor in ein toxisches Produkt umgewandelt. Repräsentative Beispiele für solche Prodrugs ist Ganciclovir, das von HSV-Thymidinkinase unter in vivo-Bedingungen in eine toxische Verbindung umgewandelt wird. Das anschließend erhaltene Ganciclovirderivat ist toxisch für Tumorzellen. Weitere repräsentative Beispiele für Prodrugs sind unter anderem Acyclovir, FIAU [1-(2-Deoxy-2-fluor-β-D-arabinofuranosyl)-5-iodu racil], 6-Methoxypurinarabinosid für VSV-TK und 5-Fluorcytosin für Cytosindeaminase.
  • Ganciclovir ist von einem Fachmann auf diesem Gebiet mit normalen Fähigkeiten leicht zu verabreichen. Einer Person mit normalen Fähigkeiten würde es leicht fallen, die geeigneteste Dosis und den geeignetesten Verabreichungsweg für Ganciclovir zu ermitteln. Ganciclovir wird vorzugsweise in einer Dosis von ungefähr 1–20 mg/Tag/kg Körpergewicht verabreicht. Vorzugsweise wird Acyclovir in einer Dosis von ungefähr 1–100 mg/Tag/kg Körpergewicht und FIAU in einer Dosis von ungefähr 1–50 mg/Tag/KG Körpergewicht verabreicht.
  • Bei einem anderen Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein Adenovirus, das eine Zytokingensequenz enthält, von verschiedenen Promotern gesteuert werden, unter anderem dem Long tTrminal Repeat des Rous-Sarkomvirus, dem Zytomegalievirus-Promoter, dem Maus-Leukämievirus-LTR, den "early"- und "late"-Promotern des Simianvirus 40 und Herpes simplex Virus Thymidinkinase. Dieses Zytokingen-enthaltende Adenovirus kann anschließend zusammen mit dem Suizidgen-enthaltenden Adenovirus verabreicht werden, um eine "Kombinations-Gentherapie" zu erhalten.
  • "Zytokingen" bedeutet bei seiner Verwendung in diesem Schriftstück ein Gen mit dem Kode für eine beliebige der löslichen Substanzen, die von lymphoiden oder nicht-lymphoiden Zellen produziert werden, die sich durch ihre Fähigkeit auf eine Antigeninvasion anzusprechen auszeichnen. Zu diesen Substanzen gehören unter anderem die Interferone und Faktoren, die an der Stimulation von Helfer- und zytolytischen T-Lymphozyten zur Erzeugung einer effektiven Antitumorantwort beteiligt sind, sowie Makrophagen und Monozyten, die bei der Aktivierung von B-Lymphozyten zu Antikörper-produzierenden Zellen assistieren. Zu den Zytokingenen gehören unter anderem Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-10, Interleukin-12, Interferon-α, Interferon-β, Interferon-δ, Tumornekrosefaktor α und β, Granulozyten-Makrophagen-kolo niestimulierender Faktor (GM-CSF) und Granulozyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF).
  • In diesem Schriftstück werden u.a. die folgenden Abkürzungen verwendet: ADV/RSV-TK, ein rekombinanter Vektor, der das Thymidinkinase-Gen, gesteuert von dem Long Terminal Repeat aus dem Rous-Sarkomvirus, enthält; ADV/RSV-β-gal, der selbe Vektor wie oben, der jedoch das Gen für 1-Galaktosidase enthält; TK, das Thymidinkinase-Gen aus dem Herpes simplex Virus; GCV, Ganciclovir; PBS, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (Saline).
  • Die folgenden Beispiele dienen Erläuterungszwecken und beschränken die Erfindung in keiner Weise.
  • BEISPIEL 1
  • Gentherapie für Hirntumoren:
  • Regression von experimentellen Gliomen durch Adenovirus-vermittelten Gentransfer unter in vivo-Bedingungen.
  • Konstruktion des Adenovirusvektors. Die Konstruktion des rekombinanten Adenovirusvektors, der das Thymidinkinase-Gen aus dem Herpes simplex Virus (HSV-TK) enthält (Summers, W.C., et al., PNAS 78(3), S. 1441–1445 (1981)) ist 1 zu entnehmen. Es wurden drei verschiedene Vektoren konstruiert, die jeweils einen anderen Promoter 5' zur Kodiersequenz und dem Polyadenylierungssignal des HSV-TK-Gens enthielten: (1) die Sequenz des Long Terminal Repeat aus dem Rous-Sarkomvirus (Ad/RSV-TK), (2) den "early"-Genpromoter aus dem Zytomegalievirus (Ad/CMV-TK) und (3) den Thymidinkinase-Promoter aus dem Herpes simplex Virus (Ad/HSV-TK).
  • Transduktion von C6-Gliomzellen.
  • Die Transduktion von C6-Gliomzellen unter in vitro-Bedingungen wurde erreicht unter Einsatz eines rekombinanten Adenovirusvektors, der das bakterielle B-Galaktosidase-Gen enthielt. 5 × 105 C6-Zellen wurden auf Wells mit einem Durchmesser von 1,5 cm ausgestrichen und mit AdV/RSV- B-gal bei verschiedenen Virusdosen transduziert und zwei Tage danach mit X-gal angefärbt. Tafel A zeigt die Ergebnisse bei einer MOI von 0. Tafel B zeigt die Ergebnisse bei einer MOI von 125. Tafel C zeigt die Ergebnisse bei einer MOI von 500 und Tafel D zeigt die bei einer MOI von 2.000 erhaltenen Ergebnisse.
  • Transduktion von C6-Zellen unter Einsatz des HSV-TK-Gens.
  • Die Transduktion von C6-Gliomzellen wurde ebenfalls erreicht unter Einsatz eines rekombinanten Adenovirusvektors, der das HSV-TK-Gen (Ad/RSV-TK) enthielt. 5 × 105 C6-Zellen wurden auf Wells mit einem Durchmesser von 1,5 cm ausgestrichen und mit dem Virusvektor bei den angegebenen verschiedenen Dosen transduziert. Die Zellen wurden zwei Tage danach geerntet und Proteinextrakte hergestellt. Die HSV-TK-Enzymaktivität wurde durch Phosphorylierung mit 3H-Acyclovir ermittelt, wie von James et al., J. Biol. Chem., 253 (24): 8721–8727 (1978) beschrieben.
  • Wie 3 zu entnehmen ist, war die HSV-TK-Aktivität in den C6-Zellen nach der Transduktion mit AD/RSV-TK bei einer MOI von 1.000 bzw. 2.000 am höchsten.
  • Ganciclovir-Suszeptibilität von HSV-TK+-C6-Zellen.
  • Die Suszeptibilität von Ad/RSV-TK-transduzierten C6-Gliomzellen gegenüber der Toxizität von Ganciclovir ist in 4 dargestellt. Platten mit virustransduzierten Zellen (jeweils zweifach) gemäß 3 wurden einer Ganciclovirbehandlung mit 2 ug/ml unterzogen und die Anzahl der nach 72 Stunden verbliebenen überlebenden Zellen ausgezählt.
  • 4 erläutert den Effekt von Ganciclovir bei C6-Zellen nach der Transduktion mit AD/RSV-TK. Dabei ist 4 zu entnehmen, daß bei einer MOI von 250 62,5% der Zellen abgetötet waren und eine MOI von 500 zum Tod von 75% der Zellen führte. Am dramatischsten war eine MOI von 1.000, bei dem ungefähr 95% der Zellen abgetötet waren.
  • Gentherapeutische Strategie.
  • Die Strategie für die Gentherapie bei Hirntumoren unter Einsatz von rekombinanten Adenovirusvektoren, die HSV-TK enthalten, ist den 5 und 6 zu entnehmen. In 5 wurden C6-Gliomzellen stereotaktisch in das Gehirn von Nacktmäusen injiziert, wobei die Injektionsstellen mit etwas Aktivkohle markiert wurden. Ungefähr 1 Woche danach wurde Ad/RSV-TK stereotaktisch in den Tumor injiziert. Die Mäuse wurden anschließend in 2 Gruppen aufgeteilt: eine Gruppe wurde 6 Tage lang mit Ganciclovir behandelt und die andere mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Anschließend wurden die Tiere ohne weitere Behandlung bis zur Tumorentwicklung gehalten, d.h. ungefähr ein bis zwei Wochen.
  • 6 zeigt die Injektionen von Tumorzellen in Organe von Mäusen dar. Nach 4–8 Tagen wurden die Mäuse auf zwei Gruppen aufgeteilt. Bei einer Gruppe wurde AD/β-gal in den Tumor injiziert, bei der anderen Gruppe wurde AD/HSV-TK in den Tumor injiziert. Ungefähr 1–2 Wochen danach wurde jeweils die Hälfte der Mäuse in den beiden Gruppen mit PBS und die andere Hälfte mit Ganciclovir behandelt. Lediglich bei den Mäusen, die mit Ganciclovir und AD/RSV-TK behandelt worden waren, war eine Tumorregression festzustellen.
  • Wirkung der Injektion von Ad/RSV-TK und Ganciclovir bei Hirntumoren.
  • Die Versuchstiere erhielten eine Inokulation von 104 C6-Gliomzellen mittels einer stereotaktischen Injektion in das Gehirn. 4–8 Tage danach wurden 3 × 108 Teilchen rekombinanter Adenovirusvektor, der das HSV-TK (HSV/RSV-TK)-Gen enthielt, mit stereotaktischer Technik in die selbe Stelle injiziert. Zwölf Stunden danach erhielten die Tiere als Behandlung täglich entweder eine intraperitoneale Verabreichung von Puffer (PBS) oder Ganciclovir (GCV: 125 mg/kg) an 6 aufeinanderfolgenden Tagen. Die Tiere erhielten keine weitere Behandlung bis Tag 20 nach der Tumorzellinokulation und das Auftreten von Hirntumoren bei den einzelnen Tieren wurde festgehalten.
  • In 7 sind Versuchstiere 20 Tage nach der C6-Gliomzell-Inokulation in das Gehirn gefolgt von der stereotaktischen Verabreichung von Ad/RSV-TK zu sehen. Ein repräsentatives PBS-behandeltes Tier mit einem offensichtlichen Hirntumor ist in der linken Tafel in 7 dargestellt, während die rechte Tafel von 7 eine repräsentative GCV-behandelte Maus ohne offensichtlichen Hirntumor darstellt.
  • Makroanatomie des Mausgehirns mit und ohne Tumor.
  • In 8 sind Ganzgehirne von Mäusen dargestellt, die gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 entweder mit PBS (links) oder Ganciclovir (rechts) behandelt worden waren. 20 Tage nach einer Tumorzellinokulation wurde den Versuchstieren das Gehirn wie oben beschrieben entnommen. Die Tumorraumforderung bei den PBS-behandelten Tieren wurde aus dem Gehirn herauspräpariert und auf das Organ gelegt. Da die C6-Gliomzellen ursprünglich mit etwas Aktivkohle in das Mausgehirn injiziert worden waren, befindet sich auf dem Ganciclovir-behandelten Mausgehirn einen Flecken Aktivkohle, der die Stelle der Tumorzellinjektion angibt. TABELLE 1 Hirntumorbehandlung mit einem Adenovirusvektor, der das HSV-TK-Gen enthält
    BEHANDLUNG PBS GCV
    Anzahl der behandelten Tiere 4 4
    Anzahl der Tiere mit Hirntumor 4 1
  • BEISPIEL 2
  • Ganciclovir-Effekt bei einer Brustkrebs-Zelllinie.
  • Behandlung von umschriebenen Brustkrebstumoren bei Mäusen.
  • Zur Untersuchung des "Bystander-Effekts" bei soliden Tumoren wurde eine von BALB/c-Mäusen abgeleitete Brustkrebs-Zelllinie (MOD) verwendet. Nach einer subkutanen Injektion von Tumorzellen in kongene Empfänger bildet diese Zelllinie leicht umschriebene Tumoren. Daher kann diese Zelllinie als ein Modell für eine Gentherapie bei Brustkrebs verwendet werden.
  • 9 zeigt den Effekt der Ganciclovirbehandlung und die Regression eines HSV-Tk+-Brusttumors in schematischer Darstellung. 9 ist zu entnehmen, daß in einem Fall die Eltern-Tumorzellen den Mäusen durch subkutane Injektion verabreicht wurden. Die Mäuse wurden anschließend auf zwei Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe wurde mit PBS behandelt, die andere Gruppe wurde 5 Tage mit GCV behandelt. Zwei Wochen danach wurden die Tiere getötet. Außerdem ist 9 zu entnehmen, daß eine andere Gruppe Mäuse eine Injektion von Tumorzellen erhielt, in die zuvor das HSV-TK-Gen unter in vitro-Bedingungen eingefügt worden war (HSV-TK+). Anschließend wurden die Mäuse wie oben beschrieben entweder mit PBS oder mit GCV behandelt.
  • In 10 ist der Effekt der Ganciclovirbehandlung auf die Tumorgröße dargestellt. Der oberen Tafel ist zu entnehmen, daß kaum ein signifikanter Unterschied zwischen der Behandlung mit PBS bzw. GCV bei den Mäusen bestand, denen nur die Elternzellen injiziert wurden. Die untere Tafel in 10 zeigt, daß die Ganciclovirbehandlung die Tumorgröße signifikant verringerte, wenn das HSV-TK-Gen in die Tumorzellen eingefügt worden war, bevor diese in die Mäuse injiziert wurden.
  • 11 zeigt den "Bystander-Effekt" in schematischer Darstellung. In der schematischen Darstellung in 11 wurden Eltern-Tumorzellen und Tumorzellen, die das HSV-TK-Gen enthalten, gemischt und den Mäusen per subkutaner Injektion verabreicht. Anschließend wurden die Mäuse mit PBS oder GCV behandelt.
  • ERGEBNISSE
  • Unter in vitro-Bedingungen zeigten HSV-TK-Gen-transformierte MOD-Zellen eine weit größere Empfindlichkeit gegenüber den toxischen Effekten von Ganciclovir als die Eltern-Tumorzellen.
  • Bei der Untersuchung unter in vivo-Bedingungen war durch die intraperitoneale Verabreichung von Ganciclovir nicht nur das Wachstum der mit dem HSV-TK-Gen transformierten MOD-Zellen gehemmt, sondern es war auch eine Regression der soliden Tumoren bei den Mäusen festzustellen. Bei Tumoren, die nur von den Eltern-Tumorzellen abgeleitet waren, war dagegen keine Regression festzustellen. Darüber hinaus wurde auch ein ausgeprägter "Bystander-Effekt" bei den Brusttumorzellen unter in vivo-Bedingungen festgestellt. Erhielten die Tiere die HSV-TK-exprimierenden MOD-Zellen und Eltern-Tumorzellen als Koinjektion, reichten bereits 10% HSV-TK-exprimierende Zellen aus, um das Tumorwachstum insgesamt bei den Tieren nach der Ganciclovirbehandlung zu hemmen (12). Die Tumoren traten bei dieser Gruppe von Tieren jedoch nach 30–45 Tagen erneut auf. Andererseits blieben Tiere, die eine Inokulation mit 90% oder 50% TK+-Zellen erhalten hatten, für diese Zeitspanne tumorfrei.
  • Für die HSV-TK-Gen-Expression nach der Verabreichung von rekombinantem Adenovirusvektor kann auch eine Zelltypspezifität bei einem bestimmten soliden Tumor, Papillom oder Warze erreicht werden, indem gewebespezifische Promoter zur Steuerung der Transkription des HSV-TK-Gens eingesetzt werden. Einige Beispiel der verschiedenen gewebespezifischen Promoter sind Tabelle II zu entnehmen. TABELLE II
    TUMOR PROMOTER
    Leber Albumin, alpha-Fetoprotein, α1-Antitrypsin, Transferrin Transthyretin
    Kolon Karbonsäureanhydrase I, karzinoembryogenes Antigen
    Ovar, Placenta Östrogen, Aromatase Cytochrom P450, Cholesterin-Nebenketten-spaltendes P450, 17-alpha-Hydroxylase P450
    Prostata Prostata-spezifisches Antigen, gp91-phox-Gen, Prostataspezifisches Kallikrein (hKLK2
    Brust, G.I. erb-B2, erb-B3, β-Kasein, β-Laktoglobulin, WAP (Molke-saures Protein)
    Lunge Oberflächenaktives Protein C Uroglobin (cc-10, Cllacell 10kd-Protein)
    Haut K-4-Keratin, Humankeratin 1 oder 6, Loicrin
    Gehirn Gliafibrillen-saures Protein, reife Astrozyten-spezifisches Protein, Myelin, Tyrosinhydroxylase
    Pankreas Villin, Glucagon, Insulin, Amylin (islet amyloid polypeptide)
    Schilddrüse Thyreoglobulin, Calcitonin
    Knochen Alpha 1 (I) Kollagen, Osteocalcin, Knochen-Sialoglykoprotein
    Niere Renin, Alkalische Phosphatase von Leber/Knochen/Nieren, Erythropoetin (Epo)
  • BEISPIEL 3
  • Adenovirus-vermittelte Gentherapie bei experimentellen Gliomen.
  • Die Wirksamkeit der Adenovirus-vermittelten Gentherapie bei der Behandlung von Hirntumoren wurde mit Hilfe eines syngenen Gliommodells nachgewiesen. Zu diesem Zweck wurden Tumorzellen unter in situ-Bedingungen mit einem replikationsdefektiven Adenovirus (ADV) transduziert, der das Gen für die Herpes simplex Virus Thymidinkinase (HSV-tk) unter Steuerung durch den Rous-Sarkomvirus-Promoter enthielt. Durch die Expression des HSV-tk-Gens werden die transduzierten Zellen in die Lage versetzt, das Arzneimittel Ganciclovir in eine Form umzuwandeln, die zytotoxisch auf in der Teilung befindliche Zellen wirkt. Zur Erzeugung von Tumoren erhielten Ratten des Stamms Fischer 344 eine stereotaktische Implantation von 9L-Gliosarkomzellen in den Nucleus caudatus. Acht Tage später wurde entweder der das HSV-tk-Gen tragende ADV (ADV-tk) oder ein Kontroll-ADV-Vektor, der das β-Galaktosidase-Gen enthielt (ADV-βgal) in die Tumoren injiziert und die Ratten wurden entweder mit Ganciclovir oder mit Kochsalzlösung behandelt. Die Tumorgröße wurde 20 Tage nach der Implantation der 9L-Zellen oder bei Versterben der Tiere gemessen. Bei den mit ADV-βgal und Ganciclovir oder mit ADV-tk und Kochsalzlösung behandelten Ratten wurden große Tumoren festgestellt. Keine Tumoren waren nachweisbar bei den Tieren, die mit ADV-tk und mit Ganciclovir in Dosierungen ≥ 80 mg/kg behandelt worden waren. Ein Makrophagen- und Lymphozytenenthaltendes Infiltrat an der Injektionsstelle bei den mit ADV-tk und Ganciclovir behandelten Tieren ist als ein Anzeichen für eine aktive umschriebene Immunreaktion anzusehen. In Überlebensstudien waren alle mit ADV-tk und Ganciclovir behandelten Tiere nach 80 Tagen und bis zu 120 Tage nach der Tumorinduktion noch am Leben, während alle unbehandelten Tiere bis Tag 22 verstorben waren. Diese Ergebnisse belegen, daß der Adenovirusvermittelte Transfer von HSV-tk in Gliomzellen unter in vivo- Bedingungen eine Empfindlichkeit gegenüber Ganciclovir verleiht und ein Verfahren zur Behandlung von Hirntumoren darstellt.
  • Adenoviruskonstrukte.
  • Zur Konstruktion des ADV-tk-Vektors wurde HSV-tk in das Plasmid, das den Long Terminal Repeat des Rous-Sarkomvirus als Promoter enthielt (RSV-LTR), eingefügt und pADL.1/RSV-tk (Chen et al., 1994) erzeugt. Zur Produktion von rekombinantem Adenovirus wurden 293-Zellen mit pADL.1/RSV-tk und einem Plasmid, pJM17, das das Adenovirusgenom enthielt, kotransfiziert. Bei 293-Zellen handelt es sich um transformierte Humannierenzellen, die die E1-Region des Adenovirusgenoms tragen. Bei der Ko-Transfektion von 293-Zellen mit pADL.1/RSV-tk und pJM17 wurde durch eine homologe Rekombination ein replikationsdefektiver Adenovirus erhalten (Graham and Prevec, 1991). Der Virustiter wurde durch Messung der optischen Extinktion bei 260 nm ermittelt. Ein replikationsdefizienter Adenovirusvektor, der das β-Galaktosidase-Gen von E. coli unter Steuerung des Promoters RSV-LTR enthielt (ADVβ-gal), diente als Kontrollvektor.
  • Erzeugung von experimentellen Tumoren.
  • Unter in vivo-Bedingungen zeigen die 9L-Tumorzellen eine Morphologie, die als eine Mischung aus Glioblastom und Sarkom oder Gliosarkom beschrieben worden ist (Barker et al., 1973; Weizaecker et al., 1981). Die 9L-Gliomzellen wurden in DMEM-Medium (Dulbecco's modified Eagle medium) angereichert mit 10% Rinderfötenserum, Penizillin (100 E/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) bei 5% CO2 und 37°C in Erhaltungskultur gehalten. Für die Injektion wurden die Tumorzellen abgeerntet, indem die Zellen bei 37°C für eine Dauer von 5 Minuten mit 0,25% Trypsin in 1,0 mM Ethylendiamintetraessigsäure behandelt wurden. Anschließend wurden die Zellen in DMEM gesammelt, gewaschen und in HBSS (Ranks' balanced salt solution) bei einer Konzentration von 2,0 × 1013 Zellen/μl resuspendiert. Die Anzahl der Zellen wurde vor und nach dem Konzentrationsschritt sowie vor der Injektion mit einem Hämocytometer bestimmt. Nach dem Implantationsverfahren wurde die Lebens fähigkeit der Zellpräparation durch eine Trypanblau-Ausschlußanalyse beurteilt.
  • Adulte, weibliche Fischer 344-Ratten (155–175 Gramm) dienten als Wirtstiere. Die Ratten wurden durch eine intramuskuläre Injektion (0,6 ml/kg) eines aus Ketamin (42,8 mg/ml), Xylazin (8,6 mg/ml) und Acepromazin (1,4 mg/ml) bestehenden Anästhetikums betäubt und in einen Stereotaxierahmen eingelegt. In der Mittellinie der Kopfhaut wurde eine Inzision geführt und mit einem 0,9 mm-Bohrer ein Bohrloch 1,8 mm rechts von und 2,5 mm anterior zum Bregma erzeugt. Mit einer 10 μl-Spritze, an die eine Nadel der Größe 26 Ch. angesetzt war und die an den Manipulationsarm des Stereotaxierahmens angeschlossen war, wurden 1 × 104 in 5 μl HBSS suspendierte 9L-Gliomzellen in Teilmengen von jeweils 0,2 μl über eine Dauer von 5 Minuten in einer Tiefe von 4,5 mm von der Dura in den rechten Nucleus caudatus injiziert. Die Nadel wurde 3 Minuten an dieser Stelle belassen und anschließend langsam über die nächsten 3 Minuten zurückgezogen. Das Bohrloch wurde mit Knochenwachs verschlossen und die Kopfhautwunde mit Klemmen verschlossen. Neun Tage nach der Tumorzellinjektion hatten die Tumoren einen Durchmesser von 1,65 ± 0,094 mm2 (n = 4) und führten, wenn sie unbehandelt blieben, zum Tod der Wirte nach einer mittleren Dauer von 20 Tagen nach der Implantation.
  • Adenovirustransduktion von experimentellen Tumoren.
  • Acht Tage nach der Injektion der 9L-Tumorzellen wurden entweder ADV-tk oder ADV-βgal in die Tumoren injiziert, wobei die selben Koordinaten wie bei der Tumorimplantation verwendet wurden. Dazu wurden Virusteilchen (1,2 × 109) in 6 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10% Glycerin und 1 mM MgCl2 an 6 Stellen in das Tumorbett injiziert. Ausgehend von einer Tiefe von 5,5 mm unter der Duraoberfläche wurde jeweils 1 μl Virus injiziert und dann die Nadel um 0,5 mm nach oben bewegt, bevor der nächste Mikroliter injiziert wurde. Dies wurde wiederholt bis insgesamt 6 Injektionen von jeweils 1 μl in die Mitte des Tumors vorgenommen worden waren. Die Virusinjektionen dauerten an allen Stellen jeweils 5 Minuten und anschließend wurde die Nadel über eine Dauer von weiteren 5 Minuten langsam zurückgezogen. Kohlenstoffteilchen (< 30 μm) wurden Zur Markierung der Injektionsstelle auf den Schaft der Injektionsnadel aufgebracht. Die Wunde wurde mit Klemmen verschlossen.
  • Ganciclovirbehandlung von experimentellen Tumoren.
  • Zum Nachweis der Wirksamkeit der Behandlung mit ADV-tk und Ganciclovir bei experimentellen 9L-Tumoren wurden 3 Behandlungsgruppen eingerichtet: 1) ADV-tk plus 100 mg/kg Ganciclovir (n = 6), 2) ADV-βgal plus 100 mg/kg Ganciclovir (n = 4), 3) ADV-tk plus Kochsalzlösung (n = 7). Mit der Behandlung wurde 12 Stunden nach der Virusinjektion begonnen. Dabei erhielten die Tiere Ganciclovir oder normale Kochsalzlösung per intraperitonealer Injektion zweimal täglich für eine Dauer von 6 aufeinanderfolgenden Tagen. 20 Tage nach der Injektion der Tumorzellen oder beim Versterben wurden die Tiere mit Fixiermittel perfundiert, die Gehirne sektioniert und angefärbt und die Tumorgröße morphometrisch bestimmt.
  • Der Effekt der Ganciclovirdosierung auf die Wirksamkeit der Behandlung mit ADV-tk wurde ermittelt, indem 7 Versuchsgruppen eingerichtet wurden (n = 4 für alle Gruppen), die eine Implantation von 9L-Zellen erhielten, mit 1,2 × 109 ADV-tk behandelt wurden und anschließend mit Ganciclovir in Dosierungen von 0, 10, 20, 50, 80, 100 und 150 mg/kg zweimal täglich für eine Dauer von 6 Tagen behandelt wurden. 20 Tage nach der Tumorinduktion wurden die Tiere mit Fixiermittel perfundiert, die Gehirne sektioniert und angefärbt und die Tumorgröße bestimmt.
  • Um den Effekt der Behandlung mit ADV-tk und Ganciclovir auf das Langzeit-Überleben aufzuzeigen, wurden 17 Tiere mit Tumoren mit ADV-tk und Ganciclovir (50 mg/kg) und 7 Tiere mit ADV-βgal und Ganciclovir (50 mg/kg) behandelt. Die Tiere wurden einer täglichen Überwachung unterzogen und sobald sie Anzeichen von Morbidität zeigten oder verstarben, wurden die Gehirne für eine histologische Analyse entnommen.
  • Histologische Analyse.
  • Die Tiere wurden betäubt und durch eine Herzperfusion mit 100 ml 10 mM Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) enthaltend Heparin (10 Einheiten/ml) gefolgt von 200 ml 4% Paraformalin in PBS fixiert. Die Gehirne wurden entnommen, 24 Stunden in 4% Paraformalin in PBS eingelegt und anschließend mit 21% Sucrose in PBS einer 24–48-stündigen Kroyprotektionsbehandlung bei 4°C unterzogen, anschließend in OCT montiert, eingefroren und auf einem Kryostat sektioniert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt oder für die immunzytochemische Analyse vorbereitet. Die maximale Tumor-Querschnittsfläche wurde mit Hilfe der Optimas Software von Bioscan ermittelt. Die mittleren Tumorwerte wurden mit Hilfe der statistischen Analyse ANOVA verglichen. Zur immunzytochemischen Anfärbung dienten ED1 Anti-Makrophagen-Antikörper (Dijkstra et al., 1985, Polman et al., 1986) in einer Verdünnung von 1 zu 500 auf 40 μm-Schnitten.
  • ERGEBNISSE
  • Wirkung der ADV-Gentherapie bei experimentellen Gliomen.
  • Wurden die Tumoren mit ADV-βgal und Ganciclovir (100 mg/kg) oder mit ADV-tk und Kochsalzlösung behandelt, waren 20 Tage nach der Injektion der Tumorzellen in allen Gehirnen große Tumoren festzustellen. Die Tumoren zeichneten sich durch Hyperzellularität, Kernpleomorphismus und Mitosen ohne inflammatorische Zellinfiltration aus. Die Tumoren waren im allgemeinen gut umschrieben und verursachten Kompression des umgebenden Gehirngewebes. Eine fokale, perivaskuläre Glioma-Infiltration in das umgebende Gehirngewebe war jedoch zu beobachten. Dagegen waren bei den Tieren, die eine Behandlung mit ADV-tk und Ganciclovir (100 mg/kg) erhalten hatten, keine Tumorzellen zu sehen. Statt dessen waren im Bereich der Tumorinjektion Makrophagen, Lymphozyten, neutrophile Granulozyten, Nekrose und Einblutungen festzustellen. Zwar schien die ipsilaterale intraventrikuläre auskleidende Schicht aus Ependymzellen bei den Proben beschädigt zu sein, doch war über die Tumoren oder die Injektionsstellen hinaus keine Nekrose, Demyelinisierung oder inflammatorische Antwort zu erkennen.
  • Dosis-Wirkungs-Beziehungen der Ganciclovirbehandlung.
  • Die morphometrische Analyse der Tumorgröße bei den mit Ganciclovir in verschiedenen Dosierungen behandelten Tieren ergab, daß selbst bei einer niedrigen Ganciclovirdosis von 10 mg/kg die Behandlungen mit ADV-tk plus Ganciclovir signifikante Wirkungen (P < 0,005) auf die Tumorgröße besaßen (13). Große Tumoren waren bei den mit ADV-tk und Kochsalzlösung bzw. den mit ADV-βgal und Ganciclovir behandelten Tieren vorhanden, während bei den mit ADV-tk und Ganciclovir in Dosierungen von 80 bis 150 mg/kg behandelten Tiere keine Resttumoren zu beobachten waren. Kleine Resttumoren traten bei Tieren auf, die mit ADV-tk und Ganciclovir in Dosierungen von weniger als 80 mg/kg behandelt worden waren. Bei den Tieren, die mit ADV-βgal und 150 mg/kg Ganciclovir behandelt worden waren, ergab sich eine signifikante Reduktion (P < 0,005) der Tumorgröße im Vergleich zu ADV-tk- plus Kochsalzlösung-behandelten Tieren. Dies spricht dafür, daß Ganciclovir an sich bereits eine Zytotoxizität oder hemmende Wirkung auf das Tumorwachstum besitzt, die unabhängig von der Thymidinkinase-Aktivität ist.
  • Überlebensstudien.
  • Das Langzeit-Überleben von mit ADV-βgal oder ADV-tk und 50 mg/kg Ganciclovir behandelten Tieren wurden bei zwei experimentellen und einer Kontrollgruppe gemessen (14). Alle Kontrolltiere (n = 5), die mit ADV-βgal und Ganciclovir behandelt wurden, verstarben innerhalb weniger Tage nach der Tumorinjektion und wiesen bei der Nekroskopie große intrakranielle Tumoren auf. Drei der vier Tiere in der ersten experimentellen Gruppe, die mit ADV-tk und Ganciclovir (50 mg/kg) behandelt worden waren, überlebten für mehr als 120 Tage. Eines dieser Tiere verstarb nach 98 Tagen. Im Gehirn dieses Tiers befand sich kein Tumor und die Nekroskopie ergab auch keine andere Todesursache. Die zweite experimentelle Gruppe bestand aus fünf Tieren, die mit ADV-tk und Ganciclovir (50 mg/kg) behandelt wurden. Alle Tiere aus dieser Gruppe haben inzwischen 80 Tage lang überlebt.
  • Diese Versuche belegen, daß die Transduktion von experimentellen Gliomen unter Einsatz eines rekombinanten Adenovirusvektors, der HSV-tk trägt, den Zellen eine Empfindlichkeit gegenüber dem zytotoxischen Arzneimittel Ganciclovir verleiht. Adenovirusvektoren infizieren sowohl sich teilende als auch nicht in der Teilung befindliche Zellen und eine Zelle kann von mehreren Virionen gleichzeitig infiziert werden, wodurch sich die Anzahl der Kopien der rekombinanten Gene erhöht, die pro Zelle exprimiert werden. In der vorliegenden Untersuchung waren 20 Tage nach der Tumorinjektionsbehandlung bei den Tieren, die mit ADV-tk und Ganciclovir in Dosierungen von 80, 100 und 150 mg/kg behandelt wurden, keine Tumoren vorhanden, während die mit ADV-tk und Kochsalzlösung oder ADV-βgal und Ganciclovir behandelten Kontrolltiere große Tumoren aufwiesen. Bei Ganciclovirdosierungen von bis zu 50 mg/kg waren 20 Tage nach der Injektion der 9L-Zellen bei manchen Tieren noch Resttumoren nachweisbar. Aber trotz des Vorhandenseins von Resttumoren bei den Tieren, die mit ADV-tk und 50 mg/kg Ganciclovir behandelt und 20 Tage nach der Implantation für die histologischen Untersuchungen getötet wurden, haben Tiere, die im Rahmen von Überlebensstudien nach dem selben Protokoll behandelt wurden, bis zu 120 Tage überlebt. Aufgrund des raschen in vivo-Wachstums vom implantierten 9L-Gliosarkomzellen ist es zweifelhaft, daß bei den Langzeit-Überlebenden noch Resttumorzellen vorhanden sind oder, falls dies doch der Fall ist, müssen diese Zellen ein anderes biologisches Verhalten zeigen.
  • BEISPIEL 4
  • Adenovirus-vermittelte Gentherapie bei Plattenepithelkarzinomen in Kopf und Nacken beim Menschen in einem Nacktmausmodell.
  • Der Adenovirus-vermittelte Transfer des Herpes-Thymidinkinase-Gens gefolgt von einer Ganciclovirverabreichung wurde zur Be handlung von humanen Plattenepithelkarzinomen in Kopf und Nacken, die in den Mundboden von Nacktmäusen implantiert worden waren, verwendet. Zur Tumorerzeugung diente eine transkutane Nadelinjektion von 6 × 106 Krebszellen und 14 Tage später wurden 1010 Teilchen eines replikationsdefektiven rekombinanten Adenovirus, das das Thymidinkinase-Gen des Herpes simplex Virus enthielt (ADV/RSV.TK) unmittelbar in die Tumoren injiziert. Anschließend wurden die Mäuse 6 aufeinanderfolgende Tage lang mit GCV behandelt und 21 Tage nach der Tumorimplantation getötet. Die klinische Antwort auf die Behandlung wurde rechnergestützt ausgewertet. Die morphometrische Analyse von Aufnahmen der Querschnittsflächen von nicht-nekrotischen Tumoren sowie die Mitoseaktivität dienten zur Berechnung eines Tumorindexes. Der Medianwert des Tumorindexes der gesamten Behandlungsgruppe war 280- bis 2400-mal kleiner als bei den Kontrollen, die das therapeutische Gen nicht erhalten hatten (p < 0,001–0,016) und drei Viertel der Behandlungsgruppe wiesen Tumorindexwerte auf, die auf nahezu vollständige Tumorfreiheit schließen lassen. Diese Ergebnisse belegen, daß unter Einsatz der Adenovirus-vermittelten Gentherapie eine klinisch effektive in vivo-Behandlung für humane Plattenepithelkarzinome erreicht werden konnte.
  • Adenoviruskonstrukte.
  • Zur Konstruktion des ADV-tk-Vektors wurde HSV-tk in das Plasmid, das den Long Terminal Repeat des Rous-Sarkomvirus als Promoter enthielt, eingefügt und pADL.1/RSV-tk (Chen et al., 1994) erzeugt. Zur Produktion von rekombinantem Adenovirus wurden 293-Zellen mit pADL.1/RSV-tk und einem Plasmid, pJM17, das das Adenovirusgenom enthielt, ko-transfiziert. Bei 293-Zellen handelt es sich um transformierte Humannierenzellen, die die E1-Region des Adenovirusgenoms tragen. Bei der Ko-Transfektion der 293-Zellen mit pADL.1/RSV-tk und pJM17 wurde durch homologe Rekombination ein replikationsdefektiver Adenovirus erhalten (Graham and Prevec, 1991). Der Virustiter wurde durch Messung der optischen Extinktion bei 260 nm ermittelt. Ein replikationsdefizienter Adenovirusvektor, der das β Galaktosidase-Gen von E. coli unter Steuerung des Promoters RSV-LTR enthielt (ADV-βgal), diente als Kontrollvektor.
  • In vitro-Versuche.
  • 5 × 105 HLAC-79-Zellen wurden auf Gewebekulturplatten mit einem Durchmesser von 1,5 cm in Eagle's MEM-Medium, das 10% Rinderfötenserum und essenzielle Aminosäuren und Vitamine enthielt, ausgestrichen. Bei einer Zellkonfluenz von ungefähr 50% wurde der das bakterielle β-Galaktosidase-Gen enthaltende rekombinante Adenovirusvektor (ADV/RSV-β-gal) (Stratford-Perricaudel et al., J. Clin. Invest. (1992)) bei verschiedenen Infektionsmultiplizitäten zugegeben. 24 Stunden nach der Transduktion wurden die transduzierten Zellen mit X-gal angefärbt. Unter identischen Bedingungen wurden getrennte Zellkulturversuche mit dem ADV/RSV-TK-Vektor gefolgt von einer Behandlung mit entweder PBS oder GCV bei einer Konzentration von 10 μg/ml durchgeführt. 68 Stunden später wurden die überlebenden Zellen ausgezählt und mit den PBS-Kontrollplatten verglichen.
  • In vivo-Versuche.
  • Sämtliche Tierversuche wurden mit thymuslosen Nackt (nu/nu)-Mäusen (Harlan Sprague Dawley) unter Einsatz einer sterilen Technik unter einem Laminarflussabzug durchgeführt. 6–10 Wochen alte Nacktmäuse wurde durch eine intraperitoneale Injektion von 0,5 ml Avertin bei einer Konzentration von 20 mg/ml betäubt. Mit Hilfe einer 100 μl-Spritze und einer Nadel der Stärke 26 Ch. wurden 50 μl einer Lösung, die 6 × 106 humane H1AC-79-Plattenepithelzellen in Hank's gepufferter Kochsalzlösung enthielt, in den Mundboden der Nacktmäuse injiziert. Die Zellsuspension wurde langsam in Tiefe des Musculus mylohyoideus injiziert und anschließend die Nadel ohne offensichtliche Leckage zurückgezogen. Danach wurden die Tiere 14 Tage lang unter Standardzuchtbedingungen gehalten.
  • Für die Adenovirusinjektion wurden die Nacktmäuse wie oben beschrieben betäubt und eine Inzision in die Nackenhaut gelegt. Die Tumoren wurden durch vorsichtige chirurgische Präparation freigelegt und ihre Größe mit Hilfe einer Messlehre in allen drei Dimensionen vermessen. Eine Mikroliterspritze mit einer Nadel der Größe 25 Ch. diente sodann zur direkten Injektion von 75 μl einer Lösung, die 1 × 1010 Adenovirusteilchen ADV/RSV-TK oder ADV/RSV-βgal enthielt. Eine weitere Kontrollgruppe erhielt lediglich 75 μl Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Zur Anlieferung des Adenovirus oder PBS selbst dienten vier getrennte Nadeleinstiche, zwei parallel zur langen Tumorachse und zwei im rechten Winkel zu dieser Achse. Die Nackeninzisionen wurden mit einem Seidenfaden der Stärke 4-0 (Ethicon) verschlossen. Achtzehn Stunden nach den Virusinjektionen wurden die Behandlungen mit Ganciclovir 100 mg/kg oder dem selben Volumen PBS bei den Mäusen eingeleitet und sechs Tage bei dem selben Volumen fortgeführt. Die behandelten Mäuse zeigten keine Änderung ihrer Freß- oder sonstigen Gewohnheiten während der Dauer des Ganciclovirbehandlung.
  • 21 Tage nach der ursprünglichen Tumorimplantation wurden die Mäuse getötet und die Läsionen vorsichtig exzidiert, so daß sie lediglich die nekrotischen oder Resttumorraumforderungen enthielten. Die Tumorraumforderungen wurden sofort nach der Exzision mit einer Schieblehre gemessen; vor der Einbettung für die histologische Untersuchung wurden von einem zweiten Untersucher Wiederholungsmessungen vorgenommen. Für die X-gal-Untersuchungen wurden die exzidierten Tumore in O.C.T. eingebettet und über Trockeneis schnellgefroren. Diese Präparate wurden bei –80°C bis zur Herstellung von Gefrierschnitten gelagert, die anschließend mit X-gal angefärbt wurden (Ponder et al, PNAS (1988)). Für alle anderen histologischen Untersuchungen wurde das Gewebe mit 10% gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, serielle 3-Mikrometer-Schnitte angefertigt und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die histologischen Schnitte wurden alle von der selben Person (M.R.S.) untersucht, wobei dieser Person nicht bekannt war, welche Behandlungen die Tiere im einzelnen erhalten hatten. Zur Beurteilung von Tumorgrad, Umschreibung, Nekrose, Fibrose, inflammatorischer Antwort und zur Mitosezählung wurden mikroskopische Standardgeräte verwendet. Quantitative morphometrische Messungen der maximalen Tumor-Querschnittsflächen, Prozentanteil Tumornekrose pro Querschnittsfläche und Mitosezahlen pro 10 hochaufgelöste Felder wurden mit einem rechnerunterstützten Bildanalysegerät durchgeführt. Dieses System beinhaltete ein Mikrophot-FXA-Mikroskop von Nikon, eine Hochauflösungskamera des Typs 370M von Ikegami, einen Sony Triniton Hochauflösungs-Farbvideobildschirm und einen 486-Rechner von Compudyne mit der Optimas Software von Bioscan (Edmonds, WA, USA).
  • ERGEBNISSE
  • Effizienz der Adenovirus-Transduktion von HlaC-79-Zellen unter in vitro-Bedingungen.
  • Bei den ADV/RSV β-gal-Versuchen waren 85% der humanen Plattenepithelkarzinomzellen bei einer MOI von 8 laut positiver blauer X-gal-Anfärbung transduziert und 100% der Zellen waren bei einer MOI von 16 transduziert. Bei dieser Adenoviruskonzentration bestand keine offensichtliche Toxizität und die Krebszellen zeigten keine morphologischen Veränderungen im Vergleich zu den Kontrollen. Bei den ADV/RSV-TK-Versuche erfolgten die Transduktionen mit einer Reihe von MOIs (von 0 (Kontrolle) bis 50) gefolgt von einer Behandlung mit entweder PBS oder GCV in den Kulturmedien. Eine effektive Abtötung der Krebszellen in der GCV-Gruppe wurde bei einer sehr niedrigen MOI von 3 erreicht und in der PBS-Gruppe waren weder Abtötung noch Toxizität bis zu einer MOI von 25 (15) zu beobachten. Zelltod in signifikantem Ausmaß war in den Plattenepithelkarzinom-Zellkulturen zu beobachten, wenn die Zellen bei einer MOI von 50 oder mehr mit Adenovirus transduziert, aber keiner GCV-Behandlung unterzogen wurden. Diese Befunde sprechen dafür, daß ADV/RSV-TK ein effizientes Vektorsystem darstellt, das in Kombination mit GCV auf eine effektive Weise humane Plattenepithelkarzinomzellen unter in vitro-Bedingungen abtötet.
  • Regression von humanen Plattenepithelkarzinomen nach der Adenovirustransduktion.
  • Nach der ursprünglichen Implantation von 6 × 106 Tumorzellen zeigte sich im Mundboden der Mäuse im Verlauf der anschließenden zwei Wochen ein langsames klinisches Tumorwachstum mit Ausdehnung in den anterioren Nackenbereich. Anzeichen für Kachexie waren während dieser Dauer nicht zu beobach ten und sämtliche Tiere machten einen gesunden Eindruck zum Zeitpunkt der Adenovirusinjektionen. Die Tiere einer Kontrollgruppe wurden nach zwei Wochen getötet und die anschließende histopathologische Untersuchung ergab einen Befund von wenig differenzierten Plattenepithelkarzinomen mit zahlreichen mitotischen Zahlen ohne Hinweis auf Keratinbildung oder Nekrose. Außerdem gab es klinische und histopathologische Hinweise für eine Invasion des umgebenden Weichteilgewebes, der Muskeln und Knochen. Bei einer zweiten Kontrolltiergruppe entwickelte sich mit der Zeit Kachexie und die Tiere verstarben nach 30–45 Tagen.
  • Die klinischen Versuche wurden mit vier Kontrollgruppen und einer Gruppe mit einer vollständigen Behandlung durchgeführt:
    (1) PBS-Injektion in den Tumor plus GCV-Behandlung (PBS+ G+), (2) ADV/RSV-β-gal plus PBS (β-gal+ G–), (3) ADV/RSV-β-gal plus GCV (β-gal+ G+), (4) ADV/RSV-TK plus PBS (TK+ G–) und (5) ADV/RSV-TK plus GCV (TK+ G+). Die Versuchstiere zeigten keine Anzeichen von Kachexie oder Veränderungen der Freßgewohnheiten im Verlauf der Behandlungsdauer und machten ausnahmslos einen klinisch gesunden Eindruck bei der Nekroskopie. Die Tumorgrößen vor der Behandlung lagen bei mindestens 4,36 mm2 (Querschnittsfläche) bei einem Durchschnittswert von 13,7 mm2 für alle Gruppen und von 16,4 mm2 für die Gruppe mit der vollständigen Behandlung (TK+ G+). Die große Schwankungsbreite bei der Tumorgröße stimmt mit den Angaben in der Originalarbeit überein, die den einzigen Bericht über dieses Krebsmodell darstellt (Dinesman et al., Otolaryngol Head Neck Surg., (1990)).
  • Die zytotoxischen Effekte der Behandlungen wurden histologisch bewertet, indem der Prozentanteil Nekrose in den Tumorraumforderungen unter Einsatz eines rechnerunterstützten Bildanalysesystems gemessen wurde. Die Tiere in den Gruppen PBS+ G+ und β-gal+ G– zeigten keine Tumornekrose, bei den Tieren in den Gruppen TK+ G– und 5-gal+ G+ zeigten sich lediglich herdförmige Nekrosebereiche, die zwischen 0,5 und 5,0% der mittleren Querschnittsfläche ausmachten. Bei der Gruppe TK+ G+ zeigte sich dagegen eine deutliche diffuse Nekrose bei zwischen 17 und 72% der Tumorraumforderung mit einem Mittelwert von 41%, der laut t-Test-Analyse im Vergleich zu den Kontrollen statistisch signifikant war (p < 0,001) (16).
  • Die X-Gal-Anfärbungen von Schnitten aus den mit ADV/RSV-Bgal injizierten Tumoren ergaben eine positive Kernfärbung bei 1–10% der Tumorzellen, deren Verteilung mit den Regionen der Nadelinjektionen übereinstimmte. Kleine Resttumorinseln waren bei den meisten Tieren mit der vollständigen Behandlung (TK+ G+) noch zu erkennen, doch ergab die mikroskopische Untersuchung angeschwollene absterbende Tumoren oder individuelle nekrotische Zellen in diesen Bereichen. Außerdem war die Mitoseaktivität sehr gering oder völlig abwesend. Drei Tumorproben zeigten eine deutliche fibröse Obliteration mit lediglich kleinen Inseln aus absterbenden Tumorzellen im Innern von dichtem fibrösem Gewebe. Lediglich die beiden größten Tumoren der Gruppe TK+ G+ (220 bzw. 324 mm2 bei der Transduktion) zeigten nach der Behandlung noch deutliche Bereiche mit lebensfähigen Tumorzellen.
  • Um diese Befunde auf eine objektive Weise zu analysieren, wurde für jede Gruppe ein die klinische Antwort insgesamt anzeigender Tumorindexwert ermittelt, wobei eine Modifikation der vorbeschriebenen Berechnung eines Krebszellindexes (Caruso et al., PNAS (1990)) verwendet wurde. Der Tumorindex stützte sich auf morphometrische Messungen der maximalen Tumor-Querschnittsfläche multipliziert mit der Mitoseaktivität der nicht-nekrotischen Tumorraumforderungen und Veränderung der makroskopischen Größe. Bei der Mehrzahl der Tiere der Gruppe TK+ G+ lag der Tumorindex bei "30" oder darunter, was eine fast vollständige Tumorregression widerspiegelt bei der lediglich selten lebensfähige Tumorzellen in der mikroskopischen Analyse festzustellen sind (17). Ein Wert von "0" trat bei vier Tieren der Gruppe TK+ G+ auf und war nicht nur mit fehlenden Mitosezahlen sondern auch mit dem Fehlen von charakteristischen lebensfähigen Tumorzellen in der histologischen Untersuchung verbunden.
  • Der mittlere Tumorindex für die Gruppe mit der vollständigen Behandlung (TK+ G+) war 10–100-mal kleiner und der Medianwert 280–2400-mal kleiner als die entsprechenden Werte bei den Kontrollgruppen, die das therapeutische TK-Gen nicht erhalten hatten. Im Vergleich zu der TK-Gruppe, die kein Ganciclovir erhalten hatte (TK+ G–), waren der mittlere und der mediane Tumorindexwert bei der Behandlungsgruppe TK+ G+ 6- bzw. 55-fach kleiner. Mit Hilfe einer Analyse nach Mann-Whitney zeigte sich der Vergleich der Gruppe TK+ G+ zu jeder einzelnen Kontrollgruppe als statistisch signifikant bei Werten im Bereich von p < 0,001 bis p < 0,02 aufgezeigt (16).
  • Lokale und systemische Effekte von Adenovirus-Gentransfer und Ganciclovirbehandlung.
  • Zwei der Tiere, die eine Behandlung mit ADV/RSV-TK und Ganciclovir erhalten hatten, wurden auf Zufallsbasis ausgewählt und Proben des lokalen Gewebes und von Fernorganen wurden auf histologische Auffälligkeiten untersucht. Die umgebenden Muskeln, das Weichgewebe und die Speicheldrüsen im Mundboden und Nackenbereich ergaben keinen Hinweis auf Nekrose, absterbende Zellen oder morphologische Veränderungen. Bei der Nekroskopie wurden auch Fernorgane entnommen, unter anderem Dünndarm, Harnblase, Ovar, Milz, Herz, Gehirn, Nieren, Lungen und Leber. Sämtliche Organe ergaben Normalbefunde bei der makroskopischen Untersuchung und die histologische Analyse ergab keine Tumormetastasen, Nekrose, Fibrose oder sonstige morphologischen Auffälligkeiten. Insgesamt gesehen machten die lokalen und die Ferngewebe einen normalen Eindruck ohne offensichtliche Effekte durch die Adenovirus- oder Ganciclovirbehandlung.
  • Diese Versuche sind der erste erfolgreiche Nachweis für die Verwendung eines Adenovirus-vermittelten Gentransfers zur Behandlung von Plattenepithelkarzinomen in Kopf und Nacken des Menschen in einem Nacktmausmodell. Die Wirksamkeit des Behandlungsablaufs verdeutlich die sehr niedrige MOI, die zur Abtötung unter in vitro-Bedingungen benötigt wird, und die Ergebnisse der beiden analysierten therapeutischen Indices. Diese Humankrebs-Zelllinie ist hochgradig suszeptibel gegenüber der Transduktion mit dem Adenovirus-Vektorsystem, da eine dramatische Abtötungsrate bereits bei einer MOI von lediglich 3 erreicht wurde. Diese Suszeptibilität gegenüber der Transduktion mit Adenoviren sollte sich als vorteilhaft erweisen, da unter diesen Umständen auch niedrigere Konzentrationen von ADV/RSV-TK zu Tumoren geliefert werden können, um noch eine erfolgreiche klinische Antwort zu erreichen.
  • Bei dem ersten therapeutischen Index handelt es sich um den Mittelwert der Tumornekrose, der bei der Gruppe mit ADV/RSV-TK plus GCV (TK+ G+) hoch war, was auf einen deutlichen zytotoxischen Effekt der gekoppelten Therapie schließen lässt. Die Behandlung mit Ganciclovir allein (PBS+ G+) oder in Verbindung mit dem g-gal-Vektor (β-gal+ G+) führte nicht zur Tumornekrose und zwei der sieben Tumore, in die nur der Thymidinkinase-Vektor injiziert worden war (TK+ G–), zeigten nur mikroskopisch kleine Regionen mit herdförmiger Nekrose. Bei der verbleibenden experimentellen Gruppe, die nur den β-gal-Vektor erhalten hatte (β-gal+ G–), war mikroskopische herdförmige Nekrose bei jedem einzelnen Tumor an den Nadelinjektionsstellen festzustellen. Daraus kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß zur direkten Tumorvernichtung die Kombination aus dem Thymidinkinase-Gentransfer plus Ganciclovirbehandlung benötigt wird.
  • Der zweite therapeutische Index stützt sich auf eine morphometrische Analyse und histologische Eigenschaften des Tumors und hat die Bezeichnung Tumorindex erhalten. Die Bedeutung dieser Methode zur Berechnung des Tumorindex liegt darin, daß sie ein objektives Mittel zur Beurteilung von offensichtlichen Resttumoren und des Gesamt-Cutcomes der Behandlung liefert und auf diese Weise mögliche Voreingenommenheiten der Untersucher bei der Interpretation der Tumorhistologie ausgeschlossen werden. Bei der Mehrzahl der Tiere in der Gruppe mit der vollständigen Behandlung (TK+ G+) lag der Tumorindex bei einem Wert unter "30", was als Anzeichen für eine fast vollständige Vernichtung des Tumors anzusehen ist; bei vier Tieren lag der Wert sogar bei "0". Diese Befunde sind ein Nachweis für einen definitiven therapeutischen Effekt durch den Thymidinkinase-Gentransfer und die Ganciclovirbehandlung.
  • In der Gruppe TK+ G+ traten zwei starke klinische Antworten auf, die auf eine unvollständige Vernichtung des Tumors und Bereiche mit lebensfähigem Resttumor zurückzuführen waren. Bei der Überprüfung der makroskopischen Tumorgröße vor der Behandlung hatten diese Tiere Tumore mit einer Größe von 324 bzw. 220 mm3 im Vergleich zu einem Durchschnittsvolumen von 95 mm3 bei den anderen Tumoren in der Gruppe TK+ G+. Dieser Befund spricht dafür, daß es ein kritisches Tumorvolumen gibt, das das Ansprechen auf eine einmalige Gentransfertherapie beschränkt. Außerdem traten bei der Kontrollgruppe TK+ G– zwei geringe klinische Antworten auf, allerdings ohne histologischen Hinweis auf Nekrose, und der Tumor zeigte eine hohe Anzahl bei den Mitosezahlen. Diese niedrigen Werte waren eine direkte Folge der sehr kleinen Querschnittsflächen dieser beiden Tumoren und könnten einfach auf die bekanntermaßen variable Krebsgröße bei diesem Modell zurückzuführen sein (Dinesman et al., Otolaryngol Head Neck Surg., (1990)). Ein möglicher Hemmeffekts durch den Thymidinkinase-Gentransfer auf das Tumorwachstum muß jedoch in Erwägung gezogen werden, da die Tumorindices der Gruppe TK+ G– insgesamt kleiner sind als die Werte der Kontrolltiere mit PBS bzw. β-gal-Adenovirus-Gentransfer (p < 0,10; 0,16). Die Kontrolltiere in den Gruppen B-gal+ G+ und B-gal+ G– zeigten ebenfalls statistisch signifikante Unterschiede bei der Tumorantwort beim Vergleich mit der Kontrollgruppe PBS+ G+.
  • Für diese Versuche wurden thymuslose Mäuse ohne T-Zellen (CD4+– und CD8+-Lymphozyten) ausgewählt, um auf diese Weise die zelluläre Immunantwort zu eliminieren, die als eine wichtiger Faktor bei der Tumorregression nach der Virustransduktion genannt worden ist (Caruso et al, PNAS (1990), Culver et al., Science (1992)). Frühere Studien über den Retrovirus-vermittelten TK-Gentransfer bei Gliomtumoren bei immunkompetenten Ratten haben gezeigt, daß bei diesen Tumoren eine Infiltration durch Makrophagen und Lymphozyten auftritt (Culver et al., Science (1992)). Es wird angenommen, daß diese Immunreaktion die allgemeine Tumorabtötung nach dem Virustransfer verstärkt. Bei unseren Versuchen kam es weder in der Behandlungsgruppe TK+ G+ noch in einer der Kontrollgruppen zu einer inflammatorischen oder einer Immunzellantwort. Folglich ist die tumorizidale Antwort unmittelbar auf den Thymidinkinase-Gentransfer in Verbindung mit der Verabreichung von Ganciclovir zurückzuführen.
  • Die bei unserer Studie erhaltenen Befunde unterstützen das Konzept eines Beitrags durch den sogenannten "Bystander-Effekt". Sowohl in Maus- als auch in Human-Sarkom-Tumormodellen hat der Transfer eines toxischen Stoffwechselprodukts von Ganciclovir, vermutlich eine phosphorylierte Form, über Gap Junctions oder mittels Endozytose von apoptotischen Vesikeln von absterbenden virustransduzierten Tumorzellen zu nahegelegenen nicht-transduzierten Zellen zur Abtötung dieser Nebenzellen ("Bystander-Zellen") geführt. Bei unseren Versuchen mit Human-Plattenepithelkarzinomen unter in vivo-Bedingungen führte die Anlieferung von ADV/RSV-β-gal lediglich zu 1–10% Transduktion laut X-gal-Anfärbung, während die selbe Virusinjektionsmenge bei ADV/RSV-TK bei der experimentellen Gruppe zur diffusen Tumorabtötung und Nekrose führte. Darüber hinaus ist die umschriebene Anfärbung mit X-gal ein Zeichen dafür, daß die Adenoviren nicht leicht durch den soliden Tumor hindurchzudiffundieren vermögen, um einen Einfluss auf Krebszellen fernab von der Anlieferungsstelle auszuüben. Weiterhin ist zu bedenken, daß unter in vitro-Bedingungen bei niedrigen Infektionsmultiplizitäten ähnliche Transduktionseffizienzen für den β-gal- und den TK-Adenovirus erzielt wurden. Das Ausmaß der Tumorabtötung in diesen großen Plattenepitheltumoren im Mundboden nach der Adenovirus-Transduktion könnte in Verbindung mit einer anderen Komponente auftreten, wie dem Bystander-Effekt.
  • Zwar wurden die ADV/RSV-TK unmittelbar in die Tumoren injiziert, doch ist ein gewisses Maß an Leckage in das umgebende Muskel-, Speicheldrüsen- und Subkutangewebe aufgetreten. Mikro skopisch war in diesen umgebenden normalen Geweben keine Nekrose oder morphologische Veränderung festzustellen. Demnach bleiben die Wirkungen der Adenovirus-TK-Transduktion und GCV-Verabreichung auf die in der aktiven Teilung befindlichen Krebszellen beschränkt. Es wurde außerdem auch kein Hinweis auf eine systemische Schädigung durch die Behandlung erhalten, da die makro- und mikroskopische Untersuchung von Fernorganen, wie Dünndarm, Harnblase, Ovar, Milz, Herz, Gehirn, Nieren, Lunge und Leber keine Verletzungen erkennen ließen.
  • Diese Versuche sind ein Beweis, daß eine klinisch effektive in vivo-Behandlung von humanen Plattenepithelkarzinomen in einem Tiermodell durch den Einsatz der Adenovirus-vermittelten Gentherapie realisiert werden kann.
  • BEISPIEL 5
  • Kombinations-Gentherapie bei Lebermetastasen von Kolonkarzinomen unter in vivo-Bedingungen.
  • Die Wirksamkeit der Kombinationstherapie mit einem Suizidgen und einem Zytokingen zur Behandlung von Kolonkarzinommetastasen in der Leber wurde untersucht. Lebertumoren wurden erzeugt durch intrahepatische Injektion einer Kolonkarzinom-Zellinie (MGA 26) bei syngenen BALB-Mäusen. Unmittelbar in die soliden Tumoren wurden rekombinante Adenovirusvektoren, die verschiedene Kontroll- und therapeutische Gene enthielten, injiziert gefolgt von einer Behandlung mit Ganciclovir. Während die Tumoren bei allen mit einem Kontrollvektor oder einem Maus-Interleukin-2-Vektor behandelten Tieren ein anhaltendes Wachstum zeigten, war bei den mit einem Herpes simplex Virus/Thymidinkinase-Vektor mit oder ohne Mitverabreichung des Maus-Interleukin-2 Vektors ein dramatischer Grad von Nekrose und Regression zu beobachten. Aber nur bei den mit beiden Vektoren behandelten Tiere entwickelte sich eine effektive systemische Antitumorimmunität gegenüber Gaben von tumorigenen Dosen der Eltern-Tumorzellen (Challenge) per Inokulation an fernab gelegenen Körperstellen der Tiere. Die Antitumorimmunität war mit dem Auftreten von MCA26-Tumor-spezifischen zytolytischen CD8+-T-Lymphozyten begleitet. Die Ergebnisse belegen, daß eine Kombinationstherapie mit einem Suizidgen und einem Zytokingen unter in vivo-Bedingungen einen leistungsfähigen Ansatz zur Behandlung von Kolonkarzinommetastasen in der Leber darstellt.
  • Konstruktion der rekombinanten Adenovirusvektoren.
  • Die Konstruktion eines replikationsdefektiven Adenovirusvektors, der das Herpes simplex Virus-Thymidinkinase-Gen enthält (ADV/RSV-tk), wurde bereits an früherer Stelle beschrieben (Chef et al., PNAS (1994)). Auf ähnliche Weise wurde ein replikationsdefektiver Adenovirusvektor, der die Maus-Interleukin-2-cDNA enthält (ADV/RSV-mIL2), konstruiert. Zu diesem Zweck wurde die den Kode für das Peptid enthaltende Region einer Maus-Interleukin-2-cDNA (mIL-2) in eine Expressionskassette eingefügt, die aus dem Promoter RSV-LTR und der Polyadenylierungsregion des Rinderwachstumshormon-Gens sowie einen Großteil des Adenovirusvektors E1A bestand (Fang et al., Cancer Res. (1994)). Anschließend wurden 293-Zellen mit dem Konstrukt und pJM17-DNA, die den Rest des Adenovirusgenoms enthält, ko-transfiziert. Das rekombinante Adenovirus wurde mittels Plaqueaufreinigung gefolgt von zweifacher Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation isoliert. Der Virustiter wurde mit Hilfe eines Plaqueassays ermittelt (PBE/ml).
  • Etablierung und Behandlung eines Lebermetastasenmodells für Kolonkarzinome.
  • Die Bildung von Kolonkarzinommetastasen in der Leber wurde durch intrahepatische Implantation von MCA-26-Zellen induziert, bei denen es sich um eine Chemikalien-induzierte, von BALB/c-Mäusen abgeleitete, wenig differenzierte Kolonkarzinom-Zelllinie handelt (Corbett et al., Cancer Res. (1975)). Die Leber wurde durch eine abdominelle Inzision freigelegt und anschließend wurden syngenen Mäusen 3 × 105 MCA-26-Zellen an einer Stelle an der Spitze des linken Seitenlappens injiziert. Am Tag 7 wurde die Leber durch eine abdominelle Inzision freigelegt und die Tumorgrößen gemessen. Rekombinanter Adenovirusvektor in 70 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin und 20 μg/ml Polybren wurde bei verschiedenen Virustitern unmittelbar in die hepatischen Tumoren injiziert. Zwölf Stunden nach der Virusinjektion erhielten die Tiere an 6 aufeinanderfolgenden Tagen zweimal täglich eine intraperitoneale Behandlung mit Ganciclovir (GCV) 35 mg/kg KG.
  • Histopathologische und Morphometrische Analyse der Resttumoren.
  • Nach den verschiedenen gentherapeutischen Behandlungen wurde eine rechnergestützte morphometrische Analyse der größten Querschnittsflächen des Resttumoren durchgeführt. Für diese morphometrischen Analyen wurde die Punktzählmethode unter Einsatz eines rechnerassistierten Digitalisierungssystems mit Bioquant-Software ausgewählt, da die lebensfähigen Tumorzellen sich nicht immer nahe aneinander befinden. Kurz zusammengefaßt wurden über 1600 vorher festgelegte Punkte in der Tumorregion ausgezählt. Der Anteil der lebensfähigen Tumorzellen in dem Knötchen entsprach der Summe der Punkte mit lebensfähigen Tumorzellen geteilt durch die Gesamtzahl von Punkten. Für den Vergleich der funktionellen Fläche der lebensfähigen Tumorzellen zwischen den einzelnen Gruppen wurde die ANOVA-Methode herangezogen.
  • Fernab-Challenge mit Eltern-Tumorzellen bei vorbehandelten Tieren.
  • Einen Tag nach dem Abschluß der GCV-Behandlung, und somit 2 Wochen nach der Implantation der MCA-26-Zellen in die Leber, wurden Tiere aus allen Behandlungsgruppen mit tumorigenen Dosen der Eltern-Tumorzellen (MCA-26) (Challenge) bzw. einer heterologen, aber syngenen Brusttumor-Zelllinie (MOD) behandelt. Zu diesem Zweck wurden auf der rechten Körperflanke der Tiere an einer einzelnen Stelle 1 × 105 MCA-26-Zellen subkutan injiziert und auf der kontralateralen Seite wurden 2 × 106 MOD-Zellen subkutan injiziert. Erkennbare subkutane Tumoren von einer ähnlichen Größe entwickelten sich bei den normalen Tieren nach einer Woche und das Auftreten von subkutanen Tumoren bei den Tieren nach den verschiedenen gentherapeutischen Behandlungen wurde für eine Dauer von 4 Wochen beobachtet.
  • Assay für zytotoxische T-Lymphozyten (CTh).
  • Der CTL-Assay wurde durchgeführt wie beschrieben (Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1991)). Drei Tage nach Abschluß der GCV-Behandlung und somit 10 Tage nach der Adenovirusvektor-Injektion wurden lebensfähige Splenozyten von den verschiedenen Tier-Behandlungsgruppen isoliert. Zur in vitro-Stimulation in 24-Well-Platten wurden pro Well 6 × 106 Splenozyten und 5 × 105 MCA-26-Zellen, die mit 15.000 rad bestrahlt worden waren, plus 20 U/ml rekombinantes Nager-IL-2 verwendet. Bei den 51Cr-Freisetzungsassays wurden verschiedene Mengen stimulierte Splenozyten, die nach 5-tägiger Anzucht geerntet worden waren (Effektorzellen), in 96-Well-Platten (U-Form) mit 5000 51Cr-markierten MCA-26-Zellen gemischt (Zielzellen). Nach 4 Stunden bei 37°C wurden aus jedem Well 100 μl der Kulturflüssigkeit entnommen und mit einem Gammazähler ausgezählt. Der Prozentsatz an Zelllyse ist definiert als [(cpmexp – cpmmin)/(cpmmax – cpmmin)] × 100, wobei Cpmmax die Gesamtmenge an Radioaktivität darstellt, die von NP-40-lysierten Zielzellen freigesetzt wurde und cpmmin die von den Zielzellen spontan freigesetzte Hintergrundradioaktivität darstellt. Die Daten entsprechen der mittleren spezifischen Radioaktivität pro Minute (cpm) von Dreifachkulturen, wobei der Standardfehler des Mittelwerts bei allen Assays unter 7% lag.
  • ERGEBNISSE
  • Funktionelle Charakterisierung der rekombinanten Adenovirusvektoren.
  • Um herauszufinden, ob die Einführung des HSV-tk-Gens die MCA-26-Kolontumorzellen suszeptibel für die Abtötung durch GCV werden lässt, wurde der replikationsdefektive rekombinante Adenovirusvektor ADV/RSV-tk zur Transduktion der Kolonkarzinom-Zelllinie unter in vitro-Bedingungen verwendet (18). Nach der Transduktion mit dem rekombinanten Adenovirusvektor und einer anschließenden Behandlung mit PBS waren die Zellen selbst bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 12.000 noch voll lebensfähig. Nach einer anschließenden GCV-Behandlung waren jedoch nur noch 10% der Zellen bei einer MOI von 250 lebensfähig und bei einer MOI von 1.000 überlebten nur wenige Zellen. Die Funktionstüchtigkeit des replikationsdefektiven mIL-2-Adenovirusvektor (ADV/RSV-mIL2) wurde nachgewiesen durch Transduktion von Maus-B16-Zellen unter in vitro-Bedingungen gefolgt vom Nachweis der mIL2-Aktivität in den konditionierten Medien unter Einsatz eines T-Zellproliferations-Assays (Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1991)). Nach der Transduktion mit dem mIL-2-Adenovirusvektor bei einer MOI von 500 bzw. 1000 war in den konditionierten Medien der Zellen eine hohe mIL2-Aktivität vorhanden, während in den mit einem Kontroll-Adenovirusvektor transduzierten Zellen keine mIL-2-Aktivität nachgewiesen werden konnte (19).
  • Regression von hepatischen MCA-26-Tumoren in syngenen Tieren nach der Kombinations-Gentherapie unter in vivo-Bedingungen.
  • Zur Etablierung eines Tiermodells für Kolonkarzinommetastasen in der Leber wurden 3 × 105 MCA-26-Zellen in die Leber injiziert. Nach 6 Tagen waren Tumoren mit einer Größe von 5 × 7 mm2 bei 60–70% der Tiere vorhanden. Diese Tumorgröße wurde für alle nachfolgenden Gentherapieversuche ausgewählt. Es wurden fünf Behandlungsgruppen mit BALB/c-Mäuse mit hepatischen Kolonkarzinomen eingerichtet: A: ADV/RSV-βgal, B: ADV/RSV-mIL2, C: ADV/RSV-βgal + ADV/RSV-mIL2, D: ADV/RSV-tk und E: ADV/RSV-tk + ADV/RSV-mIL2. Die Resttumoren der soliden Tumoren bei den verschiedenen Tier-Behandlungsgruppen wurden vermessen und histopathologisch untersucht. Die mit dem β-gal-Vektor behandelten Tiere wiesen große Knoten aus aktiv wachsenden undifferenzierten Karzinomzellen und selten kleine Herde spontaner Nekrose und zahlreichen Mitosen auf. Es bestand ein Druck auf die umgebenden Leberanteile, der Entzündungsgrad war unwesentlich. Die mit dem mIL2-Vektor behandelten Tiere zeigten begrenzte subskapuläre Nekrose, besaßen aber große Knoten, die vorwiegend aus lebensfähigen Tumorzellen bestanden, wobei die Mitoseaktivität der bei den mit dem βgal-Vektor behandelten Mäusen entsprach. Eine mäßige Menge eines inflammatorischen Infiltrat aus Lymphozyten, Makrophagen und eosinophilen Granulozyten war am Rand des Tumors festzustellen. Interessanterweise zeigten die mit einer Kombination des βgal- und des mIL2-Vektors behandelten Tiere eine ausgeprägtere Tumornekrose in Verbindung mit Infiltration von inflammatorischen Zellen, aber es waren noch lebensfähige Tumorzellen vorhanden. Bei der Behandlungsgruppe mit dem tk-Vektor war eine ausgeprägte Tumornekrose zu beobachten, aber es war auch eine reichliche Menge an aktiv in der Replikation befindlichen neoplastischen Zellen vorhanden. Sämtliche mit den beiden Vektoren tk + mIL2 behandelten Tiere zeigten massive Tumornekrose umgeben von inflammatorischen Zellen. In manchen Lebern war keine lebensfähige Malignität mehr verblieben. Die große Nekrosezone enthielt eine Mischung aus vollständig zerstörtem Tumor, Einblutung und ischämische Leberschädigung. Überall waren Makrophagen, Lymphozyten und Granulozyten in großer Anzahl vorhanden. Bei 7 der 10 Tiere der Kombinationsbehandlungsgruppe tk + mIL2 waren nur wenige Resttumorzellen vorhanden und die anderen 3 Tiere schienen tumorfrei zu sein.
  • Zur Quantifizierung der Wirksamkeit der Kombinations-Gentherapie mit tk + mIL2 bei der Herbeiführung der Tumorregression wurden rechnergestützte morphometrische Punktzählanalysen der maximalen Querschnittsfläche der soliden Tumore durchgeführt. Die erhaltenen Tumorgrößenmessungen bei den Tieren der fünf Behandlungsgruppen sind 20 zu entnehmen. Bei allen mit dem βgal-Vektor behandelten Tieren entwickelten sich wie erwartet große Tumoren. Bei der nur mit dem mIL2-Vektor behandelten Tiergruppe ergab sich eine geringfügige, aber nicht-signifikante Reduktion der Resttumorgröße. Die mit dem βgal- und dem mIL2-Vektor behandelten Tiere und die nur mit dem tk-Vektor behandelten Tiere zeigten Tumornekrose und die Resttumorgröße war ungefähr 5-mal geringer als bei den mit dem βgal-Vektor behandelten Tieren. Bei der mit dem tk-Vektor und dem mIL2-Vektor behandelten Tiergruppe ergab sich eine signifikante zusätzliche Reduktion der Resttumorgröße im Vergleich zu der nur mit dem tk-Vektor behandelten Tiergruppe.
  • Systemische Antitumorimmunität bei Tieren nach Behandlung mit tk- und mIL2-Vektor.
  • Um herauszufinden, ob bei den mit den verschiedenen Gentherapiebehandlungen versorgten Tieren eine Anti tumorimmunität auftrat, wurde eine mögliche Schutzwirkung vor einer Sekundär-Challenge durch eine subkutane Inokulation mit MCA-26-Zellen in tumorigenen Dosen nach dem Abschluß der GCV-Verabreichung durchgeführt. Bei allen Tieren in der βgal- und der tk-Vektor-Behandlungsgruppe entwickelten sich innerhalb von 7 Tagen riesige subkutane Tumoren an der Injektionsstelle. Auch bei 5 von 6 mIL2-Vektor-behandelten und bei 4 von 6 mit βgal + mIL2-Vektor behandelten Tiere entwickelten sich subkutane Tumoren an der Injektionsstelle. Bei den 6 Tieren, die mit dem tk- und dem mIL2-Vektor behandelt worden waren, entwickelten sich dagegen keine subkutanen Tumore, selbst nach einer Dauer von 4 Wochen (21). Die Antitumorimmunität bei diesen Tieren schien auch spezifisch für MCA-26-Zellen zu sein, denn es war keine Schutzwirkung gegen eine Fernab-Challenge mit tumorigenen Dosen einer heterologen, aber syngenen Brusttumor-Zelllinie (MOD) bei diesen Tieren zu beobachten (21).
  • Zur kritischen Evaluierung, ob die Tumorzurückweisung mit einer Sensibilisierung der Wirts-Effektorzellen verbunden war, wurde ein Assay für zytotoxische T-Lymphozyten unter in vitro-Bedingungen durchgeführt. Drei Tage nach Abschluß einer GCV-Behandlung wurden zu diesem Zweck Splenozyten von normalen Tieren und von Tieren aus allen fünf Behandlungsgruppen isoliert und dann fünf Tage gemeinsam mit bestrahlten MCA-26-Zellen in Kultur gehalten. Die stimulierten Effektor-Zellpopulationen wurden in verschiedenen Mengen mit Chrom-51-markierten MCA-26-Zielzellen inkubiert und der Prozentsatz an Zielzelllyse gegen die Effektor-/Zielzell-Verhältnisse aufgetragen (22). Bei den Splenozyten der unbehandelten normalen Mäuse wurde keine signifikante CTL-Aktivität gegen die MCA-26-Zielzellen festgestellt und auch nicht bei den Tieren aus den ersten vier Behandlungsgruppen. Bei den Splenozyten von Tieren, die mit dem tk- und dem mIL2-Vektor behandelt worden waren, wurde ein dramatischer Anstieg der MCA-26-spezifischen CTL-Aktivität festgestellt (22). Im Gegensatz dazu waren Splenozyten von tk- und mIL2-behandelten Mäusen nicht in der Lage, von BALB/c-abgelei tete MOD-Brustkrebs-Tumorzellen oder YACI-Zielzellen zu lysieren.
  • Um herauszufinden, ob die CTL-Antwort eine Aktivität von CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen widerspiegelte, wurden monoklonale Antikörper gegen entweder CD4 oder CD8 als Blockierreagenzien im Chrom-51-Freisetzungsassay verwendet. Die monoklonalen Antikörper gegen CD8 waren effektiv, indem sie die CTL-Antwort gegen MCA-26-Zellen vollständig unterbinden konnten, während der monoklonale Antikörper gegen CD4 sich als ineffektiv erwies (23). Diese Versuche bieten überzeugende Hinweise darauf, daß CD8+-T-Zellen bei den mit dem tk- und dem mIL2-Vektor behandelten Tieren für die MCA-26-spezifische Zytotoxizität verantwortlich waren.
  • In der vorliegenden Untersuchung wurde festgestellt, daß die direkte Anlieferung des HSV-tk-Gens und des Maus-IL2-Gens in rekombinanten Adenovirusvektoren zu Kolonkarzinommetastasen in der Leber zur Regression des Karzinoms unter in vivo-Bedingugen führte. Weder der βgal-Vektor noch der mIL2-Vektor alleine waren in der Lage, das Tumorwachstum bei diesem Modell anzuhalten. Der tk-Vektor alleine bewirkte kein signifikantes Ausmaß von Nekrose, aber es blieb eine große Anzahl von lebensfähigen Tumorzellen zurück. Die Kombinationstherapie mit dem tk- und dem mIL2-Vektor war nicht nur wirksamer bei der Herbeiführung der Tumorregression bei nur wenigen verbleibenden lebensfähigen Tumorzellen, sondern führte zudem zur Ausbildung einer systemischen Antitumorimmunität, die eine effektive Schutzwirkung gegen tumorige Dosen der Eltern-Tumorzellen bei der Inokulation an fernab gelegenen Stellen bot. Die Spezifität dieser gegen die Eltern-Tumorzellen gerichteten Antitumorimmunität wird noch verdeutlicht durch die Tatsache, daß eine Antitumorimmunität gegen tumorigene Dosen einer heterologen Brustkrebs-Zelllinie, die diese Tiere durch Inokulation erhielten, nicht gegeben war. Und schließlich wurde nachgewiesen, daß die Antitumorimmunität bei diesen Tieren mit dem Vorhandensein von MCA-26-spezifischen zytotoxischen CD8+-T-Lymphozyten verbunden war.
  • Interessanterweise führte die Kombination des mIL2-Vektors mit 3 × 109 Plaque-bildenden Einheiten des βgal-Vektors zu einer signifikanten Reduktion der Tumorgröße in Verbindung mit der Anwesenheit von inflammatorischen Zellen und Tumornekrose. Dieser Effekt schien mit der Virusgesamtdosis verbunden zu sein, da ähnliche Ergebnisse auch bei Tieren erhalten wurden, die mit dem mIL2-Vektor + 3 × 109 Plaque-bildenden Einheiten des tk-Vektors ohne anschließende Verabreichung von GCV behandelt wurden. Der rekombinante Adenovirusvektor E1A exprimiert bekanntermaßen geringe Mengen von viralen Antigenen, die eine zelluläre Immunantwort gegen virustransduzierte Zellen unter in vivo-Bedingungen hervorrufen können und diese Antivirusimmunität kann durch die lokale Expression des Interleukin-2-Gens verstärkt werden. Bei dieser Behandlungsgruppe fehlte jedoch eine effektive, gegen die Eltern-Tumorzellen gerichtete systemische CTL-Antwort und 4 der 6 Tiere zeigten keine Schutzwirkung gegen eine Challenge mit Eltern-Tumorzellen an einer fernab gelegenen Körperstelle.
  • BEISPIEL 6
  • Vektor-Sicherheitstest mit nicht-humanen Primaten.
  • Toxizitätstests für die Behandlung mit ADV/RSV-tk und GCV bei Pavianen (Papio cynocephalus).
  • Virus wurde mit einem Titer von 1,6 × 1011 Teilchen/ml laut Messung der optischen Dichte hergestellt. Der Vektor wurde in vivo- und in vitro-Toxizitätstest, tk-Funktionstests, Replikationskompetenz- und Kontaminationstests unterzogen. Vor den Virusinjektionen wurden alle Paviane einer MRT unterzogen. Präoperative Serum-, Samen-, Harn- und Stuhlproben wurden entnommen und auf Wildtyp-Virus getestet. Das Serum wurde auf neutralisierende Antikörper gegen Wildtyp-Adenovirus getestet. Es wurden drei Behandlungsgruppen eingerichtet.
  • Gruppe 1 – Mäßige Dosis ADV/RSV-tk, mit GCV, 6-Wochen-Überleben.
  • Eine mäßige Dosis ADV/RSV-tk (1,5 × 109 Teilchen in 10 μl PBS mit 10% Glycerin) wurde in das Centrum semiovale eines 16,3 Jahre alten fortpflanzungsfähigen weiblichen und eines 17,5 Jahre alten männlichen Pavians injiziert. Ab dem nächsten Tag wurde bei beiden Tieren eine Behandlung mit 10 mg/kg GCV zweimal täglich für eine Dauer von 14 Tagen eingeleitet. Proben wurden an den Tagen 2 und 7 nach der Injektion zur Testung auf Virus und Antikörper gegen Adenoviren entnommen. 3 Wochen nach der Virusinjektion wurden die Tiere einer Kernspintomographie mit Gadoliniumverstärkung unterzogen. Ungefähr 6 Wochen nach der Virusinjektion wurden erneut Plasma-, Serum-, Harn-, Stuhl und Samenproben zur Testung auf freigesetzte Viren und Antikörper gegen Adenoviren entnommen, Gehirnaufnahmen mit Gadoliniumverstärkung wurden angefertigt und die Tiere wurden einer Nekroskopie unterzogen.
  • Die makroskopische Untersuchung der Gehirne ergab keine Auffälligkeiten. Insbesondere waren keine Nekrosekavitäten, Raumforderungseffekte, Einblutungen oder subarachnoide Verschattung zu erkennen. Die Gehirne wurden intensiv auf mikroskopische Hinweise für Auffälligkeiten untersucht und im Centrum semiovale der rechten Hemisphäre waren kleine Bereiche mit Makrophageninfiltration und leichte perivaskuläre lymphatische Manschettenbildung festzustellen. Über die rechte Hemisphäre hinaus war keine Manschettenbildung festzustellen und Substantia alba-Ödeme waren nicht zu erkennen. Es lag kein Hinweis auf Leptomeningitis vor. Nekrose oder virale Einschlüsse waren nicht zu erkennen. Plexus choroideus und Ependym waren intakt. Es war keine systemische Pathologie zu erkennen mit Ausnahme von herdförmigen hepatischen Lymphozyteninfiltraten ohne Nekrose bei einem der Tiere. Die systemische Untersuchung des anderen Tiers ergab Normalbefunde.
  • Gruppe 2 – Hohe Dosis ADV/RSV-tk, mit GCV, 3-Wochen-Überleben.
  • Auf ausdrückliches Verlangen der FDA wurden zwei Paviane mit ADV/RSV-tk und GCV in hoher Dosis behandelt. Zu diesem Zweck wurde ADV/RSV-tk (3 × 1010 Teilchen in 200 μl PBS mit 10% Glycerin) in das Centrum semiovale eines 16-jährigen fortpflanzungsfähigen weiblichen und eines 11-jährigen männlichen Pavians injiziert. Ab dem nächsten Tag erhielten die Tiere eine Behandlung mit 10 mg/kg GCV zweimal täglich für 14 Tage mittels des Leinensystems. 2 Tage nach der Injektion und 1 Woche nach der Injektion wurden Proben von Plasma, Serum, Harn, Stuhl und Samen zur weiteren Analyse auf das Vorhandensein von freigesetzten Viren und Antikörpern gegen Adenovirus entnommen. Für den Fall, daß kein Virus nachgewiesen wurde, war beabsichtigt, die Tiere ungefähr 3 Wochen nach der Virusinjektion mit Gadoliniumverstärkung bildgebend zu untersuchen und die Tiere am nächsten Tag einer Nekroskopie zu unterziehen. Der männliche Pavian verstarb 5 Tage nach der Virusinjektion.
  • Diese Tiere verstarben nach 5 Tagen bzw. wurden 10 Tage nach der Virusinjektion und Einleitung der GCV-Behandlung eingeschläfert. In beiden Fällen wurden ein Bereich mit Liquefaktionsnekrose von 1,5 bis 1,8 cm an der Injektionsstelle festgestellt. Diese Nekrosemassen zeigten einen Raumforderungseffekt. Die histopathologische Untersuchung belegte akute Entzündung, die sich durch polymorphkernige Zellen und Lymphozyten eingemischt mit eosinophiler Liquefaktionsnekrose des Centrum semiovale auszeichnete. Ausstrahlend von der Nekrosemasse waren zerebrale Ödeme belegt durch Spongiose der Substantia alba festzustellen. Intensive lymphozytäre perivaskuläre Manschettenbildung war in einem Abstand von bis zu 1,5 cm von der Injektionskavität in der rechten Hemisphäre zu erkennen. Koagulative Nekrose war transmural in den neben der Injektionsstelle gelegenen Gefäßen zu erkennen. In der linken Hemisphäre, dem Hirnstamm und dem Kleinhirn waren seltene Herde eines perivaskulären Infiltrats vorhanden. Zu einer multifokalen subarachnoiden Lymphozyteninfiltration kam es vorwiegend über der rechten Hemisphäre und in geringerem Ausmaß über der linken Hemisphäre und um den Hirnstamm und das Kleinhirn herum. Eine Zerstörung des Plexus choroideus oder Ependyms war nicht festzustellen, aber auf der rechten Seite des 10 Tage überlebenden Tiers war eine herdförmige Entzündung des Plexus choroideus zu erkennen. Intranukleäre Viruseinschlüsse waren nicht zu erkennen. Luxol-Fast Blue-angefärbte Schnitte ergaben keinen Hinweis auf einen Verlust von Myelin außer in den nekrotischen Kavitäten.
  • Die systemische Untersuchung belegte Lungenstauung bei dem an Tag 5 verstorbenen Tier und die mikroskopische Untersuchung ergab eosinophiles Material in den Alveolarräumen, was als Hinweis auf ein neurogenes Pulmonalödem zu werten ist. Eine Entzündung der Lunge lag nicht vor. Bei dem nach 10 Tagen eingeschläferten Tier ergaben sich keine systemisch-pathologischen Befunde.
  • Gruppe 3 – Hohe Dosis ADV/RSV-tk, keine GCV-Behandlung, 3- und 5-Wochen-Überleben.
  • Zur Unterscheidung von Wirkungen durch die Virusinjektion alleine bzw. die Virusinjektion plus GCV-Verabreichung erhielten 2 männliche Paviane (10,5 bzw. 11,5 Jahre alt) auf die oben beschriebene Weise Injektionen, die 3 × 1010 Teilchen ADV/RSV-tk enthielten. Diese beiden Tiere wurden nicht mit GCV behandelt. Probenentnahmen und -analysen wurden auf die oben beschriebene Weise durchgeführt. Ein Pavian wurde 3 Wochen nach der ersten MRT einer Nekroskopie unterzogen. Der andere Pavian wurde 6 Wochen nach der zweiten MRT einer Nekroskopie unterzogen. Gewebe- und Körperflüssigkeitsproben wurden auf die oben beschriebene Weise analysiert.
  • Bei dem nach drei Wochen untersuchten Tier war eine zystische Kavität im rechten Centrum semiovale mit einer Größe von 1,5 cm vorhanden. Ein Raumforderungseffekt, Herniation oder Einblutung war makroskopisch nicht zu erkennen. Die Histopathologie belegte die Auffüllung der Kavität mit Makrophagen, die Lipidbruchstücke enthielten. In der Nähe der Kavität war leichte Gliose, persistente Entzündung mit Lymphozyten, perivaskuläre lymphozytäre Manschettenbildung und minimales Substantia alba-Ödem vorhanden. Viruseinschlüssen waren nicht zu erkennen, Plexus choroideus und Ependym waren intakt. Im Gegensatz zur lin ken Hemisphäre und dem Hirnstamm waren über der rechten Hemisphäre leichte herdförmige Lymphozytenansammlungen im Subarachnoidalraum festzustellen. Systemische pathologische Veränderungen waren nicht vorhanden.
  • Bei dem sechs Wochen nach der Behandlung untersuchten Tier war im rechten posterioren Centrum semiovale eine etwas unregelmäßige zystische Kavität mit einer Größe von 1,6 cm vorhanden. Die Auskleidung der Kavitätenwand war hellbraun; für ein Raumforderungseffekt, Herniation oder Hämatom lagen keine Hinweise vor. Die mikroskopische Untersuchung belegte die Anwesenheit von lipidbeladenen Makrophagen in der Kavitätenwand, persistente Lymphozyteninfiltrate in der Wand und um die nahegelegenen Blutgefäße herum und minimale Ödembildung und Gliose unmittelbar neben der Kavität. Es war kein Infiltrat im Plexus choroideus, Ependym und/oder leptomeningeales Restinfiltrat zu erkennen. Systemische pathologische Veränderungen waren nicht vorhanden.
  • Kurzgefaßt scheint der Vektor einen dosisabhängigen neurotoxischen Effekt bei den Hochdosis-Behandlungsgruppen zu besitzen, bei denen es an der Injektionsstelle zu einer koagulativen Nekrose kommt, die im Lauf der Zeit von Makrophagen unter Bildung von zystischen Kavitäten beseitigt wird. Dieser Prozeß hält 6 Wochen lang an, obwohl die inflammatorische Komponente zu diesem Zeitpunkt in der Auflösung befindlich ist. GCV scheint die klinische Toxizität des hochdosierten Vektors zu potenzieren, denn beide Tiere mit hochdosiertem Vektor plus GCV erkrankten stark genug, um eingeschläfert werden zu müssen. Die mit dem mäßig-dosierten Vektor plus GCV behandelten Tiere zeigten lediglich mikroskopische Anzeichen von Neurotoxizität an der Injektionsstelle. Der Adenovirusvektor besaß dosisabhängige zytopathische Wirkungen, die über die Penton-Strukturproteine vermittelt wurden, was mit dem zytopathischen Effekt des Wildtyp-Vektors übereinstimmt. Die Tatsache, daß bei den Hochdosisgruppen dieses Experiments sowohl mit als auch ohne GC Nekrose auftrat, während dies bei den mäßig-dosierten und GCV-erhalten den Tieren nicht der Fall war, ist ein deutliches Argument für einen direkten zytopathischen Effekt des Vektors anstatt einer Toxizität, die aus der 6k-Umwandlung von BVC zu toxischen Verbindungen herrührt. Mit diesem Versuch wird eine Zytopathologie-Dosisgrenze von 1,5 × 109 Teilchen festgelegt. Eine Vektordosis unterhalb dieser Grenze, gekoppelt mit BVC, ist toxisch für in der Teilung befindliche Tumorzellen und verschont diejenigen Zellen des ZNS, die sich nicht in der Teilung befinden.
  • MRT-Analyse von Paviangehirnen nach der Behandlung mit ADV/RSV-tk in mäßiger und hoher Dosis.
  • Die makroskopischen neuropathologischen Veränderungen scheinen sich auch in den MRT-Befunden widerzuspiegeln. Leider verstarben unsere Tiere, die den hochdosierten Vektor und GCV erhalten hatten, bevor Nachsorge-MRT-Untersuchungen durchgeführt werden konnten. Bei beiden Tieren mit hochdosiertem Vektor, aber ohne GCV-Behandlung, zeigten sich nach drei Wochen Bereiche mit hoher Signalintensität in T2-gewichteten Aufnahmen, die den nach drei bzw. sechs Wochen bei der Nekroskopie zu sehenden zystischen Kavitäten entsprachen. Nach drei Wochen waren minimale Raumforderungseffekte mittels MRT nachweisbar. Die MRT nach sechs Wochen bei dem verbliebenen Tier dieser Gruppe zeigte die zystische Kavität in besserer Abgrenzung, die den makroskopischen pathologischen Befunden einer in der Auflösung befindlichen umschriebenen Kavität entsprachen. Bei diesen Tieren war Gadoliniumleckage zu erkennen, die mit den inflammatorischen Veränderungen um die Blutgefäße herum übereinstimmte. Bei den Tieren mit dem mäßig dosierten Vektor plus GCV zeigten sich weit weniger ausgeprägte Veränderungen bei der MRT und eine Kavitätenbildung war weder in der bildgebenden Darstellung noch bei der makroskopischen Untersuchung zu erkennen, was auf den niedrigeren toxischen Effekt dieses Behandlungsschemas zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse belegen, daß die MRT zur Überwachung von Gewebeeffekten dieser Therapie verwendet werden kann.
  • PCR-Analyse von Geweben von Pavianen, die Injektionen mit mäßig- bzw. hochdosiertem ADV/RSV-tk erhalten haben.
  • Für diese Analyse wurde Nekroskopie-Gewebe (Durchmesser 2–3 cm) verwendet. Im Falle von größeren Organproben (Gehirn, Leber, usw.) wurden mehrere (4–6) Gewebeproben entnommen und miteinander vereint. Die Gesamt-DNA wurde mit SDS und Proteinase K isoliert (Ausubel et al., 1987). Eine Teilmenge von 1 μl DNA einer jeden Probe wurde bei der PCR-Reaktion eingesetzt. Bei den verwendeten Primer-Oligonukleotiden handelte es sich um einen Sense-Primer Adv.3205 (5'-GTGTTACTCATAGCGTAA-3') und einen Antisense-Primer RSV 270A (5'GACTCCTAACCGCGACA-3'), wobei der erste Primer in der Adenovirussequenz und letzterer in den RSV-LTR-Sequenzen enthalten war und beide 5' zum Thymidinkinase-Gen in das rekombinante Plasmid pADL-1/RSV-tk zur Produktion des rekombinanten Virus eingebaut waren. Die PCR-Reaktion wurde über 30 Zyklen von jeweils 30 Sek bei 92°C, 30 Sek. bei 50°C und 1 Min bei 72°C durchgeführt. Die Reaktionsmischung bestand aus jeweils 50 μl der enzelnen dNTPs, jeweils 50 pM jedes Primers und 4 Einheiten Taq-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 100 μl (Saiki, 1990). Am Ende der PCR wurde eine Teilmenge von 10 μl auf einem 4% NuSieve-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht erkennbar gemacht. Proben, die bei der Untersuchung des Gels ein Fragment mit 232 bp aufwiesen, wurden als positiv gewertet. Die Injektionsstelle war bei 3 der 4 Tiere positiv, die das hochdosierte Virus erhalten hatten. Bei einem Tier mit Virussequenz an der Injektionsstelle wurde das Virus auch im Rückenmark nachgewiesen. Bei den beiden anderen Tieren mit positiven Befunden an der Injektionsstelle wurde das Virus in keinem anderen Bereich als dem ZNS nachgewiesen. Keine andere Gewebe, einschließlich Keimdrüsengewebe, ergaben einen Positivbefund für Sequenzen des ADV/RSV-tk-Virus. Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle III in Form eine Liste aufgeführt. TABELLE III PCR-Analyse von Geweben von Pavianen, die ADV/RSV-tk-Injektionen erhalten haben. ND = nicht durchgeführt
    ORGAN Mäßige Dosis + GCV, f Mäßige Dosis + GCV, m Hohe Dosis + GCV, f Hohe Dosis + GCV, m Hohe Dosis – GCV, f Hohe Dosis – GCV, m
    Injektionsstelle – – + + + –
    ZNS distal zur Injektionsstelle – – + – – –
    Lunge ND – ND – – –
    Niere – – – – – ND
    Ovar/Hoden * – – – – –
    • f = Wecen, m = Männchen
    • *Vor der Studie entnommen
  • Die Gesamtheit der in dieser Patentschrift erwähnten Patente und Veröffentlichungen gibt den Kenntnistand eines Fachmanns auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung an.
  • Für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist leicht ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung zur Durchführung der Aufgaben und zur Erreichung der erwähnten und implizit enthaltenen Ziele und Vorteile gut geeignet ist. Die hierin beschriebenen Methoden, Verfahren, Behandlungen, Moleküle und speziellen Verbindungen sind zum jetzigen Zeitpunkt repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen und sind als beispielhaft anzusehen und sollen keine Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Art und Weise darstellen. Für den Fachmann sind Veränderungen und andere Einsatzzwecke leicht ersichtlich, doch gehören diese zur Lehre der vorliegenden Erfindung und sind durch den in den Ansprüchen angegebenen Umfang der vorliegenden Erfindung festgelegt.

Claims (7)

  1. Ein DNA-Zufuhrsystem zur Verabreichung eines Suizidgens und eines oder mehrerer Zytokingene, die in der DNA enthalten sind, an ein Individuum zur Behandlung eines soliden Tumors, Papilloms oder einer Warze bei einem nicht-humanen Tier oder einem Menschen, wobei das DNA-Zufuhrsystem aus einem Virusvektor, einem Episomenvektor, einem Liposom, einem kationischen Lipid oder einem nicht-viralen Zufuhrsystem ausgewählt ist, bestehend aus der DNA oder RNA von Interesse, einer einen Zelloberflächenrezeptor oder -antigen erkennenden und an diesen bindenden Einheit, einer DNA-bindenden Einheit und einer Lyseeinheit, die den Transport eines Komplexes von der Zelloberfläche in das Zytoplasma ermöglicht; wobei das Suizidgen und das eine oder die mehreren Zytokingen(e) in der DNA oder RNA enthalten und exprimierbar sind, und wobei das Suizidgen so angepaßt ist, daß es den Kode für ein Protein enthält, das ein Prodrug, das dem Tier oder Menschen verabreicht wird, unter Invivo-Bedingungen enzymatisch in eine toxische Verbindung umwandeln kann.
  2. System nach Anspruch 1, wobei die Sequenz des Suizidgens so angepaßt ist, daß es Kodes für ein Protein exprimiert, das aus Thymidinkinase des Herpes simplex-Virus, einer Thymidinkinase des Varicella zoster-Virus oder einer bakteriellen Zytosindeaminase ausgewählt ist.
  3. System nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die eine oder mehreren Zytogensequenz(en) aus Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-10, Interleukin-12, Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Tumornekrosefaktor-α, Tumornekrosefaktor-β, GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) oder G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) ausgewählt sind.
  4. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Suizidgensequenz so angepaßt ist, daß sie ein Protein exprimiert, das ein Prodrug umwandeln kann, das aus Ganciclovir, Acyclovir, 1–5 Joduracil FIAU, 5-Fluorzytosin oder 6-Methoxypurinarabinosid oder einem Derivat derselben ausgewählt ist.
  5. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit entsprechender Anpassung zur Behandlung eines Tumors, der aus einem Kolon-, Prostata-, Brust-, Lungen-, Haut-, Leber-, Knochen-, Bauchspeicheldrüsen-, Ovarial-, Hoden-, Blasen-, Nieren-, Hirn-, Kopf- oder Halstumor ausgewählt ist.
  6. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit entsprechender Anpassung zur Behandlung eines Papilloms, das aus einem Plattenepithelzellpapillom, einem Plexus choroideus-Papillom oder einem Kehlkopfpapillom ausgewählt ist.
  7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit entsprechender Anpassung zur Behandlung einer Warze, die aus einer Genitalwarze, einer Fußsohlenwarze, einer Epidermodysplasia verruciformis- oder einer malignen Warze ausgewählt ist.
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